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CN115151652B - 用于酶促合成多核苷酸的方法和设备 - Google Patents

用于酶促合成多核苷酸的方法和设备 Download PDF

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CN115151652B CN202180016515.9A CN202180016515A CN115151652B CN 115151652 B CN115151652 B CN 115151652B CN 202180016515 A CN202180016515 A CN 202180016515A CN 115151652 B CN115151652 B CN 115151652B
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Abstract

本发明涉及使用具有序列依赖性偶联效率的无模板聚合酶在反应室阵列中平行酶促合成多核苷酸的方法和设备。每当在合成多核苷酸的生长链的3’端处出现引起低效率偶联的序列时，一个或多个无去保护步骤的另外的偶联循环被插入到合成计划中，以提供另外的时间来在多核苷酸的该位置处完成偶联反应。

Description

用于酶促合成多核苷酸的方法和设备
最近对多核苷酸合成的酶促方法的兴趣增加，这不仅是因为许多领域，如合成生物学、CRISPR-Cas9应用和高通量测序对合成多核苷酸的需求增加，而且还因为多核苷酸合成的化学方法的局限性，如产物长度的上限以及有机溶剂的使用和需要处置，Jensen等人,Biochemistry,57:1821-1832(2018)。酶促合成因其特异性和效率以及由于其使用消除了处理有害废物的需要的温和的水性反应条件而具有吸引力。
目前，大多数酶促方法采用无模板聚合酶将3’-O封闭的核苷三磷酸重复添加到连接至支持物的单链引发剂或延长链上，然后去封闭，直到获得所需序列的多核苷酸。然而，不幸的是，无模板聚合酶通常在其偶联产率上具有序列特异性的低效率。也就是说，在给定的一组反应条件和时间下，发生核苷酸偶联的生长链3’端处的序列可能会影响偶联效率。每当相同的反应时间用于所有反应室时，这使得在平行合成操作中难以或不可能获得一致的产物产率。
鉴于上述情况，如果可获得能够使由于序列特异性偶联低效导致的产物产量差异最小化的方法和设备，则使用无模板聚合酶平行合成多核苷酸将得到推进。
发明概述
本发明涉及用于在单独的反应室中平行合成多个多核苷酸的方法和装置，包括微流体装置。
更特别地，本发明涉及利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的方法，其中所述无模板聚合酶在一个或多个低效率基序处具有降低的偶联效率，所述方法包括以下步骤：(a)为所述多个核苷酸中的每个多核苷酸提供反应室，每个反应室具有设置在其中的连接有引发剂的合成支持物，其中每种引发剂具有游离的3’-羟基，并且其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述合成支持物并在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；(b)提供在操作上与所述反应室的出口关联的废物歧管，使得每当在所述反应室与所述废物歧管之间产生正压差时，从所述反应室中去除反应溶液；(c)对每个反应室重复以下反应步骤的循环，直到此类反应室的多核苷酸完成：(i)在偶联溶液中使所述引发剂或去保护的延长片段与3’-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶接触，使得通过所述3’-保护的核苷三磷酸延长引发剂或去保护的延长片段，以形成3’-保护的延长片段，(ii)利用去保护溶液对所述3’-保护的延长片段去保护，以及(iii)在所述反应室和所述废物歧管之间施加压差，以从所述反应室中去除溶液；其中通过所述反应室的多核苷酸序列确定在反应室中步骤(i)中接触的3’-保护的核苷三磷酸的种类，以及其中，每当在此类反应室的去保护的延长片段的3’端处存在低效率基序时，在每个循环之前，在反应室中进行步骤(i)的一个或多个短循环。如下文更完整解释的，效率基序是在延长片段的3’端处的序列区段，其导致无模板聚合酶在将核苷酸单体偶联至延长片段方面具有降低的效率。在一些实施方案中，无模板聚合酶包括末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。在采用本文公开的TdT的一些实施方案中，低效率基序包括选自包括CCA、CTA、GCA、GTA和CCT的集合的3-mer序列。在其他实施方案中，此类集合包括CCA和CTA。在其他实施方案中，鉴定了无模板聚合酶的低效率基序，例如，如下文所述，使得可以实施本发明的方法和设备。
本发明还涉及利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的设备，其中所述无模板聚合酶在一个或多个低效率基序处具有降低的偶联效率，所述设备包括：(a)多个反应室，每个反应室具有设置在其中的连接有引发剂的合成支持物，其中每种引发剂具有游离的3’-羟基，并且其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述合成支持物并在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；(b)废物歧管，其在操作上与所述反应室的出口关联，使得每当在所述反应室和所述废物歧管之间建立正压差时，反应溶液从所述反应室中去除并进入所述废物歧管；(c)流体输送系统，其用于将反应溶液输送至所述阵列的反应室中；(d)用户界面，其用于接受要合成的多核苷酸的核苷酸序列和低效率基序数据；(e)在操作上与所述用户界面、所述多个反应室、所述流体输送系统和所述废物歧管关联的控制系统，其中所述控制系统确定每个多核苷酸的每个低效率基序的数量和位置，并将每个多核苷酸分配至反应室以进行合成，并且其中对于每个反应室，直到其多核苷酸完成，所述控制系统指导以下重复步骤：(i)在偶联条件下，将偶联溶液输送至所述引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段，所述偶联溶液含有3’-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶，以允许通过所述3’-保护的核苷三磷酸延长引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段，来形成3’-保护的延长片段，(ii)向所述反应室输送去保护溶液，使得所述3’-保护的延长片段去保护，以及(iii)在所述反应室和所述废物歧管之间产生压差，以从所述反应室中去除偶联和/或去保护溶液；其中通过所述反应室的预定序列确定在反应室中步骤(i)中接触的3’-保护的核苷三磷酸的种类，以及其中，每当在此类反应室的去保护的延长片段的3’端处存在低效率基序时，在每个循环之前，在反应室中进行步骤(i)的一个或多个短循环。
如上，在本发明设备的一些实施方案中，无模板聚合酶包括末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。在采用本文公开的TdT的其他实施方案中，低效率基序包括选自包括CCA、CTA、GCA、GTA和CCT的集合的3-mer序列。在其他实施方案中，此类集合包括CCA和CTA。
本发明的设备特别适合于实施利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的方法，其中所述无模板聚合酶在本发明的一个或多个低效率基序处具有降低的偶联效率。本发明还涉及利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的试剂盒，其包含本发明的设备和3’-保护的核苷三磷酸和/或无模板聚合酶和/或偶联溶液和/或去保护溶液。
在许多所示的实施方式和应用中举例说明本发明的这些上文表征的方面以及其他方面，其中一些在附图中示出并且在随后的权利要求部分中表征。然而，以上概述并非旨在描述本发明的每个所示实施方案或每个实施方式。
附图的简要说明
图1示出了酶促合成多核苷酸的基本步骤。
图2A示出了反应孔的阵列，例如，每个反应孔具有用于去除反应流体的出口，并且为输送试剂的目的，每个是可寻址的。
图2B示出了可以在图2A的反应孔中平行合成的多核苷酸的给定选择，显示了针对每个多核苷酸而言低效率基序的出现，引起对于选定的无模板聚合酶，如TdT变体M27的困难偶联。
图2C示出了在所示低效率基序后“短”合成循环的插入，所述短循环为在此类低效率基序后偶联有效地提供了另外的时间。
图3A和3B显示了在3’-3-mer序列处对于不同TdT变体的相对偶联效率的数据。
图4示出了本发明的设备。
发明详述
本发明的一般原理在本文中更详细地公开，特别是通过实例的方式，如附图中所示和详细描述的那些。然而，应当理解，意图不是将本发明限制于所描述的特定实施方案。本发明适用于各种修改和替代形式，其细节针对若干实施方案示出。意图是涵盖落入本发明的原理和范围内的所有修改、等效物和替代物。
除非另有指示，否则本发明的实践可以采用有机化学、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学和生物化学的常规技术和描述，这些都在本领域的技术范围内。此类常规技术可包括但不限于制备和使用合成肽、合成多核苷酸、单克隆抗体、核酸克隆、扩增、测序和分析以及相关技术。此类常规技术的方案可以在来自制造商的产品资料和标准实验室手册，如Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I卷-第IV卷)；PCR Primer:ALaboratory Manual；和Molecular Cloning:A Laboratory Manual(均来自Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Lutz和Bornscheuer编,Protein Engineering Handbook(Wiley-VCH,2009)；Hermanson,Bioconjugate Techniques,第二版(Academic Press,2008)；以及类似参考文献中找到。
本发明涉及使用具有序列依赖性偶联效率的无模板聚合酶在反应室阵列中平行酶促合成多核苷酸的方法和设备。所述阵列的每个反应室具有入口和出口，并且与每个出口关联的是每当通过出口去除溶液时，用于将固体支持物，例如珠粒保持在反应室中的过滤器。在一些实施方案中，反应室的阵列是在操作上与允许通过在微孔和歧管之间施加压差从微孔同时去除反应溶液(例如，偶联溶液和/或去保护溶液)的废物歧管关联的微孔平面阵列。
给定的无模板聚合酶具有降低的偶联效率处的多核苷酸的序列片段在本文中称为聚合酶的“低效率基序”。每当低效率基序在生长链(或延长片段)的3’端处出现时，就会出现降低的偶联效率。此类降低的偶联效率可以通过当对于所有反应，偶联反应时间相同时，与在相同位置处不含有低效率基序的完成产物相比，完成产物中低效率基序3’端旁边的核苷酸缺失的增加来证实。图3A-3B中示出了对于两种末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体的现象。无模板聚合酶的偶联低效的程度可以广泛变化，使得本发明的实施取决于这种程度以及所需的最终产物的纯度和产率。在一些实施方案中，低效率基序被鉴定为3’-末端序列，与相同长度的所有3’-末端序列的平均偶联效率相比，其将偶联效率降低10％或更多。在其他实施方案中，低效率基序被鉴定为3’-末端序列，与相同长度的所有3’-末端序列的平均偶联效率相比，其将偶联效率降低了25％或更多。在其他实施方案中，低效率基序被鉴定为3’-末端序列，与相同长度的所有3’-末端序列的平均偶联效率相比，其将偶联效率降低50％或更多。
根据本发明的方法和设备，无模板聚合酶的低效率基序特征位于要合成的多个多核苷酸的每一个中。然后使用该信息将所谓的“短”偶联循环插入到每个多核苷酸的合成计划中，以便为在低效率基序处发生的反应提供额外的时间，同时不影响不涉及低效率基序的反应的偶联时间。如下文更全面描述的，多核苷酸的酶促合成中的常规循环(如图1所示)包括以下步骤：(i)将3’-O可逆封闭的核苷三磷酸与生长链(或第一个循环中的引发剂)的游离3’-OH偶联，(ii)对添加的核苷酸的3’-OH去封闭，和(iii)洗涤。短循环可包括多个步骤，但关键特征是它包括偶联步骤而没有任何去封闭步骤，从而允许在实施短循环的反应室中进一步积累与游离3’-OH基团的偶联。
本发明的设备包括流体输送系统，用于在程序控制下将反应溶液输送到反应室，从而使适当的反应溶液(例如“A”、“C”、“G”或“T”偶联试剂或溶液、洗涤溶液、去保护或去封闭溶液等)在适当的时间被输送到适当的反应室以产生所需序列的多核苷酸。在例如，通过用户界面输入多个多核苷酸序列而获得多个多核苷酸序列后，反应室被分配给每个多核苷酸，并且为每个多核苷酸确定常规和短循环的序列。该确定包括分析多核苷酸序列以鉴定低效率基序的数量和位置，以及(因此)针对多核苷酸的合成计划插入一个或多个短循环的位置。关于多核苷酸的术语“合成计划”意指用于合成此类多核苷酸的方法或设备中的常规和短循环的序列。假设的多核苷酸(SEQ ID NO:1)的合成计划示于图2C中。
常规和短循环都具有相同数量的具有相同持续时间的步骤。在任一类型循环中的每个步骤之后，反应溶液都经由它们的出口从所有反应室中去除。在一些实施方案中，常规和短循环仅在反应溶液去除之间在反应室中发生的活动方面不同。根据本发明的方法和设备，通过在反应室和在操作上与反应室阵列的出口关联的废物歧管之间产生压差，从反应室中除去反应溶液。在一些实施方案中，通过将废物歧管连接到真空源来产生这种压差，从而真空将液体从腔室中通过它们的过滤器和出口拉出并进入废物歧管的腔室中，并最终到达废物容器。
通常，低效率基序由1-5个核苷酸组成，并且更通常地，低效率基序由3个核苷酸组成。如下文更全面解释的，并且如图3A和3B所示，可以通过对在标准反应中使用这种聚合酶合成的多核苷酸产物的样品进行测序以及将与产物中的子序列(例如，3-mers)相邻的缺失制表来容易地确定给定的无模板聚合酶的低效率基序。该程序还提供了在生长链的3’端处给定长度的每个可能的序列区段处的偶联效率的测量。在获得该信息之后，选择一个或多个低效率基序(对应于低效率偶联)来实现本发明的方法和设备是本领域普通技术人员的设计选择；也就是说，在通过插入一个或多个短循环以提供另外的偶联时间来改善偶联效率之前，确定可以容忍多少偶联效率的降低是本领域普通技术人员的的设计选择。如图3A-3B所示，在一些实施方案中，对于给定的无模板聚合酶，可能存在一个或多个低效率基序。在其他实施方案中，给定的无模板聚合酶的不同低效率基序的数量范围可以为1到6。在其他实施方案中，给定的无模板聚合酶的不同低效率基序的数量可以是多个；并且在一些实施方案中，多个的范围可以为2到10；或2到6；或2到4。尽管不希望受理论或假设的束缚，但关于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或相关的无模板聚合酶，认为在一些实施方案中，在某些序列，尤其是3-mer序列处的偶联效率与聚合酶与生长链3’端的连接的稳定性成比例。也就是说，低效率偶联可能是由于TdT生长链复合物缺乏稳定性，因此可用于捕获单体以与生长链偶联的此类复合物较少。
本发明的方面在图2A-2C中示出。如图2A所示，在反应室(202)的平面阵列(200)中合成了一个以上的多核苷酸，其可以如图所示标记为S1至Sn。在一些实施方案中，每个多核苷酸在单独的反应室中合成。如图2B所示，在用户输入后，分析每个多核苷酸的序列以确定低效率基序(204)(在本实例中为CCA、CTA和GCA)的身份和位置以及它们的紧接3’的核苷酸。这决定了将短循环插入每个多核苷酸的合成计划的数量和位置。在一些实施方案中，在每个低效率基序(即，3’)之后插入一个或多个短循环。在一些实施方案中，插入的短循环的数量或类型可能取决于低效率基序。在一些实施方案中，在每个低效率基序之后插入单个短循环。如上所述，在一些实施方案中，常规和短循环都包括三个相同持续时间的步骤，并且在每个步骤之后(或作为每个步骤的一部分)，在反应室和废物歧管之间产生压差以从反应室去除反应溶液(如果有的话)。在一些实施方案中，这种压差是通过将废物歧管连接到常规真空源来产生的。通常在这些步骤之间施加真空10-30秒。常规循环可以表示如下：
常规循环的步骤
如上所示，偶联反应溶液(RS)保留在反应室中，并且在步骤(ii)中简单地将去封闭溶液添加到其中。在一些实施方案中，可以在偶联步骤之后和去保护步骤之前进行去除反应溶液的洗涤步骤。如上所述，短循环可具有下表所示的各种形式(其并非旨在为穷举性的)。
短循环的步骤(形式1)
短循环的步骤(形式2)
短循环的步骤(形式3)
短循环的步骤(形式4)
在特定实施方案中，可以在合成过程期间每个循环中或周期性地执行进一步的步骤。例如，不时地，如果出现酶积累，例如通过无模板聚合酶粘附到表面，如反应室壁、过滤器表面或孔，从而导致抑制流体转移的阻塞，可以采用蛋白酶处理的步骤。反应时间或持续时间t1、t2和t3可根据特定实施方案广泛变化，其中例如采用不同的无模板聚合酶、反应温度、反应缓冲液、单体、去保护溶液等。
对于假设的21-mer序列(220)(SEQ ID NO:1)，在图2C中示出了插入短循环的上述过程。对21-mer(220)的分析鉴定了两个低效率基序：CTA(222)和GCA(224)。多核苷酸的合成计划显示在下面的行中，其中常规循环由“(N)”表示，其中N＝A、C、G或T，短循环由“(n)”表示，其中n＝a、c、g或t，并且字母表示循环中添加的核苷酸的种类。由于低效率基序，在本实例中添加了两个短循环(226和228)，每个循环紧接在低效率基序之后或低效率基序的3’插入。选择是否插入一个、两个、三个或更多个短循环以及短循环的形式是本领域普通技术人员的设计选择，其至少部分取决于所采用的特定无模板聚合酶，且特别取决于低效率基序后偶联效率降低的幅度。其他因素可包括所采用的聚合酶的浓度或活性。
多种设备可以被构造或适用于执行本发明方法的步骤。在自动化化学合成和分析的文献中获得了针对此目的的广泛指导，例如Miertus等人,编辑,CombinatorialChemistry and Technologies:Methods and Applications,第二版(CRC Press,2005)；West等人,美国专利9103809；Butendeich等人,J.Laboratory Automation,18(3):245-250(2013)；Fluent Automated Workstations(Tecan Group)；Tisone等人,美国专利6063339；Cathcart等人,美国专利5443791；Ingenhoven等人,美国专利7529598；Glauser等人,美国专利8580197；Sindalar等人,Nucleic Acids Research,23(6):982-987(1995)；Cheng等人,Nucleic Acids Research,30(18):e93(2002)；Skold等人,美国专利5273718等。在一些实施方案中，本发明的设备可以部分地包括常规的流体输送机器人。在其他实施方案中，本发明的设备可以部分地包括喷墨流体输送系统。
在一些实施方案中，本发明的设备包括以下元件：(a)多个反应室，每个反应室具有入口和出口，其中出口在操作上与过滤膜或层关联，当反应溶液通过出口去除时，所述过滤膜或层允许固体支持物保留在反应室中，(b)废物歧管，其可连接到多个反应室，使得当连接时，每当在反应室和废物歧管之间产生压差时，就可从所有反应室中去除反应溶液，(c)流体输送系统，其用于在程序控制下将一种或多种反应溶液输送到多个反应室，(d)用户界面，其用于接受要合成的多核苷酸的核苷酸序列和低效率基序数据，以及(e)在操作上与用户界面、反应室的阵列、流体输送系统和废物歧管关联的控制系统，其用于(i)分析输入的核苷酸序列和低效率基序数据并确定合成计划，以及为每个多核苷酸分配反应室，以及(ii)用于控制流体输送系统、废物歧管和阵列，使得对于每个反应室，重复以下步骤直到其预定序列完成：(A)在偶联条件下将偶联溶液输送至引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段，所述偶联溶液含有3’-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶，以允许通过3’-保护的核苷三磷酸延长引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段，来形成3’-保护的延长片段，(B)将去保护溶液输送至反应室，使得3’-保护的延长片段去保护，以及(C)在反应室和废物歧管之间产生压差，以从反应室中去除去保护溶液；其中通过反应室的预定序列确定在反应室中在步骤(A)中接触的3’-保护的核苷三磷酸的种类，并且其中每当在此类反应室的去保护的延长片段的3’端处存在低效率基序时，在每个循环之前，在反应室中进行步骤(A)的一个或多个短循环。
在一些实施方案中，在完成多核苷酸的合成之后，可以进行进一步的步骤以从固体支持物上切割完成的多核苷酸并纯化它们以供应用。这些进一步的步骤可以在阵列的反应室中进行，或者仍然连接至固体支持物上的多核苷酸可以转移到其他反应容器中以进行这些进一步的步骤。另外，一些切割方法可导致释放的产物，其仍需要修饰才能将其转化为可用的产物。例如，在“核酸内切酶V-肌苷”中，切割(如下所述)会留下5’-磷酸，对于一些应用必须将其去除。因此，可能需要进一步的磷酸酶处理步骤。
图4示意性地示出了本发明设备的一个实施方案的元件。这些元件包括：(a)阵列(400)中的多个反应室(402)；(b)废物歧管(404)，其在操作上与阵列(400)的反应室(402)关联；(c)流体输送系统(406)，其用于在程序控制下将反应溶液输送至反应室(402)的；(d)用户界面(408)，其用于输入多核苷酸的核苷酸序列和低效率基序数据；以及(e)控制系统(410)，其(i)从用户界面(408)接收核苷酸序列和低效率基序数据，(ii)计算针对每个多核苷酸的合成计划，(iii)将多核苷酸分配至反应室(402)以进行合成，以及(iv)通过将命令发送至流体输送系统(406)、阵列(400)和废物歧管(404)的控制器控制反应溶液输送至单个反应室(402)和从单个反应室(402)去除。反应室(402)的阵列(400)可以是24孔、96孔、384孔、1536孔或类似形式的常规过滤板，例如可从商业制造商处获得，如Pall Corp.,PortWashington,NY。本发明可以采用这种过滤板的典型反应体积，例如对于96孔板为10-50μL，对于384孔板为3-10μL，对于1536孔板为0.5-3.0μL。废物歧管(404)可以包括在主体(414)中的腔室(412)，其密封地夹在阵列(400)上，使得当腔室(412)连接到真空源(416)时，真空被传送到阵列(400)中的所有单独的反应室(402)的出口，并且废物反应溶液被转移到废物容器(418)。阵列(400)可以与废物歧管(404)一起移动或单独移动。例如，可以通过使阵列(400)静止并且头部(420)相对于阵列(400)的表面在x、y和z方向上可移动来执行向反应室的流体输送，或者阵列(400)也可以是在x和y方向上可移动的，或者两个元件可以是在x和y方向上相对于彼此可移动的。头部(420)可以是其上安装有可能具有阀门和致动器的移液管、喷嘴或喷射口的框架。该框架又可以安装在机械臂、龙门导轨(gantry rail)或其他允许其在阵列(400)上可编程地平移以输送反应溶液的机械部件上。流体输送可以通过多种方法完成。在一些实施方案中，所需的合成规模是一个重要因素。对于少量的大量多核苷酸，流体输送可以通过喷墨方法或喷墨方法和总体流动，例如用于洗涤或一些去保护步骤的总体流动的组合来完成。对于例如范围为10至2000、或10至1000、或10至384的中等数量的多核苷酸，流体输送可通过范围为0.5μL至50μL或更多的移液体积来完成，并且可以采用常规的自动化实验室系统(如上文提及的)。在一些实施方案中，流体输送系统(406)包括一个或多个试剂储器(例如422a-422g)和可移动头部(420)。在一些实施方案中，流体输送系统还可以包括用于从反应室(402)抽吸反应溶液的子元件或甚至单独的头部。例如，在一些实施方案中，将连接至固体支持物的完成的多核苷酸转移到单独的反应室以用于切割和纯化可能是有利的。这可以通过从发生合成的每个反应室中吸出这样的反应溶液并将溶液沉积在单独阵列的单独反应室中来实现。在其他实施方案中，可以在使用切割溶液(422a)进行合成的反应室中进行从固体支持物切割完成的多核苷酸。
如所述，控制系统(410)向控制器发送信号(411)，其致动流体输送系统(406)、阵列(400)、废物歧管(404)和真空源(416)的元件和子元件，以便执行由控制系统(410)确定的合成计划。在一些实施方案中，控制系统(410)可以是运行常规仪器控制软件(例如LabVIEW,National Instruments,Austin,TX)的通用可编程计算机。
确定无模板聚合酶的低效率基序
作为生长链的3’端序列的函数的无模板聚合酶的核苷酸掺入的相对效率可通过对各自在标准反应中合成的随机序列产物的样品进行测序而容易地确定。然后根据紧邻的3’位置发生多少缺失，将所得序列的2-mer、3-mer、4-mer等制表。具有较高数量的缺失的2-mer、3-mer或4-mer序列是候选的低效率基序。作为示例性测试，可以通过无模板聚合酶，如TdT变体(例如以一式两份或一式三份)合成24个52-mer随机序列多核苷酸。24个52-mer可以如下选择：每个可能的4-mer在总共(24x52个有效序列长度)中以大约其预期频率即1/256，或约4或5次出现表示。(也就是说，具有4-mer的倾斜表示的随机序列，诸如例如，那些恰好缺少许多4-mer的随机序列被拒绝)。
TdT的示例性合成条件。在这本实例中，3’-O封闭的dNTP是3’-O-NH2-dNTP，但类似的反应条件也适用于其他可逆保护基团。在TY1x缓冲液0.01％吐温20中分别制备含有两倍浓缩的dNTP-ONH2(1mM)、DMSO(20％)和辅因子(4mM CoCl2)和两倍浓缩的突变体(32μM)的预混物。对于M59对比M27反应，在核苷酸预混物中添加2x吐温20。用M27和M59或M57在37℃下以一式两份合成24个序列(52mer)。延长时间设定为4min。使用500pmol的dI树脂(R133)和带有wwPTFE膜的过滤板(Pall Laboratory,New York)进行合成。TY1x缓冲液含有二甲胂酸钾200mM pH6.8、MgCl2 5mM。dI树脂R133是经由氨基官能与10T-dI-T初始DNA(引发剂DNA)偶联的CNBr琼脂糖树脂(GE Healthcare)，且接头为C12。与树脂连接的完整引发剂序列为5AmMC12/TTTTTTTTTT/dI/T。
合成后加工。合成后，进行第一次洗涤(1x 100μL/孔H2O、3x100μL/孔SDS/DTT、3x100μL/孔H2O)。在通过抽真空和以2000g离心板2min去除剩余液体后立即用TH1缓冲液1x或WLE1缓冲液1x进行3x 50μL洗涤。之后直接进行从树脂中去除合成链的切割。对于dI切割，将树脂与1μM EndoV一起在50μL反应体积(含有173mM NaCl和50mM MgCl2的10mM Tris,pH7.9或者含有50mM KCl和15mM MgCl2的10mM Tris,pH7.9)中在42℃，1250rpm下孵育30min，然后以2000g离心2min。将树脂用25μL TH1缓冲液1x或WLE1缓冲液1x洗涤，在42℃，1250rpm下再孵育2min，并再次以2000g离心2min。如果需要，将回收的滤液转移到96孔PCR板中并储存在-20℃下。最后，从每孔中收集不到75μL。TH1缓冲液含有10mM Tris、170mMNaCl、50MgCl2 pH8。WLE1缓冲液含有10mM Tris pH7.9、50mM KCl和15mM MgCl2。
DNA沉淀。每孔加入0.5μL糖原和NaAc(3M)pH 5.2(7.5μL)并短暂摇动。每孔加入75μL异丙醇，并在4℃下以3428g离心1h15。吸出上清液，且每孔只剩下20μL。每孔加入180μL新鲜制备的80％乙醇，并在4℃下以3428g离心30min。去除上清液并重复洗涤。离心后，每孔只剩下10μL，在Speedvac中于35℃下干燥30min。将干燥的DNA重悬于15μL水MB级中，然后测量浓度。
文库制备：使用Illumina 1 96rxns的Accel-NGS 1S Plus DNA文库试剂盒(ozymeSW10096)制备文库。使用Illumina的1S Plus索引试剂盒(ozyme SW16024)对文库进行索引。得到的序列数据可以以表格形式或图形显示，如图3A-3B所示，以快速鉴定低效率基序。
寡核苷酸的无模板酶促合成
通常，无模板(或等效地，“不依赖模板的”)酶促DNA合成的方法包括重复的步骤循环，如图1所示(对于所谓的“常规”循环)，在每个循环中，预定的核苷酸与引发剂或生长链偶联。以下参考文献中描述了无模板酶促合成的一般要素：Ybert等人,国际专利公开WO/2015/159023；Ybert等人,国际专利公开WO/2017/216472；Hyman,美国专利5436143；Hiatt等人,美国专利5763594；Jensen等人,Biochemistry,57:1821-1832(2018)；Mathews等人,Organic&Biomolecular Chemistry,DOI:0.1039/c6ob01371f(2016)；Schmitz等人,Organic Lett.,1(11):1729-1731(1999)。
提供了例如，连接到固体支持物(120)的具有游离3’-羟基(130)的引发剂多核苷酸(100)。固体支持物可以是平面固体表面，珠粒，如磁珠、琼脂糖珠等。在有效地将3’-O保护的dNTP酶促掺入到引发剂多核苷酸(100)(或延长的引发剂多核苷酸)的3’端的条件(140)下，向引发剂多核苷酸(100)(或后续循环中的延长的引发剂多核苷酸)添加3’-O保护的dNTP和无模板聚合酶，如TdT或其变体(例如Ybert等人,WO/2017/216472；Champion等人,WO2019/135007)。该反应产生延长的引发剂多核苷酸，其3’-羟基被保护(160)。如果延长的序列未完成，则实施另一添加循环(180)。如果延长的引发剂多核苷酸含有竞争序列，则可以去除或去保护3’-O保护基团，并且可以从原始引发剂多核苷酸(182)切割所需序列。这种切割可以使用多种单链切割技术中的任何一种来进行，例如，通过在原始引发剂多核苷酸内的预定位置处插入可切割的核苷酸。示例性的可切割核苷酸可以是被尿嘧啶DNA糖基化酶切割的尿嘧啶核苷酸。如果延长的引发剂多核苷酸不包含完整的序列，则去除3’-O保护基以暴露游离的3’-羟基(130)，并使延长的引发剂多核苷酸经历另一核苷酸添加和去保护循环。
如本文所用，“引发剂”(或等同术语，如“引发片段”、“引发剂核酸”、“引发剂寡核苷酸”等)通常是指在其末端具有游离3’-羟基的短寡核苷酸序列，其可以通过无模板聚合酶，如TdT进一步延长。在一个实施方案中，引发片段是DNA引发片段。在替代实施方案中，引发片段是RNA引发片段。在一些实施方案中，引发片段具有3-100个核苷酸，特别是3-20个核苷酸。在一些实施方案中，引发片段是单链的。在替代实施方案中，引发片段可以是双链的。在一些实施方案中，引发剂寡核苷酸可以通过其5’端连接至合成支持物；并且在其他实施方案中，引发剂寡核苷酸可以通过与直接连接至合成支持物的互补寡核苷酸形成双链体，例如，通过共价键而间接连接至合成支持物。在一些实施方案中，合成支持物是固体支持物，其可以是固体平面固体的离散区域，或者可以是珠粒。
在一些实施方案中，引发剂可以包括具有游离羟基的非核酸化合物，TdT可以将3’-O保护的dNTP偶联到该游离羟基上，例如Baiga,美国专利公开US2019/0078065和US2019/0078126。
合成完成后，可以通过切割从引发剂和固体支持物上释放具有所需核苷酸序列的多核苷酸。
为此目的可以使用多种可切割的连键或可切割的核苷酸。在一些实施方案中，切割所需多核苷酸在切割链上留下天然游离5’-羟基；然而，在替代实施方案中，切割步骤可留下部分，例如5’-磷酸，其可以在后续步骤中例如通过磷酸酶处理而去除。切割步骤可以以化学方法、热方法、酶促或通过光化学方法进行。在一些实施方案中，可切割的核苷酸可以是核苷酸类似物，如脱氧尿苷或8-氧代-脱氧鸟苷，它们被特定的糖基化酶(例如分别为尿嘧啶脱氧糖基化酶接着是核酸内切酶VIII和8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶)识别。在一些实施方案中，可以通过提供具有脱氧肌苷作为倒数第二个3’核苷酸的引发剂来完成切割，其可以在引发剂的3’端被核酸内切酶V切割，在释放的多核苷酸上留下5’-磷酸。用于切割单链多核苷酸的其他方法在以下参考文献中公开，这些参考文献通过引用并入：第5,739,386号、第5,700,642号和第5,830,655号美国专利；以及第2003/0186226号和第2004/0106728号美国专利公开；以及在Urdea和Horn的美国专利5367066中。
回到图1，在一些实施方案中，在每个合成步骤中，在3’-O保护的dNTP存在下，使用无模板聚合酶如TdT将有序序列的核苷酸偶联至引发剂核酸。在一些实施方案中，合成寡核苷酸的方法包括以下步骤：(a)提供具有游离3’-羟基的引发剂；(b)在3’-O保护的核苷三磷酸存在下，在延伸条件下使引发剂或具有游离3’-羟基的延伸中间物与无模板聚合酶反应，以产生3’-O保护的延伸中间物；(c)对延伸中间物去保护，以产生具有游离3’-羟基的延伸中间物；以及(d)重复步骤(b)和(c)，直到合成多核苷酸。(有时术语“延伸中间物”或“延长片段”或“生长链”可互换使用)。在一些实施方案中，引发剂提供为例如通过其5’端连接至固体支持物的寡核苷酸。上述方法还可以包括在反应或延伸步骤之后以及在去保护步骤之后的洗涤步骤。例如，反应步骤可以包括在预定的孵育期或反应时间之后例如通过洗涤去除未掺入的核苷三磷酸的子步骤。这种预定的孵育期或反应时间可以是几秒钟，例如30秒到几分钟，例如30min。
当合成支持物上的多核苷酸序列包括反向互补子序列时，可以通过在反向互补区之间形成氢键来产生二级分子内或分子间结构。在一些实施方案中，选择环外胺的碱基保护部分以使受保护氮的氢不能参与氢键合，从而防止此类二级结构的形成。也就是说，可以采用碱基保护部分来防止氢键的形成，如在正常碱基配对中形成的氢键，例如核苷A和T之间以及G和C之间。在合成结束时，可以去除碱基保护部分并且可以将多核苷酸产物从固体支持物上切割下来，例如，通过将其从其引发剂上切割下来。
除了提供具有碱基保护基团的3’-O封闭的dNTP单体外，延长反应还可以使用热稳定的无模板聚合酶在较高的温度下进行。例如，可以采用在高于40℃具有活性的热稳定的无模板聚合酶；或者，在一些实施方案中，可以采用在范围为40-85℃具有活性的热稳定的无模板聚合酶；或者，在一些实施方案中，可以采用在范围为40-65℃具有活性的热稳定的无模板聚合酶。
在一些实施方案中，延长条件可以包括向延长反应混合物中添加抑制氢键合或碱基堆积的溶剂。这样的溶剂包括具有低介电常数的水混溶性溶剂，如二甲亚砜(DMSO)、甲醇等。同样，在一些实施方案中，延长条件可包括提供离液剂，其包括但不限于正丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、2-丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、尿素等。在一些实施方案中，延长条件包括存在二级结构抑制量的DMSO。在一些实施方案中，延长条件可包括提供抑制二级结构形成的DNA结合蛋白，其中此类蛋白包括但不限于单链结合蛋白、解旋酶、DNA乙二醇酶等。
没有碱基保护的3’-O封闭的dNTP可以从商业供应商处购买或使用公开的技术合成，例如美国专利7057026；Guo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,105(27):9145-9150(2008)；Benner,美国专利7544794和8212020；国际专利公开WO2004/005667、WO91/06678；Canard等人,Gene(本文引用的)；Metzker等人,Nucleic Acids Research,22:4259-4267(1994)；Meng等人,J.Org.Chem.,14:3248-3252(3006)；美国专利公开2005/037991。可以按如下所述合成具有碱基保护的3’-O封闭的dNTP。
当采用碱基保护的dNTP时，图1的上述方法可以进一步包括去除碱基保护部分的步骤(e)，在酰基或脒保护基团的情况下，这可以(例如)包括用浓氨水处理。
上述方法还可包括在反应或延伸步骤之后以及在去保护步骤之后的加帽步骤以及洗涤步骤。如上文提及的，在一些实施方案中，可以包括加帽步骤，其中未延伸的游离3’-羟基与防止加帽链的任何进一步延伸的化合物反应。在一些实施方案中，此类化合物可以是双脱氧核苷三磷酸。在其他实施方案中，具有游离3’-羟基的非延伸链可以通过用3’-核酸外切酶活性，例如Exo I处理它们来降解。例如，参见Hyman，美国专利5436143。同样，在一些实施方案中，可以处理未能去封闭的链以去除链或使其对进一步延伸呈惰性。
在一些实施方案中，延长步骤(有时也称为延伸步骤或偶联步骤)的反应条件可以包括以下：2.0μM纯化的TdT；125-600μM 3’-O封闭的dNTP(例如3’-O-NH2封闭的dNTP)；约10至约500mM二甲胂酸钾缓冲液(6.5至7.5的pH)和约0.01至约10mM二价阳离子(例如CoC12或MnC12)，其中延长反应可在50μL反应体积中在范围为RT至45℃的温度下进行3分钟。在其中3’-O封闭的dNTP是3’-O-NH2封闭的dNTP的实施方案中，去封闭步骤的反应条件可以包括以下：700mM NaNO2；1M乙酸钠(用乙酸调节pH值在4.8-6.5范围内)，其中去封闭反应可以在50μL体积中在范围为RT至45℃的温度下进行30秒至数分钟。可以用不含偶联反应组分(例如酶、单体、二价阳离子)的二甲胂酸盐缓冲液进行洗涤。
取决于特定的应用，去封闭和/或切割的步骤可以包括多种化学或物理条件，例如光、热、pH、特定试剂的存在，如能够切割特定化学键的酶。选择3’-O封闭基团和相应的去封闭条件的指导可以在以下参考文献中找到，这些参考文献通过引用并入：Benner,美国专利7544794和8212020；美国专利5808045；美国专利8808988；国际专利公开WO91/06678；以及下文引用的参考文献。在一些实施方案中，切割剂(有时也称为去封闭剂或试剂)是化学切割剂，诸如例如二硫苏糖醇(DTT)。在替代实施方案中，切割剂可以是酶切割剂，诸如例如磷酸酶，其可以切割3’-磷酸封闭基团。本领域技术人员将理解，去封闭剂的选择取决于所使用的3’-核苷酸封闭基团的类型、是否使用一个或多个封闭基团、引发剂是否连接至活细胞或有机体或者连接至固体支持物等，其使得需要温和处理。例如，膦，如三(2-羧乙基)膦(TCEP)可用于切割3’O-叠氮基甲基，钯络合物可用于切割3’O-烯丙基，或者亚硝酸钠可用于切割3’O-氨基。在特定实施方案中，切割反应涉及TCEP、钯络合物或亚硝酸钠。
如上所述，在一些实施方案中，希望采用两个或更多个封闭基团，这些封闭基团可以使用正交去封闭条件来去除。以下示例性的封闭基对可用于平行合成实施方案中。应当理解，其他封闭基团对或含有多于两个的基团可获得而用于本发明的这些实施方案中。
3’-O-NH2 3’-O-叠氮基甲基
3’-O-NH2 3’-O-烯丙基
3’-O-NH2 3’-O-磷酸
3’-O-叠氮基甲基 3’-O-烯丙基
3’-O-叠氮基甲基 3’-O-磷酸
3’-O-烯丙基 3’-O-磷酸
在活细胞上合成寡核苷酸需要温和的去封闭或去保护条件，即不破坏细胞膜、不使蛋白质变性、不干扰关键细胞功能等的条件。在一些实施方案中，去保护条件在与细胞存活相容的生理条件范围内。在这样的实施方案中，酶促去保护是期望的，因为它可以在生理条件下进行。在一些实施方案中，特定的酶促可去除的封闭基团与特定的酶关联以用于它们的去除。例如，基于酯或酰基的封闭基团可以用酯酶如乙酰酯酶或类似酶去除，并且磷酸封闭基团可以用3’磷酸酶如T4多核苷酸激酶去除。例如，可以通过用100mM Tris-HCl(pH6.5)、10mM MgCl2、5mM 2-巯基乙醇和一个单位的T4多核苷酸激酶的溶液处理来去除3’-O-磷酸。反应在37℃的温度下进行一分钟。
“3’-磷酸封闭的”或“3’-磷酸保护的”核苷酸是指其中3’-位置处的羟基被含磷酸的部分的存在封闭的核苷酸。根据本发明的3’-磷酸封闭的核苷酸的实例是核苷酸基-3’-磷酸单酯/核苷酸基-2’,3’-环磷酸、核苷酸基-2’-磷酸单酯和核苷酸基-2’或3’-烷基磷酸二酯，以及核苷酸基2’或3’-焦磷酸。也可以使用硫代磷酸酯或此类化合物的其他类似物，条件是该取代不会阻止磷酸酶去磷酸化导致游离的3’-OH。
3’-O-酯保护的dNTP或3’-O-磷酸保护的dNTP的合成和酶促去保护的其他实例在以下参考文献中描述：Canard等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,92:10859-10863(1995)；Canard等人,Gene,148:1-6(1994)；Cameron等人,Biochemistry,16(23):5120-5126(1977)；Rasolonjatovo等人,Nucleosides&Nucleotides,18(4&5):1021-1022(1999)；Ferrero等人,Monatshefte fur Chemie,131:585-616(2000)；Taunton-Rigby等人,J.Org.Chem.,38(5):977-985(1973)；Uemura等人,Tetrahedron Lett.,30(29):3819-3820(1989)；Becker等人,J.Biol.Chem.,242(5):936-950(1967)；Tsien,国际专利公开WO1991/006678。
在一些实施方案中，修饰的核苷酸包含修饰的核苷酸或核苷分子，其包含嘌呤或嘧啶碱基和具有与其共价连接的可去除的3’-OH封闭基团的核糖或脱氧核糖糖部分，使得3’碳原子连接有一组结构：
-O-Z
其中–Z是–C(R’)2-O-R”、-C(R’)2-N(R”)2、-C(R’)2-N(H)R”、-C(R’)2-S-R”和–C(R’)2-F中的任一个，其中每个R”是可去除的保护基团或者是可去除的保护基团的一部分；每个R’独立地是氢原子、烷基、取代的烷基、芳基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酰基、氰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基或酰氨基，或通过连接基团连接的可检测标记物；条件是在一些实施方案中，此类取代基具有多达10个碳原子和/或多达5个氧或氮杂原子；或(R’)2表示一组式＝C(R”’)2，其中每个R”’可以相同或不同，并且选自氢和卤素原子以及烷基，条件是在一些实施方案中，每个R’”的烷基具有1-3个碳原子；并且其中所述分子可以反应以产生中间体，其中每个R”被交换为H，或者，其中Z是–(R’)2-F，F被交换为OH、SH或NH2，优选OH，所述中间体在水性条件下解离以得到具有游离3’-OH的分子；条件是其中Z是–C(R’)2-S-R”，两个R’基团都不是H。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的R’是烷基或取代的烷基，条件是这样的烷基或取代的烷基具有1-10个碳原子和0-4个氧或氮杂原子。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的-Z具有式–C(R’)2-N3。在某些实施方案中，Z是叠氮基甲基。
在一些实施方案中，Z是分子量为200或更小的具有或不具有杂原子的可切割有机部分。在其他实施方案中，Z是分子量为100或更小的具有或不具有杂原子的可切割有机部分。在其他实施方案中，Z是分子量为50或更小的具有或不具有杂原子的可切割有机部分。在一些实施方案中，Z是分子量为200或更小的具有或不具有杂原子的酶促可切割的有机部分。在其他实施方案中，Z是分子量为100或更小的具有或不具有杂原子的酶促可切割的有机部分。在其他实施方案中，Z是分子量为50或更小的具有或不具有杂原子的酶促可切割的有机部分。在其他实施方案中，Z是具有200或更小的分子量的酶促可切割的酯基团。在其他实施方案中，Z是被3’-磷酸酶可去除的磷酸基团。在一些实施方案中，以下3’-磷酸酶中的一种或多种可以与制造商推荐的方案一起使用：T4多核苷酸激酶、小牛肠碱性磷酸酶、重组虾碱性磷酸酶(例如可从New England Biolabs,Beverly,MA获得的)
在其他实施方案中，3’-封闭的核苷三磷酸被3’-O-叠氮基甲基、3’-O-NH2或3’-O-烯丙基封闭。
在其他实施方案中，本发明的3’-O封闭基团包括3’-O-甲基、3’-O-(2-硝基苄基)、3’-O-烯丙基、3’-O-胺、3’-O-叠氮基甲基、3’-O-叔丁氧基乙氧基、3’-O-(2-氰基乙基)和3’-O-炔丙基。
在一些实施方案中，3’-O保护基团是电化学不稳定的基团。也就是说，保护基团的去保护或切割是通过改变导致切割的保护基团附近的电化学条件来完成的。电化学条件的这种变化可以通过改变或施加物理量如电压差或光以激活辅助物质而引起，所述辅助物质继而会导致保护基团位点处电化学条件的变化，如pH升高或降低。在一些实施方案中，电化学不稳定的基团包括例如pH敏感保护基团，每当pH改变至预定值时切割所述pH敏感保护基团。在其他实施方案中，电化学不稳定的基团包括保护基团，每当例如通过增加或减少保护基团位点处的电压差改变还原或氧化条件时，直接切割所述保护基团。
在一些实施方案中，酶促合成方法采用TdT变体，相对于3’-O-修饰的核苷三磷酸，所述TdT变体显示增加的掺入活性。例如，这样的TdT变体可以使用Champion等人,美国专利10435676中描述的技术产生，该专利通过引用并入本文中。在一些实施方案中，采用TdT变体，其具有与SEQ ID NO:2至少60％相同的氨基酸序列以及在位置207处的第一个精氨酸的取代和在位置325处的第二个精氨酸的取代，或者其功能上等效的残基。在一些实施方案中，采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体，其具有与选自SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列，相对于SEQ ID NO2、3、4、6、7、9、12和13在位置207处，相对于SEQ ID NO 5在位置206处，相对于SEQ ID NO8和10在位置208处，相对于SEQ ID NO 11在位置205处，相对于SEQ ID NO 14在位置216处，以及相对于SEQ ID NO 15在位置210处具有精氨酸(“第一精氨酸”)的取代；以及相对于SEQ ID NO2、9和13在位置325处，相对于SEQ ID NO3和4在位置324处，相对于SEQ ID NO 320在位置320处，相对于SEQ ID NO6和8在位置331处，相对于SEQ ID NO 11在位置323处，相对于SEQ IDNO12和15在位置328处以及相对于SEQ ID NO 14在位置338处的精氨酸(“第二精氨酸”)的取代；或者其功能上等效的残基；其中所述TdT变体(i)能够在没有模板的情况下合成核酸片段，并且(ii)能够在核酸片段的游离3’-羟基上掺入3’-O修饰的核苷酸。在一些实施方案中，上述同一性值百分比为与所示SEQ ID NO至少80％相同；在一些实施方案中，上述同一性值百分比为与所示SEQ ID NO至少90％相同；在一些实施方案中，上述同一性值百分比为与所示SEQ ID NO至少95％相同；在一些实施方案中，上述同一性值百分比为至少97％相同；在一些实施方案中，上述同一性值百分比为至少98％相同；在一些实施方案中，上述同一性值百分比为至少99％相同。如本文所用，用于比较参考序列与变体序列的同一性值百分比不包括明确指定的含有变体序列取代的氨基酸位置；也就是说，同一性关系百分比是在参考蛋白质的序列和在变体中包含取代的明确指定位置之外的变体蛋白质的序列之间。因此，例如，如果参考序列和变体序列各自包含100个氨基酸并且变体序列在位置25和81处具有突变，那么同源性百分比将是关于序列1-24、26-80和82-100。
关于(ii)，此类3’-O修饰的核苷酸可以包含3’-O-NH2-核苷三磷酸、3’-O-叠氮基甲基-核苷三磷酸、3’-O-烯丙基-核苷三磷酸、3’O—(2-硝基苄基)-核苷三磷酸或3’-O-炔丙基-核苷三磷酸。
在一些实施方案中，上述TdT变体在第一和第二精氨酸处具有取代，如表1中所示。
表1
在一些实施方案中，用于本发明的方法和设备的其他TdT变体包括甲硫氨酸、半胱氨酸或谷氨酸的进一步取代中的一种或多种，如表1中所示。
可以在本发明的方法和设备中使用的其他特定TdT变体在表2中列出。表2的TdT变体DS1001至DS1018中的每一个包含与SEQ ID NO 2至少60％相同的氨基酸序列并且包括在指定位置处的取代。在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少80％相同的氨基酸序列并且包括在指定位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少90％相同的氨基酸序列并且包括在指定位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少95％相同的氨基酸序列并且包括在指定位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQID NO 2至少97％相同的氨基酸序列并且包括在指定位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少98％相同的氨基酸序列并且包括在指定位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少99％相同的氨基酸序列并且包括在指定位置处的取代。
表2
用于本发明方法的特定TdT变体
可用于本发明方法和设备的其他特定TdT变体包括与SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30至少90％相同(或至少95％相同)的氨基酸序列，其中SEQ ID No:16、17、18、19和20的氨基酸序列各自在位置4处被选自E、S、D和N的稳定化突变取代，并且其中所述TdT变体(i)能够在没有模板的情况下合成核酸片段，以及(ii)能够在多核苷酸的游离3’-羟基上掺入3’-O保护的核苷酸。在其他实施方案中，此类在位置4处的稳定化突变是E。
如上所述的本发明的TdT变体各自包含与经受指定取代存在的指定SEQ ID NO具有序列同一性百分比的氨基酸序列。在一些实施方案中，以这种方式描述的本发明的TdT变体与指定的SEQ ID NO之间的序列差异的数量和类型可能是由于取代、缺失和/或插入，并且取代、缺失和/或插入的氨基酸可以包括任何氨基酸。在一些实施方案中，此类缺失、取代和/或插入仅包括天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，取代仅包括保守的或同义的氨基酸变化，如Grantham,Science,185:862-864(1974)中所述。也就是说，氨基酸的取代只能发生在其同义氨基酸组的成员中。在一些实施方案中，可以采用的同义氨基酸组列于表3A中。
表3A
氨基酸的同义组I
在一些实施方案中，可以采用的同义氨基酸组列于表3B中。
表3B
氨基酸的同义组II
定义
除非本文另有具体定义，否则本文使用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准论文和教科书的那些，例如Kornberg和Baker,DNAReplication,第二版(W.H.Freeman,New York,1992)；Lehninger,Biochemistry,第二版(Worth Publishers,New York,1975)；Strachan和Read,Human Molecular Genetics,第二版(Wiley-Liss,New York,1999)。
关于两种或更多种不同TdT中的氨基酸位置的“功能上等效的”意指(i)各个位置处的氨基酸在TdT的活性中发挥相同的功能作用，并且(ii)氨基酸出现在各个TdT的氨基酸序列中的同源氨基酸位置处。基于序列比对和/或分子建模，可以鉴定两种或更多种不同TdT的氨基酸序列中位置上等效的或同源的氨基酸残基。在一些实施方案中，功能上等效的氨基酸位置属于在进化相关物种，例如，属、科等的TdT的氨基酸序列中保守的低效率基序。此类保守的低效率基序的实例描述于Motea等人,Biochim.Biophys.Acta.1804(5):1151-1166(2010)；Delarue等人,EMBO J.,21:427-439(2002)以及类似参考文献中。
可互换使用的“突变体”或“变体”是指来源于本文所述的天然或参考TdT多肽，并且在一个或多个位置处包含修饰或改变，即取代、插入和/或缺失的多肽。变体可以通过本领域熟知的各种技术获得。特别地，用于改变编码野生型蛋白质的DNA序列的技术的实例包括但不限于定点诱变、随机诱变、序列改组和合成寡核苷酸构建。诱变活性在于缺失、插入或取代蛋白质，或者在本发明的情况下聚合酶序列中的一个或几个氨基酸。以下术语用于指定取代：L238A表示参考或野生型序列的位置238处的氨基酸残基(亮氨酸，L)变为丙氨酸(A)。A132V/I/M表示亲本序列位置132处的氨基酸残基(丙氨酸，A)被下列氨基酸之一取代：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或蛋氨酸(M)。取代可以是保守或非保守取代。保守取代的实例位于以下组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。
“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换使用并且各自意指核苷酸单体的线性聚合物或其类似物。构成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过单体与单体相互作用的规则模式，如Watson-Crick类型的碱基配对、碱基堆叠、Hoogsteen或反向Hoogsteen类型的碱基配对等特异性结合天然多核苷酸。此类单体及其核苷间连键可以是天然存在的或可以是其类似物，例如天然存在的或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可以包括PNA、硫代磷酸酯核苷间连键、含有允许连接标记物如荧光团或半抗原的连接基团的碱基等。每当寡核苷酸或多核苷酸的使用需要酶促加工，如通过聚合酶延伸、通过连接酶连接等时，普通技术人员将理解在那些情况下寡核苷酸或多核苷酸将不包含在任何或一些位置处的核苷间连键的某些类似物、糖部分或碱基。多核苷酸的大小范围通常从一些单体单元开始，例如5-40，此时它们通常被称为“寡核苷酸”，到几千个单体单元。每当多核苷酸或寡核苷酸由字母序列(大写或小写)表示时，如“ATGCCTG”，应理解核苷酸从左到右按5’-3’的顺序排列，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，且“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷，除非另有说明或从上下文中显而易见。除非另有说明，否则术语和原子编号约定将遵循Kornberg和Baker,DNA Replication,第二版(W.H.Freeman,1992)或类似参考文献中公开的那些。通常多核苷酸包含通过磷酸二酯键连接的四种天然核苷(例如对于DNA为脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷，或对于RNA为它们的核糖对应物)；然而，它们也可以包含非天然核苷酸类似物，例如包括修饰的碱基、糖或核苷间连键。本领域技术人员清楚，酶对活性具有特定的寡核苷酸或多核苷酸底物要求，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，然后针对寡核苷酸或多核苷酸底物选择合适的组成完全在普通技术人员的知识范围内，尤其是在来自论文的指导下，如Sambrook等人,Molecular Cloning,第二版(ColdSpring Harbor Laboratory,New York,1989)和类似参考资料。同样，寡核苷酸和多核苷酸可以指单链形式或双链形式(即寡核苷酸或多核苷酸及其相应互补物的双链体)。从术语使用的上下文中普通技术人员将清楚旨在是哪种形式或是否为两种形式。
“序列同一性”是指两个序列，如两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间的匹配(例如，相同的氨基酸残基)的数量(或分数，通常表示为百分比)。序列同一性是通过在比对时比较序列来确定的，以使重叠和同一性最大化，同时使序列空位最小化。特别地，序列同一性可以使用许多数学全局或局部比对算法中的任何一种来确定，这取决于两个序列的长度。相似长度的序列优选使用全局比对算法(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch,1970)比对，所述全局比对算法在整个长度上最佳地比对序列，而基本上不同长度的序列优选使用局部比对算法(例如Smith和Waterman算法(Smith和Waterman,1981)或Altschul算法(Altschul等人,1997；Altschul等人,2005))进行比对。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可在互联网网站如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或ttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/上获得的公开可用的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，氨基酸序列同一性％值是指使用成对序列比对程序EMBOSS Needle生成的值，该程序使用Needleman-Wunsch算法创建两个序列的最佳全局比对，其中所有搜索参数都设置为默认值，即评分矩阵＝BLOSUM62，空位开头(Gap open)＝10，空位延长＝0.5，末端空位罚分＝错误，末端空位开头＝10和末端空位延长＝0.5。
“取代”意指一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代。优选地，术语“取代”是指一个氨基酸残基被选自以下的另一个氨基酸残基取代：天然存在的标准20个氨基酸残基、罕见天然存在的氨基酸残基(例如羟脯氨酸、羟赖氨酸、别羟基赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、别异亮氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、焦谷氨酰胺、氨基丁酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸)和非天然存在的氨基酸残基，通常是合成的，(例如环己基丙氨酸)。优选地，术语“取代”是指一个氨基酸残基被选自天然存在的标准20个氨基酸残基的另一氨基酸残基取代。符号“+”表示取代的组合。根据以下命名法，氨基酸在本文中通过它们的单字母或三字母代码表示：A：丙氨酸(Ala)；C：半胱氨酸(Cys)；D：天冬氨酸(Asp)；E：谷氨酸(Glu)；F：苯丙氨酸(Phe)；G：甘氨酸(Gly)；H：组氨酸(His)；I：异亮氨酸(Ile)；K：赖氨酸(Lys)；L：亮氨酸(Leu)；M：蛋氨酸(Met)；N：天冬酰胺(Asn)；P：脯氨酸(Pro)；Q：谷氨酰胺(Gln)；R：精氨酸(Arg)；S：丝氨酸(Ser)；T：苏氨酸(Thr)；V：缬氨酸(Val)；W：色氨酸(Trp)和Y：酪氨酸(Tyr)。
序列表
<110> DNA斯克瑞普特公司(DNA SCRIPT)
<120> 用于酶促合成多核苷酸的方法和设备
<130> B3213PC00
<150> EP20159227.6
<151> 2020-02-25
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 核苷酸
<400> 1
gtttcctaag ttgcatttgc g 21
<210> 2
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 截短的小鼠TdT
<400> 2
Asn Ser Ser Pro Ser Pro Val Pro Gly Ser Gln Asn Val Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Tyr Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Glu Gly Ser Cys Leu Ala Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Ser Ile Ile
85 90 95
Glu Gly Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Ala Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Lys Ile Gln Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Asn Arg
165 170 175
Pro Glu Ala Glu Ala Val Ser Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val Thr
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Met Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala
210 215 220
Thr Glu Asp Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe Trp
225 230 235 240
Lys Gln Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Phe Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Gly Arg Val His Ser
275 280 285
Glu Lys Ser Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Arg Thr
340 345 350
Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 3
<211> 380
<212> PRT
<213> 牛科动物(BOVINE)
<400> 3
Asp Tyr Ser Ala Thr Pro Asn Pro Gly Phe Gln Lys Thr Pro Pro Leu
1 5 10 15
Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Tyr Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Ser Glu Phe Lys Glu Asn Glu Val Ser Tyr Val Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser
130 135 140
Leu Ser Lys Ile Met Ser Asp Lys Thr Leu Lys Phe Thr Lys Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Ala Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu
225 230 235 240
Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu
245 250 255
Lys Phe Lys Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln
260 265 270
Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser
275 280 285
Lys Ser Asn Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp
290 295 300
Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp
305 310 315 320
Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Ile Arg Arg Tyr Ala Thr His
325 330 335
Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys
340 345 350
Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu
355 360 365
Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 4
<211> 380
<212> PRT
<213> 人类(HUMAN)
<400> 4
Asp Tyr Ser Asp Ser Thr Asn Pro Gly Pro Pro Lys Thr Pro Pro Ile
1 5 10 15
Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn Gln Ile Phe Thr Asp Ala Phe Asp Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Asp Ser Cys Val Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Ser Lys Val Lys Gly Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Lys Val Arg Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Arg Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Ser Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Met Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Thr Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Gln Lys Val Met Asn Leu Trp Glu
225 230 235 240
Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu
245 250 255
Lys Leu Arg Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln
260 265 270
Lys Cys Phe Leu Ile Phe Lys Leu Pro Arg Gln Arg Val Asp Ser Asp
275 280 285
Gln Ser Ser Trp Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp
290 295 300
Leu Val Leu Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp
305 310 315 320
Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His
325 330 335
Glu Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys
340 345 350
Arg Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu
355 360 365
Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 5
<211> 376
<212> PRT
<213> 鸡(CHICKEN)
<400> 5
Gln Tyr Pro Thr Leu Lys Thr Pro Glu Ser Glu Val Ser Ser Phe Thr
1 5 10 15
Ala Ser Lys Val Ser Gln Tyr Ser Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu Asn
20 25 30
Asn Cys Asn Lys Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Met Ala Glu Asn
35 40 45
Tyr Glu Phe Lys Glu Asn Glu Ile Phe Cys Leu Glu Phe Leu Arg Ala
50 55 60
Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Val Thr Arg Met Lys Asp
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Pro Cys Met Gly Asp Arg Val Arg Asp Val Ile Glu
85 90 95
Glu Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Arg Ala Lys Asp Val Leu Asn
100 105 110
Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Glu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val
115 120 125
Gly Val Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Leu Arg Thr Val
130 135 140
Glu Glu Val Lys Ala Asp Lys Thr Leu Lys Leu Ser Lys Met Gln Arg
145 150 155 160
Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ser Lys Ala
165 170 175
Glu Ala Asp Ala Val Ser Ser Ile Val Lys Asn Thr Val Cys Thr Phe
180 185 190
Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys
195 200 205
Lys Ile Gly His Asp Ile Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Gln Arg
210 215 220
Glu Asp Asp Glu Leu Leu His Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile
225 230 235 240
Ile Glu Ser Thr Phe Val Lys Glu Gln Ile Pro Ser Arg His Val Asp
245 250 255
Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Ala Ile Leu Lys Leu Tyr Gln
260 265 270
Pro Arg Val Asp Asn Ser Ser Tyr Asn Met Ser Lys Lys Cys Asp Met
275 280 285
Ala Glu Val Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Ile Thr
290 295 300
Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg
305 310 315 320
Gln Phe Gly Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met
325 330 335
Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Arg Lys Arg Val Phe Leu
340 345 350
Lys Ala Gly Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr
355 360 365
Val Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 6
<211> 387
<212> PRT
<213> 负鼠(POSSUM)
<400> 6
Ser Ala Asn Pro Asp Pro Thr Ala Gly Thr Leu Asn Ile Leu Pro Pro
1 5 10 15
Thr Thr Lys Thr Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Ile
20 25 30
Asn Asn His Asn Gln Arg Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Lys
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Lys Glu Asn Asp Asp Thr Cys Leu Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ile Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Glu Val Val Ser Leu Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Leu Pro Trp Ile Gly Asp Glu Val Lys Gly Ile Met
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Gln Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ala Asp Lys Trp Tyr Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Asn Lys Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Lys Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Leu Cys Tyr Tyr Glu Asp Leu Ile Asp Cys Val Ser Lys
165 170 175
Ala Glu Ala Asp Ala Val Ser Leu Leu Val Gln Asp Ala Val Trp Thr
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Glu Phe Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ala
210 215 220
Glu Lys Glu Gln Glu Asp Gln Leu Leu Gln Lys Val Thr Asn Leu Trp
225 230 235 240
Lys Lys Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Ile Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Asp Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Ile Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Tyr His His Lys Glu Asp Lys
275 280 285
Arg Lys Trp Glu Met Pro Thr Gly Ser Asn Glu Ser Glu Ala Lys Ser
290 295 300
Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Asp Arg Tyr
305 310 315 320
Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Ser Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp
325 330 335
Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys Lys Met Met Leu Asp Asn His
340 345 350
Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile Phe Leu Lys Ala Lys Ser Glu
355 360 365
Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Glu Tyr Ile Gln Pro Ser Glu
370 375 380
Arg Asn Ala
385
<210> 7
<211> 381
<212> PRT
<213> 地鼠(SHREW)
<400> 7
Asp Cys Pro Ala Ser His Asp Ser Ser Pro Gln Lys Thr Glu Ser Ala
1 5 10 15
Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ser Tyr Val Thr Tyr Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Ser Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Ala Asp Lys Val Lys Cys Val Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Leu Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Gly Ile Met Asn Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr His Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Ile Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Val Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala
210 215 220
Thr Glu Glu Gln Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Ile Thr Phe Trp
225 230 235 240
Glu Lys Glu Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Tyr Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Met Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Glu Cys Val Asp Asp
275 280 285
Gly Thr Ser Ser Gln Leu Gln Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Pro Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
340 345 350
Lys Arg Lys Phe Leu Ser Ala Asp Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 8
<211> 387
<212> PRT
<213> 巨蟒(PYTHON)
<400> 8
Glu Lys Tyr Gln Leu Pro Glu Asp Glu Asp Arg Ser Val Thr Ser Asp
1 5 10 15
Leu Asp Arg Asp Ser Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr
20 25 30
Leu Lys Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala
35 40 45
Glu Asn Tyr Glu Phe Asn Glu Asn Lys Gly Phe Cys Thr Ala Phe Arg
50 55 60
Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Thr Ile Val Gln Val
65 70 75 80
His Asp Ile Glu Gly Val Pro Trp Met Gly Lys Gln Val Lys Gly Ile
85 90 95
Ile Glu Asp Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Lys Val Lys Ala Val
100 105 110
Leu Asp Asn Glu Asn Tyr Arg Ser Val Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe
115 120 125
Gly Val Gly Leu Lys Thr Ser Asp Lys Trp Tyr Arg Met Gly Leu Arg
130 135 140
Thr Leu Glu Glu Val Lys Arg Asp Lys Asn Leu Lys Leu Thr Arg Met
145 150 155 160
Gln Lys Ala Gly Phe Leu His Tyr Asp Asp Leu Thr Ser Cys Val Ser
165 170 175
Lys Ala Glu Ala Asp Ala Ala Ser Leu Ile Val Gln Asp Val Val Trp
180 185 190
Lys Ile Val Pro Asn Ala Ile Val Thr Ile Ala Gly Gly Phe Arg Arg
195 200 205
Gly Lys Gln Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Val Pro Gly
210 215 220
Ser Lys Gln Glu Glu Glu Glu Leu Leu His Thr Val Ile Asp Ile Trp
225 230 235 240
Lys Lys Gln Glu Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Ile Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Asp Thr Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Ala Ile Leu Lys Val His Lys Glu Arg Glu Asp Lys
275 280 285
Gly Asn Ser Ile Arg Ser Lys Ala Phe Ser Glu Glu Glu Ile Lys Asp
290 295 300
Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Val Val Pro Phe Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Thr Gln Phe Glu Arg Asp
325 330 335
Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys Lys Met Met Leu Asp Asn His
340 345 350
Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile Phe Leu Asn Ala Ala Ser Glu
355 360 365
Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Leu Glu Pro Trp Glu
370 375 380
Arg Asn Ala
385
<210> 9
<211> 381
<212> PRT
<213> 狗(DOG)
<400> 9
Asp Tyr Thr Ala Ser Pro Asn Pro Glu Leu Gln Lys Thr Leu Pro Val
1 5 10 15
Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Tyr Asn Asn Val Phe Thr Asp Ala Phe Glu Val Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Arg Glu Asn Glu Val Phe Ser Leu Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Gln Val Lys Cys Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Lys Ile Lys Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Pro Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Gly Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Met Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Thr Asp Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp
225 230 235 240
Glu Arg Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Gly
275 280 285
Gly Lys Cys Ser Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Ser
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
340 345 350
Lys Lys Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 10
<211> 382
<212> PRT
<213> 截短的鼹鼠(TRUNC MOLE)
<400> 10
Gly Asp Cys Pro Ala Ser His Asp Ser Ser Pro Gln Lys Thr Glu Ser
1 5 10 15
Ala Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr
20 25 30
Leu Asn Asn His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala
35 40 45
Glu Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ser Tyr Val Thr Tyr Met
50 55 60
Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Ser Ile Ile Ser Met
65 70 75 80
Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Ala Asp Lys Val Lys Cys Val
85 90 95
Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val
100 105 110
Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe
115 120 125
Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Leu Gly Phe Arg
130 135 140
Thr Leu Ser Gly Ile Met Asn Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr His Met
145 150 155 160
Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr
165 170 175
Arg Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp
180 185 190
Ala Phe Leu Pro Asp Ala Ile Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg
195 200 205
Gly Lys Lys Val Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu
210 215 220
Ala Thr Glu Glu Gln Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Ile Thr Phe
225 230 235 240
Trp Glu Lys Glu Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Tyr Glu Ser Thr
245 250 255
Phe Glu Lys Leu Lys Met Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His
260 265 270
Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Glu Cys Val Asp
275 280 285
Asp Gly Thr Ser Ser Gln Leu Gln Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg
290 295 300
Val Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala Leu Leu
305 310 315 320
Gly Trp Thr Gly Ser Pro Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala
325 330 335
Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys
340 345 350
Thr Lys Arg Lys Phe Leu Ser Ala Asp Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala
355 360 365
His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 11
<211> 379
<212> PRT
<213> PIKA TRUNK
<400> 11
Glu Tyr Ser Ala Asn Pro Ser Pro Gly Pro Gln Ala Thr Pro Ala Val
1 5 10 15
Tyr Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn
20 25 30
His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Tyr
35 40 45
Glu Phe Lys Glu Asn Glu Gly Cys Tyr Val Thr Tyr Met Arg Ala Ala
50 55 60
Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Val Ser Met Lys Asp Thr
65 70 75 80
Glu Gly Ile Pro Cys Leu Glu Asp Lys Val Lys Ser Ile Met Glu Glu
85 90 95
Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Ser Asp
100 105 110
Glu Arg Tyr Gln Cys Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly
115 120 125
Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser Leu Ser
130 135 140
Asn Ile Arg Leu Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala
145 150 155 160
Gly Phe Arg Tyr Tyr Glu Asp Ile Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu
165 170 175
Ala Glu Ala Val Asp Val Leu Val Asn Glu Ala Val Arg Ala Phe Leu
180 185 190
Pro Asp Ala Phe Ile Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys
195 200 205
Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Leu Thr Glu
210 215 220
Glu Asp Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Met Asn Leu Trp Glu Lys
225 230 235 240
Lys Gly Leu Leu Leu Tyr His Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys
245 250 255
Leu Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys
260 265 270
Cys Phe Leu Ile Phe Lys Leu Tyr His Glu Arg Val Gly Gly Asp Arg
275 280 285
Cys Arg Gln Pro Glu Gly Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu
290 295 300
Val Met Cys Pro Tyr Glu Cys His Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr
305 310 315 320
Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Ser His Glu
325 330 335
Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg
340 345 350
Val Phe Leu Gln Ala Glu Asn Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly
355 360 365
Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 12
<211> 384
<212> PRT
<213> 截短的刺猬(TRUNC HEDGEHOG)
<400> 12
Asp Ala Ser Phe Gly Ser Asn Pro Gly Ser Gln Asn Thr Pro Pro Leu
1 5 10 15
Ala Ile Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Ser Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn His Glu Phe Arg Glu Asn Glu Val Ser Cys Val Ala Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Lys Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Ala Lys Cys Val Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Ile Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Asn Lys Ile Met Ser Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Arg Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ala Lys
165 170 175
Ala Glu Ala Asp Ala Val Ser Val Leu Val Gln Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Met Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Leu Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ala
210 215 220
Thr Glu Glu Glu Glu Gln Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Phe Trp
225 230 235 240
Glu Arg Lys Gly Leu Leu Leu Tyr His Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Leu Gln His Val Asn Gly
275 280 285
Val Gly Asn Ser Lys Thr Gly Gln Gln Glu Gly Lys Asn Trp Lys Ala
290 295 300
Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala
305 310 315 320
Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg
325 330 335
Phe Ala Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr
340 345 350
Asp Lys Thr Lys Arg Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile
355 360 365
Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Asp Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 13
<211> 381
<212> PRT
<213> 树鼩(TREE SHREW)
<400> 13
Asp His Ser Thr Ser Pro Ser Pro Gly Pro Gln Lys Thr Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn Arg Val Phe Thr Asp Ala Phe Glu Thr Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Arg Glu Asn Glu Asp Ser Ser Val Ile Phe Leu Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Arg Ser Leu Pro Phe Thr Ile Thr Ser Met Arg
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Leu Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Val Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Asn Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Lys Ser Leu His Leu Thr Arg Met Gln
145 150 155 160
Gln Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ala Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Gly Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Thr Glu Glu Lys Glu Glu Glu Leu Leu Gln Lys Val Leu Asn Leu Trp
225 230 235 240
Glu Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Thr Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Pro Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Gly
275 280 285
Asp Lys Pro Ser Gln Gln Glu Gly Lys Ser Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg His Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
340 345 350
Lys Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 14
<211> 394
<212> PRT
<213> 鸭嘴兽(PLATYPUS)
<400> 14
Leu Thr Asn Ser Ala Pro Ile Asn Cys Met Thr Glu Thr Pro Ser Leu
1 5 10 15
Ala Thr Lys Gln Val Ser Gln Tyr Ala Cys Glu Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn Gln Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Lys
35 40 45
Asp Phe Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ile Cys Leu Ala Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ile Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Thr Ile Val Arg Met Lys
65 70 75 80
Asp Ile Glu Gly Val Pro Trp Leu Gly Asp Gln Val Lys Ser Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Ser Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Arg Ser Phe Gln Leu Phe Asn Ser Val Phe Glu
115 120 125
Val Gly Leu Thr Asp Asn Gly Glu Asn Gly Ile Ala Arg Gly Phe Gln
130 135 140
Thr Leu Asn Glu Val Ile Thr Asp Glu Asn Ile Ser Leu Thr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Leu Ser Thr Ser Leu Trp Asn Tyr Leu Pro Gly Phe Leu Tyr Tyr
165 170 175
Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ala Lys Glu Glu Ala Asp Ala Val Tyr
180 185 190
Leu Ile Val Lys Glu Ala Val Arg Ala Phe Leu Pro Glu Ala Leu Val
195 200 205
Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Ile Gly His Asp Val
210 215 220
Asp Phe Leu Ile Ser Asp Pro Glu Ser Gly Gln Asp Glu Gln Leu Leu
225 230 235 240
Pro Asn Ile Ile Lys Leu Trp Glu Lys Gln Glu Leu Leu Leu Tyr Tyr
245 250 255
Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Thr Lys Ile Pro Ser Arg Lys
260 265 270
Val Asp Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu
275 280 285
His His Gln Lys Val Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Pro Pro Pro Glu Ser
290 295 300
Lys Asn His Glu Ala Lys Asn Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
305 310 315 320
Met Cys Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
325 330 335
Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys
340 345 350
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile
355 360 365
Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Thr His Leu Gly Leu
370 375 380
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
385 390
<210> 15
<211> 384
<212> PRT
<213> 跳鼠(JERBOA)
<400> 15
Ser Ser Glu Leu Glu Leu Leu Asp Val Ser Trp Leu Ile Glu Cys Met
1 5 10 15
Gly Ala Gly Lys Pro Val Glu Met Thr Gly Arg His Gln Leu Val Lys
20 25 30
Gln Thr Phe Cys Leu Pro Gly Phe Ile Leu Gln Asp Ala Phe Asp Ile
35 40 45
Leu Ala Glu Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Ala Ser Cys Val Glu
50 55 60
Phe Met Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Ile
65 70 75 80
Ser Val Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Trp Leu Gly Gly Lys Val Lys
85 90 95
Cys Val Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys
100 105 110
Ala Leu Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser
115 120 125
Val Phe Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Arg Trp Phe Arg Met Gly
130 135 140
Phe Arg Thr Leu Ser Thr Val Lys Leu Asp Lys Ser Leu Thr Phe Thr
145 150 155 160
Arg Met Gln Lys Ala Gly Phe Leu His Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys
165 170 175
Val Thr Arg Ala Glu Ala Glu Ala Val Ser Val Leu Val Gln Gln Ala
180 185 190
Val Val Ala Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Ser Met Thr Gly Gly Phe
195 200 205
Arg Arg Gly Lys Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser
210 215 220
Pro Glu Ala Thr Glu Glu Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr
225 230 235 240
Asn Phe Trp Glu Gln Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp His Val Glu
245 250 255
Ser Thr Phe Glu Lys Cys Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu
260 265 270
Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Tyr Arg Glu Arg
275 280 285
Val Asp Ser Val Lys Ser Ser Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala
290 295 300
Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala
305 310 315 320
Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg
325 330 335
Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met Arg Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr
340 345 350
Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile
355 360 365
Phe Ala His Leu Gly Leu Glu Tyr Ile Glu Pro Leu Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 16
<211> 362
<212> PRT
<213> 截短的小鼠(Truncated mouse)
<400> 16
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ala Glu Arg Val Asn Arg Pro Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Ile Arg Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val Thr Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Met Thr
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala Thr Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe Trp Lys Gln Gln
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe
225 230 235 240
Lys Gln Pro Ser Arg Thr Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Pro Arg Val His Ser Val Lys Ser
260 265 270
Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val
325 330 335
Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 17
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 牛科动物-小鼠嵌合体(没有His标签&接头的M57)
<400> 17
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
325 330 335
Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 18
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 牛科动物-小鼠嵌合体(没有His标签和接头的M59)
<400> 18
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ala Glu Arg Val Asn Arg Pro Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Ile Arg Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val Thr Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Met Thr
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
325 330 335
Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 19
<211> 361
<212> PRT
<213> 小鼠(mouse)
<400> 19
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ala Glu Arg Val Asn Arg Pro Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Ile Arg Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val Thr Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Met Thr
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
325 330 335
Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 20
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> M54
<400> 20
Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Ile Phe Thr Arg Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Ser Glu
20 25 30
Phe Lys Glu Asn Glu Glu Ser Tyr Val Thr Phe Arg Arg Ala Ala Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Gln Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Lys Phe Thr Lys Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Ala Phe Phe Asn Arg Asp Ile Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
325 330 335
Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Arg Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 21
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 没有His标签的M77
<400> 21
Lys Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn
1 5 10 15
Tyr Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp
20 25 30
Glu Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser
35 40 45
Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr
50 55 60
Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu
65 70 75 80
Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp
85 90 95
Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly
100 105 110
Arg Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu
115 120 125
Lys Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala
130 135 140
Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu
145 150 155 160
Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu
165 170 175
Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys
180 185 190
Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu
195 200 205
Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys
210 215 220
Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe
225 230 235 240
Lys Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser
260 265 270
Asn Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
275 280 285
Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
290 295 300
Ser Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg
305 310 315 320
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val
325 330 335
Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu
340 345 350
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 22
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 具有His标签的M77
<400> 22
Met Ala Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Glu Lys
1 5 10 15
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
20 25 30
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
35 40 45
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
50 55 60
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
65 70 75 80
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
85 90 95
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
100 105 110
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
115 120 125
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
130 135 140
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
145 150 155 160
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala
165 170 175
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
180 185 190
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
195 200 205
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
210 215 220
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
225 230 235 240
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
245 250 255
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
260 265 270
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
275 280 285
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
290 295 300
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
305 310 315 320
Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
325 330 335
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
355 360 365
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 23
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 没有His标签的C1-40
<400> 23
Lys Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu
20 25 30
Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser
35 40 45
Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu
50 55 60
Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu
85 90 95
Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg
100 105 110
Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys
115 120 125
Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly
130 135 140
Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro
165 170 175
Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp
195 200 205
Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly
210 215 220
Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys
225 230 235 240
Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe
245 250 255
Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met
275 280 285
Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser
290 295 300
Pro Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys
305 310 315 320
Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe
325 330 335
Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp
340 345 350
Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
355 360
<210> 24
<211> 376
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 具有His标签的C1-40
<400> 24
Met Ala Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Glu Lys
1 5 10 15
Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr Asn
20 25 30
Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu Phe
35 40 45
Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala Ser Ser Val
50 55 60
Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu Gly
65 70 75 80
Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu Glu Ile Ile
85 90 95
Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu Arg
100 105 110
Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Arg Lys
115 120 125
Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Glu Lys Ile
130 135 140
Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly Phe
145 150 155 160
Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala Glu Ala Glu
165 170 175
Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe Leu Pro Asp
180 185 190
Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys Lys Ile Gly
195 200 205
His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser Ala Glu Asp Glu
210 215 220
Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu Lys Lys Gly Leu
225 230 235 240
Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys Leu
245 250 255
Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu
260 265 270
Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser Lys Ser Asn Gln
275 280 285
Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys
290 295 300
Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Pro
305 310 315 320
Gln Phe Asn Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met
325 330 335
Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe Leu
340 345 350
Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr
355 360 365
Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 25
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 没有His标签的A2-20
<400> 25
Val Thr Thr Val Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn
1 5 10 15
Asn Tyr Asn Glu Leu Phe Thr Arg Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn
20 25 30
Asp Glu Phe Arg Glu Asn Glu Glu Ser Arg Asp Ala Phe Arg Arg Ala
35 40 45
Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp
50 55 60
Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Arg Ile Ile Glu
65 70 75 80
Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Asn
85 90 95
Asp Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val
100 105 110
Gly Arg Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu
115 120 125
Glu Lys Ile Arg Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys
130 135 140
Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Gly Val Thr Arg Ala
145 150 155 160
Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala Phe
165 170 175
Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Leu Gly Lys
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355 360 365
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370 375

Claims (11)

1.利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的方法，其中所述无模板聚合酶在一个或多个低效率基序处具有降低的偶联效率，所述方法包括以下步骤：
(a)为所述多个核苷酸中的每个多核苷酸提供反应室，每个反应室具有设置在其中的连接有引发剂的合成支持物，其中每种引发剂具有游离的3’-羟基，并且其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述合成支持物并在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；
(b)提供在操作上与所述反应室的出口关联的废物歧管，使得每当在所述反应室与所述废物歧管之间产生正压差时，从所述反应室中去除反应溶液；
(c)对每个反应室重复以下反应步骤的循环，直到此类反应室的多核苷酸完成：(i)在偶联溶液中使所述引发剂或去保护的延长片段与3’-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶接触，使得通过所述3’-保护的核苷三磷酸延长引发剂或去保护的延长片段，以形成3’-保护的延长片段，(ii)利用去保护溶液对所述3’-保护的延长片段去保护，以及(iii)在所述反应室和所述废物歧管之间施加压差，以从所述反应室中去除反应溶液；
其中通过所述反应室的多核苷酸序列确定在反应室中步骤(i)中接触的3’-保护的核苷三磷酸的种类，以及
其中，每当在此类反应室的去保护的延长片段的3’端处存在低效率基序时，在每个循环之前，在反应室中进行步骤(i)的一个或多个短循环。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述循环和所述短循环具有相同的持续时间。
3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括从所述合成支持物切割所述多核苷酸的步骤。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述无模板聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述低效率基序是CCA、CTA、GCA、GTA或CCT。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述TdT是具有与SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30至少90％相同的氨基酸序列的TdT变体，其中SEQ IDNo:16、17、18、19和20的氨基酸序列各自具有取代Q4E/S/D/N，并且其中所述TdT变体(i)能够在没有模板的情况下合成核酸片段，以及(ii)能够在多核苷酸的游离的3’-羟基上掺入3’-O保护的核苷酸。
7.利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的设备，其中所述无模板聚合酶在一个或多个低效率基序处具有降低的偶联效率，所述设备包括：
(a)多个反应室，每个反应室具有设置在其中的连接有引发剂的合成支持物，其中每种引发剂具有游离的3’-羟基，并且其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述合成支持物并在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；
(b)废物歧管，其在操作上与所述反应室的出口关联，使得每当在所述反应室和所述废物歧管之间建立正压差时，反应溶液从所述反应室中去除并进入所述废物歧管；
(c)流体输送系统，其用于将反应溶液输送至所述阵列的反应室中；
(d)用户界面，其用于接受要合成的多核苷酸的核苷酸序列和低效率基序数据；
(e)在操作上与所述用户界面、所述反应室的阵列、所述流体输送系统和所述废物歧管关联的控制系统，其中所述控制系统确定每个多核苷酸的每个低效率基序的数量和位置，并将每个多核苷酸分配至反应室以进行合成，并且其中对于每个反应室，直到其多核苷酸完成，所述控制系统指导以下重复步骤：(i)在偶联条件下，将偶联溶液输送至所述引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段，所述偶联溶液含有3’-保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶，以允许通过所述3’-保护的核苷三磷酸延长引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段，来形成3’-保护的延长片段，(ii)向所述反应室输送去保护溶液，使得所述3’-保护的延长片段去保护，以及(iii)在所述反应室和所述废物歧管之间产生压差，以从所述反应室中去除去保护溶液；
其中通过所述反应室的预定序列确定在反应室中步骤(i)中接触的3’-保护的核苷三磷酸的种类，以及
其中，每当在此类反应室的去保护的延长片段的3’端处存在低效率基序时，在每个循环之前，在反应室中进行步骤(i)的一个或多个短循环。
8.如权利要求7所述的设备，其中所述无模板聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。
9.如权利要求7所述的设备，其中所述低效率基序是CCA、CTA、GCA、GTA或CCT。
10.权利要求7所述的设备用于实施权利要求1-6中任一项所述的利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的方法的用途。
11.利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求7所述的设备和3’-保护的核苷三磷酸和/或一种或多种无模板聚合酶和/或偶联溶液和/或去保护溶液。
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