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KR102617947B1 - 접합체와 제조 및 그 용도 - Google Patents

접합체와 제조 및 그 용도 Download PDF

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KR102617947B1
KR102617947B1 KR1020207014140A KR20207014140A KR102617947B1 KR 102617947 B1 KR102617947 B1 KR 102617947B1 KR 1020207014140 A KR1020207014140 A KR 1020207014140A KR 20207014140 A KR20207014140 A KR 20207014140A KR 102617947 B1 KR102617947 B1 KR 102617947B1
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지웨이 양
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쑤저우 리보 라이프 사이언스 컴퍼니, 리미티드
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Abstract

화학식 (321)로 표현되는 구조를 가지고 올리고뉴클레오티드같은 활성제를 포함하는 접합체를 형성하기 위한 화합물. 또한 본원 개시는 상응하는 접합체를 제공한다. 본원의 접합체는 간세포를 특정 표적화할 수 있어서, 생체 내에서 올리고뉴클레오티드 약물의 전달과 관련된 문제를 효율적으로 해결하고, 전달된 올리고뉴클레오티드의 높은 안정성을 유지하며 낮은 독성과 우수한 전달 효율을 가진다.
Figure 112020049632550-pct00242

화학식 (321)

Description

접합체와 제조 및 그 용도
본 발명은 올리고뉴클레오티드같은 활성제를 포함하는 접합체를 형성하기 위한 화합물과 이에 상응하는 접합체에 관한 것으로 본원의 접합체는 간세포를 특정 표적화할 수 있는 접합체이다.
전달 시스템은 소형 RNA 약물 개발에 있어 핵심적인 기술 중 하나이다. 소형RNA 전달 시스템의 한 유형은 간세포에 표적 접합 전달 기술이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명에서 화학식 (321)로 표현되는 구조를 갖는 화합물이 제공된다
본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 화학식 (1)로 표현되는 구조를 갖는 접합체를 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 본원은 간세포에서 특정 유전자의 발현에 의해 유발된 병리학적 상태 또는 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위해 본 발명에 개시된 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 본원은 유효량의 접합체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 간세포에서 특정 유전자의 발현에 의해 유발된 병리학적 상태 또는 질병에 필요로 하는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 본원은 본원에 개시된 접합체를 접촉시키는 것을 포함하고, 간세포의 특정 유전자 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 본원은 본원에 개시된 접합체를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명에서 화학식 (321)로 표현되는 구조를 갖는 화합물이 제공된다
화학식 (321)
상기,
n1 은 1-3의 정수이고, n3은 0-4의 정수이며;
m1, m2 및 m3 각각은 독립적으로 2-10의 정수이고;
각 R10, R11, R12, R13, R14 및R15는 독립적으로 H, C1-C10　알킬, C1-C10　할로 알킬, 및 C1-C10　알콕시에서 선택되고;
R4 는 활성 약물 또는 활성제에 공유결합을 통해 결합할 수 있는 부분이고;
각 L1 은 1내지 70개의 탄소 원자 길이의 선형 알킬렌이고, 상기 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10　알케닐렌, C2-C10　알키닐렌, C6-C10　아릴렌, C3-C18　헤테로사이클릴렌(heterocyclylene), C5-C10　헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있으며, 상기 L1 은 선택적으로 C1-C10　알킬, C6-C10　아릴, C5-C10　헤테로아릴, C1-C10　할로알킬, ­OC1-C10　알킬, ­OC1-C10　알킬페닐, -C1-C10　알킬­OH, ­OC1-C10　할로알킬, ­SC1-C10　알킬, ­SC1-C10　알킬페닐, -C1-C10　알킬­SH, ­SC1-C10　할로알킬, 할로, ­OH, -SH, ­NH2, ­C1-C10　알킬­NH2, ­N(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬), ­NH(C1-C10　알킬), ­N(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬페닐), ­NH(C1-C10　알킬페닐), 시아노, 니트로, ­CO2H, ­C(O)OC1-C10　알킬, ­CON(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬), ­CONH(C1-C10　알킬), ­CONH2, ­NHC(O)(C1-C10　알킬), ­NHC(O)(페닐), ­N(C1-C10　알킬)C(O)(C1-C10　알킬), ­N(C1-C10　알킬)C(O)(페닐), ­C(O)C1-C10　알킬, ­C(O)C1-C10　알킬페닐, ­C(O)C1-C10　할로알킬, ­OC(O)C1-C10　알킬, -SO2(C1-C10　알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10　할로알킬), -SO2NH2, ­SO2NH(C1-C10　알킬), ­SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10　알킬), -NHSO2(페닐), 및 ­NHSO2(C1-C10　할로알킬)로 이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있고;
각 S1 은 독립적으로 M1이고, 상기 활성 히드록실이 존재한다면 히드록실 보호기로 보호되고;
각 M1 은 독립적으로 세포 표면의 수용체에 결합할 수 있는 리간드 중에서 선택된다.
일부 실시 태양에서, 각 L1 은 독립적으로 A1-A26 군 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다:
상기 각 j1은 독립적으로 1 -20의 정수이며;
상기 각 j2은 독립적으로 1-20의 정수이며;
각 R' 은 독립적으로 C1-C10 알킬이며;
각 Ra 는 A27-A45 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다:
각 Rb는 독립적으로 C1-C10 알킬이며;
는 기가 나머지 분자구조에 부착되는 위치를 나타낸다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명은 화학식 (1)로 표현되는 구조를 갖는 접합체를 제공한다:
화학식 (1),
상기,
n1은 1-3의 정수이고, n3은 0-4의 정수이며;
각 m1, m2 및 m3 는 독립적으로 2-10의 정수이고;
각 R10, R11, R12, R13, R14 및 R15는H, C1 -C10　알킬, C1-C10　할로알킬, 및 C1-C10　알콕시로부터 독립적으로 선택되며;
R3 는 활성 약물이고;
R2 는 1내지 20개의 탄소 원자 길이의 선형 알킬렌이고, 상기 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10　알케닐렌, C2-C10　알키닐렌, C6-C10　아릴렌, C3-C18　헤테로사이클릴렌(heterocyclylene), 및 C5-C10　헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있고, 상기 R2 는 선택적으로 C1-C10　알킬, C6-C10　아릴, C5-C10　헤테로아릴, C1-C10　할로알킬, ­OC1-C10　알킬, ­OC1-C10　알킬페닐, -C1-C10　알킬­OH, ­OC1-C10　할로알킬, ­SC1-C10　알킬, ­SC1-C10　알킬페닐, -C1-C10　알킬­SH, ­SC1-C10　할로알킬, 할로, ­OH, -SH, ­NH2, ­C1-C10　알킬­NH2, ­N(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬), ­NH(C1-C10　알킬), ­N(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬페닐), ­NH(C1-C10　알킬페닐), 시아노, 니트로, ­CO2H, ­C(O)OC1-C10　알킬, ­CON(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬), ­CONH(C1-C10　알킬), ­CONH2, ­NHC(O)(C1-C10　알킬), ­NHC(O)(페닐), ­N(C1-C10　알킬)C(O)(C1-C10　알킬), ­N(C1-C10　알킬)C(O)(페닐), ­C(O)C1-C10　알킬, ­C(O)C1-C10　알킬페닐, ­C(O)C1-C10　할로알킬, ­OC(O)C1-C10　알킬, -SO2(C1-C10　알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10　할로알킬), -SO2NH2, ­SO2NH(C1-C10　알킬), ­SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10　알킬), -NHSO2(페닐), 및 ­NHSO2(C1-C10　할로알킬)로 이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있고;
각 L1 은 1내지 70개의 탄소 원자 길이의 선형 알킬렌이고, 상기 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10　알케닐렌, C2-C10　알키닐렌, C6-C10　아릴렌, C3-C18　헤테로사이클릴렌(heterocyclylene), 및 C5-C10　헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있고, 상기 L1 은 선택적으로 C1-C10　알킬, C6-C10　아릴, C5-C10　헤테로아릴, C1-C10　할로알킬, ­OC1-C10　알킬, ­OC1-C10　알킬페닐, -C1-C10　알킬­OH, ­OC1-C10　할로알킬, ­SC1-C10　알킬, ­SC1-C10　알킬페닐, -C1-C10　알킬­SH, ­SC1-C10　할로알킬, 할로, ­OH, -SH, ­NH2, ­C1-C10　알킬­NH2, ­N(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬), ­NH(C1-C10　알킬), ­N(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬페닐), ­NH(C1-C10　알킬페닐), 시아노, 니트로, ­CO2H, ­C(O)OC1-C10　알킬, ­CON(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬), ­CONH(C1-C10　알킬), ­CONH2, ­NHC(O)(C1-C10　알킬), ­NHC(O)(페닐), ­N(C1-C10　알킬)C(O)(C1-C10　알킬), ­N(C1-C10　알킬)C(O)(페닐), ­C(O)C1-C10　알킬, ­C(O)C1-C10　알킬페닐, ­C(O)C1-C10　할로알킬, ­OC(O)C1-C10　알킬, -SO2(C1-C10　알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10　할로알킬), -SO2NH2, ­SO2NH(C1-C10　알킬), ­SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10　알킬), -NHSO2(페닐), 및 ­NHSO2(C1-C10　할로알킬)로 이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있고;
각 M1 은 독립적으로 세포 표면의 수용체에 결합할 수 있는 리간드의 하나에서 선택된다.
일부 실시 태양에서, 각 L1 은 A1-A26 군 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다:
상기 각 j1은 독립적으로 1-20의 정수이고;
각 j2은 독립적으로 1-20 의 정수이며;
각 R'은 독립적으로 C1-C10 알킬이고;
각 Ra은 A27-A45 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다:
각 Rb는 독립적으로 C1-C10 알킬이고;
는 기가 분자의 나머지에 부착되는 위치를 나타낸다.
일부 실시 태양에서, 본원에서 제공되는 접합체는 생체 내에서 올리고뉴클레오티드의 더 높은 전달 효율, 더 낮은 독성, 더 높은 안정성, 및/또는 더 높은 활성을 가진다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 표적 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 유의한 표적 외(off-target) 효과를 보이지 않는다.
본원 개시의 일부 실시 태양에 따르면, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 siRNA를 간에 효과적으로 전달하며, HBV 유전자 발현 억제에 우수한 특성을 보인다.
본원 개시의 한 실시 태양에 따르면, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 siRNA을 간에 효과적으로 전달하고, HBV 유전자 발현 억제에 우수한 특성을 보인다.
본원 개시의 한 실시 태양에 따르면, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 siRNA를 간에 효과적으로 전달하며, ANGPTL3 유전자 발현 억제에 우수한 특성을 보인다.
본원 개시의 한 실시 태양에 따르면, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 siRNA를 간에 효과적으로 전달하며, APOC3 유전자 발현 억제에 우수한 특성을 보인다.
일부 실시 태양에서, 본원 개시에 의해 설명되는 접합체는 동물 모델에서 낮은 독성을 나타내고 이것은 우수한 안전성을 나타낸다.
상기 예는 본원에서 제공된 접합체가 세포 표면 수용체를 표적화하고 로딩 활성제를 수용체를 발현하는 세포에 전달하는데 효과적이라는 것을 보여준다. 접합 분자는 이러한 수용체를 발현하는 세포에 활성제를 표적화하기 위한 추가 세포 표면 수용체와 추가 활성제에도 적합할 것으로 예상된다.
본 발명의 추가적인 특징과 장점은 이하에 자세히 설명될 것이다.
도 1a 및 도 1b 는 시험관 내 트리토좀에서 siRNA 접합체의 안정성 시험의 반 정량적 결과를 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 시험관 내 인간 혈장에서 siRNA 접합체의 안정성 시험의 반 정량적 결과를 보여준다.
도 3a 및 도 3b는 시험관 내 원숭이 혈장에서 siRNA 접합체의 안정성 시험의 반 정량적 결과를 보여준다.
도 4 내지 도 11은 시간 경과에 따른 PK/TK 혈장 또는 조직 농도를 나타내는 물질대사 프로파일이다. 접합체 24를 래트의 혈장에 10 mg/kg 용량 투여(도 4); 접합체 24를 래트의 간과 신장에 10 mg/kg 용량 투여 (도 5); 접합체 24를 래트의 혈장에 50 mg/kg 용량 투여 (도 6); 접합체 24를 래트의 간과 신장에 50 mg/kg 용량 투여 (도 7); 접합체 25를 래트의 혈장에 10 mg/kg 용량 투여 (도 8); 접합체 25를 래트의 간과 신장에 10 mg/kg 용량 투여 (도 9); 접합체 25를 쥐의 혈장에 50 mg/kg 용량 투여 (도 10); 접합체 25를 래트의 간과 신장에 50 mg/kg 용량 투여 (도 11).
도 12a, 도 12b, 도 12c, 및 도 12d 는 GSSM, PSCM및 PSSM 각각과 대비했을 때 GSCM 발현을 억제하는데 있어서 접합체 24의 IC50 값의 결정을 나타낸다.
도 13 내지 도 15 는 생체 내에서 본원에 개시된 접합체에 의한 HBV mRNA억제를 나타낸다.
도 16은 본원에 개시된 접합체에 의하여 HBV유전자 이식 쥐의 혈청에서 시간에 따른 HBsAg 발현 억제를 나타낸다.
도 17은 본원에 개시된 접합체에 의하여 HBV유전자 이식 쥐의 혈청에서 시간에 따른 HBV DNA 발현 억제를 나타낸다
도 18은 본원에 개시된 접합체 25에 의하여 HBV유전자 이식 쥐의 혈청에서 시간에 따른 HBsAg 발현 억제를 나타낸다.
도 19는 본원에 개시된 접합체에 의하여 M-Tg 모델에서 시간에 따른 HBsAg 발현 억제를 나타낸다.
도 20은 본원에 개시된 접합체에 의하여 M-Tg 모델에서 시간에 따른 HBsAg 발현 억제를 나타낸다.
도 21은 본원에 개시된 접합체에 의하여 1.28 카피 HBV-Tg 모델에서 시간에 따른 HBsAg 발현 억제를 나타낸다.
도 22 내지 도 24는 본원에 개시된 접합체의 표적 mRNA 대비 표적 외 mRNA 에 대한 억제를 나타낸다.
도 25 내지 도 27은 생체 내에서 본원에 개시된 접합체의 HBV mRNA에 대한 억제를 나타낸다.
도 28은 본원에 개시된 접합체에 의하여 HBV유전자 이식 쥐의 혈청에서 시간에 따른 HBsAg 발현 억제를 나타낸다.
도 29는 본원에 개시된 접합체에 의하여 HBV유전자 이식 쥐의 혈청에서 시간에 따른 HBsAg 발현 억제를 나타낸다.
도 30은 생체 내에서 본원에 개시된 접합체에 의한 D85에서 HBV mRNA의 억제를 나타낸다.
도 31은 본원에 개시된 접합체 43에 의하여 HBV유전자 이식 쥐의 혈청에서 시간에 따른 HBsAg 발현 억제를 나타낸다
도 32는 본원에 개시된 접합체 43에 의하여 HBV유전자 이식 쥐의 혈청에서 시간에 따른 HBV DNA 발현 억제를 나타낸다
도 33 및 도 34는 인간 유래 및 쥐 유래 리소좀 용해물에서의 접합체 167의 안정성을 나타낸다.
도 35는 본원에 개시된 접합체 168에 의하여 1.28 카피 HBV-Tg 모델에서 시간에 따른 HBsAg 발현 억제를 나타낸다.
도 36은 본원에 개시된 접합체 168에 의하여 1.28 카피 HBV-Tg 모델에서 시간에 따른 HBeAg 발현 억제를 나타낸다.
도 37은 본원에 개시된 접합체 168에 의하여 1.28 카피 HBV-Tg 모델에서 시간에 따른 HBV DNA 발현 억제를 나타낸다
도 38a 및 도 38b는 D14 및 D28 에서 ANGPTL mRNA 발현 억제율을 나타낸다.
도 39a 및 도 39b는 본원에 개시된 접합체에 의한 혈청에서 총 콜레스테롤 (CHO) 및 중성지방(TG)으로 표시되는 혈액 지질의 억제율을 나타낸다.
도 40a 및 도 40b 는 접합체 115에 의해 혈청에서 총 콜레스테롤 (CHO) 및 중성지방(TG)로 표시되는 혈액 지질의 시간에 따른 억제율을 도시한다.
도 41a 및 도 41b 는 접합체 115 및 111에 의해 혈청에서 총 콜레스테롤(CHO) 및 중성지방(TG)로 표시되는 혈액 지질의 시간에 따른 억제율을 도시한다.
도 42a, 도 42b, 도 42c 및 도 42d는 접합체 111를 상이한 용량으로 투여했을 때 혈청에서 총 콜레스테롤 (CHO) 및 중성지방 (TG)로 표시되는 혈액 지질의 시간에 따른 억제 비율을 도시한다.
도 43a 및 도 43B 는 접합체 25 및 169 의해 혈청에서 총 콜레스테롤 (CHO) 및 중성지방(TG)로 표시되는 혈액 지질의 시간에 따른 억제 비율을 도시한다. 그리고 도 43c 는 ANGPTL mRNA 발현 억제율을 나타낸다.
도 44a는 14D에 간에서 APOC3 발현의 억제 비율을 도시 한 것이다. 도 44b 및 도 44c는 상이한 용량으로 접합체 144에 의해 혈청 중 총 콜레스테롤 (CHO) 및 중성지방(TG)로 표시되는 혈액 지질의 억제 비율을 도시한다.
도 45a 및 도 45b는 접합체 170를 상이한 용량으로 투여했을 때 혈청 중 총 콜레스테롤 (CHO) 및 중성지방 (TG)로 표시되는 혈액 지질의 억제 비율을 도시한다.
도 46a, 도 46b, 도 46c 및 도 46d는 본원에 개시된 접합체에 의해 혈청에서 총 콜레스테롤 (CHO) 및 중성지방 (TG)로 표시되는 혈액 지질의 억제 비율을 나타낸다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함된 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구 범위에 구체적으로 제시된다. 본 발명의 원리를 이용한 실시예를 제시하는 하기 상세한 설명과 첨부 도면을 참조로 하여 본 발명의 특징과 장점에 대한 더 나은 이해가 가능할 것이다.
이하, 본 발명의 구체적인 실시태양을 상세히 기술한다. 본 명세서에 기재된 상세한 실시태양은 본 발명을 예시하고 설명하기 위해서만 사용되며 임의의 측면에서 본 발명을 제한하기 위한 용도가 아니라는 것이 이해되어야 할 것이다.
정의
본원 개시의 문맥에서, 달리 명시되지 않는 한 대문자 C, G, U 및 A는 뉴클레오티드의 염기 조성을 나타내고; 소문자 m은 문자 m의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 2'- 메톡시 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; 소문자 f는 문자 f의 좌측에 인접한 뉴클레오티드가 2'- 플루오르 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; 소문자 s는 문자 s의 양쪽에 인접한 두 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; P1은 P1의 우측에 인접한 뉴클레오티드가 5'- 포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'- 포스페이트 유사체에 의한 변성 뉴클레오티드, 특히 비닐 포스페이트에 의해 변성 뉴클레오티드 (하기 실시예에서 VP로 표현), 5’-포스페이트 뉴클레오티드(하기 실시예에서 P로 표현), 또는 5’-티오포스페이트에 의해 변성된 뉴클레오티드(하기 실시예에서 Ps로 표현)임을 나타낸다.
본원 개시의 문맥에서, "상보적" 및 "역 상보적"이라는 표현은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 당 업계에 널리 공지된 의미를 가지며, 즉 이중 가닥 핵산 분자에서 한 가닥의 염기는 다른 가닥의 염기와 각각 상보적으로 쌍을 이룬다. DNA에서 퓨린 염기 아데닌 (A)은 항상 피리미딘 염기 티민 (T) (또는 RNA에서 우라실 (U))과 쌍을 이룬다; 퓨린 염기 구아닌 (G)은 항상 피리미딘 염기 시토신 (C)과 쌍을 이룬다. 각 염기쌍은 퓨린 및 피리미딘을 포함한다. 한 가닥의 아데닌은 항상 다른 가닥의 티민 (또는 우라실)과 쌍을 이루고 구아닌은 시토신과 쌍을 이룰 때, 두 가닥은 상보적인 것으로 간주된다. 한 가닥의 염기 서열은 그의 상보적 가닥의 서열로부터 추론될 수 있다. 따라서,“염기쌍오류(mispairing)”는 이중가닥 핵산에서 해당 위치에 상보적 쌍(pair)이 존재하지 않는 염기를 의미한다.
본원 개시의 문맥에서 달리 명시되지 않는 한, "기본적으로 역 상보적"은 2 개의 뉴클레오티드 서열에서 3 개 이하의 염기쌍오류를 의미한다. "실질적으로 역 상보적"은 2 개의 뉴클레오티드 서열에서 1 개 이하의 염기쌍오류를 의미한다. "완전히 역 상보적인"은 2 개의 뉴클레오티드 서열에서 염기쌍오류가 없음을 의미한다.
본원 개시의 문맥에서, 뉴클레오티드 서열과 다른 서열 사이의 "뉴클레오티드 차이"는 그들 사이의 동일 위치에서 뉴클레오티드 염기의 변화를 지칭한다. 예를 들어, 제 2 서열의 뉴클레오티드 염기가 A 인 반면, 제 1 서열의 동일한 위치의 염기가 U, C, G 또는 T 인 경우, 2 개의 서열 사이의 위치에 뉴클레오티드 차이가 존재하는 것으로 간주된다. 일부 실시 태양에서, 한 위치의 뉴클레오티드가 비염기성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체로 대체되는 것 또한 해당 위치에 뉴클레오티드 차이가 있는 것으로 간주된다.
본원 개시의 문맥에서, 특히 본 발명에 기재된 접합 분자 또는 siRNA 접합체를 제조하는 방법의 설명에서, 달리 명시되지 않는 한, RNA서열 제조 방법에 따라, "뉴클레오시드 단량체"또는 "복수의 뉴클레오시드 단량체"는 "비변성 또는 변성 RNA 포스포라미다이트", 또는 "복수의 비변성 또는 변성된 RNA 포스포라미다이트" 를 나타낸다. 이들은 각각 RNA 합성을 위해 당 업계에 널리 공지된 소위 "고상 포스포라미다이트 합성"에 이용된다. RNA 포스포라미다이트는 또한 다른 부분에서 뉴클레오시드 포스포라미다이트로 지칭된다. 본 발명의 설명에 사용된 뉴클레오시드 단량체는 모두 상업적으로 입수 가능하다.
본원에서 사용된, 두 영문자나 기호 사이에 위치하지 않은 대시기호("-")는 치환기가 부착되는 지점을 표시하는데 사용된다. 예를 들어, ­C1-C10 알킬­NH2 은 C1-C10 알킬을 통해 부착된다.
본원에서 사용된 "선택적" 또는 "선택적으로"는 후술되는 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있고, 이 설명은 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 그렇지 않은 경우를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, "선택적으로 치환된 알킬"은 하기 정의된 "알킬" 및 "치환된 알킬"모두를 포함한다. 하나 이상의 치환기를 포함하는 임의의 기와 관련하여 이러한 기는 입체적으로 비현실적이거나, 합성 불가하거나, 및/또는 본질적으로 불안정한 임의의 치환 또는 치환 패턴을 도입하려는 것이 아님이 당업자 수준에서 이해될 것이다
본원에서 사용된, "알킬(alkyl)"은 표시된 수의 탄소원자를 가진 선형 사슬 또는 가지 사슬을 의미한다. 주로 1 내지 20개의 탄소원자이며 예를 들자면 1 내지 10의 탄소원자나 1 내지 8 또는 1 내지 6의 탄소원자이다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 탄소 원자 1 에서 6개의 선형 또는 가지 사슬 알킬을 모두 포함한다. 특정 개수의 탄소를 가진 알킬 잔기가 명명될 때 지정된 수의 탄소를 가지는 모든 선형 또는 가지 사슬이 포함되고; 따라서 예를 들어 “부틸”은, n-부틸, sec- 부틸, iso 부틸 및 t-부틸을 포함하고; "프로필" 은 n-프로필 및 이소프로필을 포함한다. 알킬렌(Alkylene)은 알킬과 동일한 잔기를 가지나 2개의 부착점을 갖는 알킬의 일종이다.
본원에서 사용된, “알케닐(alkenyl)”은 모 알킬의 인접한 탄소 원자로부터 하나의 수소 분자를 제거함으로써 생성된 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화 가지 또는 직선 알킬기를 지칭한다. 알케닐기는 이중 결합(들)을 기준으로 시스 또는 트랜스 배열 일 수있다. 다음 기재에 한정되지 않지만 전형적인 알케닐 기는 에테닐, 프로페닐로써 프로프(prop)-1-엔(en)-1-일(yl), 프로프(prop)-1-엔(en)-2-일(yl), 프로프(prop)-2-엔(en)-1-일(yl) (allyl), 프로프(prop)-2-엔(en)-2-일(yl); 부테닐로써 부트(but)-1-엔(en)-1-일(yl), 부트(but)-1-엔(en)-2-일(yl), 2-메틸- 프로프(prop)-1-엔(en)-1-일(yl), 부트(but)-2-엔(en)-1-일(yl), 부트(but)-2-엔(en)-1-일(yl), 부트(but)-2-엔(en)-2-일(yl), 부타(buta)-1,3-디엔(dien)-1-일(yl), 부타(buta)-1,3-디엔(dien)-2-일(yl); 같은 것이 있다. 특정 실시 태양에서, 알케닐기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가지고 있고, 다른 실시 태양에서는 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6의 탄소원자를 가지고 있다. 알케닐렌(Alkenylene)은 알케닐과 동일한 잔기를 가지나 2개의 부착점을 갖는 알케닐의 일종이다.
본원에서 사용된 "알키닐(alkynyl)" 모 알킬의 인접한 탄소 원자로부터 2개의 수소 분자를 제거함으로써 유도된 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화 가 지형 또는 선형 알킬기를 지칭한다. 다음 기재에 한정되지 않지만 전형적인 알키닐기는 에티닐; 프로피닐, 예컨대 프로프(prop)-1-인(yn)-1-일(yl), 프로프(prop)-2-인(yn)-1-일(yl); 부타닐로써 부트(but)-1-인(yn)-1-일(yl), 부트(but)-1-인(yn)-3-일(yl), 부트(but)-3-인(yn)-1-일(yl); 특정 실시 태양에서 알키닐기는 2 내지 20 개의 탄소 원자이고, 다른 실시 태양에서는 2 내지 10, 2 내지 8 또는 2 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는다. 알키닐렌(Alkynylene)은 알키닐과 동일한 잔기를 지칭하지만 2개의 부착점을 갖는 알키닐의 일종이다.
본원에서 사용된 "알콕시(alkoxy)"는 산소 가교(bridge)를 통해 부착된 지시된 수의 탄소 원자의 알킬기를 지칭하고, 예시로 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n- 부톡시, 2차- 부톡시, 3차- 부톡시, 펜틸옥시, 2- 펜틸옥시, 이소펜틸옥시, 네오펜틸옥시, 헥실옥시, 2- 헥실옥시, 3- 헥실옥시, 3- 메틸펜틸옥시 등이 있다. 알콕시 기는 일반적으로 산소 가교를 통해 부착된 1 내지 10 개, 1 내지 8 개, 1 내지 6 개, 또는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 가진다.
본원에서 사용된, "아릴(aryl)"은 고리 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 방향족 모노 사이클릭 또는 멀티 사이클릭 탄화수소 고리 시스템으로부터 유도된 라디칼을 지칭한다. 방향족 모노 사이클릭 또는 멀티 사이클릭 탄화수소 고리 시스템은 6 내지 18 개의 탄소 원자와 수소만을 함유하며, 고리 시스템에서 하나 이상의 고리는 완전히 불포화되어있다. 즉, 휘켈(Huckel) 이론에 따른 고리형이고 비 편재화된 (4n + 2) π- 전자 시스템을 포함한다. 아릴기는 페닐, 플루오레닐 및 나프틸과 같은기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 아릴렌(Arylene)은 아릴과 동일한 잔기를 지칭하지만 2 개의 부착점을 갖는 아릴의 일종이다.
본원에서 사용된, "사이클로알킬(cycloalkyl)" 은 비 방향족 카보사이클릭 고리를 말하며, 일반적으로 3 내지 7 개의 고리 탄소 원자를 갖는다. 고리는 포화되거나 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 가질 수있다. 사이클로알킬기의 예에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실 및 사이클로헥세닐뿐만 아니라 노르보르난(norbornane)과 같은 브릿지(bridge) 와 닫힌 고리를 가진 기가 포함된다.
본원에서 사용된, "할로(halo)" 또는 “할로겐(halogen)”은 플루오르(fluoro), 클로로(Chloro), 브로모(bromo) 및 요오드(iodo)를 지칭하고, "할로겐"이라는 용어는 불소(fluorine), 염소(chlorine), 브롬(bromine) 및 요오드(iodine)를 포함한다.
본원에서 사용된, "할로알킬(haloalkyl)" 1 개 이상부터 치환 가능한 최대 개수의 할로겐 원자로 치환된 지정된 수의 탄소 원자를 갖는 상기 알킬을 지칭한다. 할로알킬의 예에는 트리플루오르 메틸, 디플루오르 메틸, 2-플루오르 에틸 및 펜타-플루오르 에틸이 포함 되나, 이에 제한되지는 않는다.
“헤테로사이클릴(Heterocyclyl)"은 2 내지 12 개의 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1 내지 6 개의 이종 원자를 포함하는 안정적인 3- 내지 18 원자-(membered) 비 방향족 환형 라디칼을 지칭한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 헤테로사이클릴 라디칼은 단환식, 이환식, 삼환식 또는 사환식 고리 시스템이며, 이는 융합 또는 가교(bridged) 고리 시스템을 포함 할 수있다. 헤테로사이클릴 라디칼의 헤테로 원자는 임의로 산화될 수 있다. 하나 이상의 질소 원자가 존재하는 경우에는 선택적으로 4급화(quaternized)된다. 헤테로사이클릴 라디칼은 부분적으로 또는 완전히 포화된다. 헤테로사이클릴은 고리(들)의 임의의 원자를 통해 나머지 분자에 부착될 수있다. 이러한 헤테로사이클릴 라디칼의 예는 디옥솔라닐(dioxolanyl), 티에닐[1,3]디티아닐(thienyl[1,3]dithianyl), 데카히드로이소퀴놀릴(decahydroisoquinolyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 이미다졸리디닐(imidazolidinyl), 이소티아졸리디닐(isothiazolidinyl), 이속사졸리디닐(isoxazolidinyl), 모르폴리닐(morpholinyl), 옥타히드로인돌릴(octahydroindolyl), 옥타히드로이소인돌릴(octahydroisoindolyl), 2-옥소피페라지닐(2-oxopiperazinyl), 2-옥소피페리디닐(2-oxopiperidinyl), 2-옥소피롤리디닐(2-oxopyrrolidinyl), 옥사졸리디닐(oxazolidinyl), 피페리디닐(piperidinyl), 피페라지닐(piperazinyl), 4-피페리도닐(4-piperidonyl), 피롤리디닐(pyrrolidinyl), 피라졸리다닐(pyrazolidinyl), 퀴누클리디닐(quinuclidinyl), 티아졸리디닐(thiazolidinyl), 테트라히드로퓨릴(tetrahydrofuryl), 트리티아닐(trithianyl), 테트라히드로피라닐(tetrahydropyranyl), 티오모르폴리닐(thiomorpholinyl), 티아모르폴리닐(thiamorpholinyl), 1-옥소-티오모르폴리닐(1-oxo-thiomorpholinyl), 및 1,1-디옥소-티오모르폴리닐(1,1-dioxo-thiomorpholinyl)이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다
"헤테로아릴(Heteroaryl)"은 2 내지 17 개의 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1 내지 6 개의 이종 원자를 포함하는 3- 내지 18- 원자(membered) 방향족 고리 라디칼로부터 유도된 라디칼을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같이, 헤테로 아릴 라디칼은 단환식, 이환식, 삼환식 또는 사환식 고리 시스템이며 일 수 있으며, 상기 환 시스템에서 하나 이상의 환은 완전히 불포화되어있다. 즉, 휘켈(Huckel) 이론에 따른 고리형이고 비 편재화된 (4n + 2) π-전자 시스템을 포함한다. 헤테로아릴은, 이는 융합 또는 가교(bridged) 고리 시스템을 포함할 수 있다. 헤테로 아릴 라디칼에서 헤테로 원자 (들)는 임의로 산화된다. 하나 이상의 질소 원자가 존재하는 경우에는 선택적으로 4급화(quaternized)된다 헤테로 아릴은 고리(들)의 임의의 원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착된다. 헤테로 아릴의 예로는 아제피닐(azepinyl), 아트리디닐(acridinyl), 벤지미다졸릴(benzimidazolyl), 벤진돌릴(benzindolyl), 1,3-벤조다이옥소릴(1,3-benzodioxolyl), 벤조퓨라닐(benzofuranyl), 벤조옥사조릴(benzooxazolyl), 벤조[d]티아조릴(benzo[d]thiazolyl), 벤조티아디아조릴(benzothiadiazolyl), 벤조[b][1,4]디옥세피닐(benzo[b][1,4]dioxepinyl), 벤조[b][1,4]옥세피닐(benzo[b][1,4]oxazinyl), 1,4-벤조디옥사닐(1,4-benzodioxanyl), 벤조나프토퓨라닐(benzonaphthofuranyl), 벤조옥사조릴(benzoxazolyl), 벤조디옥사조릴(benzodioxolyl), 벤조디옥시닐(benzodioxinyl), 벤조피라닐(benzopyranyl), 벤조피라노닐(benzopyranonyl), 벤조퓨라닐(benzofuranyl), 벤조퓨라노닐(benzofuranonyl), 벤조티에닐(benzothienyl), (벤조티오페닐(benzothiophenyl)), 벤조티에노[3,2-d]피리미디닐(benzothieno[3,2-d]pyrimidinyl), 벤조트리아조릴(benzotriazolyl), 벤조[4,6]이미다조[1,2-a]피리디닐(benzo[4,6]imidazo[1,2-a]pyridinyl), 카르바조릴(carbazolyl), 시놀리닐(cinnolinyl), 사이클로펜타[d]피리미디닐(cyclopenta[d]pyrimidinyl), 6,7-디히드로-5H-사이클로펜타[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐(6,7-dihydro-5H-cyclopenta[4,5]thieno[2,3-d]pyrimidinyl), 5,6-디히드로벤조[h]퀴나졸리닐(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl), 5,6-디히드로벤조[h]신놀리닐(5,6-dihydrobenzo[h]cinnolinyl), 6,7-디히드로-5H-벤조[6,7] 사이클로헵타[1,2-c]피리다지닐(6,7-dihydro-5H-benzo[6,7]cyclohepta[1,2-c]pyridazinyl), 디벤조퓨라닐(dibenzofuranyl), 디벤조티오(dibenzothio), 푸라닐(furanyl), 푸라노닐(furanonyl), 푸로[3,2-c]피리디닐(furo[3,2-c]pyridinyl), 5,6,7,8,9,10-헥사히드로사이클로옥타[d]피리미디닐(5,6,7,8,9,10-hexahydrocycloocta[d]pyrimidinyl), 5,6,7,8,9,10-헥사히드로사이클로옥타[d]피리다지닐(5,6,7,8,9,10-hexahydrocycloocta[d]pyridazinyl) 5,6,7,8,9,10-헥사히드로사이클로옥타[d]피리디닐(5,6,7,8,9,10-hexahydrocycloocta[d]pyridinyl), 이소티아졸릴(isothiazolyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 인다졸릴(indazolyl), 인돌릴(indolyl), 인다졸릴(indazolyl), 이소인돌릴(isoindolyl), 인돌리닐(indolinyl), 이소인돌리닐(isoindolinyl), 이소퀴놀릴(isoquinolyl), 인돌리지닐(indolizinyl), 이속사졸릴(isoxazolyl), 5,8-메타노-5,6,7,8-테트라히드로퀴나졸리닐(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl), 나프티리디닐(naphthyridinyl), 1,6-나프티리디노닐(1,6-naphthyridinonyl), 옥사디아졸릴(oxadiazolyl), 2-옥소아제피닐(2-oxoazepinyl), 옥사졸릴(oxazolyl), 옥시 라닐(oxiranyl), 5,6,6a,7,8,9,10,10a-옥타히드로벤조[h]퀴나졸리닐(5,6,6a,7,8,9,10,10a-octahydrobenzo[h]quinazolinyl), 1-페닐-1H-피롤릴(1-phenyl-1H-pyrrolyl),페나지닐(phenazinyl), 페노티아지닐(phenothiazinyl), 페녹사지닐(phenoxazinyl), 프탈라지닐(phthalazinyl), 프테리티닐(pteridinyl), 퓨리닐(purinyl), 피롤릴(pyrrolyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 피라졸로[3,4-d] 피리미디닐(pyrazolo[3,4-d]pyrimidinyl), 피리디닐(pyridinyl), 피리도[3,2-d]피리미디닐(pyrido[3,2-d]pyrimidinyl), 피리도[3,4-d]피리미디닐(pyrido[3,4-d]pyrimidinyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 피리다지닐(pyridazinyl), 피롤릴(pyrrolyl), 퀴나졸리닐(quinazolinyl), 퀴녹살리닐(quinoxalinyl), 퀴놀리닐(quinolinyl), 이소퀴놀리닐(isoquinolinyl), 테트라히드로퀴놀리닐(tetrahydroquinolinyl), 5,6,7,8-테트라히드로퀴나졸리닐(5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl), 5,6,7,8-테트라히드로벤조[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐 (5,6,7,8-tetrahydrobenzo[4,5]thieno[2,3-d]pyrimidinyl), 6,7,8,9-테트라히드로-5H-사이클로헵타[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐(6,7,8,9-tetrahydro-5H-cyclohepta[4,5] thieno[2,3-d]pyrimidinyl), 5,6,7,8-테트라히드로피리도[4,5-c]피리다지닐(5,6,7,8-tetrahydropyrido[4,5-c]pyridazinyl), 티아졸릴(thiazolyl), 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 트리아졸릴(triazolyl), 테트라졸릴(tetrazolyl, 트리아지닐(triazinyl), 티에노[2,3-d 피리미디닐(thieno[2,3-d]pyrimidinyl), 티에노[3,2-d] 피리미디닐(thieno[3,2-d]pyrimidinyl), 티에노[2,3-c]프리디닐(thieno[2,3-c]pridinyl), 및 티오페닐(thiophenyl) (즉, 티에닐(thienyl))이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
다양한 히드록실 보호기가 본 발명에 사용될 수 있다. 일반적으로, 보호기는 화학적 작용기가 특정 반응 조건에 대해 불활성이 되게 하며, 분자의 나머지를 실질적으로 손상시키지 않으면서 분자의 이러한 작용기에 첨가되거나 제거될 수 있다. 대표적인 히드록실 보호그룹은 Beaucage, et al.,Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311 및 Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 2, 2d ed, John Wiley & Sons, New York, 1991,에 의해 개시되어있는데, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시 태양에서, 보호기는 염기성 조건 하에서 안정하지만 산성 조건 하에서 제거될 수있다. 일부 실시 태양에서, 본원에서 사용될 수있는 히드록실 보호기의 비 독점적 예에는 디메톡시트리틸(DMT), 모노메톡시트리틸, 9-페닐잔텐-9-일(yl)(픽실(Pixyl)) 및 9-(p-메톡시페닐)잔텐-9-일(yl)(Mox)이 포함된다. 일부 실시 태양에서, 본원에 사용될 수 있는 히드록실 보호기의 비 독점적 예는 Tr(트리틸), MMTr(4- 메톡시트리틸), DMTr(4, 4'-디메톡시트리틸) 및 TMTr(4, 4', 4”-트리메톡시트리틸)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 동물, 예를 들어 포유동물 또는 유대류를 지칭한다. 본 발명의 대상은 인간, 비인간 영장류 (예를 들어, 히말라야 원숭이 혹은 마카크(아프리카-아시아원숭이)), 쥐, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 래트 및 모든 종류의 가금류를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된, "치료(treatment)" 또는 "치료(treating)", 또는 "완화" 또는 "개선"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이들 용어는 유익한 또는 바람직한 결과를 얻기 위한 접근법을 지칭하며 치료적 이점을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "치료적 이점"은 치료 대상인 기저 질환의 근절 또는 개선을 의미한다. 또한, 환자는 여전히 기저 질환에 시달릴 수 있음에도 불구하고, 환자에게서 이러한 기저 질환과 관련된 하나 이상의 생리학적 증상의 근절 또는 개선이 관찰된다면 치료적 이점이 달성된다.
본원에 사용된 "예방(prevention)" 및 "예방(preventing)"은 상호 교환적으로 사용된다. 이들 용어는 유익하거나 바람직한 결과를 얻기위한 접근법을 지칭하며 예방적 이점을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. “예방적 이점"의 경우, 접합체 또는 조성물은 특정 질환이 발병할 위험이 있는 환자에게 또는 이 질환의 진단이 없을 수 있지만 질환의 하나 이상의 생리학적 증상을 나타내는 환자에게 투여될 수 있다.
접합 분자(Conjugating molecules)
한 측면에서, 활성제 또는 활성제를 전달하기 위한 접합 분자가 본 발명에 개시된다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합 분자는 조직 특이적 표적화에 유용하다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합 분자는 세포 표면 수용체에 결합한다. 이를 위해, 임의의 세포 표면 수용체 또는 바이오 마커 또는 분획이 알맞을 것으로 예상된다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합 분자는 특정 조직의 고유한 수용체에 특이적으로 결합하여 조직 특이적 표적화를 달성한다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합 분자는 간세포 표면 수용체를 특이적으로 표적화해서 간 조직을 특이적으로 표적화한다. 일부 실시예에서, 본원에 개시된 접합 분자는 간 세포의 고유의 세포표면 수용체를 특이적으로 표적화한다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합 분자는 간 표면 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)를 특이적으로 표적화한다.
본원에 사용된 "활성제"는 용어 "활성 약물"과 상호 교환적으로 사용되며, 둘다 본원에 개시된 접합 분자에 의해 전달될 수 있는 분자를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 활성제는 간세포로의 작용제 전달이 요구된다. 이러한 작용제는 당업자에게 공지되어 있으며, 특히 본원에 기재된 기능성 올리고뉴클레오티드와 같은 기능성 뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시 태양에서, 본원의 개시는 하기 화학식 (321)로 표현되는 구조를 갖는 접합 분자를 제공한다.
화학식 (321)
상기:
n1 은 1-3의 정수이고, n3은 0-4의 정수이며;
m1, m2 및 m3 각각은 독립적으로 2-10의 정수이고; 각 R10, R11, R12, R13, R14 및R15는 독립적으로 H, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시에서 선택되고;
R4 는 활성 약물 또는 활성제에 공유결합을 통해 결합할 수 있는 부분이고;
각 L1 은 1에서 70개의 탄소 원자 길이의 선형 알킬렌이고, 상기 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌(heterocyclylene), 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있고, 상기 L1 은 선택적으로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, ­OC1-C10 알킬, ­OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬­OH, ­OC1-C10 할로알킬, ­SC1-C10 알킬, ­SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬­SH, ­SC1-C10 할로알킬, 할로, ­OH, -SH, ­NH2, ­C1-C10 알킬­NH2, ­N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), ­NH(C1-C10 알킬), ­N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), ­NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, ­CO2H, ­C(O)OC1-C10 알킬, ­CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), ­CONH(C1-C10 알킬), ­CONH2, ­NHC(O)(C1-C10 알킬), ­NHC(O)(페닐), ­N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), ­N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), ­C(O)C1-C10 알킬, ­C(O)C1-C10 알킬페닐, ­C(O)C1-C10 할로알킬, ­OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, ­SO2NH(C1-C10 알킬), ­SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 ­NHSO2(C1-C10 할로알킬)이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있고;
각 S1 은 독립적으로 M1이고, 상기 활성 히드록실이 존재한다면 히드록실 보호기로 보호되고;
각 M1 은 독립적으로 세포 표면의 수용체에 결합할 수 있는 리간드 중에서 선택된다.
일부 실시 태양에서, n1은 1-3의 정수이고, 2 이상의 S1기가 접합 분자에 존재하는 것도록 하기 위해 n3은 0-4의 정수일 수 있다. 일부 실시 태양에서, n1+n3 ≥ 2이므로 접합 분자에 의해 형성되는 접합체 내에서 M1 리간드의 개수는 3개 이상일 수 있다. 그렇게 함으로써 M1 리간드가 더 용이하게 간세표 표면의 아시알로당단백질 수용체에 결합되며, 이것은 접합체가 세포에 들어가는 세포내 섭취를 촉진한다. 실험은 M1리간드의 수가 3보다 클 때에도, M1리간드가 간세포 표면의 아시알로당단백질 수용체에 결합하는 경향이 현저하게 증가하지 않는다는 것을 보여준다. 따라서, 합성 편의성, 건설/공정 비용, 전달 효율 등 여러 측면을 고려했을때, 일부 실시 태양에서, n1은 1-2의 정수이고, n3은 0-1의 정수이고, n1+n3 = 2-3일 수있다.
일부 실시 태양에서 m1, m2, 및 m3 이 각각 독립적으로 2 내지 10의 정수로 선택될 경우, 접합 분자에 의해 형성되는 접합체의 M1 리간드의 다수의 입체 자리가 M1 리간드가 간세포 표면의 아시알로당단백질 수용체와 결합하기에 적당하다. 이 명세서에서 제공하는 접합 분자를 간단하게 만들고, 합성의 편의성을 향상시키고 및/또는 비용을 줄이기 위해, 본원의 일부 실시 태양에서m1, m2 및 m3 은 각각 독립적으로 2-5의 정수일 수 있고, 일부 실시 태양에서 m1 = m2 = m3이다.
각 R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15 는 독립적으로 H, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시에서 선택되며, 본 발명의 목적인 본원에 개시된 접합 분자의 특성 변화가 없다는 점을 달성할 수 있다는 것을 당업자가 이해할 수 있을 것이다. 일부 실시 태양에서, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15 은 각각 독립적으로 H, 메틸 및 에틸에서 선택된다. 일부 실시 태양에서, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15 은 전부 H일 수 있다.
R4는 활성제에 결합 가능하여 본원에서 개시한 접합 분자에 의해 전달되는 부분이다. 일부 실시 태양에서, R4는 올리고뉴클레오티드에 결합 가능하여 본원에서 개시한 접합 분자에 의해 전달되는 부분이다. 일부 실시 태양에서, R4는 공유 결합을 통해 올리고뉴클레오티드에 결합 가능한 부분이다. 일부 실시 태양에서, R4 는 포스포디에스테르 결합을 통해 올리고뉴클레오티드에 결합 가능한 부분이다. 일부 실시 태양에서, R4는 질소 함유 골격의 질소 원자와 연결하기 위해서 및 올리고뉴클레오티드 접합체를 합성하기 위한 적합한 반응 위치를 제공하기 위해 선택된다. 본원 개시의 맥락에서, "질소 함유 골격"은 R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15 이 부착된 탄소원자와 질소 원자가 서로 연결된 사슬 구조를 가리킨다. 일부 실시 태양에서, R4는 적절한 방법으로 질소 함유 골격의 질소 원자와 부착되는 부분이다. 일부 실시 태양에서, R4는 질소 함유 골격의 질소 원자와 결합하는 부분과, 반응을 의한 포스포디에스테르 결합을 통해 올리고뉴클레오티드에 접합될 수 있는 임의의 작용기를 포함한다.
일부 실시 태양에서, R4는 올리고뉴클레오티드나 뉴클레오티드오상의 기와 포스페이트에스테르 결합을 이루며 반응할 수 있는 제 1 작용기와 히드록시기 또는 아미노기와 공유결합을 형성하는 제 2 작용기, 또는 공유결합을 통해 연결되는 고상 지지체를 포함한다. 일부 실시 태양에서, 제 1 작용기는 포스포아미다이트, 히드록시 또는 보호된 히드록시이다. 일부 실시 태양에서, 제 2 작용기는 포스포아미다이트, 카르복실, 또는 카르복실레이트 염이다. 일부 실시 태양에서, 제 2 작용기는 히드록시기 또는 아미노기에 의해 형성된 공유결합을 통해 나머지 분자에 부착되는 고상 지지체다. 일부 실시 태양에서, 고상 지지체는 포스포에스테르 결합, 카르복실에스테르 결합 또는 아미도 결합을 통해 부착된다. 일부 실시 태양에서, 고상 지지체는 수지이다.
일부 실시 태양에서, 제 1 작용기는 히드록시기, -ORk, 또는 화학식 (C3)에 의해 표현되는 기를 포함하고; 및/또한 제 2 작용기는 화학식 (C1), (C2), (C3), (C1'), 또는 (C3')로 표현되는 기를 포함한다:
상기 q1 은 1-4의 정수이고, X 는 O 또는 NH이며, M+ 은 양이온이고, Rk는 히드록시 보호기이며, SPS 는 고상 지지체를 나타내며, 는 기가 공유결합으로 부착하는 위치를 나타낸 것이다.
일부 실시 태양에서, 제 1 작용기는 화학식 (C3)으로 표현되는 것과 같은 포스포르아미다이트(phosphoramidite) 기를 포함한다. 포스포르아마이트 기는 2'- 또는 3'- 히드록시 같이 뉴클레오티드의 임의의 위치에서 히드록시와 짝지을 수 있으며, 올리고뉴클레오티드에 접합 분자의 접합을 위해 산화를 통해 포스페이트디에스테르 결합을 형성할 수 있고, 그래서 제 2 작용기가 존재하지 않더라도, 본원의 접합 분자는 뉴클레오티드와 접합할 수 있다.
일부 실시 태양에서, 제 1 작용기는 보호된 히드록시기를 포함한다. 일부 실시 태양에서, 제 2 작용기는 접합 분자가 고상 지지체를 포함하도록 하기 위해 고상 지지체에 반응하는 기를 포함한다. 일부 실시 태양에서, 제 2 작용기는 화학식 (C1), (C2) 또는 (C3)과 같은 카르복실, 카르복실레이트, 포스포르아미다이트를 포함한다. 카르복실, 카르복실레이트는 수지와 같은 고상 지지체 상 히드록시기 또는 아미노 기와 에스터화 또는 아미노화를 통해 반응하여 카르복실레이트 에스터 결합 또는 아미도 결합으로 고상 지지체를 포함하는 접합 분자를 형성한다. 포스포르아미다이트는 수지와 같은 범용 고상 지지체 상의 히드록시기와 결합할 수 있고, 후속 산화에 의한 포스포디에스터 결합으로 연결된 고상 지지체를 포함하는 접합 분자를 형성한다. 따라서, 발명의 한 측면에서, 접합 분자를 포함한 접합체를 제조하는 방법이 본 발명에서 제공된다. 일부 실시 태양에서, 접합 분자를 고상 지지체와 축합 또는 커플링 반응에 의해 제 1 결합을 구성한 다음, 고상 포스포르아미다이트 합성 방법을 통해 뉴클레오시드 단량체를 첨가한다. 이 방법을 통해 올리고뉴클레오티드에 접합된 접합 분자를 포함하는 본원에 개시된 접합체를 제공할 수 있다. 일부 실시 태양에서, 고상 포스포르아미다이트를 합성하는 동안, 커플링 상태에서 뉴클레오시드에 있는 포스포르아미다이트기가 커플링된 다음 제 1 작용기가 탈 보호된다.
일부 실시 태양에서, R4는 제 1 작용기와 제 2 작용기를 포함한다. 상기 제 1 작용기는 히드록시와 보호된 히드록시기를 포함하고, 제 2 작용기는 카복실레이트 에스터 결합, 아미도 결합 또는 포스포디에스테르 결합, 또는 카복실레이트 에스터 결합, 아미도 결합, 또는 포스포디에스테르 결합을 통해 연결되는 고상 지지체를 포함한다. 일부 실시 태양에서, 제 2 작용기는 화학식 (C1') 또는 (C3')로 표현되는 부분이다. 일부 실시 태양에서, 제 2 작용기가 고상 지지체를 포함시, 고상 지지체를 포함하는 접합 분자는 본 발명에서 개시된 접합체 제조에 유용하다. 따라서, 발명의 한 측면에서, 접합 분자를 이용하여 본원에 개시된 접합체를 제조하는 방법을 본 발명에서 제공한다. 일부 실시 태양에서, 고상 지지체를 포함하는 접합 분자를 고상 포스포르아미다이트 합성 방법에 따라 뉴클레오시드 단량체와 반응시켜, 상기 접합체의 접합 분자를 올리고뉴클레오티드에 제공한다. 일부 실시 태양에서, 고상 지지체를 포함하는 접합 분자는 카르복실, 카복실레이트 또는 포스포르아미다이트를 고상 지지체에서 접합 분자와 반응시켜서 접합 분자로부터 직접 제조될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 접합 분자는 공급자에 의해 공급 될 수 있다..
일부 실시 태양에서, 카복실레이트는 -COO-M+로 표현되며, 상기 M+ 는 양이온으로 금속 양이온, 암모늄 양이온 NH4 +, 혹은 유기 암모늄 양이온 일 수 있다. 일부 실시 태양에서, 금속 양이온은 알칼리 금속 양이온으로, 그 예는 K+ 또는 Na+이다. 용해도를 증가시키고 반응을 촉진하기 위하여, 일부 실시 태양에서, 유기 암모늄 양이온은 3차 아민 또는 4차 암모늄 이온에서 생성되는 암모늄 이온이다. 그 예는 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민에서 생성되는 암모늄 양이온이다. 일부 실시 태양에서, 카복실레이트는 트리에틸아민 카복실레이트 또는 N,N-디이소프로필에틸아민 카복실레이트이다.
본 명세서의 일부 실시 태양에서, R4는 화학식 (B9), (B10), (B9'), (B10'), (B11), (B12), (B11') 또는 (B12')으로 표현되는 작용기이다.
상기 q1은 1-4의 정수이고, q2 는 1-10의 정수이고, X는 O 또는 NH이며, M+은 양이온이고, Rk는 히드록시 보호기이며, SPS는 고상 지지체이며, 는 기가 공유결합으로 부착하는 위치를 나타낸 것이다. 일부 실시 태양에서,q1은 1 또는 2이다. 일부 실시 태양에서, q2는 1-5의 정수이다. 일부 실시 태양에서, R4는 화학식 (B9) 또는 (B10)으로 표현되는 기를 포함한다. 일부 실시 태양에서, R4는 화학식 (B11) 또는 (B12) 으로 표현되는 기를 포함한다.
일부 실시 태양에서, Rk는 하나 이상의 Tr (트리틸), MMTr (4-메톡시트리틸), DMTr (4,4'-디메톡시트리틸), 및 TMTr (4,4',4"-트리메톡시트리틸) 이다. 일부 실시 태양에서, Rk은 DMTr이다.
L1 은 1에서 70개의 탄소 원자 길이의 선형 알킬렌이고, 상기 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌(heterocyclylene), 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있으며, 상기 L1 은 선택적으로C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, ­OC1-C10 알킬, ­OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬­OH, ­OC1-C10 할로알킬, ­SC1-C10 알킬, ­SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬­SH, ­SC1-C10 할로알킬, 할로, ­OH, -SH, ­NH2, ­C1-C1`0 알킬­NH2, ­N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), ­NH(C1-C10 알킬), ­N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), ­NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, ­CO2H, ­C(O)OC1-C10 알킬, ­CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), ­CONH(C1-C10 알킬), ­CONH2, ­NHC(O)(C1-C10 알킬), ­NHC(O)(페닐), ­N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), ­N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), ­C(O)C1-C10 알킬, ­C(O)C1-C10 알킬페닐, ­C(O)C1-C10 할로알킬, ­OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, ­SO2NH(C1-C10 알킬), ­SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 ­NHSO2(C1-C10 할로알킬)으로 이루어진 군의 하나 이상으로 치환될 수 있다. 비록 편의상L1 이 선형 알킬렌으로 정의되어 있어도, 위의 대체 및/또는 치환의 결과로써 선형 군이 아니거나 아민 또는 알케닐로 다르게 명명될 수 있음을 당업자가 이해할 수 있을 것이다. 본원 발명의 목적상, L1 의 길이는 두 부착점을 연결하는 사슬의 원자 수이다. 이러한 목적상, 헤테로사이클릴렌(heterocyclylene)이나 헤테로아릴렌 같은 선형 알킬렌의 탄소 원자 치환으로 생성된 고리는 1번 원자에서부터 수를 센다.
일부 실시 태양에서, 간 표적화 기능을 본 발명의 접합체에 제공하기 위해서, M1 리간드 (또는 상응하는 S1 기)를 질소 함유 골격의N 원자에 결합하기 위해 L1이 사용된다. 일부 실시 태양에서, L1 은 임의의 한 화학식 A1-A26과 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시 태양에서, L1 은 A1, A4, A5, A6, A8, A10, A11, A13이거나 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시 태양에서,L1 은 A1, A4, A8, A10, 및 A11의 2 이상의 조합일 수 있다; 일부 실시 태양에서, L1 은A1, A8, 및 A10 의 2 이상의 조합일 수 있다.
일부 실시 태양에서, L1 의 길이는 3 내지 25, 3 내지 20, 4 내지 15, 또는 5 내지 12 원자이다. 일부 실시 태양에서,L1 은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 원자 길이이다.
본 명세서에 따른 일부 실시 태양에서, j1은 2-10의 정수이고, 일부 실시태양에서 3-5의 정수이며; j2은 2-10의 정수이고, 일부 실시태양에서 3-5의 정수이다. R' 은 C1-C4 알킬이며, 일부 실시 태양에서는 메틸, 에틸, 이소프로필 중 하나일 수 있다. Ra 은 A27, A28, A29, A30, 및 A31 중 하나이고, 일부 실시 태양에서는 A27 또는 A28이다. Rb 은 C1-C5 알킬이고, 일부 실시 태양에서는 메틸, 에틸, 이소프로필, 및 부틸 중 하나이다. 일부 실시 태양에서, A1-A26 에서 j1, j2, R', Ra, 및 Rb는 접합 분자로 형성된 올리고뉴클레오티드 접합체의 질소 함유 골격의 N 원자와 M1 리간드 사이의 결합을 이루고, 간세포 표면의 아시알로당단백질(asialoglycoprotein) 수용체에 M1 리간드를 결합하기 위해 보다 적합한 리간드의 사이 입체 위치를 형성하기 위해서 각각 선택될 수 있다.
각 M1은 독립적으로 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드에서 선택된다. 일부 실시 태양에서, 하나 이상의 M1 은 간세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 실시 태양에서, 하나 이상의 M1 은 포유동물 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 실시 태양에서, 하나 이상의 M1 은 인간 간세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드이다. 일부 실시 태양에서, 하나 이상의 M1은 간 표면 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 결합할 수 있는 리간드이다.
일부 실시 갈락토오스 태양에서, M1은 포유동물 간세포 표면의 아시알로당단백질 수용체에 친화성을 가진 임의의 하나의 리간드일 수 있다. 이러한 리간드의 종류는 당업자에게 잘 알려져 있다. 일부 실시 태양에서, 하나 이상의 M1은 당류이다. 일부 실시 태양에서, 각 M1은 당류이다. 일부 실시 태양에서, 하나 이상의 M1은 단당류, 이당류, 삼당류 또는 다당류이다. 일부 실시 태양에서, 각 M1은 단당류, 이당류, 삼당류 또는 다당류이다. 일부 실시 태양에서, 하나 이상의 M1은 변성 당류이다. 일부 실시 태양에서, 각 M1은 변성 당류이다. 일부 실시 태양에서, 각 M1은 독립적으로 다당류, 변성 다당류, 단당류 또는 단당류 유도체에서 선택될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 각 또는 하나 이상의 M1은 독립적으로 글루코스와 그 유도체, 마노스(mannose)와 그 유도체, 갈락토오스와 그 유도체, 자일로스와 그 유도체, 리보오스와 그 유도체, 푸코오스(fucose)와 그 유도체, 젖당과 그 유도체, 엿당과 그 유도체, 아라비노스와 그 유도체, 과당과 그 유도체, 및 시알산으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일부 실시 태양에서, 각 또는 하나 이상의 M1 은 독립적으로 D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노스, D-실로푸라노스, L-실로푸라노스, D-글루코스, L-글루코스, D-갈락토스, L-갈락토스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코사민, 시알산, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-트리플루오르아세틸 갈락토사민, N-프로피닐갈락토사민, N-n-부티릴갈락토사민, N-이소부티릴갈락토사민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카르복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-디옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노스, 4,6-디데옥시-4-포르마미도(formamido)-2,3-디(di)-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜릴-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코피라노스, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노사이드, 4-티오-β-D-갈락토피라노스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코헵토피라노사이드, 2,5-안히드로-D-알로니트릴, 리보오스, D-리보오스, D-4-티오리보오스, L-리보오스, L-4-티오리보오스로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 일부 실시 태양에서,하나 이상의 M1 은 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)이다. 일부 실시 태양에서, 각 M1은 N-아세틸 갈락토사민 (GalNAc)이다. 리간드 선택은 예를 들어 CN105378082A명세서 에서 참고할 수 있으며 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
CN105378082A는 변성 올리고뉴클레오티드와 접합기(conjugating group)를 포함하는 물질을 개시한다. 상기 접합기는 하나 이상의 리간드(들) 뿐만 아니라, 하나 이상의 포스포러스 결합기 또는 중성 결합기를 포함한다. 각 리간드는 다당류, 변성 다당류, 만노오스, 갈락토스, 만노오스 유도체, 갈락토스 유도체, D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노스, D-실로푸라노스, L-실로푸라노스, D-글루코스, L-글루코스, D-갈락토스, L-갈락토스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코사민, 시알산, α-D-갈락토사민, N-아세틸 갈락토사민, 2-아미노 -3-O-[(R)-1-카르복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노스, 4,6-디데옥시(dideoxy)-4-포르마미도(formamido)- 2,3-디(di)-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜릴-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코피라노스, 메틸2,3,4-트리스 -O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노사이드, 4-티오-β-D-갈락토피라노스, 에틸3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코헵토피라노사이드, 2,5-안히드로-D-알로니트릴, 리보오스, D-리보오스, D-4-티오리보오스, L-리보오스 및 L-4-티오리보오스 으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 이 화합물은 세포 내 핵산 전사의 양 또는 활성을 감소시킬 수 있다고 주장된다.
WO2016077321A1는 HBV 유전자를 특이적으로 표적화하는 다수의 siRNA 및 그의 전달 방법을 개시하고, siRNAs의 혈청 안정성은 그 뉴클리오티드의 변성으로 향상된다. 본 문서 또한 siRNA 접합체를 개시하고, 더 구체적인 몇몇 siRNA 접합체를 개시한다.
WO2016168286A1는 ANGPTL3 유전자를 특이적으로 표적화하는 다수의 siRNA 및 그 전달 방법을 개시하고, siRNA의 혈청 안정성은 그 뉴클레오티드를 변성시킴으로써 향상된다. 이 문헌 또한 siRNA 접합체를 개시한다.
N-아세틸 갈락토사민(GalNAc)은 간 표면의 아시알로당단백질 수용체(ASGPR) 에 결합하는 리간드이다. ASGPR는 간세포에 의해 특이적으로 발현되는 세포 내 수용체이다. 최근 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc)은 간에 소형 RNA 약물을 수송하는 표적 분자로 이용되어져왔다. 예시로, Alnylam Pharmaceuticals, Inc.는 최초로 GalNAc 결합 기술을 기반으로 siRNAs 가 쥐에서 간섭 활성을 발휘한다는 사실을 보고하였다(Nair et al., J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 16958-16961). 이 문헌은 GalNAc의 3개의 클러스터에 접합된 siRNA가 시험관내 및 생생체 내 모두에서 우수한 전달 활성을 나타낸다고 보고하였다. 피하 투여된 쥐의 생체 내 실험을 통해, 단일 주사 용량이 1 ml 미만일 때, 단일 주사 용량의 ED50 은 1 mg/kg 인 것으로 결정되었다. 장기 투여 실험에서, 주장한 바에 따르면 매주 한 번 피하 주사하여 최대 9 개월 동안 안정적인 간섭 활성을 얻을 수 있다.
일부 실시 태양에서, S1는 독립적으로 M1이다. 일부 실시 태양에서, S1은 독립적으로 하나 이상의 히드록실 보호기로 보호된 활성 히드록실을 가지고 있는 M1이다. 일부 실시 태양에서, S1 은 독립적으로 모든 활성 히드록실(있는 경우)이 히드록실 보호기로 보호된 M1이다. 일부 실시 태양에서, 당업자에게 알려진 임의의 히드록실 보호기는 M1의 활성 히드록실을 보호하기 위해 이용 가능하다. 일부 실시 태양에서, 보호된 히드록시는 화학식 YCOO-으로 표현되며, 상기 각 Y는 독립적으로 할로 및 C1-C6 알킬으로 이루어진 군에서 선택되는 하나이상의 치환체로, 임의로 치환가능한 C1-C10 알킬 및 C6-C10 아릴로 구성되는 군에서 선택된다. 일부 실시 태양에서, 각 Y 은 독립적으로 메틸, 트리플루오르메틸, 디플루오르메틸, 모노플루오르메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로 페닐, 및 C1-C6 알킬페닐로 구성되는 군에서 선택된다.
일부 실시 태양에서, 각각 S1 은 독립적으로 화학식 A46-A54으로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 실시 태양에서, S1 는 A49 또는 A50이다. 일부 실시 태양에서, Y 는 각 경우에 독립적으로 메틸, 트리플루오르메틸, 디플루오르메틸, 모노플루오르메틸, 트리클로로메틸, 디클로로메틸, 모노클로로메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 페닐, 할로 페닐, 및 알킬페닐 중 하나이다. 본원 개시의 접합 분자를 단순화하기 위한 일부 실시 태양에서, Y 는 메틸이다.
일부 실시태양에서 본원 발명의 접합 분자는 화학식 (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421), 또는 (422)과 같은 구조를 가진다
,
(403)
,
(404)
,
(405)
,
(406)
,
(407)
,
(408)
,
(409)
,
(410)
,
(411)
,
(412)
,
(413)
,
(414)
,
(415)
,
(416)
,
(417)
,
(418)
,
(419)
,
(420)
,
(421)
.
(422)
상기 화학식 (403)부터 (422)까지, X는 O 또는 NH이고, Rk는 히드록시 보호기이며, M+은 금속 양이온, 암모늄 양이온, 3차 아민 또는 4차 아민 양이온으로부터 형성된 양이온이다. 일부 실시 태양에서, M+은 이다.
일부 실시 태양에서, 본원 발명의 접합 분자는 화학식 (423), (424), (425), (426), (427), (428), (429), (430), (431), (432), (433), (434), (435), (436), (437), (438), (439), (440), (441), 또는 (442) 과 같은 구조를 가진다.
상기 화학식 (423)부터 (442)까지, X는 O 또는 NH이고, Rk는 히드록시 보호기이며, SPS는 고상 지지체를 나타낸다.
일부 실시 태양에서, 본원 발명의 접합 분자는 화학식 (503), (504), (505), (506), (507), (508), (509), (510), (511), (512), (513), (514), (515), (516), (517), (518), (519), (520), (521), 또는 (522) 과 같은 구조를 가진다.
(503)
(504)
(505)
(506)
(507)
(508)
(509)
(510)
(511)
(512)
(513)
(514)
(515)
(516)
(517)
(518)
(519)
(520)
(521)
.
(522)
상기 화학식 (503) 내지 (522)에서, DMTr 는 4,4'-디메톡시트리틸이다. 구조식 는 해당 카르복시산 또는 트리에틸아민으로부터 형성된 염을 나타낸다.
일부 실시 태양에서, 본원 발명의 접합 분자는 화학식 (523), (524), (525), (526), (527), (528), (529), (530), (531), (532), (533), (534), (535), (536), (537), (538), (539), (540), (541), 또는 (542) 과 같은 구조를 가진다.
상기 화학식 (523) 내지 (542)에서, SPS는 고상 지지체이고, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸이다.
본원에 개시된 접합 분자 제조 방법
본원의 접합 분자는 당업자에 의해 임의의 적절한 합성 경로를 통해 제조될 수 있다.
본원의 일부 실시 태양에서, 화학식 (321)의 접합 분자를 제조하는 방법은 유기 용매에서 에스테르화 촉매와 염기의 존재 하에 에스테르화 반응 조건 하에서 화학식 (313)로 표현되는 화합물을 고리형 무수물과 접촉시키는 단계; 화학식 (321)로 표현되는 화합물을 이온 교환 및 분리하는 단계를 포함한다:
,
화학식 (313)
상기
R6는 화학식 (321)의 R4를 제공하는 기이다. 일부 실시 태양에서, 예시로, R6은 화학식 (A61)으로 표현되는 구조를 갖는다:
,
(A61)
n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, S1 각 정의와 선택은 상기 기재에 따르고; Ri 는 질소 함유 골격의 N 원자를 RkO 및 유리 히드록시기와 결합시킬 수 있는 기이며; Rk 는 히드록시 보호기이다. 상기 R4 는 제 1 작용기로 히드록시 보호기와 제 2 작용기로 화학식 (C1) 또는 (C2)로 표현되는 기를 포함하는 경우에, 화학식 (321)으로 표현되는 화합물이 얻어진다. 일부 실시 태양에서, R6 는 B7 또는 B8이다.
상기 q2 및 Rk 는 각각 상기 정의된 바와 같다.
에스테르화 반응 조건은 0-100℃의 반응 온도 및 8-48시간의 반응 시간을 포함한다. 일부 실시 태양에서, 에스테르화 반응 조건은 10-40℃의 반응 온도와 20-30 시간의 반응 시간을 포함한다.
일부 실시 태양에서, 유기 용매는 하나 이상의 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 술폭시드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민을 포함한다. 일부 실시 태양에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라히드로푸란이다. 일부 실시 태양에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3차-부틸 에테르이다. 일부 실시 태양에서, 할로알칸 용매는 하나 이상의 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 및 1,2-디클로로에탄이다. 일부 실시 태양에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 유기 용매의 양은 3-50 L/mol이고, 일부 실시 태양에서, 화학식 (313)로 표현된 화합물에 관해서는 5-20 L/mol이다.
일부 실시 태양에서, 고리 무수물은 숙신산 무수물, 글루타르산 무수물, 아디프산 무수물 또는 피멜산 무수물 중 히나이다. 일부 실시 태양에서, 고리무수물은 숙신산 무수물이다. 고리 무수물과 화학식 (313)로 표현된 화합물의 몰 비는 1:1 에서 10:1이고, 일부 실시 태양에서는 2:1 에서 5:1이다.
에스테르화 반응의 촉매는 4-디메틸아미노피리딘과 같이 임의의 에스테르화 반응을 촉진시킬 수 있는 임의의 촉매이다. 촉매와 화학식 (313)로 표현된 화합물의 몰 비는 1:1 에서 10:1이고, 일부 실시 태양에서는 2:1 에서 5:1이다.
일부 실시 태양에서, 염기는 임의의 무기 염기, 유기 염기 또는 이들의 혼합액이다. 생산물의 안정성 및 용해성을 고려할 때, 염기는 3차 아민이다. 일부 실시 태양에서, 3차 아민은 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3차 아민과 화학식 (313)로 표현된 화합물의 몰 비는 1:1에서 20:1이고, 일부 실시 태양에서 3:1에서 10:1이다.
이온 교환은 화학식 (321)로 표현된 화합물을 원하는 형태의 카르복실산이나 이의 염으로 전환시키는 역할을 한다. 이온 교환 방법으로서, 당업자에게 널리 알려진 적절한 이온 교환 용매와 이온 교환 조건을 이용하여 M+ 양이온을 갖는 접합 분자를 얻을 수 있다. 일부 실시 태양에서, 이온 교환에 트리에틸아민 포스페이트염 용액이 사용된다. 일부 실시 태양에서, 트리에틸아민 포스페이트염 용액의 농도는 0.2-0.8 M이다. 일부 실시 태양에서, 트리에틸아민 포스페이트염 용액의 농도는 0.4-0.6 M이다. 일부 실시 태양에서, 트리에틸아민 포스페이트염 용액의 양은 3-6 L/mol이고, 더 나아가 화학식 (313)로 표현된 화합물에 대해서는 4-5 L/mol이다.
화학식 (321)로 표현된 화합물은 임의의 적절한 방법을 이용하여 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 화학식 (321)로 표현된 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후 크로마토그래피를 통해서 분리될 수 있다. 예를 들어, 분리를 위하여 다음과 같은 크로마토그래피 조건을 이용할 수 있다. (1) 정상 정제: 200-300 메쉬 실리카겔 필터, 구배 용리는 1 중량‰ 트리에틸아민을 포함하는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:18 내지 100:20 이거나; (2) 역상 정제: C18 과 C8 역상 필터, 구배 용리는 메탄올:아세토니트릴= 0.1:1 내지1:0.1이다. 일부 실시 태양에서, 화학식 (321)로 표현된 화합물의 조 생성물(crude product)을 얻기 위해 용매는 직접적으로 제거된다. 이는 후속 반응에 직접 이용될 수 있다.
일부 실시 태양에서, 화학식 (321)로 표현된 화합물의 제조 방법은 유기 용매에 축합제, 축합 촉매, 3차 아민이 존재하는 축합 반응 조건 하에서 상기 이온 교환에 의한 생성물을 아미노기 또는 히드록시기를 가진 고상 지지체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 이 경우에 화학식 (321)로 표현된 화합물이 얻어지고, 상기 R4는 제 1 작용기로 히드록시 보호기와 제 2 작용기로 화학식 (C1')로 표현된 기를 포함한다.
고상 지지체는 siRNA 고상 합성의 지지체 중 하나이며, 이들 중 일부는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 고상 지지체는 활성 히드록시기나 아미노 작용기를 가진 것들 중에 선택된다. 일부 실시 태양에서, 고상 지지체는 아미노 또는 히드록시 수지(resin)이다. 일부 실시 태양에서, 아미노 또는 히드록시 수지는 입자크기가 100-400 메쉬이고, 0.2-0.5 mmol/g의 아미노 또는 히드록시 표면 하중을 가진다. 화학식 (321)로 표현된 화합물과 고상 지지체의 비는 고상 지지체 그램 당 10 μmol 화합물(μmol/g) 내지 400 μmol/g이다. 일부 실시 태양에서, 화학식 (321)로 표현된 화합물과 고상 지지체의 비는 50 μmol/g 내지 200 μmol/g이다.
유기 용매는 당업자에게 본원의 목적에 적합하다고 알려진 혼합 용매 중 임의의 적합한 용매일 수 있다. 일부 실시 태양에서, 유기 용매는 하나 이상의 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민이다. 일부 실시 태양에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라히드로퓨란이고, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3차(tert)-부틸 에테르이며, 할로알칸 용매는 하나 이상의 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 및 1,2-디클로로에탄이다. 일부 실시 태양에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 20-200 L/mol이고, 일부 실시 태양에서 화학식 (313)로 표현된 화합물에 관해서는 50-100 L/mol 이다.
일부 실시 태양에서, 축합제는 벤조트리아졸-1-일(yl)-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리아졸-4(3H)-온(one) 및/또는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트일 수 있다. 일부 실시 태양에서, 축합제는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이다. 축합체와 화학식 (313)로 표현된 화합물의 몰 비는 1:1 내지 20:1이고, 추가 실시 태양에서는 1:1 내지 5:1이다.
일부 실시 태양에서, 3차 아민은 트리에틸아민 및/또는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, 일부 실시 태양에서는 N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3차 아민과 화학식 (313)로 표현된 화합물의 몰비는 1:1 내지 20:1이고, 일부 실시 태양에서는 1:1 내지 5:1이다.
일부 실시 태양에서, 화학식 (321)로 표현된 화합물을 합성하는 방법은 유기용매에서 캡핑(capping) 반응 조건 하 축합 반응을 통해 얻어진 생성물을 캡핑 시약 및 아실화 촉매와 접촉시키는 단계와, 화학식 (321)로 표현된 화합물 분리 단계를 추가적으로 포함한다. 캡핑 반응은 임의의 미 반응 활성 작용기를 제거하는데 이용되며 후속 반응으로 불필요한 부산물 생성을 방지하는데 이용된다. 캡핑 반응 조건은 반응 온도 0-50℃, 일부 실시 태양에서는 15-35℃, 및 반응 시간 1-10 시간, 일부 실시 태양에서 3-6 시간을 포함한다. 캡핑 시약은 당업자에게 잘 알려진 고상 합성에 이용되는 캡핑 시약 중 하나일 수 있다. 일부 실시 태양에서, 캡핑 시약은 캡핑 시약 A (캡A)와 캡핑 시약 B (캡B)로 구성된다. 캡A는 N-메틸이미다졸이고, 일부 실시 태양에서 피리딘/아세토니트릴 혼합 용매에서 N-메틸이미다졸 용액으로 제공된다. 상기 피리딘과 아세토니트릴의 부피비는 1:10 내지 1:1이며, 일부 실시 태양에서는 1:3 내지 1:1이다. 일부 실시 태양에서, 피리딘과 아세토니트릴의 총 부피는 N-메틸이미다졸 부피와 1:1 내지 10:1의 부피 비이며, 일부 실시 태양에서는 3:1 내지 7:1이다. 일부 실시 태양에서, 캡핑 시약 B는 무수 아세트산이다. 일부 실시 태양에서, 캡핑 시약 B는 아세토니트릴 용매에서 무수 아세트산 용액으로 제공되며, 상기 무수 아세트산과 아세토니트릴의 부피비는 1:1 내지 1:10이며, 추가 실시 태양에서 1:2 내지 1:6이다.
일부 실시 태양에서, 피리딘/아세토니트릴 혼합 용매에서 N-메틸이미다졸 용액의 부피와 화학식 (313)로 표현된 화합물의 질량 비는 5 ml/g-50 ml/g이며, 일부 실시 태양에서는 15 ml/g-30 ml/g이다. 아세토니트릴 용매에서 무수 아세트산 용액의 부피와 화학식 (313)로 표현된 화합물의 질량 비는 0.5 ml/g-10 ml/g이고, 일부 실시 태양에서는 1 ml/g-5 ml/g이다.
일부 실시 태양에서, 캡핑 시약은 등몰(equimolar)의 무수 아세트산과 N-메틸이미다졸이다. 일부 실시 태양에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 실시 태양에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 일부 실시 태양에서, 유기 용매의 양은 10-50 L/mol이고, 일부 실시 태양에서 화학식 (313)로 표현된 화합물과 관해서는 5-30 L/mol 이다.
일부 실시 태양에서, 아실화 촉매는 알칼리성 이형고리 화합물과 같이 에스테르화나 아미드화에 쓰이는 임의의 촉매에서 선택된다. 일부 실시 태양에서, 아실화 촉매는 4-디메틸아미노피리딘이다. 촉매와 화학식 (313)로 표현된 화합물의 질량비는 0.001:1 내지 1:1일 수 있고, 일부 실시 태양에서는 0.01:1 내지 0.1:1이다.
일부 실시 태양에서, 화학식 (321)로 표현된 화합물은 적절한 방법에 의해서 반응 혼합물로부터 분리된다. 일부 실시 태양에서, 미 반응한 반응물들, 과도한 캡핑 시약, 및 다른 불순물들을 제거하기 위해 유기 용매로 충분히 세척하고 거르는 과정을 거쳐 화학식 (321)로 표현된 화합물이 얻어진다. 상기, 유기 용매는 아세토니트릴, 디클로로메탄, 또는 메탄올 중에서 선택된다. 일부 실시 태양에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다.
일부 실시 태양에서, 화학식 (321)로 표현된 접합 분자의 제조는 유기 용매내에서 커플링 제제(coupling agent)의 존재 하에 커플링 반응조건에서 화학식 (313)로 표현된 화합물을 포스포로아미다이트와 접촉시키고, 화학식 (321)로 표현된 화합물을 분리하는 과정을 포함한다. 이 경우에 R4가 제 1 작용기로 히드록시 보호기와 제 2 작용기가 화학식 (C3)의 작용기를 가지는 화학식(321)로 표현된 화합물이 얻어진다.
일부 실시 태양에서, 커플링 반응 조건의 반응 온도는 0-50℃이며, 예컨대 15-35℃이다. 화학식 (322)로 표현된 화합물과 포스포로디아미다이트의 몰 비는 1:1 내지 1:50이고, 예컨대 1:5 내지 1:15 이다. 화학식 (313)로 표현된 화합물과 커플링 제제의 몰 비는 1:1 내지 1:100이고, 예컨대 1:50 내지 1:80이다. 반응 시간은 200-3000 초이며, 바람직하게는 500-1500 초일 수 있다. 포스포로디아미다이트는 예를 들면2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프포필 포스포로디아미다이트일 수 있고, 시판되거나 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 제조된 것일 수 있다. 커플링 제제는 1H-테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸 및 5-벤질티오-1H-테트라졸 중에서 하나 이상 선택되고, 5-에틸티오-1H-테트라졸일 수 있다. 커플링반응은 유기용매에서 진행된다. 일부 실시 태양에서, 유기용매는 무수 아세토니트릴, 무수 DMF 및 무수 디클로로메탄중 하나 이상 선택되고, 바람직하게는 무수 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 3-50 L/mol일 수 있으며, 화학식 (313)로 표현된 화합물에 대해서는 5-20 L/mol일 수 있다. 커플링 반응을 통해서, 화학식 (313)로 표현된 화합물의 히드록시기는 포스포로디아미다이트와 반응하여 포스포르아미다이트기를 형성한다. 일부 실시 태양에서, 화학식 (321)로 표현된 화합물의 조 생성물을 얻기 위해 용매는 직접 제거될 수 있으며, 이는 후행 반응에서 직접 사용될 수 있다.
일부 실시 태양에서, 화학식 (321)로 표현된 화합물의 제조방법은 추가적 단계를 포함한다. 유기 용매에서 커플링 제제 존재 하에 커플링 반응 조건에서 분리된 생성물과 히드록시기를 가진 고상 지지체를 접촉시키는 단계, 이후 화학식 (321)로 표현된 화합물을 얻기 위해서 캡핑, 산화, 분리하는 단계를 포함한다. 상기 R4 는 제 1 작용기로 히드록시 보호기와 제 2 작용기로 화학식 (C3')의 작용기를 포함한다.
일부 실시 태양에서, 고상 지지체는 상용화 되어 있는 탈 보호 범용 고상 지지체와 같이 핵산 고상 합성에 이용되는 지지체 이다. (예시로 NittoPhase®HL UnyLinker™ 300 Oligonucleotide Synthesis Support, Kinovate Life Sciences, 화학식 B80로 표현된다):
탈 보호 반응은 당업계에 널리 알려져 있다. 일부 실시 태양에서, 탈 보호 조건은 반응 온도 0-50℃이고, 예컨대 15-35℃일 수 있으며, 반응 시간은 30-300 초이고, 예컨대 50-150 초이다. 탈 보호 제제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 및 모노클로로아세트산 중 하나 이상 선택된다. 일부 실시 태양에서, 탈 보호 제제는 디클로로아세트산이다. 고상 지지체 상 탈 보호 제제 대 -DMTr(4,4′-디메톡시트리틸) 보호기의 몰 비는 2:1 내지 100:1이며, 예컨대 3:1 내지 50:1이다. 탈 보호를 통해, 고상 지지체 표면에 반응성 유리 히드록시기가 얻어 지므로 결과적으로 커플링 반응이 가능하다.
커플링 반응 조건과 커플링 제제는 상기와 같이 선택될 수 있다. 이러한 커플링을 통해서, 탈 보호 반응에서 생성된 유리 히드록시기가 생성된 포스포르아미다이트 기와의 반응하여 포스페이트 에스테르 결합을 형성한다.
일부 실시 태양에서, 캡핑 반응 조건은 온도는 0-50℃, 예컨대 15-35℃이고, 반응 시간은 5-500초, 예컨대 10-100초 이다. 캡핑 제제와 그 양은 상기와 같이 선택될 수 있다.
산화 반응 조건은 온도는 0-50℃, 예컨대 15-35℃이고, 반응 시간은 1-100 초, 예컨대 5-50 초이다. 산화제는 예를 들어 요오드(iodine)일 수 있다 (일부 실시 태양에서, 요오드수로 제공될 수도 있다). 일부 실시 태양에서, 커플링 단계에서 산화제와 고상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:1 내지 100:1이고, 바람직하게는 5:1 내지 50:1이다. 일부 실시 태양에서, 테트라히드로푸란: 물: 피리딘 = 3:1:1 내지1:1:3 인 혼합 용매하에서 산화 반응한다.
일부 실시 태양에서, R6 는 B7 또는 B8이다. 이 경우에 화학식 (313)로 표현된 화합물은 유기용매에서 아미드 반응 조건과 아미드 반응 응축제 존재하에 화학식 (314)로 표현된 화합물을 화학식 (A-1) 또는 (A-2) 로 표현된 화합물과 접촉시킨 다음 분리하여 얻을 수 있다:
,
화학식 (314)
상기, n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1, S1, q2 및 Rk 각 정의와 선택은 상기 기재한 바와 같다.
아미드화 반응 조건은 반응 온도 0-100℃와 반응 시간 1-48 시간을 포함한다. 일부 실시 태양에서, 아미드화 반응 조건은 반응 온도 10-40℃와 반응 시간 2-16 시간이다.
일부 실시 태양에서, 유기 용매는 알코올 용매, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 실시 태양에서,알코올 용매는 메탄올, 에탄올 및 프로판올 중 하나 이상이고, 추가 실시 태양에서는 에탄올이다. 일부 실시 태양에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라히드로푸란이다. 일부 실시 태양에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3차-부틸 에테르이다. 일부 실시 태양에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 실시 태양에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 유기 용매의 양은 3-50 L/mol이고, 추가 실시 태양에서는 화학식 (314)로 표현된 화합물과 관련해서 3-20 L/mol 이다.
일부 실시 태양에서, 아미드화 반응 축합제는 벤조트리아졸-1-일(yl)-옥시트리피롤리디노포스포늄(oxytripyrrolidinophosphonium) 헥사플루오로포스페이트, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온(one), 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일(yl))-4-메틸모르폴린 히드로클로라이드, 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1, 2-디히드로 퀴놀린(EEDQ) 또는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트이고, 추가 실시 태양에서 축합제는 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온(one)이다. 아미드화 반응 축합제와 화학식 (314)로 표현된 화합물의 몰 비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 실시 태양에서는 2.5:1 내지 5:1이다.
일부 실시 태양에서, 3차 아민은 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, 추가 실시 태양에서는 N,N-디이소프로필에틸아민이다. 3차 아민과 화학식 (314) 로 표현된 화합물 몰 비는 3:1 내지 20:1이고, 일부 실시 태양에서는 5:1 내지 10:1이다.
일부 실시 태양에서, 화학식 (A-1) 및 (A-2)로 표현된 화합물은 임의의 적합한 수단으로 제조된다. 예시로 화학식 (A-1)로 표현된 화합물은 칼슘 글리세레이트(glycerate)를 DMTrCl와 반응시켜 제조할 수 있다. 상기 Rk 은 DMTr 기이다. 유사하게, 화학식 (A-2)로 표현된 화합물은 우선 3-아미노-1,2-프로판디올을 4-13 탄소원자를 가진 고리 무수물과 접촉시키고, 일부 실시 태양에서는 4-8 탄소원자이다, DMTrCl과 반응시켜 제조할 수 있다. 화학식 (A-2)로 표현된 화합물에서 이종의 고리 무수물을 선택시 다른 q2값을 갖는 점은 당업자가 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어 고리 무수물이 숙신산 무수물일 경우 q2=1이고; 고리 무수물이 글루타르산 무수물일 경우 q2=2인 것 등이다.
어떤 변성에서, 화학식 (313)로 표현된 화합물은 화학식 (314)로 표현된 화합물과 고리형 무수물, 3-아미노-1,2-프로판디올, 및 DMTrCl의 연속적인 반응에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변성이 화학식 (313)로 표현된 화합물의 구조나 기능에 영향을 미치지 않는다는 것을 당업자가 쉽게 이해할 것이다. 당업자는 이러한 변성을 상기 방법을 이용하여 쉽게 달성할 것이다.
유사하게, 화학식 (313)로 표현된 화합물은 반응 혼합물로부터 임의의 적정한 분리 방법을 이용하여 분리될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 화학식 (313)로 표현된 화합물은 증발을 통한 용매의 제거 후 크로마토그래피를 통해 분리될 수 있다. 예를 들어, 분리를 위해 다음의 두 종류의 크로마토그래피 조건이 사용될 수 있다. (1) 정상 정제: 200-300 메쉬 실리카겔 필터, 구배 용리는 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: N,N-디메틸포름아미드 = 1:1:1:0.5 내지 1:1:1:0.6이고; (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 필터, 구배 용리는 메탄올: 아세토니트릴 = 0.1:1 내지1:0.1이다. 일부 실시 태양에서, 화학식 (313)로 표현된 화합물의 조 생성물을 얻기 위해 용매는 직접 제거될 수 있고, 조 생성물은 후속 반응에 직접 사용될 수 있다.
일부 실시 태양에서, 화학식 (314)로 표현된 화합물은 유기 용매에서 탈 보호 반응 조건하에 화학식 (315)로 표현된 화합물을 할로아세틱산과 접촉시킨 후, 분리를 통해 얻을 수 있다:
화학식 (315)
상기, R7 는 화학식 (330), (331), (332) 또는 (333)로 표현된 화합물 중에서 선택되고, 일부 실시 태양에서, R7 은 화학식 (330)의 구조를 갖는 화합물이다.
상기 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1 및 S1 각 정의와 선택은 상기 기재된 바와 같다.
할로아세틱산은 디클로로아세트산, 트리클로로아세트산, 모노클로로아세트산 및 트리플루오로아세트산 중 하나 이상 선택되고, 일부 실시 태양에서는 디클로로아세트산이다.
탈 보호 반응 조건은 반응 온도 0-100℃ 및 반응 시간 0.1-24 시간이고, 일부 실시 태양에서 반응 온도 10-40℃ 및 반응 시간 0.5-16 시간이다.
일부 실시 태양에서, 유기 용매는 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민중 하나 이상이다. 일부 실시 태양에서, 에폭시 용매는 디옥산 또는/및 테트라히드로푸란이다. 일부 실시 태양에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3차-부틸 에테르이다. 일부 실시 태양에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 실시 태양에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 유기 용매의 양은 3-50 L/mol이고, 추가 실시태양에서 화학식 (315)로 표현된 화합물과 관련하여 5-20 L/mol 이다.
할로아세틱산과 화학식 (315)로 표현된 화합물의 몰 비는 5:1 내지 100:1일 수있고, 일부 실시 태양에서는 10:1 내지 50:1이다.
유사하게, 화학식 (314)로 표현된 화합물은 적절한 분리 방법을 사용하여 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 화학식 (314)로 표현된 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후 크로마토그래피를 통해서 분리될 수 있다. 예를 들어, 분리를 위하여 다음 두 종류의 크로마토그래피 조건을 이용할 수 있다. (1) 정상 정제: 200-300 메쉬 실리카겔 필터, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:30 내지 100:40이고; (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 필터, 구배 용리는 메탄올: 아세토니트릴 = 0.1:1 내지 1:0.1이다. 일부 실시 태양에서, 용매는 화학식 (314)로 표현된 화합물의 조 생성물을 얻기 위해 직접 제거될 수 있고, 조 생성물은 후속 반응에 직접 사용될 수 있다.
화학식 (315)로 표현된 화합물은 유기 용매에서 아미드화 반응용 축합제와 3차 아민의 존재에서 축합 반응 조건 하에서 화학식 (317)로 표현된 화합물과 화학식 (316)로 표현된 화합물을 접촉시킨 후, 분리하여 얻을 수 있다.
화학식 (316)
,
화학식 (317)
상기 n1, n3, m1, m2, m3, R7, R10, R11, R12, R13, R14, R15, L1 및 S1 의 각 정의와 선택은 상기 설명한 바와 같다.
화학식 (316)로 표현된 화합물에 관하여, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 16958-16961 에 기재된 것과 같은 화합물이 사용될 수 있다. 당업자가 다양한 방법을 통하여 제조할 수 있는 화학식 (316)로 표현된 화합물로도 대체 가능할 것이다. 예를 들어, 화학식 (316)로 표현된 몇 개의 화합물은 미국 특허 8,106,022 B2의 실시예 1 기재에 따라 제조될 수 있고, 본 발명과 일치하는 전 범위에서 해당 문헌의 전문이 참고로 포함된다.
일부 실시 태양에서, 중합 반응 조건은 반응 온도 0-100℃ 와 반응 시간 0.1-24 시간이다. 일부 실시 태양에서, 반응 온도는 10-40℃이고 반응 시간은 0.5-16 시간이다.
화학식 (316)로 표현된 화합물과 화학식 (317)로 표현된 화합물의 몰 비는 2:1 내지 10:1일 수 있고, 일부 실시 태양에서는 2.5:1 내지 5:1이다.
일부 실시 태양에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 술폭시드, N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 실시 태양에서 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라히드로푸란이고. 일부 실시 태양에서 에테르 용매는 디에틸에테르 및/또는 메틸 3차-부틸 에테르이다. 일부 실시 태양에서 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 이상이다. 일부 실시 태양에서,유기 용매는 아세토니트릴이다. 유기 용매 양은 3-50 L/mol이고, 일부 실시 태양에서는 화학식 (317)로 표현된 화합물에 관련하여 5-20 L/mol 이다.
일부 실시 태양에서, 아미드화 반응용 중합제는 벤조트리아졸-1-일(yl)-옥시 트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4 (3H)-온(one) (DEPBT), O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사 플루오로포스페이트 또는 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일(yl))-4-메틸모르폴린 히드로클로라이드이다. 추가 실시 태양에서는 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일(yl))-4-메틸모르폴린 히드로클로라이드일 수 있다. 아미드 반응 중합제와 화학식 (317)로 표현된 화합물의 몰 비는 2:1 내지 10:1이고, 일부 실시 태양에서는 2.5:1 내지 5:1이다.
3차 아민은 N-메틸모르폴린, 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민일 수 있고, 일부 실시 태양에서 N-메틸모르폴린이다. 3차 아민과 화학식 (317)로 표현된 화합물의 몰 비는 3:1 내지 20:1일 수 있고, 일부 실시 태양에서는 5:1 내지 10:1이다.
유사하게, 화학식 (315)화합물은 적절한 분리 방법을 이용해 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 화학식 (315)로 표현된 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후 크로마토그래피를 통해서 분리될 수 있다, 예를 들어, 분리를 위해 다음 두 종류의 크로마토그래피 조건을 이용할 수 있다; (1) 정상 정제: 200-300 메쉬 실리카겔 필터, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:5 내지 100:7이고; (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 필터, 구배 용리는 메탄올: 아세토니트릴 = 0.1:1 내지1:0.1이다. 일부 실시 태양에서, 용매는 화학식 (315)로 표현된 화합물의 조 생성물을 얻기 위해 직접 제거될 수 있고, 조 생성물은 후속 반응에 직접 사용될 수 있다.
일부 실시 태양에서, 동일한 S1-L1 잔기를 가지는 목표 화학식 (315)로 표현된 화합물을 얻기 위해 한 배치(batch)에서 화학식 (317)의 화합물은 충분한 양의 화학식 (316)의 한 화합물과 반응한다. 일부 실시 태양에서, 내부에 두 종류 이상의 S1 및/또는 L1 를 갖는 화학식 (315)로 표현된 화합물을 얻기 위해서 화학식 (317)로 표현된 화합물은 여러 배치(batch)에서 다종의 화학식 (316) 화합물, 즉 필요에 따라 다른 L1 및/또는 S1을 가지는 화학식 (316)의 화합물과 반응한다. 예를 들어, 화학식 (317)화합물의 말단 1차 아민기에 제 1 S1-L1 잔기를 부착하기 위해 1 당량의 화학식 (317)로 표현된 화합물은 2 당량의 제 1 화학식 (316)로 표현된 화합물과 우선 접촉된다. 그 다음에 제 2 S1-L1잔기를 화학식 (317)의 화합물의 (n3+n1-1) 2차 아민기에 부착하기 위해 (n3+n1-1) 당량의 제 2 화학식 (316)로 표현된 화합물과 접촉한다.(상기 n3 및 n1 의 정의와 범위는 상기 기재된 바와 같다).
일부 실시 태양에서, 화학식 (317)로 표현된 화합물은 유기 용매 존재 하 탈 보호 반응 조건에서 화학식 (318)로 표현된 화합물을 메틸아민 수용액과 접촉시킨 다음, 분리를 통해 얻어진다:
,
화학식 (318)
상기 n1, n3, m1, m2, m3, R7, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15 각 정의와 선택은 상기 기재된 바와 같다.
탈 보호 반응 조건은 반응 온도 0-150℃ 및 반응 시간 5-72 시간을 포함하고, 일부 실시 태양에서는 반응 온도 20-80℃ 및 반응 시간 10-30 시간을 포함한다.
유기 용매는 알코올에서 선택될 수 있으며, 일부 실시 태양에서 메탄올, 에탄올 이소프로판올 중 하나이고, 추가 실시 태양에서는 메탄올이다. 유기 용매의 양은 1-20 L/mol일 수 있으며, 일부 실시 태양에서는 화학식 (318)에 관하여 1.5-10 L/mol 이다.
메틸아민 수용액의 농도는 질량 기준 30%-40% 이며, 메틸아민과 화학식 (318)로 표현된 화합물의 몰 비는 10:1 내지 500:1이며, 일부 실시 태양에서는 50:1 내지 200:1이다.
유사하게, 화학식 (317)로 표현된 화합물은 적절한 분리 방법을 사용하여 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 화학식 (317)로 표현된 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후 크로마토그래피를 통해서 분리될 수 있다. 예를 들어, 분리를 위해 다음 두 종류의 크로마토그래피 조건을 이용할 수 있다. (1) 정상 정제: 200 내지 300 메쉬 실리카겔 필터, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올: 암모니아 수용액 (25 중량 %) = 1:1:0.05 내지 1:1:0.25; 및 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 필터, 구배 용리는 메탄올: 아세토니트릴 = 0.1:1 내지 1:0.1이다. 일부 실시 태양에서, 용매는 화학식 (317)로 표현된 화합물의 조 생성물을 얻기 위해 직접 제거될 수 있고, 조 생성물은 후속 반응에 직접 사용될 수 있다.
화학식 (318)로 표현된 화합물은 화학식 (319)로 표현된 화합물을 트리페닐클로로메탄(TrCl), 디페닐에틸페닐클로로메탄, 페닐디에틸페닐클로로메탄 또는 트리에틸페닐클로로메탄과 접촉시키고, 일부 실시 태양에서는 유기 용매 존재 하 치환 반응 조건에서 트리페닐클로로메탄 (TrCl)과 접촉시킨 다음, 분리해서 얻는다.
화학식 (319)
상기 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15 각 정의와 선택은 상기 기재된 바와 같다.
치환 반응 조건은 반응 온도 0-100℃와 반응 시간 5-72 시간을 포함하고, 일부 실시 태양에서는 반응 온도 10-40℃와 반응 시간 10-30 시간을 포함한다.
트리페닐클로로메탄 (TrCl), 디페닐에틸페닐클로로메탄, 페닐디에틸 페닐클로로메탄 또는 트리에틸 페닐클로로메탄은 상용화되어 있다. 트리페닐클로로메탄 (TrCl), 디페닐에틸 페닐클로로메탄, 페닐디에틸페닐클로로메탄 또는 트리에틸 페닐클로로메탄과 화학식 (319)와의 몰 비는 1:1 내지 10:1이고, 일부 실시 태양에서는 1:1 내지 3:1이다.
유기 용매는 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민중 하나 이상일 수 있다. 일부 실시 태양에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라히드로푸란이다. 일부 실시 태양에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3차-부틸 에테르이다. 일부 실시 태양에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄중 하나 이상이다. 일부 실시 태양에서,유기 용매는 디클로로메탄이다. 유기 용매의 양은 3-50 L/mol일수 있고, 일부 실시 태양에서 화학식 (319)과 관련하여 5-20 L/mol 이다.
유사하게, 화학식 (318)으로 표현된 화합물은 적절한 분리 방법을 이용해 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 화학식 (318)으로 표현된 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후 크로마토그래피를 통해서 분리될 수 있다. 예를 들어, 분리를 위해 다음 두 종류의 크로마토그래피 조건을 이용할 수 있다. (1) 정상 정제: 200 내지300 메쉬 실리카겔 필터, 구배 용리는 메탄올: 디클로로메탄 = 0.01:1 내지 0.5:1 또는 구배 용리는 메탄올: 디클로로메탄: 에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 0.1:1:1:1 내지 1:1:1:1; 및 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 필터, 구배 용리는 메탄올: 아세토니트릴 = 0.1:1 내지 1:0.1. 용매는 화학식 (318)로 표현된 화합물의 조 생성물을 얻기 위해 직접 제거될 수 있고, 조 생성물은 후속 반응에 직접 사용될 수 있다.
일부 실시 태양에서, 화학식 (319)으로 표현된 화합물은 유기 용매에서 치환 반응 조건 하 화학식 (320)로 표현된 화합물을 에틸 트리플루오르아세테이트와 접촉시킨 다음 분리하여 얻을 수 있다.
,
화학식 (320)
상기 n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15 각 정의와 선택은 상기 기재된 바와 같다.
일부 실시 태양에서, 유기 용매는 아세토니트릴, 에폭시 용매, 에테르 용매, 할로알칸 용매, 디메틸 술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, 및 N,N-디이소프로필에틸아민 중 하나 이상이다. 일부 실시 태양에서, 에폭시 용매는 디옥산 및/또는 테트라히드로푸란이다. 일부 실시 태양에서, 에테르 용매는 디에틸 에테르 및/또는 메틸 3차-부틸 에테르이다. 일부 실시 태양에서, 할로알칸 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 1,2-디클로로에탄 중 하나이상이다. 일부 실시 태양에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 1-50 L/mol일 수있고, 일부 실시 태양에서 화학식 (320)로 표현된 화합물과 관련하여 1-20 L/mol 이다.
치환 반응 조건은 반응 온도 0-100℃ 및 반응 시간 5-72 시간을 포함 할 수 있고, 일부 실시 태양에서 반응 온도 10-40℃ 및 반응 시간 10-30 시간을 포함한다.
화학식 (320)로 표현된 화합물은 상업적으로 구매하거나, 당업자에게 공지된 방법을 통해 얻을수 있다. 예를 들어, m1=m2=m3=3, n1=1, n3=2인 경우에 각 R10, R11, R12, R13, R14 및 R15 가 H 일때 화학식 (320)로 표현된 화합물은 Alfa Aesar Inc.에서 구매할 수 있다.
에틸 트리플루오르아세테이트와 화학식 (320)로 표현된 화합물의 몰 비는 2:1 내지 10:1일 수 있고, 일부 실시 태양에서는 3:1 내지 5:1이다.
유사하게, 화학식 (319)로 표현된 화합물은 적절한 분리 방법을 사용하여 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 화학식 (319) 로 표현된 화합물은 증발을 통해 용매를 제거한 후 크로마토그래피를 통해서 분리될 수 있다. 예를 들어, 분리를 위해 다음 두 종류의 크로마토그래피 조건을 이용할 수 있다. (1) 정상 정제: 200-300 메쉬 실리카겔 필터, 구배 용리는 메탄올: 디클로로메탄 = 0.01:1 내지 0.5:1 또는 구배 용리는 메탄올: 디클로로메탄: 에틸 아세테이트: 석유 에테르 = 0.1:1:1:1 내지 1:1:1:1; 및 (2) 역상 정제: C18 및 C8 역상 필터, 구배 용리는 메탄올: 아세토니트릴 = 0.1:1 내지 1:0.1이다. 일부 실시 태양에서, 용매는 화학식 (319)로 표현된 화합물의 조 생성물을 얻기 위해 직접 제거될 수 있고, 조 생성물은 후속 반응에 직접 사용될 수 있다.
접합체
다른 측면에서, 본원은 화학식 (1)로 표현되는 구조를 가진 접합체를 제공한다:
화학식 (1),
상기
n1 은 1-3의 정수이고, n3은 0-4의 정수이며;
m1, m2 및 m3 각각은 독립적으로 2-10의 정수이고;
각 R10, R11, R12, R13, R14 및 R15 는 H, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬, 및 C1-C10 알콕시에서 독립적으로 선택되고, 일부 실시 태양에서, 독립적으로 H, 메틸 또는 에틸이다;
R3 은 활성 약물이고, 일부 실시 태양에서 기능성 올리고뉴클레오티드를 포함하며;
R2 는 1 내지 20 탄소 원자 길이의 선형 알킬렌이고, 상기 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있고, 상기 R2 는 선택적으로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, ­OC1-C10 알킬, ­OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬­OH, ­OC1-C10 할로알킬, ­SC1-C10 알킬, ­SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬­SH, ­SC1-C10 할로알킬, 할로, ­OH, -SH, ­NH2, ­C1-C10 알킬­NH2, ­N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), ­NH(C1-C10 알킬), ­N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), ­NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, ­CO2H, ­C(O)OC1-C10 알킬, ­CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), ­CONH(C1-C10 알킬), ­CONH2, ­NHC(O)(C1-C10 알킬), ­NHC(O)(페닐), ­N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), ­N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), ­C(O)C1-C10 알킬, ­C(O)C1-C10 알킬페닐, ­C(O)C1-C10 할로알킬, ­OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, ­SO2NH(C1-C10 알킬), ­SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 ­NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 군의 하나 이상으로 치환될 수 있으며;
각 L1 은 독립적으로 1에서 70개의 탄소 원자 길이의 선형 알킬렌이고, 상기 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알킬렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10 헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있고, 상기 L1은 선택적으로 C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, ­OC1-C10 알킬, ­OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬­OH, ­OC1-C10 할로알킬, ­SC1-C10 알킬, ­SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬­SH, ­SC1-C10 할로알킬, 할로, ­OH, -SH, ­NH2, ­C1-C10 알킬­NH2, ­N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), ­NH(C1-C10 알킬), ­N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), ­NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, ­CO2H, ­C(O)OC1-C10 알킬, ­CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), ­CONH(C1-C10 알킬), ­CONH2, ­NHC(O)(C1-C10 알킬), ­NHC(O)(페닐), ­N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), ­N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), ­C(O)C1-C10 알킬, ­C(O)C1-C10 알킬페닐, ­C(O)C1-C10 할로알킬, ­OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, ­SO2NH(C1-C10 알킬), ­SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐), 및 ­NHSO2(C1-C10 할로알킬)로 이루어진 군의 하나 이상으로 치환될 수 있으며, 일부 실시 태양에서,L1 은 A1-A26 로 이루어진 군이나 이들의 결합에서 선택될 수 있다. 상기 A1-A26의 구조와 정의는 상기 기재된 바와 같으며;
n1, n3, m1, m2, m3, R10, R11, R12, R13, R14, R15 및 M1 은 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시 태양에서, R2 는 반응을 통해 화학식 (321)로 표현된 화합물의 R4기와 활성 약물간의 결합으로 형성되는 연결기이다. 일부 실시 태양에서, R2 는 반응을 통해 화학식 (321)로 표현된 화합물의 R4기와 올리고뉴클레오티드간의 결합으로 형성되는 연결기이다. 일부 실시 태양에서, R2 기는 질소 함유 골격의 N 원자와 R3의 P 원자 모두의 연결 위치를 갖는다. 일부 실시 태양에서, 질소 함유 골격의 N 원자와 R2의 연결 위치는 아미드 결합을 N 원자와 형성하고, R3의 P원자와 R2의 연결 위치는 P원자와 포스페이트에스테르 결합을 형성한다. 일부 실시 태양에서, R2 는 B5, B6, B5' 또는 B6'이다:
상기, 는 작용기가 공유결합으로 결합되는 부분을 나타내고, q2 의 선택과 범위는 상기 기재와 같다.
일부 실시 태양에서, R3 는 화학식 A59로 표현되는 구조를 가진 기이다.
(A59)
상기 E1 은 OH, SH 또는 BH2이고, 일부 실시 태양에서는 OH 또는 SH이고; Nu 는 기능성 올리고뉴클레오티드이다.
본원 개시의 문맥에서, 다른 기재가 없는 한 "접합"기 또는 분자는 적절한 파트너(partner)와 공유 결합을 형성할 수 있는 기 또는 분자를 의미하고, 접합기와 분자 모두와 그 파트너는 특정한 기능이 있다. 따라서, "접합체"는 화학적 잔기가 그 파트너와 공유 결합을 형성하여 생성되는 화합물을 의미한다. 더 나아가, "올리고뉴클레오티드 접합체"는 공유 결합된 올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 각 특정 작용을 하는 접합 잔기로 형성된 화합물을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 올리고뉴클레오티드 접합체이다. 이와 관련하여, "접합 분자"는 반응을 통해서 올리고뉴클레오티드에 접합할 수 있는 특정 화합물이고, 최종적으로 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합을 형성한다. 일부 실시 태양에서, 올리고뉴클레오티드는 siRNA이고, 따라서 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합은 siRNA 접합체이다.
일부 실시 태양에서, 접합체는 화학식 (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21), 또는 (22)의 구조를 가지고 있다.
화학식 (3)
화학식 (4)
화학식 (5)
화학식 (6)
화학식 (7)
화학식 (8)
화학식 (9)
화학식 (10)
화학식 (11)
화학식 (12)
화학식 (13)
화학식 (14)
화학식 (15)
화학식 (16)
화학식 (17)
화학식 (18)
화학식 (19)
화학식 (20)
화학식 (21)
.
화학식 (22)
일부 실시 태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체에서 올리고뉴클레오티드는 기능성 올리고뉴클레오티드이다. 기능성 올리고뉴클레오티드는 RNA 활성화(RNAa), RNA 간섭 (RNAi), 역배열 핵산 기술, 및 엑손 스킵 기술과 같은 원리를 이용하여 표적 서열에 안정하고 특이적인 혼성화를 도입해 결과적으로 대안적 mRNA 스플라이싱을 하거나 타겟 유전자의 발현을 상향 또는 하향 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시 태양에서, 기능적 올리고뉴클레오티드는 안정하고 표적 단백질에 특이적인 결합을 제공하는 핵산 구조일 수 있다. 또한, 간 표적 전달과 같은 표적 전달과 mRNA에 의해 전사된 단백질 발현 조절을 위해 본원에 개시된 접합 분자와의 접합을 통해 접합체를 형성하는데 mRNA자체나 그 단편과 같은 폴리뉴클레오티드가 적합하다는 것은 당업자에 의해 쉽게 이해될 것이다. 따라서 본원에서, "기능성 올리고뉴클레오티드" 는 또한 mRNA 나 그 단편을 포함할 수있다.
일부 실시 태양에서, 기능성 올리고뉴클레오티드는 상기 표적 서열과 상호작용 할 수 있고, 이에 의해 표적 서열 분자의 정상 기능에 영향을 미친다. 예시로 파괴 또는 mRNA 번역 억제 또는 엑손 스킵(skipping)으로 인한 대안적 mRNA 스플라이싱 등이 발생한다. 일부 실시 태양에서, 기능성 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 염기와 상보적이다. 일부 실시 태양에서, 기능성 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 염기와 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상보적이거나, 표적 서열과 완전히 상보적일 수 있다. 일부 실시 태양에서, 기능적 올리고뉴클레오티드는 표적 서열과 비 상보적인 1, 2, 또는 3 염기를 가질 수 있다. 일부 실시 태양에서, 기능성 올리고뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클리오티드, 리보뉴클리오티드, 및 변성 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 태양에서, 기능적 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 키메라, 또는 이중 가닥 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 하이브리드이다.
이와 같이, 일부 실시 태양에서 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체에 적합한 기능성 올리고뉴클레오티드는 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA, 항-마이크로 RNA (antimiR), 마이크로RNA 길항제(안타고미르(antagomir)), 마이크로RNA 모방제, 디코이(decoy) 올리고뉴클레오티드, 면역 자극제, G-쿼드플렉스(G-quadruplex), 스플라이스 변경(splice altering), 단일 가닥 RNA (ssRNA), 역배열 핵산, 핵산 앱타머, 작은 활성화 RNA (saRNA), 스템-루프 RNA 또는 DNA 중 하나 이상일 수 있다. WO2015/006740A2 는 올리고뉴클레오티드에 접합된 상이한 리간드를 포함한 접합체를 개시하고, 상기 리간드는 링커(linkers)를 통해 올리고뉴클레오티드에 결합된다. 올리고뉴클레오티드는 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA, 항 마이크로RNA (antimiR), 안타고미르, 마이크로RNA 모방제, 디코이 올리고뉴클레오티드(decoy), 면역 자극제, G-쿼드플렉스, 스플라이스 변경(splice altering), 단일 가닥 RNA (ssRNA), 역배열 핵산 (antisense), 앱타머(aptamer), 스템-루프 RNA 또는 DNA으로 이루어진 군에서 선택된다. 이 접합체들은 생체 내에서 올리고뉴클레오티드의 전달에 있어 우수한 안정성을 보인다. 추가 실시 태양에서 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체에 적합한 기능성 올리고뉴클레오티드는 WO2009082607A2, WO2009073809A2 또는 WO2015006740A2에 개시된 올리고뉴클레오티드이며, 본 발명과 일치하는 전 범위에서 해당 문헌의 전문이 참고로 포함된다.
본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체는 기능성 올리고뉴클레오티드 같은 활성제의 간-표적화 전달을 증가시키고, 그 결과 기능성 올리고뉴클레오티드와 세포의 표적 서열 상호 작용을 개선시킴으로써 간세포와 같은 특정 세포에서 특정 유전자의 이상 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시 태양에서, 특정 유전자는 간의 내재 유전자 또는 간에서 재생산되는 병원체 유전자일 수 있다. 간세포에서 이상 발현된 유전자는 ApoB, ApoC, ANGPTL3, PCSK9, SCD1, TIMP-1, Col1A1, FVII, STAT3, p53, HBV, 및 HCV 등과 같은 유전자일 수 있다. 일부 실시 태양에서, 간 세포에서 이상 발현된 유전자는 HBV 유전자, ANGPTL3 유전자, APOC3 유전자이다. 본원 개시의 문맥에서, HBV 유전자는 Genbank Accession No. NC_003977.1에 나타난 서열을 가지고 있는 유전자이고; ANGPTL3 유전자는 Genbank Accession No. NM_014495.3 에 나타난 mRNA 서열을 가지고 있는 유전자이며; APOC3 유전자는 Genbank Accession No. NM_000040.1 에 나타난 mRNA 서열을 가지고 있는 유전자이다.
일부 실시 태양에서, "표적 서열"은 표적 mRNA이다. 본원 개시의 문맥에서, "표적 mRNA"는 간세포에서 이상 발현되는 유전자에 상응하는 mRNA를 지칭하며, 과발현된 유전자에 상응하는 mRNA 또는 저발현된 유전자에 상응하는 mRNA 모두 일 수 있다. 일부 실시 태양에서, 대다수의 질병은 mRNA 의 과발현으로부터 유도 되기 때문에 바람직하게 표적 mRNA는 과발현된 유전자에 상응하는 mRNA 이다. 본원에 개시된 일부 실시 태양에서, 상기 언급한 이상 발현 유전자에 상응하는 표적 mRNA는 ApoB, ApoC, ANGPTL3, PCSK9, SCD1, TIMP-1, Col1A1, FVII, STAT3, p53, HBV, 및 HCV, 등의 유전자와 상응하는 mRNA일 수 있다. 일부 실시 태양에서, 표적 mRNA는 HBV 유전자, ANGPTL3 유전자 또는 APOC3 유전자로부터 전사된 mRNA일 수 있다.
화학식 A59의 P 원자는 올리고뉴클레오티드의 임의의 뉴클레오티드 같이 올리고뉴클레오티드 서열의 임의의 가능한 위치에 연결될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 본원에서 개시한 올리고뉴클레오티드 접합체의 기능성 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 단일 가닥 RNA 또는 압타머) 이다. 이 경우에 화학식 A59 의 P원자는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 말단부에 연결될 수 있으며, 이는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 한쪽 말단과 가장 가까운 4개의 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시 태양에서, 화학식 A59의 P 원자는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 한 말단과 연결된다.
일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체에서 기능성 올리고뉴클레오티드는 정배열 가닥(sense strand)과 역배열 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA, 마이크로RNA, 또는 DNA)이다. 일부 실시 태양에서, 화학식 A59의 P원자는 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 정배열 가닥 또는 역배열 가닥의 말단부에 연결될 수 있으며, 정배열 또는 역배열 가닥의 한쪽 말단과 가장 가까운 4개의 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시 태양에서,화학식 A59의 P원자는 정배열 또는 역배열 가닥의 한쪽 말단에 연결될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 화학식 A59의 P원자는 정배열 가닥의 3' 말단에 연결된다. 화학식 A59의 P원자가 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 정배열 가닥에서 상기 위치에 연결된 경우에, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체는 세포로 들어간 이후 풀리는 동안 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 분리된 역배열 가닥을 방출(release)할 수 있다. 그래서 표적 mRNA 가 단백질로 번역되는 것을 막고, 특정 유전자의 발현을 막는다.
화학식 A59의 P원자는 올리고뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드의 임의의 가능한 위치에, 예를 들어 5', 2' 또는 3' 위치 또는 뉴클레오티드의 염기에 연결될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 화학식 A59의 P원자는 포스포디에스테르결합을 형성하며 올리고뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드의 2', 3', 또는 5' 위치에 연결될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 화학식 A59의 P원자는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 서열의 정배열 가닥 3′말단의 뉴클레오티드의 3′-히드록시기의 탈 보호 후에 형성된 산소 원자와 연결될 수 있거나, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 서열에서 정배열 가닥 뉴클레오티드의 2'-히드록시의 수소원자를 치환하거나, 정배열 가닥의 5′말단의 뉴클레오티드의 5'-히드록시기의 수소 원자를 치환한 뉴클레오티드에 연결될 수 있다.
제한하고자 하는 바는 아지니만, 하기 발명의 예시 실시형태에서 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체의 기능성 올리고뉴클레오티드가 소형 간섭 RNA (siRNA)인 것에 대한 실시 형태나 실시예에서 발명이 추가적으로 상세하게 설명된다. 이 경우에 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체는siRNA 접합체이다. 본원 개시의 문맥에서, 설명의 편의상 해당 실시 태양에서 siRNA 접합체는 본원에서 개시된 siRNA 접합체를 지칭한다. 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체의 올리고뉴클레오티드가 siRNA만 될 수 있다는 것을 의미하는 것은 아니며, 본원에 개시되거나 당업자에게 알려진 올리고뉴클레오티드나 활성 약물이 추가 대안일 수도 있다. siRNA 접합체에 대한 구체적인 설명에 기초하여, 다른 활성 약물이나 기능성 올리고뉴클레오티드가 상기 주어진 접합 분자와 접합될 때에도 유사하게 작용할 것이라고 예상된다.
siRNA는 건설 블록과 같이 뉴클레오티드 군(groups)을 포함한다는 것이 당업자에게 알려져 있다. 뉴클레오티드 군은 차례로 포스페이트기와 리보오스기 및 염기를 포함한다. 일반적으로, 기능성 siRNA 같은 활성 siRNA는 약 12-40개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있으며, 일부 실시 태양에서는 약 15-30개의 뉴클레오티드 길이다. 각 siRNAs의 뉴클레오티드는 독립적으로 변성되거나 변성되지 않은 뉴클레오티드일 수 있다. 안정성을 증가시키기 위해, 하나 이상의 siRNA 뉴클레오티드는 변성 뉴클레오티드다.
본원 개시에서 발명자는 하기 실시 태양에서 설명된 siRNAs가 더 높은 활성 및/또는 안정성을 가지고 있고 따라서 상기 개시된 목적을 위해 siRNAs가 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 siRNA 접합체의 siRNA 의 각 뉴클레오티드 (또한 이후 본원 개시의 siRNA라고도 한다)는 독립적으로 변성되거나 변성되지 않은 뉴클레오티드이다. siRNA는 정배열 가닥과 역배역 가닥을 포함하며, 상기 정배열 가닥은 뉴클레오티드 서열 1을 포함하고, 역배열 가닥은 뉴클레오티드 서열2를 포함한다. 뉴클레오티드 서열 1 및 뉴클레오티드 서열 2 는 모두 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오티드 길이를 가지고 있고 이중-가닥 상보 영역을 형성하기 위해 적어도 부분적으로 역 상보적이다. 뉴클레오티드 서열 2 는 표적mRNA 의 뉴클레오티드 서열 단편으로 지칭되는 제 1 뉴클레오티드 서열 단편과 상보적이다.
일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 siRNA 은 3 mg/kg 농도에서 HBV 유전자의 발현을 50% 이상 억제하거나, ANGPTL3 유전자의 발현을 50% 이상 억제하거나, APOC3 유전자 발현을 50% 이상 억제하는 siRNA를 지칭한다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 siRNA는 3 mg/kg 농도에서 HBV 유전자, ANGPTL3 유전자, 또는 APOC3 유전자의 발현을 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80% 이상 억제하는 siRNA를 지칭한다.
일부 실시 태양에서, 뉴클레오티드 서열 1 은 제 1 뉴클레오티드 서열 단편에서 3개 뉴클레오티드 이상 상이하지 않고 동일한 길이를 가지고; 뉴클레오티드 서열 2 는 뉴클레오티드 서열 B와 3개 뉴클레오티드 이상 상이하지 않고 동일한 길이를 가지며, 뉴클레오티드 서열 B는 제 1 뉴클레오티드 서열 단편에 완전히 역 상보적인 뉴클레오티드 서열이다. 임의의 이론에 구속되지 않고자 하는 의도에서, 이러한 독특한 뉴클레오티드 차이는 siRNA 접합체의 활성 감소를 현저하게 줄이지 않을 것이라서, 본원 개시의 범위에 속한다.
일부 실시 태양에서, 뉴클레오티드 서열 1 은 뉴클레오티드 서열 2와 기본적으로 역상보적이거나, 실질적으로 역상보적이거나, 또는 완전히 역상보적이다.
일부 실시 태양에서, 뉴클레오티드 서열 1은 제 1 뉴클레오티드 서열 단편과 1 뉴클레오티드 이상 차이나지 않으며; 및/또는 뉴클레오티드 서열 2는 뉴클레오티드 서열 B와 1 뉴클레오티드 이상 차이나지 않는다. 일부 실시 태양에서, 뉴클레오티드 서열 2 과 뉴클레오티드 서열 B 사이의 뉴클레오티드 차이는 뉴클레오티드 서열 2의 5' 말단부터 3' 말단까지에서 첫번째 뉴클레오티드 Z'의 위치에서 차이를 포함한다. 일부 실시 태양에서, 뉴클레오티드 서열 1의 5' 말단부터 3' 말단까지에서 마지막 뉴클레오티드 Z는 Z'와 상보적인 뉴클레오티드이다.
일부 실시 태양에서, 정배열 가닥은 뉴클레오티드 서열 3을 포함하고, 역배열 가닥은 뉴클레오티드 서열 4를 포함한다. 뉴클레오티드 서열 3 과 4 는 1-4 뉴클레오티드의 동일한 길이를 가진다. 뉴클레오티드 서열 3은 뉴클레오티드 서열 1의 5'말단과 연결되며, 뉴클레오티드 서열 4은 뉴클레오티드 서열 2의 3'말단과 연결된다. 뉴클레오티드 서열 4는 제 2 뉴클레오티드 서열 단편과 상보적이며, 제 2뉴클레오티드 서열은 제 1 뉴클레오티드 서열 단편과 인접하고, 표적 mRNA의 뉴클레오티드 서열 4 와 동일한 길이를 갖는다. 일부 실시 태양에서, 뉴클레오티드 서열 3은 뉴클레오티드 서열 4와 실질적으로 역 상보적이거나 완전히 역 상보적이다. 따라서, 일부 실시 태양에서, 정배열 가닥과 역배열 가닥은 19-23개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다.
일부 실시 태양에서, 본원에 개시한 siRNA 는 뉴클레오티드 서열 5를 포함한다. 뉴클레오티드 서열 5은 1-3개의 뉴클레오티드 길이를 가지며 역배열 가닥의 3' 말단에 연결되고, 역배열 가닥의 3' 돌출부(overhang)를 구성한다. 일부 실시 태양에서, 뉴클레오티드 서열 5 는 1 또는 2개의 뉴클레오티드 길이다. 이와 같이, 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 siRNA 에서 정배열 가닥과 역배열 가닥의 길이 비는 19/20, 19/21, 20/21, 20/22, 21/22, 21/23, 22/23, 22/24, 23/24, 또는 23/25일 수 있다.
일부 실시 태양에서, 뉴클레오티드 서열 5 은 2개의 뉴클레오티드길이를 가진다. 게다가, 뉴클레오티드 서열 5는 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 2개의 연속적인 티미딘 디옥시 뉴클레오티드 또는 2개의 연속적인 우리딘 뉴클레오티드이거나, 또는 제 3 뉴클레오티드 서열 단편과 상보적이다. 제 3 뉴클레오티드 서열 단편은 제 1 또는 제 2 뉴클레오티드 서열 단편과 인접한 뉴클레오티드 서열로, 뉴클레오티드 서열 5와 동일한 길이를 가진다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 siRNA 에서 정배열 가닥 과 역배열 가닥의 길이비는 19/21 또는 21/23이다. 상기, 본원에 개시된 siRNA는 간세포의 mRNA대해 상당한 침묵 활성을 나타낸다.
일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 siRNA의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 변성 또는 변성되지 않은 뉴클레오티드이다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 siRNA는 변성되지 않은 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 siRNA 는 변성된 뉴클레오티드 군을 포함한다.
현재 당업계에 siRNA 변성에 사용되는 골격 변성 (또는 포스페이트기 변성과 같은 뉴클레오티드간 연결 변성), 리보오스기 변성, 염기 변성, 등을 포함한 많은 수단이 있다(예를 들어 Watts, J.K., G. F. Deleavey and M. J.Damha, Chemically Modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today, 2008.13(19-20): p.842-55를 참조, 이는 전문이 본원에 참조로 포함된다.).
본원 개시의 맥락에서, “변성 뉴클레오티드”라는 용어는 상기 리보오스 기의 2'-히드록시가 다른 기로 치환되어 형성되는 것과 같이 리보오스기가 변성된 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 변성 염기를 포함한 뉴클레오티드를 포함한다.
본원 개시의 일부 실시 태양에서, 정배열 또는 역배열 가닥의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변성 뉴클레오티드며, 및/또는 하나 이상의 포스페이트는 변성된 기를 가진 포스페이트기이다. 다시 말해, 정배열 가닥 및 역배열 가닥에서 하나 이상 단일 가닥의 포스페이트-리보오스 골격에서 포스페이트 및/또는 리보오스기의 한 부분 이상은 변성된 기를 가진 포스페이트 및/또는 리보오스기(또는 변성 포스페이트 및/또는 변성 리보오스)이다. 본원 개시의 일부 실시 태양에서 정배열 가닥 및/또는 역배열 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변성 뉴클레오티드다.
일부 실시 태양에서, 정배열 가닥 및 역배열 가닥의 각 뉴클레오티드는 독립적으로 플루오로 변성 뉴클레오티드 또는 비-플루오로 변성 뉴클레오티드다.
“플루오로 변성 뉴클레오티드”는 화학식 (207)로 표현되는 것처럼 리보오스기의 2'-히드록시가 플루오르로 치환되어 형성된 뉴클레오티드를 지칭한다.
“비-플루오르 변성 뉴클레오티드” 리보오스기의 2'-히드록시가 플루오르가 아닌 기로 치환되어 형성된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체를 지칭한다. 일부 실시 태양에서, 각 비-플루오르 변성 뉴클레오티드는 독립적으로 리보오스기의 2'-히드록시가 비-플루오르기로 치환되어 형성된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체이다.
리보오스기의 2’-히드록시가 비-플루오르기로 치환되어 형성되는 뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예시로는 2'-알콕시 변성 뉴클레오티드, 2'-치환 알콕시 변성 뉴클레오티드, 2'-알킬 변성 뉴클레오티드, 2'- 치환 알킬 변성 뉴클레오티드, 2'-아미노 변성 뉴클레오티드, 2'-치환 아미노 변성 뉴클레오티드 또는 2'-데옥시 뉴클레오티드이다.
일부 실시 태양에서, 2'-알콕시 변성뉴클레오티드는 화학식 (208)으로 표현된 메톡시 변성 뉴클레오티드다. 일부 실시 태양에서, 2'-치환 알콕시 변성뉴클레오티드는 화학식 (209)로 표현된 2'-O-메톡시에톡시 변성 뉴클레오티드다. 일부 실시 태양에서, 2'-아미노 변성 뉴클레오티드는 화학식 (210) 로 표현된다. 일부 실시 태양에서, 2'-데옥시 뉴클레오티드 (DNA)는 화학식 (211) 로 표현된다.
“뉴클레오티드 유사체”는 핵산에서 뉴클레오티드를 대체할 수 있는 군을 지칭하며, 아데닌 리보뉴클레오티드, 구아닌 리보뉴클레오티드, 시토신 리보뉴클레오티드, 우라실 리보뉴클레오티드 또는 티민 데옥시리보뉴클레오티드와는 차이가 있다. 일부 실시 태양에서, 뉴클레오티드 유사체는 예를 들어 이소 뉴클레오티드, 가교 핵산 (BNA) 뉴클레오티드 또는 비고리형(acyclic) 뉴클레오티드일 수 있다.
BNA 뉴클레오티드는 제한적이거나 접근하기 어려운 뉴클레오티드이다. BNA는 “고정된” C3'-엔도 당(sugar) 주름잡힘(puckering)가 있는 5-, 6- 원자 또는 7-원자 고리 가교 구조 (bridged structure)를 포함할 수 있다. 가교는 전형적으로 리보오스 고리의 2'- 및 4'-위치에서 통합되며 화학식 (212), (213) 및 (214)에 각각 표현된 LNA, ENA 및 cET BNA같은 2', 4'-BNA 뉴클레오티드를 제공한다.
비고리형(acyclic) 뉴클레오티드는 리보오스 고리가 열린 뉴클레오티드이며, 예시로 화학식 (215) 및 (216)로 각각 표현된 잠금 해제(unlocked) 핵산(UNA) 뉴클레오티드 및 글리세롤 핵산 (GNA) 뉴클레오티드이다
상기 R 은 H, OH 또는 알콕시 (O-알킬)이다.
이소뉴클레오티드는 리보오스 고리의 염기의 위치가 변경된 뉴클레오티드이며, 예시로는 화학식 (217) 또는 (218)로 각각 표현된 것과 같이 리보오스 고리에서 염기를 포함한 화합물이 1' 에서부터 2' 또는 3'까지 이동된 것이다.
상기 염기는 핵산 염기 A, U, G, C 또는 T를 나타내고; R은 H, OH, F 또는 상기 설명한 비-플루오르 기이다.
일부 실시 태양에서, 뉴클레오티드 유사체는 이소뉴클레오티드, LNA, ENA, cET, UNA 또는 GNA이다. 일부 실시 태양에서, 각 비-플루오르 변성 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드고, 이는 리보오스기의 2’-히드록시가 메톡시기로 치환되어 형성되는 뉴클레오티드를 지칭한다.
본원 개시의 맥락에서, "플루오르 변성 뉴클레오티드", "2'-플루오르 변성 뉴클레오티드", "리보오스기의 2'-히드록시가 플루오르로 치환된 뉴클레오티드" 및 "2'-플루오르리보실(fluororibosyl) 뉴클레오티드" 는 동일한 의미이며, 뉴클레오티드의 2’-히드록시가 플루오르로 치환되어 화학식 (207)로 표현된 구조를 형성하는 뉴클레오티드를 지칭한다. "메톡시 변성 뉴클레오티드", "2'-메톡시 변성 뉴클레오티드", "리보오스기의 2'-히드록시가 메톡시로 치환된 뉴클레오티드" 및 "2'-메톡시리보실(methoxyribosyl) 뉴클레오티드"는 동일한 의미이며, 뉴클레오티드에서 리보오스기의 2’-히드록시가 메톡시로 치환되어 화학식 (208)로 표현된 구조를 형성하는 뉴클레오티드를 지칭한다.
일부 실시 태양에서, 본원 개시의 siRNA는 다음과 같이 변성된 siRNA이다: 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 정배열 가닥에서 뉴클레오티드 서열 1의 7, 8 및 9 위치의 뉴클레오티드는 플루오르 변성 뉴클레오티드고, 정배열 가닥에서 나머지 위치의 뉴클레오티드는 메톡시 변성뉴클레오티드이며; 및/또는 역배열 가닥에서 뉴클레오티드 서열 2의 2, 6, 14 및 16 위치의 뉴클레오티드는 플루오르 변성 뉴클레오티드고, 역배열 가닥에서 나머지위치의 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드다. 일부 실시 태양에서, 본원 개시의 siRNA 는 다음과 같이 변성된 siRNA이다: 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 정배열 가닥에서 뉴클레오티드 서열 1의 5, 7, 8 및 9 위치의 뉴클레오티드는 플루오르 변성 뉴클레오티드고, 정배열 가닥에서 나머지 위치의 뉴클레오티드는 메톡시 변성뉴클레오티드다; 및/또는 역배열 가닥에서 뉴클레오티드 서열 2의 2, 6, 8, 9, 14 및 16 위치의 뉴클레오티드는 플루오르 변성 뉴클레오티드고, 역배열 가닥에서 나머지 위치의 뉴클레오티드는 2'-메톡시 변성 뉴클레오티드다. 일부 실시 태양에서, 본원 개시의 siRNA 는 다음과 같이 변성된 siRNA이다: 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, siRNA의 정배열 가닥에서 뉴클레오티드 서열 1의 7, 8 및 9 위치의 뉴클레오티드는 플루오르 변성 뉴클레오티드고, 정배열 가닥에서 나머지 위치의 뉴클레오티드는 메톡시 변성뉴클레오티드다; 및/또는 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 역배열 가닥에서 뉴클레오티드 서열 2의 2, 6, 14 및 16 위치의 뉴클레오티드는 플루오르 변성 뉴클레오티드고, 역배열 가닥에서 나머지 위치의 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드다.
본원에 개시된 siRNA의 일부 실시 태양에서, 뉴클레오티드는 포스페이트기의 변성을 갖는다. 본원 개시의 문맥에서, 포스페이트기의 변성은 일부 실시 태양에서 화학식 (201)에 표현된 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 변성이고, 이것은 포스포디에스테르 결합에서 비-가교(non-bridging) 산소 원자를 황 원자로 치환해서 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 디에스터 결합으로 전환된다. 일부 실시 태양에서, 이러한 변성은 siRNA의 구조를 안정하게 하고 염기 쌍에 대한 높은 특이성과 높은 친화성을 유지한다.
(201)
본원 개시의 일부 실시 태양에 따르면, siRNA에서, 포스포로티오에이트 결합은 정배열 또는 역배열 가닥의 양쪽 끝에서부터 제 1 또는 제 2 뉴클레오티드사이, 정배열 가닥 또는 역배열 가닥의 양쪽 끝에서부터 제 2 또는 제 3 뉴클레오티드사이, 또는 이들의 임의의 결합 중 하나 이상의 위치에 존재한다. 일부 실시 태양에서, 포스포로티오에이트 결합은 정배열 가닥 5'말단을 제외한 상기 모든 위치에 존재한다. 일부 실시 태양에서, 포스포로티오에이트 결합은 정배열 가닥의 3’말단을 제외한 상기 모든 위치에 존재한다. 일부 실시 태양에서, 포스포로티오에이트 결합은 하나 이상의 다음 위치에 존재한다.
정배열 가닥의 5’말단으로부터 제 1 과 제 2 뉴클레오티드 사이;
정배열 가닥의 5’말단으로부터 제 2 과 제 3 뉴클레오티드 사이;
정배열 가닥의 3’말단으로부터 제 1 과 제 2 뉴클레오티드 사이;
정배열 가닥의 3’말단으로부터 제 2 과 제 3 뉴클레오티드 사이;
역배열 가닥의 5’말단으로부터 제 1 과 제 2 뉴클레오티드 사이;
역배열 가닥의 5’말단으로부터 제 2 과 제 3 뉴클레오티드 사이;
역배열 가닥의 3’말단으로부터 제 1 과 제 2 뉴클레오티드 사이; 및
역배열 가닥의 3’말단으로부터 제 2 과 제 3 뉴클레오티드 사이.
본원 개시의 일부 실시 태양에 따르면, siRNA 분자에서 역배열 가닥 서열의 5'-말단 뉴클레오티드는 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드다.
일부 실시 태양에서, 5'-포스페이트 뉴클레오티드는 화학식 (202)로 표현되는 구조를 가진다.
(202);
5′-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드의 일반적인 종류는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 그 예를 들면 Anastasia Khvorova and Jonathan K. Watts, The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nature Biotechnology, 2017, 35(3): 238-48에 개시된 다음 화학식 (203) 내지 (206)로 나타나는 4개의 뉴클레오티드이다:
상기 R은 H, OH, F, 및 메톡시로 이루어진 군으로부터 선택되는 기이다;
"염기”는 A, U, C, G, 또는 T 중에서 선택되는 염기를 나타낸다.
일부 실시 태양에서, 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드는 화학식 (203)에 나타난 비닐 포스페이트 (VP) 변성을 포함하는 뉴클레오티드이거나, 화학식 (202)에 나타난 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 화학식 (205)에 나타난 5'-포스포로티오에이트 변성 뉴클레오티드다.
본원 개시의 발명자들은 본원에 개시된 siRNA 접합체가 표적 mRNA 침묵 활성(silencing activity)을 실질적으로 손상하지 않는 반면 실질적으로 개선된 혈청 안정성을 보여 생체 내에서 뛰어난 유전자 발현 억제 효과를 초래한다는 예측하지 못한 점을 발견하였다. 본원에 개시된 siRNA 접합체는 생체 내에서 더 높은 전달 효율을 갖는 것으로 나타난다. 본원 개시의 일부 실시 태양에 따르면, 본원 개시의 올리고뉴클레오티드 접합체는 따라서 표 1 내지 표 6에 나타난 바와 같은 siRNA를 포함하는 siRNA 접합체이다.
번호. 염기 서열 방향 5' - 3' 서열 번호
siHBa1 *S CCUUGAGGCAUACUUCAAA 1
AS UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU 2
siHBa2 S GACCUUGAGGCAUACUUCAAA 3
AS UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUCGG 4
siHBa1M1 S CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 5
AS UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 6
siHBa1M2 S CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 7
AS UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 8
siHBa2M1 S GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 9
AS UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm 10
siHBa2M2 S GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 11
AS UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm 12
siHBa1M1S S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 14
siHBa1M2S S CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 15
AS UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 16
siHBa2M1S S GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 17
AS UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 18
siHBa2M2S S GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 19
AS UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 20
siHBa1M1P1 S CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 5
AS P1-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 21
siHBa1M2P1 S CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 7
AS P1-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 22
siHBa2M1P1 S GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 9
AS P1-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm 23
siHBa2M2P1 S GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 11
AS P1-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm 24
siHBa1M1SP1 S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 25
siHBa1M2SP1 S CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 15
AS P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 26
siHBa2M1SP1 S GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 17
AS P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 27
siHBa2M2SP1 S GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 19
AS P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 28
번호. 염기 서열 방향 5' - 3' 서열 번호
siHBb1 S UGCUAUGCCUCAUCUUCUA 29
AS UAGAAGAUGAGGCAUAGCAGC 30
siHBb2 S UGCUAUGCCUCAUCUUCUA 29
AS UAGAAGAUGAGGCAUAGCAUU 31
siHBb1M1 S UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 32
AS UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm 33
siHBb2M1 S UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 32
AS UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm 34
siHBb1M2 S UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 35
AS UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm 36
siHBb2M2 S UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 35
AS UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm 37
siHBb1M1S S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm 39
siHBb2M1S S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 40
siHBb1M2S S UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 41
AS UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm 42
siHBb2M2S S UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 41
AS UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 43
siHBb1M1P1 S UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 32
AS P1-UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm 44
siHBb2M1P1 S UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 32
AS P1-UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm 45
siHBb1M2P1 S UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 35
AS P1-UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm 46
siHBb2M2P1 S UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 35
AS P1-UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm 47
siHBb1M1SP1 S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS P1-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm 48
siHBb2M1SP1 S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS P1-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 49
siHBb1M2SP1 S UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 41
AS P1-UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm 50
siHBb2M2SP1 S UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 41
AS P1-UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 51
번호 염기 서열 방향 5'- 3' 서열 번호
siHBc1 S UCUGUGCCUUCUCAUCUGA 52
AS UCAGAUGAGAAGGCACAGACG 53
siHBc1M1 S UmCmUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 54
AS UmCfAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmCmGm 55
siHBc1M2 S UmCmUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 56
AS UmCfAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmCmGm 57
siHBc1M1S S UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 58
AS UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 59
siHBc1M2S S UmsCmsUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 60
AS UmsCfsAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 61
siHBc1M1P1 S UmCmUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 54
AS P1-UmCfAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmCmGm 62
siHBc1M2P1 S UmCmUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 56
AS P1-UmCfAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmCmGm 63
siHBc1M1SP1 S UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 58
AS P1-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 64
siHBc1M2SP1 S UmsCmsUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 60
AS P1-UmsCfsAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 65
번호. 염기 서열 방향5' - 3' 서열 번호
siHBd1 S CGUGUGCACUUCGCUUCAA 66
AS UUGAAGCGAAGUGCACACGGU 67
siHBd1M1 S CmGmUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 68
AS UmUfGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUm 69
siHBd1M2 S CmGmUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 70
AS UmUfGmAmAmGfCmGfAfAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUm 71
siHBd1M1S S CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 72
AS UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 73
siHBd1M2S S CmsGmsUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 74
AS UmsUfsGmAmAmGfCmGfAfAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 75
siHBd1M1P1 S CmGmUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 68
AS P1-UmUfGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUm 76
siHBd1M2P1 S CmGmUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 70
AS P1-UmUfGmAmAmGfCmGfAfAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUm 77
siHBd1M1SP1 S CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 72
AS P1-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 78
siHBd1M2SP1 S CmsGmsUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 74
AS P1-UmsUfsGmAmAmGfCmGfAfAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 79
번호. 염기 서열 방향5' - 3' 서열 번호
siAN1 S CCAAGAGCACCAAGAACUA 80
AS UAGUUCUUGGUGCUCUUGGCU 81
siAN2 S AGCCAAGAGCACCAAGAACUA 82
AS UAGUUCUUGGUGCUCUUGGCUUG 83
siAN1M1 S CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 84
AS UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm 85
siAN2M1 S AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 86
AS UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm 87
siAN1M2 S CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 84
AS UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm 88
siAN2M2 S AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 86
AS UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm 89
siAN1M3 S CmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 90
AS UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm 88
siAN2M3 S AmGmCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 91
AS UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm 89
siAN1M1S S CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 92
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 93
siAN2M1S S AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 94
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm 95
siAN1M2S S CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 92
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 96
siAN2M2S S AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 94
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm 97
siAN1M3S S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 96
siAN2M3S S AmsGmsCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 99
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm 97
siAN1M1P1 S CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 84
AS P1-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm 100
siAN2M1P1 S AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 86
AS P1-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm 101
siAN1M2P1 S CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 84
AS P1-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm 102
siAN2M2P1 S AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 86
AS P1-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm 103
siAN1M3P1 S CmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 90
AS P1-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm 102
siAN2M3P1 S AmGmCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 91
AS P1-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm 103
siAN1M1SP1 S CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 92
AS P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 104
siAN2M1SP1 S AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 94
AS P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm 105
siAN1M2SP1 S CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 92
AS P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 106
siAN2M2SP1 S AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 94
AS P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm 107
siAN1M3SP1 S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
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번호. 염기 서열 방향5' - 3' 서열 번호
siAP1 S CAAUAAAGCUGGACAAGAA 108
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siAP2 S CCCAAUAAAGCUGGACAAGAA 110
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siAP1M2S S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 124
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AS P1-UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 132
siAP2M1SP1 S CmsCmsCmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 122
AS P1-UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm 133
siAP1M2SP1 S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 124
AS P1-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 134
siAP2M2SP1 S CmsCmsCmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 126
AS P1-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm 135
*S: 정배열 가닥; AS: 역배열 가닥
상기 표에서, 대문자 C, G, U, 및 A 는 뉴클레오티의 염기 조성을 나타내며; 소문자 m은 문자 m의 왼쪽에 인접한 뉴클레오티드가 2'-메톡시 변성뉴클레오티드임을 나타내며; 소문자 f 는 문자 f의 왼쪽에 인접한 뉴클레오티드가 2'-플루오르 변성 뉴클레오티드임을 나타내며; 소문자 s 는 문자 s의 양 옆에 인접한 두 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; P1은 P1의 오른쪽에 인접한 뉴클레오티드가 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드인 것을 나타내고, 일부 실시 태양에서는 비닐 포스페이트 변성 뉴클레오티드(하기 실시예에서 VP로 나타난다)거나, 포스페이트 뉴클레오티드(하기 실시예에서 P로 나타난다) 또는 포스포로티오에이트 변성 뉴클레오티드(하기 실시예에서 Ps로 나타난다)이다.
변성 뉴클레오티드기는 상응하는 변성을 가지는 뉴클레오시드 단량체에 의해 본원에 개시된 siRNA에 도입된다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상응하는 변성을 가지는 뉴클레오시드 단량체의 제조와 뉴클레오티드기를 siRNA에 도입하는 방법 또한 당업자에게 잘 알려져 있다. 변성된 뉴클레오시드 단량체는 상용화되어 있거나 널리 알려진 방법으로 제조될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 접합체의 제조
본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체는 임의의 적절한 합성 경로를 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체는 포스포르아미다이트 고상 합성 조건 하에서 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 종류와 서열 각각에 따라 뉴클레오시드 단량체를 3' 에서 5' 방향으로 연속적으로 연결하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 각 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링(coupling), 캡핑(capping) 및 산화 또는 황화(sulfurization)의 4 단계의 반응을 포함한다. 일부 실시 태양에서, 이 방법은 커플링 제제의 존재와 커플링 반응 조건 하에서 화학식 (321)로 표현된 화합물과 뉴클레오시드 단량체 또는 고상 지지체에 연결된 뉴클레오티드 서열을 접촉시켜 커플링 반응을 통함으로써 뉴클레오티드 서열에 화학식 (321)로 표현된 화합물이 연결되는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시 태양에서, 이 방법은 보호기의 탈보호와 고상 지지체 절단, 분리 및 정제 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 태양에서, 올리고뉴클레오티드는 이중가닥 올리고뉴클레오티드이고, 제조 방법은 다음 단계를 포함한다: 커플링 제제의 존재와 커플링 반응 조건 하에서 화학식 (321)로 표현된 화합물을 정배열 또는 역배열 가닥의 3' 말단 뉴클레오시드 단량체과 접촉시키고, 화학식 (321)로 표현된 화합물을 서열의 제 1 뉴클레오티드 서열에 연결하여, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 정배열 또는 역배열 가닥을 합성하기 위해 3' 에서부터 5'까지 뉴클레오시드 단량체를 연속적으로 연결한다. 상기 화학식 (321)로 표현된 화합물은 R4 에서 제 1 작용기로 보호된 히드록시와 제 2 작용기로 화학식 (C1') 또는 (C3')로 나타나는 기를 포함하는 화합물이며, 화학식 (321)로 표현된 화합물은 제 1 뉴클레오시드 단량체 연결 전에 탈보호된다. 각 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링(coupling), 캡핑(capping) 및 산화 또는 황화(sulfurization)의 4 단계의 반응을 포함하며, 따라서 접합 분자와 연결된 정배열 또는 역배열 가닥을 얻는 단계; 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 다른 가닥을 합성하기 위해 3’에서 5’로 뉴클레오시드 단량체를 연속적으로 연결하는 단계, 상기 각 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화 또는 황화의 4 단계의 반응을 포함한다; 보호기의 제거와 고상 지지체 절단 단계; 분리와 정제를 통해 정배열 가닥 및 역배열 가닥을 얻는 단계; 어닐링(annealing)하는 단계를 포함한다.
일부 실시 태양에서, 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드이고, 제조 방법은 다음 단계를 포함한다: 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 정배열 가닥 및 역배열 가닥을 합성하기 위해 3' 부터 5'까지 뉴클레오시드 단량체를 연속적으로 연결, 각 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑 및 산화 또는 황화의 4 단계의 반응을 포함하며, 따라서 고상 지지체에 연결된 정배열 가닥 및 고상 지지체에 연결된 역배열 가닥을 얻는 단계; 커플링 제제의 존재와 커플링 반응 조건 하에서 화학식 (321)로 표현된 화합물을 고상 지지체에 연결된 정배열 가닥 및 고상 지지체에 연결된 역배열 가닥과 접촉, 그래서 화학식 (321)화합물을 정배열 또는 역배열 가닥에 연결하는 단계, 상기 화학식 (321)로 표현된 화합물의 R4 는 제 1 작용기로 포스포르아미다이트기를 포함한다; 보호기의 제거와 고상 지지체 절단 단계, 분리와 정제를 통해 올리고뉴클레오티드의 정배열 가닥 및 역배열 가닥을 얻고, 어닐링하는 단계를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드의 정배열 또는 역배열 가닥은 접합 분자에 연결된다.
일부 실시 태양에서, 화학식 A59의 P원자는 siRNA 의 정배열 가닥의 3’말단에 연결되고, 본원에 개시된 siRNA 접합체의 제조 방법은 다음을 포함한다:
(1) 상기 기재된 고상 지지체에 연결된 화학식 (321)로 표현된 화합물의 보호기 Rk 를 제거 (이하, 고상 지지체에 연결된 L-접합 분자라고도 지칭); L-접합 분자를 통해 고상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체를 얻기 위해, 커플링 제제의 존재와 커플링 반응 조건 하에서 고상 지지체에 연결된 L-접합 분자에 뉴클레오시드 단량체를 접촉하는 단계;
(2) 포스포르아미다이트 고상 합성 방법으로 L-접합 분자를 통해 고상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체에서부터 출발하여 3'부터 5'까지 siRNA의 정배열 가닥 합성하는 단계;
(3) 포스포르아미다이트 고상 합성 방법으로 siRNA의 역배열 가닥 합성하는 단계; 및
(4) 본원에 개시된 siRNA 접합체를 얻기 위해 siRNA의 정배열 가닥 및 역배열 가닥 분리 및 이를 어닐링하는 단계를 포함한다.
단계 (1)에서, L-접합 분자를 연결하는 고상 지지체의 보호기 Rk 를 제거하는 방법은 탈 보호 조건 하 화학식 (321)로 표현된 화합물을 탈 보호제와 접촉시키는 것을 포함한다. 탈 보호 조건은 온도 0-50℃, 일부 실시 태양에서 15-35℃, 및 반응 시간 30-300 초, 일부 실시 태양에서 50-150초를 포함한다. 탈 보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 및 모노클로로아세트산에서 하나 이상 선택될 수 있고, 일부 실시 태양에서 디클로로아세트산이다. 탈 보호제와 화학식 (322)로 표현된 화합물의 몰 비는 10:1 내지 1000:1이고, 일부 실시 태양에서 50:1 내지 500:1이다.
커플링 반응 조건 및 커플링제는 상기 커플링 반응에 적절한 임의의 조건 및 작용제일 수 있다. 일부 실시 태양에서, 고상 합성 방법에서 사용된 커플링 반응과 동일한 조건 및 작용제가 이용된다.
일부 실시 태양에서, 커플링 반응 조건은 반응 온도 0-50°C, 일부 실시 태양에서 15-35℃을 포함한다. 화학식 (321)로 표현된 화합물과 뉴클레오시드 단량체의 몰비는 1:1 내지 1:50일 수 있고, 일부 실시 태양에서는 1:2 내지 1:5이다. 화학식 (322)로 표현된 화합물과 커플링제의 몰 비는 1:1 내지 1:50일 수있고, 일부 실시 태양에서 1:3 내지 1:10이다. 반응 시간은 200-3000 초 일수 있고, 일부 실시 태양에서 500-1500 초이다. 커플링제는 1H-테트라졸, 5-에틸티오-1H-테트라졸 및 5-벤질티오-1H-테트라졸 중 하나 이상 선택될 수 있고, 일부 실시 태양에서는 5-에틸티오-1H-테트라졸이다. 커플링 반응은 유기용매 내에서 수행될 수 있다. 유기 용매는 무수 아세토니트릴, 무수 DMF 및 무수 디클로로메탄중 하나 이상 선택되고, 일부 실시 태양에서는 무수 아세토니트릴이다. 유기 용매의 양은 3-50 L/mol일 수있고, 일부 실시 태양에서 화학식 (321)화합물과 관련하여 5-20 L/mol이다.
단계 (2)에서, siRNA 접합체의 정배열 가닥 S는 상기 단계에서 준비된 L-접합 분자를 통해 고상 지지체에 연결된 뉴클레오시드 단량체에서부터 시작되는 포스포르아미다이트 고상 합성 방법에 의해 3' 에서 5' 방향으로 합성된다. 이 경우에, L-접합 분자는 생성된 정배열 가닥의 3'말단에 연결된다.
단계 (2)와 (3)에서 설명된 고상 합성의 다른 조건은 뉴클레오시드 단량체에 대한 탈보호 조건, 탈보호제의 종류와 양, 커플링 반응 조건, 커플링제의 종류와 양, 캡핑 반응 조건, 캡핑제의 종류와 양, 산화 반응 조건, 산화제의 종류와 양, 황화 반응 조건, 및 황화제의 종류와 양을 포함하고, 통상적으로 당업계에 이용되는 다양한 활성제, 양, 및 조건 이 상기 사용될 수 있다.
일부 실시 태양에서, 예를 들어 단계 (2) 및 (3)에서 설명된 고상 합성은 다음 조건을 사용할 수 있다:
뉴클레오시드 단량체에 대한 탈보호 조건은 온도 0-50℃이고, 일부 실시 태양에서 15-35℃, 및 반응 시간 30-300 초이고, 일부 실시 태양에서 50-150 초를 포함한다. 탈보호제는 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 및 모노클로로아세트산 중 하나 이상 선택될 수 있고, 일부 실시 태양에서는 디클로로아세트산이다. 탈보호제와 고상 지지체의 4,4′-디메톡시트리틸의 보호기의 몰 비는 2:1 내지 100:1일 수 있고, 일부 실시 태양에서는 3:1 내지 50:1이다.
커플링 반응 조건은 온도 0-50℃이고, 일부 실시 태양에서 15-35℃을 포함한다. 고상 지지체에 연결된 핵산 서열과 뉴클레오시드 단량체의 몰비는 1:1 내지 1:50일 수있고, 일부 실시 태양에서는 1:5 내지 1:15이다. 고상 지지체에 연결된 핵산서열과 커플링제의 몰 비는 1:1 내지 1:100이고, 일부 실시 태양에서는 1:50 내지 1:80이다. 반응 시간과 커플링제는 상기와 같이 선택될 수 있다.
캡핑 반응 조건은 온도 0-50℃, 일부 실시 태양에서 15-35℃, 및 반응 시간 5-500 초, 일부 실시 태양에서10-100 초를 포함한다. 캡핑제는 상기와 같이 선택될 수 있다. 캡핑제 총량과 고상 지지체에 연결된 핵산서열의 몰 비는 1:100 에서 100:1일 수 있고, 일부 실시 태양에서는 1:10 내지 10:1이다. 등몰의 무수 아세트산 및 N-메틸이미다졸이 이 캡핑제로 사용 되는 경우에, 무수 아세트산, N-메틸이미다졸, 및 고상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:1:10 내지 10:10:1일 수 있고, 일부 실시 태양에서는 1:1:2 내지 2:2:1이다.
산화 반응 조건은 온도 0-50℃, 일부 실시 태양에서 15-35℃, 및 반응 시간 1-100 초, 일부 실시 태양에서5-50 초를 포함한다. 일부 실시 태양에서, 산화제는 요오드(iodine) (추가 실시 태양에서 요오드 수의 형태로 제공)이다. 커플링 단계에서 산화제와 고상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 1:1 내지 100:1일 수 있고, 일부 실시 태양에서는 5:1 내지 50:1이다. 일부 실시 태양에서, 산화 반응은 테트라히드로푸란: 물: 피리딘 = 3:1:1 내지 1:1:3의 혼합 용매에서 수행된다. 황화 반응 조건은 온도 0-50℃, 일부 실시 태양에서 15-35℃, 및 반응 시간 50-2000초, 일부 실시 태양에서 100-1000 초를 포함한다. 일부 실시 태양에서, 황화제는 크산탄 수소화물이다. 커플링 단계에서 황화제와 고상 지지체에 연결된 핵산 서열의 몰 비는 10:1 내지 1000:1일 수 있고, 일부 실시 태양에서는 10:1 내지 500:1이다. 일부 실시 태양에서, 황화 반응은 아세토니트릴: 피리딘 = 1:3-3:1의 혼합 용매에서 수행된다.
본원에 제공된 방법에 따르면, 이 방법은 모든 뉴클레오시드 단량체을 연결한 이후 및 어닐링 전에 siRNA 정배열 가닥 및 역배열 가닥 분리를 추가적으로 포함한다. 분리 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며 일반적으로 고상 지지체에서 합성된 뉴클레오티드 서열을 분리하고, 염기, 포스페이트기 또는 리간드를 탈보호하고, 정제와 탈염하는 것을 포함한다.
siRNA 합성에서의 통상적인 절단 및 탈보호방법에 따라 합성 뉴클레오티드 서열은 고상 지지체로부터 절단될 수 있고 염기, 포스페이트기, 및 리간드상 보호기는 제거될 수 있다. 예를 들어, 고상 지지체에 연결되어 생성된 뉴클레오티드 서열은 농축된 수성 암모니아와 접촉된다; 탈보호하는 동안, A46-A54 군의 보호기 YCOO- 는 히드록실기로 전환되며, 그래서 S1 기는 상응하는 M1 기로 전환되며 화학식 (1)에 표현된 접합체를 제공한다. 이 경우에, 농축된 수성 암모니아는 25-30중량% 농도의 수성 암모니아일 수 있다. 농축된 수성 암모니아의 양은 표적 siRNA 서열에 따라 0.2 ml/μmol 내지 0.8 ml/μmol 일 수 있다.
합성 뉴클레오티드 서열에 하나 이상의 2'-TBDMS 보호가 있을 때, 이 방법은 2'-TBDMS 보호를 제거하기 위해 고상 지지체에서 분리한 뉴클레오티드 서열을 트리에틸아민 트리히드로플로라이드(trihydrofluoride)와 접촉시키는 것을 추가적으로 포함한다. 상기, 생성된 표적 siRNA 서열은 상응하는 뉴클레오시드에 유리 2'-히드록시를 가진다. 순수한 트리에틸아민 트리히드로플로라이드(trihydrofluoride)의 양은 표적 siRNA 서열에 따라 0.4 ml/μmol 내지 1.0 ml/μmol일 수 있다. 이러한 방법을 통해 본원에 개시된 siRNA 접합체가 얻어질 수 있다.
정제 및 탈염 방법은 당업자에 의해 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 핵산 정제는 NaBr 또는 NaCl의 구배 용리를 갖는 조제용 이온 크로마토그래피 정제 칼럼을 이용하여 수행될 수 있다; 생성물의 수집 및 조합 후, 역상 크로마토그래피 정제 칼럼이 탈염을 위해 사용될 수 있다.
합성하는 동안 합성 품질을 더 편리하게 제어하기 위해 핵산 서열의 순도와 분자량은 어느 때나 결정될 수있다. 이런 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예시로, 핵산의 순도는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있다. 분자량은 액상 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS)에 의해 결정될 수 있다.
어닐링 방법 또한 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 수소 결합을 통한 이중가닥 구조를 형성하기 위해 합성된 정배열 가닥 (S 가닥) 및 역배열 가닥 (AS 가닥)은 등몰비로 주입해 간단히 물에서 혼합되고, 70-95℃로 가열되고, 실온에서 냉각될 수 있다. 따라서 개시된 siRNA 접합체가 수득할 수 있다.
본원에 개시된 접합체를 수득한 후, 일부 실시 태양에서 합성된 siRNA 접합체는 합성 된 siRNA 접합체가 의도된 표적 siRNA 접합체이고 합성된 siRNA 서열이 예를 들어 상기 표 1 내지 표 6에 나타난 서열 중 하나와 같이 원하던 siRNA 서열인지 확인하기 위해 몰질량 검출 수단으로 LC-MS 와 같은 기구를 이용하여 특정될 수 있다.
본원에 개시된 접합체의 용도
본원에 개시된 바와 같이, 접합체는 이러한 전달이 필요한 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하기 위해 세포에 특정 활성제를 전달하기 위해 유용하다. 임의의 이론에 한정되고자 하는 바는 아니지만, 접합 분자의 공간적 배열이 세포 표면 수용체 표적화에 특별히 효과적이고, 따라서 로딩 활성제를 접촉하고 있는 세포에 운반한다. 일부 실시 태양에서, 이러한 접합체는 간세포를 표적화하는 올리고뉴클레오티드 접합체이다.
일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체는 뛰어난 간-표적화 특이성을 가지므로, 접합된 기능성 올리고뉴클레오티드를 효과적으로 간으로 전달할 수 있고, 그래서 간 세포의 특정세포 발현을 효과적으로 조절할 수 있다. 따라서 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체는 넓은 활용 전망을 가진다.
본원에 개시된 일부 실시 태양에서, 간세포에서 특정 유전자의 발현에 의해 유발되는 병리학적 상태 또는 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약의 제조에서 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체의 용도가 본원에 제공된다. 특정 유전자는 간에서 발현되는 내인성 유전자 또는 간에서 재 생산된 병원체 유전자일 수 있다. 일부 실시 태양에서, 특정 유전자의 예는 ApoB, ApoC, ANGPTL3, PCSK9, SCD1, TIMP-1, Col1A1, FVII, STAT3, p53, HBV 또는 HCV이다. 일부 실시 태양에서, 특정 유전자는 HBV 유전자, ANGPTL3 유전자, 또는 APOC3 유전자이다. 이와 상응하게, 질병은 만성 간 질환(chronic liver disease), 간염(hepatitis), 간 섬유증(hepatic fibrosis), 간 증식성 질환(liver proliferative diseases) 및 이상지질혈증(dyslipidemia) 중에서 선택된다. 일부 실시 태양에서, 이상 지질 혈증(dyslipidemia)은 고콜레스테롤 혈증(hypercholesterolemia), 고중성지질 혈증(hypertriglyceridemia), 또는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)이다.
본원에 개시된 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하여 간세포에서 특정 유전자의 발현으로 발생하는 병리학적 상태 또는 질병을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시 태양에서, 특정 유전자는 ApoB, ApoC, ANGPTL3, PCSK9, SCD1, TIMP-1, Col1A1, FVII, STAT3, p53, HBV 또는 HCV이다. 일부 실시 태양에서, 특정 유전자는 HBV 유전자, ANGPTL3 유전자, 및 APOC3 유전자에서 선택된다. 이와 상응하게, 질병은 만성 간 질환, 간염, 간 섬유증, 간 증식성 질환 및 이상지질혈증 중에서 선택된다. 일부 실시 태양에서, 이상지질혈증은 고콜레스테롤 혈증, 고중성지질 혈증, 또는 죽상동맥경화증이다. 일부 실시 태양에서, 본원에서 제공된 접합체는 바람직하지 않은 세포 증식을 특징으로 하는 질환, 혈액 질환, 대사 질환, 및 염증을 특징으로 하는 질환을 포함하는 다른 간 질환을 치료하는데 또한 이용될 수 있다. 간의 증식성 질환은 암, 간세포암종(hepatocellular carcinoma) (HCC), 간 전이(hepatic metastasis) 또는 간모세포종(hepatoblastoma)과 같은 양성 또는 악성 질환일 수 있다. 간 혈액학(Liver hematology) 또는 염증성 질환(inflammatory diseases)은 혈액 응고 인자(blood coagulation factors), 보체-매개 염증(complement-mediated inflammation), 또는 섬유증(fibrosis)을 수반하는 질환일 수 있다. 간 대사성 질환은 이상지질혈증 및 불규칙한 포도당 조절(irregular glucose regulation)을 포함한다. 일부 실시 태양에서, 이 방법은 간 질환에 관여하는 유전자 서열에 높은 상동성을 가지는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 투여를 포함한다.
본원에 개시된 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 siRNA 접합체를 간세포와 접촉시키는 것을 포함하여 간세포에서 특정유전자의 발현을 억제하는 방법을 본원에서 제공한다.
본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 방법으로 유전자 발현을 조절하는 기전(mechanism)을 통해서 간세포에서 특정 유전자의 발현으로 발생하는 병리학적 상태 또는 질병의 예방 및/또는 치료 목적이 달성될 수 있다. 그래서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체는 상기 개시된 병리학적 상태 또는 질병의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있거나 상기 개시된 병리학적 상태 또는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약품의 제조를 위해 사용될 수 있다.
상기 사용한 것처럼, "투여"라는 용어와 그 문법적 등가물은 원하는 효과를 내기 위해 적어도 원하는 위치에 부분적으로 접합체를 위치시키는 방법 또는 경로에 의해 올리고뉴클레오티드 접합체 같은 접합체를 대상체의 신체에 전달하는 것을 지칭한다. 본원에 개시된 방법을 위한 투여의 적합한 경로는 국소 투여 및 전신 투여를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 국소 투여는 대상체의 체순환과 비교할 때 더 많은 올리고뉴클레오티드 접합체를 특정 위치에 전달하는 반면; 전신 투여는 올리고뉴클레오티드 접합체를 환자의 체순환에 전달한다. 일부 실시 태양에서, 간세포에서 특정 유전자의 발현으로 발생하는 병리학적 상태 또는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 수단을 제공하는 본원 개시의 목적을 고려한, 간에 약물을 전달할 수 있는 투여 방식이 사용된다.
환자에게 투여는 당업계에 알려진 임의의 적절한 경로로 수행될 수 있으며, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 경피 투여, 기관내 투여(에어로졸), 폐 투여, 비강 투여, 직장 투여, 국소 투여(구강 투여 및 설하 투여 포함) 같은 경구와 비경구 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 투여의 주기는 매일, 매주, 매 2주, 매월, 또는 매년 1회 이상일 수 있다.
본원 개시의 올리고뉴클레오티드 접합체의 용량은 특히 환자의 나이, 체중, 및 성별 등 다양한 척도에 따라 결정되는 당업계의 통상적인 용량일 수 있다. 독성 및 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 측정 될 수 있다. 예를 들어 LD50 (50%의 집단 사망을 야기하는 치사량) 및 ED50 (등급이 매겨진 반응에서 최대 반응 강도의 50%를 야기할 수 있는 용량, 및 정성적인 반응에서 양성 반응을 나타내는 실험체가 50% 이상인 용량)결정에 의한다. 인간에 대한 용량 범위는 세포 배양 분석 및 동물 연구에서 얻어진 데이터에 기초하여 도출될 수 있다.
본원에 개시된 접합체를 기능성 올리고뉴클레오티드 및 본원에 개시된 접합 분자에 의해 형성되는 올리고뉴클레오티드 접합체를 전달하기 위해 예를 들어C57BL/6J 또는 C3H/HeNCrlVr 쥐, 수컷 혹은 암컷, 6-12 주령, 18-25 g 체중에 주사할 때, 접합체에 의해 전달되기 위한 올리고뉴클레오티드의 양은 0.001-100 mg/kg 체중일 수 있고, 일부 실시 태양에서는 0.01-50 mg/kg 체중이며, 추가 실시 태양에서는 0.05-20 mg/kg 체중이고, 또 다른 실시 태양에서는 0.1-15 mg/kg 체중이고, 또 다른 실시 태양에서는 0.1-10 mg/kg 체중이고, 이는 올리고뉴클레오티드 접합체에서 올리고뉴클레오티드의 양에 의해 계산된다. 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체를 투여할 때, 상기 용량이 바람직하다.
또한, 간세포에서 특정 유전자의 발현을 억제하기 위한 목적은 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 접합체를 특정 유전자가 이상 발현된 간세포 내로 도입하는 유전자 발현 조절 기작(mechanism)을 통해 또한 달성될 수 있다. 일부 실시 태양에서, 간세포는 간염 세포이고, 일부 실시 태양에서는 HepG2.2.15 세포이다. 일부 실시 태양에서, 간세포는 Hep3B, HepG2 또는 Huh7과 같은 간암 세포주와 분리된 간 1차 세포에서 선택되고, 일부 실시 태양에서 Huh7 간암 세포이다.
본원에서 제공된 방법을 이용하여 간세포에서 특정 유전자의 발현이 억제되는 경우에, 제공된 올리고뉴클레오티드 접합체에서 기능성 올리고뉴클레오티드의 양은 원하는 효과에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 접합체가 siRNA 접합체인 일부 실시 태양에서, 주어진 siRNA 접합체에서 siRNA의 양은 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양이고 세포외 농도는 1 pM 내지 1 μM, 또는 0.01 nM 내지 100 nM, 또는 0.05 nM 내지 50 nM 또는 0.05 nM 내지 약 5 nM가 된다. 이 국소 농도를 달성하기 필요한 양은 전달 방식, 전달 위치, 전달 위치와 표적 세포 혹은 조직 사이에 세포 층 수, 전달 경로(국소 또는 전신)등을 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 전달 위치에서의 농도는 표적 세포나 조직표면에서의 농도보다 실질적으로 높을 것이다.
유용한 효과
일부 실시 태양에서, 본원에서 제공되는 접합체는 생체 내에서 올리고뉴클레오티드의 더 높은 전달 효율, 더 낮은 독성, 더 높은 안정성, 및/또는 더 높은 활성을 가진다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 표적 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 HBV 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 간에서 HBV 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 동물 모델에서 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 간에서 HBV 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 인간 대상체에서 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 HBV 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 HBV 표면 항원 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 ANGPTL3 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 간에서 ANGPTL3 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 동물 모델에서 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 간에서 ANGPTL3 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 인간 대상체에서 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 ANGPTL3 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 APOC3 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 간에서 APOC3 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 동물 모델에서 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 간에서 APOC3 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 인간 대상체에서 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 APOC3 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원에 개시된 접합체는 유의한 표적 외(off-target) 효과를 보이지 않는다. 표적 외 효과는 예를 들어 표적 유전자가 아닌 유전자 발현 억제일 수 있다. 표적 외 유전자 발현의 결합/억제가 표적 내(on-target) 효과의 50%, 40%, 30%, 20%, 또는 10% 보다 낮은 수준이라면 중요하지 않은 것으로 간주된다.
본원 개시의 일부 실시 태양에 따르면, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 siRNA를 간으로 효과적으로 전달하며, HBV 유전자 발현 억제에 우수한 특성을 보인다. 예를 들어 1 mg/kg 용량일 때 HBV 모델 쥐의 간에서 낮은 표적 외 효과와 함께 87.4%-92.2%의 HBV 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 HBV 모델 쥐에서 3 mg/kg 용량일 때 HBV 표면 항원 발현을 효과적으로 감소시키고, HBV 표면 항원 발현 억제율 96.9%, HBV DNA억제율 95.4%을 달성한다. 일부 실시 태양에서, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 저 용량에서 140일까지 우수한 HBV발현 억제 효과를 보인다.
본원 개시의 한 실시 태양에 따르면, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 siRNA을 간에 효과적으로 전달하고, HBV 유전자 발현 억제에 우수한 특성을 보인다. 예를 들어, 낮은 표적 외 효과와 함께 1 mg/kg 용량일 때 HBV 모델 쥐의 간에서 HBV 유전자 발현의 억제율은 69.3% 이상, 또는 78.1%-89.1%이다. 일부 실시 태양에서, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 HBV 모델 쥐에서 HBV 표면 항원 발현을 효과적으로 감소시키고 3 mg/kg 용량일 때 HBV표면 항원 발현 억제율 98.4%, HBV DNA억제율 95.8%을 달성한다. 일부 실시 태양에서, 본원 개시에 의해 제공되는 특정 접합체는 참조문헌의 접합체와 대비할 때, 저 용량에서 84일까지 우수한 HBV발현 억제 효과를 보인다.
본원 개시의 한 실시 태양에 따르면, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 siRNA를 간으로 효과적으로 전달하며, HBV 유전자 발현 억제에 우수한 특성을 보인다. 예를 들어 1 mg/kg 용량일 때 HBV 모델 쥐의 간에서 낮은 표적 외 효과와 함께 48.5% 이상, 또는 76.8%-80.0%의 HBV 유전자 발현 억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 HBV 모델 쥐에서 HBV 표면 항원 발현을 효과적으로 감소시키고, 심지어 3 mg/kg 용량일 때 HBV 표면 항원 발현 억제율 84.6%, HBV DNA 억제율 85.6%을 달성한다. 일부 실시 태양에서, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 참조문헌의 접합체와 대비할 때, 저 용량에서 21일까지 우수한 HBV발현 억제 효과를 보인다.
본원 개시의 한 실시 태양에 따르면, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 siRNA를 간으로 효과적으로 전달하며, HBV 유전자 발현 억제에 우수한 특성을 보인다. 예를 들어 1 mg/kg 용량일 때 HBV 모델 쥐의 간에서 낮은 표적 외 효과와 함께 HBV X 유전자 영역의 유전자 발현의 억제율이 60.1% 이상이거나, 일부 실시 태양에서 80.7%-84.5%이다. 일부 실시 태양에서,본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 HBV 모델 쥐에서 HBV 표면 항원 발현을 효과적으로 감소시키고, 심지어 3 mg/kg 용량일 때 HBV 표면 항원 발현 억제율 94.8%, HBV DNA 억제율 95.8%을 달성한다. 일부 실시 태양에서,본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 참조문헌의 접합체와 대비할 때, 저 용량에서 56 일까지 우수한 HBV발현 억제 효과를 보인다.
본원 개시의 한 실시 태양에 따르면, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 siRNA를 간으로 효과적으로 전달하며, ANGPTL3 유전자 발현 억제에 우수한 특성을 보인다. 예를 들어 고 지방 모델 쥐 에서 1 mg/kg 용량일 때 간에서 ANGPTL3 유전자 발현 억제율이 57.3% 이상이며, 3 mg/kg 용량일 때 90.4%까지 달성된다. 일부 실시 태양에서,본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 참조문헌의 접합체와 대비할 때, 저 용량과 낮은 투여 빈도에서 49일까지 우수한 ANGPTL3 발현 억제와 저지질혈(hypolipidemic) 효과를 나타낸다.
본원 개시의 한 실시 태양에 따르면, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 siRNA를 간으로 효과적으로 전달하며, APOC3 유전자 발현 억제에 우수한 특성을 보인다. 예를 들면 고 지방 모델 쥐에서 3mg/kg용량일 때 간에서 75% 이상의 APOC3 유전자 발현억제율을 나타낸다. 일부 실시 태양에서, 본원 개시에 의해 제공되는 접합체는 참조문헌의 접합체와 대비할 때, 저 용량과 낮은 투여 빈도에서 65일 까지 우수한 혈액 지질 억제 효과를 나타낸다.
일부 실시 태양에서, 본원 개시에 의해 설명되는 접합체는 동물 모델에서 낮은 독성을 나타내고 이것은 우수한 안전성을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시 태양에서, 심지어 본원의 접합체를 유효 농도의 100-배까지의 농도에서(유효농도는 3 mg/kg 이다) C57BL/6J 쥐에 투여되었을 때에도 명백한 독성 반응이 관찰되지 않는다.
상기 예는 본원에서 제공된 접합체가 세포 표면 수용체를 표적화하고 로딩 활성제를 수용체를 발현하는 세포에 전달하는데 효과적이라는 것을 보여준다. 접합 분자는 이러한 수용체를 발현하는 세포에 활성제를 표적화하기 위한 추가 세포 표면 수용체와 추가 활성제에도 적합할 것으로 예상된다.
키트(kit)
다른 측면에서, 상술된 접합체를 포함하는 키트가 본원에서 제공된다.
일부 실시 태양에서, 본원에 제공된 키트를 하나의 용기에 접합체를 포함한다. 일부 실시 태양에서, 본원에 제공된 키트는 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 용기이다. 일부 실시 태양에서, 본원에 제공된 키트는 안정제 또는 보존제 같은 제약상 허용되는 부형제를 추가적으로 포함한다. 일부 실시 태양에서, 본원에 제공된 키트는 하나 이상의 추가 치료제를 포함한다. 일부 실시 태양에서, 키트는 본원에 제공된 접합제를 포함하는 용기와 상이한 용기에 하나 이상의 추가 치료제를 포함한다. 일부 실시 태양에서, 키트는 제약상 허용하는 부형제 또는 다른 재료(존재시)를 포함하는 접합체를 혼합하기 위한 설명서를 포함한다.
본원 개시의 키트에서, 접합체 및/또는 제약상 허용되는 부형제는 임의의 형태로 주어질 수 있다. 예를 들면, 액체 형태, 건조 형태, 또는 동결 건조 형태이다. 일부 실시 태양에서, 접합체 및/또는 제약 상 허용되는 부형제는 대체로 순수하고/하거나 멸균이다. 일부 실시 태양에서, 멸균수는 본원에 개시된 키트에서 제공될 수 있다.
실시예
이하, 본원 개시는 실시예의 방법으로 상세히 설명된다. 달리 명시되지 않는 한, 하기 실시예에서 사용된 시약 및 배양 배지는 모두 상용화 되어있고, 핵산 전기영동 또는 실시간 PCR에서 사용된 조작은 모두 Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))에 기재된 방법에 따라 수행된다.
HEK293A 세포는 Nucleic acid technology laboratory, Institute of Molecular Medicine, Peking University에서 제공되고, 5% CO2/95% 공기를 포함하고 있는 37℃인 인큐베이터에서 20% 소태아혈청(FBS, Hyclone 사)과 0.2v% 시아노마이신 2약물 내성(biresistant) (Penicillin-Streptomycin, Gibco, Invitrogen 사)을 포함하고 있는 DMEM 완전 배지 (Hyclone 사)에서 배양된다.
Huh7 세포는 Stem Cell Bank of Chinese Academy of Science 에서 구매되며 5% CO2/95% 공기를 포함하고 있는 37℃인 인큐베이터에서 10% 소태아혈청 (FBS, Hyclone 사), 1% 비필수 아미노산(NEAA, Corning 사)를 포함하는 DMEM 완전 배지 (Hyclone 사)에서 배양된다.
달리 명시되지 않는 한, 세포가 하기 제조예 12-15에서 합성된 siRNA 접합체에 의해 형질주입될 때 LipofectamineTM2000 (Invitrogen 사)는 형질주입 시약으로 사용된다. 상세한 조작은 생산자에 의해 제공된 설명서의 지침에 따라 수행된다.
달리 명시되지 않는 한, 하기 제공된 시약의 비율은 모두 부피비(v/v)로 계산된다.
달리 명시되지 않는 한, 사용된 동물 모델은 다음과 같다:
C57BL/6J 쥐(mice): Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd에서 구매하였다;
SD 래트(rat): Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd에서 제공되었다;
HBV 유전자 이식 쥐 C57B/6N-Tg (1.28 HBV)/Vst (유전자형 A), Beijing Vitalstar Biotechnology Co., Ltd.에서 구매. COI>104 인 쥐(이하 간략하게 1.28 복제 쥐라고 지칭한다)를 실험 전에 선택하였다;
HBV 유전자 이식 쥐 C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J: Department of Laboratory Animal Science, Peking University Health Science Center에서 구매. S/COV>10인 쥐를 실험전에 선택하였다;
HBV 유전자 이식 쥐: M-TgHBV로 명명, Department of Animal, Shanghai Public Health Center에서 구매. 유전자 이식 쥐의 제조 방법은 Ren J. et al., in J. Medical Virology. 2006, 78:551-560에 기재되어 있다;
AAV-HBV 유전자 이식 쥐: 문헌 방법(Xiaoyan Dong et al., Chin J Biotech 2010, May 25; 26(5): 679-686) 에 따라 rAAV8-1.3HBV과 D 타입 (ayw) 바이러스 (Beijing FivePlus Molecular Medicine Institute Co. Ltd.에서 구입, 1×1012 바이러스 유전체(v.g.)/mL, 로트 번호 2016123011)를 사용해서 제조. rAAV8-1.3HBV은 멸균된 PBS로 5×1011 v.g./mL로 희석된다. 희석된 200μL rAAV8-1.3HBV는 각 마우스에 주사되고, 즉, 마우스당 1×1011 v.g. 이다. HBV DNA의 검출을 위한 혈청을 모으기 위해서 바이러스를 주사한 날로부터 28일이 지난 후에 모든 쥐의 눈확(orbits)에서 혈액(약 100 μL) 은 채취된다;
저 농도 AAV-HBV 유전자 이식 쥐: 상기 모델링 방법과 거의 동일한 방법을 사용하며, 차이점은 실험 전에 바이러스가 멸균된 PBS로 1×1011 v.g./mL로 희석된다. 100 μL 바이러스가 각 마우스에 주사되고, 즉, 마우스당 1×1010 v.g. 이다;
BALB/c 쥐: 6-8 주령, Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd에서 구매하였다;
ob/ob 쥐: 6-8 주령, Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.에서 구매하였다;
인간 APOC3 유전자 이식 쥐: B6; CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J, Jackson Lab에서 구매하였다;
대사 증후군 원숭이: 모두 수컷, Non-human primate research center, Institute of Molecular Medicine, Peking University에서 제공;
제조예 1 L-9 접합 분자 (접합 분자 1)의 제조
본 제조예에서, 접합 분자 1(또한 이하 L-9 접합 분자라고 지칭한다)는 다음 방법에 따라 합성된다.
(1-1) GAL-5 (L-9 접합 분자의 말단부 분자) 의 합성
(1-1a) GAL-2의 합성
100.0 g의 GAL-1 (N-아세틸-D-갈락토사민 히드로클로라이드, CAS No.: 1772-03-8, Ning Bo hongxiang bio-chem Co., Ltd.에서 구매, 463.8 mmol)는 1000 ml의 무수 피리딘에 용해되며, 여기에 540 ml의 무수 아세트산(Enox Inc.에서 구매, 5565.6 mmol)을 얼음물 수조에서 첨가하여 실온에서 교반하면서 1.5 시간동안 반응시켰다. 생성된 반응 용액은 10L의 얼음물에 부어지고 감압 하에서 흡입 여과되었다. 잔류물은 2L의 얼음물로 세척되었고, 그 다음에 혼합 아세토니트릴/톨루엔 용매(아세토니트릴의 부피: 톨루엔의 부피 = 1:1)를 완전히 용해될 때까지 첨가하였다. 용매를 증발시켜 130.0 g 의 생성물 GAL-2 흰색 고체의 형태로 수득하였다.
(1-1b) GAL-3의 합성
단계(1-1a)에서 얻어진 GAL-2 (35.1 g, 90.0 mmol)을 213 ml의 무수 1,2-디클로로에탄에 용해시키고, 여기에 24.0 g의 TMSOTf (CAS No.: 27607-77-8, Macklin Inc.에서 구매, 108.0 mmol)를 얼음물 수조에서 첨가하여 질소 대기 하 밤새 실온에서 반응시켰다.
희석하기 위해 400 ml 디클로로메탄을 반응 용액에 첨가하고, 규조토로 여과하고, 그 다음에 1L의 포화 수용성 중탄산나트륨 용액을 생성된 반응 용액에 첨가하고 균일하게 교반하였다. 유기상을 분리하였다. 남아있는 수성상은 각각 300 ml의 디클로로에탄으로 두 번 추출했고, 모든 유기상을 혼합하고 300 ml의 포화 수용성 중탄산나트륨 용액 및 300 ml 의 포화 염수로 각각 세척하였다. 세척된 유기상을 분리하고 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 용매는 감압하에서 증발되고 26.9 g의 생성물 GAL-3를 연한 황색의 점성 시럽으로 수득하였다.
(1-1c) GAL-4의 합성
단계 (1-1b)에서 얻어진 GAL-3 (26.9 g, 81.7 mmol)을 136 ml의 무수 1,2-디클로로에탄에 용해시키고, 건조 분말 형태의 30g의 4Å 분자체 다음에 9.0g 의 5-헥센(hexen)-1-올(ol) (CAS No.: 821-41-0, Adamas-beta Inc.에서 구매, 89.9 mmol)을 첨가하고, 30 분간 실온에서 교반하였다. 9.08 ml의 TMSOTf (40.9 mmol)를 얼음물 수조에서 질소 보호하에 첨가하고 실온에서 교반하며 밤새 반응시켰다. 4Å 분자체 분말은 여과를 통해 제거되었다. 희석을 위해 300 ml 디클로로에탄을 여과물에 첨가하고, 규조토로 여과하고, 그 다음에 세척을 위해 500 ml의 포화 수용성 중탄산나트륨 용액을 생성된 반응 용액에 첨가하고 10 분간 교반하였다. 유기상을 분리하였다. 남아 있는 수성상은 300 ml의 디클로로에탄으로 1번 추출된다. 모든 유기상을 혼합하고 각각300 ml의 포화 수용성 중탄산나트륨 용액 및 300 ml의 포화 염수로 세척하였다. 세척된 유기상은 분리되고 무수 황산나트륨으로 건조된다. 용매를 감압 하에 증발시키고 황색 시럽 형태의 41.3g 의 생성물 GAL-4 을 수득하였다, 이는 정제없이 다음 산화 반응에 직접 사용된다.
(1-1d) GAL-5의 합성
단계 (1-1c)에 기재된 방법에 따라 얻어진 GAL-4 (14.9 g, 34.7 mmol) 77 ml의 디클로로메탄 및 77 ml의 아세토니트릴의 혼합 용매에 용해시키고, 103 ml의 탈염수 및 29.7 g의 과요오드산 나트륨 (CAS No.: 7790-28-5, Aladdin Inc. 에서 구매, 138.8 mmol) 각각 첨가하고, 얼음 수조 하에서 10 분간 교반하였다. 삼염화 루테늄 (CAS No.: 14898-67-0, Energy Chemical에서 이용 가능, 238 mg, 1.145 mmol) 을 첨가해 밤새 실온에서 반응시켰다. 생성된 반응 용액을 300 ml의 물을 첨가하여 희석하고, 교반하고, 포화 중탄산 나트륨을 첨가해 pH를 약 7.5로 조절하였다. 분리된 유기상을 버렸다. 남아 있는 수성상은 각 200 ml의 디클로로메탄로 3회 추출하고, 추출로 생성된 유기상을 버렸다. 추출로 생성된 수용액은 구연산 고체로 pH를 약 3으로 조정하고, 각 200 ml의 디클로로메탄로 3회 추출하고, 유기상은 혼합되고 무수 황산나트륨으로 건조된다. 용매는 감압 하에서 증발되고 흰색 발포성 고체형태의 6.85 g의 생성물 GAL-5를 수득하였다.
L-9 접합 분자는 상기 방법에 따라 얻어진 GAL-5 화합물을 이용하여 하기 공정 경로를 통해 합성된다:
(1-2) M-11-T3의 합성:
J-0 (1.883 g, 10 mmol, Alfa Aesar에서 구매) 는 25 ml의 아세토니트릴에서 용해되고, 트리에틸아민 (4.048 g, 40 mmol)이 첨가되고, 얼음물 수조에서 0℃로 냉각된다. 에틸 트리플루오르아세테이트 (5.683 g, 40 mmol)가 첨가되고 22 시간동안 실온에서 반응한다. 감압하에서 용매가 증발되고, 잔류물을 18 시간동안 진공 오일 펌프로 발포 -건조해 5.342 g 의 원 고체 생성물 M-11-T3을 얻는다. 이는 추가 정제 없이 직접 후속 반응에 사용되었다. MS m/z: C15H22F9N4O3, [M+H]+, 계산치: 477.35, 측정치: 477.65.
(1-3) M-11-T3-Tr의 합성:
조 생성물 M-11-T3 (5.342 g, 10 mmol)을 50 ml 의 디클로로메탄에 용해하였다. 생성된 반응 용액에 TrCl (3.345 g, 12 mmol) 및 트리에틸아민 (1.518 g, 15 mmol)을 첨가해 20 시간 동안 실온에서 교반 하에 반응시켰다. 반응 용액은, 각 20 ml 의 포화 중탄산 나트륨으로 2번, 20 ml의 포화 염수로 1번 세척되었다. 유기상은 무수 황산나트륨으로 건조되고 여과되었다. 감압하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 밤새 진공 오일 펌프로 발포 건조되고 7.763 g의 원 고체 생성물 M-11-T3-Tr을 수득하였다. MS m/z: C34H36F9N4O3, [M+Na]+, 계산치: 741.25, 측정치: 741.53. 조 생성물 M-11-T3-Tr은 정제 없이 다음 단계의 M-18-Tr 의 합성을 위해 사용되었다.
(1-4) M-18-Tr의 합성:
단계 (1-3)에서 얻어진 조 생성물 M-11-T3-Tr (7.763 g, 10 mmol)을 100 ml의 메탄올에 용해시키고, 100 ml의 메틸아민 수용액 (40 질량 %)을 첨가해 50 °C에서 교반하에 23 시간동안 반응시킨다. 불용성 입자는 여과를 통해 제거되었다. 감압하에서 용매가 증발되고, DCM: 메탄올 의 부피 비가 1:1인 200 ml의 혼합 용매를 잔류물에 추가하고, 50 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척했다. 얻어진 수성상을 각 50 ml의 디클로로메탄으로 3번 추출했다. 모든 유기상을 혼합하고 무수 황산나트륨으로 건조했고, 여과했다. 감압 하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 밤새 진공 오일 펌프로 발포 건조되고, 200-300 메쉬 정상 실리카겔 칼럼을 이용해 정제되었다. 칼럼은 석유 에테르로 채워져있고, 실리카겔의 산성을 중화하기 위해 1 중량% 트리에틸아민이 첨가되어 있고, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올: 암모니아 수용액 (25 중량%) = 1:1:0.05-1:1:0.25이다. 용출액을 모아서, 감압하에서 용매를 증발시키고 잔류물은 진공 오일 펌프로 발포 건조되어서 2.887g의 순수 생성물 M-18-Tr을 수득한다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ7.47 - 7.39 (m, 6H), 7.32 -7.24 (m, 6H), 7.19 - 7.12 (m, 3H), 2.60 - 2.47 (m, 4H), 2.46 - 2.19 (m, 13H), 1.70 - 1.55 (m, 4H), 1.40 (p, J = 6.8 Hz, 2H). MS m/z: C28H39N4, [M+H]+, 계산치: 431.65, 측정치: 432.61.
(1-5) L-5-Tr의 합성:
단계 (1-4)에서 얻어진 M-18-Tr (2.02 g, 4.69 mmol)및 단계 (1-1)에서 얻어진 GAL-5 (6.93 g, 15.48 mmol)은 혼합되고 47 ml의 아세토니트릴에 용해되었고, N-메틸모르폴린 (3.13 g, 30.96 mmol) 및 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일(yl))-4-메틸모르폴린 히드로클로라이드 (DMTMM, 4.28 g, 15.48 mmol)를 첨가하여 2 시간동안 실온에서 교반 하에 반응했다. 생성된 반응 용액을 200 ml의 디클로로메탄으로 희석하고, 100 ml의 포화 중탄산 나트륨 용액 및 100 ml의 포화 염수로 세척되고, 무수 황산나트륨으로 건조되고, 여과했다. 그 다음 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득했다. 조 생성물은 200-300 메쉬 정상 실리카겔 칼럼을 이용해 정제되었다 칼럼은 석유 에테르로 채워져있고, 실리카겔의 산성을 중화하기 위해 1 중량% 트리에틸아민이 첨가되어 있고, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:5-100:7이다. 용출액을 모아서, 감압하에서 용매를 증발시켜 7.49 g의 조 생성물 L-5-Tr를 수득했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ7.83 - 7.10 (m, 4H), 7.67 - 7.60 (m, 1H), 7.44 - 7.34 (m, 6H), 7.33 - 7.24 (m, 6H), 7.20 - 7.15 (m, 3H), 5.22 (s, 3H), 4.97 (d, J = 11.3 Hz, 3H), 4.49 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.06 - 3.07 (m, 9H),3.95 - 3.83 (m, 3H), 3.77 - 3.64 (m, 3H), 3.45 - 3.35 (m, 3H), 3.12 - 2.87 (m, 8H), 2.30 - 2.15 (m, 3H), 2.11 - 1.98 (m, 22H), 1.95 - 1.84 (m, 11H), 1.81 - 1.61 (m, 14H), 1.54 - 1.36 (m, 14H).MS m/z: C85H119N7O30, [M+H]+, 계산치: 1718.81, 측정치: 1718.03.
(1-6) L-8의 합성:
단계 (1-5)에서 얻어진 L-5-Tr (5.94 g, 3.456 mmol)은 69 ml의 디클로로메탄에 용해되고, 디클로로아세트산 (13.367 g, 103.67 mmol)을 첨가해 2 시간동안 실온에서 반응시켰다. 생성된 반응 용액은 100 ml의 디클로로메탄을 첨가해 희석되고, 세척하고 포화 중탄산 나트륨 용액으로 pH를 7-8로 조절하였다. 분리된 수성상은 각 30 ml의 디클로로메탄으로 6번 추출되었다. 모든 유기상을 혼합하고 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 그 다음에 용매는 조 생성물을 얻기 위해 감압 하에 증발되었다. 조 생성물은 200-300 메쉬 정상 실리카겔 칼럼을 이용해 정제되었고, 실리카겔의 산성을 중화하기 위해 10 중량% 트리에틸아민을 첨가하였다. 칼럼을 1중량‰ 트리에틸아민으로 평형화하고 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:30-100:40이다. 용출액을 모아서, 감압하에서 용매를 증발시키고 4.26 g의 순수 생성물 L-8을 수득한다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.84 (d, J = 9.0 Hz, 3H), 7.27 - 7.23 (m, 1H), 7.13 - 7.18 (m, 1H), 5.22 (d, J = 3.1 Hz, 3H), 4.97 (dd, J = 11.3, 3.1 Hz, 3H), 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.09 - 3.98 (m, 9H), 3.88 (dd, J = 19.3, 9.3 Hz, 3H), 3.75 - 3.66 (m, 3H), 3.44 - 3.38 (m, 3H), 3.17 - 3.30 (m, 4H), 3.10 - 2.97 (m, 4H), 2.35 - 2.20 (m, 6H), 2.15 - 2.08 (m, 9H), 2.07 - 1.98 (m, 13H), 1.94 - 1.87 (m, 9H), 1.81 - 1.74 (m, 9H), 1.65 - 1.42 (m, 18H).MS m/z: C85H119N7O30, [M+H]+, 계산치: 1477.59, 측정치: 1477.23.
(1-7a) A-1의 합성
A-1
DMTrCl (4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드, 38.12 g, 112.5 mmol) 를 450 ml의 무수 피리딘에 용해시키고, 칼슘 DL-글리세르산염 수하물(glycerate hydrate) (12.88 g, 45.0 mmol)을 첨가하여 22 시간 동안 45℃에서 반응시켰다. 생성된 반응 용액을 여과하였다. 잔류물을 200 ml의 DCM로 헹구고, 여과된 액체는 감압하에서 농축 건조시켰다. 잔류물을 500 ml의 디클로로메탄에 다시 용해시키고, 각 200 ml의 0.5M 트리에틸아민 포스페이트 (pH=7-8)으로 2번 세척하였다. 분리된 수성상은 200 ml의 디클로로메탄으로 2번 추출된다. 모든 유기상을 혼합하고 무수 황산나트륨으로 건조했고, 여과하였다. 감압하에서 용매가 증발되고, 잔여물은 200-300 메쉬, 구배 용리는 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: 메탄올 = 1:1:1:0.35-1:1:1:0.55인 정상 실리카겔 칼럼을 이용해 정제되었다. 용출물을 모으고, 감압하에서 용매가 증발되었다. 잔류물은 500 ml의 디클로로메탄에 다시 용해되고, 200 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 한번 세척하였다. 분리된 수성상은 200 ml의 디클로로메탄으로 2번 추출되었다. 모든 유기상을 혼합하고 무수 황산나트륨으로 건조했고, 여과하였다. 감압하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 감압하에서 밤새 진공 오일 펌프로 건조해 20.7 g의 생성물 A-1을 흰색 고체 형태로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.46 (ddd, J = 6.5, 2.3, 1.1 Hz, 1H), 7.40 - 7.28 (m, 7H), 6.89 - 6.81 (m, 4H), 4.84 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.36 - 4.24 (m, 1H), 4.29 (s, 6H), 3.92 (dd, J = 12.4, 7.0 Hz, 1H), 3.67 (dd, J = 12.3, 7.0 Hz, 1H), 2.52 (q, J = 6.3 Hz, 6H), 1.03 (t, J = 6.3 Hz, 9H). MS m/z: C24H23O6, [M-H]-, 계산치: 407.15, 측정치: 406.92.
(1-7b) L-7의 합성:
단계 (1-6)에서 얻어진 L-8 (2.262 g, 1.532 mmol) 및 단계 (1-7a)에서 얻어진 A-1 (2.342 g, 4.596 mmol)을 혼합해 16 ml의 디클로로메탄에 용해하고, 3-(디에톡시포스포릴옥시(diethoxyphosphoryloxy))-1,2,3-벤조트리진(benzotrizin)-4(3H)-온(one)(DEPBT, 1.375 g, 4.596 mmol)을 첨가하고, 디이소프로필에틸아민(1.188 g, 9.191 mmol)을 추가로 첨가해 2시간 동안 25℃에서 교반 하 반응시키고, 10 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 분리된 수성상을 각 10 ml의 디클로로메탄으로 3번 추출하였다. 모든 유기상을 모으고 10 ml의 포화 염수로 세척했고, 분리된 수성상을 각 10 ml의 디클로로메탄로 2번 추출하고, 수득된 유기상을 혼합하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과하였다. 감압하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 밤새 진공 오일 펌프로 발포 건조되고 4.900 g의 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물은 200-300 메쉬, 실리카겔의 산성을 중화하기 위해 20 ml 트리에틸아민을 포함한, 정상 실리카겔 칼럼 120 g 을 이용해 칼럼 정제된다. 칼럼은 1 중량% 트리에틸아민을 포함하는 석유 에테르로 평형화 되어있고 구배 용리는 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: N,N-디메틸포름아미드= 1:1:1:0.5-1:1:1:0.6이다. 용출물을 모으고, 용매를 감압 하에 증발시키고 2.336 g의 순수 생성물 L-7을 수득한다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ7.90 - 7.78 (m, 4H), 7.75 - 7.64 (m, 1H), 7.38 - 7.18 (m, 9H), 6.91 - 6.83 (m, 4H), 5.25 - 5.10 (m, 4H), 4.97 (dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 3H), 4.48 - 4.30 (m, 4H), 4.02 (s, 9H), 3.93 - 3.84 (m, 3H), 3.76 - 3.66 (m, 9H), 3.45 - 3.35 (m, 3H), 3.24 - 2.98 (m, 10H), 2.30 - 2.20 (m, 2H), 2.11 - 1.88 (m, 31H), 1.80 - 1.40 (m, 28H). MS m/z: C90H128N7O35, [M-DMTr]+, 계산치: 1564.65, 측정치: 1564.88.
(1-8) L-9의 합성:
단계 (1-7b)에서 얻어진 L-7 (2.300 g, 1.26 mmol), 숙신산 무수물 (0.378 g, 3.78 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 0.462 g, 3.78 mmol)을 혼합하여 13 ml의 디클로로메탄에 용해하고, DIPEA (0.814 g, 6.30 mmol)을 추가 첨가하고, 24 시간 동안 25℃에서 교반하였다. 생성된 반응 용액을 5 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 세척하였다. 분리된 수성상을 각 5 ml의 디클로로메탄으로 3번 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고, 용매를 감압 하에 증발시키고 2.774 g의 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물은 200-300 메쉬, 실리카겔의 산성을 중화하기 위해 1 중량% 트리에틸아민을 포함한 정상 실리카겔 칼럼 60 g을 이용해 칼럼 정제되었다. 칼럼은 디클로로메탄으로 평형화되어있고 구배 용리는 1중량‰ 트리에틸아민을 포함하는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:18-100:20이다. 용출물을 모으고, 용매를 감압 하에 증발시켜 1.874 g의 순수 생성물 L-9 접합 분자 (접합 분자 1)를 수득한다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.58 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 7.94 - 7.82 (m, 3H), 7.41 - 7.29 (m, 5H), 7.22 (d, J = 8.1 Hz, 5H), 6.89 (d, J = 8.3 Hz, 4H), 5.49 - 5.37 (m, 1H), 5.21 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 4.97 (d, J = 11.1 Hz, 3H), 4.49 (d, J = 8.2 Hz, 3H), 4.02 (s, 9H), 3.88 (dd, J = 19.4, 9.4 Hz, 3H), 3.77 - 3.65 (m, 9H), 3.50 - 3.39 (m, 6H), 3.11 - 2.90 (m, 5H), 2.61 - 2.54 (m, 4H), 2.47 - 2.41 (m, 2H), 2.26 - 2.17 (m, 2H), 2.15 - 1.95 (m, 22H), 1.92 - 1.84 (m, 9H), 1.80 - 1.70 (m, 10H), 1.65 - 1.35 (m, 17H), 1.31 - 1.19 (m, 4H), 0.96 (t, J = 7.1 Hz, 9H). MS m/z: C94H132N7O38, [M-DMTr]+, 계산치: 1664.72, 측정치: 1655.03. 생성된 L-9 접합 분자의 구조는 화학식 (503)으로 표현된다.
제조예 2 P-9 접합 분자 (접합 분자 2)의 제조
이 제조예에서, 접합 분자 2(또한 이후 P-9 접합 분자라고 지칭한다)는 하기 방법에 따라 합성되었다:
(2-1) GAL5-C4-1의 합성
상기 (1-1)에 설명된 방법에 따라 얻어진 GAL-5 (13.43 g, 30.0 mmol), t-부틸 4-아미노부티레이트(aminobutyrate) 히드로클로라이드 (5.87 g, 30.0 mmol), O-벤조트리아졸(benzotriazol)-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (tetramethyluronium hexafluorophosphate) (13.65 g, 36.0 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (11.63 g, 90.0 mmol)을 40 ml의 N,N-디메틸포름아미드에 첨가하고, 균질하게 용해한 다음 실온에서 5 시간 동안 교반해 반응시켰다. 300 ml의 포화 수용성 중탄산나트륨 용액을 생성된 반응 용액에 더하였다. 분리된 수성상은 각 200 ml의 에틸 아세테이트로 3번 추출되었다. 모든 유기상을 혼합히고 200 ml의 포화 염수로 1번 세척된다. 세척된 유기상은 분리되고 무수 황산나트륨으로 건조되었다. 용매는 감압 하에 증발 건조되고 30.3 g의 조 생성물 GAL5-C4-1을 기름 형태로 수득하였다. 이는 다음 반응에서 직접 사용된다.
(2-2) GAL5-C4-2의 합성
단계 (2-1)에서 얻어진 조 생성물 GAL5-C4-1 (30.3 g, 30 mmol)는 180 ml의 포름산에 용해되고 실온에서 16 시간 동안 교반하여 반응시켰다. 용매를 증발 건조시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다 (200-300 메쉬 정상 실리카겔, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:18-100:20). 용출물을 모아서 용매를 제거하기 위해 농축하고 총 14.84 g의 표적 생성물 GAL5-C4-2을 수득하였다.
(2-3) P-6의 합성:
단계 (1-4)에서 기재된 방법에 따라 얻어진 M-18-Tr (2.02 g, 4.69 mmol) 및 (2-2) 단계에서 얻어진 GAL5-C4-2 (8.24 g, 15.48 mmol)을 혼합하고 47 ml의 아세토니트릴에 용해시켰고, N-메틸모르폴린 (3.13 g, 30.96 mmol)를 첨가한 후, 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일(yl))-4-메틸모르폴린 히드로클로라이드 (DMTMM, 4.28 g, 15.48 mmol)을 첨가해 2 시간 동안 실온에서 교반하며 반응시킨다. 생성된 반응 용액을 200 ml의 디클로로메탄으로 희석시킨다. 생성된 유기상을 100 ml의 포화 중탄산 나트륨 용액 및 100 ml의 포화 염수 각각으로 세척한다. 모든 유기상을 혼합하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하였다, 이는 200-300 메쉬, 정상 실리카겔 칼럼을 이용해 정제되었다. 이 칼럼은 석유 에테르로 충전되고, 실리카겔의 산성을 중화하기 위해 1 중량% 트리에틸아민이 첨가 되었고, 용리구배는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:5-100:7 이다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 총 8.27 g의 순수 생성물 P-6을 수득하였다.
(2-4) P-7의 합성:
상기 (2-3)에서 얻어진 P-6 (6.82 g, 3.456 mmol)를 69 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디클로로아세트산 (13.367 g, 103.67 mmol)을 첨가해 2 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 생성된 반응 용액을 100 ml의 디클로로메탄을 첨가해 희석하고, 세척하고 포화 중탄산 나트륨 용액으로 pH를 7-8로 조절하였다. 분리된 수성상을 각 30 ml의 디클로로메탄으로 6번 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 그 다음에 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 실리카겔의 산성을 중화하기 위해 10 중량% 트리에틸아민을 첨가한 200-300 메쉬, 정상 실리카겔 칼럼으로 정제하였다. 칼럼을 1중량‰ 트리에틸아민으로 평형화하고 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:30-100:40이다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 총 4.82 g의 P-7을 수득하였다. MS m/z: C78H127N10O33, [M+H]+, 계산치: 1732.91, 측정치: 1735.73.
(2-5) P-8 의 합성:
(A-1)
P-7 (2.653 g, 1.532 mmol) 및 A-1 (2.342 g, 4.596 mmol)을 혼합하고 16 ml의 디클로로메탄에 용해하고, 3-디에톡시포스포릴-1,2,3-벤조트리아졸4(3H)-온(one) (DEPBT) (1.375 g, 4.596 mmol)을 첨가한 후 디이소프로필에틸아민 (1.188 g, 9.191 mmol)을 첨가해 2 시간 동안 25℃에서 교반 하 반응시키고, 10 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 분리된 수성상을 각 10 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고 10 ml의 포화 염수로 세척된다. 분리된 수성상을 각 10 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하고, 얻어진 유기상을 혼합하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과하였다. 감압하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 밤새 진공 오일 펌프로 발포 건조되고 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물은 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 20 ml 트리에틸아민을 포함한, 200-300 메쉬, 120 g 정상 실리카겔로 칼럼 정제되었다. 칼럼은 1 중량% 트리에틸아민을 포함한 석유 에테르로 평형화되어 있고 구배 용리는 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: N,N-디메틸포름아미드 = 1:1:1:0.5-1:1:1:0.6이다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 총 2.793 g의 순수 생성물 P-8을 수득한다.
(2-6) P-9의 합성:
P-8 (490 mg, 0.231 mmol), 숙신산 무수물 (69 mg, 0.693 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 68 mg, 0.554 mmol)를 혼합하고 2.3 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 149 mg, 1.155 mmol)을 첨가해 21 시간 동안 25℃에서 교반 하 반응시켰다. 생성된 반응 용액에 희석을 위해 50 ml 디클로로메탄이 첨가되고, 그 다음에 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 세척하였다. 분리된 수성상을 각 10 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고, 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 200-300 메쉬, 80g, 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 1 중량% 트리에틸아민이 첨가된 정상 실리카겔로 칼럼 정제 하였다. 이 칼럼은 디클로로메탄으로 평형화되어있고 구배 용리는 1중량‰ 트리에틸아민을 포함한 디클로로메탄: 메탄올 = 100:18-100:20이다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 총 200 mg의 순수 생성물 P-9 접합 분자 (접합 분자 2)를 수득하였다. MS m/z: C106H153N10O41, [M-DMTr]+, 계산치: 1921.05, 측정치: 1920.97. 생성된 P-9 접합 분자의 구조는 화학식 (504)에 나타나있다.
제조예 3 R-4 접합 분자 (접합 분자 3)의 제조
이 제조예에서, 접합 분자 3 (또한 이하 R-4 접합 분자라고 지칭한다) 는 하기 방법에 따라 합성되었다:
(3-1) GAL-C7-1의 합성
단계 (1-1b)에 기재된 방법에 따라 얻어진 GAL-3 (26.4 g, 80.2 mmol)를 134 ml의 무수 1,2-디클로로에탄에 용해하고, 60 g의 분말 형태 4Å 분자체를 첨가한 후 7-옥텐-1-올 (11.3 g, 88.2 mmol)을 첨가하여 10 분 동안 실온에서 교반 하 반응시켰다. 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(TMSOTf, 8.9g, 40.1 mmol) 를 얼음 수조에 질소 보호하에 첨가하고 24 시간 동안 실온에서 교반하에 반응시켰다. 4Å 분자체 분말을 여과를 통해 제거하였다. 500 ml의 포화 수용성 중탄산나트륨 용액이 세척을 위해 여과액에 첨가되었다. 유기상을 분리하였다. 남아있는 수성상을 100 ml의 디클로로메탄으로 1회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고 250 ml의 포화 염수로 1회 세척된다. 세척된 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 용매를 감압 하에 증발 건조시키고 33.3 g의 황색 시럽형태의 생성물 GAL-C7-1을 수득하였다. 이는 정제 없이 다음 산화 반응에 직접 이용된다.
(3-2) GAL-C7-2의 합성
단계 (3-1)에서 얻어진 GAL-C7-1 (33.3 g, 72.8 mmol)를 160 ml의 디클로로메탄 및 160 ml의 아세토니트릴의 혼합 용매에 용해시키고, 216 ml의 물 및 과요오드산 나트륨 고체 (62.3 g, 291.2 mmol)를 각각 첨가하고, 얼음 수조 하 10분 동안 교반하고, 삼염화 루테늄 촉매(498 mg, 2.4 mmol)를 첨가하였다. 이 반응은 자연스럽게 실온까지 데워지며 23시간 동안 교반하였다. 생성된 반응 용액을 200 ml의 물을 첨가해 희석했고, 교반하고, 포화 중탄산 나트륨을 첨가해 pH 7.5로 조정하였다. 분리된 유기상을 버렸다. 남아 있는 수성상을 각각 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 추출로 생성된 유기상을 버렸다. 추출로 생성된 수성상에 구연산 고체를 넣어 약 pH 3으로 조정하고, 각 200 ml의 디클로로메탄로 3회 추출하고, 얻어진 유기상을 혼합하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압하에서 용매가 증발되고, 그 다음에 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(200-300 메쉬 정상 실리카겔, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:18-100:20). 22.4 g의 생성물 GAL-C7-2을 흰색 발포 고체형태로 수득하였다. MS m/z: C21H32NO11, [M+H]+, 계산치: 476.50, 측정치: 475.94.
(3-3) R-1의 합성:
단계 (1-4)에 기재된 방법에 따라 얻어진 M-18-Tr (2.02 g, 4.69 mmol) 및 GAL-C7-2 (7.36 g, 15.48 mmol)를 혼합하고 47 ml의 아세토니트릴에 용해하고, N-메틸모르폴린 (3.13 g, 30.96 mmol)를 첨가한 후 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일(yl))-4-메틸모르폴린 히드로클로라이드 (DMTMM, 4.28 g, 15.48 mmol)를 첨가해 2 시간 동안 실온에서 교반 하에 반응 시켰다. 생성된 반응 용액을 200 ml의 디클로로메탄으로 희석시켰다. 생성된 유기상을 100 ml의 포화 중탄산 나트륨 용액 및 100 ml의 포화 염수로 각각 세척하였다. 모든 유기상을 혼합히고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하여 200-300 메쉬 정상 실리카겔 칼럼을 이용해 정제하였다. 이 칼럼은 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 1 중량% 트리에틸아민이 첨가된 석유 에테르로 충전되어 있고, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:5-100:7이다. 용출물을 모아서 용매를 감압 하에 증발시키고 7.82 g의 순수 생성물 R-1을 수득하였다.
(3-4) R-2의 합성:
R-1 (6.23 g, 3.456 mmol)을 69 ml의 디클로로메탄에 용해하고, 디클로로아세트산 (13.367 g, 103.67 mmol)를 첨가해 2 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 생성된 반응 용액을 100 ml의 디클로로메탄을 첨가해 희석하고, 세척하고 포화 중탄산 나트륨 용액으로 pH를 7-8로 조절하였다. 분리된 수성상을 각 30 ml의 디클로로메탄으로 6번 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 그 다음에 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 200-300 메쉬, 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 10 중량% 트리에틸아민을 첨가한 정상 실리카겔 칼럼으로 정제하였다. 이 칼럼은 1중량‰ 트리에틸아민으로 평형화 되었고, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:30-100:40이다. 용출액의 용매를 감압하 증발시키고 4.49 g의 순수 생성물 R-2를 수득하였다.
(3-5) R-3의 합성:
R-2 (2.391 g, 1.532 mmol) 및 A-1 (2.342 g, 4.596 mmol)를 혼합하고 16 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온(one) (DEPBT, 1.375 g, 4.596 mmol)을 첨가한 후 디이소프로필에틸아민(1.188 g, 9.191 mmol)을 첨가해 2 시간 동안 25℃에서 교반 하 반응시키고, 10 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 분리된 수성상을 각 10 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고 10 ml의 포화 염수로 세척된다. 분리된 수성상을 10 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하고, 얻어진 유기상을 혼합하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과하였다. 감압하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 밤새 진공 오일 펌프로 발포 건조되고 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 200-300 메쉬, 120 g, 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 20 ml 트리에틸아민을 포함한 정상 실리카겔을 이용해서 칼럼 정제하였다. 칼럼은 1 중량% 트리에틸아민을 포함한 석유 에테르로 평형화되어 있고, 용래 구배는 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: N,N-디메틸포름아미드 = 1:1:1:0.5-1:1:1:0.6이다. 용매를 감압 하에 증발시키고 2.642 g의 순수 생성물 R-3를 수득하였다.
(3-6) R-4의 합성:
R-3 (795mg, 0.4074mmol), 숙신산 무수물 (82mg, 0.8148mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 100mg, 0.8148mmol)를 혼합하고 4 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 100mg, 0.8148 mmol)를 첨가해 18 시간 동안 25℃에서 교반 하 반응시켰다. 생성된 반응 용액을 5 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 세척하였다. 수성상을 각 5 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고, 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 200-300 메쉬, 30 g, 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 1 중량% 트리에틸아민을 포함한 정상 실리카겔을 이용해서 칼럼 정제하였다. 이 칼럼은 디클로로메탄으로 평형화되어 있고 구배 용리는 1중량‰ 트리에틸아민을 포함한 디클로로메탄: 메탄올 = 100:18-100:20이다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 505 mg의 R-4 접합 분자 (접합 분자 3)의 순수 생성물을 수득하였다. 생성된 R-4 접합 분자의 구조는 화학식 (507)으로 나타난다.
제조예 4 LA-4 접합 분자 (접합 분자 4)의 제조
접합 분자 4 (또한 이하 LA-4 접합 분자라고도 지칭된다)가 하기 공정 경로에 따라 합성될 수 있을 것으로 예상된다. 생성된 LA-4 접합 분자의 구조는 화학식 (512)으로 나타난다.
접합 분자
제조예 5 LB-4 접합 분자 (접합 분자 5)의 제조
이 제조예에서, 접합 분자 5 (또한 이하 LB-4 접합 분자라고도 지칭된다)는 하기 방법에 따라 합성되었다:
(5-1) LB-1의 합성:
단계 (1-6)에 기재된 방법에 따라 얻어진 L-8 (5.0g，3.386mmol), 아디프산 무수물(adipic anhydride) (870mg, 6.772mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 827mg, 6.772 mmol)를 혼합하고 130 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 2.2 g, 16.931 mmol)를 첨가해 4 시간 동안 25℃에서 교반 하 반응시켰다. 희석을 위해 70ml 디클로로메탄을 생성된 반응 용액에 첨가하고, 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 세척하였다. 분리된 수성상을 각 10 ml의 디클로로메탄으로 4회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고, 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 200-300 메쉬, 120 g, 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 1 중량% 트리에틸아민을 포함한 정상 실리카겔을 이용해서 칼럼 정제하였다. 이 칼럼은 디클로로메탄으로 평형화 되어 있고, 구배 용리는 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: 메탄올 = 1:1:1:0.2-1:1:1:1이다. 용매를 감압 하에 증발시키고 4.267 g의 순수 생성물 LB-1을 수득하였다.
(5-2) LB-2의 합성:
단계 (5-1)에 기재된 방법에 따라 얻어진 LB-1 (4.697 g, 2.753 mmol, 2 용기(batches)의 혼합), 3-아미노-1,2-프로판디올 (313mg, 3.442 mmol), 4-(4,6-디메톡시트리아진-2-일(yl))-4-메틸모르폴린 히드로클로라이드 (DMTMM, 953mg, 3.442mmol) 및 N-메틸모르폴린 (700mg, 6.884mmol)를 순차적으로 30 ml의 아세토니트릴 및 3 ml의 메탄올의 혼합물에 첨가하고 밤새 실온에서 교반 하에 반응시켰다. 반응물을 60℃의 오일 배스로 옮겨 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 증발 건조 시키고, 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(200-300 메쉬 정상 실리카겔, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 1:0.07-1:0.5이다). 용출물을 모아서 용매를 제거하기 위해 농축시키고 3.27 g의 표적 생성물 LB-2을 수득하였다.
(5-3) LB-3의 합성:
LB-2 (2.27 g, 1.353 mmol)을 14 ml의 무수 피리딘에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (688mg, 2.03mmol)를 첨가해 실온에서 밤새 교반 하에 반응시켰다. 150 ml의 메탄올을 추가해 생성물을 급냉시켰다. 용매를 증발 건조 시키고, 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다 (200-300 메쉬 정상 실리카겔, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 1:0.05-1:0.2). 용출물을 모아서 용매를 제거하기 위해 농축시키고, 1.647 g의 표적 생성물 LB-3을 수득하였다.
(5-4) LB-4의 합성:
LB-3 (822 mg, 0.415 mmol), 숙신산 무수물 (83 g, 0.83 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 102 mg, 0.83 mmol)를 혼합하고 4 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, DIPEA (270 mg, 2.075 mmol)를 첨가하고, 25℃에서 밤새 교반해 반응시켰다. 생성된 반응 액체를 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 3회 세척하였다. 분리된 수성상을 각 2 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고, 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 200-300 메쉬, 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 5 중량% 트리에틸아민을 포함한 정상 실리카겔을 이용해서 칼럼 정제하였다. 이 칼럼은 석유 에테르로 평형화되어 있고 구배 용리는 1중량‰ 트리에틸아민을 포함하는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:5-100:20이다. 용매를 감압 하에 증발시키고 787 mg의 순수 생성물, LB-4 접합 분자 (접합 분자 5)를 수득하였다. 생성된 LB-4 접합 분자의 구조는 화학식 (513)에 나타난다.
제조예 6 V-7 접합 분자 (접합 분자 6)의 합성
접합 분자 6 (또한 이하 V-7 접합 분자로 지칭한다) 하기 공정 경로에 따라 합성될 수 있을 것으로 예상된다. 생성된 V-7 접합 분자의 구조는 화학식 (514)로 나타난다. 접합 분자
접합 분자
제조예 7 W-7 접합 분자 (접합 분자 7)의 제조
이 제조예에서, 접합 분자 7 (또한 하기 W-7 접합 분자로 지칭한다) 는 하기 방법에 따라 합성되었다.
(7-1) W-1 의 합성:
W-0(2.024 g, 10 mmol)를 25 ml의 아세토니트릴에 용해시키고, 트리에틸아민 (4.048 g, 40 mmol)을 첨가하고, 얼음물 수조에서 약 0℃로 냉각시켰다. 에틸 트리플루오르아세테이트 (5.683 g, 40 mmol)를 첨가하여 22 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 감압하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 18 시간 동안 진공 오일 펌프로 발포 건조되고 5.835 g의 원 고체 생성물 W-1를 수득하였다.
(7-2) W-2 의 합성:
조 생성물 W-1 (5.835 g, 10 mmol)를 50 ml의 디클로로메탄에 용해시켰다. TrCl (3.345 g, 12 mmol) 및 트리에틸아민 (1.518 g, 15 mmol)를 첨가해 20 시간 동안 실온에서 교반 하 반응시켰다. 생성된 반응액을 20 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 2회 및 20 ml의 포화 염수로 1회 세척하였다. 모든 유기상을 혼합히고, 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과되었다. 유기 용매는 감압하에서 증발되고, 잔류물은 밤새 진공 오일 펌프로 발포 건조되고 8.012 g의 원 고체 생성물 W-2를 수득하였다. 원 고체 생성물 W-2은 처리 없이 다음 탈보호 반응에 이용되었다.
(7-3) W-3 의 합성:
조 생성물 W-2 (8.012 g, 10 mmol)을 100 ml의 메탄올에 용해시키고, 100 ml의 메틸아민 수용액 (40 중량%)을 첨가해 23 시간 동안 50℃에서 교반 하에 반응시켰다. 불용성 입자는 여과에 의해 반응 혼합물로부터 제거되었다. 감압하에서 용매가 증발되었다. 잔류물을 200 ml의 DCM: 메탄올의 부피비가 1:1인 혼합 용매에 첨가하고, 생성된 유기상을 50 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 분리된 수성상을 각 50 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고, 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과하였다. 감압하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 밤새 진공 오일 펌프로 발포 건조되고, 200-300 메쉬 정상 실리카겔 칼럼을 이용하여 정제되었다. 이 칼럼은 석유 에테르로 채워지고, 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 1 중량% 트리에틸아민을 포함하고, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올: 암모니아 수용액 (25 중량%) = 1:1:0.05-1:1:0.25이다. 용출물을 모아서. 감압하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 진공 오일 펌프로 발포 건조되고 3.062 g의 순수 생성물 W-3 수득하였다.
(7-4) W-4 의 합성:
W-3 (675 mg, 1.517 mmol) 및 GAL-C7-2 (2.60 g, 5.46 mmol) 를 혼합하고 47 ml의 아세토니트릴에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (1.57 g, 12.14 mmol)를 첨가한 후 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진 -4(3H)-온(one) (DEPBT, 1.816 g, 6.04 mmol)를 첨가해 2.5 시간 동안 실온에서 교반 하에 반응시켰다. 생성된 반응액을 100 ml의 디클로로메탄으로 희석시켰다. 얻어진 유기상을 80 ml의 포화 중탄산 나트륨 용액 및 80 ml의 포화 염수 각각으로 세정하였다. 모든 유기상을 혼합히고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하였다, 이는 200-300 메쉬, 정상 실리카겔 칼럼을 이용해 정제되었다. 이 칼럼은 석유 에테르로 채워지고, 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 1 중량% 트리에틸아민이 첨가되고, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:5-100:7이다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 1.610 g의 순수 생성물 W-4를 수득하였다.
(7-5) W-5 의 합성:
W-4 (1.61 g, 0.886 mmol) 125 ml의 디클로로메탄에 용해되고, 디클로로아세트산 (3.5 ml, 42.43 mmol)을 첨가해 1 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 생성된 반응액에 150 ml의 피리딘을 첨가해 중화시켰다. 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하였다. 200-300 메쉬, 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 10 중량% 트리에틸아민을 포함한 정상 실리카겔 칼럼으로 조 생성물을 정제하였다. 이 칼럼은 1중량‰ 트리에틸아민으로 평형화되어있고, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 100:30-100:40이다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 1.26 g의 순수 생성물 W-5를 수득하였다.
(7-6) W-6 의 합성:
W-5 (1.25 g, 0.793 mmol) 및 (1-7a)단계에 기재된 방법에 따라 얻어진 A-1 (1.21 g, 2.38 mmol)을 혼합하고 12 ml의 디클로로메탄으로 용해시키고, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온(one) (DEPBT, 0.712 g, 2.38 mmol)을 첨가한 후 디이소프로필에틸아민 (0.615 g, 4.76 mmol)를 첨가해 3 시간 동안 25℃에서 교반 하에 반응시키고, 80 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 분리된 수성상을 각 10 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고 10 ml의 포화 염수 로 세척된다. 얻어진 유기상을 혼합했고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 감압하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 밤새 진공 오일 펌프로 발포 건조되고 조 생성물을 수득하였다. 200-300 메쉬, 185 g, 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 20 ml 트리에틸아민을 포함한 정상 실리카겔을 이용해서 조 생성물을 칼럼 정제하였다. 칼럼은 1 중량% 트리에틸아민을 포함한 석유 에테르로 평형화되어 있고 구배 용리는 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: N,N-디메틸포름아미드 = 1:1:1:0.1-1:1:1:0.7이다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 1.57 g의 순수 생성물 W-6를 수득하였다.
(7-7) W-7 의 합성:
W-6 (1.238 g, 0.63 mmol), 숙신산 무수물 (0.189 g, 1.89 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 0.231 g, 1.89 mmol) 을 혼합하고 7 ml의 디클로로메탄으로 용해시키고, DIEA (0.407 g, 3.15 mmol)를 첨가해 24 시간 동안 25℃에서 교반 하 반응시켰다. 생성된 반응액은 5 ml의 0.5M 트리에틸아민 포스페이트로 세척된다. 분리된 수성상을 각 5 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출한다. 모든 유기상을 혼합히고, 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하였다. 200-300 메쉬, 30 g, 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 1 중량% 트리에틸아민을 포함한 정상 실리카겔을 이용해서 조 생성물을 칼럼 정제하였다. 이 칼럼은 디클로로메탄으로 평형화되고 구배 용리는 1중량% 트리에틸아민을 포함한 디클로로메탄: 메탄올 = 100:18-100:20이다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 1.033 g의 순수 생성물, W-7 접합 분자 (접합 분자 7)를 수득하였다. MS m/z: C101H146N7O38, [M-DMTr]+, 계산치: 1763.92, 측정치: 1763.21. 생성된 W-7 접합 분자의 구조는 화학식 (515)로 나타난다.
제조예 8 X-7 접합 분자 (접합 분자 8) 의 제조
접합 분자 8 (또한 하기 X-7 접합 분자로 지칭한다)은 하기 공정 경로에 따라 합성될 수 있을 것으로 예상된다. 생성된 X-7 접합 분자의 구조는 화학식 (521)로 나타난다.
제조예 9 K-3 접합 분자 (비교 접합 분자 1) 의 제조
이 제조예에서, K-3 접합 분자 (또한 하기 비교 접합 분자 1 로 지칭한다) 는 하기 방법에 따라 합성되었다:
(9-1) K-1의 합성:
단계 (1-7a)에 기재된 방법에 따라 얻어진 A-1 (3.0 g, 6.0 mmol), PyBOP (6.2 g, 12.0 mmol), HOBt (1.6 g, 2.0 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 3.9 g, 30.0 mmol)을 60 ml의 디클로로메탄에 첨가했고 10 분 동안 실온에서 교반 하에 반응시켰다. 그 다음에 상기 용액을 K-0 (5.6 g, 30.0 mmol)에 첨가하여 실온에서 1 시간 50분 동안 반응시켰다. 반응액을 30 ml의 포화 중탄산 나트륨 용액에 부었다. 분리된 수성상을 각 30 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합하고, 포화 염화 나트륨 용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 200-300 메쉬, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올: 암모니아 수용액 (25 중량%) = 10:2:0.1 - 4:4:1인 정상 실리카겔 칼럼을 이용하여 정제하였다. 용출물을 모아서, 농축하여 용매를 제거하고, 진공 오일 펌프로 발포 건조하였다 2.2 g의 생성물 K-1을 흰색 고체 형태로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.02 (s, 1H), 7.43 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.34 - 7.17 (m, 7H), 6.87 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 4.05 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 3.74(s, 6H), 3.20 - 3.01 (m, 5H), 2.60 - 2.38 (m, 12H), 1.60 - 1.39 (m, 8H), 1.24 (s, 1H). MS m/z: C33H47N4O5, [M+H]+, 계산치: 579.35, 측정치: 579.26.
(9-2) K-2 의 합성:
단계 (1-1)에 기재된 방법에 따라 얻어진 GAL-5 (483 mg, 1.08 mmol), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온(one) (359 mg, 1.2 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 310 mg, 2.4 mmol)를 3 ml의 디클로로메탄에 첨가하고, 실온에서 30분 간 교반하였다. 그 다음에 K-1 (174 mg, 0.3 mmol)을 첨가해 실온에서 16 시간 동안 반응시켰다. 반응액을 10ml의 포화 중탄산 나트륨 용액에 부었다. 분리된 수성상을 각 10ml 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합하고, 10 ml의 포화 염화 나트륨 용액으로 세척되고, 무수 황산나트륨으로 건조한 다음, 여과하고 농축하고, 200-300 메쉬, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 20:1인 정상 실리카겔 칼럼을 이용하여 정제된다. 용출물을 모아서, 농축하여 용매를 제거하고, 진공 오일 펌프로 발포 건조하였다. 205 mg의 생성물 K-2를 황색 고체 형태로 수득하였다.
(9-3) K-3 의 합성:
K-2 (205 mg, 0.11 mmol), 숙신산 무수물 (22 mg, 0.22 mmol), 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 27 mg, 0.22 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 71 mg, 0.55 mmol) 1.1 ml의 디클로로메탄에 첨가하고 밤새 실온에서 교반 하 반응시켰다. 반응액을 각 0.5 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트 용액으로 3 번 세척하고, 각 세척에서 나온 수성상을 0.5 ml의 디클로로메탄으로 1회 역추출하였다. 모든 유기상을 혼합하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다, 농축하여 용매를 제거하고, 진공 오일 펌프로 발포 건조해 218 mg의 연한 황색 고체의 형태로 생성물 K-3 접합 분자 (비교 접합 분자 1)를 수득하였다.
제조예 10 - 본 제조예는 (GalNAc)3 접합 분자 (비교 접합 분자 2)의 합성을 설명하기 위해 사용된다.
이 제조예에서, 화합물 47을 WO2014025805A1의 실시예 1-4에 설명된 제조 방법에 따라 합성하였다. 화합물 47의 구조는 하기 화학식에 나타나고, 이는 (GalNAc)3 접합 분자 (비교 접합 분자 2)라고도 지칭된다:
제조예 11 - 본 제조예는 FIN-2 접합 분자 (비교 접합 분자 3)의 제조를 설명하기 위해 사용된다.
이 제조예에서, 하기 공정 경로에 따라 FIN-2 접합 분자 (비교 접합 분자 3)를 Rajeev et al., ChemBioChem 2015, 16, 903-908에 설명된 제조방법을 참조하여 합성하였다:
(11-1) 화합물 PRO-10 의 합성
(11-1-1) PRO-7 의 합성
2.93 g의 PRO-6 (L-히드록시프롤린, CAS No.: 51-35-4, Energy Chemical 에서 구매, 22.4 mmol)를 22.5 ml의 1,4-디옥산에 용해시키고 34 ml의 10% (w/w) Na2CO3 수용액을 첨가하였다. 6.954 g의 Fmoc-Cl(9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(fluorenylmethyl chloroformate), CAS No.: 28920-43-6, Energy Chemical 에서 구매, 26.8 mmol)을 56.5 ml의 1,4-디옥산에 용해시키고, 얼음 수조 하에서 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 자연적으로 실온으로 데워 밤새 반응시켰다. 반응액을 150 ml의 얼음물에 붓고 각 100 ml의 메틸 t-부틸 에테르로 3회 추출하고, 생성된 유기상을 버렸다. 남아 있는 수성상을 농축 염산으로 pH ≤ 5로 조정하고, 100 ml의 에틸 아세테이트로 2번 추출하고, 얻어진 유기상을 혼합하고 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 7.83 g의 생성물 PRO-7을 흰색 포말 고체형태로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.91 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.48 - 7.39 (m, 2H), 7.38 - 7.27 (m, 2H), 5.17 (s, 1H), 4.27 (s, 2H), 4.23 - 4.11 (m, 2H), 3.55 - 3.41 (m, 3H), 2.31 - 2.10 (m, 1H), 2.08 - 1.88 (m, 1H). 에 대한 HRMS (ESI) m/z 계산치 C20H19NO5 [M-H]-352.1190, 측정치: 352.1033.
(11-1-2) PRO-8 의 합성
7.83 g의 PRO-7 (22.2 mmol)를 80 ml의 THF에 용해시키고, 오일 배스하에서 65℃로 가열시키고, 36.6 ml의 2 mol/L THF중 BH3-Me2S 용액(CAS No. 13292-87-0, J&K Scientific Ltd. 에서 구매, 73.2 mmol)을 환류 하에서 첨가하고, 계속 환류시켜 3 시간 동안 반응시켰다. 반응액을 붓고, 그 안의 잔존 고체를 메탄올에 용해시켰다. 생성된 반응액에 메탄올을 가스가 발생하지 않을 때까지 교반하에 첨가하고, 30분 동안 계속 교반하였다. 감압하에서 용매가 증발되고, 그 다음에 잔류물을 각 석유 에테르로 3회 정제해 7.1 g의 생성물 PRO-8을 흰색 고체 형태로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.91 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.49 - 7.39 (m, 2H), 7.38 - 7.26 (m, 2H), 5.18 (dd, J = 6.1, 3.8 Hz, 1H), 4.28 (s, 2H), 4.23 - 4.13 (m, 2H), 3.55 - 3.38 (m, 2H), 2.32 - 2.11 (m, 1H), 2.08 - 1.89 (m, 1H). C20H21NO4 [M+Na]+에 대한 HRMS (ESI) m/z 계산치 362.1368, 측정치: 362.1012.
(11-1-3) PRO-9의 합성
7.1 g의 PRO-8 (21 mmol) 을 100 ml의 피리딘에 용해시키고, 14.2 g의 DMTr-Cl (4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드, 42 mmol)을 첨가해 5시간 동안 실온에서 교반하 반응시켰다. 용매를 감압 하에서 증발시켜 제거하였다. 생성된 조 생성물을 에틸 아세테이트에 용해시키고 염 불순물을 여과하여 제거하였다. 감압하에서 용매가 증발된 다음, 실리카겔 칼럼을 이용해 잔류물을 정제하였다. 정제를 위해, 칼럼을 알칼리화하기 위해 피리딘으로 전처리한 실리카겔 칼럼에 DCM에 용해된 조 생성물을 로드하였다. DMTr-Cl를 1% (v/v) 피리딘을 포함한 DCM로 용리한 다음, 생성물을 에틸 아세테이트로 용리하였다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 8.2 g의 생성물 PRO-9를 흰색 고체 형태로 수득하였다. C41H39NO6 [M+Na]+ 에 대한 HRMS (ESI) m/z 계산치 664.2675, 측정치: 664.2348; C18 RP-HPLC (로트 번호: JJS160324-1); 순도: 94.20%.
(11-1-4) PRO-10 의 합성
8.2 g의 PRO-9 (12.8 mmol)을 64 ml의 DMF에 용해시키고 40 ml의 피페리딘(384 mmol)을 첨가해 30 분 동안 실온에서 교반 하 반응시켰다. 반응액을 300 ml의 얼음물에 붓고 각 150 ml의 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 생성된 유기상을 혼합하고, 200 ml의 포화 염수로 세척하고, 세정한 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압하에서 용매가 증발된 다음, 잔류물을 실리카겔 칼럼으로 정제하였다. 정제를 위해, DCM에 용해된 조 생성물을 칼럼을 알칼리화하기 위해 피리딘으로 전 처리한 실리카겔 칼럼에 로드한다. Fmoc을 1% (v/v) 피리딘을 포함하는 DCM로 용리시킨 다음, 생성물을 에틸 아세테이트로 용리하였다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 4.65 g의 생성물 PRO-10을 흰색 고체 형태로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.40 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.35 - 7.18 (m, 7H), 6.93 - 6.84 (m, 4H), 4.56 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 4.12 (s, 1H), 3.74 (s, 6H), 3.46 - 3.37 (m, 1H), 2.88 (ddd, J = 18.5, 10.0, 5.5 Hz, 2H), 2.75 (dd, J = 8.7, 5.8 Hz, 1H), 2.62 (dd, J = 11.0, 2.7 Hz, 1H), 1.74 - 1.65 (m, 1H), 1.40 (ddd, J = 12.9, 8.5, 5.9 Hz, 1H); C26H29NO4 [M+Na]+ 에 대한 HRMS (ESI) m/z 계산치 442.1994, 측정치: 442.1999; C18 RP-HPLC (로트 번호: JJS160329-1), 순도: 97.07%.
(11-2) FIN-1 의 합성
(1-1)에 기재된 방법에 따라 제조된 GAL-5 (4.5 g, 10 mmol)을 40 ml의 DMF에 용해시키고, 순차적으로 3.9 g의 DIPEA (N,N-디이소프로필에틸아민, CAS No.: 7087-68-5, Aladdin Inc. 에서 구매, 30 mmol) 및 3.8 g의 HBTU (벤조트리아졸-N,N,N',N'- 테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(tetramethyluronium hexafluorophosphate), CAS No.: 94790-37-2, Aladdin Inc. 에서 구매, 11 mmol)을 첨가하고, 실온에서 10분 동안 교반해 반응액을 수득한다. (12-4)단계에서 얻어진 PRO-10 (4.2 g, 10 mmol)를 40 ml의 DMF에 용해시킨 다음, 상기 반응액에 첨가하였다. 생성된 반응액을 무수 황산나트륨을 첨가해 건조하고 실온에서 2 시간 동안 교반한다. 반응액을 120 ml의 얼음물에 붓고, 각 60ml의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 생성된 유기상을 혼합하고, 20ml의 물 및 20ml의 포화 염수로 각각 세척한다. 세정된 유기상을 분리하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압하에서 용매가 증발된 다음, 잔류물을 실리카겔 칼럼으로 정제하였다. 정제를 위해, 칼럼을 알칼리화하기 위해 피리딘으로 전처리한 실리카겔 칼럼에 샘플을 로드하고, 1% (v/v) 트리에틸아민을 포함한 디클로로메탄 (DCM) 용액 및 1% (v/v) 메탄올로 용출하였다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 6.5 g의 생성물 FIN-1을 연한 황색 발포 고체의 형태로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.83 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.32 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 7.20 (td, J = 8.9, 3.5 Hz, 5H), 6.93 - 6.84 (m, 4H), 5.21 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.04 - 4.90 (m, 2H), 4.49 (s, 1H), 4.40 (d, J = 4.4 Hz, 0.8H), 4.31 (d, J = 5.0 Hz, 0.2H), 4.15 (s, 1H), 4.03 (s, 3H), 3.93 (s, 1H), 3.74 (s, 7H), 3.59 (dt, J = 12.0, 6.0 Hz, 1H), 3.50 - 3.40 (m, 1H), 3.39 - 3.25 (m, 3H), 3.13 (dd, J = 8.9, 5.2 Hz, 1H), 3.00 (dq, J = 9.3, 5.3, 4.3 Hz, 1H), 2.22 (s, 2H), 2.07 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.90 (s, 4H), 1.74 (s, 3H), 1.50 (s, 3H), 1.36 (s, 1H). C18 RP-HPLC (로트 번호: LJ160422), 순도: 95.45%.
(11-3) FIN-2의 합성
단계 (11-2)에서 얻어진 FIN-1 (3.0 g, 3.53 mmol)을 10 ml의 DMF에 용해시키고, 2.13 g의 PA (2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포로디아미다이트, Adamas Inc., 제품 No. 11356B, 7.06 mmol) 및 346 mg 테트라졸 (CAS No.: 288-94-8, Aladdin Inc. 에서 구매, 4.94 mmol)를 질소 대기 하에 첨가하고, 실온에서 교반해 반응시켰다. 10 ml의 DMF을 보충하고 1 시간 동안 계속 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켜 제거한 다음, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 정제를 위해, 칼럼을 알칼리화하기 위해 피리딘으로 전처리한 실리카겔 칼럼에 DCM에 용해된 조 생성물을 로드하고, 에틸 아세테이트로 용출하였다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 4.5 g의 조 생성물을 무색 시럽 형태로 수득하였다. 조 생성물을 50% (v/v) 아세토니트릴 수용액에 완전히 용해시키고 칼럼을 알칼리화하기 위해 아세토니트릴 중 1% (v/v) 피리딘 용액으로 전 처리된 중압 칼럼 (C-18, 330 g, 300 Å)으로 정제하였다. 구배 용리에 의한 생성물을 모으고 용매를 감압 하에 증발시켜 2.2 g의 흰색 가루 형태로, 생성물 FIN-2 접합 분자 (비교 접합 분자 3)를 수득하였다. 31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 148.04, 147.94, 147.62, 147.19, 31P NMR의 순도: 92%; C18 RP-HPLC의 순도: 90.54%.
제조예 12-본 제조예는 Z-4 접합 분자 (접합 분자 153)의 제조를 설명하기 위해 사용된다.
이 제조예에서, 접합 분자 153 (또한 하기 Z-4 접합 분자로 지칭한다)는 하기 방법에 따라 합성되었다.
(12-1) Z-1 의 합성:
단계 (7-3)에 기재된 방법에 따라 얻어진 W-3 (1.50 g, 3.37 mmol) 및 단계 (2-2)에 기재된 방법에 따라 얻어진 GAL5-C4-2 (7.18 g, 13.48 mmol)를 혼합하고 34 ml의 디클로로메탄에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 (3.48 g, 26.96 mmol)을 첨가한 후 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온(one) (DEPBT, 4.04 g, 13.48 mmol)을 첨가해 4.5시간 동안 실온에서 교반 하에 반응시켰다. 생성된 액체 용액을 100 ml의 디클로로메탄으로 희석하고, 80 ml의 포화 중탄산 나트륨 용액 및 80 ml의 포화 염수로 각각 세척하였다. 모든 유기상을 혼합히고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하였다. 이는 200-300 메쉬 정상 실리카겔 칼럼을 이용해 정제되었다. 이 칼럼은 석유 에테르로 채워지고, 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 1 중량% 트리에틸아민이 첨가되었고, 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 30:1-15:1이다. 용출물을 모아서 감압하에 증발시켜 3.97 g의 순수 생성물 Z-1을 수득하였다. MS m/z: C98H143N10O33, [M+H]+, 계산치: 1987.98, 측정치: 1987.90.
(12-2) Z-2의 합성:
(12-1)에 기재된 방법에 따라 수득한 Z-1 (3.97 g, 2.00 mmol)를 250 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 디클로로아세트산 (10.941 g, 84.85 mmol)을 첨가해 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 피리딘을 첨가해 생성된 반응 용액을 중성으로 중화시켰다. 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하였다. 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 10 중량% 피리딘을 첨가한 200 g 200-300 메쉬 정상 실리카겔 칼럼에 조 생성물을 로드하였다. 이 칼럼은 1중량‰ 피리딘으로 평형화되어있고 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 10:1-2:1이다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 3.49 g의 순수 생성물 Z-2 수득하였다. MS m/z: C79H129N10O33, [M+H]+, 계산치: 1746.94, 측정치: 1746.90.
(12-3) Z-3의 합성:
Z-2 (3.49 g, 2.0 mmol) 및 단계 (1-7a)에 기재된 방법에 따라 얻어진 A-1 (3.06 g, 6.0 mmol)를 혼합하고 30 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리진-4(3H)-온(one) (DEPBT, 1.80 g, 6.0 mmol)을 첨가한 후 디이소프로필에틸아민 (1.55 g, 12.0 mmol)을 첨가해 3 시간 동안 교반 하에 25℃에서 반응시켰다. 100 ml 디클로로메탄을 희석을 위해 생성된 반응 용액에 첨가하였다. 유기상을 30ml의 포화 중탄산 나트륨으로 2회 세척하였다. 수성상을 10 ml의 디클로로메탄으로 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고 50 ml의 포화 염수로 세척된다. 얻어진 유기상을 혼합하고 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하였다. 감압하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 밤새 진공 오일 펌프로 발포 건조되고 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 정상 실리카겔을 이용해서 칼럼 정제하였다, 200-300 메쉬, 200 g, 20 ml 트리에틸아민 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해. 칼럼은 1 중량% 트리에틸아민을 포함한 석유 에테르로 평형화되어 있고 구배 용리는 디클로로메탄: 메탄올 = 25:1-15:1. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 2.2g의 순수 생성물 Z-3을 수득하였다. MS m/z: C103H151N10O38, [M+H]+, 계산치: 2136.02, 측정치: 2136.20.
(12-4) Z-4의 합성:
Z-3 (2.10 g, 0.983 mmol)를 DIEA (635mg, 4.915 mmol)을 포함한 14.8 ml의 디클로로메탄에 용해시키고, 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 240 mg, 1.966 mmol)를 생성 용액에 첨가해 투명해질 때까지 교반하였다. 숙신산 무수물(197 mg, 1.966 mmol)을 첨가해 18 시간 동안 교반 하에 25℃에서 반응시켰다. 50 ml 디클로로메탄 희석을 위해 생성된 반응 용액에 첨가했고, 80 ml의 0.5 M 트리에틸아민 포스페이트로 세척하였다. 수성 상을 50 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고,용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 수득하였다. 200-300 메쉬, 188 g, 실리카겔의 산성을 중화시키기 위해 1 중량% 트리에틸아민을 포함한 정상 실리카겔을 이용해서 조 생성물을 칼럼 정제하였다. 칼럼은 디클로로메탄으로 평형화되고 구배 용리는 1중량‰ 트리에틸아민을 포함한 디클로로메탄: 메탄올 = 10:1-3:1이다. 용출물을 모아서, 용매를 감압 하에 증발시키고 1.95 g의 순수 생성물 Z-4 접합 분자 (접합 분자 12)를 수득하였다. MS m/z: C107H155N10O41, [M+H]+, 계산치: 1935.07, 측정치: 1935.29. Z-4 접합 분자의 구조는 화학식 (422)으로 표현된다.
제조예 13 L10-siHBa1 접합체의 제조 (접합체 9)
이 제조예에서, L10-siHBa1 접합체(또한 이하 접합체9로 지칭한다)는 하기 방법에 따라 L-9 접합 분자 (접합 분자 1)로부터 제조된다.
(13-1) 화합물 L-10의 합성:
이 단계에서, 화합물 L-10는 L-9 접합 분자를 고상 지지체에 연결하여 제조하였다.
단계 (1-8)에서 얻어진 L-9 접합 분자 (0.233 g, 0.1126 mmol), O-벤조트리아졸-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU, 0.064 g, 0.1689 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 0.029 g, 0.2252 mmol)를 혼합하고 19 ml의 아세토니트릴에 용해시키고, 실온에서 5분간 교반하였다. 아미노메틸 수지 (0.901 g, 100-200 메쉬, 아미노 로딩: 400 μmol/g, Tianjin Nankai HECHENG S&T Co., Ltd. 에서 구매) 을 반응액에 첨가하였다. 반응은 25℃에서 220 rpm/분으로 15 시간동안 혼합기에서 수행되고, 이후 여과된다. 잔류물을 각 30 ml의 DCM로 2회, 각 30 ml의 아세토니트릴로 3회, 30 ml의 에틸 에테르로 1회 헹구고, 진공 오일 펌프로 2 시간 동안 건조하였다. 그 다음에 캡핑 반응을 표 7에 나타난 충전비에 따라 수행하였다.
출발 물질 양 수준 로트 번호 제조사
캡1 20 ml - - -
캡2 2.3 ml - - -
DMAP 0.01 g 분석용 순도(analytical pure) I1422139 Aladdin
아세토니트릴 2.3 ml 분광학적 순도(spectroscopic pure) O15161001 CINC (Shanghai) Co., Ltd
상기 표에서, 캡1 및 캡2은 캡핑 시약의 용액이다. 캡1은 피리딘/아세토니트릴의 혼합물 중 20 부피% N-메틸이미다졸 용액이고, 상기 피리딘 대 아세토니트릴의 부피비는 3:5이다. 캡2은 아세토니트릴 중 20부피% 무수 아세트산 용액이다.
캡1, 캡2, 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP) 및 아세토니트릴을 상기 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응은 25℃에서 200 rpm/분으로 5 시간 동안 혼합기에서 수행된다. 반응 액은 여과된다. 잔류물을 각 30 ml의 아세토니트릴로 3번 헹구고, 용매를 증발 건조시키고, 혼합물을 감압 하 밤새 진공 오일 펌프로 건조해 90.8 μmol/g의 로딩을 가진 1.100 g의 화합물 L-10 (즉, 고상 지지체에 연결된 L-9 접합 분자)을 수득하였다. 화합물 L-10의 구조는 화학식 (523)으로 나타낼 수 있다.
(13-2) L10-siHB1 접합체의 정배열 가닥의 합성
이 단계에서, siRNA접합체의 siRNA는siHBa1으로 번호가 매겨진 서열이다:
siHBa1
정배열 가닥: 5'- CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3' (서열 번호: 1),
역배열 가닥: 5'- UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3' (서열 번호: 2).
상기 단계에서 제조된 화합물 L-10로부터 출발하여 포스포르아미다이트 고상 합성 방법에 따라 뉴클레오시드 단량체를 3' 에서 5' 방향으로 상기 서열에 따라 하나씩 연결하였다. 각 뉴클레오시드 단량체의 연결은 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화의 4 단계를 포함한다. 합성 조건은 다음과 같이 주어졌다.
뉴클레오시드 단량체는 0.1 M 아세토니트릴 용액에 제공되었다. 각 탈보호 반응에서 조건은 동일하다. 즉, 온도 25℃, 반응 시간 70초, 탈보호 시약으로써 디클로로메탄 중 디클로로아세트산 (3% v/v)용액, 및 디클로로아세트산 대 4,4'-디메톡시트리틸의 고상 지지체 상 보호기의 몰 비는 5:1이다.
각 커플링 반응에서 조건은 동일하며, 온도 25℃, 고상 지지체 상 연결된 핵산 서열 대 뉴클레오시드 단량체의 몰 비는 1:10, 고상 지지체 상 연결된 핵산 서열 대 커플링 시약의 몰 비는 1:65, 반응 시간은 600초, 커플링 시약으로 5-에틸티오-1H-테트라졸의 0.5 M 아세토니트릴 용액을 포함한다.
각 캡핑 반응에서 조건은 동일하며, 온도 25℃및 반응 시간 15초를 포함한다. 캡핑 시약은 캡1 및 캡2의 몰 비가 1:1인 혼합 용액이고; 캡핑 시약 대 고상 지지체 상 연결된 핵산 서열의 몰 비는 무수 아세트산: N-메틸이미다졸: 고상 지지체 상 연결된 핵산 서열= 1:1:1이다..
각 산화 반응에서 조건은 동일하며, 온도 25℃, 반응 시간 15 초, 및 산화 시약으로 0.05 M 요오드수; 요오드 대 커플링 단계에서 고상 지지체 상 연결된 핵산 서열의 몰 비는 30:1를 포함한다. 테트라히드로푸란: 물: 피리딘 = 3:1:1의 혼합 용매에서 반응이 수행된다.
절단 및 탈보호 조건은 다음과 같다. 지지체에 연결된 합성 뉴클레오티드 서열을 25 중량% 암모니아 수용액에 첨가해 16 시간동안 55℃에서 반응시키고, 암모니아 수용액은 뉴클레오티드 서열에 대해 0.5 ml/μmol의 양으로 존재한다. 액체는 제거되고, 잔류물을 진공에서 농축 건조하였다. 암모니아 수용액으로 처리한 이후에, 생성물을 N-메틸피롤리돈(methylpyrrolidone)에 0.4 ml/μmol의 양으로 용해시키고, 그 다음에 단일 가닥 핵산의 양에 대해 0.3 ml/μmol의 트리에틸아민 및 0.6 ml/μmol의 트리에틸아민 트리히드로플로라이드(trihydrofluoride)를 첨가하고, 그리고 나서 리보오스의 2'-TBDMS 보호를 제거한다. 정제 및 탈염화(desalination): 핵산의 정제는 NaCl의 구배 용리를 가진 조제용 이온 크로마토그래피 칼럼을 이용해 달성될 수 있다 (Source 15Q). 구체적으로, 용리제A: 20 mM 포스페이트 나트륨(pH 8.1), 용매: 물/아세토니트릴 = 9:1 (v/v); 용리제 B: 1.5 M 염화 나트륨, 20 mM 포스페이트 나트륨 (pH 8.1), 용매: 물/아세토니트릴 = 9:1 (v/v); 구배 용리: 용리제 A: 용리제의 B 비율 = 100:0-50:50이다. 용출물을 모아서, 혼합하고 역상 크로마토그래피 칼럼을 이용해 탈염화하였다. 구체적인 조건은 충전제로 Sephadex-G25 및 용리를 위한 탈이온수와 함께 탈염화에 Sephadex column을 사용한 것을 포함한다.
검출: 이온 교환 크로마토그래피(IEX-HPLC)에 의해 검출된 순도는 92.4%이었고; 액체 크로마토그래피-질량 분석 (LC-MS)에 의해 측정된 분자량은 계산값 7253.96 및 측정값 7253.12이었다.
따라서, 이 단계에서, L-9 접합 분자는 생성된 정배열 가닥의 3' 말단에 연결되었고, L-9 접합 분자가 siRNA의 3’말단에 접합된 siRNA의 정배열 가닥 S이 생성되었다.
(13-3) 역배열 가닥의 합성
이 단계에서, L10-siHB1 접합체의 역배열 가닥 AS는 범용 고상 지지체(UnyLinker™ 적재 NittoPhase®HL 고체 지지체, Kinovate Life Sciences Inc.)를 이용하여 합성되었다. siRNA의 역배열 가닥 AS는 고상 합성 방법에서 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화 반응 조건, 탈보호 및 절단 조건, 및 분리 조건을 포함하는 정배열 가닥의 합성에서와 동일한 조건에서 합성되었다.
검출: IEX-HPLC로 검출된 순도는 93.2%이고 LC-MS로 분석된 분자량은 계산값 6675.04 및 측정값 6674.50이다.
(13-4) L10-siHBa1 접합체의 합성
S 가닥 및 AS 가닥을 주사용수(water for injection) 에 용해시켜 각각 40 mg/mL의 용액을 얻었다. 이것들을 등몰비로 혼합하고, 15 분 동안 50℃에서 가열하고, 실온으로 냉각해 수소 결합을 통한 이중 가닥 구조를 형성하였다.
상기 합성이 완료된 후에, 접합체를 초순수(ultra-pure water) (18.2MΩ*cm（25℃）의 저항을 갖는, Milli-Q 초순수 장치를 이용해 제조됨)를 이용해0.2 mg/mL의 농도로 희석하였다. 분자량을 LC-MS로 측정하였다 (Waters Corp. 에서 구매, 모델: LCT Premier). 그 결과, S 및 AS에 대한 분자량의 계산값은 각각 7253.96 및 6675.04이고, 그 측정값은 각각 7253.24 및 6674.61 이다. 측정값이 계산값과 일치하기 때문에 합성된 접합체가 L9 접합 분자를 포함한 표적 설계된 이중 가닥 핵산 서열임을 확인하였다. L10-siHBa1 접합체 (접합체 9)의 구조는 화학식 (3)으로 표현된다.
제조예 14 접합체 16-18, 24-26, 42-43, 62, 78, 105, 109, 111, 115, 144, 및 154-171의 제조
주어진 접합체를 제조예 13에서와 동일한 방법을 이용해 제조하였다, 이러한 점을 제외하고: 1) 접합된 siRNA는 표 8 내지 표 14에 나타난 서열을 가지고 있고 이는 16-18, 24-26, 42-43, 62, 78, 105, 109, 111, 115, 144, 157-163, 및 167-171의 접합체와 일치한다; 2) 포스포로티오에이트 결합이 표적 서열의 두 뉴클레오티드사이에 존재할 때, 두 뉴클레오티드 중 나중의 것이 연결되는 동안 다음의 황화 반응 단계가 산화 반응 단계를 대체한다; 각 황화 반응을 위한 조건은 동일하며, 온도 25℃, 반응 시간 300 초, 및 황화 시약으로 크산탄 수소화물을 포함한다; 커플링 단계에서 황화 시약 대 고상 지지체 상 연결된 핵산 서열의 몰 비는 120:1이고; 아세토니트릴: 피리딘의 혼합 용매 = 1:1의 혼합용매에서 반응이 수행된다; 및 3) 표적 서열의 모든 뉴클레오티드에서 2'-위치가 변성 히드록실기인 경우, 리보오스에서 2'-TBDMS 보호를 제거하는 단계는 절단 및 탈보호 조건에 포함되지 않는다. 따라서, 본원에 개시된 접합체 16-18, 24-26, 42-43, 62, 78, 105, 109, 111, 115, 144, 157-163 를 제조하였다.
또한, 접합체 154-156 및 164-166을 제조예 13에서와 동일한 방법을 이용해 제조하였다, 이러한 점을 제외하고: 다음 접합 분자를 각각 L-9 접합 분자를 대체하는데 이용하였다: 접합체 164는 제조예 2에서 얻은 P-9 접합 분자 (접합 분자 2)로부터 제조되고; 접합체 155, 156 및 165은 제조예 7에서 얻은 W-7 접합 분자 (접합 분자 7) 로부터 제조되고; 접합체 154 및 166은 제조예 12 에서 얻은 Z-4 (접합 분자 12)로부터 제조되고, 접합된 siRNA는 각각 접합체 154-156 및 164-166에 대응하는 표 8 내지 14에 나타난 서열을 가지고, 접합체를 표 8-14에 따라 별도로 번호를 매겼다. 이들의 구조는 화학식 (3), 화학식 (4), 화학식 (15) 및 화학식 (22)로 각각 표현된다. 접합체의 분자량은 다음과 같이 LC-MS으로 측정되었다:
접합체 142: 계산 값 S: 7649.55, AS: 6991.46,
측정 값: S: 7649.1, AS: 6991;
접합체170: 계산 값 S: 7649.55, AS: 6995.47,
측정 값: S: 7648.8, AS: 6994.8;
접합체 171: 계산 값 S: 7649.55, AS: 7011.53,
측정 값: S: 7648.8, AS: 7010.9;
접합체 115: 계산 값 S: 7584.5, AS: 7007.46,
측정 값: S: 7584, AS: 7006.2;
접합체 109: 계산 값 S: 7584.5, AS: 6931.47,
측정 값: S: 7584, AS: 6930.9;
접합체 106: 계산 값 S: 7572.47, AS: 6907.41,
측정 값: S: 7571.8, AS: 6906.9;
접합체 113: 계산 값 S: 7584.5, AS: 7011.47,
측정 값: S: 7584, AS: 7011.3;
접합체 17: 계산 값 S: 7504.34, AS: 6961.52,
측정 값: S: 7503.4, AS: 6960.9;
접합체 25: 계산 값 S: 7504.34, AS: 7037.51,
측정 값: S: 7503.6, AS: 7036.9;
접합체 18: 계산 값 S: 8218.83, AS: 7703.05,
측정 값: S: 8218, AS: 7702.5;
접합체 16: 계산 값 S: 7516.37, AS: 6985.58,
측정 값: S: 7516.5, AS: 6984.9;
접합체 159: 계산 값 S: 7504.34, AS: 7057.58,
측정 값: S: 7503.6, AS: 7057;
접합체 160: 계산 값 S: 7504.34, AS: 7041.52,
측정 값: S: 7503.6, AS: 7040.8;
접합체 161: 계산 값 S: 7516.37, AS: 7065.58,
측정 값: S: 7516.6, AS: 7064.5;
접합체 162: 계산 값 S: 7504.34, AS: 7139.68,
측정 값: S: 7515.6, AS: 7138.9;
접합체 163: 계산 값 S: 7516.37, AS: 7081.64,
측정 값: S: 7515.6, AS: 7080.9;
접합체 62: 계산 값 S: 7485.3, AS: 7161.7,
측정 값: S: 7484.4, AS: 7160.9;
접합체 78: 계산 값 S: 7423.22, AS: 7207.78,
측정 값: S: 7422.6, AS: 7207.2;
접합체 42: 계산 값 S: 7407.22, AS: 7208.77,
측정 값: S: 7406.4, AS: 7208.1;
접합체 43: 계산 값 S: 7407.22, AS: 7170.72,
측정 값: S: 7406.5, AS: 7170.1,
측정값은 계산값과 일치한다.
접합체 번호. 서열 방향 5' - 3' 서열 번호
접합체 10 L10-siHBa1 S* CCUUGAGGCAUACUUCAAA 1
AS UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU 2
접합체 11 L10-siHBa2 S GACCUUGAGGCAUACUUCAAA 3
AS UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUCGG 4
접합체 12 L10-siHBa1M1 S CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 5
AS UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 6
접합체 13 L10-siHBa1M2 S CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 7
AS UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 8
접합체 14 L10-siHBa2M1 S GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 9
AS UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm 10
접합체 15 L10-siHBa2M2 S GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 11
AS UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm 12
접합체 16 L10-siHBa1M1S S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 14
접합체 17 L10-siHBa1M2S S CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 15
AS UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 16
접합체 18 L10-siHBa2M1S S GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 17
AS UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 18
접합체 19 L10-siHBa2M2S S GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 19
AS UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 20
접합체 20 L10-siHBa1M1P S CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 5
AS VP-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 136
접합체 21 L10-siHBa1M2P S CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 7
AS VP-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm 137
접합체 22 L10-siHBa2M1P S GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 9
AS VP-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm 138
접합체 23 L10-siHBa2M2P S GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 11
AS VP-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm 139
접합체 24 L10-siHBa1M1SP S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 140
접합체 25 L10-siHBa1M2SP S CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 15
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 141
접합체 26 L10-siHBa2M1SP S GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 17
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 142
접합체 27 L10-siHBa2M2SP S GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 19
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm 143
접합체 28 L10-siHBa1M5SP S CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 15
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 140
접합체 29 L10-siHBa1M3SP S CmsCmsUmUmGmAmGfGmCfAmUfAmCmUmUmCmAmAmAm 144
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 140
접합체 30 L10-siHBa1M4SP S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 145
접합체 31 P10-siHBa1M1SP S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 140
접합체 32 R5-siHBa1M1SP S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 140
접합체 33 LA5-siHBa1M1SP S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 140
접합체 34 LB5-siHBa1M1SP S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 140
접합체 35 V8-siHBa1M1SP S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 140
접합체 36 W8-siHBa1M1SP S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 140
접합체 37 X8-siHBa1M1SP S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 140
접합체 154 Z5-siHBa1M2SP S CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 15
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 141
접합체 155 W8-siHBa1M2SP S CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 15
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 141
비교 접합체 4 K4-siHBa1M1SP S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 140
비교 접합체 5 (GalNAc)3-siHBa1M1SP S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 140
비교 접합체 6 FIN-siHBa1M1SP S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 13
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 140
접합체 번호. 서열 방향5' - 3' 서열 번호
접합체 38 L10-siHBb1M1S S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm 39
접합체 39 L10-siHBb2M1S S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 40
접합체 40 L10-siHBb1M2 S UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 35
AS UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm 36
접합체 41 L10-siHBb2M2 S UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 35
AS UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm 37
접합체 42 L10-siHBb1M1SP S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm 146
접합체 43 L10-siHBb2M1SP S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 147
접합체 44 L10-siHBb1M2SP S UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 41
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm 148
접합체 45 L10-siHBb2M2SP S UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 41
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 149
접합체 46 L10-siHBb1M5SP S UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 41
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm 146
접합체 47 L10-siHBb1M3SP S UmsGmsCmUmAfUmGfCmCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 150
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm 146
접합체 48 L10-siHBb1M4SP S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUfGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm 151
접합체 49 L10-siHBb4M1SP S GmsCmsUmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 152
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCmsGmsCm 153
접합체 50 L10-siHBb1 S UGCUAUGCCUCAUCUUCUA 29
AS UAGAAGAUGAGGCAUAGCAGC 30
접합체 51 L10-siHBb2 S UGCUAUGCCUCAUCUUCUA 29
AS UAGAAGAUGAGGCAUAGCAUU 31
접합체 52 P10-siHBb2M1SP S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 147
접합체 53 R5-siHBb2M1SP S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 147
접합체 54 LA5-siHBb2M1SP S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 147
접합체 55 LB5-siHBb2M1SP S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 147
접합체 56 V8-siHBb2M1SP S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 147
접합체 57 W8-siHBb2M1SP S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 147
접합체 58 X8-siHBb2M1SP S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 147
비교 접합체 7 K4-siHBb2M1SP S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 147
비교 접합체 8 GalNAc-
siHBb2M1SP		 S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 147
비교 접합체 9 FIN-siHBb2M1SP S UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm 38
AS VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm 147
접합체 번호. 서열 방향 5' - 3' 서열 번호
접합체 59 L10-siHBc1 S UCUGUGCCUUCUCAUCUGA 52
AS UCAGAUGAGAAGGCACAGACG 53
접합체 60 L10-siHBc1M1 S UmCmUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 54
AS UmCfAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmCmGm 55
접합체 61 L10-siHBc1M2 S UmCmUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 56
AS UmCfAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmCmGm 57
접합체 62 L10-siHBc1M1SP S UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 58
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 154
접합체 63 L10-siHBc1M2SP S UmsCmsUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 60
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 155
접합체 64 L10-siHBc1M3SP S UmsCmsUmGmUfGmCfCmUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 156
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 154
접합체 65 L10-siHBc1M4SP S UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 58
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAfGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 157
접합체 66 L10-siHBc1M5SP S UmsCmsUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 60
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 154
접합체 67 L10-siHBc2M1SP S CmsGmsUmCmUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 158
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGmGmGm 159
접합체 68 P10-siHBc1M1SP S UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 58
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 154
접합체 69 R5-siHBc1M1SP S UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 58
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 154
접합체 70 LA5-siHBc1M1SP S UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 58
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 154
접합체 71 LB5-siHBc1M1SP S UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 58
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 154
접합체 72 V8-siHBc1M1SP S UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 58
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 154
접합체 73 W8-siHBc1M1SP S UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 58
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 154
접합체 74 X8-siHBc1M1SP S UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 58
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 154
비교 접합체 10 K4-siHBc1M1SP S UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm 58
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 154
접합체 번호. 서열 방향5' - 3' 서열 번호
접합체 75 L10-siHBd1 S CGUGUGCACUUCGCUUCAA 66
AS UUGAAGCGAAGUGCACACGGU 67
접합체 76 L10-siHBd1M1 S CmGmUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 68
AS UmUfGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUm 69
접합체 77 L10-siHBd1M2 S CmGmUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 70
AS UmUfGmAmAmGfCmGfAfAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUm 71
접합체 78 L10-siHBd1M1SP S CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 72
AS VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 160
접합체 79 L10-siHBd1M2SP S CmsGmsUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 74
AS VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGfAfAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 161
접합체 80 L10-siHBd1M3SP S CmsGmsUmGmUfGmCfAmCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 162
AS VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 160
접합체 81 L10-siHBd1M4SP S CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 72
AS VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAfGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm 163
접합체 82 L10-siHBd1M5SP S CmsGmsUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 74
AS VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 160
접합체 83 L10-siHBd2M1SP S AmsCmsCmGmUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 164
AS VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUmsCmsCm 165
접합체 84 P10-siHBd1M1SP S CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 72
AS VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 160
접합체 85 R5-siHBd1M1SP S CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 72
AS VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 160
접합체 86 LA5-siHBd1M1SP S CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 72
AS VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 160
접합체 87 LB5-siHBd1M1SP S CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 72
AS VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 160
접합체 88 V8-siHBd1M1SP S CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 72
AS VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 160
접합체 89 W8-siHBd1M1SP S CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 72
AS VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 160
접합체 90 X8-siHBd1M1SP S CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 72
AS VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 160
비교 접합체 11 K4-siHBd1M1SP S CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm 72
AS VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm 160
접합체 번호. 서열 방향 5’ - 3’ 서열 번호
접합체 91 L10-siAN1 S CCAAGAGCACCAAGAACUA 80
AS UAGUUCUUGGUGCUCUUGGCU 81
접합체 92 L10-siAN2 S AGCCAAGAGCACCAAGAACUA 82
AS UAGUUCUUGGUGCUCUUGGCUUG 83
접합체 93 L10-siAN1M1 S CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 84
AS UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm 85
접합체e 94 L10-siAN2M1 S AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 86
AS UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm 87
접합체e 95 L10-siAN1M2 S CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 84
AS UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm 88
접합체 96 L10-siAN2M2 S AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 86
AS UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm 89
접합체 97 L10-siAN1M3 S CmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 90
AS UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm 88
접합체 98 L10-siAN2M3 S AmGmCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 91
AS UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm 89
접합체 99 L10-siAN1M1P S CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 84
AS VP-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm 166
접합체 100 L10-siAN2M1P S AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 86
AS VP-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm 167
접합체 101 L10-siAN1M2P S CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 84
AS VP-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm 168
접합체 102 L10-siAN2M2P S AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 86
AS VP-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm 169
접합체 103 L10-siAN1M3P S CmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 90
AS VP-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm 168
접합체 104 L10-siAN2M3P S AmGmCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 91
AS VP-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm 169
접합체 105 L10-siAN1M1S S CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 92
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 93
접합체 106 L10-siAN2M1S S AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 94
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm 95
접합체 107 L10-siAN1M2S S CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 92
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 96
접합체 108 L10-siAN2M2S S AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 94
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm 97
접합체 109 L10-siAN1M3S S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 96
접합체 110 L10-siAN2M3S S AmsGmsCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 99
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm 97
접합체 111 L10-siAN1M1SP S CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 92
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 170
접합체 112 L10-siAN2M1SP S AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 94
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm 171
접합체 113 L10-siAN1M2SP S CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 92
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 172
접합체 114 L10-siAN2M2SP S AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 94
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm 173
접합체 115 L10-siAN1M3SP S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 172
접합체 116 L10-siAN2M3SP S AmsGmsCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 99
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm 173
접합체 117 L10-siAN1M4S S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUfGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 174
접합체 118 L10-siAN1M4SP S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 175
접합체 119 L10-siAN1M5S S CmsCmsAmAmGfAmGfCmAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 176
AS UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 177
접합체 120 L10-siAN1M5SP S CmsCmsAmAmGfAmGfCmAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 176
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 178
접합체 121 P10- siAN1M3SP S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 172
접합체 122 R5-siAN1M3SP S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 172
접합체 123 LA5-siAN1M3SP S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 172
접합체 124 LB5-siAN1M3SP S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 172
접합체 125 V8-siAN1M3SP S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 172
접합체 126 W8-siAN1M3SP S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 172
접합체 127 X8-siAN1M3SP S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 172
접합체 156 W8-siAN1M3SPs S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS Ps-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 203
접합체 157 L10-siAN1M3SPs S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS Ps-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 203
비교 접합체 12 K4-siAN1M3SP S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 98
AS VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 172
접합체 번호. 서열 방향5' - 3' 서열 번호
접합체 128 L10-siAP1 S CAAUAAAGCUGGACAAGAA 108
AS UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGG 109
접합체 129 L10-siAP2 S CCCAAUAAAGCUGGACAAGAA 110
AS UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGGAG 111
접합체 130 L10-siAP1M1 S CmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 112
AS UmUfCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGm 113
접합체 131 L10-siAP2M1 S CmCmCmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 114
AS UmUfCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmAmGm 115
접합체 132 L10-siAP1M2 S CmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 116
AS UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGm 117
접합체 133 L10-siAP2M2 S CmCmCmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 118
AS UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmAmGm 119
접합체 134 L10-siAP1M1P S CmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 112
AS VP-UmUfCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGm 179
접합체 135 L10-siAP2M1P S CmCmCmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 114
AS VP-UmUfCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmAmGm 180
접합체 136 L10-siAP1M2P S CmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 116
AS VP-UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGm 181
접합체 137 L10-siAP2M2P S CmCmCmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 118
AS VP-UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmAmGm 182
접합체 138 L10-siAP1M1S S CmsAmsAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 120
AS UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 121
접합체 139 L10-siAP2M1S S CmsCmsCmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 122
AS UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm 123
접합체 140 L10-siAP1M2S S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 124
AS UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 125
접합체 141 L10-siAP2M2S S CmsCmsCmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 126
AS UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm 127
접합체 142 L10-siAP1M1SP S CmsAmsAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 120
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 183
접합체 143 L10-siAP2M1SP S CmsCmsCmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 122
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm 184
접합체 144 L10-siAP1M2SP S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 124
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 185
접합체 145 L10-siAP2M2SP S CmsCmsCmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 126
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm 186
접합체 146 P10-siAP1M2SP S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 124
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 185
접합체 147 R5-siAP1M2SP S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 124
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 185
접합체 148 LA5-siAP1M2SP S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 124
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 185
접합체 149 LB5-siAP1M2SP S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 124
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 185
접합체 150 V8-siAP1M2SP S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 124
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 185
접합체 151 W8-siAP1M2SP S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 124
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 185
접합체 152 X8-siAP1M2SP S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 124
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 185
비교 접합체 13 K4-siAP1M3SP S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 124
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 185
접합체 번호. 서열 방향 5' - 3' 서열 번호
접합체 158 L10-simTTR S AfsAmsCfAmGfUmGfUmUfCfUfUmGfCmUfCmUfAmUfAmAf 204
AS UmsUfsAmUfAmGfAmGfCmAfAmGmAmAfCmAfCmUfGmUfUmsUmsUm 205
접합체 159 L10-siHBa1M2Sps S CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 206
AS ps-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 207
접합체 160 L10- siHBa1M2Sp S CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 208
AS p-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 209
접합체 161 L10-siHBa1M1Sp S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 210
AS p-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 211
접합체 162 L10- siHBa1M1SpsT S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 212
AS ps-TmoesUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 213
접합체 163 L10-siHBa1M1Sps S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 214
AS ps-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 215
접합체 164 P10-siHBa1M2SP S CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 216
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 217
접합체 165 W8-siHBa1M2SP S CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 218
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 219
접합체 166 Z5-siHBa1M2SP S CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 220
AS VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 221
접합체 167 L10-siP1M1Sp S GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm 222
AS p-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm 223
접합체 168 L10-siP1M1SP S GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm 224
AS VP-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm 225
접합체 169 L10- siAN2M1Sp S AmsGmsCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 226
AS p-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm 227
접합체 170 L10- siAP1M1Sp S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 228
AS p-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 229
접합체 171 L10- siAP1M1Sps S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 230
AS ps-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 231
비교 접합체 14 K4-simTTR S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 232
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 233
비교 접합체 15 AD-66810 S CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm 234
AS VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm 235
비교 접합체 16 AD-65695 S AmsCmsAmUmAmUmUfUmGfAfUfCmAmGmUmCmUmUmUmUmUm 195
AS AmsAfsAmAmAmGfAmCmUmGmAmUmCmAfAmAfUmAmUmGmUmsUmsGm 196
비교 접합체 17 AD-69535 S GmsCmsUmUmAmAmAmAmGfGmGfAmCmAmGmUmAmUmUmCmAm 197
AS UmsGfsAmAmUmAmCmUmGmUmCmCfCmUfUmUmUmAmAmGmCmsAmsAm 198
비교 siRNA 18 X2M2 S CmCmUmUmGAGGCmAUmACmUmUmCmAAAdTsdT 236
AS UfUmUfGAAGUfAUGCCUfCAAGGdTsdT 237
*S: 정배열 가닥; AS: 역배열 가닥
참고: 대문자 C, G, U, 및 A 는 뉴클레오티의 염기 조성을 나타내며; dT는 데옥시티민 뉴클레오티드임을 나타내고; 소문자 m은 문자 m의 왼쪽에 인접한 뉴클레오티드가 2'-메톡시 변성뉴클레오티드임을 나타내며; 소문자 f는 문자 f의 왼쪽에 인접한 뉴클레오티드가 2'-플루오르 변성 뉴클레오티드임을 나타내며; 소문자 s 는 문자 s의 양 옆에 인접한 두 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; VP는 문자VP 의 오른쪽에 인접한 뉴클레오티드가 비닐 포스페이트 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; P 는 문자P 의 오른쪽에 인접한 뉴클레오티드가 포스페이트 뉴클레오티드임을 나타내고; Ps 는 문자 Ps 의 오른쪽에 인접한 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 변성 뉴클레오티드임을 나타내고; Tmoe는 2'-메톡시에톡실로 변성된 티민 뉴클레오티드를 나타낸다.
비닐 포스페이트 및 2'-메톡시 변성 우리딘 단량체 (VP-Um)를 다음 방법에 따라 합성하였다:
(14-1) VP-U-2의 합성
VP-U-2 분자를 다음 방법에 따라 합성하였다:
2'-메톡시 변성 우라실 뉴클레오시드 (2'-OMe-U, 51.30 g, 91.6 mmol), 3차-부틸 디페닐클로로실란 (TBDPSCl, 50.35 g, 183.2 mmol), 및 이미다졸 (12.47 g, 183.2 mmol)을 혼합하고 450 ml의 N,N-디메틸포름아미드 (DMF)에 용해시켜 20 시간 동안 교반 하에 실온에서 반응시켰다. DMF를 증발로 제거하고, 잔류물을 600 ml의 디클로로메탄에 용해시키고 300 ml의 포화 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 분리된 수성상을 각 300 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합하고, 수성상의 pH<5가 될때까지 5% 옥살산으로 세척하였다. 용매를 증발 건조 시켰다. 조 생성물 VP-U-1을 수득하였다, 이는 후속 VP-U-2 의 합성에 직접 사용되었다.
조 생성물 VP-U-1을 100 ml의 디클로로메탄에 용해시킨 다음, 10 분간 얼음 수조하에서 교반하였다. 4℃ 냉장고에서 예비 냉각된 450 ml의 2% p-톨루엔술폰산 용액(메탄올 및 디클로로메탄을 부피비 3:7로 혼합한 용매와 함께)을 첨가하고 10 분간 반응시켰다. 200 ml의 포화 중탄산 나트륨을 첨가하여 반응을 급냉시켰다. 얻어진 유기상을 포화 중탄산 나트륨 용액의 첨가로 pH=8로 세척하였다. 수성상을 합하고 200 ml의 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고 200 ml의 포화 염수로 1회 세척된다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 200-300 메쉬, 정상 실리카겔 칼럼을 이용해 정제하였다. 이 칼럼은 석유 에테르로 채워지고 구배 용리는 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: 메탄올 = 1:1:1:0.05-1:1:1:0.25이다. 용출물을 모아서, 감압 하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 진공 오일 펌프로 발포 건조되고 총 40.00 g의 순수 생성물 VP-U-2를 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.64 (dtd, J = 5.1, 4.0, 2.2 Hz, 4H), 7.41-7.30 (m, 6H), 6.79 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 5.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.94 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.12 (td, J = 4.6, 3.9 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 4.8, 4.0 Hz, 1H), 3.96 (t, J = 4.7 Hz, 1H), 3.68 (ddd, J = 11.8, 7.0, 4.6 Hz, 1H), 3.57 - 3.46 (m, 1H), 3.39 (s, 3H), 1.05 (s, 8H). MS m/z: C26H33N2O6Si, [M+H]+, 계산치: 497.21, 측정치: 497.45.
(14-2) VP-U-4의 합성:
VP-U-2 (19.84 g, 40.0 mmol), 디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC, 16.48 g, 80.0 mmol), 피리딘 (4.20 g, 53.2 mmol), 및 트리플루오로아세트산 (6.61 g, 53.2 mmol)을 혼합하고 200 ml의 디메틸 술폭시드(DMSO)에 용해시키고 20 시간동안 교반 하에 실온에서 반응시켜 반응액을 얻는다. 별도로, 테트라에틸 메틸렌디포스페이트 (21.44 g, 74.4 mmol)를 120 ml의 THF에 용해시키고, 얼음 수조 하에서 냉각하고, 얼음 수조의 온도에서 t-BuOK (11.36 g, 101.2 mmol)를 첨가해 10 분간 반응시키고, 실온으로 가온하여 0.5 시간 동안 반응시키고 약 1 시간에 걸쳐 상기 반응액에 첨가하였다. 반응을 얼음 수조의 온도에서 1시간 동안 수행한 다음 실온으로 가온해 18 시간 동안 반응시켰다. 물을 첨가해 반응을 급냉시켰다. 분리된 수성상을 각 200 ml의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 모든 유기상을 혼합히고 200 ml의 포화 염수로 1회 세척된다. 용매를 증발 건조 시키고, 잔류물을 200-300 메쉬 정상 실리카겔 칼럼을 이용해 정제하였다. 이 칼럼은 석유 에테르로 채워지고 구배 용리는 석유 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:1-1:4이다. 용출물을 모아서, 감압하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 진공 오일 펌프로 발포 건조되고 총 14.00 g의 순수 생성물 VP-U-4를 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.64 (dtd, J = 5.1, 4.0, 2.2 Hz, 4H), 7.41 - 7.30 (m, 6H), 6.82 - 6.71 (m, 2H), 5.90 (ddd, J = 25.9, 15.0, 1.0 Hz, 1H), 5.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.36 - 4.21 (m, 3H), 4.18 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 4.05 (ddq, J = 9.7, 8.5, 6.9 Hz, 2H), 3.87 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 3.39 (s, 3H), 1.32 (td, J = 6.9, 0.7 Hz, 6H), 1.05 (s, 8H). MS m/z: C31H42N2O8PSi, [M+H]+, 계산치: 629.24, 측정치: 629.51.
(14-3) VP-U-5의 합성:
VP-U-4 (14.00g, 22.29mmol)를 100ml의 테트라히드로푸란에 용해하고, 트리에틸아민 트리히드로플로라이드(trihydrofluoride) (17.96 g, 111.45 mmol)를 첨가하고, 실온에서 20 시간동안 교반하며 완전히 반응시켰다. 용매를 직접 증발 건조시킨 후 디클로로메탄에 용해시키고 50 ml의 디클로로메탄으로 2회 증발 건조해 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 200-300 메쉬 정상 실리카겔 칼럼으로 정제하였다. 이 칼럼은 석유 에테르로 채워지고 구배 용리는 석유 에테르: 에틸 아세테이트: 디클로로메탄: 메탄올 = 1:1:1:0.05-1:1:1:0.25이다. 용출물을 모아서, 감압하에서 용매가 증발되고, 잔류물은 진공 오일 펌프로 발포 건조되고 총 6.70 g의 순수 생성물 VP-U-5를 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.77 (dd, J = 15.0, 6.2 Hz, 1H), 5.99 - 5.82 (m, 2H), 5.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 5.10 (dd, J = 5.3, 4.7 Hz, 1H), 4.29 (ddq, J = 9.8, 8.6, 7.0 Hz, 2H), 4.17 (ddd, J = 6.2, 5.2, 1.0 Hz, 1H), 4.12 - 3.98 (m, 3H), 3.39 (s, 2H), 1.32 (td, J = 6.9, 0.6 Hz, 6H). MS m/z: C15H24N2O8P, [M+H]+, 계산치: 391.13, 측정치: 391.38.
(14-4) VP-U-6의 합성:
VP-U-5 (391 mg, 1.0 mmol), 피리딘 트리플루오르아세테이트 (0.232 g, 1.2 mmol), N-메틸이미다졸 (0.099 g, 1.2 mmol), 및 2-시아노 에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포로디아미다이트 (0.452 g, 1.5 mmol)를 아르곤 대기하에 10 ml의 무수 디클로로메탄에 첨가하고 5 시간 교반 하에 실온에서 반응시켰다. 용매를 증발 건조시킨 다음, 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다 (200-300 메쉬 정상 실리카겔, 구배 용리는 디클로로메탄: 아세토니트릴 (0.5 중량% 트리에틸아민을 포함한) = 3:1-1:3이다). 용출물을 모아서 농축하여 용매를 제거하고 총 508 mg의 표적 생성물 VP-U-6을 수득하였다. 31P NMR (161 MHz, DMSO-d6) δ 150.34, 150.29, 17.07, 15.50. MS m/z: C24H41N4O9P2, [M+H]+, 계산치: 591.23, 측정치: 591.55. 이것은 VP-U-6가 표적 생성물인 VP-Um임을 나타내고, 이는 뉴클레오시드 단량체로 RNA 가닥의 합성에 관여한다.
5'-포스페이트 에스테르 변성은 다음 방법을 이용해 5’말단에 연결된다:
출발 물질로서, 다음 화학식 CPR-I (Suzhou GenePharma Inc.에서 Cat#13-2601-XX로 구입)의 구조를 갖는 인산화 구조 단량체가 사용된다:
(CPR-I)
역배열 가닥의 모든 뉴클레오시드가 연결되고 난 다음에, 화학식 (CPR-I)의 단량체는 핵산의 고상 포스포르아미다이트 합성 방법에 따라 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화의 4 단계로 역배열 가닥의 5’ 말단에 연결된 다음, 하기 조건에 따라 절단되고 탈보호되어서, 역배열 가닥을 수득한다:
지지체에 연결된 합성 뉴클레오티드 서열을 25 중량% 암모니아 수용액에 첨가하고 16 시간동안 55℃에서 반응시키고, 암모니아 수용액의 양은 뉴클레오티드 서열에 대해서 0.5 ml/μmol이다. 용액을 제거하고, 잔류물을 진공에서 농축 건조하였다. 암모니아 수용액으로 처리한 다음, 0.4 ml/μmol의 양으로 N-메틸피롤리돈 에 생성물을 용해시킨 후, 단일 가닥 핵산의 양에 대해0.3 ml/μmol 트리에틸아민을 및 0.6 ml/μmol 트리에틸아민 트리히드로플로라이드(trihydrofluoride)를 첨가하고, 리보오스에서 2'-TBDMS 보호기를 제거한다. 정제 및 탈염화: 핵산의 정제는 NaCl구배 용리를 가진 조제용 이온 크로마토그래피 칼럼 (Source 15Q) 으로 달성된다. 특히, 용리액 A: 20 mM 인산 나트륨 (pH 8.1), 용매: 물/아세토니트릴 = 9:1 (v/v); 용리액 B: 1.5 M 염화 나트륨, 20 mM 인산 나트륨 (pH 8.1), 용매: 물/아세토니트릴 = 9:1 (v/v); 구배 용리: 용리액 A: 용리액 B의 비 = 100:0-50:50. 용출물을 모아서, 혼합하고 역상 크로마토그래피 칼럼을 이용해 탈염화하였다. Sephadex 칼럼을 포함한 특정 칼럼이 탈염화에 사용되었고, 충전제로는 Sephadex-G25 과 탈 이온화된 물을 용리를 위해 사용하였다.
표적 생성물이 5'-포스포로티오에이트 변성을 가지고 있는 경우에, 연결에서 상기 산화 반응 조건이 황화 반응 조건으로 대체되어 황화 반응을 수행하는 것을 제외하고 상기와 동일한 절차가 사용된다.
상기 합성된 정배열 가닥 및 역배열 가닥의 순도는 이온 교환 크로마토그래피 (IEX-HPLC)에 의해 결정되었고, 분자량은 LC-MS에 의해 분석되었고, 합성된 핵산 서열이 표 16에서 실시예 및 비교예의 각 siRNA와 일치한다는 것이 확인되었다.
제조예 15 표 8 내지 표 14의 나머지 접합체의 제조
이와 달리, 표 8 내지 표 14에서 나머지 접합체는 제조예 13에서와 동일한 방법을 이용해 제조될 것이 예측될 것이다, 다음을 제외하고: 1) 접합체 31-37, 52-58, 68-74, 84-90, 121-127 및 146-152, 비교 접합체 4-5, 7-8 및 10-13에서, L-9 접합 분자는 실시예 2-10 또는 12에서 얻어진 접합 분자 2-8 또는 12 및 비교 접합 분자 1-2로 대체된다 (예를들어, L-9 접합 분자가 P-9 접합 분자 (접합 분자 2)로 대체될 때 P10 접합체로 번호가 매겨진 접합체 31, 52, 68, 84, 121 및 146 이 수득될 것으로 예상된다. L-9 접합 분자가 R-4 접합 분자 (접합 분자 3)로 대체될 때, R5 접합체로 번호가 매겨진 접합체 32, 53, 69, 85, 122 및 147 이 수득될 것으로 예상되는 등이다; 2) 접합된 siRNA는 표 8 내지 표 14에 나타난 접합체 10-15, 19-23, 27-41, 44-61, 63-77, 79-104, 106-108, 110, 112-114, 116-141 및 143-152, 및 비교 접합체 4-5, 7-8 및 10-17에 따른 서열을 가진다; 3) 표적 서열에서 포스포로티오에이트 결합이 두 뉴클레오티드 사이에 존재할 때, 제조예 13에 기재된 황화 반응 단계는 두 뉴클레오티드의 나중의 연결하는 동안 산화 반응 단계를 대체하는데 이용된다; 및 4) 표적 서열의 모든 뉴클레오티드의 2'-위치가 히드록실기로 변성될 때, 리보오스의 2'-TBDMS 보호를 제거하는 단계는 절단 및 탈보호를 위한 조건에 포함되지 않는다. 따라서, 접합체 10-15, 19-23, 27-41, 44-61, 63-77, 79-104, 106-108, 110, 112-114, 116-141 및 143-152, 및 비교 접합체 4-5, 7-8 및 10-17 이 얻어질 수 있다는 것이 예상되고, 접합체는 표8 내지 표 14에 따라 별도로 번호가 매겨졌다. 본원 개시의 접합체는 각각 화학식 (3), (4), (7), (12), (13), (14), (15), (21) 및 (22)로 표현되고, 비교 접합체는 각각 화학식 (901) 및 (902)로 표현된다:
화학식 (901)
화학식 (902)
상기, Nu는 비교 접합체 4-5, 7-8 및 10-13의 siRNA이다.
제조예 16 비교 접합체 6 및 9의 합성
비교 접합체 6 및 9는 상기 단계 (11-3)에서 얻어진 FIN-2를 이용해 합성된다. RNA 고상 합성 및 탈보호의 조건은 전술한 단계 (11-2)에 기재된 핵산의 고상 합성과 동일하다. 유일한 차이점은 FIN_FIN_FIN이 우선 FIN-2의 3회 반응 사이클을 거쳐 RNA의 정배열 가닥의 3’말단에 접합된 후, 범용 고상 지지체(UnyLinker™ loaded NittoPhase®HL Solid Supports)를 사용하여 고상 합성된다.
FIN_FIN_FIN 접합기의 연결은 Rajeev et al., Chem Bio Chem 2015, 16, 903-908에 기재된 방법에 따라 진행된다. 특히, 히드록시 보호기가 우선 상기 언급된 고상 지지체로부터 제거되고, 이어서 고상 지지체가 커플링 조건과 커플링제 하에서 FIN-2 접합 분자와 접촉하고 커플링하고, 캡핑 및 산화 반응 후에 고상 지지체와 연결된 FIN 접합 분자를 얻는다. 또한, 고상 지지체에 연결된 FIN 접합 분자로부터 히드록시 보호기 DMTr가 제거되고, 고상 지지체가 추가로 다른 FIN-2 접합 분자와 접촉하고 커플링한 후, 캡핑 및 산화 반응한다. 탈보호-커플링-캡핑-산화의 또 다른 주기 후에, 세 번째 FIN-2 접합 분자가 연결되고, 고상 지지체에 연결된 접합기(FIN_FIN_FIN)가 얻어졌다. 그 다음에, 고상 지지체에 연결된 접합기에서 시작으로, 뉴클레오티드 단량체를 연속적으로 연결하고, 3' 말단에 접합된 접합기 (FIN_FIN_FIN)를 갖는 RNA 정배열 가닥을 최종적으로 수득하였다
상기 반응에서, 탈보호, 커플링, 캡핑, 및 산화의 조건, 용매 및 작용제는 단계 (11-2)에 기재된 RNA 고상 합성에 따른다.
이어서, 절단 및 탈보호, 정제 및 탈염, 검출, 및 어닐링은 제조예 12 와 동일한 방법에 의해 수행되었고 결과적으로 비교 접합체 6 및 9 (때로 단순히 FIN 접합체로도 지칭)를 수득하였다. 분자량은 LC-MS (Waters Corp. 에서 구매, 모델: LCT Premier)로 측정되었다. 측정값이 이론값과 일치하기 때문에, 합성된 FIN-siHBa1M1SP 접합체가 표적 설계된 화합물임을 확인하였다. 그 구조는 화학식 (903)으로 표현된다:
화학식 (903)
상기, Nu는 대조 접합체 6 또는 9에서 siRNA이다.
상기 접합체의 제조 후, 이들은 표준 공정을 통해 고체 가루 형태로 동결 건조되고 사용될 때까지 저장되었다. 필요한 경우, 이들은 주사용수(water for injection) 또는 생리 식염수 등으로 원하는 농도의 용액이 될 수 있다.
실험예 1 - 이 실험예는 본원에 개시된 siRNA 접합체의 독성을 설명한다
C57BL/6J 쥐에서, 접합체 24를 각 생쥐에 각각 1회 용량 100 mg/kg 또는 200 mg/kg (siRNA에 의해, 0.9 중량% NaCl 수용액.의 형태로, 10 mL/kg이 각 10 mg/mL 또는 20 mg/mL 농도에서 투여되었다)으로 피하 투여하였다. 지속적인 관찰을 위한 투여 기간 동안, 동물 사망이 발생하지 않았고, 약물 부작용과 관련된 임상 증상이 관찰되지 않았고, 투여 후 24시간 내에 모두 진행된 임상 병리 시험 또는 육안 해부학에서 이상이 발견되지 않았다. 따라서, 상기 결과는 동물 수준에서 본원 개시의 접합체의 상대적으로 낮은 독성을 나타낸다.
실험예 2 이 실험예는 본원 개시의 접합체의 안정성을 보여준다
실험예 2-1 시험관 내(in vitro) 리소좀 용해물의 안정성.
접합체 24, 25, 42, 43, 62, 78, 및 비교 서열 1 (각 siRNA에 관해 20 μM에서 0.9 중량% NaCl 수용액 형태로 제공됨, 각 그룹에 대해 12μl)은 27.2 μL의 시트르산 나트륨 수용액(pH 5.0)과, 4.08 μL의 탈이온 수 및 2.72 μL의 래트 트리토좀(Xenotech Inc. 에서 구매, Cat. R0610LT, No. 1610069, 0.2 mU/μL의 최종 농도에서)과 개별적으로 잘 혼합되고, 37℃의 항온에서 배양되었다. 각각 0 시간, 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 및 8 시간 각 시점에서 5 μL 샘플을 채취하고, 변성을 위해 15 μL 의 9 M 우레아 수용액을 각 첨가하고, 4 μL의 로딩 버퍼(Solarbio Inc.에서 구매, Cat. 20160830)를 첨가한 다음, 반응을 급냉시키기 위해 즉시 -80℃ 냉동고에서 냉동보존하였다. 0시간은 샘플이 리소좀 용해물과 잘 혼합되고 즉시 채취된 때를 나타낸다. 리소좀 용해물로 처리되지 않은 샘플의 경우, 각 상기 접합체의 1.5 μL는 등 몰(20 μM)에서 7.5 μL의 시트르산 나트륨 수용액 (pH 5.0) 및 1 μL의 탈이온수와 잘 혼합되고, 변성을 위해 각 15 μL의 9 M 우레아 수용액이 첨가되고, 4 μL의 로딩 버퍼(Solarbio Inc.에서 구매, Cat. 20160830)가 첨가된 후, 반응을 급냉시키기 위해 즉시 -80℃ 냉동고에서 냉동보존하였다. 각 접합체에 대한 대조 샘플은 전기 영동에서 Con으로 표시된다. 16 중량% 의 비-변성 폴리아크릴아마이드 겔을 제조하였다. 각 냉동보존된 샘플을 4 μL의 로딩 버퍼(Solarbio Inc. 에서 구매, 20 mM EDTA의 수성 용액, 36 중량% 글리세롤, 및 0.06 중량% 브로모페놀 블루)와 모두 혼합한 후 20 μL의 혼합물을 겔에 로드하고 20 mA 하에서 10분 동안, 이어서 30분 동안 40 mA하에서 전기영동을 수행하였다. 전기영동을 완료한 후, 겔을 젤러드 염료(Gelred dye)(BioTium, Cat. 13G1203)로 10분 동안 염색한 후 영상화 하였다. 결과는 도 1a에 나타난다. 비교 서열 1은 다음과 같다: 정배열: 5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3’(서열 번호: 250); 역배열 가닥: 5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’(서열 번호: 251).
동일한 방법에 따라, 6 시간 동안 접합체 105, 109, 111 및 115의 안정성이 측정되고, 결과는 도 1b에 나타난다.
도 1a 및 1B는 시험관에서 트리토좀에서 siRNA 접합체의 안정성 시험의 반 정량적인 결과를 보여준다. 이는 본원 개시의 접합체가 트리토좀에서 장시간 분해되지 않고 유지될 수 있으며, 우수한 안정성을 보여주는 것이 입증되었다.
실험예 2-2 시험관 내 인간 혈장에서의 안정성.
접합체 24, 25, 42, 43, 62, 78, 및 비교 서열 1 (siRNA에 관해서 20 μM에서 0.9 중량% NaCl 수용액 형태로 각 제공됨, 각 그룹에 대해 12 μl)는 108 μL의 90% 인간 혈장 (PBS로 희석된)과 개별적으로 잘 혼합되고 37℃의 항온에서 배양되었다. 각각 0 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 48 시간 및 72 시간 각 시점에서 10 μL 샘플을 채취하고, 액체 질소에 즉시 냉동시키고 -80℃ 냉동고에서 냉동보존하고 사용하였다. 한편, 각각의 상기 접합체는 등몰(2 μM, 2μL)에서 8 μL의 1x PBS와 잘 혼합되고, 그래서 인간 혈장으로 처리하지 않은 10 μL의 샘플(Con으로 표시)을 얻었다. 20 중량%의 비-변성 폴리아크릴아마이드 겔을 제조하였다. 각 냉동보존된 샘플을 4 μL의 로딩 버퍼(20 mM EDTA의 수성 용액, 36 중량% 글리세롤, 및 0.06 중량% 브로모페놀 블루)과 모두 혼합한 후 혼합물을 겔에 로드하고 60 분 동안 80 mA 정전류하에서 전기영동을 수행하였다. 전기영동을 완료한 후, 겔을 1x Sybr Gold 염료 (Invitrogen, Cat. 11494)로 15분 동안 염색한 후 영상화 하였다. 결과는 도 2a에 나타난다. 비교 서열 1은 다음과 같다: 정배열: 5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3’ (서열 번호: 250); 역배열 가닥: 5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’ (서열 번호: 251).
동일한 방법에 따라, 72 시간 동안 접합체 105, 109, 111 및 115의 안정성이 측정되고, 결과는 도 2b에 나타난다.
도 2a 및 2b는 시험관 내 인간 혈장에서 시험 된 siRNA 접합체의 안정성 시험의 반 정량적인 결과를 보여준다. 이는 본원 개시의 접합체가 인간 혈장에서 72시간 까지 분해되지 않고 유지될 수 있으며, 인간 혈장에서 우수한 안정성을 보여주는 것이 입증되었다.
실험예 2-3 시험관 내 원숭이 혈장에서의 안정성
접합체 24, 25, 42, 43, 62, 78, 및 비교 서열 2 (각 siRNA에 관해 20 μM에서 0.9 중량% NaCl 수용액 형태로 제공됨, 각 그룹에 대해 12 μl, 상기 비교 서열 2는 서열 번호: 80으로 표현되는 서열을 갖는 정배열 가닥 및 서열 번호: 81으로 표현되는 서열을 갖는 역배열 가닥을 갖는 siRNA이다, 임의의 접합 분자에 접합하지 않는다)를 108 μL의 90% 시노몰구스 원숭이 혈장 (원숭이 혈장, HONGQUAN Bio에서 구입, Cat. HQ70082, PBS로 희석)에 각각 잘 혼합하고 37℃의 항온에서 배양하였다. 0 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 48 시간 및 72 시간 각 시점에서 10 μL 샘플을 채취하고, 액체 질소에 즉시 냉동시키고 -80℃ 냉동고에서 냉동보존하였다. 각 시점에서 샘플링한 다음, 각 샘플을 1×PBS (pH 7.4)으로 5-배 희석하고 사용을 위해 10 μL의 부피로 채취하였다. 한편, 등몰 (2 μM, 2μL)의 각 상기 접합체를 8 μL의 1x PBS와 잘 혼합하고, 원숭이 혈장으로 처리하지 않은 10 μL 의 샘플(Con으로 표시)을 얻는다. 20 중량%의 비-변성 폴리아크릴아마이드 겔을 준비하였다. 각 희석된 샘플은 4 μL의 로딩 버퍼(20 mM EDTA 수성 용액, 36 중량% 글리세롤, 및 0.06 중량% 브로모페놀 블루) 와 모두 혼합된 후 겔에 로드되고, 그 다음 60 분 동안 80 mA 정전류 하에서 전기영동을 수행하였다. 전기영동을 완료한 후, 겔을 1x Sybr Gold 염료 (Invitrogen, Cat. 11494)로 15분 동안 염색한 후 영상화 하였다. 결과는 도 3a에 나타난다.
72 시간 동안 접합체 105, 109, 111 및 115의 안정성이 동일한 방법에 따라 측정되고, 결과는 도 3b에 나타난다.
도 3a 및 3b는 시험관 내 원숭이 혈장에서 시험된 siRNA 접합체의 안정성 시험의 반 정량적인 결과를 보여준다. 이는 본원 개시의 접합체가 시노몰구스 원숭이 혈장에서 72시간 까지 분해되지 않고 유지될 수 있으며, 원숭이 혈장에서 우수한 안정성을 보여주는 것이 입증되었다.
실험예 3 이 실험은 래트의 생체 내에서 접합체 24 및 25의 약물 동력학을 보여준다.
이 실험예에서, 접합체 24 및 25는 각 실험군(각 군에 10마리의 래트, 반은 암컷이고 반은 수컷)의 래트에 각각 10 mg/kg 및 50 mg/kg의 단일 용량으로 피하 주사로 투여되었다. 이어서, 래트의 혈장, 간, 및 신장 조직에서의 약물 농도가 각 시점에서 측정되었다.
먼저, PRISTIMA 7.2.0 데이터 시스템을 이용해 체중 및 성별에 따라 SD 래트를 무작위 군으로 나눈 후, 설계된 용량에 따라 접합체를 각각 투여하였다. 모든 동물의 약물 투여량은 체중에 따라 계산되었다. 단일 용량을 각 1mg/ml 및 5 mg/ml의 0.9% NaCl 수용액을 10 ml/kg의 부피 형태로 각각 10 mg/kg 및 50 mg/kg의 용량으로 피하 투여하였다. 래트 전혈을 투여 전 및 투여 후 5 분 (±30 초), 30 분 (±1 분), 1 시간 (±2 분), 2 시간 (±2 분), 6 시간 (±5 분), 24 시간 (±10 분), 48 시간 (±20 분), 72 시간 (±20 분), 120 시간 (±30 분), 및 168 시간 (±30 분)에서 경정맥으로부터 모았다. 그 다음에 전혈 샘플을 2-8℃에서 1800 x g 하 10 분동안 혈장을 분리하기 위해 원심분리하였다. 약 70 μL 부피의 혈장 샘플을 1개의 튜브에 넣고, 동일 샘플의 나머지를 다른 튜브에 넣었고, 둘 다 검사를 위해 -70℃ 내지 -86℃에서 동결 보존하였다. 체중에 따라(60 mg/kg 복강 내 주사) 래트를 펜토바르비탈 나트륨으로 마취시키고, 복부 대동맥에서 혈액을 수집해 래트를 안락사 시키고, 육안 해부학을 수행하는 것을 포함하는 방법으로 래트의 간과 신장 조직을 투여 후 약 24, 48, 72, 120, 및 168 시간에 모았다. 각 래트의 간 및 신장을 샘플링하고 측정 및 분석할 때까지 -68℃ 이하에서 1 mL 냉동관에 저장하였다.
다음 단계에 따라 형광 검출 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC-FLD)로 래트의 혈장, 간 및 신장 조직에서 접합체 24 및 25의 접합체 농도를 정량적으로 측정하였다:
(1) 조직 질량이 80 mg이하로 얻어질 때까지 조직을 간 후, 조직 및 세포 용해액(공급자: Epicentre, Cat. MTC096H)를 첨가해 66.7 mg/mL의 조직 균질액을 제조하는 단계;
(2) 조직 균질액을 초음파 분해 (150 W, 30 s) 하여 세포를 파괴하는 단계;
(3) 각 조직 샘플의 그룹 당, 75 μL의 조직 샘플을 96-웰(well) PCR 플레이트에 첨가하고, 10 중량% 아세토니트릴 및 0.01 중량% 트윈(Tween) 20의 10 μL혼합 수용액과 5 μL의 프로테이나제 K (공급자: Invitrogen, Cat. 25530-015)을 첨가하는 단계;
각 혈장 샘플 그룹 당, 20 μL의 혈장을 96-웰(well) PCR 플레이트에 첨가하고, 10 중량% 아세토니트릴 및 0.01 중량% 트윈(Tween) 20의 20 μL 혼합용액과 45 μL의 조직 및 세포 용해액, 5 μL 의 프로테이나제 K를 첨가하는 단계;
(4) 플레이트를 닫고 플레이트를 PCR 기구(공급자: Applied Biosystems, 모델: GeneAmp® PCR system 9700)에 넣고 65°C에서 45 분동안 배양하는 단계;
(5) 배양을 마친 후에, 10 μl 의 3 M KCl 수용액 (공급자: Sigma-aldrich, Cat. 60135-250ML)을 첨가하고, 잘 흔들고, 3200 rcf에서 4℃에서 15분 동안 원심 분리하는 단계;
(6) 각 조직 샘플의 그룹 당, 80 μL의 상청액을 120 μL의 혼성화 혼합물(화학식: 0.5 ml의 6 μM PNA 프로브 (공급자: TAHE-PNA), 1 ml의 200 mM 트리즈마(Trizma)/pH = 8, 5 ml의 8 M 우레아 수용액, 3.5 ml의 H2O, 2 ml의 아세토니트릴)에 첨가하는 단계;
각 혈장 샘플 그룹 당, 160 μL의 혼성화 혼합물 (화학식: 0.5 ml의 6 μM PNA 프로브(probe), 1 ml의 200 mM 트리즈마(Trizma)/pH = 8, 5 ml의 8 M 우레아 수용액, 7.5 ml의 H2O, 2 ml의 아세토니트릴)에 40 μL의 상청액을 첨가하고 단계;
(7) 플레이트를 닫고 플레이트를 PCR 기구에 넣고, 95℃에서 15분 동안 배양한 후, 즉시 5분 동안 얼음에 넣어 두는 단계;
(8) 원뿔형 바닥의 새로운 96-웰(well) 플레이트에 샘플을 옮기고, 잘 흔들고, 3200 rcf에서 1분 동안 원심 분리하는 단계;
(9) HPLC-FLD (액상 시스템 공급자: Thermo Fisher, 크로마토그래피 모델: ultimate 3000)을 사용한 측정 및 정량적인 분석을 위해 샘플을 주입하는 단계이다.
분석 결과는 도 4 내지 11에서 찾을 수 있다. 도 4 내지 7는 접합체 24의 각각 래트 혈장에서 PK/TK 혈장 농도 및 래트의 간 및 신장에서 PK/TK 조직 농도의 시간 경과에 따른 물질대사 프로파일을 나타내고; 도 8 내지 11는 접합체 25의 각각 래트 혈장에서 PK/TK 혈장 농도 및 래트의 간 및 신장에서 PK/TK 조직 농도의 시간 경과에 따른 물질대사 프로파일을 나타낸다. 구체적으로,
도 4는 접합체 24를 래트의 혈장에 10 mg/kg 용량 투여시 PK/TK 혈장 농도를 나타내는 시간에 따른 물질대사 프로파일이다.
도 5는 접합체 24를 래트의 간과 신장에 10 mg/kg 용량 투여시 PK/TK 조직 농도 나타내는 시간에 따른 물질대사 프로파일이다.
도 6 는 접합체 24를 래트의 혈장에 50 mg/kg 용량 투여시 PK/TK 혈장 농도를 나타내는 시간에 따른 물질대사 프로파일이다.
도 7는 접합체 24를 래트의 간과 신장에 50 mg/kg 용량 투여시 PK/TK 조직 농도 나타내는 시간에 따른 물질대사 프로파일이다.
도 8는 접합체 25를 래트의 혈장에 10 mg/kg 용량 투여 PK/TK 혈장 농도를 나타내는 시간에 따른 물질대사 프로파일이다.
도 9는 접합체 25를 래트의 간과 신장에 10 mg/kg 용량 투여시 PK/TK 조직 농도 나타내는 시간에 따른 물질대사 프로파일이다.
도 10는 접합체 25를 쥐의 혈장에 50 mg/kg 용량 투여시 PK/TK 혈장 농도를 나타내는 시간에 따른 물질대사 프로파일이다.
도 11는 접합체 25를 래트의 간과 신장에 50 mg/kg 용량 투여시 PK/TK 조직 농도 나타내는 시간에 따른 물질대사 프로파일이다.
도 4 내지 11의 결과에서 알 수 있듯이, 저 용량 (10 mg/kg)에서 또는 상대적으로 고 용량 (50 mg/kg)에서 모두, 래트 혈장에서 접합체 24 및 25 의 농도는 몇 시간내에 검출 한계 미만으로 빠르게 감소하는 반면, 래트의 간 조직에서 상대적으로 안정적인 수준의 농도는 168 시간동안 유지된다. L-9 접합 분자를 접합해 수득한 siRNA 접합체가 구체적이고 실질적으로 간에서 강화되고 안정하게 남아있고, 높은 수준의 표적화를 나타내는 것을 알 수 있다.
실험예 4 이 실험은 C57BL/6J 쥐에서 상이한 접합 분자에 의해 형성되는 접합체에 의해 발생하는 표적 mRNA에 대한 억제 효과를 입증한다.
우선, C57BL/6J 쥐 (모두 암컷)를 무작위의 군으로 나눴다. 실험군은 접합체 158 (5마리 쥐), 비교 접합체 14 (5마리 쥐), 및 PBS 대조군 (8마리 쥐)으로 각각 번호 매겨졌다. 모든 동물은 체중에 따라 투여되고, 1 mg/kg 또는 0.1 mg/kg의 상이한 단일 용량에서 피하 투여되었다. 투여 부피는 5 ml/kg이다. 상이한 투여량에 대해, 접합체는 0.2 mg/mL 및 0.02 mg/mL의 농도로 0.9% 염화 나트륨 수용액에 용해된다. 동물을 투여 72 시간 후 희생시키고, 간을 수집하였다; 간 조직을 조직 균질화기로 균질화하고, 총 RNA 추출 표준 절차에 따라 총 RNA를 RNAVzol (VIGOROUS, lot: 161G)로 추출하였다.
간 조직에서 TTR mRNA의 발현 수준은 실시간 형광-기반 정량적 PCR에 의해 검출되었다. 구체적으로, 추출된 총 RNA는 설명서에 따라 역전사 시스템 (Promega, Lot#0000223677, REF: A3500)을 사용해 cDNA로 역전사되었다. 이어서 정량적 형광 PCR 기구 (ABI 단계 1)는 간 조직에서 mTTR mRNA 발현에 대한 siRNA 억제 효율을 검출하는데 사용되었다. 이 검출법에서, GAPDH 유전자를 내부 참조 유전자로 사용했고, 각각 TTR용 프라이머 및 GAPDH용 프라이머를 사용해 mTTR 및 GAPDH 발현을 검출하였다.
검출 프라이머의 서열은 표 15에 나타난다.
유전자 업스트림 프라이머 다운스트림 프라이머
mTTR 5'- CCGTCTGTGCCTTCTCATCT -3'
（서열 번호: 187）		 5'- TAATCTCCTCCCCCAACTCC -3'
（서열 번호: 188）
GAPDH 5'- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG- 3'
（서열 번호: 189）		 5'- AGGGGCCATCCACAGTCTTC -3'
（서열 번호: 190）
실시간 PCR 방법에서, mTTR mRNA의 발현은 TTR 유전자 발현의 잔여량의 백분율로 표현되고, 다음과 같이 계산된다:
TTR 유전자 발현의 잔여량 = (실험군에서 TTR 유전자의 복제 수 / 실험군에서 GAPDH의 복제 수) / (대조군에서 TTR 유전자의 복제 수 / 대조군에서 GAPDH의 복제 수) × 100%
접합체의 mRNA 억제율은 다음 식에 따라 계산된다:
mRNA 억제율 = (1- TTR 유전자 발현의 잔여량) × 100%,
상기, 대조군은 실험에서 PBS가 투여된 쥐고, 각 실험군은 상이한 siRNA 접합체를 투여한 쥐 군이다. 결과는 표 16에 나타난다.
siRNA 접합체 샘플 일련 번호 mRNA 억제율 (%)
1mg/kg 0.1mg/kg
접합체158 L10-simTTR 94 51
비교 접합체 14 K4--simTTR 74 18
이 결과는 동일한 siRNA 서열 및 변성을 가지더라도 접합체 158의 표적 mRNA 억제율이 비교 접합체 14의 억제율보다 현저하게 높다는 것을 입증한다.
다음 실험예 5 내지 실험예 11에서, 표 8 내지 표 13의 siRNA 접합체의 특성 및 효과는 표적 위치 및 서열 상관 관계에 따라 실험적으로 검증되었다.
실험예 5 - 표8에서 siRNA 접합체의 효과 검증을 위한 실험
실험예 5-1 - 접합체 26 표적 외 효과를 검증하기 위한 실험
Kumico Ui-Tei et. al.에 기재된 방법에 따라, 체계적인(systematic) DNA 치환에 의한 siRNA 서열의 기능적 정밀 분석: DNA 씨드 암(seed arm)을 포함한 변성 siRNA는 표적 외 효과를 실질적으로 감소시키며 포유 동물 유전자 침묵에 강력한 도구이다. Nucleic Acids Research, 2008.36(7), 2136-2151, 검출용 플라스미드는 구성되고 HEK293A 세포에서 검출되는siRNA 접합체와 공동 형질주입되고; 이중 루시페라아제 정보 제공 유전자의 발현 수준은 이중 루시페라아제 정보 제공 검출 키트를 사용해 측정된다. 구체적인 단계는 다음과 같다:
검출을 위한 플라스미드 구성
4개의 재조합 플라스미드를 psiCHECKTM-2 (PromegaTM) 플라스미드를 사용해 구성했고, 상기 GSCM는 표적 내 플라스미드로 표현되고 PSCM, GSSM, 및 PSSM는 표적 외 플라스미드로 표현된다:
(1) 표적 서열을 포함하는 GSCM, 표적 서열은 검출될 접합체에서 역배열 가닥의 모든 21개의 뉴클레오티드 서열과 완전히 상보적으로 쌍을 이룬다.
(2) 표적 서열을 포함하는 PSCM, 표적 서열은 검출될 접합체에서 정배열 가닥의 모든 21개의 뉴클레오티드 서열과 완전히 상보적으로 쌍을 이룬다.
(3) 표적 서열을 포함하는 GSSM, 표적 서열은 검출될 접합체에서 역배열 가닥의 5’말단에서부터 1-8 위치의 뉴클레오티드 서열과 완전히 상보적으로 쌍을 이룬다. 검출을 위해 접합체에서 역배열 가닥의 5’말단에서부터 9-21 위치의 뉴클레오티드 서열은 상응하는 표적 서열과 상보적으로 불일치 된다. 불일치 규칙은: 검출될 접합체에서 역배열 가닥의 5’말단에서부터 9부터 21사이의 임의의 위치의 뉴클레오티드 G, C, A 또는 U는 각각 표적 서열의 상응하는 위치의 뉴클레오티드 T, A, C 또는 G와 불일치된다.
(4) 표적 서열을 포함하는 PSSM, 표적 서열은 검출될 접합체에서 정배열 가닥의 5’말단에서부터 1-8 위치의 뉴클레오티드 서열과 완전히 상보적으로 쌍을 이룬다. 검출을 위해 접합체에서 정배열 가닥의 5’말단에서부터 9-21 위치의 뉴클레오티드 서열은 상응하는 표적 서열과 상보적으로 불일치 된다. 불일치 규칙은: 검출될 접합체에서 정배열 가닥의 5’말단에서부터 9부터 21사이의 임의의 위치의 뉴클레오티드 G, C, A 또는 U는 각각 표적 서열의 상응하는 위치의 뉴클레오티드 T, A, C 또는 G와 불일치된다.
표적 서열은 psiCHECKTM-2 플라스미드의 Xho I/Not I 위치에 삽입되었다.
형질주입(Transinfection)
96-웰 플레이트에서, LipofectamineTM 2000 (Invitrogen)의 설명에 따라 siRNA 및 각 상기 플라스미드를 공동-형질주입하였다. 각 플라스미드는 각각 특정 농도에서 상응하는 siRNA의 11개의 군을 가진다. 구체적으로, 10 ng의 플라스미드를 웰(well) 당 형질주입시켰고; 웰(well) 당 공동 형질주입된 siRNA의 최종 농도는 웰(well) 당 0.2 μL의 LipofectamineTM 2000를 사용해 100 nM 내지 0.0001 nM (4-배 연속 희석)이었고, 그룹 당 3개의 복제 웰(replicate wells)이 있었다.
검출
공동 형질주입 24 시간 후, 이중 루시페라아제 정보 제공 유전자의 발현 수준을 검출하기 위해 사용 설명서에 따라 이중 루시페라아제 정보 제공 유전자 분석 키트 (Promega, cat. E2940)를 이용해 HEK293A 세포를 용해하였다. 각 특정 농도의 시험군에 대해, 접합체로 처리되지 않은 것을 대조군(con)으로 사용하였다. 레닐라(Renilla) 루시페라아제 단백질 수준 (Ren)은 반딧불이 루시페라아제 단백질 수준(Fir)으로 정규화되었다. 용량-반응 곡선은 상이한 siRNA 농도에서 측정된 활성 결과로 도표 그려지고, 이 곡선은 하기 공식을 가지며 Graphpad 5.0 소프트웨어의 기능 로그 (억제제) 대. 반응-가변 기울기를 사용하여 모델링되었다:
상기
Y는 잔류 mRNA의 발현 수준이며,
X는 형질주입된 siRNA의 농도의 로그이고,
Bot는 점근선 하단의 Y값이고,
Top 는 점근선 상단의 Y값이고,
LogIC50는 Y가 점근선의 하단과 상단 사이의 중앙값일 때 X 값이고, HillSlope는 곡선의 기울이이다.
GSCM에 따라 검출되는 접합체의 IC50 는 용량-반응 곡선에 기초한 계산을 통해 결정된 후, PSCM, GSSM 또는 PSSM과 비교되었다.
접합체 24에 대해, 결과는 도면 12A-12D에 나타나고 GSCM에 상응하는 접합체 24의 IC50 값은 0.0019 nM로 계산되었다; PSCM, GSSM 또는 PSSM와 비교하여, 접합체 24는 각 siRNA 농도에서 유의한 억제 효과를 보이지 않았고, 본원에 개시된 siRNA 접합체가 실험관에서 상대적으로 높은 활성 및 낮은 표적 외 표과를 가짐을 나타낸다.
실험예 5-2 - 이 실험은 생체 내에서 HBV mRNA의 발현에서 표8의 siRNA 접합체의 억제 효율을 보여준다..
이 실험예에서, HBV 유전자 이식 쥐 C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J 의 HBV mRNA 발현에서 접합체 16 및 24의 억제 효율은 조사되었다.
우선, C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J 쥐를 혈청에서 HBsAg 함량을 기준으로 무작위의 군(모두 암컷, 각 군에 4 마리 쥐)으로 나누고 각각 접합체 16 및 접합체 24으로 번호 매기고, 대조군으로 생리 식염수 (NS) 군을 추가하였다. 모든 동물의 약물 투여량은 체중에 따라 계산되었다. 각각 0.9 중량% NaCl 수용액 중 접합체 농도 0.2 mg/ml 및 0.02 mg/ml 를 5 ml/kg의 투여량 부피로 1 mg/kg의 용량의 단일 용량을 피하 투여하였다. 동물을 투여 후 14일에 희생시켰다. 간을 수집하고 RNA 레이터(RNA later) (Sigma Aldrich)로 보관하고, 간 조직을 조직 균질화기로 균질화하였다. 그 다음에 총 RNA를 추출하고 총 RNA 추출 표준 절차에 따라 트리졸(Trizol)을 사용해 수득하였다.
간 조직에서 HBV mRNA 의 발현수준은 실시간 형광 qPCR 로 측정된다. 구체적으로, 추출된 총 RNA는 지시에 따라 ImProm-II™ 역 전사 키트 (Promega)를 사용해 cDNA로 역전사된 후, 간 조직에서 HBV mRNA 의 발현에 대한 siRNA 억제 효율을 형광 qPCR 키트(Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd)를 사용해 측정하였다. 이러한 형광 qPCR 방법에서, β-액틴 유전자를 내부 조절 유전자로 사용하고, HBV 및 β-액틴을 각각 HBV 및 β-액틴 용 프라이머를 사용해 검출하였다.
검출을 위한 프라이머의 서열은 표 17에 나타난다.
유전자 업스트림 프라이머 다운스트림 프라이머
HBV 5'- CCGTCTGTGCCTTCTCATCT -3'
（서열 번호: 187）		 5'- TAATCTCCTCCCCCAACTCC -3'
（서열 번호: 188）
β-액틴 5'- AGCTTCTTTGCAGCTCCTTCGTTG -3'
（서열 번호: 191）		 5'- TTCTGACCCATTCCCACCATCACA-3'
（서열 번호: 192）
이러한 형광 qPCR 방법에서, HBV mRNA의 발현은 HBV 유전자 발현 잔여량으로 표현되고 다음 수식에 따라 계산된다:
HBV 유전자 발현 잔여량 = (실험군에서 HBV 유전자의 복제 수 /실험군에서 β- 액틴 유전자의 복제수)/(대조군에서 HBV 유전자의 복제수 / 대조군에서 β-액틴 유전자의 복제수) × 100%, 이는 HBV X / β-액틴 mRNA 발현으로 표시된다.
이어서, 접합체의 mRNA에 대한 억제율은 다음 수식에 따라 계산된다:
mRNA에 대한 억제율 = (1- HBV 유전자 발현 잔여량) × 100%,
상기, 대조군은 본 실험에서 NS를 투여한 대조 쥐 군이고 각 실험군은 각각 상이한 siRNA 접합체를 투여한 쥐 군이다. 결과는 도 13에 나타난다.
다른 실험에서, 하기 프로토콜에 따라 2개의 실험이 추가 진행되었다: 시험을 위해 투여된 접합된 siRNA가 접합체 17, 25, 159 및 160로 대체되고, 데이터가 7일에 수집되는 것을 제외하고, 상기와 동일한 방법이 사용된다; 및 시험을 위해 투여된 접합된 siRNA가 접합체 24, 161, 162 및 163로 대체되고, 데이터가 28일에 수집되고, 각 접합체가 1 mg/kg 및 0.3 mg/kg (상기 투여량 부피는 동일하게 유지되는 반면, 접합체 용액의 농도가 각각 조정된다)의 용량으로 투여되는 것을 제외하고, 상기와 동일한 방법이 사용된다. 결과는 각각 도 14 및 15에 나타난다.
상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 상이한 시험 시점을 갖는 여러 실험에서, 본원에 개시된 상기 모든 접합체는 생체 내 쥐에서 HBV mRNA발현에 높은 억제 활성을 나타낸다.
실험예 5-3 - 이 실험은 HBV 유전자 이식 쥐 혈청에서 HBsAg 및 HBV DNA의 발현에서 표 8의 상이한 접합 분자를 가진 siRNA 접합체의 억제율을 설명한다.
실험예 4의 방법에 따르면, 44Bri HBV 쥐에서, 표 17의 검출 서열을 프라이머로 이용해 접합체 25, 164, 165 및 166의 표적 mRNA억제 효율을 측정하였다. 결과는 표 18에 각각 나타난다.
siRNA 접합체 번호. mRNA 억제 효율 (%)
1mg/kg 0.1mg/kg
접합체 25 L10- siHBa1M2SP 91 40
접합체 164 P10- siHBa1M2SP 92 65
접합체 165 W8- siHBa1M2SP 96 74
접합체 166 Z5- siHBa1M2SP 96 78
표 18에서 알 수 있듯이, 본원에 개시된 다양한 접합 분자로부터 형성되는 siRNA 접합체는 생체 내 쥐의 표적 mRNA에 대해 우수한 억제 효율을 나타낸다.
실험예 5-4 - 이 실험은 HBV 유전자 이식 쥐 혈청에서 HBsAg 및 HBV DNA에 대한 표 8의 접합 분자를 가진 siRNA 접합체의 억제 효율의 시간에 따른 시험을 보여준다.
AAV-HBV 마우스 모델이 사용되었다. 동물 모델을 성공적으로 확립한 후, 이 쥐를 혈청에서 HBsAg 함량에 따라(각 군에 5마리 쥐) 무작위의 군으로 나눴다. 접합체 24、25 및 비교 접합체 15는 각각 각 군에 투여되고, NS가 빈(blank) 대조군으로 사용되었다. 모든 동물의 약물 투여량은 체중에 따라 계산되었다. 0.9 중량% NaCl 수용액에서 0.6 mg/ml 및 5 ml/kg의 부피로 3 mg/kg의 용량의 단일 용량을 피하 투여하였다. 투여 전 및 투여 후 7, 14, 21, 28, 56, 84, 112, 140, 154, 168 및 182일에 마우스의 눈부위 정맥얼기로부터 혈액을 채취하고, 혈청에서 HBsAg 수준을 각 시점에서 측정 하였다. 실험하는 동안, 시험 결과에서 혈청 내 HBsAg 함량이 원래 값에 근접하거나 초과될 때 대상체에 대한 시험이 종료되었다.
눈확(orbit)에서 채취한 혈액은 매번 약 100 μl이었고, 혈청은 원심 분리 후 20 μl 이상이었다. 혈청에서 HBsAg의 발현 수준은 HBsAg CLIA 키트 (Autobio, CL0310)를 사용해 측정된다. HBV DNA의 발현 수준은 QIAamp 96 DNA Blood Kit의 지시를 참조하여 혈청에서 DNA를 추출한 후 qPCR 을 통해 측정되었다.
정규화된 HBsAg 발현 = (투여 후 HBsAg의 함량 /투여 전 HBsAg의 함량) × 100%.
HBsAg에 대한 억제율 = (1 - 투여 후 HBsAg의 함량/투여 전 HBsAg의 함량) × 100%,
상기 HBsAg의 함량은 혈청의 밀리미터(ml) 당 HBsAg의 당량(UI)으로 표현된다.
정규화된 HBV DNA 발현 = (투여 후 HBV DNA의 함량/투여 전 HBV DNA의 함량) × 100%.
HBV DNA에 대한 억제율 = (1 - 투여 후 HBV DNA의 함량/투여 전 HBV DNA의 함량) × 100%,
상기 HBV DNA의 함량은 혈청의 밀리미터(ml) 당 HBV DNA의 복제수(copies)로 표현된다.
결과는 도 16 및 17에 나타난다. 도 16의 결과에서 알 수 있듯이, NS 음성 대조군은 투여 후 상이한 시점에서 억제 효과를 나타내지 않는다; 대조적으로, 모든 접합체 24 및 25는 투여 후 상이한 시점에서 HBsAg에 대한 우수한 억제 효과를 나타낸다. 특히, 3mg/kg 용량에서 접합체 24는 혈청에서 HBsAg에 대해 140 일까지 지속적으로 높은 억제율을 나타내고, 이는 장기간에 걸쳐 안정적이고 효율적으로 HBV 유전자의 발현을 억제할 수있다는 것을 나타낸다.
도 17의 결과에서 알 수 있듯이, 각 실시예의 siRNA 접합체는 또한 HBV DNA의 발현에 대해 효과적인 억제를 나타내고 84일 까지의 기간 동안 상대적으로 높은 억제율을 유지한다.
대조적으로, 비록 비교 접합체 15가 첫 28일에서 각 실시예와 근사치의 mRNA 억제 효과를 달성하지만, 그 후에 억제 효과는 현저하게 감소되었으므로, 도 16 및 도 17에 나타나는 억제 효과의 지속 기간은 동일한 투여량 수준에서 접합체 24 및 25에서 보다 현저하게 짧다.
다음을 제외하고 상기와 동일한 방법에 따라, 4가지 시험이 추가로 진행되고, 상기 혈청 HBsAg가 측정된다:
AAV-HBV 저농도 마우스 모델에서, 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 접합체 25를 각각 투여하고, NS가 대조군으로 사용되고, 시험은 140일까지 계속되었고, 결과는 도 18에 나타난다;
M-Tg 모델에서, 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 접합체 17 및 25 를 각각 투여하고, PBS를 대조군으로 투여하고, 시험은 70일까지 계속되었고, 결과는 도 19 에 나타난다;
M-Tg 모델에서, 5 mg/kg, 1 mg/kg 및 0.2 mg/kg의 접합체 26 및 5 mg/kg의 비교 접합체 15 를 각각 투여하고, PBS를 대조군으로 투여하고, 시험은 78일까지 계속되었고, 결과는 도 20 에 나타난다;
1.28 카피 모델에서, 3 mg/kg 및 1mg/kg의 접합체 24 를 각각 투여하고, 시험은 210일까지 계속되었고, 결과는 도 21 에 나타난다.
상기 다양한 투여량에서, 각 접합체는 동일한 투여량 부피로 투여되지만, 접합체 용액의 농도가 각각 조절하여, 그에 따라 투여되도록 하였다.
도 18-21의 결과에서, 본원 개시의 siRNA 접합체가 다양한 동물 모델에서 혈청 HBsAg에 장기적이고 효과적인 억제 효율을 나타내고, 표준 투여량(regular dose) 의존성이 밝혀짐을 알 수 있다.
실험예 6 - 표 9 내지 표 11에서 siRNA 접합체의 효과를 검증하기 위한 실험
실험예 6-1 -접합체 43, 62 및 78에 대한 표적 외 효과 시험.
다음을 제외하고 실험예 5-1에 기술된 방법에 따라, 접합체 43, 62 및 78의 표적 외 효과가 개별적으로 시험되었다: 각 접합체에서, 상응하는 접합체의 siRNA의 역배열 가닥 서열과 완전히 상보적으로 결합하는 표적 서열은 표적 내 플라스미드 GSCM를 구성하기 위해 사용되는 반면, 역배열 가닥 서열과 완전히 동일한 표적서열, 상응하는 접합체의 siRNA의 역배열 가닥 서열의 1-8위치와 상보적으로 결합하는 또는 역배열 가닥 서열의 1-8위치와 동일한 표적 서열은 각각 표적 외 플라스미드 GSSM, PSCM ?? PSSM를 구성하는데 사용되었다. 결과는 도 22-24 에 각각 나타난다. 도 22-24 의 결과에서, 상기 모든 접합체가 표적 mRNA에 우수한 억제 효과를 가질 뿐만 아니라, 낮은 표적 외 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실험 접합체 6-2 - 이 실험은 생체 내 쥐에서 HBV mRNA의 발현에서 본원 개시에 의해 제공되는 접합체의 발현 억제 효율을 설명한다.
이 실험예에서, HBV 유전자 이식 쥐 C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J에서 HBV mRNA발현에 대한 접합체 25, 42, 43, 62 및 78의 억제 효율이 조사되었다.
우선, C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J 쥐를 혈청에서 HBsAg 함량에 기초해 무작위의 군(모두 암컷, 각 군에 4마리 쥐)으로 나누고 개별적으로 번호를 매기고, 대조군으로 NS 군을 추가하였다. 모든 동물의 약물 투여량은 체중에 따라 계산되었다. 접합체 24 또는 42를 각각 0.9 중량% NaCl 수용액 중0.2 mg/ml 및 0.02 mg/ml 접합체를 투여량 부피 5 ml/kg로 각 1 mg/kg 또는 0.1 ml/kg의 용량으로 단일 용량을 피하 투여 하였다. 동물을 투여 후 7일에 희생시켰다. 간을 수집하고 RNA 레이터(RNA later) (Sigma Aldrich)로 보관하고, 간 조직을 조직 균질화기로 균질화하였다. 그 다음 총 RNA 추출 표준 절차에 따라 트리졸(Trizol)을 사용해 총 RNA를 추출하고 수득한다.
간 조직에서 HBV mRNA의 발현수준은 실시간 형광 qPCR 로 측정된다. 구체적으로, 추출된 총 RNA는 지시에 따라 ImProm-II™ 역 전사 키트 (Promega)를 사용해 cDNA로 역전사 된 후, 간 조직에서 HBV mRNA 의 발현에 대한 siRNA 억제 효율을 형광 qPCR 키트(Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd)를 사용해 측정하였다. 이러한 형광 qPCR 방법에서, β-액틴 유전자를 내부 조절 유전자로 사용하고, HBV 및 β-액틴을 각각 HBV 및 β-액틴 용 프라이머를 사용해 검출하였다.
검출을 위한 프라이머의 서열은 표 17에 나타난다.
이러한 형광 qPCR 방법에서, 접합체의 mRNA에 대한 억제율 뿐만 아니라 HBV mRNA의 발현의 계산은 실험예 5-2에 따른다.
상기, 대조군은 본 실험에서 NS를 투여한 대조 쥐 군이고 각 실험군은 각각 상이한 siRNA 접합체를 투여한 쥐 군이다. 결과는 도 25에 나타난다.
다른 실험에서, 하기 프로토콜에 따라 2개의 실험이 추가 진행되었다:
시험을 위해 투여된 접합된 siRNA가 접합체 43, 62, 78 및 25로 대체되고, 데이터가 7일에 수집되는 것을 제외하고, 상기와 동일한 방법이 사용된다. 결과는 도 26에 나타난다;
시험을 위해 투여된 접합된 siRNA가 접합체 42, 43 및 25로 대체되고, 각 접합체 42 및 25는 1 mg/kg 및 0.1 mg/kg (상기 투여 부피는 동일하게 유지되나, 접합체 용액의 농도가 각각 조절된다)의 용량으로 투여되는 것을 제외하고 상기와 동일한 방법이 사용된다. 또한, 검출용 프라이머의 서열이 표 19에 나타난 서열로 대체된다. 결과는 도 27에 나타난다.
유전자 업스트림 프라이머 다운스트림 프라이머
HBV 5'- CCGTCTGTGCCTTCTCATCT -3'
（서열 번호: 187）		 5'- TAATCTCCTCCCCCAACTCC -3'
（서열 번호: 188）
β-액틴 5'- AGCTTCTTTGCAGCTCCTTCGTTG -3'
（서열 번호: 191）		 5'- TTCTGACCCATTCCCACCATCACA-3'
（서열 번호: 192）
도 26 및 27에서 알 수 있듯이, 본원에 기재된 상기 모든 접합체는 쥐 생체 내에서 HBV mRNA 발현에서 높은 억제 활성을 보인다. 또한, 상이한 종류의 HBV mRNA에 대한 억제 효과도 기본적으로 동일하게 유지된다.
실험예 6-3 - 이 실험은 HBV 유전자 이식 쥐 혈청 중 HBsAg 및 HBV DNA의 발현에서 표 9의 siRNA 접합체의 억제 효율의 시간에 따른 실험을 보여준다.
AAV-HBV 저농도 마우스 모델이 사용되었다. 동물 모델을 성공적으로 확립한 후, 이 쥐들을 혈청에서 HBsAg 함량에 기초해 무작위의 군으로 나눴다 (각 군마다 5마리의 쥐). 접합체 43는 각각 각 군에 투여되고, PBS를 빈(blank) 대조군으로 사용하였다. 모든 동물의 약물 투여량은 체중에 따라 계산되었다. 0.9 중량% NaCl 수용액 중 0.6 mg/ml 또는 0.2 mg/ml의 접합체에 관해 부피 5 ml/kg로 3 mg/kg 또는 1 mg/kg의 용량으로 단일 용량을 피하 투여하였다. 투여 전 및 투여 후 7, 14, 21, 28, 56, 84, 112, 126 및 140 일에 마우스의 눈부위 정맥얼기로부터 혈액을 채취했고, 각 시점에서 혈청의 HBsAg 수준을 측정하였다.
눈확(orbit)에서 채취한 혈액은 매번 약 100 μl이었고, 혈청은 원심 분리 후 20 μl 이상이었다. 혈청에서 HBsAg의 함량은 HBsAg CLIA 키트 (Autobio, CL0310)를 사용해 측정된다.
정규화된 HBsAg 발현 = (투여 후 HBsAg의 함량/투여 전 HBsAg의 함량) × 100%.
HBsAg에 대한 억제율 = (1 - 투여 후 HBsAg의 함량/투여 전 HBsAg의 함량) × 100%, 상기 HBsAg의 함량은 혈청의 밀리미터(ml) 당 HBsAg 당량(UI)로 표현되었다.
결과는 도 28에 나타난다. 도 28의 결과에서 알 수 있듯이, NS 음성 대조군은 투여 후 상이한 시점에서 억제 효과를 나타내지 않는다; 대조적으로, 접합체 43는 투여 후 상이한 시점에서 HBsAg에 대한 우수한 억제 효과를 나타내고, 혈청의 HBsAg에 대해 100 일까지 지속적으로 높은 억제율을 나타내고, 이는 장기간에 걸쳐 안정적이고 효율적으로 HBV 유전자의 발현을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
추가 실험에서, 상기 기재된 방법에 따라, M-tg 모델 쥐에서, 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 접합체 24, 62 및 78 를 0.9 중량% NaCl 수용액 중 0.6 mg/ml 또는 0.2 mg/ml의 접합체로 부피 5 ml/kg를 각각 투여하였다. 시험은 85일까지 계속되었고, 결과는 도 29 및 30에 나타난다.
도 29의 결과로부터, 접합체 24, 62 및 78 모두 85일 까지 혈청 HBsAg에 대한 장기적이고 효과적인 억제 효율을 나타낸다는 것을 알 수있다. 도 30 의 결과로부터, 투여 후 85일에서, 3 mg/kg 투여량의 접합체 24 및 78는 여전히 각각 68.6% 및 62% 의 HBV mRNA의 억제를 나타낸다.
추가 실험에서, 상기 기재된 방법에 따라, 1.28 카피 모델 쥐에서, 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 접합체 43 을 0.9 중량% NaCl 수용액 중 0.6 mg/ml 또는 0.2 mg/ml의 접합체로 부피 5 ml/kg를 각각 투여하였다. 시험은 85일까지 계속되었다. HBsAg 및 HBV DNA 에 대한 억제 효과는 실험예 5-4에 따라 측정되었고, 결과는 도 31 및 32 에 나타난다.
도 31 및 32 의 결과에서, 1.28 카피 모델 쥐에서, 접합체 43는 HBV DNA 뿐만 아니라 HBV발현에 대해서도 85일 까지 지속적으로 효과적인 억제를 보인다는 것을 알 수 있다.
실험예 7 - 접합체 167 및 168의 효과를 검증하기 위한 실험
실험예 7-1 - 이 실험은 본원 개시의 siRNA 접합체가 비교적 높은 실험관 내 활성을 가질 뿐만 아니라, 낮은 표적 외 효과를 나타내는 것을 설명한다.
이 실험예에서, 접합체 168는 실험관 내 psiCHECK 시스템에서 표적 내 활성 및 표적 외 효과를 위해 조사되었다. 구체적으로 말하면, 표적 서열과 완전히 일치하는 표적화 (접합체 168의 역배열 가닥의 전체 길이의 뉴클레오티드 서열과 완전히 상보적이거나 동일한 뉴클레오티드 서열) 또는 표적 서열과 시드(seed) 영역이 일치하는 표적화에 대해 (접합체 168의 역배열 가닥의 1-8 위치의 뉴클레오티드 서열과 완전히 상보적이거나 동일한 뉴클레오티드 서열)의 활성에 대해 접합체 168를 시험하였다.
실험예 5-1에 기술된 방법에 따라, 접합체 168가 시험된다, 다음을 제외하고, 접합체 168의 siRNA의 역배열 가닥 서열과 완전히 상보적으로 결합하는 표?Ъ?열이 표적 내 플라스미드 GSCM를 구성하기 위해 사용되는 반면, 역배열 가닥 서열과 완전히 동일한 표적 서열, 접합체 168의 siRNA의 역배열 가닥 서열의 1-8 위치와 상보적으로 결합 또는 역배열 가닥 서열 1-8 위치와 같은 표적 서열이 표적 외 플라스미드 GSSM, PSCM 및 PSSM를 구성하기 위해 각각 사용된다. 시험 결과에서, 상기 모든 접합체가 표적 mRNA에 (IC50=0.0513 nM으로) 우수한 억제 효과를 가질 뿐만 아니라, 낮은 표적 외 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실험예 7-2 - 이 실험은 시험관에서 siRNA 접합체 리소좀 용해물의 안정성을 보여준다.
제조예 1에서 얻어진 접합체 167 및 대조 서열 1 (각 siRNA에 대해 20 μM에서 0.9 중량% NaCl 수용액의 형태로 각각 제공, 각 그룹 당 6 μl, 대조 서열 1은 NC로 표시) 를 27.2 μL 의 시트르산 나트륨 수용액 (pH 5.0), 4.08 μL 의 탈이온수 및 2.72 μL 의 쥐 트리토좀 (Xenotech Inc. 에서 구매, Cat. R0610LT, 최종 농도 0.2 mU/μL)과 개별적으로 잘 혼합하고, 37°C. 항온에서 배양하였다. 0 시간, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 및 24 시간 각 시점에서 5 μL 샘플을 채취하고, 변성을 위해 15 μL 의 9 M 우레아 수용액을 각 첨가하고, 사용을 위해 즉시 -80℃ 냉동고에서 냉동 보존하였다, 상기 0 시간은 siRNA 접합체가 샘플이 리소좀 용해물과 잘 혼합되고 시험을 위해 즉시 채취된 시점을 나타낸다. 그 동안, 접합체 167 및 대조 서열 1에 대해, 등 몰비의 siRNA (20 μM, 1.5 μL)는 7.5 μL 의 시트르산 나트륨 수용액 (pH 5.0) 및 1 μL 의 탈이온수와 개별적으로 잘 혼합된 후, 변성을 위해 30 μL 의 9 M 우레아 수용액이 첨가되고, 8 μL 의 6x 로딩 버퍼 (20 mM EDTA 수성 용액, 36 중량% 글리세롤, 및 0.06 중량% 브로모페놀 블루)와 결과적으로 잘 혼합되고, 반응을 급냉시키기 위해 즉시 -80℃ 냉동고에서 냉동보존하고, 그래서 실험을 위해 리소좀 용해물로 처리되지 않은 샘플 (전기영동도에서 M으로 표시)을 준비하였다. 16 중량%의 비-변성 폴리아크릴아마이드 겔을 제조하였다. 테스트를 위한 각 샘플 20 μL 를 별도로 젤에 로드시키고 60 분 동안 80 mA 정 전류하에서 전기 영동을 수행하였다. 전기영동을 완료한 후, 겔을 1x Sybr Gole 염료 (Invitrogen, Cat. 11494) 로 15 분 동안 염색한 후 영상화 하였다. 결과는 도 33에 나타난다.
접합체 167 및 대조 서열 1 (도 34에서 NC로 표시)의 래트-유래 리소좀 용해물에서의 안정성은 인간-유래 리소좀 용해물이 래트-유래 리소좀 용해물 (Rat Liver Tritosomes Xenotech Inc. 에서 구매, Cat. R0610.LT, 최종 농도 0.2 mU/μL)로 대체되는 것을 제외하고 동일한 방법에 따라 측정된다. 결과는 도 34에 나타난다.
도 33 및 34는 본원 개시의 접합체가 우수한 안정성을 나타내며, 인간- 및 래트-유래 리소좀 용해물 모두에서 24 시간이상 분해되지 않은 상태로 유지될 수 있음을 나타낸다.
실험 접합체 7-3 - 이 실험은 쥐 생체 내에서 HBV mRNA의 발현에서 본원 개시에 의해 제공되는 접합체의 억제 효율을 보여준다.
이 실험예에서, HBV 유전자 이식 쥐 C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J 에서 HBV mRNA 발현에서 접합체 167 ?? 168의 억제 효율이 조사되었다.
우선, C57BL/6J-Tg (Alb1HBV) 44Bri/J 쥐를 혈청에서 HBsAg 함량에 기초해 무작위의 군(모두 암컷, 각 군에 5마리 쥐)과 PBS 군으로 나누고 접합체 167 및 168를 각각 투여하였다. 상기, PBS 군의 각 동물에 5 mg/kg의 1x PBS를 피하 투여 하였다. 접합체 167 또는 168에서, 접합체의 단일 용량을 피하 투여 했고, 각 0.9 중량% NaCl 수용액 중 0.2 mg/ml의 접합체와 투여 부피 5 ml/kg로 단일 용량을 투여량 1 mg/kg로 피하 투여 하였다. 동물을 투여 후 28일에 희생시켰다. 간을 수집하고 RNA 레이터(RNA later) (Sigma Aldrich)로 보관하고, 간 조직을 조직 균질화기로 균질화한 다음, 총 RNA 추출 표준 절차에 따라 트리졸(Trizol)을 사용해 총 RNA를 추출하고 수득한다.
간 조직에서 HBV mRNA 의 발현수준은 실시간 형광 qPCR로 측정된다. 구체적으로, 추출된 총 RNA는 지시에 따라 ImProm-II™ 역 전사 키트 (Promega)를 사용해 cDNA로 역전사 된 후, 간 조직에서 HBV mRNA 의 발현에 대한 siRNA 억제 효율을 형광 qPCR 키트(Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd)를 사용해 측정하였다. 이러한 형광 qPCR 방법에서, β-액틴 유전자를 내부 조절 유전자로 사용하고, HBV 및 β-액틴을 각각 HBV 및 β-액틴용 프라이머를 사용해 검출하였다.
검출을 위한 프라이머의 서열은 표 20에 나타난다.
유전자 업스트림 프라이머 다운스트림 프라이머
HBV 5'- GTCTTTTGGGTTTTGCTGCC -3'
(서열 번호: 238)		 5'- GCAACGGGGTAAAGGTTCAG -3'
(서열 번호: 239)
β-액틴 5'- GGTCGGAGTCAACGGATTT -3'
(서열 번호: 240)		 5'- CCAGCATCGCCCCACTTGA -3'
(서열 번호: 241)
이러한 형광 qPCR 방법에서, 접합체의 mRNA에 대한 억제율 뿐만 아니라 HBV mRNA 발현 계산은 실험예 5-2에 따른다. 결과는 표 21 에 나타난다.
다른 실험에서, 시험을 위해 투여된 접합된 siRNA가 접합체 167 및 168로 대체되고, 투여량이 변경되는 것을 제외하고 상기와 동일한 방법이 사용되고, 결과는 표 21 에 나타난다.
접합체 투여량 (mg/kg) 간의 HBV mRNA 억제율 (%)
-- NA 0
접합체167 1 77.41
접합체 168 1 88.27
접합체 168 0.3 57.95
상기 결과에서 볼 수 있듯이, 본원에 개시된 상기 모든 접합체는 쥐 생체 내에서 HBV mRNA 발현에 높은 억제 활성을 나타내고, 본원에 개시된 siRNA 접합체의 생체 내에서 우수한 전달 효율을 나타낸다.
실험예 7-4 - 이 실험은 HBV 유전자 이식 쥐 혈청에서 HBsAg 및 HBV DNA의 발현에서 표 9의 siRNA 접합체의 시간에 따른 억제 효율 실험을 나타낸다.
1.28 카피 모델에서, 쥐들을 무작위의 군으로 나눴다 (각 군에 6 마리 쥐, 반은 암컷이고 반은 수컷). 생리 식염수 및 상이한 용량의 접합체 168가 각각 각 군에 투여되고, NS 군에 대해 5 ml/kg의 생리 식염수를 피하 투여 했고. 접합체 군에 대해, 모든 동물의 약물 투여량은 체중에 따라 계산되었다. 0.9 중량% NaCl 수용액 중 접합체 0.6 mg/ml 또는 0.2 mg/ml에 따라 5 ml/kg의 부피로 3 mg/kg 또는 1 mg/kg 용량의 단일 용량을 피하 투여하였다. 투여 전 및 투여 후 7, 13, 21, 28, 42, 56, 70, 84, 98, 112, 126, 140 및 154일에 마우스의 눈부위 정맥얼기로부터 혈액을 채취했고, 혈청에서 HBsAg, HBeAg 및 HBV DNA 수준을 각 시점에서 측정하였다.
눈확(orbit)에서 채취한 혈액은 매번 약 100 μl이었고, 혈청은 원심 분리 후 20 μl 이상이었다. 혈청에서 HBsAg의 함량은 HBsAg CLIA 키트 (Autobio, CL0310)를 사용해 측정된다. 혈청에서 HBeAg의 함량은 HBeAg CLIA 키트 (Autobio, CL0310)를 사용해 측정된다. HBV DNA의 발현 수준은 QIAamp 96 DNA Blood Kit의 지시를 참조 하여 혈청에서 DNA를 추출한 후 qPCR 을 통해 측정되었다.
정규화된 HBsAg 발현 = (투여 후 HBsAg의 함량/투여 전 HBsAg의 함량) × 100%.
HBsAg에 대한 억제율 = (1 - 투여 후 HBsAg의 함량/투여 전 HBsAg의 함량) × 100%, 상기 HBsAg의 함량은 혈청의 밀리미터(ml) 당 HBsAg의 당량(UI)으로 표현된다.
정규화된 HBeAg 발현 = (투여 후 HBeAg의 함량/투여 전 HBeAg의 함량) × 100%.
HBeAg에 대한 억제율 = (1 - 투여 후 HBeAg의 함량/투여 전 HBeAg의 함량) × 100%, 상기 HBeAg의 함량은 혈청의 밀리미터(ml) 당 HBeAg의 당량(UI)으로 표현된다.
정규화된 HBV DNA 발현 = (투여 후 HBV DNA의 함량/투여 전 HBsAg의 함량) × 100%.
HBV DNA 에 대한 억제율 = (1 - 투여 후 HBV DNA의 함량/투여 전 HBV DNA의 함량) × 100%,
상기 HBV DNA의 함량은 혈청의 밀리미터(ml) 당 HBV DNA의 복제수(copies)로 표현된다.
결과는 도 35 내지 37 에 나타난다. 도 35 의 결과에서 알 수 있듯이, NS 음성 대조군은 투여 후 상이한 시점에서 억제 효과를 나타내지 않는다; 대조적으로, 접합체 168 모두는 투여 후 상이한 시점에서 HBsAg에 대한 우수한 억제 효과를 나타내고, 특히 3 mg/kg 군에서 혈청의 HBsAg에 대한 90%이상의 억제율을 100 일까지 지속적으로 나타내고, 이는 장기간에 걸쳐 안정적이고 효율적으로 HBV 유전자의 발현을 억제할 수있다는 것을 나타낸다.
도 36의 결과에서 알 수 있듯이, siRNA 접합체는 또한 HBeAg 발현을 억제할 수있다. 상기, 3 mg/kg 군에서 둘다 혈청의 HBeAg에 대한 50% 이상의 억제율을 70 일 까지 지속적으로 나타낸다.
도 37의 결과로부터, 접합체는 또한 HBV DNA 발현에 효율적인 억제 효율을 나타내고 154 일 까지 HBV DNA에 대한 상대적으로 높은 억제율을 나타내는 것을 알 수 있다.
실험예 8 - 표 12에서 siRNA 접합체의 효과를 검증하기 위한 실험
실험예 8-1 - 이 실험은 생체 내(in vivo)에서 ANGPTL3 mRNA 발현에서 표 12의 siRNA 접합체의 억제 효율을 보여준다.
이 실험예에서, 정상 BALB/c 쥐의 간 조직에서 ANGPTL3 발현 수준에서 접합체 105, 109, 111 및 115의 억제율이 조사된다.
정상 BALB/c 쥐 (6-8 주령, Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.Ltd. 에서 구매)를 무작위의 군으로 나눴다 (각 군마다 5마리의 쥐). 접합체 105, 109, 111, 115 및 PBS를 독립적으로 각 군의 쥐에 투여하였다. 모든 동물의 약물 투여량은 체중에 따라 계산되었다. 0.9 중량% NaCl 수용액 중 0.3 mg/ml 및 0.03 mg/ml의 siRNA 접합체에 대해 용량 부피 10 ml/kg로 3 mg/kg 및 0.3 mg/kg (siRNA의 양에 따라)의 용량의 단일 용량을 피하 투여하였다. 쥐를 투여 후 14일 및 28일에 각각 배치(batches)에서 희생시켰다. 간을 수집하고 RNA 레이터(RNA later) (Sigma Aldrich)로 보관하고, 간 조직을 조직 균질화기로 균질화하고. 그 다음 총 RNA 추출 표준 절차에 따라 트리졸(Trizol) (Thermo Fisher)을 사용해 총 RNA를 추출하고 수득한다.
간 조직에서 ANGPTL3 mRNA의 발현수준은 실시간 형광 qPCR로 측정된다. 구체적으로, 추출된 총 RNA는 지시에 따라 ImProm-II™ 역 전사 키트(Promega)를 사용해 cDNA로 역전사된 후, 간 조직에서 ANGPTL3 mRNA 의 발현에 대한 siRNA 억제 효율을 형광 qPCR 키트(Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd)를 사용해 측정하였다. 이러한 형광 qPCR 방법에서, GAPDH 유전자를 내부 조절 유전자로 사용하고, ANGPTL3 및 GAPDH를 각각 ANGPTL3 및 GAPDH 용 프라이머를 사용해 검출하였다.
검출을 위한 프라이머의 서열은 표 22에 나타난다.
유전자 업스트림 프라이머 다운스트림 프라이머
마우스 ANGPTL3 5’-GAGGAGCAGCTAACCAACTTAAT-3’
（서열 번호: 199）		 5’-TCTGCATGTGCTGTTGACTTAAT-3’
（서열 번호: 200）
마우스 GAPDH 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGGGCTC-3’
（서열 번호: 201）		 5’-TGGAAGAGTGGGAGTTGCTGTTGA-3’
（서열 번호: 202）
ANGPTL3 mRNA의 발현은 수식에 의해 계산된다: ANGPTL3 mRNA의 발현 = (시험군에서 ANGPTL3 mRNA의 발현/시험군에서 GAPDH mRNA의 발현)/(대조군에서 ANGPTL3 mRNA의 발현/대조군에서 GAPDH mRNA의 발현) × 100%.
접합체에 의한 ANGPTL3 mRNA에 대한 억제율은 수식에 의해 계산된다: ANGPTL3 mRNA에 대한 억제율 = (1 - 시험군에서 ANGPTL3 mRNA의 발현/시험군에서 GAPDH mRNA의 발현)/(대조군에서 ANGPTL3 mRNA의 발현/대조군에서 GAPDH mRNA의 발현) × 100%. 대조군은 이 실험에서 PBS가 투여된 대조 쥐 군이고 각 시험군은 각각 상이한 siRNA 접합체가 투여된 쥐 군이다. 결과는 도 38a 및 38b 에 나타난다.
도 38a 및 38b 의 결과에서 알 수 있듯이, 상기 모든 siRNA 접합체는 ANGPTL3 mRNA 발현에 대해 우수한 억제 활성을 나타낸다.
혈액(약 100 μL)은 상기 실험 대상체의 눈확(orbits)으로부터 채취되고 혈청을 얻기 위해 원심분리되었다. 혈청에서 총 콜레스테롤(CHO)과 중성지방(TG)의 양은 PM1P000/3 전자동 혈청 생화학 분석기(SABA, Italy)를 사용해 추가적으로 측정된다. 혈액 지질의 결과를 정규화하고 혈액 지질 수준에 대한 억제율을 수식으로 계산하였다: 억제율 = (1 - 투여 후 시험군에서 혈액 지질 양/투여 전 시험군에서 혈액 지질 양) × 100%. 혈액 지질은 총 콜레스테롤 또는 중성지방을 지칭한다. 시험 결과는 도 39a 및 39b에 나타난다.
도 39a 및 39b의 결과에서 알 수 있듯이, 접합체 105, 109, 111 및 115의 상이한 투여량으로 처리된 쥐의 혈청에서, CHO 및 TG의 양 모두가 현저하게 감소했고, 혈액 지질 수준 감소가 투여 후 28일 이상까지 관찰되었다.
실험 접합체 8-2 - 이 실험은 본원에 개시된 siRNA 접합체의 혈액 지질에 대한 효과를 보여준다.
Tg(APOC3)3707Bres 쥐를 TG 함량 > 2mmol/L에 기초해 무작위의 군으로 나누고(각 군마다 5마리의 쥐) 각 군에, PBS 음성 대조군 및 접합체 115를 각각 투여하였다. 모든 동물의 약물 투여량은 체중에 따라 계산되었다. 0.9 중량% NaCl 수용액 중 접합체 각각 0.6 mg/ml 또는 0.2 mg/ml 및 투여 부피 5 ml/kg으로 각 용량 3 mg/kg 또는 1 mg/kg 으로 접합체의 단일 용량을 피하 투여 하였다. 투여 전 및 투여 후 7, 14, 21, 28, 35, 56, 70, 84, 98, 112, 126, 140, 154 및 168 일에 혈액은 쥐의 눈확(orbits)으로부터 채취되고, 혈청에서 CHO 및 TG의 양이 측정된다.
눈확(orbit)에서 채취한 혈액은 매번 약 0.1ml이었고, 혈청은 원심 분리 후 20 μl 이상이었다. 혈청에서 총 콜레스테롤(CHO)과 중성지방(TG)의 양은 PM1P000/3 전자동 혈청 생화학 분석기(SABA, Italy)를 사용해 측정된다.
혈액 지질의 결과를 정규화한다: 정규화 된 혈액 지질 수준 = (투여 후 시험군에서 혈액 지질 양/투여 전 시험군에서 혈액 지질 양), 및 혈액 지질 수준에 대한 억제율 = (1 - 투여 후 시험군에서 혈액 지질 양/투여 전 시험군에서 혈액 지질 양) × 100%. 시험 결과는 도 40a 및 40b에 나타난다.
도 40a 및 40b의 결과에서 알 수 있듯이, 투여 후 다양한 시점에서, 접합체 115는 최대 168 일 동안 TG 및 CHO 감소에 현저한 효과를 나타내고, 쥐 생체 내에서 ANGPTL3 유전자 발현에 대해 장기간에 걸쳐 안정적이고 효율적인 억제를 나타낸다.
다른 실험에서, ob/ob 모델 쥐가 사용되고; 각 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 투여량에서 접합체 111, 115 및 비교 접합체 16이 개별적으로 투여되고; 데이터가 투여 후 0, 7, 14, 21, 28, 35 및 41 일에 수집되는 것을 제외하고, 상기와 동일한 방법이 사용된다. 결과는 도 41a-41b에 나타난다.
도 41a-41b의 결과에서 알 수 있듯이, 본원에 개시된 접합체 111 및 115는 41 일 내에 ob/ob 쥐 생체 내에서 혈액 지질 수준을 지속적으로 감소시킬 수 있고, 우수한 억제 활성을 보이는 것을 알 수 있다.
다른 실험에서, 접합체 111 및 비교 접합체 16는 0.9 중량% NaCl 수용액 중 각각 0.6 mg/ml 및 0.2 mg/ml, 투여 부피 5 ml/kg으로 각 3 mg/kg 및 1 mg/kg 투여량으로 별도로 투여되며; CHO 및 TG 값이 투여 후 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 56 및 70일에 시험되는 것을 제외하고 상기와 동일한 방법이 사용된다. 결과는 도 42a-42d에 나타난다.
도 42a-42d의 결과에서 알 수 있듯이, 본원에 개시된 접합체 111는 70 일 간 혈액 지질을 지속적으로 줄일 수 있고, 이는 동일안 투여량 수준에서 비교 접합체 16보다 우수하다는 것을 알 수 있다.
실험예 8-3 - 이 실험은 표 8 의 상이한 접합 분자를 갖는 siRNA 접합체의 ANGPTL3 mRNA 발현에 대한 억제 효율 및 비-인간 영장류의 혈액 지질에서의 효과를 보여준다.
대사 증후군을 가진 원숭이(모두 수컷)에 대하여, 12 마리 동물은 접합체 169를 투여하는 실험군 8마리와 접합체 25를 투여하는 대조군 4마리로 그룹화되고; 원숭이의 기본 데이터는 테스트되고 3 주동안 관찰되며, 혈액을 매 주 채취해 혈액 지질 수준(TG, CHO, HDL)을 측정하였다. 그 후에, 접합체 169 및 접합체 25 (비교 접합체로서 완전히 관련 없는 mRNA를 표적화 하는 siRNA)를 투여하였다. 모든 동물의 약물 투여량은 체중에 따라 계산되었다. 0.9 중량% NaCl 수용액 중 100 mg/ml 로 각 투여 위치에서의 투여 부피는 2 ml이하로 투여량 9 mg/kg (siRNA양에 따라) 단일 용량을 피하 투여하였다. 투여 전 및 투여 후 7, 14, 21, 28 및 35일에 혈액이 채취되고, 혈청에서 TG 및 CHO 수준이 각 시점에서 시험된다.
혈액 지질의 결과를 정규화하고, 정규화 된 혈액 지질 수준 = (투여 후 시험군에서 혈액 지질 양/투여 전 시험군에서 혈액 지질 양), 혈액 지질 수준에 대한 억제율 = (1 - 투여 후 시험군에서 혈액 지질 양/투여 전 시험군에서 혈액 지질 양) × 100%. 상기 투여 전 시험군에서 혈액 지질 양은 투여 전 3주 동안 혈액 지질의 평균값이고, 도 43a 및 43b에 D0로 표시된다.
0일(투여 당일) 및 28일에서, 간 조직에서 ANGPTL mRNA 발현 수준을 측정하기 위해 경피 경간 생검(Percutanous transshepatic biopsy)을 진행하였다. 간을 수집하고 RNA 레이터(RNA later) (Sigma Aldrich)로 보관하고, 간 조직을 조직 균질화기로 균질화하였다. 그 다음에 총 RNA 추출 표준 절차에 따라 트리졸(Trizol)을 사용해 총 RNA를 추출하고 수득한다.
간 조직에서 ANGPTL3 mRNA 의 발현수준은 실시간 형광 qPCR로 측정된다. 구체적으로, 추출된 총 RNA는 지시에 따라 ImProm-II™ 역 전사 키트 (Promega)를 사용해 cDNA로 역전사된 후, 간 조직에서 ANGPTL3 mRNA 의 발현에 대한 siRNA 억제 효율을 형광 qPCR 키트(Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd)를 사용해 측정하였다. 이러한 형광 qPCR 방법에서, GAPDH 유전자를 내부 조절 유전자로 사용하고, ANGPTL3 및 GAPDH는 각각 ANGPTL3 및 GAPDH용 프라이머를 사용해 검출되었다.
검출을 위한 프라이머의 서열은 표 23에 나타난다.
유전자 업스트림 프라이머 (5’-3’) 다운스트림 프라이머 (5’-3’)
원숭이 ANGPTL3 CTGGTGGTGGCATGATGAGT
(서열 번호: 242)		 CTCTTCTCCGCTCTGGCTTAG
(서열 번호: 243)
원숭이 GAPDH GGGAGCCAAAAGGGTCATCA
(서열 번호: 244)		 CGTGGACTGTGGTCATGAGT
(서열 번호: 245)
ANGPTL3 mRNA발현 및 ANGPTL3 mRNA에 대한 억제율에 대한 계산은 실험예(8-1)에 따른다. 대조군은 본 실험에서 PBS를 투여한 대조 원숭이 군이며 각 실험군은 각각 상이한 siRNA 접합체를 투여한 원숭이 군이다. 결과는 도 43a-43c 에 나타난다. 도 43a-43c의 결과에서 알 수 있듯이, 접합체 169는 투여 후 28일에 ANGPTL3 유전자 mRNA의 82.7% 를 감소시켜 ANGPTL3 유전자 발현에 대한 상당한 TG 감소 및 억제를 나타낸다.
실험예 9 - 표 13의 siRNA 접합체의 효과를 검증하기 위한 실험
실험예 9-1 - 이 실험은 표 13의 siRNA 접합체의 생체 내에서 APOC3 mRNA발현에 대한 억제 효율을 보여준다.
이 실험예에서, 인간 APOC3 유전자 이식 쥐 (B6; CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J, Jackson Lab 에서 구매) 생체 내의 간 조직에서 접합체 144의 APOC3 발현 수준에 대한 억제율이 조사된다.
인간 APOC3 유전자 이식 쥐 (6-8 주령, triglyceride > 2mmol/L) 를 무작위의 군으로 나눴다 (각 군마다 5 마리의 쥐). 접합체 144 및 접합체 25 (비교 접합체로서 완전히 관련 없는 mRNA를 표적화 하는 siRNA)를 각 그룹의 쥐에 각각 투여하였다. 모든 동물의 약물 투여량은 체중에 따라 계산되었다. 0.9 중량% NaCl 수용액 중 0.2 mg/ml 및 0.02 mg/ml 이고 siRNA 접합체에 대해 투여 부피 5 ml/kg 로 각각 1 mg/kg 및 0.1 mg/kg (siRNA의 양에 따라)투여량으로 단일 용량을 피하 투여하였다. 쥐를 투여 후 14에 희생시켰다. 간을 수집하고 RNA 레이터(RNA later) (Sigma Aldrich)로 보관하고, 간 조직을 조직 균질화기로 균질화하였다. 그 다음 총 RNA 추출 표준 절차에 따라 트리졸(Trizol) (Thermo Fisher)을 사용해 총 RNA를 추출하고 수득한다.
간 조직에서 APOC3 mRNA의 발현수준은 실시간 형광 qPCR로 측정된다. 구체적으로, 추출된 총 RNA는 지시에 따라 ImProm-II™ 역 전사 키트 (Promega)를 사용해 cDNA로 역전사 된 후, 간 조직에서 APOC3 mRNA 의 발현에 대한 siRNA 억제 효율을 형광 qPCR 키트(Beijing Cowin Biosicences Co., Ltd)를 사용해 측정하였다. 이러한 형광 qPCR 방법에서, β-액틴 유전자를 내부 조절 유전자로 사용하고, APOC3 및 β-액틴을 각각 APOC3 및 β-액틴 용 프라이머를 사용해 검출하였다.
검출을 위한 프라이머의 서열은 표 24에 나타난다.
유전자 업스트림 프라이머 다운스트림 프라이머
인간 APOC3 5'- GTGACCGATGGCTTCAGTTC -3'
（서열 번호: 248）		 5'- ATGGATAGGCAGGTGGACTT -3'
（서열 번호: 249）
마우스 β-액틴 5’-AGCTTCTTTGCAGCTCCTTCGTTG-3’
（서열 번호: 246）		 5’-TTCTGACCCATTCCCACCATCACA-3’
（서열 번호: 247）
APOC3 mRNA의 발현은 수식에 따라 계산된다: APOC3 mRNA의 발현 = (실험군에서 APOC3 mRNA의 발현/실험군에서 β-액틴 mRNA의 발현)/(대조군에서 APOC3 mRNA의 발현/대조군에서 β-액틴 mRNA의 발현) × 100%.
APOC3 mRNA의 발현에 대한 접합체의 억제율은 수식에 따라 계산된다: 억제율 = [1-(실험군에서 APOC3 mRNA의 발현/실험군에서 β-액틴 mRNA의 발현)/(대조군에서 APOC3 mRNA의 발현/대조군에서 β-액틴 mRNA의 발현) × 100%. 상기, 대조군은 본 실험에서 PBS가 투여된 대조 쥐 군이고 각 시험군은 각각 상이한 siRNA 접합체가 투여된 쥐군이다. 결과는 도 44a 에 나타난다.
도 44a의 결과에서 알 수 있듯이, 접합체 144는 유전자 변형 쥐 생체 내에서 인간 APOC3 유전자의 발현에 대한 우수한 억제 활성을 나타낸다.
실험예 9-2 - 이 실험은 생체 내에서 혈액 지질의 양에 대한 접합체 144의 siRNA 접합체의 효과를 보여준다.
이 실험예에서, 인간 APOC3 유전자 이식 쥐 (B6; CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J, Jackson Lab 에서 구매) 생체 내에서 혈청 중 총 콜레스테롤(CHO)과 중성지방(TG)의 양에 대한 접합체 144의 siRNA 접합체의 효과를 조사하였다.
인간 APOC3 유전자 이식 쥐 (6-8 주령， TG 함량 > 2mmol/L) 를 무작위의 군으로 나눴다 (각 군에 7마리의 쥐): (1) NS 대조 군; (2) 접합체 144의 접합체에 대한 3 mg/kg 군; (3) 접합체 144의 접합체에 대한 1 mg/kg 군. 모든 동물의 약물 투여량은 체중에 따라 계산되었다. 각각 0.9 중량% NaCl 수용액 중 0.6 mg/ml 및 0.2 mg/ml로 siRNA 접합체에 대해 부피 5 ml/kg부피로 단일 용량을 피하 투여하였다.
각각 투여 전 (0일로 기록) 및 투여 후 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63, 77, 91, 112, 133, 147, 154, 161, 175 및189 에 눈확(orbits)에서 혈액 (약 100 μL)을 채취했고 혈청을 얻기 위해 원심분리하였다. 혈청에서 총 콜레스테롤(CHO)과 중성지방(TG)의 양은 PM1P000/3 전자동 혈청 생화학 분석기(SABA, Italy)를 사용해 추가적으로 측정된다. 혈액 지질의 결과를 정규화하고 정규화 된 혈액 지질 수준 및 혈액 지질 수준에 대한 억제율은 실험예 8-3에 따른다. 실험 결과는 도 44b 및 44c에 나타난다.
도 44b 및 44c에서 알 수 있듯이, 접합체 144는 189일 까지 마우스 혈청 중 TG 및 CHO 수준의 양에 대해 유의미한 하향-조절 효과를 나타내며, 인간 APOC3 유전자의 발현에 대한 장기간의 안정적이고 효율적인 억제를 나타낸다.
다른 실험에서, 접합체 170이 투여되고, 각 투여량은 0.1, 0.3, 1, 3 및 9 mg/kg (동일한 투여 부피이며 용액에서 접합체의 농도가 각각 조절된다)이며; 투여 후 112일 까지 데이터가 수집되는 것을 제외하고 상기와 동일한 방법이 사용된다. 결과는 도 45a 및 45b에 나타난다.
도 45a 및 45b 의 결과에서 알 수 있듯이, 접합체 170이 유전자 조작 쥐 생체 내에서 112일 까지 지속적으로 혈액 지질 및 ANGPTL3 mRNA 수준을 지속적으로 감소시키며, 감소는 유의미한 용량 의존성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
다른 실험에서, 쥐의 혈청에서 총 콜레스테롤(CHO)과 중성지방(TG)의 양을 측정하기 위해 접합체 144, 170 및 171 뿐만 아니라 비교 접합체 17가 투여되고, 각 투여량은 1mg/kg 및 3 mg/kg (동일한 투여 부피이며 용액에서 접합체의 농도가 각각 조절된다)이며; 투여 후 112일 까지 데이터가 수집되는 것을 제외하고 상기와 동일한 방법이 사용된다. 결과는 도 46a-46d에 나타난다.
도 46a 내지 46d의 결과에서 알 수 있듯이, 접합체 144, 170 및 171가 최대 112 일 동안 유전자 변성 쥐의 혈액 지질의 지속적인 감소를 나타내고, 감소 지속 효과가 비교 접합체 17에 비해 전반적으로 우수하다는 것을 알 수 있다.
본원에 개시된 실시태양은 상기와 같이 상세하게 설명되나, 본원 개시는 상기-설명된 실시태양의 특정 세부사항에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 기술적 해결책의 다양한 단순 변형이 본 발명의 기술 개념의 범위에서 이루어질 수 있으며, 이러한 단순한 변형은 본 발명의 범위에 속한다.
각 상기 실시 태양에 기재된 특정한 기술적 특징들은 모순이 발생하지 않는 한 임의의 적절한 방법과 결합될 수 있음에 유의해야 한다. 불필요한 반복을 피하기 위해, 가능한 다양한 조합 방식은 더 이상 본원에 기재되지 않는다.
또한, 본원에 개시된 실시태양과 상이한 다양한 실시태양은 본원의 사상에 위반되지 않는 한 또한 임의의 조합으로 수행될 수 있으며, 또한 이는 본원 개시에 개시된 것으로 간주되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Suzhou Ribo Life Science Co.,Ltd. <120> CONJUGATES AND PREPARATION AND USE THEREOF <130> DP1P182407ZX <150> CN201711479058.9 <151> 2017-12-29 <150> CN201811165363.5 <151> 2018-09-30 <160> 251 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sense sequence for siHBa1 <400> 1 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for siHBa1 <400> 2 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for siHBa2 <400> 3 gaccuugagg cauacuucaa a 21 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for siHBa2 <400> 4 uuugaaguau gccucaaggu cgg 23 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for siHBa1M1 <400> 5 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for siHBa1M1 <400> 6 uuugaaguau 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L10-siAN1M5S <400> 176 ccaagagcac caagaacua 19 <210> 177 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siAN1M5S <400> 177 uaguucuugg ugcucuuggc u 21 <210> 178 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siAN1M5SP <400> 178 uaguucuugg ugcucuuggc u 21 <210> 179 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siAP1M1P <400> 179 uucuugucca gcuuuauugg g 21 <210> 180 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siAP2M1P <400> 180 uucuugucca gcuuuauugg gag 23 <210> 181 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siAP1M2P <400> 181 uucuugucca gcuuuauugg g 21 <210> 182 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siAP2M2P <400> 182 uucuugucca gcuuuauugg gag 23 <210> 183 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siAP1M1SP <400> 183 uucuugucca gcuuuauugg g 21 <210> 184 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siAP2M1SP <400> 184 uucuugucca gcuuuauugg gag 23 <210> 185 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siAP1M2SP <400> 185 uucuugucca gcuuuauugg g 21 <210> 186 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siAP2M2SP <400> 186 uucuugucca gcuuuauugg gag 23 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> upstream primer for mTTR <400> 187 ccgtctgtgc cttctcatct 20 <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> downstream primer for mTTR <400> 188 taatctcctc ccccaactcc 20 <210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> upstream primer for GAPDH <400> 189 agaaggctgg ggctcatttg 20 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> downstream primer for GAPDH <400> 190 aggggccatc cacagtcttc 20 <210> 191 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> upstream primer for ┑-actin <400> 191 agcttctttg cagctccttc gttg 24 <210> 192 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> downstream primer for ┑-actin <400> 192 ttctgaccca ttcccaccat caca 24 <210> 193 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> upstream primer for HBV <400> 193 cgtttctcct ggctcagttt a 21 <210> 194 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> downstream primer for HBV <400> 194 cagcggtaaa aagggactca a 21 <210> 195 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for AD-65695 <400> 195 acauauuuga ucagucuuuu u 21 <210> 196 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for AD-65695 <400> 196 aaaaagacug aucaaauaug uug 23 <210> 197 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for AD-69535 <400> 197 gcuuaaaagg gacaguauuc a 21 <210> 198 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for AD-69535 <400> 198 ugaauacugu cccuuuuaag caa 23 <210> 199 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> upstream primer for mouse ANGPTL3 <400> 199 gaggagcagc taaccaactt aat 23 <210> 200 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> downstream primer for mouse ANGPTL3 <400> 200 tctgcatgtg ctgttgactt aat 23 <210> 201 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> upstream primer for mouse GAPDH <400> 201 aactttggca ttgtggaagg gctc 24 <210> 202 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> downstream primer for mouse GAPDH <400> 202 tggaagagtg ggagttgctg ttga 24 <210> 203 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for W8-siAN1M3SPs <400> 203 uaguucuugg ugcucuuggc u 21 <210> 204 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for L10-simTTR <400> 204 aacaguguuc uugcucuaua a 21 <210> 205 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-simTTR <400> 205 uuauagagca agaacacugu uuu 23 <210> 206 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for L10-siHBa1M2Sps <400> 206 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 207 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siHBa1M2Sps <400> 207 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 208 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for L10- siHBa1M2Sp <400> 208 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 209 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10- siHBa1M2Sp <400> 209 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 210 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for L10-siHBa1M1Sp <400> 210 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 211 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siHBa1M1Sp <400> 211 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 212 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for L10- siHBa1M1SpsT <400> 212 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 213 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10- siHBa1M1SpsT <400> 213 uugaaguaug ccucaagguu 20 <210> 214 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for L10-siHBa1M1Sps <400> 214 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 215 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siHBa1M1Sps <400> 215 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 216 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for P10-siHBa1M2SP <400> 216 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 217 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for P10-siHBa1M2SP <400> 217 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 218 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for W8-siHBa1M2SP <400> 218 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 219 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for W8-siHBa1M2SP <400> 219 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 220 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for Z5-siHBa1M2SP <400> 220 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 221 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for Z5-siHBa1M2SP <400> 221 uuugaaguau gccucaaggu u 21 <210> 222 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for L10-siP1M1Sp <400> 222 gaaaguaugu caacgaaua 19 <210> 223 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siP1M1Sp <400> 223 uauucguuga cauacuuucu u 21 <210> 224 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for L10-siP1M1SP <400> 224 gaaaguaugu caacgaaua 19 <210> 225 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siP1M1SP <400> 225 uauucguuga cauacuuucu u 21 <210> 226 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for L10-siAN2M1Sp <400> 226 agccaagagc accaagaacu a 21 <210> 227 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siAN2M1Sp <400> 227 uaguucuugg ugcucuuggc uug 23 <210> 228 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for L10-siAP1M1Sp <400> 228 caauaaagcu ggacaagaa 19 <210> 229 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siAP1M1Sp <400> 229 uucuugucca gcuuuauugg g 21 <210> 230 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for L10-siAP1M1Sps <400> 230 caauaaagcu ggacaagaa 19 <210> 231 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for L10-siAP1M1Sps <400> 231 uucuugucca gcuuuauugg g 21 <210> 232 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for K4-simTTR <400> 232 caauaaagcu ggacaagaa 19 <210> 233 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for K4-simTTR <400> 233 uucuugucca gcuuuauugg g 21 <210> 234 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for AD-66810 <400> 234 caauaaagcu ggacaagaa 19 <210> 235 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for AD-66810 <400> 235 uucuugucca gcuuuauugg g 21 <210> 236 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for X2M2 <400> 236 ccuugaggca uacuucaaat t 21 <210> 237 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for X2M2 <400> 237 uuugaaguau gccucaaggt t 21 <210> 238 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> upstream primer for HBV <400> 238 gtcttttggg ttttgctgcc 20 <210> 239 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> downstream primer for HBV <400> 239 gcaacggggt aaaggttcag 20 <210> 240 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> upstream primer for ┑-actin <400> 240 ggtcggagtc aacggattt 19 <210> 241 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> downstream primer for ┑-actin <400> 241 ccagcatcgc cccacttga 19 <210> 242 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> upstream primer for monkey ANGPTL3 <400> 242 ctggtggtgg catgatgagt 20 <210> 243 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> downstream primer for monkey ANGPTL3 <400> 243 ctcttctccg ctctggctta g 21 <210> 244 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> upstream primer for monkey GAPDH <400> 244 gggagccaaa agggtcatca 20 <210> 245 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> downstream primer for monkey GAPDH <400> 245 cgtggactgt ggtcatgagt 20 <210> 246 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> upstream primer for mouse ┑-actin <400> 246 agcttctttg cagctccttc gttg 24 <210> 247 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> downstream primer for mouse ┑-actin <400> 247 ttctgaccca ttcccaccat caca 24 <210> 248 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> upstream primer for human APOC3 <400> 248 gtgaccgatg gcttcagttc 20 <210> 249 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> downstream primer for human APOC3 <400> 249 atggataggc aggtggactt 20 <210> 250 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sense sequence for comparative sequence 1 <400> 250 ccuugaggca uacuucaaa 19 <210> 251 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Antisense sequence for comparative sequence 1 <400> 251 uuugaaguau gccucaaggu u 21

Claims (114)

  1. 화학식 (321)로 표현되는 구조를 가진 화합물:

    화학식 (321)
    상기,
    n1은 1-2의 정수이고, n3은 0-1의 정수이고, n1+n2=2-3이며;
    m1, m2, 및m3 각각은 독립적으로 2-10의 정수이고;
    각 R10, R11, R12, R13, R14 및 R15는 독립적으로 H, C1-C10　알킬, C1-C10　할로알킬, 및 C1-C10　알콕시에서 선택되며;
    R4 는 활성 약물 또는 활성제에 공유결합을 통해 결합할 수 있는 부분이고;
    각 L1은 1 내지 70 개의 탄소 원자 길이의 선형 알킬렌이고, 상기 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10　알케닐렌, C2-C10　알키닐렌, C6-C10　아릴렌, C3-C18　헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10　헤테로아릴렌 으로 이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있으며, 상기 L1 은 선택적으로 C1-C10　알킬, C6-C10　아릴, C5-C10　헤테로아릴, C1-C10　할로알킬, ­OC1-C10　알킬, ­OC1-C10　알킬페닐, -C1-C10　알킬­OH, ­OC1-C10　할로알킬, ­SC1-C10　알킬, ­SC1-C10　알킬페닐, -C1-C10　알킬­SH, ­SC1-C10　할로알킬, 할로, ­OH, -SH, ­NH2, ­C1-C10　알킬­NH2, ­N(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬), ­NH(C1-C10　알킬), ­N(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬페닐), ­NH(C1-C10　알킬페닐), 시아노, 니트로, ­CO2H, ­C(O)OC1-C10　알킬, ­CON(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬), ­CONH(C1-C10　알킬), ­CONH2, ­NHC(O)(C1-C10　알킬), ­NHC(O)(페닐), ­N(C1-C10　알킬)C(O)(C1-C10　알킬), ­N(C1-C10　알킬)C(O)(페닐), ­C(O)C1-C10　알킬, ­C(O)C1-C10　알킬페닐, ­C(O)C1-C10　할로알킬, ­OC(O)C1-C10　알킬, -SO2(C1-C10　알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10　할로알킬), -SO2NH2, ­SO2NH(C1-C10　알킬), ­SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10　알킬), -NHSO2(페닐), 및 ­NHSO2(C1-C10　할로알킬) 로 이루어진 군의 하나 이상으로 치환될 수 있고;
    각 S1은 독립적으로 M1이고, 상기 활성 히드록실이 존재한다면 히드록실 보호기로 보호되고;
    각 M1은 독립적으로 세포 표면의 수용체에 결합할 수 있는 리간드 중에서 선택되며;
    상기 수용체는 인간 간세포상의 아시알로당단백질 수용체인 화합물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 각 L1은 독립적으로 A1-A26 군 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물:


    상기 각 j1은 독립적으로 1 -20의 정수이며;
    상기 각 j2은 독립적으로 1-20의 정수이며;
    각 R' 은 독립적으로 C1-C10 알킬이며;
    각 Ra 는 A27-A45 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다:


    각 Rb는 독립적으로 C1-C10 알킬이며;
    는 기가 나머지 분자구조에 부착되는 위치를 나타낸다.
  3. 제2항에 있어서, 상기 L1은 A1, A4, A5, A6, A8, A10, A11, A13군 및 이들의 연결 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 L1 의 길이는 3 내지 25 원자이고, 상기 L1 의 길이는 질소 함유 골격의 N 원자에 연결된 원자로부터 S1에 연결된 원자까지 형성된 가장 긴 원자 사슬 내에서 L1의 사슬-형성 원자의 수를 나타내는 화합물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 각 m1, m2 및 m3은 독립적으로 2-5의 정수이거나; m1= m2 = m3인 화합물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 각 M1은 D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노스, D-실로푸라노스, L-실로푸라노스, D-글루코스, L-글루코스, D-갈락토스, L-갈락토스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코사민, 시알산, 갈락토사민, N-아세틸 갈락토사민, N-트리플루오르아세틸갈락토사민, N-프로피닐 갈락토사민, N-n-부티릴 갈락토사민, N-이소부티릴 갈락토사민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카르복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노 -L-글루코피라노스, 4,6-디데옥시-4-포름아미도 -2,3-디-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜릴-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코피라노스, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노사이드, 4-티오-β-D-갈락토피라노스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코헵토피라노사이드, 2,5-안히드로-D-알로니트릴, 리보오스, D-리보오스, D-4-티오 리보오스, L-리보오스, 및 L-4-티오리보오스로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 화합물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 R4는 포스포디에스테르 결합을 통해 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있는 기인 화합물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 R4 는 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드상의 기와 반응하여 포스페이트 에스테르 결합을 형성할 수 있는 제 1 작용기를 포함하는 화합물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 R4 는 히드록시기 또는 아미노기와 공유 결합을 형성할 수 있거나, 히드록시기 또는 아미노기와 형성된 공유결합을 통해 분자의 나머지에 부착되는 고상 지지체인 제 2 작용기를 추가적으로 포함하는 화합물.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 제 1 작용기는 포스포르아미다이트, 히드록시 또는 보호된 히드록시인 화합물.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 제 2 작용기는 포스포르아미다이트기, 카르복실 또는 카복실레이트인 화합물.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 (403) 내지 (442)으로 나타나는 구조를 가지는 화합물:
    ,
    (403)
    ,
    (404)
    ,
    (405)
    ,
    (406)
    ,
    (407)
    ,
    (408)
    ,
    (409)
    ,
    (410)
    ,
    (411)
    ,
    (412)
    ,
    (413)
    ,
    (414)
    ,
    (415)
    ,
    (416)
    ,
    (417)
    ,
    (418)
    ,
    (419)
    ,
    (420)
    ,
    (421)
    ,
    (422)











    상기 X 는 O 또는 NH이고, M+ 는 양이온이며, Rk 는 히드록시 보호기이고, SPS 는 고상 지지체를 나타낸다.
  13. 제12항에 있어서, 상기 M+ 은 알칼리 금속 양이온, 암모늄 양이온, 3차 아민으로 부터 형성된 양이온, 또는 4차 암모늄 양이온이고, Rk 는 트리틸, 4-메톡시트리틸, 4,4'-디메톡시트리틸, 또는 4,4',4"-트리메톡시트리틸이며, SPS 는 수지를 나타내는 화합물.
  14. 화학식 (1)로 표현되는 구조를 가지는 접합체:

    화학식 (1),
    상기,
    n1은 1-2 의 정수이고, n3는 0-1 의 정수이고, n1+n2=2-3이며;
    각 m1, m2, 및 m3는 독립적으로 2-10 의 정수이고;
    각 R10, R11, R12, R13, R14 및 R15는 H, C1-C10　알킬, C1-C10　할로알킬, 및 C1-C10　알콕시로부터 독립적으로 선택되고;
    R3 는 활성 약물이고;
    R2 는 1내지 20개의 탄소 원자 길이의 선형 알킬렌이고, 상기 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10　알케닐렌, C2-C10　알키닐렌, C6-C10　아릴렌, C3-C18　헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10　헤테로아릴렌 으로 이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있고, 상기 R2 는 선택적으로 C1-C10　알킬, C6-C10　아릴, C5-C10　헤테로아릴, C1-C10　할로알킬, ­OC1-C10　알킬, ­OC1-C10　알킬페닐, -C1-C10　알킬­OH, ­OC1-C10　할로알킬, ­SC1-C10　알킬, ­SC1-C10　알킬페닐, -C1-C10　알킬­SH, ­SC1-C10　할로알킬, 할로, ­OH, -SH, ­NH2, ­C1-C10　알킬­NH2, ­N(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬), ­NH(C1-C10　알킬), ­N(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬페닐), ­NH(C1-C10　알킬페닐), 시아노, 니트로, ­CO2H, ­C(O)OC1-C10　알킬, ­CON(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬), ­CONH(C1-C10　알킬), ­CONH2, ­NHC(O)(C1-C10　알킬), ­NHC(O)(페닐), ­N(C1-C10　알킬)C(O)(C1-C10　알킬), ­N(C1-C10　알킬)C(O)(페닐), ­C(O)C1-C10　알킬, ­C(O)C1-C10　알킬페닐, ­C(O)C1-C10　할로알킬, ­OC(O)C1-C10　알킬, -SO2(C1-C10　알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10　할로알킬), -SO2NH2, ­SO2NH(C1-C10　알킬), ­SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10　알킬), -NHSO2(페닐), 및 ­NHSO2(C1-C10　할로알킬)로 이루어진 군의 하나 이상으로 치환될 수 있으며;
    각 L1 은 독립적으로 1 내지 70개의 탄소 원자 길이의 선형 알킬렌이고, 상기 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10　알케닐렌, C2-C10　알키닐렌, C6-C10　아릴렌, C3-C18　헤테로사이클릴렌, 및 C5-C10　헤테로아릴렌으로 이루어진 군의 하나 이상으로 대체될 수 있고, 상기 L1 은 선택적으로 C1-C10　알킬, C6-C10　아릴, C5-C10　헤테로아릴, C1-C10　할로알킬, ­OC1-C10　알킬, ­OC1-C10　알킬페닐, -C1-C10　알킬­OH, ­OC1-C10　할로알킬, ­SC1-C10　알킬, ­SC1-C10　알킬페닐, -C1-C10　알킬­SH, ­SC1-C10　할로알킬, 할로, ­OH, -SH, ­NH2, ­C1-C10　알킬­NH2, ­N(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬), ­NH(C1-C10　알킬), ­N(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬페닐), ­NH(C1-C10　알킬페닐), 시아노, 니트로, ­CO2H, ­C(O)OC1-C10　알킬, ­CON(C1-C10　알킬)(C1-C10　알킬), ­CONH(C1-C10　알킬), ­CONH2, ­NHC(O)(C1-C10　알킬), ­NHC(O)(페닐), ­N(C1-C10　알킬)C(O)(C1-C10　알킬), ­N(C1-C10　알킬)C(O)(페닐), ­C(O)C1-C10　알킬, ­C(O)C1-C10　알킬페닐, ­C(O)C1-C10　할로알킬, ­OC(O)C1-C10　알킬, -SO2(C1-C10　알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10　할로알킬), -SO2NH2, ­SO2NH(C1-C10　알킬), ­SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10　알킬), -NHSO2(페닐), 및 ­NHSO2(C1-C10　할로알킬)로 이루어진 군의 하나 이상으로 치환될 수 있고;
    각 M1 은 독립적으로 세포 표면의 수용체에 결합할 수 있는 리간드의 하나에서 선택되며,
    상기 수용체는 인간 간세포상의 아시알로당단백질 수용체인 접합체.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 각 L1은 A1-A26 군 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 접합체:


    상기 각 j1은 독립적으로 1-20의 정수이고;
    각 j2은독립적으로 1-20 의 정수이며;
    각 R'은 독립적으로 C1-C10 알킬이고;
    각 Ra은 A27-A45 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다:


    각 Rb는 독립적으로 C1-C10 알킬이고;
    는 기가 분자의 나머지에 부착되는 위치를 나타낸다.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 L1은 A1, A4, A5, A6, A8, A10, A11, A13 군 및 그들의 연결 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 접합체.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 L1의 길이는 3 내지 25 원자인 접합체.
  18. 제 14 항에 있어서, 상기 각 m1, m2 및 m3은 독립적으로 2-5의 정수이거나; m1= m2 = m3인 접합체.
  19. 제 14 항에 있어서, 상기 각 M1은 독립적으로 단당류, 이당류, 삼당류, 또는 다당류인 접합체.
  20. 제 14 항에 있어서, 상기 각 M1은 독립적으로 D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노스, D-실로푸라노스, L-실로푸라노스, D-글루코스, L-글루코스, D-갈락토스, L-갈락토스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코사민, 시알산, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-트리플루오르아세틸갈락토사민, N-프로피닐 갈락토사민, N-n-부티릴 갈락토사민, N-이소부티릴 갈락토사민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카르복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노스, 4,6-디데옥시-4-포름아미도-2,3-디-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜릴-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코피라노스, 메틸 2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노사이드, 4-티오-β-D-갈락토피라노스, 에틸 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코헵토피라노사이드, 2,5-안히드로-D-알로니트릴, 리보오스, D-리보오스, D-4-티오리보오스, L-리보오스, 및 L-4-티오리보오스로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 접합체.
  21. 제 14 항에 있어서, 상기 R3는 화학식 A59로 표현되는 구조를 가진 기인 접합체:

    (A59)
    상기, E1은 OH, SH 또는 BH2이고, Nu는 기능성 올리고뉴클레오티드이다.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 R2는 R3의 P 원자와 포스포에스테르 결합을 형성하는 접합체.
  23. 제 14항에 있어서, 상기 접합체는 화학식 (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21), 또는 (22)로 표현되는 구조를 가지는 접합체:

    화학식 (3)

    화학식 (4)

    화학식 (5)

    화학식 (6)

    화학식 (7)

    화학식 (8)

    화학식 (9)

    화학식 (10)

    화학식 (11)

    화학식 (12)

    화학식 (13)

    화학식 (14)

    화학식 (15)

    화학식 (16)

    화학식 (17)

    화학식 (18)

    화학식 (19)

    화학식 (20)

    화학식 (21)
    .
    화학식 (22)
  24. 제 21 항에 있어서, 상기 기능성 올리고뉴클레오티드는 소형 간섭RNA, 마이크로RNA, 항-마이크로RNA, 마이크로RNA 길항제, 마이크로RNA 모방제, 디코이 올리고뉴클레오티드, 면역 자극제, G-쿼드플렉스, 스플라이스 변경, 단일 가닥 RNA, 역배열 핵산, 핵산 앱타머, 스템-루프 RNA, mRNA 단편, 활성화 RNA, 또는 DNA로 이루어진 군에서 선택되는 접합체.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 기능성 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고, 화학식 A59의 상기 P원자는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 3' 말단부에 연결되거나; 상기 기능성 올리고뉴클레오티드는 정배열 가닥 및 역배열 가닥을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드이고, 상기 화학식 A59의 P원자는 상기 정배열가닥의 3' 말단부에 연결되는 접합체.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 siRNA이며, 상기 siRNA에서 각 뉴클레오티드는 독립적으로 변성 또는 비 변성 뉴클레오티드이고; siRNA는 정배열 가닥 및 역배열 가닥을 포함하고, 상기 정배열 가닥은 뉴클레오티드 서열 1을 포함하며, 역배열 가닥은 뉴클레오티드 서열 2를 포함하고, 두 서열 모두 19개의 뉴클레오티드 길이를 가지고, 이중-가닥 상보 영역을 형성하기 위해 적어도 부분적으로 역 상보적이며; 상기 뉴클레오티드 서열 2는 표적 mRNA에서 뉴클레오티드의 단편을 지칭하는 제 1 뉴클레오티드 서열 단편과 적어도 부분적으로 상보적이고; 상기 표적 mRNA는 간세포에서 이상 발현되는 유전자의 mRNA를 지칭하는 접합체.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 표적 mRNA는 ApoB, ApoC, ANGPTL3, PCSK9, SCD1, TIMP-1, Col1A1, FVII, STAT3, p53, HBV 또는 HCV에 상응하는 mRNA인 접합체.
  28. 제 26 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 1은 제 1 뉴클레오티드 서열 단편과 동일한 길이와 제 1 뉴클레오티드 서열 단편과 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 가지고; 상기 뉴클레오티드 서열 2는 뉴클레오티드 서열 B와 동일한 길이와 뉴클레오티드 서열 B와 3개 이하의 상이한 뉴클레오티드를 가지며, 상기 뉴클레오티드 서열 2는 제 1 뉴클레오티드 서열 단편과 완전히 역 상보적인 뉴클레오티드 서열을 지칭하는 접합체.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열 2 와 뉴클레오티드 서열 B 사이의 뉴클레오티드 차이는 뉴클레오티드 서열 2의 5' 말단부터 3' 말단까지에서 첫 번째 뉴클레오티드 Z'의 위치에서의 차이를 포함하는 접합체.
  30. 제 26 항에 있어서, 상기 정배열 가닥이 뉴클레오티드 서열 3을 추가적으로 포함하고, 역배열 가닥이 뉴클레오티드 서열 4를 추가적으로 포함하며; 뉴클레오티드 서열 3 및 4는 1-4개 뉴클레오티드의 동일한 길이를 가지며; 뉴클레오티드 서열 3은 뉴클레오티드 서열 1의 5'말단에 연결되고, 뉴클레오티드 서열 4는 뉴클레오티드 서열 2의 3'말단에 연결되며; 뉴클레오티드 서열 4 는 제 2 뉴클레오티드 서열 단편과 상보적이고; 제 2 뉴클레오티드 서열 단편은 표적 mRNA에서 제 1 뉴클레오티드 서열 단편에 인접한 뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 뉴클레오티드 서열 4와 동일한 길이를 가지며; 뉴클레오티드 서열 3은 뉴클레오티드 서열 4에 실질적으로 역 상보적, 또는 완전히 역 상보적인 접합체.
  31. 제 26 항에 있어서, 상기 siRNA는 1-3개 뉴클레오티드 길이를 갖고, 역배열 가닥의 3' 말단에 연결되어 역배열 가닥의 3' 돌출부(overhang)를 구성하는, 뉴클레오티드 서열 5를 추가적으로 포함하는 접합체.
  32. 제 26 항에 있어서, 상기 정배열 및 역배열 가닥의 각 뉴클레오티드는 독립적으로 플루오르 변성 뉴클레오티드 또는 비-플루오르 변성 뉴클레오티드이고, 상기 플루오르 변성 뉴클레오티드는 리보오스기의 2’-히드록시가 플루오르 기로 치환되어 형성되는 뉴클레오티드를 지칭하며; 상기 비-플루오르 변성 뉴클레오티드는 리보오스기의 2’-히드록시가 플루오르가 아닌 기로 치환되어 형성된 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체를 지칭하며, 상기 뉴클레오티드 유사체는, 아데닌 리보뉴클레오티드, 구아닌 리보뉴클레오티드, 시토신 리보뉴클레오티드, 우라실 리보뉴클레오티드 또는 티민 데옥시리보뉴클레오티드 중 임의의 하나와 상이한 구조를 갖지만 핵산에서 뉴클레오티드를 대체할 수 있는 기를 지칭하는 접합체.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 정배열 및 역배열 가닥 모두 플루오르 및 비-플루오르 변성 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 플루오르 변성 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 1 및 뉴클레오티드 서열 2에 존재하며, 5개 이하의 플루오르 변성 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 서열 1에 존재하며, 5’ 말단에서 3’ 말단의 방향에서, 뉴클레오티드 서열 1의 위치 7, 8 및 9의 뉴클레오티드는 플루오르 변성 뉴클레오티드이고; 7개 이하의 플루오르 변성 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 서열 2에 존재하며, 5’ 말단에서 3’ 말단의 방향에서, 뉴클레오티드 서열 2의 2, 6, 14 및 16 위치의 뉴클레오티드는 플루오르 변성 뉴클레오티드인 접합체.
  34. 제 32 항에 있어서, 상기 각 비-플루오르 변성 뉴클레오티드는 메톡시 변성 뉴클레오티드이고, 상기 메톡시 변성 뉴클레오티드는 리보오스기의 2’-히드록시가 메톡시 기로 치환되어 형성되는 뉴클레오티드를 지칭하는 접합체.
  35. 제 26 항에 있어서, 상기 siRNA에서, 하나 이상의 포스페이트 기는 포스포로티오에이트 기이며, 다음 위치의 하나 이상에 포스포로티오에이트 결합이 존재하는 접합체:
    정배열 가닥의 5’말단으로부터 제 1 뉴클레오티드와 제 2 뉴클레오티드 사이;
    정배열 가닥의 5’말단으로부터 제 2 뉴클레오티드와 제 3 뉴클레오티드 사이;
    정배열 가닥의 3’말단으로부터 제 1 뉴클레오티드와 제 2 뉴클레오티드 사이;
    정배열 가닥의 3’말단으로부터 제 2 뉴클레오티드와 제 3 뉴클레오티드 사이;
    역배열 가닥의 5’말단으로부터 제 1 뉴클레오티드와 제 2 뉴클레오티드 사이;
    역배열 가닥의 5’말단으로부터 제 2 뉴클레오티드와 제 3 뉴클레오티드 사이;
    역배열 가닥의 3’말단으로부터 제 1 뉴클레오티드와 제 2 뉴클레오티드 사이; 및
    역배열 가닥의 3’말단으로부터 제 2 뉴클레오티드와 제 3 뉴클레오티드 사이.
  36. 제 26 항에 있어서, 상기 역배열 가닥 5' 말단의 뉴클레오티드는 5'-포스페이트 뉴클레오티드 또는 5'-포스페이트 유사체 변성 뉴클레오티드인 접합체.
  37. 간세포에서 특정 유전자의 발현으로 발생하는 병리학적 상태 또는 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 제 14항에 따른 접합체.
  38. 제 37항에 있어서, 상기 특정 유전자는 간염 B 바이러스 유전자, 안지오포이에틴 유사 단백질 3 유전자, 및 아포지질단백질 C3 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 접합체.
  39. 제 37항에 있어서, 상기 질병이 만성 간 질환, 간염, 간 섬유증, 간 증식성 질환, 및 이상 지질 혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 접합체.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 이상 지질 혈증은 고콜레스테롤혈증, 고중성지질혈증, 또는 죽상동맥경화증인 접합체.
  41. 제 14항에 따른 접합체를 시험관내에서 간세포에 접촉시키는 단계를 포함하고, 간세포에서 특정 유전자의 발현을 억제하는 시험관내 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 특정 유전자는 ApoB, ApoC, ANGPTL3, PCSK9, SCD1, TIMP-1, Col1A1, FVII, STAT3, p53, HBV 또는 HCV인 시험관내 방법.
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