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KR102421818B1 - 펜 내 분석들을 위한 방법들, 시스템들 및 키트들 - Google Patents

펜 내 분석들을 위한 방법들, 시스템들 및 키트들 Download PDF

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KR102421818B1
KR102421818B1 KR1020187033059A KR20187033059A KR102421818B1 KR 102421818 B1 KR102421818 B1 KR 102421818B1 KR 1020187033059 A KR1020187033059 A KR 1020187033059A KR 20187033059 A KR20187033059 A KR 20187033059A KR 102421818 B1 KR102421818 B1 KR 102421818B1
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매튜 이 파울러
필립 제이 엠 엘름스
케빈 디 라우터백
주니어 랜덜 디 로우
지안 공
제이 테너 네빌
강 에프 왕
그레고리 지 라비유
존 에이 테니
아타반 카루나카란
아누팜 싱할
이-종 린
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버클리 라잇츠, 인크.
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Abstract

분석의 결과들을 검출하는 방법들, 시스템들 및 키트들이 본원에서 설명된다. 특히, 본 개시물의 방법들, 시스템들 및 디바이스들은 미세유체 디바이스에서의 피분석물의 양을 정량화하기 위해 리포터 분자와 관심 피분석물의 확산 레이트들 사이의 차이에 의존한다. 피분석물은 생물학적 마이크로-객체의 분비된 생성물일 수도 있다.

Description

펜 내 분석들을 위한 방법들, 시스템들 및 키트들
본 출원은 2016년 4월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 제 62/323,500호, 및 2016년 7월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 제 62/364,568호의 35 U.S.C. 119(e) 하에서의 이점을 주장하는 정규 출원이며, 이들 개시물들의 각각은 전체적으로 참조로 본원에 포함된다.
본원에서 개시되는 실시형태들은 일반적으로, 정의된 영역 내에 한정된 마이크로-객체의 양 또는 품질 파라미터를 광학적으로 측정하는 시스템들, 장치들 및 방법들에 관한 것이다.
좀더 구체적으로, 미세유체 어셈블리 내 챔버에 한정된 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 정확하게 결정할 수 있는 이미징 시스템들 또는 방법들이 요구되고 있다.
일 양태에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템이 제공된다. 시스템은 이미지 획득 유닛을 포함할 수 있다. 이미지 획득 유닛은 미세유체 디바이스를 고정할 수 있는 미세유체 디바이스 홀더를 포함할 수 있으며, 여기서, 미세유체 디바이스는 흐름 영역 및 흐름 영역에 유체 흐름 가능하게 연결된 복수의 격리 펜들을 포함한다. 복수의 격리 펜들의 각각은 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 유지할 수 있다. 이미지 획득 유닛은 미세유체 디바이스의 복수의 격리 펜들 및 흐름 영역의 하나 이상의 분석 이미지들을 캡쳐하도록 구성된 이미징 엘리먼트를 더 포함할 수 있다. 시스템은 이미지 획득 유닛에 통신가능하게 접속된 이미지 프로세싱 유닛을 더 포함할 수 있다. 이미지 프로세싱 유닛은 각각의 캡쳐된 분석 이미지를 수신하고 분석 이미지에 묘사된 각각의 격리 펜에 대한 관심 영역을 정의하도록 구성된 관심 영역 결정 엔진을 포함할 수 있다. 관심 영역은 피분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 피분석물 변동들이 측정될 때 격리 펜에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며, 그리고 격리 펜과 흐름 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는, 격리 펜 내 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함할 수 있다. 이미지 프로세싱 유닛은 각각의 격리 펜의 관심 영역 내 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하여, 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 구성된 스코어링 엔진 (scoring engine) 을 더 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 방법이 제공된다. 본 방법은 흐름 영역 및 흐름 영역에 유체 흐름 가능하게 연결된 복수의 격리 펜들을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미징 데이터를 수신하는 스텝을 포함할 수 있다. 이미징 데이터는 피분석물 분석 이미지, 및 배경 잡음 이미지 및 신호 참조 이미지 중 하나 또는 양자를 포함할 수 있다. 본 방법은 각각의 격리 펜에 대한 관심 영역을 정의하는 단계를 더 포함할 수 있다. 관심 영역은 피분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 피분석물 변동들이 측정될 때 격리 펜에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하고, 그리고 격리 펜과 흐름 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는, 격리 펜 내 이미지 영역을 포함할 수 있다. 본 방법은 심지어, 각각의 격리 펜에 대한 관심 영역의 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석함으로써 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 컴퓨터로 하여금 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 이미지 프로세싱 방법을 수행하게 하는 프로그램이 저장되는 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체가 제공된다. 상기 방법은 흐름 영역 및 흐름 영역에 유체 흐름 가능하게 연결된 복수의 격리 펜들을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미징 데이터를 수신하는 단계를 포함할 수 있다. 이미징 데이터는 피분석물 분석 이미지, 및 배경 잡음 이미지 및 신호 참조 이미지 중 하나 또는 양자를 포함할 수 있다. 본 방법은 각각의 격리 펜에 대한 관심 영역을 정의하는 단계를 더 포함할 수 있다. 관심 영역은 피분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 피분석물 변동들이 측정될 때 격리 펜에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하고, 그리고 격리 펜과 흐름 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는, 격리 펜 내 이미지 영역을 포함할 수 있다. 본 방법은 심지어, 각각의 격리 펜에 대한 관심 영역의 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석함으로써 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법이 제공되며, 본 방법은, 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 격리 펜으로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 흐름 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 격리 펜은 흐름 영역에 유체 연결되며, 그리고, 격리 펜은 제 1 유체 매질을 포함하는, 상기 도입하는 단계; 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군으로 하여금 피분석물을 격리 펜 내 제 1 유체 매질로 분비하게 하는 단계; 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 매질은 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 그리고, 각각의 리포터 분자는 분비된 피분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 도입하는 단계; 복수의 리포터 분자들의 부분으로 하여금 격리 펜으로 확산하게 하여 그 안에 분비된 피분석물에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 리포터 분자: 분비된 피분석물 (RMSA) 착체들을 발생시키는 단계; 및 미세유체 디바이스 내 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계로서, 관심 영역은 격리 펜의 적어도 일부분을 포함하는, 상기 검출하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 클론주 개발의 방법이 제공되며, 본 방법은, 개개의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 복수의 격리 펜들의 각각으로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 흐름 영역을 가지는 인클로저를 더 포함하며, 그리고 복수의 격리 펜들의 각각은 흐름 영역에 유체 연결되며 제 1 유체 매질을 포함하는, 상기 미세유체 디바이스의 복수의 격리 펜들의 각각으로 도입하는 단계; 각각의 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군으로 하여금, 피분석물을 대응하는 격리 펜에 포함된 제 1 유체 매질로 분비하게 하는 단계; 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 매질은 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 리포터 분자는 분비된 피분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 흐름 영역으로 도입하는 단계; 복수의 리포터 분자들의 부분으로 하여금 복수의 각각의 격리 펜으로 확산하게 하여 그 안에 분비된 피분석물의 적어도 일부분에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 격리 펜들의 각각에서 복수의 리포터 분자:분비된 피분석물 (RMSA) 착체들을 발생시키는 단계; 복수의 각각의 격리 펜에 대해, 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도를 검출하는 단계로서, 관심 영역은 대응하는 격리 펜의 적어도 일부분을 포함하며, 그리고 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 적어도 일부분은 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출되는, 상기 신호의 강도를 검출하는 단계; 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 검출된 신호 강도에 기초하여, 복수의 각각의 격리 펜에 대해, 스코어를 결정하는 단계; 복수의 격리 펜들로부터 격리 펜들의 세트를 선택하는 단계로서, 상기 세트의 각각의 격리 펜은 그 안에 포함된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 클론 개체군이 상위 피분석물 생산자임을 표시하는 스코어를 가지는, 상기 격리 펜들의 세트를 선택하는 단계; 선택된 격리 펜들의 세트의 각각의 격리 펜 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 미세유체 디바이스로부터 배출시키는 단계; 대응하는 반응 용기들에서 선택된 격리 펜들의 세트의 각각의 격리 펜으로부터의 배출된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 증식시키는 단계; 및 각각의 대응하는 반응 용기에서 분비된 피분석물의 레벨을 결정하고, 이에 의해 각각의 생물학적 마이크로-객체 또는 클론 개체군에 대한 분비의 레벨을 결정하는 단계를 포함한다.
여전히, 다른 양태에서, 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 피분석물의 분비 레벨들의 평가를 위한 키트가 제공되며, 상기 키트는, 흐름 영역을 가지는 인클로저; 및 격리 펜을 포함하는 미세유체 디바이스로서, 격리 펜은 흐름 영역에 유체 연결되며, 그리고 흐름 영역 및 격리 펜은 유체 매질을 포함하도록 구성되는, 상기 미세유체 디바이스; 및 검출가능한 라벨 및 피분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분을 포함하는 리포터 분자를 포함한다.
본원에서 개시된 원리들, 및 그의 이점들의 더 완전한 이해를 위해, 첨부 도면들을 함께 인용한, 다음 설명들을 참조한다.
도 1a 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스 및 연관된 제어 장비와 함께 사용을 위한 시스템의 일 예를 예시한다.
도 1b 및 도 1c 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스를 예시한다.
도 2a 및 도 2b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 분리 펜들을 예시한다.
도 2c 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 상세한 격리 펜을 예시한다.
도 2d 내지 도 2f 는 본 개시물의 어떤 다른 실시형태들에 따른, 격리 펜들을 예시한다.
도 2g 는 본 개시물의 일 실시형태에 따른, 미세유체 디바이스를 예시한다.
도 2h 는 본 개시물의 일 실시형태에 따른, 미세유체 디바이스의 코팅된 표면을 예시한다.
도 3a 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스 및 연관된 제어 장비와 함께 사용을 위한 시스템의 구체적인 예를 예시한다.
도 3b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 이미징 디바이스를 예시한다.
도 4a 내지 도 4c 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 분석의 그래픽 표현들이다.
도 5a 내지 도 5c 는 본 개시물의 어떤 다른 실시형태들에 따른, 분석의 그래픽 예시들이다.
도 6 은 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 챔버 내에서의 확산 특성들의 개략도이다.
도 7a 및 도 7b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 분자들의 계산된 확산 레이트들의 그래픽 표현들이다.
도 8a 및 도 8b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 계산되어 실험적으로 확인된 분자들의 확산 레이트들의 그래픽 표현들이다.
도 9a 및 도 9b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 챔버 내에서의 확산 특성들의 그래픽 표현이다.
도 10a 및 도 10b 는 본 개시물의 어떤 다른 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 챔버 내에서의 확산 특성들의 그래픽 표현이다.
도 11a 및 도 11b 는 본 개시물의 또 다른 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 챔버 내에서의 확산 특성들의 그래픽 표현이다.
도 12a 내지 도 12c 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 챔버 및 생물학적 마이크로-객체로부터의 생성물의 분비의 레벨들을 평가하기 위한 관심 영역 내에서의 확산 특성들의 그래픽 및 사진 표현들이다.
도 13a 및 도 13b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 정규화 전후 미세유체 디바이스의 사진 이미지들을 나타낸다.
도 14a 내지 도 14c 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스 내 분석 이미지들 및 그의 관심 영역에 대한 분석 데이터의 그래픽 및 사진 표현들이다.
도 15 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스 내 복수의 챔버들에 대한 중간 강도 값들의 오버레이의 그래픽 표현이다.
도 16a 및 도 16b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스 내에 배치된 생물학적 마이크로-객체들에 의한 피분석물 분비의 그래픽 표현들이다.
도 17 은 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 격리들 펜들에 존재하는 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비되는 피분석물의 양을 정량화하기 위해 수행되는 스텝들을 예시한다.
도 18 은 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비되는 피분석물의 양을 나타내는 절대 또는 상대 값을 계산하기 위해 수행되는 스텝들의 시퀀스를 예시한다.
도 19 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 세포들의 클론 개체군에 의해 분비되는 피분석물의 양을 나타내는 절대 또는 상대 값을 평가하기 위해 수행되는 스텝들을 예시한다.
도 20 은 본 개시물의 일부 실시형태들에 따라서 발생된 적정 곡선의 그래픽 표현이다.
도 21 은 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 펜 식별 및 분석 스코어들을 포함하는 미세유체 디바이스의 부분의 정규화된 분석 이미지의 사진 표현이다.
도 22 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 배양 및 분석 시퀀스의 진행의 사진 및 그래픽 표현이다.
도 23a 및 도 23b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 모든 챔버들에 대한 분석 값들의 그래픽 표현이다.
도 24 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 선택된 챔버들에서의 클론 개체군들 및 개별 스케일 업된 클론 개체군에 대한 분석 값들 사이의 상관 관계의 그래픽 표현이다.
도 25 는 다양한 실시형태들에 따른, 컴퓨터 시스템을 예시하는 블록도이다.
도 26 은 다양한 실시형태들에 따른, 피분석물의 양을 평가하는 시스템의 개략도이다.
도 27 은 다양한 실시형태들에 따른, 피분석물의 양을 평가하는 시스템의 개략도이다.
도 28 은 다양한 실시형태들에 따른, 마이크로-유체 디바이스의 챔버의 단면도이다.
도 29 및 도 30 은 다양한 실시형태들에 따른, 피분석물의 양을 결정하는 방법을 나타내는 예시적인 플로우차트들이다.
도면들은 반드시 축척대로 도시되는 것은 아니며 도면들 내 물체들이 반드시 서로에 대해 축척대로 도시되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 도면들은 본원에서 개시된 장치들, 시스템들, 및 방법들의 다양한 실시형태들에 대한 명료성 및 이해를 주도록 의도된 묘사들이다. 가능한 경우에는 언제나, 동일한 또는 유사한 부재들을 지칭하기 위해서 동일한 참조 번호들이 도면들 전반에 걸쳐서 사용된다. 더욱이, 도면들은 어떤 방법으로든 본 교시들의 범위를 한정하도록 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서는 본 개시물의 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들을 기술한다. 그러나, 본 개시물은, 이들 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들에, 또는 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들이 동작하거나 또는 본원에서 설명되는 방법에 한정되지 않는다. 더욱이, 도면들은 단순화된 또는 부분 도들을 나타낼 수도 있으며, 도면들에서의 엘리먼트들의 치수들은 확대되거나 또는 아니면 비율대로 확대되지 않을 수도 있다. 게다가, 용어들 "상에 (on)", "에 부착된", "에 연결된", "에 커플링된", 또는 유사한 용어들이 본원에서 사용될 때, 하나의 엘리먼트 (예컨대, 물질, 층, 기판, 등) 는 하나의 엘리먼트가 바로 다른 엘리먼트 상에 있거나, 그에 부착되거나, 그에 연결되거나, 또는 그에 커플링되든지 또는 하나의 엘리먼트와 다른 엘리먼트 사이에 하나 이상의 간섭하는 엘리먼트들이 존재하든지에 관계없이 다른 엘리먼트 "상에", "그에 부착되거나", "그에 연결되거나", 또는 "그에 커플링될" 수 있다. 또한, 문맥에 달리 명시되지 않는 한, 방향들 (예컨대, 위에 (above), 아래에 (below), 상부 (top), 저부 (bottom), 측면 (side), 위로 (up), 아래로 (down), 아래에 (under), 가로질러 (over), 상부의 (upper), 하부의 (lower), 수평, 수직, "x", "y", "z", 등) 은, 제공되는 경우, 상대적이며, 단지 일 예로서, 예시 및 설명의 용이를 위해 비한정적으로 제공된다. 게다가, 엘리먼트들 (예컨대, 엘리먼트들 a, b, c) 의 리스트에 대해 참조가 이루어지는 경우, 이러한 참조는 리스트된 엘리먼트들 단독, 모든 리스트된 엘리먼트들 미만의 임의의 조합, 및/또는 리스트된 엘리먼트들의 모두의 조합 중 하나를 포함하도록 의도된다. 명세서에서의 섹션 분할들은 단지 검토의 용이성을 위한 것이며 설명되는 엘리먼트들의 임의의 조합을 한정하지 않는다.
미세유체 피쳐들의 치수들은 폭 또는 면적을 갖는 것으로 설명되는 경우, 치수는 일반적으로, 미세유체 디바이스의 기판 및/또는 커버에 평행한 평면 내에 놓인, x-축 및/또는 y-축 치수에 대해 설명된다. 미세유체 피쳐의 높이는 미세유체 디바이스의 기판 및/또는 커버에 평행한 평면에 수직한 z-축 방향에 대해 설명될 수도 있다. 일부의 경우, 채널 또는 통로와 같은, 미세유체 피쳐의 단면적은 x-축/z-축, y-축/z-축, 또는 x-축/y-축 영역을 기준으로 할 수도 있다.
본원에서 사용될 때, "실질적으로" 는 의도된 목적에 따라 작용하기에 충분하다는 것을 의미한다. 용어 "실질적으로" 는 따라서 예컨대, 당업자에 의해 예상되지만 전체 성능에 눈에 띄게 영향을 미치지 않을, 절대적 또는 완전한 상태, 치수, 측정치, 결과, 또는 기타 등등으로부터의 작은, 중요하지 않은 변동들을 허용한다. 수치 값들, 또는 수치 값들로서 표현될 수 있는 파라미터들 또는 특성들에 대해 사용될 때, "실질적으로" 는 10 퍼센트 이내를 의미한다.
용어 "하나들 (ones)" 는 하나 보다 많은 것을 의미한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "복수" 는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상일 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "배치된 (disposed)" 은 그의 의미 내에 "위치된" 을 포괄한다.
본원에서 사용될 때, "미세유체 디바이스" 또는 "미세유체 장치" 는 유체를 유지하도록 구성된 하나 이상의 별개의 미세유체 회로들을 포함하는 디바이스이며, 각각의 미세유체 회로는 영역(들), 유동 통로(들), 채널(들), 챔버(들), 및/또는 펜(들), 및 유체 (그리고, 옵션적으로, 유체 내에 현탁된 마이크로-객체들) 로 하여금 미세유체 디바이스로 유동시키거나 및/또는 그로부터 유동되도록 구성된 적어도 하나의 포트를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 유체 상호연결된 회로 엘리먼트들을 포함한다. 일반적으로, 미세유체 디바이스의 미세유체 회로는 미세유체 채널 및 적어도 하나의 챔버를 포함할 수도 있는 흐름 영역을 포함할 것이며, 그리고, 약 1 mL 미만, 예컨대, 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 μL 미만의 유체의 체적을 유지할 것이다. 어떤 실시형태들에서, 미세유체 회로는 약 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-5, 2-8, 2-10, 2-12, 2-15, 2-20, 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 10-50, 10-75, 10-100, 20-100, 20-150, 20-200, 50-200, 50-250, 또는 50-300 μL 를 유지한다. 미세유체 회로는 미세유체 디바이스에서의 제 1 포트 (예컨대, 입구) 와 유체 흐름 가능하게 연결된 제 1 단부, 및 미세유체 디바이스에서의 제 2 포트 (예컨대, 출구) 와 유체 흐름 가능하게 연결된 제 2 단부를 갖도록 구성될 수도 있다.
본원에서 사용될 때, "나노유체 디바이스" 또는 "나노유체 장치" 는 약 1 μL 미만, 예컨대, 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 nL 또는 그 이하의 미만인 유체의 체적을 유지하도록 구성된 적어도 하나의 회로 엘리먼트를 포함하는 미세유체 회로를 가지는 미세유체 디바이스의 유형이다. 나노유체 디바이스는 복수의 회로 엘리먼트들 (예컨대, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000 개, 또는 그 이상) 을 포함할 수도 있다. 어떤 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트들 중 하나 이상 (예컨대, 모두) 는 약 100 pL 내지 1 nL, 100 pL 내지 2 nL, 100 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 2 nL, 250 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 5 nL, 500 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 10 nL, 750 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 20 nL, 1 내지 10 nL, 1 내지 15 nL, 1 내지 20 nL, 1 내지 25 nL, 또는 1 내지 50 nL 의 유체의 체적을 유지하도록 구성된다. 다른 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트들 중 하나 이상 (예컨대, 모두) 은 약 20 nL 내지 200nL, 100 내지 200 nL, 100 내지 300 nL, 100 내지 400 nL, 100 내지 500 nL, 200 내지 300 nL, 200 내지 400 nL, 200 내지 500 nL, 200 내지 600 nL, 200 내지 700 nL, 250 내지 400 nL, 250 내지 500 nL, 250 내지 600 nL, 또는 250 내지 750 nL 의 유체의 체적을 유지하도록 구성된다.
미세유체 디바이스 또는 나노유체 디바이스는 본원에서 "미세유체 칩" 또는 "칩"; 또는 "나노유체 칩" 또는 "칩" 으로서 지칭될 수도 있다.
"미세유체 채널" 또는 "유동 채널" 은 본원에서 사용될 때 수평 치수 및 수직 치수 양쪽보다 현저하게 더 긴 길이를 가지는 미세유체 디바이스의 흐름 영역을 지칭한다. 예를 들어, 유동 채널은 수평 또는 수직 치수의 적어도 5 배의 길이, 예컨대, 적어도 10 배의 길이, 적어도 25 배의 길이, 적어도 100 배의 길이, 적어도 200 배의 길이, 적어도 500 배의 길이, 적어도 1,000 배의 길이, 적어도 5,000 배의 길이, 또는 더 긴 길이일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 유동 채널의 길이는 그 사이의 임의의 값을 포함하여, 약 100,000 마이크론 내지 약 500,000 마이크론이다. 일부 실시형태들에서, 수평 치수는 약 100 마이크론 내지 약 1000 마이크론 (예컨대, 약 150 마이크론 내지 약 500 마이크론) 이며, 수직 치수는 약 25 마이크론 내지 약 200 마이크론 (예컨대, 약 40 마이크론 내지 약 150 마이크론이다. 유동 채널이 미세유체 디바이스에서 다양한 상이한 공간 구성들을 가질 수도 있으며 따라서 완전한 선형 엘리먼트에만 제한되지 않는다는 점에 유의한다. 예를 들어, 유동 채널은 다음 구성들: 곡선, 굴곡, 나선, 오름 경사, 내리막 경사, 포크 (예컨대, 다수의 상이한 유동 통로들), 및 이들의 임의의 조합을 가지는 하나 이상의 섹션들일 수도 있거나 또는 포함할 수도 있다. 게다가, 유동 채널은 그의 경로를 따라서 상이한 단면적들을 가질 수도 있으며, 그 내부에 원하는 유체 유동을 제공하기 위해 넓어지거나 수축될 수도 있다. 유동 채널은 밸브들을 포함할 수도 있으며, 밸브들은 마이크로 유체공학의 분야에 공지된 임의의 유형일 수도 있다. 밸브들을 포함하는 미세유체 채널들의 예들은 미국 특허들 제 6,408,878호 및 제 9,227,200호에 개시되어 있으며, 이들의 각각은 본원에서 전체적으로 참고로 포함된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "장애물 (obstruction)" 은 일반적으로, 미세유체 디바이스에서의 2개의 상이한 영역들 또는 회로 엘리먼트들 사이의 목표 마이크로-객체들의 이동을 부분적으로 방해하기에 (그러나, 완전히 방해하지 않기에) 충분히 큰, 범프 또는 유사한 유형의 구조를 지칭한다. 2개의 상이한 영역들/회로 엘리먼트들은 예를 들어, 미세유체 격리 펜의 접속 영역 및 고립 영역일 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "수축" 은 일반적으로 미세유체 디바이스에서의 회로 엘리먼트 (또는, 2개의 회로 엘리먼트들 사이의 인터페이스) 의 폭의 좁힘 (narrowing) 을 지칭한다. 수축은 예를 들어, 본 개시물의 미세유체 격리 펜의 고립 영역과 접속 영역 사이의 인터페이스에 위치될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "투명" 은 가시 광선이 통과함에 따라 그 광을 실질적으로 변경시키지 않고 통과시키는 물질을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "마이크로-객체" 는 일반적으로, 본 개시물에 따라서 분리되거나 및/또는 조작될 수도 있는 임의의 미시적 (microscopic) 오브젝트를 지칭한다. 마이크로-객체들의 비한정적인 예들은, 무생물 마이크로-객체들, 예컨대 극미립자들; 마이크로비드들 (예컨대, 폴리스티렌 비드들, Luminex™ 비드들, 또는 기타 등등); 자기 비드들; 마이크로로드들; 와이크로와이어들; 양자 도트들, 및 기타 등등; 생물학적 마이크로-객체들, 예컨대 세포들; 생물학적 세포소기관들; 소포들, 또는 착체들; 합성 소포들; (예컨대, 합성 또는 멤버레인 표본들로부터 유래된) 리포솜들; 지질 나노래프트들, 및 기타 등등; 또는 무생물 마이크로-객체들과 생물학적 마이크로-객체들의 조합 (예컨대, 세포들에 부착된 마이크로비드들, 리포솜-코팅된 마이크로-비드들, 리포솜-코팅된 자기 비드들, 또는 기타 등등) 을 포함한다. 비드들은 분석에 이용가능한 형광 라벨들, 단백질들, 탄수화물들, 항원들, 작은 분자 시그널링 모이어티들, 또는 다른 화학적/생물학적 종과 같은, 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 부착된 모이어티들/분자들을 포함할 수도 있다. 지질 나노래프트들은 예를 들어, Methods Enzymol., (2009), 464:211-231, Ritchie 등, "Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs" 에 설명되어 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "세포" 는 용어 "생물학적 세포" 와 상호교환가능하게 사용된다. 생물학적 세포들의 비한정적인 예들은, 진핵 세포들, 식물 세포들, 동물 세포들, 예컨대 포유동물 세포들, 파충류 세포들, 조류 세포들, 물고기 세포들, 또는 기타 등등, 원핵 세포들, 박테리아 세포들, 곰팡이 세포들, 원생동물 세포들, 또는 기타 등등, 조직으로부터 해리된 세포들, 예컨대 근육, 연골, 지방, 피부, 간, 폐, 신경 조직, 및 기타 등등, 면역 세포들, 예컨대 T 세포들, B 세포들, 자연 킬러 세포들, 대식세포들, 및 기타 등등, 배아들 (예컨대, 접합체들), 난모세포들, 난자, 정자 세포들, 하이브로도마들, 배양 세포들, 세포주로부터의 세포들, 암 세포들, 감염 세포들, 세포감염된 및/또는 형질전환된 세포들, 리포터 세포들 등을 포함한다. 포유류의 세포는 예를 들어, 인간, 생쥐, 쥐, 말, 염소, 양, 암소, 영장류, 또는 기타 등등으로부터 유래할 수 있다.
복제하는 것이 가능한 콜로니에서 생 세포들의 모두가 단일 부모 세포로부터 유도된 딸 세포들이면, 생물학적 세포들의 콜로니는 "클론" 이다. 어떤 실시형태들에서, 클론 콜로니에서의 모든 딸 세포들은 단일 부모 세포로부터 10 번 이하의 분할들에 의해 유도된다. 다른 실시형태들에서, 클론 콜로니에서의 모든 딸 세포들은 단일 부모 세포로부터 14 번 이하의 분할들에 의해 유도된다. 다른 실시형태들에서, 클론 콜로니에서의 모든 딸 세포들은 단일 부모 세포로부터 17 번 이하의 분할들에 의해 유도된다. 다른 실시형태들에서, 클론 콜로니에서의 모든 딸 세포들은 단일 부모 세포로부터 20 번 이하의 분할들에 의해 유도된다. 용어 "클론 세포들" 은 동일한 클론 콜로니의 세포들을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, 생물학적 세포들의 "콜로니" 는, 2 개 이상의 세포들 (예컨대, 약 2 내지 약 20, 약 4 내지 약 40, 약 6 내지 약 60, 약 8 내지 약 80, 약 10 내지 약 100, 약 20 내지 약 200, 약 40 내지 약 400, 약 60 내지 약 600, 약 80 내지 약 800, 약 100 내지 약 1000개, 또는 1000 개 초과의 세포들) 을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "(a) 세포(들) 를 유지하는 것" 은 세포들을 생존가능하게 유지하거나 및/또는 증식시키는데 필요한 조건들을 제공하는, 유체 및 가스 성분들 양쪽, 그리고, 옵션적으로 표면을 포함하는 환경을 제공하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "증식시키는 (expanding)" 은, 세포들을 언급할 때, 세포 개수가 증가하는 것을 지칭한다.
유체 매질의 "컴포넌트" 는 용매 분자들, 이온들, 작은 분자들, 항생제들, 뉴클레오티드들 및 뉴클레오시드들, 핵산들, 아미노산들, 펩티드들, 단백질들, 당류들, 탄수화물들, 지질들, 지방 산들, 콜레스테롤, 대사물질들, 또는 기타 등등을 포함한, 매질에 존재하는 임의의 화학적 또는 생화학적 분자이다.
본원에서 사용될 때, "캡쳐 모이어티" 는 마이크로-객체에 대한 인식 사이트를 제공하는 화학적 또는 생물학적 종, 기능, 또는 모티프이다. 선택된 종류의 마이크로-객체들은 원 위치에서 (in situ)-발생된 캡쳐 모이어티를 인식할 수도 있으며, 원 위치에서-발생된 캡쳐 모이어티에 결합하거나 또는 그에 대한 친화력을 가질 수도 있다. 비한정적인 예들은 항원들, 항체들, 및 세포 표면 결합 모티프들을 포함한다.
본원에서 사용될 때, "유동성 중합체" 는 유체 매질 (예컨대, 사전-중합체 용액) 내에서 가용성이거나 또는 분산성인 중합체 단량체 또는 거대 단량체이다. 유동성 중합체는 미세유체 흐름 영역으로 유입되어 그 안의 유체 매질의 다른 성분들과 함께 유동할 수도 있다.
본원에서 사용될 때, "광개시 중합체" 는 광에의 노출 시, 공유결합으로 가교시키거나, 특정의 공유 결합들을 형성하거나, 경화된 화학적 모티프 주위에서 위치화학을 변경하거나, 또는 물리적 상태에서의 변화를 초래하는 이온 쌍들을 형성하고, 이에 의해 중합체 네트워크를 형성할 수 있는 중합체 (또는, 중합체를 발생시키는데 사용될 수 있는 단량체 분자) 를 지칭한다. 일부의 경우, 광개시 중합체는 공유결합으로 가교시키거나, 특정의 공유 결합들을 형성하거나, 경화된 화학적 모티프 주위에서 위치화학을 변경하거나, 또는 물리적 상태에서의 변화를 초래하는 이온 쌍들을 형성할 수 있는 하나 이상의 화학적 모이어티들에 결합된 중합체 세그먼트를 포함할 수도 있다. 일부의 경우, 광개시 중합체는 (예컨대, 중합체의 중합을 통해서) 중합체 네트워크의 형성을 개시하기 위해 광활성가능한 라디칼 개시제를 필요로 할 수도 있다.
본원에서 사용될 때, "항체" 는 면역글로불린 (Ig) 을 지칭하며, 그리고, 폴리클론 및 모노클론 항체들 양자; 영장류화된 것(예컨대, 인간화된 것); 쥐; 마우스-인간; 마우스-영장류; 및 키메릭을 포함하며; 비손상 분자, (scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' 및 F(ab)'2 단편들과 같은) 그의 단편, 또는 멀티머들 또는 비손상 분자들 및/또는 단편들의 집합체들일 수도 있으며; 그리고, 자연적으로 발생하거나 또는 예컨대, 면역화, 합성 또는 유전 조작에 의해 제조될 수도 있다. "항체 단편 (fragment)" 은, 본원에서 사용할 때, 항원에 결합하며, 그리고 일부 실시형태들에서는, 예컨대, 갈락토오스 잔류물들의 혼입에 의해, 제거 및 흡수를 촉진시키는 구조적 피쳐들을 나타내도록 유도체화될 수도 있는, 항체로부터 유도되거나 또는 관련된 단편들을 지칭한다. 이것은 예컨대, F(ab), F(ab)'2, scFv, 경쇄 가변 영역 (VL), 중쇄 가변 영역 (VH), 및 이들의 조합들을 포함한다.
유체 매질와 관련하여 본원에서 사용될 때, "확산하다 (diffuse)" 및 "확산 (diffusion)" 은 농도 기울기 아래로의 유체 매질의 성분의 열역학적 이동을 지칭한다.
어구 "매질의 유동" 은 주로 확산 이외의 임의의 메커니즘에 의한 유체 매질의 벌크 이동을 의미한다. 예를 들어, 매질의 유동은 지점들 사이의 압력 차이로 인한 하나의 지점으로부터 다른 지점으로의 유체 매질의 이동을 수반할 수 있다. 이러한 유동은 액체의 연속적, 펄스적, 주기적, 무작위적, 간헐적, 또는 왕복하는 유동, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 유체 매질이 다른 유체 매질로 유동할 때, 매질들의 난류 (turbulence) 및 혼합이 일어날 수 있다.
어구 "실질적으로 어떤 유동도 없는" 은, 시간에 따라 평균할 때, 유체 매질로의 또는 내에서의 물질 (예컨대, 관심 피분석물) 의 성분들의 확산의 레이트보다 작은 유체 매질의 유동의 레이트를 지칭한다. 이러한 물질의 성분들의 확산의 레이트는 예를 들어, 온도, 성분들의 사이즈, 및 성분들과 유체 매질 사이의 상호작용들의 강도에 의존할 수 있다.
미세유체 디바이스 내 상이한 영역들과 관련하여 본원에서 사용될 때, 어구 "유체 흐름 가능하게 연결된" 은 상이한 영역들이 유체 매질들과 같은 유체로 실질적으로 충진될 때, 영역들 각각에서의 유체가 유체의 단일체를 형성하도록 연결된다는 것을 의미한다. 이것은 상이한 영역들에서의 유체들 (또는, 유체 매질들) 이 조성이 반드시 동일하다는 것을 의미하지 않는다. 대신, 미세유체 디바이스의 상이한 유체 흐름 가능하게 연결된 영역들에서의 유체들은 용질들이 그들의 개개의 농도 기울기들 아래로 이동하고 및/또는 유체들이 미세유체 디바이스를 통과하여 유동에 따라서 유입하는 상이한 조성들 (예컨대, 단백질들, 탄수화물들, 이온들, 또는 다른 분자들과 같은, 용질들의 상이한 농도들) 을 가질 수 있다.
본원에서 사용될 때, "유동 통로" 는 매질의 유동의 궤적을 정의하고 겪는 하나 이상의 유체 흐름 가능하게 연결된 회로 엘리먼트들 (예컨대, 채널(들), 영역(들), 챔버(들) 및 기타 등등) 을 지칭한다. 따라서, 유동 통로는 미세유체 디바이스의 스윕된 영역의 일 예이다. 다른 회로 엘리먼트들 (예컨대, 비스윕된 영역들) 이 유동 통로에서의 매질의 유동에 영향을 주지 않고, 유동 통로를 포함하는 회로 엘리먼트들에 유체 연결될 수도 있다.
본원에서 사용될 때, "마이크로-객체를 분리하는" 은 마이크로-객체를 미세유체 디바이스 내 정의된 영역에 제한한다.
미세유체 (또는, 나노유체) 디바이스는 "스윕된 (swept)" 영역들 및 "비스윕된 (unswept)" 영역들을 포함할 수 있다. 본원에서 사용될 때, "스윕된 (swept)" 영역은 유체가 미세유체 회로를 통과하여 유동할 때 매질의 유동을 각각 경험하는, 미세유체 회로의 하나 이상의 유체 상호연결된 회로 엘리먼트들로 구성된다. 스윕된 영역의 회로 엘리먼트들은 예를 들어, 영역들, 채널들, 및 챔버들의 모두 또는 부분들을 포함할 수 있다. 본원에서 사용될 때, "비스윕된 (unswept)" 영역은 유체가 미세유체 회로를 통과하여 유동할 때 실질적으로 어떤 유체의 유동도 경험하지 않는, 미세유체 회로의 하나 이상의 유체 상호연결된 회로 엘리먼트로 구성된다. 유체 연결들이 스윕된 영역과 비스윕된 영역 사이에 확산이 가능하지만 어떤 실질적인 매질들의 유동도 불가능하도록 구조화된다고 가정하면, 비스윕된 영역은 스윕된 영역에 유체 연결될 수 있다. 따라서, 미세유체 디바이스는 단지 스윕된 영역과 비스윕된 영역 사이에 확산 유체 연통을 실질적으로 가능하게 하면서도, 스윕된 영역에서의 매질의 유동으로부터 비스윕된 영역을 실질적으로 분리하도록 구조화될 수 있다. 예를 들어, 마이크로-유체 디바이스의 유동 채널은 스윕된 영역의 일 예인 반면, 미세유체 디바이스의 (아래에서 좀더 자세히 설명되는) 고립 영역은 비스윕된 영역의 일 예이다.
특정의 생물학적 물질들 (예컨대, 항체들과 같은 단백질들) 을 생산하는 생물학적 마이크로-객체들 (예컨대, 생물학적 세포들) 의 능력은 이러한 미세유체 디바이스에서 분석될 수 있다. 분석의 특정의 실시형태에서, 관심 피분석물의 생산을 위해 분석될 생물학적 마이크로-객체들 (예컨대, 세포들) 을 포함하는 표본 물질은 미세유체 디바이스의 스윕된 영역으로 로드될 수 있다. 생물학적 마이크로-객체들 (예컨대, 인간 세포들과 같은 포유류의 세포들) 중 하나들이 특정의 특성들에 대해 선택되고 비스윕된 영역들에 배치될 수 있다. 그후 나머지 표본 물질이 스윕된 영역으로부터 유출되고 분석 물질이 스윕된 영역으로 유출될 수도 있다. 선택된 생물학적 마이크로-객체들이 비스윕된 영역들에 있기 때문에, 선택된 생물학적 마이크로-객체들은 나머지 표본 물질의 유출 또는 분석 물질의 유입에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다. 선택된 생물학적 마이크로-객체들은 관심 피분석물을 생성하도록 허용될 수 있으며, 이 관심 피분석물은 비스윕된 영역들로부터 스윕된 영역으로 확산될 수 있으며, 여기서, 관심 피분석물은 분석 물질과 반응하여, 특정의 비스윕된 영역과 각각 연관될 수 있는 로컬라이즈된 검출가능한 반응들을 생성할 수 있다. 검출된 반응과 연관되는 임의의 비스윕된 영역이 비스윕된 영역에서의 생물학적 마이크로-객체들 중 어느 것이, 있다면, 관심 피분석물의 충분한 생산자들인지를 평가하기 위해 분석될 수 있다.
미세유체 디바이스들 및 이러한 디바이스들을 동작 및 관측하기 위한 시스 템들. 도 1a 는 생물학적 마이크로-객체들을 유지, 고립, 분석 또는 배양하기 위해 사용될 수 있는 미세유체 디바이스 (100) 및 시스템 (150) 의 예를 예시한다. 미세유체 디바이스 (100) 의 사시도는 미세유체 디바이스 (100) 안의 부분 뷰를 제공하도록 그 커버 (110) 의 부분 컷-어웨이를 갖고 도시된다. 미세유체 디바이스 (100) 는 일반적으로, 흐름 경로 (106) 를 포함하는 미세유체 회로 (120) 를 포함하고, 이 흐름 경로를 통해 유체 매질 (180) 이 유동하여 선택적으로, 하나 이상의 마이크로-객체들 (미도시) 을 미세유체 회로 (120) 안으로 운반하고/하거나 통과시킬 수 있다. 단일의 미세유체 회로 (120) 가 도 1a 에 예시되지만, 적합한 미세유체 디바이스들은 복수 (예를 들어, 2 또는 3) 의 이러한 미세유체 회로들을 포함할 수 있다. 관계없이, 미세유체 디바이스 (100) 는 나노유체 디바이스이도록 구성될 수 있다. 도 1a 에 예시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 미세유체 격리 펜들 (124, 126, 128, 및 130) 을 포함할 수도 있고, 여기서 각각의 격리 펜들은 흐름 경로 (106) 와 유체 연통하는 하나 이상의 개구들을 가질 수도 있다. 도 1a 의 디바이스의 일부 실시형태들에서, 격리 펜들은 흐름 경로 (106) 와 유체 연통하는 단지 단일의 개구만을 가질 수도 있다. 이하에서 추가로 논의되는 바와 같이, 미세유체 격리 펜들은, 매질 (180) 이 흐름 경로 (106) 를 통해 유동하고 있을 때에도, 미세유체 디바이스 (100) 와 같은 미세유체 디바이스 내에 마이크로-객체들을 보유하기 위해 최적화되어 있는 다양한 피처들 및 구조들을 포함한다. 그러나, 전술한 것을 시작하기 전에, 미세유체 디바이스 (100) 및 시스템 (150) 의 간단한 설명이 제공된다.
일반적으로 도 1a 에 예시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 는 인클로저 (102) 에 의해 정의된다. 인클로저 (102) 는 상이한 구성들로 물리적으로 구조화될 수 있지만, 도 1a 에 도시된 예에서 인클로저 (102) 는 지지 구조 (104)(예를 들어, 베이스), 미세유체 회로 구조 (108), 및 커버 (110) 를 포함하는 것으로 도시된다. 지지 구조 (104), 미세유체 회로 구조 (108), 및 커버 (110) 는 서로 부착될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 회로 구조 (108) 는 지지 구조 (104) 의 내측 면 (109) 상에 배치될 수 있고, 커버 (110) 는 미세유체 회로 구조 (108) 위에 배치될 수 있다. 지지 구조 (104) 및 커버 (110) 와 함께, 미세유체 회로 구조 (108) 는 미세유체 회로 (120) 의 엘리먼트들을 정의할 수 있다.
지지 구조 (104) 는 도 1a 에 예시된 바와 같이 미세유체 회로 (120) 의 하단에 있고 커버 (110) 는 상단에 있을 수 있다. 대안으로, 지지 구조 (104) 및 커버 (110) 는 다른 배향들에서 구성될 수 있다. 예를 들어, 지지 구조 (104) 는 미세유체 회로 (120) 의 상단에 있을 수 있고 커버 (110) 는 하단에 있을 수 있다. 관계없이, 인클로저 (102) 안 또는 밖으로의 통로를 각각 포함하는 하나 이상의 포트들 (107) 이 존재할 수 있다. 통로의 예들은 밸브, 게이트, 관통 홀 (pass-through hole) 등을 포함한다. 예시된 바와 같이, 포트 (107) 는 미세유체 회로 구조 (108) 에서 갭에 의해 생성된 관통 홀이다. 그러나, 포트 (107) 는 커버 (110) 와 같은, 인클로저 (102) 의 다른 컴포넌트들에 놓일 수 있다. 단지 하나의 포트 (107) 가 도 1a 에 예시되지만, 미세유체 회로 (120) 는 2 이상의 포트들 (107) 을 가질 수 있다. 예를 들어, 미세유체 회로 (120) 로 진입하는 유체에 대한 인렛로서 기능하는 제 1 포트 (107) 가 존재할 수 있고, 미세유체 회로 (120) 를 나가는 유체에 대한 아웃렛으로서 기능하는 제 2 포트 (107) 가 존재할 수 있다. 포트 (107) 가 인렛 또는 아웃렛으로서 기능하는지 여부는 유체가 흐름 경로 (106) 를 통해 유동하는 방향에 의존할 수 있다.
지지 구조 (104) 는 하나 이상의 전극들 (미도시) 및 기판 또는 복수의 상호접속된 기판들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지지 구조 (104) 는 하나 이상의 반도체 기판들을 포함할 수 있고, 이 기판들 각각은 전극에 전기적으로 접속된다 (예를 들어, 반도체 기판들의 전부 또는 서브세트는 단일 전극에 전기적으로 접속될 수 있다). 지지 구조 (104) 는 인쇄 회로 기판 어셈블리 ("PCBA") 를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 반도체 기판(들) 은 PCBA 상에 장착될 수 있다.
미세유체 회로 구조 (108) 는 미세유체 회로 (120) 의 회로 엘리먼트들을 정의할 수 있다. 이러한 회로 엘리먼트들은, 미세유체 회로 (120) 가 유체로 채워질 때 유동적으로 상호접속될 수 있는 공간들 또는 영역들을, 예컨대 (하나 이상의 흐름 채널들을 포함하거나 하나 이상의 흐름 채널들일 수도 있는) 흐름 영역들, 챔버들, 펜들, 트랩들 등을 포함할 수 있다. 도 1a 에 예시된 미세유체 회로 (120) 에서, 미세유체 회로 구조 (108) 는 프레임 (114) 및 미세유체 회로 재료 (116) 를 포함한다. 프레임 (114) 은 미세유체 회로 재료 (116) 를 부분적으로 또는 완전히 인클로징할 수 있다. 프레임 (114) 은, 예를 들어 미세유체 회로 재료 (116) 를 실질적으로 둘러싸는 상대적으로 강성 구조일 수 있다. 예를 들어, 프레임 (114) 은 금속 재료를 포함할 수 있다.
미세유체 회로 재료 (116) 는 미세유체 회로 (120) 의 상호접속들 및 회로 엘리먼트들을 정의하도록 캐비티들 등으로 패터닝될 수 있다. 미세유체 회로 재료 (116) 는, 기체 투과성일 수 있는 유연성 재료, 예컨대 유연성 폴리머 (예를 들어, 고무, 플라스틱, 엘라스토머, 실리콘, 폴리디메틸실록산 ("PDMS"), 등) 을 포함할 수 있다. 미세유체 회로 재료 (116) 를 구성할 수 있는 재료들의 다른 예들은 몰딩된 유리, 실리콘 (예를 들어, 포토-패턴 가능 실리콘 또는 "PPS") 과 같은 식각 가능 재료, 포토-레지스트 (예를 들어, SU8) 등을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 이러한 재료들 - 및 이에 따른 미세유체 회로 재료 (116) - 은 강성 및/또는 실질적으로 기체에 대해 불투과성일 수 있다. 관계없이, 미세유체 회로 재료 (116) 는 지지 구조 (104) 상에 그리고 프레임 (114) 안에 배치될 수 있다.
커버 (110) 는 미세유체 회로 재료 (116) 및/또는 프레임 (114) 의 일체형 부품일 수 있다. 대안으로, 커버 (110) 는 도 1a 에 예시된 바와 같이 구조적으로 별개의 엘리먼트일 수 있다. 커버 (110) 는 미세유체 회로 재료 (116) 및/또는 프레임 (114) 과 동일한 또는 상이한 재료들을 포함할 수 있다. 유사하게, 지지 구조 (104) 는 예시된 바와 같이 프레임 (114) 또는 미세유체 회로 재료 (116) 로부터 별개의 구조이거나, 또는 프레임 (114) 또는 미세유체 회로 재료 (116) 의 일체형 부품일 수 있다. 마찬가지로, 프레임 (114) 및 미세유체 회로 재료 (116) 는 도 1a 에 도시된 바와 같이 별개의 구조들이거나 또는 동일한 구조의 일체형 부분들일 수 있다.
일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 강성 재료를 포함할 수 있다. 강성 재료는 유리 또는 유사한 특성들을 갖는 재료일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 변형 가능한 재료를 포함할 수 있다. 변형 가능한 재료는 폴리머, 예컨대 PDMS 일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 강성 및 변형 가능한 재료들 양자 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 커버 (110) 의 하나 이상의 부분들 (예를 들어, 격리 펜들 (124, 126, 128, 130) 위에 위치된 하나 이상의 부분들) 은 커버 (110) 의 강성 재료들과 인터페이스하는 변형 가능한 재료를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 하나 이상의 전극들을 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 전극들은 유리 또는 유사한 절연 재료 상에 코팅될 수도 있는, 전도성 산화물, 예컨대 인듐-틴-옥사이드 (ITO) 를 포함할 수 있다. 대안으로, 하나 이상의 전극들은, 변형 가능한 재료, 예컨대 폴리머 (예를 들어, PDMS) 에 임베딩된, 유연성 전극들, 예컨대 단일-벽 나노튜브들, 멀티-벽 나노튜브들, 나노와이어들, 전기적으로 전도성 나노입자들의 클러스터들, 또는 이들의 조합들일 수 있다. 미세유체 디바이스들에서 사용될 수 있는 유연성 전극들은, 예를 들어 미국 2012/0325665 (Chiou 등) 에서 설명되어 있고, 이 내용들은 참조로서 본원에 통합된다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 세포 부착, 생존성 및/또는 성장을 지원하도록 (예를 들어, 미세유체 회로 (120) 를 향해 내측으로 대면하는 표면의 전부 또는 부분을 조절함으로써) 변경될 수 있다. 이 변경은 합성 또는 천연 폴리머의 코팅을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 및/또는 지지 구조 (104) 는 광에 투명할 수 있다. 커버 (110) 는 기체 투과성인 적어도 하나의 재료 (예를 들어, PDMS 또는 PPS) 를 포함할 수도 있다.
도 1a 은 또한, 미세유체 디바이스들, 예컨대 미세유체 디바이스 (100) 를 동작 및 제어하는 시스템 (150) 을 나타낸다. 시스템 (150) 은 전기 전원 (192), 이미징 디바이스 (194) (이미징 모듈 (164) 내에 통합된, 여기서 디바이스 (194) 는 도 1a 자체에는 도시되지 않음), 및 틸팅 디바이스 (190) (틸팅 모듈 (166) 의 부분, 여기서 디바이스 (190) 는 도 1a 에 도시되지 않음) 를 포함한다.
전기 전원 (192) 은, 필요에 따라 바이어싱 전압들 또는 전류들을 제공하는, 미세유체 디바이스 (100) 및/또는 틸팅 디바이스 (190) 에 전기 전력을 제공할 수 있다. 전기 전원 (192) 은, 예를 들어 하나 이상의 교류 (AC) 및/또는 직류 (DC) 전압 또는 전류 소스들을 포함할 수 있다. 이미징 디바이스 (194) (이하에 논의되는 이미징 모듈 (164) 의 부분) 는 미세유체 회로 (120) 내의 이미지들을 캡처하기 위한 디바이스, 예컨대 디지털 카메라를 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 이미징 디바이스 (194) 는 (예를 들어, 낮은 광 애플리케이션들에 대해) 빠른 프레임 속도 및/또는 고 감도를 갖는 검출기를 더 포함한다. 이미징 디바이스 (194) 는 또한, 시뮬레이팅 방사 및/또는 광 빔들을 미세유체 회로 (120) 로 지향시키고 미세유체 회로 (120) (또는 그 안에 포함된 마이크로-객체들) 로부터 반사 또는 방출된 방사 및/또는 광 빔들을 수집하기 위한 메커니즘을 포함할 수 있다. 방출된 광 빔들은 가시적 스펙트럼에 있을 수도 있고, 예를 들어 형광 방출들을 포함할 수도 있다. 반사된 광 빔들은 LED 또는 넓은 스펙트럼 램프, 예컨대 수은등 (예를 들어, 고 압력 수은등) 또는 크세논 아크 등에서 비롯되는 반사된 방출들을 포함할 수도 있다. 도 3b 에 대하여 논의된 바와 같이, 이미징 디바이스 (194) 는 아이피스를 포함하거나 포함하지 않을 수도 있는 현미경 (또는 광학 트레인) 을 더 포함할 수도 있다.
시스템 (150) 은 하나 이상의 회전 축들을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 회전시키도록 구성된 틸팅 디바이스 (190) (이하에 논의되는 틸팅 모듈 (166) 의 부분) 를 더 포함한다. 일부 실시형태들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는, 미세유체 디바이스 (100)(및 이에 따른 미세유체 회로 (120)) 가 레벨 배향 (즉, x 및 y 축에 대해 0°), 수직 배향 (즉, x 축 및/또는 y 축에 대해 90°), 또는 그 사이의 임의의 배향에서 홀딩될 수 있도록 적어도 하나의 축을 중심으로 미세유체 회로 (120) 를 포함하는 인클로저 (102) 를 지지 및/또는 홀딩하도록 구성된다. 축에 대한 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 의 배향은 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 의 "틸트" 로서 본원에서 지칭된다. 예를 들어, 틸팅 디바이스 (190) 는 미세유체 디바이스 (100) 를 x-축에 대하여 0.1°, 0.2°, 0.3°, 0.4°, 0.5°, 0.6°, 0.7°, 0.8°, 0.9°, 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 10°, 15°, 20°, 25°, 30°, 35°, 40°, 45°, 50°, 55°, 60°, 65°, 70°, 75°, 80°, 90°에서 또는 그 사이의 임의의 각도에서 틸팅할 수 있다. 레벨 배향 (및 이에 따른, x- 및 y-축) 은 중력에 의해 정의된 수직 축에 대해 법선으로서 정의된다. 틸팅 디바이스는 또한, x-축 및/또는 y-축에 대해 90°보다 큰 임의의 각도까지 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅하거나, 또는 x-축 또는 y-축에 대해 180°로 미세유체 디바이스 (및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅하여 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 를 완전히 인버팅할 수 있다. 유사하게, 일부 실시형태들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 미세유체 회로 (120) 의 일부 다른 부분 또는 흐름 경로 (106) 에 의해 정의된 회전 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅한다.
일부 경우들에서, 미세유체 디바이스 (100) 는, 흐름 경로 (106) 가 하나 이상의 격리 펜들 위 또는 아래에 위치되도록 수직 배향으로 틸팅된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "~위" 는, 흐름 경로 (106) 가 중력에 의해 정의된 수직 축 상에서 하나 이상의 격리 펜들보다 더 높이 위치된다 (즉, 흐름 경로 (106) 위의 격리 펜에서의 객체는 흐름 영역/채널에서의 객체보다 더 높은 중력 포텐셜 에너지를 가질 것이다) 는 것을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "~아래" 는, 흐름 경로 (106) 가 중력에 의해 정의된 수직 축 상에서 하나 이상의 격리 펜들보다 더 낮게 위치된다 (즉, 흐름 경로 (106) 아래의 격리 펜에서의 객체는 흐름 경로에서의 객체보다 더 낮은 중력 포텐셜 에너지를 가질 것이다) 는 것을 나타낸다.
일부 경우들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 흐름 경로 (106) 에 평행한 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅한다. 또한, 미세유체 디바이스 (100) 는, 흐름 경로 (106) 가 격리 펜들 바로 위 또는 아래에 위치되지 않고 하나 이상의 격리 펜들 위 또는 아래에 위치되도록 90°미만의 각도로 틸팅될 수 있다. 다른 경우들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 흐름 경로 (106) 에 수직한 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅한다. 또 다른 경우들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 흐름 경로 (106) 에 평행하지도 또는 수직하지도 않은 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅한다.
시스템 (150) 은 매질 소스 (178) 를 더 포함할 수 있다. 매질 소스 (178)(예를 들어, 콘테이너, 저장고 등) 는 상이한 유체 매질 (180) 을 각각 홀딩하기 위해 다수의 섹션들 또는 콘테이너들을 포함할 수 있다. 따라서, 매질 소스 (178) 는 도 1a 에 예시된 바와 같이, 미세유체 디바이스 (100) 밖에 있는 그리고 이로부터 별개인 디바이스일 수 있다. 대안으로, 매질 소스 (178) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 인클로저 (102) 내에 전체적으로 또는 부분적으로 위치될 수 있다. 예를 들어, 매질 소스 (178) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 부분인 저장고들을 포함할 수 있다.
도 1a 은 또한, 시스템 (150) 의 부분을 구성하고 미세유체 디바이스 (100) 와 함께 이용될 수 있는 제어 및 모니터링 장비 (152) 의 예들의 단순화된 블록도 도시들을 예시한다. 도시된 바와 같이, 이러한 제어 및 모니터링 장비 (152) 의 예들은 매질 소스 (178) 를 제어하기 위한 매질 모듈 (160), 미세유체 회로 (120) 내의 마이크로-객체들 (미도시) 및/또는 매질 (예를 들어, 매질의 액적들) 의 이동 및/또는 선택을 제어하기 위한 동기 모듈 (162), 이미지들 (예를 들어, 디지털 이미지들) 을 캡처하는 이미징 디바이스 (194)(예를 들어, 카메라, 현미경, 광원 또는 이들의 임의의 조합) 를 제어하기 위한 이미징 모듈 (164), 및 틸팅 디바이스 (190) 를 제어하기 위한 틸팅 모듈 (166) 을 포함하는 마스터 제어기 (154)를 포함한다. 제어 장비 (152) 는 또한, 미세유체 디바이스 (100) 에 대하여 제어, 모니터링, 또는 다른 기능들을 수행하기 위한 다른 모듈들 (168) 을 포함할 수 있다. 도시된 바와 같이, 장비 (152) 는 디스플레이 디바이스 (170) 및 입/출력 디바이스 (172) 를 더 포함할수 있다.
마스터 제어기 (154) 는 제어 모듈 (156) 및 디지털 메모리 (158) 를 포함할 수 있다. 제어 모듈 (156) 은, 예를 들어 메모리 (158) 내에 비-일시적 데이터 또는 신호들로서 저장된 머신 실행가능 명령들 (예를 들어, 소프트웨어, 펌웨어, 소스 코드, 등) 에 따라 동작하도록 구성된 디지털 프로세서를 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 제어 모듈 (156) 은 하드웨어 디지털 회로부 및/또는 아날로그 회로부를 포함할 수 있다. 매질 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 은 유사하게 구성될 수 있다. 따라서, 미세유체 디바이스 (100) 또는 임의의 다른 미세유체 장치에 대하여 수행되는 것으로서 본원에 설명된 기능들, 프로세스들, 액트들, 액션들, 또는 프로세스의 단계들은 위에서 논의된 바와 같이 구성된 마스터 제어기 (154), 매질 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 중 임의의 하나 이상에 의해 수행될 수 있다. 유사하게, 마스터 제어기 (154), 매질 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 은 본원에 논의된 임의의 기능, 프로세스, 액트, 액션 또는 단계에서 사용된 데이터를 송신 및 수신하도록 통신 가능하게 커플링될 수도 있다.
매질 모듈 (160) 은 매질 소스 (178) 를 제어한다. 예를 들어, 매질 모듈 (160) 은 선택된 유체 매질 (180) 을 (예를 들어, 인렛 포트 (107) 를 통해) 인클로저 (102) 안으로 입력하도록 매질 소스 (178) 를 제어할 수 있다. 매질 모듈 (160) 은 또한, (예를 들어, 아웃렛 포트 (미도시) 를 통해) 인클로저 (102) 로부터 매질의 제거를 제어할 수 있다. 하나 이상의 매질은 따라서, 선택적으로 미세유체 회로 (120) 안으로 입력되고 이로부터 제거될 수 있다. 매질 모듈 (160) 은 또한, 미세유체 회로 (120) 내의 흐름 경로 (106) 에서의 유체 매질 (180) 의 흐름을 제어할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서 매질 모듈 (160) 은 틸팅 모듈 (166) 이 틸팅 디바이스 (190) 로 하여금 원하는 각도의 기울기로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅하게 하기 전에 인클로저 (120) 를 통해 그리고 흐름 경로 (106) 에서의 매질 (180) 의 흐름을 정지시킨다.
동기 모듈 (162) 은 미세유체 회로 (120) 에서 마이크로-객체들 (미도시) 의 선택, 트랩핑, 및 이동을 제어하도록 구성될 수 있다. 도 1b 및 도 1c 를 참조하여 이하에 논의된 바와 같이, 인클로저 (102) 는 유전영동 (DEP), 광전 트위저들 (optoelectronic tweezers; OET) 및/또는 광-전기습윤 (OEW) 구성 (도 1a 에 미도시) 을 포함할 수 있고, 동기 모듈 (162) 은 흐름 경로 (106) 및/또는 격리 펜들 (124, 126, 128, 130) 에서 매질 (미도시)의 액적 (droplet) 들 및/또는 마이크로-객체들 (미도시) 을 선택 및 이동시키도록 전극들 및/또는 트랜지스터들 (예를 들어, 포토트랜지스터들) 의 활성화를 제어할 수 있다.
이미징 모듈 (164) 은 이미징 디바이스 (194) 를 제어할 수 있다. 예를 들어, 이미징 모듈 (164) 은 이미징 디바이스 (194) 로부터 이미지 데이터를 수신 및 프로세싱할 수 있다. 이미징 디바이스 (194) 로부터의 이미지 데이터는 이미징 디바이스 (194) 에 의해 캡처된 정보의 임의의 유형 (예를 들어, 마이크로-객체들의 존재 또는 부재, 매질의 액적들, 형광 라벨과 같은 라벨의 축적 등) 을 포함할 수 있다. 이미징 디바이스 (194) 에 의해 캡처된 정보를 사용하여, 이미징 모듈 (164) 은 또한, 객체들 (예를 들어, 마이크로-객체들, 매질의 액적들) 의 포지션 및/또는 미세유체 디바이스 (100) 내에서의 이러한 객체들의 모션 속도를 계산할 수 있다.
틸팅 모듈 (166) 은 틸팅 디바이스 (190) 의 틸팅 모션들을 제어할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 틸팅 모듈 (166) 은 틸팅 속도 및 타이밍을 제어하여, 중력들을 통해 하나 이상의 격리 펜들로의 마이크로-객체들의 트랜스퍼를 최적화할 수 있다. 틸팅 모듈 (166) 은 미세유체 회로 (120) 에서 매질의 액적들 및/또는 마이크로-객체들의 모션을 설명하는 데이터를 수신하도록 이미징 모듈 (164) 과 통신 가능하게 커플링된다. 이 데이터를 사용하여, 틸팅 모듈 (166) 은, 마이크로-객체들 및/또는 매질의 액적들이 미세유체 회로 (120) 에서 이동하는 속도를 조정하기 위해 미세유체 회로 (120) 의 틸트를 조정할 수도 있다. 틸팅 모듈 (166) 은 또한, 이 데이터를 사용하여 미세유체 회로 (120) 에서 마이크로-객체 및/또는 매질의 액적의 포지션을 반복적으로 조정할 수도 있다.
도 1a 에 도시된 예들에서, 미세유체 회로 (120) 는 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜들 (124, 126, 128, 130) 을 포함하는 것으로서 예시된다. 각각의 펜은 채널 (122) 에 대한 개구를 포함하지만, 다르게는 펜들이 펜 내부의 마이크로-객체들을 채널 (122) 의 흐름 경로 (106) 내 또는 다른 펜들 내의 마이크로-객체들 및/또는 유체 매질 (180) 로부터 실질적으로 격리할 수 있도록 인클로징된다. 격리 펜의 벽들은 베이스의 내부 표면 (109) 로부터 커버 (110) 의 내측 표면까지 연장되어 인클로저를 제공한다. 미세유체 채널 (122) 에 대한 펜의 개구는 흐름 (106) 이 펜들로 지향되지 않도록 유체 매질 (180) 의 흐름 (106) 에 대해 소정 각도로 배향된다. 그 흐름은 펜의 개구의 평면에 접하거나 직교할 수도 있다. 일부 경우들에서, 펜들 (124, 126, 128, 130) 은 미세유체 회로 (120) 내에 하나 이상의 마이크로-객체들을 물리적으로 몰아넣도록 구성된다. 본 개시에 따른 격리 펜들은, 이하에서 상세히 논의 및 도시되는 바와 같이, DEP, OET, OEW, 유체 흐름, 및/또는 중력들과의 사용을 위해 최적화되는 다양한 형상들, 표면들 및 피처들을 포함할 수 있다.
미세유체 회로 (120) 는 임의의 수의 미세유체 격리 펜들을 포함할 수도 있다. 5 개의 격리 펜들이 도시되지만, 미세유체 회로 (120) 는 더 적은 또는 더 많은 격리 펜들을 가질 수도 있다. 도시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 의 미세유체 격리 펜들 (124, 126, 128, 및 130) 은 각각 생물학적 마이크로-객체들을 유지, 고립, 분석 또는 배양하기 위해 유용한 하나 이상의 이익들을 제공할 수도 있는 상이한 특징들 및 형상들을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 동일한 미세유체 격리 펜들을 포함한다.
도 1a 에 예시된 실시형태에서, 단일의 채널 (122) 및 흐름 경로 (106) 가 도시된다. 그러나, 다른 실시형태들은 다수의 채널들 (122) 을 포함할 수도 있고, 채널들 각각은 흐름 경로 (106) 를 포함하도록 구성된다. 미세유체 회로 (120) 는 흐름 경로 (106) 및 유체 매질 (180) 과 유체 연통하는 인렛 밸브 또는 포트 (107) 를 더 포함하고, 이로써 유체 매질 (180) 은 인렛 포트 (107) 를 통해 채널 (122) 에 접근할 수 있다. 일부 경우들에서, 흐름 경로 (106) 는 단일의 경로를 포함한다. 일부 경우들에서, 그 단일의 경로는 지그재그 패턴으로 배열되고, 이에 의해 흐름 경로 (106) 는 교번하는 방향들에서 2 회 이상 미세유체 디바이스 (100) 를 가로질러 이동한다.
일부 경우들에서, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 병렬 채널들 (122) 및 흐름 경로들 (106) 을 포함하며, 여기서 각각의 흐름 경로 (106) 내의 유체 매질 (180) 은 동일한 방향으로 흐른다. 일부 경우들에서, 각각의 흐름 경로 (106) 내의 유체 매질은 순방향 또는 역방향 중 적어도 하나로 유동한다. 일부 경우들에서, 복수의 격리 펜들은, 격리 펜들이 타겟 마이크로-객체들과 병렬로 로딩될 수 있도록 (예를 들어, 채널 (122) 에 대해) 구성된다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 회로 (120) 는 하나 이상의 마이크로-객체 트랩들 (132) 을 더 포함한다. 트랩들 (132) 은 일반적으로, 채널 (122) 의 경계를 형성하는 벽에 형성되고, 미세유체 격리 펜들 (124, 126, 128, 130) 중 하나 이상의 개구 반대편에 위치될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 트랩들 (132) 은 흐름 경로 (106) 로부터 단일의 마이크로-객체를 수신 또는 캡처하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 트랩들 (132) 은 흐름 경로 (106) 로부터 복수의 마이크로-객체들을 수신 또는 캡처하도록 구성된다. 일부 경우들에서, 트랩들 (132) 은 단일의 타겟 마이크로-객체의 체적과 거의 동일한 체적을 포함한다.
트랩들 (132) 은 타겟이되는 마이크로-객체들의 트랩들 (132) 안으로의 흐름을 돕도록 구성되는 개구를 더 포함할 수도 있다. 일부 경우들에서, 트랩들 (132) 은 단일의 타겟 마이크로-객체의 치수들과 대략 동일한 높이 및 폭을 갖는 개구를 포함하고, 이에 의해 더 큰 마이크로-객체들이 마이크로-객체 트랩 안으로 진입하는 것이 방지된다. 트랩들 (132) 은 트랩 (132) 내에 타겟이되는 마이크로-객체들의 보유를 돕도록 구성된 다른 피처들을 더 포함할 수도 있다. 일부 경우들에서, 트랩 (132) 은, 미세유체 채널 (122) 에 평행한 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅할 때, 트랩된 마이크로-객체가, 마이크로-객체로 하여금 격리 펜의 개구 안으로 들어가게 하는 궤적에서 트랩 (132) 을 나가도록, 미세유체 격리 펜의 개구에 대해 채널 (122) 의 반대 측에 놓이고 이와 정렬된다. 일부 경우들에서, 트랩 (132) 은, 트랩 (132) 을 통한 흐름을 용이하게 하고 이에 의해 트랩 (132) 에서 마이크로-객체를 캡처하는 가능성을 증가시키기 위해 타겟 마이크로-객체보다 더 작은 사이드 통로 (134) 를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 유전영동 (DEP) 힘들이 하나 이상의 전극들 (미도시) 을 통해 (예를 들어, 흐름 경로에서 및/또는 격리 펜들에서) 유체 매질 (180) 을 가로질러 인가되어 그 안에 위치된 마이크로-객체들을 조작, 이송, 분리 및 소팅한다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 단일의 마이크로-객체를 흐름 경로 (106) 로부터 원하는 미세유체 격리 펜 안으로 트랜스퍼하기 위해 미세유체 회로 (120) 의 하나 이상의 부분들에 DEP 힘들이 인가된다. 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 격리 펜 (예를 들어, 격리 펜 (124, 126, 128, 또는 130)) 내의 마이크로-객체가 챔버로부터 변위되는 것을 방지하는데 사용된다. 또한, 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 본 개시의 실시형태들에 따라 이전에 수집되었던 마이크로-객체를 격리 펜으로부터 선택적으로 제거하는데 사용된다. 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 광전 트위저 (OET) 힘들을 포함한다.
다른 실시형태들에서, 광전기습윤 (OEW) 력들은 미세유체 회로 (120) 내에 위치된 액적들을 조작, 수송, 분리 및 분류하기 위해 하나 이상의 전극들 (도시하지 않음) 을 통해 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) (및/또는 커버 (110)) 에서의 하나 이상의 위치들 (예를 들어, 흐름 경로 및/또는 격리 펜들을 정의하는 것을 돕는 위치들) 에 인가된다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, OEW 력들은 흐름 경로 (106) 로부터 원하는 미세유체 격리 펜 내로 단일의 액적을 이송하기 위해 지지 구조 (104) (및/또는 커버 (110)) 에서의 하나 이상의 위치들에 인가된다. 일부 실시형태들에서, OEW 력들은 격리 펜 (예를 들어, 격리 펜 (124, 126, 128, 또는 130)) 내의 액적이 그것으로부터 변위되는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 일부 실시형태들에서, OEW 력들은 본 개시의 실시형태들에 따라 이전에 수집되었던 액적을 격리 펜으로부터 선택적으로 제거하기 위해 사용된다.
일부 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 미세유체 회로 (120) 내의 액적들 및/또는 마이크로-객체들을 조작, 이송, 분리 및 소팅하도록, 다른 힘들, 예컨대 흐름 및/또는 중력과 결합된다. 예를 들어, 인클로저 (102) 는 흐름 경로 (106)) 및 그 안에 위치된 마이크로-객체들을 미세유체 격리 펜들 위에 위치시키도록 (예를 들어, 틸팅 디바이스 (190) 에 의해) 틸팅될 수 있고, 중력의 힘은 마이크로-객체들 및/또는 액적들을 펜들 안으로 이송할 수 있다. 일부 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들 전에 인가될 수 있다. 다른 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들 후에 인가될 수 있다. 또 다른 경우들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들과 동시에 또는 다른 힘들과 교번하는 방식으로 인가될 수 있다.
도 1b, 도 1c, 및 도 2a 내지 도 2h 는 본 개시의 실시형태들의 실시에서 사용될 수 있는 미세유체 디바이스들의 여러 실시형태들을 도시한다. 도 1b 는 미세유체 디바이스 (200) 가 광학적으로 작동되는 동전기적 디바이스로서 구성되는 실시형태를 묘사한다. 광전 트위저 (OET) 구성을 갖는 디바이스들 및 광전기습윤 (OEW) 구성을 갖는 디바이스들을 포함하는 여러 광학적으로 작동되는 동전기적 디바이스들이 본 기술에서 알려져 있다. 적합한 OET 구성들의 예들은 각각 그 전체가 참조에 의해 여기에 포함되는 다음의 미국 특허 문서들에 예시된다: 미국 특허 제 RE 44,711 호 (Wu 등) (US 특허 제 7,612,355 호로서 특허됨); 및 US 특허 제 7,956,339 호 (Ohta 등). OEW 구성들의 예들은 양자 모두가 전체가 참조에 의해 여기에 포함되는 미국 특허 제 6,958,132 (Chiou 등) 및 US 특허 출원 공개 제 2012/0024708 호 (Chiou 등) 에 예시되어 있다. 광학적으로 작동되는 동전기적 디바이스의 또 다른 예는 결합된 OET/OEW 구성을 포함하며, 이것의 예들은 미국 특허 공보들 제 20150306598 호 (Khandros 등) 및 제 20150306599 호 (Khandros 등) 및 그들의 대응하는 PCT 공보들 WO2015/164846 호 및 WO2015/164847 호에 도시되며, 이들 모두는 그 전체가 참조에 의해 여기에 포함된다.
생물학적 마이크로-객체들이 배치, 배양, 및/또는 모니터될 수 있는 펜들을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은 예를 들어 US 2014/0116881 (2013년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제 14/060,117 호), US 2015/0151298 (2014년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제 14/520,568 호), 및 US 2015/0165436 (2014년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제 14/521,447 호) 에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 여기에 포함된다. 미국 출원 번호들 제 14/520,568 호 및 제 14/521,447 호는 또한 미세유체 디바이스에서 배양된 세포들의 분비물들을 분석하는 예시적인 방법들을 기술한다. 상기 출원들 각각은 광전 트위저들 (OET) 과 같은 유전영동 (DEP) 힘들을 생성하도록 구성되거나 광-전기습윤 (OEW) 을 제공하도록 구성된 미세유체 디바이스들을 더 기술한다. 예를 들어, US 2014/0116881 의 도 2 에 도시된 광전 트위저 디바이스는 개개의 생물학적 마이크로-객체 또는 생물학적 마이크로-객체들의 그룹을 선택하고 이동시키기 위해 본 개시의 실시형태들에서 이용될 수 있는 디바이스의 예이다.
미소유체 디바이스 동기 (motive) 구성들. 전술된 바와 같이, 시스템의 제어 및 모니터링은 미세유체 디바이스의 미세유체 회로에서, 마이크로-객체들 또는 액적들과 같은 객체들을 선택 및 이동시키기 위한 동기 모듈을 포함할 수 있다. 미세유체 디바이스는, 이동되고 있는 객체의 유형 및 다른 고려사항들에 따라, 다양한 동기 구성들을 가질 수 있다. 예를 들어, 유전영동 (DEP) 구성은 미세유체 회로에서 마이크로-객체들을 선택하고 이동시키기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 및/또는 커버 (110) 는 미세유체 회로 (120) 내의 유체 매질 (180) 내의 마이크로-객체들상에 DEP 힘들을 선택적으로 유도하기 위한 DEP 구성을 포함할 수 있고, 이것에 의해 개개의 마이크로-객체들 또는 마이크로-객체들의 그룹들을 선택, 캡쳐, 및/또는 이동시킬 수 있다. 대안적으로, 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 및/또는 커버 (110) 는 미세유체 회로 (120) 에서의 유체 매질 (180) 내의 액적들상에 EW 힘들을 선택적으로 유도하기 위한 전기습윤 (EW) 구성을 포함할 수 있고, 이것에 의해 개개의 액적들 또는 액적들의 그룹들을 선택, 캡쳐, 및/또는 이동시킬 수 있다.
DEP 구성을 포함하는 미세유체 디바이스 (200) 의 하나의 예가 도 1b 및 도 1c 에 도시된다. 간단성의 목적으로, 도 1b 및 도 1c 는 영역/챔버 (202) 를 갖는 미세유체 디바이스 (200) 의 인클로저 (102) 의 부분의, 각각, 측단면도 및 평면 단면도를 도시하지만, 그 영역/챔버 (202) 는 성장 챔버, 격리 펜, 흐름 영역, 또는 흐름 채널과 같은 더 상세한 구조를 갖는 유체 회로 엘리먼트의 부분일 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 더욱이, 미세유체 디바이스 (200) 는 다른 유체 회로 엘리먼트들을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 미세유체 디바이스 (200) 는, 미세유체 디바이스 (100) 에 대하여 본원에 설명된 바와 같은, 복수의 성장 챔버들 또는 격리 펜들 및/또는 하나 이상의 흐름 영역들 또는 흐름 채널들을 포함할 수 있다. DEP 구성은 미세유체 디바이스 (200) 의 임의의 이러한 유체 회로 엘리먼트들 안에 통합되거나, 또는 그 부분들을 선택할 수도 있다. 위 또는 아래에 설명된 미세유체 디바이스 컴포넌트들 및 시스템 컴포넌트들 중 어느 하나는 미세유체 디바이스 (200) 에 통합되고/되거나 이와 결합되어 사용될 수도 있다는 것이 또한 인식되어야 한다. 예를 들어, 전술된 제어 및 모니터링 장비 (152) 를 포함하는 시스템 (150) 은, 매질 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및 다른 모듈들 (168) 중 하나 이상을 포함하는 미세유체 디바이스 (200) 와 함께 사용될 수도 있다.
도 1b 에서 알 수 있는 바와 같이, 미세유체 디바이스 (200) 는 하단 전극 (204) 및 하단 전극 (204) 위에 있는 전극 활성화 기판 (206) 을 갖는 지지 구조 (104), 및 하단 전극 (204) 으로부터 떨어져 이격된 상단 전극 (210) 을 갖는 커버 (110) 를 포함한다. 상단 전극 (210) 및 전극 활성화 기판 (206) 은 영역/챔버 (202) 의 반대 표면들을 정의한다. 영역/챔버 (202) 에 포함된 매질 (180) 은 따라서, 상단 전극 (210) 과 전극 활성화 기판 (206) 간의 저항성 접속을 제공한다. 하단 전극 (204) 및 상단 전극 (210) 에 접속되고 영역/챔버 (202) 에서 DEP 힘들의 생성에 필요한 바와 같은 전극들 간의 바이어싱 전압을 생성하도록 구성된 전원 (212) 이 또한 도시된다. 전원 (212) 은, 예를 들어 교류 (AC) 전원일 수 있다.
소정 실시형태들에서, 도 1b 및 도 1c 에 예시된 미세유체 디바이스 (200) 는 광학적으로-작동된 DEP 구성을 가질 수 있다. 따라서, 동기 모듈 (162) 에 의해 제어될 수도 있는 광원 (216) 으로부터의 광 (218) 의 패턴들을 변경하는 것은 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 의 영역들 (214) 에서 DEP 전극들의 패턴들을 변경하는 것을 선택적으로 활성화 및 비활성화할 수 있다. (이하에서, DEP 구성을 갖는 미세유체 디바이스의 영역들 (214) 은 "DEP 전극 영역들" 로서 지칭된다). 도 1c 에 예시된 바와 같이, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 위로 지향된 광 패턴 (218) 은 정사각형과 같은 패턴으로 DEP 전극 영역들 (214a)(화이트로 도시됨) 을 선택적으로 조명할 수 있다. 비-조명된 DEP 전극 영역들 (214)(십자-해칭됨) 은 "어두운" DEP 전극 영역들 (214) 로서 이하에서 지칭된다. DEP 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 (즉, 하부 전극 (204) 으로부터 흐름 영역 (106) 에서 매질 (180) 과 인터페이스하는 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 까지의) 상대적인 전기적 임피던스는 각각의 어두운 DEP 전극 영역 (214) 에서 영역/챔버 (202) 내의 매질 (180) 을 통한 (즉, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 으로부터 커버 (110) 의 상단 전극 (210) 까지의) 상대적 전기적 임피던스보다 더 크다. 그러나, 조명된 DEP 전극 영역 (214a) 은, 각각의 조명된 DEP 전극 영역 (214a) 에서 영역/챔버 (202) 내의 매질 (180) 을 통한 상대적 임피던스보다 작은 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 감소된 상대적 임피던스를 보인다.
전원 (212) 이 활성화됨에 따라, 상기 DEP 구성은 조명된 DEP 전극 영역들 (214a) 과 인접한 어두운 DEP 전극 영역들 (214) 사이의 유체 매질 (180) 에서 전계 구배를 생성하고, 이것은 이어서 유체 매질 (180) 에서 부근의 마이크로-객체들 (미도시) 을 끌어당기거나 밀어내는 로컬 DEP 힘들을 생성한다. 유체 매질 (180) 내의 마이크로-객체들을 끌어당기거나 밀어내는 DEP 전극들은 따라서, 광원 (216) 으로부터 미세유체 디바이스 (200) 로 프로젝팅된 광 패턴들 (218) 을 변경함으로써 영역/챔버 (202) 의 내측 면 (208) 에서 많은 상이한 이러한 DEP 전극 영역들 (214) 에서 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다. DEP 힘들이 부근의 마이크로-객체들을 끌어당기거나 밀어내는지 여부는, 매질 (180) 및/또는 마이크로-객체들 (미도시) 의 유전 특성들 및 전원 (212) 의 주파수와 같은 이러한 파라미터들에 의존할 수 있다.
도 1c 에 예시된 조명된 DEP 전극 영역들 (214a) 의 정사각형 패턴 (220) 은 단지 일 예이다. DEP 전극 영역들 (214) 의 임의의 패턴이 미세유체 디바이스 (200) 로 프로젝팅된 광의 패턴 (218) 에 의해 조명 (및 이에 의해 활성화) 될 수 있고, 조명된/활성화된 DEP 전극 영역들 (214) 의 패턴은 광 패턴 (218) 을 변경 또는 이동시킴으로써 반복적으로 변경될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 광전도 재료를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 이러한 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 은 특색이 없을 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 수소화 비정질 실리콘 (a-Si:H) 을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. a-Si:H 는, 예를 들어 (100 * 수소 원자들의 수/수소 및 규소 원자들의 총 수로서 계산된) 약 8% 내지 40% 수소를 포함할 수 있다. a-Si:H 의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 ㎛의 두께를 가질 수 있다. 이러한 실시형태들에서, DEP 전극 영역들 (214) 은 광 패턴 (218) 에 따라, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 상에 임의의 패턴으로 그리고 어디든 생성될 수 있다. 따라서, DEP 전극 영역들 (214) 의 패턴 및 수는 고정될 필요가 없고, 광 패턴 (218) 에 대응할 수 있다. 위에서 논의된 바와 같은 광전도성 층을 포함하는 DEP 구성을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국특허 제 RE 44,711 (Wu 등)(미국특허 제 7,612,355 호로서 최초로 발행됨) 에서 설명되어 있고, 이 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다.
다른 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 복수의 도핑된 층들, 전기적으로 절연 층들 (또는 영역들), 및 반도체 분야들에서 알려진 바와 같은 반도체 집적 회로들을 형성하는 전기적으로 전도성 층들을 포함하는 기판을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 예를 들어, 측방 바이폴러 포토레지스터들을 포함하는 복수의 포토레지스터들을 포함할 수 있고, 포토레지스터들 각각은 DEP 전극 영역 (214) 에 대응한다. 대안으로, 전극 활성화 기판 (206) 은 포토레지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들 (예를 들어, 전도성 금속 전극들) 을 포함할 수 있고, 각각의 이러한 전극은 DEP 전극 영역 (214) 에 대응한다. 전극 활성화 기판 (206) 은 이러한 포토레지스터들 또는 포토레지스터-제어된 전극들의 패턴을 포함할 수 있다. 패턴은, 예를 들어 도 2b 에 도시된 바와 같이 행들 및 열들로 배열된 실질적으로 정사각형의 포토레지스터들 또는 포토레지스터-제어된 전극들의 어레이일 수 있다. 대안으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각의 포토레지스터들 또는 포토레지스터-제어된 전극들의 어레이일 수 있다. 패턴에 관계없이, 전기 회로 엘리먼트들은 하단 전극 (210) 과 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 에서의 DEP 전극 영역들 (214) 간의 전기적 접속들을 형성할 수 있고, 이들 전기적 접속들 (즉, 포토레지스터들 또는 전극들) 은 광 패턴 (218) 에 의해 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다. 활성화되지 않은 경우, 각각의 전기적 접속은, 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 (즉, 하단 전극 (204) 으로부터 영역/챔버 (202) 에서 매질 (180) 과 인터페이스하는 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 까지의) 상대적 임피던스가 대응하는 DEP 전극 영역 (214) 에서 매질 (180) 을 통한 (즉, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 으로부터 커버 (110) 의 상단 전극 (210) 까지의) 상대적 임피던스보다 더 크도록 높은 임피던스를 가질 수 있다. 그러나 광 패턴 (218) 에서 광에 의해 활성화되는 경우, 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 상대적 임피던스는 각각의 조명된 DEP 전극 영역 (214) 에서 매질 (180) 을 통한 상대적 임피던스보다 더 작고, 이에 의해 위에서 논의된 바와 같이 대응하는 DEP 전극 영역 (214) 에서 DEP 전극을 활성화시킨다. 매질 (180) 내의 마이크로-객체들 (미도시) 을 끌어당기거나 밀어내는 DEP 전극들은 따라서, 광 패턴 (218) 에 의해 결정된 방식으로 영역/챔버 (202) 의 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 에서 많은 상이한 DEP 전극 영역들 (214) 에서 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다.
포토레지스터들을 포함하는 전극 활성화 기판들을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국특허 제 7,956,339 (Ohta 등) (예를 들어, 도 21 및 도 22 에 예시된 디바이스 (300), 및 그 설명들을 참조) 에서 설명되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다. 포토레지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들을 포함하는 전극 활성화 기판들을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국 특허공개 제 2014/0124370 (Short 등) (예를 들어, 도면들 전체에 예시된 디바이스들 (200, 400, 500, 600, 및 900) 및 그 설명들을 참조) 에서 설명되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다.
DEP 구성된 미세유체 디바이스의 일부 실시형태들에서, 상단 전극 (210) 은 인클로저 (102) 의 제 1 벽 (또는 커버 (110)) 의 부분이고, 전극 활성화 기판 (206) 및 하단 전극 (204) 은 인클로저 (102) 의 제 2 벽 (또는 지지 구조 (104)) 의 부분이다. 영역/챔버 (202) 는 제 1 벽과 제 2 벽 사이에 있을 수 있다. 다른 실시형태들에서, 전극 (210) 은 제 2 벽 (또는 지지 구조 (104)) 의 부분이고, 하나 또는 양자 모두의 전극 활성화 기판 (206) 및/또는 전극 (210) 은 제 1 벽 (또는 커버 (110)) 의 부분이다. 또한, 광원 (216) 은 대안으로 아래로부터 인클로저 (102) 를 조명하도록 사용될 수 있다.
DEP 구성을 갖는 도 1b 및 도 1c 의 미세유체 디바이스 (200) 로, 동기 모듈 (162) 은, 마이크로-객체를 둘러싸고 캡처하는 패턴 (예를 들어, 정사각형 패턴 (220)) 에서 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 의 DEP 전극 영역들 (214a) 에서 하나 이상의 DEP 전극들의 제 1 세트를 활성화시키도록 광 패턴 (218) 을 미세유체 디바이스 (200) 로 프로젝팅함으로써 영역/챔버 (202) 내의 매질 (180) 에서 마이크로-객체 (미도시) 를 선택할 수 있다. 동기 모듈 (162) 은 그 후, DEP 전극 영역들 (214) 에서 하나 이상의 DEP 전극들의 제 2 세트를 활성화시키도록 미세유체 디바이스 (200) 에 대해 광 패턴 (218) 을 이동시킴으로써 인 시츄 생성된 캡처된 마이크로-객체를 이동시킬 수 있다. 대안으로, 미세유체 디바이스 (200) 는 광 패턴 (218) 에 대해 이동될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (200) 는 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 에서 DEP 전극들의 광 활성화에 의존하지 않는 DEP 구성을 가질 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 적어도 하나의 전극을 포함하는 표면 (예를 들어, 커버 (110)) 의 반대편에 위치된 선택적으로 어드레싱 가능 및 에너자이징 가능한 전극들을 포함할 수 있다. 스위치들 (예를 들어, 반도체 기판에서의 트랜지스터 스위치들) 은 DEP 전극 영역들 (214) 에서 DEP 전극들을 활성화 또는 비활성화시키도록 선택적으로 개방 및 폐쇄될 수도 있고, 이에 의해 활성화된 DEP 전극들 근처에서 영역/챔버 (202) 내의 마이크로-객체 (미도시) 상에 순 (net) DEP 힘을 생성한다. 영역/챔버 (202) 에서 마이크로-객체들 및/또는 매질 (미도시) 의 유전 특성들 및 전원 (212) 의 주파수와 같은 이러한 특징들에 따라, DEP 힘은 부근의 마이크로-객체를 끌어당기거나 밀어낼 수 있다. (예를 들어, 정사각형 패턴 (220) 을 형성하는 DEP 전극 영역들 (214) 의 세트에서) DEP 전극들의 세트를 선택적으로 활성화 및 비활성화시킴으로써, 영역/챔버 (202) 내의 하나 이상의 마이크로-객체들은 영역/챔버 (202) 내에서 트랩 및 이동될 수 있다. 도 1a 에서의 동기 모듈 (162) 은 이러한 스위치들을 제어하고, 따라서 영역/챔버 (202) 주변의 특정한 마이크로-객체들 (미도시) 을 선택, 트랩, 및 이동시키도록 DEP 전극들 중 개별의 전극들을 활성화 및 비활성화시킬 수 있다. 선택적으로 어드레싱 가능 및 에너자이징 가능한 전극들을 포함하는 DEP 구성을 갖는 미세유체 디바이스들은 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들어 미국특허 제 6,294,063 (Becker 등) 및 6,942,776 (Medoro) 에서 설명되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다.
또 다른 예로서, 미세유체 디바이스 (200) 는 전기습윤 (EW) 구성을 가질 수 있으며, 이것은 DEP 구성 대신일 수 있거나 DEP 구성을 갖는 부분으로부터 분리된 미세유체 디바이스 (200) 의 부분에 위치될 수 있다. EW 구성은 광-전기습윤 구성 또는 유전체상의 전기습윤 (EWOD) 구성일 수도 있으며, 이들 양자는 본 기술에서 알려져 있다. 일부 EW 구성들에서, 지지 구조 (104) 는 유전체층 (미도시) 과 하부 전극 (204) 사이에 샌드위치된 전극 활성화 기판 (206) 을 갖는다. 유전체층은 이하에 기술되는 바와 같이 소수성 재료를 포함할 수 있고 및/또는 소수성 재료로 코팅될 수 있다. EW 구성을 갖는 미세유체 디바이스들 (200) 의 경우, 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) 은 유전체층의 내부 표면 또는 그것의 소수성 코팅이다.
유전체층 (미도시) 은 하나 이상의 산화물 층들을 포함할 수 있고, 약 50 nm 내지 약 250 nm (예를 들어, 약 125 nm 내지 약 175 nm) 의 두께를 가질 수 있다. 소정의 실시형태들에서, 유전체층은 금속 산화물 (예를 들어, 알루미늄 산화물 또는 하프늄 산화물) 과 같은 산화물의 층을 포함할 수도 있다. 소정의 실시형태들에서, 유전체층은 실리콘 산화물 또는 질화물과 같은, 금속 산화물 이외의 유전체 재료를 포함할 수 있다. 정확한 조성 및 두께에 관계 없이, 유전체층은 약 10 kOhms 내지 약 50 kOhms 의 임피던스를 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 영역/채널 (202) 를 향해 내부로 마주하는 유전체층의 표면은 소수성 재료로 코팅된다. 소수성 재료는 예를 들어 플루오리네이티드 카본 분자들을 포함할 수 있다. 플루오리네이티드 카본 분자들의 예들은 폴리테트라플루오로에틸렌 (예를 들어, TEFLON®) 또는 폴리(2,3-디플루오로메틸렌일-퍼플루오로테트라하이드로퓨란) (예를 들어, CYTOPTM) 과 같은 퍼플루오로-폴리머들을 포함한다. 소수서 재료를 구성하는 분자들은 유전체층의 표면에 공유결합될 수 있다. 예를 들어, 소수성 재료의 분자들은 실록산 기, 포스포닉 애시드 기, 또는 티올 기와 같은 연결자에 의해 유전체층의 표면에 공유결합될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 소수성 재료는 알킬-말단 실록산, 알킬-말단 포스포닉 애시드, 또는 알킬-말단 티올을 포함할 수 있다. 일킬 기는 (예를 들어, 적어도 10 개의 탄소들, 또는 적어도 16, 18, 20, 22 개 또는 그 이상의 탄소들의 사슬을 갖는) 긴-사슬 탄화수소들일 수 있다. 대안적으로, 플루오리네이티드 (또는, 퍼플루오리네이티드) 카본 사슬들이 알킬 기들을 대신하여 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 소수성 재료는 플루오로알킬-말단 실록산, 플루오로알킬-말단 포스포닉 애시드, 또는 플루오로알킬-말단 티올을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 소수성 코팅은 약 10 nm 내지 약 50 nm 의 두께를 갖는다. 다른 실시형태들에서, 소수성 코팅은 10 nm 미만 (예를 들어, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 내지 3.0 nm) 의 두께를 갖는다.
일부 실시형태들에서, 전기습윤 구성을 갖는 미세유체 디바이스 (200) 의 커버 (110) 는 마찬가지로 소수성 재료 (미도시) 로 코팅된다. 소수성 재료는 지지 구조 (104) 의 유전체층을 코팅하기 위해 사용되는 동일한 소수성 재료일 수 있고, 소수성 코팅은 지지 구조 (104) 의 유전체층상의 소수성 코팅의 두께와 실질적으로 동일한 두께를 가질 수 있다. 게다가, 커버 (110) 는 지지 구조 (104) 의 방식으로, 유전체층과 상부 전극 (210) 사이에 샌드위치된 전극 활성화 기판 (206) 을 포함할 수 있다. 커버 (110) 의 전극 활성화 기판 (206) 및 유전체층은 지지 구조 (104) 의 전극 활성화 기판 (206) 및 유전체층과 동일한 조성 및/또는 치수들을 가질 수 있다. 따라서, 미세유체 디바이스 (200) 는 2 개의 전기습윤 표면들을 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 상술된 바와 같은 광도전 재료를 포함할 수 있다. 이에 따라, 소정의 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 수소화 비정질 실리콘 (a-Si:H) 의 층을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. a-Si:H 는, 예를 들어 (100 * 수소 원자들의 수/수소 및 규소 원자들의 총 수로서 계산된) 약 8% 내지 40% 수소를 포함할 수 있다. a-Si:H 의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 ㎛의 두께를 가질 수 있다. 대안적으로, 전극 활성화 기판 (206) 은 상술된 바와 같이 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어되는 전극들 (예를 들어, 도전성 금속 전극들) 을 포함할 수 있다. 광-전기습윤 구성을 갖는 미세유체 디바이스들은 본 기술에서 알려져 있고 및/또는 본 기술에서 알려져 있는 전극 활성화 기판들로 구성될 수 있다. 예를 들어, 그 전체 내용들이 참조로 여기에 포힘되는 미국 특허 제 6,958,132 호 (Chiou 등) 는 a-Si:H 와 같은 광도전성 재료를 갖는 광-전기습윤 구성들을 개시하는 반면, 상술된 미국 특허 공보 제 2014/0124370 호 (Short 등) 는 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어되는 전극들을 갖는 전극 활성화 기판들을 개시한다.
미세유체 디바이스 (200) 는 따라서 광-전기습윤 구성을 가질 수 있고, 광 패턴들 (218) 은 전극 활성화 기판 (206) 에서의 광도전성 EW 영역들 또는 광응답성 EW 전극들을 활성화하기 위해 사용될 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 의 그러한 활성화된 EW 영역들 또는 EW 전극들은 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) (즉, 오버레이잉 유전체층 또는 그것의 소수성 코팅의 내부 표면) 에서 전기습윤력을 생성할 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 상에 입사하는 광 패턴들 (218) 을 변경함으로써 (또는 광원 (216) 에 대해 미세유체 디바이스 (200) 를 이동시킴으로써), 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) 과 접촉하는 (예를 들어, 수성 매질, 용액, 또는 용매를 포함하는) 액적들이 영역/챔버 (202) 에 존재하는 비혼성 유체 (예를 들어, 오일 매질) 를 통해 이동될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스들 (200) 은 EWOD 구성을 가질 수 있고, 전극 활성화 기판 (206) 은 활성화를 위해 광에 의존하지 않는 선택적으로 어드레싱가능한 및 에너자이징가능한 전극들을 포함할 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 은 따라서 그러한 전기습윤 (EW) 전극들의 패턴을 포함할 수 있다. 그 패턴은 예를 들어 도 2b 에 도시된 바와 같은 열들 및 행들로 배열된 실질적으로 정사각형 EW 전극들의 어레이일 수 있다. 대안적으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각형 EW 전극들의 어레이일 수 있다. 패턴에 관계없이, EW 전극들은 전기 스위치들 (예를 들어, 반도체 기판 내의 트랜지스터 스위치들) 에 의해 선택적으로 활성화 (또는 활성화해제) 될 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 내의 EW 전극들을 선택적으로 활성화 및 활성화해제함으로써, 오버레이잉 유전체층 또는 그것의 소수성 코팅의 내부 표면 (208) 과 접촉하는 액적들 (미도시) 은 영역/챔버 (202) 내에서 이동될 수 있다. 도 1a 에서의 동기 모듈 (162) 은 그러한 스위치들을 제어할 수 있고 따라서 영역/챔버 (202) 주위의 특정의 액적들을 선택하고 이동시키기 위해 개개의 EW 전극들을 활성화 및 활성화해제할 수 있다. 선택적으로 어드레싱가능한 및 에너자이징가능한 전극들을 갖는 EWOD 구성을 갖는 미세유체 디바이스들은 본 기술에서 알려져 있고 예를 들어 미국 특허 제 8,685,344 호 (Sundarsan 등) 에 기술되었으며, 이것의 전체 내용들은 참조에 의해 여기에 포함된다.
미세유체 디바이스 (200) 의 구성에 관계없이, 전원 (212) 은 미세유체 디바이스 (200) 의 전기 회로들에 전력을 공급하는 전위 (예를 들어, AC 전압 전위) 를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 전원 (212) 은 도 1 에서 참조되는 전원 (192) 과 동일하거나, 그 전원의 컴포넌트일 수 있다. 전원 (212) 은 상부 전극 (210) 및 하부 전극 (204) 에 AC 전압 및/또는 전류를 제공하도록 구성될 수 있다. AC 전압의 경우, 전원 (212) 은 상술된 바와 같이 영역/챔버 (202) 내에서 개개의 마이크로-객체들 (미도시) 을 트랩하고 이동시키며, 및/또는 또한 상술된 바와 같이 영역/챔버 (202) 에서 지지 구조 (104) (예를 들어, 유전체층 및/또는 유전체층상의 소수성 코팅) 의 내부 표면 (208) 의 습윤 특성들을 변경하기에 충분히 강한 네트 DEP 힘들 (또는 습윤력들) 을 발생시키기에 충부난 주파수 범위 및 평균 또는 피크 전력 (예를 들어, 전압 또는 전류) 범위를 제공할 수 있다. 그러한 주파수 범위들 및 평균 또는 피크 전력 범위들은 본 기술에서 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,958,132 호 (Chiou 등), 미국 특허 제 RE44,711 (Wu 등) (미국특허 제 7,612,355 호로서 이슈됨), 및 미국 특허 출원 공개 제 US2014/0124370 호 (Short 등), 제 US2015/0306598 호 (Khandros 등) 및 제 US2015/0306599 호 (Khandros 등) 참조.
격리 펜들. 일반적인 격리 펜들 (224, 226, 및 228) 의 비-제한 예들은 도 2a 내지 도 2c 에 도시된 미세유체 디바이스 (230) 내에 도시된다. 각각의 격리 펜 (224, 226, 및 228) 는 고립 영역 (240) 및 고립 영역 (240) 을 미세유체 채널 (122) 에 유동성으로 접속시키는 접속 영역 (236) 을 정의하는 고립 구조 (232) 를 포함할 수 있다. 접속 영역 (236) 은 미세유체 채널 (122) 로의 근위 (proximal) 개구 (234) 및 고립 영역 (240) 로의 원위 (distal) 개구 (238) 를 포함할 수 있다. 접속 영역 (236) 은, 채널 (122) 로부터 격리 펜 (224, 226, 228) 안으로 유동하는 유체 매질 (미도시) 의 흐름의 최대 침투 깊이가 고립 영역 (240) 안으로 확장하지 않도록 구성될 수 있다. 따라서, 접속 영역 (236) 으로 인해, 격리 펜 (224, 226, 228) 의 고립 영역 (240) 에 배치된 마이크로-객체 (미도시) 또는 다른 재료 (미도시) 는 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 흐름으로부터 고립될 수 있고, 실질적으로 이에 의해 영향을 받지 않는다.
도 2a 내지 도 2c 의 격리 펜들 (224, 226, 및 228) 은 각각 미세유체 채널 (122) 에 대해 직접 개방하는 단일 개구를 갖는다. 격리 펜의 개구는 미세유체 채널 (122) 로부터 측면방향으로 개방된다. 전극 활성화 기판 (206) 은 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜들 (224, 226, 및 228) 양자의 아래에 놓인다. 격리 펜의 바닥을 형성하는, 격리 펜의 인클로저 내의 전극 활성화 기판 (206) 의 상부 표면은 미세유체 디바이스의 흐름 채널 (또는 각각, 흐름 영역) 의 바닥을 형성하는, 미세유체 채널 (122) (또는 채널이 존재하지 않는 경우 흐름 영역) 내의 전극 활성화 기판 (206) 의 상부 표면의 동일한 레벨 또는 실질적으로 동일한 레벨에 배치된다. 전극 활성화 기판 (206) 은 피쳐리스 (featureless) 일 수도 있거나 그것의 최고 고도로부터 그것의 최저 함몰부까지 약 3 미크론 이하만큼, 2.5 미크론, 2 미크론, 1.5 미크론, 1 미크론, 0.9 미크론, 0.5 미크론, 0.4 미크론, 0.2 미크론, 0.1 미크론 이하만큼 변화하는 불규칙적이거나 패터닝된 표면을 가질 수도 있다. 미세유체 채널 (122) (또는 흐름 영역) 및 격리 펜들 양자에 걸친 기판의 상부 표면에서의 고도의 변동은 격리 펜의 벽들 또는 미세유체 디바이스의 벽들의 높이의 약 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.5%, 0.3% 또는 0.1% 보다 작을 수도 있다. 미세유체 디바이스 (200) 에 대해 상세히 설명되지만, 이것은 또한 여기에 기술된 미세유체 디바이스들 (100, 230, 250, 280, 290, 300, 400, 500, 900, 1000, 1100, 1200) 중 임의의 것에 적용된다.
미세유체 채널 (122) 은 따라서, 스윕 영역의 일 예일 수 있고, 격리 펜들 (224, 226, 228) 의 고립 영역들 (240) 은 스윕되지 않은 영역들의 예들일 수 있다. 주목된 바와 같이, 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜들 (224, 226, 228) 은 하나 이상의 유체 매질 (180) 을 포함하도록 구성될 수 있다. 도 2a 및 도 2b 에 도시된 예에서, 포트들 (222) 은 미세유체 채널 (122) 에 접속되고 유체 매질 (180) 이 미세유체 디바이스 (230) 안으로 도입되거나 이로부터 제거되는 것을 허용한다. 유체 매질 (180) 의 도입 전에, 미세유체 디바이스는 이산화탄소 기체와 같은 기체로 프라이밍될 수도 있다. 일단, 미세유체 디바이스 (230) 가 유체 매질 (180) 을 포함하면, 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 은 선택적으로 생성 및 정지될 수 있다. 예를 들어, 도시된 바와 같이 포트들 (222) 은 미세유체 채널 (122) 의 상이한 로케이션들 (예를 들어, 반대편 단부들) 에 배치될 수 있고, 매질의 흐름 (242) 은 인렛로서 기능하는 하나의 포트 (222) 로부터 아웃렛으로서 기능하는 다른 포트 (222) 로 생성될 수 있다.
도 2c 는 본 개시에 따른 격리 펜 (224) 의 일 예의 상세 뷰를 예시한다. 마이크로-객체들 (246) 의 예들이 또한, 도시된다.
알려진 바와 같이, 격리 펜 (224) 의 근위 개구 (234) 를 지나 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 은 격리 펜 (224) 의 안 및/또는 밖으로의 매질 (180) 의 세컨더리 흐름 (244) 을 야기할 수 있다. 격리 펜 (224) 의 고립 영역 (240) 에서 마이크로-객체들 (246) 을 세컨더리 흐름 (244) 으로부터 고립시키기 위해, (즉, 근위 개구 (234) 로부터 원위 개구 (238) 로의) 격리 펜 (224) 의 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 는 세컨더리 흐름 (244) 의 접속 영역 (236) 안으로의 침투 깊이 (Dp) 보다 커야 한다. 세컨더리 흐름 (244) 의 침투 깊이 (Dp) 는 미세유체 채널 (122) 에서 유동하는 유체 매질 (180) 의 속도 및 미세유체 채널 (122) 및 미세유체 채널 (122) 에 대한 접속 영역 (236) 의 근위 개구 (234) 의 구성에 관련한 다양한 파라미터들에 의존한다. 소정의 미세유체 디바이스에 대해, 미세유체 채널 (122) 및 개구 (234) 의 구성들은 고정될 것이지만 반면에, 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 의 속도는 가변적일 것이다. 따라서, 각각의 격리 펜 (224) 에 대해, 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 대한 최대 속도 (Vmax) 는, 세컨더리 흐름 (244) 의 침투 깊이 (Dp) 가 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 를 초과하지 않는 것을 보장하도록 식별될 수 있다. 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 의 속도가 최대 속도 (Vmax) 를 초과하지 않는 한, 결과의 세컨더리 흐름 (244) 은 미세유체 채널 (122) 및 접속 영역 (236) 에 제한되고 고립 영역 (240) 밖에서 유지될 수 있다. 미세유체 채널 (122) 에서 매질 (180) 의 흐름 (242) 은 따라서, 마이크로-객체들 (246) 을 고립 영역 (240) 밖으로 인출하지 않을 것이다. 차라리, 고립 영역 (240) 에 위치된 마이크로-객체들 (246) 은 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 관계없이 고립 영역 (240) 에 머무를 것이다.
또한, 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 흐름 (242) 의 속도가 Vmax 를 초과하지 않는 한, 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 은 미세유체 채널 (122) 로부터 격리 펜 (224) 의 고립 영역 (240) 으로 잡다한 입자들 (예를 들어, 마이크로입자들 및/또는 나노입자들) 을 이동시키지 않을 것이다. 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 가 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 더 큰 것은 따라서, 미세유체 채널 (122) 또는 다른 격리 펜 (예를 들어, 도 2d 에서 격리 펜들 (226, 228)) 로부터의 잡다한 입자들로 하나의 격리 펜 (224) 의 오염을 방지할 수 있다.
격리 펜들 (224, 226, 228) 의 접속 영역들 (236) 및 미세유체 채널 (122) 이 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 미세유체 채널 (122) 및 접속 영역들 (236) 은 미세유체 디바이스 (230) 의 스윕 (또는 흐름) 영역들로 간주될 수 있다. 한편, 격리 펜들 (224, 226, 228) 의 고립 영역들 (240) 은, 스윕되지 않은 (또는 비-흐름) 영역들로 간주될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 채널 (122) 에서의 제 1 유체 매질 (180) 내의 성분들 (미도시) 은 미세유체 채널 (122) 로부터 접속 영역 (236) 을 통해 그리고 고립 영역 (240) 내의 제 2 유체 매질 (248) 로의 제 1 매질 (180) 의 성분들의 확산에 의해서만 실질적으로, 고립 영역 (240) 에서 제 2 유체 매질 (280) 와 혼합할 수 있다. 유사하게, 고립 영역 (240) 에서의 제 2 매질 (248) 의 성분들 (미도시) 은 고립 영역 (240) 으로부터 접속 영역 (236) 을 통해 그리고 미세유체 채널 (122) 의 제 1 매질 (180) 안으로 제 2 매질 (248) 의 성분들의 확산에 의해서만 실질적으로, 미세유체 채널 (122) 에서 제 1 매질 (180) 과 혼합할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 확산에 의한 격리 펜의 고립 영역과 흐름 영역 사이의 유체 매질 교환의 정도는 유체 교환의 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 보다 더 크거나 약 99% 보다 더 크다. 제 1 매질 (180) 은 제 2 매질 (248) 와 동일한 매질이거나 상이한 매질일 수 있다. 또한, 제 1 매질 (180) 및 제 2 매질 (248) 는 동일하게 시작하고, 그 후 (예를 들어, 고립 영역 (240) 에서 하나 이상의 세포들에 의해 제 2 매질 (248) 의 조절을 통해, 또는 미세유체 채널 (122) 을 통해 유동하는 매질 (180) 을 변경함으로써) 상이하게 될 수 있다.
미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 의해 야기된 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 는, 위에서 언급된 바와 같이 다수의 파라미터들에 의존할 수 있다. 이러한 파라미터들의 예들은: 미세유체 채널 (122) 의 형상 (예를 들어, 미세유체 채널은 접속 영역 (236) 안으로 매질을 지향시키고, 접속 영역 (236) 으로부터 멀리 매질을 전환시키고, 또는 접속 영역 (236) 의 근위 개구 (234) 에 실질적으로 수직한 방향에서 매질을 미세유체 채널 (122) 로 지향시킬 수 있음); 근위 개구 (234) 에서 미세유체 채널 (122) 의 폭 (Wch)(또는 단면적); 및 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon)(또는 단면적); 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 의 속도 (V); 제 1 매질 (180) 및/또는 제 2 매질 (248) 의 속도 등을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜들 (224, 226, 228) 의 치수들은 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 의 벡터에 대하여 다음과 같이 배향될 수 있다: 미세유체 채널 폭 (Wch)(또는 미세유체 채널 (122) 의 단면적) 은 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 수직할 수 있다; 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon)(또는 단면적) 은 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 평행할 수 있다; 및/또는 접속 영역의 길이 (Lcon) 는 미세유체 채널 (122) 에서 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 수직할 수 있다. 상기는 단지 예들이며, 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜들 (224, 226, 228) 의 상대적 포지션은 서로에 대하여 다른 배향들에 있을 수 있다.
도 2c 에 예시된 바와 같이, 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 로부터 원위 개구 (238) 까지 균일할 수 있다. 따라서, 원위 개구 (238) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 에 대해 본원에 식별된 값들 중 임의의 값일 수 있다. 대안으로, 원위 개구 (238) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 보다 더 클 수 있다.
도 2c 에 예시된 바와 같이, 원위 개구 (238) 에서 고립 영역 (240) 의 폭은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 과 실질적으로 동일할 수 있다. 원위 개구 (238) 에서 고립 영역 (240) 의 폭은 따라서, 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 에 대해 본원에 식별된 값들 중 임의의 값일 수 있다. 대안으로, 원위 개구 (238) 에서 고립 영역 (240) 의 폭은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 보다 더 크거나 또는 더 작을 수 있다. 또한, 원위 개구 (238) 는 근위 개구 (234) 보다 더 작을 수도 있고, 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 와 원위 개구 (238) 사이에서 좁아질 수도 있다. 예를 들어, 접속 영역 (236) 은 다양한 상이한 지오메트리들을 사용하여 (예를 들어, 접속 영역을 챔퍼링, 접속 영역을 베벨링), 근위 개구와 원위 개구 사이에서 좁아질 수도 있다. 또한, 접속 영역 (236) 의 임의의 부분 또는 하위부분 (예를 들어, 근위 개구 (234) 에 인접한 접속 영역의 부분) 이 좁아질 수도 있다.
도 2d 내지 도 2f 는 도 1a 의 각각의 미세유체 디바이스 (100), 회로 (132) 및 채널 (134) 의 변형들인, 미세유체 회로 (262) 및 흐름 채널들 (264) 을 포함하는 미세유체 디바이스 (400) 의 다른 예시적인 실시형태를 도시한다. 미세유체 디바이스 (250) 는 또한, 전술된 격리 펜들 (124, 126, 128, 130, 224, 226 또는 228) 의 추가적인 변형들인 복수의 격리 펜들 (266) 을 갖는다. 특히, 도 2d 내지 도 2f 에 도시된 디바이스 (250) 의 격리 펜들 (266) 은 전술된 디바이스들 (100, 200, 230, 280, 290, 300, 400, 500, 900, 1000, 1100, 1200) 내의 격리 펜들 (124, 126, 128, 130, 224, 226 또는 228) 중 어느 하나를 대체할 수 있다. 마찬가지로, 미세유체 디바이스 (400) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 다른 변형이고, 또한 전술된 미세유체 디바이스 (100, 200, 230, 280, 290, 300, 400, 500, 900, 1000, 1100, 1200), 뿐만 아니라 본원에 설명된 다른 미세유체 시스템 컴포넌트들 중 어느 하나와 동일한 또는 상이한 DEP 구성을 가질 수도 있다.
도 2d 내지 도 2f 의 미세유체 디바이스 (250) 는 지지 구조 (도 2d 내지 도 2f 에서 보이지 않지만, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 와 동일하거나 일반적으로 유사할 수 있음), 미세유체 회로 구조 (256), 및 커버 (도 2d 내지 도 2f 에서 보이지 않지만, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 커버 (122) 와 동일하거나 일반적으로 유사할 수도 있음) 를 포함한다. 미세유체 회로 구조 (256) 는, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 프레임 (252) 및 미세유체 회로 재료 (260) 와 동일하거나 또는 일반적으로 유사할 수 있는 프레임 (252) 및 미세유체 회로 재료 (260) 를 포함한다. 도 2d 에 나타낸 바와 같이, 미세유체 회로 재료 (260) 에 의해 정의된 미세유체 회로 (262) 는 다수의 격리 펜들 (266) 이 유동적으로 접속되는 다수의 채널들 (264)(2 개가 도시되지만 더 많이 존재할 수 있음) 을 포함할 수 있다.
각각의 격리 펜 (266) 는 고립 구조 (272), 고립 구조 (272) 내의 고립 영역 (270), 및 접속 영역 (268) 을 포함할 수 있다. 미세유체 채널 (264) 에서의 근위 개구 (274) 로부터 고립 구조 (272) 에서의 원위 개구 (276) 까지, 접속 영역 (268) 은 미세유체 채널 (264) 을 고립 영역 (270) 에 유동적으로 접속시킨다. 일반적으로, 도 2b 및 도 2c 의 상기 논의에 따르면, 미세유체 채널 (264) 에서 제 1 유체 매질 (254) 의 흐름 (278) 은 미세유체 채널 (264) 로부터 격리 펜들 (266) 의 각각의 접속 영역들 (268) 안으로 및/또는 밖으로 제 1 매질 (254) 의 세컨더리 흐름들 (282) 을 생성할 수 있다.
도 2e 에 예시된 바와 같이, 각각의 격리 펜 (266) 의 접속 영역 (268) 은 일반적으로, 미세유체 채널 (264) 로의 근위 개구 (274) 와 고립 구조 (272) 로의 원위 개구 (276) 사이에서 확장하는 영역을 포함한다. 접속 영역 (268) 의 길이 (Lcon) 는 세컨더리 흐름 (282) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 더 클 수 있고, 이 경우에서 세컨더리 흐름 (282) 은 (도 2d 에 도시된 바와 같이) 고립 영역 (270) 을 향해 재지향되지 않고 접속 영역 (268) 으로 확장할 것이다. 대안으로, 도 2f 에 예시된 바와 같이, 접속 영역 (268) 은 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 작은 길이 (Lcon) 를 가질 수 있고, 이 경우에서 세컨더리 흐름 (282) 은 접속 영역 (268) 을 통해 확장하고 고립 영역 (270) 을 향해 재지향될 것이다. 이 후자의 상황에서, 접속 영역 (268) 의 길이들 (LC1 및 LC2) 의 합은 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 커서, 세컨더리 흐름 (282) 이 고립 영역 (270) 안으로 확장하지 않을 것이다. 접속 영역 (268) 의 길이 (Lcon) 가 침투 깊이 (Dp) 보다 크든 아니든, 또는 접속 영역 (268) 의 길이들 (LC1 및 LC2) 의 합이 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 크든 아니든, 최대 속도 (Vmax) 를 초과하지 않는 미세유체 채널 (264) 에서의 제 1 매질 (254) 의 흐름 (278) 은 침투 깊이 (Dp) 를 갖는 세컨더리 흐름을 생성할 것이고, 격리 펜 (266) 의 고립 영역 (270) 에서 마이크로-객체들 (도시되지 않지만, 도 2e 에 도시된 마이크로-객체들 (246) 과 동일하거나 또는 일반적으로 유사할 수 있음) 은 미세유체 채널 (264) 에서 제 1 매질 (254) 의 흐름 (278) 에 의해 고립 영역 (270) 밖으로 인출되지 않을 것이다. 또한, 미세유체 채널 (264) 에서의 흐름 (278) 은 미세유체 채널 (264) 로부터 격리 펜 (266) 의 고립 영역 (270) 안으로 잡다한 재료들 (미도시) 을 인출하지도 않을 것이다. 이와 같이, 확산은, 미세유체 채널 (264) 에서 제 1 매질 (254) 내의 성분들이 미세유체 채널 (264) 로부터 격리 펜 (266) 의 고립 영역 (270) 내의 제 2 매질 (258) 로 이동할 수 있는 유일한 메커니즘이다. 마찬가지로, 확산은, 격리 펜 (266) 의 고립 영역 (270) 에서의 제 2 매질 (258) 내의 성분들이 고립 영역 (270) 으로부터 미세유체 채널 (264) 내의 제 1 매질 (254) 로 이동할 수 있는 유일한 메커니즘이다. 제 1 매질 (254) 은 제 2 매질 (258) 과 동일한 매질일 수 있고, 또는 제 1 매질 (254) 은 제 2 매질 (258) 과 상이한 매질일 수 있다. 대안으로, 제 1 매질 (254) 및 제 2 매질 (258) 는 동일하게 시작할 수 있고, 그 후 예를 들어 고립 영역 (270) 내의 하나 이상의 세포들에 의한 제 2 매질의 조절을 통해, 또는 미세유체 채널 (264) 을 통해 유동하는 매질을 변경함으로써 상이하게 될 수 있다.
도 2e 에 예시된 바와 같이, 미세유체 채널 (264) 내의 (즉, 도 2d 에서 화살표들 (482) 에 의해 표시된 미세유체 채널을 통한 유체 매질 흐름의 방향을 가로질러 취해진) 미세유체 채널들 (264) 의 폭 (Wch) 은 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 에 실질적으로 수직하고 따라서 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 에 실질적으로 평행할 수 있다. 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 및 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 은 그러나, 서로 실질적으로 수직할 필요는 없다. 예를 들어, 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 이 배향되는 축 (미도시) 과 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 이 배향되는 다른 축 간의 각도는 수직 외 및 따라서 90°이외일 수 있다. 다르게 배향된 각도들의 예들은 약 30°내지 약 90°, 약 45°내지 약 90°, 약 60°내지 약 90°등의 각도들을 포함한다.
격리 펜들 (예를 들어, 124, 126, 128, 130, 224, 226, 228, 또는 266) 의 다양한 실시형태들에서, 고립 영역 (예를 들어, 240 또는 270) 은 복수의 마이크로-객체들을 포함하도록 구성된다. 다른 실시형태들에서, 고립 영역은 단지 1, 2, 3, 4, 5, 또는 유사한 상대적으로 작은 수의 마이크로-객체들 만을 포함하도록 구성될 수 있다. 따라서, 고립 영역의 체적은, 예를 들어 적어도 1x106, 2x106, 4x106, 6x106 세제곱 마이크론, 또는 그 이상일 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 폭 (Wch) 은 약 50-1000 마이크론, 50-500 마이크론, 50-400 마이크론, 50-300 마이크론, 50-250 마이크론, 50-200 마이크론, 50-150 마이크론, 50-100 마이크론, 70-500 마이크론, 70-400 마이크론, 70-300 마이크론, 70-250 마이크론, 70-200 마이크론, 70-150 마이크론, 90-400 마이크론, 90-300 마이크론, 90-250 마이크론, 90-200 마이크론, 90-150 마이크론, 100-300 마이크론, 100-250 마이크론, 100-200 마이크론, 100-150 마이크론, 또는 100-120 마이크론일 수 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 폭 (Wch) 은 약 200-800 마이크론, 200-700 마이크론, 또는 200-600 마이크론일 수 있다. 상기의 것은 단지 예들이며, 미세유체 채널 (122) 의 폭 (Wch) 은 위에 열거된 엔드포인트들 중 임의의 것 내의 임의의 폭일 수 있다. 또한, 미세유체 채널 (122) 의 폭 (Wch) 은 격리 펜의 근위 개구 외의 미세유체 채널의 영역들에서 이들 폭들 중 임의의 폭에 있도록 선택될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 격리 펜은 약 30 내지 약 200 마이크론, 또는 약 50 내지 약 150 마이크론의 높이를 갖는다. 일부 실시형태들에서, 격리 펜은 약 1x104 내지 3x106 제곱 마이크론, 2x104 내지 2x106 제곱 마이크론, 4x104 내지 1x106 제곱 마이크론, 2x104 내지 5x105 제곱 마이크론, 2x104 내지 1x105 제곱 마이크론 또는 약 2x105 내지 2x106 제곱 마이크론의 단면적을 갖는다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 높이 (Hch) 는 다음의 높이들 중 임의의 것 내의 높이일 수 있다: 20-100 마이크론, 20-90 마이크론, 20-80 마이크론, 20-70 마이크론, 20-60 마이크론, 20-50 마이크론, 30-100 마이크론, 30-90 마이크론, 30-80 마이크론, 30-70 마이크론, 30-60 마이크론, 30-50 마이크론, 40-100 마이크론, 40-90 마이크론, 40-80 마이크론, 40-70 마이크론, 40-60 마이크론, 또는 40-50 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 높이 (Hch) 는 위에서 열거된 엔드포인트들 중 임의의 것 내의 높이일 수 있다. 미세유체 채널 (122) 의 높이 (Hch) 는 격리 펜의 근위 개구 이외의 미세유체 채널의 영역들에서 이들 높이들 중 임의의 높이에 있도록 선택될 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 단면적은 약 500-50,000 제곱 마이크론, 500-40,000 제곱 마이크론, 500-30,000 제곱 마이크론, 500-25,000 제곱 마이크론, 500-20,000 제곱 마이크론, 500-15,000 제곱 마이크론, 500-10,000 제곱 마이크론, 500-7,500 제곱 마이크론, 500-5,000 제곱 마이크론, 1,000-25,000 제곱 마이크론, 1,000-20,000 제곱 마이크론, 1,000-15,000 제곱 마이크론, 1,000-10,000 제곱 마이크론, 1,000-7,500 제곱 마이크론, 1,000-5,000 제곱 마이크론, 2,000-20,000 제곱 마이크론, 2,000-15,000 제곱 마이크론, 2,000-10,000 제곱 마이크론, 2,000-7,500 제곱 마이크론, 2,000-6,000 제곱 마이크론, 3,000-20,000 제곱 마이크론, 3,000-15,000 제곱 마이크론, 3,000-10,000 제곱 마이크론, 3,000-7,500 제곱 마이크론, 또는 3,000 내지 6,000 제곱 마이크론일 수 있다. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 단면적은 위에서 열거된 엔드포인트들 중 임의의 것 내의 임의의 면적일 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 길이 (Lcon) 는 약 1-600 마이크론, 5-550 마이크론, 10-500 마이크론, 15-400 마이크론, 20-300 마이크론, 20-500 마이크론, 40-400 마이크론, 60-300 마이크론, 80-200 마이크론, 또는 약 100-150 마이크론일 수 있다. 상기의 것은 단지 예들이며, 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 길이 (Lcon) 는 위에서 열거된 엔드포인트들 중 임의의 것 내의 임의의 길이에 있을 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 은 약 20-500 마이크론, 20-400 마이크론, 20-300 마이크론, 20-200 마이크론, 20-150 마이크론, 20-100 마이크론, 20-80 마이크론, 20-60 마이크론, 30-400 마이크론, 30-300 마이크론, 30-200 마이크론, 30-150 마이크론, 30-100 마이크론, 30-80 마이크론, 30-60 마이크론, 40-300 마이크론, 40-200 마이크론, 40-150 마이크론, 40-100 마이크론, 40-80 마이크론, 40-60 마이크론, 50-250 마이크론, 50-200 마이크론, 50-150 마이크론, 50-100 마이크론, 50-80 마이크론, 60-200 마이크론, 60-150 마이크론, 60-100 마이크론, 60-80 마이크론, 70-150 마이크론, 70-100 마이크론, 또는 80-100 마이크론일 수 있다. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 은 상기 예들과 상이할 수 있다 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 임의의 것 내의 임의의 값).
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 은 적어도 격리 펜이 그에 대해 의도되는 마이크로-객체 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 난자 또는 배아일 수도 있는 생물학적 세포) 의 최대 치수만큼 클 수 있다. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 은 상기 예들과 상이할 수 있다 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 임의의 것 내의 폭) .
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 접속 영역의 근위 개구의 폭 (Wpr) 은 적어도 격리 펜이 그에 대해 의도되는 마이크로-객체 (예를 들어, 세포와 같은 생물학적 마이크로-객체) 의 최대 치수만큼 클 수도 있다. 예를 들어, 폭 (Wpr) 은 약 50 마이크론, 약 60 마이크론, 약 100 마이크론, 약 200 마이크론, 약 300 마이크론일 수도 있거나, 약 50-300 마이크론, 약 50-200 마이크론, 약 50-100 마이크론, 약 75-150 마이크론, 약 75-100 마이크론, 또는 약 200-300 마이크론일 수도 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 길이 (Lcon) 대 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 의 비율은 다음의 비율들 중 어느 하나 이상일 수 있다: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 또는 그 이상. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 대 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 의 비율은 상기 예들과 상이할 수 있다.
미세유체 디바이스들 (100, 200, 230, 250, 280, 290, 300, 400, 500, 900, 1000, 1100, 1200) 의 다양한 실시형태들에서, Vmax 는 대략 0.2, 0.5, 0.7, 1.0, 1.3, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.7, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 마이크로리터/초로 설정될 수 있다.
격리 펜들을 갖는 미세유체 디바이스들의 다양한 실시형태들에서, 격리 펜의 고립 영역 (예를 들어, 240) 의 체적은, 예를 들어 적어도 5x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 6x106, 8x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, 또는 8x108 세제곱 마이크론, 또는 그 이상일 수 있다. 격리 펜들을 갖는 미세유체 디바이스들의 다양한 실시형태들에서, 격리 펜의 체적은 약 5x105, 6x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 8x106, 1x107, 3x107, 5x107, 또는 약 8x107 세제곱 마이크론, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 격리 펜의 체적은 약 1 나노미터 내지 약 50 나노미터, 2 나노미터 내지 약 25 나노미터, 2 나노미터 내지 약 20 나노미터, 약 2 나노미터 내지 약 15 나노미터, 또는 약 2 나노미터 내지 약 10 나노미터일 수도 있다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 디바이스는, 본원에 논의된 실시형태들 중 어느 하나로서 구성된 격리 펜들을 갖고, 여기서 미세유체 디바이스는 약 5 내지 약 10 개의 격리 펜들, 약 10 내지 약 50 개의 격리 펜들, 약 100 내지 약 500 개의 격리 펜들; 약 200 내지 약 1000 개의 격리 펜들, 약 500 내지 약 1500 개의 격리 펜들, 약 1000 내지 약 2000 개의 격리 펜들, 약 1000 내지 약 3500 개의 격리 펜들, 약 3000 내지 약 7000 개의 격리 펜들, 약 5000 내지 약10,000 개의 격리 펜들, 약 9000 내지 약 15,000 개의 격리 펜들, 또는 약 12,000 내지 약 20,000 개의 격리 펜들을 갖는다. 격리 펜들은 모두 동일한 사이즈일 필요는 없고 다양한 구성들 (예를 들어, 격리 펜 내의 상이한 폭들, 상이한 특징들) 을 포함할 수도 있다.
여러 실시형태들에서, 격리 펜들 (424, 426, 428, 524, 526, 528, 624, 924, 1024, 1124, 1126, 1424, 1426) 은 임의의 조합으로 여기에 기술된 바와 같은 특징들, 치수들 또는 성분들 중 임의의 것을 가질 수도 있다.
도 2g 는 일 실시형태에 따른 미세유체 디바이스 (280) 를 예시한다. 도 2g 에 예시된 미세유체 디바이스 (280) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 양식화된 다이어그램이다. 실제로, 미세유체 디바이스 (280) 및 그 구성 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 채널들 (122) 및 격리 펜들 (128)) 은 본원에 논의된 치수들을 가질 것이다. 도 2g 에 예시된 미세유체 회로 (120) 는 2 개의 포트들 (107), 4 개의 별개의 채널들 (122) 및 4 개의 별개의 흐름 영역들 (106) 을 갖는다. 미세유체 디바이스 (280) 는 각각의 미세유체 채널 (122) 에서 개방된 복수의 격리 펜들을 더 포함한다. 도 2g 에 예시된 미세유체 디바이스에서, 격리 펜들은 도 2c 에 예시된 펜들과 유사한 지오메트리를 갖고, 따라서 양자의 접속 영역들 및 고립 영역들을 갖는다. 따라서, 미세유체 회로 (120) 는 스윕 영역들 (예를 들어, 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 내의 접속 영역들 (236) 의 부분들 및 채널들 (122)) 및 비-스윕 영역들 (예를 들어, 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 내에 있지 않은 접속 영역들 (236) 의 부분들 및 고립 영역들 (240)) 양자 모두를 포함한다.
도 3a 및 도 3b 는 본 개시에 따른 미세유체 디바이스들 (예를 들어, 100, 200, 230, 250, 280, 290, 300, 400, 500, 900, 1000, 1100, 1200) 을 동작 및 관측하는데 사용될 수 있는 시스템 (150) 의 다양한 실시형태들을 나타낸다. 도 3a 에 예시된 바와 같이, 시스템 (150) 은 미세유체 디바이스 (100)(미도시), 또는 본원에 설명된 임의의 다른 미세유체 디바이스를 홀딩하도록 구성된 구조 ("네스트 (nest)")(300) 를 포함할 수 있다. 네스트 (300) 는 미세유체 디바이스 (320) (예를 들어, 광학적으로-작동된 동전기 디바이스 (100)) 와 인터페이스하고 전원 (192) 으로부터 미세유체 디바이스 (320) 로 전기적 접속들을 제공할 수 있는 소켓 (302) 을 포함할 수 있다. 네스트 (300) 는 집적된 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 더 포함할 수 있다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은, 바이어싱 전압이, 미세유체 디바이스가 소켓 (302) 에 의해 홀딩되는 경우 미세유체 디바이스 (320) 내의 전극들의 쌍 양단에 인가되도록 바이어싱 전압을 소켓 (302) 에 공급하도록 구성될 수 있다. 따라서, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 전원 (192) 의 부분일 수 있다. 미세유체 디바이스 (320) 에 바이어싱 전압을 인가하는 능력은, 바이어싱 전압이, 미세유체 디바이스 (320) 가 소켓 (302) 에 의해 홀딩되는 경우 항상 인가될 것이라는 것을 의미하지는 않는다. 차라리, 대부분의 경우들에서, 바이어싱 전압은 간헐적으로, 예를 들어 미세유체 디바이스 (320) 에서 유전영동 또는 전기습윤과 같은 동전기적 힘들의 생성을 용이하게 하도록 필요할 때에만, 인가될 것이다.
도 3a 에 예시된 바와 같이, 네스트 (300) 는 인쇄 회로 기판 어셈블리 (PCBA)(322) 를 포함할 수 있다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 PCBA (322) 상에 장착되고 이 안에 전기적으로 집적될 수 있다. 예시적인 지지체는 PCBA (322) 상에 또한 장착된 소켓 (302) 을 포함한다.
통상적으로, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 파형 생성기 (미도시) 를 포함할 것이다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 파형 생성기로부터 수신된 파형을 증폭시키도록 구성된 파형 증폭 회로 (미도시) 및/또는 오실로스코프 (미도시) 를 더 포함할 수 있다. 오실로스코프는, 존재하는 경우, 소켓 (302) 에 의해 홀딩된 미세유체 디바이스 (320) 에 인가된 파형을 측정하도록 구성될 수 있다. 소정 실시형태들에서, 오실로스코프는 미세유체 디바이스 (320) 에 근접한 (및 파형 생성기에 대해 먼) 로케이션에서 파형을 측정하고, 따라서 디바이스에 실제로 인가된 파형을 측정하는데 있어서 더 큰 정확도를 보장한다. 오실로스코프 측정으로부터 획득된 데이터는, 예를 들어 파형 생성기에 피드백으로서 제공될 수 있고, 파형 생성기는 이러한 피드백에 기초하여 그 출력을 조정하도록 구성될 수 있다. 적합한 결합형 파형 생성기 및 오실로스코프의 예는 Red Pitaya™ 이다.
소정의 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 제어기 (308), 예컨대 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 감지 및/또는 제어하는데 사용된 마이크로프로세서를 더 포함한다. 적합한 마이크로프로세서들의 예들은 Arduino™ 마이크로프로세서들, 예컨대 Arduino Nano™ 을 포함한다. 제어기 (308) 는 기능들 및 분석을 수행하는데 사용될 수도 있고, 또는 기능들 및 분석을 수행하도록 (도 1a 에 도시된) 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신할 수도 있다. 도 3a 에 예시된 실시형태에서, 제어기 (308) 는 인터페이스 (310)(예를 들어, 플러그 또는 커넥터) 를 통해 마스터 제어기 (154) 와 통신한다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 Red Pitaya™ 파형 생성기/오실로스코프 유닛 ("Red Pitaya 유닛") 및 Red Pitaya 유닛에 의해 생성된 파형을 증폭시키고 증폭된 전압을 미세유체 디바이스 (100) 로 패스하는 파형 증폭 회로를 포함하는 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, Red Pitaya 유닛은 미세유체 디바이스 (320) 에서 증폭된 전압을 측정하고, 그 후, 미세유체 디바이스 (320) 에서 측정된 전압이 원하는 값이도록 필요에 따라 그 자신의 출력 전압을 조정하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 파형 증폭 회로는, 미세유체 디바이스 (100) 에서 최대 13 Vpp 의 신호를 초래하는, PCBA (322) 상에 장착된 DC-DC 컨버터들의 쌍에 의해 생성된 +6.5V 내지 -6.5V 전력 공급을 가질 수 있다.
도 3a 에 예시된 바와 같이, 지지 구조 (300) (예를 들어, 네스트 (nest)) 는 열 제어 서브시스템 (306) 을 더 포함할 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306) 은 지지 구조 (300) 에 의해 홀딩된 미세유체 디바이스 (320) 의 온도를 조절하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 열 제어 서브시스템 (306) 은 펠티어 열전기 디바이스 (미도시) 및 냉각 유닛 (미도시) 을 포함할 수 있다. 펠티어 열전기 디바이스는 미세유체 디바이스 (320) 의 적어도 하나의 표면과 인터페이스하도록 구성된 제 1 표면을 가질 수 있다. 냉각 유닛은, 예를 들어 냉각 블록 (미도시), 예컨대 수냉식 (liquid-cooled) 알루미늄 블록일 수 있다. 펠티어 열전기 디바이스의 제 2 표면 (예를 들어, 제 1 표면의 반대 표면) 은 이러한 냉각 블록의 표면과 인터페이스하도록 구성될 수 있다. 냉각 블록은 냉각 블록을 통해 냉각된 유체를 순환시키도록 구성된 유체 경로 (314) 에 접속될 수 있다. 도 3a 에 예시된 실시형태에서, 지지 구조 (300) 는 인렛 (316) 및 아웃렛 (318) 를 포함하여, 외부 저장소 (미도시) 로부터 냉각된 유체를 수신하고, 냉각된 유체를 유체 경로 (314) 안으로 그리고 냉각 블록을 통해 도입하며, 그 후 냉각된 유체를 외부 저장소로 리턴한다. 일부 실시형태들에서, 펠티어 열전기 디바이스, 냉각 유닛, 및/또는 유체 경로 (314) 는 지지 구조 (300) 의 케이싱 (312) 상에 장착될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 열 제어 서브시스템 (306) 은 미세유체 디바이스 (320) 에 대한 목표 온도를 달성하도록 펠티어 열전기 디바이스의 온도를 조절하도록 구성된다. 펠티어 열전기 디바이스의 온도 조절은, 예를 들어 Pololu™ 열전기 전력 공급기 (Pololu Robotics and Electronics Corp.) 와 같은 열전기 전력 공급기에 의해 달성될 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306) 은 아날로그 회로에 의해 제공된 온도 값과 같은 피드백 회로를 포함할 수 있다. 대안으로, 피드백 회로는 디지털 회로에 의해 제공될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 (예를 들어, 저항 1 kOhm+/-0.1 %, 온도 계수 +/-0.02 ppm/CO 를 갖는) 저항기 및 (예를 들어, 공칭 저항 1 kOhm+/-0.01 % 를 갖는) NTC 서미스터를 포함하는 아날로그 분압기 회로 (미도시) 인 피드백 회로를 갖는 열 제어 서브시스템 (306) 을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 열 제어 서브시스템 (306) 은 피드백 회로로부터의 전압을 측정하고, 그 후 온-보드 PID 제어 루프 알고리즘에 대한 입력으로서 계산된 온도 값을 사용한다. PID 제어 루프 알고리즘으로부터의 출력은, 예를 들어 Pololu™ 모터 드라이브 (미도시) 상에서 방향성 및 펄스-폭-변조 신호 핀 양자 모두를 구동하여 열전기 전력 공급기를 작동시키고, 이에 의해 펠티어 열전기 디바이스를 제어할 수 있다.
네스트 (300) 는, 제어기 (308) 의 마이크로프로세서가 인터페이스 (310) (미도시) 를 통해 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신하는 것을 허용하는 직렬 포트 (324) 를 포함할 수 있다. 또한, 제어기 (308) 의 마이크로프로세서는 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 및 열 제어 서브시스템 (306) 과 (예를 들어, Plink 툴 (미도시) 을 통해) 통신할 수 있다. 따라서, 제어기 (308), 인터페이스 (310), 및 직렬 포트 (324) 의 조합을 통해, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 및 열 제어 서브시스템 (306) 은 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신할 수 있다. 이 방식으로, 마스터 제어기 (154) 는, 다른 것들 중에서, 출력 전압 조정들을 위한 스케일링 계산들을 수행함으로써 전기적 신호 생성 서브시스템 (308) 을 도울 수 있다. 외부 마스터 제어기 (154) 에 커플링된 디스플레이 디바이스 (170) 를 통해 제공된, 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)(미도시) 는 열 제어 서브시스템 (306) 및 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 각각으로부터 획득된 온도 및 파형 데이터를 플롯 (p10t) 하도록 구성될 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, GUI 는 제어기 (308), 열 제어 서브시스템 (306), 및 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 에 대한 업데이트들을 허용할 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 시스템 (150) 은 이미징 디바이스 (194) 를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 이미징 디바이스 (194) 는 광 조절 서브시스템 (330) (도 3b 참조) 을 포함한다. 광 조절 서브시스템 (330) 은 디지털 미러 디바이스 (DMD) 또는 마이크로셔터 어레이 시스템 (MSA) 을 포함할 수 있고, 이들 중 어느 하나는 광원 (332) 으로부터 광을 수신하고 수신된 광의 서브세트를 현미경 (450) 의 광학 트레인으로 송신하도록 구성될 수 있다. 대안으로, 광 조절 서브시스템 (330) 은 그 자신의 광을 생성하고 (따라서 광원 (332) 에 대한 필요성을 없애는) 디바이스, 예컨대 유기 발광 다이오드 디스플레이 (OLED), 액정 온 실리콘 (LCOS) 디바이스, 강유전성 액정 온 실리콘 디바이스 (FLCOS), 또는 투과형 액정 디스플레이 (LCD) 를 포함할 수 있다. 광 조절 서브시스템 (330) 은, 예를 들어 프로젝터일 수 있다. 따라서, 광 조절 서브시스템 (330) 은 구조화된 및 구조화되지 않은 광 양자 모두를 방출할 수 있다. 소정의 실시형태들에서, 시스템 (150) 의 이미징 모듈 (164) 및/또는 동기 모듈 (162) 은 광 조절 서브시스템 (330) 을 제어할 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 이미징 디바이스 (194) 는 현미경 (350) 을 더 포함한다. 이러한 실시형태들에서, 네스트 (300) 및 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 상에 장착되도록 개별적으로 구성될 수 있다. 현미경 (350) 은, 예를 들어 표준 연구-등급 광 현미경 또는 형광 현미경일 수 있다. 따라서, 네스트 (300) 는 현미경 (350) 의 스테이지 (344) 상에 장착되도록 구성될 수도 있고/있거나 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 의 부분 상에 장착하도록 구성될 수 있다. 다른 실시형태들에서, 본원에 설명된 네스트 (300) 및 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 의 일체형 컴포넌트들일 수 있다.
소정의 실시형태들에서, 현미경 (450) 은 하나 이상의 검출기들 (348) 을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 검출기 (348) 는 이미징 모듈 (164) 에 의해 제어된다. 검출기 (348) 는 아이 피스 (eye piece), 전하-결합 디바이스 (CCD), 카메라 (예를 들어, 디지털 카메라), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 적어도 2 개의 검출기들 (348) 이 존재하면, 하나의 검출기는 예를 들어, 고속-프레임율 (fast-frame-rate) 카메라일 수 있는 한편, 다른 검출기는 고 감도 카메라일 수 있다. 또한, 현미경 (350) 은 미세유체 디바이스 (320) 로부터 반사 및/또는 방출된 광을 수신하고, 반사 및/또는 방출된 광의 적어도 일부분을 하나 이상의 검출기들 (348) 상에 포커싱하도록 구성된 광학 트레인을 포함할 수 있다. 현미경의 광학 트레인은 또한, 각각의 검출기 상의 최종 배율이 상이할 수 있도록, 상이한 검출기들에 대한 상이한 튜브 렌즈들 (미도시) 을 포함할 수 있다.
소정 실시형태들에서, 이미징 디바이스 (194) 는 적어도 2 개의 광원들을 사용하도록 구성된다. 예를 들어, 제 1 광원 (332) 은 (예를 들어, 광 조절 서브시스템 (330) 을 통해) 구조화된 광을 생성하도록 사용될 수 있고, 제 2 광원 (334) 은 비구조화된 광을 제공하도록 사용될 수 있다. 제 1 광원 (332) 은 광학적으로-작동된 전기역학 및/또는 형광성 여기를 위해 구조화된 광을 생성할 수 있고, 제 2 광원 (334) 은 밝은 필드 조명을 제공하도록 사용될 수 있다. 이들 실시형태들에서, 동기 모듈 (164) 은 제 1 광원 (332) 을 제어하도록 사용될 수 있고, 이미징 모듈 (164) 은 제 2 광원 (334) 을 제어하도록 사용될 수 있다. 현미경 (350) 의 광학 트레인은 (1) 디바이스가 네스트 (300) 에 의해 홀딩되는 경우, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 구조화된 광을 수신하고, 이 구조화된 광을 광학적으로-작동된 전기역학 디바이스와 같은 미세유체 디바이스에서의 적어도 제 1 영역에 포커싱하고, (2) 미세유체 디바이스로부터 반사 및/또는 방출된 광을 수신하고 이러한 반사 및/또는 방출된 광의 적어도 일부를 검출기 (348) 로 포커싱하도록 구성될 수 있다. 광학 트레인은 또한, 디바이스가 네스트 (300) 에 의해 홀딩되는 경우, 제 2 광원으로부터 비구조화된 광을 수신하고, 이 비구조화된 광을 미세유체 디바이스의 적어도 제 2 영역 상에 포커싱하도록 구성될 수 있다. 소정 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 제 1 및 제 2 영역들은 오버랩하는 영역들일 수 있다. 예를 들어, 제 1 영역은 제 2 영역의 서브세트일 수 있다. 다른 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 추가적으로 또는 대안적으로 광의 임의의 적합한 파장을 가질 수도 있는 레이저를 포함할 수도 있다. 도 3b 에 도시된 광학 시스템의 표현은 단지 개락적인 표현이고, 광학 시스템은 추가적인 필터들, 노치 필터들, 렌즈들 등을 포함할 수도 있다. 제 2 광원 (334) 이 브라잇필드 및/또는 형광 여기 뿐아니라 레이저 조명을 위한 하나 이상의 광원(들)을 포함할 때, 광원(들) 의 물리적 배열은 도 3b 에 도시된 것으로부터 변화할 수도 있고, 레이저 조명이 광학 시스템 내의 임의의 적합한 물리적 로케이션에 도입될 수도 있다. 광원 (334) 및 광원 (332)/광 조절 서브시스템 (330) 의 개략적인 로케이션들은 마찬가지로 상호교환될 수도 있다.
도 3b 에서, 제 1 광원 (332) 은, 시스템 (355)(미도시) 의 현미경 (350) 의 광학 트레인에 구조화된 광을 제공하는, 광 조절 서브시스템 (330) 에 광을 공급하는 것으로 도시된다. 제 2 광원 (334) 은 비구조화된 광을 빔 스플리터 (336) 를 통해 광학 트레인에 제공하는 것으로 도시된다. 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터의 구조화된 광 및 제 2 광원 (334) 으로부터의 비구조화된 광은 빔 스플리터 (336) 로부터 광학 트레인을 통해 함께 이동하여 제 2 빔 스플리터 (또는 광 조절 서브시스템 (330) 에 의해 제공된 광에 따라, 이색성 필터 (338)) 에 도달하며, 여기서 광은 대물렌즈 (336) 를 통해 샘플 평면 (342) 으로 아래로 반사된다. 샘플 평면 (342) 으로부터 반사 및/또는 방출된 광은 그 후, 대물렌즈 (340) 를 통해, 빔 스플리터 및/또는 이색성 필터 (338) 를 통해, 이색성 필터 (346) 로 위로 다시 이동한다. 이색성 필터 (346) 에 도달하는 광의 일부 만이 통과하여 검출기 (348) 에 도달한다.
일부 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 블루 광을 방출한다. 적합한 이색성 필터 (346) 로, 샘플 평면 (342) 으로부터 반사된 블루 광은 이색성 필터 (346) 를 통과하고 검출기 (348) 에 도달할 수 있다. 반대로, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 오는 구조화된 광은 샘플 평면 (342) 으로부터 반사되지만, 이색성 필터 (346) 를 통과하지 않는다. 이 예에서, 이색성 필터 (346) 는 495 nm 보다 긴 파장을 갖는 가시 광을 필터링한다. 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터의 광의 이러한 필터링은 단지, 광 조절 서브시스템으로부터 방출된 광이 495 nm 보다 짧은 임의의 파장을 포함하지 않는다면 (도시된 바와 같이) 완료될 것이다. 실제로, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 오는 광이 495 nm 보다 짧은 파장들 (예를 들어, 블루 파장들) 을 포함하면, 광 조절 서브시스템으로부터의 광의 일부는 필터 (346) 를 통과하여 검출기 (348) 에 도달한다. 이러한 실시형태에서, 필터 (346) 는 제 1 광원 (332) 및 제 2 광원 (334) 으로부터 검출기 (348) 에 도달하는 광의 양 간의 균형을 변화시키도록 작용한다. 이것은, 제 1 광원 (332) 이 제 2 광원 (334) 보다 상당히 더 강한 경우 유리할 수 있다. 다른 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 레드 광을 방출할 수 있고, 이색성 필터 (346) 는 레드 광 외의 가시 광 (예를 들어, 650 nm 보다 짧은 파장을 갖는 가시 광) 을 필터링할 수 있다.
코팅 용액들 및 코팅제들. 이론에 의헤 제한되도록 의도하지 않고, 미세유체 디바이스 (예를 들어, DEP-구성된 및/또는 EW-구성된 미세유체 디바이스) 내에서의 생물학적 마이크로-객체 (예를 들어, 생물학적 세포) 의 유지보수는, 미세유체 디바이스와 그 안에 유지되는 생물학적 마이크로-객체(들) 사이의 일차 인터페이스를 제공하는 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 미세유체 디바이스의 적어도 하나 이상의 내부 표면들이 조절 또는 코팅된 경우, 용이하게 될 수도 있다 (즉, 생물학적 마이크로-객체는 미세유체 디바이스 내에서 증가된 생존 능력, 더 큰 증식 및/또는 더 큰 운반가능성을 나타낸다). 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 내부 표면들 중 하나 이상 (예를 들어, DEP-구성된 미세유체 디바이스의 전극 활성화 기판의 내부표면, 미세유체 디바이스의 커버, 및/또는 회로 재료의 표면들) 은 생체 분자 및/또는 친수성 분자들의 원하는 층을 생성하기 우해 코팅 용액 및/또는 코팅제에 의해 처리 또는 개질될 수도 있다.
코팅은 생물학적 마이크로-객체(들) 의 도입 전 또는 후에 도포될 수도 있거나, 생물학적 마이크로-객체(들) 과 동시에 도입될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체(들) 은 하나 이상의 코팅제들을 포함하는 유체 매질에서 미세유체 디바이스 내로 들여와 질 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (예를 들어, DEP-구성된 미세유체 디바이스) 의 내부 표면(들) 은 미세유체 디바이스 내로 생물학적 마이크로-객체(들) 의 도입 이전에 코팅제를 포함하는 코팅 용액으로 처리 또는 "프라이밍" 된다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 적어도 하나의 표면은 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지 및/또는 증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하는 (예를 들어, 이하에 기술된 바와 같이 조절된 표면을 제공하는) 코팅 재료를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 실질적으로 모든 내부 표면들은 코팅 재료를 포함한다. 코팅된 내부 표면(들) 은 흐름 영역 (예를 들어, 채널), 챔버, 또는 격리 펜, 또는 이들의 조합의 표면을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 복수의 격리 펜들 각각은 코팅 재료들로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 갖는다. 다른 실시형태들에서, 복수의 흐름 영역들 또는 채널들 각각은 코팅 재료들로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 갖는다. 일부 실시형태들에서, 복수의 격리 펜들 각각 및 복수의 채널들 각각의 적어도 하나의 내부 표면은 코팅 재료들로 코팅된다.
코팅제/ 용액. 혈청 또는 혈청 인자들, 소 혈청 알부민 (BSA), 폴리머들, 계면활성제들, 효소들, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 편리한 코팅제/코팅 용액이 사용될 수 있다.
폴리머 -기반 코팅 재료들. 적어도 하나의 내부 표면은 폴리머를 포함하는 코팅 재료를 포함할 수도 있다. 폴리머는 적어도 하나의 표면에 공유결합 또는 비공유결합될 수도 있다 (또는 비특정적으로 부착될 수도 있다). 폴리머는 예를 들어 블록 폴리머들 (및 코폴리머들), 성형 폴리머들 (성형 코폴리머들), 및 그래프트 또는 빗살모양 폴리머들 (그래프트 코폴리머들) 에서 발견되는 다양한 구조성 모티프들을 가질 수도 있으며, 이들 모두는 여기에 개시된 방법들에 적합할 수도 있다.
폴리머는 알킬렌 에테르 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 매우 다양한 알킬렌 에테르 함유 폴리머들이 여기에 기술된 미세유체 디바이스들에서의 사용을 위해 적합할 수도 있다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 하나의 비제한적인 예시의 클래스는 폴리머 사술 내에 상이한 비율들로 및 상이한 위치들에서 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO) 및 폴리프로필렌 옥사이드 (PPO) 서브유닛들의 블록들을 포함하는 양쪽 친매성 비이온 블록 코폴리머들이다. Pluronic® 폴리머들 (BASF) 은 이러한 타입의 블록 코폴리머들이고, 살아있는 세포들과 접촉할 때 사용하기에 적합한 것으로 본 기술에서 알려져 있다. 폴리머들은 평균 분자 질량 (MW) 에서 약 2000Da 로부터 약 20KDa 까지의 범위에 있을 수도 있다. 일부 실시형태들에서, PEO-PPO 블록 코폴리머는 약 10 (예를 들어, 12-18) 보다 큰 친수성-친유성 밸런스 (HLB) 를 가질 수 있다. 코팅된 표면을 산출하기 위해 유용한 특정의 Pluronic® 폴리머들은 Pluronic® L44, L64, P85, 및 F127 (F127NF 를 포함) 을 포함한다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 다른 클래스는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG MW < 100,000Da) 또는 대안적으로 폴리에티렌 옥사이드 (PEO, MW > 100,000) 이다. 일부 실시형태들에서, PEG 는 약 1000Da, 5000Da, 10,000Da 또는 20,000Da 의 MW 를 가질 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 카르복실릭 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 카르복실릭 애시드 서브유닛은 알킬, 알케닐 또는 방향족 모이어티 포함 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비제한적인 예는 폴리락틱 애시드 (PLA) 이다. 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 폴리머 백본의 말단 또는 폴리머의 백본으로부터의 펜던트 (pendant) 에서 포스페이트 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 술포닉 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 술포닉 애시드 서브유닛은 알킬, 알케닐 또는 방향족 모이어티 포함 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비제한적인 예는 폴리스티렌 술포닉 애시드 (PSSA) 또는 폴리아네톨 술포닉 애시드이다. 추가의 실시형태들에서, 코팅 재료는 아민 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 폴리아미노 폴리머는 천연 폴리아민 폴리머 또는 합성 폴리아민 폴리머를 포함할 수도 있다. 천연 폴리아민들의 예들은 스페르민, 스페르미딘, 및 푸트레신을 포함한다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 당류 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 비제한적인 예에서, 크산탄 검 또는 덱스트란과 같은 다당류들은 미세유체 디바이스에서 세포 스티킹 (sticking) 을 감소시키거나 방지할 수 있는 재료를 형성하는데 적합할 수도 있다. 예를 들어, 약 3kDa 의 사이즈를 갖는 덱스트란 폴리머는 미세유체 디바이스 내의 표면을 위한 코팅 재료를 제공하기 위해 사용될 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 뉴클레오티드 모이어티들을 포함하는 폴리머, 즉 핵산을 포함할 수도 있으며, 이것은 리보뉴클레오티드 모이어티들 또는 데옥시리보뉴클레오티드 모이어티들을 가져서 고분자전해질 표면을 제공할 수도 있다. 핵산은 천연 뉴클레오티드 모이어티들만을 포함할 수도 있거나 제한 없이 7-디아자아데닌, 펜토오스, 메틸 포스포네이트 또는 포스포로티오에이트 모이어티들과 같은 핵염기, 리보오스 또는 포스페이트 모이어티 유사체들을 포함하는 비천연 뉴클레오티브 모이어티들을 포함할 수도 있다.
또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 아미노 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 아미노 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머는 천연 아미노 액시드 포함 폴리머 또는 비천연 아미노 액시드 포함 폴리머를 포함할 수도 있으며, 이들 중 어느 것은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 단백질은 코팅제들로서 알부민 및/또는 하나 이상의 다른 유사한 단백질들을 포함하는 소 혈청 알부민 (BSA) 및/또는 혈청 (또는 다수의 상이한 형청들의 조합) 일 수도 있다. 혈청은 신생 우아 혈청, 양 혈청, 염소 혈청, 말 혈청 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 편리한 소스로부터일 수 있다. 소정의 실시형태들에서, 코팅 용액 내의 BSA 는 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 또는 그 이상 또는 이들 사이의 임의의 값을 포함하는 약 1 mg/mL 로부터 약 100 mg/mL 까지의 농도에서 존재한다. 소정의 실시형태들에서, 코팅 용액 내의 혈청은 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 그 이상 또는 이들 사이의 임의의 값을 포함하는 약 20% (v/v) 내지 약 50% v/v 의 농도에서 존재할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, BSA 는 5 mg/mL 로 코팅 용액 내에서 코팅제로서 존재할 수도 있지만, 다른 실시형태들에서, BSA 는 70 mg/mL 로 코팅 용액 내에서 코팅제로서 존재할 수도 있다. 소정의 실시형태들에서, 혈청은 30% 로 코팅 용액 내에서 코팅제로서 존재한다. 일부 실시형태들에서, 세포외 기질 (ECM) 단백질은 세포 성장을 조성하기 위해 최적화된 세포 부착을 위해 코팅 재료 내에 제공될 수도 있다. 코팅 재료에 포함될 수도 있는 세포 기질 단백질은 콜라겐, 엘라스틴, RGD-함유 펩티드 (예를 들어, 피브로넥틴), 또는 라미닌을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 또 다른 실시형태들에서, 성장 인자들, 사이토킨들, 호르몬들 또는 다른 세포 시그널링 종이 미세유체 디바이스의 코팅 재료 내에 제공될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 알킬렌 옥사이드 모이어티들, 카르복실릭 애시드 모이어티들, 술포닉 애시드 모이어티들, 포스페이트 모이어티들, 당류 모이어티들, 뉴클레오티드 모이어티들, 또는 아미노 애시드 모이어티들 중 2 이상을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 폴리머 조절된 표면은 각각 알킬렌 옥사이드 모이어티들, 카르복실릭 애시드 모이어티들, 술포닉 애시드 모이어티들, 포스페이트 모이어티들, 당류 모이어티들, 뉴클레오티드 모이어티들, 및/또는 아미노 애시드 모이어티들을 갖는 2 이상의 폴리머의 혼합물을 포함할 수도 있으며, 그것은 코팅 재료 내로 독립적으로 또는 동시에 통합될 수도 있다.
공유결합으로 연결된 코팅 재료들. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 내부 표면은 미세유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식을 위해 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하는 공유결합으로 연결된 분자들을 포함하여, 그러한 세포들에 대한 조절된 표면을 제공한다.
공유결합으로 연결된 분자들은 연결기를 포함하며, 여기서 연결기는 이하에 기술된 바와 같이 미세유체 디바이스의 하나 이상의 표면들에 공유결합으로 연결된다. 연결기는 또한 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식을 위해 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 공유결합으로 연결된다.
일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식을 위해 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 공유결합으로 연결된 모이어티는 알킬 또는 플루오로알킬 (퍼플루오로알킬을 포함함) 모이어티들; (덱스트란을 포함할 수도 있지만 이것에 제한되지 않는) 단당류 또는 다당류; (프로파르길 알콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는) 알콜류; 폴리비닐 알콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 폴리알콜류; 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 알킬렌 에테르류; (폴리아크릴릭 애시드 또는 폴리비닐 포스포닉 애시드를 포함하지만 이것에 제한되지 않는) 고분자 전해질류; 아미노기들 (알킬레이티드 아민류, 히드록시알킬레이티드 아미노기, 구아니디늄과 같은, 그러나 이들에 제한되지 않는 그것의 유도체들, 및 모르폴리닐 또는 피페라지닐과 같은, 그러나 이들에 제한되지 않는 비방향화된 질소 고리 원자를 함유하는 헤테로실릭 기들을 포함); (카르복실레이트 음이온성 표면을 제공할 수도 있는) 프로피올릭 애시드를 포함하지만 이것에 제한되지 않는 카르복실릭 애시드류; (포스포네이트 음이온성 표면을 제공할 수도 있는) 에티닐 포스포닉 애시드를 포함하지만 이것에 제한되지 않는 포스포닉 애시드류; 술포네이트 음이온들; 카르복시베타인류; 술포베타인류; 술파믹 애시드류; 또는 아미노 애시드류를 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 내의 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식을 위해 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 공유결합으로 연결된 모이어티는 알킬 모이어티와 같은 비-폴리머 모이어티들, (퍼플루오로알킬 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는) 플루오로알킬 모이어티와 같은 치환된 알킬 모이어티, 아미노 애시드 모이어티, 알콜 모이어티, 아미노 모이어티, 카르복실릭 애시드 모이어티, 포스포닉 애시드 모이어티, 술포닉 애시드 모이어티, 술파믹 애시드 모이어티, 또는 당류 모이어티를 포함할 수도 있다. 대안적으로, 공유결합으로 연결된 모이어티는 상술된 모이어티들 중 임의의 것일 수도 있는 폴리머 모이어티들을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 알킬 모이어티는 선형 체인 (예를 들어, 적어도 10 개의 탄소들, 또는 적어도 14, 16, 18, 20, 22 개, 또는 그 이상의 탄소들의 선형 체인) 을 형성하는 탄소 원자들을 포함할 수도 있고, 비분기형 알킬 모이어티일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 알킬 기는 치환된 알킬 기 (예를 들어, 알킬 기에서의 탄소들의 일부는 플루오르화 또는 퍼플루오르화될 수 있음) 를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 알킬 기는 비-치환된 알킬 기를 포함할 수도 있는 제 2 분절 (segment) 에 결합된, 퍼플루오로알킬 기를 포함할 수도 있는 제 1 분절을 포함할 수도 있고, 여기서 제 1 및 제 2 분절들은 직접적으로 또는 (예를 들어, 에테르 결합에 의해) 간접적으로 결합될 수도 있다. 알킬 기의 제 1 분절은 연결 기에서 멀리 위치될 수도 있고, 알킬 기의 제 2 분절은 연결기에 근접하여 위치될 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 2 이상의 타입의 아미노 애시드를 포함할 수도 있는 적어도 하나의 아미노 애시드를 포함할 수도 있다. 따라서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 세포 성장, 생존 능력, 운반가능성, 또는 이들의 임의의 조합을 지원하기 위해 양쪽성 이온 표면을 제공할 수도 있는 아미노 애시드를 포함할 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 적어도 하나의 알킬렌 옥사이드 모이어티를 포함할 수도 있고, 상술된 바와 같은 임의의 알킬렌 옥사이드 폴리머를 포함할 수도 있다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 하나의 유용한 클래스는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG MW < 100,000Da) 또는 대안적으로 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO, MW > 100,000) 이다. 일부 실시형태들에서, PEG 는 약 1000Da, 5000Da, 10,000Da 또는 20,000Da 의 MW 를 가질 수도 있다.
공유결합으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 당류를 포함할 수도 있다. 공유결합으로 연결된 당류는 단당류, 이당류, 또는 다당류일 수도 있다. 공유결합으로 연결된 당류는 표면에 대한 부착을 위해 커플링 또는 정교화 (elaboration) 를 허용하는 반응성 페어링 (pairing) 모이어티를 도입하기 위해 개질될 수도 있다. 예시적인 반응성 페어링 모이어티들은 알데히드, 알킨 또는 할로 모이어티들을 포함할 수도 있다. 다당류는 랜덤한 양식으로 개질될 수도 있으며, 여기서 당류 모노머들 각각이 개질될 수도 있거나 다당류 내의 당류 모노머들의 일부만이 표면에 직접 또는 간접으로 커플링될 수도 있는 반응성 페어링 모이어티를 제공하기 위해 개질된다. 하나의 예는 비분기형 연결자를 통해 표면에 간접적으로 커플링될 수도 있는 덱스트란 다당류를 포함할 수도 있다.
공유결합으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 아미노기들을 포함할 수도 있다. 아미노기는 치환된 아민 모이어티, 구아니딘 모이어티, 질소 함유 헤테로시클릭 모이어티 또는 헤테로아릴 모이어티일 수도 있다. 아미노 함유 모이어티들은 미세유체 디바이스 내의, 및 선택적으로 격리 펜들 및/또는 흐름 영역들 (예를 들어, 채널들) 내의 환경의 pH 변경을 허용하는 구조들을 가질 수도 있다.
조절된 표면을 제공하는 코팅 재료는 단지 한 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 포함할 수도 있거나 2 이상의 상이한 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 포함할 수도 있다. 예를 들어, (퍼플루오로알킬을 포함하는) 플루오로알킬 조절된 표면들은 모두 동일한, 예를 들어, 표면에 대한 동일한 연결기 및 공유결합 부착, 동일한 전체 길이, 및 플루오로알킬 모이어티를 포함하는 동일한 수의 플루오로메틸렌 유닛들을 갖는 복수의 공유결합으로 연결된 모이어티들을 가질 수도 있다. 대안적으로, 코팅 재료는 표면에 부착된 2 이상의 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 가질 수도 있다. 예를 들어, 코팅 재료는 특정의 수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛들을 가지는 공유결합으로 연결된 알킬 또는 플루오로알킬 모이어티들을 갖는 분자들을 포함할 수도 있고, 더 큰 수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛들을 갖는 알킬 또는 플루오로알킬 사슬에 공유결합으로 부착된 대전된 모이어티들을 갖는 분자들의 추가의 세트를 더 포함할 수도 있으며, 이것은 코팅된 표면에서 더 덩치가 큰 (bulkier) 모이어티들을 제공하는 용량을 제공할 수도 있다. 이러한 예에서, 상이한, 덜 입체구조로 요구하는 말단들 및 더 적은 백본 원자들을 갖는 분자들의 제 1 세트는 전체 기판 표면을 기능화하고, 이것에 의해 기판 자체를 구성하는 실리콘/실리콘 옥사이드, 하프늄 옥사이드 또는 알루미나와의 원하지 않는 부착 또는 접촉을 방지하는 것을 도울 수 있다. 다른 예에서, 공유결합으로 연결된 모이어티들은 표면상에서 랜덤한 양식으로 교번하는 전하들을 제시하는 양쪽성 이온 표면을 제공할 수도 있다.
조절된 표면 특성들. 조절된 표면의 조성은 별문제로 하고, 소수성 재료의 물리적 두께와 같은 다른 인자들은 DEP 힘에 영향을 줄 수 있다. 조절된 표면이 기판상에 형성되는 방식 (예를 들어, 기상증착, 액상 증착, 스핀 코팅, 플러딩, 및 정전 코팅) 과 같은 여러 인자들이 조절된 표면의 물리적 두께를 변경할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 조절된 표면은 약 1 nm 내지 약 10 nm; 약 1 nm 내지 약 7 nm; 약 1 nm 내지 약 5 nm 또는 이들 사이의 임의의 개개의 값의 두께를 갖는다. 다른 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티들에 의해 형성된 조절된 표면은 약 10 nm 내지 약 50 nm 의 두께를 가질 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 여기에 기술된 바와 같이 준비된 조절된 표면은 10 nm 미만의 두께를 갖는다. 일부 실시형태들에서, 조절된 표면의 공유결합으로 연결된 모이어티들은 미세유체 디바이스의 표면 (예를 들어, DEP 구성 기판 표면) 에 공유결합으로 연결될 때 단분자층을 형성할 수도 있고, 10 nm 미만 (예를 들어, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 내지 3.0 nm) 의 두께를 가질 수도 있다. 이들 값들은 약 30 nm 의 두께를 통상적으로 가질 수도 있는, 예를 들어, 스핀 코팅에 의해 준비된 표면의 값들과 대조적이다. 일부 실시형태들에서, 조절된 표면은 완벽하게 형성된 단분자층이 DEP 구성 미세유체 디바이스 내에서의 동작을 위해 적합하게 기능적이도록 요구하지 않는다.
여러 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 조절된 표면을 제공하는 코팅 재료는 바람직한 전기적 특성들을 제공할 수도 있다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않고, 특정의 코팅 재료로 코팅된 표면의 강건성에 영향을 주는 하나의 인자는 본질적 (intrinsic) 전하 트랩핑이다. 상이한 코팅 재료들이 전자들을 트랩할 수도 있고, 이것은 코팅 재료의 고장을 야기할 수 있다. 코팅 재료에서의 결함들은 전하 트랩핑을 증가시킬 수도 있고 코팅 재료의 추가의 고장을 야기할 수도 있다. 유사하게, 상이한 코팅 재료들은 전하 트랩핑에 영향을 줄 수도 있는 상이한 절연 내력들 (즉, 절연 파괴를 야기하는 최소 인가 전계) 을 갖는다. 소정의 실시형태들에서, 코팅 재료는 전하 트랩핑의 양을 감소시키거나 제한하는 전체 구조 (예를 들어, 빽빽히 채워진 단분자층 구조) 를 가질 수 있다.
그것의 전기적 특성들에 더하여, 조절된 표면은 또한 생물학적 분자들과 함께 사용하는데 유익한 특성들을 가질 수도 있다. 예를 들어, 플루오리네이티드 (또는 퍼플루오리네이티드) 탄소 사슬들을 함유하는 조절된 표면은 표면 부착물의 양을 감소시킴에 있어서 알킬-말단 사슬들에 비해 이익을 제공할 수도 있다. 여기서 사용된 표면 부착물은 미세유체 디바이스의 표면상의 무분별한 재료 증착의 양을 지칭하며, 그것은 단백질 및 그것의 분해 생성물들, 핵산들 및 각각의 분해 생성물들 등과 같은 생체재료들의 영구적인 또는 반영구적인 증착을 포함할 수도 있다.
유니터리 (unitary) 또는 멀티- 파트 조절 된 표면. 공유결합으로 연결된 코팅 재료는 이하에 기술되는 바와 같이, 미세유체 디바이스 내의 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를 이미 함유하는 분자의 반응에 의해 형성될 수도 있다. 대안적으로, 공유결합으로 연결된 코팅 재료는 그자신이 표면에 공유결합으로 연결된 표면 개질 리간드에 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를 커플링함으로써 2-파트 시퀀스에서 형성될 수도 있다.
공유결합으로 연결된 코팅 재료를 준비하는 방법들. 일부 실시형태들에서, (예를 들어, 격리 펜들 및/또는 흐름 영역들의 적어도 하나의 표면을 포함하는) 미세유체 디바이스의 표면에 공유결합으로 연결되는 코팅 재료는 식 1 또는 식 2 의 구조를 갖는다. 코팅 재료가 하나의 단계에서 표면에 도입될 때, 그것은 식 1 의 구조를 갖는 반면, 코팅 재료가 다수의 단계 프로세스에서 도입되는 경우, 그것은 식 2 의 구조를 갖는다.
Figure 112018113390202-pct00001
식 1 ,
또는,
Figure 112018113390202-pct00002
식 2
코팅 재료는 DEP-구성 또는 EW-구성 기판의 표면의 산화물들에 공유결합으로 연결될 수도 있다. DEP- 또는 EW-구성 기판은 실리콘, 실리콘 옥사이드, 알루미나, 또는 하프늄 옥사이드를 포함할 수도 있다. 산화물들은 기판의 본래의 화학적 구조의 부분으로서 제공될 수도 있거나 이하에 논의된 바와 같이 도입될 수도 있다.
코팅 재료는 산화물들과 실록산 또는 포스포닉 애시드기의 반응으로부터 형성된 실록시 또는 포스포네이트 에스테르기일 수도 있는 연결기 ("LG") 를 통해 산화물들에 부착될 수도 있다. 미세유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 여기에 기술된 모이어티들 중 임의의 것일 수 있다. 연결기 (LG) 는 미세유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 직접 또는 간접으로 연결될 수도 있다. 연결기 (LG) 가 모이어티에 직접 연결되는 경우, 선택적 연결자 ("L") 는 존재하지 않고 n 은 0 이다. 연결기 (LG) 가 모이어티에 간접으로 연결되는 경우, 연결자 (L) 는 존재하고 n 은 1 이다. 연결자 (L) 는 선형 부분을 포함할 수도 있으며, 여기서 그 선형 부분의 백본은 본 기술에서 알려진 바와 같은 화학 결합 제한들을 받는, 규소, 탄소, 질소, 산소, 황 및/또는 인 원자들의 임의의 조합으로부터 선택된 1 내지 200 개의 비수소 원자들을 포함할 수도 있다. 그것은 에테르, 아미노, 카르보닐, 아미도, 및/또는 포스포네이트 기들, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 또는 헤테로시클릭 기들로부터 선택될 수도 있는 하나 이상의 모이어티들의 임의의 조합으로 차단될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 연결자 (L) 의 백본은 10 내지 20 개의 원자들을 포함할 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 연결자 (L) 의 백본은 약 5 개의 원자들 내지 약 200 개의 원자들; 약 10 개의 원자들 내지 약 80 개의 원자들; 약 10 개의 원자들 내지 약 50 개의 원자들; 또는 약 10 개의 원자들 내지 약 40 개의 원자들을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 백본 원자들은 모두 탄소 원자들이다.
일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 다중-단계 프로세스에서 기판의 표면에 첨가될 수도 있고, 상술된 바와 같이 식 2 의 구조를 갖는다. 그 모이어티는 상술된 모이어티들 중 임의의 것일 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 커플링기 (CG) 는 반응성 모이어티 (RX) 와 반응성 페어링 모이어티 (RPX) (즉, 반응성 모이어티 (RX) 와 반응하도록 구성된 모이어티) 의 반응으로부터의 결과의 기를 나타낸다. 예를 들어, 하나의 통상적인 커플링기 (CG) 는 활성화된 에스테르, 애시드 클로라이드 등과 같은 카르복실릭 애시드의 유도체와 아미노기의 반응의 결과인 카로복사미딜기를 포함할 수도 있다. 다른 CG 는 트리아졸릴렌기, 카르복사미딜, 티오아미딜, 옥심, 메르캅틸, 디술피드, 에테르, 또는 알케닐기, 또는 반응성 모이어티의 그의 각각의 반응성 페어링 모이어티와의 반응 시에 형성될 수도 있는 임의의 다른 적합한 기를 포함할 수도 있다. 커플링기 (CG) 는 상술된 바와 같은 원소들의 임의의 조합을 포함할 수도 있는 연결자 (L) 의 제 2 단부 (즉, 미세유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 근접한 단부) 에 위치될 수도 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 커플링기 (CG) 는 연결자 (L) 의 백본을 차단할 수도 있다. 커플링기 (CG) 가 트리아졸릴렌인 경우, 그것은 클릭 커플링 반응으로부터 야기되는 생성물일 수도 있고 더 치환될 수도 있다 (예를 들어, 디벤조시클로옥테닐 용융 트리아졸릴렌기).
일부 실시형태들에서, 코팅 재료 (또는 표면 개질 리간드) 는 화학적 기상 증착을 사용하여 미세유체 디바이스의 내부 표면들에 증착된다. 기상 증착 프로세스는 예를 들어, 용매 배스, 음파처리, 또는 이들의 조합에 노출함으로써 커버 (110), 미세유체 회로 재료 (116), 및/또는 기판 (DEP-구성 기판의 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208), 또는 EW-구성 기판의 지지 구조 (104) 의 유전체층) 을 사전 세정함으로써 선택적으로 향상될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 그러한 사전 세정은 동시에 산화된 표면 (여기에 기술된 바와 같이 공유결합으로 개질될 수도 있는 표면에서의 산화물들) 을 도입하면서 여러 불순물들을 제거할 수 있는 산소 플라즈마 클리너에서 커버 (110), 미세유체 회로 재료 (116), 및/또는 기판을 처리하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 하이드로클로릭 애시드와 하이드로전 페록사이드의 혼합물 또는 설퓨릭 애시드와 하이드로전 페록사이드의 혼합물 (예를 들어, 약 3:1 내지 약 7:1 의 설퓨릭 애시드 대 하이드로전 페록사이드의 비를 가질 수도 있는 피라냐 용액) 과 같은 액상 처리들은 산소 플라즈마 클리너 대신에 사용될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 기상 증착은 미세유체 디바이스 (200) 가 미세유체 회로 (120) 를 정의하는 인클로저 (102) 를 형성하기 위해 조립된 후 미세유체 디바이스 (200) 의 내부 표면을 코팅하기 위해 사용된다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않고, 완전히 조립된 미세유체 회로 (120) 상에 그러한 코팅 재료를 증착하는 것은 미세유체 회로 재료 (116) 와 전극 활성화 기판 (206) 유전체층 및/또는 커버 (110) 사이의 약해진 결합에 의해 야기되는 박리를 방지하는데 유익할 수도 있다. 2-단계 프로세스가 채용되는 실시형태들에서, 표면 개질 리간드는 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티의 후속적인 도입으로, 상술된 바와 같은 기상 증착을 통해 도입될 수도 있다. 후속적인 반응은 용액 내의 적합한 커플링 시약에 표면 개질된 미세유체 디바이스를 노출시킴으로써 수행될 수도 있다.
도 2h 는 조절된 표면을 제공하는 예시적인 공유결합으로 연결된 코팅 재료를 갖는 미세유체 디바이스 (290) 의 단면도를 도시한다. 도시된 바와 같이, (개략적으로 도시된) 코팅 재료들 (298) 은 DEP 기판일 수도 있는 베이스 (286) 의 내부 표면 (294), 및 미세유체 디바이스 (290) 의 커버 (288) 의 내부 표면 (292) 양자에 공유결합으로 결합된 빽빽하게 채워진 분자들의 단분자층을 포함할 수 있다. 코팅 재료 (298) 는 일부 실시형태들에서 그리고 상술된 바와 같이 미세유체 디바이스 (290) 내의 회로 소자들 및/또는 구조들을 정의하기 위해 사용되는 미세유체 회로 재료 (미도시) 의 표면들을 포함하는, 미세유체 디바이스 (290) 의 인클로저 (284) 에 근접하고, 그것을 향해 내부로 마주하는 실질적으로 모든 내부 표면들 (294, 292) 에 증착될 수 있다. 대안적인 실시형태들에서, 코팅 재료들 (298) 은 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면들의 단지 하나 또는 일부에만 증착될 수 있다.
도 2h 에 도시된 실시형태에서, 코팅 재료 (298) 는 오르가노실록산 분자들의 단분자층을 포함할 수 있고, 각각의 분자는 실록시 연결자 (296) 를 통해 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면들 (292, 294) 에 공유결합된다. 상술된 코팅 재료들 (298) 중 임의의 것이 사용될 수 있으며 (예를 들어, 알킬-말단, 플루오로알킬 말단 모이어티, PEG-말단 모이어티, 덱스트란 말단 모이어티, 또는 오르가노실록시 모이어티들에 대한 포지티브 또는 네거티브 전하들을 함유하는 말단 모이어티), 여기서 말단 모이어티는 그것의 인클로저 대향 말단 (즉, 내부 표면들 (292, 294) 에 결합되지 않고 인클로저 (284) 에 근접한 코팅 재료 (298) 의 단부자층의 부분) 에 배치된다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면(들) (292, 294) 을 코팅하기 위해 사용되는 코팅 재료 (298) 는 음이온성, 양이온성, 또는 양쪽성 이온 모이어티들, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않고, 미세유체 회로 (120) 의 인클로저 (284) 의 내부 표면들에 양이온성 모이어티들, 음이온성 모이어티들, 및/또는 양쪽성 이온 모이어티들을 제공함으로써, 코팅 재료 (298) 는 수화의 결과의 물이 비생물학적 분자들 (예를 들어, 기판의 실리콘 및/또는 실리콘 산화물) 과의 상호작용들로부터 생물학적 마이크로-객체들을 분리하는 층 (또는 "실드 (shield)") 으로서 작용하도록 물 분자들과 강한 수소 결합들을 형성할 수 있다. 또, 코팅 재료 (298) 가 코팅제들과 함께 사용되는 실시형태들에서, 코팅 재료 (298) 의 음이온들, 양이온들, 및/또는 양쪽성 이온들은 인클로저 (284) 내의 매질 (180) (예를 들어, 코팅 용액) 에 존재하는 비공유결합 코팅제들 (예를 들어, 용액 내의 단백질들) 의 대전된 부분들과 이온성 결합들을 형성할 수 있다.
또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 친수성 코팅제를 그것의 인클로저-대향 말단에 포함하거나 제공하도록 화학적으로 개질될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 PEG 와 같은 알킬렌 에테르 함유 폴리머를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 덱스트란과 같은 다당류를 포함할 수도 있다. 상술된 대전된 모이어티들 (예를 들어, 양이온성 모이어티들, 음이온성 모이어티들, 및/또는 양쪽성 이온 모이어티들) 처럼, 친수성 코팅제는 수화의 결과의 물이 비생물학적 분자들 (예를 들어, 기판의 실리콘 및/또는 실리콘 산화물) 과의 상호작용들로부터 생물학적 마이크로-객체들을 분리하는 층 (또는 "실드 (shield)") 으로서 작용하도록 물 분자들과 강한 수소 결합들을 형성할 수 있다.
적절한 코팅 처리들 및 개질들의 추가의 상세들이 2016 년 4월 22일자로 출원되고, 그 전체가 참조에 의해 포함되는 미국 출원 번호 제 15/135,707 호에서 발견될 수도 있다.
미세유체 디바이스의 격리 펜들 내의 세포들의 생존 능력의 유지보수를 위한 추가적인 시스템 성분들. 세포 개체수들의 성장 및/또는 증식을 증진시키기 위해, 기능성 세포들을 유지하게 하는 환경적 조건들은 시스템의 추가적인 성분들에 의해 제공될 수도 있다. 예를 들어, 그러한 추가적인 성분들은 영양분들, 세포 성장 시그널링 종, pH 조절, 가스 교환, 온도 제어, 및 세포들로부터의 쓰레기 산물들의 제거를 제공할 수 있다.
생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물을 분석하기. 일부 실시형태들에서, 본 개시물은 격리 펜들에 존재하는 생물학적 분자를 정량화하는 방법들, 시스템들 및 디바이스들을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 분자는 분비된 피분석물을 생성할 수 있는, 생물학적 세포 또는 임의의 다른 생물학적 마이크로-유기체의 분비된 피분석물이다.
생체생산 산업에서, 하나의 심각한 문제는 현재의 가용 기구조작 및 작업흐름들을 채용할 때 원하는 레벨들의 생산 및 성장 습성들을 가지는 클론 개체군들을 식별하는데 드는 비용, 시간 및 어려움이다. 예를 들어, 새로운 항체 생산 라인을 개발하는데는 수개월의 노력이 소요될 수 있으며, 인력, 장비 및 물질들에 수백만 달러의 비용이 들 수 있다. 본원에서 설명된 바와 같이, 개개의 기초 세포들 (founding cells) 을 파종한 후 3, 4, 5, 6, 또는 7 일과 같은 개체군들을 증식시키는 아주 초기에, 미세유체 디바이스 내 유망한 클론들을 스크리닝하여 식별하는 능력은 상당한 시간 및 비용 이점들을 제공할 수 있다. 출원인은, 나노유체 환경, 특히, 본원에서 설명된 바와 같은, 격리 펜들에 기초한 나노유체 환경이 서로로부터의 클론 개체군들의 모범적인 분리를 제공함으로써, 미세유체 디바이스 내에 위치된 다른 클론 개체군들로부터의 오염없이 각각의 개개의 클론 개체군으로부터 분석 결과들을 얻는 능력을 가능하게 한다는 것을 발견하였다. 또한, 본원에서 설명하는 방법들을 이용하여, 분비된 피분석물의 상대 또는 절대 량을 결정하는 분석들이, 심지어 클론 증식의 초기 스테이지들에서 수행될 때에도, 더 전형적인 거대규모 스케일의 증식 (예컨대, 쉐이크 플라스크들, 등) 에서의 원하는 분비된 피분석물의 생산과 상관될 수 있다는 것을 발견하였다. 또, 이러한 초기 스테이지들에서 개개의 클론들을 스크리닝하는 능력은 또한 생장률 및/또는 더 강건한 생산의 특정의 요건들을 만족시키는 원하는 클론들 (예를 들어, 대사 폐기물들 또는 소진된 영양소들과 같은 배양 환경에서 물질의 레벨들에 더 저항력이 있는 고 생산성 클론들) 의 식별을 가능하게 할 수 있다.
출원인에 의해 발견된 다른 이점은 본원에서 설명된 나노유체 챔버들 (예컨대, 격리 펜들) 이 최고 수천 개의 개개의 기초 세포들에 대해, 동시에 극 소량들로 동시적인 성장/분석을 가능하게 하기 때문에, 클론 개체군에 대한 잠재적인 기초 세포들로서의 복수의 세포들의 더 완전한 탐색이 과도한 리소스들의 사용 없이 이루어질 수 있다는 것이다.
추가적으로, 본원에서 설명되는 나노유체 환경은 반복된 분석들로부터의 피드백에 의해, 세포들에 대한 특정의 조건들의 효과들의 검사를 가능하게 한다. 예를 들어, 세포의 분비된 생성물 (본원에서의 방법들에서는 피분석물) 의 대규모 생산과 더 밀접하게 관련된, 배양 매질와 같은, 조건들 및 물질들이 추가적인 검사에 가장 적합한 클론들을 발견하고 특성화하기 위해 사용될 수도 있다. 다른 예에서, B-세포 항체 자극에 대한 다양한 자극 프로토콜들은 보다 재현가능한 방법으로 검사될 수도 있으며, 다른 프로토콜에 대한 하나의 프로토콜의 이점들을 더 비교가능하게 평가하기 위해 분석될 수도 있다.
확산 프로파일들을 이용한 검출 및 정량화. 앞에서 설명한 바와 같이, 생물학적 마이크로-객체의 분비된 피분석물의 양은 분비된 피분석물에 결합하는 리포터 분자를 이용하여 정량화될 수도 있다. 리포터 분자는 정량화될 분비된 피분석물을 결합하는 결합 성분, 및 리포터 분자의 양을 검출하는데 사용되는 신호 성분을 포함한다. 리포터 분자는 (예컨대, 분비된 피분석물의 하나 이상의 분자들에 결합된) 그의 결합된 상태에서보다 (예컨대, 분비된 피분석물에 결합되지 않은) 그의 비결합된 상태에서 더 높은 확산 레이트를 갖는다. 일부 실시형태들에서, 비결합된 분자와 결합된 리포터 분자 사이의 확산 레이트에서의 차이는 리포터 분자가 결합하는 분비된 피분석물 분자(들) 의 사이즈의 함수일 것이다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자는 분비된 피분석물을 확산의 레이트를 늦추는 형태로 결합할 수도 있다. 예를 들어, 리포터 분자는 분비된 피분석물의 다수의 복제본들을, 분비된 피분석물이 집합되어 부분적으로 그의 형태로 인해 느리게 확산하는 형태로, 결합할 수도 있다. 본원에서 설명하는 방법들은 분비된 피분석물의 양을 정량화하기 위해 (비결합된) 리포터 분자와 결합된 리포터 분자:피분석물 착체 (RMSA) 사이의 확산의 레이트에서의 차이들을 이용한다.
미세유체 채널에서의 유동 조건들 하에서의 확산 분석. 도 4a 내지 도 4c 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른 분석을 예시한다. 도 4a 에서, 검출가능한 라벨을 각각 가지는, 리포터 분자들 (412) 이, 유동 (242) 내 리포터 분자들 (412) 의 농축물을 포함하는 유체를 미세유체 디바이스 (400) 의 채널 (122) 로 유동시킴으로써 미세유체 채널 (122) 로 도입된다. 격리 펜들 (424, 426, 428) 은 생물학적 피분석물 (410) 을 분비하는 다수의 세포들 (402, 404, 406) 을 포함하는 미세유체 채널 (122) 에 각각 유체 흐름 가능하게 연결된다. 격리 펜들 (424, 426, 428) 의 각각은 접속 영역 (436) 및 고립 영역 (440) 을 포함한다 (격리 펜 (424) 은 단지 명료성을 위해 그렇게 라벨링된 펜이다). 접속 영역 (436) 및 고립 영역 (440) 은 위에서 설명한 바와 같은 속성들을 가지며, 채널 (122) 로 도입되는 물질들의 접촉을 제한한다 (예컨대, 고립 영역 (440) 내에서, 채널 (122) 내에서 유동하는 물질들은 고립 영역으로의 직접 유동에 의하지 않고, 단지 확산에 의해 고립 영역으로 진입할 수도 있다.) 도 4a 에 예시된 시점에서, 분비된 피분석물 (410) 의 분자들은 세포들의 근위에 있다.
도 4b 는 후속 시점에서 도 4a 에서와 동일한 미세유체 디바이스의 영역을 예시한다. 리포터 분자들 (412) 은 리포터 분자들 (412) 의 농도가 채널 (122) 과 격리 펜들 (424, 426, 428) 의 내부들 사이에 평형이 되도록, 채널 (122) 및 격리 펜들 (424, 426, 428) 내에서 빨리 확산할 수 있다. 도 4b 에 예시된 바와 같이, 리포터 분자들 (412) 은 정상-상태 농도에 도달하여, 격리 펜들 (424, 426, 428) 내에서 실질적으로 균일해 진다. 리포터 분자 (412) 를 포함하는 매질의 유동 (242) 은 어떤 리포터 분자 (412) 도 포함하지 않는 매질의 유동 (242) 으로 대체되며, 채널 (122) 은 상당량들의 리포터 분자를 포함하지 않는다.
각각의 격리 펜 (424, 426, 428) 내 리포터 분자들 (412) 이 분비된 피분석물 (410) 의 분자들과 접촉함에 따라, 리포터 분자들 (412) 은 피분석물 (410) 에 결합하여, 리포터 분자:피분석물 착체 (414) 를 형성하고, 그리고 분비된 피분석물 (410) 의 양에 관련된 국부화된 검출가능한 신호를 제공할 수 있다. 유동 (242) 이 계속됨에 따라, 리포터 분자들은 격리 펜으로부터 확산하여, 채널 (122) 에 진입하고 미세유체 디바이스로부터 배출된다. 그러나, 도 4b 에 나타낸 바와 같이, 리포터 분자:피분석물 착체 (410) 의 확산은 그의 더 큰 분자량 (및 유효 사이즈) 으로 인해, 비결합된 리포터 분자 (412) 의 확산보다 더 느리며, 달리, 격리 펜들 (424, 426, 428) 로부터 급격하게 확산하지 않는다.
도 4c 는 분비된 피분석물 (410) 및 리포터 분자:피분석물 착체들 (414) 이 분비된 피분석물 (410) 의 소스 (예컨대, 세포들 (402, 404, 406)) 로부터 채널 (122) 로 확산하는 후속 시점에서, 도 4a 및 도 4b 에서와 동일한 미세유체 디바이스의 영역을 예시한다. 유동 (242) 은 채널 (122) 내에서 계속하며, 이에 의해 리포터 분자 (412) 가 각각의 격리 펜 (424, 426, 428) 으로부터 리포터 분자:피분석물 착체 (410) 보다 더 빨리 확산가능하게 한다.
분비된 피분석물 분자들 (410) 이 리포터 분자들 (412) 보다 더 큰 분자량 (및 용액에서의 연관된 유효 사이즈) 을 가질 수도 있기 때문에, 리포터 분자:피분석물 착체는 더 느리게 확산한다. 분비된 피분석물이 항체이고 리포터 분자가 펩티드 또는 압타머인 실시형태들에서, 분자량에서의 차이가 상당하다. 어쨌든, 결합된 리포터 분자:피분석물 착체 (414) 의 중량 (따라서, 사이즈) 은 비결합된 리포터 분자 (412) 의 중량보다 더 크며, 따라서, 리포터 분자:피분석물 착체 (414) 가 비결합된 리포터 분자 (412) 보다 더 느리게 확산하여, 비결합된 리포터 분자들 (412) 에 의해 제공되는 균일한 신호에 비해, 명확한 확산 프로파일 및 연관된 검출가능한 신호를 제공할 수 있다. 추가적으로, 생물학적 마이크로-객체들 (502, 504, 506) 은 피분석물 (410) 을 계속 분비하여, 격리 펜들 (524, 526, 528) 내에 여전히 배치된 리포터 분자들 (412) 과 결합하기 위한 더 많은 타겟들을 제공한다. 격리 펜으로부터 확산하거나 또는 이미 확산된 비결합된 리포터 분자들의 퍼센티지가 임계값을 초과함으로써, 실질적으로 또는 뚜렷하게 단지 각각의 격리 펜 (424, 426, 428) 내 리포터 분자:피분석물 착체 (414) 로부터의 검출가능한 신호의 이미징을 가능하게 하는, 시점이 선택될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 분석 이미지는 격리 펜으로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들 (412) 의 양이 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 전술한 값들 중 2개로 정의된 임의의 범위일 때 얻어진다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 일부 실시형태들에서, 분석 이미지는 격리 펜으로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들 (412) 의 양이 격리 펜으로부터 확산되는 결합된 리포터 분자:피분석물 착체들 (414) 의 양보다 더 큰 약 1.25X, 1.5X, 2.0X, 2.5X, 3.0X, 3.5X, 4.0X, 4.5X, 5.0X, 7.5X, 10X, 25X, 50X, 또는 100X 일 때 얻어진다.
분석 이미지에서 얻어진 검출가능한 신호들은 펜들에서의 생물학적 마이크로-객체들의 개수에 비례할 수도 있다. 격리 펜 (424) 은 6 개의 생물학적 마이크로-객체들을 포함하는 것으로 예시되며, 격리 펜 (426) 은 4 개의 생물학적 마이크로-객체들을 포함하는 것으로 예시되며, 격리 펜 (428) 은 2 개의 생물학적 마이크로-객체들을 포함하는 것으로 예시되며, 그리고 일부 실시형태들에서, 개별 격리 펜들로부터의 분석 신호는 이들 세포들의 수들에 비례할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 피분석물의 분비는 분석 신호 획득 시간에서의 세포 사이클 상태에 의존할 수도 있으며, 복수의 격리 펜들의 각각으로부터의 신호는 각각의 격리 펜 내 세포들의 수에 실질적으로 비례하지 않을 수도 있다. 추가적으로, 도 4c 에 예시된 바와 같이, 세포들 (402, 404, 406) 의 모두는 피분석물 (410) 을 분비하고 있는 동안, 세포들의 상이한 개체군들 (예컨대, 상이한 클론들) 은 생물학적 피분석물 (410) 을 다양한 레이트들로 분비할 수도 있다. 따라서, 발생된 피분석물 (410) 의 양 (및 리포터 분자:피분석물 착체 (414) 로부터 검출된 결과적인 확산 프로파일 신호의 강도) 은 심지어, 각각의 펜에 존재하는 세포들 (402, 404, 406) 의 개수에 대해 정규화되더라도, 펜마다, 동일하지 않을 수도 있다. 이미지화된 격리 펜들 (424, 426, 428) 내에서의 분비된 피분석물 (410) 의 양을 특성화하는데 사용될 수도 있는 하나 이상의 분석 이미지들이 이 시간 기간 동안 얻어질 수도 있다. 생성되는 분비된 피분석물 (410) 의 양의 상대 또는 절대 정량화에 도달하기 위해 수행되는 분석의 설명이 아래에서 뒤이어진다.
미세유체 채널에서 비-유동 조건들 하에서의 확산 분석. 도 5a 내지 도 5c 는 본 개시물의 일 실시형태에 따른 분석을 예시한다. 도 5a 에서, 검출가능한 라벨을 각각 가지는 리포터 분자들 (412) 이 리포터 분자들 (412) 의 농축물을 포함하는 유체를 채널 (122) 로 유동시킴으로써 미세유체 디바이스 (500) 의 미세유체 채널 (122) 로 도입된다. 도 5a 는 또한 생물학적 피분석물 (410) 을 분비하는 다수의 세포들 (502, 504, 506) 을 포함하는 미세유체 채널 (122) 에 유체 흐름 가능하게 연결된 격리 펜들 (524, 526, 528) 을 나타낸다. 격리 펜들 (524, 526, 528) 의 각각은 접속 영역 (536) 및 고립 영역 (540) 을 포함한다 (격리 펜 (524) 은 단지 명료성을 위해 단지 라벨링된 펜이다). 접속 영역 (536) 및 고립 영역 (540) 은 위에서 설명한 바와 같은 속성들을 가지며, 채널 (122) 에 도입된 물질들의 접촉을 제한한다 (예컨대, 고립 영역 (540) 내에서, 채널 (122) 내에서 유동하는 물질들은 고립 영역으로의 직접 유동이 아닌, 단지 확산에 의해, 고립 영역에 진입할 수도 있다.) 도 5a 에 예시된 시점에서, 분비된 피분석물 (410) 의 분자들은 세포들에 인접한다.
도 5b 는 추후 시점에서 도 5a 와 동일한 미세유체 디바이스의 영역을 예시한다. 리포터 분자들 (412) 은 리포터 분자들 (412) 의 농도가 채널 (122) 과 격리 펜들 (524, 526, 528) 의 내부들 사이에 평형을 이루도록, 채널 (122) 및 격리 펜들 (524, 526, 528) 내에서 빠르게 확산할 수 있다. 도 5b 에 예시된 바와 같이, 리포터 분자들 (412) 은 정상-상태 농도 평형에 도달하여, 비결합된 리포터 분자들 (412) 의 농도가 격리 펜들 (524, 526, 528) 및 채널 (122) 에서 실질적으로 균일할 수 있다. 채널에서의 유동은 리포터 분자들 (412) 의 농도가 격리 펜들 (524, 526, 528) 내로 평형될 때 중지된다. 리포터 분자들 (412) 이 분비된 피분석물 (410) 의 분자들과 접촉함에 따라, 리포터 분자들 (412) 은 피분석물 (410) 에 결합하여, 리포터 분자:피분석물 착체 (414) 를 형성하고, 그리고 분비된 피분석물 (410) 의 양에 관련된 국부화된 검출가능한 신호를 제공할 수 있다.
도 5c 는 분비된 피분석물 (410) 및 리포터 분자:피분석물 착체들 (414) 이 분비된 피분석물 (410) 의 소스 (예컨대, 세포들 (502, 504, 506)) 로부터 채널 (122) 로 확산하고 있는 또다른 추후 시점에서 도 5a 및 도 5b 에서와 동일한 미세유체 디바이스의 영역을 예시한다. 이 시점에서, 채널 (122) 에는 어떤 유동도 없다.
위와 같이, 분비된 피분석물 분자들 (410) 은 리포터 분자들 (412) 보다 큰 분자량 (및, 용액에서의 연관된 유효 사이즈) 을 가질 수도 있다. 따라서, 리포터 분자:피분석물 착체 (414) 는 비결합된 리포터 분자 (412) 보다 더 느리게 확산하여, 비결합된 리포터 분자들 (412) 에 의해 제공되는 균일한 신호에 비해, 명확한 확산 프로파일 및 연관된 검출가능한 신호를 제공할 수 있다. 추가적으로, 생물학적 마이크로-객체들 (502, 504, 506) 은 피분석물 (410) 을 계속 분비하여, 격리 펜들 (524, 526, 528) 내에 여전히 배치된 리포터 분자들 (412) 과 결합하기 위한 더 많은 타겟들을 제공한다.
확산 프로파일들 및/또는 연관된 신호들은 펜들 내 생물학적 마이크로-객체들의 개수에 비례할 수도 있다. 격리 펜 (524) 은 6 개의 생물학적 마이크로-객체들을 포함하는 것으로 예시되며, 격리 펜 (526) 은 4 개의 생물학적 마이크로-객체들을 포함하는 것으로 예시되며, 격리 펜 (528) 은 2 개의 생물학적 마이크로-객체들을 포함하는 것으로 예시된다. 어떤 다른 실시형태들에서, 그러나, 개별 격리 펜들 (524, 526, 528) 에서의 세포들 (502, 504, 506) 은 피분석물 (410) 을 대략 동일한 레이트로 분비할 수도 있으며, 리포터 분자:피분석물 착체들 (414) 로부터의 검출된 신호의 결과적인 강도는 각각의 격리 펜에 존재하는 세포들 (502, 504, 506) 의 개수에 비례할 수도 있다. 그러나, 피분석물의 분비는 분석 신호 획득 시간에서의 세포 사이클 상태에 의존할 수도 있다. 또, 도 5c 에 예시된 바와 같이, 세포들 (502, 504, 506) 의 모두는 피분석물을 분비하는 동안, 세포들의 상이한 개체군들 (예컨대, 상이한 클론들) 은 생물학적 피분석물 (410) 을 다양한 레이트들로 분비할 수도 있다. 따라서, 발생된 피분석물 (410) 의 양 (및 리포터 분자:피분석물 착체 (414) 로부터 검출된 결과적인 확산 프로파일 신호의 강도) 은, 설령 각각의 펜에 존재하는 세포들 (502, 504, 506) 의 개수에 대해 정규화되더라도, 펜들간에 동일하지 않을 수도 있다. 이미지화된 격리 펜들 (524, 526, 528) 내 분비된 피분석물 (410) 의 양을 특성화하는데 사용될 수도 있는, 하나 이상의 분석 이미지들이 이 시간 기간 동안 얻어질 수도 있다. 생성된 분비된 피분석물 (410) 의 양의 상대 또는 절대 정량화에 도달하기 위해 수행되는 분석의 설명은 다음과 같다.
분비된 피분석물들. 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 3Kd 미만의 분자량을 가지는 유기 분자, 소포, 바이러스, 및 이들의 임의의 조합일 수도 있다. 분비된 피분석물은 자연적으로 발현된 피분석물일 수도 있거나 (예컨대, 자연적으로 발현될 수도 있거나) 또는 생체공학적 피분석물 (예컨대, 유전자 삽입, 결실, 변형 및 기타 등등에 기인하는 생성물) 일 수도 있다. 핵산인 분비된 피분석물은 리보 또는 디옥시 핵산일 수도 있으며, 천연 또는 비천연 뉴클레오티드들을 포함할 수도 있다. 바이러스인 분비된 피분석물은 바이러스 입자, 벡터 또는 파지일 수도 있다. 사카라이드인 분비된 피분석물은 모노-, 디- 또는 폴리사카라이드일 수도 있다. 사카라이드들의 비한정적인 예들은 글루코스, 트레할로스, 마노스, 아라비노오스, 프룩토오스, 리보오스, 잔탄 또는 키토산을 포함할 수도 있다. 분비된 작은, 유기 분자는 바이오연료들, 오일들, 중합체들, 또는 조제약들, 예컨대 매크로라이드 항생제들을 포함할 수도 있지만, 이에 한정되지 않는다. 단백질인 분비된 피분석물은 항체 또는 항체의 단편일 수 있다. 단백질인 분비된 피분석물은 혈액 단백질, 예컨대 알부민, 글로불린 (예컨대, 알파2-고분자글로불린, 감마 글로불린, 베타-2 저분자글로불린, 합토글로불린), 보충 단백질 (예컨대, 컴포넌트 3 또는 4), 트랜스페린, 프로트롬빈, 알파 1 항트립신, 및 기타 등등; 호르몬, 예컨대 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 성장 호르몬, 성장 인자들 (예컨대, FGF, HGF, NGF, EGF, PDGF, TGF, 에리스로포이에틴, IGF, TNF), 난포 자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 렙틴, 및 기타 등등; 섬유 단백질, 예컨대 실크 또는 세포외 기질 단백질 (예컨대, 파이브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 엘라스틴, 비트로넥틴, 테나신, 베르시칸, 골 시알로단백질); 효소, 예컨대 메탈로프로테아제 (예컨대, 기질 매트릭스 메탈로프로테나제 (MMP)) 또는 다른 유형의 프로테아제 (예컨대, 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 아스파라긴 펩티드 리아제), 아밀라아제, 셀룰라아제, 카탈라아제, 펙티나아제, 및 기타 등등; 박테리아, 효모, 또는 원생동물 단백질; 식물 단백질; o 또는 바이러스 단백질, 예컨대 캡시드 또는 엔벨로프 단백질일 수 있다. 단백질인 분비된 피분석물은 항체, 항체의 단편, (단백질 분해 효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는) 효소, 예를 들어, 알부민과 같은 조작된 (통상적으로는 세포내 단백질) 단백질, 및/또는 (누에 실크 또는 거미 실크를 포함하지만 이에 한정되지 않는) 구조 단백질일 수 있다. 이 리스트에는 제한이 없으며, 분비되도록 조작될 수도 있는 임의의 단백질이 이 방법들에 의해 평가될 수도 있다. 분비된 피분석물은 항체-약물 접합체일 수도 있다. 단백질, 사카라이드, 핵산, 3Kd 미만의 분자량을 갖는 유기 분자, 및/또는 바이러스의 조합을 가질 수도 있는 분비된 피분석물의 비한정적인 예는 프로테오글리칸 또는 당단백질을 포함할 수 있다.
리포터 분자들 및 이들의 특성들. 리포터 분자는 분비된 피분석물에 결합하도록 설계된 결합 성분을 포함할 수도 있으며, 또한 검출가능한 라벨을 포함할 수도 있다. 결합 성분은 분비된 피분석물을 결합하도록 구성된 임의의 적합한 결합 파트너일 수도 있다. 결합 성분은 단백질, 펩티드, 핵산 또는 3Kd 미만인 분자량을 가지는 소형 유기 분자일 수도 있다. 예를 들어, 결합 성분은 다른 핵산 시퀀스를 특이적으로 결합하는 핵산 시퀀스, 또는 단백질 (예컨대, 특정의 항체를 인식하는 에피토프) 에 특이적으로 결합하는 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 결합 성분은 생물학적 마이크로-객체의 분비된 피분석물들의 패밀리에 비특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 결합 성분은 IgG 도메인에 특이적으로 결합하는 펩티드 또는 핵산 시퀀스들의 패밀리에 존재하는 도메인에 결합하는 핵산일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자는 다가이며, 분비된 피분석물의 하나 보다 많은 복제본에 결합하기 위해 또는 분비된 피분석물들의 패밀리의 하나 보다 많은 멤버에 결합하기 위해 하나 보다 많은 결합 성분을 포함한다. 설명의 용이성을 위해, 용어 분비된 피분석물은, 본원에서 사용될 때, 특정의 분비된 피분석물 분자 또는 분비된 피분석물들의 패밀리를 지칭할 수 있다. 따라서, RMSA 착체의 화학양론은 변할 수 있다. 예를 들어, 분비된 피분석물의 하나의 복제본을 결합하는 리포터 분자는 1:1 화학양론을 갖는 RMSA 착체를 가질 수도 있다. 대안적으로, RMSA 착체는 리포터 분자: 분비된 피분석물의 2:1, 3:1, 4:1, 2:2, 4:2, 또는 다른 화학양론을 가질 수도 있다. 리포터 분자는 분자량에 의존하는 리포터 분자:피분석물 착체의 확산 특성들에 의해 정의된 바와 같은, 겉보기 "사이즈" 가 비결합된 리포터 분자들과 RMSA 착체들 사이의 차동 확산을 관측하기 위해 리포터 분자 자체보다 충분히 "더 크다" 는 규정에 따라, 임의의 적합한 분자량을 가질 수도 있다. 리포터 분자는 분비된 피분석물의 분자량의 약 10 %, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 동일 분자량인 분자량을 가질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 분자량은 분비된 피분석물의 분자량의 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 미만이다. RMSA 착체의 분자량은 리포터 분자의 분자량보다, 적어도 2X, 4X, 10X, 20X, 30X, 40X, 50X 또는 이들 사이의 임의의 수일 수도 있다. RMSA 착체의 분자량은 비결합된 리포터 분자의 분자량보다 2 배, 4 배 또는 50 배 더 클 수도 있다.
분비된 피분석물들: 항체들의 하나의 클래스에 대한 리포터 분자들. 항체들에 결합하는데 적합한 리포터 분자들은 IgG 의 영역들을 결합하도록 구성된, 단백질들, 펩티드들 및 압타머들을 포함한다. 항체를 검출하기 위해 리포터 분자 내에서의 사용에 적합한 결합 성분들의 비한정적인 리스트가 테이블 1 에 나타내어진다.
테이블 1. 항체들을 검출하기 위한 리포터 분자의 결합 성분들로서의 화합물들.
Figure 112018113390202-pct00003
Figure 112018113390202-pct00004
CPD들 1-14 중 임의의 것이 본원에서 설명되는 분석들에 사용될 수 있다. 상기 리스트된 CPD들의 일부는 IgG 의 Fc 도메인에 결합하는 것으로 알려진 작은 펩티드들이다 (CPD 4 및 7-14 의 경우, DeLano WL, 등 (2000), Science 287:1279-1283, 및 미국 특허 번호 제 7608681B2호 참조, 이들 개시물 각각은 본원에서 전체적으로 참고로 포함된다).
CPD 3 은 Asp Ser Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 의 구조를 갖는다.
CPD 4 는 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 의 구조를 갖는다.
CPD 7 은 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa2 는 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa3 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa4 는 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa5 는 Cys 또는 Ser 이며; Xaa6 은 임의의 아미노 산이며; Xaa7 은 임의의 아미노 산이며; Xaa8 은 임의의 아미노 산이며; Xaa9 는 임의의 아미노 산이며; Xaa10 은 임의의 아미노 산이며; Xaa11 은 임의의 아미노 산이며; Xaa16 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa17 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa18 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa19 는 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; 그리고 Xaa20 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재한다.
CPD 8 은 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa2 는 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa3 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa4 는 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa5 는 Cys 또는 Ser 이며; Xaa6 은 임의의 아미노 산이며; Xaa7 은 임의의 아미노 산이며; Xaa8 은 임의의 아미노 산이며; Xaa9 는 임의의 아미노 산이며; Xaa16 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa17 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa18 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; Xaa19 는 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하고; 그리고 Xaa20 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재한다.
CPD 9 는 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa2 는 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa3 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa4 는 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa5 는 Cys 또는 Ser 이며; Xaa6 은 Ala, Ser, 또는 Thr 이며; Xaa7 은 Trp 또는 Tyr 이며; Xaa8 은 His 또는 Trp 이며; Xaa9 는 Leu 또는 Met 이며; Xaa16 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa17 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa18 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa19 는 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; 그리고 Xaa20 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재한다.
CPD 10 은 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa2 는 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa3 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa4 는 Ser, Arg, 또는 Asp 이며; Xaa5 는 Cys 또는 Ser 이며; Xaa6 은 Ala, Ser, 또는 Thr 이며; Xaa7 은 Trp 또는 Tyr 이며; Xaa8 은 His 또는 Trp 이며; Xaa9 는 Leu 또는 Met 이며; Xaa16 은 Glu, Ser, Thr, 또는 Val 이며; Xaa17 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa18 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa19 는 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; 그리고 Xaa20 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재한다.
CPD 11 은 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa13 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa2 는 Cys 또는 Ser 이며; Xaa3 은 임의의 아미노 산이며; Xaa4 는 임의의 아미노 산이며; Xaa5 는 임의의 아미노 산이며; Xaa6 은 임의의 아미노 산이며; Xaa7 은 임의의 아미노 산이며; Xaa8 은 임의의 아미노 산이며; 그리고 Xaa13 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재한다.
CPD 12 는 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa13 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa2 는 Cys 또는 Ser 이며; Xaa3 은 임의의 아미노 산이며; Xaa4 는 임의의 아미노 산이며; Xaa5 는 임의의 아미노 산이며; Xaa6 은 임의의 아미노 산이며; 그리고 Xaa13 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재한다.
CPD 13 은 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa13 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재하며; Xaa2 는 Cys 또는 Ser 이며; Xaa3 은 Ala, Ser, 또는 Thr 이며; Xaa4 는 Trp 또는 Tyr 이며; Xaa5 는 His 또는 Trp 이며; Xaa6 은 Leu 또는 Met 이며; 그리고 Xaa13 은 임의의 아미노 산이거나 또는 부재한다.
CPD 14 는 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa13 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 은 Ser, Arg, 또는 Asp 이며; Xaa2 는 Cys 또는 Ser 이며; Xaa3 은 Ala, Ser, 또는 Thr 이며; Xaa4 는 Trp 또는 Tyr 이며; Xaa5 는 His 또는 Trp 이며; Xaa6 은 Leu 또는 Met 이며; 그리고 Xaa13 은 Glu, Ser, Thr, 또는 Val 이다.
결합 성분은 IgG 에 대해 높은 친화력 (예컨대, 테이블 1 의 CPD 1 및 CPD 2 에 대해 알려진 바와 같은 나노몰) 을 가지는 물질로 한정되지 않는다. 일부 실시형태들에서, 약 100 밀리몰 또는 1 마이크로몰보다 큰 친화력들을 가지는 결합 성분들이 항체들을 검출하기 위해 이 확산 기반의 분석에 성공적으로 사용될 수도 있다.
다른 유형들의 분비된 피분석물들에 대해, 리포터 분자들의 상이한 유형들의 결합 성분들이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 비가역성 프로테아제 억제제가 세린 또는 시스테인 프로테아제들에 대한 플루오로메틸 케톤 억제제와 같은, 단백질분해 효소를 검출하는데 사용될 수도 있다. 사카라이드들 또는 매크로라이드 항생제들과 같은 조작된 피분석물들에 대한 압타머들이 사용될 수도 있다. 항체들 또는 그의 단편들이 알부민들, 구조 단백질들, 또는 매크로라이드 항생제들을 검출하는데 사용될 수도 있다. 당업계에서 공지되어 있는 바와 같은, 분비된 피분석물에 대한 임의의 적합한 결합 성분이 사용될 수도 있다.
검출가능한 라벨. 리포터 분자는 또한 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 검출가능한 라벨을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 형광 라벨일 수도 있다. 형광물질, 로다민, 시아닌, 페난트렌 또는 임의의 다른 종류의 형광 염료 라벨을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 임의의 적합한 형광 라벨이 사용될 수도 있다. 유용한 형광 염료 라벨들의 일부 예들은 (리포터 분자의 결합 성분의 레벨링을 위한 티오이소시아네이트 활성 종으로서 이용가능한) 형광물질 Alexa Fluor® 594 ((AF594, ThermoFisher Scientific, Cat. No. A20004 (NHS 에스테르)) MW 819.8, Ex/Em590/617 nm) 또는 HiLyte FluorTM 555 (AnaSpec Inc., Cat. # AS-81250) MW 869, Ex/Em 550/566 nm (Cy3 필터) 를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자, 예컨대 압타머 또는 캡쳐 올리고뉴클레오티드는, 분자 비콘, 이중 혼성 프로브, Scorpion®, 또는 Eclipse® 프로브를 포함할 수도 있지만 이에 한정되지 않는, FRET 라벨링된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. FRET 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프로브 쌍은 혼성 이벤트가 발생할 때까지 형광을 발하지 않는 형광 라벨들을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 리포터 분자의 결합 성분에 직접 또는 간접적으로 공유결합으로 부착된다. 어떤 다른 실시형태들에서, 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 리포터 분자의 결합 성분일 수도 있으며, 내재 또는 외래 형광 염료는 검출가능한 라벨일 수도 있으므로, 캡쳐 올리고뉴클레오티드가 피분석물, 예를 들어, 삽입 염료에 결합할 때까지 리포터 분자의 검출가능한 라벨이 검출불가능할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 검출가능한 라벨은, 검출가능한 신호가 결합하기 전에 존재하지 않는 새로운 파장으로 시프트되기 때문에, RMSA 착체가 형성된 후까지 검출불가능할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분에 공유결합으로 부착된 삽입 염료. 다른 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 동위원소일 수도 있다.
또한 다른 실시형태들에서, 검출가능한 라벨 및 결합 성분은 단일 모이어티, 예를 들어, 검출가능한 신호를 제공하는 단백질 또는 핵산 (예컨대, 녹색 형광 단백질 (GFP) 와 같은 자가-검출가능한 단백질, 또는 GFP 와 동등한 RNA 인, "스피나치 (Spinach)" 와 같은 리보핵산 압타머) 이다. 스피나치는 3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴 이미다졸리논 (DFHBI) 을 형광 검출가능한 라벨로서 포함한다.
확산 모델링. 본원에서 설명하는 방법들은 격리 펜의 고립 영역으로부터 흐름 영역 (예컨대, 미세유체 채널) 으로의 분비된 피분석물들의 차동 확산에 관련된 모델들 및 관측들을 이용한다. COMSOL®, MATLAB® 및/또는 다양한 수치 모델링 및 컴퓨터-지원 설계 툴들을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 다수의 소프트웨어 프로그램들이 생물학적 마이크로-객체의 분비된 피분석물들의 거동들을 모델링하는데 사용될 수도 있다.
도 6 은 고립 영역 (640) 내, 격리 펜 (624) 의 기부에, 채널 (122) 에 대한 격리 펜 (624) 의 개구에 대해 원위의 지점에, 위치된 하나의 생물학적 세포 (602) 를 가지는 격리 펜의 하나의 유형의 모델을 나타낸다. 확산 (610) 의 라인들은 고립 영역 (640) 으로부터 접속 영역 (636) 을 통해서 채널 (122) 까지의 세포 (602) 의 분비된 피분석물의 확산의 궤적을 나타낸다. 확산하는 물질들이 접속 영역을 통과함에 따라, 확산의 라인들이 집중되며 채널 (122) 로 선형적으로 유동한다는 것을 알 수 있다. 확산의 레이트는 분비된 피분석물의 확산 계수에 의해 정의되며, 다음과 같이 모델링될 수 있다.
특정의 분비된 피분석물에 대한 확산 계수 D 는 다음과 같이 정의된다:
D = (1/f) kT (수식 1)
여기서, f 는 마찰 계수이며, k 는 볼츠만 상수이며, T 는 절대 온도이다. 마찰 계수 f 는 분비된 피분석물이 확산하고 있는 용매의 점도
Figure 112018113390202-pct00005
에, 그리고, 분비된 피분석물의 사이즈 및 형상에 의존한다. 구형 구를 갖는 분비된 피분석물은 최소의 마찰 계수를 갖지만, 정의된 구조적 제약들을 갖는 항체 또는 다른 단백질의 비대칭 형상과 같은 비대칭 형상은 더 큰 f 를 초래할 것이다. 추가적으로, 분비된 피분석물이 분비된 피분석물과 연관된 수소 결합 또는 수화수들과 같은 용매와의 상호작용들을 가지면, 마찰 계수가 또한 증가될 것이다. 일부 일반화된 확산 계수들이 테이블 2 에 나타내어진다.
테이블 2. 예시적인 확산 계수들.
Figure 112018113390202-pct00006
분비된 피분석물의 확산은 다음 수식으로 표현될 수 있다:
<x2> = qiDt (수식 2)
여기서, <x2> 는 평균 제곱 변위이며, x 는 시간 t 에 걸친 선택된 이동의 시작 지점으로부터의 평균 거리이다. qi 의 값은 확산이 1, 2, 또는 3 차원들에서 평가되는지 여부에 의존한다.
이들 수식들에 의해, 리포터 분자가 정의된 구성의 격리 펜 안으로 그리고 밖으로 확산하는 시간 및 RMSA 착체에 대한 시간이 모델링될 수 있으며, 그리고, 약 150 kDa 의 범위의 분자량을 가지는 항체 분비된 피분석물에 대해, 도 7a 및 도 7b 에 도시된다. 도 7b 에서, 곡선 (712) 는 약 2.5kDa 의 분자량인, CPD 3 과 같은 작은 펩티드의 거동을 모델링하며, 여기서, 작은 펩티드는 채널로부터 격리 펜 (424, 524, 624) 및 기타 등등 (각각 도 4a 내지 도 4c, 도 5 및 도 6) 과 같이 구성된 격리 펜 내로 25-30 분 내에 확산하여 평형화될 수 있도록 계산된다. 이에 반해, 곡선 (714) 는 약 45 kDa 의 분자량을 갖는, 보다 더 큰 CPD 1 의 거동을 모델링한다. 이러한 더 큰 분자는 용매와 상호작용할 더 많은 기회들을 제공하며, 45-50 분 사이의 어느 지점에서 완전 평형에 도달되지 않는다.
도 7b 에서, 424, 624 와 유사하게 구성된 격리 펜으로부터의 확산에 대해 4개의 상이한 종 (species) 의 거동이 도시된다. 이 그래프에서, 곡선 (716) 은 작은 펩티드 CPD 3 에 대해, 격리 펜 (424, 524, 624), 및 기타 등등과 유사하게 구성된 격리 펜으로부터의 계산된 확산의 레이트를 나타낸다. 작은 펩티드 CPD 3 은 격리 펜으로부터 약 25 분 동안 실질적으로 제거된다. 이에 반해, CPD 3 이 분비된 피분석물 IgG (MS 150 kDa) 에 결합될 때, 곡선 (722) (삼각형 형상) 는 CPD 3 을 포함하는 RMSA 착체에 대한 계산된 확산 거동을 나타내며, 여기서, 적은 양의 RMSA 착체가 60 분후에 남아있다. 곡선 (718) (다이아몬드 형상) 은 CPD 1 (단백질 A, 45kDa 단백질) 에 대한 계산된 확산 거동을 나타내며, 따라서 실질적으로 완전히 확산되기 위해서는 50 분 이상을 필요로 한다. 이 단백질이 분비된 항체 (MW 150 kDa) 와 착체를 형성할 때, 곡선 (724) (점선 선분) 은 CPD 3: IgG 착체의 확산 레이트에 대해 유사하게 느린 확산 레이트를 나타내며, 60 분 후에 여전히 착체가 잔존함을 나타낸다.
도 8a 는 리포터 분자의 2개의 상이한 결합 성분들의 각각에 대한, 리포터 분자와 RMSA 착체들 사이의 차이의 계산을 나타낸다. 곡선 (826) 은 RMSA 착체로부터 발생하는 최대 신호 및 비결합된 리포터 분자로 인한 최소의 신호를 관찰하기 위해, CPD 3: CPD 3/IgG 페어링에 대한 격리 펜 내 농도에서의 최대 차이에 대한 분석 시간 최적화를 나타내며, 임의의 확산 물질을 미세유체 디바이스로부터 배출하는 미세유체 채널에서의 복원된 매질 유동의 약 15 분에 있는 것으로 보인다. 곡선 (826) 은 CPD 1 에 대한 차이 곡선을 나타내며, 비결합된 CDP-1 및 격리 펜 내에서 CPD 1 을 포함하는 RMSA 착체 사이의 농도의 차이를 나타내며, 그리고 최대 차이가 추후 시점에, 25 분후 또는 더 긴 어느 시점에서, 나타난다는 것을 보여준다. 도 8b 는 비결합된 CPD 1 에 대한, 내측 확산 (상부 그래프) 및 외측 확산 (하부 그래프) 에 대한 실험 시간을 나타내며, 계산된 값들과의 적절한 상관 관계를 나타낸다. 이러한 일련의 모델링 및 실행된 실험들은 특정의 격리 펜 내에서 피분석물 분비의 레벨들을 평가하기 위해, 실질적으로 리포터 분자: 분비된 피분석물 착체로부터의 검출가능한 신호의 관측을 위한 최적화된 시점들을 찾을 수 있음을 나타낸다.
확산 축을 따른 영역의 선택. 도 9a - 도 9b, 및 도 10a - 도 10b 는 분석 이미지들로부터 정량적 측정치들 (상대 또는 절대) 을 추출할 영역을 결정하는데 사용되는 모델링 실험들을 나타낸다. 도 9a 및 도 9b 에서, RMSA 착체로부터의 확산 유동 및 결과적인 형광 신호 강도의 모델링이 격리 펜 (424, 524, 624) 과 유사한 미세유체 디바이스 (900) 의 격리 펜 (924) 내에서의 생물학적 세포 (902, 904, 906) 의 위치의 효과를 고려하기 위해 수행되었다. 그 효과는 채널 (122) 에 대한 격리 펜 (924) 의 개구에 원위에 있는 격리 펜의 기부 (0 마이크론) 로부터 약 25 마이크론에서 세포 (902) 에 대한 위치를 이용하여 모델링되었으며; 세포 (904) 는 격리 펜 (924) 의 기부로부터 거리 약 100 마이크론에서 모델링되었으며; 세포 (906) 는 격리 펜 (924) 의 기부로부터 거리 약 180 마이크론에서 모델링되었다 (도 9a 및 도 9b 의 수평축 참조). 각각의 세포는 모델링 단순화를 위해, 라인 (952) 로 예시된, 격리 펜의 개구 측으로 확산 궤적의 중심 축을 따라서 있도록 모델링된다. 이들 위치들의 각각은 격리 펜의 고립 영역 (940) 내에, 그리고 격리 펜의 접속 영역 (936) 으로부터 멀리 떨어져 있으며, 따라서, 고립 영역 (940) 내 세포들 (902, 904, 906) 로부터 검출되는 신호 강도가 채널 (122) 에서의 유동 (242) 으로부터의 유동 효과들에 의해 영향을 받지 않도록 보장한다. 도 9a 의 y 축은 리포터 분자 (또는, 동등하게는, 이 실험이 단지 검출된 형광 강도들에만 의존하기 때문에, RMSA 착체) 의 정규화된 농도를 나타낸다. 도 9a 에 나타낸 바와 같이, 형광 신호의 강도 (모델링은 902, 904, 906 이 모두 분비된 피분석물을 동일한 레이트에서 생성하고 있다는 제약을 포함한다) 는, 형광으로 라벨링된 착체가 격리 펜 (924) 의 기부 근처의 그의 위치로 인해, 904, 906 의 것보다 더 단방향 방법으로 확산하기 때문에, 세포 (902) 에 대해 가장 높다. 세포들 (904, 906) 은 라벨링된 RMSA 착체들을 모든 방향들로 확산시키기에 더 많은 용량을 갖는다. 이 모델에 의해 결정되는 것은 영역이 식별될 수 있다는 것이며, 여기서, 신호 강도는 라벨링된 종의 농도들 (예컨대, RMSA 착체) 에서의 변화들로 인해 형광 신호 강도에서의 변화들에 가장 민감하고, 도 9a 및 9b 양자에 표시된 바와 같이, 격리 펜 (924) 과 채널 (122) 사이의 확산 축을 따라서 있는, 영역 (944) 인, 세포 (902, 904, 906) 의 정확한 위치에 가장 적게 민감하다. 세포 위치 불감 영역 (944) 은 격리 펜 (924) 내 생물학적 마이크로-객체의 분비된 피분석물의 상대 또는 절대 량을 평가하는데 사용되는 관심 영역 (AOI) 의 적어도 일부분이다. 일부 실시형태들에서, AOI 는 격리 펜 (924) 및/또는 채널 (122) 의 추가적인 부분들을 포함할 수도 있다.
세포들의 큰 개체군들에 대해 최적화된 격리 펜. 도 10a 및 도 10b 는 상이하게 구성된 격리 펜 (1024) 에 대해 도 9a 및 도 9b 에 나타낸 바와 같이, 유사하게 구성된 모델링 실험을 예시한다. 미세유체 디바이스 (1000) 의 (격리 펜 (224, 226, 228) 과 유사한) 격리 펜 (1024) 내 생물학적 세포 (1002, 1004, 1006) 의 위치의 효과가 도시되어 있다. 그 효과는 채널 (122) 에 대한 격리 펜 (1024) 의 개구에 원위에 있는, 격리 펜의 기부 (0 마이크론) 로부터 약 25 마이크론에서 세포 (1002) 에 대한 위치를 이용하여 모델링되었으며; 세포 (1004) 는 격리 펜 (1024) 의 기부로부터 거리 약 100 마이크론에서 모델링되었으며; 세포 (1006) 는 격리 펜 (1024) 의 기부로부터 거리 약 180 마이크론에서 모델링되었다 (도 10a 및 도 10b 의 수평축 참조). 각각의 세포는 모델링 단순화를 위해, 라인 1052 로 예시된, 격리 펜의 개구 측으로 확산 궤적의 중심 축을 따라서 있도록 모델링된다. 이들 위치들의 각각은 격리 펜의 고립 영역 (1040) 내에, 그리고 격리 펜의 접속 영역 (1036) 으로부터 멀리 떨어져 있으며, 따라서, 고립 영역 (1040) 내 세포들 (1002, 1004, 1006) 로부터 검출되는 신호 강도가 채널 (122) 에서의 유동 (242) 으로부터의 유동 효과들에 의해 영향을 받지 않도록 보장한다. 도 10a 의 y 축은 리포터 분자 (또는, 동등하게는, 이 실험이 단지 검출된 형광 강도들에만 의존하기 때문에, RMSA 착체) 의 정규화된 농도를 나타내며, 나타낸 농도들의 설명은 상기 도 9a 에 대한 것과 같다. 이 모델에 의해 결정되는 것은 영역이 식별될 수 있다는 것이며, 여기서, 신호 강도는 라벨링된 종의 농도들 (예컨대, RMSA 착체) 에서의 변화들로 인해 형광 신호 강도에서의 변화들에 가장 민감하고, 도 10a 및 도 10b 양자에 표시된 바와 같이, 격리 펜 (1024) 과 채널 (122) 사이의 확산 축을 따라서 있는, 영역 (1044) 인, 세포 (1002, 1004, 1006) 의 정확한 위치에 가장 적게 민감하다. 세포 위치 불감 영역 (1044) 은 격리 펜 (1024) 내 생물학적 마이크로-객체의 분비된 피분석물의 상대 또는 절대 량을 평가하는데 사용되는 AOI 의 적어도 일부분이다. 일부 실시형태들에서, AOI 는 격리 펜 (1024) 과 채널 사이의 확산 축을 따라서 위치되는 격리 펜 (1024) 및/또는 채널 (122) 의 추가적인 부분들을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 격리 펜의 기하학적 구조는 분비된 피분석물의 최적의 확산 프로파일을 제공하도록 변경될 수도 있다. 도 11a 는 최적화된 확산 프로파일을 제공하도록 설계된 채널 (122) 및 격리 펜들 (1124, 1126) 을 포함하는 미세유체 디바이스 (1100) 의 섹션을 예시한다. 구체적으로 설명하면, 격리 펜들 (1124, 1126) 은 세포들 (1102) 의 분비된 피분석물들의 (상대 또는 절대) 양을 평가할 때에 사용을 위해 더 큰 신호 강도를 제공하는데 유용할 수도 있는 다수의 생물학적 마이크로-객체들 (1102) 을 수용할 수 있는 고립 영역들을 갖는다.
일부 실시형태들에서, 격리 펜 (1124) 의 고립 영역 (1140) 은 0.1 내지 100 nL 의 범위인 체적을 수용할 수도 있다. 특정의 실시형태에서, 도 11b 에 나타낸 바와 같이, 고립 영역 (1140) 은 6 nL 의 체적을 유지할 수도 있다. 격리 펜들 (1124, 1126) 은 무려 100, 200, 300, 400 또는 500 개나 되는 마이크로-객체들을 수용할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 격리 펜들은 최대 300-400 개의 마이크로-객체들을 수용할 수도 있다.
격리 펜들 (1124, 1126) 은, 각각 고립 영역 (1140) 에서 생물학적 마이크로-객체들 (1102) 을 접속 영역 (1136) 으로부터 분리하도록 구성되는 접속 영역 (1136) 을 가지며, 분비된 피분석물이 그의 소스 (예컨대, 피분석물을 분비하는 생물학적 마이크로-객체들 (1102) 중 하나) 로부터 멀리 확산되기에 충분한 거리를 생성한다. 이러한 분리는 예상된 확산 궤적 (1130) 의 라인을 따른 그의 확산 궤적을 가진 (예컨대, 자유롭게 확산되지 않는) 생물학적 마이크로-객체 (1102) 에서 또는 상에서 여전히 연관되는 RMSA 착체들로부터의 국부화된 신호의 간섭 또는 중첩을 감소시킨다. 이러한 중첩을 제거함으로써, AOI 의 적어도 일부분 또는 전체 AOI 로부터 발생된 농도 값들은 확산될 때 그 결합된 리포터 분자로부터의 신호를 나타낼 것이다. 일부 실시형태들에서, 접속 영역 (1136) 은 고립 영역 (1140) 에 대한 접속 영역 (1136) 의 수축에 의해 고립 영역 (1140) 으로부터 분리된다. 일부 실시형태들에서, 접속 영역 (1136) 은 10-30 마이크론의 범위인 폭 및 40 내지 200 마이크론의 범위인 길이를 가질 것이다. 특정의 실시형태에서, 접속 영역 (1136) 은 폭이 20 마이크론이며 길이가 100 내지 200 마이크론의 범위이다.
도 11b 는 격리 펜 (1124) 내로부터 접속 영역 (1136) 을 통과하여 채널 (122) 밖으로, 생물학적 마이크로-객체 (1102) 의 분비된 피분석물의 플럭스 라인들 (1120) 및 농도 기울기 라인들 (110) 을 도시한다. 접속 영역 (1136) 의 부분들은 AOI 의 적어도 일부분으로서 선택될 수도 있으며, 세포 위치에 민감하지 않고 분석 이미지에서 관측된 강도들에서의 변화에 민감한 영역의 부분일 수도 있다.
관심 영역 (AOI) 을 평가하기. 도 12a 는 데이터가 생물학적 마이크로-객체로부터의 분비된 피분석물의 상대 또는 절대 량의 결정을 위해 추출되는 AOI 의 개략도를 나타낸다. AOI (1250) 는 (미세유체 디바이스 (1200) 에서의 격리 펜 (1224) 의) 고립 영역 (1240) 에서의 영역, 접속 영역 (1236) 에서의 영역; 및 채널 (122) 의 부분을 포괄하도록 선택되며, 이들 모두는 격리 펜 (1224) 으로부터 채널 (122) 까지 확산 축을 따라서 정렬된다. 이 실시형태에서, 유동 (242) 은 미세유체 채널 (122) 에 존재하며, AOI 에 통합된 채널의 부분 내에서의 임의의 검출가능한 신호를 감소시킨다. AOI 가 격리 펜 내에서 끝나는 지점의 선택이, 피분석물을 분비하고 검출가능한 신호가 방출되는 생물학적 오브젝트 (1202) 와의 중첩을 방지하기 위해 이루어진다. 도 12a 에 나타낸 바와 같이, 확산의 라인들 (1210) 은 접속 영역 (1236) 측으로 지향되며, 접속 영역 (1236) 으로 진입함에 따라 확산 축과 정렬되게 된다. 농도 기울기 라인들 (1220) 이 또한 도시되어 있다.
도 12b 는 미세유체 디바이스 (1200) 내 그의 위치를 표시하는, "327" 의 식별 번호 (1260) 를 가지는, 격리 펜 (1224) 에 대한 분석 이미지를 나타내는 사진이다. 식별 번호는 명시야 위치와 형광 이미지 위치를 상관시키는 것을 도우며, 또한 사용자들이 선택된 격리 펜으로부터 세포들을 선택하고, 조작하고, 그리고 배출하는 것을 돕는다. 도 12b 의 격리 펜 (1224) 은 (비라벨링된) 고립 영역 내에 존재하는 하나의 생물학적 마이크로-객체 (1202) 를 갖는다. 분석 이미지는 생물학적 마이크로-객체 (1202) 로부터 방출되는, 격리 펜 내 형광 신호의 광범위한 양을 명확하게 나타낸다. AOI (1250) 는 사진적으로 올려 놓아진 것으로 도시되며, 확산 축을 따라서 정렬되며 확산 궤적 (1252) 의 라인을 따라서 중심에 위치한다. AOI 는 넓이가 20 픽셀들이며, 이는 (도 12b 에 라벨링되지 않은) 접속 영역 (126) 의 폭에 따라 선택되며 20 개의 서브-영역들로 분할된다. AOI 는 각각의 서브-영역에 대해 다른 픽셀 사이즈들을 가질 수도 있으며, 서브- 영역들의 개수는 약 1 개로부터 약 50 개까지 다양할 수도 있다. AOI 의 서브-영역 (1254) 은 AOI 의 모든 서브-영역들의 채널 (122) 로부터 가장 멀리 위치된 서브-영역이며, 그러나 생물학적 마이크로-객체 (1202) 와 중첩하지 않도록 선택된다. AOI 의 제 2 단부에서의 서브-영역은 채널 (122) 내에 위치된 서브-영역 (1258) 이다. 중요하게는, 서브-영역들 (1256) 의 그룹은 검출된 형광이 격리 펜 내 생물학적 마이크로-객체의 분비된 피분석물의 상대 또는 절대 량을 평가하는데 사용되는, 도 9a - 도 9b 및 도 10a - 도 10b 의 세포 위치 불감 영역 (944, 1044) 이다.
도 12c 는 AOI 에서 검출된 형광의 그래픽 표현을 나타내며, 여기서, 수평축 상의 값들은 (도 12b 의 서브-영역 (1254) 에 대응하는) 서브-영역들 1, 즉, 생물학적 마이크로-객체 (1202) 에 대한 AOI 의 가장 근위의 단부에서의 서브-영역을 나타내며, 서브-영역 (20) 은 채널 (122) 에서의 AOI 의 가장 근위의 단부에서, 도 12b 의 서브-영역 (1258) 에 대응한다. AOI 에서의 검출된 형광의 양은 분비된 피분석물의 양에 비례한다. 다양한 수학적 연산들이 분비된 피분석물의 상대 또는 절대 량에 관한 정보를 추출하는데 사용될 수도 있으며 아래 섹션들에서 자세히 설명된다.
분석 이미지의 정규화. 분석 이미지를 프로세싱하여 분비된 피분석물의 상대 또는 절대 량들을 평가하기 전에, 미가공 분석 이미지는 정규화될 수도 있다. 도 13a 는 광 소스(들), 광 변조 서브시스템 (예컨대, DMD), 이미지 캡쳐 디바이스 (예컨대, 카메라) 와 같은 시스템 컴포넌트들의 변동 및 비-선형성과 같은 에러를 디스플레이하는 미가공 분석 이미지를 나타낸다.
유동 조건들 하에서 수행되는 분석들을 위한 방법 A. 일 실시형태에서, 미가공 분석 이미지는 다음 수식에서와 같이, 미가공 분석 이미지에서의 각각의 픽셀로부터 암 (Dark) 참조 이미지 및 신호 참조 이미지 양자의 보정치를 감산함으로써 정규화될 수도 있다:
Figure 112018113390202-pct00007
(수식 3)
암 참조 이미지는 임의의 매질을 디바이스로 유동시키기 전에 미세유체 디바이스를 이미징함으로써 얻어질 수도 있다. 자발형광 에러들 및 다른 시스템 에러들은 각각의 픽셀에서의 암 참조 값을 감산함으로써 보정될 수 있다. 신호 참조 이미지는 롤 오프 (roll off), 포토블리칭 (photobleaching) 에러들 또는 카메라 에러들에 대해 보정될 수도 있으며, 리포터 분자, 또는 단지 리포터 분자를 미세유체 디바이스를 통해서 유동시켜 리포터 분자 또는 형광 라벨의 평형 농도에 도달함으로써 얻어진다. 미가공 분석 이미지에서의 각각의 픽셀은 정량 목적들을 위해 형광 데이터를 추출하기 전에 이러한 방식으로 보정될 수도 있다. 정규화된 분석 이미지가 도 13b 에 도시된다
비-유동 조건들 하에서 수행되는 분석들의 일부 실시형태들에 대한 방법 B. 정규화에서의 제 1 스텝으로서, 암 참조 이미지가, 위에서 설명한 바와 같이, "암 참조 감산된 이미지" 를 생성하기 위해, 존재하는 결합된 및 비결합된 리포터 분자들에 의한 미세유체 디바이스의 이미지로부터 감산되었다.
제 2 스텝으로서, 결합된 및 비결합된 리포터 분자들이 존재하지 않는 도 13a 의 미가공 분석 이미지의 부분들 (즉, 미세유체 디바이스에서의 격리 펜들 및 채널들을 정의하는 벽들) 이 "마스크된 암 참조 감산된 이미지" 를 생성하기 위해 자발-형광 감산된 이미지로부터 제거되거나 또는 "마스크되었다". 당업자들이 주지하고 있는 바와 같이, 이 스텝은 또한 자발-형광의 감산 전에 수행될 수 있다.
도 13a 의 정규화된 이미지를 발생시키는 제 3 스텝으로서, 마스크된, 자발-형광 감산된 이미지에서의 각각의 픽셀에 대한 강도 값은 마스크된, 자발-형광 감산된 이미지에서의 모든 픽셀들에 기초하여 계산된 전역 평균 강도로 나눠졌다. 각각의 픽셀에 대한 강도 값을 전역 평균 강도로 나눔으로써, 각각의 픽셀에 대한 이득 보정 인자를 포함하는 이미지 또는 유사한 데이터 구조 (예컨대, 매트릭스) 가 발생되며 ("이득 보정 이미지") 이미지의 각각의 픽셀에 대해 생성된다. 이득 보정 이미지를 발생시키는 다른 방법들은 당업자들에게 널리 공지되어 있다.
도 13a 에 도시된 정규화된 이미지를 발생시키는 제 4 스텝으로서, 이득-보정 이미지는 무작위 잡음을 감소시키기 위해 평활화 알고리즘을 겪었다. 이 스텝은 본 방법의 일부 실시형태들에서 채용되지 않을 수도 있다. 구체적으로 설명하면, 이득-보정 이미지는 각각의 픽셀에 대해 로컬 평균을 발생시킬 때에 이미지의 마스크된 부분들을 고려하는 9-픽셀 곱하기 9-픽셀 박스-필터를 사용하는 박스-필터 평활화 알고리즘을 겪었다. 당업자들이 알고 있는 바와 같이, 평균 필터링, 가우시안 필터링, 기울기 가중 필터링, 시퀀스 통계적 필터링, 강건한 평활화 필터링, Crimmins 잡음 제거 필터링, 에지 보존 필터링 및 자가-적응적 중간값 필터링과 같은, 다른 평활화 알고리즘들이 사용될 수도 있다.
도 13b 에 도시된 정규화된 사진을 발생시키는 제 5 스텝으로서, 평활된 이득-보정 이미지는 정규화된 이미지를 발생시키기 위해 자발-형광 감산된 이미지로 곱해질 수도 있다.
이들 방법들은 전술한 스텝들 및 방법들 중 임의의 것을 동일한 또는 상이한 시퀀스로 결합할 수도 있다.
비-유동 조건들 하에서 수행된 분석들의 일부 실시형태들에 대한 방법 C. 결합된 RMSA 착체의 확산의 레이트보다 그의 더 큰 확산의 레이트로 인해, 채널 내 비결합된 리포터 분자의 실질적으로 균일한 농도에 따라서, 이미지를 정규화하는 다른 방법이 사용될 수도 있다. 채널들의 명도가 위에서 설명된 에러들을 보정하기 위해 이미지를 정규화하는데 사용될 수도 있다.
따라서, 대안 실시형태에서, 미세유체 디바이스의 영역들의 뷰를 가로지르는 명도의 양에서의 임의의 분산을 보정하기 위해, 도 13b 의 정규화된 이미지가 펜들에 인접한 채널들에서의 명도를 이용하여 얻어질 수 있다. 이 정규화의 방법은 채널들이 임의의 존재하는 피분석물 (또는, 임의의 RMSA 착체) 을 가질 것으로 예상되지 않으므로 존재하는 피분석물을 갖지 않는 미세유체 디바이스의 임의의 영역을 이용하여 수행될 수 있다는 사실에 의존한다.
채널 강도에 기초하여 정규화하기 위해, 제 1 스텝으로서, 그것 내에 존재하는 임의의 피분석물을 가질 것으로 예상되지 않는 채널의 영역 R 이 각각의 격리 펜에 대해 식별된다. 일부 실시형태들에서, 이 영역 R 은 펜 위의 채널의 영역에 대응하는 사전-정의된 영역 R 일 수 있다. 다른 실시형태들에서, 각각의 격리 펜에 대한 영역 R 은 다른 정보에 기초하여 식별되거나 또는 이미지에 기초하여 계산될 수 있다.
채널의 각각의 영역 R 에 대해, 명도 값 B R 은 영역 내 픽셀들에 기초하여 계산된다. 명도 값들을 계산하기 전에, 명도 값을 계산하는데 사용되는 이미지는 위에서 설명한 바와 같이, 감산되거나, 마스크되거나 또는 아니면 프로세싱될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, B R 은 영역 R 내 픽셀들의 평균 명도 값이다.
각각의 영역 R 에 대한 평균 명도 값 B R 이 계산된 후, 펜들 및 채널들의 이미지는 일련의 영역들 A 로 파티션될 수도 있으며, 여기서, 각각의 영역 A 는 개별 영역 R 을 포괄한다. 이 영역은 영역 R 이 영역 A 의 중심에 있도록 계산될 수도 있다. 특정의 실시형태에서, 영역들 A 는 각각의 영역 R 의 도형 중심들의 Voronoi 다이어그램 또는 Delauney 삼각측량을 생성함으로써 계산될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 각각의 영역 R 은 그의 개별 영역 A 의 중심에 있을 필요가 없으며, 미세유체 디바이스를 세그먼트화하는 사전-정의된 영역들에 기초하여 계산될 수 있다. 각각의 영역 A 에 대해, 이득-보정 인자는 영역 A 와 연관된 영역 R 에 대한 명도 값 B R 로 나눈 가장 밝은 영역에 대해 계산된 최대 명도 값 B Rmax 에 기초하여 계산된다. 이득-보정 인자는 정규화된 이미지를 생성하기 위해 다른 이미지 (예컨대, 자발-형광 감산된 이미지) 에 곱해질 수 있는 이득-보정 이미지를 발생시키는데 사용될 수도 있다. 이득-보정 인자 이미지는 또한 정규화에서의 사용 전에 위에서 설명한 바와 같이 평활화될 수도 있다.
분석 신호의 정량화. 일부 실시형태들에서, RMPC 의 확산 프로파일이 격리 펜에 존재하는 RMPC 의 양을 정량화하는데 사용될 수도 있다. 확산 프로파일은 그의 소스로부터 채널로 확산될 때 RMPC 의 농도를 나타내는 일련의 값들 ("농도 값들") 을 제공한다.
AOI 의 식별 후, 다른 변환들이 적용될 수도 있다. 예를 들어, 각각의 라인에서의 픽셀들은 아웃라이어 (outlier) 및/또는 비정상적인 픽셀들을 폐기하는 것, 다른 형태들의 글로벌/로컬 정규화, 공간 변환, 및 픽셀의 공간을 (예컨대, 다-차원 공간으로부터 2차원 공간으로 또는 반대로) 변환하는 것에 의해 프로세싱될 수도 있다.
실시형태에 따라서, 강도 값들은 농도 값들을 계산하는데 상이한 방법들로 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, AOI 는 고정 소수점들에서의 강도 값들에 대응하는 농도 값들의 세트를 발생시키기 위해 고정 소수점들에서 샘플링될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, AOI 는 일련의 세그먼트들로 세그먼트화되며, 각각의 세그먼트의 중간 또는 평균 강도가 계산될 수도 있다. 실시형태 및 요구된 해상도의 정도에 기초하여 계산된 농도 값들의 개수는 1 만큼 낮고, 확산 궤적을 나타내는 라인 내 픽셀들의 개수 만큼 높을 수 있다.
실시형태에 따라서, 농도 값들은 존재하는 결합된 리포터 분자로부터의 신호의 양 (따라서, 분비된 피분석물의 양) 을 정량화하기 위해 상이한 방법들로 결합될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 농도 값들은 농도 값들이 확산 프로파일과 일관된 특성들을 나타내는지 여부를 평가하기 위해 플롯될 수도 있다. 실시형태에 따라서, 다수의 알고리즘들이 라인을 농도 값들에 피팅하고 그 라인과 연관된 기울기 및 에러와 같은 라인의 특성들을 계산하는데 사용될 수도 있다. 적합한 라인-피팅 알고리즘들은 최소제곱, 다항식 피트, 곡선-피팅, 및 erfc 피팅을 포함한다. 다른 알고리즘들은 당업자들에게 공지되어 있다. 농도 값들을 획득하기 위해 형광 강도 값들을 변환하는 방법들이 아래에서 더 충분히 설명된다.
도 14a 는 식별 번호 "1107" 을 가지는 하나의 격리 펜 (1424) 의 분석 이미지 (사진) 이며, 여기서, 예상된 확산 궤적 (1452) 의 라인이 도시된다. AOI (1450) 는 분석 이미지 상에 투영되며, 이 예에서, 약 12 픽셀들의 폭을 가지며, 그것은 라인에 의해 정의된 축을 따른 20 개의 세그먼트들 (세그먼트들은 미도시됨) 로 세그먼트화되었다. 20 개의 동일한 세그먼트들의 각각에 대한 중간 강도가 계산되었으며 그후 도 14b 의 그래프에서 농도 값으로서 플롯된다. 그래프들의 수평축 상에서, 세그먼트 번호들 1-20 은 소스 (즉, 분비된 피분석물을 분비하는 세포들) 로부터의 이들의 거리에 따라서 넘버링되며, 여기서, 세그먼트 번호들은 채널로부터 가장 원위의 격리 펜의 영역에서의 세포들에 가장 가까운 AOI 의 세그먼트를 나타내는 낮은 번호를 가진다.
도 14b 는 이전 패러그라프 및 후속하는 다른 섹션들에서 설명되는 방법에 따라서 발생된 격리 펜들의 세트에 대한 농도 값들을 나타내는 일련의 곡선들을 도시한다. 도 14b 에 나타낸 일련의 곡선들을 발생시키기 위해, 각각의 격리 펜에 대해 발생된 농도 값들은 격리 펜에서의 세포들의 수에 기초하여 정규화되지 않았다. 그러나, 대안적인 실시형태들에서, 농도 값들 및 최종적인 곡선들은 각각의 격리 펜에서의 세포들의 수에 기초하여 정규화될 수도 있다. 도 14b 에 나타낸 바와 같이, 각각의 펜에 대한 (농도 값들의) 곡선의 기울기가 각각의 격리 펜에 존재하는 분비된 피분석물의 상대 량을 평가하는데 사용될 수도 있다. 다시 말해서, 기울기는 격리 펜들이 서로에 대해 랭크 및 순위화될 수 있도록 스코어로서 사용될 수도 있으며, "기울기" 및 "스코어" 는, 본원에서의 일부 실시형태들에서는, 교환가능하게 사용될 수도 있다. 일부의 경우, 스코어는 분비 스코어로서 지칭될 수도 있다. 좀더 구체적으로, 분비된 피분석물이 격리 펜들에 존재하는 생물학적 마이크로-객체 (예컨대, 세포) 에 의해 생성되는 경우들에서, 기울기들이 각각의 격리 펜에서의 세포들이 분비된 피분석물을 발생시키는 상대적인 능력 (예컨대, 세포들이 항체를 분비하는 상대적인 능력) 을 평가하는데 사용될 수도 있다. 아래에서 설명하는 바와 같이, 분비된 피분석물의 상대 또는 절대 량은, 격리 펜에서의 세포들의 위치들에 민감하지 않으며 관측된 형광 강도에서의 분산에 가장 민감한 AOI 의 서브-영역 (예컨대, 도 12b 의 영역들 (1256), 도 10a 내지 도 10b 의 1044, 및 도 9a 내지 도 9b 의 944) 에서의 모든 지점들을 합산하는 것을 포함한, 상이한 방법들을 이용하여 계산될 수도 있다.
게다가, 각각의 펜에 대한 농도 값들이 예상된 파라미터들에 따르는지 또는 시스템 에러를 표시하는지 여부를 평가하기 위해 곡선의 형상이 평가될 수도 있다. 예를 들어, 도 14b 에서 "펜 (1497)" 로 라벨링된 곡선의 형상은 다른 격리 펜들에 대해 관측된 곡선들의 형상에 대응하지 않는 반면, "펜 (1107)" 로 라벨링된 곡선의 형상은 예상된 확산 프로파일에 대응하지 않는다. 도 14a 에 나타낸 바와 같이, 펜 (1107) 은 예상된 확산 프로파일에 대응하는 그의 곡선을 발생시킨, 그의 격리 펜으로부터 채널까지 리포터 분자의 가시적인 기울기를 가졌다. 도 14c 에 나타낸 바와 같이, 식별 번호 펜 (1497) 을 가지는, 격리 펜 (1426) 은 예상된 확산 궤적 (1452) 및 AOI (1450) 의 라인을 갖는다. 그러나, 격리 펜 (1426) 은 거품을 포함하는 채널에 근위에 있으며, 여기서, 거품의 메니스커스 (1401) 가 이미지에 백색 타원으로서 나타난다. 거품의 존재는 도 14b 에 도시된 펜 (1497) 에 대한 비정상적인 곡선을 초래한다. 다양한 실시형태들에서, 선형 회귀가 적용될 수도 있는 세그먼트화된 AOI 의 영역은 세그먼트들 (서브-영역들) 9-13 로 선택될 수도 있는데, 이는 전술한 바와 같이 접속 영역의 부분들을 포괄하며 형광 강도 분산에 가장 민감하고 그리고 격리 펜 내 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 민감하지 않은 것으로 식별되었다.
도 15 는 미세유체 디바이스 내 복수의 격리 펜들로부터 얻어진, 본원에서 설명하는 방법들 중 임의의 방법을 통해서 유도된 강도 값들 (및, 이에 따른 농도 값들) 을 나타내는 복수의 곡선들의 오버레이를 나타낸다. 그래프의 수직축에 대해 플롯된, 각각의 곡선에서의 각각의 지점의 강도 값들은 오버레이의 용이성을 위해 정규화되었다. 수평축을 따른 값들은 도 9a 및 도 9b, 도 10a 및 도 10b, 도 12a 및 도 12b, 및 도 14a 및 도 14c 에 나타낸 AOI들과 유사하게, (미세유체 디바이스의 채널 내에, 그리고 격리 펜의 외부에 물리적으로 위치되는) 각각의 AOI 의 y 치수에서의 제 1 픽셀을 나타내는, 제로와 동일한 "y" 의 값에서 시작한다. "200" 으로 표시된 수평축을 따른 지점들은 피분석물을 분비하는 세포들에 가장 가까운 AOI 의 경계, 따라서, RMPC들로부터의 검출가능한 신호가 방출되는 소스인, 복수의 격리 펜들의 각각의 AOI 에서의 최종 픽셀에 대응한다. 격리 펜 내 세포들의 위치에 가장 적게 민감하고 형광 강도들에서의 분산에 가장 민감한 AOI 의 부분 (1544) 으로부터 얻어진 농도 값들은 나타낸 바와 같이, 약 90 과 약 130 사이의 y 값들과 연관된 곡선의 부분에 도시된다. 이 영역에서 선형 형상을 부과하며 그의 기울기를 추출하는 수학적 연산이 데이터의 상태를 가깝게 나타낸다는 것을 알 수 있다.
별개의 격리 펜에 배치된 단일 세포로부터 각각 유래되는 수천 개의 클론 개체군들을 포함하는 나노유체 디바이스에 걸쳐서 분석을 수행하는 것은, 클론 개체군들의 각각의 정량화를 제공할 수 있다. 도 16a 및 도 16b 에 나타낸 바와 같이, 희귀하게 높은 생산성 클론들을 발견할 수 있는 능력이 향상된다. 세포들의 무작위 분비 풀 (pool) 로부터의 역가들의 분포가 푸아송 통계들에 의해 잘 설명된다고 가정하면, 역가 분포는 감마 분포에 피트해야 한다. 도 16a 에서, (스코어들로부터 얻어져, 복수의 각각의 격리 펜에 존재하는 세포들의 수에 대해 정규화된) 역가들의 바 그래프 분포 상에 중첩되고 임의의 유닛들 (A.U.) 로 표현된 곡선은 우수한 일치를 나타낸다. 50 A.U. 미만 내지 100 A.U. 미만의 피분석물을 발현하는 대다수의 클론 개체군들이 있으며, 250 A.U. 이상의 높은 범위에서는 아주 적은 개개의 역가들이 나온다. (수평축을 따른) 성장의 레이트에 대한 상대 고유 생산성을 플롯한 동일한 데이터가 나타내어진다. 그래프 상에 중첩된 곡선들은 일정한 역가의 라인들을 나타내며, 이는 또한, 대부분의 클론들이, 이들이 빠른 성장 클론이든 또는 느린 성장 클론이든, 피분석물을 100 A.U. 미만에서 표현하며 세포주 개발에 대해 강구되는 바람직한 높은 생산성 클론들이 아니다는 것을 나타낸다. 영역들 (1670, 1680, 및 1690) 내에서 식별된 단지 약간의 클론들만이 희귀한 높은 생산자들이다. 그러나, 이들 클론들은 원래 파종된 단일 세포들로부터 발생하는 가장 빠른 생산성 클론들이 아니다. 이들 세포들이 웰 플레이트 또는 쉐이커 플라스크와 같은 더 큰 성장 환경의 부분으로서 다른 세포들과 혼합되면, 이들 희귀하고 높은 생산성 클론들은 더 빠르게 성장하며 덜 생산적인 클론들 만큼 과성장될 가능성이 가장 클 것이다. 이들 클론들을 식별하려고 시도하는 것은, 증식을 위해 무작위 단일 세포 세트들의 선택을 시도하려고 하면, 그들을 볼 확률을 갖기 위해 요구되는 세포들의 수를 증가시키기 위해 리소스들의 대량의 입력과 함께 대량의 샘플링 노력을 필요로 할 것이다. 본원에서 제공되는 시스템에서, 역가 (또는, 스코어) 는 클론 개체군들의 모두에 대해 얻어질 수도 있으며, 생산성 클론들의 물리적인 위치는 알려져 있다 (아래, 도 21 참조). 또, 단지 선택된 클론들만이 선택되어 추가적인 증식/서브클로닝을 위해 물리적으로 이동될 수도 있으며; 선택 및 이동은 다른 세포 개체군들에 의한 오염을 방지하기 위해 개별적으로 수행될 수도 있다. 원래 파종된 세포들로부터 발생하는 클론들의 모두를 스크리닝할 수 있는 기회는 원하는 피분석물을 분비하는 세포들을 스크리닝하여 선택하는데 크게 향상된 프로세스를 제공한다.
방법들. 생물학적 마이크로-객체들, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법이 제공되며, 본 방법은, 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 격리 펜으로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 흐름 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 격리 펜은 흐름 영역에 유체 연결되며, 격리 펜은 제 1 유체 매질을 포함하는, 상기 미세유체 디바이스의 격리 펜으로 도입하는 단계; 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군으로 하여금 피분석물을 격리 펜 내 제 1 유체 매질로 분비하게 하는 단계; 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 매질은 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 리포터 분자는 분비된 피분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 흐름 영역으로 도입하는 단계; 복수의 리포터 분자들의 부분으로 하여금 격리 펜으로 확산하게 하여 그 안에 분비된 피분석물에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 리포터 분자: 분비된 피분석물 (RMSA) 착체들을 발생시키는 단계; 및 미세유체 디바이스 내 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계로서, 관심 영역은 격리 펜의 적어도 일부분을 포함하는, 상기 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 흐름 영역은 또한 제 1 유체 매질을 포함할 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 흐름 영역은 제 1 유체 매질와는 상이한 유체 매질을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 리포터 분자는 분비된 피분석물을 결합함으로써, RMSA 착체의 리포터 분자: 분비된 피분석물의 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 2:2, 4:2, 및 기타 등등의 화학양론을 가질 수도 있는 RMSA 착체를 형성할 수도 있다.
피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법의 다양한 실시형태들에서, 리포터 분자들을 검출하는 단계는 비결합된 리포터 분자들을 검출하는 단계 뿐만 아니라, RMSA 착체들의 부분인 리포터 분자들을 검출하는 단계를 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 격리 펜은 고립 영역 및 고립 영역을 흐름 영역에 유체 연결하는 접속 영역을 가질 수도 있으며, 여기서, 고립 영역 및 접속 영역은 고립 영역에서의 유체 매질의 성분들이 실질적으로 단지 확산에 의해서만, 흐름 영역에서의 유체 매질의 성분들과 교환되도록 구성된다.
피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법의 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 격리 펜 내 생물학적 마이크로-객체를 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군으로 증식시키는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 본 방법은 배양 매질로 흐름 영역을 관류시키는 단계를 더 포함할 수도 있으며, 여기서, 관류시키는 것은 생물학적 마이크로-객체를 격리 펜으로 도입한 후, 그리고 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하기 전에 발생한다. 일부 실시형태들에서, 배양 매질은 제 1 매질와 동일할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 배양 매질은 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 매질 성분, 및/또는 가용성 자극 성분 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 내에서 배양중인 세포들의 생존력은 미세유체 디바이스 내에서 배양되는 세포들을 자극하거나 또는 아니면 지원하는 보조 생체분자들을 제공하는 피더 세포들의 상청액 배양 매질의 부분을 포함시킴으로써 향상될 수도 있다. 피더 세포들 자체는 미세유체 디바이스 내에 존재하지 않을 수도 있지만, 표준 반응 용기들에서 배양될 수도 있다. 미세유체 디바이스로의, 피더 세포들의 존재에 의해 조절된 배양 매질의 부분들의 수확 및 전달이 수행될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 용존 산소의 양은 원하는대로 측정되어 변경될 수도 있으며, 이는 배양 웰플레이트들, 쉐이크 플라스크들 및 기타 등등에서의 이러한 조정과 비교하여, 본원에서 설명되는 미세유체 환경 내에서 순쉬운 프로세스일 수도 있다. 어떤 다른 실시형태들에서, 미세유체 환경 내 배양 매질의 pH 는 모니터링되어 변경될 수도 있으며, 역시, 표준적으로 사용되는 플라스틱제품 (plasticware) 보다 더 손쉬운 프로세스이다.
또한 다른 실시형태들에서, 소진된 성장 매질이 미세유체 환경에 첨가될 수도 있으며, 이는 미세유체 환경 내 어느 클론들이 분비된 피분석물을 여전히 더 용이하게 생성할 수 있는지 또는 웰플레이트들, 쉐이커 플라스크들 및 생물반응기들을 포함할 수도 있는, 다양한 유형들의 반응 용기들의 스케일업 환경을 근사화하는데 사용될 수 있는지를 분석하는 선택 메커니즘으로서 기능할 수 있다. 또한 다른 실시형태들에서, 미세유체 환경 내 세포들을 자극하여 더 빨리 생성하거나 또는 자극 성분의 도입하기 전과는 상이한 피분석물들을 생성할 수도 있는, (CD28 을 포함하지만 이에 한정되지 않는) 항체들, 시토킨들, 성장 인자들, 및 기타 등등과 같은, 가용성 자극 성분들. 다른 실시형태들에서, 세포들이 서로 그리고 펜들에 부착하는 것을 방지하도록 구성된 하나 이상의 화합물들 및/또는 시약들이 배양 매질에 첨가될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 배양 매질에의 이들 첨가들 중 하나 이상은 격리 펜들 내 세포들 중 하나 이상에 대해 선택 압력을 가할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계는 제 1 시간 기간 동안 흐름 영역을 통해서 제 2 유체 매질을 유동시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 제 1 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들에 대한 확산 프로파일의 모델링에 기초할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 1 시간 기간은 약 30 내지 약 60 분일 수도 있다.
본 방법은 제 3 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 제 3 유체 매질은 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 도입하는 단계; 및 비결합된 리포터 분자들의 적어도 일부분을 격리 펜으로부터 확산시키는 단계를 더 포함할 수도 있으며, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 것은 격리 펜으로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들의 양이 격리 펜으로부터 확산되는 RMSA 착체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생한다. 검출하는 단계는 비결합된 리포터 분자들을 검출하는 단계 및 RMSA 착체들의 부분인 리포터 분자들을 검출하는 단계를 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 제 3 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계는 제 2 시간 기간 동안 흐름 영역을 통해서 제 3 유체 매질을 유동시키는 단계를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 2 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들 및 RMSA 착체들에 대한 확산 프로파일들의 모델링에 기초하여 선택될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 관심 영역은 격리 펜 내로부터 흐름 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 격리 펜의 적어도 일부분을 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 관심 영역으로부터 오는 검출가능한 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함할 수도 있으며, 여기서, 검출가능한 신호의 적어도 일부는 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 신호의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 더 이상이 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다. 일부 실시형태들에서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 검출가능한 신호의 측정된 강도로부터 배경 신호의 강도를 감산함으로써 배경-감산된 신호 강도를 결정하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 배경 신호는 리포터 분자들이 검출될 때마다 측정되지 않을 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 배경 신호는 기지의/표준 조건들 (예컨대, 칩 유형, 칩 내 격리 펜의 위치, 검출가능한 라벨의 유형, 제 1 유체 매질의 성분들) 에 기초하여 미리 결정될 수도 있다.
본 방법은 생물학적 마이크로-객체를 격리 펜으로 도입하기 이전의 시간에, 관심 영역 내 배경 신호의 강도를 측정하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 격리 펜 내에서 관측된 세포들의 수에 대해 정규화될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 본 방법은 피분석물의 분비의 레벨을 정량화하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 생성물의 분비의 레벨을 정량화하는 것은 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도와 같은 다수의 측정치들 중 임의의 측정치에 기초할 수도 있으며, 이들 중 어느 쪽이든 그 관측 시야에서의 비네팅 (vignetting) 을 위해 정규화될 수도 있다. 본 방법은 격리 펜에 대한 분비 스코어를 제공하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 분비 스코어는 검출된 및/또는 정규화된 형광 신호를 프로세싱하는 방법들을 기술하는 다음 섹션들에서의 방법들 중 임의의 방법에 따라서 결정될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 분비된 피분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 가질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 분비된 피분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 큰 분자량을 가질 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 분비된 피분석물은 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 큰 분자량을 가질 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 SEQ ID 번호들: 1 내지 10 중 어느 하나의 시퀀스를 가지는 펩티드를 포함할 수도 있다. 어떤 다른 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 형광 라벨일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물은 항체일 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물은 항체 이외의 단백질일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스는 복수의 격리 펜들을 포함할 수도 있으며, 여기서, 배치하는 스텝은 복수의 격리 펜들 중 적어도 일부분 내에 생물학적 마이크로-객체를 배치하는 단계를 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 복수의 격리 펜들의 격리 펜들의 서브-세트의 각각의 격리 펜에 대한 분비의 레벨을 비교하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 본 방법은 복수의 격리 펜들 중 하나 보다 많은 격리 펜들의 스코어들을 비교하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 본 방법은 분비의 레벨을 정량화하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 복수의 격리 펜들 중 하나 이상을 선택하고 선택된 하나 이상의 격리 펜들로부터 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군을 배출하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 결과적인 서브클론 개체군들을 추가로 증식 및 분석함으로써 서브클론들의 서브클로닝 및 비교 분석을 가능하게 한다. 이것은 선택된 클론 개체군을 미세유체 디바이스 내 다른 격리 펜들의 세트로 이동시키고 선택된 개체군의 각각의 개개의 세포에 대해 다시 증식시킴으로써 달성될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 본 방법은 선택된 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군을 미세유체 디바이스로부터 배출하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 격리 펜들로부터 채널로 또는 격리 펜 및/또는 채널로부터 미세유체 디바이스로 배출하는 스텝은 각각의 선택된 격리 펜 상에서 개별적으로 수행될 수도 있다 (예컨대, 선택된 격리 펜들의 세트로부터의 세포들은 일련의 배출 스텝들로, 한번에 하나의 격리 펜씩 배출될 수도 있다). 일부 실시형태들에서, 격리 펜 내에 배치된 세포들은 이전에 분석된 격리 펜으로부터 발생될 수 있어, 서브클론들의 서브클로닝 및 비교 분석을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 특정 항체의 절대 또는 상대 값이 특정의 항체의 높은 체적을 발생시키는 세포들을 선택 및 증식시키는이데 사용될 수도 있다. 이와 유사하게, 단백질들 (예컨대, IgG 도메인을 가진 항체들) 의 패밀리의 절대 또는 상대 값이 항체의 높은 체적을 발생시키는 세포들을 선택 및 증식시키는데 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 분비된 피분석물의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값과 연관된 격리 펜으로부터의 모든 세포들이 칩의 동일한 격리 펜 또는 다른 포함된 영역에서 선택 및 증식될 것이다. 다른 실시형태들에서, 분비된 피분석물의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값과 연관된 동일한 격리 펜으로부터의 세포들 중 하나 이상이 상이한 격리 펜들에서 선택 및 증식될 것이다. 일부 실시형태들에서, 상대 또는 절대 값을 발생시키는 위에서 설명된 스텝들은 증식된 세포들 상에서 (1X, 2X, 3X, 4X, 또는 더 이상의 배수로) 반복적으로 수행될 수도 있다.
다른 실시형태에서, 이 방법의 적용은 반복된 분석들로부터의 피드백으로, 세포들에 대한 특정의 조건들의 효과들의 검사를 가능하게 할 수도 있다. 예를 들어, 분비된 피분석물의 대규모 생산에 밀접하게 관련된 조건들 및 물질들이, 추가적인 검사를 위해 가장 적합한 클론들을 찾아내고 특성화하기 위해, 사용될 수도 있다. 다른 예에서, B-세포 항체 자극을 위한 다양한 자극 프로토콜들이 보다 재현가능한 방법으로 검사될 수도 있으며, 다른 프로토콜보다 하나의 프로토콜의 이점들을 더 비교할 수 있을 만큼 분석될 수도 있다.
다음으로 도 17 을 참조하면, 도 17 은 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 격리들 펜들에 존재하는 분비된 피분석물의 양을 정량화하기 위해 수행되는 기능들을 예시한다.
박스 (1702) 에서, 분비된 피분석물을 발생시키는 생물학적 마이크로-객체들이 미세유체 디바이스에서의 하나 이상의 격리 펜들에서 유지된다. 예를 들어, 생물학적 마이크로-객체들은 격리 펜들 내에서 배양될 수도 있거나, 또는 광학적으로 구동될 수도 있는 유전영동력들 및/또는 중력을 포함한 다양한 수단을 이용하여 격리 펜들로 로드될 수도 있다. 각각의 펜은 단일 생물학적 마이크로-객체 또는 복수의 생물학적 마이크로-객체들을 포함할 수도 있다. 복수의 생물학적 마이크로-객체들은 단일 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군 (예컨대, 세포들의 클론 개체군) 일 수도 있거나, 또는 생물학적 마이크로-객체들의 이종 개체군일 수도 있다.
박스 (1704) 에서, 분비된 피분석물을 결합하는 결합 성분 및 신호 성분을 가지는 리포터 분자가 채널 및 격리 펜들에 제공된다. 예를 들어, 리포터 분자는 채널로 유동될 수도 있으며 채널로 개방되는 격리 펜들로 확산되도록 허용될 수도 있다. 리포터 분자를 채널에 제공하는 다른 수단이 사용될 수 있다.
박스 (1706) 에서, 리포터 분자가, 그의 비결합된 상태에서 정상-상태 농도 평형에 도달할 때까지, 미세유체 디바이스 내에서 (예컨대, 채널 및 격리 펜들 내에서) 확산하도록 허용된다. 리포터 분자의 분자량에 따라서, 정상-상태 농도 평형을 달성하는데 요구되는 시간의 양은 변할 수 있다.
박스 (1708) 에서, 리포터 분자는 격리 펜에 존재하는 분비된 피분석물들을 결합한다. 일부 실시형태들에서, 유동이 채널 내에서 재개되며, 비결합된 리포터 분자가 격리 펜으로부터 확산된다.
박스 (1710) 에서, 비결합된 리포터 분자들 및 RMSA 착체들을 포함하는 격리 펜(들) 및 채널(들) 의 이미지가 발생된다. 리포터 분자의 신호 성분에 따라서, 신호 성분을 가시화하기 위해 미세유체 디바이스를 특정의 광에 노출시키거나 (예컨대, 형광단을 광의 특정의 주파수에 노출시키거나) 또는 추가적인 시약을 도입하는 것이 필요할 수도 있다.
박스 (1712) 에서, 격리 펜(들) 및 채널(들) 의 이미지가 격리 펜(들) 에 존재하는 분비된 피분석물의 양을 계산하기 위해 분석된다.
이제 도 18 을 참조하면, 도 18 은 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 분비된 피분석물의 양을 나타내는 절대 또는 상대 값을 계산하기 위해 수행되는 기능들을 예시한다.
박스 (1802) 에서, 채널(들) 및 격리 펜(들) 을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미지가 시스템 에러를 보정하기 위해 정규화된다. 위에서 설명한 바와 같이, 다수의 상이한 정규화 알고리즘들이 시스템 에러를 보정하기 위해 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 이득-보정 인자가 이미지를 정규화하기 위해 사용된다. 일부 실시형태들에서, 격리 펜에 인접한 채널에 존재하는 형광 신호의 양이 이미지를 정규화하기 위해 사용된다. 일부 실시형태들에서, 자발-형광 이미지가 정규화 동안 미세유체 디바이스의 이미지로부터 감산된다.
박스 (1804) 에서, 펜 내 분비된 피분석물의 소스 (예컨대, 펜 내 세포들) 로부터 펜에 근위인 채널까지의 예상된 확산 궤적의 축을 나타내는 라인이 식별된다. 예상된 확산 궤적의 축을 따라서 정렬되며 격리 펜 내로부터 채널로 연장되는 AOI 가 식별된다. AOI 의 적어도 일부는 신호 강도에 대해 가장 큰 감도를 가지는 영역을 포함하지만, 또한 격리 펜 내 세포 위치에 불감하다. 위에서 설명한 바와 같이, AOI, 및 신호에 대해 가장 큰 감도를 가지거나/세포 위치에 불감한 개별 영역은 격리 펜의 기하학적 구조, 펜 내 분비된 피분석물의 소스의 위치, 분비된 피분석물의 분자량 및 채널 내 유동의 존재 (또는, 부재) 를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 상이한 파라미터들을 계산적으로 모델링함으로써 결정될 수도 있다.
박스 (1806) 에서, 하나 이상의 농도 값들이 세포 위치에 불감하며 신호 분산에 가장 민감한 AOI 의 적어도 일부분을 포함하는 AOI 에 기초하여 발생된다. 이 실시형태에 따르면, 농도 값들은 AOI 내에서 픽셀들을 샘플링하는 것 또는 AOI 를 픽셀들의 그룹들로 세그먼트화하는 것에 기초하여, 계산될 수도 있다.
박스 (1808) 에서, 하나 이상의 농도 값들이 각각의 격리 펜에 존재하는 분비된 피분석물의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값을 계산하기 위해 사용된다. 위에서 설명한 바와 같이, 주어진 격리 펜에 대해 계산된 하나 이상의 농도 값들은 각각의 격리 펜에 존재하는 생물학적 마이크로-객체들 (예컨대, 세포들) 의 개수에 기초하여 정규화될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 하나 이상의 농도 값들이 분비된 피분석물의 소스로부터 채널까지의 확산 프로파일을 나타내는 곡선 또는 다른 합성 값을 발생시키기 위해 사용될 수도 있다. 이들 실시형태들에서, 농도 값들 (또는, 다른 합성 값) 의 곡선에 피팅된 라인의 기울기는 격리 펜들과 연관된 분비 스코어를 평가할 수도 있으며, 다른 격리 펜들에 대한 각각의 격리 펜 내에 존재하는 분비된 피분석물의 양 (즉, 분비된 피분석물의 상대적인 값) 을 평가하기 위해 사용될 수도 있다.
다른 양태에서, 클론주 개발의 방법이 제공되며, 본 방법은, 개개의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 복수의 격리 펜들의 각각으로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 흐름 영역을 가지는 인클로저를 더 포함하며, 그리고 복수의 격리 펜들의 각각은 흐름 영역에 유체 연결되며 제 1 유체 매질을 포함하는, 상기 미세유체 디바이스의 복수의 격리 펜들의 각각으로 도입하는 단계; 각각의 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군으로 하여금, 피분석물을 대응하는 격리 펜에 포함된 제 1 유체 매질로 분비하게 하는 단계; 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 매질은 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 리포터 분자는 분비된 피분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 흐름 영역으로 도입하는 단계; 복수의 리포터 분자들의 부분으로 하여금 복수의 각각의 격리 펜으로 확산하게 하여 그 안에 분비된 피분석물의 적어도 일부분에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 격리 펜들의 각각에서 복수의 리포터 분자:분비된 피분석물 (RMSA) 착체들을 발생시키는 단계; 복수의 각각의 격리 펜에 대해, 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도를 검출하는 단계로서, 관심 영역은 대응하는 격리 펜의 적어도 일부분을 포함하며, 그리고 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 적어도 일부분은 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출되는, 상기 신호의 강도를 검출하는 단계; 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 검출된 신호 강도에 기초하여, 복수의 각각의 격리 펜에 대해, 스코어를 결정하는 단계; 복수의 격리 펜들 중에서 격리 펜들의 세트를 선택하는 단계로서, 상기 세트의 각각의 격리 펜은 그 안에 포함된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 클론 개체군이 상위 피분석물 생산자임을 표시하는 스코어를 가지는, 상기 격리 펜들의 세트를 선택하는 단계; 선택된 격리 펜들의 세트의 각각의 격리 펜 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 미세유체 디바이스로부터 배출시키는 단계; 대응하는 반응 용기들에서 선택된 격리 펜들의 세트의 각각의 격리 펜으로부터의 배출된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 증식시키는 단계; 및 각각의 대응하는 반응 용기에서 분비된 피분석물의 레벨을 결정하고, 이에 의해 각각의 생물학적 마이크로-객체 또는 클론 개체군에 대한 분비의 레벨을 결정하는 단계를 포함한다. 상위 피분석물 생산자는 생산자들의 상위 50% 중 하나일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 상위 피분석물 생산자는 피분석물들을 상위 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 생산성 클론들 또는 더 이상 중의 레이트로 생산한다. 대안적으로, 상위 생산자는 피분석물을 임계치 양보다 많이 생산할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 스코어는 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도일 수 있거나, 또는 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도에 기초하여 계산될 수 있다.
복수의 각각의 격리 펜은 고립 영역 및 고립 영역을 흐름 영역에 유체 연결하는 접속 영역을 가질 수도 있으며, 고립 영역 및 접속 영역은 고립 영역에서의 유체 매질의 성분들이 흐름 영역에서의 유체 매질의 성분들과 실질적으로 단지 확산에 의해서만 교환되도록 구성될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 본 방법은 복수의 격리 펜들 중 일부 또는 모든 격리 펜들 내 개개의 생물학적 마이크로-객체를 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군으로 증식시키는 단계를 더 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 배양 매질로 흐름 영역을 관류시키는 단계를 더 포함하며, 여기서, 관류시키는 것은, 개개의 생물학적 마이크로-객체들을 복수의 격리 펜들로 도입한 후 그리고 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하기 전에 발생한다. 배양 매질은 제 1 매질와 동일할 수도 있다. 관류시키는 것은 연속적으로 또는 간헐적으로 수행될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 배양 매질은 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 매질 성분, 및/또는 가용성 자극 성분 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 내에서 배양중인 세포들의 생존력은 미세유체 디바이스 내에서 배양되는 세포들을 자극하거나 또는 아니면 지원하는 보조 생체분자들을 제공하는 피더 세포들의 상청액 배양 매질의 부분을 포함시킴으로써 향상될 수도 있다. 피더 세포들 자체는 미세유체 디바이스 내에 존재하지 않을 수도 있지만 표준 반응 용기들에서 배양될 수도 있다. 미세유체 디바이스로의, 피더 세포들의 존재에 의해 조절된 배양 매질의 부분들의 수확 및 전달이 수행될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 용존 산소의 양은 원하는대로 측정되어 변경될 수도 있으며, 이는 배양 웰플레이트들, 쉐이크 플라스크들 및 기타 등등에서의 이러한 조정과 비교하여, 본원에서 설명되는 미세유체 환경 내에서 순쉬운 프로세스일 수도 있다. 어떤 다른 실시형태들에서, 미세유체 환경 내 배양 매질의 pH 는 모니터링되어 변경될 수도 있으며, 역시, 표준적으로 사용되는 플라스틱제품 (plasticware) 보다 더 손쉬운 프로세스이다.
또한 다른 실시형태들에서, 소진된 성장 매질이 미세유체 환경에 첨가될 수도 있으며, 이는 미세유체 환경 내 어느 클론들이 분비된 피분석물을 여전히 더 용이하게 생산할 수 있는지 또는 웰플레이트들, 쉐이커 플라스크들 및 생물반응기들을 포함할 수도 있는, 다양한 유형들의 반응 용기들의 스케일업 환경을 근사화하는데 사용될 수 있는지를 분석하는 선택 메커니즘으로서 기능할 수 있다. 또한 다른 실시형태들에서, 미세유체 환경 내 세포들을 자극하여 더 빨리 생성하거나 또는 자극 성분의 도입하기 전과는 상이한 피분석물들을 생성할 수도 있는, (CD28 을 포함하지만 이에 한정되지 않는) 항체들, 시토킨들, 성장 인자들, 및 기타 등등과 같은, 가용성 자극 성분들. 다른 실시형태들에서, 세포들이 서로 그리고 펜들에 부착하는 것을 방지하도록 구성된 하나 이상의 화합물들 및/또는 시약들이 배양 매질에 첨가될 수도 있다.
본 방법의 다양한 실시형태들에서, 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계는 제 1 시간 기간 동안 흐름 영역을 통해서 제 2 유체 매질을 유동시키는 단계를 포함할 수도 있다. 제 1 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들에 대한 확산 프로파일의 모델링에 기초하여 선택될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 1 시간 기간은 약 30 분 내지 약 60 분일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 본 방법은 제 3 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 제 3 유체 매질은 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 도입하는 단계; 및 비결합된 리포터 분자들의 적어도 일부분을 격리 펜으로부터 확산시키는 단계를 더 포함하며, 복수의 각각의 격리 펜의 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도를 검출하는 것은 격리 펜으로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들의 양이 격리 펜으로부터 확산되는 RMSA 착체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생한다. 일부 실시형태들에서, 제 3 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계는 제 2 시간 기간 동안 흐름 영역을 통해서 제 3 유체 매질을 유동시키는 단계를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 2 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들 및 RMSA 착체들에 대한 확산 프로파일들의 모델링에 기초하여 선택될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 2 시간 기간은 약 20 분 내지 약 50 분일 수도 있다.
본 방법의 다양한 실시형태들에서, 관심 영역은 격리 펜 내로부터 흐름 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 격리 펜의 적어도 일부분을 포함할 수도 있다.
본 방법의 다양한 실시형태들에서, 복수의 각각의 격리 펜의 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도를 검출하는 단계는 검출가능한 신호의 측정된 강도로부터 배경 신호의 강도를 감산하여 배경-감산된 신호 강도를 결정하는 단계를 포함할 수도 있다. 배경 신호는 리포터 분자들이 검출될 때마다 측정되지 않을 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 배경 신호는 기지의/표준 조건들 (예컨대, 칩 유형, 칩 내 격리 펜의 위치, 검출가능한 라벨의 유형, 제 1 유체 매질의 성분들) 에 기초하여 미리 결정될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 본 방법은 생물학적 마이크로-객체들을 격리 펜들로 도입하기 전 시간에서, 복수의 각각의 격리 펜의 대응하는 관심 영역 내 배경 신호의 강도를 측정하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 대응하는 격리 펜 내에서 관측된 세포들의 수에 대해 정규화될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 복수의 격리 펜들의 스코어들은 검출된 및/또는 정규화된 형광 신호를 프로세싱하는 방법들을 기술하는 다음 섹션들에서의 방법들 중 임의의 방법에 따라서 결정된다.
다양한 실시형태들에서, 분비된 피분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 가질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 분비된 피분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 큰 분자량을 가질 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 분비된 피분석물은 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 큰 분자량을 가질 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 SEQ ID 번호들: 1 내지 10 중 어느 하나의 시퀀스를 가지는 펩티드를 포함할 수도 있다. 어떤 다른 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 형광 라벨일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물은 항체일 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물은 항체 이외의 단백질일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 반응 용기들은 웰-플레이트 내의 웰들, 쉐이커 플라스크들, 또는 생물-반응기들일 수도 있다. 반응 용기들은 약 20 마이크로리터들, 약 100 마이크로리터들, 약 1 밀리미터, 약 10 밀리미터, 약 100 mL, 약 1 L, 또는 그 이상의 체적을 가질 수도 있다. 생물-반응기는 O2 및 CO2 의 독립적인 제어에 의한 pH 및 용존 산소 (DO) 의 폐 루프 제어, 20 L, 50 L, 50 gal, 200 gal, 또는 이 이상의 체적을 가질 수도 있는 분비된 피분석물의 대량 생산에 사용되는 반응기의 환경을 가깝게 근사화할 수도 있는, 반응기 셋업, 공급들, 염기 첨가 및 샘플링을 위한 자동화된 액체 처리와 같은, 특징들 중 하나 이상을 가질 수도 있다. 생물-반응기는 10 mL 또는 15 mL 와 같은 비교적 소용량을 가질 수도 있다 (예컨대, ambr15TM (TAP Biosystems) 생물 반응기). 생물-반응기는 통합된 생존력 분석 능력들을 가질 수도 있다.
도 19 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 세포들의 클론 개체군에서의 분비된 피분석물의 양을 나타내는 절대 또는 상대 값을 평가하기 위해 수행되는 기능들을 예시한다.
박스 (1902) 에서, 단일 세포가 증식을 위해 선택된다. 위에서 설명한 바와 같이, 세포는 분석의 결과들에 기초하여 선택될 수도 있거나 또는 세포는 표현형 및/또는 모폴로지와 같은 다른 특성들에 기초하여 선택될 수도 있다.
박스 (1904) 에서, 단일 세포가 세포들의 클론 개체군으로 증식된다. 일부 실시형태들에서, 세포들의 클론 개체군의 양태들은 세포들이 증식함에 따라 분석될 수도 있다. 예를 들어, 증식 속도, 세포들의 모폴로지 및 세포 부착력이 세포들의 전체 건강 및/또는 생존력을 평가하기 위해 분석될 수도 있다.
박스 (1906) 에서, 세포들의 클론 개체군에 의해 생성되는 분비된 피분석물의 절대 또는 상대 값이 평가된다. 일부 실시형태들에서, 절대 또는 상대 값은 도 12a 내지 도 12c 및 도 15 와 관련하여 위에서 설명한 바와 같이 평가될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 절대 또는 상대 값은 미국 특허출원 번호 제 14/964,025호에 기술된 방법들과 같은 다른 방법들을 이용하여 평가될 수도 있으며, 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다.
박스 (1908) 에서, 세포들의 클론 개체군으로부터의 세포들 중 하나 이상은 세포들의 클론 개체군에 의해 생성되는 분비된 피분석물의 절대 또는 상대 값에 기초하여 선택될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 하나 이상의 세포들은 위에서 설명한 바와 같이, 세포 증식 동안 관측되는 세포들의 클론 개체군의 양태들에 기초하여 선택될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 선택된 세포들은 분석 또는 추가적인 증식 (예컨대, 분비된 피분석물을 생산하기 위한 세포주로서의 증식) 를 위해 배출될 수도 있다. 위에서 설명한 바와 같이, 일부 실시형태들에서, 분비된 피분석물의 생산을 위해 단일 세포를 증식시켜 클론 개체군을 분석하는 프로세스는 제 2 분비된 피분석물의 절대 또는 상대 양을 평가하기 위해 또는 단일 세포가 박스 (1906) 에서 정량화된 분비된 피분석물을 안정되게 생산하는지 여부를 평가하기 위해, 반복될 수도 있다.
분비된 피분석물 농도: 적정 곡선의 절대 값. 일부 실시형태들에서, 확산의 이론적 모델이 펜들 중 하나에서의 생물학적 마이크로-객체의 분비된 피분석물의 하나 이상의 농도 값들 및/또는 기지의 양에 기초하여 절대 값을 발생시키기 위해 사용될 수도 있다. 실시형태에 따라서, 상이한 확산의 이론적 모델들이 하나 이상의 농도 값들에 기초하여 피분석물의 절대 값을 계산하는데 사용될 수도 있다. 실시형태에 따라서, 이론적 모델은 다양한 현상을 모델링하거나 또는 상이한 가정들을 평가할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 적정 곡선이 생물학적 마이크로-객체의 분비된 피분석물의 절대 값을 발생시키기 위해 사용될 수도 있다. 이들의 경우, 피분석물의 다양한 기지의 양들이 미세유체 디바이스로 도입될 수도 있으며, 피분석물의 기지의 양들을 나타내는 절대 값들을 발생시키는데 사용될 수도 있다. 피분석물의 기지의 양들을 나타내는 절대 값들이 절대 값들과 피분석물의 다양한 기지의 양들 사이의 선형 관계를 부분적으로 나타내는 적정 곡선을 발생시키는데 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 피분석물의 기지의 양들에 대응하는 다수의 절대 값들은, 적정 곡선이 다양한 시스템 파라미터들 (즉, 선형 관계를 가지는 절대 값을 발생시키는 피분석물의 최고 및 최저 양) 이 주어지면, 피분석물의 정확한 정량화의 상한 및 하한을 나타내는 "동적 범위" 를 포함하도록, 발생될 수도 있다.
실시형태에 따라서, 예상된 확산 프로파일을 복제하는 다양한 방법들이 피분석물의 기지의 농도들에 대한 농도 값들을 격리 펜 내 소스에서 (예컨대, 격리 펜 내 세포에 의해) 발생된 피분석물과 동일한 방법으로 발생시키기 위해 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 다양한 기지의 농도들의 관심 피분석물이 리포터 분자와 함께 인큐베이트된다. 대부분의 실시형태들에서, 리포터 분자의 농도는 피분석물의 모든 복제본들을 결합하는데 필요한 리포터 분자의 양을 초과할 것이다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 농도는 피분석물의 모든 복제본들을 결합하는데 필요한 양의 대략 5-200 배일 것이다. 그러나, 이 범위는 피분석물에 대한 리포터 분자의 결합 친화력에 기초하여 변할 수 있다. 예를 들어, 실시형태들에서, 리포터 분자가 피분석물에 대한 강한 결합 친화력을 가지는 경우, 리포터 분자의 농도는 피분석물의 모든 복제본들을 결합하는데 필요한 양의 2-200 배의 범위일 수도 있다. FITC-라벨링된 CPD 4 (테이블 1) 가 IgG 를 결합하는데 사용되는 특정의 실시형태에서, FITC-라벨링된 CPD 4 의 농도는 IgG 의 모든 복제본들을 결합하는데 필요한 양의 5-100 배의 범위일 수도 있다. 본 방법은 CPD 4 의 사용에 한정되지 않으며, 그러나, 확산 분석 자체에 적합한 임의의 리포터 분자를 이용할 수도 있다. 예를 들어, 형광으로 라벨링된 CPD 1, CPD 2, CPD 3, CPD 5, CPD 6 (테이블 1) 이 적정 곡선을 발생시기키 위해 사용될 수도 있으며, 형광단은 Alexa Fluor® 594 또는 HiLyte FluorTM 555 와 같은, 임의의 적합하게 선택된 형광단일 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 예상된 확산 프로파일은 비결합된 및 결합된 리포터 분자:피분석물 착체를 격리 펜들에 진입시키기에 충분한 시간 동안 비결합된 리포터 분자 및 리포터 분자:피분석물 착체를 미세유체 디바이스의 격리 펜들 및 채널들에 제공함으로써 (즉, 비결합된 및 결합된 리포터 분자를 미세유체 디바이스 전체에 걸쳐서 관류시킴으로써) 발생될 수도 있다. RMSA 착체 및 비결합된 리포터 분자가 미세유체 디바이스 전체에 걸쳐서 관류된 후, 채널들에는 격리 펜들의 채널들 및 스윕된 영역들로부터 RMSA 착체 및 비결합된 리포터 분자를 제거하는 (즉, 플러싱하는) 다른 매질의 유동이 제공된다. RMSA 착체들 및 비결합된 리포터 분자들은 그후 격리 펜으로부터 채널들로 확산된다. 그러나, 위에서 설명한 바와 같이, 비결합된 리포터 분자들은 RMSA 착체보다 더 높은 확산의 레이트를 갖는다. 따라서, 비결합된 리포터 분자들은 RMSA 착체들보다 휠씬 더 빠르게 미세유체 디바이스를 통해서 평형에 도달한다 (즉, 채널들 및 격리 펜들에서 동일한 농도를 갖는다). 이러한 차이는 도 12a 내지 도 12c 및 도 15 와 관련하여 위에서 설명되고, 그리고 특정의 데이터 조작과 관련하여 아래에서 설명되는 바와 같은 AOI (관심 영역) 의 서브-영역들에 대한 중간 강도 값들에 기초하여 농도 값들의 정량화를 가능하게 한다.
도 20 은 특정의 실시형태에 따라서 발생된 적정 곡선을 도시한다. 구체적으로 설명하면, 도 20 은 (X-축 상에 micrograms/mL 로 도시된) IgG 의 기지의 양들에 대응하는 (Y-축 상에 "온칩 분석 역가 스코어들" 로서 라벨링된) 일련의 절대 값들을 도시한다. 구체적으로 설명하면, 도 20 에 나타낸 적정 곡선을 발생시키는데 사용되는 IgG 의 기지의 양들은 0.001526, 0.003052, 0.006104, 0.012207, 0.024414, 0.048828, 0.097656, 0.195313, 0.390625, 0.78125, 1.5625, 3.125, 6.25, 12.5 micrograms/ml 이었다.
도 20 에 나타낸 (분석 스코어들로서 라벨링된) IgG 의 기지의 양들을 나타내는 절대 값들을 발생시키기 위해, 기지의 양들의 IgG 는 FITC-라벨링된 CPD 4 를 포함하는 용액에서 인큐베이트시켰다. IgG 의 모든 복제본들의 결합 및 검출을 보장하기 위해, IgG 의 모든 복제본들을 결합하는데 필요한 FITC-라벨링된 CPD 4 의 양의 6배를 용액 내에 포함시켰다. 미세유체 디바이스를 그후 45 분 동안 용액으로 관류시켰으며, 그후 채널들을 세포주 매질들 (ThermoFisher CD CHO 매질들) 로 10 마이크로리터들/초의 속도로 플러싱시켰다. 채널들을 플러싱한 후, FITC-라벨링된 CPD 4 및 IgG 가 격리 펜으로부터 채널로 10 분 동안 확산하도록 하였다. 미세유체 디바이스를 그후 이미징하여, 아래에서 설명되는 바와 같이 미세유체 디바이스에서의 격리 펜들의 각각에 대해 분석 스코어들을 발생시키는데 사용한다. 이 프로세스를 IgG 의 최고 양 (즉, 12.5 micrograms/mL) 으로 처음에 수행하였으며, 매회 더 낮은 양의 IgG 를 이용하여 연속적으로 반복하였다.
미세유체 디바이스를 이미징한 후, 미세유체 디바이스에서의 각각의 격리 펜에 대해 발생된 개개의 절대 값들의 평균을 취함으로써 IgG 의 각각의 기지의 양에 대한 분석 스코어들을 계산하였다. 개개의 절대 값들의 각각은 도 12 내지 도 15 와 관련하여 위에서 설명한 바와 같이 격리 펜에 대해 발생된 농도 값들의 기울기를 취함으로써, 발생되었다. 구체적으로 설명하면, 선택된 AOI 에 기초하여 발생된 농도 값들에 기초하여, 각각의 격리 펜에 대한 기울기를 계산하였다. 농도 값들을 발생시키기 전에, 이미지를 정규화하여, 도 13a 내지 도 13b 와 관련하여 위에서 설명한 바와 같이 이득-보정 인자로 처리하였다. 각각의 격리 펜에 대해 기울기들을 계산한 후, 미세유체 디바이스에서의 격리 펜들의 모두에 대한 모든 기울기들의 평균을 분석 스코어로서 사용하였다.
일단 발생되면, 도 20 에 도시된 것과 같은, 적정 곡선을 사용하여, 분비된 피분석물의 미지의 양들의 절대 값들을 발생시킬 수도 있다. 도 20 에 나타낸 바와 같이, 적정 곡선에서의 분석 스코어들은 절대 값 (즉, 분석 스코어들) 과 피분석물 (즉, IgG) 의 기지의 양들 사이의 관계를 정의하는 기울기 수식을 발생시키기 위해 임의의 라인-피팅 알고리즘과 피팅될 수도 있다. 그후, 실험 조건들 하에서 관측된 분석 스코어들이 주어지면, 실험 조건들 (즉, 미지의 양들의 피분석물을 생성하는 세포들) 하에서 존재하는 피분석물의 양을 나타내는 절대 값을 발생시키기 위해 기울기 수식이 사용될 수도 있다. 도 20 에 나타낸 적정 곡선을 발생시키기 위해, Tableau 소프트웨어를 이용하여, 분석 스코어들의 표준 편차에 기초한 95% 신뢰 구간들을 이용한 로그 피트 모델을 생성하였다.
도 20 에 나타낸 바와 같이, IgG 의 기지의 양들에 대한 분석 스코어들은 대략 1 microgram/ml 에서 시작하는 선형 관계를 나타낸다. 즉, 분석 스코어들은 IgG 의 증가하는 양들에 응답하여 비례하는 증가를 나타낸다. 1 mcirogram/ml 아래의 농도들에서, 어떤 선형 관계도 관측되지 않는다. 따라서, 도 20 에 나타낸 적정 곡선은 대략 1microgram/ml 에서 정확한 정량화의 하한을 가지는 동적 범위를 나타낸다. 도 20 에 나타낸 적정 곡선은, IgG 의 최고 양에 대응하는 분석 스코어가 IgG 의 기지의 양들과 선형 관계를 나타내는 분석 스코어의 범위 이내에 있기 때문에, 상한을 나타내지 않는다.
도 20 에 도시된 곡선에 나타낸 바와 같이, 실험 조건들 (즉, IgG 를 분비하는 격리 펜들 내 세포들) 하에서 일반적으로 관측되는 분석 스코어들은 적정 곡선 상에 회색으로 표시되며 "분석 역가들의 전형적인 범위" 로 라벨링된다. 실험 조건들 하에서 관측되는 분석 스코어들이 IgG 의 기지의 양들과의 선형 관계들을 나타내는 분석 스코어들의 범위 내에 있기 때문에, 도 20 에 대해 발생된 기울기가 실험 조건들 하에서 일반적으로 생성되는 IgG 의 양을 계산하는데 사용될 수 있다.
키트들. 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 피분석물의 분비 레벨들의 평가를 위한 키트들이 제공될 수도 있으며, 상기 키트들은 흐름 영역을 가지는 인클로저; 및 격리 펜을 포함하는 미세유체 디바이스를 포함하며, 격리 펜은 흐름 영역에 유체 연결되며, 흐름 영역 및 격리 펜은 유체 매질; 및 검출가능한 라벨 및 피분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분을 포함하는 리포터 분자를 포함하도록 구성된다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 격리 펜은 고립 영역 및 고립 영역을 흐름 영역에 유체 연결하는 접속 영역을 가질 수도 있으며, 고립 영역 및 접속 영역은 유체 매질의 성분들이 격리 펜의 흐름 영역과 고립 영역 사이에 실질적으로 단지 확산에 의해서만 교환되도록 구성된다. 다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 인클로저는 흐름 영역 및 격리 펜이 배치되는 기부를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 인클로저의 기부는 유전영동 구성을 가지는 기판을 포함할 수도 있다. 유전영동 구성은 광학적으로 구동될 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 흐름 영역은 채널일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스는 본원에서 설명하는 바와 같은 임의의 격리 펜과 유사하게 구성될 수도 있는 복수의 격리 펜들을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 적어도 하나의 내측 표면은 공유결합으로 개질된 표면을 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 키트의 미세유체 디바이스는 본원에서 설명되는 임의의 미세유체 디바이스와 유사하게 구성될 수도 있으며, 임의의 컴포넌트, 치수들, 및/또는 다수의 미세유체 회로 엘리먼트들을 임의의 조합으로 가질 수도 있다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 펩티드 또는 단백질 결합 성분은 인간 또는 쥐 IgG 를 결합하는 펩티드 또는 단백질일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 CPD 1, CPD 2, CPD 3, CPD 4, CPD 7, CPD 8, CPD 9, CPD 10, CPD 11, CPD 12, CPD 13 또는 CPD 14 중 임의의 것일 수도 있다 (테이블 1 참조). 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 CPD 1, CPD 2, CPD 3 또는 CPD 4 일 수도 있다 (테이블 1 참조). 일부 실시형태들에서, 인간 또는 쥐 IgG 를 결합하는 단백질 결합 성분은 CPD 1 또는 CPD 2 일 수도 있다 (테이블 1 참조). 다른 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 압타머는 CPD 5 또는 CPD 6 일 수도 있다 (테이블 1). 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 압타머 결합 성분은 IgG 의 Fc 에 결합한다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 리포터 분자의 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 형광 라벨이다. 형광 라벨은 로다민, 형광물질, 또는 시아닌 형광 염료일 수도 있다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 키트는 또한 유체 매질을 포함할 수도 있다. 유체 매질은 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 선택적 압력을 유지, 증식 또는 제공하도록 구성될 수도 있다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 키트는 또한 미세유체 디바이스의 하나 이상의 표면들을 조절하도록 구성된 시약을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 시약은 미세유체 디바이스의 하나 이상의 표면들을 공유결합으로 개질되도록 구성될 수도 있다.
컴퓨터-구현 시스템. 도 25 는 본 교시들의 실시형태들이 구현될 수도 있는 컴퓨터 시스템 (3100) 을 예시하는 블록도이다. 본 교시들의 다양한 실시형태들에서, 컴퓨터 시스템 (3100) 은 정보를 통신하기 위한 버스 (3102) 또는 다른 통신 메커니즘, 및 정보를 프로세싱하기 위해 버스 (3102) 와 커플링된 프로세서 (3104) 를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 컴퓨터 시스템 (3100) 은 또한 프로세서 (3104) 에 의해 실행될 명령들을 결정하기 위해 버스 (3102) 에 커플링된, 랜덤 액세스 메모리 (RAM) 또는 다른 동적 저장 디바이스일 수 있는, 메모리 (3106) 를 포함할 수 있다. 메모리 (3106) 는 또한 프로세서 (3104) 에 의해 실행될 명령들의 실행 동안 임시 변수들 또는 다른 중간 정보를 저장하는데 사용될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 컴퓨터 시스템 (3100) 은 프로세서 (3104) 에 대한 정적 정보 및 명령들을 저장하기 위해 버스 (3102) 에 커플링된 판독 전용 메모리 (ROM) (3108) 또는 다른 정적 저장 디바이스를 더 포함할 수 있다. 정보 및 명령들을 저장하기 위해 자기 디스크 또는 광 디스크와 같은, 저장 디바이스 (3110) 를 제공하여, 버스 (3102) 에 커플링할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 컴퓨터 시스템 (3100) 은 컴퓨터 사용자에게 정보를 디스플레이하기 위해, 버스 (3102) 를 통해서 음극선관 (CRT) 또는 액정 디스플레이 (LCD) 와 같은 디스플레이 (3112) 에 커플링될 수 있다. 정보 및 지령 선택들을 프로세서 (3104) 로 통신하기 위해, 영숫자 및 다른 키들을 포함한, 입력 디바이스 (3114) 가 버스 (3102) 에 커플링될 수 있다. 사용자 입력 디바이스의 다른 유형은 방향 정보 및 지령 선택들을 프로세서 (3104) 로 통신하고 디스플레이 (3112) 상에서의 커서 이동을 제어하기 위한 마우스, 트랙볼 또는 커서 방향 키들과 같은 커서 제어기 (3116) 이다. 이 입력 디바이스 (3114) 는 일반적으로 디바이스로 하여금 평면에서의 위치들을 지정가능하게 하는 2개의 축들, 즉, 제 1 축 (즉, x) 및 제 2 축 (즉, y) 에서 2개의 자유도들을 갖는다. 그러나, 3 차원 (x, y 및 z) 커서 이동을 허용하는 입력 디바이스들 (3114) 이 또한 본원에서 고려될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 교시들의 어떤 구현예들에 따르면, 프로세서 (3104) 가 메모리 (3106) 에 포함된 하나 이상의 명령들의 하나 이상의 시퀀스들을 실행하는 것에 응답하여 컴퓨터 시스템 (3100) 에 의해 결과들이 제공될 수 있다. 이러한 명령들은 다른 컴퓨터-판독가능 매체 또는 컴퓨터-판독가능 저장 매체, 예컨대 저장 디바이스 (3110) 로부터 메모리 (3106) 로 판독될 수 있다. 메모리 (3106) 에 포함된 명령들의 시퀀스들의 실행은 프로세서 (3104) 로 하여금 본원에서 설명되는 프로세스들을 수행가능하게 할 수 있다. 대안적으로, 하드-와이어드 (hard-wired) 회로부가 본 교시들을 구현하기 위해 소프트웨어 명령들 대신 또는 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본 교시들의 구현예들은 하드웨어 회로부와 소프트웨어의 임의의 특정의 조합에 한정되지 않는다.
용어 "컴퓨터-판독가능 매체" (예컨대, 데이터 스토어, 데이터 스토리지, 등) 또는 "컴퓨터-판독가능 저장 매체" 는, 본원에서 사용될 때, 명령들을, 실행을 위해, 프로세서 (3104) 에 제공하는데 참여하는 임의의 매체들을 지칭한다. 이러한 매체는 비-휘발성 매체들, 휘발성 매체들, 및 송신 매체들을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 다수의 형태들을 취할 수 있다. 비-휘발성 매체들의 예들은 저장 디바이스 (3110) 와 같은, 광학, 고체 상태, 자기 디스크들을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 휘발성 매체들의 예들은 메모리 (3106) 와 같은, 동적 메모리를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 송신 매체들의 예들은 버스 (3102) 를 포함하는 와이어들을 포함한, 동축 케이블들, 구리 와이어, 및 광섬유를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
컴퓨터-판독가능 매체들의 일반적인 형태들은 예를 들어, 플로피 디스크, 가요성 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 또는 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드들, 종이 테이프, 홀들의 패턴들을 가진 임의의 다른 물리적인 매체, RAM, PROM, 및 EPROM, 플래시-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 또는 컴퓨터가 판독할 수 있는 임의의 다른 유형의 매체를 포함한다.
컴퓨터 판독가능 매체에 더해서, 명령들 또는 데이터가 하나 이상의 명령들의 시퀀스들을, 실행을 위해, 컴퓨터 시스템 (3100) 의 프로세서 (3104) 에 제공하기 위해 통신 장치 또는 시스템에 포함된 송신 매체들 상에 신호들로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 통신 장치는 명령들 및 데이터를 나타내는 신호들을 가지는 트랜시버를 포함할 수도 있다. 명령들 및 데이터는 하나 이상의 프로세서들로 하여금, 본원의 본 개시물에서 약술한 기능들을 구현가능하게 하도록 구성된다. 데이터 통신들 송신 접속들의 대표적인 예들은 전화기 모뎀 접속들, 광역 네트워크들 (WAN), 근거리 네트워크들 (LAN), 적외선 데이터 접속들, NFC 접속들 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 설명한 방법론들, 플로우 차트들, 다이어그램들 및 첨부된 개시물이 컴퓨터 시스템 (3100) 을 스탠드얼론 디바이스로서 이용하여 또는 클라우드 컴퓨팅 네트워크와 같은, 공유된 컴퓨터 프로세싱 리소스들의 분산 네트워크 상에서 구현될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
피분석물 정량화기 시스템. 다양한 실시형태들에 따르면, 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템들 및 방법들이 개시된다. 피분석물은 예를 들어, 마이크로-객체로부터의 분비물들을 포함할 수 있으며, 여기서 마이크로-객체는 생물학적 마이크로-객체일 수 있다. 피분석물은 예를 들어, 단백질, 사카라이드, 핵산, 항체, 항원, 단백질, 사카라이드 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함할 수 있다. 피분석물의 양은 아래에서 설명되는 바와 같이 상대 량일 수 있다.
도 26 은 다양한 실시형태들에 따른, 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템의 개략도이다. 본원에서 도시된 바와 같이, 시스템 (3200) 은 데이터를 출력하고 사용자 입력을 연관된 입력 디바이스 (미도시됨) 를 통해서 수신하기 위해, 이미지 획득 유닛 (3202), 이미지 프로세싱 유닛 (3204), 및 디스플레이 (3212) 를 포함할 수 있다.
(상기 도 1 에 도시된 이미징 모듈 (164) 과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 이미지 획득 유닛 (3202) 은 (상기 도 1 및 도 3b 에 도시된 서포트 구조 (104 및 300) 와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 미세유체 디바이스 홀더 (3214) 및 (위에서 언급한 이미징 디바이스 (194) 와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 이미징 엘리먼트 (3216) 를 포함할 수 있다.
미세유체 디바이스 홀더 (3214) 는 미세유체 디바이스를 고정하도록 배향되고 설계될 수 있다. 미세유체 디바이스는 (상기 도 1b-도 1c, 도 2a-도2b, 도 2d, 도 2g-도 2h, 도 3a, 도 4a-도4c, 도 5a-도5c, 도 9b, 도 10b, 도 11a-도 11b 및 도 12a-도 12b 에 도시된 미세유체 디바이스 (200, 230, 250, 280, 290, 320, 400, 500, 900, 1000, 1100 및 1200) 와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 본원에서 설명되는 다양한 예들 중 임의의 예를 포함할 수 있다. 대안적으로, 홀더 (3214) 는 미세유체 디바이스와 통합될 수 있다. 미세유체 디바이스는 흐름 영역 및 흐름 영역에 유체 연결될 수 있는 챔버, 또는 복수의 챔버들을 포함할 수 있으며, 여기서, 챔버들의 각각은 하나 이상의 마이크로-객체들을 유지할 수 있다. 앞에서 언급한 바와 같이, 챔버들은 예를 들어, 격리 펜들일 수 있다. 챔버들은 이들이 사용되는 특정의 애플리케이션에 의해 요구되는 따라 임의의 형상, 사이즈 또는 방위일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 전술한 바와 같이, 흐름 영역은 (상기 도 1a 및 도 2b 에 도시된 유동 통로 (106), 및 상기 도 2c-도 2d, 도 4a-도 4c, 도 5a, 도 9b, 도 10b, 도 12a 에 도시된 바와 같은 매질 (242 및 278) 의 유동과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 단일 유동 통로 또는 복수의 유동 통로들을 제공하는, (상기 도 1a 및 도 2a-도 2c 에 도시된 바와 같은 채널 (122), 및 상기 도 2d-도 2f 에 도시된 바와 같은 유동 채널들 (264) 과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 단일 미세유체 채널, 또는 복수의 미세유체 유동 채널들일 수 있다. 흐름 영역은 단일, 또는 복수의 챔버들과 유체 연통할 수 있다. 대안적으로, 흐름 영역은 예를 들어, 밸브와 같은 가역성 클로져를 통해, 단일 챔버, 또는 복수의 챔버들과 유체 연통할 수도 있다. 흐름 영역은 앞에서 설명된 바와 같이 입구를 통해서 물질의 유동을 수용하도록 구성될 수 있다. 물질의 유동은 예를 들어, 마이크로-객체들, 결합제 또는 시약들의 유동, 또는 그 물질을 포함하는 매질의 유동을 포함할 수 있다. 미세유체 디바이스는 유동 통로를 통한 그리고 챔버들로의 (예를 들어, 리포터 분자와 같은) 결합제의 유동을 수용하도록 더 구성될 수 있다. 결합제는 피분석물에 결합 시, 결합제의 검출가능한 라벨 (예컨대, 형광, UV, 등) 에 의해 방출되는 광과 같은, 전자기 방사선을 방출할 수도 있다. 피분석물은 예를 들어, 마이크로-객체로부터의 분비물들을 포함할 수 있으며, 여기서, 마이크로-객체는 생물학적 마이크로-객체일 수 있다. 피분석물은 예를 들어, 단백질, 사카라이드, 핵산, 항체, 항원, 단백질, 사카라이드 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함할 수 있다.
이미징 엘리먼트 (216) 는 미세유체 디바이스의 복수의 챔버들 및 흐름 영역의 하나 이상의 분석 이미지들 (3222) (도 27 참조) 을 캡쳐하도록 구성될 수 있다. 이미징 엘리먼트 (3216) 는 아래에서 자세히 설명되는 바와 같이 하나 이상의 분석 이미지들 (3222) 과 함께 분석되고 구현될, 하나 이상의 대응하는 배경 이미지들 (3218) (도 27 참조) 및/또는 하나 이상의 대응하는 신호 참조 이미지들 (3220) (도 3 참조) 을 캡쳐하도록 더 구성될 수 있다.
배경 이미지 (3218) 는 (예를 들어, 마이크로-객체들, 결합제, 또는 다른 시약들과 같은) 임의의 이물질이 미세유체 디바이스로 도입되기 전에 이미징 엘리먼트 (3216) 에 의해 취해질 수 있다. 그렇게 해서, 배경 이미지 (3218) 는 아래에서 추가로 설명되는, 디바이스에서, 특히 관심 영역에서, 임의의 배경 잡음을 캡쳐한다. 배경 잡음은 예를 들어, 아티팩트들, 또는 기구 셋업 및 이미징 파라미터들-예를 들어, 여기 소스로부터의 광, 카메라 잡음, 및 주변 광에 기인할 수 있다. 또한, 배경 잡음은 예를 들어, 샘플들, 용기들, 이미징 매질들의 자발-형광, 또는 특정의 타겟들에 결합되지 않은 형광들로 인한 형광에 의해 주어지는 배경 형광에 기인할 수 있다. 어떤 이미지 영역이 배경 이미지에 포함되는지는 그 이미지가 시스템 상에서 어떻게 구현되는지에 의존한다. 예를 들어, 아래에서 자세하게 설명되는 바와 같이, 사용되는 교정 방법들에 따라서, 상이한 배경 이미지 영역이 요망될 수도 있다.
신호 참조 이미지 (3220) 는 결합제 농도가 관심 영역 ("AOI") 에서 평형을 이루는 레벨까지 결합제가 챔버들로 도입된 후, 이미징 엘리먼트 (3216) 에 의해 취해질 수 있다. 그렇게 함으로써, 신호 참조 이미지 (3220) 는 디바이스에서 이미지 획득 왜곡들을 캡쳐한다. 이러한 왜곡들은 예를 들어, 미세유체 또는 이미징 엘리먼트 설계에 기인할 수 있다. 이미지 왜곡 유형들은 예를 들어, 이미지 에지 효과들, 원근 왜곡, 배럴 왜곡, 핀쿠션 왜곡, 머스타치 (mustache) 왜곡, 및 색 수차를 포함할 수 있다. 신호 참조 이미지 영역은 AOI 의 이미지, 챔버에 인접한 흐름 영역 및 연관된 AOI, 또는 양자를 포함할 수 있다. 어떤 이미지 영역이 신호 참조 이미지에 포함되는지는 그 이미지가 시스템에 의해 어떻게 구현되는지에 의존한다. 예를 들어, 아래에서 좀더 상세히 제공되는 바와 같이, 시스템에 의해 구현되는 교정 방법들에 따라서, 상이한 신호 참조 이미지 영역이 이용될 수도 있다.
도 26 의 시스템 (3200) 의 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 은 이미지 획득 유닛 (3202) 에 통신가능하게 접속될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 은 관심 영역 결정 엔진 (3206) 및 스코어링 엔진 (3210) 을 포함할 수 있다. 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 의 부분으로서 도시되는 (그리고, 본원에서 설명되는) 각각의 컴포넌트 (예컨대, 엔진, 모듈 등) 가 하드웨어, 펌웨어, 소프트웨어, 또는 이들의 임의의 조합으로서 구현될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
다양한 실시형태들에서, 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 은 이미지 획득 유닛 (3202) 과의 통합된 기구 시스템 어셈블리로서 구현될 수 있다. 즉, 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 및 이미지 획득 유닛 (3202) 은 동일한 하우징 어셈블리 내에 하우징될 수 있으며 종래의 디바이스/컴포넌트 접속 수단 (예컨대, 직렬 버스, 광학적 케이블링, 전기적 케이블링 등) 을 통해서 통신할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 은 광학, 직렬 포트, 네트워크 또는 모뎀 접속을 통해서 이미지 획득 유닛 (3202) 에 통신가능하게 접속된 (상기 도 25 에 나타낸 바와 같은) 스탠드얼론 컴퓨팅 디바이스로서 구현될 수 있다. 예를 들어, 이미지 프로세싱 유닛은 분석의 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 으로의 이미지 획득 유닛 (3202) 에 의해 획득된 이미징 데이터의 송신을 가능하게 하는 LAN 또는 WAN 접속을 통해서 접속될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 의 기능들은 WAN (또는, 등가물) 접속을 통해서 이미지 획득 유닛 (3202) 에 통신가능하게 접속된 (클라우드 컴퓨팅 네트워크와 같은) 공유된 컴퓨터 프로세싱 리소스들의 분산 네트워크 상에서 구현될 수 있다. 예를 들어, 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 의 기능들은 AMAZON WEB SERVICES™ 과 같은 클라우드 프로세싱 서비스 상의 하나 이상의 컴퓨팅 노드들에서 구현되도록 분할될 수 있다.
관심 영역 결정 엔진 (3206) 은 캡쳐된 분석 이미지를 이미징 엘리먼트 (3216) 로부터 수신하고 분석 이미지에 묘사된 각각의 챔버에 대해 AOI 를 정의하도록 설계 및 구성될 수 있다. 관심 영역 결정 엔진 (3206) 은 AOI 내에, 피분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감한 챔버 내 이미지 영역을 포함시킴으로써, 적합한 AOI 를 정의하도록 프로그래밍될 수 있다. 예를 들어, 이것은 광 방출들 (예컨대, 형광, UV, 등) 과 같은, 전자기 방사선에서의 가장 작은 변동들이 이미징 엘리먼트 (3216) 에 의해 측정될 수 있는 챔버 내 영역일 것이다. 또한, 이미지 영역은 피분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감한 이미지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이것은 광 방출들 (예컨대, 형광, UV, 등) 과 같은, 전자기 방사선의 측정들의 감도가 챔버 내 마이크로-객체들의 존재에 의해 가장 적게 영향을 받는 챔버 내 영역일 것이다. AOI 는 개별 챔버와 개별 챔버와 유체 연통하는 흐름 영역 사이에서, 확산 축 (3302) (도 28 참조) 을 따라서 연장되도록, 심지어 더 정의될 수 있다.
도 28 에 도시된 예시적인 실시형태에서, 확산 축 (3302) 은 미세유체 디바이스 및 그의 대응하는 챔버들에 관한 공간 정보를 이용하여 결정될 수 있다. 그 공간 정보는 시스템 (3200) 에 포함된 CAD 모델, 연관된 소프트웨어, 또는 별개의 소프트웨어 패키지로부터 도출되어, 정의된 비정렬된 AOI (3224) 를 생성할 수 있다. 이미징 엘리먼트 및 미세유체 디바이스에 대한 교정 알고리즘들은 그후 이미지 데이터를 이 CAD 모델에 맵핑하여 적합한 확산 축 (3302) 을 획득할 수 있다. 이 맵핑에 기초하여 공간 보정 변환 (3226) 을 적용하면, 관심 영역 결정 엔진 (3206) 은 정렬된 AOI들 (3228) 의 세트를 생성할 수 있다. AOI 는 관심 영역 결정 엔진 (3206) 으로부터 자동적으로 결정될 수 있거나 또는 디스플레이 (3212) 에의 사용자 입력을 통해서 수동으로 결정될 수 있다.
도 26 의 시스템 (3200) 의 스코어링 엔진 (3210) 은 각각의 챔버의 관심 영역 내 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하여 각각의 챔버에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 설계 및 구성될 수 있다. 더욱이, 스코어가 피분석물의 상대 량, 또는 농도를 표시하기 위해 스코어링 엔진 (3210) 에 의해 다른 스코어들과 비교될 수 있는 무차원 값일 수 있기 때문에, 결정된 스코어는 사용자를 위한 농도의 단위들로 변환될 수 있다.
스코어를 결정하기 위해, 스코어링 엔진 (3210) 은 다양한 모델들을 사용할 수 있다. 일부 모델들은, 아래에서 설명되는 바와 같이, 예를 들어, 각각의 챔버, 흐름 영역, 또는 양자에서 피분석물에 결합하는 (예를 들어, 리포터 분자와 같은) 결합제의 양을 정량화하는 형광 데이터를 이용하는 모델들일 수 있다. 피분석물은 예를 들어, 챔버 내 마이크로-객체로부터의 분비물들을 포함할 수 있으며, 여기서, 마이크로-객체는 생물학적 마이크로-객체일 수 있다. 스코어링 엔진 (3210) 은 특히, AOI 에 걸쳐, (예를 들어, 형광 값들과 같은) 결합된 리포터 분자 데이터를 이용하여, 그 챔버 내 피분석물의 양을 표시하는, 개별 챔버에 대한 스코어를 결정할 수 있다. 스코어링 모델들의 비한정적인 예들은 선형 회귀 분석을 각각의 챔버의 AOI 의 이미지 영역의 부분에 걸쳐서 광 방출 데이터 (예컨대, 형광 값들 또는 어떤 다른 유형의 검출가능한 신호) 에 적용하는 것, S자형 모델을 AOI 에 적용하는 것, 관심 피분석물을 방출하는 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 불변량인 AOI 의 평균 강도를 이용하는 것, 또는 각각의 챔버의 AOI 의 이미지 영역의 부분에 걸쳐서 광 방출 데이터 (예컨대, 형광 값들 또는 어떤 다른 유형의 검출가능한 신호) 를 통합하는 것을 포함한다.
S자형 모델링은, 예를 들어, S자형, 또는 기호논리학, 곡선들, 수식들 및 세부 사항들에 의해 AOI 에서 확산 기울기를 근사화한다. 예를 들어, 생장률, 점근선들 사이의 차이, 및 변곡점 위치와 같은, 파라미터들의 조합을 이용한 정량 모델은 필요한 정확도 및/또는 정밀도를 산출할 수도 있다. 모델의 파라미터들은 예를 들어, 사용된 S자형 곡선의 정확한 유형에 따라서 비선형 회귀 또는 곡선 회귀에 의해 추정될 수 있다. 일반적인 모델 파라미터 추정 기법들은 예를 들어, Levenberg-Marquardt, 심플렉스, 및 시뮬레이트된 어닐링을 포함한다. 휴리스틱 기법들이 비선형 회귀와 같은 반복 피팅 기법들 동안 수렴을 보장하는 것을 추가로 돕기 위해 파라미터들을 초기화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상부 및 하부 점근선들이 AOI 의 극치에서의 서브-영역들의 평균들에 의해 거칠게 추정될 수 있다.
대안적으로, 도 27 의 실시형태에 도시된 바와 같이, AOI 에 대해 상기 스코어링 모델들을 적용하기 전에, 스코어링 엔진 (3210) 은 정렬된 AOI (3228) 를 별개의 세그먼트들 (3230) 로 확산 축 (3302) 을 따라서 파티션할 수 있다 (도 28 참조). 도 4 는 흐름 영역 (3308), 챔버 (3306), 확산 축 (3302), 복수의 세그먼트들 (3304) 및 마이크로-객체 (3310) 를 포함한, 미세유체 디바이스의 부분의 일 예를 도시한다. 세그먼트들 (3304) 의 개수는 필수 스코어링 모델을 수행하기 위해 필요에 따라 변할 수 있다. 세그먼트들 (3304) 의 개수는 예를 들어, 20 개일 수 있다. 세그먼트들 (3304) 에 대해, 스코어링 엔진 (3210) 은 중간 값 (3232) 을 계산할 수도 있으며, 여기서, 값은 예를 들어, 각각의 챔버 (3306), 흐름 영역 (3308), 또는 양자 내 피분석물에 결합하는 (예를 들어, 리포터 분자와 같은) 결합제의 양을 표시하는, 형광 값들과 같은, 전자기 방사선 값들일 수 있다. 피분석물은 예를 들어, 마이크로-객체 (3310) 로부터의 분비물들을 포함할 수도 있으며, 여기서, 마이크로-객체는 생물학적 마이크로-객체일 수 있다. 스코어링 엔진 (3210) 은 그후 하위섹션 정량화 프로세스 (3234) 를 통해서 파라미터들의 세트에 기초하여 세그먼트들 (3304) 의 서브세트를 결정할 수 있다.
스코어링 엔진 (3210) 은 하위섹션 정량화 프로세스 (3234) 를 통해서, 스코어링 엔진 (3210) 에 (예를 들어, 무선으로, 원격 소프트웨어 프로그램으로, 사용자 입력으로) 원격으로 인코딩되거나 또는 제공되는 명령들의 세트를 이용하여, 세그먼트들 (3304) 의 서브세트를 결정할 수 있다. 명령들의 세트는 예를 들어, 마이크로-객체 유형들, 챔버 내 마이크로-객체 카운트들, 세그먼트 카운트들, 하위섹션 카운트들 및 하위섹션 위치들의 상이한 조합들을 이용하여 수행되는, 예를 들어, 이전의 수치 시뮬레이션들에 기초할 수 있다. 이 데이터를 이용하여, 관심 마이크로-객체를 다양한 수치 시뮬레이션들과 연관시켜 관심 생물학적 마이크로-객체의 분석에 적합한 세그먼트들의 서브세트를 결정하는 명령들이 인코딩될 수 있다.
세그먼트들 (3304) 의 서브세트는 상기 챔버 (3306) 에 대한 스코어를 결정하는데 필요한 전체 세그먼트 카운트 내 임의의 세그먼트들의 그룹을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제공된 파라미터들 또는 명령들의 세트에 기초하여, 스코어링 엔진 (3210) 은 빈들 9-13 을 특정의 챔버에 대한 스코어를 결정할 때에 사용되는 빈들의 서브세트로서 결정할 수 있다. 이전에 설명된 것들과 같은, 스코어링 모델들을 적용하면, 스코어링 엔진 (3210) 은 그후 상기 챔버에 대한, 분비 스코어 (3236) 와 같은, 스코어를 결정할 수 있다.
대안적으로, 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 은 도 26 의 실시형태 및 도 27 의 실시형태에서 도시된 바와 같은 교정 엔진 (3208) 을 더 포함할 수 있다. 교정 엔진 (3208) 은 미세유체 디바이스로부터의 배경 잡음에 의해 그리고 분석 이미지 캡쳐 동안 초래되는 이미지 왜곡들에 대해 각각의 챔버의 AOI 정규화 프로세스 (3238) 를 적용하도록 설계 및 구성될 수 있다. 그후, 결과적인 교정된 이미지 AOI 가 스코어링 엔진 (3210) 에 의해 스코어링될 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 배경 잡음은 예를 들어, 아티팩트들, 또는 기구 셋업 및 이미징 파라미터들-예를 들어, 여기 소스로부터의 광, 카메라 잡음, 및 주변 광에 기인할 수 있다. 배경 잡음은 또한, 예를 들어, 샘플들, 용기들, 이미징 매질들의 자발-형광, 또는 특정의 타겟들에 결합되지 않은 형광들로 인한 형광에 의해 주어지는 배경 형광에 기인할 수 있다. 분석 이미지 캡쳐 동안의 이미지 왜곡들은 예를 들어, 미세유체 디바이스 설계 또는 이미징 디바이스 설계에 기인할 수 있다. 이미지 왜곡 유형들은 예를 들어, 이미지 에지 효과들, 프로젝터 불-균일성, 카메라 비네트, 원근 왜곡, 배럴 왜곡, 핀쿠션 왜곡, 머스타치 왜곡, 및 색 수차를 포함할 수 있다.
교정 엔진 (3208) 은 분석 이미지 캡쳐 동안 도입되거나 및/또는 도입 전 미세유체 디바이스로부터의 이미지 왜곡들에 대해, 각각의 챔버의 AOI, 또는 적어도 각각의 챔버의 AOI 의 이미지 영역을 정규화하도록 설계 및 구성될 수 있다. 교정 엔진 (3208) 은 분석 이미지 및/또는 신호 참조 이미지로부터 배경 이미지를 감산하고 신호 참조 이미지에서 캡쳐된 이미지 획득 왜곡들을 고려함으로써 이를 달성할 수 있다. 결과적인 정규화된 이미지 AOI 가 그후 스코어링 엔진 (3210) 에 의해 스코어링될 수 있다.
피쳐 추출 및 비정상 검출을 위해 이미지를 정규화하는 다양한 모델들이 존재한다. 일 실시형태에서, 통계적 추론을 통한 데이터 배제가 AOI 를 정규화하기 전에 비정상들을 제거할 수 있다. 매우 낮거나 또는 매우 높은 강도들을 가질 수도 있는, 이물질과 같은 비정상들이 모든 AOI 데이터의 분포 내 주어진 데이터 지점의 z-스코어를 계산하는 것과 같은, 기본적인 통계적 변환들로 검출될 수 있다.
일 실시형태에서, 통계적 추론을 통한 데이터 배제는 AOI 를 정규화하기 전에 비정상들을 제거할 수 있다. 이상적인 확산 프로파일이 일반적으로 확산 축에 직교한 임의의 라인을 따라서 상수 값을 갖기 때문에, 이물질과 같은, 비정상들이 AOI 에 존재하는지 여부를 통계적으로 추론하고 모델링으로부터 이들 데이터 지점들을 제외하는 것이 가능하다. AOI 에서의 각각의 데이터 지점은 무작위 변화로 인한 그의 발생의 확률을 표시하는 z-스코어로 변환될 수 있다. 예를 들어, AOI 가 주어지고, 여기서, I 가 주어진 지점에서의 강도 값이고, μ 가 평균 강도 값이고, σ 가 표준 편차이고, y 가 확산의 방향을 표시하고 x 가 그것에 직교하면, 주어진 지점에서의 z-스코어는 하기 수식 (1) 을 통해서 계산될 수 있다:
Figure 112018113390202-pct00008
상기 수식에 의해 생성되는 z-스코어들을, 주어진 임계치보다 큰 z-스코어 크기들을 가진 데이터를 제외시키기 위해, 사용할 수 있다. 이 프로세스는 상이한 사이즈들 및 강도들의 비정상들을 반복적으로 제거하기 위해 반복될 수 있다.
일 실시형태에서, 구분적 모델링은 AOI 를 정규화하기 전에 비정상들을 제거할 수 있다. 확산 프로파일이 확산 축에 직교한 임의의 방향을 따라서 이상적으로 일정하다는 원리에 기초하여, AOI 의 N 개의 칼럼들에 걸쳐서 독립적으로 분석 모델을 피팅할 수 있다. 이상적인 시스템에서, 이들 모델들은 동일한 파라미터 추정치들을 모두 산출할 것이다. 실제는, 이들은 정상적으로 분포될 것이다. 그러나, 오정렬 또는 이물질의 존재와 같은, 비정상들의 경우, 파라미터 추정들의 분포에서 추가적인 양식들 (modalities) 이 존재할 것이다. AOI-칼럼의 데이터에 대한 모델들의 상관 관계와 같은 정보를 모든 파라미터 추정들의 분포 내에서의 주어진 파라미터의 크기의 출현율과 결합함으로써, 어느 모델들이 비정상 결과를 반영하는지를 결정할 수도 있으며, 따라서, 추가적인 분석으로부터 배제되어야 한다. 이것은 관심 데이터를 적합하게 정규화하기 위해 위에서 설명된 z-스코어 기법과 함께 사용될 수도 있다.
일 실시형태에서, 지점 x,y 에서의 분석 이미지에 대한 정규화된 값들 (ICorrected) 은 하기 수식 (2) 에 따라, 배경 이미지 "a" 및 신호 참조 이미지 "c" 데이터를 이용하여 발생 및 캡쳐될 수 있다:
Figure 112018113390202-pct00009
일 실시형태에서, G 스코어는 AOI 에서의 모든 데이터 지점들을 정규화하기 위해 발생된다. 배경 이미지 "a" 및 신호 참조 이미지 "c" 를 캡쳐한 후, 보정 인자 "G" 는 하기 수식 (3) 에 따라서 계산될 수 있다:
Figure 112018113390202-pct00010
보정 인자 G 는 그후, 다음과 같이 적용되어, AOI 의 스코어링을 위한 수식 (4) 에 따라서 분석 이미지에 대한 정규화된 값들 (ICorrected) 이 결정될 수 있다:
Figure 112018113390202-pct00011
분석 이미지에 대한 정규화된 값들을 이용하여, 스코어링 엔진 (3210) 은 각각의 챔버의 정규화된 관심 영역의 부분을 분석하여 각각의 챔버에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 더 설계 및 구성될 수 있다. 상술한 바와 같이, 스코어링 모델들의 예들은 선형 회귀 분석을 각각의 챔버의 정규화된 관심 영역의 부분에 적용하는 것, 또는 각각의 챔버의 정규화된 관심 영역의 부분에 걸쳐서 형광 값들 (또는, 어떤 다른 유형의 검출가능한 신호) 을 통합하는 것을 포함한다.
대안적으로, AOI 의 신호 참조 이미지 및 배경 이미지를 이용하기 보다는, 교정 엔진 (3208) 은 챔버(들) 에 인접한 흐름 영역 및 연관된 AOI(들) 뿐만 아니라, 생물학적 마이크로-객체들을 포함하지 않는 미세유체 디바이스의 다른 영역들의 신호 참조 이미지 및/또는 배경 이미지를 이용한 교정을 위해 상기 실시형태들을 적용할 수도 있다. 이들 "비-AOI" 이미지들은 위에서 자세하게 설명된 바와 같이 분석 이미지 데이터를 정규화하기 위해 분석 이미지 데이터와 함께 사용될 수 있다.
다양한 실시형태들에 따르면, 이미지 획득 유닛 (3202) 및 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 은 단일 물리 유닛으로 통합될 수 있다. 대안적으로, 이미지 획득 유닛 (3202) 및 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 은, 유닛들이 여전히 정보를 교환하도록 통신가능하게 접속되도록 독립적인 유닛들로 제공되면, 분리가능하게 배향될 수 있다.
위에서 설명된 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 의 각각의 컴포넌트는 하드웨어일 수도 있거나 또는 부분적으로 또는 전체적으로 소프트웨어 모듈일 수도 있다.
도 29 는 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 예측하여 결정하는 방법을 나타내는 예시적인 플로우차트이다. 본원에서 도시된 바와 같이, 스텝 (3410) 은 도 26 의 시스템 (3200) 의 이미지 획득 유닛 (3202) 의 관심 영역 엔진 (3206) 에 의해 이용될 수 있는 예시적인 작업흐름을 상술한다. 단계 (3410) 에서, 관심 영역 엔진 (3206) 은 흐름 영역 및 흐름 영역에 유체 흐름 가능하게 연결된 복수의 챔버들을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미징 데이터를 수신하며, 여기서, 이미징 데이터는 배경 잡음 이미지, 신호 참조 이미지 및 피분석물 분석 이미지를 포함한다. 배경 이미지는 (예를 들어, 마이크로-객체들, 결합제, 또는 다른 시약들과 같은) 임의의 이물질이 미세유체 디바이스로 도입되기 전에 이미징 엘리먼트 (3216) 에 의해 취해질 수 있다. 그렇게 해서, 배경 이미지는 시스템 (3200) 및 디바이스 상의 영역들의 이미지 캡쳐들과 연관된 임의의 배경 잡음을 캡쳐한다. 배경 잡음의 예들은 앞에 설명되어 있다. 신호 참조 이미지는 결합제 농도가 디바이스에서 평형을 이루는 레벨까지 결합제가 챔버들로 도입된 후 이미징 엘리먼트 (3216) 에 의해 취해질 수 있다. 그렇게 함으로써, 신호 참조 이미지는 시스템 (3200) 과 연관되고 디바이스 상의 영역들의 이미지 캡쳐들과 연관된 이미지 획득 왜곡들을 캡쳐한다.
수신된 이미징 데이터는 예를 들어, 하나 이상의 챔버들, 흐름 영역, 또는 양자에서 피분석물에 결합하는 (예를 들어, 리포터 분자와 같은) 결합제로부터 방출된 형광으로부터 결정된 형광 방출 데이터를 포함할 수 있다. 피분석물은 예를 들어, 마이크로-객체들로부터의 분비물들을 포함할 수 있으며, 여기서, 마이크로-객체들은 생물학적 마이크로-객체들일 수 있다. 생물학적 마이크로-객체들로부터의 분비물들은 예를 들어, 단백질, 사카라이드, 핵산, 3Kd 미만의 분자량을 가지는 유기 분자, 또는 바이러스를 포함할 수 있다. 앞에서 언급한 바와 같이, 챔버들은 예를 들어, 격리 펜들일 수 있다.
본원에서 도시된 바와 같이, 스텝들 (3420 및 3430) 은 도 26 의 시스템 (3200) 의 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 의 스코어링 엔진 (3210) 에 의해 이용될 수 있는 예시적인 작업흐름을 상술한다. 단계 (3420) 에서, 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 은 각각의 챔버에 대한 관심 영역 ("AOI") 을 정의할 수 있다. AOI 는 피분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감한 챔버 내 이미지 영역을 포함할 수 있다. AOI 는 피분석물 변동들이 측정될 때 챔버 내 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감한 이미지 영역을 더 포함할 수 있으며, 심지어, 이미지 영역은 챔버와 흐름 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장될 수 있다.
단계 (3430) 에서, 스코어링 엔진 (3210) 은 각각의 챔버에 대한 AOI 의 부분을 분석함으로써 각각의 챔버에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정할 수 있다. 챔버 당 스코어를 결정하기 위해, 스코어링 엔진 (3210) 은 위에서 설명한 바와 같은 다양한 모델들을 이용할 수 있다. 일부 모델들은 예를 들어, 피분석물에 결합하는 (예를 들어, 리포터 분자와 같은) 결합제의 양을 정량화하는 형광 데이터를 이용하는 모델들일 수 있다. 피분석물은 예를 들어, 챔버 내 마이크로-객체로부터의 분비물들을 포함할 수 있으며, 여기서, 마이크로-객체는 생물학적 마이크로-객체일 수 있다. 스코어링 엔진 (3210) 은 특히, AOI 에 걸쳐, 결합된 리포터 분자 데이터 (또는, 형광 값들) 를 사용하여, 그 챔버 내 피분석물의 양을 표시하는, 개별 챔버에 대한 스코어를 결정할 수 있다. 스코어링 모델들의 비한정적인 예들은 선형 회귀 분석을 각각의 챔버의 정규화된 관심 영역의 부분에 적용하는 것, 또는 각각의 챔버의 정규화된 관심 영역의 부분에 걸쳐 형광 값들 (또는, 어떤 다른 유형의 검출가능한 신호) 을 통합하는 것을 포함한다.
도 30 은 피분석물 분석 이미지에서 챔버들의 각각에 대한 정규화된 AOI 를 획득하기 위해 이미징 데이터에 적용될 수 있는 교정 방법을 예시한다. 본원에서 도시된 바와 같이, 스텝들 (3510 내지 3530) 은 도 26 의 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 의 교정 엔진 (3208) 에 의해 이용될 수 있는 교정 방법에 대한 예시적인 작업흐름을 상술한다.
단계 (3510) 에서, 교정 엔진 (3208) 은 배경 이미지, 신호 참조 이미지 및 피분석물 분석 이미지의 이미징 데이터를 포함할 수 있는 이미지 획득 유닛 (3202) 로부터 이미징 데이터를 수신할 수 있다. 전술한 바와 같이, 이미징 데이터는 미세유체 디바이스 상의 챔버 당 관심 영역으로부터의 형광 값들의 형태일 수 있다. 이미징된 형광은 (배경 이미지에 대해) 배경 잡음으로부터, (신호 참조 이미지에 대해) 관심 영역을 채우는 결합제로부터, 또는 예를 들어, 챔버 내에 존재하는 생물학적 마이크로-객체로부터의 분비물들을 포함할 수도 있는 피분석물에 결합하는 (예를 들어, 리포터 분자와 같은) 결합제에 의한 방출들로부터, 유래하는 것일 수 있다.
단계 (3520) 에서, 교정 엔진 (3208) 은 신호 참조 이미지 및 피분석물 분석 이미지 값들로부터 배경 이미지 값들을 감산할 수 있다. 그렇게 함으로써, 시스템에 이미 존재하는 임의의 배경 잡음이 잡음에 의해 더 이상 영향을 받지 않는 양자의 이미지들에 대해 배경 보정된 값들을 획득하기 위해 신호 참조 이미지 및 피분석물 분석 이미지 값들로부터 제거된다.
단계 (3530) 에서, 교정 엔진 (3208) 은 신호 참조 이미지를 통해서 식별될, 이전에 설명된 이미지 획득 왜곡들을 고려하기 위해, 신호 참조 이미지의 배경 보정된 값들과 피분석물 분석 이미지 값들을 비교함으로써, 피분석물 분석 이미지 값들을 추가로 보정할 수 있다. 이 비교는 특히, AOI 내에서, 정규화된 피분석물 분석 이미지 값들을 발생시킬 것이다. 정규화된 값들을 결정하는 연관된 수식들 및 계산들의 예들은 위에 제공되어 있다.
정규화된 데이터를 이용하여, 스코어링 엔진 (3210) 은 각각의 챔버에 대한 현재 정규화된 AOI 의 부분을 분석함으로써 각각의 챔버에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정할 수 있다.
본원에서 설명하는 방법론들은 애플리케이션에 따라서 다양한 수단에 의해 구현될 수도 있다. 예를 들어, 이들 방법론들은 하드웨어, 펌웨어, 소프트웨어, 또는 이들의 임의의 조합으로 구현될 수도 있다. 하드웨어 구현을 위해, 프로세싱 유닛은 하나 이상의 주문형 집적회로들 (ASICs), 디지털 신호 프로세서들 (DSPs), 디지털 신호 프로세싱 디바이스들 (DSPDs), 프로그래밍가능 로직 디바이스들 (PLDs), 필드 프로그래밍가능 게이트 어레이들 (FPGAs), 프로세서들, 제어기들, 마이크로-제어기들, 마이크로프로세서들, 전자 디바이스들, 본원에서 설명되는 기능들을 수행하도록 설계된 다른 전자 유닛들, 또는 이들의 조합 내에서 구현될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 본 교시들의 방법들은 펌웨어 및/또는 C, C++, 등과 같은 종래의 프로그래밍 언어들로 기록된 소프트웨어 프로그램 및 애플리케이션들로서 구현될 수도 있다. 펌웨어 및/또는 소프트웨어로서 구현되는 경우, 본원에서 설명하는 실시형태들은 컴퓨터로 하여금 위에서 설명된 방법들을 수행하게 하는 프로그램이 저장된 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체 상에 구현될 수 있다. 본원에서 설명되는 다양한 엔진들이 도 1 의 컴퓨터 시스템 (3100) 과 같은 컴퓨터 시스템 상에 제공될 수 있으며, 이에 의해 프로세서 (3104) 가 메모리 컴포넌트들 (3106/3108/3110) 및 입력 디바이스 (3114) 를 통해서 제공되는 사용자 입력 중 임의의 하나, 또는 이들의 조합에 의해 제공되는 명령들에 따라, 이들 엔진들에 의해 제공되는 분석들 및 결정들을 실행할 것으로 이해되어야 한다.
본 교시들은 다양한 실시형태들과 함께 설명되지만, 본 교시들은 이러한 실시형태들에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 반대로, 본 교시들은 당업자들이 주지하고 있는 바와 같이, 다양한 대안들, 변경들, 및 등가물들을 포괄한다.
또, 다양한 실시형태들을 설명할 때, 본 명세서는 방법 및/또는 프로세스를 스텝들의 특정의 시퀀스로서 제시하였을 수도 있다. 그러나, 그 방법 또는 프로세스가 본원에서 개시된 스텝들의 특정의 순서에 의존하지 않는 한, 본 방법 또는 프로세스는 설명된 스텝들의 특정의 시퀀스에 한정되지 않아야 한다. 당업자가 주지하고 있는 바와 같이, 다른 스텝들의 시퀀스들이 가능할 수도 있다. 따라서, 명세서에서 개시된 스텝들의 특정의 순서는 청구범위에 대한 한정들로서 간주되지 않아야 한다. 게다가, 본 방법 및/또는 프로세스에 관한 청구범위는 서술된 순서로 이들의 스텝들의 수행에 한정되어서는 안되며, 당업자는 시퀀스들이 다양할 수도 있으며 여전히 다양한 실시형태들의 정신 및 범위 내에 있음을 쉽게 알 수 있다.
본원에서 설명하는 실시형태들은, 핸드-헬드 디바이스들, 마이크로프로세서 시스템들, 마이크로프로세서-기반 또는 프로그래밍가능 가전제품, 미니 컴퓨터들, 메인프레임 컴퓨터들 및 기타 등등을 포함한, 다른 컴퓨터 시스템 구성들로 실시될 수 있다. 실시형태들은 또한 태스크들이 네트워크를 통해서 링크된 원격 프로세싱 디바이스들에 의해 수행되는 분산 컴퓨팅 환경들에서 실시될 수 있다.
또한, 본원에서 설명하는 실시형태들이 컴퓨터 시스템들에 저장된 데이터를 포함하는 다양한 컴퓨터-구현 동작들을 채용할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이들 동작들은 물리량들의 물리적인 조작을 필요로 하는 동작들이다. 대개, 반드시는 아니지만, 이들 양들은 저장, 전달, 결합, 비교, 및 기타 조작이 가능한 전기 또는 자기 신호들의 형태를 취한다. 또, 수행되는 조작들은 발생, 식별, 결정, 또는 비교와 같은, 용어들로 종종 지칭된다.
본원에서 설명하는 실시형태들의 부분을 형성하는 동작들 중 임의의 동작은 유용한 머신 동작들이다. 본원에서 설명되는, 실시형태들은, 또한 이들 동작들을 수행하는 디바이스 또는 장치에 관한 것이다. 본원에서 설명되는 시스템들 및 방법들은, 요구된 목적들을 위해 특별히 구성될 수 있거나 또는 컴퓨터에 저장된 컴퓨터 프로그램에 의해 선택적으로 활성화되거나 또는 구성되는 범용 컴퓨터일 수도 있다. 특히, 다양한 범용 머신들이 본원에서의 교시들에 따라서 작성된 컴퓨터 프로그램들과 함께 사용될 수도 있거나, 또는 요구된 동작들을 수행하기 위해 보다 특수화된 장치를 구성하는 것이 더욱 편리할 수도 있다.
어떤 실시형태들은 또한 컴퓨터 판독가능 매체 상에 컴퓨터 판독가능 코드로서 구현될 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체는 데이터를 저장할 수 있는 임의의 데이터 저장 디바이스이며, 이후 컴퓨터 시스템에 의해 판독될 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체의 예들은 하드 드라이브들, NAS (network attached storage), 판독 전용 메모리, 랜덤-액세스 메모리, CD-ROM들, CD-R들, CD-RW들, 자기 테이프들, 및 다른 광학적, 플래시 메모리 및 비-광학적 데이터 저장 디바이스들을 포함한다. 컴퓨터 판독가능 매체는 또한 컴퓨터 판독가능 코드가 분산된 방식으로 저장 및 실행되도록 네트워크 커플링된 컴퓨터 시스템들 상에 걸쳐서 분산될 수 있다.
실험
시스템 및 디바이스: OptoSelectTM 디바이스, 즉, Berkeley Lights, Inc. 에 제조되고 또한 Berkeley Lights, Inc. 에 의해 제조된 광학 기구에 의해 제어되는 나노유체 디바이스를 채용하였다. 기구는 온도 제어기에 커플링된 칩용 마운팅 스테이지; 펌프 및 유체 매질 조정 컴포넌트; 및 카메라 및 칩 내 포토트랜지스터들을 활성화하기에 적합한 구조화된 광원을 포함하는 광학 트레인을 포함한다. OptoSelect 디바이스는 포토트랜지스터-활성화된 OET 힘을 제공하는 OptoElectroPositioning (OEP™) 기술로 구성된 기판을 포함한다. 칩은 또한 복수의 미세유체 채널들을 포함하며, 각각의 미세유체 채널들은 그에 유체 흐름 가능하게 연결된 복수의 나노펜™ 챔버들 (또는, 격리 펜들) 을 갖는다. 각각의 격리 펜의 체적은 대략 1x106 입방 마이크론이다.
생물학적 세포들. 인간 항체를 표현하도록 조작된 CHO 세포들을 사용하였다. 세포 수들 및 생존력을 카운트하였으며 OptoSelect 디바이스 상으로 세포들을 로딩하기 위해 세포 밀도를 5x105/ml 로 조절하였다.
디바이스 프라이밍 (priming). 250 마이크로리터들의 100% 이산화탄소를 OptoSelect 디바이스로 12 마이크로리터들/초의 레이트로 유동시킨 후, 0.1% Pluronic® F27 (Life Technologies® Cat# P6866) 을 함유하는 250 마이크로리터들의 PBS 를 12 마이크로리터들/초로 유동시키고, 최종적으로 250 마이크로리터들의 PBS 를 12 마이크로리터들/초로 유동시킨다. 배양 매질의 도입은 다음과 같다.
매질들: CD CHO 매질 (ThermoFisher Scientific Cat. # 10743029), 시중에서 입수가능한 무 단백질 및 무 혈청 매질, 즉, 화학적으로 정의된 매질을 사용하였다.
배양 동안 매질들 관류. 다음 2개의 방법들 중 어느 하나에 따라서 OptoSelect 디바이스를 통해서 매질을 관류시킨다:
1. 2시간 동안 0.01 마이크로리터들/초로 관류시키고; 64 초 동안 2 마이크로리터들/초로 관류시키고; 그리고 반복시킨다.
2. 100 초 동안 0.02 마이크로리터들/초로 관류시키고; 유동을 500 초 중지시키고; 64 초 동안 2 마이크로리터들/초로 관류시키고; 그리고 반복시킨다.
실시예 1: 펩티드 리포터 분자를 이용하여 항체의 상대적인 생산을 평가하기.
리포터 분자. HiLyte FluorTM 555 NHS 에스테르 (AnaSpec Inc., Cat. # AS-81251, 869da (유리 산의 MW), Ex/Em 550/566 nm (Cy3 필터)) 로 N-말단 라벨링된, 2.4Kd 의 분자량을 가지는 IgG 결합 펩티드.
암 참조 이미지 수집: 세포들의 도입 전에, OptoSelect 디바이스를 먼저 어떤 매질도 없고 리포터 분자도 존재하는 상태에서 이미징하여, 배경을 제거하고, 각각의 나노펜 챔버의 이미지를 정규화하는 본원에서 설명된 바와 같은 프로세스에서 사용되는 암 참조 이미지를 획득하였다.
신호 참조 이미지 수집: 형광 화합물이 확산되어 나노펜 챔버들과 미세유체 채널 사이에 평형 분포를 달성될 때까지, N-말단 라벨링된 HiLyte FluorTM 555 IgG 결합 펩티드 (리포터 분자) 를 1 microgram/ml 의 농도로 함유하는 배양 매질을, OptoSelect 디바이스로 45 분 간 0.005 마이크로리터들/초로 유동시켰다. 그 때, 신호 참조 이미지를 획득하였다. 그후, OptoSelect 디바이스를 배양 매질로 리포터 분자 없이 0.03 마이크로리터들/초로 25 분 동안 플러싱하였다. 이 플러싱의 기간은 리포터 분자들이 나노펜 챔버로부터 실질적으로 완전히 확산되어, 나노펜 챔버들 내에 남아 있는 리포터 분자들을 전혀 또는 거의 남기지 않도록 보장한다. 신호 참조 이미지는 대안적으로, 형광 염료 자체를 동일한 몰 농도로 유동시킴으로써 얻어질 수도 있으며, 형광으로 라벨링된 리포터 분자가 채용될 필요가 없다.
분비 세포들을 미세유체 디바이스에 도입하기. CHO 세포들을 OptoSelect 디바이스로 도입하고, 디바이스의 OEP 기술의 유전영동력들을 이용하여 나노펜 챔버들에 선택적으로 위치시켰다. 세포들을 나노펜 챔버 당 하나의 세포로 배치하였다. 배양 매질을 6 일의 기간 동안 상기와 같이 관류시켰다. 명시야 이미지들을 매일 찍어서, 각각의 나노펜 챔버 내 세포 증식을 기록하였다. 제 1 분석 전 6일 배양 기간의 선택은 생물학적 세포들 및 분비된 피분석물의 특정의 요건들에 따라서 다양할 수도 있다. (명시야 이미지를 포함할 수도 있는) 연장된 배양 기간의 매일 분석하는 것이 바람직할 수도 있거나, 또는 배양 기간 동안 선택된 일자들에서 하나 이상의 분석들을 수행할 수도 있다.
분석 신호 수집. 분석의 초기 스텝으로서, 각각의 나노펜 챔버 내 세포 개수와 위치를 연관시키기 위해 명시야 이미지를 얻었다. 명시야 이미지의 수집 후, 1 microgram/ml 의 농도의 형광 리포터 분자를 45 분의 기간 동안 미세유체 채널로 0.05 마이크로리터들/초로 유동시켜, 리포터 분자가 각각의 나노펜 챔버로 충분히 확산하도록 충분한 시간을 주었다. 나노펜 챔버으로의 리포터 분자의 도입 후, 어떤 형광 리포터 분자도 포함하지 않는 배양 매질의 유동을 위에서 결정된 바와 같은 확산 레이트에 기초하여, 25 분의 기간 동안 0.03 마이크로리터들/초로 재개하였다. 형광 이미지를 얻었다. 분석은 원할 경우, 특정의 세포들 및/또는 이로부터의 분비된 피분석물에 적합한 것으로 결정된 배양/증식의 추가적인 기간들에 걸쳐서, 반복될 수도 있다.
피분석물의 상대적인 생산의 결정. 폭 약 20 픽셀들 및 길이 200 픽셀들의 영역을 포괄하는, 나노펜 챔버 내로부터의 확산 축을 따른 관심 영역 (AOI) 을 각각의 나노펜 챔버 내에서 식별하였으며, 여기서, AOI 의 하부 (제 1) 말단을, 고립 영역 내에, 세포들이 배치되지 않은 미세유체 채널로의 개구에 원위에 있는 나노펜 챔버의 기부로부터 선택된 거리에 있도록 선택하였다. AOI 의 길이의 제 2 (상부) 말단을 미세유체 채널 자체 내에 있도록 선택하였으며, 이는 AOI 내에 그리고 채널 내에 상주하는 픽셀들이 실질적으로 어떤 신호도 갖지 않도록 보장하였다. AOI 의 폭은 나노펜 챔버의 고립 영역으로부터 OptoSelect 디바이스의 채널까지 예상된 확산의 궤적을 따라서 집중된다. 앞에서 설명한 바와 같이, AOI 를 20 픽셀들의 폭 및 10 픽셀들의 예상된 확산 궤적을 따른 길이를 각각 갖는 20 개의 서브-영역들 (빈들) 로 세분하였다.
시스템 에러들, 및 시야의 불완전한 조명으로 인한 신호 이미지의 롤 오프 (roll off) 를 감소시키기 위해, 암 참조 및 신호 참조 이미지들을 이용하여, 본원에서 설명된 바와 같이 형광 분석 이미지를 정규화/교정하였다. AOI 에서의 각각의 픽셀은 다음과 같이 프로세싱된다:
Figure 112018113390202-pct00012
서브-영역에서의 각각의 픽셀에 대한 신호 강도들을 추가함으로써, 20 개의 서브-영역들의 각각에 대한 중간 강도를 결정하였다. 각각의 서브-영역에 대한 정규화된 중간 강도 값들을 플롯한 결과로 나타나는 곡선의 표현이 도 12b 에 도시되며, 여기서, x 축은 서브-영역들 1 내지 20 을 나열한다. 서브- 영역 1 은 채널로부터 가장 원위에 있는 AOI 의 서브-영역이며, 서브-영역 20 은 채널까지 가장 멀리있는 AOI 의 서브-영역이다. 서브-영역들 9-13 (도 12b 에서 영역 (1156)) 에 대한 정규화된 중간 강도 값들을 플롯하는 곡선의 섹션에 대해 선형 회귀를 수행하였다. 위에서 설명한 바와 같이, 관측된 신호 강도가 나노펜 챔버의 고립 영역의 하부 (채널로부터 가장 원위에 있는) 부분 내 생물학적 세포들의 위치에 민감하지 않은 영역 내에 있도록, 이들 서브-영역들을 결정하였다. 이 동작으로부터 얻어진 기울기의 값을 임의의 단위들 (A.U.) 로 스코어로서 사용하였다. 더 큰 기울기들 (스코어) 은 그 나노펜 챔버 내 세포들에 의한 더 큰 피분석물의 분비를 나타내었다.
도 21 에 나타낸 바와 같이, 관측된 신호의 강도와 명확하게 상관된 식별 번호 및 스코어가 시인가능한 나노펜 챔버들의 각각에 대해 표시된다 (상부 숫자는 그 나노펜 챔버에 대한 식별 번호이고, 하부 숫자는 그 나노펜 챔버에 대한 스코어이다). 10.01 및 8.67 의 낮은 스코어들을 각각 갖는, 나노펜 챔버들 (563 및 941) 은 피분석물을 생산하는 적어도 하나의 세포를 가지고 있었지만, 낮은 양들의 리포터 분자: 항체 착체가 이들 나노펜 챔버들의 각각으로부터 확산되었다. 13.15 및 17.26 의 스코어들을 각각 갖는, 나노펜 챔버들 (563 및 949) 은 중간-범위 스코어들을 보였다. 마지막으로, 25.26, 29.99 및 27.95 의 스코어들을 각각 가지는, 나노펜 챔버들 (560, 566, 및 942) 은 더 많은 양들의 항체 피분석물을 생산하였다. 본원에서 나타낸 스코어들은 존재하는 세포들의 수에 대해 보정되지 않는다. 그러나, 본원에서 나타낸 스코어들에 대해 그 계산이 부과될 수도 있다. 어느 나노펜 챔버들이 고 생산성 세포주들을 개발하려는 노력에서 추가로 검사될지를 결정하는 것을 돕기 위해, 나노펜 챔버들을 더 용이하게 순위를 정하는데, 미가공 스코어들 또는 세포-카운트-보정된 스코어들을 이용할 수도 있다. 각각의 나노펜 챔버 내 분비된 피분석물의 생산의 레벨을 정량화하기 위해, 곡선 아래의 영역 또는 본원에서 설명되는 다른 방법들과 같은, 나노펜 챔버로부터 채널까지 농도 변화의 레이트를 계산하는 다른 방법들이 또한 채용될 수도 있다.
상대 생산성의 측정. 스코어들은 도 22a 내지 도 22b 에 나타낸 바와 같이, 나노펜 챔버 당 세포들의 수에 대해 보정될 수도 있다. 이 실험에서, 세포 유형, 매질들, 리포터 분자, 사전-배양 이미지 획득, 배양 조건들, 및 분석 조건들은 상기와 동일하였다. 도 22a 는 도 21 의 상부 로우에 이미지들에 나타낸 바와 같이, 0일, 및 3, 4, 5, 6일에 명시야 이미지가 획득된 단일 나노펜 챔버 (2124) 를 나타낸다. 추가적으로, 위에서 설명한 바와 같은 분석을 3, 4, 5, 6 일에 각각에 수행하였으며, 동일한 단일 나노펜 챔버 (2124) 에 대한 3, 4, 5, 및 6 일 각각의 형광 이미지들은 그 날에 대한 대응하는 명시야 이미지 아래에 정렬되어 도시되어 있다. 명시야 이미지를 이용하여 존재하는 세포들의 수를 카운트하였으며, 이는 자동화된 프로세스로 수행될 수도 있으며, 클론 개체군이 증식됨에 따라, 선택된 나노펜 챔버에 대해: 0 일째 (1 개의 세포); 3 일째 (8 개의 세포들); 4 일째 (25 개의 세포들); 5 일째 (65 개의 세포들); 6 일째 (123 개의 세포들) 을 나타내었다. (음의 기울기를 나타내는) 위에서 설명한 바와 같이 얻어진 분석 스코어들은 또한 3 일째 (195 A.U.); 4 일째 (566 A.U.); 5 일째 (1431 A.U.); 6 일째 (2842) 로, 꾸준히 증가되었다. 따라서, 3 일째에, 나노펜 챔버 내 8개의 세포들은 195 (A.U.) 의 스코어를 얻었다. 4 일째에, 동일한 나노펜 챔버는 이제 25 개의 세포들을 가지고 있어, 566 (A.U.) 의 스코어를 얻었다. 5 일째에, 동일한 나노펜 챔버는 65 개의 세포들을 가지고 있어, 1431 (A.U.) 의 스코어를 얻었다. 마지막으로, 하루 6 일째에, 동일한 나노펜 챔버는 123 개의 세포들을 가지고 있어, 2843 (A.U.) 의 스코어를 얻었다. 도 22b 의 그래프는 나노펜 챔버 내에서의 세포 배양의 시작 이후, 일자 단위인 분석 시점 (X-축) 에 대해 플롯된 분석 스코어들 (y-축) 을 나타낸다. 챔버 내 세포들의 수에 대해 정규화된 스코어를 제공하기 위해, 절대 스코어들을 그 시점에 존재하는 세포들의 수로 나누었다. 이는 선택된 나노펜 챔버 내 세포들의 생산성 (rQp) 의 정규화된 측정치를 산출했으며, 세포 당 22.6 내지 24.1 A.U. 사이의 범위에 여전히 있었다.
실시예 2. 대규모 생산 및 세포주 개발과 항체 생산의 인-시츄 (in-situ) 스코어링의 상관 관계.
시스템 및 디바이스: 상기와 같다.
세포들: 실험 1 에서와 같은 CHO 세포들.
매질들: 실험 1 에서와 같다.
리포터 분자: 실험 1 에서와 같다.
6 일 동안 배양을 수행하였으며, 2.4Kd 의 분자량을 가지는 HiLyte FluorTM 555 라벨링된 IgG 결합 펩티드를 이용한 확산 기반의 분석을 실험 1 에서와 같이 수행하였다. 본원에서 정의된 바와 같은 AOI 내에서 관측된 신호의 강도들에 기초하여 스코어를 할당하는 분석을 수행하였다. OptoSelect 디바이스 내 각각의 나노펜 챔버에 대해 스코어들을 평가하였다. 도 22a 및 도 22b 에서, OptoSelect 디바이스의 각각의 나노펜 챔버를 플롯하였으며, 여기서, 수평축은 칩 상에서 얻어진 역가 ("스코어", 또는 이 경우, 세포 위치 불감 서브-영역 (전체 AOI 에 대해 1-20 의 서브-영역들 9-13) 을 따른 중간 강도 값들의 기울기) 이다. 각각의 나노펜 챔버를 (명시야 이미지로부터 얻어진) 분석시점 시점에 개별 나노펜 챔버에서 카운트된 세포들의 수를 나타내는 그래프의 Y-축 (도 23a) 상에 플롯하였다. 피분석물의 분비에 대한 낮은 스코어들 (800 A.U. 미만의 컷오프); 피분석물 분비에 대한 중간-레벨들 스코어들 (800 A.U. 미만 내지 약 1400 A.U.) 및 피분석물 분비에 대한 높은 스코어들 (약 1400 내지 약 2400 A.U.) 을 가지는 3개의 나노펜 챔버들의 그룹들을 선택함으로써, 제 1 선택을 하였다. 이들 선택된 그룹들의 각각 내에서, 큰, 중간 및 낮은 개수들의 세포들을 가지는 나노펜 챔버들이 있었다.
도 23b 에 나타낸 바와 같이, 빠른 성장을 가지는 나노펜 챔버들을 선택하기 위해 추가적인 선택을 포함시켰으며; 챔버들은 중간 레이트의 세포 배증 (doubling) 을 나타내었으며, 제 3 그룹을 단지 느리게 증식하는 세포들의 개수들만을 갖도록 선택하였다. 이들 그룹들의 각각에서, 높은, 중간 및 낮은 레벨들의 피분석물 생산을 나타내었다 (스코어들은 도 23b 의 전체 수평축을 가로지르는 범위이다). 성장/분비 프로파일들의 모든 9개의 서브-유형들 중 하나 내에서 개개의 나노펜 챔버들의 선택을 하였으며, (별개의 클론 개체군을 각각 유지하는) 선택된 펜들을 개별적으로, 먼저 웰 플레이트들로 배출시켰다. IgG 에 대한 ELISA 분석을 통해 역가들을 얻었다. 클론 개체군들을 함유하는 낮은, 중간 및 높은 분비하는 웰들의 추가적인 선택을 125 ml 쉐이커 플라스크들로 도입하여 추가로 스케일 업시켰다.
스케일 업된 125ml 쉐이커 플라스크들에서의 클론 개체군들을 IgG 에 대한 ELISA 분석을 통해 분석하였다. 선택된 클론들이 도 24 에 도시되며, 여기서, 각각의 125ml 쉐이커 플라스크의 역가는 Y-축 상에 표시되며, 세포들이 유래되는 개별 나노펜 챔버에 대한 온 칩 역가 (위에서 설명된 분석에서 얻어진 바와 같은, A.U. 단위인 스코어) 는 X-축 상에 나타내어진다. 제 1 그룹 (2405) 은 낮은 온칩 역가들 (스코어들) 을 가지는 나노펜 챔버들 내 세포들로부터 유래하였다. 그룹 (2405) 은 125 ml 쉐이커 플라스크로 스케일링되면 임의의 높은 생산성 클론들을 포함하지 않았다. 제 2 그룹 (2415) 은 온칩 역가 (스코어) 의 중간 범위를 가지는 나노펜 챔버들 내 세포들로부터 유래하였으며, 125 쉐이커 플라스크로부터 ELISA 역가 값들의 중간 범위를 나타내었다. 최종 그룹 (2425) 은 모두 139.1 micrograms/mL 의 풀 평균 (pool average) 보다 더 높은, 높은 역가 값들을 가지며, 또한 높았던 온칩 역가들 (A.U. 단위인 스코어) 을 가지는 나노펜 챔버들로부터의 세포들과 높은 상관 관계를 보였다. 따라서, 중간 내지 높은 온 칩 역가들 (스코어들, 또는, 특정의 실시형태에서, 기울기) 을 가지는 나노펜 챔버들 내 세포들에 대해, 대규모 개체군에서 얻어진 역가의 레벨에 대해 우수한 상관 관계가 있음이 입증되었다. 따라서, 본원에서 설명된 바와 같은 OptoSelect 디바이스 내에서 수행되는 분석은 세포주 개발을 위해 더 많은 수의 고 생산성 클론들을 더 빨리 식별하는 의미 있는 접근법을 산출하였다. 추가적으로, 도 16b 와 관련하여 위에서 설명된 바와 같이, 각각의 클론 개체군을 개별적으로 스크리닝하는 능력은 다른 비-생산성 클론 개체군들만큼 빠르게 성장하지 않을 수도 있는 생산성 클론들을 식별하는 능력을 제공한다. 이들 더 느리게 성장하는, 보다 생산적인 클론들은 벌크 증식의 조건 하에서 식별될 확률이 낮을 것이다.
실시예 3. 압타머를 이용하여 항체의 상대적인 생산을 평가하기.
시스템 및 디바이스: 위와 같다.
세포들: 실험 1 에서와 같은 CHO 세포들.
매질들: 실험 1 에서와 같다.
리포터 분자: 인간 면역글로불린 G 에 대한 압타머, (Apta-IndexTM, Apt 8, ID# 44, 23-mer, MW. 7.4Kd, Fc 도메인에 대한 친화력, Aptagen L.L.C. 시퀀스: 5'- rGp-rGp-rAp-rGp-rGp-fUp-fCp-fCp-rGp-rAp-rAp-rAp-rGp-rGp-rAp-fCp-fUp-fCp-fCp-3'. 시퀀스 표기에서, r- 접두부는 리보뉴클레오티드를 표시하며; f- 접두부는 2-플루오로 뉴클레오티드를 표시하며; -p 접미부는 포스페이트를 표시하며; 그리고 G, A, C, U 는 표준 뉴클레오티드 약어들이다. 이것은 Alexa Fluor® 594 (AF594, ThermoFisher Scientific, Cat. No. A20004 (NHS 에스테르)) MW 819.8, Ex/Em590/617nm) 로 라벨링된다.
Alexa Fluor® 594 또는 Alexa Fluor 594 라벨링된 압타머를 2 micrograms/ml 의 농도로 함유하는 배양 매질을, 형광 화합물이 확산되어 나노펜 챔버들과 미세유체 채널 사이에 평형 분포를 달성할 때까지, 45 분 동안 OptoSelect 디바이스로 유동시킨다. 신호 참조 이미지를 획득한다. 그후, OptoSelect 디바이스를 어떤 리포터 분자도 갖지 않는 배양 매질로 30 분 동안 0.03 마이크로리터들/초로 플러싱한다. 이 플러싱의 기간은 리포터 분자들이 나노펜 챔버로부터 실질적으로 완전히 확산되도록 보장한다.
CHO 세포들을 OptoSelect 디바이스로 도입하고 디바이스의 OEP 기술의 유전영동력들을 이용하여 나노펜 챔버들로 선택적으로 위치시킨다. 세포들을 나노펜 챔버 당 하나의 세포로 배치한다. 6 일의 기간 동안, 배양 매질을 상기와 같이 관류시킨다. 각각의 나노펜 챔버 내 세포 증식을 기록하기 위해 매일 명시야 이미지들을 찍는다. 실험의 3, 4, 5 및 6 일의 각각의 일자에 항체 생산을 검출하기 위한 분석들을 수행한다.
분석 신호 수집. 각각의 나노펜 챔버 내 세포 개수와 위치를 상관시키기 위해 명시야 이미지를 얻는다. 명시야 이미지의 수집 후, 2 microgram/ml 의 농도의 형광 리포터 분자, 즉, 압타머-AlexaFluor 594 를 50 분의 기간 동안 미세유체 채널로 유동시켜, 리포터 분자가 각각의 나노펜 챔버로 확산되도록 충분한 시간을 준다. 나노펜 챔버으로의 리포터 분자의 도입 후, 어떤 리포터 분자도 포함하지 않는 배양 매질의 유동을 대략 7Kd 의 분자에 대한 확산 레이트에 기초하여, 30 분의 기간 동안 0.03 마이크로리터들/초로 재개한다. 형광 이미지를 얻는다.
나노펜 챔버 내로부터의 확산 축을 따른 관심 영역 (AOI) 이 상기 실험 1 에서 설명한 바와 같이 위치된, 폭 약 20 픽셀들 및 길이 200 픽셀들의 영역을 포괄하는 각각의 나노펜 챔버 내에서 식별된다. AOI 의 폭은 나노펜 챔버의 고립 영역으로부터 OptoSelect 디바이스의 채널까지 예상된 확산의 궤적을 따라서 집중된다. AOI 를, 20 픽셀들의 폭 및 10 픽셀들의 예상된 확산 궤적을 따른 길이를 각각 갖는 20 개의 서브-영역들 (빈들 또는 세그먼트들) 로 세분한다. 시스템 에러들, 및 시야의 불완전한 조명으로 인한 신호 이미지의 롤 오프 (roll off) 를 감소시키기 위해, 암 참조 및 신호 참조 이미지들을 이용하여, 본원에서 설명된 바와 같이 형광 분석 이미지를 정규화/교정한다.
서브-영역에서의 각각의 픽셀에 대한 신호 강도들을 추가함으로써, 20 개의 서브-영역들의 각각에 대한 중간 강도를 결정한다. 각각의 서브-영역에 대한 정규화된 중간 강도 값들의 곡선을 발생시켜, 서브-영역들 9-13 에 대한 정규화된 중간 강도 값들을 플롯하는 곡선의 섹션에 대해 선형 회귀를 수행한다. 이 동작으로부터 얻어진 기울기의 값을 스코어로서, 임의의 단위들 (A.U.) 로, 사용한다. OptoSelect 디바이스의 3500 개의 전체 나노펜 챔버들의 선택된 수의 개별 나노펜 챔버들은 200-250 A.U. 보다 큰 스코어들을 가지며 증식 및 추가적인 개발을 위해 배출되도록 선택될 것으로 예상된다.
본 개시물의 특정의 실시형태들 및 애플리케이션들이 본 명세서에서 설명되지만, 이들 실시형태들 및 애플리케이션들은 단지 예시적이며, 다수의 변형예들이 가능하다.
선택된 실시형태들의 설명
실시형태 1. 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템으로서, 이미지 획득 유닛; 및 이미지 획득 유닛에 통신가능하게 접속된 이미지 프로세싱 유닛을 포함하되, 상기 이미지 획득 유닛은, 미세유체 디바이스를 고정할 수 있는 미세유체 디바이스 홀더로서, 미세유체 디바이스는 흐름 영역 및 흐름 영역에 유체 흐름 가능하게 연결된 복수의 격리 펜들을 포함하며, 복수의 격리 펜들의 각각은 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 유지할 수 있는, 상기 미세유체 디바이스 홀더, 및 미세유체 디바이스의 복수의 격리 펜들 및 흐름 영역의 하나 이상의 분석 이미지들을 캡쳐하도록 구성된 이미징 엘리먼트를 포함하며; 그리고, 상기 이미지 프로세싱 유닛은, 각각의 캡쳐된 분석 이미지를 수신하고 분석 이미지에 묘사된 각각의 격리 펜에 대한 관심 영역을 정의하도록 구성된 관심 영역 결정 엔진으로서, 관심 영역은 피분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고 피분석물 변동들이 측정될 때 격리 펜에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며 격리 펜과 흐름 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는 격리 펜 내 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함하는, 상기 관심 영역 결정 엔진, 및 각각의 격리 펜의 관심 영역 내 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하여, 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 구성된 스코어링 엔진을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 2. 실시형태 1 의 시스템에 있어서, 배경 잡음에 의해 초래되거나 및/또는 분석 이미지 캡쳐 동안 도입되는 이미지 왜곡들에 대해 적어도 각각의 격리 펜의 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하도록 구성된 교정 엔진을 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 3. 실시형태 1 또는 2 의 시스템에 있어서, 이미징 엘리먼트는 하나 이상의 대응하는 배경 이미지들 및 하나 이상의 대응하는 신호 참조 이미지들을 캡쳐하도록 더 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 4. 실시형태 3 의 시스템에 있어서, 교정 엔진은 분석 이미지로부터 대응하는 배경 이미지를 감산함으로써 이미지 왜곡들에 대해 적어도 각각의 격리 펜의 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하도록 구성되며; 및/또는 교정 엔진은 대응하는 신호 참조 이미지에서 캡쳐된 이미지 획득 왜곡들을 고려함으로써 이미지 왜곡들에 대해 적어도 각각의 격리 펜의 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 5. 실시형태들 2-4 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 스코어링 엔진은 각각의 격리 펜의 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하여 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 6. 실시형태 5 의 시스템에 있어서, 스코어링 엔진은 각각의 격리 펜의 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 부분에 걸쳐서 선형 회귀 분석을 광도 값들에 적용하여 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 7. 실시형태 5 의 시스템에 있어서, 스코어링 엔진은 각각의 격리 펜의 정규화된 관심 영역의 부분에 걸쳐서 광도 값들을 통합하여 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 8. 실시형태들 1 내지 7 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 이미지 획득 유닛 및 이미지 프로세싱 유닛은 별개로 배향되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 9. 실시형태들 1 내지 7 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 이미지 획득 유닛 및 이미지 프로세싱 유닛은 단일 유닛으로 통합되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 10. 실시형태들 1 내지 9 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 관심 영역은 이미지 프로세싱 유닛에 의해 자동적으로 정의되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 11. 실시형태들 1 내지 10 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 미세유체 디바이스는 생물학적 마이크로-객체들에 의해 발생된 피분석물에 결합하며 검출가능한 라벨을 포함하는 결합제의 유동을 수용하도록 구성되며, 스코어링 엔진은 분석 이미지로부터 결정되는 바와 같이, 결합제의 검출가능한 라벨에 의해 방출되는 광의 양에 기초하여, 각각의 격리 펜에서의 피분석물 양을 결정하도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 12. 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 방법으로서, 흐름 영역 및 흐름 영역에 유체 흐름 가능하게 연결된 복수의 격리 펜들을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미징 데이터를 수신하는 단계로서, 이미징 데이터는 피분석물 분석 이미지, 및 배경 잡음 이미지 및 신호 참조 이미지 중 하나 또는 양자를 포함하는, 상기 수신하는 단계; 각각의 격리 펜에 대한 관심 영역을 정의하는 단계로서, 관심 영역은 피분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 피분석물 변동들이 측정될 때 격리 펜에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하고, 그리고 격리 펜과 흐름 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는, 격리 펜 내 이미지 영역을 포함하는, 상기 정의하는 단계; 및 각각의 격리 펜에 대한 관심 영역의 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석함으로써 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 13. 실시형태 12 의 방법에 있어서, 이미징 데이터는 생물학적 마이크로-객체들에 의해 발생된 피분석물에 결합하는 리포터 분자로부터 방출된 광으로부터 결정된 광 방출 데이터를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 14. 실시형태 12 또는 13 의 방법에 있어서, 배경 잡음 이미지에서 캡쳐된 배경 잡음을 감산함으로써 피분석물 분석 이미지에서 적어도 격리 펜들의 각각에 대한 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하는 단계; 및/또는 신호 참조 이미지에서 캡쳐된 이미지 획득 왜곡들을 고려함으로써 피분석물 분석 이미지에서 적어도 격리 펜들의 각각에 대한 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 15. 실시형태들 14 의 방법에 있어서, 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계는 각각의 격리 펜에 대한 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 16. 실시형태들 14 의 방법에 있어서, 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계는 각각의 격리 펜의 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분에 걸쳐서 선형 회귀 분석을 광 방출 데이터에 적용하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 17. 실시형태들 14 의 방법에 있어서, 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계는 각각의 격리 펜의 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분에 걸쳐서 광 방출 데이터를 통합하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 18. 실시형태들 12 내지 17 중 어느 하나의 방법에 있어서, 피분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 19. 컴퓨터로 하여금 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 이미지 프로세싱 방법을 수행하게 하는 프로그램이 저장되는 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체로서, 상기 방법은 흐름 영역 및 흐름 영역에 유체 흐름 가능하게 연결된 복수의 격리 펜들을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미징 데이터를 수신하는 단계로서, 이미징 데이터는 피분석물 분석 이미지, 및 배경 잡음 이미지 및 신호 참조 이미지 중 하나 또는 양자를 포함하는, 상기 수신하는 단계; 각각의 격리 펜에 대한 관심 영역을 정의하는 단계로서, 관심 영역은 피분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 피분석물 변동들이 측정될 때 격리 펜에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하고, 그리고 격리 펜과 흐름 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는, 격리 펜 내 이미지 영역을 포함하는, 상기 정의하는 단계; 및 각각의 격리 펜에 대한 관심 영역의 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석함으로써 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계를 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 20. 실시형태 19 의 방법에 있어서, 이미징 데이터는 생물학적 마이크로-객체들에 의해 발생된 피분석물에 결합하는 리포터 분자로부터 방출된 광으로터 결정된 광 방출 데이터를 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 21. 실시형태 19 또는 20 의 방법에 있어서, 배경 잡음 이미지에서 캡쳐된 배경 잡음을 감산함으로써 피분석물 분석 이미지에서 적어도 격리 펜들의 각각에 대한 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하는 단계; 및/또는 신호 참조 이미지에서 캡쳐된 이미지 획득 왜곡들을 고려함으로써 피분석물 분석 이미지에서 적어도 격리 펜들의 각각에 대한 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하는 단계를 더 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 22. 실시형태 21 의 방법에 있어서, 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계는 각각의 격리 펜에 대한 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하는 단계를 더 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 23. 실시형태 21 의 방법에 있어서, 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계는 선형 회귀 분석을 각각의 격리 펜의 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분으로부터의 광 방출 데이터에 적용하는 단계를 더 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 24. 실시형태 21 의 방법에 있어서, 각각의 격리 펜에서의 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계는 각각의 격리 펜의 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분에 걸쳐서 광 방출 데이터를 통합하는 단계를 더 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 25. 실시형태들 19 내지 24 중 어느 하나의 방법에 있어서, 피분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 26. 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법으로서, 상기 방법은 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 격리 펜으로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 흐름 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 격리 펜은 흐름 영역에 유체 연결되며, 격리 펜은 제 1 유체 매질을 포함하는, 상기 미세유체 디바이스의 격리 펜으로 도입하는 단계; 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군으로 하여금 피분석물을 격리 펜 내 제 1 유체 매질로 분비하게 하는 단계; 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 매질은 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 리포터 분자는 분비된 피분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 흐름 영역으로 도입하는 단계; 및 복수의 리포터 분자들의 부분으로 하여금 격리 펜으로 확산하게 하여 그 안에 분비된 피분석물에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 리포터 분자: 분비된 피분석물 (RMSA) 착체들을 발생시키는 단계; 및 미세유체 디바이스 내 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계로서, 관심 영역은 격리 펜의 적어도 일부분을 포함하는, 상기 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 27. 실시형태 26 의 방법에 있어서, 격리 펜은 고립 영역 및 고립 영역을 흐름 영역에 유체 연결하는 접속 영역을 가지며, 고립 영역 및 접속 영역은 고립 영역에서의 유체 매질의 성분들이 흐름 영역에서의 유체 매질의 성분들과 실질적으로 단지 확산에 의해서만 교환되도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 28. 실시형태 27 의 방법에 있어서, 격리 펜 내 생물학적 마이크로-객체를 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군으로 증식시키는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 29. 실시형태 28 의 방법에 있어서, 배양 매질로 흐름 영역을 관류시키는 단계를 더 포함하며, 관류시키는 것은 생물학적 마이크로-객체를 격리 펜으로 도입시킨 후 그리고 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하기 전에 발생하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 30. 실시형태 29 의 방법에 있어서, 배양 매질은 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 매질 성분, 및/또는 가용성 자극 성분 중 하나 이상을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 31. 실시형태들 26 내지 30 중 어느 하나의 방법에 있어서, 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계는 제 1 시간 기간 동안 흐름 영역을 통해서 제 2 유체 매질을 유동시키는 단계를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 32. 실시형태 31 의 방법에 있어서, 제 1 시간 기간은 약 30 분 내지 약 60 분인, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 33. 실시형태들 26 내지 32 중 어느 하나의 방법에 있어서, 제 3 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 제 3 유체 매질은 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 도입하는 단계; 및 비결합된 리포터 분자들의 적어도 일부분을 격리 펜으로부터 확산시키는 단계를 더 포함하며, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 것은 격리 펜으로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들의 양이 격리 펜으로부터 확산되는 RMSA 착체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 34. 실시형태 33 의 방법에 있어서, 제 3 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계는 제 2 시간 기간 동안 흐름 영역을 통해서 제 3 유체 매질을 유동시키는 단계를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 35. 실시형태 34 의 방법에 있어서, 제 2 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들 및 RMSA 착체들에 대한 확산 프로파일들의 모델링에 기초하여 선택되는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 36. 실시형태 34 의 방법에 있어서, 제 2 시간 기간은 약 20 분 내지 약 50 분인, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 37. 실시형태들 26 내지 36 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역은 격리 펜 내로부터 흐름 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 격리 펜의 적어도 일부분을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 38. 실시형태들 26 내지 37 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 관심 영역으로부터 오는 검출가능한 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함하며, 검출가능한 신호의 적어도 일부는 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출되는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 39. 실시형태 38 의 방법에 있어서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 검출가능한 신호의 측정된 강도로부터 배경 신호의 강도를 감산함으로써 배경-감산된 신호 강도를 결정하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 40. 실시형태 39 의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체를 격리 펜으로 도입하기 이전의 시간에 관심 영역 내 배경 신호의 강도를 측정하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 41. 실시형태들 38 내지 40 중 어느 하나의 방법에 있어서, 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 격리 펜 내에서 관측된 세포들의 수에 대해 정규화되는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 42. 실시형태들 26 내지 41 중 어느 하나의 방법에 있어서, 피분석물의 분비의 레벨을 정량화하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 43. 실시형태들 26 내지 42 중 어느 하나의 방법에 있어서, 격리 펜에 대한 분비 스코어를 제공하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 44. 실시형태 43 의 방법에 있어서, 분비 스코어는 제 12 항 내지 제 18 항의 방법들 중 어느 하나에 따라서 결정되는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 45. 실시형태들 26 내지 44 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분비된 피분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 갖는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 46. 실시형태들 26 내지 44 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분비된 피분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 더 큰 분자량을 갖는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 47. 실시형태들 26 내지 44 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분비된 피분석물은 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 더 큰 분자량을 갖는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 48. 실시형태들 26 내지 47 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 49. 실시형태 48 의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 50. 실시형태 49 의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 SEQ ID 번호들: 1 내지 10 중 어느 하나의 시퀀스를 가지는 펩티드를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 51. 실시형태 49 의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 52. 실시형태들 26 내지 51 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 53. 실시형태들 26 내지 52 중 어느 하나의 방법에 있어서, 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 54. 실시형태들 26 내지 52 중 어느 하나의 방법에 있어서, 검출가능한 라벨은 형광 라벨인, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 55. 실시형태들 26 내지 54 중 어느 하나의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 56. 실시형태들 26 내지 55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물은 항체 또는, 옵션적으로, 글리코실화된 항체인, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 57. 실시형태들 26 내지 55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물은 옵션적으로 글리코실화된 단백질인, 항체 이외의 단백질인, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 58. 실시형태들 26 내지 57 중 어느 하나의 방법에 있어서, 미세유체 디바이스는 복수의 격리 펜들을 포함하며, 생물학적 마이크로-객체는 복수의 격리 펜들 중 적어도 2개의 격리 펜들로 도입되며, 상기 방법의 나머지는 적어도 2개의 격리 펜들의 각각에 대해 수행되는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 59. 실시형태 58 의 방법에 있어서, 복수의 격리 펜들 중 적어도 2개의 격리 펜들의 격리 펜들에 대한 분비의 레벨을 비교하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 60. 실시형태 58 의 방법에 있어서, 복수의 격리 펜들 중 하나 보다 많은 격리 펜의 분비 스코어들을 비교하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 61. 실시형태들 58 내지 60 중 어느 하나의 방법에 있어서, 적어도 2개의 격리 펜들 중 하나 이상을 선택하는 단계; 및 선택된 격리 펜들의 각각으로부터의 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 배출하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 62. 실시형태 61 의 방법에 있어서, 선택된 격리 펜들의 각각으로부터의 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들은 미세유체 디바이스로부터 추가로 배출되는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 63. 실시형태 61 또는 62 의 방법에 있어서, 선택된 격리 펜들은 개별적으로 배출되는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 64. 클론주 개발의 방법으로서, 상기 방법은 개개의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 복수의 격리 펜들의 각각으로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 흐름 영역을 가지는 인클로저를 더 포함하며, 복수의 격리 펜들의 각각은 흐름 영역에 유체 연결되며 제 1 유체 매질을 포함하는, 상기 복수의 격리 펜들의 각각으로 도입하는 단계; 각각의 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군으로 하여금, 피분석물을 대응하는 격리 펜에 포함된 제 1 유체 매질로 분비하게 하는 단계; 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 매질은 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 리포터 분자는 분비된 피분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 흐름 영역으로 도입하는 단계; 복수의 리포터 분자들의 부분으로 하여금 복수의 각각의 격리 펜으로 확산하게 하여 그 안에 분비된 피분석물의 적어도 일부분에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 격리 펜들의 각각에서 복수의 리포터 분자:분비된 피분석물 (RMSA) 착체들을 발생시키는 단계; 복수의 각각의 격리 펜에 대해, 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도를 검출하는 단계로서, 관심 영역은 대응하는 격리 펜의 적어도 일부분을 포함하며, 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 적어도 일부분은 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출되는, 상기 신호의 강도를 검출하는 단계; 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 검출된 신호 강도에 기초하여, 복수의 각각의 격리 펜에 대해, 스코어를 결정하는 단계; 복수의 격리 펜들 중에서 격리 펜들의 세트를 선택하는 단계로서, 상기 세트의 각각의 격리 펜은 그 안에 포함된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 클론 개체군이 상위 피분석물 생산자임을 표시하는 스코어를 가지는, 상기 격리 펜들의 세트를 선택하는 단계; 선택된 격리 펜들의 세트의 각각의 격리 펜 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 미세유체 디바이스로부터 배출시키는 단계; 대응하는 반응 용기들에서 선택된 격리 펜들의 세트의 각각의 격리 펜으로부터의 배출된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 증식시키는 단계; 및 각각의 대응하는 반응 용기에서 분비된 피분석물의 레벨을 결정하고, 이에 의해 각각의 생물학적 마이크로-객체 또는 클론 개체군에 대한 분비의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 65. 실시형태 64 의 방법에 있어서, 복수의 각각의 격리 펜은 고립 영역 및 고립 영역을 흐름 영역에 유체 연결하는 접속 영역을 가지며, 고립 영역 및 접속 영역은 고립 영역에서의 유체 매질의 성분들이 흐름 영역에서의 유체 매질의 성분들과 실질적으로 단지 확산에 의해서만 교환되도록 구성되는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 66. 실시형태 65 의 방법에 있어서, 복수의 격리 펜들 중 일부 또는 모든 격리 펜들 내 개개의 생물학적 마이크로-객체를 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군으로 증식시키는 단계를 더 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 67. 실시형태 66 의 방법에 있어서, 배양 매질로 흐름 영역을 관류시키는 단계를 더 포함하며, 관류시키는 것은 개개의 생물학적 마이크로-객체들을 복수의 격리 펜들로 도입한 후 그리고 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하기 전에 발생하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 68. 실시형태 67 의 방법에 있어서, 배양 매질은 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 매질 성분, 및/또는 가용성 자극 성분 중 하나 이상을 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 69. 실시형태들 64 내지 68 중 어느 하나의 방법에 있어서, 제 2 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계는 제 1 시간 기간 동안 흐름 영역을 통해서 제 2 유체 매질을 유동시키는 단계를 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 70. 실시형태 69 의 방법에 있어서, 제 1 시간 기간은 약 30 분 내지 약 60 분인, 클론주 개발의 방법.
실시형태 71. 실시형태들 64 내지 70 중 어느 하나의 방법에 있어서, 제 3 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 제 3 유체 매질은 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 흐름 영역으로 도입하는 단계; 및 비결합된 리포터 분자들의 적어도 일부분을 격리 펜으로부터 확산시키는 단계를 더 포함하며, 복수의 각각의 격리 펜의 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도를 검출하는 것은 격리 펜으로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들의 양이 격리 펜으로부터 확산되는 RMSA 착체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 72. 실시형태 71 의 방법에 있어서, 제 3 유체 매질을 흐름 영역으로 도입하는 단계는 제 2 시간 기간 동안 흐름 영역을 통해서 제 3 유체 매질을 유동시키는 단계를 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 73. 실시형태 72 의 방법에 있어서, 제 2 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들 및 RMSA 착체들에 대한 확산 프로파일들의 모델링에 기초하여 선택되는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 74. 실시형태 73 의 방법에 있어서, 제 2 시간 기간은 약 20 분 내지 약 50 분인, 클론주 개발의 방법.
실시형태 75. 실시형태들 64 내지 74 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역은 격리 펜 내로부터 흐름 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 격리 펜의 적어도 일부분을 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 76. 실시형태들 64 내지 75 중 어느 하나의 방법에 있어서, 복수의 각각의 격리 펜의 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도를 검출하는 단계는 검출가능한 신호의 측정된 강도로부터 배경 신호의 강도를 감산하여 배경-감산된 신호 강도를 결정하는 단계를 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 77. 실시형태 76 의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체들을 격리 펜들로 도입하기 전 시간에서, 복수의 각각의 격리 펜의 대응하는 관심 영역 내 배경 신호의 강도를 측정하는 단계를 더 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 78. 실시형태 76 또는 77 의 방법에 있어서, 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 대응하는 격리 펜 내에서 관측된 세포들의 수에 대해 정규화되는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 79. 실시형태 64 의 방법에 있어서, 복수의 격리 펜들의 스코어들은 제 12 항 내지 제 18 항의 방법들 중 어느 하나에 따라서 결정되는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 80. 실시형태들 64 내지 79 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분비된 피분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 갖는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 81. 실시형태들 64 내지 79 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분비된 피분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 큰 분자량을 갖는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 82. 실시형태들 64 내지 79 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분비된 피분석물은 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 큰 분자량을 갖는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 83. 실시형태들 64 내지 82 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 84. 실시형태 83 의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 85. 실시형태 84 의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 SEQ ID 번호들: 1 내지 10 중 어느 하나의 시퀀스를 가지는 펩티드를 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 86. 실시형태 84 의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 87. 실시형태들 64 내지 86 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 88. 실시형태들 64 내지 87 중 어느 하나의 방법에 있어서, 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 89. 실시형태들 64 내지 87 중 어느 하나의 방법에 있어서, 검출가능한 라벨은 형광 라벨인, 클론주 개발의 방법.
실시형태 90. 실시형태들 64 내지 89 중 어느 하나의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 91. 실시형태들 64 내지 90 중 어느 하나의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물은 항체 또는, 옵션적으로, 글리코실화된 항체인, 클론주 개발의 방법.
실시형태 92. 실시형태들 64 내지 90 중 어느 하나의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물은 옵션적으로 글리코실화된 단백질인, 항체 이외의 단백질인, 클론주 개발의 방법.
실시형태 93. 실시형태들 64 내지 92 중 어느 하나의 방법에 있어서, 반응 용기들은 웰-플레이트 내 웰들, 쉐이커 플라스크들, 또는 생물-반응기들인, 클론주 개발의 방법.
실시형태 94. 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트로서, 상기 키트는, 흐름 영역을 갖는 인클로저 및 복수의 격리 펜들을 포함하는 미세유체 디바이스로서, 각각의 격리 펜은 흐름 영역에 유체 연결되며, 흐름 영역 및 격리 펜들은 유체 매질을 포함하도록 구성되는, 상기 미세유체 디바이스; 및 검출가능한 라벨 및 피분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분을 포함하는 구성된 리포터 분자를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 95. 실시형태 94 의 키트에 있어서, 복수의 각각의 격리 펜은 고립 영역 및 고립 영역을 흐름 영역에 유체 연결하는 접속 영역을 가지며, 고립 영역 및 접속 영역은 고립 영역에서의 유체 매질의 성분들이 흐름 영역에서의 유체 매질의 성분들과 실질적으로 단지 확산에 의해서만 교환되도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 96. 실시형태 94 또는 95 의 키트에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 97. 실시형태 96 의 키트에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 98. 실시형태 97 의 키트에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 SEQ ID 번호들: 1 내지 10 중 어느 하나의 시퀀스를 가지는 펩티드를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 99. 실시형태 97 의 키트에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 100. 실시형태 96 의 키트에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 101. 실시형태들 94 내지 100 중 어느 하나의 키트에 있어서, 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 102. 실시형태들 94 내지 100 중 어느 하나의 키트에 있어서, 검출가능한 라벨은 형광 라벨인, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 103. 실시형태들 94 내지 102 중 어느 하나의 키트에 있어서, 유체 매질을 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 104. 실시형태 103 의 키트에 있어서, 유체 매질은 선택적 압력을 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 유지, 증식 또는 제공하도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 105. 실시형태들 94 내지 104 중 어느 하나의 키트에 있어서, 미세유체 디바이스의 하나 이상의 표면들을 조절하도록 구성된 시약을 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 106. 실시형태 105 의 키트에 있어서, 시약은 미세유체 디바이스의 하나 이상의 표면들을 공유결합으로 개질하도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 107. 실시형태들 26 내지 63 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역은 피분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고 피분석물 변동들이 측정될 때 격리 펜에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며 격리 펜과 흐름 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는 격리 펜 내 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 108. 실시형태 107 의 방법에 있어서, 관심 영역은 이미지 영역으로 본질적으로 이루어지는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 피분석물, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
실시형태 109. 실시형태들 26 내지 63 또는 107 내지 108 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 방법은 자동화되는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 생성되는 (및/또는 분비되는) 피분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 110. 컴퓨터로 하여금, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 방법을 수행하도록 시스템에게 지시하게 하는 프로그램이 저장된 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체로서, 상기 방법은 실시형태들 26 내지 63 또는 107 내지 108 의 방법들 중 어느 하나인, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 111. 실시형태 110 의 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체에 있어서, 시스템은 실시형태들 1 내지 11 의 시스템들 중 어느 하나인, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 112. 실시형태들 64 내지 93 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역은 피분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고 피분석물 변동들이 측정될 때 격리 펜에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며 격리 펜과 흐름 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는 격리 펜 내 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함하는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 113. 실시형태 112 의 방법에 있어서, 관심 영역은 이미지 영역으로 본질적으로 이루어지는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 114. 실시형태들 64 내지 93 또는 112 내지 113 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 방법은 자동화되는, 클론주 개발의 방법.
실시형태 115. 컴퓨터로 하여금, 클론주 개발을 위한 방법 중 적어도 일부분을 수행하도록 시스템에게 지시하게 하는 프로그램이 저장된 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체로서, 상기 방법은 실시형태들 64 내지 93 또는 112 내지 113 의 방법들 중 어느 하나이며, 상기 시스템은 선택된 격리 펜들의 세트의 각각의 격리 펜 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 미세유체 디바이스로부터 배출하는 것을 포함하여 배출할 때까지, 적어도 스텝들 업 (steps up) 을 수행하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 116. 실시형태 115 의 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체에 있어서, 상기 시스템은 실시형태들 1 내지 11 의 시스템들 중 어느 하나인, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
SEQUENCE LISTING <110> Berkeley Lights Inc. <120> METHODS, SYSTEMS AND DEVICES FOR IN-PEN ASSAYS <130> 1107028.00016 <150> US 62/323,500 <151> 2016-04-15 <150> US 62/364,568 <151> 2016-07-20 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> Xaa is any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(11) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Xaa is any amino acid or absent <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Val Trp Cys Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> Xaa is any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(9) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Xaa is any amino acid or absent <400> 2 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> Xaa is any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ala, Ser, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Trp or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is His or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Leu or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Xaa is any amino acid or absent <400> 3 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> Xaa is any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Ser, Arg, or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Cys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ala, Ser, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Trp or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is His or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Leu or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Glu, Ser, Thr, or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(20) <223> Xaa is any amino acid or absent <400> 4 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(8) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid or absent <400> 5 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Val Trp Cys Xaa 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(6) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid or absent <400> 6 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Xaa 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is any amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Ala, Ser, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Trp or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is His or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Leu or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid or absent <400> 7 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Xaa 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Ser, Arg, or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Ala, Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Trp or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is His or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Leu or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Glu, Ser, Thr, or Val <400> 8 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Xaa 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG binding peptide <400> 9 Asp Ser Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG binding peptide <400> 10 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 11 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG binding aptamer <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(5) <223> Phosphate <220> <221> misc_RNA <222> (6)..(6) <223> 2'-F-RNA Phosphate <220> <221> misc_RNA <222> (7)..(7) <223> Phosphate <220> <221> misc_RNA <222> (8)..(11) <223> 2'F-RNA Phosphate <220> <221> misc_RNA <222> (12)..(19) <223> Phosphate <220> <221> misc_RNA <222> (20)..(23) <223> 2'-F-RNA Phosphate <400> 11 ggaggugcuc cgaaarraac ucc 23

Claims (116)

  1. 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법으로서,
    상기 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 격리 펜으로 도입하는 단계로서, 상기 미세유체 디바이스는 흐름 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 상기 격리 펜은 상기 흐름 영역에 유체 연결되며, 상기 격리 펜은 제 1 유체 매질을 포함하는, 상기 격리 펜으로 도입하는 단계;
    상기 생물학적 마이크로-객체, 또는 상기 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군으로 하여금 상기 피분석물을 상기 격리 펜 내 상기 제 1 유체 매질로 분비하게 하는 단계;
    제 1 시간 기간 동안 제 2 유체 매질을 상기 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 상기 제 2 유체 매질은 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 리포터 분자는 상기 분비된 피분석물에 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 상기 흐름 영역으로 도입하는 단계;
    상기 복수의 리포터 분자들의 부분으로 하여금 상기 격리 펜의 고립 영역으로 확산하게 하여 그 안에 분비된 상기 피분석물에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 리포터 분자: 분비된 피분석물 (RMSA) 착체들을 발생시키는 단계; 및
    상기 미세유체 디바이스 내 관심 영역 내에 위치된 상기 RMSA 착체들과 연관된 신호를 검출하는 단계로서, 상기 관심 영역은 상기 격리 펜의 적어도 일부분을 포함하고 상기 격리 펜과 상기 흐름 영역에 의해 정의되는 확산 축을 따라 연장되며, 상기 신호는 상기 확산 축을 따라 복수의 RMSA 착체들의 확산과 연관된 형광의 공간 분포를 포함하는, 상기 RMSA 착체들과 연관된 신호를 검출하는 단계; 및
    상기 검출된 신호에 기초하여 상기 분비된 피분석물의 상기 분비의 레벨을 평가하는 단계를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 격리 펜은 고립 영역 및 상기 고립 영역을 상기 흐름 영역에 유체 연결하는 접속 영역을 가지며,
    상기 고립 영역 및 상기 접속 영역은 상기 고립 영역에서의 유체 매질의 성분들이 상기 흐름 영역에서의 유체 매질의 성분들과 실질적으로 단지 확산에 의해서만 교환되도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 격리 펜 내 상기 생물학적 마이크로-객체를 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군으로 증식시키는 단계, 및
    선택적으로 상기 흐름 영역을 배양 매질로 관류시키는 단계를 더 포함하며,
    상기 관류시키는 단계는 상기 생물학적 마이크로-객체를 상기 격리 펜으로 도입한 후 그리고 상기 제 2 유체 매질을 상기 흐름 영역으로 도입하기 전에 발생하는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 제 1 유체 매질은 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 매질 성분, 또는 가용성 자극 성분을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 시간 기간은 30 분 내지 60 분인, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    제 2 시간 기간 동안 제 3 유체 매질을 상기 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 상기 제 3 유체 매질은 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 흐름 영역으로 도입하는 단계; 및
    비결합된 리포터 분자들의 적어도 일부분을 상기 격리 펜으로부터 확산시키는 단계를 더 포함하며,
    상기 관심 영역 내에 위치된 상기 RMSA 착체들과 연관된 신호를 검출하는 단계는 상기 격리 펜으로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들의 양이 상기 격리 펜으로부터 확산되는 RMSA 착체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생하는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    (i) 상기 제 2 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들 및 RMSA 착체들에 대한 확산 프로파일들의 모델링에 기초하여 선택되고, 및
    (ii) 상기 제 2 시간 기간은 20 분 내지 50 분인 것
    중 적어도 하나를 특징으로 하는 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 상기 격리 펜 내로부터 상기 흐름 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 상기 격리 펜의 적어도 일부분을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 관심 영역 내에 위치된 상기 RMSA 착체들과 연관된 신호를 검출하는 단계는 상기 관심 영역으로부터 오는 검출가능한 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 검출가능한 신호의 적어도 일부는 상기 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 상기 검출가능한 라벨로부터 방출되는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 관심 영역 내에 위치된 상기 RMSA 착체들과 연관된 신호를 검출하는 단계는:
    상기 생물학적 마이크로-객체를 상기 격리 펜으로 도입하기 이전의 시간에, 상기 관심 영역 내 배경 신호의 강도를 측정하는 단계; 및
    상기 검출가능한 신호의 측정된 상기 강도로부터 상기 배경 신호의 상기 강도를 감산함으로써 배경-감산된 신호 강도를 결정하는 단계를 더 포함하고,
    선택적으로 상기 검출가능한 신호의 상기 측정된 강도는 상기 격리 펜 내에서 관측된 세포들의 수에 대해 정규화되는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    (i) 상기 피분석물의 분비의 상기 레벨을 정량화하는 단계; 및
    (ii) 상기 격리 펜에 대한 분비 스코어를 제공하는 단계
    중 적어도 하나를 더 포함하고,
    상기 분비 스코어는:
    흐름 영역 및 상기 흐름 영역에 유체 흐름 가능하게 연결된 복수의 격리 펜들을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미징 데이터를 수신하는 것으로서, 상기 이미징 데이터는 피분석물 분석 이미지, 및 배경 잡음 이미지 및 신호 참조 이미지 중 하나 또는 양자를 포함하는, 상기 이미징 데이터를 수신하는 것;
    각각의 격리 펜에 대한 관심 영역을 정의하는 것으로서, 상기 관심 영역은 (i) 피분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하거나, (ii) 피분석물 변동들이 측정될 때 상기 격리 펜 내에서의 상기 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하거나, 또는 (iii) 상기 격리 펜과 상기 흐름 영역 사이의 확산 축을 따라서 연장되는 것 중 하나 이상을 포함하는 상기 격리 펜 내 이미지 영역을 포함하는, 상기 정의하는 것; 및
    각각의 격리 펜에 대한 상기 관심 영역의 상기 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석함으로써, 각각의 격리 펜에서의 상기 피분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 것
    에 의해 결정되는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 리포터 분자의 상기 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 또는 적어도 하나의 핵산 중 하나 이상; 및 펩티드 또는 단백질, SEQ ID 번호들: 1 내지 10 중 어느 하나의 시퀀스를 가지는 펩티드, 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편 또는 압타머 중 하나 이상을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비되는 상기 피분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세유체 디바이스는 복수의 격리 펜들을 포함하고,
    생물학적 마이크로-객체는 상기 복수의 격리 펜들 중 적어도 2개의 격리 펜들로 도입되며,
    상기 방법의 나머지는 상기 적어도 2개의 격리 펜들의 각각에 대해 수행되고,
    상기 복수의 격리 펜들 중 상기 적어도 2개의 격리 펜들의 격리 펜들에 대한 분비의 레벨을 비교하는 단계를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 적어도 2개의 격리 펜들 중 하나 이상을 선택하는 단계; 및
    선택된 상기 격리 펜들의 각각으로부터 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 배출시키는 단계를 더 포함하고,
    상기 선택된 격리 펜들의 각각으로부터의 상기 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들은 상기 미세유체 디바이스로부터 추가로 배출되는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 피분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 피분석물 변동들이 측정될 때 상기 격리 펜 내 상기 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하고, 그리고 상기 격리 펜과 상기 흐름 영역 사이의 상기 확산 축을 따라서 연장되는 상기 격리 펜 내 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 방법은 자동화되는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  18. 컴퓨터로 하여금, 제 16 항에 기재된 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법을 수행하도록 시스템에게 지시하게 하는 프로그램이 저장된, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
  19. 제 2 항에 있어서,
    상기 흐름 영역은 미세유체 채널을 포함하고,
    상기 접속 영역은 20 마이크론 내지 100 마이크론의 폭 (Wcon) 을 갖는 상기 미세유체 채널에 대한 근위 개구 및 상기 고립 영역에 대한 원위 개구를 포함하며,
    상기 근위 개구로부터 상기 원위 개구까지의 상기 접속 영역의 길이 (Lcon) 는 상기 접속 영역의 상기 근위 개구의 폭 (Wcon) 의 적어도 1.0 배이고,
    선택적으로, 상기 접속 영역의 길이 (Lcon) 는 상기 접속 영역의 상기 근위 개구의 폭 (Wcon) 의 적어도 1.5 배, 또는 적어도 2.0 배인, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    (i) 상기 접속 영역의 상기 근위 개구의 폭 (Wcon) 은 20 마이크론 내지 100 마이크론이고,
    (ii) 상기 접속 영역의 길이 (Lcon) 은 20 마이크론과 내지 500 마이크론 사이이며, 및
    (iii) 상기 격리 펜의 체적은 5 x 105 내지 1 x 107 세제곱 마이크론인 것
    중 적어도 하나를 특징으로 하는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 흐름 영역은 상기 격리 펜이 개방되는 미세유체 채널을 포함하고,
    (i) 상기 접속 영역의 상기 근위 개구에서의 상기 미세유체 채널의 폭은 50 마이크론과 500 마이크론 사이이고, 및
    (ii) 상기 접속 영역의 상기 근위 개구에서의 상기 미세유체 채널의 높이는 20 마이크론과 100 마이크론 사이인 것
    중 적어도 하나를 특징으로 하는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 마이크로-객체는 진핵 세포, 선택적으로 포유동물 세포 또는 곰팡이 세포인, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서,
    상기 검출가능한 라벨은 형광 라벨인, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서,
    상기 분비된 피분석물은 상기 리포터 분자들의 분자량의 크기의 적어도 2 배의 분자량을 갖는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서,
    상기 복수의 RMSA 착체들은 복수의 가용성 RMSA 착체들을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  26. 제 1 항에 있어서,
    상기 RMSA 착체들과 연관된 신호를 검출하는 단계는,
    선택된 시점에서 이미지를 획득하는 단계로서, 상기 격리 펜으로부터 확산하거나 또는 이미 확산된 비결합된 리포터 분자들의 퍼센티지가 임계값을 초과하여, 각각의 격리 펜 내의 비결합된 리포터 대신 RMSA 착체로부터 검출가능한 신호의 이미징을 가능하게 하는, 상기 이미지를 획득하는 단계를 포함하는,
    생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
  27. 미세유체 디바이스 내에 배치된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을, 상기 미세유체 디바이스 내에서 평가하는 방법으로서,
    생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들로부터, 상기 피분석물을 상기 미세유체 디바이스의 격리 펜 내 제 1 유체 매질로 분비하는 단계로서, 상기 미세유체 디바이스는 흐름 영역을 가지는 인클로저를 포함하고, 상기 격리 펜은 하나의 개구에 의해 상기 흐름 영역에 유체 연결되는, 상기 분비하는 단계;
    제 1 시간 기간 동안 제 2 유체 매질을 상기 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 상기 제 2 유체 매질은 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 리포터 분자는 상기 분비된 피분석물에 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 흐름 영역으로 도입하는 단계;
    상기 복수의 리포터 분자들의 부분을 상기 격리 펜의 고립 영역으로 확산하는 단계;
    확산된 리포터 분자들을 상기 격리 펜 내 상기 제 1 유체 매질 내에서 분비된 상기 피분석물에 결합하고, 이에 의해 복수의 리포터 분자들: 분비된 피분석물 (RMSA) 착체들을 발생시키는 단계;
    관심 영역 내에 위치된 상기 RMSA 착체들과 연관된 신호를 검출하는 단계로서, 상기 관심 영역은 상기 격리 펜의 적어도 일부분을 포함하고 상기 격리 펜과 상기 흐름 영역에 의해 정의되는 확산 축을 따라 연장되며, 상기 신호는 상기 확산 축을 따라 복수의 RMSA 착체들의 확산과 연관된 형광의 분포를 포함하는, 상기 신호를 검출하는 단계를 포함하는,
    상기 미세유체 디바이스 내에 배치된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을, 상기 미세유체 디바이스 내에서 평가하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 관심 영역 내에 위치된 상기 RMSA 착체들과 연관된 신호를 검출하는 단계는 상기 관심 영역으로부터 오는 검출가능한 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 검출가능한 신호의 적어도 일부는 상기 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 상기 검출가능한 라벨로부터 방출되는,
    상기 미세유체 디바이스 내에 배치된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을, 상기 미세유체 디바이스 내에서 평가하는 방법.
  29. 제 27 항에 있어서,
    배양 매질로 상기 흐름 영역을 관류시키는 단계를 더 포함하고, 상기 관류시키는 단계는 상기 제 2 유체 매질을 상기 흐름 영역으로 도입하기 전에 발생하는,
    상기 미세유체 디바이스 내에 배치된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을, 상기 미세유체 디바이스 내에서 평가하는 방법.
  30. 제 27 항에 있어서,
    상기 제 1 시간 기간은 30 분 내지 60 분인,
    상기 미세유체 디바이스 내에 배치된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을, 상기 미세유체 디바이스 내에서 평가하는 방법.
  31. 제 27 항에 있어서,
    제 2 시간 기간 동안 제 3 유체 매질을 상기 흐름 영역으로 도입하는 단계로서, 상기 제 3 유체 매질은 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 도입하는 단계; 및
    비결합된 리포터 분자들의 적어도 일부분을 상기 격리 펜으로부터 확산시키는 단계를 더 포함하며,
    상기 관심 영역 내에 위치된 상기 RMSA 착체들과 연관된 신호를 검출하는 단계는 상기 격리 펜으로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들의 양이 상기 격리 펜으로부터 확산되는 RMSA 착체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생하는,
    상기 미세유체 디바이스 내에 배치된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을, 상기 미세유체 디바이스 내에서 평가하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    상기 제 2 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들 및 RMSA 착체들에 대한 확산 프로파일들의 모델링에 기초하여 선택되는,
    상기 미세유체 디바이스 내에 배치된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을, 상기 미세유체 디바이스 내에서 평가하는 방법.
  33. 제 27 항에 있어서,
    상기 리포터 분자의 상기 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함하는,
    상기 미세유체 디바이스 내에 배치된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을, 상기 미세유체 디바이스 내에서 평가하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 리포터 분자의 상기 결합 성분은 SEQ ID 번호들: 1 내지 10 중 어느 하나의 시퀀스를 가지는 펩티드를 포함하는,
    상기 미세유체 디바이스 내에 배치된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 피분석물의 분비의 레벨을, 상기 미세유체 디바이스 내에서 평가하는 방법.

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