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KR102471452B1 - 핵산, 특히 긴 핵산을 합성하는 방법, 상기 방법의 용도 및 상기 방법을 수행하기 위한 키트 - Google Patents

핵산, 특히 긴 핵산을 합성하는 방법, 상기 방법의 용도 및 상기 방법을 수행하기 위한 키트 Download PDF

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KR102471452B1
KR102471452B1 KR1020167032133A KR20167032133A KR102471452B1 KR 102471452 B1 KR102471452 B1 KR 102471452B1 KR 1020167032133 A KR1020167032133 A KR 1020167032133A KR 20167032133 A KR20167032133 A KR 20167032133A KR 102471452 B1 KR102471452 B1 KR 102471452B1
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fragments
nucleic acid
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토마스 이베르
실뱅 가리엘
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디엔에이 스크립트
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Abstract

본 발명은 핵산의 초기 단편을 연장하는 적어도 하나의 사이클을 포함하는 긴 핵산(long nucleic acids)을 합성하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 a) 상기 단편으로의 뉴클레오티드의 효소적 첨가를 포함하는 상(phase), b) 정확한 시퀀스를 갖는 단편의 정제를 포함하는 상(phase), c) 효소적 증폭의 임의의 상(phase)을 포함하고, 각 사이클은 수성 매질과 같은, 효소적 첨가 및 증폭과 호환될 수 있는 반응 매질 내에서 수행되며, 상기 합성 방법은 또한 모든 연장 사이클의 말단에서 최종 증폭의 마지막 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 유전자, 핵산의 합성 시퀀스, DNA 또는 RNA의 생산을 위한 용도와 관련된다. 본 발명은 추가로 상기 방법을 수행하기 위한 키트와 관련된다.

Description

핵산, 특히 긴 핵산을 합성하는 방법, 상기 방법의 용도 및 상기 방법을 수행하기 위한 키트 {METHOD FOR SYNTHESISING NUCLEIC ACIDS, IN PARTICULAR LONG NUCLEIC ACIDS, USE OF SAID METHOD AND KIT FOR IMPLEMENTING SAID METHOD}
본 발명은 핵산, 특히 긴 핵산의 합성 방법 및 또한 이러한 합성 방법의 수행을 위한 키트에 관한 것이다.
핵산은 현재 유기 합성법에 의하여 시험관 내에서 합성된다. 이러한 방법 중의 가장 흔한 것은 아담스와 그의 동료들에 의해 기술된 "포스포라미다이트" 법이다 (1983, J.　 Amer . Chem . Soc ., 105, 661) 및 Froehler et al. (1983, Tetrahedron Lett ., 24, 3171).
이러한 합성법은 매우 광범위하게 알려졌고 핵산 생산 활동을 하는 여러 실험실 및 회사에 의해 사용되는 가장 흔한 것으로 남아 있다. 사용의 정도 및 그에 특정한 성능으로 인하여, 이러한 방법은 핵산의 합성의 관점에서 현재의 기준을 구성한다.
이러한 방법은 핵산 단편의 최종 뉴클레오티드와 첨가되어야 할 뉴클레오티드 간의 커플링 반응을 채용하며, 제1 커플링 반응은 고체 지지체와 제1 뉴클레오티드 간에서 수행된다. 커플링은 핵산의 최종 뉴클레오티드의 5'-OH기와 첨가되어야 할 뉴클레오티드의 3'-OH기 간에서 수행된다. 이러한 방법으로, 핵산의 합성은 3'에서 5'(3'→5')이라고 한다. 커플링 반응 동안, 포스포라미다이트기가 반응 중에 포함된다.
첨가되어야 할 각 뉴클레오티드는 5'-OH기에서 보호되어 동일한 형태의 여러 뉴클레오티드의 제어되지 않는 중합을 방지하도록 하며, 커플링 단계는 단지 하나의 뉴클레오티드의 첨가라는 결과를 가지도록 한다. 일반적으로, 5'-OH기의 보호(protection)는 트리틸(trityl) 기에 의하여 수행된다. 강력한 시약의 사용으로 인한 가능한 분해를 피하도록 하기 위하여, 뉴클레오티드에 의해 수반되는 염기가 또한 보호될 수 있다. 일반적으로, 사용되는 보호는 이소부티릴(isobutyryl) 기를 포함한다 (Reddy et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 1589). 신규한 뉴클레오티드의 각 혼입 이후, 쇄의 최종 뉴클레오티드의 5'-OH기는 탈보호 반응을 진행하게 되어 다음의 중합 단계에 대하여 사용가능하도록 한다. 그들로서 핵산을 구성하는 뉴클레오티드에 의해 수반되는 염기는 단지 중합이 완료된 이후 탈보호된다.
뉴클레오티드의 첨가의 각 단계 사이에서, 특정한 중화의 단계가 수행된다. 이는 커플링 단계에서 뉴클레오티드가 혼입되지 않은 단편의 탈보호된 5'-OH기의 영구적 변성을 구성하고 그의 시퀀스는 실제로 부정확하다. 이러한 단계는 일반적으로 아세틸화 반응을 포함한다.
마지막으로, 핵산 분자의 뉴클레오티드 간에 천연적으로 존재하는 포스포디에스터 결합을 재생하기 위하여 산화의 마지막 단계 (예를 들어 요오드로의 처리에 의한)가 요구된다.
상기 정리된 것과 같은 핵산의 유기 합성을 위한 방법은 환경 및 건강에 영향을 줄 수 있는, 대량의, 불안정하고, 위험하고, 고가인 시약을 필요로 한다. 수행되는 여러 단계들 또한 비용이 많이 들고 때때로 제어하기 어렵다. 마지막으로, 이러한 합성을 수행하는 것을 가능하게 하는 장치는 실제로 복잡하고, 큰 투자 비용을 요구하고 자격을 갖추고 전담하는 노동자에 의해 운전되어야 한다.
이러한 유기 합성 기술의 주요한 단점들 중의 하나는 이들의 낮은 수율에 있다. 각 사이클 동안, 커플링 반응은 단지 각 케이스의 98 내지 99.5%로 일어나고, 반응 매질 중에 정확한 시퀀스를 갖지 않는 핵산을 남긴다. 합성이 진행됨에 따라, 그에 따라 반응 매질은 완전히 부정확한 시퀀스를 포함하는 단편들로 크게 풍부화된다. 그에 따라 일어나는 결실 형태의 오류는 특히 대상의 핵산 단편의 리딩 프레임의 오프셋의 결과를 가져오는 극적인 영향을 갖는다.
따라서, 케이스의 99%의 커플링 반응의 정확도를 위하여는, 70개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산이 50% 이하의 수율로 합성될 것이다. 이는 70회의 첨가 사이클 이후에는, 반응 매질이 정확한 시퀀스를 갖는 단편에 비하여 더 많은 오류가 있는 시퀀스를 갖는 단편을 포함할 것이다. 계속해서 이러한 혼합물은 후속의 사용에 대하여는 적절하지 않은 것으로 입증된다.
일반적으로, 각 첨가가 성공률 ρ을 갖는, 뉴클레오티드의 i 회 정확한 첨가 사이클 이후 혼합물 중에 존재하는 정확한 단편의 비율 Z는 Z　=　ρ i 로 씌여질 수 있다.
커플링의 유효성에 대한 제한에 의해 유발된 문제점들에 더하여 합성 과정에 포함된 모든 다른 반응들에 대하여도 동일한 문제점들이 있다. 이는 이들 반응들이 항상 완전하지 않고 또한 오류가 있는 시퀀스 또는 그에 따른 분자 구조를 포함하는 핵산 단편의 생성을 촉진한다. 이러한 단편은 합성 사이클의 순서가 진행함에 따라 불순물의 할당은 확대할 것이다.
따라서, 핵산의 유기 합성을 위한 방법은 이들이 부정확한 시퀀스를 갖고, 따라서 불순물로 여겨지는 단편을 대량으로 생성하기 때문에 긴(long) 단편의 합성을 위해서는 비효율적인 것으로 입증된다. 실제로, 이러한 방법으로 유효하게 생성될 수 있는 단편의 최대 길이는 50 내지 100개의 뉴클레오티드이다.
커플링 단계를 수행하기 위한 효소 촉매, 특히 기질 가닥(matrix strand)의 부재 중에서 뉴클레오티드 간의 커플링 반응을 수행할 수 있는 효소를 사용하는 대안의 기술이 존재한다. 여러 폴리머라아제 형태의 효소가 이러한 형태의 합성 방법에 적절한 것으로 나타난다. 2개의 뉴클레오티드 간에 포스포디에스터 결합을 생성할 수 있는 폴리머라아제(polymerase) 또는 리가아제(ligase)의 카테고리 중의 효소, 특히 텔로머라아제(telomerase) 족, 폴리머라아제 η(에타) 또는 ζ(제타) 형태의 트랜스병소(translesion) 효소 족, 폴리뉴클레오티드 포스포릴라아제(PNPase: Polynucleotide phosphorylase) 족, 주형-비의존성 RNA(template-independent RNA) 폴리머라아제 족, 말단 트랜스퍼라아제(transferase) 족 또는 리가아제 족의 효소가 효소 촉매로서 작용할 수 있는 효소 중에 포함된다. 이러한 정황에서 RNA 리가아제 효소 및 또한 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 (TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase)가 사용될 수 있다.
이러한 "효소" 합성법은 유기 합성법 동안에 사용되는 불안정하고, 위험하고 고가인 용매 및 시약을 생략하는 것을 가능하게 한다. 효소적 합성법은 5'에서 3' (5'→3') 방향에서 핵산의 중합을 수행한다. 따라서, 커플링은 최종 뉴클레오티드의 3'-OH기와 첨가되어야 할 뉴클레오티드의 5'-OH기 간에서 수행된다.
일부 효소법에 있어서, 중합을 가능하게 하는 효소가 직접적으로 천연 뉴클레오티드에 첨가된다 (Deng et al., 1983, Meth . Enzymol ., 100, 96). 프라이머로 알려진 초기 핵산 단편으로부터 출발하여, 중합 효소 및 또한 하나의 그리고 동일한 형태의 뉴클레오티드가 첨가된다. 계속해서 중합 반응이 개시되고 물리적 또는 화학적 방법에 의해 중단된다. 핵산은 이러한 포스포디에스터 결합 생성의 단계의 반복에 의해 순차적으로 성장한다.
천연 뉴클레오티드의 사용은 제어되지 않는 중합의 현상이라는 결과를 가져와 핵산 분자의 매우 불균질한 혼합물이라는 결과를 가져온다. 이는 어느 것도 제1 첨가 이후 하나의 그리고 동일한 형태의 여러 뉴클레오티드의 첨가를 방지하지 못하기 때문이다. 실제로, 이러한 합성법은 원하는 시퀀스를 갖는 핵산 단편의 합성을 위하여는 사용불가능한 것으로 입증된다.
보호된 뉴클레오티드의 사용은 원하는 포스포디에스터 결합에 비하여 부가의 포스포디에스터 결합의 생성을 완전히 또는 부분적으로 방지하고 그에 따라 합성의 중단을 유발하는 것에 의하여 이러한 제어되지 않는 중합의 현상을 특정한 정도까지 해결하는 것을 가능하게 한다.
이러한 경우에서 직면하는 문제는 보호된 뉴클레오티드의 합성의 문제이다. 염기 상 3'-OH기 상에 위치될 수 있는 보호의 설치는 일련의 복잡한 화학 반응을 포함한다. 합성의 종결에 대하여, 원하는 보호를 갖는 뉴클레오티드는 거의 순수한 형태로 존재하지 않는다. 보호되지 않은 출발 뉴클레오티드 등과 같은 일부 불순물이 합성 수율에 매우 부정적으로 영향을 준다.
직면하는 다른 문제는 뉴클레오티드의 보호의 유효성에 연관된다. 선택된 전략에 따르면, 보호의 유효성은 때로 양호한 합성 수율을 보증하는 데 불충분하다. 이 경우에서, 유효한 전략은 말단 뉴클레오티드와 존재하는 뉴클레오티드 간의 공유 결합의 생성의 완전한 방지가 될 것으로 여겨진다. 이는 일반적으로 3'-OH기의 효소의 부분 상에서의 전환의 수행이 불가능한 다른 화학 관능기로의 전환의 결과를 가져온다.
다른 난점은 일단 첨가가 수행되면 뉴클레오티드를 만족스럽게 그리고 후속 사이클을 위하여 계획된 첨가 이전에 뉴클레오티드를 탈보호하는 능력과 연관된다. 그의 최종 뉴클레오티드의 탈보호가 실패하는 각 핵산 단편은 다음 사이클 동안 후속 뉴클레오티드에 수용될 수 없다. 따라서 이러한 단편은 합성의 수율을 낮추는 결과를 갖는 오류가 있는 시퀀스를 가질 것이다.
효소적 합성법에 의해 직면하는 주요 문제는 커플링 반응의 유효성이다. 비록 유기 합성법 보다 더 크기는 하나, 효소법의 전체 커플링 유효성은 100%에 훨씬 못 미친다. 따라서, 부가의 뉴클레오티드를 첨가하는 데 실패한 단편이 반응 혼합물 중에 잔류한다.
이는 결합 반응을 수행하기 위하여는 효소가 그의 기질을, 한편으로는 핵산 단편과 및 다른 한편으로는 뉴클레오티드와 맞닥뜨리게 할 수 있어야 하기 때문이다. 효소와 핵산 단편이 거대분자이기 때문에, 이들의 조우는 때로 허용된 시간 이내에 일어나지 않을 수 있다. 효소 및 핵산 단편의 높은 농도는 이러한 현상을 완전히 제거할 수는 없으나 최소화하는 것을 가능하게 한다. 다른 한편으로, 세척 또는 과량의 시약을 제거하는 단계를 수반함이 없이 효소의 연속적인 첨가를 포함하는 방법은 시약의 과도한 희석을 촉진하여 낮은 커플링 효율의 결과를 가져온다.
종종, 합성 수율을 낮추는 데 기여하는, 오류가 있는 시퀀스를 갖는 단편의 출현은, 중화 단계의 추가를 야기한다. 이 단계는 포스포디에스터 결합을 형성하지 않는 3'-OH기를 제거하는 것으로 이루어진다. 이 단계는 화학 반응에 의하거나 효소의 작용에 의해 수행될 수 있으나, 어떠한 경우에도, 한편으로는, 100% 유효하지 않고 다른 한편으로는 연관되는 단편을 제거하지 않으며, 따라서 이는 혼합물의 불균질성에 기여한다.
일부 과정에서, 반응 후, 도입되는 효소 및 시약은 다른 효소 또는 시약의 첨가에 의하거나 특정한 물리적인 조건의 적용에 의하여 비활성화된다. 이러한 전략은 세척 단계를 회피하는 것을 가능하게 하나 앞서 기술된 바와 같이 반응 용적의 가차없는 증가를 포함하여 시약의 희석의 결과를 가져오고, 및 그에 따라 유효성 및 반응 속도의 감소를 초래한다. 게다가, 이러한 전략은 예를 들어 중합 효소 등과 같은 일부 고가의 시약의 재활용을 가능하지 않게 만든다. 마지막으로, 이러한 전략은 그 결과의 다수의 반응 폐기물을 생성하여 초기 시약의 비활성화의 결과를 가져온다. 이러한 폐기물은 또한 그 자체로서 최종 혼합물의 불균질성 및 가능한 효소 또는 시약의 억제에 의한 합성 수율에서의 저하에 기여한다.
어떠한 방법이 사용되더라도, 다수의 불순물이 합성 사이클 동안 축적된다. 불순물은 주로 예상되는 뉴클레오티드 시퀀스를 갖지 않는 단편으로 이루어진다. 크기 배제 크로마토그래피 또는 폴리머 겔 전기영동 또는 고체상에의 고정 등과 같이 오류가 있는 시퀀스의 단편을 제거하기 위한 여러 전략들이 적용가능하다. 하지만, 첫 번째로 너무 낮은 성능을 나타내어 약 10개의 뉴클레오티드 이상의 단편의 합성을 구현할 수 없고 두 번째로 초기 핵산 단편이 불용성의 고체 지지체에 고정되는 것이 추정된다. 따라서, 각 사이클에서, 고체 지지체의 보유를 수반하는 세척의 간단한 단계가 고정되는 핵산 단편을 제외한 모든 불순물의 제거를 가능하게 한다. 비록 고도로 효율적이기는 하나, 이러한 전략은 사이클 동안 뉴클레오티드의 첨가를 진행하지 않는 단편 또는 중화되는 단편의 제거를 가능하게 하지는 않는다. 따라서, 우세한 불순물이 제거되지 않고, 이는 합성 수율에서의 유의미한 저하에 기여한다.
게다가, 문헌 WO　2005/059096은 고체 지지체 상에서의 핵산의 합성 및 후속하는 오류가 있는 시퀀스의 검출 및 보정에 대한 방법을 기술하고 있다. 이러한 방법은 동정 또는 분석의 복잡한 단계를 요구한다.
지금까지, 어떠한 핵산 합성을 위한 방법도 진실로 만족스럽고, 그들의 시퀀스가 무엇이든 간에 긴(long) 단편의 합성의 문제에 대응하는 것을 가능하게 하지 못하였다. 가장 중요한 이유 중의 하나는 지금까지 제안된 모든 방법들에서 고유한 수율에서의 조직적인 손실이다. 특히, 이러한 수율에서의 손실은 원하는 핵산의 길이에 의존적이며 긴 단편의 합성을 방지할 정도의 지경에 이른다. 특히, 유전자의 전형적인 크기, 즉 500 내지 5000개의 뉴클레오티드를 갖는 핵산 단편의 직접적인 합성은 현재 방법으로는 완전히 접근불가능하다.
본 발명의 제1 목적은 높은 수율로의 핵산의 합성을 위한 방법을 제공하는 것에 의하여 선행 기술의 방법의 단점을 극복하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 긴 핵산, 즉 적어도 수백 또는 수천 개의 뉴클레오티드의 핵산의 합성을 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 일련의 단계들을 포함하는 합성 방법을 제공하여, 이들 단계들이 함께 조합되어, 합성될 핵산 단편의 크기와는 무관하게 극히 높은 합성 수율을 유지할 수 있도록 하는 방법을 제공하는 것이다.
이들 목적들은,
n이 3 내지 1012의 범위 이내인, n 개의 뉴클레오티드를 포함하는 (또는 n 개의 뉴클레오티드를 가지는 시퀀스의), 초기 단편으로 알려진, 핵산 단편의 적어도 하나의 연장 사이클을 포함하는, 본 발명에 따른 핵산, 특히 긴 핵산의 합성 방법으로, 각 사이클이 하기의 방법으로 세분되고:
a) 하기의 단계를 포함하는, 제1 상으로 알려지는, 상기 단편의 하나의 말단에 Xi 개의 뉴클레오티드 (X는 1 내지 5, 바람직하게는 1 내지 3일 수 있고, i는 사이클의 수 (number of cycle)임)를 효소적으로 첨가하여 n + Xi 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편을 수득할 수 있는 상(phase):
- n 개의 뉴클레오티드를 포함하는, 초기 핵산 단편 또는 연장 과정 내 핵산 단편의 제1 말단을 제1 지지체에 부착하는 제1 부착 단계,
- 효소적 첨가에 필요한 시약의 첨가 단계, 상기 핵산 단편의 제2 말단으로의 Xi 뉴클레오티드의 효소적 첨가 단계, 상기에서 X가 1 내지 5, 바람직하게는 1 내지 3일 수 있고, i는 사이클의 수임,
- 반응 매질(medium)로부터의 원치 않는 시약을 제거하는 임의적 단계,
- 상기 제1 지지체로부터 n + Xi개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편을 탈착하는 단계,
- 상기 n + Xi 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편을 이송하는 제1 이송 단계;
b) 하기의 연속적인 단계를 포함하고, 제2 상으로 알려지는, n + Xi 개의 뉴클레오티드를 포함하는 정확한 시퀀스를 갖는 단편을 정제하는 상(phase):
- 제1 상 동안 첨가된 Xi 개의 뉴클레오티드를 수반하는 단편의 말단에 의하여, 상기 n + Xi 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편을 제2 지지체에 부착하는 제2 부착 단계,
- 첨가되지 않은 단편 및 제2 지지체에 부착되지 않은 단편의 제거 단계,
- 상기 제2 지지체로부터의, 상기 n + Xi 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편의 탈착 단계,
- 반응 매질로부터 원치 않는 잔류 시약을 제거하는 임의적 단계;
c) 하기의 연속적인 단계를 포함하는, 제3 상으로 알려지는, n + Xi 뉴클레오티드를 포함하는 정확한 시퀀스를 갖는 단편을, PCR에 의한 것과 같은 것에 의해, 증폭, 바람직하게는, 효소적으로 증폭하는, 임의의 증폭 상(phase):
- 증폭에 필요한 시약의 첨가 단계,
- n + Xi 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편을, 증배 인자(multiplication factor) Yi에 의해 증배하는(multiplication) (임의로 공정을 가능하게 만드는 세부단계로 이루어지는) 단계, 상기에서 i는 사이클 수이고, Y는 1 내지 4　X　1010, 바람직하게는 1 내지 1　X　109일 수 있음,
- n　+　Xi 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편의 이송 단계,
상기에서, 각 사이클은, 수성 매질과 같은, 효소적 첨가 및 효소 증폭과 호환될 수 있는 반응 매질 중에서 수행되며,
합성 방법은 또한 i 회의 연장 사이클의 모두의 말단에서 증배 인자(multiplication factor) Yf에 의한 최종 증폭 단계를 포함하는, 방법,
에 의해 달성된다.
따라서 효소 촉매에 의해 첨가하는 상 각각에 후속하여 반응 매질 중에 단지 n + Xi 뉴클레오티드를 포함하는 정확한 시퀀스의 단편만이 보유되도록 하는 것을 가능하게 만드는 정제하는 상이 따르게 되고, 이러한 단편은, 각 사이클 사이에, 또는 원하는 수의 사이클 이후에, 또는 핵산 단편이 원하는 길이를 나타내는 경우 i 연장 사이클의 말단에만 수행되는 임의적 증폭 상에 적용될 유일한 단편이 된다.
따라서, 본 발명의 방법은 원하는 시퀀스를 갖는 핵산 단편을 합성하는 것을 가능하게 만든다. 이는 모델 핵산 단편의 사용을 생략하고 선택된 시퀀스의 길이 및 속성에 무관하게 매우 높은 순도의 생성물의 합성을 가능하게 만든다.
특히, n + Xi 뉴클레오티드를 포함하는 정확한 시퀀스의 단편을 정제하는 상은 첨가되지 않은 단편 및/또는 임의의 다른 원치 않는 잔류 시약을 제거하는 것을 포함한다.
증폭 상은 특히 반응 매질 중에서 부정확한 시퀀스 단편으로 알려진 다른 단편, 특히 첨가되지 않은 단편의 증배 인자에 비하여 정확한 시퀀스를 갖는 단편을 10 배 이상, 바람직하게는 100 배 이상의 증배 인자로 증배하는 정확한 시퀀스 단편으로 알려진 n+ Xi 뉴클레오티드를 포함하는 시퀀스를 갖는 단편의 선택적 증폭이다.
바람직하게는, 제1 지지체는 그에 적어도 3개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 가닥이 비공유적으로 고정되는 표면을 나타내고, 이러한 핵산 가닥의 상기 뉴클레오티드는 초기 단편의 제1 말단에 존재하는 뉴클레오티드에 상보적이어서 그들 개개의 염기들 간의 수소 결합에 의해, 단편의 상기 제1 말단을 부동화(immobilize)한다.
상기 제1 및 제2 지지체는 유리하게는, 예를 들어, 유리판(glass sheet), 폴리머 물질의 판(sheet of polymer material) 또는 비드의 형태로 제공되는 2개의 별개의 지지체이다. 바람직하게는, 이러한 지지체들 중의 하나 또는 다른 하나, 유리하게는 제2 지지체는 자기적 특성을 나타낸다.
제1 지지체 및 제2 지지체는 유리하게는 서로 다른 속성의 부착하는 표면을 나타내며, 상기 제1 및 제2 지지체는 바람직하게는 별개, 특히 그들의 공간 위치에서 별개이다. 고체 지지체들 중의 하나는 고정될 수 있고 다른 하나는, 예를 들어, 반응 매질 중에서 이동되거나 변위될 수 있다.
본 발명에 따른 합성 방법은, 제조하고자 하는 핵산 단편을 구성하는 뉴클레오티드의 중합을 가능하게 만드는 포스포디에스터 결합을 수행하기 위하여, 효소 촉매의 사용을 기초로 한다. 특히, 방법은, 효소를 합성의 과정 중의 핵산 단편의 3'-OH기와 효소적 첨가 단계 동안에 첨가될 뉴클레오티드의 5'-OH기 사이의 포스포디에스터 결합을 생성할 수 있도록 하는 효소를 채용하지만, 이에 제한되지 않는다.
바람직한 구현예에 있어서, 사용되는 효소는 기질 모델의 존재와 무관하게 뉴클레오티드의 중합을 제공할 수 있다. 따라서 이러한 효소는 매질 중에의 어떠한 임의의 상보적 가닥의 부재 중에서도 핵산을 합성할 수 있다. 더욱이, 이러한 효소는 단일 가닥 핵산 단편을 합성할 수 있다.
따라서, X 개의 뉴클레오티드의 첨가는 유리하게는 기질 가닥의 존재 없이도 변성된(modified) 뉴클레오티드를 중합할 수 있는 효소를 사용하여, 효소적 경로에 의해 수행된다.
효소는, 예를 들어, 텔로머라아제(telomerase) 족, 폴리머라아제 η 또는 ζ 형태의 트랜스병소(translesion) 효소 족, 폴리뉴클레오티드 포스포릴라아제(PNPases) 족, 주형-비의존성 RNA 폴리머라아제 족, 말단 트랜스퍼라아제 족 또는 리가아제 족, 주형-비의존성 DNA 폴리머라아제의 효소 또는 그밖에 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 (terminal deoxynucleotidyl transferase: TdT) 족의 효소로부터 선택된다. 이러한 효소는 생물의 특정한 세포에 의하여 발현되고 이러한 세포에서 추출되거나 재조합 배양물에서 정제될 수 있다.
이러한 효소는 프라이머로 알려진 초기 핵산 단편의 존재를 요구한다. 이러한 초기 단편은 합성되어야 할 핵산의 연장의 제1 사이클 동안 기질로서 작용한다. 이는 첨가될 제1 뉴클레오티드의 5'-OH기와 반응하도록 유리된 3'-OH기를 갖는다.
바람직한 구현예에 있어서, 프라이머는 본 발명의 실시를 위하여 가장 적절한 길이 및 또한 연속하는 단계의 만족스러운 진행에 가장 선호되는 시퀀스를 갖는다. 필요한 경우, 수의 제한 없이 복수의(several) 서로 다른 프라이머가 동시적으로 또는 연속적으로 사용될 수 있다. 이러한 프라이머는 천연 뉴클레오티드 또는 변성된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 채용되는 뉴클레오티드는 일반적으로 천연 또는 변성된 질소성 염기의 5' 말단에 적어도 하나의 화학기(chemical group) 및 3' 말단에 하나의 화학기를 포함하는 시클릭 당(cyclic sugar)으로 이루어진다.
반응 매질의 조건, 특히 온도, 압력, pH, 임의의 완충 된 매질 및 다른 시약은 중합 효소의 최적의 관능화를 가능하게 하는 한편, 서로 다른 시약의 분자 구조의 무결성이 제공되는 것을 보증하도록 선택된다.
단편에 첨가되는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 유리 단부(free end)는 유리하게는 하나의 그리고 동일한 단편에의 X 개의 뉴클레오티드의 다중 첨가를 방지하도록 하기 위한 보호성 화학기를 포함한다.
그의 3' 말단이 보호되는 뉴클레오티드의 첨가는 본 발명의 바람직한 구현예들 중의 하나를 구성하며, 보호기는 후속의 중합의 어떠한 가능성을 방지하고 따라서 제어되지 않는 중합의 위험을 제한하는 목적을 갖는다. 포스포디에스터 결합의 생성의 방지에 더하여, 제2 고체 지지체와의 상호작용 또는 반응 매질의 다른 시약과의 상호작용이 상기 보호기에 할당될 수 있다.
예를 들어, 제2 지지체는 단백질 등과 같은 분자로 피복되어 이러한 분자와 상기 보호성 화학기 간의 비공유 결합 및 그에 따라, 제2 부착 단계 동안, 그에 첨가되는 단편의 부동화를 가능하게 한다. 보호된 뉴클레오티드 및 그 단독만이 제2 고체 지지체와 상호작용할 수 있다. 따라서 첨가되지 않은 단편의 제거는 이들의 3' 말단과 제2 고체 지지체 간의 상호작용의 결여에 의해 수행될 수 있다.
본 방법의 제2 상은 오류가 있는 시퀀스를 갖는 단편을 검출(detection)하는 단계를 포함하지 않는다. 이러한 단편은 그와 같이 동정되지 않고 이를 단리하거나 보정하도록 하기 위하여 동정하도록 허용되는 조작가능한 정보가 없다. 본 방법은 이들 3' 말단과 제2 고체 지지체 간의 상호작용의 결여에 의하여 단순히 오류가 있는 단편을 제거한다.
상기 제2 지지체로부터 n + Xi 뉴클레오티드를 포함하는 상기 정확한 단편을 탈착하는 단계가 후속하여 pH에 대한 또는 온도에 대한 변경 등과 같은 반응 매질의 조건의 변경 또는 상기 제2 지지체가 자석 지지체인 경우 전자기 방사(electromagnetic radiation)의 작용 하에서 수행될 수 있다.
바람직하게는, 제1 부착 단계는 출발 핵산 단편 또는 연장의 과정에서의 핵산 단편의 5' 말단을 제1 지지체에 부착하는 것에 대응하고 제2 부착 단계는 n + Xi 뉴클레오티드를 포함하는 상기 단편의 3' 말단을 제2 지지체에 부착하는 것에 대응한다.
효소적 첨가는 유리하게는 5'에서 3' 방향에서 수행된다.
정제 단계 이후, 합성의 만족스러운 진행을 위하여는 탈보호(deprotection)가 요구된다. 그 목적은, 차기 중합 상 동안 반응할 수 있는 -OH 기를, 3' 말단에, 재생하여, 이어지는 i+1 사이클 동안, 보호된 말단을 포함하는 n+Xi 시퀀스의 핵산 단편의 이후의 연장을 가능하도록 하는 것이다. 상기 말단의 탈보호 단계는 특히 화학 반응, 전자기 상호작용, 효소 반응 및/또는 화학 또는 단백질 상호작용을 채용할 수 있다.
유리하게는, 제2 고체 지지체에 결합 된 단편을 부착하는 단계는, 보호된 뉴클레오티드의 탈보호의 단계에 부수되며 분리 불가능하다. 역으로, 연장의 과정에서 단편 중에 막 혼입된 뉴클레오티드를 탈보호 할 수 있는 임의의 작용은, 단편이 제2 고체 지지체와 상호작용하는 능력에 대하여 돌이킬 수 없는 해로운 영향을 가지며 따라서 그들의 탈착의 결과를 가져온다.
본 발명은 유리하게는 합성의 직교 모드 (orthogonal mode)를 채용한다. 합성의 이러한 모드에서, 특정한 시약은 특정한 단계를 진행하지 않는 것을 허용하는 특성을 갖는 반면에 다른 시약은 이를 진행할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 합성 방법은 "이중-직교(double-orthogonal)", 다시 말해서 2개의 "차원(dimensions)"에 따르는 것으로 기술될 수 있으며: 제1 차원은 연장의 과정 동안 단편의 5' 말단이 제1 고체 지지체에 결합되는 것에 연관되고, 제2 차원은 후속하여 상기 단편의 3' 말단이 제2 고체 지지체에 결합되는 것에 연관된다.
따라서, 출발 핵산 단편 프라이머는 그의 5' 말단에 제1 고체 지지체(들) 또는 이러한 상기 제1 지지체 상에 부동화된 요소와 상호작용하는 것을 허용하는 관능기(functionality)을 보유한다. 프라이머의 관능기는 합성의 과정 동안 유지된다. 상호작용은 특히 특정한 물리화학적 조건의 적용에 의하여 가역적이다. 이러한 상호작용 특성을 화학 또는 효소 반응에 의하여 비가역적으로 중화하는 것 또한 가능하다.
프라이머는 첨가되어야 할 제1 뉴클레오티드를 수령하는 것에 의하여 합성의 출발점을 구성한다. 이는 원하는 시퀀스 중에 존재하는 최종 뉴클레오티드가 첨가될 때까지 이러한 동일한 합성을 통하여 보유된다. 이러한 프라이머의 5' 말단 상에 존재하는 관능기(functionalities)는 유리하게는 합성을 통하여 기능이 잔류하도록 선택된다. 따라서, 이러한 관능기는, 연장의 과정 중에서 핵산 단편 상에, 초기에 프라이머에 부여된 것과 동일한 특성 및 특징, 특히, 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 효소적 첨가 단계 이전에, 각 연장 사이클 동안, 상기 제1 지지체에 이미 고정된 핵산 가닥을 경유하여 제1 고체 지지체에 부착되어야 할 능력을 부여한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 합성의 개시를 위하여 사용되는 프라이머의 5' 말단에 존재하는 관능기는 상기 제1 고체 지지체 상에 존재하는 분자 또는 단백질과의 비공유적 상호작용을 가능하게 만든다. 합성의 각 단계 동안, 이러한 관능기는 이들이 채용되는 시약과 반응하지 않음에 따라 보유된다. 비공유 결합은 특정한 물리화학적 조건에 따라 안정한 상호작용을 제공하기에 충분히 강하나 또한 다른 물리화학적 조건을 적용하는 경우 제거되기에 충분히 약하다. 마지막으로, 이러한 관능기의 분자 구조는 이들에 특정한 시약의 적용에 의해 파괴되거나 제거될 가능성을 부여할 수 있으며, 이 시약은 이러한 특성을 위하여 초기 프라이머를 구성하는 뉴클레오티드의 파괴 또는 제거가 소망 되는 경우에서 사용될 수 있다.
상기 고체 지지체의 표면은 이들이 프라이머 상에 존재하는 관능기와 원하는 상호작용을 허용하는 관능기를 갖는다. 후자와 마찬가지로, 이러한 고체 지지체의 관능기는 그들의 상호작용 성능의 하락 없이 합성 사이클의 상이한 단계를 겪을 수 있어야 한다.
온도, pH 및/또는 전자기장에서의 변화 등과 같은 특정한 물리화학적 조건의 적용은 합성의 과정 중의 핵산 단편과 고체 지지체 간에 존재하는 상호작용을 끝내는 것을 가능하게 만든다. 또 다른 경우, 상기 기술된 것과 별개의 물리화학적 조건의 적용은 이러한 상호작용의 강화를 가능하게 만든다. 다른 물리화학적 조건은 핵산 단편의 합성의 사이클의 적절한 순간에 적용된다.
특히, 제1 고체 지지체와 단편의 5' 말단 간의 상호작용을 강화하는 물리화학적 조건은 핵산 단편의 탈착의 단계 동안을 제외하고는 합성 단계 전체 동안에 적용된다. 이러한 탈착 단계 동안, 물리화학적 조건은 단편을 방출하도록 변경된다.
각 연장 사이클의 두 상 사이에서, 지지체로부터 느슨해진(unfastened) 핵산 단편은 펌프 또는 유체를 변위시킬 수 있는 다른 장치를 사용하여 이동 유체 스트림(stream)의 생성에 의하여 변위된다. 특히, 단편은 계속해서 핵산 단편과 상기 지지체 간의 상호작용의 무효화에 바람직한 물리화학적 조건에 기여하는 액체 흐름에 의하여 상기 지지체로부터 느슨해진다. 이후, 단편은 변위 되는 반면 지지체는 부동화된 상태로 남게 된다.
첨가되는 뉴클레오티드는 합성의 기본적인 중합 개체를 구성한다. 이들은 교대로 핵산 단편에 첨가된다. 이들 뉴클레오티드는 이들의 결합 반응성 관능기 및 이들의 보호 관능기에 더하여 상호작용 관능기를 나타낸다. 뉴클레오티드의 상호작용 관능기는 프라이머의 5' 말단의 상호작용 관능기와 유사한 기능을 갖는다.
바람직하게는, 합성의 과정 중의 핵산 단편의 5' 말단의 상호작용 관능기 및 최근 첨가된 뉴클레오티드의 관능기는 동일한 합성 사이클 동안 공동으로 사용된다.
온도, pH, 전자기 환경 또는 여과 물질의 존재 등과 같은 특정한 물리화학적 조건의 적용은 상기 언급된 서로 다른 지지체들과, 정확하거나 부정확한 시퀀스의 핵산 단편 사이의 분리를 수행하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 단편의 효소적 합성의 상이한 단계들은, 핵산 단편의 최대의 정확한 중합을 제공함으로써 이러한 합성 성능에 기여하고, 상기 언급된 상호작용 메카니즘을 통해, 이들이 연장 사이클을 구성하는 단계들 중의 하나를 실패하기 때문에 원하는 시퀀스(desired sequence)를 갖지 않는 핵산 단편의 최대 가능한 수의 제거가 가능하도록 한다.
따라서, 본 발명은 핵산 단편의 "광범위한 제거(wide removal)의" 원리를 채용한다. 이러한 "광범위한 제거(wide removal)"에는 주로 오류가 있는 시퀀스를 갖는 단편을 포함되지만 또한, 어느 정도까지는, 정확한 시퀀스를 갖는 단편이 포함된다. 이러한 광범위한 제거 개념의 목적은 이를 수행하여 정확한 시퀀스를 갖는 특정한 단편을 보류에 손상을 줌에도, 오류가 있는 시퀀스를 갖는 단편을 모두 제거하는 것이다.
일반적으로, 일부 경우에 있어서 오류가 있는 시퀀스를 갖는 단편을 포함하여 불순분을 제거하는 단계는 유체의 이동 흐름을 채용하는 세척 운전에 의해 수행된다. 세척 단계 동안, 보유되기에 적절한 요소는 특히 고체 지지체와의 상호작용, 예를 들어 여과에 움직이지 못하도록 고정되거나 보유되는 것에 의하여 보유된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 상호작용은 선택적이 되도록 그리고 그에 따라 단지 정확한 시퀀스를 수반하는 핵산에 대해서만 작용하고 반응 매질 중에 존재하는 다른 화합물, 예를 들어, 미반응된 핵산 단편, 효소 또는 완충제 용액의 성분에 대하여는 작용하지 않도록 선택된다. 예로서, 첨가되는 뉴클레오티드와 고체 지지체 간의 상호작용은 단지 보호된 뉴클레오티드가 혼입된 단편이 세척 단계 동안 보유되도록 선택된다. 이러한 동일한 상호작용은, 모든 경우에서, 단지 보호된 뉴클레오티드가 혼입된 단편이 세척 단계 동안 보유되도록 충분히 약하게 되도록 선택된다. 이러한 약한 상호작용은 보유되어야 함에도 불구하고 결국 뉴클레오티드가 혼입된 단편을 특정한 비율로 보유하지 않는 결과를 가질 수 있다. 이러한 특성은 이것이 원치 않는 핵산 단편의 완벽한 가능한 제거를 제공하는 한에 있어서는 본 발명에 따른 방법의 적용을 위하여 바람직하다.
상기 기술되는 비공유 상호작용은 특히 서로 상호작용하는 개체의 구조의 최적화 및 상호작용의 원인이 되는 물리화학적 조건의 최적화에 의하여 이들이 원하는 단편의 일부와의 유효한 상호작용 및 원치 않는 단편과의 무 상호작용을 가능하게 하도록 선택된다. 비제한적인 실시예로서, 서로 다른 친화 크로마토그래피 또는 정제 기술의 맥락에서 사용되는 비공유 상호작용이 이러한 성능을 가능하게 만든다.
본 발명의 대상이 되는 합성 과정은 또한 특히 핵산 단편의 동시적 합성에 적합하다. 원하는 시퀀스의 뉴클레오티드의 성장을 가능하게 만드는 합성 사이클은, 복수의 서로 다른 단편을 동시에 합성하기 위하여, 병렬로 수행될 수 있는 복수의 단계들로 분할될 수 있다.
따라서, 충분한 자원에 따라, 동시에 합성될 수 있는 서로 다른 핵산 단편의 수에는 제한이 없다. 유리하게는, 많은 단편의 병렬적 합성은 본 발명을 채용하는 시험자의 핵산의 합성에 대한 역량을 유의적으로 증가시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 원하는 단편의 합성과 병행하여, 원하는 것과 상보적인 단편의 전부 또는 일부의 동시적 합성을 수행하는 것이 가능하다.
다른 바람직한 구현예에 있어서, 합성은 이들 사이의 결합을 갖는 단편들에 대하여 동시적으로 수행될 수 있다. 예로서, 문제의 단편은 유전자, 염색체 영역, 염색체 또는 게놈 등과 같은 그러나 이로 제한되지 않는 대상의 더 큰 시퀀스의 일부를 구성할 수 있다. 여전히 예로서, 공통의 시퀀스를 구성하는 이러한 서로 다른 단편은 동일하거나 상보적인 시퀀스 부분을 가져 가능한 후속하는 조립을 용이하게 할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 정확한 시퀀스의 핵산 단편의 하나 이상의 증폭의 상을 포함하여 반응 매질 중에 존재하는 이러한 핵산 단편의 수를 증배(multiply)시키는 것을 가능하게 만든다. 이러한 핵산 쇄 증폭은 기질 핵산 가닥, 뉴클레오티드, 상보성 초기 프라이머 및 주형-의존성 중합 효소를 결합하는 효소 중합 방법을 사용한다. 증폭의 결과는 매우 많은 수의 초기에 존재하는 기질 가닥의 복제로 이루어진다. 증폭은 증폭 사이클을 구성하는 일련의 단계에 의해 수행된다. 증폭되는 단편의 증배 인자 Y M 은 식: YM　=　2m에 따라 수행되는 증폭 사이클 m의 수에 의존적이다.
바람직한 구현예에 있어서, 증폭에 사용되는 효소는 기질 가닥을 복제하는 것에 의하여 뉴클레오티드의 중합을 제공할 수 있는 것이다. 따라서 이러한 효소는 상보성 가닥에 의존적이다. 이러한 효소는 이중 가닥 핵산 단편을 합성할 수 있는 능력을 갖는다.
증폭 상을 위하여 사용될 수 있는 본 발명에 대하여 비제한적인 효소의 예는 DNA-의존성 DNA 폴리머라아제이다. 이러한 효소는 상업적으로 이용가능하고 종종 재조합 배양물로부터 정제된다.
증폭에 채용되는 뉴클레오티드는 일반적으로 트리포스페이트 형태의 5' 말단에 적어도 하나의 화학기(chemical group) 및 하이드록실 형태의 3' 말단에 하나의 화학기 및 천연 질소성 염기를 포함하는 천연 뉴클레오티드이다. 바람직한 구현예에 있어서, 증폭에 채용되는 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드이다.
온도, 압력, pH, 완충제, 보조인자 및/또는 다른 시약 등과 같은 반응 조건 와, 단계 및 이들의 시퀀스도 고려 중인 단편의 최적의 증폭을 제공하도록 선택된다.
증폭은 증폭되어야 할 핵산 단편에 상보적인 프라이머의 존재를 요구한다. 상보적인 프라이머는 증폭되어야 할 단편의 뉴클레오티드 시퀀스에 상보적인 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 짧은 핵산 단편이다. 이러한 이유로 이들은 증폭되어야 할 단편을 구성하는 뉴클레오티드와 상호작용할 수 있는 유사한 뉴클레오티드로 이루어진다. 이러한 상보적인 프라이머는 유리하게는 본 발명의 방법에 따라 합성되는 핵산 단편에 병렬로 합성될 수 있다. 따라서, 이러한 원리에 따라, 본 발명의 대상과는 다른 임의의 방법에 의존함이 없이 고려 중인 임의의 시퀀스를 증폭하는 것이 가능하다.
상보적인 프라이머는 증폭 효소가 반응할 수 있도록 하기 위하여 증폭되어야 할 단편의 말단들 중의 하나와 비공유적으로 상호작용하여야 한다. 이러한 비공유적 상호작용은 증폭되어야 할 단편에, 그리고 프라이머의 상보적 시퀀스에 의존적이고 특이적이다. 따라서, 이러한 상호작용의 특이성은 그들의 3' 말단에 정확한 시퀀스를 갖지 않는 가능한 단편의 증폭을 매우 크게 제한한다. 이러한 방법으로, 증폭 단계는 또한 합성 과정의 최종 결과의 순도에 기여한다.
합성된 핵산
본 발명은 또한 상기 기술된 방법에 의하여 합성된 핵산과 연관된다. 이러한 핵산의 뉴클레오티드 시퀀스가 사전결정되어 연장 사이클의 수행 동안 상기 뉴클레오티드의 중합의 차수를 부과할 수 있다. 하지만, 본 발명의 방법을 무작위 시퀀스를 갖는 핵산을 합성하는 데에 사용하는 것도 예상될 수 있다.
본 발명에 따른 합성 방법은, 핵산의 최소 크기가 합성 동안 사용된 초기 프라이머의 최소 크기로 결정됨에도, 모든 크기의 핵산의 합성을 가능하게 만든다. 충분한 양으로 획득 가능한 자원에 따라서 그리고 공간 및 바람직한 조건에 따라, 본 발명의 대상인 방법에 의해 합성될 수 있는 핵산의 최대 크기가 존재하지 않는다. 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 3 내지 1 X 109개의 염기, 바람직하게는 20 내지 1 X 107개의 염기의 길이를 갖는 핵산 단편을 합성하는 것이 가능하다.
따라서, 합성된 핵산은 다중의 생물학적 또는 생명공학적 역할을 갖는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있다. 유리하게는, 본 발명은 분자 생물학 및 유전공학의 분야의 특정한 수의 조작을 대체하며, 이러한 지루하고 반복적인 조작은 대개 당해 기술분야의 숙련된 자에 의하여 수작업으로 수행된다.
본 발명의 방법의 사용은 핵산의 조작을 채용하는 임의의 방법의 성능에서 그리고 생산성에서의 유의적인 증가를 가능하게 만든다. 비 제한적인 예로서, 본 발명의 사용은 하기의 분야: 유전적 구조물(genetic constructs)의 제조, 간섭 RNA 분자의 생산, DNA 또는 RNA 칩 생산, 세포주 또는 세포계의 구축, 효소공학, 단백질 모델의 개발, 생물요법의 개발, 동물 또는 식물 모델의 개발에서 특히 유리하다.
상기 기술된 방법을 사용하여 수득되는 핵산은 당업자에게 공지된 분자 생물학의 조작 동안에 직접적으로 사용될 수 있다. 그에 따라 수득된 핵산은 추가의 처리 단계를 요구함이 없이 직접적인 사용에 극히 적절한 정도의 순도를 나타낸다. 대안적 형태에 있어서, 본 발명에 따른 합성 방법에 의해 합성되는 핵산은 추가의 목적하는 변성, 예를 들어, 핵산 단편을 고리화하는 것, 핵산 단편을 발현 벡터에 삽입하는 것, 핵산 단편을 살아있는 세포의 유전자 내로 삽입하는 것, 핵산 단편을 다른 화학적 개체와 반응시키는 것 또는 반응의 촉매를 위하여 핵산 단편을 사용하는 것을 진행할 수 있다.
자동화(automation)
본 발명의 대상인 방법의 자동화가 이러한 방법을 최적화할 수 있는 임의의 사전적응된 장치에 의해, 특히 연장 사이클의 기간을 최소화하는 것에 의해, 첨가, 세척 운전 및 유체의 흐름의 정확성을 극대화하는 것에 의해, 그리고 이러한 사이클의 서로 다른 단계들 동안 채용된 반응 조건을 최적화하는 것에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 그들의 크기에 무관하게 합성된 핵산의 높은 순도의 결과로서 별도의 정제 또는 수집 단계를 수반함이 없이 직접적으로 사용될 수 있는 핵산의 합성을 가능하게 만든다. 이러한 반응을 위한 본 발명의 주제인 방법의 자동화는 매우 큰 산업 및 상용적 이익을 갖는다.
키트
본 발명은 또한
- n 개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 단편을 포함하는 반응 매질
- 뉴클레오티드의 첨가를 위한 효소 시약
- 상기 효소적 첨가 시약에 의해 첨가될 수 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 조합
- 정제 상을 위한 세척 및/또는 완충제 용액
- 핵산의 증폭을 위한 효소 시약 및 효소 증폭 시약에 의해 사용될 수 있는 천연 뉴클레오티드를 포함하는 증폭 반응 매질
- 사용을 위한 인스트럭션
을 포함하는, 상기 기술된 방법의 수행을 위한 임의의 키트와 연관된다.
다른 형태의 키트가 실험자의 요구에 따라 제공될 수 있다. 특히, 합성되어야 할 시퀀스에 따라 다른 키트 내에 다른 개시 프라이머가 제공될 수 있다. 유사하게, 자동 또는 비자동의 용도의 기능에 따라 다른 형태의 키트들이 제공될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법의 바람직한 구현예의 수행을 위한 키트는
- 합성 프라이머로 사용되는 핵산 단편
- 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 단편을 부착하기 위한 제1 지지체
- 첨가되는 핵산 단편을 부착하기 위한 제2 지지체
- 뉴클레오티드의 첨가를 위한 효소 시약 및 효소적 첨가 시약에 의해 첨가될 수 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 조합을 포함하는 첨가 반응 매질
- 부착, 정제 및 탈착 단계를 위한 세척 및/또는 완충제 용액
- 핵산의 증폭을 위한 효소 시약 및 효소 증폭 시약에 의해 사용될 수 있는 천연 뉴클레오티드를 포함하는 증폭 반응 매질
- 사용을 위한 인스트럭션
을 포함한다.
게다가, 상기 키트는
- 제1 및/또는 제2 부착 지지체에의 핵산의 부착에 선호되는 완충제 매질 및/또는
- 제1 및/또는 제2 부착 지지체로부터 핵산을 탈착하는 데 선호되는 완충제 매질
을 포함할 수 있다.
합성 방법의 특정한 단계 동안 핵산 단편을 부동화하기 위한 부착 지지체의 사용을 수반하는 본 발명의 바람직한 형태의 예시적인 구현예의 설명이 도면을 참조하여 이하에서 기술되며, 여기에서 도 1 내지 도 7은 방법의 서로 다른 단계:
도 1은 출발 단편의 부동화;
도 2는 부동화된 단편에의 뉴클레오티드의 첨가;
도 3은 첨가된 핵산 단편의 세척 및 탈착;
도 4는 제2 지지체에의 첨가된 핵산 단편의 고정;
도 5는 첨가된 핵산 단편의 탈보호;
도 6은 증폭 단계;
도 7은 선행하는 사이클로부터 첨가된 단편을 사용하는 신규한 사이클의 개시;
를 모식적으로 나타내고
도 8은 효소적 첨가의 상 및 정확한 시퀀스의 단편의 정제의 상을 수행하기 위한 "반응기(reactor)"의 가능한 배치의 모식도를 나타낸다.
실시예
도면을 참조하여, 본 발명에 따른 합성 방법에서의 핵산 단편의 연장의 사이클이 이하에서 기술된다.
적어도 3개의 뉴클레오티드를 포함하는 가닥(4)이 유리판 등과 같은 제1 고체 지지체(1)에 고정된다. Xi + n개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산의 연장(3)의 과정 중의 프라이머 또는 단편이 그들 개개 염기들 사이의 수소 결합을 통하여 지지체(1)에 고정된 가닥(4)에 결합된다. 연장(3)의 과정 중의 핵산 단편은 고정된 가닥(4)에 상보적인 적어도 3개의 뉴클레오티드를 포함하며 개시제로 표시되는 유리부(free part)(33) 및 부동화가능부(immobilizable part)(34)를 포함한다. 계속해서, 도 1의 우측편 상에 모식적으로 나타낸 바와 같이, 제1 고체 지지체(1) 상에 부동화 된 핵산 단편(30)이 반응 매질 중에서 수득된다.
첨가 효소(5) 및 그의 일측 단부가 보호기(8)로 차단된 적어도 하나의 뉴클레오티드(7)를 포함하는 시약(6)을 포함하는 반응 매질의 첨가에 의한 효소적 첨가의 단계가 후속하여 수행된다.
이는, 도 2의 우측부 상에 모식적으로 나타낸 바와 같이, 제1 고체 지지체 상에 부동화된 단편(30)의 유리 단부(33)에의 시약(6)의 첨가에서 보호된 단부를 포함하는 첨가된 (즉, 적어도 하나의 뉴클레오티드가 수령된) 핵산 단편을 제공하는 결과를 가져오며, 이는 지지체(1) 상에 부동화된다. 이러한 보호되고 부동화된 핵산 단편은 참조번호 36으로 참조된다.
반응 매질 중에는, 지지체 상 또는 상기 지지체(1)에 근접하여 효소, 시약(6) 및 가능한 완충제 용액의 잔사가 잔류하고, 계속해서 이들은 화할표(3A)를 따르는 세척에 의하여 제거된다. 이러한 제1 세척 작업(3A) 이후, 단편(36)이 화살표(3B)를 따라 지지체(1)로부터 탈착되고, 이 단편(36)은, 도 3에서 38로 표시되는 첨가된 유리 보호 단편을 제공한다.
그러나, 이러한 탈착 단계는, 지지체(1)로부터, 첨가된 단편(38) 및 첨가되지 않은 초기 단편(3) 둘 다를 풀리게 한다. 계속해서 항체, 디하이드로폴레이트 리덕타아제(DHFR: dihydrofolate reductase), 아비딘, 스트렙타비딘, 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(GST: glutathione S-transferase), 포스포펩티드(세린, 티로신 또는 올리고머) 또는 히스티딘 올리고머 등과 같은 단백질로 형성된 코팅(9)으로 피복된 제2 지지체(2), 이 경우에서는 자기 비드(magnetic bead),가 도 4에서 모식적으로 나타낸 바와 같이 정확한 시퀀스의 핵산 단편 및 부정확한 시퀀스의 단편을 포함하는 반응 매질 중에 개입된다.
이는 말단 보호기(8)에 의하여 정확한 시퀀스의 보호된 단편(38)의 비드(2)의 표면에의 부착인 고정의 결과를 가져온다. 계속해서 효소적 첨가를 진행하지 않고 따라서 비드(2)의 코팅(9)의 단백질에 결합될 수 있는 보호기를 수반하는 말단을 포함하지 않는 초기 단편(3)이 용이하게 세척에 의하여 제거된다.
이러한 정확한 시퀀스의 첨가된 단편의 효과적인 선택 후에, 자기 비드 (2) 가 반응 혼합물의 조건을 변경하는 것에 의하여 분리된다. 예를 들어, pH의 변화, 온도의 증가 또는 시약 또는 전자기장의 작용에 의해 비드 (2) 로 부터 첨가된 단편이 탈착될 수 있어 반응 매질 중에 첨가된 유리 미보호 단편(37)이 수득된다 (도 5 참조).
그 후, 코팅(9)에 결합되어 남아있는 보호기로 피복된 비드(2)가, 예를 들어, 자기장의 작용 하에서 반응 매질로부터 제거된다.
이어서, 도 6은 증폭 효소 및 또한 뉴클레오티드, 예를 들어, 천연 뉴클레오티드를 포함하는 증폭 반응 매질(11)의 작용 하에서 지금까지 앞서 기술된 연장 사이클을 진행한 첨가된 미보호 단편(37)의 증폭 단계를 모식적으로 나타낸다. 계속해서 핵산 단편(37)의 수가 증폭된다.
이러한 증폭 단계는 이것이 단지 연장 사이클이 진행되는 단편(37)만을 증폭하기 때문에 전적으로 효율적이다. 게다가, 이는 증폭 시약의 사용을 최소화한다. 계속해서 합성을 종결하거나 신규한 연장 사이클 i + 1을 수행하기 전에 후속의 정제 단계가 필요치 않다.
이어서, 도 7에 모식적으로 나타낸 바와 같이, 단편(37)을 부동화하는 데 사용된 가닥(4)이 그에 고정된 동일한 제1 고체 지지체(1)를 통하여 신규한 연장 사이클이 발생할 수 있다.
도 8은 바람직하게는 2개의 별개의 격실을 포함하는 연장 챔버의 하나의 실시예의 모식도를 나타내며, 여기에서 격실이 본 발명에 따른 각 연장 사이클을 수행한다.
그 안에서 효소적 첨가의 상이 수행되는 제1 반응기(10)는 그에 가닥(4)이 고정되는 제1 고체 지지체(1)를 포함하고 첨가 뉴클레오티드(7)를 공급하기 위한 장치(70) 및 추가 효소(5)를 공급하기 위한 장치(50)에 연결된다.
그 안에서 정확한 합성의 단편의 정제의 상이 수행되는 제2 반응기(12)에는 이 경우에서는 전자기 장치(전자석(21))가 장착되고 비드 타입의 지지체의 공급(20)에 연결된다.
2개의 반응기(10 및 12)는 단편의 보다 나은 정제가 가능하도록 하기 위해 분리되어 있지만, 그럼에도 불구하고, 상기 반응기들은 서로 연결되고, 세척 용액(들)을 위한 입구(13, 14)에 그리고 또한 폐기물이 방출되도록 하기 위한 출구(15, 16)에 연결된다.
증폭 단계(들)가 또한 반응기(12) 내에서 수행된다. 그에 따라 합성된 핵산이 최종 증폭 단계 이후 제2 반응기의 출구(17)에서 회수된다.
DNA 단편의 합성을 나타내는 실시예가 이하에서 기술된다.
효소적 합성 단계를 수행하기 위하여 선택된 효소는 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 또는 TdT이며, 이는 상업적으로 획득 가능하다 (Thermo Scientific). 재조합으로 대량의 TdT를 생산하는 것이 또한 가능하다.
합성을 개시하는 데 사용되는 프라이머가 이하와 같이 주어진다:
Figure 112016112274457-pct00001
이러한 프라이머는 상기 시퀀스 중에 표시되는 화살표에 제한효소 Pst1에 의한 시퀀스의 개열(cleavage)을 포함하는 제한 부위를 갖는다. 합성되어야 할 시퀀스가 또한 Pst1 부위를 포함하는 경우, 초기 프라이머는 필요에 따라 변형(modified)될 수 있다.
사용되는 뉴클레오티드는 5' 말단에 그들의 반응성을 촉진하는 3인산기(triphosphate group)를 갖는다. 이들은 DNA 분자 중에 천연에 존재하는 4가지 질소성 염기, 즉 A 아데닌, T 티민, C 시토신 또는 G 구아닌을 가지고, 그들의 3' 말단에 천연에 존재하고 TdT에 의한 뉴클레오티드의 후속의 첨가를 차단하는 능력 및 다른 분자 또는 단백질과 상호작용할 수 있는 능력을 갖는 하이드록실기와는 다른 기를 갖는다.
사용되는 합성 조건은 효소 TdT와 연관되는 프로토콜의 설명으로부터 유래된다: 50　U의 TdT, 200　mM 카코딜산 나트륨, 25　mM 트리스-염산 pH　7.2, 8　mM MgCl2, 0.33　mM ZnSO4, 0.2　mM dATP, 2　pmol의 프라이머 (시퀀스 번호　1) 및 100　μM의 보호된 뉴클레오티드가 총 50 μL의 반응 용적으로 혼합된다. 혼합물은 37℃에서 5 분 동안 배양된다.
선택된 보호기의 속성에 따라, 첨가된 뉴클레오티드가 10　mM MgCl2의 존재 중에서 37℃에서 15 분 동안 50 mM 아세트산 나트륨 등과 같은 온건한 산이 작용에 의하여 탈보호된다. 탈보호 반응은 뉴클레오티드와 보호기 간에 존재하는 결합 및 또한 선택적으로 보호기와 연관된 임의의 다른 기를 파괴하는 결과를 갖는다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에 따르면, 이러한 탈보호 단계는 동시적으로 그의 3' 말단에서의 상호작용으로부터 단편을 방출할 수 있다.
합성의 과정에서의 DNA 단편은 사전에 그에 하기의 시퀀스:
Figure 112016112274457-pct00002
를 갖는 DNA 단편이 고정된 유리판을 포함하는 반응실 내에서 20℃에서 10 분 동안 배양된다.
DNA 칩을 생산하기 위한 기술을 채용하여 시퀀스 (시퀀스 번호 2)를 갖는 DNA 단편의 3' 말단에 의하여 고정시켰다. 따라서 DNA 단편은 이러한 방법으로 부동화된다.
초당 5 μL의 흐름 속도로 30 초 동안 25　mM 트리스-염산 pH 7.2 용액으로 세척 단계가 수행된다.
95 ℃에서 초당 5 μL의 흐름 속도로 60 초 동안 25　mM 트리스-염산 pH 7.2 용액을 통과시키는 것에 의하여 DNA 단편을 방출하는 단계가 수행된다.
그 안에 단편이 용해된 25　mM 트리스-염산 pH 7.2의 흐름을 제2 반응기(12) 내로 운송하는 것을 가능하게 만드는 밸브 시스템의 도움으로 유리 DNA 단편의 이동이 수행된다.
계속해서 보호된 뉴클레오티드를 사용하는 효소 연장의 단계를 진행한 DNA 단편이 그들의 표면에 첨가된 최종 뉴클레오티드와 상호작용하는 것을 가능하게 만드는 분자 또는 단백질을 나타내는 자석 비드(2)의 존재 중에서 주변 온도에서 15 분 동안 배양된다. GST 단백질로 피복된 자석 비드는 사용될 수 있는 비드의 형태의 비제한적인 실시예이다.
영구 자석을 사용하여, DNA 단편을 수반하는 자석 비드(2)에 고정 상태를 부여하는 한편으로 초당 10 μL의 흐름 속도에서 25　mM 트리스-염산 pH　7.2 흐름을 적용시켜 30 초 동안 세척시킨다.
DNA 단편의 증폭의 단계는 하기의 프로토콜에 따라 Platinum® Taq DNA 폴리머라아제 효소 (Invitrogen)에 의해 수행된다: 50 μL의 총 용적 당 공급된 1배량(1x) 완충제 10배량(10X), 각 뉴클레오티드 당 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.2　μM 상보적인 프라이머, 1.0　U 폴리머라아제.
사용되는 증폭 사이클은 하기의 표에 의해 주어진다: 94℃에서 60 초 동안 배양, 하기의 단계로의 30회의 증폭 사이클의 적용: 94℃에서 30 초 동안 변성, 계속해서 55℃에서 30 초 동안 페어링(pairing), 계속해서 증폭되어야 할 수천의 뉴클레오티드 당 72℃에서 60 초 동안 연장; 72℃에서 5 분 동안 최종의 단계가 첨가된다.
DNA 단편의 합성의 진행의 상태의 함수로서 프라이머가 선택된다. 이는 대략 20개의 뉴클레오티드의 시퀀스이다. 선택된 상보적인 프라이머와 정확하게 페어링할 수 있는 단편의 매우 특이한 증폭을 촉진하도록 상기 기술된 증폭 조건이 조정된다. 게다가 이러한 상보적인 프라이머의 크기는 또한 시퀀스의 함수로 선택되어 가능한 가장 특이한 증폭을 촉진하도록 한다.
본 발명에 의하여 기술된 원리에 따라, 서로 다른 단계의 성능이 측정되고 하기 표 1에 제공된다:
[표 1]
Figure 112016112274457-pct00003
예를 들어, 광범위한 제거 단계는 90%의 정확한 시퀀스를 갖는 단편 ("양호"로 간주)및 단지 2%의 부정확한 시퀀스를 갖는 단편 ("불량"으로 간주)을 수득하는 것을 가능하게 만든다. 주의깊게 결합된 이러한 서로 다른 단계를 채용하는 사이클의 반복이 긴 단편(long fragment)의 합성을 가능하게 만들고, 그의 최종 순도가 하기 표 2에 주어진다 (2 pmol(피코몰)의 초기 프라이머의 양):
[표 2]
Figure 112016112274457-pct00004
따라서, 별도로 취해진 각 단계에서 고유한 불완전성에도 불구하고 그리고 합성의 여러 단계에서 실패하는 단편의 존재에도 불구하고, 최종 결과는 99% 이상의 순도를 나타내고 따라서 실험자에 의하여 직접적으로 사용될 수 있으며, 이는 고려 중인 단편의 길이와는 무관한 케이스이다. 이 표에 의해 주어진 결과는 실시예로서 제공되고 매개변수로 간주된 각 단계에서 생성된 양호한 그리고 불량한 단편의 함량의 매개변수 (표 1에 나타낸)가 다른 경우, 실질적으로 다를 수 있다.
본 발명의 주제인 방법은 수율에서의 손실 없이 그들의 길이에 무관하게 핵산의 합성을 가능하게 만든다. 현존하는 기술, 특히 수행의 단순성, 합성 비용, 합성 시간, 수득되는 생성물의 순도 및 합성 용량의 관점에서 핵산의 합성의 성능에서의 실질적인 개선을 가능하게 만든다. 이러한 방법은 유전자 또는 핵산의 합성 시퀀스의 생산에 사용될 수 있다. 이는 특히 생명공학 분야 또는 보다 일반적으로는 생물학의 광범위한 분야에서 연구, 개발 또는 산업적 수행의 목적으로 DNA 또는 RNA 등과 같은 핵산의 합성을 위한 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> DNA SCRIPT <120> Procede de synthese d'acides nucleiques, notamment d'acides nucleiques de grande longueur, utilisation du procede et kit pour la mise en oeuvre du procede <130> IP20163045/FR <150> FR1453455 <151> 2014-04-17 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amorce <400> 1 gggggggggg ggggctgcag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment d'ADN <400> 2 cccccccccc ccccgacgtc 20

Claims (19)

  1. n이 3 내지 1012의 범위 내인, n 개의 뉴클레오티드를 포함하는, 초기 단편으로 알려진, 핵산 단편의 적어도 하나의 연장(elongation) 사이클을 포함하는, 핵산의 합성 방법으로,
    각 사이클이 하기의 방법으로 세분되고:
    a) 하기의 단계를 포함하는, 제1 상으로 알려지는, 상기 단편의 하나의 말단에 X 개의 뉴클레오티드(상기 X는 1 내지 5)를 효소적으로 첨가하여 n + X 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편을 수득할 수 있는, 효소적 첨가 상(phase of enzymatic addition):
    - n 개의 뉴클레오티드를 포함하는, 초기 핵산 단편 또는 연장 과정 내 핵산 단편의 제1 말단을 제1 지지체에 부착하는 제1 부착 단계로, 상기 제1 지지체가 상기 단편의 5'말단과 가역적 상호작용을 허용하는 부착 표면을 가지는, 제1 부착 단계,
    - 효소적 첨가에 필요한 시약의 첨가 단계로, 상기 초기 핵산 단편의 제2 말단으로의 X개의 뉴클레오티드의 효소적 첨가 단계로, 단편에 첨가되는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 유리 단부(free end)가, 하나의 그리고 동일한 단편에의 X 개의 뉴클레오티드의 다중 첨가를 방지하도록 하기 위한 보호성 화학기를 포함하는, 첨가 단계,
    - 반응 매질(medium)로부터의 원치 않는 시약을 제거하는 임의적 단계,
    - 상기 제1 지지체로부터 n + X 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편을 탈착하는 단계, 및
    - 상기 n + X 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편을 이동 유체 스트림(stream)의 생성에 의하여, 비공유 상호작용에 의해 n + X개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편의 3' 말단의 보호기와 상호작용할 수 있는 제2 지지체로 이송하는 제1 이송 단계;
    b) 하기의 연속적인 단계를 포함하고, 제2 상으로 알려지는, n + X 개의 뉴클레오티드를 포함하는 정확한 시퀀스를 갖는 단편의 정제 상(phase of purification):
    - 3' 말단에 의하여 상기 n + X 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편을 제2 지지체에 부착하는 제2 부착 단계,
    - 첨가되지 않은 단편 및 제2 지지체에 부착되지 않은 단편의 제거 단계,
    - 상기 제2 지지체로부터의, 상기 n + X 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편의 탈착 단계,
    - 반응 매질로부터 원치 않는 잔류 시약을 제거하는 임의적 단계;
    c) 하기의 연속적인 단계를 포함하는, 제3 상으로 알려지는, n + X개의 뉴클레오티드를 포함하는 정확한 시퀀스를 갖는 단편을 증폭하는, 임의적 증폭 상(phase of amplification):
    - 증폭에 필요한 시약의 첨가 단계,
    - n + X 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편을, 증배 인자(multiplication factor) Y에 의해 증배하는(multiplication) 단계로서, 상기 Y는 1 내지 4　X　1010의 범위 내인, 단계,
    - n　+　X개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편의 이송 단계;
    이 때, 상기 각 사이클은, 수성 매질과 같은, 효소적 첨가 및 효소 증폭과 호환될 수 있는 반응 매질 중에서 수행되며,
    합성 방법은 또한 연장 사이클의 모두의 말단에서 증배 인자(multiplication factor) Y에 의한 최종 증폭 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    n + X 개의 뉴클레오티드를 포함하는 정확한 시퀀스의 단편의 정제 상이, 임의의 원치 않는 잔류 시약의 제거를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    증폭 상이, 반응 매질 중에서, 부정확한 시퀀스 단편으로 알려진 다른 단편의 증배 인자에 비하여, 정확한 시퀀스를 갖는 단편을 10 배 이상 더 큰 증배 인자로 증배하는, 정확한 시퀀스 단편으로 알려진 n + X개의 뉴클레오티드를 포함하는 시퀀스를 갖는 단편의 선택적 증폭임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 지지체 및 제2 지지체가 서로 다른 속성의 부착 표면을 나타냄(exhibit)을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 지지체가, 적어도 3개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 가닥을 비공유적으로 고정하는 표면을 나타내고, 이들 핵산 가닥의 상기 뉴클레오티드는 초기 단편의 제1 말단에 존재하는 뉴클레오티드에 상보적이어서, 그들 개개의 염기들 간의 수소 결합에 의해, 단편의 상기 제1 말단을 부동화(immobilize)하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 지지체가 유리판(glass sheet), 폴리머 물질의 판(sheet of polymer material) 또는 비드의 형태임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    X 개의 뉴클레오티드의 첨가가, 기질 가닥(matrix strand)의 존재 없이 변성된(modified) 뉴클레오티드를 중합할 수 있는 효소를 사용하여, 효소적 경로에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    효소가 텔로머라아제(telomerase), 번역 효소(translation enzyme), 주형-비의존성 RNA 폴리머라아제 족의 효소 또는 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 족의 효소로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제2 지지체가 단백질과 같은 분자로 피복되어, 상기 분자와 상기 보호성 화학기 간의 비공유 결합, 및 이에 따른, 제2 부착 단계 동안의, 첨가된 단편의 부동화를 가능하게 함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제2 지지체로부터 상기 n + X 개의 뉴클레오티드를 포함하는 단편을 탈착하는 단계가, pH 또는 온도의 변경과 같은 반응 매질 조건의 변경(modification)에 의해 수행되거나 또는 상기 제2 지지체가 자석 지지체인 경우 전자기 방사(electromagnetic radiation)의 작용 하에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    효소적 첨가가 5'에서 3' 방향으로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    X가 1 내지 3임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    Y가 1 내지 1 x 1010임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    증폭 상이 효소적인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제4항에 있어서,
    제1 지지체와 제2 지지체가 별개인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제6항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 지지체 중 하나가 자기적 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서
    유전자의 생산, 핵산의 합성 시퀀스 생산, DNA의 생산 또는 RNA의 생산을 위한 방법.
  18. 하기를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 방법을 시행하기 위한 키트:
    - n 개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 단편을 포함하는 반응 매질
    - 뉴클레오티드의 첨가를 위한 효소 시약
    - 상기 효소적 첨가 시약에 의해 첨가될 수 있는, 3' 말단에 화학적 보호기를 포함하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 조합
    - 정제 상을 위한, 세척(13, 14) 또는 완충제 용액 또는 이들의 조합
    - 핵산의 증폭을 위한 효소 시약 및 효소 증폭 시약에 의해 사용될 수 있는 천연 뉴클레오티드를 포함하는 증폭 반응 매질
    - 핵산 단편의 5' 말단과 상호작용을 허용하는 부착 표면을 갖는 제1 지지체,
    - 핵산 단편의 3' 말단에서 보호기와 비공유 상호작용을 허용하는 부착 표면을 갖는 제2 지지체,
    - 사용을 위한 지시서(instruction).
  19. 제18항에 있어서,
    - 핵산 단편의 제1 부착 지지체로의 부착에 선호되는 완충제 매질, 핵산 단편의 제2 부착 지지체로의 부착에 선호되는 완충제 매질, 및
    - 제1 부착 지지체로부터 핵산 단편을 탈착하는데 선호되는 완충제 매질, 제2 부착 지지체로부터 핵산 단편을 탈착하는데 선호되는 완충제 매질
    을 추가로 포함하는 키트.
KR1020167032133A 2014-04-17 2015-04-15 핵산, 특히 긴 핵산을 합성하는 방법, 상기 방법의 용도 및 상기 방법을 수행하기 위한 키트 Active KR102471452B1 (ko)

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