CN119546760A - 纯化包含多核苷酸的溶液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及纯化包含新合成的多核苷酸的溶液的方法，特别是在多核苷酸合成(例如酶促多核苷酸合成)领域。本发明还涉及被配置为实施所述纯化方法的装置。

Description

纯化包含多核苷酸的溶液的方法

技术领域

本发明涉及纯化包含新合成的多核苷酸的溶液的方法，特别是在多核苷酸合成(例如酶促多核苷酸合成)领域。本发明还涉及配置为实施所述纯化方法的装置及其试剂盒。

引言

多核苷酸合成越来越多地用于研究领域和药物领域以提供治疗和诊断解决方案。实例包括基因组和诊断测序、多重核酸扩增、治疗性抗体开发，合成生物学或核酸扩增。

多核苷酸合成能够以化学方式或酶促方式来实现。。这两种方式通常都是通过将液体溶液从过滤板转移到另一过滤板上来进行的，这些过滤板本身从工作站转移到另一工作站，以将新合成的多核苷酸与合成期间使用的固体支持物分离，并且可能与污染物分离。

更具体地，在专用的第一过滤板中的固体支持物上进行多核苷酸合成。一旦完成合成步骤，将附着于固体支持物的新合成的多核苷酸从第一过滤板转移到第二过滤板(也称为转移板)，以从固体支持物释放多核苷酸。最后将包含所释放的多核苷酸的液体溶液转移到第三过滤板(称为脱盐板)，以从污染物中沉淀并纯化多核苷酸。因此，本领域技术人员通常使用至少三个过滤板和同样多的转移步骤。

虽然这种方法有效，但仍然成本高昂，因为使用了更大数量的过滤板和其他消耗品，这成本更高，耐用性更低，还会产生更多的废物。

此外，大量的转移步骤、清洁步骤和纯化步骤可能产生较少量的纯化的合成多核苷酸。此外，它还增加了外部污染的风险。而且，这需要在处理过程中多次破坏真空，导致延迟和可能的材料损失。

本发明的目的是克服前述缺点中的至少一个，并且通过提出用于纯化液体溶液的新方法以进一步产生其他优点，所述方法包括直接在第一过滤板中新合成多核苷酸，消除了新合成的多核苷酸从样本装载到回收的转移任何液体溶液的需要。同时，这样的方法大大降低了液体溶液中外部污染的风险，以及样本损失，并且是更加环境友好的方法。此外，该方法增加了回收的多核苷酸的量。发明人必须克服以下事实，即在板中存在许多杂质，并且他们需要确保杂质被消除，因为在转移到另一个板的过程中他们不能消除杂质。而且，必须优化和选择试剂，因为沉淀在同一板中发生，并因此需要优化缓冲液和离液剂的比例。

发明内容

本发明涉及纯化包含多核苷酸和污染物的溶液的方法，所述溶液包含在过滤板的孔中，所述孔配备有过滤器，所述方法包括：

-向包含在孔中的溶液添加离液剂的步骤，以获得混合物，

-孵育混合物的步骤，以便在孔中获得沉淀物和上清液，沉淀物包含多核苷酸并且上清液包含污染物的至少一部分，

-对孔施加差压以通过过滤器除去上清液的步骤，沉淀物被过滤器保留，

-添加低盐洗脱液的步骤，以溶解沉淀物中的多核苷酸并将溶解在低盐洗脱液中的多核苷酸转移到容器中，

其中所述方法的所述步骤在配备有过滤器的孔中进行，

其中所述方法在配备有过滤器的孔中进行，并且所述方法包括在添加离液剂的步骤之前酶促合成多核苷酸的步骤，所述酶促合成多核苷酸的步骤在实施添加离液剂的步骤的孔中进行。

在此，并且在随后的所有内容中，应该理解的是，过滤板意指包括多个孔的板，每个孔都配备有布置在孔底部的过滤器。

本发明提出的纯化包含在溶液中的多核苷酸以及污染物的方法包括至少四个步骤，其全部在过滤板的同一孔中进行。因此，不再需要将溶液从一个过滤板转移到另一个过滤板。通过消除这种转移，大大降低了多核苷酸损失的风险。

在一个或多个实施方案中，可以在孵育的第二步骤期间搅拌混合物。任选地，通过摇动过滤板完成搅拌。

在过滤板的同一孔中进行酶促合成多核苷酸的步骤、添加离液剂的步骤、孵育混合物的步骤、施加差压的步骤和添加低盐洗脱液的步骤。因此，本发明的方法允许在过滤板的同一孔中进行多核苷酸的合成、纯化和分离。这允许在合成后直接进行纯化而不进行任何转移。

在一个或多个实施方案中，酶促合成多核苷酸的步骤包括：

a)提供具有含游离3’-羟基的3’-末端核苷酸的引发剂的子步骤，

b)在延长条件下使具有游离3’-O-羟基的引发剂与3’-封闭的苷三磷酸和聚合酶接触的子步骤，使得通过掺入3’-封闭的核苷三磷酸来延长引发剂以形成3’-封闭的延长片段

c)解封延长片段的子步骤，以形成具有游离3’-羟基的延长片段，和

d)重复子步骤b)和c)直到形成多核苷酸的子步骤，

e)从引发剂切割多核苷酸的子步骤。

应当理解，每次掺入一个核苷三磷酸以延长引发剂构成一个循环。

在一个或多个实施方案中，通过酶促消化、通过光照切割和/或通过化学切割执行从引发剂切割多核苷酸的子步骤。

在一个或多个实施方案中，通过在延长条件下接触步骤c)中获得的延长片段来实施重复子步骤b)和c)的子步骤d)，直到形成多核苷酸。

酶促多核苷酸合成的实例描述于，例如Ybert等人的国际专利公开WO2015/159023中。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括在孵育混合物的步骤之前添加珠的步骤，以帮助沉淀混合物。因此，可以在添加离液剂之前或同时将珠添加到溶液中。或者可以，即在加入离液剂之后，将珠添加到混合物中。在任何情况下，向同一孔中添加离液剂和珠以得到混合物。

在一个或多个实施方案中，当该方法包括酶促合成多核苷酸的步骤时，优选地，在合成步骤之后进行添加珠的步骤。

在一个或多个实施方案中，珠是玻璃珠，优选二氧化硅玻璃珠。

在一个或多个实施方案中，珠是空心玻璃珠，优选二氧化硅空心玻璃珠。

在一个或多个实施方案中，珠的直径为9微米至13微米。

在一个或多个实施方案中，孔的过滤器的孔径小于珠直径。因此，珠不能通过所述孔的过滤器。应当理解，在本发明的上下文中，当该方法包括在添加离液剂的步骤之前酶促合成多核苷酸的步骤时，至少第一类型的珠，优选琼脂糖珠可用作实施所述酶促合成的支持物；并且第二类型的珠，优选玻璃珠，可以用于沉淀根据本发明的混合物，这两种类型的珠都被孔的过滤器所保留。

在一个或多个实施方案中，过滤器优选地具有包括0.45μm至1.2μm的孔径。

在一个或多个实施方案中，过滤板优选地包括96个孔或384个孔。

在一个或多个实施方案中，离液剂选自由以下组成的组：异丙醇溶液、碘化钠溶液、高氯酸钠溶液、以及它们组合中的一种。优选地，离液剂是异丙醇溶液。

在一个或多个实施方案中，孵育混合物以获得沉淀物的步骤优选地在室温下进行，并且优选地至少孵育10分钟。

在一个或多个实施方案中，通过孵育混合物在孔中形成沉淀物和上清液，上清液包含至少一部分污染物，并且沉淀物包含多核苷酸和任选地包含另一部分污染物。

在一个或多个实施方案中，方法包括洗涤沉淀物的步骤，以除去沉淀物中的污染物。

在一个或多个实施方案中，方法包括：

-用洗涤溶液洗涤沉淀物的步骤，以溶解可能存在于沉淀物中的污染物，和

-对所述孔施加差压以通过所述过滤器除去所述洗涤溶液的步骤，所述洗涤溶液包含所述沉淀物的溶解的污染物，

其中在通过过滤器除去上清液之后，即在施加差压的步骤之后实施洗涤沉淀物的步骤和施加差压的步骤。

在一个或多个实施方案中，洗涤溶液是乙醇溶液，优选地包含以体积计70％至80％的乙醇。

在一个或多个实施方案中，新合成的至少一种多核苷酸的长度为至少为10个核苷酸长，优选地至少17个核苷酸长。

本发明还涉及被配置成实施根据本发明的实施方案中的任一个的方法的任何试剂盒，所述试剂盒包括：

-离液剂溶液

-洗涤溶液和/或缓冲溶液，用于纯化

-洗脱液溶液和/或缓冲液，以回收纯化的多核苷酸

-任选地，说明书手册，

-任选地，珠溶液。

在一个或多个实施方案中，试剂盒被配置成实施本发明的酶促合成和方法，其中所述试剂盒还包括：

-至少一种反应介质，其包含由核苷酸制成的核酸片段，

-酶促核苷酸添加试剂、适于通过所述酶促添加试剂添加的核苷酸或核苷酸组合，

-至少一种洗涤溶液和/或至少一种缓冲溶液，用于酶促合成的纯化阶段，

-至少一种扩增反应介质，其包含至少一种酶促核酸扩增试剂和适于通过酶促扩增试剂使用的天然核苷酸。

本发明还涉及被配置成实施根据前述实施方案中的任何一个的方法的装置。

在一个或多个实施方案中，装置包括合成工作站和回收工作站，其中合成工作站包括位于压力调节器和/或摇动器工作站上方的过滤板。

在一个或多个实施方案中，装置还可以包括被配置成位于板下方的冷却或加热工作站。

一方面，根据以下描述，以及另一方面，根据通过参考附加示意图的指示而不是限制的方式给出的若干个实施方案，本发明进一步的特征和优点将变得明显。

附图简要说明

图1表示本发明的一个实施方案，其没有在过滤板的孔中洗涤的步骤，并且包括对孔施加差压以回收纯化的多核苷酸的最终步骤。

图2表示本发明的另一个实施方案，其包括在过滤板的孔中添加洗涤溶液的附加步骤，和对孔施加差压以回收纯化的多核苷酸的最终步骤。

图3表示对应于在过滤板的每个孔中以pmol回收的DNA量的产量分布。

图4表示对应于过滤板的每个孔中的盐污染率的DNA/盐比率分布。

图5表示对应于过滤板的每个孔中的蛋白质污染率的DNA/蛋白质比率分布。

图6A是表示通过OP2测量的纯度的影响的凝胶图片

图6B表示使用合成的寡核苷酸的％N带的纯度估计。

发明详述

定义

“多核苷酸”是由共价连接以形成核酸链(例如DNA或RNA)的链或片段的核苷酸单体构成的聚合物。在本发明的上下文中，“多核苷酸(polynucleotide)”和“多核苷酸(polynucleotides)”可以互换，并且具有相同的意义和范围。

在本发明的上下文中，“合成的多核苷酸”意指通过酶促合成方法(例如WO 2015/159023)获得的延长的多核苷酸序列，直到获得目标多核苷酸。

本发明的方法

通常，纯化包含目标多核苷酸的液体溶液使用若干个工作站和板进行，以提取并最终回收纯化的目标多核苷酸。

然而，出于生态或经济目的，希望减少工作站和板的数量，并且希望使用基本硬件模块：差压装置(例如真空)、搅拌器、分配和板，来改进高通量多核苷酸提取的自动化。改进高通量多核苷酸提取的自动化需要简化现有装置，以便在较短的一段时间内提取越来越多的多核苷酸。然而，现有装置的简化首先需要改变纯化方法，其次需要克服通过现有技术方法的改变而出现的技术困难。这是本发明的目的，旨在限制材料从一个板到另一个板的转移。

此外，在第一方面，本发明提供了纯化包含多核苷酸和污染物的溶液的方法，所述溶液包含在过滤板的孔中，所述孔配备有过滤器，所述方法包括：

-向包含在孔中的溶液添加离液剂的步骤，以获得混合物，

-孵育混合物步骤，以便在孔中获得沉淀物和上清液，沉淀物包含多核苷酸并且上清液包含污染物的至少一部分，

-对孔施加差压的步骤，以便通过过滤器除去上清液，沉淀物被过滤器保留，

-添加低盐洗脱液的步骤，以溶解沉淀物中的多核苷酸并将溶解在低盐洗脱液中的多核苷酸转移到容器中，

其中所述方法在配备有过滤器的孔中实施。

特别地，溶液包含在过滤板的孔中，其中过滤板位于差压工作站和/或摇动器工作站上方。

过滤板是本领域技术人员公知的，以提供一步分析而不需要离心或沉淀，特别是过滤板通常用于以96或384孔格式进行PCR分析。

根据本发明，所述方法在单个过滤板中进行，而不需要转移包含多核苷酸的液体溶液。为此，第一步骤需要在过滤板的孔中添加离液剂以得到混合物。混合物优选地包含污染物、多核苷酸、离液剂和任选的珠。

为了改进目标多核苷酸的沉淀并因此进行纯化，所述方法包括孵育混合物的第二步骤，以便在孔中获得沉淀物和上清液，沉淀物包含多核苷酸，并且上清液包含污染物。

离液剂会引起液体溶液中存在的多核苷酸的沉淀，特别是当液体溶液存在盐时。离液剂会干涉多核苷酸的弱分子内相互作用，允许其3-维构象的破坏并因此变性。变性引起溶解度的改变，导致多核苷酸的沉淀。

根据本发明，可以使用本领域技术人员已知的所有离液剂。在优选的实施方案中，离液剂选自由以下组成的组：异丙醇溶液、碘化钠溶液、高氯酸钠溶液及其组合中的一种。更优选地，离液剂是异丙醇溶液。例如，异丙醇溶液的体积浓度为至少60％(v/v)。

在优选的实施方案中，孵育混合物以获得沉淀的步骤在室温下进行，更优选地孵育进行至少10分钟。

在本发明的一些实施方案中，混合物导致包含多核苷酸和一部分污染物的沉淀物的形成；和包含另一部分污染物的上清液的形成。因此，混合物在孔中产生沉淀和上清液，沉淀物包含多核苷酸和任选地一些污染物，以及上清液任选地包含另一部分污染物。污染物可以是酶、盐或缓冲液。

第三步骤由以下组成：在孔中施加差压，以便通过过滤器除去上清液，从而除去污染物；沉淀物被过滤器保留。任选地，沉淀物和珠被过滤器保留在一起。

施加到上清液的差压不溶解多核苷酸，只除去污染物，因此由过滤器保留的沉淀物仅包含目标多核苷酸和任选地，珠。

施加到上清液的差压可以是正压或真空，更优选地是真空。例如，差压可以包括5kPa至60kPa。“正压”意指高于大气压的压力。所使用的真空是本领域技术人员通常使用的装置，并且其被配置成位于过滤板的下方，从而可以通过过滤板的过滤器从孔中除去上清液。包含多核苷酸和任选地部分污染物的沉淀物被过滤器保留。

在具体的实施方案中，当沉淀物包含多核苷酸和部分污染物时，本发明的方法还包括洗涤步骤以溶解存在于沉淀物中的污染物。

因此，在本发明的一个或多个实施方案中，所述方法还包括：

-用洗涤溶液洗涤沉淀物的步骤，以溶解可能存在于沉淀物中的污染物，和

-对所述孔施加差压的步骤，以便通过过滤器除去洗涤溶液，所述洗涤溶液包含沉淀物的溶解的污染物，

其中所述洗涤步骤和所述施加差压的步骤在通过过滤器除去上清液之后实施。

在优选的实施方案中，在通过过滤器除去上清液之后并在添加低盐洗脱液的步骤之前实施洗涤步骤和施加步骤。

可以使用的洗涤溶液是不溶解多核苷酸但仅溶解沉淀物中存在的污染物的任何溶液，由此多核苷酸可以经过孔以除去污染物。在优选的实施方案中，洗涤溶液是乙醇溶液，更优选地70％至80％为乙醇溶液。

在本发明的优选实施方案中，施加到沉淀物上的差压也是正压或真空，更优选地为真空。真空也被配置成位于过滤板的下方，从而可以通过过滤板的过滤器从孔中去除污染物。

因此，根据本发明的任何实施方案，施加到沉淀物和/或上清液的差压是正压或真空，更优选地为真空。在特定的实施方案中，可以对上清液施加真空，并对沉淀施加正压，或者反过来。

一旦从孔中除去上清液，添加低盐洗脱液的第四步骤目的是溶解过滤器保留的沉淀，特别是为了重新悬浮并溶解多核苷酸。为了将它们转移到所需容器中，溶解是特别有用的。“低盐洗脱液”意指没有水中存在的大部分矿物盐的洗脱液，优选地低盐洗脱液是纯净水或蒸馏水，更优选地为本领域技术人员已知的适于PCR的超纯水，例如分子生物学级水(不含核酸酶和蛋白酶)。

因此，除去上清液后获得的干燥多核苷酸可以使用低盐洗脱液溶液回收到所需容器中。

所需容器优选地为回收板的孔。

在另一个优选的实施方案中，低盐洗脱液选自纯净水、蒸馏水、超纯水以及其组合中的一种。

根据本发明，新合成的至少一种多核苷酸的长度为至少10个核苷酸长，优选地至少17个核苷酸长。

在根据本发明的一个更优选的实施方案中，方法包括：

-向孔中包含的溶液中添加离液剂的步骤，以获得混合物，

-孵育所述混合物的步骤，以便在孔中获得沉淀物和上清液，沉淀物包含多核苷酸和任选地污染物，并且上清液包含污染物的至少一部分，

-对孔施加差压的步骤，以便通过过滤器除去上清液，所述沉淀物被过滤器保留，

-用洗涤溶液洗涤沉淀物的步骤，以溶解可能存在于沉淀物中的污染物，和

-对孔施加差压的步骤，以便通过过滤器除去洗涤溶液，洗涤溶液包含沉淀物中溶解的污染物，

-添加低盐洗脱液的步骤，以溶解沉淀物中的多核苷酸，并将溶解在低盐洗脱液中的多核苷酸转移到所需容器中，

其中所述方法的每个步骤在配备有过滤器的孔中进行。

在本发明的一个或多个实施方案中，所述方法还包括在孵育混合物的步骤之前添加珠的步骤。将珠与离液剂同时添加到孔中以获得混合物，特别适合用作沉淀表面并促进多核苷酸沉淀。当珠是玻璃珠，优选地为二氧化硅玻璃珠时，进一步改善了沉淀。

在更优选的实施方案中，珠是玻璃珠，其是空心珠。特别合适的是，玻璃球是空心的，以具有等于或稍高于离液剂的密度，从而使得便于再悬浮。

珠的直径优选地为9至13微米。

当添加珠时，本发明的方法在过滤板的孔中实施，其中过滤器的孔径小于珠直径。优选地，过滤器的孔径为0.45μm至1.2μm。

一旦形成包含珠的上清液和沉淀，冲洗孔。由于珠的特定直径，包含珠和多核苷酸的沉淀因此被过滤板的过滤器保留。

在优选的实施方案中，本发明的方法在酶促合成的情况下进行。因此，所述方法优选地包括在添加离液剂的步骤之前酶促合成多核苷酸的另外步骤，所述酶促合成多核苷酸的步骤在实施添加离液剂的步骤的孔中进行。因此，多核苷酸的合成也在实施根据本发明的纯化方法的孔中进行。

优选地，所述酶促合成多核苷酸的另外步骤包括：

a)提供具有含游离3’-羟基的3’-末端核苷酸的引发剂的子步骤，

b)在延长条件下使具有游离3’-O-羟基的引发剂与3’-O-封闭的核苷三磷酸和聚合酶接触的子步骤，使得通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸来延长引发剂以形成3’-O-封闭的延长片段

c)解封延长片段的子步骤，以形成具有游离3’-羟基的延长片段，和

d)重复子步骤b)和c)直到形成多核苷酸的子步骤，

e)从引发剂切割多核苷酸的子步骤，优选地通过核酸内切酶消化。

在优选的实施方案中，重复子步骤b)和c)的子步骤d)通过在延长条件下接触步骤c)中获得的延长片段来实施，直到获得多核苷酸。

存在非常大量的DNA聚合酶，其能够在模板链存在或不存在的情况下催化合成多核苷酸。因此，polX家族的DNA聚合酶涉及广泛的生物学过程，特别是涉及DNA修复机制或用于校正DNA序列中出现的错误的机制。这些酶能够在核酸链中插入核苷酸，所述核苷酸在鉴定序列错误后进行了切除。polX家族的DNA聚合酶包括DNA聚合酶β(Polβ)、λ(Polλ)、μ(Polμ)、酵母IV(Pol IV)和末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)。尤其TdT特别有用，因此在核酸分子的酶促合成方法中非常广泛地使用。

然而，这些DNA聚合酶仅允许掺入天然核苷酸。在所有情况下，天然DNA聚合酶在非天然核苷酸存在的情况下失去其催化活性，特别是3'-OH修饰的核苷酸，其表现出比天然核苷酸更大的空间位阻。因此，已经开发了能够通过掺入此类核苷酸来催化多核苷酸合成的酶。特别地，已经开发了DNA聚合酶变体，优选地为TdT变体，例如，如在US2020/0002690中所述的。

在更优选的实施方案中，多核苷酸的酶促合成描述于，例如Ybert等人的国际专利公开WO2015/159023中。

本发明的试剂盒

本发明还涉及被配置成实施根据前述任一实施方案中的方法的任何试剂盒，其包括：

-离液剂溶液，

-洗涤溶液和/或缓冲溶液，用于纯化，

-洗脱液溶液和/或缓冲液，以回收纯化的多核苷酸，

-任选地，说明书手册，

-任选地，珠溶液。

在优选的方案中，试剂盒被配置成实施本发明的酶促合成和方法，其中所述试剂盒还包括：

-至少一种反应介质，其包含包括n个核苷酸的核酸片段，

-酶促核苷酸添加试剂、适于通过所述酶促添加试剂添加的核苷酸或核苷酸组合，

-至少一种洗涤溶液和/或缓冲液，用于酶促合成的纯化阶段，

-至少一种扩增反应介质，其包含至少一种酶促核酸扩增试剂和适于通过酶促扩增试剂使用的天然核苷酸。

可以根据实验者的需要提供不同类型的试剂盒。类似地，可以根据是否自动使用来提供不同类型的试剂盒。

本发明的装置

在另一方面，本发明还涉及被配置成实施根据前述任一实施方案中的任一个的方法的装置。

在优选的实施方案中，装置包括合成工作站和回收工作站，其中合成工作站包括位于压力调节器和/或摇动器工作站上方的过滤板(11)。

优选地，装置还包括配置成位于板下方的冷却或加热工作站。冷却或加热工作站特别用于专门控制孔的温度，并因此控制包含在孔中的溶液的温度，以便例如，加热以释放与用于酶促合成的固体支持物连接的合成的多核苷酸，或快速冷却至室温以进行根据本发明的方法。

本发明的其他特征和优点将根据以下实施例和结果变得更加清楚，这些实施例和结果当然是非限制性的。

实施例

实施例证实了本发明方法的有效性，特别是通过在同一过滤板中进行酶促合成，然后进行本发明的合成和纯化方法。

材料&方法

如国际专利申请WO 2015/159023中所述，750pmol引发剂DNA链，其是具有含游离3’-羟基的3’-末端核苷酸的小DNA链，用于引发酶促合成并延长目标DNA链。将引发剂装载在固体支持物上，然后分配到384w过滤板的每个孔中。过滤孔为1.2μm宽并且膜由聚醚砜(PES)制成。

将装载的板置于由DNA Script以商标名称SYNTAX销售的装置中，以实施WO 2015/159023中所述的酶促合成方法。酶促合成在一组定制序列上进行。(20至28聚体的16个DNA探针)

在合成之后，在合成板的每个孔中进行下文表1中描述的以下步骤。

第一步骤如下所述：“将25μL低盐洗脱液(MB水)分配在板的每个孔中，然后在室温下孵育，1500rpm5秒，然后在-40kPa下在30秒期间抽空液体，将该步骤重复两次”。

表1

SE缓冲液使用低盐洗脱液(MB水)。W3缓冲液是10mM Tris、0.25mM EDTA、100mMNaCl、0.5％吐温、蛋白酶K 0.1mg/mL。LB缓冲液是10mM Tris、500mM MgCl₂、1700mM NaCl、Endo V 2.9μM。W1缓冲液是80％ EtOH、20％ Mili Q水。W6缓冲液是纯异丙醇。

为了证实方法的有效性，已经确定如下成功标准：

-C1：使用用于合成的单个过滤板和根据本发明的方法，所述方法过程在的装置中100％自动化，

-C2：对于100％的孔,DNA回收必须达到产量>200pmol(对于750pmol装载，用260nm吸光度测量)。

-C3：盐污染必须是：对于100％的孔，

-C4：蛋白质污染必须是：对于100％的孔，

-C5：根据本发明的方法应该对合成的链的纯度没有影响。

然后在384UV定量板中回收并分析样本。发明人分析了回收的DNA的“产量”、盐或蛋白质污染并检查了纯度。

以pmol计的回收的DNA的量被称为“产量”，通常所装载的引发剂DNA的量为750pmol，这设定了750pmol的最大回收产量。在实践中，我们根据所使用的方案、固体支持物等，回收了200pmol至400pmol的DNA。

然后在UV定量板中回收DNA，并在Epoch微孔板分光光度计中使用260nm吸光度进行定量。发明人还使用230nm和280nm分别估计盐和蛋白质污染。对于“纯”核酸，260/230值高于相应的260/280值。

预期的260/230值通常在2.0至2.2的范围内。如果该比率显著低于预期，则其可以指示在230nm处吸收的污染物的存在。

预期的260/280值通常在1.8至2.0的范围内。如果该比率显著低于预期，则其可以指示在280nm处吸收的污染物的存在。

然后使用Oligo Pro II(OP2)系统分析合成的DNA，该系统利用UV检测以及平行毛细管电泳来提供单核苷酸分辨率和寡核苷酸纯度的直接评估。

结果

结果展示于图3至图6B中。

根据第一标准C1，本方法已经使用单个过滤板以最少的硬件和软件需求实现自动化，而不需要人工干预。

在根据本发明的纯化方法之前，将750pmol的DNA装载到板的每个孔中。如图3所示，没有孔包含小于200pmol。此外，发明人已经证明，50％以上的孔包含至少400pmol的DNA，这表明与通过现有技术的方法获得的结果相比，本发明的方法具有非常好的效率，为大约至少10％至20％的效率。

发明人还已经表明，每个孔中的污染非常低。为了检查污染，发明人测量了DNA/盐比率，然后测量了DNA/蛋白质比率。因此，发明人在图4中显示所有孔的DNA/盐比率为至少1.8，图5中所有孔的DNA/蛋白质比率为至少1.6。这些结果也表示与现有技术相比回收的多核苷酸增加了约20％。

最后，发明人已经证实，针对使用OP2对寡核苷酸进行分析，本发明的方法对合成的链的纯度没有影响。结果显示在图6A和图6B中，表明寡核苷酸的纯度对应于该给定化学性质和寡核苷酸尺寸的最佳标准。

总之，本发明的方法满足了高性能纯化方法的所有要求。这为结合此类方法的装置开辟了新的视角以及新的功能。

Claims (22)

1.纯化包含多核苷酸和污染物的溶液的方法，所述溶液包含在过滤板的孔中，所述孔配备有过滤器，所述方法包括：

-向包含在所述孔中的所述溶液添加离液剂的步骤，以获得混合物，

-孵育所述混合物的步骤，以便在所述孔中获得沉淀物和上清液，所述沉淀物包含所述多核苷酸并且所述上清液包含所述污染物的至少一部分，

-对所述孔施加差压的步骤，以便通过所述过滤器除去所述上清液，所述沉淀物被所述过滤器保留，

-添加低盐洗脱液的步骤，以溶解所述沉淀物中的多核苷酸并将溶解在所述低盐洗脱液中的多核苷酸转移到容器中，

其中所述方法在配备有所述过滤器的孔中进行，并且所述方法包括在添加离液剂的步骤之前酶促合成多核苷酸的步骤，所述酶促合成多核苷酸的步骤在实施所述添加离液剂的步骤的孔中进行。

2.根据前述权利要求所述的方法，其中所述酶促合成多核苷酸的步骤包括：

a)提供具有含游离3’-羟基的3’-末端核苷酸的引发剂的子步骤，

b)在延长条件下使具有游离3’-O-羟基的引发剂与3’-O-封闭的核苷三磷酸和聚合酶接触的子步骤，使得通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸来延长所述引发剂以形成3’-O-封闭的延长片段

c)解封所述延长片段的子步骤，以形成具有游离3’-羟基的延长片段，和

d)重复子步骤b)和c)直到形成所述多核苷酸的子步骤，

e)从所述引发剂切割所述多核苷酸的子步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其中通过酶促消化、通过光照切割和/或通过化学切割实施从所述引发剂切割所述多核苷酸的子步骤。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在室温下实施孵育步骤。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中孵育步骤进行至少10分钟

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤板优选地包括96个孔或384个孔

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述离液剂选自由以下组成的组：异丙醇溶液、碘化钠溶液、高氯酸钠溶液、以及它们组合中的一种。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过孵育所述混合物在所述孔中形成沉淀物和上清液，所述上清液包含所述污染物的至少一部分，并且所述沉淀物包含所述多核苷酸和任选地所述污染物的另一部分

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括：

-用洗涤溶液洗涤所述沉淀物的步骤，以溶解可能存在于所述沉淀物中的污染物，和

-对所述孔施加差压的步骤，以便通过所述过滤器除去所述洗涤溶液，所述洗涤溶液包含所述沉淀物中溶解的污染物，

其中所述洗涤沉淀物的步骤和所述施加差压的步骤在通过所述过滤器除去所述上清液之后实施。

10.根据前述权利要求所述的方法，其中所述洗涤溶液是乙醇溶液，优选地包含以体积计70％至80％的乙醇。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括在所述孵育混合物的步骤之前添加珠的步骤。

12.根据前述权利要求所述的方法，其中所述孔的过滤器的孔径小于所述珠的直径。

13.根据权利要求11或12中任一项所述的方法，其中所述珠是玻璃珠，优选地为二氧化硅玻璃珠。

14.根据前述权利要求所述的方法，其中所述珠是空心珠。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器的孔径为0.45μm至1.2μm。

16.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述珠的直径为9微米至13微米。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述新合成的至少一种多核苷酸的长度为至少10个核苷酸长，优选地至少17个核苷酸长。

18.试剂盒，其被配置为实施根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述试剂盒包括：

-离液剂溶液，

-洗涤溶液和/或缓冲溶液，用于纯化，

-洗脱剂溶液和/或缓冲液，以回收纯化的多核苷酸，

-任选地，说明书手册。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括：

-至少一种反应介质，其含有包括n个核苷酸的核酸片段，

-酶促核苷酸添加试剂、适于通过所述酶促添加试剂添加的核苷酸或核苷酸组合，

-至少一种洗涤溶液和/或缓冲液，用于所述酶促合成的纯化阶段，

-至少一种扩增反应介质，其包含至少一种酶促核酸扩增试剂和适于通过所述酶促扩增试剂使用的天然核苷酸。

20.装置，其被配置为实施根据权利要求1至17中任一项所述的方法。

21.根据权利要求20所述的装置，其中所述装置包括合成工作站和回收工作站，其中所述合成工作站包括位于压力调节器和/或摇动器工作站上方的过滤板。

22.根据权利要求21所述的装置，其中所述装置还包括配置成位于所述过滤板下方的冷却或加热工作站。