KR102567147B1 - 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 kra16-334m70 균주 - Google Patents
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- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/28—Streptomyces
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P13/00—Herbicides; Algicides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Abstract
본 발명은 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주에 관한 것으로, 상기 돌연변이주 KRA16-334M70 균주는 야생형 균주에 비해 제초 활성 물질의 수율이 증가되어 이를 이용하여 잡초 방제를 효과적으로 수행할 수 있다.
Description
본 발명은 잡초 방제 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주에 관한 것이다.
잡초 혹은 잡풀은 절대적인 것이 아니고 상대적인 개념으로 인간이 농경생활을 시작하면서 발생한 것으로 때와 장소에 적절하지 않은 식물을 말한다. 잡초는 작물재배에서 광, 양분, 수분 등의 경합 및 탈취하여 생산성과 상품성을 크게 저하시키거나 병해충의 매개, 농작업을 곤란하게 하는 주요 방제 대상이다. 잡초는 장소, 계절, 환경 등에 상관없이 연중 발생하며, 방제에 많은 노력과 비용이 소요된다. 또한, 잡초는 많은 종류가 있고 다양하기 때문에 식물분류학적 분류, 형태학적 분류에 따라 화본과 잡초, 광엽 잡초 및 방동사니과 잡초로 구분하며, 생활형에 따라 일년생잡초, 월년생잡초 및 다년생잡초로 나누고 있다. 그러므로 일반적으로 잡초는 화본과 일년생잡초·다년생잡초, 광엽 일년생잡초·다년생잡초 그리고 방동사니과 일년생잡초·다년생잡초 등으로 분류하거나, 반대로 일년생 화본과 잡초, 광엽 잡초, 방동사니과 잡초 또는 다년생 화본과 잡초, 광엽 잡초, 방동사니과 잡초로 구분한다.
화본과(grasses) 잡초의 줄기에는 잘 구분될 수 있는 마디와 마디 사이가 있고, 잎은 마디로부터 어긋나기로 나 있으며 잎은 줄기를 둘러싸서 보호하는 잎집(leaf sheath)과 잎몸(leaf blade)으로 나누어지는데 잎몸은 좁고 기다란 모양으로 잎맥(leaf vein)이 평행하게 형성된 것이 특징이다. 피, 바랭이, 뚝새풀, 강아지풀, 갈대, 억새 등이 이에 속한다. 방동사니과(sedges)에 속하는 잡초들은 화본과와 비슷한 점이 있으나 대부분 줄기 횡단면이 삼각형 모양이며 잎혀나 잎귀가 없다는 점으로 구분이 된다. 잎은 좁고 능선이 있으며 끝이 뾰족하고 소수에 작은 꽃이 달린다. 방동사니, 너도방동사니, 올방개, 매자기, 올챙이고랭이 등이 속한다. 광엽(broad leaves) 잡초란 화본과 잡초나 방동사니과 잡초에 속하지 않는 식물로서 말 그대로 잎이 비교적 넓은 잡초이다. 잎은 주로 타원형, 난형, 피침형이며 엽맥이 그물처럼 얽혀 있는 것이 특징이다. 우리 주변에서 흔히 발생하는 망초, 토끼풀, 쑥, 냉이, 비름, 물달개비, 가래, 가막사리 등 많은 잡초가 이 범주에 속한다.
현재 잡초 방제를 위하여 저렴한 비용으로 높은 제초 활성을 나타내는 여러 가지 유기합성 제초제를 사용하고 있으나, 저항성 잡초 출현, 환경에 대한 유해성 및 잔류 독성이 문제로 지적되고 있다. 특히 유기합성 제초제의 장기 사용으로 인한 저항성 잡초의 출현은 심각한 사회경제적 문제로까지 인식되고 있다(Riches 등 1996).
유기합성 제초제의 강한 독성, 토양 내 잔류 및 저항성 품종 출현과 같은 문제점을 극복하고 이를 대체하고자 새로운 작용기작과 새로운 구조의 제초 활성 물질을 미생물 대사산물로부터 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이미 아니소마이신(anisomycin), 비알라포스(bialaphos), 사이클로헥시미드(cycloheximide), 허비마이신(herbimycin), 토요카마이신(toyocamycin) 등의 제초 활성 물질이 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 방선균으로부터 발견되었다. 그러나 방선균과 같이 균사를 형성하는 미생물은 그 독특한 형태(morphology)와 이차대사의 까다로운 생리(physiology)로 인해 생물반응기의 설계 및 발효공정 최적화에 많은 어려움이 있으며, 특히 이차대사산물의 낮은 생산성 등의 경제적 문제점으로 산업화에 어려움을 겪고 있다.
방선균 2차 대사산물의 생산성은 균주 개량을 포함한 배양 조건 최적화를 통해 향상될 수 있는, 고생산성 균주 개발 및 발효공정 기술은 농업 생물 산업의 노하우 및 경제성을 결정하는 가장 중요한 기술로 인식된다. 방선균 2차 대사산물의 수율을 증가시키기 위한 균주개량 기술로는 돌연변이 유발이 가장 신뢰할 수 있고 널리 사용되는 방법 중 하나이다. 돌연변이 유발을 위한 물리적 방법으로 UV 광선, X선, γ선, 레이저, 중성자 및 화학영동 등이 사용되고 있으며 화학적 돌연변이 유발을 위해 메틸 메탄 설포네이트(MMS), 하이드록실아민(HA) 및 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG) 등의 약품을 사용하고 있다. 이중 광범위한 스펙트럼의 돌연변이를 얻을 수 있는 물리적 방법은 자외선(UV) 조사를 통한 것으로 화학적 돌연변이 유발에 비해 안전할 뿐만 아니라 무작위 돌연변이 유발 및 발효 스크리닝을 통해 산업용 미생물 균주로부터 향상된 2차 대사산물 생산을 얻을 수 있다.
이에, 본 발명자들은 천연물 유래 제초제를 위해 개발된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주 KRA16-334(등록특허 제10-2010471호, 제10-2032913호)로부터 얻어지는 제초 활성 물질 334-HP50-W4(TMC-86A)의 생산성 향상을 위해 상기 KRA16-334 균주에 돌연변이 유발을 통한 균주 개량을 수행하고 우수한 생산성을 나타내는 배양 조건을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 잡초 방제 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속 KRA16-334M70 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 제초 활성 물질 334-HP50-W4(TMC-86A)의 생산성이 향상된 스트렙토마이세스 속 KRA16-334M70 균주를 제공하는데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA16-334M70 균주(KCTC15096BP)를 제공한다.
상기 균주 또는 이의 배양액은 잡초 방제 활성을 가질 수 있다.
상기 균주는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주 KRA16-334(KCTC13357BP)에 비해 제초 활성 물질의 수율이 증가하는 것 일 수 있다.
상기 제초 활성 물질은 하기 화학식 1로 표시되는 물질 또는 허보옥시디엔(herboxidiene)을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
상기 균주 또는 이의 배양액은 화본과 잡초 또는 광엽 잡초에 대한 방제 활성을 가질 수 있다.
상기 균주 또는 이의 배양액은 화본과 잡초로서 수수(Sorghum bicolor), 돌피(Echinochloa crus-galli), 바랭이(Digitaria sanguinalis), 개밀(Agropyron smithii) 및 미국개기장(Panicum dichotomiflorum)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 식물에 대한 잡초 방제 활성을 가질 수 있다.
상기 균주 또는 이의 배양액은 광엽 잡초로서 까마중(Solanum nigrum), 자귀풀(Aeschynomene indica), 어저귀(Abutilon avicennae), 도꼬마리(Xanthium strumarium) 및 메꽃(Calystegia japonica)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 식물에 대한 잡초 방제 활성을 가질 수 있다.
상기 균주는 온도 17 내지 30℃에서 배양될 수 있다.
상기 균주는 교반 속도 100 내지 250rpm에서 배양될 수 있다.
상기 균주는 pH 5.5 내지 10에서 배양될 수 있다.
본 발명에 따르면, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA16-334M70 균주는 야생형 균주에 비해 제초 활성 물질의 수율이 증가된 것으로, 이를 이용하여 잡초 방제를 효과적으로 수행할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70를 위해 사용된 자외선 돌연변이 방법 및 조건을 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주가 생산하는 제초 활성 물질 334-HP100-M의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석 결과이고, 도 2b는 상기 제초 활성 물질 334-HP100-M의 정량분석 그래프를 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주가 생산하는 제초 활성 물질 334-HP50-W4의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석 결과이고, 도 3b는 상기 제초 활성 물질 334-HP50-W4의 정량분석 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이 후보 균주들의 제초 활성을 평가한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이 후보 균주들이 생산하는 제초 활성 물질의 수율을 비교한 것이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주의 배양 온도에 따른 제초 활성 물질을 수율을 나타낸 그래프이고, 도 6b는 상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70의 배양 온도에 따른 제초 활성을 평가한 사진이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주의 교반 속도에 따른 제초 활성 물질을 수율을 나타낸 그래프이고, 도 7b는 상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70의 교반 속도에 따른 제초 활성을 평가한 사진이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주의 배양 배지 초기 pH에 따른 제초 활성 물질을 수율을 나타낸 그래프이고, 도 8b는 상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70의 배양 배지 초기 pH에 따른 제초 활성을 평가한 사진이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주가 생산하는 제초 활성 물질 334-HP100-M의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석 결과이고, 도 2b는 상기 제초 활성 물질 334-HP100-M의 정량분석 그래프를 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주가 생산하는 제초 활성 물질 334-HP50-W4의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석 결과이고, 도 3b는 상기 제초 활성 물질 334-HP50-W4의 정량분석 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이 후보 균주들의 제초 활성을 평가한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이 후보 균주들이 생산하는 제초 활성 물질의 수율을 비교한 것이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주의 배양 온도에 따른 제초 활성 물질을 수율을 나타낸 그래프이고, 도 6b는 상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70의 배양 온도에 따른 제초 활성을 평가한 사진이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주의 교반 속도에 따른 제초 활성 물질을 수율을 나타낸 그래프이고, 도 7b는 상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70의 교반 속도에 따른 제초 활성을 평가한 사진이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주의 배양 배지 초기 pH에 따른 제초 활성 물질을 수율을 나타낸 그래프이고, 도 8b는 상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70의 배양 배지 초기 pH에 따른 제초 활성을 평가한 사진이다.
본 발명을 상세하기 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 무조건 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 발명자가 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해서 각종 용어의 개념을 적절하게 정의하여 사용할 수 있고, 더 나아가 이들 용어나 단어는 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 알아야 한다.
즉, 본 명세서에서 사용된 용어는 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기 위해서 사용되는 것일 뿐이고, 본 발명의 내용을 구체적으로 한정하려는 의도로 사용된 것이 아니며, 이들 용어는 본 발명의 여러 가지 가능성을 고려하여 정의된 용어임을 알아야 한다.
또한, 본 명세서에 있어서, 단수의 표현은 문맥상 명확하게 다른 의미로 지시하지 않는 이상, 복수의 표현을 포함할 수 있으며, 유사하게 복수로 표현되어 있다고 하더라도 단수의 의미를 포함할 수 있음을 알아야 한다.
본 명세서의 전체에 걸쳐서 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소를 "포함"한다고 기재하는 경우에는, 특별히 반대되는 의미의 기재가 없는 한 임의의 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 임의의 다른 구성 요소를 더 포함할 수도 있다는 것을 의미할 수 있다.
또한, 이하에서, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 구성, 예를 들어, 종래 기술을 포함하는 공지기술에 대한 상세한 설명은 생략될 수도 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.
본 발명은 기탁번호 KCTC15096BP로 기탁된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA16-334M70 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주[이하, ' KRA16-334M70 균주', '균주 KRA16-334M70', '균주 M70' 또는 '돌연변이주 M70' 이라고 함]는 충남 보령군 풍산리 일대 산림 토양으로부터 분리 배양을 통해 동정된 트렙토마이세스 드로즈도윅치이(Streptomyces drozdowiczii) KRA16-334 균주(수탁번호 KCTC 13357BP)에 돌연변이를 유발하여 균주 개량을 한 것이다.
본 발명자들은 상기 신규한 균주를 스트렙토마이세스 속 KRA16-334M70 (Streptomyces sp. KRA16-334M70) 균주로 명명하여 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2022년 09월 22일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 15096BP를 부여받았다.
상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70 균주 또는 이의 배양액은 잡초 방제 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 배양액은 미생물 균주를 배지에서 배양한 결과물로서 미생물의 대사산물을 포함할 수 있다. 상기 배양액은 균주를 배양한 액체 배지일 수 있으나 이에 제한되지 않으며 통상의 미생물 배양 배지에 균주를 배양한 것 일 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양한 배양액 또는 상기 배양액을 물리적으로 여과한 배양여액일 수 있으며, 상기 배양액은 희석하지 않거나 희석하여 잡초에 처리할 수 있다. 상기 배양액은 잡초에 제초 활성을 나타내는 한, 여과, 농축, 희석 등의 처리 과정을 거쳐 잡초에 처리될 수 있다.
상기 잡초 방제 활성은 잎의 황변, 마름병 등의 심각한 손상으로 식물 성장을 감소시키거나 고사에 이르게 하는 것으로, 본 발명에서 제초 활성 또는 살초 활성과 같은 의미로 사용되었다.
상기 돌연변이주 KRA16-334M70 균주는 이의 야생형 균주인 KRA16-334(KCTC13357BP)에 비해 제초 활성 물질의 수율이 증가한 것 일 수 있고, 상기 수율은 2배 이상 또는 3배 이상으로 증가한 것 일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 야생형 균주인 KRA16-334의 제초 활성 물질의 수율을 높이기 위하여 스트렙토마이세스 드로즈도윅치이 KRA16-334 야생형 균주에 1차적으로 자외선을 조사하여 돌연변이를 유발하고, 2차적으로 화학적 물질을 처리하여 돌연변이를 유발하였고, 돌연변이 후보 균주 중 제초 활성 및 제초 활성 물질의 수율을 가장 높게 나타내는 균주를 선발하였다. 그 결과 돌연변이주 M70은 제초 활성에서 대조군 대비 10배 이상의 향상을 나타내었고(도 4), 제초 활성 물질 334-W4의 수율에서 야생형 대비 약 4배의 수율 증가를 나타내었다(도 5).
상기 제초 활성 물질은 하기 화학식 1로 표시되는 물질 또는 허보옥시디엔(herboxidiene)을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
상기 야생형 균주인 KRA16-334의 제초 활성 물질은 화학식 1로 표시되는 물질[334-HP50-W4, 334-W4 또는 TMC-86A] 또는 허보옥시디엔(herboxidiene)[334-HP100-M 또는 334-M100]이며, 이는 선행문헌인 등록특허 제10-2032913호에 기재되어 있다. 또한, 본 발명의 도 2a-2b, 도 3a-3b와 같이, 돌연변이주 KRA16-334M70 균주가 상기 제초 활성 물질을 생산함을 확인하였다.
상기 잡초는 화본과 잡초, 광엽 잡초 또는 방동사니과 잡초일 수 있다. 구체적으로, 화본과 잡초는 수수(Sorghum bicolor), 돌피(Echinochloa crusgalli), 바랭이(Digitaria ciliaris), 미국개기장(Panicum dichotomiflorum), 개밀(Elymus tsukushiensis var. transiens), 피(Echinochloa utilis), 뚝새풀(Alopecurus aequalis var. amurensis), 강아지풀(Setaria viridis), 갈대(Phragmites australis) 및 억새(Miscanthus sinensis)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 광엽 잡초는 까마중(Solanum nigrum), 자귀풀(Aeschynomene indica), 어저귀(Abutilon theophrasti), 도꼬마리(Xanthium strumarium), 메꽃(Calystegia sepium var. japonica), 망초(Conyza canadensis), 토끼풀(Trifolium repens), 쑥(Artemisia princeps), 냉이(Capsella bursapastoris), 비름(Amaranthus tricolor), 물달개비(Monochoria vaginalis), 가래(Potamogeton distinctus) 및 가막사리(Bidens tripartita)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 방동사니과 잡초는 방동사니(Cyperus amuricus), 너도방동사니(Cyperus serotinus), 올방개(Eleocharis kuroguwai), 매자기(Scirpus maritimus) 및 올챙이고랭이(Scirpus juncoides var. hotarui)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 물질은 상기 열거된 화본과 잡초, 광엽 잡초 또는 방동사니과 잡초에 대해 잡초 방제 활성이 있으므로(등록특허 제10-2032913호에 기재됨), 화학식 1로 표시되는 물질의 생산 수율이 향상된 돌연변이주 KRA16-334M70 균주는 상기 열거된 화본과 잡초, 광엽 잡초 또는 방동사니과 잡초에 대해 잡초 방제 활성이 있다.
상기 돌연변이주 KRA16-334M70 균주는 온도 17 내지 30℃에서 배양될 수 있고, 온도 20 내지 30℃에서 배양되는 것이 더욱 바람직하며, 온도 20 내지 27℃에서 배양되는 것이 가장 바람직하다. 도 6a를 참조하면, 334-W4의 생산량이 가장 높았으며 30℃ 온도에서 급격히 저하되는 것으로 확인되었다.
상기 돌연변이주 KRA16-334M70 균주는 교반 속도 100 내지 250rpm에서 배양될 수 있고, 교반 속도 150 내지 250rpm에서 배양되는 것이 바람직하며, 교반 속도 200 내지 250rpm에서 배양되는 것이 가장 바람직하다. 도 7a를 참조하면, 334-W4의 경우 100~150rpm에서 제초 활성 물질의 수율이 급격히 증가하고 150rpm 이상에서도 교반속도가 증가할수록 함량이 증가하여 교반속도 200~250rpm으로 배양 시 제초 활성 물질 334-W4를 효과적으로 얻을 수 있었다.
상기 돌연변이주 KRA16-334M70 균주는 pH 5.5 내지 10에서 배양될 수 있고, pH 7 내지 10에서 배양되는 것이 바람직하며, pH 8 내지 9에서 배양되는 것이 가장 바람직하다. 도 8a를 참조하면, pH 7~10에서 배양한 경우 제초 활성 물질 334-W4의 수율이 높게 나타났고, pH 8.5를 포함한 pH 8.5 전후의 약 알칼리 조건에서 제초 활성 물질 334-W4의 수율이 가장 높은 것으로 나타났다.
상기 돌연변이주 KRA16-334M70 균주 또는 이의 배양액은 잡초 방제를 위하여 잡초의 전부 또는 일부, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리할 수 있다. 상기 처리는 잡초의 경엽처리하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
실시예
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
재료 및 방법
1. 자외선에 의한 돌연변이 유발
스트렙토마이세스 드로즈도윅치이 KRA16-334 균주(기탁번호: KCTC13357BP) 포자현탁액(107 colony/ml)을 멸균증류수를 이용하여 희석(10-3)한 후 방선균 배양용 한천배지에 도말하고 암 조건에서 일정 시간 동안 UV(254nm)를 조사한 후 콜로니 형성률 1%의 조건을 탐색하기 위하여 시간별로 콜로니 개수를 조사하였다(도 1).
야생형 KRA16-334 균주의 경우 무처리 대조군의 콜로니 수는 평균 1250개 이고, 상기 야생형 균주에 대해 17cm 높이에서 45초간 UV 조사하여 형성된 돌연변이 콜로니 수는 평균 13.8개로, 무처리 대조구와 비교 시 1.1%의 콜로니를 형성하였다(표 1). 이후 자외선에 의한 돌연변이 유발은 도 1의 조건을 사용하고 자외선 조사 시간을 45분으로 하여 수행하였다.
또한, 균주개량을 통해 선발된 각 콜로니들을 액체 배양용 배지(M3; Soytone 1%, Starch 2%, Glucose 1%, CaCO3 0.3%, FeSO4 0.02% /L)에 각각 접종하여 27℃, 150 rpm으로 7일간 진탕 배양한 후 배양여액을 사용하여 살초 활성 평가 및 HPLC 정량분석을 실시하였다. 각 배양액의 살초 활성 평가는 바랭이에 배양여액을 50배 희석하여 분무 살포하고 7일 후 달관조사를 통해 활성을 평가하였으며, 살초활성 평가 결과 활성이 우수한 돌연변이는 HPLC를 사용하여 활성물질의 수율을 정량분석한 후 가장 활성이 우수한 돌연변이를 최종 선발하였다.
2. 화학적 돌연변이 유발
자외선에 의한 돌연변이를 통해 1차 선발한 돌연변이 균주 포자 현탁액(2x105 spore/ml)에 일정양의 NTG(N-methy-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG) 용액을 첨가하여 1시간 또는 3시간 배양한 후 배양시간, NTG의 처리농도 등 균 사멸율이 50~60%인 조건을 조사하여 돌연변이주 선발에 사용하였다. 또한 자외선에 의한 돌연변이를 통해 선발된 균주에 질산나트륨(sodium nitrate)을 첨가하고 동일한 방법으로 화학적 돌연변이를 유발시켰다.
3. 선발 돌연변이주의 배양조건 확립
활성물질 334-HP50-W4의 생산성 향상을 위해 선발한 돌연변이주의 최적 배양조건을 확립하기 위하여 M3 배지를 사용하여 배양온도, 교반속도, 배양액의 초기 pH를 각각 달리하여 배양한 후 배양액의 살초활성 및 활성물질의 수율을 분석하였다. 각 조건에서의 살초활성은 바랭이를 사용하여 달관조사를 통해 평가하였으며 물질의 수율변화는 HPLC 정량분석을 통해 조사하였다.
배양온도(15 ~ 35 ℃)에 따른 활성물질의 수율 변화를 알아보기 위해 500 ml 배플 플라스크(baffled flask)에 100ml의 M3 배지를 넣고 균주를 접종(1%) 한 후 150rpm, 초기 pH 7.7 조건으로 7일간 배양하였다. 배양액은 50배 희석하여 바랭이에 대한 살초활성을 비교 조사하였으며 HPLC 분석을 통해 활성물질 334-HP50-W4(TMC-86A)와 334-100M(herboxidien)의 수율을 측정하였다.
교반속도(50 ~ 250rpm)에 따른 활성물질의 수율변화는 27℃에서 위와 동일한 방법(교반속도 제외)으로 배양한 후 살초활성 및 수율을 조사하였다.
배지 초기 pH(pH 3 ~ pH 10)에 따른 활성물질의 수율변화는 27℃에서 위와 동일한 방법(초기 pH 제외)으로 배양한 후 살초활성 및 수율을 조사하였다.
4. HPLC 분석을 통한 개량균주의 유효 제초 활성물질 함량측정
KRA16-334M70 균주가 생산하는 유효 제초 활성 물질의 배양액 내 함량분석은 Waters 사의 atlantis T3 column (C18 column; 4.6X250mm)을 사용하여 각 용매조건으로 0.8㎖/min의 유속으로 전개하면서 210nm, 230nm로 활성물질의 피크를 확인하고 각 피크의 면적을 계산하였다.
활성물질 334-W4의 정량분석을 위한 전개용매는 aq. 30% MeOH을 사용하였고 334-M100의 경우 55~100% acetonitrile + 0.02% TFA를 사용하여 활성물질을 분리하였다. 각 활성물질의 경우 정제된 화합물을 이용하여 정량 그래프를 작성한 후 돌연변이 유발 및 배양조건 확립을 통해 확보되는 배양액 내의 물질의 함량을 HPLC 분석을 통해 확인하였으며 활성물질의 함량은 동일조건, 동일 정체시간(retention time)의 피크 면적을 수식화된 정량 그래프를 이용하여 추정하였다(도 2a-2b, 도 3a-3b).
결과
1. 자외선 돌연변이를 이용한 균주 개량
자외선 조사에 의한 균주 개량을 통해 선발된 182개의 돌연변이 균주 배양액의 살초 활성을 평가한 결과 18개 돌연변이 균주에서 야생형보다 살초 활성이 증가한 것이 확인되었다. 상기 18개 돌연변이 균주 처리 후 달관 조사 결과 일부를 도 4에 나타내었다.
상기 18개 돌연변이 균주 중 11개 돌연변이 균주에서 활성물질 334-W4의 함량이 야생형에 비해 크게 증가하였으며, 7개 돌연변이 균주에서 334-100M의 함량이 야생형에 비해 증가한 것으로 정량분석 결과 확인되었다(도 5).
활성물질 334-W4의 수율이 증가한 돌연변이 균주 중 가장 높은 수율을 보이는 균주 M70을 선발하고 리커버리(recovery) 방지를 통해 안정적으로 활성물질을 생산하는 것을 확인한 후 글리세롤(30%) 저장 용액을 사용하여 보관균주를 만들어 -70℃로 보관하면서 이후 실험에 접종원으로 사용하였다.
돌연변이주 M70은 활성물질 334-W4의 경우 야생형 보다 약 4배의 수율증가를 보였으며(도 5), 달관조사에 따른 살초활성 평가 시에는 대조군 대비 10배 이상의 살초활성을 보였다(도 4). 따라서 돌연변이주 M70가 가장 우수한 살초 활성 및 활성물질 함량 증가를 나타내어 이를 본 발명의 돌연변이주로 선발하였다.
2. 돌연변이주 M70의 배양조건 확립
선발된 돌연변이주 M70에 대하여 온도, 교반속도, 배양 배지의 초기 pH를 달리하여 활성물질의 수율변화를 확인한 결과는 다음과 같다.
(1) 배양온도에 따른 활성물질의 수율변화: 20~27℃ 배양조건에서 334-W4의 생산량이 가장 높았으며 30℃ 온도에서 급격히 저하되는 것으로 확인되었다. 따라서 활성물질 334-W4의 생산을 위한 M70의 최적 배양온도는 20~27℃로 나타났다.
(2) 교반속도에 따른 활성물질의 수율변화: 활성물질 334-100M와 334-W4 모두 100 rpm 이하 조건에서 생산되지 않으며 최소 100rpm 이상의 교반속도에서 물질을 생산하는 것이 확인되었다. 또한 334-100M은 150rpm 이상일 경우 교반 속도에 크게 영향을 받지 않으나 334-W4의 경우 100~150rpm에서 활성물질의 수율이 급격히 증가하고 150rpm 이상에서도 교반속도가 증가할수록 함량이 증가하는 것을 알 수 있었다. 두 개의 활성물질의 생산성을 비교분석한 결과 200~250rpm으로 배양 시 활성물질 334-W4를 효과적으로 생산할 수 있는 것으로 나타났다.
(3) 배양 배지의 초기 pH에 따른 활성물질의 수율변화: pH 7~10에서 배양한 경우 활성물질 334-W4의 수율이 높게 나타났고, pH 8.5를 포함한 pH 8.5 전후의 약 알칼리 조건에서 활성물질 334-W4의 수율이 가장 높은 것으로 나타났다.
따라서 돌연변이주 M70의 최적 배양조건은 20~27℃, 200~250rpm, 초기 pH 8.5의 조건으로 7일간 진탕 배양한 경우 가장 높은 수율의 활성물질을 획득할 수 있는 것으로 확인되었다.
지금까지 본 발명의 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 KRA16-334M70에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (10)
- 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA16-334M70 균주(KCTC15096BP).
- 제1항에 있어서,
상기 균주 또는 이의 배양액은 잡초 방제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는,
스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA16-334M70 균주(KCTC15096BP).
- 제1항에 있어서,
상기 균주는
스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주 KRA16-334(KCTC13357BP)에 비해 제초 활성 물질의 수율이 증가하는 것을 특징으로 하는,
스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA16-334M70 균주(KCTC15096BP).
- 제3항에 있어서,
상기 제초 활성 물질은
하기 화학식 1로 표시되는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는,
스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA16-334M70 균주(KCTC15096BP).
[화학식 1]
- 제1항에 있어서,
상기 균주 또는 이의 배양액은
화본과 잡초 또는 광엽 잡초에 대한 방제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는,
스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA16-334M70 균주(KCTC15096BP).
- 제1항에 있어서,
상기 균주 또는 이의 배양액은
화본과 잡초로서 수수(Sorghum bicolor), 돌피(Echinochloa crus-galli), 바랭이(Digitaria sanguinalis), 개밀(Agropyron smithii), 및 미국개기장(Panicum dichotomiflorum)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 식물에 대한 잡초 방제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는,
스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA16-334M70 균주(KCTC15096BP).
- 제1항에 있어서,
상기 균주 또는 이의 배양액은
광엽 잡초로서 까마중(Solanum nigrum), 자귀풀(Aeschynomene indica), 어저귀(Abutilon avicennae), 도꼬마리(Xanthium strumarium) 및 메꽃(Calystegia japonica)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 식물에 대한 잡초 방제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는,
스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA16-334M70 균주(KCTC15096BP).
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 온도 17 내지 30℃에서 배양되는 것을 특징으로 하는,
스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA16-334M70 균주(KCTC15096BP).
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 교반 속도 100 내지 250rpm에서 배양되는 것을 특징으로 하는,
스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA16-334M70 균주(KCTC15096BP).
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 pH 5.5 내지 10에서 배양되는 것을 특징으로 하는,
스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 KRA16-334M70 균주(KCTC15096BP).
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