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KR102483033B1 - 페길화된 리포솜 및 이의 용도 - Google Patents

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KR102483033B1
KR102483033B1 KR1020187034749A KR20187034749A KR102483033B1 KR 102483033 B1 KR102483033 B1 KR 102483033B1 KR 1020187034749 A KR1020187034749 A KR 1020187034749A KR 20187034749 A KR20187034749 A KR 20187034749A KR 102483033 B1 KR102483033 B1 KR 102483033B1
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South Korea
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pegylated
liposome
lipid
antigen
liposomes
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KR1020187034749A
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English (en)
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크리스토퍼 비. 폭스
수잔 에스. 린
데릭 카터
호벤 닐 반
마유레쉬 엠. 아바양카
윌리엄 에이. 주니어 페트리
Original Assignee
액세스 투 어드밴스드 헬스 인스티튜트
유니버시티 오브 버지니아 페이턴트 파운데이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 명세서에는 페길화된 리포솜 및 이의 제조 및 사용 방법이 제공된다. 페길화된 리포솜은 적어도 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 상기 페길화된 지질 중의 상기 PEG 구성성분의 평균 분자량은 약 5000달톤 이하이다. 페길화된 리포솜은 안정적이고, 면역 반응의 생성을 위한 작용제, 예를 들어, 백신, 치료 또는 진단 용도를 위한 작용제를 전달할 수 있다. 상기 페길화된 리포솜의 제조에 관련된 조성물 및 방법 및 면역 반응을 자극하기 위한 상기 페길화된 리포솜의 사용에 관련된 조성물 및 방법이 또한 제공된다.

Description

페길화된 리포솜 및 이의 용도
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 전문이 참고로 포함된, 2016년 5월 16일자로 출원된 미국 가출원 제62/337,328호의 우선권을 주장한다.
연방 후원 연구 또는 개발에 대한 진술
본 발명은 미국 보건 복지부의 질병 예방 대응 본부(Assistant Secretary for Preparedness and Response: ASPR) 내의 "생물의학 첨단 연구 개발국(Biomedical Advanced Research and Development Authority: BARDA)에 의해서 수여된 계약 번호 HHSO100201000039C 및 미국 보건 복지부 내의 국립 알레르기 감염 질환 연구소(National Institute of Allergy and Infectious Dieases)에 의해서 수여된 증서 번호 5R21AI109118 및 계약 번호 HHSN272200800045C 하에 정부 지원에 의해서 수행되었다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
리포솜-기반 전달 시스템은 생체분자, 예컨대, 약물 및 조영제를 위해서 개발되어 왔다. 이러한 리포솜은 연장된 순환 지속성과 같은 이점을 제공하여, 면역계에 대한 개선된 제시, 생체분자의 제어된 방출, 및 소수성 생체분자 또는 친수성 생체분자 둘 모두의 제형을 허용하는 다능성(versatility)으로 이어진다. 리포솜의 순환 반감기를 연장시키기 위해서 그것이 혈청 단백질 및 식세포와의 상호작용을 비롯한 정상 제거 기전으로부터 차단되는 것이 필요하다. 리포솜의 페길화(폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 함유하는 리포솜)를 비롯하여 면역계로부터의 리포솜의 차단을 개선시키기 위한 다수의 접근법이 개발되어 왔다. 대식세포로부터 리포솜을 차단하도록 설계된 PEG 및 다른 공중합체를 함유하는 리포솜은 관련 기술 분야에서 "스텔스(stealth) 리포솜"이라 지칭되어 왔다. 차단 특성에 더하여, 페길화는 연장된 저장 시에 리포솜의 용합을 배제하지 않고, 저지함으로써 리포솜 제제의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 이러한 융합을 회피하기 위해서, PEG 코로나는 리포솜 표면을 입체 방해적으로 차단하기에 충분히 두꺼운 층을 제공해야 한다.
PEG 분자량은 효과적인 표면 차단의 중요한 결정기인 것으로 전통적으로 간주되어 왔다. 저분자량 PEG로 코팅된 페길화된 리포솜은 차단에 효과적이지 않았다. 예를 들어, 750달톤의 PEG를 갖는 페길화된 리포솜을 비-페길화된 리포솜과 비교할 때, 어떠한 차이점도 존재하지 않았다(Mori et al., FEBS Lett, 1991). 연장된 혈액 순환 및 감소된 식세포 흡수는 PEG 분자량이 5000달톤을 초과하게 증가되었을 경우에만 단지 관찰되었다.
리포솜은 또한 소단위 단백질 백신 및 아주반트의 전달에 대해서 평가되어 왔다. 리포솜은 목적하는 지질 농도, 전하, 크기 및 항원 및 아주반트의 분포 또는 표적화를 달성하기 위해서 리포솜 조성물을 맞춤 조정하는 능력으로 인해서 매력적인 백신 전달 비히클이다. 음이온성, 양이온성, 및 중성 리포솜을 비롯한 다수의 리포솜-기반 시스템이 평가되어 왔지만, 모든 리포솜이 동등하게 생성되는 것은 아니다. 다수의 양이온성 지질 리포솜 제형은 독성이다. 다수의 중성 리포솜은 생체외에서 불안정적이고, 시간 경과에 따라서 크기가 성장하거나 제조 직 후에 떨어져 나간다. 음이온성 리포솜은 다양한 항원을 전달하고, 세포막과 융합하는 이의 능력에 영향을 주는 전하 제한을 갖는다. 다른 리포솜은 면역계 자체에 효과를 발휘할 수 있는 합성 지질 또는 블록 공중합체를 함유한다. 콜레스테롤-기반 리포솜 제형은, 콜레스테롤이 인간 세포막의 자연 구성성분이라는 점에서 이상적이고, 다른 보조-지질, 예컨대, DOTAP 및 DOPC과 조합되는 경우, 대략 0.3의 목적하는 다분산 지수를 갖는 대략 100 내지 200㎚의 안정적인 양이온성 나노입자를 형성한다. 페길화 전략을 비롯하여 백신 제형으로 사용하기 위해서 리포솜 제형을 개선시키기 위해서 다양한 전략이 사용되어 왔다. 지금까지, 공지된 리포솜의 안정성 및 독성과 연관된 문제를 극복하고, 면역 반응의 질을 효과적으로 개선시킬 수 있는 어떠한 명확한 제형도 개발되어 있지 않다(문헌[Carstens et al. Vaccine 29, 2011; Kaur et al. Journal of Controlled Release, 2012; Schwendener, Ther Adv Vaccines, 2014; Nag and Awasthi, Pharmaceutics, 2013; Vartak and Sucheck, Vaccines, 2016; Fan et al., Journal of Controlled Release, 2015; Schmidt et al., Pharmaceutics, 2016]에서 검토됨).
따라서, 백신, 치료제 및 진단제를 위해서, 안정적이고, 제조 가능하고, 지질-기반 항원 및 아주반트와 상용성이고, 크기가 작은 페길화된 리포솜을 개발할 필요성이 존재한다. 백신 분야에서, 인플루엔자, 장 질환(예컨대, 아메바성감염(amebiasis)), 결핵, HIV, 암, 및 간염을 위한 면역 반응 및 백신접종을 향상시킬 수 있는 아주반트와 함께 이러한 리포솜을 제공하기 위한 필요성이 특별하게 존재하고, 예를 들어, 이러한 리포솜의 개발로부터 이득을 얻을 수 있다. 본 명세서에는 이와 관련된 조성물 및 방법이 제공된다.
특허 출원 및 특허 공보를 비롯한 본 명세서에 인용된 모든 문헌은, 각각의 개별 문헌이 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 제시된 바와 같이 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 페길화된 리포솜, 페길화된 리포솜을 포함하는 제형 및 조성물, 및 페길화된 리포솜의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 페길화된 리포솜은 백신, 치료제, 및 진단제를 위해서 유용하다.
페길화된 리포솜은 적어도 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 페길화된 지질 중의 PEG 구성성분의 평균 분자량은 약 5000달톤 이하이다. 페길화된 리포솜은 안정적이고, 면역 반응의 생성을 위한 작용제를 전달할 수 있다. 페길화된 지질이 약 5000달톤 이하인 경우, 리포솜의 페길화는 리포솜의 안정성을 허용하고, 면역 반응의 생성을 위한, 면역 세포로의 전달을 허용한다. 본 명세서에 제공된 바와 같이, 조성물 중에 존재하는 페길화된 리포솜의 크기는 약 1㎚ 내지 약 450㎚ 범위이고, 그 크기는 다양한 온도에서 그리고 시간 경과에 따라서 안정적으로 유지된다. 페길화된 리포솜은 안정적이고, 응집이 거의 없거나 전혀 없거나, 또는 감소된 응집을 나타내고, 바이알 보관 이전에 최종 멸균화 단계로 처리될 수 있다. 본 명세서에 제공된 페길화된 리포솜은 TLR 효능제 및/또는 작용제, 예를 들어 백신, 치료 또는 진단 용도를 위한 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 면역 반응을 자극하기 위한 페길화된 리포솜의 제조 및 사용과 관련된 조성물 및 방법이 또한 제공된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 (a) 콜레스테롤; (b) 비-페길화된 중성 지질; 및 (c) 페길화된 지질을 포함하는 리포솜이 제공되며, 여기서 페길화된 지질 중의 PEG의 평균 분자량은 약 5000달톤 이하이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 지질 중의 PEG의 평균 분자량은 약 750달톤 내지 약 5000달톤 범위이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 지질 중의 PEG의 평균 분자량은 약 2000달톤 이하이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 지질 중의 PEG의 평균 분자량은 약 750달톤이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 중성 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 C14 알킬쇄, C16 알킬쇄, 또는 C18 알킬쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 DSPE, DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE, 또는 DMPE이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 DSPE이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 DPPE이다. 일부 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질은 C14 알킬쇄, C16 알킬쇄, 또는 C18 알킬쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질은 DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE, 또는 DMPE이다. 일부 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질은 DPPC이다. 일부 실시형태에서, 리포솜은 안정적이다. 일부 실시형태에서, 리포솜은 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정적이다. 일부 실시형태에서, 리포솜은 약 25℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정적이다. 일부 실시형태에서, 리포솜은 약 37℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정적이다. 일부 실시형태에서, 리포솜의 다분산 지수는 약 0.3 이하에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 리포솜의 크기는 약 450㎚ 이하이다. 일부 실시형태에서, 리포솜의 크기는 약 450㎚ 이하에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 리포솜의 크기는 약 50㎚ 내지 약 300㎚ 범위이다. 일부 실시형태에서, 리포솜의 다분산 지수는 약 0.3 이하이다. 일부 실시형태에서, 리포솜 중의 페길화된 지질의 몰 백분율(㏖%)은 약 1㏖% 내지 약 25㏖%의 범위이다. 일부 실시형태에서, 리포솜 중의 페길화된 지질의 ㏖%는 약 1㏖% 내지 약 10㏖%의 범위이다. 일부 실시형태에서, 리포솜 중의 페길화된 지질의 ㏖%는 약 5㏖%이다. 일부 실시형태에서, 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 1㏖% 내지 약 50㏖%의 범위이다. 일부 실시형태에서, 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 50㏖%이다. 일부 실시형태에서, 리포솜 중의 비-페길화된 지질의 ㏖%는 약 45㏖% 내지 약 98㏖%의 범위이다. 일부 실시형태에서, 리포솜 중의 비-페길화된 지질의 ㏖%는 약 45㏖%이다. 일부 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질:콜레스테롤:페길화된 지질의 지질 몰비는 약 9.8:5.7:0.8이다. 일부 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질:콜레스테롤:페길화된 지질의 지질 몰비는 약 18:5.5:3이다. 일부 실시형태에서, 리포솜은 적어도 1종의 TLR 효능제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 효능제는 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR5 효능제, TLR6 효능제, TLR7 효능제, TLR8 효능제, TLR7/8 효능제, 또는 TLR9 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 효능제는 TLR4, SLA, GLA, 3D-MPL, R837, 또는 R848을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 효능제는 소수성 테일을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 효능제는 TLR7/8 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 효능제는 TLR7 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 효능제는 TLR8 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR7/8 효능제는 이미다조퀴놀린 또는 이미다조퀴놀린-함유 화합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR7/8 효능제는 3M-052를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR7/8 효능제는 R848을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 효능제는 TLR4 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR4 효능제는 3D-MPL을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR4 효능제는 GLA를 포함한다. 실시형태에서, TLR4 효능제는 화학식 (V)의 합성 GLA를 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR4 효능제는 화학식 (VI)의 합성 GLA를 포함한다.
일부 실시형태에서, TLR4 효능제는 하기 화학식의 합성 GLA 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure 112018119746337-pct00001
. 일부 실시형태에서, 리포솜은 TLR4 효능제 및 TLR7/8 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 리포솜은 GLA 및 3M-052를 포함한다. 일부 실시형태에서, 리포솜은 적어도 1종의 작용제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용제는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 항원, 아주반트, 진단제, 치료제, 또는 유기체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용제는 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 아메바성감염-관련 항원이다. 일부 실시형태에서, 항원은 LecA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 인플루엔자-관련 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 H5N1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 결핵-관련 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 ID91을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 ID93을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 BCG로부터의 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 간염 바이러스-관련 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 B형 간염 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 C형 간염 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 HIV-관련 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 암-관련 항원을 포함한다.
관련된 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 리포솜 중 임의의 하나를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 백신이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 치료제이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 진단제이다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공되며, 이 방법은 대상체에게 본 명세서에 기술된 리포솜 중 임의의 것을 투여함으로써, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 단계를 포함한다. 또 다른 양상에서, 본 명세서에는 대상체에서 Th1 반응을 유도하는 방법이 제공되며, 이 방법은 대상체에게 본 명세서에 기술된 리포솜 중 임의의 것, 또는 본 명세서에 기술된 리포솜을 포함하는 조성물 중 임의의 것을 투여함으로써, 대상체에서 Th1 반응을 유도하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 비-특이적 면역 반응이다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 항원-특이적 면역 반응이다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 전신 면역 반응을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 점막 면역 반응을 포함한다. 일부 실시형태에서, 점막 면역 반응은 장, 대변(fecal), 또는 질 점막 면역 반응을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 암의 치료 또는 예방을 위해서 사용된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 백신으로 사용된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 인플루엔자-유발 바이러스에 대한 보호 면역을 향상시키는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 아메바성감염-유발 유기체에 대한 보호 면역을 향상시키는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica)에 대한 보호 면역을 향상시키는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 인플루엔자에 대한 보호 면역을 향상시키는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 아메바성감염에 대한 보호 면역을 향상시키는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 조성물의 투여 경로는 경구, 국소, 비경구, 설하, 협측, 직장, 질, 정맥내, 피내, 경피, 비내, 점막내, 또는 피하이다. 일부 실시형태에서, 투여 경로는 비내이다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 대상체에서 전신 면역 반응 및 점막 면역 반응을 자극하는 방법이 제공되며, 이 방법은 대상체에게 본 명세서에 제공된 리포솜 중 임의의 하나 또는 본 명세서에 제공된 바와 같은 리포솜을 포함하는 조성물 중 임의의 하나를 비내로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 TLR4 효능제 및 TLR7/8 효능제를 포함하는 리포솜을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 GLA 및 3M-052를 포함하는 리포솜을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 점막 면역 반응은 장, 대변 또는 질 점막 면역 반응을 포함한다. 일부 실시형태에서, 점막 면역 반응은 비강에 대해서 원위이다.
본 명세서에 기술된 방법 중 임의의 것에서, 리포솜 또는 조성물은 레티노산 보조-아주반트와 함께 투여될 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법 중 임의의 것에서, 리포솜 또는 조성물은 인간에게 투여된다.
본 명세서에 기술된 방법 중 임의의 것에서, 리포솜 또는 조성물은 비-인간 포유동물에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 비-인간 포유동물은 개, 소 또는 말이다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 제공된 페길화된 리포솜 중 임의의 하나의 제조 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 비-페길화된 중성 지질, 페길화된 지질, 및 콜레스테롤을 유기 용매 중에서 혼합하는 단계; (b) 유기 용매를 증발시켜, 이에 의해서 지질막을 생성시키는 단계; (c) 지질막을 완충액 중에서 재수화시키는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 재수화된 생성물을 초음파처리하거나, 미소유동화(microfluidizing)시키거나 또는 압출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (a)는 TLR 효능제를 혼합하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 유기 용매는 클로로폼이다. 일부 실시형태에서, 단계 (c)의 재수화된 생성물을 초음파처리하고, 이어서 미소유동화시킨다. 일부 실시형태에서, 방법은 작용제를 페길화된 리포솜에 혼합하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용제는 항원을 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 양상은 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 설명 및 첨부된 도면을 참고하면 명백해질 것이다. 또한, 다양한 문헌이 본 명세서에 언급되고, 이것은 본 발명의 특정 양상을 보다 상세하게 기술하고, 따라서 이의 전문이 참고로 포함된다.
도 1A 내지 도 1D는 다양한 제형의 물리적 특징 및 안정성 특징을 도시한 도면. 도 1A는 5℃에서 시간 경과에 따른 입자 직경을 도시한다. 도 1B는 5℃에서 시간 경과에 따른 다분산 지수를 도시한다. 도 1C는 37℃에서 시간 경과에 따른 입자 직경을 도시한다. 도 1D는 37℃에서 시간 경과에 따른 다분산 지수를 도시한다.
도 2는 ELISA에 의해서 결정된 바와 같은, 다양한 제형의 IgG1 및 IgG2a 반응을 나타낸 도면. 도면은 상응하는 아주반트와 혼합된 LecA 항원의 다양한 제형으로 마우스를 면역화시킨 후 혈장 IgG1 및 IgG2a 역가의 비교를 도시한다.
도 3A 내지 도 3D는 LecA-특이적 사이토카인 반응을 도시한 도면.
도 4A 내지 도 4B는 시험감염전 점막 IgA 반응 및 접착 저해 가능성을 도시한 도면. 마우스를 혼합된 비내(0주 및 4주) 및 피하(2주) 요법을 사용하여 GLA 3M-052 리포솜 아주반트처리 LecA로 면역화시켰다. 제시된 군 내의 마우스에게 150㎎의 올(all)-트랜스 레티노산(RA)의 매주 복강내 주사를 제공하였다. 분변 샘플을 제3 면역화 3주 후에 수집하였다. 도 4A의 경우, 대변 상청액을 120-배로 희석하고, 시험감염전 항-레시틴 IgA 역가를 ELISA에 의해서 결정하였고; 도 4B의 경우, 포유동물 세포에 대한 영양체(trophozoite)의 접착을 저해하는 대변 IgA의 가능성을 기술된 바와 같은 접착 저해 검정을 사용하여 시험관내에서 결정하였다.
도 5A 및 도 5B는 장 아메바성감염의 마우스 모델을 사용하여 백신 매개된 보호된 보호를 도시한 도면. GLA 3M-052 리포솜 아주반트는 맹장 챌린지 시험에서 중간 정도의 보호를 제공하였다. 이종(heterologous) 요법을 사용하여 면역화된 마우스를 최종 면역화 4주 후에 이. 히스톨리티카(E. histolytica)로 맹장내로 시험감염시켰다. 마우스를 감염 1주 후에 안락시키고, ELISA를 사용하여(도 5A) 항원 부하(antibody load)에 대해서 항원 멸균 면역의 척도로서 배양에 의해서(도 5B) 살아있는 아메바에 대해서 맹장 내용물을 분석하였다. 전체 시험감염된 것으로부터 감염된 마우스의 수를 각각의 칼럼 위에 나타낸다. 2개의 독립적이지만 동일한 시험으로부터의 데이터를 풀링하였다.
도 6은 제시된 제형에 대한 혈장 IgG 반응을 도시한 도면.
도 7은 제시된 제형에 대한 대변 IgA 반응을 도시한 도면. 도면은 PEG 길이의 증가가 점막 IgA 반응을 향상시킨다는 것을 도시한다.
도 8A 및 도 8B는 IN(비내) 단일 요법으로부터 유발된 최고 IgG2a 및 IgA 역가로의 면역화에 대한 전달 경로의 효과를 도시한 도면. 리포솜 + 아주반트는 강력한 점막 및 전신 Th1 면역 반응, 소화관 항-LecA IgA를 생성하였다(도 8B).
도 9A 및 도 9B는 면역화에 대한 전달 경로 효과를 도시한 도면. IN 단독 요법이 다른 요법에 비해서 동등하거나 더 높은 IFN-γ 및 IL-17 역가를 생성하였다. 리포솜 + 아주반트는 강력한 점막 및 전신 Th1 면역 반응, IFN-γ(도 9A) 및 IL17(도 9B)을 생성하였다.
도 10A 및 도 10B는 5℃에서 6개월 동안 3M-052의 대표적인 제형의 (a) 입자 직경 및 (b) 크기 다분산 지수를 도시한 도면. 오차 막대는 각각의 시점에서 단일 제형 배취로부터의 3회 개별 입자 크기 검정의 표준 편차를 나타낸다. 이들 배취에 대해서 3M-052 함량을 측정하지 않았지만, 동일한 공정을 사용하여 제조된 후속 배취를 기준으로 0.04㎎/㎖로 추정되었다.
도 11A 내지 도 11H는 3M-052로 면역화된 마우스가 H5N1 시험감염 이후 향상된 생존을 나타낸다는 것을 도시한 도면. 동물을 제시된 바와 같이 아주반트와 조합하여 rHA 단백질(A/VN/1203/04)로 1회 면역화시켰다. 면역화 21일, 동물을 106PFU의 A/VN/1203/04(H5N1, 클레이드(Clade) 1)로 시험감염시켰다. 동물을 시험감염 3일(도 11D) 및 7일(도 11E) 후에 생존(도 11A) 및 체중 감소(도 11B, 11C)에 대해서 매일 모니터링하고, 마우스를 안락시키고, 폐 바이러스 역가를 플라크(plaque) 검정에 의해서 결정하였다. 또한, 응고화(consolidation)의 척도로서 시험감염 7일 후 온전한 폐를 칭량하고(11F), 육안 병리학의 외관에 대해서 점수 매겼다(도 11G). 맨텔-콕스 로그-랭크 시험(Mantel-Cox Log-Rank Test)(A)에 의해서 또는 일측 ANOVA(도 11D 내지 11G)에 의해서 유의성을 결정하였다(**p<0.005, ***p<0.0005, ****p<0.0001). 도 11H는 폐 바이러스 역가를 나타낸다.
도 12A 내지 도 12D는 제형화된 3M-052 아주반트로 면역화된 마우스에서 CD4 T-세포 반응을 도시한 도면. 동물을 제시된 바와 같은 아주반트와 조합하여 rHA 단백질(A/VN/1203/04)로 1회 면역화시켰다. 면역화 7일 후, 안락사시킨 마우스(n=5/군)로부터의 비장세포를 rHA로의 자극 후 사이토카인 자극에 대해서 분석하였다. IFNγ(I), TNFα(T), 및 IL-2(2)에 대한 사이토카인 분비 패턴을 결정하여 Th1 CD4+ T-세포 반응의 유도를 조사하였다. 다작용성 t 세포의 상대적인 백분율을 또한 결정하였다. 일측 ANOVA에 의해서 군들 간의 유의성을 결정하였다(*p<0.05, **p<0.005).
도 13A 내지 도 13H는 단일 면역화 이후 동종 H5N1 시험감염으로부터의 페럿(ferret)의 보호를 도시한 도면. 수컷 피치 페럿(Fitch ferret)을 제형화된 3M-052 아주반트와 조합하여 분할(split) H5N1 백신(H5N1, 사노피 파스테르(Sanofi Pasteur))으로 1회 면역화시키고, 106PFU의 A/VN/1203로 면역화 21일 후에 처리하였다. 동물을 생존(도 A, E), 체중 감소(도 B, F) 및 임상 점수(도 C, G)에 대해서 최대 14일 동안 모니터링하였다. 또한, 코 세척액(nasal wash)을 수집하여 바이러스 역가(도 D, H)를 평가하였다. 3M-052-SE 및 3M-052-리포솜 아주반트 제형 둘 모두는 코 세척액으로부터의 보다 신속한 바이러스 제거, 감소된 체중 감소 및 임상 점수, 및 100% 생존을 특징으로 하는, 이러한 모델에서 강한 싱글 쇼트(single shot) 보호를 나타낸다.
도 14A 내지 도 14F는 제형화된 3M-052 아주반트의 역가를 중화시키는 바이러스의 유도를 도시한 도면. 수컷 피치 페럿을 제형화된 3M-052 아주반트와 조합하여 분할 H5N1백신(SP-H5, 사노피 파스테르)으로 1회 면역화시켰다. 면역화 21일 후, 모든 동물로부터 혈액을 수집하고, 레트로바이러스 위형 중화 검정을 사용하여 항체를 중화시키는 바이러스에 대해서 검정하였다. 아주반트 제형 중에 3M-052를 포함시키는 것은 동종 클레이드 1 바이러스(도 A, D)뿐만 아니라 클레이드 2 바이러스 균주(도 B, E) 및 클레이드 2.2 균주(도 C, F) 둘 모두에 대해서 역가를 중화시키는 데 있어서 유의한(일측 ANOVA) 증가를 초래하였다.
도 15A 및 도 15B는 단일 면역화 후 이종 H5N1 시험감염으로부터의 페럿의 보호를 도시한 도면. 수컷 피치 페럿을 제형화된 3M-052 아주반트와 조합하여 분할 H5N1 백신(H5N1, 사노피 파스테르)으로 1회 면역화시키고, 면역화 21일 후 106PFU의 A/큰 고니(Whooper Swan)/몽골리아(Mongolia)/244/05로 시험감염시켰다. 코 세척액을 수집하여 바이러스 역가를 평가하였다. 3M-052-SE 아주반트는 바이러스의 보다 신속한 제거를 유도하였고, 5일에 검출 가능하지 않은 역가를 가졌다. 3M-052-리포솜 아주반트 제형은 3일에 걸쳐서 역가를 나타내고, 5일에 제거를 나타내었다.
본 출원은 특히 페길화된 리포솜 제형, 페길화된 리포솜을 포함하는 조성물, 페길화된 리포솜 제형의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은, 불용성 톨-유사 수용체(toll-like receptor: TLR) 효능제를 제형화하는 중에, 놀랍게도 항원과 혼합되는 경우 안정적으로 유지되고 향상된 면역 반응에서 효과적이면서 다양한 TLR 리간드 및/또는 항원의 혼입에서 다용도성인 리포솜 제형을 개발하였다. 본 발명자들은 이들 리포솜과 혼합되는 경우 다양한 상이한 항원이 포유동물에 투여될 수 있는 항원-리포솜 제형을 초래하였다는 것을 발견하였다. 리포솜 제형은 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 페길화된 지질 중의 PEG의 평균 분자량은 약 5000달톤 이하, 바람직하게는 약 750 내지 약 5000달톤, 또는 750 내지 약 2000달톤이다. 페길화된 지질의 사용은 안정성을 제공하고, 전달 및 면역 반응의 생성/자극/변형을 가능하게 한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질은 DPPC이고, 페길화된 지질은 페길화된 DSPE 또는 DPPE이다. 일부 특히 바람직한 실시형태에서, 리포솜은 톨-유사 수용체(TLR) 효능제 및 임의로, 항원을 추가로 포함한다.
본 명세서에 기술된 페길화된 리포솜을 포함하는 조성물(예컨대, 백신 조성물, 약제학적 조성물)이 또한 제공된다. 조성물은 대상체에서 면역 반응을 생성/자극/변형하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물은 1종 이상의 항원 및/또는 TLR 효능제를 추가로 포함한다.
본 발명자들은 또한 DMPC 대신에 난 포스파티딜콜린 또는 POPC를 사용하여 제조된 에멀션인 불용성 톨-유사 수용체 3M-052의 스쿠알렌-기반 수중유 에멀션(oil--in-water emulsion)을 제형화하는 경우, 가공 후에 톨-유사 수용체의 더 높은 회수율을 초래하였다는 것을 발견하였다. 추가로, 클로로폼 중에서 톨-유사 수용체를 난 포스파티딜콜린 또는 POPC와 조합하는 초기 혼합 단계를 추가하는 것이 톨-유사 수용체의 회수율을 추가로 증가시켰다. 본 출원은 또한 특히 스쿠알렌, 불포화 포스파티딜콜린, 및 톨-유사 수용체(예를 들어, 불용성 톨-유사 수용체)를 포함하는 스쿠알렌-기반 수중유 에멀션, 및 클로로폼 중에서 톨-유사 수용체를 불포화 포스파티딜콜린과 혼합함으로써 이러한 에멀션을 제조하는 방법에 관한 것이다.
I. 정의
하기 용어는 달리 제시되지 않는 한 하기 의미를 갖는다. 임의의 정의되지 않은 용어는 관련 기술 분야에서 인지되는 의미를 갖는다.
본 설명에서, 용어 "약" 및 "본질적으로 이루어진다"는 달리 제시되지 않는 한 제시된 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다.
대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 모두 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나를 의미하도록 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함한다", "갖는다" 및 "포함한다"는 동의어로 사용되고, 이 용어 및 이의 변형은 제한이 아닌 것으로 이해되도록 의도된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 그 맥락이 달리 명백하게 제시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다.
용어 "마크로분자"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 생물 또는 합성 기원의 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드에 의해서 예시되지만 이들로 제한되지 않은 큰 분자를 지칭한다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하도록 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 그것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그것은 비-아미노산에 의해서 중단될 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대, 표지 구성성분과의 융합에 의해서 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한 이 정의 내에는 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비자연 아미노산 등 포함)뿐만 아니라 관련 기술 분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩타이드가 포함된다.
용어 "단리된"은 이의 자연 환경으로부터 제거된 분자를 의미한다.
"정제된"은 분자가 순도가 증가되어, 그것이 그의 자연 환경에서 존재하는 것보다 그리고/또는 처음 합성되고/되거나 실험실 조건 하에서 증폭되는 경우보다 더 순수한 형태로 존재하는 것을 의미한다. 순도는 상대적인 용어이고, 절대 순도를 본질적으로 의미하는 것이 아니다.
"폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되는 바와 같이, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해서 또는 합성 반응에 의해서 중합체 내에 혼입될 수 있는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 임의의 물질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드에 대한 변형은 중합체의 조립 이전에 또는 이후에 부여될 수 있다.
"올리고뉴클레오타이드"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 일반적이지만 필수적이지 않은 약 200개 뉴클레오타이드 길이인 짧고, 일반적으로 단일 가닥이고, 일반적으로 합성인 폴리뉴클레오타이드를 일반적으로 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 서로 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 설명은 올리고뉴클레오타이드와 동일하고, 완전히 적용 가능하다.
"개체" 또는 "대상체"는 임의의 포유동물이다. 포유동물은 인간, 영장류, 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물(예컨대, 고양이, 개, 말) 및 설치류를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"알킬"은 선형 또는 분지형 포화 탄화수소이다. 예를 들어, 알킬기는 1 내지 30개의 탄소 원자(즉, (C1-C30)알킬) 또는 1 내지 20개의 탄소 원자(즉, (C1-C20 알킬) 또는 1 내지 10개의 탄소 원자(즉, (C1-C10)알킬) 또는 1 내지 8개의 탄소 원자(즉, (C1-C8)알킬) 또는 1 내지 6개의 탄소 원자(즉, (C1-C6)알킬) 또는 1 내지 4개의 탄소 원자(즉, (C1-C4)알킬)를 가질 수 있다. 이 용어는 예의 방식에 의해서 선형 및 분지형 하이드로카빌기, 예컨대, 메틸(CH3-), 에틸(CH3CH2-), n-프로필(CH3CH2CH2-), 아이소프로필((CH3)2CH-), n-부틸(CH3CH2CH2CH2-), 아이소부틸((CH3)2CHCH2-), sec-부틸((CH3)(CH3CH2)CH-), t-부틸((CH3)3C-), n-펜틸(CH3CH2CH2CH2CH2-), 네오펜틸((CH3)3CCH2-), 및 n-헥실(CH3(CH2)5-)을 포함한다.
"할로" 또는 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 지칭한다.
"하이드록시" 또는 "하이드록실"은 -OH기를 지칭한다.
"알콕시"는 기 -O-알킬을 지칭하고, 여기서 알킬은 본 명세서에 정의된 바와 같다. 알콕시는 예의 방식에 의해서 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 아이소프로폭시, n-부톡시, t-부톡시, sec-부톡시, n-펜톡시 등을 포함한다.
"카복실 에스터" 또는 "카복시 에스터"는 -C(O)O-알킬 및 -C(O)O-치환된 알킬기를 지칭하고, 여기서 알킬 및 치환된 알킬은 본 명세서에 정의되어 있다.
본 발명의 실시는 달리 제시되지 않는 한 분자 생물학, 재조합 DNA, 생화학 및 화학의 종래의 기술을 사용할 것이고, 이것은 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 범위 이내이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다(예를 들어, 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., U.S. Pat. No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) 참고).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "수 중 불용성"은 화합물이 물과 혼합되는 경우, 예를 들어, 실온, 예를 들어, 약 25℃ 내지 50에서 물과 혼합되는 경우 용해되지 않거나 무시할 정도의 수준으로 용해되는 화합물을 지칭한다.
II. 페길화된 리포솜
본 개시내용은 적어도 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하는 페길화된 리포솜을 제공하며, 여기서 페길화된 지질 중의 PEG 구성성분의 평균 분자량은 약 5000달톤 이하이다. 본 명세서에 제공된 페길화된 리포솜은 작용제, 예를 들어, 백신, 치료 또는 진단 용도를 위한 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 제공된 페길화된 리포솜은 예를 들어 상기에 언급된 백신, 치료 또는 진단 용도를 위한 TLR 효능제를 추가로 포함할 수 있다. 페길화된 리포솜의 각각의 개별 구성성분의 설명 및 페길화된 리포솜의 특징을 하기에 기술한다.
A. 페길화된 지질
본 명세서에 제공된 페길화된 리포솜은 페길화된 지질(폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 연결된 지질)을 포함하며, 여기서 페길화된 지질 중의 PEG의 평균 분자량은 약 5000달톤 이하이다. 중성 비-페길화된 지질 및 콜레스테롤과 조합하여 PEG에 연결된 이러한 지질의 사용은 페길화된 지질을 함유하지 않은 다른 중성 리포솜에 안정성을 부여한다는 것을 인식하였다. 이러한 페길화된 지질의 사용은 페길화된 리포솜 구조의 장기간 안정성을 허용하고, 면역 반응의 효과적인 자극을 허용한다.
페길화된 지질 중의 PEG의 특징
본 명세서에 고려된 실시형태에서, 페길화된 지질 중의 PEG의 평균 분자량은 약 5000달톤 이하이다. 일부 실시형태에서 페길화된 지질 중의 PEG의 평균 분자량은 약 2000달톤 이하이다. 특별한 실시형태에서, PEG의 평균 분자량은 약 750달톤 내지 약 5000달톤 범위이다. 특별한 실시형태에서, PEG의 평균 분자량은 약 750달톤 내지 약 2000달톤 범위이다. 일부 실시형태에서, PEG의 평균 분자량은 약 750 내지 1000; 750 내지 1500; 750 내지 2000; 750 내지 2500; 750 내지 3000; 750 내지 3500; 750 내지 4000; 750 내지 4500; 또는 750 내지 5000달톤 범위이다. 일부 실시형태에서, PEG의 평균 분자량은 약 4500 내지 5000; 4000 내지 5000; 3500 내지 5000; 3000 내지 5000; 2500 내지 5000; 2000 내지 5000; 1500 내지 5000; 1000 내지 5000; 또는 750 내지 5000달톤 범위이다. 일부 실시형태에서, PEG의 평균 분자량은 약 500 내지 1000; 500 내지 750; 또는 750 내지 1000달톤 범위이다. 일부 실시형태에서, PEG의 평균 분자량은 약 1500 내지 2500; 1500 내지 2000; 또는 2000 내지 2500달톤 범위이다. 일부 실시형태에서, PEG의 평균 분자량은 약 4500 내지 5500; 4500 내지 5000; 또는 2000 내지 5000달톤 범위이다.
일 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질은 PEG750을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질은 PEG1000을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질은 PEG1500을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질은 PEG2000을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질은 PEG2500을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질은 PEG3000을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질은 PEG3500을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질은 PEG4000을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질은 PEG4500을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질은 PEG5000을 포함한다.
페길화된 지질 중의 지질의 특징
본 명세서에서 페길화된 지질의 지질 구성성분은 콜레스테롤 및 비- 페길화된 중성 지질 구성성분과 회합하여 안정한 리포솜 구조를 형성할 수 있는 임의의 지질을 포함할 수 있다고 고려된다.
표 1은 본 발명에서 사용하기 위한 PEG에 연결될 수 있는 예시적인 지질의 비제한적인 목록을 제공한다.
Figure 112018119746337-pct00002
Figure 112018119746337-pct00003
특정 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 인지질 또는 4차 암모늄염 지질이다. 특정 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 포스파티딜콜린 또는 포스포글리세리드인 인지질이다. 특정 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 하기 모이어티 중 임의의 것을 포함한다:
Figure 112018119746337-pct00004
여기서, X-는 알칼리 금속 반대이온이고, Y+는 할라이드 반대이온이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 C10-20 알킬쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 C12-18 알킬쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 C14 알킬쇄, C16 알킬쇄, 또는 C18 알킬쇄를 포함한다.
특정 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 음이온성이다. 특정 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 양이온성이다. 특정 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 전체적으로 중성으로 하전되어 있다. 특정 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 쯔비터이온이다.
특정 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DSPE, DPPE 또는 DMPE이다. 일 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 DSPE이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 DPPE이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 DMPE이다.
본 명세서에 기술된 실시형태 중 임의의 것에서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 DLPE일 수 있다.
특정 실시형태에서, 리포솜 중의 페길화된 지질의 몰 백분율(㏖%)은 약 1㏖% 내지 약 25㏖%의 범위이다. 특정 실시형태에서, 리포솜 중의 페길화된 지질의 몰 백분율(㏖%)은 약 1㏖%, 2㏖%, 3㏖%, 4㏖%, 5㏖%, 6㏖%, 7㏖%, 8㏖%, 9㏖%, 10㏖%, 11㏖%, 12㏖%, 13㏖%, 14㏖%, 15㏖%, 16㏖%, 17㏖%, 18㏖%, 19㏖%, 20㏖%, 21㏖%, 22㏖%, 23㏖%, 24㏖%, 또는 심지어는 약 25㏖%이다. 예시적인 실시형태에서, 리포솜 중의 페길화된 지질의 ㏖%는 약 5㏖%이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 리포솜 중의 페길화된 지질의 ㏖%는 약 10㏖%이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 리포솜 중의 페길화된 지질의 ㏖%는 약 15㏖%이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 리포솜 중의 페길화된 지질의 ㏖%는 약 20㏖%이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 리포솜 중의 페길화된 지질의 ㏖%는 약 25㏖%이다.
예시적인 페길화된 지질
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 페길화된 지질은 DSPE-PEG750, DSPE-PEG1000, DSPE-PEG1500, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2500, DSPE-PEG3000, DSPE-PEG3500, DSPE-PEG4000, DSPE-PEG4500 또는 DSPE-PEG5000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 페길화된 지질은 DPPE-PEG750, DPPE-PEG1000, DPPE-PEG1500, DPPE-PEG2000, DPPE-PEG2500, DPPE-PEG3000, DPPE-PEG3500, DPPE-PEG4000, DPPE-PEG4500 또는 DPPE-PEG5000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 페길화된 지질은 DMPE-PEG750, DMPE-PEG1000, DMPE-PEG1500, DMPE-PEG2000, DMPE-PEG2500, DMPE-PEG3000, DMPE-PEG3500, DMPE-PEG4000, DMPE-PEG4500 또는 DMPE-PEG5000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 페길화된 지질은 DPPC-PEG750, DPPC-PEG1000, DPPC-PEG1500, DPPC-PEG2000, DPPC-PEG2500, DPPC-PEG3000, DPPC -PEG3500, DPPC-PEG4000, DPPC-PEG4500 또는 DPPC-PEG5000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 페길화된 지질은 DOPC-PEG750, DOPC-PEG1000, DOPC-PEG1500, DOPC-PEG2000, DOPC-PEG2500, DOPC-PEG3000, DOPC -PEG3500, DOPC-PEG4000, DOPC-PEG4500 또는 DOPC-PEG5000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 페길화된 지질은 DLPC-PEG750, DLPC-PEG1000, DLPC-PEG1500, DLPC-PEG2000, DLPC-PEG2500, DLPC-PEG3000, DLPC -PEG3500, DLPC-PEG4000, DLPC-PEG4500 또는 DLPC-PEG5000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 페길화된 지질은 DMPC-PEG750, DMPC-PEG1000, DMPC-PEG1500, DMPC-PEG2000, DMPC-PEG2500, DMPC-PEG3000, DMPC -PEG3500, DMPC-PEG4000, DMPC-PEG4500 또는 DMPC-PEG5000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 페길화된 지질은 POPC-PEG750, POPC-PEG1000, POPC-PEG1500, POPC-PEG2000, POPC-PEG2500, POPC-PEG3000, POPC -PEG3500, POPC-PEG4000, POPC-PEG4500 또는 POPC-PEG5000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 페길화된 지질은 DSPC-PEG750, DSPC-PEG1000, DSPC-PEG1500, DSPC-PEG2000, DSPC-PEG2500, DSPC-PEG3000, DSPC -PEG3500, DSPC-PEG4000, DSPC-PEG4500 또는 DSPC-PEG5000이다.
B. 비-페길화된 중성 지질
본 명세서에 제공된 페길화된 리포솜은 또한 비-페길화된 중성 지질(폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 연결되지 않은 중성 지질)을 포함한다. 리포솜의 비-페길화된 중성 지질 구성성분은 전체 중성 전하를 보유하거나, 쯔비터이온성인 임의의 중성 지질(이것은 중성 인지질을 포함함)을 포함하고, 이것은 페길화된 지질 구성성분과 회합하여 안정한 리포솜 구조를 형성할 수 있다고 본 명세서에서 고려된다.
본 명세서에 제공된 바와 같이, 비-페길화된 중성 지질은 전체적으로 중성으로 하전되어 있다. 특정 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질은 쯔비터이온이다. 페길화된 리포솜의 중성 비-페길화된 지질 구성성분은, 일부 변형에서, 페길화된 리포솜이 전체적으로 중성으로 하전되어 있도록 할 수 있다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜의 비-페길화된 중성 지질 구성성분은 C10-20 알킬쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질 구성성분은 C12-18 알킬쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질 구성성분은 C14 알킬쇄, C16 알킬쇄, 또는 C18 알킬쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질은 DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE 또는 DMPE이다.
특정 실시형태에서, 리포솜 중의 비-페길화된 중성 지질의 몰 백분율(㏖%)은 약 45㏖% 내지 약 98㏖%의 범위이다. 특정 실시형태에서, 리포솜 중의 비-페길화된 중성 지질의 몰 백분율(㏖%)은 약 45㏖%, 50㏖%, 55㏖%, 60㏖%, 65㏖%, 70㏖%, 75㏖%, 80㏖%, 85㏖%, 90㏖%, 95㏖%, 또는 심지어는 약 98㏖%이다. 예시적인 실시형태에서, 리포솜 중의 비-페길화된 중성 지질의 ㏖%는 약 45㏖%이다.
예시적인 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질 대 페길화된 지질의 지질 몰비는 9.8:0.8이다. 예시적인 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질 대 페길화된 지질의 지질 몰비는 18:3이다.
예시적인 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질 DPPC 대 페길화된 지질 DPPE-PEG2000의 지질 몰비는 9.8:0.8이다. 예시적인 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질 DPPC 대 페길화된 지질 DPPE-PEG750의 지질 몰비는 9.8:0.8이다. 예시적인 실시형태에서, 비-페길화된 중성 지질 DPPC 대 페길화된 지질 DPPE-PEG750의 지질 몰비는 18:3이다.
C. 콜레스테롤
본 명세서에 제공된 페길화된 리포솜은 콜레스테롤(이것은 콜레스테롤-함유 화합물을 포함함)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 1㏖% 내지 약 50㏖%, 약 5㏖% 내지 약 50㏖%, 약 10㏖% 내지 약 50㏖%, 약 20㏖% 내지 약 50㏖%, 약 25㏖% 내지 약 50㏖%, 약 5㏖% 내지 약 10㏖%, 약 5㏖% 내지 약 20㏖%, 약 5㏖% 내지 약 25㏖%, 약 10㏖% 내지 약 20㏖%, 약 10㏖% 내지 약 25㏖%, 약 20㏖% 내지 약 30㏖%, 약 20㏖% 내지 약 40㏖%, 또는 심지어는 약 1㏖% 내지 약 10㏖%의 범위이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 50㏖%이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 45㏖%이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 40㏖%이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 35㏖%이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 30㏖%이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 25㏖%이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 20㏖%이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 15㏖%이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 10㏖%이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 5㏖%이다.
특정 실시형태에서 콜레스테롤 대 비-페길화된 중성 지질 대 페길화된 지질의 지질 몰비는 약 5.7:9.8:0.8이다. 특정 실시형태에서 콜레스테롤 대 비-페길화된 중성 지질 대 페길화된 지질의 지질 몰비는 약 5.5:18:3이다.
특정 실시형태에서 콜레스테롤 대 비-페길화된 중성 지질 DPPC 대 페길화된 지질 DPPE-PEG2000의 지질 몰비는 약 5.7:9.8:0.8이다. 특정 실시형태에서 콜레스테롤 대 비-페길화된 중성 지질 DPPC 대 페길화된 지질 DPPE-PEG750의 지질 몰비는 약 5.7:9.8:0.8이다. 특정 실시형태에서 콜레스테롤 대 비-페길화된 중성 지질 DPPC 대 페길화된 지질 DPPE-PEG750의 지질 몰비는 약 5.5:18:3이다.
D. TLR 효능제
본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 명세서에 기술된 페길화된 리포솜은 1종 이상의 톨-유사 수용체 효능제(TLR 효능제)를 포함할 수 있다. 톨-유사 수용체(TLR)는 다양한 보존된 미생물 분자 구조를 위한 숙주 세포에 대한 초기-단계 인식 능력을 부여하고, 예컨대, 다량의 감염성 병원균 내에 또는 그 상에 존재할 수 있는 선천적인 면역계의 세포 표면 막관통 수용체를 포함한다. 선천적인 면역계를 통해서 면역 반응의 개시를 증강시키는 TLR-매개된 신호 변환의 유도는 세포 표면 TLR과 관여된 TLR 효능제에 의해서 달성될 수 있다. 예를 들어, 지질다당류(LPS)는 TLR2 또는 TLR4를 통한 TLR 효능제일 수 있고(Tsan et al., 2004 J. Leuk. Biol.76:514; Tsan et al., 2004 Am. J. Physiol. Cell Phsiol.286:C739; Lin et al., 2005 Shock 24:206); 폴리(이노신-사이티딘)(폴리:C)은 TLR3을 통한 TLR 효능제일 수 있고(Salem et al., 2006 Vaccine 24:5119); CpG 서열(비메틸화 사이토신-구아노신 또는 "CpG" 다이뉴클레오타이드 모티프, 예를 들어, CpG 7909를 함유하는 올리고데옥시뉴클레오타이드)(Cooper et al., 2005 AIDS 19:1473; CpG 10101 Bayes et al. Methods Find Exp Clin Pharmacol 27:193; Vollmer et al. Expert Opinion on Biological Therapy 5:673; Vollmer et al., 2004 Antimicrob. Agents Chemother. 48:2314; Deng et al., 2004 J. Immunol. 173:5148)은 TLR9를 통한 TLR 효능제일 수 있고(Andaloussi et a., 2006 Glia 54:526; Chen et al., 2006 J. Immunol. 177:2373); 펩타이도글리칸은 TLR2 및/또는 TLR6 효능제일 수 있고(Soboll et al., 2006 Biol. Reprod. 75:131; Nakao et al., 2005 J. Immunol.174:1566); 3M003(또한 관련 화합물 3M001 및 3M002의 공급원인 쓰리엠 파마슈티컬즈(3M Pharmaceuticals)(미국 미네소타주 세인트 폴 소재)로부터의 4-아미노-2-(에톡시메틸)-α,α-다이메틸-6,7,8,9-테트라하이드로-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 수화물, 분자량 318Da; Gorden et al., 2005 J. Immunol.174:1259)은 TLR7 효능제(Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg.35:1591) 및/또는 TLR8 효능제(Johansen 2005)일 수 있고; 플라젤린은 TLR5 효능제일 수 있고(Feuillet et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:12487); C형 간염 항원은 TLR7 및/또는 TLR9을 통한 TLR 길항제로서 작용할 수 있다(Lee et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1828; Horsmans et al., 2005 Hepatol.42:724)). 다른 TLR 효능제가 공지되어 있고(예를 들어, Schirmbeck et al., 2003 J. Immunol. 171:5198), 본 명세서에 기술된 실시형태의 특별한 것에 따라서 사용될 수 있다.
다양한 실시형태에서, TLR 효능제는 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR5 효능제, TLR6 효능제, TLR7 효능제, TLR8 효능제, TLR7/8 효능제, TLR9 효능제, 이들의 조합물일 수 있다.
TLR7/8 효능제
본 명세서에는 본 명세서에 기술된 조성물에서 사용될 수 있는 TLR7/8 효능제가 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "TLR7/8 효능제"는 이것과 TLR7, TLR8, 또는 둘 모두의 상호작용을 통해서 이의 생물학적 활성도에 영향을 주는 효능제를 지칭한다. 이러한 생물학적 활성도는 선천적인 면역계를 통해서 면역 반응을 증강시키기 위한 TLR7 및/또는 TLR8 매개된 신호 변환의 도입을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, TLR은 이미다조퀴놀린, 이미다조퀴놀린 함유 화합물, 또는 이미다조퀴놀린 아민 유도체(예를 들어, 미국 특허 제4,689,338호(제스터(Gerster)) 참고)이지만, 다른 화합물 부류가 마찬가지로 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,446,153호(린드스톰(Lindstrom) 등); 미국 특허 제6,194,425호(제스터 등); 및 미국 특허 제6,110,929호(제스터 등); 및 국제 공개 번호 제WO2005/079195호(헤이스(Hays) 등)).
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물에서 사용된 TLR7/8 효능제는 이미다조퀴놀린 유도체, 예컨대, 쉬(Shi)등의 문헌(ACS Med. Chem. Lett., 2012, 3(6), pp.501-504), 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함됨)에 기술된 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, TLR7/8은 이미다조퀴놀린 또는 이미다조퀴놀린-함유 화합물을 포함한다. 일부 실시형태에서 이미다조퀴놀린은 면역 반응 변형제인 이미퀴모드(IMQ 또는 R837이라 지칭됨)이다. 일부 실시형태에서 이미다조퀴놀린은 면역 반응 변형제로서 작용하는 약물인 레시퀴모드(R848)이다(Tomai MA, Miller RL, Lipson KE, Kieper WC, Zarraga IE, Vasilakos JP (October 2007). "Resiquimod and other immune response modifiers as vaccine adjuvants". Expert Review of Vaccines 6 (5): 835-47). 특정 실시형태에서, TLR 7/8 효능제는 CL075이다.
예를 들어, 특정 실시형태에서, TLR7/8 효능제는 하기 화학식 (I)의 구조의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112018119746337-pct00005
식 중: R11은 수소 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되되, C1-6알킬은 할로, 하이드록실, 및 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되고;
R12는 수소 및 카복실 에스터로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R13은 수소 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되되, C1-6알킬은 할로, 하이드록실, 및 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 군으로 임의로 치환된다.
화학식 (I)의 일부 실시형태에서, R11은 수소이다. 일부 실시형태에서, R11은 C1-6알킬이다. 일부 실시형태에서, R11은 메틸, 에틸, n-프로필 또는 n-부틸이다. 일부 실시형태에서, R11은 n-부틸이다. 일부 실시형태에서, R11은 C1-6알킬이고, 이것은 치환된 C1-6알콕시이다. 일부 실시형태에서, R11은 -CH2-O-CH2-CH3이다.
화학식 (I)의 일부 실시형태에서, R12는 수소이다. 일부 실시형태에서, R12는 카복실 에스터이다. 일부 실시형태에서, R12는 -C(O)O-C1-4알킬이다. 일부 실시형태에서, R12는 -C(O)O-CH3이다.
화학식 (I)의 일부 실시형태에서, R13은 C1-6알킬이다. 일부 실시형태에서, R13은 C2-4알킬이다. 일부 실시형태에서, R13은 -CH2-CH(CH3)2이다.
일부 실시형태에서, R13은 C1-6알킬이고, 이것은 할로, 하이드록실, 또는 C1-6알콕시로 치환된다. 일부 실시형태에서, R13은 C1-6알킬이고, 이것은 하이드록실로 치환된다. 일부 실시형태에서, R13은 C2-4알킬이고, 이것은 하이드록실로 치환된다. 일부 실시형태에서, R13은 -CH2-C(CH3)2OH이다.
특정 실시형태에서, TLR7/8 효능제는 하기 화학식 (II)의 구조의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112018119746337-pct00006
식 중:
R11은 수소 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되되, C1-6알킬은 할로, 하이드록실 및 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되고;
R12는 수소 및 카복실 에스터로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R13a는 수소 및 하이드록실로 이루어진 군으로부터 선택된다.
화학식 (II)의 일부 실시형태에서, R11은 수소이다. 일부 실시형태에서, R11은 C1-6알킬이다. 일부 실시형태에서, R11은 메틸, 에틸, n-프로필 또는 n-부틸이다. 일부 실시형태에서, R11은 n-부틸이다. 일부 실시형태에서, R11은 C1-6알킬이고, 이것은 치환된 C1-6알콕시이다. 일부 실시형태에서, R11은 -CH2-O-CH2-CH3이다.
화학식 (II)의 일부 실시형태에서, R12는 수소이다. 일부 실시형태에서, R12는 카복실 에스터이다. 일부 실시형태에서, R12는 -C(O)O-C1-4알킬이다. 일부 실시형태에서, R12는 -C(O)O-CH3이다.
화학식 (II)의 일부 실시형태에서, R13a는 하이드록실이다. 일부 실시형태에서, R13a는 수소이다.
특정 실시형태에서, TLR7/8 효능제는 하기 화학식 (III)의 구조의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112018119746337-pct00007
식 중:
R11은 수소 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되되, C1-6알킬은 할로, 하이드록실 및 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되고;
R12는 수소 및 카복실 에스터로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R13b는 할로, 하이드록실, C1-6알콕시 및 아실아미노로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 임으로 치환된 C1-6알킬이다.
화학식 (III)의 일부 실시형태에서, R11은 수소이다. 일부 실시형태에서, R11은 C1-6알킬이다. 일부 실시형태에서, R11은 메틸, 에틸, n-프로필 또는 n-부틸이다. 일부 실시형태에서, R11은 n-부틸이다. 일부 실시형태에서, R11은 C1-6알킬이고, 이것은 치환된 C1-6알콕시이다. 일부 실시형태에서, R11은 -CH2-O-CH2-CH3이다.
화학식 (III)의 일부 실시형태에서, R12는 수소이다. 일부 실시형태에서, R12는 카복실 에스터이다. 일부 실시형태에서, R12는 -C(O)O-C1-4알킬이다. 일부 실시형태에서, R12는 -C(O)O-CH3이다.
화학식 (III)의 일부 실시형태에서, R13b는 C2-4알킬이고, 이것은 아실아미노로 치환된다. 일부 실시형태에서, R13b는 -(CH2)4-아실아미노이다. 일부 실시형태에서, R13b는 -(CH2)4-NH-C(O)-C1-25알킬이다. 일부 실시형태에서, R13b는 -(CH2)4-NH-C(O)-C15-25알킬이다. 일부 실시형태에서, R13b는 -(CH2)4-NH-C(O)-C15-20알킬이다. 일부 실시형태에서, R13b는 -(CH2)4-NH-C(O)-C17알킬이다.
특정 실시형태에서, TLR7/8 효능제는 하기 화학식 (IV)의 구조의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112018119746337-pct00008
식 중:
R10은 수소 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R11b는 할로, 하이드록실, C1-6알콕시 및 아실아미노로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환된 C1-6알킬이다.
화학식 (IV)의 일부 실시형태에서, R10은 수소이다. 일부 실시형태에서, R10은 C1-6알킬이다. 일부 실시형태에서, R10은 메틸, 에틸, n-프로필 또는 n-부틸이다. 일부 실시형태에서, R10은 n-부틸이다.
화학식 (IV)의 일부 실시형태에서, R11b는 C2-4알킬이고, 이것은 아실아미노로 치환된다. 일부 실시형태에서, R11b는 -(CH2)4-아실아미노이다. 일부 실시형태에서, R11b는 -(CH2)4-NH-C(O)-C1-25알킬이다. 일부 실시형태에서, R11b는 -(CH2)4-NH-C(O)-C15-25알킬이다. 일부 실시형태에서, R11b는 -(CH2)4-NH-C(O)-C15-20알킬이다. 일부 실시형태에서, R11b는 -(CH2)4-NH-C(O)-C17알킬이다.
특정 실시형태에서, TLR7/8 효능제는 하기 구조 중 임의의 것의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112018119746337-pct00009
Figure 112018119746337-pct00010
특정 실시형태에서, TLR7/8 효능제는 하기 구조식의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112018119746337-pct00011
특정 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에서 조성물에서 사용되는 TLR7/8 효능제는 미국 특허 제9,242,980호에 기술된 바와 같은 N-(4-{[4-아미노-2-부틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]옥시}부틸)옥타데칸아마이드), 3M-052를 포함한다.
TLR4 효능제
본 명세서에는 본 명세서에 기술된 조성물에서 사용될 수 있는 TLR4 효능제가 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서 조성물에서 사용되는 TLR4 효능제는 글리코피라노실 지질 아주반트(GLA), 예컨대, 미국 특허 공개 제US2007/021017호, 제US2009/045033호, 제US2010/037466호, 및 제US 2010/0310602호에 기술된 것을 포함하며, 이들의 내용은 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.
예를 들어, 특정 실시형태에서, TLR4 효능제는 하기 화학식 (V)의 구조를 갖는 합성 GLA 아주반트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112018119746337-pct00012
식 중:
L1, L2, L3, L4, L5 및 L6은 동일하거나 또는 상이하고, 독립적으로 -O-, -NH- 또는 -(CH2)-이고;
L7, L8, L9, 및 L10은 동일하거나 또는 상이하고, 독립적으로 존재하지 않거나 또는 -C(=O)-이고;
Y1은 산 작용기이고;
Y2 및 Y3은 동일하거나 또는 상이하고, 독립적으로 -OH, -SH, 또는 산 작용기이고;
Y4는 -OH 또는 -SH이고;
R1, R3, R5 및 R6은 동일하거나 또는 상이하고, 독립적으로 C8-13 알킬이고;
R2 및 R4는 동일하거나 또는 상이하고, 독립적으로 C6-11 알킬이다.
합성 GLA 구조의 일부 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C10 알킬이고; R2 및 R4는 C8 알킬이다. 특정 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
예를 들어, 특정 실시형태에서, TLR4 효능제는 하기 화학식 (VI)의 구조식을 갖는 합성 GLA 아주반트이다:
Figure 112018119746337-pct00013
구체적인 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C12-C20 알킬이다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, GLA는 상기에 언급된 화학식을 갖고, 여기서 R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C13 알킬이다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, GLA는 상기에 언급된 화학식을 갖고, 여기서 R1, R3, R5 및 R6은 C10 알킬이고; R2 및 R4는 C8 알킬이다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, GLA는 상기에 언급된 화학식을 갖고, 여기서 R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다. 특정 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
특정 실시형태에서, TLR4 효능제는 하기 화학식 (VII)의 구조를 갖는 합성 GLA 아주반트이다:
Figure 112018119746337-pct00014
상기 GLA 구조의 특정 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다. 특정 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
특정 실시형태에서, TLR4 효능제는 하기 화학식 (VIII)의 구조를 갖는 합성 GLA 아주반트이다:
Figure 112018119746337-pct00015
상기 GLA 구조의 특정 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다. 특정 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
특정 실시형태에서, TLR4 효능제는 하기 화학식 (IX)의 구조를 갖는 합성 GLA 아주반트이다:
Figure 112018119746337-pct00016
.
상기 GLA 구조의 특정 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다. 특정 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
특정 실시형태에서, TLR4 효능제는 하기 구조를 갖는 합성 GLA 아주반트이다:
Figure 112018119746337-pct00017
특정 실시형태에서, TLR4 효능제는 하기 구조를 갖는 합성 GLA 아주반트이다:
Figure 112018119746337-pct00018
특정 실시형태에서, TLR4 효능제는 하기 구조를 갖는 합성 GLA 아주반트이다:
Figure 112018119746337-pct00019
또 다른 실시형태에서, 약화된 지질 A 유도체(ALD)가 본 명세서에 기술된 조성물 중에 혼입된다. ALD는, 분자가 지질 A의 부작용 보다 적게 또는 다르게 나타내도록 변경되거나 작제된 지질 A-유사 분자이다. 이러한 부작용은 발열원성, 국소 쉬와츠만(Shwarzman) 반응성, 독성(닭 배아 50% 치사량 검정(CELD50)으로 평가되는 바와 같음)을 포함한다. 본 개시내용에 따라서 유용한 ALD는 모노포스포릴 지질 A(MPL) 및 3-탈아세틸화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)를 포함한다. MPL 및 3D-MPL은 공지되어 있어서, 본 명세서에서 상세하게 기술될 필요가 없다(예를 들어, 모노포스포릴 지질 A 및 이의 제조를 개시한 미국 특허 제4,436,727호 참고). 미국 특허 제4,912,094호 및 재심사 증명 B1 미국 특허 제4,912,094호는 3-탈아세틸화된 모노포스포릴 지질 A 및 이의 제조 방법을 포함한다(또한 예를 들어, 영국 특허 제GB 2220211호 및 국제 특허 제WO 92/116556호 참고). 3 탈-O-아세틸화된 모노포스포릴 지질 A는 영국 특허 제GB 2220211호(리비(Ribi))로부터 공지되어 있다. 화학적으로 그것은 3 탈-O-아세틸화된 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 아세틸화된 쇄의 혼합물이고, 리비 이뮤노켐 몬타나(Ribi Immunochem Montana)에 의해서 제조된다. 3 탈-O-아세틸화된 모노포스포릴 지질 A의 특정 형태는 국제 특허 출원 제WO 92/116556호에 개시되어 있다. MPL 및 3D-MPL에 관련하여 이들 특허 각각의 개시내용이 본 명세서에 참고로 포함된다.
상기 TLR4 효능제 화합물에서, 전체 전하는 분자 내의 작용기에 따라서 결정될 수 있다. 예를 들어, 포스페이트기는 포스페이트기의 이온화 상태에 따라서 음으로 하전되거나 또는 중성일 수 있다.
예시적인 TLR 효능제 실시형태
일부 실시형태에서, TLR 효능제는 페길화된 리포솜의 지질 이중층과 회합한다.
일부 실시형태에서, TLR 효능제는 페길화된 리포솜 내에 엔벨로핑(enveloping)된다.
일부 실시형태에서, TLR 효능제는 비-페길화된 리포솜의 구조를 파괴할 것이다.
일부 실시형태에서, TLR 효능제는 소수성 테일을 포함한다. 일부 실시형태에서, TLR 효능제의 소수성 테일은 페길화된 리포솜의 지질 이중층과 회합한다.
일부 실시형태에서, TLR 효능제는 TLR4, SLA, GLA, MPL, 3D-MPL, R848, R837 또는 이들의 조합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, TLR 효능제는 TLR4 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, TLR 효능제는 TLR7/8 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, TLR 효능제는 TLR7 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, TLR 효능제는 LR8 효능제를 포함한다.
일부 실시형태에서, TLR 효능제는 이미다조퀴놀린을 포함한다.
일부 실시형태에서, TLR 효능제는 3M-052를 포함한다.
일부 실시형태에서, TLR 효능제는 TLR4 효능제와 TLR 7/8 효능제의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 3M-052 및 GLA를 포함한다.
E. 작용제
본 명세서에 제공된 페길화된 리포솜은 1종 이상의 작용제를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 작용제는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 항원, 아주반트, 진단제, 치료제, 유기체, 게놈 또는 바이러스일 수 있다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 2종 이상의 작용제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 작용제는 페길화된 리포솜과 회합한다. 일부 실시형태에서, 작용제는 리간드 교환에 의해서 그리고/또는 정전기(전하-기반) 상호작용에 의해서 페길화된 것과 회합한다.
특정 실시형태에서, 작용제는 페길화된 리포솜의 약 0.01 내지 1중량%일 수 있다.
폴리펩타이드
일부 실시형태에서 작용제는 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서 폴리펩타이드는 전장 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서 폴리펩타이드는 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 융합 단백질이다. 일부 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 개체에게 투여 시 면역 반응을 도출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 하기에 추가로 기술된 바와 같은 항원이다.
항원
일 실시형태에서, 작용제는 항원을 포함한다.
일부 실시형태에서 폴리펩타이드 항원은 알레르기, 암, 또는 감염 질환과 연관되거나 이로부터 유래된다.
일부 실시형태에서 본 명세서에 기술된 조성물은 백신접종 목적을 위해서 유용하고, 백신 제형(백신 조성물)로서 제공된다.
항원은 대상체에서 면역반응성의 도출 및 향상이 바람직한 임의의 표적 에피토프, 분자(생체분자 포함), 분자 복합체(생체분자를 함유하는 분자 복합체 포함), 하위세포 조립체, 세포 또는 조직일 수 있다. 빈번하게는, 용어 항원은 관심 폴리펩타이드 항원을 지칭할 것이다. 그러나, 항원은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 또한 관심 폴리펩타이드 항원(예를 들어, 발현 작제물)을 암호화하는 재조합 작제물을 지칭할 수 있다. 특정 실시형태에서 항원은 감염, 암, 자가면역 질환, 알레르기, 천식 또는 항원-특이적 면역 반응의 자극이 바람직하거나 이로울 임의의 다른 병태와 연관된 감염성 병원균 및/또는 에피토프, 생체분자, 세포 또는 조직일 수 있거나, 이것으로부터 유래될 수 있거나, 또는 이것과 면역학적으로 교차-반응성일 수 있다.
특정 실시형태는 적어도 1종의 감염성 병원균, 예컨대, 악티노박테리리아, 예컨대, 엠. 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 또는 엠. 레프레(M. leprae) 또는 또 다른 마이코박테리아; 박테리아, 예컨대, 살모넬라(Salmonella), 나이제리아(Neisseria), 보르렐리아(Borrelia), 클라미디아(Chlamydia) 및 보르데텔라(Bordetella) 속; 바이러스, 예컨대, 단순 포진 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 사이토메갈로바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, 간염 바이러스, 엡스타인 바르 바이러스(EBV), 호흡기 합포체 바이러스, 인간 유두종 바이러스(HPV) 및 사이토메갈로바이러스; HIV 예컨대, HIV-1 또는 HIV-2; 진균, 예컨대, 아스퍼질러스(Aspergillus), 블라스토마이세스(Blastomyces), 콕시디오이데스(Coccidioides) 및 뉴모시스티스(Pneumocystis)를 비롯한 박테리아, 바이러스 또는 진균, 또는 칸디다(Candida) 종, 예컨대, 씨. 알비칸스(C. albicans), 씨. 글라브라타(C. glabrata), 씨. 크루세이(C. krusei), 씨. 루시타니에(C. lusitaniae), 씨. 트로피칼리스(C. tropicalis) 및 씨. 파랍실로시스(C. parapsilosis)를 비롯한, 효모; 기생충, 예컨대, 원생동물, 예를 들어, 피. 팔시파럼(P. falciparum), 피. 비박스(P. vivax), 피. 말라리에(P. malariae) 및 피.오발레(P. ovale)를 비롯한 플라스모듐(Plasmodium) 종; 또는 또 다른 기생충, 예컨대, 아칸트아메바(Acanthamoeba), 엔트아메바 히스톨리티카, 안지오스트롱질루스(Angiostrongylus), 시스토소마 만소니이(Schistosoma mansonii), 시스토소마 헤마토비움(Schistosomahaematobium), 시스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum), 크립토스포리디움(Cryptosporidium), 안실로스토마(Ancylostoma), 엔트아메바 히스톨리티카, 엔트아메바 콜라이(Entamoeba coli), 엔트아메바 디스파(Entamoeba dispar), 엔트아메바 하르트만니(Entamoeba hartmanni), 엔트아메바 폴레키(Entamoeba polecki), 우체레리아 반크로프티(Wuchereriabancrofti), 지알디아(Giardia), 레이슈마니아(Leishmania)로부터 유래된 항원을 고려한다. 구체적인 실시형태에서, 항원은 결핵, 인플루엔자, 아메바성감염, HIV, 간염, 또는 리슈마니아증(Leishmaniasis)에 관여된 항원으로부터 유래하거나 이것과 연관될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원은 아메바성감염-관련 항원이다. 일부 실시형태에서, 항원은 아메바성감염-유발 항원이다. 일부 실시형태에서, 항원은 아메바성감염 유발 유기체로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 항원은 엔트아메바 히스톨리티카로부터 유래한다. 일 실시형태에서, 항원은 LecA를 포함한다. 일 실시형태에서, 항원은 LecA이다.
일부 실시형태에서, 항원은 인플루엔자-관련 항원이다. 일부 실시형태에서, 항원은 인플루엔자-유발 항원이다. 일부 실시형태에서, 항원은 인플루엔자 유발 바이러스로부터 유래한다. 일 실시형태에서, 항원은 H5N1을 포함한다. 일 실시형태에서, 항원은 H5N1을 포함한다.
예를 들어, 특정 실시형태에서, 항원은 보르렐리아 종으로부터 유래되고, 항원은 핵산, 병원균 유래 항원 또는 항원 제제, 재조합 방식으로 생산된 단백질 또는 펩타이드 및 키메라 융합 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 한 항원은 OspA이다. OspA는 숙주 세포(Lipo-OspA)에서의 이의 생합성으로 인해서 지질화된 형태의 완전 성숙 단백질일 수 있거나 또는 대안적으로는 비-지질화된 유도체일 수 있다. 이러한 비-지질화된 유도체는 인플루엔자 바이러스의 비-구조 단백질(NS1)의 제1 81개의 N-말단 아미노산을 갖는 비-지질화된 NS1-OspA 융합 단백질, 및 완전 OspA 단백질을 포함하고, 또 다른, MDP-OspA는 3개의 추가적인 N-말단 아미노산을 보유하는 OspA의 비-지질화된 형태이다.
특정 실시형태에서 항원은 바이러스, 예컨대, HIV-1, (예컨대, tat, nef, gp120 또는 gp160), 인간 포진 바이러스, 예컨대, gD 또는 이의 유도체 또는 극초기 단백질, 예컨대, HSV1 또는 HSV2로부터의 ICP27, 사이토메갈로바이러스(특히, 인간)(예컨대, gB 또는 이의 유도체), 로타바이러스(살아있는-약화된 바이러스 포함), 엡스타인 바르 바이러스(예컨대, gp350 또는 이의 유도체), 수두대상포진 바이러스(예컨대, gpl, II 및 IE63), 또는 간염 바이러스, 예컨대, B형 간염 바이러스(예를 들어 B형 간염 표면 항원 또는 이의 유도체), A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스, 또는 다른 바이러스 병원균, 예컨대, 파라믹소바이러스: 호흡기 세포융합 바이러스(예컨대, F 및 G 단백질 또는 이의 유도체), 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 유두종 바이러스(예를 들어 HPV6, 11, 16, 18 등), 플라비바이러스(예를 들어, 황열병 바이러스, 뎅기 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스) 또는 인플루엔자 바이러스(완전 생 또는 불활성화 바이러스, 분할 인플루엔자 바이러스, 난 또는 MDCK 세포에서 성장됨 또는 홀 플루 비로솜(whole flu virosome)(문헌[Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920에 기술된 바와 같음) 또는 이의 정제되거나 또는 재조합된 단백질, 예컨대, HA, NP, NA, 또는 M 단백질 또는 이들의 조합물)로부터 유래된다.
특정 다른 실시형태에서, 항원은 1종 이상의 박테리아 병원균, 예컨대, 나이제리아 종, 예컨대, 엔. 고노레아(N. gonorrhea) 및 엔. 메닝지티디스(N. meningitidis)(예를 들어, 협막 다당류 및 이의 접합체, 트랜스페린 결합 단백질, 락토페린 결합 단백질, PilC, 부착소); 에스. 피오제네스(S. pyogenes)(예를 들어, M 단백질 또는 이의 단편, C5A 프로테아제, 리포테이코산), 에스. 아갈락티에(S. agalactiae), 에스. 뮤탄스(S. mutans); 에이치. 두크레이(H. ducreyi); 모락셀라(Moraxella) 종, 예컨대, 엠. 카타랄리스(M. catarrhalis)(브란하멜라 카타랄리스(Branhamella catarrhalis)라고도 공지됨)(예를 들어, 고 및 저 분자량 부착소 및 인베이신); 보르데텔라(Bordetella) 종, 예컨대, 비. 퍼투시스(B. pertussis)(예를 들어, 퍼탁틴, 백일해 독소 또는 이의 유도체, 사상 헤마글루티닌, 아데닐레이트 사이클라제, 핌브리에), 비. 파라퍼투시스(B. parapertussis) 및 비. 브론치셉티카(B. bronchiseptica); 마이코박테리움(Mycobacterium) 종, 예컨대, 엠. 튜베르쿨로시스(예를 들어, ESAT6, 항원 85A, -B 또는 -C), 엠.보비스(M. bovis), 엠. 레프레, 엠. 아븀(M. avium), 엠. 파라튜베르쿨로시스(M. paratuberculosis), 엠. 스메그마티스(M. smegmatis); 레지오넬라 종, 예컨대, 엘. 뉴모필라(L. pneumophila); 에스케리키아(Escherichia) 종, 예컨대, 장독소 이. 콜라이(E. coli)(예컨대, 집락 인자, 열불안정 독소 또는 이의 유도체, 열안정성 독소 또는 이의 유도체), 장출혈성 이.콜라이, 장병원성 이. 콜라이(예컨대, 시가 독소양 독소 또는 이의 유도체); 비브리오 종, 예컨대, 브이. 콜레라(예를 들어, 콜레라 독소 또는 이의 유도체); 시겔라 종, 예컨대, 에스. 손네이(S. sonnei), 에스. 디센테리에(S. dysenteriae), 에스. 플렉스네리(S. flexnerii); 예르시니아 종, 예컨대, 와이. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica)(예를 들어, Yop 단백질), 와이. 페스티스(Y. pestis), 와이. 슈도튜베르쿨로시스(Y. pseudotuberculosis); 캄필로박터(Campylobacter) 종, 예컨대, 씨. 제주니(C. jejuni)(예컨대, 독소, 부착소 및 인베이신) 및 씨. 콜라이(C. coli); 살모넬라(Salmonella) 종, 예컨대, 에스. 티피(S. typhi), 에스. 파라티피(S. paratyphi), 에스. 콜레라에수스(S. choleraesuis), 에스. 엔테리티디스(S. enteritidis); 리스테리아(Listeria) 종, 예컨대, 엘. 모노사이토제네스(L. monocytogenes); 헬리코박터(Helicobacter) 종, 예컨대, 에이치. 필로리(H. pylori)(예를 들어, 우레아제, 카탈라제, 공포화 독소); 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 예컨대, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa); 스타필로코커스(Staphylococcus) 종, 예컨대, 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 에피더미디스(S. epidermidis); 엔테로코커스(Enterococcus) 종, 예컨대, 이. 페칼리스(E. faecalis), 이. 페슘(E. faecium); 클로스트리디움(Clostridium) 종, 예컨대, 씨. 테타니(C. tetani)(예를 들어, 파상풍 독소 및 이의 유도체), 씨. 보툴리눔(C. botulinum)(예컨대, 보툴리늄 독소 및 이의 유도체), 씨. 디피실(C. difficile)(예컨대, 클로스트리디움 독소 A 또는 B 및 이의 유도체); 바실러스(Bacillus) 종, 예컨대, 비.안트라시스(B.anthracis)(예컨대, 보툴리누스 독소 및 이의 유도체); 코리네박테리움(Corynebacterium) 종, 예컨대, 씨.디프테리에(C. diphtheriae)(예컨대, 디프테리아 독소 및 이의 유도체); 보렐리아(Borrelia) 종, 예컨대, 비. 버그도페리(B. burgdorferi)(예컨대, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 가리니(B. garinii)(예컨대, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 아프젤리(B. afzelii)(예컨대, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 앤더소니(B. andersonii)(예컨대, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 에스. 험시(S. hermsii); 에를리히아(Ehrlichia) 종, 예컨대, 이. 에퀴(E. equi) 및 사람 과립구 에를리히아증 인자; 리케치아(Rickettsia) 종, 예컨대, 알. 리케치(R. rickettsii); 클라미디아(Chlamydia) 종, 예컨대, 씨. 트라코마티스(C. trachomatis)(예컨대, MOMP, 헤파린 결합 단백질), 씨. 뉴모니에(C. pneumoniae)(예컨대, MOMP, 헤파린 결합 단백질), 씨. 프시타시(C. psittaci); 렙토스피라(Leptospira) 종, 예컨대, 엘.인터로간스(L. interrogans); 트레포네마(Treponema) 종, 예컨대, 티. 팔리덤(T. pallidum)(예컨대, 희귀 외막 단백질), 티. 덴티콜라(T. denticola), 티. 히오디센테리에(T. hyodysenteriae); 또는 다른 박테리아 병원균 세균 병원체로부터 유래된다.
특정 다른 실시형태에서, 항원은 1종 이상의 기생충(예를 들어, 문헌[John, D.T. and Petri, W.A., Markell and Voge's Medical Parasitology-9 th Ed., 2006, WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D.D., Georgis' Parasitology for Veterinarians-8 th Ed., 2002, WB Saunders, Philadelphia] 참고), 예컨대, 플라스모듐(Plasmodium) 종, 예컨대, 피. 팔시파럼(P. falciparum); 톡소플라즈마(Toxoplasma) 종, 예컨대, 티. 곤디(T. gondii)(예컨대, SAG2, SAG3, Tg34); 엔트아메바 종, 예컨대, 이.히스토리티카(E. histolytica); 바베시아(Babesia) 종, 예컨대, 비.마이크로티(B. microti); 트리파노소마(Trypanosoma) 종, 예컨대, 티.크루지(T. cruzi); 지아디아(Giardia) 종, 예컨대, 지. 람블리아(G. lamblia); 레쉬마니아(Leshmania) 종, 예컨대, 엘. 메이저(L. major); 뉴모시스티스(Pneumocystis) 종, 예컨대, 피.카리니(P. carinii); 트리코모나스(Trichomonas) 종, 예컨대, 티.바지날리스(T. vaginalis) 유래; 또는 포유동물을 감염시킬 수 있는 연충, 예컨대, (i) 선충 감염(엔테로비우스 버미큘라리스(Enterobiusvermicularis), 아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides), 트리쿠리스 트리쿠리아(Trichuristrichuria), 네카토 아메리카누스(Necator americanus), 안실로스토마 두오데날레(Ancylostoma duodenale), 우체레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti), 브루지아 말라이(Brugia malayi), 온코세르카 볼불루스(Onchocerca volvulus), 드라칸쿨러스 메디넨시스(Dracanculus medinensis), 트리치넬라 스피랄리스(Trichinella spiralis) 및 스트롱질로이데스 스테르코랄리스(Strongyloides stercoralis)을 포함하지만 이들로 제한되지 않음); (ii) 흡충 감염(시스토소마 만소니(Schistosoma mansoni), 시스토소마 헤마토비움(Schistosomahaematobium), 시스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum), 시스토소마 메콩이(Schistosoma mekongi), 오피스토키스 시넨시스(Opisthorchis sinensis), 파라고니무스(Paragonimus) 종, 파시올라 헤파티카(Fasciolahepatica), 파시올라 마그나(Fasciola magna), 파시올라 지간티카(Fasciola gigantica)를 포함하지만 이들로 제한되지 않음); 및 (iii) 촌충 감염(테니아 사기나타(Taenia saginata) 및 테니아 솔륨(Taenia solium)을 포함하지만 이들로 제한되지 않음)으로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 항원은 시스토소마 종, 시스토소마만소니(Schistosoma mansonii), 시스토소마 헤마토븀(Schistosoma haematobium) 및/또는 시스토소마 자포니컴(Schistosoma japonicum)으로부터 유래되거나, 또는 효모, 예컨대, 칸디다 종, 예컨대, 씨. 알비칸스(C. albicans); 크립토코커스 종, 예컨대, 씨. 네오푸르만스(C. neoformans)로부터 유래된다.
다른 구체적인 항원은 엠. 튜베르쿨로시스, 예를 들어 Th Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 및 hTCC1(국제 특허 제WO 99/51748호)으로부터 유래된다. 엠. 튜베르쿨로시스를 위한 단백질은 또한 융합 단백질 및 이의 변이체를 포함하며, 여기서 엠. 튜베르쿨로시스의 적어도 2개, 3개 또는 4개 또는 그 초과의 폴리펩타이드는 더 큰 단백질로 융합된다. 특정 융합체는 Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI(국제 특허 제WO 99151748호)를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 항원은 미국 특허 제US 2010/0129391호 및 국제 특허 제WO 2008/124647호에 기술된 항원, 항원의 조합물 및 융합 단백질을 포함한다. 일 예시적인 실시형태에서, 융합 단백질은 ID93이다. 일 예시적인 실시형태에서, 융합 단백질은 ID91이다.
다른 구체적인 항원은 클라미디아로부터 유래되고, 이것은 예를 들어, 고분자량 단백질(HWMP)(국제 특허 제WO 99/17741호), ORF3(유럽 특허 제EP 366 412호), 및 추정 막 단백질(Pmp)을 포함한다. 다른 클라미디아 항원은 국제 특허 제99128475호에 기술된 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 항원은 에스. 뉴모니에를 비롯한 스트렙토코쿠스 종(예를 들어, 이의 협막 다당류 및 이의 접합체, PsaA, PspA, 스트렙톨리신, 콜린-결합 단백질) 및 단백질 항원 뉴모라이신(Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342), 및 이의 돌연변이 탈독소화된 유도체(국제 특허 제WO 90/06951호; 제WO 99/03884호)로부터 유래될 수 있다. 다른 박테리아 백신은 해모필러스 종(Haemophilus spp), 예컨대, 에이치. 인플루엔자 타입 B(예를 들어 PRP 및 이의 접합체), 비형별성 에이치. 인플루엔자, 예를 들어 OMP26, 고분자량 부착소, P5, P6, 단백질 D 및 지질단백질 D, 및 핌브린 및 핌브린 유래 펩타이드(미국 특허 제5,843,464호) 또는 이의 다중 카피 변이체 또는 융합 단백질로부터 유래된 항원을 포함한다.
다른 구체적인 항원은 B형 간염으로부터 유래된다. B형 간염 표면 항원의 유도체는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 특히, 유럽 특허 출원 제EP-A414 374호; 제EP-A-0304 578호, 및 제EP 198474호에 기술된 상기에 언급된 PreS1, Pars2 S 항원을 포함한다. 일 양상에서, 항원은 특히, CHO 세포에서 발현되는 경우 HIV-1 gp120이다. 추가 실시형태에서, 항원은 gD2t이다.
다른 실시형태에서, 항원은 생식기 사마귀에 책임이 있는 것으로 간주된 인간 유두종 바이러스(HPV)(HPV 6 또는 HPV 11 및 다른 것), 및 자궁경부 암에 책임이 있는 HPV 바이러스(HPV16, HPV18 및 다른 것)으로부터 유래된다. 특정 항원은 L1 입자 또는 캡소머, 및 HPV 6 및 HPV 11 단백질 E6, E7, L1, 및 L2로부터 선택된 1종 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 융합 단백질의 특정 형태는 국제 특허 제WO 96/26277호에 개시된 바와 같은 L2E7, 및 영국 특허 GB 9717953.5(PCT/EP98/05285)호에 기술된 단백질 D(1/3)-E7을 포함한다. 추가적인 가능한 항원은 HPV 16 또는 18 항원을 포함한다. 예를 들어, L1 또는 L2 항원 단량체, 또는 L1 또는 L2 항원은 바이러스 유사 입자(VLP)로서 함께 제공하였거나, 또는 L1 단독 단백질은 VLP 또는 캡소머 구조로 단독으로 제공하였다. 이러한 항원, 바이러스 유사 입자 및 캡소머는 그 자체로 공지되어 있다(예를 들어 WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792, 및 WO93/02184호 참고).
다른 실시형태에서, 항원은 융합 단백질이다. 융합 단백질은 단독으로서, 또는 융합 단백질, 예컨대, 예를 들어, E7, E2 또는 F5로서 포함될 수 있고; 특별한 실시형태는 L1E7 융합 단백질을 포함하는 VLP를 포함한다(국제 특허 제WO 96/11272호). 특별한 HPV 16 항원은 HPV 16 또는 이들의 조합물로부터의 단백질 D-E6 또는 E7 융합체; 또는 E6 또는 E7과 L2의 조합물을 형성하도록 단백질 D 담체와 융합되어 초기 단백질 E6 또는 F7을 포함한다(WO 96/26277). 대안적으로 HPV 16 또는 18 초기 단백질 E6 및 E7은 단일 분자, 단백질 D-E6/E7 융합체로 존재할 수 있다. 조성물은 예를 들어 단백질 D-E6 또는 단백질 D-E7 융합 단백질 또는 단백질 D E6/E7 융합 단백질의 형태로, HPV 18 앞에 E6 및 E7 단백질 중 하나 또는 둘 모두를 임의로 함유할 수 있다. 조성물은 다른 HPV 균주, 예를 들어 균주 HPV 31 또는 33으로부터의 항원을 추가로 포함할 수 있다.
항원은 또한 말라리아를 유발하는 기생충으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 플라스모디아 팔시파럼(Plasmodia falciparum)으로부터의 항원은 RTS,S 및 TRAP를 포함한다. RTS는 B형 간염 표면 항원의 프리S2의 4개의 아미노산을 통해서 B형 간염 바이러스의 표면(S) 항원에 연결된 피. 팔시파럼의 포자소체(circumsporozoite: CS) 단백질의 실질적으로 모든 C-말단 부분을 포함하는 혼성 단백질이다. 이의 전체 구조는 영국 특허 출원 제9124390.7호로부터 우선권을 주장하는, 국제 특허 제WO 93/10152로서 공개된, 국제 특허 출원 제PCT/EP92/02591호에 개시되어 있다. 효모에서 발현되는 경우 RTS는 지질단백질 입자로서 생산되고, 그것이 HBV로부터의 S 항원과 공동발현되는 경우, 그것은 RTS,S로서 공지된 혼합된 입자를 생산한다.
TRAP 항원은 국제 특허 제WO 90/01496호로서 공개된 국제 특허 출원 제PCT/GB89/00895호에 기술되어 잇다. 본 발명의 실시형태는 말라리아 백신이며, 여기서 항원 제제는 RTS,S 항원과 TRAP 항원의 조합물을 포함한다. 다단계 말라리아 백신의 구성성분일 후보 가능성이 있는 다른 플라스모디아 항원은 피. 파시파럼(P. faciparum) MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 세퀘스트린(Sequestrin), PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27125, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 및 이들의 플라스모듐 종의 유사체이다.
일 실시형태에서, 항원은 암 세포로부터 유래되는데, 그 이유는 암의 면역요법 치료에 유용할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 항원은 종양 거부 항원, 예컨대, 전립선암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 췌장암, 신장암 또는 흑색종 암일 수 있다. 예시적인 암 또는 암 세포-유래 항원은 MAGE 1, 3 및 MAGE 4 또는 다른 MAGE 항원, 예컨대, 국제 특허 제WO99/40188호에 기술된 것, PRAME, BAGE, Lage(NY Eos 1이라고도 공지됨) SAGE 및 HAGE(국제 특허 제WO 99/53061호) 또는 GAGE(Robbins and Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 & 1998); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p.293)를 포함한다. 암 항원의 이러한 비제한적인 예는 광범위한 종양 유형, 예컨대, 흑색종, 폐 암종, 육종 및 방광 암종에서 발현된다(예를 들어, 미국 특허 제 No.6,544,518호 참고).
다른 종양-특이적 항원은 종양-특이적 또는 종양-연관 강글리오사이드, 예컨대, GM2, 및 GM3 또는 담체 단백질에 대한 이의 접합체; 또는 자가 펩타이드 호르몬, 예컨대, 전장 고나도트로핀 호르몬 방출 호르몬(GnRH, 국제 특허 제WO 95/20600호), 다수의 암의 치료에 유용한 짧은 10개 아미노산 길이의 펩타이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 또 다른 실시형태 전립선 항원, 예컨대, 전립선 특이적 항원(PSA), PAP, PSCA(예를 들어, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95(4) 1735-1740 1998), PSMA 또는, 일 실시형태에서 프로스타제로서 공지된 항원이 사용된다(예를 들어, 문헌[Nelson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 3114-3119; Ferguson, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96, 3114-3119]; 국제 특허 제WO 98/12302호; 미국 특허 제5,955,306호; 국제 특허 제WO 98/20117호; 미국 특허 제5,840,871호 및 제5,786,148호; 국제 특허 제WO 00/04149호). 다른 전립선 특이적 항원은 국제 특허 제WO 98/137418호, 및 제WO/004149호로부터 공지되어 있다. 또 다른 것은 STEAP(PNAS 96 14523 14528 7-12 1999)이다.
본 발명의 맥락에서 유용한 다른 종양 연관 항원은 하기를 포함한다: Plu-1(J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HasH-2, Cripto(Salomon et al Bioessays 199, 21:61-70, 미국 특허 제5,654,140호) 및 크립틴(미국 특허 제5,981,215호). 추가로, 특히 암의 요법에서 백신과 특히 관련된 항원은 타이로사니제 및 서바이빈을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물에서 사용되는 작용제는 병태, 예컨대, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)의 예방 및 치료를 위해서, 호흡기 질환, 예컨대, 박테리아 감염에 의해서 유발되거나 악화되는 것(예를 들어, 폐렴구균성)과 연관된 항원을 포함한다. COPD는 만성 기관지염 및/또는 폐기종을 갖는 환자에서 비가역적 또는 부분 가역적인 기도 폐쇄의 존재 의해서 생리학적으로 정의된다(Am J Respir Crit Care Med.1995 Nov;152(5 Pt 2):S77-121). COPD의 악화는 종종 박테리아(예를 들어, 폐렴구균성) 감염에 의해서 유발된다(Clin Microbiol Rev. 2001 Apr;14(2):336-63).
폴리뉴클레오타이드
일부 실시형태에서 작용제는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 압타머, 및 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서 폴리뉴클레오타이드는 DNA이다. 일부 실시형태에서 폴리뉴클레오타이드는 RNA이다. 일부 실시형태에서, DNA 또는 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥이다. 일부 실시형태에서 폴리뉴클레오타이드는 비-암호 RNA이다. 일부 실시형태에서 폴리뉴클레오타이드는 암호 RNA이다. 일부 실시형태에서 RNA는 레플리콘 RNA, mRNA, tRNA, siRNA, shRNA, 및 마이크로RNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 항원이거나 또는 항원을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 폴리펩타이드는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이에 의해서 암호화된 폴리펩타이드는 LecA이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 폴리펩타이드는 H5N1이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드에 의해서 암호화된 폴리펩타이드는 ID93이다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 레플리콘이다. 일부 실시형태에서, 레플리콘은 그 자신의 제어 하에서 더 크게 복제할 수 있는 플라스미드, 코스미드, 바크미드, 파지 또는 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 레플리콘은 RNA 또는 DNA이다. 일부 실시형태에서, 레플리콘은 단일 또는 이중 가닥이다. 일부 실시형태에서, 레플리콘은 RNA 바이러스로부터 유래된다.
아주반트
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 페길화된 리포솜은 아주반트를 추가로 포함하거나 또는 보조-아주반트와 함께 공동 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 아주반트는 레티노산(RA), AS-2, 모노포스포릴 지질 A, 3-탈-O-아세틸화된 모노포스포릴 지질 A, IFA, QS21, CWS, TOM, AGP, CpG-함유 올리고뉴클레오타이드, 톨-유사 수용체(TLR) 효능제, 레이프(Leif), 사포닌, 사포닌 모방체, 생물 및 합성 지질 A, 이미퀴모드, 가드퀴모드, 레시퀴모드, 폴리I:C, 플라젤린, GLA, SLA, 스틴진(Stingin), 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
유기체
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 페길화된 리포솜은 유기체, 예를 들어, 엔트아메바 히스톨리티카, 인플루엔자-유발 바이러스, 또는 결핵(TB)을 유발하는 박테리아 마이코박테리아 튜베르쿨로시스를 포함한다. 현재, 간 박테리아로의 백신접종이 결핵에 대한 보호 면역을 유도하기 위한 가장 효율적인 방법이다. 이러한 목적을 위해서 사용되는 가장 일반적인 마이코박테리아는 마이코박테리아 보비스의 비병원성 균주인 바실리우스 칼메트-게렝(BCG)이다. 따라서 일부 실시형태에서 조성물은 페길화된 리포솜 및 마이코박테리아를 포함한다.
일부 실시형태에서 작용제는 바이러스 또는 바이러스 게놈이다. 따라서, 이들 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 바이러스 또는 바이러스 게놈을 포함한다.
F. 예시적인 페길화된 리포솜
특정 실시형태에서, 본 발명의 페길화된 리포솜 중의 비-페길화된 중성 지질:콜레스테롤:페길화된 지질의 지질 몰비는 약 9.8:5.7:0.8이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 페길화된 리포솜 중의 비-페길화된 중성 지질:콜레스테롤:페길화된 지질의 지질 몰비는 약 18:5.5:3이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 페길화된 리포솜 중의 비-페길화된 중성 지질 DPPC:콜레스테롤:페길화된 지질 DPPE-PEG750의 지질 몰비는 약 9.8:5.7:0.8이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 페길화된 리포솜 중의 비-페길화된 중성 지질 DPPC:콜레스테롤:페길화된 지질 DPPE-PEG2000의 지질 몰비는 약 9.8:5.7:0.8이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 페길화된 리포솜 중의 비-페길화된 중성 지질 DPPC:콜레스테롤:페길화된 지질 DPPE-PEG750의 지질 몰비는 약 18:5.5:3이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG2000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG750이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 LecA 항원, GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG2000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 LecA 항원, GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG750이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 H5N1 항원, GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG2000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 H5N1 항원, GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG750이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 ID93 항원, GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG2000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 ID93 항원, GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG750이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 ID91 항원, GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG2000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 ID91 항원, GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG750이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 3M-052, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG2000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 3M-052, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG 750이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 3M-052 및 GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG2000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 3M-052 및 GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG750이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 LecA 항원, 3M-052 및 GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG2000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 LecA 항원, 3M-052 및 GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG750이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 H5N1 항원, 3M-052 및 GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG2000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 H5N1 항원, 3M-052 및 GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG750이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 결핵-관련 항원, HIV-관련 항원, 암-관련 항원, 아메바성감염-관련 항원, 인플루엔자-관련 항원, 또는 간염-관련 항원, TLR 효능제, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG2000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 결핵-관련 항원, HIV-관련 항원, 암-관련 항원, 아메바성감염-관련 항원, 인플루엔자-관련 항원, 또는 간염-관련 항원, TLR 효능제, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG750이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 결핵-관련 항원, HIV-관련 항원, 암-관련 항원, 아메바성감염-관련 항원, 인플루엔자-관련 항원, 또는 간염-관련 항원, GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG2000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 결핵-관련 항원, HIV-관련 항원, 암-관련 항원, 아메바성감염-관련 항원, 인플루엔자-관련 항원, 또는 간염-관련 항원, GLA, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG750이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 결핵-관련 항원, HIV-관련 항원, 암-관련 항원, 아메바성감염-관련 항원, 인플루엔자-관련 항원, 또는 간염-관련 항원, 3M-052, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG2000이다.
특정 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 결핵-관련 항원, HIV-관련 항원, 암-관련 항원, 아메바성감염-관련 항원, 인플루엔자-관련 항원, 또는 간염-관련 항원, 3M-052, 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질을 포함하며, 여기서 PEG 구성성분은 PEG750이다.
III. 페길화된 리포솜의 생리화학적 특징
A. 크기
본 명세서에 제공된 바와 같이, 페길화된 리포솜의 크기는 약 1㎚ 내지 450㎚ 범위이고, 이것은 페길화된 나노리포솜인 것으로 간주될 수 있다. 이러한 나노리포솜은 제조가 용이하고, 필터 멸균가능하다. 추가로, 생체내에서, 작용제(예를 들어, 항원 및/또는 아주반트)를 포함하는 이러한 나노리포솜의 전달은 전형적으로 데포(depot) 효과의 발생을 나타내지 않거나 또는 감소시킨다. 더욱이, 작용제(예를 들어, 항원 및/또는 아주반트)를 포함하는 이러한 나노리포솜의 생체내 전달은 드레이닝 림프절(draining lymph node)로의 전달을 허용하고, 항원 제시 세포에 대한 제시를 허용하고, 효과적인 Th1-기반 면역 반응의 생성을 허용한다.
일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜의 크기는 x-선 및 레이저 회절, 동적 광 산란(DLS), CryoEM, 또는 말버른 제타사이즈(Malvern Zetasize)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 관련 기술 분야에서 공지된 기술에 의해서 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜의 크기는 Z-평균 직경을 지칭한다.
일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 크기는 약 50㎚ 내지 75㎚ 범위이다. 일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 크기는 약 50㎚ 내지 100㎚ 범위이다. 일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 크기는 약 50㎚ 내지 150㎚ 범위이다. 일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 크기는 약 50㎚ 내지 200㎚ 범위이다. 일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 크기는 약 50㎚ 내지 300㎚ 범위이다. 일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 크기는 약 20㎚ 내지 100㎚ 범위이다. 일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 크기는 약 20㎚ 내지 50㎚ 범위이다. 일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 크기는 약 10㎚ 내지 200㎚ 범위이다. 일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 크기는 약 10㎚ 내지 100㎚ 범위이다. 일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 크기는 약 10㎚ 내지 50㎚ 범위이다. 일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 크기는 약 1㎚이거나, 약 5㎚이거나, 약 10㎚이거나, 약 15㎚이거나, 약 20㎚이거나, 약 25㎚이거나, 약 30㎚이거나, 약 35㎚이거나, 약 40㎚이거나, 약 45㎚이거나, 약 50㎚이거나, 약 55㎚이거나, 약 60㎚이거나, 약 65㎚이거나, 약 70㎚이거나, 약 75㎚이거나, 약 80㎚이거나, 약 85㎚이거나, 약 90㎚이거나, 약 95㎚이거나, 약 100㎚이거나, 약 105㎚이거나, 약 110㎚이거나, 약 115㎚이거나, 약 120㎚이거나, 약 125㎚이거나, 약 130㎚이거나, 약 135㎚이거나, 약 140㎚이거나, 약 145㎚이거나, 약 150㎚이거나, 약 155㎚이거나, 약 160㎚이거나, 약 165㎚이거나, 약 170㎚이거나, 약 175㎚이거나, 약 180㎚이거나, 약 185㎚이거나, 약 190㎚이거나, 약 195㎚이거나, 약 200㎚이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜의 크기는 약 1㎚ 이하, 약 5㎚ 이하, 약 10㎚ 이하, 15㎚ 이하, 20㎚ 이하, 25㎚ 이하, 약 30㎚, 약 35㎚ 이하, 약 40㎚ 이하, 약 45㎚ 이하, 약 50㎚ 이하, 약 55㎚ 이하, 약 60㎚ 이하, 약 65㎚ 이하, 약 70㎚ 이하, 약 75㎚ 이하, 약 80㎚ 이하, 약 85㎚ 이하, 약 90㎚ 이하, 약 95㎚ 이하, 약 100㎚ 이하, 약105㎚ 이하, 약 110㎚ 이하, 약 115㎚ 이하, 약 120㎚ 이하, 약 125㎚ 이하, 약 130㎚ 이하, 약 135㎚ 이하, 약 140㎚ 이하, 약 145㎚ 이하, 약 150㎚ 이하, 약 155㎚ 이하, 약 160㎚ 이하, 약 165㎚ 이하, 약 170㎚ 이하, 약 175㎚ 이하, 약 180㎚ 이하, 약 185㎚ 이하, 약 190㎚ 이하, 약 195㎚ 이하, 또는 약 199㎚ 이하이다.
본 명세서에 제공된 바와 같이, 바람직한 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 적어도 0.45마이크론 필터를 통해서 여과될 수 있다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 0.45마이크론보다 작은 필터를 통해서 여과될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 0.20 또는 0.22마이크론 필터를 통해서 여과될 수 있다.
B. 안정성
본 명세서에 제공된 페길화된 리포솜은 안정적이어서, 사용 용이성, 제조성, 이송성, 및 저장을 허용한다. 본 발명자들은 리포솜을 페길화하는 것이 리포솜의 안정성에 기여한다는 것을 발견하였다. 크기를 포함하지만 이것으로 제한되지 않는 페길화된 리포솜의 생리화학적 특징은 다양한 온도 및 다양한 조건 하에서 시간 경과에 따라서 유지된다.
일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 페길화된 지질의 부재 하의 리포솜과 비교할 때 감소된 응집을 나타내거나 응집이 없다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜 또는 페길화된 리포솜으로 구성된 조성물은 이의 초기 크기와 비교하는 경우 시간 경과에 따라서 응집하지 않거나, 응집을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않거나, 감소된 응집을 나타내거나 평균 크기의 전체 증가를 나타내지 않는다.
페길화된 리포솜의 안정성은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 친숙한 기술에 의해서 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 안정성은 육안으로 관찰된다. 육안 검사는 미립자, 집합체(flocculence) 또는 응집물에 대한 검사를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 안정성은 페길화된 리포솜의 크기에 의해서 결정되고, 임의로 시간 경과에 따라서 또는 다양한 온도에서 또는 특정 조건 하에서 크기의 변화로서 표현된다. 일부 실시형태에서, 안정성은 조성물 중의 페길화된 리포솜의 응집%를 평가함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, 안정성은 특별한 크기의 필터, 예를 들어 0.20, 0.22 또는 0.45마이크론 필터를 통과하는 페길화된 리포솜의 능력에 의해서 평가된다. 일부 실시형태에서, 안정성은 pH에 의해서 결정된다. 일부 실시형태에서, 안정성은 예를 들어, 동적 광 산란(DLS) 기술의 사용에 의해서 다분산 지수(PdI)의 측정에 의해서 결정된다.
일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜의 Z-평균 직경은 검정된 시간 기간에 걸쳐서 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 12% 미만, 10% 미만, 7% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 1% 미만 증가한다.
일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 0 내지 8℃에서 안정적이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 또는 8℃에서 적어도 1분 동안, 적어도 5분 동안, 적어도 10분 동안, 적어도 15분 동안, 적어도 20분 동안, 적어도 25분 동안, 적어도 30분 동안, 적어도 35분 동안, 적어도 40분 동안, 적어도 45분 동안, 적어도 50분 동안, 적어도 55분 동안, 적어도 1시간 동안, 적어도 2시간 동안, 적어도 6시간 동안, 적어도 12시간 동안, 적어도 18시간 동안, 적어도 24시간 동안, 적어도 48시간 동안, 적어도 72시간 동안, 적어도 1주 동안, 적어도 2주 동안, 적어도 3주 동안, 적어도 1개월 동안, 적어도 2개월 동안, 적어도 3개월 동안, 적어도 4개월 동안, 적어도 5개월 동안, 적어도 6개월 동안, 적어도 7개월 동안, 적어도 8개월 동안, 적어도 9개월 동원, 적어도 10개월 동안, 적어도 11개월 동안, 적어도 1년 동안, 적어도 2년 동안, 또는 적어도 5년 동안 안정적이다. 일 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정적이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 약 4℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정적이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 약 4℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 6개월 동안 안정적이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 약 4℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 1년 동안 안정적이다.
일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 8 내지 20℃에서 안정적이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 8 내지 20℃에서 적어도 1분 동안, 적어도 5분 동안, 적어도 10분 동안, 적어도 15분 동안, 적어도 20분 동안, 적어도 25분 동안, 적어도 30분 동안, 적어도 35분 동안, 적어도 40분 동안, 적어도 45분 동안, 적어도 50분 동안, 적어도 55분 동안, 적어도 1시간 동안, 적어도 2시간 동안, 적어도 6시간 동안, 적어도 12시간 동안, 적어도 18시간 동안, 적어도 24시간 동안, 적어도 48시간 동안, 적어도 72시간 동안, 적어도 1주 동안, 적어도 2주 동안, 적어도 3주 동안, 적어도 1개월 동안, 적어도 2개월 동안, 적어도 3개월 동안, 적어도 4개월 동안, 적어도 5개월 동안, 적어도 6개월 동안, 적어도 7개월 동안, 적어도 8개월 동안, 적어도 9개월 동안, 적어도 10개월 동안, 적어도 11개월 동안, 적어도 1년 동안, 적어도 2년 동안, 또는 적어도 5년 동안 안정적이다. 일 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 약 8℃ 내지 약 20℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정적이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 동안 안정적이다 적어도 1개월 약 8℃ 내지 약 20℃의 온도에서. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 약 8℃ 내지 약 20℃의 온도에서 적어도 6개월 동안 안정적이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 약 8℃ 내지 약 20℃의 온도에서 적어도 1년 동안 동안 안정적이다.
일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 20 내지 30℃에서 안정적이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 25℃에서 적어도 1분 동안, 적어도 5분 동안, 적어도 10분 동안, 적어도 15분 동안, 적어도 20분 동안, 적어도 25분 동안, 적어도 30분 동안, 적어도 35분 동안, 적어도 40분 동안, 적어도 45분 동안, 적어도 50분 동안, 적어도 55분 동안, 적어도 1시간 동안, 적어도 2시간 동안, 적어도 6시간 동안, 적어도 12시간 동안, 적어도 18시간 동안, 적어도 24시간 동안, 적어도 48시간 동안, 적어도 72시간 동안, 적어도 1주 동안, 적어도 2주 동안, 적어도 3주 동안, 적어도 1개월 동안, 적어도 2개월 동안, 적어도 3개월 동안, 적어도 4개월 동안, 적어도 5개월 동안, 적어도 6개월 동안, 적어도 7개월 동안, 적어도 8개월 동안, 적어도 9개월 동안, 적어도 10개월 동안, 적어도 11개월 동안, 적어도 1년 동안, 적어도 2년 동안, 또는 적어도 5년 동안 안정적이다. 일 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 약 25℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정적이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 약 25℃의 온도에서 적어도 6개월 동안 안정적이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 약 25℃의 온도에서 적어도 1년 동안 안정적이다.
일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 30 내지 40℃에서 안정적이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 또는 40℃에서 적어도 1분 동안, 적어도 5분 동안, 적어도 10분 동안, 적어도 15분 동안, 적어도 20분 동안, 적어도 25분 동안, 적어도 30분 동안, 적어도 35분 동안, 적어도 40분 동안, 적어도 45분 동안, 적어도 50분 동안, 적어도 55분 동안, 적어도 1시간 동안, 적어도 2시간 동안, 적어도 6시간 동안, 적어도 12시간 동안, 적어도 18시간 동안, 적어도 24시간 동안, 적어도 48시간 동안, 적어도 72시간 동안, 적어도 1주 동안, 적어도 2주 동안, 적어도 3주 동안, 적어도 1개월 동안, 적어도 2개월 동안, 적어도 3개월 동안, 적어도 4개월 동안, 적어도 5개월 동안, 적어도 6개월 동안, 적어도 7개월 동안, 적어도 8개월 동안, 적어도 9개월 동안, 적어도 10개월 동안, 적어도 11개월 동안, 적어도 1년 동안, 적어도 2년 동안, 또는 적어도 5년 동안 안정적이다. 일 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 약 37℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정적이다.
일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 40 내지 62℃에서 안정적이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 40 내지 62℃에서 적어도 1분 동안, 적어도 5분 동안, 적어도 10분 동안, 적어도 15분 동안, 적어도 20분 동안, 적어도 25분 동안, 적어도 30분 동안, 적어도 35분 동안, 적어도 40분 동안, 적어도 45분 동안, 적어도 50분 동안, 적어도 55분 동안, 적어도 1시간 동안, 적어도 2시간 동안, 적어도 6시간 동안, 적어도 12시간 동안, 적어도 18시간 동안, 적어도 24시간 동안, 적어도 48시간 동안, 적어도 72시간 동안, 적어도 1주 동안, 적어도 2주 동안, 적어도 3주 동안, 적어도 1개월 동안 안정적이다.
일 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 4 내지 8℃에서 적어도 1년 동안 안정적이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 25℃에서 적어도 1년 동안 안정적이다.
일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 1 내지 5회 동결 해동 후에 안정적이다. 일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜은 1회, 2회, 3회, 4회, 또는 5회 동결 해동 후에 안정적이다.
일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 다분산 지수는 약 0.3 이하로 유지된다. 일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 다분산 지수는 약 0.25 이하로 유지된다. 일부 실시형태에서 페길화된 리포솜의 다분산 지수는 약 0.2 이하로 유지된다.
IV. 페길화된 리포솜의 제조 방법
본 명세서에 제공된 바와 같이, 페길화된 리포솜의 제조 방법은 (a) 비-페길화된 중성 지질, 페길화된 지질, 및 콜레스테롤을 유기 용매 중에서 혼합하는 단계; (b) 유기 용매를 증발시킴으로써, 지질막을 생성시키는 단계; (c) 지질막을 완충액 중에서 재수화시키는 단계; 및 (d) 고에너지 투입원(예를 들어, 초음파처리, 미소유동화, 압출)을 단계 (c)의 재수화된 생성물에 적용하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 고에너지 투입원은 미소유동화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 고에너지 투입원은 초음파처리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 고에너지 투입원은 압출을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유기 용매는 클로로폼 또는 클로로폼/메탄올/물 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 단계 (a)는 TLR 효능제를 다른 구성성분과 혼합하는 것을 추가로 포함한다.
예시적인 실시형태에서, DPPC, 콜레스테롤, 및 DPPE-PEG750을 유기 용매(클로로폼 또는 클로로폼/메탄올/물 혼합물) 중에서 다양한 양의 3M-052와 배합한다. 이어서 유기 용매를 증발시킨다. 생성된 지질막을 완충액 중에 재수화시키고, 큰 가시적인 입자가 없이 제형이 반투명해질 때까지 초음파처리한다. 더 큰 배취(100 ㎖)의 페길화된 리포솜을 상기와 같이 그러나 더 짧은 초음파처리 시간 그 다음 고전단 균질화를 사용하여 제조할 수 있다.
일부 실시형태에서, 생성된 페길화 리포솜을 작용제(예를 들어, 항원)와 혼합한다.
V. 페길화된 리포솜을 포함하는 조성물
본 명세서에는 본 명세서에 기술된 페길화된 리포솜을 포함하는 제형, 조성물, 및 약제학적 조성물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 페길화된 리포솜을 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기술된 조성물은 임의의 백신접종, 치료 또는 진단 목적을 위해서 대상체에게 투여될 수 있다.
약제학적 조성물은 일반적으로 본 명세서에 기술된 조성물을 포함하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 조합하여, 항원, 추가적인 효능제 또는 재조합 발현 작제물로부터 선택된 본 명세서에 제공된 바와 같은 1종 이상의 구성성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.45마이크론 필터를 통해서 여과될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.20마이크론 필터를 통해서 여과될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.22마이크론 필터를 통해서 여과될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 TLR7/8 효능제 또는 TLR4 효능제를 포함하는 페길화된 리포솜을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 "단일요법"을 위해서 사용될 수 있으며, 여기서 본 명세서에 기술된 바와 같은, TLR7/8 효능제 또는 TLR 4 효능제는 조성물 중에 제형화되어 있고, 조성물은 다른 항원이 실질적으로 존재하지 않고, 질환 또는 다른 병태, 예컨대, 유기체에 의한 감염을 진단, 치료 또는 예방하려는 목적을 위해서, 면역 반응, 예를 들어, 비-특이적 면역 반응 또는 항원-특이적 면역 반응을 자극하기 위해서 대상체에게 투여된다.
다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기술된 조성물 및 항원 둘 모두를 포함하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 조합하여, 본 명세서에 제공된 바와 같은, 1종 이상의 구성성분을 추가로 포함할 수 있는 백신 조성물이다. 예시적인 담체는 통상적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수령자에게 비독성이다.
본 명세서에는 제공된 치료 실시형태에서, 치료적 약제학적 조성물의 약 1㎍/㎏ 내지 약 1㎎/㎏의 투여량이 투여된다. 투여 횟수 및 빈도는 대상체의 반응에 좌우될 것이라는 것이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
본 명세서에 제공된 백신-기반 실시형태에서, 약 1ug 내지 25ug의 작용제(예를 들어 아주반트, 또는 항원)이 투여당 투여될 것이다. 투여 횟수 및 빈도는 대상체의 반응에 좌우될 것이라는 것이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
치료 용도를 위한 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 약제학적 분야에서 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit.1985)]에 기술되어 있다. 생리 pH에서 예를 들어, 멸균 염수 및 인산염-완충 염수가 사용될 수 있다. 보존제, 안정화제, 염료 및 심지어는 착향료가 약제학적 조성물 중에 제공될 수 있다. 예를 들어, 소듐 벤조에이트, 솔브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스터가 보존제로서 첨가될 수 있다(1449에서 Id.). 또한, 항산화제 및 현탁화제가 사용될 수 있다(Id.).
"약제학적으로 허용 가능한 염"은 이러한 화합물과 유기산 또는 무기산(산 부가염) 또는 유기 염기 또는 무기 염기(염기 부가염)의 조합물로부터 유래된 본 발명의 화합물의 염을 지칭힌다. 본 발명의 조성물은 유리 염기 또는 염 형태 중 어느 하나로 사용될 수 있고, 두 형태 모두는 본 발명의 범주 내이다.
약제학적 조성물은 조성물이 환자에게 투여되도록 하는 임의의 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 고체, 액체 또는 기체(에어로졸)의 형태로 존재할 수 있다. 전형적인 투여 경로는 경구, 국소, 비경구, 설하, 협측, 직장, 질, 정맥내, 피내, 경피, 비내, 점막내, 또는 피하를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 용어 비경구는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 이온영동(iontophoretic)(예를 들어, 미국 특허 제7,033,598호; 제7,018,345호; 제6,970,739호), 초음파영동(sonophoretic)(예를 들어, 미국 특허 제4,780,212호; 제4,767,402호; 제4,948,587호; 제5,618,275호; 제5,656,016호; 제5,722,397호; 제6,322,532호; 제6,018,678호), 열(예를 들어, 미국 특허 제5,885,211호; 제6,685,699호), 수동 경피(예를 들어, 미국 특허 제3,598,122호; 제3,598,123호; 제4,286,592; 4,314,557호; 제4,379,454호; 제4,568,343호; 제5,464,387호; 영국 특허 제2232892호; 미국 특허 제6,871,477호; 제6,974,588호; 제6,676,961호), 마이크로니들(예를 들어, 미국 특허 제6,908,453호; 제5,457,041호; 제5,591,139호; 제6,033,928호) 투여 및 또한 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내, 해면내(intracavernous), 척추강내, 관내(intrameatal), 요도내 주사 또는 융합 기술을 포함한다. 특별한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물(백신 및 약제학적 조성물 포함)은 이온영동, 미세공동화, 초음파영동 또는 마이크로니들로부터 선택된 기술에 의해서 피내에 투여된다.
약제학적 조성물은 조성물을 대상체에게 투여할 때 그 중에 함유된 활성 성분이 생체 적합해지도록 제형화될 수 있다. 대상체에게 투여될 조성물은 하나 이상의 투여 단위의 형태를 보유하고, 여기서 예를 들어 정제가 단일 투여 단위일 수 있고, 에어로졸 형태의 본 발명의 1종 이상의 화합물의 용기가 복수의 투여 단위를 보유할 수 있다.
경구 투여의 경우, 부형제 및/또는 결합제가 존재할 수 있다. 예는 수크로스, 카올린, 글리세린, 전분 덱스트린, 소듐 알지네이트, 카복시메틸셀룰로스 및 에틸 셀룰로스이다. 착색제 및/또는 착향료가 존재할 수 있다. 코팅 쉘이 사용될 수 있다.
조성물은 액체, 예를 들어, 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀션 또는 현탁액의 형태로 존재할 수 있다. 액체는 두 예로서, 경구 투여용 또는 주사에 의한 전달용일 수 있다. 경구 투여를 위해서 의도되는 경우, 조성물은 감미료, 보존제, 염료/착색제 및 향미 향상제 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 주사에 의해서 투여되려고 의도되는 조성물에서, 계면활성제, 보존제, 분산제, 현탁화제, 완충액, 안정화제 및 등장제 중 1종 이상이 포함될 수 있다.
용액의 형태이든, 현탁액의 형태이든 또는 다른 유사한 형태의 형태이든 간에 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 액체 약제학적 조성물은 하기 담체 또는 부형제 중 1종 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대, 주사용수, 멸균 용액, 바람직하게는 생리 염수, 링거 용액, 등장성 염화나트륨, 고정유, 예컨대, 스쿠알렌, 스쿠알란, 광유, 만나이드 모노올레이트, 콜레스테롤, 및/또는 합성 모노 또는 다이글리세리드(용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있음), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항균제, 예컨대, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 예컨대, 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충액, 예컨대, 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트 및 등장성의 조정을 위한 작용제, 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로즈.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 에어로졸화될 수 있는 방식으로 제형화된다.
약제학적 조성물 중에 다른 구성성분, 예컨대, 알루미늄염, 유중수 에멀션(water-in-oil emulsion), 생분해성 오일 비히클, 수중유 에멀션, 생분해성 마이크로캡슐 및 리포솜을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 전달 비히클을 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이러한 비히클에서 사용하기 위한 추가적인 면역자극 물질(보조-아주반트)의 예가 또한 상기에 기술되어 있고, N-아세틸무라밀-L-알라닌-D-아이소글루타민(MDP), 글루칸, IL-12, GM-CSF, 감마 인터페론 및 IL-12를 포함할 수 있다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 담체가 본 발명의 약제학적 조성물에서 사용될 수 있지만, 담체의 유형은 투여 경로 및 지속 방출형이 바람직한지의 여부에 따라서 달라질 것이다. 비경구 투여, 예컨대, 피하 주사의 경우, 담체는 물, 염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충액을 포함할 수 있다. 경구 투여의 경우, 상기 담체 중 임의의 것 또는 고체 담체, 예컨대, 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈쿰, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스 및 탄산마그네슘이 사용될 수 있다. 생분해성 미소구체(예를 들어, 폴리락트 갈락타이드)이 또한 본 발명의 약제학적 조성물을 위한 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 생분해성 미소구체는 예를 들어, 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 개시되어 있다. 이와 관련하여, 미소구체는 대략 25마이크론보다 큰 것이 바람직할 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 희석제, 예컨대, 완충액, 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트린을 비롯한 탄수화물, 킬레이트제, 예컨대, EDTA, 글루타티온 및 다른 안정화제 및 부형제를 함유할 수 있다. 중성 완충 염수 또는 비특이적 혈청 알부민과 혼합된 염수가 예시적으로 적절한 희석제이다. 예를 들어, 생성물은 희석제로서 적절한 부형제 용액(예를 들어, 수크로스)을 사용하여 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물은 국소 투여를 위해서 의도될 수 있고, 이러한 경우에 담체는 용액, 에멀션, 연고 또는 젤 베이스를 적합하게 포함할 수 있다. 베이스는 예를 들어, 하기 중 1종 이상을 포함할 수 있다: 페트롤라텀, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 비즈왁스, 광유, 희석제, 예컨대, 물 및 알코올, 및 유화제 및 안정화제. 증점제가 국소 투여를 위한 약제학적 조성물 중에 존재할 수 있다. 경구 투여가 의도되는 경우, 조성물은 경피 패치 또는 이온영동 장치를 포함할 수 있다. 국소 제형은 약 0.1 내지 약 10% w/v(단위 부피당 중량)의 항원(예를 들어, GLA-항원 백신 조성물) 또는 GLA(예를 들어, 면역학적 아주반트 조성물; GLA는 아반티 폴라 리피즈, 인크.(Avanti Polar Lipids, Inc.)(미국 알라바마주 알라바스터 소재)로부터 입수 가능함; 예를 들어, 제품 번호 699800)의 농축물을 함유할 수 있다.
조성물은 예를 들어, 직장에서 용해되어 약물을 방출할 수 있는 좌약의 형태로 직장 투여를 위해서 의도될 수 있다. 직장 투여를 위한 조성물은 적합한 비자극성 부형제로서 유성 베이스를 함유할 수 있다. 이러한 베이스는 라놀린, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 방법에서, 약제학적 조성물/아주반트는 삽입물(들), 비드(들), 시간 제어-방출 제형(들), 패치(들) 또는 신속-방출 제형(들)의 사용을 통해서 투여될 수 있다.
VI. 페길화된 리포솜의 사용 방법
본 명세서에는 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공되며, 이 방법은 페길화된 리포솜 및 본 명세서에 제공된 페길화된 리포솜을 포함하는 조성물 중 임의의 하나를 투여하는 단계를 포함한다. 페길화된 리포솜 및 조성물은 백신접종, 치료제 및 진단제를 위한 용도가 발견된다.
일 실시형태에서, 페길화된 리포솜 조성물은 암의 치료 또는 예방을 위해서 사용된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 페길화된 리포솜을 포함하는 약제학적 조성물은 백신 조성물이고, 백신으로 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물은 대상체에서 면역 반응(비-특이적 반응 및 항원-특이적 반응 포함)을 자극하기 위해서 사용된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 전신 면역 반응을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 점막 면역 반응을 포함한다.
일 실시형태에서, 페길화된 리포솜 조성물은 인플루엔자-유발 바이러스에 대한 보호 면역을 향상시키는 데 사용된다.
일 실시형태에서, 페길화된 리포솜 조성물은 아메바성감염-유발 유기체에 대한 보호 면역을 향상시키는 데 사용된다.
일 실시형태에서, 페길화된 리포솜 조성물은 엔트아메바 히스톨리티카에 대한 보호 면역을 향상시키는 데 사용된다.
일 실시형태에서, 페길화된 리포솜 조성물은 인플루엔자에 대한 보호 면역을 향상시키는 데 사용된다.
일 실시형태에서, 페길화된 리포솜 조성물은 아메바성감염에 대한 보호 면역을 향상시키는 데 사용된다.
일 실시형태에서, 페길화된 리포솜 조성물은 대상체에서 전신 면역 반응(IgG 면역 반응을 특징으로 함) 및 점막 면역 반응(IgA 면역 반응을 특징으로 함) 둘 모두를 자극하는 데 사용되며, 이것은 본 명세서에는 제공된 페길화된 리포솜 조성물 중 임의의 하나를 비내로 투여하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 페길화된 리포솜 조성물은 대상체에서 전신 면역 반응 및 점막 면역 반응 둘 모두를 자극하는 데 사용되며, 이것은 TLR4 효능제 및 TLR7/8 효능제를 포함하는 페길화된 리포솜을 비내로 투여하는 것을 포함한다. 관련된 실시형태에서, 페길화된 리포솜 조성물은 대상체에서 전신 면역 반응 및 점막 면역 반응 둘 모두를 자극하는 데 사용되며, 이것은 GLA 및 3M-052를 포함하는 페길화된 리포솜을 비내로 투여하는 것을 포함한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 페길화된 리포솜을 포함하는 조성물의 비내투여가 국소 점막 반응(비강 내에서)을 생성할 수 있고, 전신 면역 반응을 생성할 수 있고, 원위 점막 반응(예를 들어 대변, 장, 및/또는 질 점막 반응)을 생성할 수 있다는 것을 발견하였다.
본 명세서에 제공된 실시형태에서, 대상체는 포유동물(예를 들어, 농장 동물(소, 돼지, 염소, 말 등), 애완 동물(고양이, 개 등) 및 설치류(래트, 마우스 등) 또는 인간을 비롯한 동물)이다. 일 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 또 다른 실시형태에서, 비-인간 포유동물은 개, 소 또는 말이다.
VII. 키트 또는 제조품
또한 특정 실시형태에서 본 명세서에 기술된 페길화된 리포솜 및 조성물을 포함하는 키트가 고려되고, 이것은 하나 이상의 용기에 제공될 수 있다. 일 실시형태에서 조성물의 모든 구성성분은 단일 용기에 함께 존재하지만, 본 발명의 실시형태는 이것으로 제한되도록 의도되지 않으며, 예를 들어, 면역학적 아주반트 조성물이 항원 구성성분과 별개로 존재하고, 그것과 접촉하지 않는 2개 이상의 용기를 또한 고려한다. 비제한적인 이론에 의해서, 일부 경우에, 면역학적 아주반트 조성물로스 페길화된 리포솜 조성물의 투여 단독이 이롭게 수행될 수 있다고 여겨지지만, 다른 경우에 이러한 투여는 항원의 투여와 시기적으로 그리고/또는 공간적으로 이롭게 분리될 수 있고, 또 다른 경우에 대상체에 대한 투여는 본 명세서에 기술된 바와 같고, 항원 및 아주반트 조성물 둘 모두, 및 임의로 마찬가지로 본 명세서에 기술된 다른 구성성분을 함유하는 백신 조성물로 이롭게 수행된다.
일부 실시형태에서, 키트의 하나의 바이알이 페길화된 리포솜을 포함하는 조성물을 포함하고, 키트의 제2 바이알이 작용제를 함유한다. 일부 실시형태에서, 키트는 임의적인 작용제를 함유하는 제3 바이알을 포함한다.
본 발명의 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 용도를 위한 지시서 및 바이알 중에 함유된 물질을 혼합하기 위한 지시서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이알 중의 물질은 건조되거나 동결건조된다. 일부 실시형태에서, 바이알 중의 물질은 액체이다.
이러한 키트 실시형태에 따른 용기는 임의의 적합한 용기, 그릇, 바이알, 앰플, 튜브, 컵, 상자, 병, 플라스크, 자(jar), 접시, 단윌-웰 또는 다중-웰 장치의 웰, 저장소, 탱크 등 또는 본 명세서에 개시된 조성물이 배치되고/배치되거나, 저장되고/저장되거나 이송되고, 내용물을 제거하기 위해서 접근될 수 있는 다른 장치일 수 있다. 전형적으로 이러한 용기는 의도된 용도와 상용성이고, 함유된 내용물의 회수가 쉽게 달성될 수 있는 물질로 제조될 수 있다. 이러한 용기의 비제한적인 예는 고무 마개 또는 니들 및 주사기를 사용한 내용물의 배출과 상용성인 다른 밀봉 수단을 갖는 것을 비롯한, 유리 및/또는 플라스틱 밀봉된 튜브 또는 밀봉되지 않은 튜브 및 앰플을 포함한다. 이러한 용기는 예를 들어, 유리 또는 화학적으로 상용성인 플라스틱 또는 수지로 제조될 수 있는데, 이것은 용기로부터 물질을 효율적으로 회수할 수 있게 하고/하거나 예를 들어, 분해성 조건, 예컨대, 자외광 또는 온도 극한으로부터, 또는 미생물 오염물을 비롯한 원치않는 오염물의 도입으로부터 물질을 보호하는 물질로 제조될 수 있거나 그러한 물질로 코팅될 수 있다. 용기는 바람직하게는 멸균 또는 멸균성이고, 임의의 담체, 부형제, 용매, 비히클 등과 상용성일 것이고, 예컨대, 본 명세서에 기술된 백신 조성물 및/또는 면역학적 아주반트 조성물 및/또는 항원 및/또는 재조합 작제물 등을 현탁 또는 용해시키는 데 사용될 수 있는 물질로 제조된다.
VIII. 예시적인 실시형태
제1 실시형태에서, 본 발명은 특히, 콜레스테롤; 비-페길화된 중성 지질; 및 페길화된 지질을 포함하는 리포솜에 관한 것이며, 여기서 페길화된 지질 중의 PEG의 평균 분자량은 약 5000달톤 이하이다.
본 발명은 또한 제2 실시형태에서, 제1 실시형태의 리포솜 중 임의의 것으로서, 페길화된 지질 중의 PEG의 평균 분자량은 약 750달톤 내지 약 5000달톤 범위이거나; 제1 실시형태의 리포솜에 있어서, 페길화된 지질 중의 PEG의 평균 분자량은 약 2000달톤 이하이거나; 또는 제1 실시형태의 리포솜에 있어서, 페길화된 지질 중의 PEG의 평균 분자량은 약 750달톤인 것을 제공한다.
본 발명은 제3 실시형태에서, 제1 또는 제2 실시형태의 리포솜 중 임의의 것으로서, 페길화된 지질의 지질 구성성분은 중성 지질을 포함하거나; 페길화된 지질의 지질 구성성분은 C14 알킬쇄, C16 알킬쇄, 또는 C18 알킬쇄를 포함하거나; 페길화된 지질의 지질 구성성분은 DSPE, DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE 또는 DMPE이거나; 페길화된 지질의 지질 구성성분은 DSPE이거나; 또는 페길화된 지질의 지질 구성성분은 DPPE인 것을 제공한다.
본 발명은 제4 실시형태에서, 제1, 제2 또는 제3 실시형태의 리포솜 중 임의의 것으로서, 비-페길화된 중성 지질은 C14 알킬쇄, C16 알킬쇄, 또는 C18 알킬쇄를 포함하거나; 비-페길화된 중성 지질은 DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE 또는 DMPE이거나; 또는 비-페길화된 중성 지질은 DPPC인 것을 제공한다.
본 발명은 제5 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 또는 제4 실시형태의 리포솜 중 임의의 것으로서, 리포솜은 안정적이거나; 리포솜은 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정적이거나; 리포솜은 약 25℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정적이거나; 또는 리포솜은 약 37℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정적인 것을 제공한다.
본 발명은 제6 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 실시형태의 리포솜 중 임의의 것으로서, 리포솜의 다분산 지수는 약 0.3이하로 유지되는 것을 제공한다.
본 발명은 제7 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 제4 제5, 또는 제6 실시형태 리포솜 중 임의의 것으로서, 리포솜의 크기는 약 450㎚ 이하이거나; 리포솜의 크기는 약 450㎚ 이하로 유지되거나; 또는 리포솜의 크기는 약 50㎚ 내지 약 300㎚ 범위인 것을 제공한다.
본 발명은 제8 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 제4 제5, 제6 또는 제7 실시형태의 리포솜 중 임의의 것으로서, 리포솜 중의 페길화된 지질의 몰 백분율(㏖%)은 약 1㏖% 내지 약 25㏖%의 범위이거나; 리포솜 중의 페길화된 지질의 ㏖%는 약 1㏖% 내지 약 10㏖%의 범위이거나; 또는 리포솜 중의 페길화된 지질의 ㏖%는 약 5㏖%인 것을 제공한다.
본 발명은 제9 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 제4 제5, 제6, 제7 또는 제8 실시형태의 리포솜 중 임의의 것으로서, 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 1㏖% 내지 약 50㏖%의 범위이거나; 또는 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 약 50㏖%인 것을 제공한다.
본 발명은 제10 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 제4 제5, 제6, 제7 또는 제8 또는 제9 실시형태의 리포솜 중 임의의 것으로서, 리포솜 중의 비-페길화된 지질의 ㏖%는 약 45㏖% 내지 약 98㏖%의 범위이거나 또는 리포솜 중의 비-페길화된 지질의 ㏖%는 약 45㏖%인 것을 제공한다.
본 발명은 제11 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 제4 제5, 제6, 제7 또는 제8, 제9 또는 제10 실시형태의 리포솜 중 임의의 것으로서, 비-페길화된 중성 지질:콜레스테롤:페길화된 지질의 지질 몰비은 약 9.8:5.7:0.8이거나 또는 비-페길화된 중성 지질:콜레스테롤:페길화된 지질의 지질 몰비는 약 18:5.5:3인 것을 제공한다.
본 발명은 제12 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 또는 제11 실시형태의 리포솜 중 임의의 것으로서, 리포솜은 적어도 1종의 TLR 효능제를 추가로 포함하거나; 리포솜은 TLR2 효능제, TLR3 효능제, TLR4 효능제, TLR5 효능제, TLR6 효능제, TLR7 효능제, TLR8 효능제, TLR7/8 효능제, 또는 TLR9 효능제를 포함하거나; 리포솜은 TLR4, SLA, GLA, 3D-MPL, R837, 또는 R848을 포함하거나; 리포솜은 소수성 테일을 갖는 TLR 효능제를 포함하거나; 리포솜은 TLR7/8 효능제를 포함하거나; 리포솜은 TLR7 효능제를 포함하거나, 리포솜은 TLR8 효능제를 포함하거나; 리포솜은 이미다조퀴놀린 또는 이미다조퀴놀린-함유 화합물을 포함하는 TLR7/8 효능제를 포함하거나; 리포솜은 3M-052를 포함하거나; 리포솜은 R848을 포함하거나; 리포솜은 TLR4 효능제를 포함하거나; 리포솜은 3D-MPL을 포함하거나; 리포솜은 GLA를 포함하거나; 리포솜은 본 명세서에 제공된 바와 같은 화학식 (V)의 합성 GLA 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 화학식 (V)의 상응하는 실시형태 중 임의의 것 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하거나; 리포솜은 본 명세서에 제공된 바와 같은 화학식 (VI)의 합성 GLA 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 화학식 (VI)의 상응하는 실시형태 중 임의의 것 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하거나; 또는 리포솜은 하기 화학식의 합성 GLA:
Figure 112018119746337-pct00020
또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하거나; 리포솜은 TLR4 효능제 및 TLR7/8 효능제를 포함하거나; 리포솜은 본 명세서에 기술된 TLR4 또는 TLR7/8 효능제 중 임의의 하나를 포함하거나; 또는 리포솜은 GLA 및 3M-052를 포함하는 것을 제공한다.
본 발명은 제13 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 또는 제12 실시형태의 리포솜 중 임의의 것으로서, 리포솜은 적어도 1종의 작용제를 포함하거나; 리포솜은 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 항원, 아주반트, 진단제, 치료제, 또는 유기체를 포함하는 적어도 1종의 작용제를 포함하거나; 리포솜은 항원을 포함하는 적어도 1종의 작용제를 포함하거나; 리포솜은 항원을 포함하는 적어도 1종의 작용제를 포함하되, 항원은 아메바성감염-관련 항원, LecA, 인플루엔자-관련 항원, H5N1, 결핵-관련 항원, ID91, ID93, BCG로부터의 항원, 간염 바이러스-관련 항원, B형 간염 항원, C형 간염 항원, HIV-관련 항원, 또는 암-관련 항원을 포함하는 것을 제공한다.
본 발명은 제14 실시형태에서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12 또는 제13 실시형태의 리포솜 중 임의의 것을 포함하는 조성물 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12 또는 제13 실시형태의 리포솜 중 임의의 것 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 예를 들어, 백신, 치료 또는 진단용일 수 있다.
본 발명은 제15 실시형태에서, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 또는 제14 실시형태의 임의의 하나의 리포솜 또는 조성물을 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 단계를 포함하는 것을 제공한다. 면역 반응은 예를 들어, 비-특이적 면역 반응; 항원-특이적 면역 반응; 전신 면역 반응; 점막 면역 반응; 또는 장, 대변, 질 점막 면역 반응일 수 있다. 조성물은 예를 들어, 암의 치료 또는 예방을 위해서; 백신으로서; 인플루엔자-유발 바이러스에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서; 아메바성감염-유발 유기체에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서; 엔트아메바 히스톨리티카에에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서; 인플루엔자에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서; 또는 아메바성감염에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서 사용될 수 있다. 조성물의 투여 경로는 경구, 국소, 비경구, 설하, 협측, 직장, 질, 정맥내, 피내, 경피, 비내, 점막내, 또는 피하일 수 있다. 리포솜 또는 조성물은 레티노산 보조-아주반트와 함께 투여될 수 있다. 대상체는 예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다.
본 발명은 제16실시형태에서, 대상체에서 Th1 반응을 유도하는 방법으로서, 대상체에게 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 또는 제14 실시형태 중 임의의 하나의 리포솜 또는 조성물을 투여함으로써, 대상체에서 Th1 반응을 유도하는 단계를 포함하는 것을 제공한다. 면역 반응은 예를 들어, 비-특이적 면역 반응, 항원-특이적 면역 반응, 전신 면역 반응, 점막 면역 반응, 또는 장, 대변, 질 점막 면역 반응일 수 있다. 조성물은 예를 들어, 암의 치료 또는 예방을 위해서; 백신으로서; 인플루엔자-유발 바이러스에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서; 아메바성감염-유발 유기체에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서; 엔트아메바 히스톨리티카에에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서; 인플루엔자에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서; 또는 아메바성감염에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서 사용될 수 있다. 조성물의 투여 경로는 경구, 국소, 비경구, 설하, 협측, 직장, 질, 정맥내, 피내, 경피, 비내, 점막내, 또는 피하일 수 있다. 리포솜 또는 조성물은 레티노산 보조-아주반트와 함께 투여될 수 있다. 대상체는 예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다.
본 발명은 제17 실시형태에서, 대상체에서 전신 면역 반응 및 점막 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 대상체에게 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 또는 제14 실시형태 중 임의의 하나의 리포솜 또는 조성물을 비내로 투여하는 단계를 포함하는 것을 제공한다. 점막 면역 반응은 예를 들어, 장, 대변 또는 질 점막 면역 반응을 포함할 수 있다. 점막 면역 반응은 예를 들어, 비강에 대해서 원위일 수 있다. 리포솜 또는 조성물은 레티노산 보조-아주반트와 함께 투여될 수 있다. 대상체는 예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다.
본 발명은 제18 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 페길화된 리포솜 중 임의의 것의 제조 방법으로서, a) 비-페길화된 중성 지질, 페길화된 지질, 및 콜레스테롤을 유기 용매 중에서 혼합하는 단계; b) 유기 용매를 증발시킴으로써, 지질막을 생성시키는 단계; c) 지질막을 완충액 중에서 재수화시키는 단계; 및 단계 c)의 재수화된 생성물을 초음파처리, 미소유동화 또는 압출하는 단계를 포함하는 것을 제공한다. 단계 a)는 TLR 효능제를 혼합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 유기 용매는 예를 들어, 클로로폼일 수 있다. 단계 (c)의 재수화된 생성물을 예를 들어, 초음파처리하고, 이어서 미소유동화시킬 수 있다. 방법은 작용제를 페길화된 리포솜에 혼합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 작용제는 본 명세서에 기술된 작용제 중 임의의 하나일 수 있다.
본 발명은 제19 실시형태에서, TLR 효능제, 스쿠알렌, 및 불포화 포스파티딜콜린을 포함하는 수 에멀션 중의 스쿠알렌-기반 오일을 제공한다. 이러한 실시형태에서, 포화 인지질, 예를 들어, DMPC와 비교할 때 불포화 포스파티딜콜린으로 제조된 에멀션은 TLR 효능제의 더 높은 회수율, 즉, 동일한 초기 농도의 TLR 효능제로 시작하는 경우 최종 제형 중에 더 높은 농도의 TLR 효능제를 생성하였다.
본 발명은 제20 실시형태에서, TLR 효능제, 스쿠알렌, 및 불포화 포스파티딜콜린을 포함하는 수 에멀션 중의 스쿠알렌-기반 오일로서, 스쿠알렌은 약 30 내지 약 40㎎/㎖의 농도로 존재하고, 불포화 포스파티딜콜린은 약 5 내지 약 10㎎/㎖의 농도로 존재하는 것을 제공한다.
본 발명은 제21 실시형태에서, TLR 효능제, 스쿠알렌, 및 불포화 포스파티딜콜린(예를 들어, 난 포스파티딜콜린)을 포함하는, TLR 효능제, 전형적으로는 수 중에 불용성(수 중에서 무시할 만한 용해도)인 TLR 효능제와 제형화하기 위해서 최적화된 수 에멀션 중의 스쿠알렌-기반 오일로서, 스쿠알렌은 약 34㎎/㎖의 농도로 존재하고, 불포화 포스파티딜콜린은 약 7 내지 8㎎/㎖ 또는 약 7.6㎎/㎖의 농도로 존재하는 것을 제공한다.
본 발명은 제22 실시형태에서, 보조-유화제, 강장제(tonicity agent) 및 완충제를 추가로 임의로 포함하는, 제19, 제20, 또는 제21 실시형태의 에멀션 중 임의의 하나를 제공한다. 본 명세서에 기술된 실시형태 중 임의의 것에서, 보조-유화제는 예를 들어, 비-이온성 선형 삼블록 공중합체, 예컨대, 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188)일 수 있다. 본 명세서에 기술된 실시형태 중 임의의 것에서, 강장제는 예를 들어, 폴리올 예컨대, 만니톨 또는 글리세롤일 수 있다. 본 명세서에 기술된 실시형태 중 임의의 것에서, 완충제는 예를 들어, 인산염 완충제, 예컨대, 예를 들어, 암모늄 포스페이트 완충액일 수 있다. 에멀션 중에 존재하는 경우 보조-유화제는 바람직하게는 에멀션 중에 0.1 내지 약 2㎎/㎖, 바람직하게는 약 0.5㎎/㎖, 가장 바람직하게는 약 0.36㎎/㎖의 농도로 존재한다. 에멀션 중에 존재하는 경우 강장제는 조성물이 약 250 내지 350mOsm/㎏, 바람직하게는 270 내지 315mOsm/㎏의 오스몰농도를 갖도록 하기에 충분한 양으로 존재한다.
본 발명은 제23 실시형태에서, 제19, 제20, 제21 또는 제22 실시형태의 에멸선 중 임의의 하나로서, TLR 효능제는 (a) 합성된 것이거나, (b) 수 중에 불용성이거나, (c) 이미다조퀴놀린 또는 이미다조퀴놀린-함유 화합물이거나, (d) 소수성 테일을 갖거나, (e) 3M-052이거나 또는 이들의 조합인 것을 제공한다. 에멀션은 적어도 1종의 작용제를 추가로 포함할 수 있으며; 적어도 1종의 작용제는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 항원, 아주반트, 진단제, 치료제, 또는 유기체일 수 있다. 예시적인 작용제는 예를 들어, 아메바성감염-관련 항원, LecA, 인플루엔자-관련 항원, H5N1, 결핵-관련 항원, ID91, ID93, BCG로부터의 항원, 간염 바이러스-관련 항원, B형 간염 항원, C형 간염 항원, HIV-관련 항원, 또는 암-관련 항원을 포함한다.
본 발명은 제24 실시형태에서, 제19, 제20, 제21, 제22 및 제23 실시형태의 에멀션의 제조 방법으로서, TLR 효능제를 불포화 포스파티딜콜린과 유기 용매 중에서 배합하는 단계를 포함하는 것을 제공한다. 예를 들어, 에탄올, DMF 및 클로로폼을 비롯한 TLR 효능제 및 불포화 포스파티딜콜린 둘 모두를 가용화시킬 수 있는 임의의 유기 용매가 사용하기에 적합하다. 방법은 (a) 증발을 비롯한 임의의 적합한 방법에 의해서 클로로폼을 제거하여 지질막을 생성시키는 단계, (b) 건조된 지질막에 스쿠알렌을 첨가하는 단계, 및 (c) 예를 들어, 초음파처리(예를 들어, 60℃ 수욕 중에서) 또는 미소유동화 또는 단순 아지테이션에 의해서 생성된 혼합물을 혼합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 제25 실시형태에서, 제19, 제20, 제21, 제22 및 제23 실시형태의 에멀션 중 임의의 하나; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 제26 실시형태에서, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 제19, 제20, 제21, 제22 및 제23 실시형태의 에멀션 중 임의의 하나 또는 제25 실시형태의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 제공한다. 면역 반응은 예를 들어, Th1 면역 반응; 비-특이적 면역 반응, 항원-특이적 면역 반응, 전신 면역 반응, 점막 면역 반응, 또는 장, 대변, 질 점막 면역 반응일 수 있다. 에멀션 또는 조성물은 예를 들어, 암의 치료 또는 예방을 위해서, 백신으로서; 인플루엔자-유발 바이러스에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서; 아메바성감염-유발 유기체에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서; 엔트아메바 히스톨리티카에에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서; 인플루엔자에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서; 또는 아메바성감염에 대한 보호 면역을 향상시키기 위해서 사용될 수 있다. 조성물의 투여 경로는 경구, 국소, 비경구, 설하, 협측, 직장, 질, 정맥내, 피내, 경피, 비내, 점막내, 또는 피하일 수 있다. 리포솜 또는 조성물은 레티노산 보조-아주반트와 함께 투여될 수 있다. 대상체는 예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다.
하기 실시예는 제한의 방식이 아닌 설명의 방식에 의해서 제공된다.
실시예
실시예 1: 아메바성감염 백신을 위한 TLR 리간드 함유 리포솜의 제형 및 시험
물질 및 방법
아주반트, LecA 항원을 갖는 제형
모든 아주반트는 감염병 연구소(Infectious Disease Research Institute: IDRI, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)에서 제조되었고, 주사 직전 항원과 혼합하기 위해서 2X 또는 5X 농축된 제형으로서 제공되었다.
LecA 항원은 TECHLAB(미국 버지니아주 블랙스 버그 소재)에 의해서 기술된 바와 같이(Barroso L, Abhyankar M, Noor Z, Read K, Pedersen K, White R, et al. Expression, purification, and evaluation of recombinant LecA as a candidate for an amebic colitis vaccine. Vaccine.2014;32(10):1218-) 제조되었다. 글리코피라노실 지질 아주반트(GLA), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-750](DSPE-PEG750), 및 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG2000)을 코덴 파마(Corden Pharma)(스위스 리스탈 소재) 또는 아반티 폴라 리피즈(미국 알라바마주 알라바스터 소재)로부터 입수하였다. 3M-052를 쓰리엠 드럭 딜리버리 시스템즈(3M Drug Delivery)(미국 미네소타주 세인트 폴 소재)에서 무료로 제공받았다. 콜레스테롤 및 완충액염을 제이.티. 베이커(J.T. Baker)(미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)로부터 구입하였다. 본 실시예에서 사용된 GLA는 화학식 (VI)의 구조를 갖고, 식 중 R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C13 알킬이다.
페길화된 리포솜 제형은 DPPC, 콜레스테롤, DSPE-PEG750 또는 DPPE-PEG2000, 및 3M-052 및/또는 GLA를 클로포폼 중에서 배합함으로써 제조되었다. 지질 몰비는 9.8:5.7:0.8(DPPC:콜레스테롤:페길화된 지질)이었다. 이어서, 제형으로부터 유기 용매를 회전식 증발기를 사용하여 적어도 12시간 동안 증발시켰다. 지질 박막을 25mM 암모늄 포스페이트 완충액(pH 약 5.7) 중에서 재수화시키고, 크레스트 파워소닉(Crest Powersonic) CP230D(미국 뉴저지주 트렌톤 소재) 수육에서 약 60℃에서 최대 30분 동안 초음파처리하였다. 이어서, 제형을 10℃로 설정된 재순환 수 냉각기를 사용하여 5 내지 6회 통과 동안 10,000 내지 30,000psi에서 미소유동화시켰다. 리포솜을 0.8/0.2㎛의 이중막 폴리에터설폰 필터로 여과하고, 5℃, 주변 온도, 37℃, 또는 60℃에서 저장하였다. 미소유동화에 대한 대안은 초음파처리이다.
미소유동화(M110P, 마이크로플루이딕스 코프(Microfluidics Corp))에 의해서 30,000psi에서 본질적으로 기술된 바와 같이(Fox et al. Vaccine 2013, 31:5848) 수 에멀션-중-스쿠알렌을 제조하였다. 이미 기술된 바와 같이(Fox et al. J Pharm Sci 2012, 101:4357 및 Fox et al.) GLA의 페길화된 지질-기반 현탁액의 수성 지질 구성성분 또는 CpG 1826의 수성 용액을 알하이드로젤(Alhydrogel)(등록상표)(브렌태그 바이오섹터(Brenntag Biosector))에 혼합하여 알룸(Alum)-흡착 제형을 제조하였다.
물리화학적 안정성 측정
수 중에 1:100으로 희석한 후 동적 광 산란에 의해서 에멀션 및 리포솜 입자 크기를 측정하였다. 혼합 직후 및 혼합 4시간 후 및 24시간 후(혼합물은 5℃ 및 주변 온도에서 저장됨)에 입자 크기, 시각적 외관 및 항원 1차 구조를 모니터링함으로써 항원-아주반트 혼합물의 단기간(24시간 이하) 물리화학적 상용성을 평가하였다. 항원을 먼저 0.1㎎/㎖로 염수 중에 희석하고, 그 다음 리포솜 아주반트 제형과 1:1 부피로 혼합하였다. 3개 대신에 하나의 큐벳을 제조한 것을 제외하고는 상기에 기술된 바와 같이 입자 크기를 측정하였다. 50㎕의 샘플과 50㎕의 4x 환원 샘플 완충액 및 100㎕의 20% SDS를 혼합함으로써 SDS-PAGE를 수행하였다. 샘플을 90℃에서 5분 동안 가열하고, 약 20℃에서 저장하고, 그 후 이것을 1분 동안 90℃에서 재가열하고, 65m 동안, 180V에서 트리스-글리신 유동 완충액을 사용하여 폴리아크릴아마이드 젤 상에 적재하고, 그 다음 쿠마시 블루로 염색하였다.
HPLC 방법을 사용하여, 320㎚에서의 UV 흡광 검출에 의해서 3M-052의 농도를 결정하고, 하전 에어로졸 검출에 의해서 GLA의 농도를 결정하였다. HPLC 방법은 이미 기술되어 있다(Misquith A, Fung M, Dowling QM, Guderian JA, Vedvick TS, Fox CB. In vitro evaluation of TLR4 agonist activity: formulation effects. Coll Surf B: Biointerfaces. 2014; 113 :312-9). 측전된 값이 표적 농도의 +/- 20% 이내인 경우 아주반트 농도는 규격 이내인 것으로 고려되었다. 리포솜 입자 크기 및 크기 다분산도를 맬버른 인스트루먼츠(Malvern Instruments)(영국 워세스터셔 소재) 제타사이저 나노-S 또는 -ZS를 사용하여 평가하였다. 제형을 1.5㎖의 폴리스타이렌 일회용 큐벳 내에서 초고순도(18.2 ΜΩ) 물 중에 100-배로 희석하였다. 각각의 제형에 대해서, 3개의 개별 큐벳을 제조하였다. 이어서 각각의 큐벳에 대해서 3회의 모든 크기 측정을 수행하였다. 드문 경우에, 먼지 입자가 명백한 측정 편차를 생성하고; 이러한 경우에, 의심되는 큐벳으로부터의 측정치를 설정에서 제외시킨다. TLR 리간드 농도, 입자 크기, 및 시각적인 외관을 제시된 바와 같이 규칙적으로 모니터링하였다.
면역화
4 내지 6주령의 CB A/J 수컷 마우스를 잭슨 랩스(Jackson Labs)로부터 구입하였다. 비-태깅된 LecA 항원을 테크랩스 인크.(TechLab Inc.)(미국 버지니아주 블랙스버그 소재)에서 정제하고, 5ug의 항원을 마우스당 면역화당 사용하였다. 모든 마우스 연구는 IACUC 규정에 따라서 엄격하게 수행되었다. 목에서의 피하 면역화의 경우, LecA를 각각의 아주반트(표-1)와 혼합하고, 주사용 염수를 사용하여 100ul로 만들었다. 비내 면역화를 마취 하에서 수행하였고, 전형적으로 10ul의 항원-아주반트 혼합물을 콧구멍당 사용하였다. 모든 요법에 대해서 연속적인 면역화 사이에 2주 간격을 유지하였다. 올 트랜스 레티노산(RA)의 매주 투여를 포함하는 실험의 경우, 각각의 마우스에게 50ul의 최종 부피의 DMSO 중에 용해된 150ug의 올 트랜스 레티노산(시그마(Sigma))을 복강내로 제공하였다. RA 스톡을 -80℃에서 저장하고, 광으로부터 보호하였다. 모든 아주반트를 4℃에서 저장하고, 면역화 직전에 무균성으로 제형을 제조하였다.
면역원성의 측정
웰당 0.5ug 레시틴으로 코팅된 96-웰 플레이트를 사용하여 항체 역가를 ELISA에 의해서 측정하였다. 혈장 샘플을 적절하게 희석하고, 항원 특이적 IgG 하위유형을 1:10,000으로 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합된 염소 항-마우스 IgG1 및 IgG2a 검출 항체(써던 바이오테크놀로지(Southern Biotechnology))를 사용하여 측정하였다. 분변 상청액을 기술된 바와 같이 제조하였다(Guo X, Barroso L, Becker SM, Lyerly DM, Vedvick TS, Reed SG, et al). 재조합 백신에 의한 장 아메바성감염에 대한 보호는 T 세포에 의해서 전달 가능하고, 감마 인터페론에 의해서 매개된다(Infect Immun.2009 Sep;77(9):3909-18). 간략하면, 새로 수집된 분변 샘플을 PBS 함유 프로테아제 저해제 칵테일(로슈(Roche)) 중에 재현탁하고(5ul 희석제/분변 ㎎), 5분 동안 격렬하게 혼합하였다. 불용성 물질을 3000rpm 및 12,000rpm에서의 2회의 연이은 회전을 통해서 제거하고, 상청액을 -20℃에서 저장하였다. 적절하게 희석된 분변 상청액을 ELISA를 위해서 사용하였고, 1:5000 희석의 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합된 염소 항-마우스 IgA를 2차 항체로서 사용하였다. 항체 단위를 표준 곡선을 사용하여 결정하였다.
세포외 사이토카인의 측정을 위해서, 비장세포를 50㎍/㎖ LecA로 72시간 동안 재자극하고, 루미넥스 비드(Luminex bead)(바이오라드(BioRad))를 사용하여 멀티플렉스 현탁액 어레이 시스템에 의해서 상청액을 분석하였다(Guo X, Barroso L, Becker SM, Lyerly DM, Vedvick TS, Reed SG, et al. Protection against intestinal amebiasis by a recombinant vaccine is transferable by T cells and mediated by gamma interferon. Infect Immun.2009 Sep;77(9):3909-18). 제조사의 지시서에 따라서 샘플을 희석하지 않고 유동시키고, 피코그램/상청액 밀리리터 단위로 측정하였다.
배양 조건 및 시험감염 실험
마우스 맹장을 통해서 순차적으로 통과된 HM1: IMSS(ATCC)로부터 본래 유래된 영양체를 시험감염 실험을 위해서 사용하였다. 영양체를 2% 다이아몬드 비타민, 13% 열 불활성화 우혈청(제미니 랩스(Gemini Labs)) 및 100U/㎖의 페니실린과 100ug/㎖의 스트렙토마이신(인비트로젠(Invitrogen))이 보충된 트립신-효모 추출-철(TYI-S-33) 배지 중에서 유지시켰다(Diamond LS, Harlow DR, Cunnick CC. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg.1978;72(4):431-2). 최종 부스트 4주 후에 면역화시킨 군 및 대조군으로부터의 마우스를 개복술 이후에 150ul 배지 중의 2백만개의 영양체로 맹장내로 시험감염시켰다(Houpt E, Barroso L, Lockhart L, Wright R, Cramer C, Lyerly D, et al. Prevention of intestinal amebiasis by vaccination with the Entamoeba histolytica Gal/GaiNac lectin. Vaccine. 2004 Jan 26;22(5-6):611-7). 마우스를 시험감염 1주 후에 안락사시켰다. 맹장을 1㎖ PBS로 헹구고, 300㎕의 맹장 헹굼액을 TYI-S-33 브로스 중에서 최대 5일 동안 배양하고, 항원 부하 ELBA를 위해서 200ul를 사용하였다. 백신 효능을 100 x (1-(감염을 갖는 백신접종된 마우스 %)/감염을 갖는 모의 마우스 %)로서 계산하였다(Guo X, Barroso L, Becker SM, Lyerly DM, Vedvick TS, Reed SG, et al. Protection against intestinal amebiasis by a recombinant vaccine is transferable by T cells and mediated by gamma interferon. Infect Immun. 2009 Sep,77(9):3909-18; Soong CJ, Kain KC, Abd-Aila M, Jackson TF, Ravdin JI. A recombinant cysteine-rich section of the Entamoeba histolytica galactose-inhibitable lectin is efficacious as a subunit vaccine in the gerbii model of amebic liver abscess. J Infect Dis. 1995 Mar; 171(3):645-51).
대변 항원 검출
맹장 내용물 중의 대변 항원을 E. his II ELIISA 키트(테크랩스 인크., 미국 버지니아주 블랙스버그 소재)를 사용하여 검출하였다. 0.05 이상의 450㎚에서의 광학 밀도에서 상기 대조군을 양성인 것으로 간주하였다. 표준 곡선을 정제된 LecA를 사용하여 생성시켰다.
접착성 검정
중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 α-MEM 배지 중에서 성장시키고, 이. 히스톨리티카 영양체를 상기에 기술된 바와 같이 성장시켰다. 이. 히스톨리티카 영양체를 대조군 또는 면역화시킨 군으로부터의 대변 상청액의 10배 희석물과 함께 1시간 동안 얼음 상에서 사전인큐베이션시켰다. 이어서, 영양체 및 CHO 세포를 1:20 비로 혼합하고, 둥근 바닥 폴리스타이렌 튜브에서 얼음 상에서 90분 동안 인큐베이션을 계속하였다. 현미경 계수 직전에, 튜브를 약간 보텍싱하고, 세포를 혈구계 상에서 계수하였다. 적어도 3개의 접착성 CHO 세포를 갖는 영양체의 수로서 접착성을 측정하고, 로제트(rosette) 형성 %로서 기록하였다. 각각의 샘플을 3회 반복물로 시험하였고, 최소 100마리의 아메바가 계수되었다(Barroso L, Abhyankar M, Noor Z, Read K, Pedersen K, White R, et al. Expression, purification, and evaluation of recombinant LecA as a candidate for an amebic colitis vaccine. Vaccine. 2014 Feb 26;32(10):1218-24; Ravdin JI, Guerrant RL. Role of adherence in cytopathogenic mechanisms of Entamoeba histolytica. Study with mammalian tissue culture cells and human erythrocytes. J Clin Invest. 1981 Nov;68(5):1305-13).
통계학적 분석
모든 분석은 그래프 패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 시험감염 시도로부터 감염된 마우스 및 미감염 마우스의 비율을 피셔 정확 검정(Fisher's exact test)을 사용하여 분석하였다. 항원 부하, 항체 역가 및 접착 저해 차이를 만-휘트니 검정(Mann- Whitney test)을 사용하여 분석하였다.
결과
생리화학적 안정성
리포솜 안정성을 동적 광 산란(입자 크기 및 크기 다분산도), 시각적인 외관, 및 HPLC(GLA 및 3M-052 농도)에 의해서 모니터링하였다. 입자 크기 및 크기 다분산도 값은 5℃에서 12개월에 걸쳐서 거의 변화가 없거나 전혀 변화가 없음을 나타내었지만, DSPE-PEG2000을 함유하는 리포솜의 대한 다분산도 값은 DSPE-PEG750을 함유하는 리포솜에 대한 다분산도 값보다 상당히 더 높았다(도 1A). 리포솜의 시각적인 외관은 일관되게 반투명하고 균질하였고, 시간 경과에 따라서 변화되지 않았다. 37℃에서 저장하는 경우, DSPE-PEG2000을 함유하는 리포솜은 DSPE-PEG750을 함유하는 리포솜에 비해서 시간 경과에 따라서 입자 크기 및 크기 다분산도에서 더 큰 변화를 나타내었다(도 1C 및 1D). GLA 및 3M-052 농도는 5℃에서 저장된 샘플에서 12개월에 걸쳐서 변화하지 않았다. 37℃에서, GLA 손실 속도는 3M-052에 대한 것보다 더 컸는데, 6개월 후에 40% 초과의 GLA 손실을 가진 반면, 3M-052에서는 어떠한 검출 가능한 손실도 일어나지 않았다.
혼합 후 아주반트와 LecA 항원의 단기간(24시간 이하) 상용성을 평가하기 위해서, 스톡 항원을 염수 중에서 희석하고, 이어서 아주반트와 1:1 부피비로 혼합하여 하기에 기술된 생체내 면역화 연구를 위한 계획된 혼합 절차를 모방하였다. 제형은 항원과의 혼합 전 및 혼합 후에 반투명하고 균질환 외관을 가졌다. 종합하면, 5℃에서 저장하든 또는 주변 온도에서 저장하든 항원과 혼합한 후 24시간에 걸쳐서 입자 크기는 거의 변화가 없거나(15% 미만) 또는 전혀 변화가 없었지만, DSPE-PEG2000을 함유하는 리포솜은 더 짧은 길이(DSPE-PEG 750)를 함유하는 리포솜에 비해서 크기가 증가하는 약간 더 높은 경향성을 나타내었다. 종합하면, GLA, 3M-052 또는 두 효능제 함께의 존재는 입자 크기 상용성 결과에 영향을 주는 것 같지 않았다. 마찬가지로, 크기 다분산도 값은 거의 변화되지 않았지만, 다분산도는 DSPE-PEG750을 함유하는 리포솜에 비해서 DSPE-PEG2000을 함유하는 리포솜의 경우에 더 높았다. 항원-아주반트 혼합물의 SDS-PAGE 분석은 예상된 MW 근처의 균일한 단일 밴드를 갖는 리포솜 조성물에 관계 없이 임의의 시점에서 또는 24시간에 걸친 저장 조건에서 항원 1차 구조에서 변화를 나타내지 않았다. 함께, 이들 결과는 항원-아주반트 혼합물이 5℃ 또는 주변 온도에서 적어도 최대 24시간 동안 허용 가능한 단기간 상용성을 나타내었다는 것을 보여준다.
리소폼 제형의 면역원성 및 선택의 평가
면역원으로서 이. 히스톨리티카 재조합 부착소 LecA를 사용하여, 균형있는 면역 반응을 생성시킬 수 있는 아주반트를 스크리닝하였다. 합성 TLR 효능제를 함유하는 아주반트를 표 2에 나타낸 바와 같이 제조하고, 항원 특이적 체액 반응을 생성시키는 이의 능력을 평가하였다.
Figure 112018119746337-pct00021
이들 아주반트 각각은 약제학적으로 허용 가능한 구성성분으로 구성되었고, 임상 연구에 적합할 것이다. 에멀션 및 리포솜 제형은 조성물 및 가공 방법에 따라서 65 내지 130㎚의 평균 입자 크기를 나타낸 반면, 알룸-함유 제형은 마이크로입자를 함유하였다. 아주반트를 정제된 비-태깅된 LecA 단백질과 혼합하여 9개의 제형을 제조하고, 마우스를 피하로 면역화시켰다. 군당 5마리의 마우스를 상응하는 아주반트와 혼합된 LecA 항원으로 2주 간격으로 피하로 3회 면역화시켰다. 최종 면역화 1주 후에 수집된 혈장 샘플을 256,000배로 희석하고, ELISA에 의해서 IgG1 및 IgG2a 생산에 대해서 분석하였다. GLA 3M-052-리포솜 아주반트처리 LecA에 의해서 도출된 *IgG2a 수준은 EM014(GLA-CpG-SE) 및 3M-052-에멀션를 제외한 모든 다른 군에 비해서 통계학적으로 유의하였다. 혈장 IgG의 하위부류의 역가를 ELISA에 의해서 결정하였다(도 2). 도 2는 GLA(TLR-4 효능제)와 3M-052(TLR-7/8 효능제)의 혼합물을 함유하는 리포솜 제형(GLA-3M-052-LS라 지정됨)이 균형있는 IgG 반응을 나타내었고, 추가 연구를 위해서 선택되었음을 나타낸다.
다음으로, 세포 매개된 면역 반응을 나타내는 항원 특이적 사이토카인 생산을 도출하는 GLA-3M-052-LS의 능력을 조사하였다. 비장세포를 시험관내에서 LecA로 재자극하고, 배양 상청액을 분석하였다. LecA를 함유하는 GLA 3M-052 리포솜 아주반트처리는 강한 IFN-γ 및 IL-17 반응을 도출하였는데, 이것은 마우스 모델에서 보호의 마커이다(도 3A 내지 도 3D). 구체적으로, 마우스를 제3 면역화 1주 후에 안락사시키고, 비장세포를 72시간 동안 LecA로 재자극하였다. 세포외 IFN-γ, IL-17, IL-2 및 IL-4의 생산을 루미넥스에 의해서 배양 상청액에서 검출하고, pg/㎖로 표현하였다. * = p< 0.05; ** = p< 0.001.
추가로, GLA 3M-052 리포솜 아주반트처리 LecA 군 단독으로부터의 PBMC는 중간 정도지만 통계학적으로 유의한 세포내 IFN-γ 염색을 나타내었다.
보조-아주반트로서의 올-트랜스 레티노산(RA)의 상용성을 또한 시험하였다. 각각의 군에서 마우스에게 RA의 매주 주사를 제공하였다. RA 보조 요법은 IFN-γ 및 IL-17의 수준을 추가로 증가시켰다(또한 도 3A 내지 도 3D). (아주반트 + LecA)군 및 (아주반트 + LecA + RA)군 모두는 동등한 IL-2 반응을 생성한 반면; RA 보조 요법은 약간 더 높은 IL-4 반응을 초래하였다.
리포솜-기반 백신은 점막 면역화에 또한 적합하기 때문에, 혼합된 점막/비경구 면역화 요법을 항원 특이적 소화관 IgA 반응을 생성하는 이의 능력을 시험하기 위한 후속 실험을 위해서 사용하였다.
점막 IgA 반응 및 이의 접착 저해 가능성
마우스를 비내 면역화로 사전 처리하고, 그 다음 피하 및 비내 부스팅하였다. RA 보조 군의 마우스에게 RA의 매주 주사를 제공하였다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, 아주반트처리 LecA는 항원 특이적인 강력한 점막 IgA 반응을 생성하였다. RA의 포함은 IgA 역가 증가를 도왔다. 표적 세포에 대한 이. 히스톨리티카 영양체의 접착성은 감염의 발생에서 초기 단계 및 결정적인 단계이다.
점막 IgA가 자연에서 보호성인지를 평가하기 위해서, 시험관내에서 CHO 세포에 대한 기생충의 접착을 차단하는 이의 능력을 시험하였다. 영양체와 면역화시킨 마우스로부터의 대변 상청액의 사전인큐베이션은 이의 접착 가능성을 상당히 감소시켰다(도 4B). (아주반트 + LecA) 또는 (아주반트 + LecA + RA) 요법으로부터의 분변 상청액은 대등한 접착 저해 가능성을 나타내었다. 따라서, 아주반트처리 LecA는 시험관내에서 보호성인 높은 역가 소화관 IgA 반응을 도출하였다.
상승작용적 TLR 효능제를 함유하는 나노리포솜 제형은 장 기생충 시험감염에 대한 보호 가능성을 갖는다.
장 아메바성감염의 마우스 모델을 사용하여 이. 히스톨리티카 처리에 대해서 보호하는 GLA 3M-052 리포솜 아주반트의 가능성을 시험하였다. 대조군 및 실험 면역화시킨 군으로부터의 마우스를 이. 히스톨리티카의 악성 균주로 맹장내로 시험감염시키고, 시험감염 1주 후 맹장을 수거하여 항원 부하(도 5A)뿐만 아니라 살아있는 기생충의 존재(도 5B)를 평가하였다. 아주반트처리 LecA는 대조군 마우스에 비해서 항원 부하를 상당히 감소시켰고, 이러한 감소는 보조-아주반트로서 RA를 사용하여 훨씬 더 두드러졌다. 현재 요법을 갖는 아주반트는 중간 정도인 34% 효능을 나타내었다. 그러나, 요법에 RA를 포함시키는 것은 효능을 69.2%로 실질적으로 개선시켰다(표 3). 백신 효능을 계산하는 데 사용되는 수학식은 다음과 같았다:
효능 = 100 x (1-(감염을 갖는 백신화된 마우스 %)/(감염을 갖는 모의 마우스 %).
아주반트+ LecA 군에 대한 효능 = 100 x (1-46/69.2) = 100 x (1-0.66) = 34%
Figure 112018119746337-pct00022
이들 데이터는, 합성 상승작용적 TLR 효능제의 혼합물을 함유하는 나노리포솜 제형이 항원 특이적인 보호 반응을 생성시킬 가능성을 갖고, 그것은 미량영양소 보조 면역화와 상용성이라는 것을 뒷받침한다.
PEG 길이의 효과
도 6 및 도 7은 PEG750과 비교할 때 PEG2000 제형을 사용하여 더 높은 반응이 관찰되었음을 나타낸다. 도 6은 GLA-3M-052 PEG2000 + LecA 군에 대해서 균형있는 IgG2a 및 IgG1 역가를 나타내고; GLA-3M-052 PEG750 + LecA 군과 비교할 때 이러한 군에 대해서 더 높은 역가가 또한 존재하였다. 도 7에서, 대변 점막 IgA 반응에 대한 PEG 길이의 효과를 조사하였다. 도 7은 GLA-3M-052 PEG2000 + LecA 군에 대한 대변 IgA 반응이 GLA-3M-052 PEG750 + LecA 군에 대한 것보다 더 높았다는 것을 나타낸다. 따라서, 리포솜 중의 PEG 길이의 증가는 점막 IgA 반응을 향상시켰다.
전달 경로의 효과
면역화에 대한 전달 경로가 면역 반응에 효과를 갖는지의 여부를 조사하였다. 도 8A 및 도 8B는 IN(비내) 단독 요법으로부터 생성된 최고 IgG2a 및 IgA 역가로의 면역화에 대한 전달 경로의 효과를 도시한다. 리포솜 + 아주반트는 강력한 점막 및 전신 Th1 면역 반응, 소화관 항-LecA IgA를 생성하였다(16B).
도 9A 및 9B는 전달 경로를 추가로 도시한다. 비내 단독 요법은 다른 요법과 비교할 때 동등하거나 더 높은 IFN-γ 및 IL-17을 생성하였다. LecA + 리포솜 + 아주반트의 점막 단독 요법은 강력한 점막 및 전신 Th1 면역 반응, IFN-γ를 생성하였다(도 9A 및 도 9B, 표 4). 비내 전달은 IgA(전신 반응) 반응을 생성할 것이라고 예상되지 않았다. 이는, LecA와 함께 리포솜 중에 제형화된 GLA 및 3M-052의 점막 전달이 전신 면역을 생성하였다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는, 조성물의 비점막 투여가 IgG2a/IgG1 비에 의해서 입증된 바와 같이 강력한 전신 면역 반응을 산출한다는 것을 예증한다. 놀랍게도, 조성물을 점막 표면에서 국지적으로 비내로 투여하는 것은 비강에서 점막 반응을 생성할 뿐만 아니라 또한 원위장(대변) 점막 반응을 생성한다.
Figure 112018119746337-pct00023
결과 논의
본 연구의 중요한 결과는 전신뿐만 아니라 점막 면역 반응을 도출할 수 있는 합성 TLR 효능제를 함유하는 나노리포솜 아주반트를 식별하였다는 것이었다. TLR4(GLA) 및 TLR7/8(3M-052) 효능제를 함유하는 리포솜 기반 아주반트 시스템은 균형있는 체액 및 강한 사이토카인 반응을 생성하였다. GLA는 다양한 1상 및 2상 임상 시험에서 사용되는 지질-기반 플랫폼으로 제형화된 합성 TLR4 리간드이다. 3M-052는 진보된 전임상 개발에서의 합성 TLR7/8 리간드이다(Fox et al. Immunopotentiators in Modern Vaccines, 2nd ed, in press; Smirnov et al. Vaccine 2011, 29:5434; Zhao et al. J Immunother Cancer 2014, 2:12; Singh et al. J Immunol 2014, 193:4722). GLA 및 3M-052의 리포솜 제형은 혼합된 점막/비경구 면역화 요법에 적합하였고, 마찬가지로 강한 점막 IgA 반응을 도출하였다. 이. 히스톨리티카로 시험감염된 면역화시킨 마우스는 항원 부하의 실질적인 감소를 나타내었다. GLA 3M-052 나노리포솜 제형은 보조-아주반트로서 올 트랜스 레티노산의 사용과 상용성이었으며, 이러한 요법은 보호 효능 및 점막 IgA 수준을 추가로 증가시켰다.
실시예 2: 인플루엔자 백신을 위한 3M-052 아주반트의 제형 및 시험
물질 및 방법
물질의 제형 및 제조
3M-052를 쓰리엠 컴퍼니(3M Company)에 의해서 인-하우스에서 합성하였다. R848는 쓰리엠에 의해서 공급되었거나 또는 악소라 라이프 사이언시스 인크.(Axxora Life Sciences Inc.)(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 구입하였다. 합성 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-다이헥사데칸오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DPPG), 1,2-다이팔미토일-3-트라이메틸암모늄-프로판(DPTAP), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-750](DPPE-PEG750), 및 난 포스파티딜콜린(PC)은 아반티 폴라 리피즈(미국 알라바마주 알라바스터 소재)또는 리포이드 엘엘씨(Lipoid LLC)(미국 뉴저지주 뉴아크 소재)로부터 구입하였다. 스쿠알렌은 시그마(미국 미조리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수하였다. 콜레스테롤, 암모늄 포스페이트 1염기성 및 암모늄 포스페이트 2염기성은 제이.티. 베이커(미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)로부터 구입하였다. 폴록사머 188 및 글리세롤은 스펙트럼 케미컬(Spectrum Chemical)(미국 캘리포니아주 가데나 소재)로부터 구입하였다. 인삼염 완충 염수 1 x (PBS) pH 7.2는 인비트로젠(Invitrogen)(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)으로부터 구입하였다.
DPPC, 콜레스테롤, 및 DPPE-PEG750과 다양한 양의 3M-052를 유기 용매(클로로폼 또는 클로로폼/메탄올/물 혼합물) 중에서 배합함으로써 작은 배취(20㎖ 이하)의 페길화된 리포솜 제형을 제조하였다. 이어서, 유기 용매를 제네백(Genevac) EZ-2를 사용하여 증발시켰다. 지질막을 PBS(pH 7.2) 또는 25mM 암모늄 포스페이트 완충액(pH 5.7) 중에서 재수화시키고, 크레스트 파워소닉 CP230D(미국 뉴저지주 트렌톤 소재) 초음파처리 수욕에서 약 60℃에서 약 2 내지 3시간 동안 또는 제형이 어떠한 큰 가시적인 입자 크기도 없이 반투명해질 때까지 초음파처리하였다. 중성 리포솜(DOPC, 콜레스테롤), 음이온성 리포솜(DPPC, 콜레스테롤, DPPG), 및 양이온성 리포솜(DPPC, 콜레스테롤, DPTAP)에 대해서 동일한 절차를 따랐다. 리포솜 구성성분 중량비는 다음과 같았다: 페길화(18:5.5:3, DPPC:콜:DPPE-PEG750), 중성(20:5, DOPC:콜), 음이온성(18:5:2, DPPC:콜:DPPG), 양이온성(18:5:2, DPPC:콜:DPTAP). 상기와 같지만 더 짧은 초음파처리 시간, 그 다음 12회의 연속적인 통과 동안 30,000psi에서의 고전단 균질화(마이크로플루다이저(Microfluidizer) M110P)에 의해서 더 큰 배취(100㎖)의 페길화된 리포솜을 제조하였다.
리포솜을 75mM 암모늄 설페이트 용액으로 먼저 수화시킨 것을 제외하고는 상기에 기술된 바와 같이 농축된 페길화된 리포솜 조성물을 제조함으로써 R848을 함유하는 리포솜을 제조하였다. 60℃에서 약 1시간 초음파처리한 후, PD-10 칼럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용하여 리포솜의 외부 완충액을 0.9% 염수로 교환하였다. 이제 그의 외부 완충액 중에 염수를 함유하고, 그의 내부에 암모늄 설페이트를 함유하는 리포솜을 R848을 함유하는 염수 용액과 혼합하고, 1시간 동안 60℃에서 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 리포솜을 또 다른 PD-10 칼럼을 통해서 통과시켜 캡슐화되지 않은 R848을 제거하였다.
3M-052를 DMPC 또는 난 PC를 갖는 클로로폼 중에 용해시킴으로써 수중유의 안정적인 에멀션(SE)을 제조하였다. 이어서, 회전식 증발기를 사용하여 클로로폼을 제거하였다. 이어서, 스쿠알렌을 건조된 지질막에 첨가하고, 유리 용기를 60℃ 초음파처리 수욕 중에 약 1시간 동안 넣었다. 이 혼합물을 유상으로 지칭한다. 대안적으로, 3M-052를 스쿠알렌 및 DMPC(난 PC 또는 클로로폼 없음) 중에 직접 분산시킴으로써 유상을 제조하였다. 이어서, 수성상을 유상에 첨가하여 25mM의 암모늄 포스페이트 완충액, 0.037%(w/w) 폴록사머 188, 및 1.8%(v/v) 글리세롤(등장제), 4% v/v 스쿠알렌, 7,6㎎/㎖ DMPC 또는 난 PC, 및 다양한 양의 3M-052의 최종 농축액을 수득하였다. 일부 에멀션은 또한 0.02% v/v α-토코페롤을 함유하였다. 혼합물을 60℃ 수욕 중에서 추가로 10 내지 15분 동안 초음파처리함으로써 에멀션을 생성하였다. 조 에멀션을 고전단 균질화기(마이크로플루다이저 M110P)를 통해서 약 12회의 연속적인 통과 동안 30,000psi에서 가공함으로써 최종 에멀션을 제조하였다.
상기에 기술된 바와 같이 농축된 에멀션을 제조하고, 건조 분말 R848 또는 암모늄 포스페이트 완충액 중의 R848의 용액과 혼합함으로써 R848을 사용하여 에멀션을 제조하였다. 상기에 기술된 생체내 실험 이전에 에멀션 및 리포솜을 0.2㎛ 막을 통해서 여과하였다.
제형 특징규명
먼저 각각의 제형을 큐벳 내에서 98% 에탄올/2% HCl 용액 중에 20-배 희석함으로써 3M-052 및 R848의 농도를 예측하였다. 샘플을 히타치(Hitachi) U-3900H 분광광도계(일본 도쿄 소재) 상에서 약 322㎚에서의 흡광도에 대해서 분석하였다. 맬버른 인스트루먼츠(영국 워세스터셔 소재) 제타사이저 나노-S, -ZS 또는 -APS를 사용하여 입자 크기를 평가하였다. 제형을 1.5㎖의 폴리스타이렌 일회용 큐벳 내에서 초고순도 물 중에 100-배로 희석하였다. 각각의 제형에 대해서, 3개의 개별 큐벳을 제조하였다. 이어서 각각의 큐벳에 대해서 3회의 모든 크기 측정을 수행하였다. 맬버른 제타사이저 나노-ZS를 사용하여 제타 전위를 측정하였다. 각각의 제형에 대해서, 50㎕를 950㎕의 초고순도 물과 일회용 모세관 셀(맬버른 인스트루먼츠, DTS1070) 내에서 배합하였다. 9회의 측정치를 각각의 제조된 샘플(제형당 하나의 샘플)로부터 수집하였다.
바이러스 스톡 및 백신
본 연구에서 사용된 백신 항원은 모두 A/베트남(Vietnam)/1203/04(VN1203) 인플루엔자 바이러스로부터 유래하였다. 뮤린 면역원성 및 시험감염 연구에 사용된 재조합 HA 단백질(rHA)은 프로테인 사이언시스 코프(Protein Sciences Corp)로부터 입수하였다. 페럿 면역화 및 시험감염 연구에서, 임상 등급 분할 VN1203 백신은 사노피 파스테르로부터 입수하였다.
10일령의 발육란(embryonated chicken egg)을 제시된 바와 같이 H5N1로 접종함으로써 뮤린 및 페럿 시험감염 연구를 위한 바이러스 스톡을 생성하였다. 정화된 요막액을 여과하고, 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다. 표준 검정을 사용하고, 상기에 기술된 바와 같이 MDCK 세포(ATCC #CCL-34) 상에서 플라크 검정에 의해서 바이러스 역가를 결정하였다.
페럿 전혈 자극 검정
수컷 피치 페럿으로부터 수집된 전혈을 수집하고, 이미퀴모드(TLR7), TLR7/8 효능제 CL057(인비보젠(Invivogen)), 및 합성 TLR4 효능제 GLA를 비롯한, TLR 효능제 화합물과 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 이후에, RNA를 자극된 대조군 및 염수 대조군 둘 모두로부터 RNA 전혈 추출 키트(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 수집하였다. TLR7, TLR8, IL-1β 및 IL-8에 대한 RNA의 수준을 실시간 PCR에 의해서 결정하였다. 발현 수준 변경을 염수 자극된 혈액 샘플과 비교하여 RNA 수준의 배수 변화로서 그래프로 나타내었다.
뮤린 시험감염 연구
뮤린 처리 연구를 위해서 6 내지 8주령의 암컷 C57Bl/6 마우스의 연구군을 제시된 바와 같이 아주반트와 조합된 재조합 H5N1 HA 단백질(VN1203 균주, 프로테인 사이언시스 코프.)로 면역화시켰다. 모든 면역화는 두 다리 사이에 균일하게 분할된 100㎕의 총 부피의 근육내 경로를 통해서 진행하였다. 면역화 21일 후, 마우스를 1 x 106PFU의 A/VN/1203/05(H5N1 클레이드 1)로 시험감염시켰다. 시험감염 1일 후에 시작하여, 모든 동물을 체중 감소에 대해서 모니터링하고, 중증 감염의 징후에 대해서 관찰하였다. 0일에 체중이 25%를 초과하게 감소된 것으로 발견된 동물을 안락사시켰다.
페럿 시험감염 연구
수컷 피치 페럿(머스텔라 푸토리스 페로(Mustela putoris fero), 트리플 에프 팜즈(Triple F Farms), 미국 펜실베니아주 세이어 소재)을 모든 면역화 및 처리 연구를 위해서 사용하였다. 사두근 근육 내로의 250㎕의 주사에 의해서 페럿의 면역화를 수행하였다. 모든 동물에게 전국적인 유행성 비축량(national pandemic stockpile)으로부터 기원한 분할 A/베트남/1203/04 H5N1 백신(사노피 파스테르) 0.5㎍를 제공하였다. 항체 역가를 결정하기 위한 혈청 샘플을 면역화 21일 후에 수집하였다.
1 x 105 내지 5 x 105PFU의 바이러스를 50㎕(25㎕/콧구멍)의 부피로 폐 내에 점적주입함으로써 시험감염을 개시하였다. 감염 이후에, 동물을 관찰하고, 매일 체중을 재어 바이러스 유도된 이병률을 모니터링하였다. 시험감염 전 중량의 25%가 감소된 임의의 동물을 안락사시켰다.
플라크 검정
바이러스 역가를 원위세뇨관(Madin-Darby canine kidney: MDCK) 세포에서 플라크 검정에 의해서 얻었다. 간략하면, 세포를 검정 개시 24시간 이전에 6-웰 접시에 1x106개 세포/웰로 10% 우태아 혈청(FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM) 중에 시딩하였다. 검정 개시시에, 융합성 MDCK 단층을 DMEM으로 3회 세척하여 FBS를 제거하였다. 연속 희석된 코 세척 샘플을 100㎕ 부피로 단층에 첨가하고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 단층을 2㎖의 1 x L-15 배지(론자(Lonza)) 중의 0.8% 아가로스(시켐(SeaKem))로 덮었다. 48 내지 72시간의 인큐베이션 후에, 플라크를 결정 바이올렛(BD) 염색에 따라서 정량하였다.
혈구응집 저해(HAI) 검정
혈구응집소 저해 검정을 WHO 프로토콜에 따라서 수행하였다(52). 포르말린 불활성화 H5N1 항원을 국립 생물 표준 통제 연구원(National Institute for Biological Standards and Control: NIBSC)으로부터 입수하였다. 모든 세포를 세척된 1% 적혈구(RBC)(람파이어(Lampire))를 사용하여 검정하였다.
미세중화 검정
위형 렌티바이러스 입자를 사용하여 중화 항체 역가를 결정하였다. 요약하면, 293T 세포를 H5N1 및 HA를 발현하는 플라스미드 및 3종의 렌티바이러스 패키징 플라스미드; pDR8.74 (55), pRSV-Rev, 및 HR'-CMV-Luc(이것은 바이러스 입자 내에 패키징되어 있고, CMV 극초기 프로모터의 제어 하에서 루시퍼라제 이식유전자를 암호화함)로 공동-형질주입함으로써 위형 입자를 생성하였다. 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) + 10% 우태아 혈청(FBS) 중에서 5 x 103개 MDCK 세포/웰로 24시간 이전에 시딩된 흑색 편평 바닥 96웰 플레이트(코닝(Corning)) 내에서 바이러스 스톡을 역가하였다. 바이러스 적정 이전에, 세포를 200㎕의 DMEM으로 3회 세척하여 DMEM을 제거하고, 연속 희석된 바이러스 스톡으로 덮었다. 이식유전자 발현을 허용하기 위해서 72시간 인큐베이션시킨 후에, 형질도입된 세포 중의 루시퍼라제의 수준을 브라이트글로(BrightGlo) 루시퍼라제(프로메가(Promega))를 사용하여 제조사의 지시서에 따라서 결정하였다.
중화 분석을 위해서, 연속 희석된 면역화후 혈청을 1 x 104 상대 루시퍼라제 단위(RLU)를 함유하는 희석된 바이러스 스톡과 1:1 비로 혼합하였다. 바이러스 혈청 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 상기와 같이 세척된 MDCK 세포를 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 모든 형질도입된 세포에서 루시퍼라제 발현 수준의 평가 후에 중화 역가를 결정하였다. 루시퍼라제 수준을 벡터 형질도입된 대조군 세포에 비해서 10-배 감소시키는 것으로 관찰된 혈청의 최대 희석으로서 IC90 항체 역가를 정의한다.
HA 어레이
인플루엔자 HA 단백질을 함유하는 HA 어레이는 이미 기술된 바와 같았다(56). 본 연구에서 사용된 어레이는 2세대이고, 다양한 인플루엔자 균주(시노바이올로지컬(Sinobiological))로부터의 278 HA 단백질을 함유한다. 백신접종 후 면역 분석을 위해서, 어레이를 먼저 PBS + 1% 우태아 혈청+ 0.1% 트윈-20으로 차단하고, 단백질 어레이 세척 완충액(어레이잇(ArrayIt))으로 3회 세척하고, 진탕하면서 1시간 동안 면역화후 마우스 혈청의 1:100 희석액 300㎕와 함께 인큐베이션시켰다. 1차 인큐베이션 이후, 어레이를 세척 완충액으로 5회 세척하고, IgG2c(잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch), 파트#: 115-495-208) 및 IgG1(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 파트#: A21123)에 대해서 형광단 접합된 2차 항체와 함께 1:2000 희석으로 인큐베이션시켰다. 실온에서 30분 인큐베이션 이후, 어레이를 린스 버퍼(Rinse Buffer)(어레이잇)로 헹구고, 몰레큘러 다이나믹스(㏖ecular Dynamics) 400B 어레이 스캐너를 사용하여 분석하였다. 타블레우(Tableau) 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 획득후 분석을 수행하였다.
ELISA
IgG, IgG1 및 IgG2c에 대한 HA-특이적 종점 역가를 면역화 7일 및 21일 후에 결정하였다. 고결합 폴리스타이렌 384웰 플레이트를 실온에서 2.5시간 동안 0.1M 중탄산염 코팅 완충액 중에서 재조합 VN1203 HA(프로테인 사이언시스 코프.)(2㎍/㎖)로 코팅하였다. 실온에서 0.05% PBS-트윈 20+1% BSA와 2시간 차단 인큐베이션시키기 전 및 후에 플레이트를 0.1% PBS-트윈(Tween) 20으로 3회 세척하였다. 마우스 혈청을 나노스크린(Nanonscreen) NSX-1536을 사용하여 0.05% PBS-트윈 20 + 0.1% BSA 중에서 연속 희석하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션시키고, 5회 세척하였다. 플레이트를 1시간 동안 진탕기 상에서 항-마우스 IgGT, IgG1 또는 IgG2c-HRP(써던 바이오테크놀로지즈)와 함께 인큐베이션시켰다. 5회 세척 후에, 플레이트를 슈어블루(SureBlue) 테트라메틸벤지딘 기질(커크가드 앤드 페리 레보러토리즈(Kirkegaard & Perry Laboratories))을 사용하여 나노스크린 로봇 상에서 현상하였다. 멀티피펫 사기안 로봇(Multipette Sagian robot)을 사용하여 1N H2SO4로 효소 반응을 중단시켰다. 플레이트를 450 내지 570㎚에서 시너지(Synergy) ELISA 플레이트 판독기(바이오테크(Biotek)) 및 Gen5 소프트웨어를 사용하여 판독하였다.
세포내 사이토카인 사이토카인 염색
백신 특이적 T 세포 반응을 정량하기 위해서, 비장세포를 백신접종 이후에 군당 5마리의 마우스로부터 단리하였다. 적혈구를 적혈구 세포 용해 완충액(이바이오사이언스(eBioscience))을 사용하여 용해시키고, cRPMI 1640(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신; 0.1% 2-머캅토에탄올) 중에 재현탁하였다. 세포를 96-웰 플레이트 내에 107개 세포/웰로 플레이팅하고, 37℃에서 배지 또는 rHA 항원(10㎍/㎖)으로 2시간 동안 자극하였다. 1:50 골지플러그(GolgiPlug((비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 첨가하고, 세포를 추가 8시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 표면을 암실에서 실온에서 15분 동안 항-CD16/32(클론 93)의 존재 하에서 1%BSA-PBS 중에서 1:100의 플루오로크롬 표지된 항체로 CD4(클론 RM4-5), CD8(클론53-6. 7), CD44(클론 IM7) 및 B220(RA3-6B2)(바이오레전드 및 이바이오사이언스)에 대해서 염색하였다. 세포를 고정시키고, 암실에서 실온에서 30분 동안 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm)(비디 바이오사이언시스)으로 투과시켰다. 세포를 펌/와쉬(Perm/Wash)(비디 바이오사이언시스)로 세척하고, 플루오로크롬 표지된 항체로 염색하여 하기와 같은 세포내 사이토카인 사이토카인을 검출하였다: IFN-γ(클론 XMG-1.2), IL-2(JES6-5H4), TNF(MP6-XT22), IL-5(클론:TRFK5) 및 IL-10(클론: JES5-16E3)(바이오레전드(BioLegend) 및 이바이오사이언스). 염색을 암실에서 실온에서 15분 동안 수행하였다. 세포를 세척하고, 1% BSA-PBS 중에 재현탁하고, 30 내지 40㎛ PP/PE 96 필터 플레이트(폴 코프(Pall Corp))를 사용하여 여과하였다. 최대 106 이벤트를 4 레이저 LSR 포테사(Fortessa) 유세포 분석기(비디 바이오사이언시스) 상에서 수집하였다. 데이터를 플로우조(FlowJo)(트리스타(Treestar))로 분석하였다.
결과
음이온성, 양이온성, 또는 페길화된 인지질로 변형된 DPPC-기반 리포솜, 및 중성 DOPC-기반 리포솜을 박막 기술, 그 다음 초음파처리에 의해서 제조하였다. 다양한 리포솜 조성물과의 비상용성에 대한 임의의 경향성을 강조하기 위해서 리포솜을 1㎎/㎖의 고 3M-052 농축액으로 제조하였다. 각각의 리포솜에 대해서 2개의 개별 배취 후에, 페길화된 리포솜 및 DOPC 리포솜은 초음파처리 후에 반투명한 외관 및 가장 작은 입자 크기 및 다분산도를 나타내었다(표 5).
Figure 112018119746337-pct00024
추가 안정성 및 생체내 평가를 위해서 페길화된 리포솜을 선택하였다. 페길화된 리포솜은 아마도 DPPE-PEG750의 음이온성 포스페이트기로 인해서 음으로 하전되었다(표 6).
Figure 112018119746337-pct00025
리포솜은 5℃에서 적어도 6개월 동안 입자 크기에서 거의 변화가 없거나 어떠한 변화도 나타내지 않았다(도 10A 및 10B). 일반적으로, 제조 동안 3M-052의 손실은 눈에 띄지 않았다.
미소유동화에 의해서 3M-052의 스쿠알렌-기반 수중유 에멀션(SE) 제형을 제조하였고, 낮은 다분산도 및 장기간 입자 크기 안정성을 갖는 100㎚ 미만 크기의 소적을 생성하였다(도 10A 및 10B). 에멀션 제타 전위 값은 약간 음성이었다(표 6). 놀랍게도, DPMC 대신에 난 PC를 사용하여 제조된 에멀션은 가공 후에 더 높은 3M-052의 회수율을 초래하였다. 더욱이, 클로로폼 중에서 3M-052와 난 PC를 배합하는 초기 혼합 단계가 클로로폼 없이 스쿠알렌/난 PC 중에서 건조 분말을 초음파처리하는 것에 비해서 3M-052의 회수율을 추가로 증가시켰다. 따서, 에멀션 조성물의 변화 및 가공 절차가 최종 제형에서 3M-052 혼입에 대해서 유의한 효과를 가졌다. 하기 표 7을 참고하기 바란다.
Figure 112018119746337-pct00026
H5N1 HA와 조합된 제형화된 3M-052는 단일 면역화 이후에 치명적인 H5N1 시험감염으로부터 마우스를 보호한다.
3M-052 아주반트 제형의 안정성의 입증(도 10A 및 도 10B) 이후에, HA 특이적 백신 반응을 향상시키는 이러한 TLR 효능제의 능력을 조사하였다. 페길화된 리포솜 또는 스쿠알렌 수중유 에멀션(SE) 중 어느 하나 중에 제형화된 3M-052를 재조합 인플루엔자 HA H5N1 단백질(A/Vietnam/1203/04 균주[VN1203](프로테인 사이언시스 코프., 미국 코네티컷주 메르디엔 소재)와 혼합하고, 이를 사용하여 근육내 경로를 통해서 C57Bl/6 마우스(N=20/군)의 군을 면역화시켰다. 단일 면역화 21일 후, 모든 마우스를 1000 LD50의 VN1203으로 비내로 시험감염시켰다. 10마리의 동물을 14일 동안 추적하여 체중 감소에 의해서 측정된, 바이러스 유도된 이병률 및 사망률을 결정하였다. 리포솜 아주반트 제형에서, 3M-052는 바이러스 유도된 이병률을 예방하였고; rH5 + 3M-052-리포솜이 제공된 동물 중 100%가 생존하였고, 이에 비해서 rH5 또는 리포솜 단독과 조합된 rH5가 제공된 동물 중 50%가 생존하였다(도 11A). rH5 + 3M-052-리포솜으로 면역화된 마우스는 체중 감소를 나타내지 않았고, 반면에 리포솜과 함께 또는 리포솜 없이 rH5가 제공된 동물은 시험감염 후 11일 동안 체중이 감소되었다(도 11B). 에멀션 기반 제형이 제공된 동물은, 인플루엔자 아주반트로서의 에멀션의 공지된 효능과 일관되게, 3M-052이 있는 것 및 없는 것 둘 모두에서 일관된 생존을 나타내었다(도 11A). 그러나, TLR 7/8 효능제와 조합된 에멀션이 제공된 동물은 rH5 + SE가 제공된 동물에 비해서 급성 감염 기간에 걸쳐서 감소된 체중 감소를 나타내었다(도 11C).
생존에 대해서 모니터링된 동물에 더하여, 5마리 동물/군을 시험감염 4일 및 7일 후에 안락사시켜 폐에서 인플루엔자 유도된 병리학을 측정/관찰하고, 폐 바이러스 역가를 결정하였다. 시험감염 4일 후에, rH5 + 3M-052 아주반트 제형으로 면역화된 동물은 비-면역화 대조군에 비해서 상당히 감소된 폐 바이러스 역가를 가졌다. rH5 + 3M-052-리포솜으로 면역화된 동물은 이 지점에서 검출 가능한 바이러스 역가를 갖지 않았다(도 11D). 7일에, 3M-052 기반 아주반트 제형이 제공된 동물은 rH5 단독에 비해서 최소 바이러스 역가를 가졌다. 리포솜 기반 제형 및 SE 기반 제형 둘 모두의 경우, 3M-052의 첨가는 TLR가 없는 동일한 제형에 비해서 상당히 감소된 역가를 초래하였다(도 11E). 감소된 바이러스 역가에 더하여, rH5 + 3M-052 아주반트 제형으로 면역화된 동물은 상당히 더 낮은 폐 중량(도 11F) 및 감소된 폐 병리학 점수(도 11G)를 나타내었다. 종합해보면, 이들 결과는, 심지어는 치명적인 조류 인플루엔자 시험감염의 임상적 후유증으로부터 마우스를 보호하는 3M-052의 능력을 예증한다. 도 11H는 폐 바이러스 역가를 나타낸다.
3M-052 아주반트 제형은 마우스에서 Th1 CD 4 T-세포 반응을 유도한다.
3M-052-힘유 아주반트 제형에 대한 보호의 상관관계를 조사하기 위해서, 아주반트와 조합하여 rH5로 면역화시킨 후에 유도되는 CD4 T-세포 반응을 조사하였다. 단일 면역화 후에, CD4+ T 세포로부터의 사이토카인 생산을 조사하였다. 낮지만 검출 가능한 수준의 Th1 사이토카인 양성 세포(IFNγ/TNFα/IL-2)가 3M-052 아주반트 제형으로 면역화된 동물에서 나타날 수 있었다(도 12A 내지 도 12C). 정규 Th1 CD+ T 세포는 동물에서 보호성인 것으로 나타난 모든 아주반트 제형에서 관찰될 수 있었다. 이전의 연구와 일관되게, 이들 데이터는 낮은 수준의 항원으로 백신접종된 후 마우스에서 Th1 편향된 세포 반응을 유도하는 3M-052의 능력을 예증한다.
3M-052 아주반트 제형은 H5N1 HA에 대한 확장된 교차 하위유형 항체 반응을 유도한다.
제형화된 3M-052 아주반트로의 면역화 이후에 Th1 CD4 T 세포(IFNγ+TNFα+IL-2+)의 유도를 관찰하였다(도 12). 2세대 고밀도 HA 단백질 어레이를 사용하여, 클레이드 1 rH5 항원에 의해서 유도된 항체 반응을 확장시키는 3M-052의 능력을 조사하였다. 본 연구에서 사용된 HA 어레이는 HA 하위유형 1 내지 16으로부터 대표적인 적어도 1종을 비롯하여, 278종의 개별 HA 단백질을 함유한다. 상이한 하위유형으로부터의 HA 단백질에 결합하는 IgG1 및 IgG2c 둘 모두의 능력을 조사하였다. 아주반트의 첨가는 부스트 면역화 후에 유도된 항체의 수준을 증가시켰다. SE 및 리포솜 아주반트는 H5 하위유형 단백질에 대한 증가된 결합을 나타내었고, IgG1 반응이 우세하였다. 두 제형 중 어느 하나에 대한 3M-052의 첨가는 광범위한 HA 하위유형에 대한 결합을 갖는, 항체 반응의 상당한 확장을 초래하였고, 또한 교차-반응성 IgG2c 항체의 유도를 초래하였다(데이터 제시 생략).
어레이 상에서의 H5 균주의 조사는 3M-052 제형으로의 면역화 이후 교차-클레이드 결합 반응을 명확하게 예증하였다. 3M-052-리포솜 면역화된 동물 및 3M-052-SE 면역화된 동물 둘 모두는 다수의 H5N1 바이러스 클레이드로부터의 단백질에 결합하는 IgG2c 항체의 증가된 수준을 나타내었다. 이에 반해서 IgG1 수준은 3M-052의 존재와 무관하였다. HA 어레이로부터의 발견을 확인하기 위해서, 코팅 항원으로서 VN1203 HA를 사용하여 ELISA에 의해서 면역화후 마우스 혈청에서 항체 종점 역가를 결정하였다. 혈청 ELISA에 의해서 관찰된 결과는 HA 어레이 상에서 관찰된 것을 투영하였다(데이터 제시 생략).
TLR 7/8 효능제는 페럿 전혈에서 수용체 및 사이토카인 mRNA를 향상시킨다.
이미다조퀴놀린이 페럿에서 동족 TLR 리셉터를 자극할 수 있는지를 확인하기 위해서, 전혈 자극 검정을 수행하였다. 수컷 피치 페럿으로부터의 전혈을 수집하고, 이미다조퀴놀린 또는 합성 TLR4 효능제 글리코피라노실 지질 A(GLA)로 자극하였다. 사이토카인 및 TLR 수용체 mRNA 둘 모두를 자극하는 효능제 분자의 능력을 실시간 PCR에 의해서 조사하였다. 100μM의 R848(다른 종에서 공지된 TLR7/8 효능제, 쓰리엠) 및 100μM의 CL075(다른 종에서 공지된 TLR8 효능제, 인비보젠(Invivogen)) 둘 모두로의 전혈의 자극은 IL-1B, IL-8, TLR7 및 TLR8 mRNA의 상당한 증가를 초래하였다. 이러한 결과는 페럿 수용체를 자극하는 이미다조퀴놀린의 능력을 예증하고, 페럿이 이러한 인플루엔자 질환 모델에서 역할을 할 수 있는 활성 TLR7 및 TLR8 둘 모두를 갖는다는 것을 시사한다.
제형화된 3M-052 아주반트는 단일 면역화 후 페럿에서 H5N1 시험감염에 대한 보호를 향상시킨다(H5N1 항원과 조합됨).
마우스에서의 유망한 결과 및 이미다조퀴놀린이 페럿 TLR을 자극할 수 있다는 확인을 고려하여, 단일 면역화 후에 치명적인 H5N1 시험감염으로부터 페럿을 보호하는 3M-052 함유 아주반트의 능력을 조사하였다. 이들 연구를 위해서, 3M-052를 갖는 중성 리포솜 및 SE 아주반트 및 3M-052를 갖지 않는 중성 리포솜 및 SE 아주반트를 VN1203(SP-H5)으로부터 유래된 H5N1 분할 바이러스 백신(사노피(Sanofi))과 배합하였다. 이것은 미국의 경우 전국적인 유행성 비축량에 현재 포함되고, 이전 연구에서 임상적으로 시험되었기 때문에, 이러한 항원을 선택하였다. 간략하면, H5N1 항원 단독으로의 용량 범위 연구(데이터 제시 생략) 이후에, 4 내지 6마리의 페럿의 군을 제시된 바와 같이 아주반트와 혼합된 SP-H5 0.5㎍으로 근육내 경로를 통해서 면역화시켰다(도 13). 면역화 21일 후, 페럿을 106PFU의 A/VN/1203/04로 비내로 시험감염시키고, 14일 동안 체중 감소, 임상 점수 및 생존에 대해서 추적하였다. 또한, 코 세척액을 시험감염 1일 후에 시작하여 격일로 수집하였다. 일 연구에서, 3M-052/SE는 SP-H5 + SE로 면역화된 동물과 비교할 때, 동물을 시험감염으로부터 완전히 보호하였다(도 13A). 3M-052/SE는 또한 SE 단독에 비해서 바이러스-유도된 이병률을 감소시켰고; SP-H5 + 3M-052/SE로 면역화된 동물은 시험감염 이후에 체중이 감소하지 않았고(도 13B), 감염 전체에서 단지 최소 임상 점수를 가졌다(도 13C). 유사한 결과가 리포솜 아주반트 제형으로의 동물의 면역화 이후에 제2 실험에서 관찰되었다. 3M-052-리포솜은 시험감염으로부터 동물 중 100%를 보호하였다(도 13E). SE 기반 제형과 유사하게, SP-H5 + 3M-052 리포솜으로 면역화된 동물은 체중이 감소되지 않았고(도 13F), 무시할 만한 임상 점수를 가졌다(도 13G). 아마도 가장 중요하게는, 폐 바이러스 역가의 조사는, SE 및 리포솜 제형 둘 모두에서, 3M-052가 코 세척액에서 바이러스 쉐딩(shedding)을 감소시킬 수 있다는 것을 나타내고; 3M-052/SE(도 13D) 또는 3M-052/리포솜(도 13H)으로 면역화된 동물은 다른 아주반트 또는 대조군 동물과 비교할 때 시험감염 3일 후에 바로 상당한 감소를 나타내었다. 두 경우 모두에서, 바이러스는 3M-052 아주반트가 제공된 모든 동물에서 5일까지 검출 가능한 수준이 확실하였다.
3M-052 아주반트 제형은 페럿에서 교차-클레이드 중화 항체 반응을 유도한다.
마우스에서 관찰된 넓은 HA-특이적 항체 반응 및 페럿에서 동종 바이러스에 대해서 본 발명자들이 관찰한 강력한 보호를 기반으로, 루시퍼라제 이식유전자를 패키징한 H5N1 HA 위형 렌티바이러스 벡터를 사용하여 상이한 아주반트 제형으로 면역화시킨 후 중화 항체 역가를 직접 조사하였다. 간략하면, 연속 희석된 혈청 샘플을 표면 상에 H5N1 HA 및 NA 단백질을 함유하는 렌티바이러스 입자와 함께 인큐베이션시켰다. 혈청-바이러스 혼합물을 MDCK 세포의 융합성 단층 상에서 인큐베이션시켰다. 바이러스 내에 패키징된 루시퍼라제 이식유전자의 발현을 허용하기 위한 인큐베이션 이후에, 혈청 샘플의 중화 가능성을 루시퍼라제 유전자 발현의 정량에 의해서 결정하였다. 이들 연구에서 관찰된 증가된 생존과 일관되게, 3M-052/SE 및 3M-052/리포솜 아주반트는 단일 주사 21일 후 혈청에서 IC90 중화 역가를 증가시켰다(도 14A, D). 또한, 두 제형 모두는 클레이드 2 바이러스에 대한 중화 역가를 상당히 증가시켰고; A/인도(Indo)/5/05[클레이드 2.1] 및 A/큰 고니/몽골리아/244/05 [클레이드 2.2]에 대해서 증가된 IC90 역가가 관찰되었다(도 14B 내지 도 14F). 이러한 발견은 이동된 인플루엔자 균주에 대한 넓은 기능성 중화 항체 역가를 유도하는 제형화된 3M-052의 능력과 일치한다.
3M-052-SE는 교차-클레이드 보호 반응을 유도한다.
VN1203 항원으로의 면역화 이후 A/큰 고니/몽골리아/244/05에 대해서 관찰된 중화 역가를 고려하여, VN1203 항원으로의 백신접종 이후 폐에서 바이러스 복제를 감소시키는 제형화된 3M-052의 능력을 조사하였다. 이전 연구에서와 같이, 페럿을 제형화된 3M-052와 조합된 SP-H5로 1회 면역화시키고, 21일 후에 5 x 105PFU의 바이러스로 시험감염시켰다. 3M-052/리포솜이 제공된 동물은 시간 경과에 따라서 바이러스 쉐딩에서 보통의 감소를 나타내었고; 3M-052/리포솜이 제공된 동물은 시험감염 5일 후에 검출 가능한 바이러스를 갖지 않은 반면, 리포솜 또는 항원 단독이 제공된 다른 동물은 이 시기에 검출 가능한 바이러스를 가졌다(도 15B). 이에 반해서, 3M-052-SE가 제공된 동물은 바이러스가 신속하게 제거되고, 시험감염 3일 후로부터 검출 가능한 플라크가 존재하지 않은 반면, SP-H5 + SE가 제공된 것은 5일을 통해서 검출 가능한 바이러스 역가를 나타내었다(도 15A).
결과의 논의
본 명세서에 제시된 결과는, 동물을 제형화된 TLR7/8 효능제 3M-052로 면역화시킨 경우 H5N1 바이러스로의 고용량(1000 LD50) 시험감염 이후에 마우스 및 페럿에서 보호를 예증한다. 3M-052는 두 제형 중 어느 하나에 혼입되고 이들 제형은 연장된 기간 기간 동안 안정적이다. 3M-052의 신규 페길화된 리포솜 제형은 저용량(100ng)의 재조합 HA 기반 항원과 조합되는 경우 생존을 증가시키고, 폐 바이러스 역가를 감소시키는 것으로 관찰되었다. 또한, 3M-052 및 DMPC 또는 난 PC를 스쿠알렌 수중유 에멀션에 혼입한 제형을 시험하였고, rHA와 조합하여 이러한 제형을 사용하면 증가된 생존 및 감소된 폐 역가가 나타났다. 3M-052로 면역화된 동물에서 Th1 CD4+ T 세포의 유도가 관찰되었다. Th1 CD4+ T-세포 유도와 일관되게, 3M-052 면역화 동물에서 IgG2c 항체의 증가가 관찰되었다. 동종 바이러스 균주 및 이종 바이러스 균주 둘 모두에 대해서 보호를 유도하는 3M-052 함유 아주반트 제형의 능력뿐만 아니라 제형화된 3M-052 아주반트의 연장된 안정성은, 이들 제형이 비축 동안 안정적이라는 것을 나타낸다. 추가로, 이들 아주반트와 국가 비축에 현재 포함된 대유행전단계(pre-pandemic) 백신 항원의 상용성이 예증되며, 조합 백신이 균주-매칭 단리물 및 이동 단리물 모두에 대해서 페럿을 보호할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 페길화된 리포솜 다능성
페길화된 리포솜 제형의 다능성을 시험하기 위해서, 추가적인 지질을 콜레스테롤, 비-페길화된 중성 지질, 및 페길화된 지질의 베이스 제형에 첨가하였다. 1종 이상의 추가적인 중성 지질 및 1종 이상의 추가적인 양이온성 지질의 첨가는 생성된 리포솜 제형의 안정성 또는 효능에 부정적으로 영향을 주지 않았다(데이터 제시 생략).

Claims (39)

  1. (a) 콜레스테롤;
    (b) 비-페길화된 중성 지질;
    (c) 페길화된 지질로서, 상기 페길화된 지질 중의 PEG의 평균 분자량은 2000달톤인, 페길화된 지질; 및
    (d) TLR4 효능제 및 TLR7/8 효능제를 포함하는 리포솜으로서,
    상기 TLR4 효능제는 GLA(glucopyranosyl lipid adjuvant)이고, TLR7/8 효능제는 N-(4-{[4-아미노-2-부틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]옥시}부틸)옥타데칸아마이드(3M-052)이며, 중량 기준으로 3M-052보다 2배 이상 더 많은 GLA가 존재하는, 리포솜.
  2. 제1항에 있어서, 상기 페길화된 지질의 지질 구성성분은 중성 지질을 포함하는, 리포솜.
  3. 제1항에 있어서, 상기 페길화된 지질의 상기 지질 구성성분은 DSPE, DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE 또는 DMPE인, 리포솜.
  4. 제1항에 있어서, 상기 페길화된 지질의 상기 지질 구성성분은 DSPE 또는 DPPE인, 리포솜.
  5. 제1항에 있어서, 상기 비-페길화된 중성 지질은 DPPC, DOPC, DLPC, DMPC, DSPC, POPC, DPPE 또는 DMPE인, 리포솜.
  6. 제1항에 있어서, 상기 비-페길화된 중성 지질은 DPPC인, 리포솜.
  7. 제1항에 있어서, 상기 리포솜은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 적어도 1개월 동안 안정적인, 리포솜.
  8. 제1항에 있어서, 상기 리포솜의 다분산 지수는 0.3 이하로 유지되는, 리포솜.
  9. 제1항에 있어서, 상기 리포솜의 크기는 450㎚ 이하인, 리포솜.
  10. 제1항에 있어서, 상기 리포솜 중의 상기 페길화된 지질의 몰 백분율(㏖%)은 1㏖% 내지 25㏖%의 범위이고, 상기 리포솜 중의 콜레스테롤의 ㏖%는 1㏖% 내지 50㏖%의 범위이고, 상기 리포솜 중의 비-페길화된 지질의 ㏖%는 45㏖% 내지 98㏖%인, 리포솜.
  11. 제1항에 있어서, 상기 비-페길화된 중성 지질:콜레스테롤:페길화된 지질의 지질 몰비는 9.8:5.7:0.8 또는 18:5.5:3인, 리포솜.
  12. 제1항에 있어서, 상기 TLR4 효능제는 소수성 테일을 포함하는, 리포솜.
  13. 제1항에 있어서, 상기 TLR4 효능제는 하기 화학식의 합성 GLA(glucopyranosyl lipid adjuvant) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    Figure 112022023857698-pct00027
    ; 또는
    하기 화학식 (VI)의 합성 GLA 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 리포솜:
    Figure 112022023857698-pct00028

    식 중,
    R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C12-C20 알킬이고, 바람직하게는 R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C13 알킬이다.
  14. 삭제
  15. 제1항에 있어서, 상기 리포솜은 항원을 더 포함하는, 리포솜.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항원은 H5N1을 포함하는, 리포솜.
  17. 제15항에 있어서, 상기 항원은 LecA를 포함하는, 리포솜.
  18. 제1항 내지 제13항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 리포솜, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하기 위한 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 중량 기준으로 3M-052보다 2.5배 더 많은 GLA가 존재하는, 리포솜.
  20. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 백신인, 조성물.
  21. 제1항 내지 제13항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 리포솜을 포함하는, 대상체에서 Th1 반응을 유도하기 위한, 조성물.
  22. 제18항에 있어서, 상기 면역 반응은 비-특이적 면역 반응인, 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 상기 Th1 반응은 비-특이적 면역 반응인, 조성물.
  24. 제18항에 있어서, 상기 면역 반응은 항원-특이적 면역 반응인, 조성물.
  25. 제21항에 있어서, 상기 Th1 반응은 항원-특이적 면역 반응인, 조성물.
  26. 제18항에 있어서, 상기 리포솜은 인플루엔자-유발 바이러스에 대한 보호 면역을 향상시키는데 사용되는, 조성물.
  27. 제21항에 있어서, 상기 리포솜은 인플루엔자-유발 바이러스에 대한 보호 면역을 향상시키는데 사용되는, 조성물.
  28. 제21항에 있어서, 상기 리포솜은 아메바성감염(amebiasis)-유발 유기체에 대한 보호 면역을 향상시키는데 사용되는, 조성물.
  29. 제17항의 리포솜을 포함하는, 대상체에서 전신 면역 반응 및 점막 면역 반응을 자극하기 위한 조성물.
  30. 하기 단계들을 포함하는, 제1항 내지 제13항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 페길화된 리포솜의 제조 방법:
    (a) 상기 비-페길화된 중성 지질, 상기 페길화된 지질, 및 상기 콜레스테롤을 유기 용매 중에서 혼합하는 단계;
    (b) 상기 유기 용매를 증발시킴으로써, 지질막을 생성시키는 단계;
    (c) 상기 지질막을 완충액 중에 재수화시키는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)의 재수화된 생성물을 초음파처리, 미소유동화(microfluidizing), 또는 압출하는 단계.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112018073676B1 (pt) * 2016-05-16 2023-10-03 University Of Virginia Patent Foundation Lipossomas peguilados e métodos de uso
CN107998070A (zh) * 2017-12-12 2018-05-08 南京中医药大学 一种复合磷脂传递体及其在制备经皮给药制剂中的应用
EP3886901A1 (en) * 2018-11-29 2021-10-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods for manufacturing an adjuvant
BR112021010717A2 (pt) * 2018-12-17 2021-08-31 Eisai R&D Management Co., Ltd. Formulação que compreende lipossomas
CN110151702A (zh) * 2019-06-24 2019-08-23 昆明医科大学 聚乙二醇修饰流感疫苗脂质体及其制备方法
WO2021194672A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Hdt Bio Corp. Compositions and methods for delivery of rna
US11679163B2 (en) 2019-09-20 2023-06-20 Hdt Bio Corp. Compositions and methods for delivery of RNA
KR102328531B1 (ko) * 2020-01-23 2021-11-17 서울대학교산학협력단 체내 면역 세포 표적 황화수소 공여체 담지 리포좀을 포함하는 면역질환 치료 또는 예방용 약학 조성물
JP2023535405A (ja) * 2020-07-22 2023-08-17 ユニバーシティー オブ ヒューストン システム 呼吸器疾患に関連する状態の処置および防止
US20240050561A1 (en) 2020-12-23 2024-02-15 Access To Advanced Health Institute Solanesol vaccine adjuvants and methods of preparing same
US20240180834A1 (en) * 2021-02-26 2024-06-06 Univesity Of Virginia Patent Foundation Development of covid-19 vaccine using a dual tlr ligand liposome adjuvant
CN117396194A (zh) * 2021-03-11 2024-01-12 宾夕法尼亚大学理事会 靶向治疗性脂质纳米颗粒及使用方法
KR102682082B1 (ko) * 2021-06-01 2024-07-05 서울대학교산학협력단 리포좀 및 이를 포함하는 암 방사선 치료용 약학 조성물
KR20240088845A (ko) 2021-09-22 2024-06-20 에이치디티 바이오 코포레이션 건조된 나노입자 조성물
WO2024137455A1 (en) * 2022-12-19 2024-06-27 Newimmune Ii, Llc Nanoparticulate formulation
CN115737800B (zh) * 2023-01-09 2023-05-23 江苏瑞科生物技术股份有限公司 一种复合脂质体佐剂及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015136479A1 (en) * 2014-03-12 2015-09-17 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Liposomal compositions for mucosal delivery

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3598122A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US4286592A (en) 1980-02-04 1981-09-01 Alza Corporation Therapeutic system for administering drugs to the skin
US4314557A (en) 1980-05-19 1982-02-09 Alza Corporation Dissolution controlled active agent dispenser
US4379454A (en) 1981-02-17 1983-04-12 Alza Corporation Dosage for coadministering drug and percutaneous absorption enhancer
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
IL73534A (en) 1983-11-18 1990-12-23 Riker Laboratories Inc 1h-imidazo(4,5-c)quinoline-4-amines,their preparation and pharmaceutical compositions containing certain such compounds
US4568343A (en) 1984-10-09 1986-02-04 Alza Corporation Skin permeation enhancer compositions
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
US4948587A (en) 1986-07-08 1990-08-14 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transbuccal drug delivery
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
EP1088830A3 (en) 1987-06-22 2004-04-07 Medeva Holdings B.V. Hepatitis b surface antigen particles
US4780212A (en) 1987-07-31 1988-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enchancement of membrane permeability
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
GB2232892B (en) 1988-02-23 1991-07-24 John Mark Tucker Occlusive body for administering a physiologically active substance
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8819209D0 (en) 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
US4999403A (en) 1988-10-28 1991-03-12 Exxon Chemical Patents Inc. Graft polymers of functionalized ethylene-alpha-olefin copolymer with polypropylene, methods of preparation, and use in polypropylene compositions
AU626961B2 (en) 1988-12-16 1992-08-13 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezonheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
DK0414374T3 (da) 1989-07-25 1998-03-09 Smithkline Beecham Biolog Hidtil ukendte antigener og fremgangsmåder til fremstilling deraf
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
GB9106048D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
ES2267890T3 (es) 1991-07-19 2007-03-16 The University Of Queensland Segmento polinucleotido de genoma hpv16.
US5464387A (en) 1991-07-24 1995-11-07 Alza Corporation Transdermal delivery device
JP3954643B2 (ja) 1991-11-16 2007-08-08 グラクソスミスクライン・バイオロジカルス・ソシエテ・アノニム マラリア原虫由来のＣＳおよびＨＢｓＡＧ間のハイブリッド蛋白質
DK0647140T3 (da) 1992-06-25 2008-02-04 Univ Georgetown Papillomavirusvacciner
US5786148A (en) 1996-11-05 1998-07-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotides encoding a novel prostate-specific kallikrein
US5437951A (en) 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
DE69434383T2 (de) 1993-03-09 2005-11-24 The University Of Rochester Herstellung von menschlichem papillomavirus hüllprotein und virus-ähnlichen teilchen
ATE195735T1 (de) 1993-07-15 2000-09-15 Minnesota Mining & Mfg Imidazo (4,5-c)pyridin-4-amine
DE69433727T2 (de) 1993-11-02 2004-09-30 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd., Kadoma Halbleiterbauelement mit einem Aggregat von Mikro-Nadeln aus Halbleitermaterial
US5458140A (en) 1993-11-15 1995-10-17 Non-Invasive Monitoring Company (Nimco) Enhancement of transdermal monitoring applications with ultrasound and chemical enhancers
US5885211A (en) 1993-11-15 1999-03-23 Spectrix, Inc. Microporation of human skin for monitoring the concentration of an analyte
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
US5688506A (en) 1994-01-27 1997-11-18 Aphton Corp. Immunogens against gonadotropin releasing hormone
US5457041A (en) 1994-03-25 1995-10-10 Science Applications International Corporation Needle array and method of introducing biological substances into living cells using the needle array
US5591139A (en) 1994-06-06 1997-01-07 The Regents Of The University Of California IC-processed microneedles
DE122007000092I1 (de) 1994-10-07 2008-03-27 Univ Loyola Chicago Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung
WO1996026277A1 (en) 1995-02-24 1996-08-29 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5981215A (en) 1995-06-06 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Human criptin growth factor
US5618275A (en) 1995-10-27 1997-04-08 Sonex International Corporation Ultrasonic method and apparatus for cosmetic and dermatological applications
US5656016A (en) 1996-03-18 1997-08-12 Abbott Laboratories Sonophoretic drug delivery system
US5955306A (en) 1996-09-17 1999-09-21 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes encoding proteins that interact with the tub protein
US7033598B2 (en) 1996-11-19 2006-04-25 Intrabrain International N.V. Methods and apparatus for enhanced and controlled delivery of a biologically active agent into the central nervous system of a mammal
US5840871A (en) 1997-01-29 1998-11-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Prostate-associated kallikrein
EP0972201B1 (en) 1997-02-25 2005-08-17 Corixa Corporation Compounds for immunodiagnosis of prostate cancer and methods for their use
EP0998557A2 (en) 1997-07-21 2000-05-10 North American Vaccine, Inc. Modified immunogenic pneumolysin, compositions and their use as vaccines
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US7459524B1 (en) 1997-10-02 2008-12-02 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, sequence and uses thereof
JP2002517179A (ja) 1997-11-28 2002-06-18 ジェンセット Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓゲノム配列およびポリペプチド、それらのフラグメント、ならびに特に感染症の診断、予防および治療のためのそれらの使用
UA67760C2 (uk) 1997-12-11 2004-07-15 Міннесота Майнінг Енд Мануфакчурінг Компані Імідазонафтиридин та тетрагідроімідазонафтиридин, фармацевтична композиція, спосіб індукування біосинтезу цитокінів та спосіб лікування вірусної інфекції, проміжні сполуки
DK1659178T3 (da) 1998-02-05 2010-07-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Fremgangsmåde til oprensning eller fremstilling af et MAGE-protein
EP1068329A2 (en) 1998-04-07 2001-01-17 Corixa Corporation FUSION PROTEINS OF $i(MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS) ANTIGENS AND THEIR USES
GB2336310B (en) 1998-04-14 2003-09-10 Stowic Resources Ltd Method of manufacturing transdermal patches
JP2002511266A (ja) 1998-04-15 2002-04-16 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ 腫瘍関連核酸及びその使用
US6322532B1 (en) 1998-06-24 2001-11-27 3M Innovative Properties Company Sonophoresis method and apparatus
CN100419079C (zh) 1998-07-14 2008-09-17 科里克萨有限公司 用于治疗和诊断前列腺癌的组合物和方法
US6110929A (en) 1998-07-28 2000-08-29 3M Innovative Properties Company Oxazolo, thiazolo and selenazolo [4,5-c]-quinolin-4-amines and analogs thereof
JP2002542203A (ja) 1999-04-19 2002-12-10 スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
US6685699B1 (en) 1999-06-09 2004-02-03 Spectrx, Inc. Self-removing energy absorbing structure for thermal tissue ablation
JP4162813B2 (ja) 1999-10-28 2008-10-08 久光製薬株式会社 イオントフォレーシス装置
US6974588B1 (en) 1999-12-07 2005-12-13 Elan Pharma International Limited Transdermal patch for delivering volatile liquid drugs
US6908453B2 (en) 2002-01-15 2005-06-21 3M Innovative Properties Company Microneedle devices and methods of manufacture
US6676961B1 (en) 2002-03-06 2004-01-13 Automated Carrier Technologies, Inc. Transdermal patch assembly
US7018345B2 (en) 2002-12-06 2006-03-28 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Iontophoresis system
KR20060120069A (ko) 2003-10-03 2006-11-24 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 피라졸로피리딘 및 그의 유사체
DE102005032175A1 (de) 2005-07-09 2007-01-18 Krones Ag Behälter-Behandlungsmaschine und Verfahren zum Laden und Entladen einer Behälter-Behandlungsmaschine
EP1611926B1 (de) 2005-07-19 2008-01-16 Gebrüder Holzapfel GmbH &amp; Co. KG Auftriebshilfe
US9333250B2 (en) * 2006-04-06 2016-05-10 The Johns Hopkins University Methods and compositions for treating bacterial infection
DK2468300T3 (da) * 2006-09-26 2018-01-29 Infectious Disease Res Inst Vaccinesammensætning indeholdende syntetisk adjuvant
JP5425642B2 (ja) * 2007-02-07 2014-02-26 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 合成ｔｌｒアゴニストの結合体およびそのための使用
MX351247B (es) 2007-04-04 2017-10-05 Infectious Disease Res Institute Star Composiciones inmunogenicas que comprenden polipeptidos de mycobacterium tuberculosis y fusiones de los mismos.
US8793881B2 (en) 2008-08-15 2014-08-05 Stanley Black & Decker, Inc. Utility knife with blade lock
AU2009286769A1 (en) * 2008-08-28 2010-03-04 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
SG173194A1 (en) * 2009-02-17 2011-09-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Inactivated dengue virus vaccine with aluminium-free adjuvant
TWI494125B (zh) 2009-06-05 2015-08-01 Infectious Disease Res Inst 合成的葡萄吡喃糖基脂質佐劑
EP2440182A2 (en) * 2009-06-08 2012-04-18 Epitarget AS Lipophilic drug carrier
TWI397428B (zh) 2009-12-29 2013-06-01 Ind Tech Res Inst 標的第四介白素受體之傳輸系統
DK2606047T3 (en) 2010-08-17 2017-03-27 3M Innovative Properties Co COMPOSITIONS AND FORMULATIONS WITH LIPIDIZED IMMUNE RESPONSE-MODIFIING COMPOUND AND PROCEDURES THEREOF
PT4226941T (pt) 2010-08-31 2024-11-18 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lipossomas peguilados para entrega de arn codificador de imunogénio
SG11201401177WA (en) * 2011-10-06 2014-04-28 Immunovaccine Technologies Inc Liposome compositions comprising an adjuvant that activates or increases the activity of tlr2 and uses thereof
WO2013066903A1 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Mallinckrodt Llc Combinational liposome compositions for cancer therapy
EP2787977A4 (en) * 2011-12-09 2015-05-06 Univ California LIPOSOMAL ACTIVE INVERTING
WO2013119856A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-15 Infectious Disease Research Institute Improved adjuvant formulations comprising tlr4 agonists and methods of using the same
WO2013155493A1 (en) * 2012-04-12 2013-10-17 Yale University Methods of treating inflammatory and autoimmune diseases and disorders
WO2014008406A2 (en) * 2012-07-05 2014-01-09 Children's Medical Center Corporation The bacterial biofilm matrix as a platform for protein delivery
CA2903254C (en) * 2013-03-13 2019-04-09 Mallinckrodt Llc Liposomal cisplatin compositions for cancer therapy
EP3104878B1 (en) 2014-02-14 2019-05-22 Immune Design Corp. Immunotherapy of cancer through combination of local and systemic immune stimulation
CN105534908B (zh) * 2016-01-15 2018-12-14 徐州医学院 一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体
BR112018073676B1 (pt) * 2016-05-16 2023-10-03 University Of Virginia Patent Foundation Lipossomas peguilados e métodos de uso

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015136479A1 (en) * 2014-03-12 2015-09-17 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Liposomal compositions for mucosal delivery

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Antimicrob Agents Chemother. 2014 May; 58(5): 2816-2824.

Also Published As

Publication number Publication date
US11266602B2 (en) 2022-03-08
AU2023200515A1 (en) 2023-03-02
RU2018137866A3 (ko) 2021-02-04
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CA3023672A1 (en) 2017-11-23
JP2019518739A (ja) 2019-07-04
RU2018137866A (ru) 2020-06-17
BR112018073676B1 (pt) 2023-10-03
KR20190025822A (ko) 2019-03-12
JP2022177112A (ja) 2022-11-30
US20200138715A1 (en) 2020-05-07
MX2018013640A (es) 2019-08-01
IL263030B1 (en) 2024-07-01
ZA201807128B (en) 2019-06-26
AU2017268175B2 (en) 2023-02-23
IL263030A (en) 2018-12-31
AU2023200515B2 (en) 2024-04-18

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