DE10106199A1 - Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer nukleinsäurehaltigen flüssigen Probe - Google Patents

Abstract

Ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer nukleinsäurehaltigen flüssigen Probe unter Verwendung einer Filtervorrichtung, die Poren aufweist, durch die man die Probe im Zuge der Isolierung hindurchfließen läßt, wobei die in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren in oder an den Poren selektiv zurückgehalten werden, ist dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einer Konzentration an Fällungsmittel für Nukleinsäuren versetzt wird, die ausreicht, die Nukleinsäuren zu kondensieren und man die Probe dann durch die Filtervorrichtung fließen läßt, wobei die Poren der eingesetzten Filtervorrichtung Innenwandbereiche mit variablen Oberflächenstrukturen aufweisen, die sich in Abhängigkeit von dem durch die Poren geleiteten Medium unterschiedlich ausbilden und über die die Durchlässigkeit der Poren zwischen einem Zustand, in dem kondensierte Nukleinsäuremoleküle zurückgehalten werden, und einem Zustand, in dem gelöste Nukleinsäuremoleküle passieren können, verstellbar ist.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren, bei denen Nukleinsäuren an durch­ strömbaren Filtervorrichtungen isoliert werden, die z. B. Poren aufweisen. Zur Isolierung läßt man eine nukleinsäurehaltige flüssige Probe durch die Filtervor­ richtung fließen, wobei die Nukleinsäuren in oder an den Poren zurückgehalten werden. Üblicherweise werden die Filtervorrichtungen dann gewaschen und in einem nächsten Schritt werden die Nukleinsäuren zur weiteren Verwendung wie­ der eluiert.

Bekannte Verfahren setzen als Filtervorrichtungen z. B. Ionen-Austauscher ein. Unter Niedrigsalzbedingungen werden die Nukleinsäuremoleküle gebunden. Die Elution erfolgt unter Hochsalzbedingungen, was die weitere Verwendung der eluierten Nukleinsäuremoleküle erschwert bzw. in der Regel eine zwischenge­ schaltete Dialyse erforderlich macht.

Ebenfalls bekannt ist, Filtermaterialien auf Silika-Basis in Verbindung mit Bin­ dungspuffern einzusetzen, die chaotrope Reagenzien enthalten. Die chaotropen Reagenzien bewirken eine spezifische Bindung von Nukleinsäuren an den Sili­ kamaterialien. Hier kann zwar unter Niedrigsalzbedingungen eluiert werden. Nachteilig ist jedoch, daß chaotrope Reagenzien relativ aggressiv sind, was die Aufarbeitung nicht unproblematisch gestaltet.

Eine weitere Möglichkeit ist, Molekularsiebe einzusetzen. Nachteilig hieran ist, daß bei der Elution die Nukleinsäuren nicht in der ursprünglichen Filtrierrichtung durch das Molekularsieb gesaugt werden können. Sie müssen vielmehr auf der Seite, auf der sie auch in das Molekularsieb eingetreten sind, wieder eluiert wer­ den, was in aller Regel einen zusätzlichen Arbeitsschritt bedeutet und demzufol­ ge die Aufarbeitungszeit verlängert.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zu schaffen, mit dem sich die oben genannten Nachteile vermeiden lassen.

Gelöst wird die Aufgabe mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1. Die Unteran­ sprüche betreffen vorteilhafte Ausgestaltungen.

Das erfindungsgemäße Verfahren arbeitet, wie aus dem Stand der Technik be­ kannt, mit einer Filtervorrichtung, durch deren Poren man die Probe im Zuge der Isolierung hindurchfließen läßt. Auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sollen die in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren selektiv in oder an den Poren zurückgehalten werden. Die Filtervorrichtung kann dabei insbesondere eine Fil­ termatrix oder eine Membran sein. Denkbar sind aber auch Filtervorrichtungen mit Mikrokanälen, wobei der Begriff Pore, wenn er im Rahmen dieser Anmel­ dung verwendet wird, breit zu verstehen ist und auch solche Kanalstrukturen ab­ decken soll.

Erfindungsgemäß ist in diesem Zusammenhang vorgesehen, daß die Probe in ei­ nem ersten Schritt mit einem Fällungsmittel (in den Beispielen auch als Bin­ dungspuffer bezeichnet) für Nukleinsäuren in einer Konzentration versetzt wird, die ausreicht, die Nukleinsäuren zu kondensieren. Vorzugsweise wird als Fäl­ lungsmittel Polyäthylenglykol und/oder Isopropanol eingesetzt, ohne daß diese Aufzählung limitierend ist. Generell geeignet sind alle Fällungsmittel, die Nu­ kleinsäuren kondensieren können. Geeignete Konzentrationen liegen für PEG zwischen 5-30% und für Isopropanol zwischen 10-100%.

Unter Kondensation sollen durch äußere Umstände hervorgerufenen Konformati­ onsänderungen verstanden werden, die Stauchungen des Nukleinsäuremoleküls bis hin zum unlöslichen Zustand umfassen. Die Stauchung des Nukleinsäuremo­ leküls geht einher mit abnehmender Flexibilität und zunehmender Komplexizität der Molekülstrukturen.

Die mit dem Fällungsmittel bewirkte Kondensation führt daher bei Nukleinsäuren in der Regel zu einer Volumenvergrößerung bei gleichzeitiger Abnahme der Fle­ xibilität, wobei wie oben erwähnt, z. B. Plasmide dazu neigen, in Gegenwart von z. B. PEG oder Isopropanol eine gestauchte Konformation einzunehmen.

Im nächsten Schritt wird das Proben/Fällungsmittelgemisch dann durch die Fil­ tervorrichtung gedrückt oder gesaugt. Dies kann insbesondere mittels Zentrifuga­ tion oder Vakuumfiltration erfolgen.

Die Poren der eingesetzten Filtervorrichtung sind dabei so ausgebildet, daß sie selektiv die kondensierten Nukleinsäuremoleküle zurückhalten, aber z. B. bei der Elution vollständig gelöste (nicht kondensierte) Nukleinsäuremoleküle passieren lassen. An dieser Stelle soll angemerkt werden, daß alle Angaben, die sich auf das Zurückhalten der Nukleinsäuren in oder an den Poren bzw ihre Passage be­ ziehen, statistische Angaben sind. Wenn z. B. gesagt wird, daß die Poren durch­ lässig für Nukleinsäuren sind, so trifft dies mindestens für einen überwiegenden Teil der Poren sowie der in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren (aber nicht zwingend für alle Poren und Nukleinsäuren) zu. Selbstverständlich ist nicht aus­ zuschließen, daß einige Poren aufgrund von Tiefenfilterwirkung etc. sich zuset­ zen und dann die Passage nicht mehr möglich ist. Andererseits kann eine Tiefen­ filterwirkung die Filterwirkung natürlich insgesamt auch unterstützen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr einfach durchzuführen. Nach Versetzen der nukleinsäurehaltigen Probe mit dem Fällungsmittel wird die Probe z. B. mit­ tels Vakuumfiltration durch eine Filtervorrichtung mit den zuvor beschriebenen Poreneigenschaften gesaugt oder mit einem Direktverdränger pipettiert, wobei die kondensierten Nukleinsäuremoleküle in oder an den Poren zurückgehalten wer­ den.

Nach gegebenenfalls zwischengeschalteten Waschschritten wird ein Elutionspuf­ fer durch die Filtervorrichtung gegeben, der die Nukleinsäuren wieder löst. Es kann sich dabei um Puffer mit niedrigen Salzkonzentrationen, im einfachsten Fall um Wasser handeln. Der Elutionspuffer muß lediglich in der Lage sein, den kon­ densierten Zustand der Nukleinsäuremoleküle wieder aufzuheben. In gelöstem Zustand können die Nukleinsäuremoleküle dann die Poren passieren und werden auf der abgewandten Seite der Filtervorrichtung gereinigt aufgefangen.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, daß die Poren der Filtervorrichtung Innen­ wandbereiche mit variablen Oberflächenstrukturen aufweisen, die sich in Abhän­ gigkeit von dem durch die Poren geleiteten Medium unterschiedlich ausbilden und auf diese Weise die Durchlässigkeit steuern. Es wird dabei in aller Regel von Porendurchmessern zwischen 0,2 und 20 Mikrometer ausgegangen. Es hat sich herausgestellt, daß sich bei kleineren Porendurchmessern die Filtervorrichtungen zusetzen, während bei größeren Durchmessern die selektive Anreicherung der Nukleinsäuren in der Filtervorrichtung leidet. Die Porendurchmesser liegen ober­ halb der für Molekularsiebe eingesetzten Ultrafiltrationsmembranen.

Bevorzugt lassen sich über die variablen Oberflächenstrukturen die Poren auf Durchmesser einstellen, bei denen kondensierten Nukleinsäuremoleküle zurück­ gehalten werden, bzw. auf Durchmesser, bei denen nicht kondensierte Moleküle die Poren passieren können. Die Einstellung erfolgt über das durch die Filtervor­ richtung geleitete Medium, also im Regelfall über Substanzen, die im Probenge­ misch enthalten sind. Diese weiter unten angesprochenen Substanzen können der Probe bzw. dem Probengemisch separat zugesetzt werden. Sie können aber auch im Bindungspuffer oder Elutionspuffer enthalten sein. Im einfachsten Fall be­ wirkt z. B. das für die Kondensation der Nukleinsäuren eingesetzte Fällungsmittel auch eine Einstellung der Poren auf den Zustand, in dem sie Nukleinsäuren zu­ rückhalten während z. B. der zur Elution eingesetzte Puffer die Poren auf einen durchlässigen Zustand einstellt.

Geeignete variable Oberflächenstrukturen können z. B. Beschichtungen mit de­ protonierbaren Gruppen, z. B. Sulfonsäure, Phosphorsäure oder Karbonsäure­ gruppen sein. Es hat sich herausgestellt, daß solche deprotonierbaren Gruppen z. B. in Abhängigkeit von der Salzkonzentration, aber auch von dem pH-Wert oder der Anwesenheit bestimmter Reagenzien, wie z. B. PEG oder Isopropanol (um nur 2 Beispiele zu nennen), unterschiedliche Affinitäten zu Nukleinsäure­ molekülen aufweisen. Bei niedrigen Salzkonzentrationen bzw. einem neutralen bis alkalischen pH-Wert oder in Abwesenheit von spezieller Reagenzien wie z. B. PEG besteht keine oder nur eine geringe Affinität zu Nukleinsäuremolekülen. Wird der pH-Wert gesenkt bzw. die Salzkonzentration erhöht, so steigt auch die Affinität dieser Gruppen für Nukleinsäuren.

Filtervorrichtungen mit entsprechend beschichteten Innenwandbereichen lassen sich in besonders vorteilhafter Weise über z. B. das eingesetzte Puffermedium schalten. Bei einem Hochsalzpuffer haben die Poren eine hohe Affinität für Nu­ kleinsäuren, die dann in den Poren zurückgehalten werden. In Gegenwart von schwach konzentrierten Elutionspuffern nimmt die Affinität ab, und die Nuklein­ säuren lassen sich aus der Filtervorrichtung entfernen.

Besonders bevorzugt werden die variablen Oberflächenstrukturen als Polymer­ ketten ausgebildet, die in Abhängigkeit von dem durch die Pore durchgeleiteten Puffermedium entweder gestreckt von der Poreninnenwand abstehen oder eine gestauchte Form einnehmen können, wodurch sich der effektive Querschnitt der Pore relativ einfach auf den gewünschten Durchlässigkeitszustand einstellen lässt. Bevorzugt werden als Polymerketten Polymere der Acrylsäure oder deren Derivate eingesetzt.

Insbesondere bei einer Beschichtung mit Polyacrylsäuren, aber auch generell bei den anderen angesprochenen Beschichtungen läßt sich eine hohe Affinität für Nukleinsäuren auch über z. B. PEG oder Isopropanol einstellen. Bei den Poly­ merketten bewirkt PEG, daß die Ketten eine gestauchte Form einnehmen, in der sie die kondensierten Nukleinsäuremoleküle besonders effektiv zurückhalten. Der durchlässige gestreckte Zustand der Polymerketten läßt sich z. B. unter Niedrig­ salzbedingungen (Wasser) wieder herstellen.

Die oben angeprochene Ausgestaltung ist besonders vorteilhaft, da über den Ein­ satz von PEG mit einer Komponente gleichzeitig die Durchlässigkeit der Pore eingestellt und die Kondensation der Nukleinsäuren bewirkt werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann bevorzugt für Plasmide oder PCR- Produkte eingesetzt werden. Denkbar ist aber auch eine Aufreinigung von geno­ mischer DNA oder RNA, wobei im Zweifelsfall die eingesetzten Filtervorrich­ tungen bezüglich ihrer Porengröße sowie die Pufferbedingungen an die zu er­ wartenden PCR-Produkte abgestimmt werden müssen.

Im folgenden soll die Erfindung an Hand mehrerer Beispiele näher erläutert wer­ den.

Beispiel 1 Aufreinigung von Plasmid-DNA an Filtern

Es wurden Proben untersucht, die das Plasmid pBlueSchript SK enthielten. Zur Herstellung der Proben wurden 1,5 ml Bakerienkultur (DH10B) zentrifugiert. Das Pellet wurde zur Lyse der Zellen mit den Puffern P1-P3 (P1: 100 µl, P2: 300 µl, P3: 30 µl) aus dem Kit "Perfect Prep Plasmid Midi" der Fa. Eppendorf versetzt und erneut zentrifugiert. Das Lysat wurde mit 700 µl Bindungspuffer (20%PEG, 1,5 mol NaCl) versetzt und mittels Zentrifugation durch folgende un­ terschiedliche Filtermaterialien gedrückt:

• 1. Cellpore C2 (Fa. Esters, Aachen), Stärke 2 mm, nominale Porenweite 3 µm,
• 2. der in 1 angegebene Filter mit Polyacrylsäurebeschichtung

Zur Modifizierung wurde der in 1 angegebene Filter (Cellpore C2) unter Schüt­ teln für 2 h mit einer 100 mM Lösung von Benzophenon (BP) in Aceton equili­ briert. Nachfolgend wurde der Filter mit einer 10%igen wässrigen Acrylsäurelö­ sung überschichtet. Anschließend wurde für 15 min mit UV-Strahlung (UVA- Spot 2000; Dr. Hönle GmbH, Planegg) belichtet. Dann wurde der modifizierte Filter für 24 h bei 60°C mit Wasser extrahiert und getrocknet.

Nach Passage der Probe wurden die Filter mit 40 µl einer 75%-igen ethanoli­ schen Lösung gewaschen. Anschließend wurde mit 70 µl Wasser eluiert und die Plasmid-Ausbeute im Eluat gelektrophoretisch bestimmt. Das Ergebnis zeigt Fig. 1.

In Spur 1 wurde eine Kontrolle aufgetragen. Sie Spuren 2 + 3 zeigen die Ergebnis­ se bei Verwendung von unbeschichteten Filtern. Die Spuren 4 + 5 zeigen die Er­ gebnisse bei Verwendung von beschichteten Filtern.

Man erkennt, daß die modifizierte Filtervariante (siehe insbesondere Spur 4) eine gute Aufreinigung von Plasmiden erlaubt, die deutlich besser ist als eine Aufrei­ nigung mit unmodifizierten Filtern (Spuren 2 und 3), die zum Vergleich mitgete­ stet wurden.

Beispiel 2 Aufreinigung von PCR-Produkten an Mikrofilterplatten (384 Format)

Es wurden Proben mit PCR-Produkten (250 bp bzw 400 bp; bp = Basenpaare) un­ tersucht. Jeweils 8 µl der Probe wurden mit 80 µl unterschiedlicher Bindungspuf­ fer versetzt und dann mittels Zentrifugation durch modifizierte Mikrofilterplatten (384 Format) gedrückt.

Eingesetzt wurden folgende Bindungspuffer:

• 1. 10% PEG 8000, 1,5 M NaCl
• 2. 10% PEG 8000, 1,5 M NaCl, 0,01 M MgCl₂
• 3. 8% PEG 8000, 1,2 M NaCl, 20% Isopropanol
• 4. 60% Isopropanol, 0,2 M NaCl

Die Modifizierung erfolgte wie oben beschrieben. Die modifizierten Filter wur­ den in die Kavitäten der Platten eingesetzt.

Nach Passage der Probe wurden die eingesetzten Filter mit jeweils 70 µl einer 75%-igen ethanolischen Lösung gewaschen. Anschließend wurde mit 10 µl Was­ ser eluiert und die gesamte Ausbeute im Eluat (10 µl) gelektrophoretisch be­ stimmt. Das Ergebnis zeigt Fig. 2.

Spur 1: Kontrolle; Spuren 2, 3: Kontrolle 400 bp; Spuren 4, 5: Probe 400 bp mit Bindungspuffer 1; Spuren 6, 7: Probe 400 bp mit Bindungspuffer 2; Spuren 8, 9: Probe 400 bp mit Bindungspuffer 3; Spuren 10, 11: Probe 400 bp mit Bindungs­ puffer 4; Spuren 12, 13: Kontrolle 250 bp; Spuren 14, 15: Probe 250 bp mit Bindungspuffer 1; Spuren 16, 17: Probe 250 bp mit Bindungspuffer 2; Spuren 18, 19: Probe 250 bp mit Bindungspuffer 3; Spur 20: Probe 250 bp mit Bindungspuf­ fer 4.

Man erkennt unterschiedliche Ausbeuten abhängig vom eingesetzten Bindungs­ puffer und der Größe der Produkte. Gute Ergebnisse für 400 bp-Produkte lassen sich mit Bindungspuffer 1, 3 und 4 erzielen. Bei Verwendung von Bindungspuf­ fer 2 erhält man keine erkennbaren Banden. Bei 250 bp-Produkten lassen sich gute Ergebnisse mit den Bindungspuffern 3 und 4 erzielen, während bei Verwen­ dung der Puffer 1 und 2 keine bzw. nur schwache Banden zu erkennen sind.

Beispiel 3 Aufreinigung von PCR-Produkten an Mikrofilterplatten (96 Format)

Es wurden Proben mit PCR-Produkten (400 bp) untersucht.

Jeweils 20 µl der Probe wurden mit jeweils 200 µl eines der in Beispiel 2 angege­ benen Bindungspuffers 1-4 versetzt und mittels Zentrifugation durch modifi­ zierte und unmodifizierte Mikrofilterplatten (96 Format) gedrückt.

Die Platten wurden durch Einsetzen von modifizierten bzw. unmodifizierten Fil­ termaterialien in die Kavitäten erhalten. Die Modifizierung erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben.

Nach Passage der Probe wurden die Mikrofilterplatten mit 20 µl 75%-iger etha­ nolischer Lösung gewaschen. Anschließend wurde mit 20 µl Wasser eluiert und die Ausbeute in jeweils 10 µl Eluat gelektrophoretisch bestimmt. Das Ergebnis zeigt Fig. 3.

Spur 1: Kontrolle; Spur 2: Kontrolle, nicht aufgereinigter PCR-Ansatz 400 bp; Spuren 3, 4: Kontrolle, herkömmlich gereinigtes PCR-Produkt 400 bp; Spuren 5, 6: Probe 400 bp mit Bindungspuffer 1, modifizierter Filter; Spuren 7, 8: Probe 400 bp mit Bindungspuffer 2, modifizierter Filter; Spuren 9, 10: Probe 400 bp mit Bindungspuffer 3, modifizierter Filter; Spuren 11, 12: Probe 400 bp mit Bin­ dungspuffer 4, modifizierter Filter; Spuren 13, 14: Probe 400 bp mit Bindungs­ puffer 1, unmodifizierter Filter; Spuren 15, 16: Probe 400 bp mit Bindungspuffer 2, anmodifizierter Filter; Spuren 17, 18: Probe 400 bp mit Bindungspuffer 3, un­ modifizierter Filter; Spur 19: Probe 400 bp mit Bindungspuffer 4, unmodifizierter Filter.

Man erkennt, daß insbesondere der Bindungspuffer 3 (8% PEG, 1,5 M NaCl, 20 % i-Prop) bei Verwendung des modifizierten Filters geeignet ist. Die zum Ver­ gleich mitgetestetn unmodifizierte Filtern erlauben zwar im Gel erkennbare Aus­ beuten, die allerdings geringer als bei modifizierten Filtern sind.

Claims (9)

1. Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer nukleinsäure­ haltigen flüssigen Probe unter Verwendung einer Filtervorrichtung, die Po­ ren aufweist, durch die man die Probe im Zuge der Isolierung hindurch­ fließen läßt, wobei die in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren in oder an den Poren selektiv zurückgehalten werden, dadurch kennzeichnet, daß die Probe mit einer Konzentration an Fällungsmittel für Nukleinsäuren versetzt wird, die ausreicht, die Nukleinsäuren zu kondensieren und man die Probe dann durch die Filtervorrichtung fließen läßt, wobei die Poren der eingesetzten Filtervorrichtung Innenwandbereiche mit variablen Ober­ flächenstrukturen aufweisen, die sich in Abhängigkeit von dem durch die Poren geleiteten Medium unterschiedlich ausbilden und über die die Durchlässigkeit der Poren zwischen einem Zustand, in dem kondensierte Nukleinsäuremoleküle zurückgehalten werden, und einem Zustand, in dem gelöste Nukleinsäuremoleküle passieren können, verstellbar ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch kennzeichnet, daß die variablen Oberflächenstrukturen deprotonierbare Gruppen enthalten, insbesondere Sulfonsäure, Phosphorsäure oder Karbonsäuregruppen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch kennzeichnet, daß die varia­ blen Oberflächenstrukturen Polymerketten sind, deren eines Ende an dem Innenwandbereich der Pore gebunden und deren anderes Ende frei beweg­ lich ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymer­ ketten im nukleinsäure-durchlässigen Zustand der Pore gestreckt sind und einem nukleinsäure-nicht-durchlässigen Zustand der Pore eine gestauchte Form einnehmen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch kennzeichnet, daß die Polymerkette eine Polyacrylsäure ist.

6. Verfahren nach einem der Anprüche 1 bis 5, dadurch kennzeichnet, daß die Filtervorrichtung eine Filtermatrix oder eine Membran, insbesondere aus Kunststoff ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch kennzeichnet, daß die Einstellung des Zustands der Poren, in dem kondensierte Nukleinsäu­ remoleküle zurückgehalten werden, über das zur Kondensierung der Nu­ kleinsäuren verwendete Fällungsmittel erfolgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch kennzeichnet, daß das Fällungsmittel Polyäthylenglykol oder Isopropanol bzw ein Gemisch aus beiden Substanzen ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch kennzeichnet, daß die zu isolierenden Nukleinsäuren Plasmide und/oder PCR-Produkte sind.