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CN109952106B - 在微流体装置中分选t淋巴细胞 - Google Patents

在微流体装置中分选t淋巴细胞 Download PDF

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CN109952106B CN201780057785.8A CN201780057785A CN109952106B CN 109952106 B CN109952106 B CN 109952106B CN 201780057785 A CN201780057785 A CN 201780057785A CN 109952106 B CN109952106 B CN 109952106B
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P·J·比米勒
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Abstract

提供了在微流体装置中分选T淋巴细胞的方法。该方法可以包括使包含T淋巴细胞的流体样品流过包含柱阵列的微流体装置的区域。柱阵列可以配置成具有临界尺寸(Dc)，其将活化的T淋巴细胞与未经免疫的T淋巴细胞分开。还提供了具有柱阵列的微流体装置，柱阵列被配置成将活化的T淋巴细胞与未经免疫的T淋巴细胞分开；富含T淋巴细胞的组合物，特别是已知对目标抗原具有反应性的活化的T淋巴细胞；以及通过施用这样的组合物治疗患有致病性病症或癌症的受试者的方法。

Description

在微流体装置中分选T淋巴细胞
相关申请的交叉引用
本申请依据35 U.S.C.§119要求2016年7月21日提交的美国专利申请号62/365,372的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。
发明领域
本领域总体而言涉及在微流体环境中分选T淋巴细胞(特别是活化的T淋巴细胞)的方法、系统和装置。
发明背景
免疫疗法是使用患者自身的免疫系统帮助对抗癌症的迅速发展的领域。已经评估了多种免疫疗法策略，包括刺激患者自身的免疫系统以攻击癌细胞或从外部来源施用免疫系统组分。例如，被设计用于体内攻击癌细胞的单克隆抗体已经单独或在基因工程构建体中施用。此外，已经研究了各种T细胞疗法。自体同源T细胞疗法涉及从受试者获得T细胞、离体扩增T细胞和将扩增的T细胞重新引入到受试者体内。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法涉及将T细胞基因工程化，以在其表面上表达含有嵌合抗体的融合蛋白，其靶向所讨论的癌症并允许T细胞杀死癌细胞。两种类型的T细胞疗法都具有优势。然而，疗法仍需要进一步改进。
自体同源T细胞疗法和CAR-T疗法中的关键问题之一是缺乏以产生具有最高肿瘤杀伤潜力的T细胞群的方式离体选择T细胞的方法。本发明的实施方案提供了用于离体分选T细胞以获得富含具有所需表型的T细胞的群的解决方案。本发明的实施方案还提供了促进这种分选的微流体装置和由其获得的组合物。
发明内容
在一个方面，提供了基于T淋巴细胞的尺寸在微流体装置中分选T淋巴细胞的方法。该方法可包括产生富含特异性识别目标抗原的活化的T淋巴细胞的样品。微流体装置可包括具有第一区域的流动路径，第一区域包括第一柱阵列。第一区域可以是通道(例如，主通道)，并且第一柱阵列可以在通道的整个宽度上延伸。该方法包括使包含T淋巴细胞的流体样品流过微流体装置的流动路径(或通道)的第一区域，并因此通过第一柱阵列。
第一阵列的特征在于临界尺寸(Dc)为约4微米至约10微米。第一阵列的柱可以布置成行和列，其中柱的行限定第一阵列方向，该第一阵列方向与第一区域的第一方向相差倾斜角(ε)，其中第一区域的第一方向由流体流过第一区域的总方向限定。第一阵列中柱的列可以周期性地重复，周期等于1/ε，其中ε以弧度测量。第一阵列中的每个相应列中的相邻柱限定了流体可以由其流过的间隙，通常相对于列是横向的。柱的列可以相对于第一区域的第一方向基本上横向地布置(例如，柱的每列可以沿着相对于第一区域的第一方向约80°至约100°定向的轴布置)，或者更一般地，柱的列可以沿着相对于第一区域的第一方向约45°至约135°定向的轴布置。
含有T淋巴细胞的流体样品可包括例如CD8+ T淋巴细胞。流体样品可以源自已经与包含目标抗原的活化剂一起温育的T淋巴细胞的起始群。活化剂可以是例如树突细胞(DC)或人工抗原呈递细胞(aAPC)。T淋巴细胞的起始群可以从例如外周血或PBMC获得。任选地，T淋巴细胞的起始群可以富集未经免疫的T细胞(例如，CD8+未经免疫的T细胞)。例如，T淋巴细胞的起始群可包含30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的未经免疫的T细胞(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多未经免疫的CD8+ T细胞)。
该方法可用于例如鉴定具有对目标抗原具有特异性的TCR的T细胞。目标抗原可以是源自病原体的肽序列，例如细菌病原体、真菌病原体、寄生病原体或病毒病原体。或者，目标抗原可以是作为肿瘤相关抗原的肽序列。可以克隆鉴定的T细胞，并且可以将来自一个或多个这样的克隆的细胞子组用于TCR测序分析。或者/另外，所述方法可用于分离适合(或在扩增时适合)用作内源性T细胞治疗剂的活化T细胞群。
在另一方面，提供了适用于分选T淋巴细胞的微流体装置。微流体装置可包括具有第一区域的流动路径，第一区域包括第一柱阵列，流动路径的第一区域具有对应于流体流过第一区域的总方向的第一方向。第一区域可以是通道(例如，主通道)，并且第一柱阵列可以在通道的整个宽度上延伸。第一阵列的特征在于临界尺寸(Dc)为约4微米至约7微米，或约7微米至约10微米。第一阵列的柱可以布置成行和列，第一阵列中柱的行限定第一阵列方向，该第一阵列方向与第一区域的第一方向相差倾斜角(ε)。第一阵列中柱的列可以周期性地重复，周期等于1/ε，其中ε以弧度测量。第一阵列中的每个相应列中的相邻柱限定了流体可以由其流过的间隙，通常相对于列是横向的。柱的列可以相对于第一区域的第一方向基本上横向地布置(例如，柱的每列可以沿着相对于第一区域的第一方向约80°至约100°定向的轴布置)，或者更一般地，柱的列可以沿着相对于第一区域的第一方向约45°至约135°定向的轴布置。
微流体装置的流动路径可包括接收穿过第一区域的流体的第二区域，并且第二区域可包括将第二区域分成第一通道和第二通道的分隔器。第一通道可以接收穿过第一区域的任何流体的第一部分，并且第二通道可以接收穿过第一区域的任何流体的第二部分。第一通道或第二通道可包括第二柱阵列。微流体装置还可包括一个或多个隔离坞，每个隔离坞可具有通向第一通道或第二通道的开口。
在另一方面，提供了包含T淋巴细胞，特别是已根据本文公开的任何一种方法分选/富集的T淋巴细胞的组合物。如上所述，这样的组合物可适合用作内源性T细胞治疗剂，或用作产生这种治疗剂的起始材料。
另外的方面、目的和优点将部分地在下文的描述中给出，并且部分地将从描述中显而易见，或者可以通过实践来学习。通过在所附权利要求中特别指出的要素和组合将实现和获得这些方面、目的和优点。
应当理解，前文的概述和下文的详细描述都只是示例性和说明性的，并不是对权利要求的限制。
包含在本说明书中并构成其一部分的附图示出了一个(几个)实施方案，并与说明书一起用于解释本文所述的原理。
附图简要说明
图1示出根据某些实施方案的用于操作和监测微流体装置的系统的实例。
图2A和2B示出了根据某些实施方案的微流体装置。
图2C和2D示出了根据某些实施方案的隔离坞。
图2E示出了根据某些实施方案的详细的隔离坞。
图2F示出了根据某些实施方案的微流体装置。
图3示出了根据某些实施方案的巢，其可以是用于操作和监测微流体装置的系统的一部分。
图4示出了根据某些实施方案的成像装置，其可以是用于操作和监测微流体装置的系统的一部分。
图5示出了根据某些实施方案的具有涂层材料的微流体装置，所述涂层材料共价结合到衬底和装置盖的内表面。
图6是根据某些实施方案的可以包括在微流体装置中的柱阵列的示意图。
图7A和7B示出了根据某些实施方案的具有柱阵列的微流体装置。
图8是具有柱阵列的微流体装置的一部分的图像，柱阵列被配置成将活化的“大”T淋巴细胞与活化的“小”T淋巴细胞分离，并且T淋巴细胞被荧光标记以允许它们在阵列内进行检测。
图9A-9D描绘了使用具有柱阵列的微流体装置在分选之前和之后对T淋巴细胞群(包括活化的T淋巴细胞和静息的T淋巴细胞)的FACS分析产生的细胞计数图。
图10是微流体装置的一部分的图像，其具有位于柱阵列下游的第一和第二通道，所述柱阵列配置成将大于柱阵列的临界尺寸(Dc)的细胞分离到第二通道中，其中微流体装置进一步包括通向第二通道的隔离坞。
图11是概述根据某些实施方案的富集T淋巴细胞的方法的流程图。
具体实施方式
本说明书描述了本发明的示例性实施方案和应用。然而，本发明不限于这些示例性实施方案和应用，也不限于示例性实施方案和应用在本文中操作或描述的方式。此外，附图可以示出简化或局部视图，并且附图中的要素的尺寸可能被夸大或者不成比例。另外，由于本文使用术语“在......上”、“附接到”、“连接到”、“耦合到”或类似的词，一个要素(例如，材料、层、衬底等)可以“在另一要素上”、“附接到另一要素”、“连接到另一要素”或“耦合到另一要素”，而不论该一个要素是直接在该另一要素上、附接到该另一要素、连接到该另一要素或耦合到该另一要素，还是在该一个要素和该另一元素之间有一个或多个间隔要素。在提及要素列表(例如，要素a、b、c)的情况下，这样的提及旨在包括所列要素本身中的任何一个、少于所有列出的要素的任何组合和/或所有列出的要素的组合。说明书中的章节划分仅为了便于审查，并不限制所讨论要素的任何组合。
如本文所用，“基本上”意指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许由绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等的微小的、无关紧要的变化，例如本领域普通技术人员所预期但不明显影响整体性能的变化。当与数值或者可以表示为数值的参数或特性相关地使用时，“基本上”意味着在百分之十之内。
如本文所用，术语“一”意味着不止一个。如本文所用，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
如本文所用，术语“置于”在其含义内包括“位于”。
如本文所用，“微流体装置”或“微流体设备”是这样的装置：其包括一个或多个分离的微流体管路，所述微流体管路被配置为容纳流体，每个微流体管路包括流体互连的管路元件，包括但不限于区域、流动路径、通道、腔室和/或坞；以及至少两个端口，所述端口被配置为允许流体(以及任选地悬浮在流体中的微物体)流入和/或流出微流体装置。通常，微流体装置的微流体管路将包括至少一个微流体通道和至少一个腔室，并且将容纳小于约1mL(例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2μL)的流体体积。在某些实施方案中，微流体管路容纳约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μL。
如本文所用，“纳米流体装置”或“纳米流体设备”是一种具有微流体管路的微流体装置，所述微流体管路含有至少一个管路元件，所述管路元件被配置为容纳小于约1μL的流体体积，例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nL或更少。通常，纳米流体装置将包括多个管路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多)。在某些实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约100pL至1nL、100pL至2nL、100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或1至50nL的流体体积。在其他实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL、或250至750nL的流体体积。
如本文所用的“微流体通道”或“通道”是指微流体装置的流动区域，其长度显著长于水平和垂直尺寸。通道的长度通常由通道的流动路径限定。在直通道的情况下，长度将是通道的“纵轴”。通道的“水平尺寸”或“宽度”是在垂直于通道的纵轴定向的横截面中观察到的水平尺寸(或者，如果通道是弯曲的，则在横截面平面上垂直于与通道的流动路径相切的轴线)。通道的“垂直尺寸”或“高度”是在垂直于通道的纵轴定向的横截面中观察到的垂直尺寸(或者，如果通道是弯曲的，则在横截面平面上垂直于与通道的流动路径相切的轴线)。例如，流动通道可以是水平或垂直尺寸的长度的至少5倍，例如，长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少500倍、长度的至少1,000倍、长度的至少5,000倍，或更长。在一些实施方案中，流动通道的长度在约100,000微米至约500,000微米的范围内，包括其间的任何范围。在一些实施方案中，水平尺寸(或宽度)在约100微米至约1000微米(例如，约150至约500微米)的范围内，并且垂直尺寸(或高度)在约25微米至约200微米的范围内，例如，约40到约150微米。应当注意，流动通道可以在微流体装置中具有各种不同的空间配置，因此不限于完美线性的元件。例如，流动通道可以是或包括具有以下配置的一个或多个部分：曲线、弯曲、螺旋、倾斜、下降，叉状(例如，多个不同的流动路径)，及其任何组合。另外，流动通道沿其路径可以具有不同的横截面积，加宽和收缩以在其中提供所需的流体流动。
如本文所用，术语“障碍物”通常是指凸起或类似类型的结构，其足够大以便部分地(但不完全地)阻碍目标微物体在微流体装置中的两个不同区域或管路元件之间的移动。两个不同的区域/管路元件可以例如是微流体隔离坞和微流体通道，或者是微流体隔离坞的连接区域和分离区域。
如本文所用，术语“收缩”通常是指微流体装置中的管路元件(或两个管路元件之间的界面)的宽度变窄。收缩可以位于例如微流体隔离坞和微流体通道之间的界面处，或者微流体隔离坞的分离区域和连接区域之间的界面处。
如本文所用，术语“透明”是指允许可见光通过而在通过时基本上不改变光的材料。
如本文所用，术语“微物体”通常是指可以根据本公开分离和收集的任何微观物体。微物体的非限制性实例包括：无生命的微物体，例如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠、LuminexTM珠等)；磁珠；微米棒；微丝；量子点等；生物微物体，例如细胞(如胚胎、卵母细胞、精子细胞、从组织中解离的细胞、真核细胞、原生生物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、免疫细胞、杂交瘤、培养的细胞、来自细胞系的细胞、癌细胞、感染的细胞、转染和/或转化的细胞、报告细胞、原核细胞等)；生物细胞器；囊泡或复合物；合成囊泡；脂质体(例如，合成的或衍生自膜制品)；脂质纳米筏(nanoraft)(如Ritchie et al.(2009)“Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs,”Methods Enzymol.,464:211-231中所述)等；或无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附着于细胞的微珠、脂质体涂布的微珠、脂质体涂布的磁珠等)。珠子可以进一步具有共价或非共价连接的其他部分/分子，例如荧光标志物、蛋白质、小分子信号传导部分、抗原或能够用于测定的化学/生物物质。
如本文所用，术语“T淋巴细胞”和“T细胞”互换使用。
如本文所用，术语“维持(一个或多个)细胞”是指提供包含流体和气体组分以及任选的表面的环境，其提供保持细胞存活和/或扩增所必需的条件。
流体介质(fluidic media)的“组分”是介质中存在的任何化学或生物化学分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、脂肪酸、胆固醇、代谢物等。
如本文关于流体介质所用，“扩散(diffuse)”和“扩散(diffusion)”是指流体介质的组分沿着浓度梯度向下的热力学运动。
短语“介质的流动”意味着流体介质主要是由于除扩散之外的任何机制的整体移动。例如，介质的流动可以包括流体介质由于点之间的压力差而从一个点移动到另一个点。这样的流动可包括液体的连续、脉冲、周期性、随机、间歇或往复流动，或其任何组合。当一种流体介质流入另一种流体介质时，可能导致介质的湍流和混合。
短语“基本上没有流动”是指流体介质的流速，其随时间平均小于材料的组分(例如，目标分析物)扩散到流体介质中或在流体介质内扩散的速率。这样的材料的组分的扩散速率可以取决于例如温度、组分的尺寸以及组分和流体介质之间的相互作用的强度。
如本文关于微流体装置内的不同区域所用，短语“流体连接”是指当不同区域基本上充满流体(例如流体介质)时，每个区域中的流体被连接以形成单一的液体。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在组成上必然相同。相反，微流体装置的不同流体连接的区域中的流体可以具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，例如蛋白质、糖、离子或其他分子)，当溶质沿着其各自的浓度梯度向下移动和/或流体流过装置时，这些组成处于变化中。
微流体(或纳米流体)装置可以包括“扫过”区域和“未扫过”区域。如本文所用，“扫过”区域包括微流体管路的一个或多个流体互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件经受介质的流。扫过区域的管路元件可以包括例如区域、通道以及全部或部分腔室。如本文所用，“未扫过”区域包括微流体管路的一个或多个流体互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件基本上不经受流体的流动。未扫过区域可以流体连接到扫过区域，条件是流体连接被构造成在扫过区域和未扫过区域之间能够实现扩散但基本上没有介质流动。因此，微流体装置可以被构造成基本上将未扫过区域与扫过区域中的介质流分离，同时在扫过区域和未扫过区域之间基本上仅能够实现扩散性流体连通。例如，微流体装置的流动通道是扫过区域的示例，而微流体装置的分离区域(下文进一步详细描述)是未扫过区域的示例。
如本文所用，“流动路径”是指一个或多个流体连接的管路元件(例如，通道、区域、腔室等)，其限定并受限于介质流动的轨迹。因此，流动路径是微流体装置的扫过(swept)区域的示例。其他管路元件(例如，未扫过(unswept)区域)可以与包括流动路径的管路元件为流体连接，而不受流动路径中的介质流动的影响。
可以在这种微流体装置中测定生物微物体(例如，生物细胞)产生特定生物材料(例如，蛋白质，例如抗体)的能力。在测定的一个具体实施方案中，可以将包含待测定用于产生目标分析物的生物微物体(例如细胞)的样品材料加载到微流体装置的扫过区域中。可以选择具有特定特征的那些生物微物体(例如哺乳动物，例如人细胞)并将其置于未扫过区域中。然后，可以使剩余的样品材料从扫过区域流出，并使测定材料流入到扫过区域中。因为所选择的生物微物体处于未扫过区域中，所以所选择的生物微物体基本上不受剩余样品材料的流出或测定材料的流入的影响。可以允许所选择的生物微物体产生目标分析物，其可以从未扫过区域扩散到扫过区域中，其中目标分析物可以与测定材料反应以产生局部的可检测的反应，每个反应可以与特定的未扫过区域相关联。可以分析与检测到的反应相关的任何未扫过区域，以确定未扫过区域中的哪些生物微物体(如果有的话)是足够的目标分析物的生产者。
在微流体/纳米流体装置中培养、选择和扩增T淋巴细胞。例如在2016年4月22日提交的美国专利申请号15/135,707中已经描述了在微流体装置内选择和扩增生物细胞(包括T淋巴细胞)的方法，其全部内容通过引用并入本文。在2017年3月16日提交的国际申请号PCT/US 17/22846中描述在微流体装置内活化和扩增T淋巴细胞的方法，其全部内容通过引用并入本文。
微流体装置和用于操作和观察这种装置的系统。图1示出了可以用于操作和观察微流体装置的微流体装置100和系统150的概括性实例。示出了微流体装置100的透视图，其盖110被部分切除以提供微流体装置100中的局部视图。微流体装置100通常包括具有流动路径106的微流体管路120，流体介质180可以任选地携带一个或多个微物体(未示出)经过流动路径106流入和/或流过微流体管路120。虽然在图1中示出了单个微流体管路120，但合适的微流体装置可以包括多个(例如，2或3个)这种微流体管路。无论如何，微流体装置100可以被配置为纳米流体装置。在图1所示的实施方案中，微流体管路120包括多个微流体隔离坞124、126、128和130，其中每个具有与流动路径106流体连通的单个开口。如下文进一步讨论的，微流体隔离坞包括已被优化用于即使当介质180流过流动路径106时，仍然将微物体保留在微流体装置(例如微流体装置100)中的各种特征和结构。然而，在描述上述之前，提供了对微流体装置100和系统150的简要说明。
如图1中大体示出的，微流体管路120由外壳102来限定。尽管外壳102可以物理地构造成不同的配置，但是在图1所示的实例中，外壳102被描绘为包括支撑结构104(例如，基部)、微流体管路结构108和盖110。支撑结构104、微流体管路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体管路结构108可以被布置在支撑结构104的内表面109上，并且盖110可以被布置在微流体管路结构108上方。微流体管路结构108与支撑结构104和盖110一起，可以限定微流体管路120的元件。
如图1所示，支撑结构104可以位于微流体管路120的底部，盖110可以位于微流体管路120的顶部。或者，支撑结构104和盖110可以以其他取向来配置。例如，支撑结构104可以位于微流体管路120的顶部，盖110可以位于微流体管路120的底部。无论如何，可以存在一个或多个端口107，其每个均包括进入或离开外壳102的通路。通路的实例包括阀、门、通孔等。如图所示，端口107是由微流体管路结构108中的间隙产生的通孔。然而，端口107可以位于外壳102的其他组件(例如盖110)中。图1中仅示出了一个端口107，但微流体管路120可以具有两个或更多个端口107。例如，可以存在第一端口107，其用作流体进入微流体管路120的入口，并且可以存在第二端口107，其用作流体离开微流体管路120的出口。端口107是用作入口还是出口可以取决于流体流过流动路径106的方向。
支撑结构104可包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似特性的材料。在一些实施方案中，支撑结构104可包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如PDMS。在一些实施方案中，支撑结构104可包括刚性和可变形材料。
支撑结构104可以包括一个或多个电极(未示出)和衬底或多个互连的衬底。例如，支撑结构104可以包括一个或多个半导体衬底，每个半导体衬底电连接到电极(例如，半导体衬底的全部或一部分可以电连接到单个电极)。支撑结构104可以进一步包括印刷电路板组件(“PCBA”)。例如，半导体衬底可以安装在PCBA上。然而，支撑结构104不需要含有任何电极或半导体衬底。
微流体管路结构108可以限定微流体管路120的管路元件。当微流体管路120填充有流体时，这样的管路元件可以包括可以流体互连的空间或区域，例如流动通道或腔室(它们任何一个可以包括柱阵列(例如由微流体管路结构108形成))、坞(pen)、阱(trap)等。在图1所示的微流体管路120中，微流体管路结构108包括框架114和微流体管路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体管路材料116。框架114可以是例如基本上包围微流体管路材料116的相对刚性的结构。例如，框架114可以包括金属材料。
微流体管路材料116可以用空腔等进行图案化，以限定微流体管路120的管路元件(包括柱阵列，未示出)和互连。微流体管路材料116可包括柔性材料，例如柔性聚合物(例如橡胶、塑料、弹性体、硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)等)，其可以是透气性的。可以构成微流体管路材料116的材料的其他实例包括模制玻璃；可蚀刻材料，例如硅氧烷(例如，可光图案化的硅氧烷或“PPS”)、光致抗蚀剂(例如，SU8)等。在一些实施方案中，此类材料(以及因此微流体管路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体管路材料116可以被布置在支撑结构104上和框架114内。
盖110可以是框架114和/或微流体管路材料116的集成(integral)部件。或者，盖110可以是结构上不同的元件，如图1所示。盖110可以包括与框架114和/或微流体管路材料116相同或不同的材料。类似地，支撑结构104可以是与框架114或微流体管路材料116分开的结构(如图所示)，或者是框架114或微流体管路材料116的集成部件。同样地，框架114和微流体管路材料116可以是如图1所示的分离结构或同一结构的集成部件。
在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似性质的材料。在一些实施方案中，盖110可以包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如PDMS。在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料和可变形材料两者。例如，盖110的一个或多个部分(例如，位于隔离坞124、126、128、130上方的一个或多个部分)可以包括与盖110的刚性材料交界的可变形材料。在一些实施方案中，盖110可以进一步包括一个或多个电极。该一个或多个电极可以包括导电氧化物，例如氧化铟锡(ITO)，其可以涂覆在玻璃或类似的绝缘材料上。或者，该一个或多个电极可以是柔性电极，例如嵌入在可变形材料例如聚合物(例如PDMS)中的单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合。已经在例如US 2012/0325665(Chiou等人)中描述了可以用于微流体装置中的柔性电极，其内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，可以修饰盖110(例如，通过调节向内朝向微流体管路120的表面的全部或一部分)以支持细胞粘附、活力和/或生长。该修饰可以包括合成或天然聚合物的涂层。在一些实施方案中，盖110和/或支撑结构104可以是透光的。盖110还可包括至少一种可透气的材料(例如，PDMS或PPS)。
微流体装置的流动路径可包括第一区域，第一区域包括柱阵列。第一区域由一对壁(例如，第一侧壁和第二侧壁)界定，这对壁一起限定第一方向，其对应于预期的流动路径的第一区域中流体流动的方向。柱阵列中的柱可以布置成行和列，总体如图6所示。柱的行可以限定第一阵列方向，该第一阵列方向与第一区域的第一方向相差倾斜角(ε)，第一阵列中柱的列周期性地重复，周期等于1/ε，其中ε以弧度测量。第一阵列中的每个相应列中的相邻柱限定了流体可以由其流过的间隙，通常相对于列是横向的。通常，柱阵列的列中的相邻柱之间的间隙将具有特征尺寸。如本文所用，关于柱阵列的列中相邻柱之间的间隙，该术语“特征尺寸”是指对于柱阵列中的大多数间隙是相同(+/-5％)的尺寸。换句话说，柱阵列的列中相邻柱之间的间隙的至少50％可具有特征尺寸。更通常，柱阵列的列中相邻柱之间的间隙的至少60％、70％、80％、90％、95％或更多可以具有特征尺寸。
阵列的柱通常可以称为障碍物。例如，在美国专利号7,150,812和8,783,467中已经描述了障碍物/柱阵列，其内容通过引用整体并入本文。
柱阵列通常将在流动路径的第一区域的整个宽度上延伸。微流体装置可具有一个或多个用作入口的端口和一个或多个用作出口的端口。例如，如图7B所示，第一区域706上游的端口可以用作入口702，而第一区域706下游的端口可以用作出口708/710。或者，如图7A所示，位于第一区域上游的一对端口可以用作微流体装置的入口702和704(例如，第一上游端口702可以提供包含细胞(例如T淋巴细胞)的流体样品流，而第二上游端口704可以提供缺乏细胞的培养基或缓冲液流)。类似地，位于下游的一对端口708和710可允许流体流动离开微流体装置。例如，第一下游端口708可以提供富集所需细胞(特别是活化的T淋巴细胞)群流体的出口，并且第二下游端口710可以提供废物出口。在一些实施方案中，废物流可以来自旁路通道。
柱阵列的特征通常可以是临界尺寸(Dc)，其可以是约3微米至约15微米(例如，约4微米至约10微米或约7微米至约12微米)。在一些实施方案中，阵列的特征在于Dc为约4微米至约7微米(例如，约4微米至约5微米、约4.5微米至约5.5微米、约5微米至约6微米、约5.5微米至约6.5微米、约6微米至约7微米，或由前述端点限定的任何范围)。在其他实施方案中，阵列的特征在于Dc为约7微米至约10微米(例如，约7微米至约8微米、约7.5微米至约8.5微米、约8微米至约9微米、约8.5微米至9.5微米、约9微米至约10微米，或由前述端点限定的任何范围)。重要的是，可以选择Dc，使得通常直径小于活化的T淋巴细胞的未经免疫的T淋巴细胞将主要以流体流动的总方向流过柱阵列，而活化的T淋巴细胞将以第一阵列的行限定的第一阵列方向行进。以这种方式，流过柱阵列的流体可以富集活化的T淋巴细胞。如本文所用，“富集的”意指与流体移动通过柱阵列之前该部分流体中目标细胞的比例相比，该部分流体中这种目标细胞的比例由于移动通过柱阵列而增加。富集量可以以不同方式计算。例如，一个简单的测量方式是移动通过柱阵列后的流体部分中活化的T淋巴细胞的百分比除以即将进入柱阵列之前的流体部分中活化的T淋巴细胞的百分比。或者，可以将富集计算为(N+ 离开/N- 离开)/(N+ 进入/N- 进入)，其中N+ 离开是移动通过柱阵列之后流体部分中检测到的目标细胞的数量，N- 离开是移动通过柱阵列之后流体部分中检测到的目标细胞之外的细胞数量，N+ 进入是移动通过柱阵列之前流体部分中检测到的目标细胞的数量，N- 进入是移动通过柱阵列之前流体部分中检测到的目标细胞之外的细胞数量。富集的精确计算并不重要。例如，可以使用前述定义中的任一个，并且只要至少一个计算指示富集，则已经移动通过柱阵列的流体部分将被认为是富集的。
在某些实施方案中，阵列的倾斜角ε为约1/3弧度至约1/100弧度(例如，约1/5弧度至约1/20弧度，或约1/10弧度至约1/16弧度)。
第一阵列的每列中相邻柱之间的间隙可为约15微米至约100微米(例如，约20微米至约30微米、约25微米至约35微米、约30微米至约40微米、约35微米至约45微米、约40微米至约50微米、约45微米至约55微米、约50微米至约60微米、约55微米至约65微米、约60微米至约70微米、约65微米至约约75微米、约70微米至约90微米、约80微米至约100微米，或由前述端点限定的任何范围)。在某些特定实施方案中，间隙可为约15微米至约30微米、约20微米至约35微米或约25微米至约40微米。
通常，第一阵列的同一列中相邻柱之间的间隙尺寸基本相等，尺寸等于特征尺寸。但是，允许例外。特别地，最靠近界定包含柱阵列的区域的侧壁的相邻柱(在同一列中)之间的间隙尺寸可以偏离特征尺寸。如本领域技术人员将理解的，间隙尺寸的这种偏差可以设计成减小由侧壁和紧邻这些壁的柱之间的间隔引起的流过阵列的流体流的边界不规则性。
在某些实施方案中，阵列的柱具有圆形横截面。或者，第一阵列的柱的横截面为多边形，例如三角形、正方形、菱形、平行四边形、五边形、六边形等，或者甚至是不规则形状。通常，阵列中的柱将具有相同的方向(当在相对于阵列的第一方向的横截面中观察时)。在某些实施方案中，多边形/不规则形状的柱相对于由第一方向限定的轴不对称地定向。以这种方式，柱可以被定向成使得没有柱的横截面形状中的对称轴平行于由阵列的第一方向限定的轴。
第一阵列的柱可具有约30微米至约100微米的直径(例如，约30微米至约50微米、约30微米至约60微米、约30微米至约70微米、约40微米至约60微米、约40微米至约70微米、约40微米至约80微米、约40微米至约90微米、约50微米至约70微米、约50微米至约80微米、约50微米至约90微米、约50微米至约100微米、约60至约80微米、约60微米至约90微米、约60微米至约100微米、约70微米至约90微米、约70微米至约100微米、约80微米至约100微米，或由前述端点限定的任何范围)。对于多边形或不规则形状的柱，柱的“直径”是沿垂直于流体流动方向(即第一方向)的轴测量的最大横截面宽度。
表1提供了示例性柱阵列的多种设计及其相应的临界尺寸Dc，根据所需的尺寸分离，任何一种都可用于本公开的方法中。
表1：示例性柱阵列设计
柱形状 柱尺寸 间隙尺寸 阵列倾斜角 临界尺寸
三角形 50 30 1/12 7.2
圆形 50 30 1/15 8.8
三角形 50 15 1/16 3
三角形 50 20 1/16 4
三角形 50 20 1/12 5
三角形 50 25 1/12 6
三角形 50 25 1/10 7
三角形 50 29 1/10 8
三角形 50 33 1/10 9
三角形 50 37 1/10 10
三角形 50 15 1/16 3
三角形 50 25 1/12 6
菱形 70 21 1/12 6
菱形 70 17.5 1/12 5
菱形 70 21 1/10 7
第一阵列的柱可以由多种材料中的任何一种形成，包括本文所述的用于构造微流体装置的任何材料，例如微流体管路材料116。因此，例如，柱可以由硅氧烷聚合物(例如，PDMS、PPS等)制成。
具有如上所述的柱阵列的微流体装置通常将具有流动路径，该流动路径包括具有柱阵列的第一区域和配置成在流体穿过第一区域之后接收流体流的第二区域。第一区域的长度可为约5mm至约15mm(例如，约5mm至约10mm、约6mm至约11mm、约7mm至约12mm、约8mm至约13mm、约9mm至约14mm、约10mm至约15mm，或由前述端点限定的任何范围)，其中长度沿由第一方向限定的轴测量。第二区域可以通过将第二区域分成例如第一通道和第二通道的分隔器(或壁)分开。其他布置也是可能的，例如多个分隔器(或壁)，如通过下面的讨论而显而易见的。第二区域可以相对于第一区域配置，使得直径小于柱阵列的特征Dc的颗粒/细胞(例如，T淋巴细胞)主要流入第一通道，并且直径大于阵列特征Dc的颗粒/细胞(例如，T淋巴细胞)主要流入第二通道。如本文所用，颗粒/细胞(例如T淋巴细胞)的“直径”是颗粒/细胞穿过柱阵列时的有效尺寸。该有效直径可受多种因素的影响，包括细胞的健康状况、细胞周期的阶段、阵列中柱的组成、阵列柱上的涂层等。在某些实施方案中，第一通道可以是直接到达出口/废物的“旁路通道”，并且第二通道可以是选择和/或测定通道，其中最期望的颗粒/细胞(例如，T淋巴细胞)被引导到其中。
在一些实施方案中，第一通道配置成接收流出第一区域(和柱阵列)的流体的至少50％(例如，至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或更多)。在一些实施方案中，第一通道配置为接受流出第一区域(和柱阵列)的流体的约85％至约95％(例如，约87％至约93％、约88％至约92％、约89％至约91％、约90％，或者由前述端点限定的任何范围)。在这样的实施方案中，流入第二通道的剩余流体(例如，可以是流出第一区域的流体的50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少)可包括有效直径大于柱阵列的Dc的所有或大部分颗粒/细胞。因此，例如，当直径大于Dc的T淋巴细胞离开第一区域并进入第二区域的第二通道时，它们可以有效地浓缩至少约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍或更大。
在某些实施方案中，微流体装置的流动路径可包括分成第一通道和第二通道的第二区域，第一和第二通道配置成使得跨第一通道的压差等于跨第二通道的压差。例如，如果通道重新连接(例如，在到达出口端口之前)或者如果它们通向不同的出口端口，则可以实现该相等的压力。为了确保每个通道中的压力基本相等，可以根据公式P＝QCH1*RCH1＝QCH2*RCH2匹配通道中的阻力，其中QCH1是每单位时间第一通道中的体积流量，QCH2是每单位时间第二通道中的体积流量，RCH1和RCH2是第一和第二通道中的相应流体阻力。对于横截面为矩形的通道，R＝L/(W*d3)，其中L是通道的长度，W是通道的一个横截面尺寸，d是通道的最小横截面尺寸。
在某些实施方案中，第一通道包括长度，并且第二通道包括长度，并且第二通道的长度大于第一通道的长度(例如，大至少6、7、8、9、10、11、12、15或20倍)。微流体装置可以包括至少一个如本文所述的隔离坞，其通向第二区域的第二通道并且具有足够大以容纳至少一个T淋巴细胞的体积。隔离坞的体积可以是约250pL至约3nL(例如，约250pL至约1nL、约375pL至约1nL、约500pL至约1nL、约750pL至约1nL、约250pL至约1.25nL、约500pL至约1.25nL、约750pL至约1.25nL、约1nL至约1.25nL、约500pL至约1.5nL、约750pL至约1.5nL、约1nL至约1.5nL、约500pL至约2nL、约750pL至约2nL、约1nL至约2nL、约1.25nL至约2nL、约1.5nL至约2nL、约1nL至约2.5nL、约1.5nL至约2.5nL、约2nL至约2.5nL、约1nL至约3nL、约1.5nL至约3nL、约2nL至约3nL或约2.5nL至约3nL)。
微流体装置可包括多于一个柱阵列。例如，第二通道可包括第一子区域，第一子区域包括第二柱阵列。第二通道可以配置成使得流过流动路径的第一区域的一部分流体将进入第二通道，并且该部分流体和其中包含的任何细胞将穿过第二阵列。第二阵列可以类似于第一阵列。例如，具有相同的临界尺寸Dc(或类似的临界尺寸，例如+/-0.5微米)可以促进去除不需要的细胞/微物体并进一步富集样品。在一些实施方案中，第二阵列可具有不同的临界尺寸(Dc)。例如，第一阵列可具有约4微米至约7微米(例如，约6微米)的临界尺寸，并且第二阵列可具有约7微米至约10微米(例如，约9微米)的临界尺寸。第二阵列的较大临界尺寸可以去除大于期望的微物体，例如即将分裂的不需要的细胞。
在一些实施方案中，第二通道可包括第一子区域，第一子区域包括第二柱阵列和第二子区域。第二子区域可以配置成在其通过第一子区域(和第二柱阵列)之后接收流体流。例如，第二子区域可以包括分隔器，例如壁，其将第二通道分成第三通道和第四通道。以这种方式，通过使样品穿过一系列柱阵列，可以更精细地分选样品中的细胞(T淋巴细胞)。另外，可以将隔离坞定位成使得它们通向第三通道或第四通道，允许液体流动停止并且目标细胞被围住并且任选地在芯片上培养。
具有柱阵列的微流体芯片的示例性设计示于图7A和7B中(即微流体装置700和715)，并结合实例进行描述。
图1还示出了用于操作和控制微流体装置(例如微流体装置100)的系统150。如所示，系统150包括电源192、成像装置194以及倾斜装置190。
电源192可以向微流体装置100和/或倾斜装置190提供电力，根据需要提供偏置电压或电流。电源192可以例如包括一个或多个交流(AC)和/或直流(DC)电压或电流源。成像装置194可以包括用于捕捉微流体管路120内的图像的装置，例如数码相机。在一些情况下，成像装置194进一步包括具有快速帧速率和/或高灵敏度(例如，用于低光应用)的检测器。成像装置194还可以包括用于将刺激性辐射和/或光束引导到微流体管路120中并收集从微流体管路120(或其中包含的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。所发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。所反射的光束可以包括源自LED或诸如汞灯(例如高压汞灯)或氙弧灯的宽光谱灯的反射的发射。如关于图4所讨论的，成像装置194可以进一步包括显微镜(或光具组)，其可以包括或不包括目镜。
系统150可进一步包括倾斜装置190，其被配置为使微流体装置100围绕一个或多个旋转轴旋转。在一些实施方案中，倾斜装置190被配置为围绕至少一个轴来支撑和/或保持包括微流体管路120的外壳102，使得微流体装置100(以及因此微流体管路120)可以保持在水平取向(即，相对于x轴和y轴为0°)、垂直取向(即，相对于x轴和/或y轴为90°)或其间的任何取向。微流体装置100(和微流体管路120)相对于轴的取向在本文中被称为微流体装置100(和微流体管路120)的“倾斜”。例如，倾斜装置190可使微流体装置100相对于x轴倾斜0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其间的任何角度。水平取向(以及因此x轴和y轴)被定义为垂直于由重力限定的垂直轴。倾斜装置还可以使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴和/或y轴倾斜任何大于90°的程度，或者使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴或y轴倾斜180°，以完全反转微流体装置100(和微流体管路120)。类似地，在一些实施方案中，倾斜装置190使微流体装置100(和微流体管路120)围绕由流动路径106或微流体管路120的一些其他部分限定的旋转轴倾斜。
在一些情况下，将微流体装置100倾斜成垂直取向，使得流动路径106位于一个或多个隔离坞的上方或下方。如本文所用的术语“上方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上高于一个或多个隔离坞(即，在流动路径106上方的隔离坞中的物体会具有比流动路径中的物体更高的重力势能)。如本文所用的术语“下方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上低于一个或多个隔离坞(即，在流动路径106下方的隔离坞中的物体会具有比流动路径中的物体更低的重力势能)。
在一些情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕平行于流动路径106的轴倾斜。此外，微流体装置100可以被倾斜至小于90°的角度，使得流动路径106位于一个或多个隔离坞的上方或下方，而不是位于隔离坞的正上方或正下方。在其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕垂直于流动路径106的轴倾斜。在另外其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕既不平行也不垂直于流动路径106的轴倾斜。
系统150可以进一步包括介质源178。介质源178(例如，容器、贮液器等)可以包括多个部分或容器，每个部分或容器用于容纳不同的流体介质180。因此，介质源178可以是在微流体装置100外部并与之分离的装置，如图1所示。或者，介质源178可以整体或部分地位于微流体装置100的外壳102内部。例如，介质源178可以包括作为微流体装置100的一部分的贮液器。
图1还示出了描绘构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用的控制和监测设备152的实例的简化框图。如图所示，这种控制和监视设备152的实例包括主控制器154，其包括介质模块160，用于控制介质源178；运动模块162，用于控制微流体管路120中的微物体(未示出)和/或介质(例如，介质液滴)的移动和/或选择；成像模块164，用于控制成像装置194(例如，相机、显微镜、光源或其任何组合)以捕捉图像(例如，数字图像)；以及倾斜模块166，用于控制倾斜装置190。控制设备152还可以包括其他模块168，用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其他功能。如图所示，设备152可以进一步包括显示装置170和输入/输出设备172。
主控制器154可以包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可以包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据被存储为存储器158中的非暂态数据或信号的机器可执行指令(例如，软件、固件、源代码等)进行操作。替代地或另外地，控制模块156可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。可以类似地配置介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168。因此，可以由如上文所讨论地配置的主控制器154、基质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168中的任意一个或多个来实施本文所讨论的针对微流体装置100或任何其他微流体设备所执行的功能、过程、动作、行动或过程的步骤。类似地，主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168可以通信地耦接，以发送和接收本文所讨论的任何功能、过程、动作、行动或步骤中使用的数据。
介质模块160控制介质源178。例如，介质模块160可以控制介质源178以将选定的流体介质180输入到外壳102中(例如，通过入口端口107)。介质模块160还可以控制从外壳102中移除介质(例如，通过出口端口(未示出))。因此，可以将一种或多种介质选择性地输入到微流体管路120中以及从其中移除。介质模块160还可以控制微流体管路120内的流动路径106中的流体介质180的流动。例如，在一些实施方案中，在倾斜模块166使倾斜装置190将微流体装置100倾斜到期望的倾斜角度之前，介质模块160停止介质180在流动路径106中和通过外壳102的流动。
运动模块162可以被配置为控制微流体管路120中的微物体(未示出)的选择、捕集和移动。如下文参考图2A和2B所讨论的，外壳102可以包括介电电泳(DEP)、光电镊子(OET)和/或光电润湿(OEW)配置(图1中未示出)，并且运动模块162可以控制电极和/或晶体管(例如，光电晶体管)的激活，以选择和移动流动路径106和/或隔离坞124、126、128、130中的微物体(未示出)和/或介质液滴(未示出)。
成像模块164可以控制成像装置194。例如，成像模块164可以接收和处理来自成像装置194的图像数据。来自成像装置的图像数据可以包括由成像装置194捕捉的任何类型的信息(例如，存在或不存在微物体、介质液滴、标记物(例如荧光标记物)的累积等)。使用由成像装置194捕捉的信息，成像模块164可以进一步计算微流体装置100内物体(例如，微物体、介质液滴)的位置和/或这些物体的运动速率。
倾斜模块166可以控制倾斜装置190的倾斜运动。替代地或另外地，倾斜模块166可以控制倾斜速率和时机，以优化微物体经由重力向一个或多个隔离坞的转移。倾斜模块166与成像模块164通信地耦接，以接收描述微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的运动的数据。使用该数据，倾斜模块166可以调节微流体管路120的倾斜，以便调节微物体和/或介质液滴在微流体管路120中移动的速率。倾斜模块166还可以使用该数据来迭代地调节微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的位置。
在图1所示的实例中，微流体管路120被示为包括微流体通道122和隔离坞124、126、128、130。每个坞均包括通向通道122的开口，但是其他部分被包围，使得坞可以将坞内的微物体与通道122的流动路径106或其他坞中的流体介质180和/或微物体基本上分离。在一些情况下，坞124、126、128、130被配置为物理地圈住微流体管路120内的一个或多个微物体。根据本发明的隔离坞可以包括各种形状、表面和特征，如下文将详细讨论和示出的，其被优化为与DEP、OET、OEW和/或重力一起使用。
微流体管路120可以包括任何数目的微流体隔离坞。尽管示出了五个隔离坞，但微流体管路120可以具有更少或更多的隔离坞。根据本公开的隔离坞用于培养、选择和扩增T细胞。如所示，微流体管路120的微流体隔离坞124、126、128和130各自包括不同的特征和形状，这些特征和形状可以提供用于培养、选择和扩增T细胞的一个或多个益处。在一些实施方案中，微流体管路120包括多个相同的微流体隔离坞。在一些实施方案中，微流体管路120包括多个隔离坞，其中两个或更多个隔离坞包括不同的结构和/或特征，其在培养、选择和扩增T细胞中提供不同的益处。
在图1所示的实施方案中，示出了单个通道122和流动路径106。然而，其他实施方案可以含有多个通道122，每个通道均被配置为包括流动路径106。微流体管路120进一步包括与流动路径106和流体介质180流体连通的入口阀或端口107，由此流体介质180可以经由入口端口107进入通道122。在一些情况下，流动路径106包括单个路径。在一些情况下，单个路径被布置为Z字形图案，由此流动路径106以交替的方向穿过微流体装置100两次或更多次。
在一些情况下，微流体管路120包括多个平行的通道122和流动路径106，其中每个流动路径106内的流体介质180沿相同的方向流动。在一些情况下，每个流动路径106内的流体介质沿正向或反向中的至少一个方向流动。在一些情况下，多个隔离坞被配置(例如，相对于通道122)，使得它们可以平行地装载目标微物体。
在一些实施方案中，微流体管路120进一步包括一个或多个微物体阱132。阱132通常形成在形成通道122的边界的壁中，并且可以与微流体隔离坞124、126、128、130中的一个或多个的开口相对地设置。在一些实施例中，阱132被配置为成从流动路径106接收或捕捉单个微物体。在一些实施方案中，阱132被配置为从流动路径106接收或捕捉多个微物体。在一些情况下，阱132包括大约等于单个目标微物体的体积的体积。
阱132还可以包括开口，其被配置为帮助目标微物体流入阱132。在一些情况下，阱132包括开口，该开口的高度和宽度近似地等于单个目标微物体的尺寸，由此防止更大的微物体进入微物体阱。阱132可以进一步包括被配置为帮助将目标微物体保留在阱132内的其他特征。在一些情况下，阱132相对于微流体隔离坞的开口对准并且位于通道122的相对侧上，使得当微流体装置100围绕平行于通道122的轴倾斜时，被捕集的微物体按照使得微物体落入隔离坞的开口中的轨迹离开阱132。在一些情况下，阱132包括小于目标微物体的侧通道134，以便有助于穿过阱132的流，从而增加在阱132中捕捉微物体的可能性。
在一些实施方案中，经由一个或多个电极(未示出)将介电电泳(DEP)力施加在流体介质180(例如，在流动路径中和/或在隔离坞中)上，以操纵、运输、分离和分类位于其中的微物体。例如，在一些实施方案中，将DEP力施加到微流体管路120的一个或多个部分，以便将单个微物体从流动路径106转移到期望的微流体隔离坞中。在一些实施方案中，使用DEP力来防止隔离坞(例如，隔离坞124、126、128或130)内的微物体从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用DEP力来从隔离坞中选择性地移除先前根据本公开的教导收集的微物体。在一些实施方案中，DEP力包括光电镊子(OET)力。
在其他实施方案中，通过一个或多个电极(未示出)将光电润湿(OEW)力施加到微流体装置100的支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置(例如，有助于限定流动路径和/或多个隔离坞的位置)，以操纵、运输、分离和分类位于微流体管路120中的液滴。例如，在一些实施方案中，将OEW力施加到支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置，以将单个液滴从流动路径106转移到期望的微流体隔离坞中。在一些实施方案中，使用OEW力来防止隔离坞(例如，隔离坞124、126、128或130)内的液滴从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用OEW力来从隔离坞中选择性地去除先前根据本公开的教导收集的液滴。
在一些实施方案中，将DEP和/或OEW力与其他力(例如流动和/或重力)组合，以便操纵、运输、分离和分类微流体管路120内的微物体和/或液滴。例如，可以将外壳102倾斜(例如，通过倾斜装置190)，以将流动路径106和位于其中的微物体定位在微流体隔离坞的上方，并且重力可以将微物体和/或液滴运输到坞中。在一些实施方案中，可以在施加其他力之前施加DEP和/或OEW力。在其他实施方案中，可以在施加其他力之后施加DEP和/或OEW力。在其他情况下，可以在施加其他力的同时或者与其他力交替地施加DEP和/或OEW力。
图2A-2F示出了可以用于实施本公开的微流体装置的各种实施方案。图2A描述了其中微流体装置200被配置为光致动的电动力学装置的实施方案。本领域已知多种光致动的电动力学装置，包括具有光电镊子(OET)配置的装置和具有光电润湿(OEW)配置的装置。在以下美国专利文献中示出了合适的OET配置的实例，其均通过引用整体并入本文：美国专利号RE 44,711(Wu等人)(最初以美国专利号7,612,355颁发)；和美国专利号7,956,339(Ohta等人)。美国专利号6,958,132(Chiou等人)和美国专利申请公布号2012/0024708(Chiou等人)中示出了OEW配置的实例，上述两者都通过引用整体并入本文。光致动的电动力学装置的另一个实例包括组合的OET/OEW配置，在美国专利公布号20150306598号(Khandros等人)和20150306599(Khandros等人)以及其对应的PCT公布WO2015/164846和WO2015/164847中示出其实例，其均通过引用整体并入本文。
微流体装置运动配置。如上文所述，系统的控制和监测设备可以包括运动模块，用于选择和移动微流体装置的微流体管路中的物体，例如微物体或液滴。微流体装置可以具有各种运动配置，这取决于被移动物体的类型和其他考虑因素。例如，可以使用介电电泳(DEP)配置来选择和移动微流体管路中的微物体。因此，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括DEP配置，其用于选择性地在微流体管路120中的流体介质180中的微物体上诱导DEP力，从而选择、捕捉和/或移动单个微物体或微物体组。或者，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括电润湿(EW)配置，其用于在微流体管路120中的流体介质180中的液滴上选择性地诱导EW力，从而选择、捕捉和/或移动单个液滴或液滴组。
图2A和2B中示出了包含DEP构造的微流体装置200的一个实例。虽然为了简化的目的，图2A和2B分别示出了具有区域/腔室202的微流体装置200的外壳102的一部分的侧截面图和顶截面图，但应当理解，开口区域/腔室202可以是具有更详细结构的流体管路元件的一部分，例如生长室、隔离坞、流动区域或流动通道。此外，微流体装置200可以包括其他流体管路元件。例如，微流体装置200可包括多个生长室或隔离坞和/或一个或多个流动区域或流动通道，例如本文关于微流体装置100所描述的那些。DEP配置可以被结合到微流体装置200的任何这种流体管路元件中，或者其选择的部分。还应当理解，上文或下文描述的微流体装置组件和系统组件中的任一个可以被结合到微流体装置200中和/或与微流体装置200组合使用。例如，上述包括控制和监测设备152的系统150可以与微流体装置200一起使用，该微流体装置200包括介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和其他模块168中的一个或多个。
如图2A所示，微流体装置200包括具有底部电极204和覆盖底部电极204的电极活化衬底206的支撑结构104，以及具有顶部电极210的盖110，顶部电极210与底部电极204间隔开。顶部电极210和电极活化衬底206限定区域/腔室202的相对表面。因此，包含在区域/腔室202中的介质180在顶部电极210和电极活化衬底206之间提供电阻连接。还示出了电源212，其被配置为连接到底部电极204和顶部电极210并且在这些电极之间产生偏置电压，如在区域/腔室202中产生DEP力所需要的。电源212可以是例如交流(AC)电源。
在某些实施方案中，图2A和2B中所示的微流体装置200可具有光致动的DEP配置。因此，改变来自光源220的光222的图案(其可以由运动模块162控制)可以选择性地激活和去激活电极活化衬底206的内表面208的区域214处的DEP电极的变化图案。(下文中，具有DEP配置的微流体装置的区域214被称为“DEP电极区域”。)如图2B所示，指向电极活化衬底206的内表面208的光图案可以以诸如正方形光图案224的图案照亮选择的DEP电极区域214a(以白色示出)。在下文中将未被照亮的DEP电极区域214(交叉阴影线)称为“暗”DEP电极区域214。通过DEP电极活化衬底206(即，从底部电极204直到与流动区域106中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)的相对电阻抗大于在每个暗DEP电极区域214处通过区域/腔室202中的介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对电阻抗。然而，被照亮的DEP电极区域214a表现出通过电极活化衬底206的减小的相对阻抗，其小于在每个被照亮的DEP电极区域214a处通过区域/腔室202中的介质180的相对阻抗。
在电源212被激活的情况下，前述DEP配置在照射的DEP电极区域214a和相邻的暗DEP电极区域214之间的流体介质180中产生电场梯度，这又产生了吸引或排斥流体介质180中附近微物体(未示出)的局部DEP力。因此，通过改变从光源220投射到微流体装置200中的光图案222，可以在区域/腔室202的内表面208处的许多不同的此类DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥流体介质180中微物体的DEP电极。DEP力是吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源212的频率和介质180和/或微物体(未示出)的介电特性之类的参数。
图2B中所示的被照亮的DEP电极区域214a的方形图案224仅是一个实例。可以通过投射到装置200中的光图案222的照亮(并由此激活)DEP电极区域214的任何图案，并且可以通过改变或移动光图案222来重复地改变被照亮/激活的DEP电极区域214的图案。
在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料或由其组成。在这样的实施方案中，电极活化衬底206的内表面208可以是无特征的。例如，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅(a-Si:H)层或由其组成。a-Si:H可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-Si:H层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。在这样的实施方案中，根据光图案222，可以在电极活化衬底206的内表面208上的任何地方以任何图案形成DEP电极区域214。因此，无需固定DEP电极区域214的数目和图案，而是可以将其对应于光图案222。已经在例如美国专利号RE 44,711(Wu等人)(最初颁布为美国专利号7,612,355)中描述了具有包括光电导层(例如上文所述的光电导层)的DEP配置的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。
在其他实施方案中，电极活化衬底206可以包括衬底，该衬底包括多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和形成半导体集成电路的导电层，例如在半导体领域中已知的。例如，电极活化衬底206可以包括多个光电晶体管，包括例如横向双极光电晶体管，每个光电晶体管均对应于DEP电极区域214。或者，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，其中每个这样的电极均对应于DEP电极区域214。电极活化衬底206可以包括此类光电晶体管或光电晶体管控制的电极的图案。例如，该图案可以是排列成行和列的基本上为正方形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列，如图2B所示。或者，图案可以是形成六方点格的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列。无论图案如何，电路元件都可以在电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极区域214与底部电极210之间形成电连接，并且可以由光图案222选择性地激活和去激活那些电连接(即，光电晶体管或电极)。当未被激活时，每个电连接都可以具有高阻抗，使得通过电极活化衬底206的相对阻抗(即，从底部电极204到与区域/腔室202中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)大于在相应的DEP电极区214处通过介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对阻抗。然而，当被光图案222中的光激活时，通过电极活化衬底206的相对阻抗小于在每个被照亮的DEP电极区域214处通过介质180的相对阻抗，从而在相应DEP电极区域214处激活DEP电极，如上所述。因此，以光图案222所确定的方式，可以在区域/腔室202中的电极活化衬底206的内表面208处的许多不同的DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥介质180中的微物体(未示出)的DEP电极。
已经在例如美国专利号7,956,339(Ohta等人)(参见例如图21和22中所示的装置300及其描述)中描述了具有包含光电晶体管的电极活化衬底的微流体装置的实例，其全部内容均通过引用并入本文。已经在例如美国专利公开号2014/0124370(Short等人)(参见例如整个附图中所示的装置200、400、500、600和900及其描述)中描述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。
在DEP配置的微流体装置的一些实施方案中，顶部电极210是外壳102的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极活化衬底206和底部电极204是外壳102的第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/腔室202可以位于第一壁和第二壁之间。在其他实施方案中，电极210是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化衬底206和/或电极210中的一个或两个是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源220可以替代地用于从下方照亮外壳102。
利用具有DEP构造的图2A-2B的微流体装置200，通过将光图案222投射到装置200中，以便以围绕并捕捉微物体的图案(例如，正方形图案224)来激活电极活化衬底206的内表面208的DEP电极区域214a处的第一组一个或多个DEP电极，运动模块162可以选择区域/腔室202中的介质180中的微物体(未示出)。然后，通过相对于装置200移动光图案222以激活DEP电极区域214处的第二组一个或多个DEP电极，运动模块162可以移动捕捉到的微物体。或者，可以相对于光图案222来移动微流体装置200。
在其他实施方案中，微流体装置200可以具有不依赖于电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极的光激活的DEP配置。例如，电极活化衬底206可以包括位于与包括至少一个电极的表面(例如，盖110)相对的位置的选择性可寻址且可激发的电极。可以选择性地打开和闭合开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)以激活或去激活DEP电极区域214处的DEP电极，从而在激活的DEP电极附近的区域/腔室202中的微物体(未示出)上产生净DEP力。取决于诸如电源212的频率和区域/腔室202中的介质(未示出)和/或微物体的介电性质的特征，DEP力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和去激活一组DEP电极(例如，在形成正方形图案224的一组DEP电极区域214处)，可以在区域/腔室202中捕捉和移动区域/腔室202中的一个或多个微物体。图1中的运动模块162可以控制这类开关，从而激活和去激活各个DEP电极，以选择、捕捉和移动区域/腔室202周围的特定微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址且可激发的电极的DEP结构的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经被描述在例如美国专利号6,294,063(Becker等人)和6,942,776(Medoro)中，其全部内容通过引用并入本文。
作为又一个示例，微流体装置200可以具有：电润湿(EW)配置，其可以代替DEP配置，或者可以位于微流体装置200与具有DEP配置的部分分离的部分中。EW配置可以是光电润湿配置或电介质上的电润湿(EWOD)配置，两者都是本领域已知的。在一些EW配置中，支撑结构104具有夹在介电层(未示出)和底部电极204之间的电极活化衬底206。介电层可以包括疏性水材料和/或可涂覆有疏水材料。对于具有EW配置的微流体装置200，支撑结构104的内表面208是介电层或其疏水涂层的内表面。
介电层(未示出)可以包括一个或多个氧化物层，并且可以具有约50nm至约250nm(例如，约125nm至约175nm)的厚度。在某些实施方案中，介电层可以包括氧化物层，例如金属氧化物(例如，氧化铝或氧化铪)层。在某些实施方案中，介电层可以包括除金属氧化物之外的介电材料，例如硅氧化物或氮化物。无论确切的组成和厚度如何，介电层可以具有约10kOhms至约50kOhms的阻抗。
在一些实施方案中，介电层的向内朝向区域/腔室202的表面涂覆有疏水材料。疏水材料可以包括例如氟代碳分子。氟代碳分子的实例包括全氟聚合物，例如聚四氟乙烯(例如，
Figure BDA0002000596950000281
)或聚(2,3-二氟亚甲基-全氟四氢呋喃)(例如，CYTOPTM)。构成疏水材料的分子可以共价键合到介电层的表面。例如，疏水材料的分子可以借助于诸如硅氧烷基团、膦酸基团或硫醇基团的连接基团共价结合到介电层的表面。因此，在一些实施方案中，疏水材料可以包含烷基封端的硅氧烷、烷基封端的膦酸或烷基封端的硫醇。烷基可以是长链烃(例如，具有至少10个碳或至少16、18、20、22或更多个碳的链)。或者，可以使用氟代(或全氟代)碳链代替烷基。因此，例如，疏水材料可以包括氟代烷基封端的硅氧烷、氟代烷基封端的膦酸或氟代烷基封端的硫醇。在一些实施方案中，疏水涂层的厚度为约10nm至约50nm。在其他实施方案中，疏水涂层的厚度小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5nm至3.0nm)。
在一些实施方案中，具有电润湿配置的微流体装置200的盖110也涂覆有疏水材料(未示出)。疏水材料可以是用于涂覆支撑结构104的介电层的相同疏水材料，并且疏水涂层可以具有与支撑结构104的介电层上的疏水涂层的厚度基本相同的厚度。此外，盖110可以包括以支撑结构104的方式夹在介电层和顶部电极210之间的电极活化衬底206。电极活化衬底206和盖110的介电层可以具有与电极活化衬底206和支撑结构104的介电层相同的组成和/或尺寸。因此，微流体装置200可以具有两个电润湿表面。
在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料，例如如上文所述的那些。因此，在某些实施方案中，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅层(a-Si:H)或由其组成。a-Si:H可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-Si:H层可以具有约500nm至约2.0微米的厚度。或者，如上文所述，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)。具有光电润湿配置的微流体装置在本领域中是已知的和/或可以用本领域已知的电极活化衬底来构建。例如，美国专利号6,958,132(Chiou等人)(其全部内容通过引用并入本文)公开了具有诸如a-Si:H的光电导材料的光电润湿配置，而上文引用的美国专利公开号2014/0124370(Short等人)公开了具有由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底。
因此，微流体装置200可以具有光电润湿配置，并且光图案222可以用于激活电极活化衬底206中的光电导EW区域或光响应EW电极。电极活化衬底206的这类激活的EW区域或EW电极可以在支撑结构104的内表面208(即，覆盖介电层或其疏水涂层的内表面)处产生电润湿力。通过改变入射在电极活化衬底206上的光图案222(或相对于光源220移动微流体装置200)，可以移动与支撑结构104的内表面208接触的液滴(例如，包含水性介质、溶液或溶剂)穿过区域/腔室202中存在的不混溶流体(例如，油介质)。
在其他实施方案中，微流体装置200可以具有EWOD配置，并且电极活化衬底206可以包括不依赖于光来激活的选择性可寻址且可激发的电极。因此，电极活化衬底206可以包括这类电润湿(EW)电极的图案。例如，图案可以是排列成行和列的基本上正方形的EW电极的阵列，如图2B所示。或者，图案可以是形成六边点格的基本上六边形EW电极的阵列。无论图案如何，都可以通过电开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)选择性地激活(或去激活)EW电极。通过选择性地激活和去激活电极活化衬底206中的EW电极，可以在区域/腔室202内移动与经覆盖的介电层或其疏水涂层的内表面208接触的液滴(未示出)。图1中的运动模块162可以控制此类开关，从而激活和去激活各个EW电极，以选择和移动区域/腔室202周围的特定液滴。具有包括选择性可寻址和可激发的电极的EWOD配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经描述在例如美国专利号8,685,344(Sundarsan等人)中，其全部内容通过引用并入本文。
无论微流体装置200的配置如何，电源212可以用于提供为微流体装置200的电路供电的电势(例如，AC电压电势)。电源212可以与图1中参引的电源192相同或者是其组件。电源212可以被配置为向顶部电极210和底部电极204提供AC电压和/或电流。对于AC电压，电源212可以提供这样的频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围：其如上文所述，足以产生足够强的净DEP力(或电润湿力)以在区域/腔室202中捕捉和移动各个微物体(未示出)，和/或还如上文所述，足以改变区域/腔室202中支撑结构104的内表面208(即，介电层和/或介电层上的疏水涂层)的润湿性质。这样的频率范围和平均或峰值功率范围在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利号6,958,132(Chiou等人)、美国专利号RE44,711(Wu等人)(最初作为美国专利号7,612,355颁布)和美国专利申请公开号US2014/0124370(Short等人)、US2015/0306598(Khandros等人)和US2015/0306599(Khandros等人)。
隔离坞。在图2C-2D中描绘的微流体装置240内示出了一般隔离坞244、246和248的非限制性实例。每个隔离坞244、246和248可以包括分离结构250，其限定了分离区域258和将分离区域258流体连接到通道122的连接区254。连接区域254可以包括通向通道122的近端开口252和通向分离区域258的远端开口256。连接区域254可以被配置为使得从通道122流入隔离坞244、246、248的流体介质(未示出)的流动的最大穿透深度不延伸到分离区域258中。因此，由于连接区域254，布置在隔离坞244、246、248的分离区域258中的微物体(未示出)或其他材料(未示出)可以与通道122中的介质180的流动分离且基本上不受其影响。
因此，微流体通道122可以是扫过区域的示例，并且隔离坞244、246、248的分离区域258可以是未扫过区域的实例。应当注意，通道122和隔离物244、246、248可以被配置为包含一种或多种流体介质180。在图2C-2D所示的实例中，端口242被连接到通道122，并允许将流体介质180引入到微流体装置240中或从其中移除。在引入流体介质180之前，微流体装置可以装填有气体，如二氧化碳气体。一旦微流体装置240包含流体介质180，就可以选择性地产生和停止通道122中的流体介质180的流242。例如，如图所示，端口260可以被布置在通道122的不同位置处(例如，相对端)，并且可以从用作入口的一个端口242到用作出口的另一个端口242形成介质的流260。
图2E示出了根据本公开的隔离坞244的实例的详细视图。还示出了微物体270的实例。
已知的是，微流体通道122中的流体介质180的流260经过隔离坞244的近端开口252可以使介质180的二次流262进入和/或离开隔离坞244。为了将隔离坞244的分离区域258中的微物体270与二次流262分离，隔离坞244的连接区域254的长度Lcon(即，从近端开口252到远端开口256)应当大于二次流262进入连接区域254的穿透深度Dp。二次流262的穿透深度Dp取决于在通道122中流动的流体介质180的速度以及与通道122的配置有关的各种参数以及到通道122的连接区域254的近端开口252。对于给定的微流体装置，通道122和开口252的配置将是固定的，而通道122中的流体介质180的流260的速率将是可变的。因此，对于每个隔离坞244，可以识别通道122中的流体介质180的流260的最大速度Vmax，确保二次流262的穿透深度Dp不超过连接区域254的长度Lcon。只要通道122中的流体介质180的流260的速率不超过最大速度Vmax，所得到的二次流262就可以被限制到通道122和连接区域254并且保持在分离区域258之外。因此，通道122中的介质180的流260将不会将微物体270拖曳出分离区域258。相反，无论通道122中的流体介质180的流260如何，位于分离区域258中的微物体270将停留在分离区域258中。
此外，只要通道122中的介质180的流260的速率不超过Vmax，通道122中的流体介质180的流260就不会把混杂的颗粒(例如，微粒和/或纳米颗粒)从通道122移动到隔离坞244的分离区域258中。因此，使连接区域254的长度Lcon大于二次流262的最大穿透深度Dp可以防止一个隔离坞244被来自通道122或另一个隔离坞(例如，图2D中的隔离坞246、248)的混杂的颗粒污染。
因为通道122和隔离坞244、246、248的连接区域254可能受到通道122中的介质180的流260的影响，所以通道122和连接区域254可以被认为是微流体装置240的扫过(或流动)区域。另一方面，隔离坞244、246、248的分离区域258可以被认为是未扫过(或非流动)区域。例如，通道122中的第一流体介质180中的组分(未示出)可以基本上仅通过第一介质180的组分从通道122扩散通过连接区域254并进入分离区域258中的第二流体介质280中而与分离区域258中的第二流体介质280混合。类似地，分离区域258中的第二介质280的组分(未示出)可以基本上仅通过第二介质280的组分从分离区域258扩散通过连接区域254并进入通道122中的第一介质180中而与通道122中的第一介质180混合。第一介质180可以是与第二介质280相同的介质或不同的介质。此外，第一介质180和第二介质280可以开始相同，然后变得不同(例如，通过分离区域258中的一个或多个细胞来调节第二介质280，或者通过改变流过通道122的介质180)。
如上所述，由通道122中的流体介质180的流260引起的二次流262的最大穿透深度Dp可以取决于多个参数。这些参数的实例包括：通道122的形状(例如，通道可以将介质引导到连接区域254中，将介质从连接区域254转移，或者沿着基本上垂直于通向微流体通道122的连接区域254的近端开口252的方向引导介质)；通道122在近端开口252处的宽度Wch(或横截面积)；和连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon(或横截面积)；通道122中的流体介质180的流260的速度V；第一介质180和/或第二介质280的粘度，等等。
在一些实施方案中，通道122和隔离坞244、246、248的尺寸可以相对于通道122中的流体介质180的流260的向量如下定向：通道宽度Wch(或通道122的横截面积)可以基本上垂直于介质180的流260；连接区域254在开口252处的宽度Wcon(或横截面积)可以基本上平行于通道122中的介质180的流260；和/或连接区域的长度Lcon可以基本上垂直于通道122中的介质180的流260。前述仅是示例，并且通道122和隔离坞244、246、248的相对位置可以相对于彼此为其他取向。
如图2E所示，连接区域254的宽度Wcon从近端开口252到远端开口256可以是均匀的。因此，连接区域254在远端开口256处的宽度Wcon可以在本文中为连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon所标识的任何范围内。或者，连接区域254在远端开口256处的宽度Wcon可以大于连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon。
如图2E所示，分离区域258在远端开口256处的宽度可以与连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon基本上相同。因此，分离区域258在远端开口256处的宽度可以在本文中为连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon所标识的任何范围内。或者，分离区域258在远端开口256处的宽度可以大于或小于连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon。此外，远端开口256可以小于近端开口252，并且连接区域254的宽度Wcon可以在近端开口252和远端开口256之间变窄。例如，使用各种不同的几何形状(例如，斜切连接区域、使连接区域成斜面)，连接区域254可以在近端开口和远端开口之间变窄。此外，连接区域254的任何部分或子部分可以变窄(例如，连接区域与近端开口252相邻的一部分)。
在隔离坞(例如，124、126、128、130、244、246或248)的各种实施方案中，分离区域(例如258)被配置为包含多个微物体。在其他实施方案中，分离区域可以被配置为包含仅一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对较少数目的微物体。因此，分离区域的体积可以是例如至少3×103、6×103、9×103、1×104、2×104、4×104、8×104、1×105、2×105、4×105、8×105、1×106、2×106、4×106、6×106立方微米或更大。
在隔离坞的各种实施方案中，通道122在近端开口(例如，252)处的宽度Wch可以在以下任一范围内：约50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米和100-120微米。以上仅是示例，并且通道122的宽度Wch可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。此外，在通道的除了隔离坞的近端开口之外的区域中，通道122的Wch可以被选择为在任何这些范围内。
在一些实施方案中，隔离坞的横截高度为约30至约200微米或约50至约150微米。在一些实施方案中，隔离坞的横截面积为约100,000至约2,500,000平方微米或约200,000至约2,000,000方微米。在一些实施方案中，连接区域的横截高度匹配对应的隔离坞的横截高度。在一些实施方案中，连接区域的横截宽度为约50至约500微米或约100至约300微米。
在隔离坞的各种实施方案中，通道122在近端开口252处的高度Hch可以在以下任何范围内：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。前述仅仅是示例，并且通道122的高度Hch可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围)。在通道的除了隔离坞的近端开口之外的区域中，通道122的高度Hch可以被选择为在任何这些范围内。
在隔离坞的各种实施方案中，通道122在近端开口252处的横截面积可以在以下任何范围内：500-50,000平方微米、500-40,000平方微米、500-30,000平方微米、500-25,000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-10,000平方微米、3,000-7,500平方微米或3,000至6,000平方微米。前述仅仅是示例，并且通道122在近端开口252处的横截面积可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域254的长度Lcon可以是在以下任何范围内：1-200微米、5-150微米、10-100微米、15-80微米、20-60微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米和100-150微米。前述仅仅是示例，并且连接区域254的长度Lcon可以在与前述示例不同的范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon可以在以下任何范围内：20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-150微米、70-100微米和80-100微米。前述仅仅是示例，并且连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon可以与前述示例不同(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon可以是任何以下范围：2-35微米、2-25微米、2-20微米、2-15微米、2-10微米、2-7微米、2-5微米、2-3微米、3-25微米、3-20微米、3-15微米、3-10微米、3-7微米、3-5微米、3-4微米、4-20微米、4-15微米、4-10微米、4-7微米、4-5微米、5-15微米、5-10微米、5-7微米、6-15微米、6-10微米、6-7微米、7-15微米、7-10微米、8-15微米和8-10微米。前述仅仅是示例，并且连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon可以与前述示例不同(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域254的长度Lcon与连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon的比可以大于或等于任何以下比值：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更大。以上仅仅是示例，并且连接区域254的长度Lcon与连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon的比可以与前述示例不同。
在微流体装置100、200、240、290、500、700、715的各种实施方案中，Vmax可以被设定为约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5μL/sec。
在具有隔离坞的微流体装置的各种实施方案中，隔离坞的分离区域258的体积可以例如是至少3×103、6×103、9×103、1×104、2×104、4×104、8×104、1×105、2×105、4×105、8×105、1×106、2×106、4×106、6×106立方微米或更大。在具有隔离坞的微流体装置的各种实施方案中，隔离坞的体积可以是约5x103、7×103、1×104、3×104、5×104、8×104、1×105、2×105、4×105、6×105、8×105、1×106、2×106、4×106、8×106、1×107、3×107、5×107或约8×107立方微米或更大。在一些实施方案中，微流体装置具有隔离坞，其中可以保持不超过1×102个生物细胞，并且隔离坞的体积可以不超过2×106立方微米。在一些实施方案中，微流体装置具有隔离坞，其中可以保持不超过1×102个生物细胞，并且隔离坞可以不超过4×105立方微米。在另外的实施方案中，微流体装置具有隔离坞，其中可以保持不超过50个生物细胞，并且隔离坞可以不超过4×105立方微米。
在各种实施方案中，微流体装置具有如本文所讨论的任何实施方案中所配置的隔离坞，其中微流体装置具有约100至约500个隔离坞；约200至约1000个隔离坞、约500至约1500个隔离坞、约1000至约2000个隔离坞或约1000至约3500个隔离坞。
在一些其他的实施方案中，微流体装置的隔离坞被配置为本文讨论的任何实施方案，其中微流体装置具有约1500至约3000个隔离坞、约2000至约3500个隔离坞、约2500至约4000个隔离坞、约3000至约4500个隔离坞、约3500至约5000个隔离坞、约4000至约5500个隔离坞、约4500至约6000个隔离坞、约5000至约6500个隔离坞、约5500至约7000个隔离坞、约6000至约7500个隔离坞、约6500至约8000个隔离坞、约7000至约8500个隔离坞、约7500至约9000个隔离坞、约8000至约9500个隔离坞、约8500至约10,000个隔离坞、约9000至约10,500个隔离坞、约9500至约11,000个隔离坞、约10,000至约11,500个隔离坞、约10,500至约12,000个隔离坞、约11,000至约12,500个隔离坞、约11,500至约13,000个隔离坞、约12,000至约13,500个隔离坞、约12,500至约14,000个隔离坞、约13,000至约14,500个隔离坞、约13,500至约15,000个隔离坞、约14,000至约15,500个隔离坞、约14,500至约16,000个隔离坞、约15,000至约16,500个隔离坞、约15,500至约17,000个隔离坞、约16,000至约17,500个隔离坞、约16,500至约18,000个隔离坞、约17,000至约18,500个隔离坞、约17,500至约19,000个隔离坞、约18,000至约19,500个隔离坞、约18,500至约20,000个隔离坞、约19,000至约20,500个隔离坞、约19,500至约21,000个隔离坞或约20,000至约21,500个隔离坞。
图2F示出了根据一个实施方案的微流体装置290。图2F中示出的微流体装置290是微流体装置100的程式化示意图。在实施中，微流体装置290及其组成管路元件(例如，通道122和隔离坞128)会具有本文所讨论的尺寸。图2F中所示的微流体管路120具有两个端口107、四个不同的通道122和四个不同的流动路径106。微流体装置290进一步包括向每个通道122开口的多个隔离坞。在图2F所示的微流体装置中，隔离坞具有与图2E中所示的坞类似的几何形状，因此具有连接区域和分离区域这两者。因此，微流体管路120包括扫过区域(例如，通道122和连接区域254在二次流262的最大穿透深度Dp内的部分)和非扫过区域(例如，分离区域258和连接区域254不在二次流262的最大穿透深度Dp内的部分)这两者。
图3至4示出了可用于操作和观察根据本公开的微流体装置(例如，100、200、240、290、500、700、715)的系统150的各种实施方案。如图3所示，系统150可以包括结构(“巢”)300，其被配置为保持微流体装置100(未示出)或本文所述的任何其他微流体装置。巢300可以包括插座(socket)302，其能够与微流体装置360(例如，光致动的电动力学装置100)交界并提供从电源192到微流体装置360的电连接。巢300还可以包括集成的电信号生成子系统304。电信号生成子系统304可以被配置为向插座302提供偏置电压，使得当插座302加持微流体装置360时，在微流体装置360中的一对电极两端施加偏置电压。因此，电信号生成子系统304可以是电源192的一部分。将偏置电压施加到微流体装置360的能力并不意味着当插座302加持微流体装置360时会一直施加偏置电压。相反，在大多数情况下，将间歇地施加偏压电压，例如，仅在需要促进在微流体装置360中生成电动力(例如介电电泳或电润湿)时施加。
如图3所示，巢300可以包括印刷电路板组件(PCBA)320。电信号生成子系统304可以被安装在PCBA 320上并被电集成到其中。示例性支撑件也包括安装在PCBA 320上的插座302。
通常，电信号生成子系统304将包括波形发生器(未示出)。电信号生成子系统304还可以包括示波器(未示出)和/或被配置为放大从波形发生器接收到的波形的波形放大电路(未示出)。示波器(如果有的话)可以被配置为测量供给至由插座302加持的微流体装置360的波形。在某些实施方案中，示波器在微流体装置360附近(并且远离波形发生器)的位置处测量波形，从而确保更精确地测量实际施加到装置的波形。从示波器测量所获得的数据可以被例如作为对波形发生器的反馈提供，并且波形发生器可以被配置为基于这样的反馈调整其输出。合适的组合式波形发生器和示波器的示例是Red PitayaTM。
在某些实施方案中，巢300进一步包括控制器308，例如用于检测和/或控制电信号生成子系统304的微处理器。合适的微处理器的实例包括ArduinoTM微处理器，例如ArduinoNanoTM。控制器308可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(图1中所示)进行通信以执行功能和分析。在图3所示的实施方案中，控制器308通过界面310(例如，插头或连接器)与主控制器154通信。
在一些实施方案中，巢300可以包括电信号生成子系统304，其包括Red PitayaTM波形发生器/示波器单元(“Red Pitaya单元”)和波形放大电路，该波形放大电路将RedPitaya单元所产生的波形放大并且将放大的电压传送给微流体装置100。在一些实施方案中，Red Pitaya单元被配置为测量微流体装置360处的放大的电压，然后根据需要调节其自身的输出电压，使得微流体装置360处测量到的电压是期望值。在一些实施方案中，波形放大电路可以具有由安装在PCBA 320上的一对DC-DC转换器产生的+6.5V至-6.5V的电源，从而在微流体装置100处产生高达13Vpp的信号。
如图3所示，支撑结构300可以进一步包括热控制子系统306。热控制子系统306可以被配置为调节由支撑结构300加持的微流体装置360的温度。例如，热控制子系统306可以包括Peltier热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。Peltier热电装置可以具有被配置为与微流体装置360的至少一个表面相交界的第一表面。冷却单元可以是例如冷却块(未示出)，例如液体冷却铝块。Peltier热电装置的第二表面(例如，与第一表面相对的表面)可以被配置为与这种冷却块的表面交界。冷却块可以被连接到流体路径330，流体路径330被配置为使冷却的流体循环通过冷却块。在图3所示的实施方案中，支撑结构300包括入口332和出口334，以从外部贮液器(未示出)接收冷却的流体，将冷却的流体引入到流体路径330并通过冷却块，然后将冷却的流体返回到外部贮液器。在一些实施方案中，Peltier热电装置、冷却单元和/或流体路径330可以被安装在支撑结构300的壳体340上。在一些实施方案中，热控制子系统306被配置为调节Peltier热电装置的温度，以实现微流体装置360的目标温度。Peltier热电装置的温度调节可以例如通过热电电源实现，例如通过PololuTM热电电源(Pololu Robotics and Electronics Corp.)实现。热控制子系统306可以包括反馈电路，例如由模拟电路提供的温度值。或者，反馈电路可以由数字电路提供。
在一些实施方案中，巢300可以包括具有反馈电路的热控制子系统306，该反馈电路是包括电阻器(例如，具有1kOhm+/-0.1％的阻抗，+/-0.02ppm/C0的温度系数)和NTC热敏电阻(例如，具有1kOhm+/-0.01％的标称阻抗)的模拟分压器电路。在一些情况下，热控制子系统306测量来自反馈电路的电压，然后使用计算出的温度值作为机载PID控制环路算法的输入。来自PID控制环路算法的输出可以驱动例如PololuTM马达驱动器(未示出)上的定向和脉冲宽度调制的信号引脚，以致动热电电源，从而控制Peltier热电装置。
巢300可以包括串行端口350，其允许控制器308的微处理器经由界面310与外部主控制器154进行通信。另外，控制器308的微处理器可以与电信号生成子系统304和热控制子系统306进行通信(例如，经由Plink工具(未示出))。因此，经由控制器308、界面310和串行端口350的组合，电信号生成子系统308和热控制子系统306可以与外部主控制器154进行通信。以这种方式，除了其他方面之外，主控制器154还可以通过执行用于输出电压调节的定标计算(scaling calculation)来辅助电信号生成子系统308。经由耦接到外部主控制器154的显示装置170提供的图形用户界面(GUI)可以被配置为绘制分别从热控制子系统306和电信号生成子系统308获得的温度和波形数据。替代地或另外地，GUI可以允许更新控制器308、热控制子系统306和电信号生成子系统308。
如上文所讨论的，系统150可以包括成像装置194。在一些实施方案中，成像装置194包括光调制子系统404。光调制子系统404可以包括数字镜像装置(DMD)或微快门阵列系统(MSA)，其中任一个都可以被配置为接收来自光源402的光并将接收到的光的一部分发送到显微镜400的光具组中。或者，光调制子系统404可以包括产生其自身光的装置(因此无需光源402)，例如有机发光二极管显示器(OLED)、硅基液晶(LCOS)装置、铁电硅基液晶装置(FLCOS)或透射式液晶显示器(LCD)。光调制子系统404可以是例如投影仪。因此，光调制子系统404能够发射结构光和非结构光。合适的光调制子系统404的一个实例是来自AndorTechnologiesTM的MosaicTM系统。在某些实施方案中，系统150的成像模块164和/或运动模块162可以控制光调制子系统404。
在某些实施方案中，成像装置194进一步包括显微镜400。在这样的实施方案中，巢300和光调制子系统404可以单独被配置为安装在显微镜400上。显微镜400可以是例如标准研究级别的光学显微镜或荧光显微镜。因此，巢300可以被配置为安装在显微镜400的载物台410上和/或光调制子系统404可以被配置为安装在显微镜400的端口上。在其他实施方案中，本文所述的巢300和光调制子系统404可以是显微镜400的集成部件。
在某些实施方案中，显微镜400可以进一步包括一个或多个检测器422。在一些实施方案中，检测器422由成像模块164控制。检测器422可以包括目镜、电荷耦合器件(CCD)、相机(例如，数码相机)或其任何组合。如果存在至少两个检测器422，则一个检测器可以是例如快速帧率相机，而另一个检测器可以是高灵敏度相机。此外，显微镜400可以包括光具组，其被配置为接收从微流体装置360反射和/或发射的光，并将反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到一个或多个检测器422上。显微镜的光具组还可以包括用于不同检测器的不同镜筒透镜(未示出)，使得每个检测器上的最终放大率可以是不同的。
在某些实施方案中，成像装置194被配置为使用至少两个光源。例如，可以使用第一光源402来产生结构光(例如，经由光调制子系统404)，并且可以使用第二光源432来提供非结构光。第一光源402可以产生用于光驱动的电运动和/或荧光激发的结构光，且第二光源432可以用于提供亮视场照明。在这些实施方案中，运动模块162可以用于控制第一光源404，并且成像模块164可以用于控制第二光源432。显微镜400的光具组可以被配置为(1)接收来自光调制子系统404的结构光，并且当微流体装置(例如，光致动的电动力学装置)被支撑结构200加持时，将结构光聚焦在该装置中的至少第一区域上，以及(2)接收从微流体装置反射和/或发射的光，并将这种反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到检测器422上。光具组可以进一步被配置为接收来自第二光源的非结构光，并且当微流体装置被支撑结构300加持时，将非结构光聚焦在微流体装置的至少第二区域上。在某些实施方案中，微流体装置的第一和第二区域可以是重叠的区域。例如，第一区域可以是第二区域的子集。
在图3B中，第一光源402被显示为将光提供给光调制子系统404，其将结构光提供给显微镜400的光具组。第二光源432被显示为经由分束器436将非结构光提供给光具组。来自光调制子系统404的结构光和来自第二光源432的非结构光一起从分束器436通过光具组行进到达第二分束器(或二向色滤光器406，取决于光调制子系统404提供的光)，光在此通过物镜408向下反射到样品平面412。然后，从样品平面412反射和/或发射的光向上返回通过物镜408、通过分束器和/或二向色滤光器406，并返回到二向色滤光器424。到达二向色滤光器424的光的仅仅一部分穿过并到达检测器422。
在一些实施方案中，第二光源422发射蓝光。利用适当的二向色滤光器424，从样品平面412反射的蓝光能够穿过二向色滤光器424并到达检测器422。相反，来自光调制子系统404的结构光从样品平面412反射，但不穿过二向色滤光器424。在该实例中，二向色滤光器424滤除波长长于495nm的可见光。只有从光调制子系统发射的光不包括短于495nm的任何波长时，这种滤除来自光调制子系统404的光才算完成(如图所示)。在实施中，如果来自光调制子系统404的光包括短于495nm的波长(例如，蓝色波长)，则来自光调制子系统的一些光会穿过滤光器424到达检测器422。在这样的实施方案中，滤光器424作用于改变从第一光源402和第二光源432到达检测器422的光量之间的平衡。如果第一光源402显著强于第二光源432，则这可能是有益的。在其他实施方案中，第二光源432可以发射红光，并且二向色滤光器424可以滤除除了红光之外的可见光(例如，波长短于650nm的可见光)。
阻断溶液和阻断剂。不希望受理论的限制，当微流体装置的一个或多个内表面已经被条件化或涂覆以便呈现有机和/或亲水分子层(其提供微流体装置和其中生长的T细胞之间的主要界面)时，可以促进微流体装置内的T细胞的培养和扩增(即，T细胞表现出增加的活力和更大的扩增)。在一些实施方案中，微流体装置的一个或多个内表面(例如，DEP配置的微流体装置的电极活化衬底的内表面、微流体装置的盖和/或管路材料的表面)可以用涂覆溶液和/或涂覆剂处理，以产生所需的有机和/或亲水分子层。在一些实施方案中，在微流体装置中培养并任选地扩增的T细胞输入到包含一种或多种涂覆剂的涂覆溶液中。
在其他实施方案中，在将T细胞引入到微流体装置中之前，将微流体装置(例如，DEP配置的微流体装置)的内表面用包含涂覆剂的涂覆溶液处理或“装填”。可以使用任何方便的涂覆剂/涂覆溶液，包括但不限于：血清或血清因子、牛血清白蛋白(BSA)、聚合物、去污剂、酶及其任何组合。在一些具体的实施方案中，涂覆剂将用于处理微流体装置的内表面。在一个实例中，在涂覆溶液中包含含亚烷基醚部分的聚合物作为涂覆剂。许多含亚烷基醚的聚合物可以是合适的。一类非限制性示例性的含亚烷基醚的聚合物是两性非离子嵌段共聚物，其包括在聚合物链内具有不同比例和位置的聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)子单元的嵌段。
Figure BDA0002000596950000421
聚合物(BASF)是这类嵌段共聚物，并且在本领域中已知适合于在与活细胞接触时使用。聚合物的平均分子量Mw范围可以为约2000Da至约20KDa。在一些实施方案中，PEO-PPO嵌段共聚物可以具有大于约10(例如，12-18)的亲水-亲油平衡(HLB)。可用于产生经涂覆的表面的特定
Figure BDA0002000596950000422
聚合物包括
Figure BDA0002000596950000423
L44、L64、P85和F127(包括F127NF)。另一类含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100,000Da)或可替代地，聚氧乙烯(PEO，Mw>100,000)。在一些实施方案中，PEG可以具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的Mw。
在一些实施方案中，涂覆溶液可包含多种蛋白质和/或肽作为涂覆剂。在一个具体的实施方案中，在本公开中使用的涂覆溶液包括作为涂覆剂的蛋白质，如牛血清白蛋白(BSA)和/或包含白蛋白的血清(或多种不同血清的组合)和/或一种或多种的其他类似蛋白质。血清可以来自任何方便的来源，包括但不限于胎牛血清、绵羊血清、山羊血清、马血清等。在某些实施方案中，BSA在涂覆溶液中存在的浓度范围为约1mg/mL至约100mg/mL，包括5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL，或更高或介于其间的任何值。在某些实施方案中，血清在涂覆溶液中存在的浓度范围可以为约20％(v/v)至约50％v/v，包括25％、30％、35％、40％、45％，或更高或介于其间的任何值。在一些实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以5mg/mL存在于涂覆溶液中，而在其他实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以70mg/mL存在于涂覆溶液中。在某些实施方案中，血清作为涂覆剂以30％存在于涂覆溶液中。
涂层材料。依据实施方案，任何上述涂覆剂/涂覆溶液可被用于涂覆微流体装置(例如，DEP配置的和/或EW配置的微流体装置)的一个或多个内表面的多种涂层材料代替，或与其组合使用。在一些实施方案中，微流体装置的至少一个表面包括涂层材料，其提供适合于T细胞培养和扩增的有机和/或亲水分子层。在一些实施方案中，微流体装置的基本上所有内表面都包括涂层材料。经涂覆的内表面可以包括流动区域(例如，通道)、室或隔离坞的表面，或其组合。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在其他实施方案中，多个流动区域或通道中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个和多个通道中的每一个的至少一个内表面都涂覆有涂层材料。
基于聚合物的涂层材料。至少一个内表面可以包括包含聚合物的涂层材料。聚合物可以与至少一个表面共价或非共价地结合(或可以连接)。聚合物可以具有多种结构基序，例如嵌段聚合物(和共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中所发现的，所有这些都可以适用于本文公开的方法。
聚合物可以包括含有亚烷基醚部分的聚合物。大量的含亚烷基醚的聚合物可以适用于本文所述的微流体装置。一类非限制性示例性的含亚烷基醚的聚合物是两性非离子嵌段共聚物，其包括在聚合物链内具有不同比例和位置的聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)子单元的嵌段。
Figure BDA0002000596950000431
聚合物(BASF)是这类嵌段共聚物，并且在本领域中已知适合于在与活细胞接触时使用。聚合物的平均分子量Mw为约2000Da至约20KDa。在一些实施方案中，PEO-PPO嵌段共聚物可以具有大于约10(例如，12-18)的亲水-亲油平衡(HLB)。可用于产生经涂覆的表面的特定
Figure BDA0002000596950000432
聚合物包括
Figure BDA0002000596950000433
L44、L64、P85和F127(包括F127NF)。另一类含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100,000Da)或可替代地，聚氧乙烯(PEO，Mw>100,000)。在一些实施方案中，PEG可以具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的Mw。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有羧酸部分的聚合物。羧酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚乳酸(PLA)。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磺酸部分的聚合物。磺酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚苯乙烯磺酸(PSSA)或聚茴香脑磺酸。后者这些示例性聚合物是聚电解质，并且可以改变表面的特征，以提供适合于培养和扩增T细胞的有机和/或亲水分子层。
在一些实施方案中，涂层材料可以包括含氨基甲酸乙酯部分的聚合物，例如但不限于聚氨酯。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磷酸酯部分的聚合物，该磷酸酯部分在聚合物主链的末端处或者从聚合物的主链悬垂。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有糖部分的聚合物。在一个非限制性实例中，多糖(例如从海藻或真菌多糖，例如黄原胶或葡聚糖)可以适合于形成可以在微流体装置中减少或防止细胞粘附的材料。例如，尺寸为约3kDa的葡聚糖聚合物可以用于为微流体装置内的表面提供涂层材料。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有核苷酸部分的聚合物，即核酸，其可以具有核糖核苷酸部分或脱氧核糖核苷酸部分。核酸可以仅含有天然核苷酸部分或者可以含有非天然核苷酸部分，其包含核碱基、核糖或磷酸酯部分类似物，例如7-脱氮腺嘌呤、戊糖、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯部分，但不限于此。含核酸的聚合物可以包括电解质，其可以提供适合于T细胞培养和扩增的有机和/或亲水分子层。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有氨基酸部分的聚合物。含有氨基酸部分的聚合物可以包括含有天然氨基酸的聚合物或含有非天然氨基酸的聚合物，其均可以包括肽、多肽或蛋白质。在一个非限制性实例中，蛋白质可以是牛血清白蛋白(BSA)。在一些实施方案中，可以在涂层材料内提供细胞外基质(ECM)蛋白质，用于获得优化的细胞粘附以促进细胞生长。可以包含在涂层材料中的细胞基质蛋白质可以包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、含RGD的肽(例如纤连蛋白)或层粘连蛋白。在其他实施方案中，可以在微流体装置的涂层材料内提供生长因子、细胞因子、激素或其他细胞信号传导物质。
在进一步的实施方案中，涂层材料可以包括含有胺部分的聚合物。聚氨基聚合物可以包括天然多胺聚合物或合成的多胺聚合物。天然多胺的实例包括精胺、亚精胺和腐胺。
在一些实施方案中，涂层材料可以包括含有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分或氨基酸部分中超过一种的聚合物。在其他实施方案中，经聚合物条件化的表面可以包括超过一种聚合物的混合物，每种聚合物具有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分和/或氨基酸部分，其可以独立地或同时地并入到涂层材料中。
共价连接的涂层材料。在一些实施方案中，至少一个内表面包括共价连接的分子，其提供适于在微流体装置内培养和扩增T细胞的有机和/或亲水分子层。共价连接的分子包括连接基团，其中连接基团与微流体装置的一个或多个表面共价连接。连接基团还与被配置为提供适合于T细胞培养和扩增的有机和/或亲水分子层的部分共价连接。与连接基团连接的表面可以包括微流体装置的衬底表面，对于其中微流体装置包括DEP配置的实施方案，可以包括硅和/或二氧化硅。在一些实施方案中，共价连接的涂层材料基本上涂覆微流体装置的所有内表面。
在一些实施方案中，被配置为提供适合于T细胞培养和扩增的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括烷基或氟代烷基(包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子表面)；磺酸盐阴离子；羧基甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
被配置为提供适合于在微流体装置中培养和扩增T细胞的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以是本文描述的任何聚合物，并且可以包括含亚烷基氧化物部分、羧酸部分、糖部分、磺酸部分、磷酸酯部分、氨基酸部分、核苷酸部分或氨基部分的聚合物。
在其他实施方案中，被配置为提供适合于在微流体装置中培养和扩增T细胞的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括非聚合部分，例如烷基部分、取代的烷基部分(例如，氟代烷基部分(包括但不限于全氟代烷基部分))、氨基酸部分、醇部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸部分、氨基磺酸部分或糖部分。
在一些实施方案中，共价连接的部分可以是烷基，其包含形成直链(例如，至少10个碳或至少14、16、18、20、22或更多个碳的直链)的碳原子。因此，烷基可以是无支链的烷基。在一些实施方案中，烷基可以包括取代的烷基(例如，烷基中的一些碳可被氟代或全氟代)。烷基可以包括结合到未取代的碳的直链的取代(例如氟代或全氟代)碳的直链。例如，烷基可以包括第一区段(其可以包括全氟代烷基)，其连接至第二区段(其可以包括未取代的烷基)。第一和第二区段可以直接或间接(例如，通过醚链接)连接在一起。烷基的第一区段可以位于连接基团的远端，并且烷基的第二区段可以位于连接基团的近端。在其他实施方案中，烷基可以包括支链烷基，并且还可以具有中断烷基的烷基主链的一个或多个亚芳基。在一些实施方案中，烷基或氟代烷基的支链或亚芳基中断的部分位于远离到表面的连接基团和共价键的位置。
在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个氨基酸，其可以包括超过一种类型的氨基酸。因此，共价连接的部分可以包括肽或蛋白质。在一些实施方案中，共价连接的部分可以包括氨基酸，其可以提供两性离子表面以支持细胞生长、活力、可携带性(portability)或其任何组合。
共价连接的部分可以包括一种或多种糖。共价连接的糖可以是单糖、二糖或多糖。可以修饰共价连接的糖，以引入反应性配对部分，其允许偶联或处理用于表面的附接。示例性的反应性配对部分可以包括醛、炔烃或卤素部分。可以以随机方式修饰多糖，其中可以修饰每种糖单体或仅修饰多糖内的一部分糖单体，以提供可以直接或间接偶联至表面的反应性配对部分。一个实例可以包括葡聚糖多糖，其可以经过非支链的连接部分间接地偶联到表面。
共价连接的部分可以包括一个或多个氨基。氨基可以是取代的胺部分、胍部分、含氮杂环部分或杂芳基部分。含氨基的部分可以具有允许对微流体装置内以及任选地对隔离坞和/或流动区域(例如，通道)内的环境进行pH修饰的结构。
涂层材料可以仅包含一类共价连接的部分，或者可以包括超过一种不同类型的共价连接的部分。例如，经氟代烷基条件化的表面(包括全氟代烷基)可以具有多个共价连接的部分，它们全部相同，例如具有相同的连接基团和与表面的共价连接、相同的总长度和相同数目的氟代亚甲基单元，包括氟代烷基部分。或者，涂层材料可以具有超过一种类型的与表面附接的共价连接部分。例如，涂层材料可以包括具有共价连接的具有指定数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基部分的分子，并且还可以包括另一组分子，其具有共价连接到具有更大数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基链的带电荷部分。在一些实施方案中，具有多于一种共价连接的部分的涂层材料可以被设计成使得具有更大数目的主链原子并因此与共价连接到表面的距离更长的第一组分子可以提供在经涂覆的表面上呈现较大部分的能力，而具有不同的、空间要求更低的末端和更少的主链原子的第二组分子能够有助于使整个衬底表面功能化，从而防止与构成衬底本身的硅或氧化铝的不期望的粘附或接触。在另一个实例中，共价连接的部分可以提供两性离子表面，其在表面上以随机的方式呈现交替的电荷。
条件化的表面性质。在一些实施方案中，当共价连接至微流体装置的表面(例如，DEP配置的衬底表面)时，共价连接的部分可以形成单层。在一些实施方案中，由共价连接的部分形成的条件化的表面可以具有小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)的厚度。在其他的实施方案中，由共价连接的部分形成的条件化的表面可具有约10nm至约50nm的厚度。在一些实施方案中，条件化的表面不需要完美形成的单层以适当地作用于在DEP配置的微流体装置内操作。
在各种实施方案中，微流体装置的涂层材料可以提供所需的电性质。不希望受理论的限制，影响涂覆有特定涂层材料的表面的稳健性的一个因素是固有电荷捕获。不同的涂层材料可能捕获电子，这可能导致涂层材料的破坏。涂层材料中的缺陷可能增加电荷捕获并导致涂层材料的进一步破坏。类似地，不同的涂层材料具有不同的介电强度(即导致介电击穿的最小施加电场)，这可能影响电荷捕获。在某些实施方案中，涂层材料可以具有降低或限制电荷捕获量的整体结构(例如，紧密堆积的单层结构)。
除了涂层材料的组成之外，其他因素(例如涂层材料的物理(和电)厚度)可通过微流体装置的衬底影响DEP力和电润湿力的产生。各种因素可能改变涂层材料的物理厚度和电厚度，包括在衬底上沉积涂层材料的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂和静电涂覆)。涂层材料的物理厚度和均一性可使用椭偏仪测量。
除了其电性质之外，涂层材料可以具有有益于与生物分子一起使用的性质。例如，相对于未取代的烷基，含有氟代(或全氟代)烷基的涂层材料可以在减少表面结垢量方面提供益处。如本文所用的表面结垢是指沉积在微流体装置的表面上的任意物质的量，其可以包括生物物质(例如，蛋白质及其降解产物、核酸和各自的降解产物)的永久性或半永久性沉积。这样的结垢可以增加生物微物体对表面的粘附量。
可在微流体装置中使用的不同涂层材料的多种电和功能特性包括在下表中。
除了条件化的表面的组成之外，其他因素(例如疏水材料的物理厚度)可能影响DEP力。各种因素可能改变条件化的表面的物理厚度，例如在衬底上形成条件化的表面的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂、溢流和静电涂覆)。条件化的表面的物理厚度和均一性可使用椭偏仪测量。
除了其电性质之外，条件化的表面还可以具有有益于与生物分子一起使用的性质。例如，相对于烷基封端的链，含有氟代(或全氟代)碳链的条件化的表面可以在减少表面结垢量方面提供益处。如本文所用的表面结垢是指沉积在微流体装置的表面上的任意物质的量，其可以包括生物材料(例如，蛋白质及其降解产物、核酸和各自的降解产物，等等)的永久性或半永久性沉积。
表面的连接基团。形成涂层材料的共价连接部分通过连接基团连接到表面上。连接基团可以是通过含硅氧烷的试剂与衬底表面的氧化物反应形成的甲硅烷氧基连接基团，其可包括氧化硅(例如，用于DEP配置的衬底)或氧化铝或氧化铪(例如，用于EW配置的衬底)。在一些其他实施方案中，连接基团可以是通过含膦酸试剂与衬底表面的氧化物反应形成的磷酸酯。
多部分条件化的表面。如下文所述的，共价连接的涂层材料可以通过已经含有被配置为提供适合于在微流体装置中培养和扩增T细胞的有机和/或亲水分子层的部分的分子(例如，烷基硅氧烷试剂或氟取代的烷基硅氧烷试剂，其可以包括全氟代烷基硅氧烷试剂)的反应形成。或者，共价连接的涂层材料可以通过将被配置为提供适合于T细胞培养和扩增的有机和/或亲水分子层的部分偶联至表面修饰配体(它本身与表面共价连接)而形成。
制备共价连接的涂层材料的方法。在一些实施方案中，共价连接至微流体装置的表面(例如，包括隔离坞和/或流动区域的至少一个表面)的涂层材料具有式1的结构。
Figure BDA0002000596950000491
式1
涂层材料可以共价连接到DEP配置的衬底的表面的氧化物上。DEP配置的衬底可以包括硅或氧化铝或氧化铪，并且氧化物可以作为衬底的初始化学结构的一部分存在，或者可以被如下所讨论地引入。
涂层材料可以经由连接基团(“LG”)与氧化物连接，该连接基团可以是由硅氧烷或膦酸基团与氧化物反应而形成的甲硅烷氧基或膦酸酯基团。被配置为提供适合于在微流体装置中培养和扩增T细胞的有机和/或亲水分子层的部分可以是本文所述的任何部分。连接基团LG可以直接或间接连接到被配置为提供适合于在微流体装置中培养和扩增T细胞的有机和/或亲水分子层的部分。当连接基团LG直接连接至该部分时，不存在任选的连接部分(“L”)，且n为0。当连接基团LG间接连接至该部分时，存在连接部分L，且n为1。连接部分L可以具有线性部分，其中线性部分的主链可以包括1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合的非氢原子，其受本领域中已知的化学键合的限制。在一些非限制性实例中，它可以被可以选自醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基的一个或多个部分的任何组合所中断。另外，连接部分L可以具有中断连接基团的主链的一个或多个亚芳基、亚杂芳基或杂环基。在一些实施方案中，连接部分L的主链可以包括10至20个原子。在其他实施方案中，连接部分L的主链可以包括约5个原子至约200个原子；约10个原子至约80个原子；约10个原子至约50个原子；或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，主链原子均为碳原子。在其他实施方案中，主链原子不全是碳，并且可以包括硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何可能组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。
当配置成提供适于在微流体装置中培养和扩增T细胞的有机和/或亲水分子层的部分在一步工艺中加入到衬底表面时，可以使用式2的分子来引入涂层材料：
部分–(L)n–LG.
式2
在一些实施方案中，配置成提供适于在微流体装置中培养和扩增T细胞的有机和/或亲水分子层的部分可以在多步骤工艺中添加到衬底的表面。当配置成提供适于T细胞培养和扩增的有机和/或亲水分子层的部分以逐步方式偶联至表面时，连接部分L可进一步包括偶联基团CG，如式3所示。
Figure BDA0002000596950000501
式3
在一些实施方案中，偶联基团CG表示由反应性部分Rx和反应性配对部分Rpx(即，被配置为与反应性部分Rx反应的部分)的反应所得到的基团。例如，一种典型的偶联基团CG可以包括羧酰氨基基团，其是氨基与羧酸衍生物(例如，活化的酯、酰氯等)反应的结果。其他CG可以包括亚三唑基、羧酰氨基、硫代酰氨基、肟、巯基、二硫化物、醚或烯基，或者可以在反应性部分与其相应的反应性配对部分反应时形成的任何其他合适的基团。偶联基团CG可以位于连接基团L的第二末端(即，邻近被配置为提供适合于在微流体装置中培养和扩增T细胞的有机和/或亲水分子层的部分的末端)。在一些其他实施方案中，偶联基团CG可以中断连接基团L的主链。在一些实施方案中，偶联基团CG是亚三唑基，它可以由炔基和叠氮基的反应获得，它们任何一个可以是反应性部分Rx和反应性配对部分Rpx，如本领域已知用于Click偶联反应的。例如，二苯并环辛烯基稠合的亚三唑基可以是结合二苯并环辛炔基反应性配对部分Rpx与表面改性分子的叠氮基反应性部分Rx的反应得到，其在以下段落中更详细地描述。多种二苯并环辛炔基改性的分子是本领域中已知的，或可以被合成以并入配置成提供适合于T细胞培养和扩增的有机和/或亲水分子层的部分。
当涂层材料在多步骤工艺中形成时，可以通过含有部分的试剂(式5)与具有与其共价连接的表面修饰配体的衬底(式6)反应引入配置成提供适于在微流体装置中培养和扩增T细胞的有机和/或亲水分子层的部分。
Figure BDA0002000596950000511
式4的改性表面具有与其连接的表面改性配体，其具有式-LG-(L”)j-Rx，其与衬底的氧化物连接并且类似于如上对于式1的条件化表面所述地形成。衬底的表面可以是如上所述的DEP配置的衬底表面，并且可以包括衬底本身或引入其中的氧化物。连接基团LG如上所述。连接部分L”可以存在(j＝1)或不存在(j＝0)。连接部分L”可以具有直链部分，其中直链部分的主链可以包括1至100个非氢原子，选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。在一些非限制性实例中，它可以被醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基团的任何组合中断。另外，连接部分L”可以具有一个或多个亚芳基、亚杂芳基或杂环基团，它们中断连接部分的主链。在一些实施方案中，连接部分L”的主链可包含10至20个碳原子。在其他实施方案中，连接部分L”的主链可包括约5个原子至约100个原子；约10个原子至约80个原子、约10个原子至约50个原子或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，骨架原子全部是碳原子。在其他实施方案中，骨架原子不全部是碳，并且可以包括硅、碳、氮、氧、硫或磷原子的任何可能的组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。
反应性部分Rx存在于表面修饰配体的末端，远离表面修饰配体与表面的共价连接。反应性部分Rx是可用于偶联反应以引入提供适于在微流体装置中培养和扩增T细胞的有机和/或亲水分子层的部分的任何合适的反应性部分。在一些实施方案中，反应性部分Rx可以是叠氮基、氨基、溴代、巯基、活化酯、琥珀酰亚胺基或炔基部分。
含有部分的试剂。含有部分的试剂(式5)被配置成供给配置成提供适于在微流体装置中培养和扩增T细胞的有机和/或亲水分子层的部分。
部分-(L’)m-Rpx
式5
在含有部分的试剂中配置成提供适于T细胞培养和扩增的有机和/或亲水分子层的部分通过反应性配对部分Rpx与反应性部分Rx的反应与表面改性配体连接。反应性配对部分Rpx是任何合适的反应性基团，其配置成与相应的反应部分Rx反应。在一个非限制性实例中，一个合适的反应性配对部分Rpx可以是炔烃，反应性部分Rx可以是叠氮化物。反应性配对部分Rpx可以可选择地是叠氮部分，相应的反应性部分Rx可以是炔烃。在其他实施方案中，反应性配对部分Rpx可以是活性酯官能团，反应性部分Rx可以是氨基。在其他实施方案中，反应性配对部分Rpx可以是醛，反应性部分Rx可以是氨基。其他反应性部分-反应性配对部分的组合是可能的，并且这些实例决不是限制性的。
式5的含有部分的试剂的配置成提供适于T细胞培养和扩增的有机和/或亲水分子层的部分可包括本文所述的任何部分，包括烷基或氟代烷基(包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯基膦酸)；氨基(包括其衍生物，例如但不限于烷基化胺、羟烷基化氨基、胍盐和含有未芳香化的氮环原子的杂环基，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可提供膦酸阴离子表面)；磺酸根阴离子；羧基甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
式5的含有部分的试剂的配置成提供适于T细胞培养和扩增的有机和/或亲水分子层的部分可以直接连接至(即，L’，其中m＝0)或间接连接至反应性配对部分Rpx。当反应性配对部分Rpx间接连接至配置成提供适于T细胞培养和扩增的有机和/或亲水分子层的部分时，反应性配对部分Rpx可连接至连接部分L’(m＝1)。反应性配对部分Rpx可以连接到连接部分L’的第一末端，并且配置成减少表面结垢和/或防止或减少细胞粘附的部分可以连接到连接部分L’的第二末端。连接部分L’可以具有直链部分，其中直链部分的主链包括1至100个非氢原子，其选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。在一些非限制性实例中，它可以被醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基团的任何组合中断。另外，连接部分L’可以具有一个或多个亚芳基、亚杂芳基或杂环基团，它们中断连接部分L’的主链。在一些实施方案中，连接部分L’的主链可包括10至20个碳原子。在其他实施方案中，连接部分L’的主链可包括约5个原子至约100个原子；约10个原子至约80个原子；约10个原子至约50个原子；或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，骨架原子全部是碳原子。在其他实施方案中，骨架原子不全部是碳，并且可以包括硅、碳、氮、氧、硫或磷原子的任何可能的组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。
当含有部分的试剂(式5)与具有表面改性配体的表面(式3)反应时，形成具有式2的条件化表面的衬底。连接部分L’和连接部分L”然后正式成为连接部分L的一部分，并且反应性配对部分Rpx与反应部分Rx的反应产生式2的偶联基团CG。
表面改性剂。表面改性剂是具有结构LG-(L”)j-Rx(式4)的化合物。连接基团LG共价连接到衬底表面的氧化物上。衬底可以是DEP配置的衬底，并且可以包括硅或氧化铝或氧化铪，并且氧化物可以作为衬底的天然化学结构的一部分存在，或者可以如本文所讨论的那样引入。连接基团LG可以是本文所述的任何连接基团，例如甲硅烷氧基或膦酸酯基团，其由硅氧烷或膦酸基团与衬底表面上的氧化物的反应形成。反应性部分Rx如上所述。反应性部分Rx可以直接连接到(L“，j＝0)或通过连接部分L”(j＝1)间接连接到连接基团LG。连接基团LG可以连接到连接部分L”的第一末端，并且反应性部分Rx可以连接到连接部分L”的第二末端，一旦表面修饰试剂如式6中所示已经被连接到表面，反应性部分Rx将位于衬底表面的远端。
Figure BDA0002000596950000541
连接部分L”可以具有直链部分，其中直链部分的主链包括1至100个非氢原子，其选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合。在一些非限制性实例中，它可以被醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基团的任何组合中断。另外，连接部分L”可以具有一个或多个亚芳基、亚杂芳基或杂环基团，它们中断连接部分L”的主链。在一些实施方案中，连接部分L”的主链可包括10至20个碳原子。在其他实施方案中，连接部分L”的主链可包括约5个原子至约100个原子；约10个原子至约80个原子、约10个原子至约50个原子或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，骨架原子全部是碳原子。在其他实施方案中，骨架原子不全部是碳，并且可以包括硅、碳、氮、氧、硫或磷原子的任何可能的组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。
在一些实施方案中，使用化学气相沉积将涂层材料(或表面修饰的配体)沉积在微流体装置的内表面上。通过化学气相沉积，涂层材料可以实现紧密堆积的单层，其中包含涂层材料的分子共价键合到微流体装置的内表面的分子上。为了获得需要的填充密度，可以在至少110℃(例如，至少120℃、130℃、140℃、150℃、160℃等)的温度下气相沉积包含例如烷基封端的硅氧烷的分子，持续至少15小时(例如，至少20、25、30、35、40、45或更多个小时)。这种气相沉积通常在真空下和在水源(例如水合硫酸盐(例如MgSO4·7H2O))存在下进行。通常，增加气相沉积的温度和持续时间产生改善的疏水涂层材料的特性。
可以任选地改进气相沉积工艺，例如，通过预清洁盖110、微流体管路材料116和/或衬底(例如，DEP配置的衬底的电极活化衬底206的内表面208，或EW配置的衬底的支撑结构104的介电层)。例如，该预清洁可包括溶剂浴，例如丙酮浴、乙醇浴或其组合。溶剂浴可包括声处理。替代地或另外地，这种预清洁可以包括在氧等离子体清洁剂中处理盖110、微流体管路材料116和/或衬底，其可以去除各种杂质，同时引入经氧化的表面(例如，表面上的氧化物，其可以如本文所述进行共价修饰)。氧等离子体清洁剂可以例如在真空条件下以100W操作60秒。或者，可以使用液相处理(其包括氧化剂(例如过氧化氢)来氧化表面)代替氧等离子体清洁剂。例如，盐酸和过氧化氢的混合物或硫酸和过氧化氢的混合物(例如，食人鱼溶液，其可以具有约3:1至约7:1的硫酸与过氧化氢的比率范围)代替氧等离子体清洁剂。
在一些实施方案中，在微流体装置200已经被组装以形成限定微流体管路120的外壳102之后，使用气相沉积来涂覆微流体装置200的内表面。在完全组装的微流体管路120上沉积包含紧密堆积的单层的涂层材料可以有益于提供多种功能特性。不希望受理论的限制，将这样的涂层材料沉积在完全组装的微流体管路120上可能有益于防止由微流体管路材料116和电极活化衬底206介电层和/或盖110之间变弱的结合所引起的分层。
图5描绘了微流体装置500的横截面视图，该微流体装置500包括示例类别的涂层材料。如所示，涂层材料529(示意性地示出)可以包括与微流体装置500的衬底504的内表面508和盖510的内表面509两者共价结合的紧密堆积的分子单层。涂层材料529可以被设置在邻近且向内朝向微流体装置500的外壳502的所有内表面508、509上，在一些实施方案中并且如上文所讨论的，包括用于定义微流体装置500内的管路元件和/或结构的微流体管路材料的表面(未示出)。在可选的实施方案中，涂层材料529可以仅被设置在微流体装置500的一个或一些内表面上。
在图5所示的实施方案中，涂层材料529包含烷基封端的硅氧烷分子单层，每个分子经由甲硅烷氧基共价键合到微流体装置500的内表面508、509。然而，可以使用任何上述涂层材料529(例如烷基封端的膦酸酯分子)。更具体地，烷基可包含至少10个碳原子(例如10、12、14、16、18、20、22或更多个碳原子)的直链，并且任选地，可以是取代的烷基。如上所述，包含紧密堆积的分子单层的涂层材料529可具有用于DEP配置的微流体装置500的有益功能特性，例如最小电荷捕获、减小的物理/电厚度和基本均匀的表面。
在另一个具体的实施方案中，涂层材料529可在其面向外壳的末端(即未结合到内表面508、509并且靠近外壳502的涂层材料529的单层的部分)包含氟代烷基(例如氟代烷基或全氟代烷基)。如上所述，涂层材料529可包括氟代烷基封端的硅氧烷或氟代烷基封端的膦酸酯单层，其中氟代烷基存在于涂层材料529的面向外壳的末端。这种涂层材料529通过将T细胞与非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)分离或“屏蔽”，提供改善的T细胞培养和扩增的功能益处。
在其他具体的实施方案中，用于涂覆微流体装置500的内表面508、509的涂层材料529可以包括阴离子、阳离子或两性离子部分，或其任何组合。不希望受理论的限制，通过在微流体管路500的外壳502的内表面上提供阳离子部分、阴离子部分和/或两性离子部分，涂层材料529可以与水分子形成强的氢键，使得所产生的水合水充当将核(nuclei)与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。另外，在涂层材料529与阻断剂结合使用的实施方案中，涂层材料529的阴离子、阳离子和/或两性离子可以与存在于外壳502中的介质180(例如，阻断溶液)中的阻断剂(例如，溶液中的蛋白质)的带电荷部分形成离子键。
在另一个具体的实施方案中，涂层材料可以包含或经化学修饰以在其朝向外壳的末端提供亲水涂覆剂。在一些实施方案中，涂覆剂可以是含亚烷基醚的聚合物，例如PEG。在一些实施方案中，涂覆剂可以是多糖，例如葡聚糖。与上文所讨论的带电荷部分(例如，阴离子、阳离子和两性离子部分)一样，亲水涂覆剂可以与水分子形成强的氢键，使得所得的水合水充当将核与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。
富集方法。本文公开的装置可用于分选T淋巴细胞，并且例如提供富集的T淋巴细胞群，特别是对目标抗原具有功能性反应的活化的T淋巴细胞。图11提供了一种这样的方法1100的概述。
在步骤1110，从受试者获得外周血样品。受试者可以是人类供体或一些其他类型的动物，例如哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、绵羊、猪、牛、马、灵长类动物等)、禽、爬行动物、两栖动物等。受试者可以是健康的，或者受试者可能患有病症。例如，对于人类受试者，该病症可由病原生物引起，例如细菌病原体、真菌病原体、寄生病原体或病毒病原体。或者，该病症可以是一种形式的癌症。对于非人动物，动物可患有任何前述病症(即，被病原体感染或癌症)，和/或动物可具有作为相应人类病症模型的病症。
可以通过白细胞分离术处理外周血样品以获得外周血单核细胞(PBMC)。PBMC可以洗涤和冷冻以备后用。或者，可以洗涤PBMC并立即进行进一步处理。
在步骤1120，可以从PBMC分离CD8+ T淋巴细胞。许多不同的商业试剂盒可用于从PBMC分离CD8+ T淋巴细胞。实例包括基于珠子的纯化试剂盒，例如EasySepTM Human CD8+ T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)和EasySepTM Human Naive CD8+ T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)。可以根据是否需要所有CD8+ T细胞或仅需要某些亚群(例如未经免疫的CD8+ T细胞)来选择不同的试剂盒。在一些实施方案中，未经免疫的CD8+ T细胞可以为步骤1130(抗原特异性活化)提供良好的起始材料。
作为基于珠子的纯化的替代方案，FACS细胞分选可用于获得CD8+ T细胞和任选的CD8+未经免疫的T细胞。例如，荧光标记的抗CD8抗体可用于FACS分选。如本领域技术人员将理解的，可以使用许多不同的抗体和抗体组合来获得所需的CD8+ T细胞群。例如，抗CD45RO(用于阴性选择)和抗CCR7抗体(用于阳性选择)抗体的组合可用于分离CD8+未经免疫的T细胞群。另外，可以使用抗CD45RA和/或抗CD62L抗体。代替CD8+未经免疫的T细胞，可以使用上述相同的抗体纯化中枢记忆T细胞(TCM)，尽管使用不同(例如，抗CD45RO用于阳性选择，抗CD45RA用于阴性选择，抗CCR7用于阳性选择等)。
在步骤1130，使CD8+ T细胞样品与已知抗原接触以刺激抗原特异性活化。已知抗原可以是人工抗原呈递细胞(aAPC)的一部分。可以设计aAPC以呈递与抗原肽结合的MHC I类分子。MHC I类分子可以作为四聚体连接，如美国专利5,635,363中所述，其全部内容通过引用并入本文。例如，在2013年6月13日公开的PCT申请WO2013/086500、2014年10月2日公开的WO2014/160132和2016年3月24日公开的WO2016/044530中描述了aAPC，其全部内容通过引用并入本文。接触的CD8+ T细胞的数量可以是约1×105至约1×107(例如，约5×105至约5×106或约1×106)。aAPC:CD8+ T细胞的比可以变化。例如，该比可以是5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。
温育可以例如在微量滴定板的孔内进行。温育的长度可以是至少约12小时(例如，约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约84小时、约96小时、约108小时、大约120小时，或由前述两个值定义的任何范围)。温育可以在T细胞培养基中进行，其实例在本领域中是众所周知的。参见，例如，Ho等人(2006),J.Immunological Methods310:40-52和2017年3月16日提交的国际申请号PCT/US17/22846。细胞培养基可以补充CD28激动剂(例如，2微克/mL的抗CD28激动剂抗体)或CD28激动剂可以与aAPC结合。培养物可以保持在标准条件下(例如，在37℃，5％CO2下)。
作为使用aAPC的替代方案，可以使用已经用含有目标抗原的抗原肽攻击的DC。例如，在2017年3月16日提交的国际申请号PCT/US17/22846中描述了DC的使用。
许多不同的抗原肽是本领域已知的。实例包括：Melan-A的M27L肽(Ho等人(2006)，如上所述)；Wilms肿瘤蛋白的WT1126肽(也在Ho等人(2006)中描述)；和NY-ESO-1(Pollack等人(2014),J.Immunother Cancer 2:36)。肽的选择可取决于aAPC上或DC中存在的MHC I类分子的类型。
在步骤1140，预期在步骤1130已经与活化剂接触的CD8+ T淋巴细胞样品包括一些抗原特异性的扩增的活化T细胞。通过使样品流过具有柱阵列的微流体装置可以选择性地富集这样的T细胞，所述柱阵列被配置为将活化的T细胞与静息/未经免疫的T细胞分离。微流体装置(和其中包含的柱阵列)可以如本文的各种实施方案中所述。因此，微流体装置可具有通常如图7A中的微流体装置700所示的配置。例如，柱阵列可具有约6微米的预测临界尺寸(Dc)，倾斜角ε＝1/12弧度，同一列中柱之间的间隙为25微米，并且柱为三角形且具有约50微米直径。或者，微流体装置可具有通常如图7B中的微流体装置715所示的配置。柱阵列可具有约6微米的预测临界尺寸(Dc)，倾斜角ε＝1/12弧度，同一列中柱之间的间隙为25微米，柱为三角形且具有约50微米直径，并且微流体装置包括DEP配置。
在使样品流过微流体装置之前，缓冲液可以快速(例如，10至100微升/秒)流过装置以消除气泡。接下来，来自步骤1140的接触/活化的T细胞样品可以以约1.0至约10微升/秒的速率或使用约10psi至约30psi的压力(例如，约20psi)流过微流体装置的柱阵列。
在步骤1140之前，可以标记从步骤1130获得的温育的样品以鉴定特异性结合抗原的个体T细胞。例如，来自步骤1130的样品可以与荧光标记的可溶性MHC I类四聚体接触，以促进抗原特异性T淋巴细胞的标记和鉴定，所述可溶性MHC I类四聚体与抗原肽(如合适)结合。这种标记和鉴定可用于选择单个T淋巴细胞用于移动到微流体装置(例如图7B的装置715)上的隔离坞725中，并随后进行克隆。或者，在隔离坞725中克隆单个T淋巴细胞后，结合抗原肽(如合适)的荧光标记的可溶性MHC I类四聚体可以流入微流体装置715的分选通道720并允许扩散到隔离坞725中，由此可以标记和鉴定抗原特异性T淋巴细胞克隆。如下所述，这样的标记和鉴定可用于选择T淋巴细胞克隆用于输出和随后的分析。
在步骤1150，可以任选地在微流体装置内扩增富集的活化的CD8+ T淋巴细胞样品。例如，在样品穿过微流体装置中的柱阵列之后，可以停止流体通过装置的流动。如果微流体装置包括隔离坞，例如图7B的微流体装置715所示，可以选择单个T淋巴细胞并移动到相应的隔离坞，并且可以使分离的T淋巴细胞生长成细胞的克隆群。以这种方式在微流体装置内克隆活化的T淋巴细胞已在例如上文提到的2017年3月16日提交的国际申请号PCT/US17/22846中描述。
在步骤1160，可以从微流体装置输出通过与活化剂接触而活化的T细胞。对于诸如图7A的微流体装置700的装置，这种输出在分选后立即发生，并且从分选的出口708收集活化的T细胞。对于诸如图7B的微流体装置715的装置，在隔离坞725中成功扩增的T细胞克隆可以移回到通道720(例如，第二通道)中并使用流体流输出通过出口708/710。活化的T细胞克隆从坞中离开的运动可以例如使用DEP力完成，其可以例如用OEP来光学驱动。
无论微流体装置的确切配置和输出时间为何，都可以收集活化的T细胞，并且任选地，进一步在离开芯片后扩增或在各种测定中测试。例如，选择T细胞可以进行TCR测序以鉴定抗原特异性TCR。或者，从微流体装置700的出口收集的活化的CD8+ T淋巴细胞的富集样品可以在被引入患有黑素瘤的患者之前使用快速扩增方案(REP)扩增。REP在本领域中是已知的。参见，例如，如上所述的Ho等人(2006)。
实施例
实施例1：微流体装置中基于柱阵列的活化的人T淋巴细胞和静息人T淋巴细胞的 分离
通过与抗CD3/抗CD28磁珠(DYNABEADSTM,Thermo Fisher Scientific,Inc.)以1个珠子/1个细胞的比例混合来活化从外周血分离的CD3+人T淋巴细胞。将混合物在5％CO2培养箱中于37℃温育5小时。温育后，将活化的T细胞/珠子混合物重新悬浮并用CellTrackerTM荧光标记物(Thermo Fisher Scientific,Inc.)标记。然后使标记的T细胞流过具有柱阵列的微流体装置，所述柱阵列具有约9微米的预测临界尺寸(Dc)，流速为约0.1微升/秒。柱阵列的特征为倾斜角ε＝1/15弧度，同一列中的柱之间具有30微米的间隙。柱具有圆形形状，直径约50微米。
标记的T细胞在它们流过柱阵列时成像。如图8所示，具有“较大”尺寸的活化的T细胞以阵列的“分选方向”(即，通常沿着由柱的行限定的轴)穿过柱阵列，同时具有“较小”尺寸的活化的T细胞通常以流体流过阵列的方向(即，通常沿着由包含柱阵列的微流体装置的区域限定的流动路径的方向)穿过柱阵列。静息T细胞也通常以流体流过阵列的方向穿过柱阵列。
该实验证明T淋巴细胞具有不同的尺寸，并且可以通过使它们流过合适配置的柱阵列而基于这种尺寸差异进行分选。
实施例2：在微流体装置中处理活化和静息T淋巴细胞的混合群后活化的人T淋巴 细胞的富集
总体上如实施例1所示，通过与抗CD3/抗CD28磁珠(DYNABEADSTM,Thermo FisherScientific,Inc.)以1个珠子/1个细胞的比例混合来活化从外周血分离的CD3+人T淋巴细胞。温育后，将T淋巴细胞的活化群重新悬浮并用具有红色荧光标记的CellTrackerTM试剂(Thermo Fisher Scientific,Inc.)标记。同时，用具有绿色荧光标记的CellTrackerTM试剂标记从外周血分离的CD3+ T淋巴细胞的未活化群(即“静息”群)。然后，将T淋巴细胞的活化群与T淋巴细胞的静息群混合以产生密度为约1.2×106个细胞/mL的T淋巴细胞混合物，其中约5％的T淋巴细胞来自活化群。
使400微升的T淋巴细胞混合物流过微流体装置，该微流体装置具有总体上如图7A中的微流体装置700所示的配置，具有两个入口702/704，位于装置的流动路径的第一区域中的柱阵列706，和两个出口708/710。使T淋巴细胞混合物流入样品入口702，同时使缓冲液(DPBS，5mM EDTA，10mM Hepes，2％FBS)流入第二入口704。淋巴细胞混合物和缓冲液共同流过微流体装置，淋巴细胞混合物由加压贮液器提供有28psi的压力，缓冲液由加压贮液器提供有30psi的压力。柱阵列的预测临界尺寸(Dc)为约5微米，倾斜角ε＝1/12弧度，同一列中柱之间的间隙为17.5微米，并且柱呈菱形并且直径为约70微米。从收集出口708(“分选的样品”)和废物出口710(“废物样品”)收集处理的细胞样品。
在BD FACSAriaTM细胞分选仪(Becton Dickinson)上分析一部分起始T淋巴细胞混合物和每个分选样品和废弃样品。如图9A所示，起始T淋巴细胞混合物的前向散射分析鉴定出两个主峰，一个代表较小的静息T淋巴细胞，不全第二个代表较大的活化的T淋巴细胞。基于CellTrackerTM绿色/CellTrackerTM红色标记分析样品(图9B-9D)也鉴定了两种主要类型的细胞。如预期的，在起始T淋巴细胞混合物中(图9B)，93.5％的细胞被鉴定为源自静息T淋巴细胞群(即，绿色++/红色-)，并且4.9％的细胞被鉴定为源自活化的T淋巴细胞群(即，绿色-/红色++)。废物样品与起始T淋巴细胞样品相似，尽管活化的T淋巴细胞群中有一些细胞消耗(图9C)，97.1％的细胞被鉴定为源自静息T淋巴细胞群，1.54％的细胞被鉴定为源自活化的T淋巴细胞群。相反，在分选的群中(图9D)，1.06％的细胞被鉴定为源自静息T淋巴细胞群，并且97.9％的细胞被鉴定为源自活化的T淋巴细胞群。分选的样品中总共8738个细胞被鉴定为源自活化的T淋巴细胞群，对应于59％的产率和914％的富集。在该实施例中，富集计算为(N+ 离开/N- 离开)/(N+ 进入/N- 进入)，其中N+ 离开是在分选的样品中检测到的活化的T淋巴细胞的数量，N- 离开是在分选的样品中检测到的静息T淋巴细胞的数量，N+ 进入是在起始混合物中检测到的活化的T淋巴细胞的数量，并且N- 进入是在起始混合物中检测到的静息淋巴细胞的数量。
该实验证明，所公开的微流体装置能够处理活化和静止T淋巴细胞的混合物，从而产生实质上富集活化的T淋巴细胞的细胞群。可以产生用于产生这些结果的柱阵列的许多变体，其具有约6微米的临界直径Dc，并且预期任何这样的变体基本上如上所示产生活化的T淋巴细胞的富集样品。
实施例3：在具有旁路通道和以隔离坞为特征的分选通道的微流体装置中活化的 人T淋巴细胞的富集
总体上如实施例1所示，通过与抗CD3/抗CD28磁珠(DYNABEADSTM,Thermo FisherScientific,Inc.)以1个珠子/1个细胞的比例混合来活化从外周血分离的CD3+人T淋巴细胞。温育后，将T淋巴细胞的活化群重新悬浮并用具有红色荧光标记的CellTrackerTM试剂(Thermo Fisher Scientific,Inc.)标记。同时，用具有绿色荧光标记的CellTrackerTM试剂标记从外周血分离的CD3+ T淋巴细胞的未活化群(即“静息”群)。然后将T淋巴细胞的活化群与T淋巴细胞的静息群混合以产生密度为约1.0×106个细胞/mL的T淋巴细胞混合物，其中约50％的T淋巴细胞来自活化群。
使T淋巴细胞混合物流过微流体装置，该微流体装置具有总体上如图7B中的微流体装置715所示的配置，具有单个入口702，位于装置主通道的第一区域中的柱阵列706，用作旁路通道的第一通道730，用作分选通道720的第二通道720，和位于第一通道730和第二通道720连接在一起的位置的下游紧邻的单个出口708/710。多个隔离坞725(参见图10)具有通向第二通道的连接区域。T淋巴细胞混合物以约1.0微升/秒的速率流入样品入口702并通过柱阵列706。柱阵列的预测临界尺寸(Dc)为约6微米，倾斜角ε＝1/12弧度，同一列中柱之间的间隙为25微米，并且柱呈三角形并且直径为约50微米(在这种情况下，定义为高为50微米，底为50微米)。
在使T淋巴细胞混合物流过柱阵列706后，将流速降至零，并且拍摄如图10所示的微流体芯片的图像。对图像的分析显示第二通道720中活化的T淋巴细胞(染成红色)的密度为约4.1×106个细胞/mL+/-2.6％。由于起始混合物具有约5×105个细胞/mL的活化的T淋巴细胞密度，这表示富集约8倍。在该实施例中，富集计算为P+ 离开/P+ 进入，其中P+ 离开是在第二通道中检测到的活化的T淋巴细胞的浓度，P+ 进入是在起始混合物中检测到的活化的T淋巴细胞的浓度。
实施例4：人T淋巴细胞的抗原特异性活化，随后在微流体装置中富集
步骤1：从健康人供体获得外周血样品，并通过白细胞分离术从样品中收获外周血单核细胞(PBMC)。PBMC可以洗涤和冷冻以备后用，或立即处理。
步骤2：使用EasySepTM Human CD8+ T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)从PBMC分离CD8+ T淋巴细胞。
步骤3：通过使5×106个细胞/mL的CD8+ T淋巴细与呈递与Melan-A的M27L肽结合的MHC I类四聚体的人工抗原呈递细胞(aAPC)以1个T细胞:l个aAPC的比例接触，以抗原特异性方式活化5×106个细胞/mL的CD8+ T淋巴细胞。例如，aAPC描述于2013年6月13日公开的PCT申请WO2013/086500，2014年10月2日公开的WO2014/160132和2016年3月24日公开的WO2016/044530，其全部内容通过引用并入本文。MHC I类分子的四聚体描述于美国专利5,635,363，其全部内容通过引用并入本文。例如，M27L肽(其是与黑素瘤相关的肿瘤抗原)已经描述于Ho等人(2006),Journal of Immunological Methods 310:40-52，其全部内容通过引用并入本文。
在T细胞培养基中接触CD8+ T淋巴细胞，T细胞培养基含有2ug/mL可溶性功能级抗CD28抗体(克隆15E8，Miltenyi 130-093-375)。各种T细胞培养基在本领域中是已知的。参见，例如，上面引用的Ho等人(2006)和2017年3月16日提交的国际申请号PCT/US17/22846。接触步骤在芯片外在5％CO2培养箱中于37℃在96孔板中进行3至4天。
步骤4：预期已经活化的CD8+ T淋巴细胞被扩增，因此通过使在步骤3中温育结束时获得的样品流过微流体装置来选择性地富集已经活化的CD8+ T淋巴细胞，微流体装置具有总体上如图7A中的微流体装置700所示的配置。柱阵列的预测临界尺寸(Dc)为约6微米，倾斜角ε＝1/12弧度，同一列中柱之间的间隙为25微米，并且柱呈三角形并且直径为约50微米(如上文实施例3中所述)。来自步骤3的温育样品以约1.0至约10微升/秒的速率流过微流体装置的柱阵列。
步骤5：从微流体装置的出口收集活化的CD8+ T淋巴细胞的富集样品，此时CD8+ T淋巴细胞可以进一步扩增到芯片外或在各种免疫学测定中测试。
可以结合到前述方法中的变化包括：
在步骤1，外周血可以从患有黑素瘤的人供体获得，或者取决于步骤3中使用的抗原肽从患有不同的相应癌症的人供体获得。
在步骤2，可以使用EasySepTM Human Naive CD8+ T细胞富集试剂盒(Stem CellTechnologies)从PBMC中分离CD8+未经免疫的T淋巴细胞。
在步骤2中，可以使用FACS和抗CD45RO抗体(用于阴性选择)和抗CCR7抗体(用于阳性选择)的组合从PBMC分离CD8+未经免疫的T淋巴细胞；可用于阳性选择CD8+未经免疫的T淋巴细胞的其他抗体包括抗CD45RA和/或抗CD62L抗体。
在步骤2，可以使用FACS和抗CD8抗体从PBMC分离CD8+ T淋巴细胞。
在步骤3，aAPC呈递与Wilms肿瘤蛋白的WT1126肽结合的MHC I类四聚体，其在广谱的白血病、淋巴瘤和实体瘤中广泛表达。在步骤3中使用WT1126肽可以与在步骤1获得患有任何Wilms肿瘤相关癌症的人类供体的外周血相结合。
在步骤3，抗CD28抗体可以与aAPC缀合，而不是在培养基中提供。
在步骤3，aAPC可以用已经用抗原性肿瘤相关肽攻击的树突细胞(DC)代替，所述肽可以是Melan-A的M27L肽、Wilms肿瘤蛋白的WT1126肽或一些其他肿瘤-相关肽。制备这类DC的方法及其在刺激CD8+ T淋巴细胞中的用途是本领域已知的。参见，例如，Ho等人(2006)和2017年3月16日提交的国际申请号PCT/US17/22846，两者都在上面提到。
在步骤4，在步骤3的温育之后获得的样品流过微流体装置的柱阵列，该微流体装置具有总体上如图7B中的微流体装置715所示的配置。柱阵列具有约6微米的预测临界尺寸(Dc)，倾斜角ε＝1/12弧度，同一列中柱之间的间隙为25微米，并且柱呈三角形并且直径为约50微米(如上文实施例3所述)，微流体装置包括DEP配置。使步骤3的温育样品以约0.1微升/秒的速率流过柱阵列，直到分选通道720充满分选的T淋巴细胞，此时停止流动。选择单个T淋巴细胞并移至相应的隔离坞725，由此将分离的T淋巴细胞培养成细胞的克隆群。以这种方式在微流体装置内克隆活化的T淋巴细胞已描述于例如上文提到的2017年3月16日提交的国际申请号PCT/US17/22846中。克隆后，可以从微流体装置输出来自选择的T细胞克隆的一个或多个细胞用于后续分析，其可以包括TCR测序以鉴定抗原特异性TCR。
恰好在步骤4之前，可以使步骤3的温育样品与结合于Melan-A的M27L肽(或其他抗原肽，如合适)的荧光标记的可溶性MHC I类四聚体接触，以促进微流体装置715的分选通道720中抗原特异性T淋巴细胞的标记和鉴定。这种标记和鉴定可用于选择单个T淋巴细胞以移动到隔离坞725中并随后进行克隆。
或者，在隔离坞725中克隆单个T淋巴细胞后，可以将与Melan-A的M27L肽(或其他抗原肽，如合适)结合的荧光标记的可溶性MHC I类四聚体流入微流体装置715的分选通道720中，并允许扩散到隔离坞725中，由此可以标记和鉴定抗原特异性T淋巴细胞克隆。如上所述，这样的标记和鉴定可用于选择T淋巴细胞克隆以用于输出和随后的分析。
在步骤5，从微流控装置700的出口收集的活化的CD8+ T淋巴细胞的富集样品可用于治疗患有黑素瘤的患者。这种变化可以通过步骤1的变化来实施，其中患有黑素瘤的受试者是外周血供体。作为外周血供体的受试者也可以是用活化的CD8+ T淋巴细胞的富集样品治疗的患者。任选地，从微流控装置700的出口收集的活化的CD8+ T淋巴细胞的富集样品可以在被引入患有黑素瘤的患者之前使用快速扩增方案(REP)扩增。REP在本领域中是已知的。参见，例如，上文引用的Ho等人(2006)。
实施方案列表
实施方案1.一种使用微流体装置生产富集活化的T淋巴细胞的样品的方法，微流体装置包括具有第一区域的流动路径，第一区域包括第一柱阵列，所述方法包括：使包含活化和静息T淋巴细胞的混合物的流体样品流过微流体装置的流动路径的第一区域，其中：流动路径的第一区域中流体流动方向限定第一方向；第一阵列中的柱布置成行和列；第一阵列中柱的行限定第一阵列方向，第一阵列方向与第一区域的第一方向相差倾斜角(ε)，并且第一阵列中柱的列周期性地重复，周期等于l/ε，其中ε以弧度测量；第一阵列中每个相应列中的相邻柱通过间隙分开，流体样品的流体可以相对于列整体上横向流动通过间隙，其中大部分间隙具有对应于第一阵列的主要间隙尺寸的特征尺寸，并且第一阵列的特征在于临界尺寸(Dc)为约4微米至约10微米。
实施方案2.如实施方案1所述的方法，其中流动路径的第一区域由具有宽度的主通道限定，并且其中第一柱阵列跨主通道的整个宽度延伸。
实施方案3.如实施方案1或2所述的方法，其中第一阵列的特征在于Dc为约4微米至约5微米、约4.5微米至约5.5微米、约5微米至约6微米、约5.5微米至约6.5微米、约6微米至约7微米、约6.5微米至约7.5微米、约7微米至约8微米、约7.5微米至约8.5微米、约8微米至约9微米、约8.5微米至约9.5微米、约9微米至约10微米，或由两个前述端点限定的任何范围。
实施方案4.如实施方案1或2所述的方法，其中第一阵列的特征在于Dc为约4微米至约7微米。
实施方案5.如实施方案1或2所述的方法，其中第一阵列的特征在于Dc为约7微米至约10微米。
实施方案6.如实施方案1或5所述的方法，其中第一阵列的倾斜角ε为约1/3弧度至约1/100弧度。
实施方案7.如实施方案1至5中任一项所述的方法，其中第一阵列的倾斜角ε为约1/5弧度至约1/30弧度。
实施方案8.如实施方案1至5中任一项所述的方法，其中第一阵列的倾斜角ε为约1/10弧度至约1/16弧度。
实施方案9.如实施方案1至8中任一项所述的方法，其中第一阵列的主要间隙尺寸为约15微米至约25微米。
实施方案10.如实施方案1至8中任一项所述的方法，其中第一阵列的主要间隙尺寸为约25微米至约40微米。
实施方案11.如实施方案1至10中任一项所述的方法，其中第一阵列的柱的直径为约30微米至约100微米(例如，约40微米至约85微米，或约50微米至约70微米)。
实施方案12.如实施方案10或11所述的方法，其中第一阵列的柱的直径大于主要间隙尺寸(例如，大1.5至5倍)。
实施方案13.如实施方案10或11所述的方法，其中第一阵列的柱的直径比主要间隙尺寸大二至四倍。
实施方案14.如实施方案1至13中任一项所述的方法，其中第一阵列的列相对于第一区域的第一方向横向布置。
实施方案15.如实施方案1至14中任一项所述的方法，其中第一阵列的柱的横截面为圆形(例如，圆形或椭圆形)。
实施方案16.如实施方案1至14中任一项所述的方法，其中第一阵列的柱的横截面为多边形(例如，三角形、正方形、菱形或平行四边形形状)。
实施方案17.如实施方案15或16所述的方法，其中第一阵列的柱都具有相同定向，并且其中定向使得柱的横截面形状中没有对称轴平行于由第一方向限定的轴。
实施方案18.如实施方案1至17中任一项所述的方法，其中第一阵列的柱包含硅氧烷聚合物。
实施方案19.如实施方案1至18中任一项所述的方法，其中流动路径的第一区域包括第一侧壁和第二侧壁，第一侧壁和第二侧壁一起限定第一方向，其中第一阵列的列中相邻柱之间的所有间隙等于第一阵列的主要间隙尺寸，除了与第一或第二侧壁最接近的同一列的相邻柱之间的间隙尺寸可以偏离主要间隙尺寸，并且其中第一阵列中柱之间的间隙尺寸的偏离减小了流体样品流过第一阵列时由第一和第二侧壁另行引起的边界不规则性。
实施方案20.如实施方案1至19中任一项所述的方法，其中微流体装置的流动路径包括第二区域，第二区域被配置成在流体样品穿过微流体装置的第一区域之后接收流体样品，第二区域具有分隔器，其将第二区域分成接收流体样品的第一部分的第一通道和接收流体样品的第二部分的第二通道，并且其中第二区域的分隔器定位成使得相对于流体样品，在流体样品的第二部分中富集直径大于Dc的T淋巴细胞。
实施方案21.如实施方案20所述的方法，其中直径小于Dc的T淋巴细胞主要位于流体样品的第一部分中。
实施方案22.如实施方案20或21所述的方法，其中流体样品的第一部分包含流体样品的至少50％(例如至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多)。
实施方案23.如实施方案20或21所述的方法，其中流体样品的第一部分包含流体样品的约85％至约95％。
实施方案24.如实施方案20至23中任一项所述的方法，其中第一通道和第二通道被配置成使得跨第一通道的压差等于跨第二通道的压差。
实施方案25.如实施方案20至24中任一项所述的方法，其中第一通道包括第一长度，且第二通道包括第二长度，并且其中第二长度大于第一长度(例如，其中第二通道的第二长度比第一通道的第一长度长至少5倍)。
实施方案26.如实施方案20至25中任一项所述的方法，其中微流体装置包括至少一个隔离坞，隔离坞具有连接区域，连接区域具有通向第二通道的近端开口，并且进一步地，其中至少一个隔离坞具有隔离区域，隔离区域具有足够大的体积以容纳至少一个T淋巴细胞(例如，多个T淋巴细胞)。
实施方案27.如实施方案26所述的方法，其中微流体装置包括多个隔离坞，每个隔离坞均具有连接区域，连接区域具有通向第二区域的第二通道的近端开口，并且每个隔离坞均具有隔离区域，隔离区域具有足够大的体积以容纳至少一个T淋巴细胞(例如，多个T淋巴细胞)。
实施方案28.如实施方案26或27所述的方法，其中隔离坞或多个隔离坞的每个隔离坞的体积为约250pL至约3nL(例如，约250pL至约750pL、约400pL至约900pL、约500μL至约1.5nL、约1nL至约2nL、约1.5nL至约2.5nL、约2nL至约3nL，或由两个前述端点限定的任何范围)。
实施方案29.如实施方案20至28中任一项所述的方法，其中具有CD8+、CD45RO+/RA-、CCR7-、CD62L-表型的T淋巴细胞富集在流体样品的第二部分中。
实施方案30.如实施方案20至28中任一项所述的方法，其中具有CD8+、CD45RO+/RA-、CCR7+、CD62L-表型的T淋巴细胞富集在流体样品的第二部分中。
实施方案31.如实施方案1至30中任一项所述的方法，其中第一区域的长度为约5mm至约15mm。
实施方案32.如实施方案1至31中任一项所述的方法，其中流体样品流过流动路径的第一区域的速率为约0.01微升/秒至约10微升/秒(例如约0.001至约0.01微升/秒、约0.005至约0.05微升/秒、约0.01至约0.1微升/秒、约0.05至约0.5微升/秒、约0.1至约1.0微升/秒、约0.5至约5微升/秒、约1.0至约10微升/秒、约5至约50微升/秒、约10至约100微升/秒、约15至约50微升/秒、约25至约75微升/秒、约50至约100微升/秒，或由两个前述端点限定的任何范围)。
实施方案33.如实施方案20至32中任一项所述的方法，其中第二通道包括第一子区域，第一子区域包括第二柱阵列，其中使流体样品流过流动路径的第一区域引起流体样品的第二部分连同其中包含的任何细胞流过第一子区域中的第二柱阵列，并且进一步地，其中：第二通道的第一子区域中流体流动的方向限定第二方向；第二阵列中的柱布置成行和列；第二阵列中柱的行限定第二阵列方向，第二阵列方向与第二方向相差倾斜角(ε')，并且第二阵列中柱的列周期性地重复，周期等于1/ε'，其中ε'以弧度测量；第二阵列中的每个相应列中的相邻柱通过间隙分开，流体样品的第二部分的流体可以相对于列整体上横向流动通过间隙，其中大部分间隙具有对应于第二阵列的次要间隙尺寸的特征尺寸，并且第二阵列的特征在于临界尺寸(Dc)为约4微米至约10微米。
实施方案34.如实施方案33所述的方法，其中第二通道具有宽度，并且其中第二柱阵列在第二通道的整个宽度上延伸。
实施方案35.如实施方案33或34所述的方法，其中第二阵列的特征在于Dc为约4微米至约5微米、约4.5微米至约5.5微米、约5微米至约6微米、约5.5微米至约6.5微米、约6微米至约7微米、约6.5微米至约7.5微米、约7微米至约8微米、约7.5微米至约8.5微米、约8微米至约9微米、约8.5微米至约9.5微米、约9微米至约10微米，或由两个前述端点限定的任何范围。
实施方案36.如实施方案35所述的方法，其中第二柱阵列的特征在于Dc为约4微米至约7微米。
实施方案37.如实施方案35所述的方法，其中第二柱阵列的特征在于Dc为约7微米至约10微米。
实施方案38.如实施方案33至37中任一项所述的方法，其中第二阵列的倾斜角ε为约1/3弧度至约1/100弧度。
实施方案39.如实施方案33至37中任一项所述的方法，其中第二阵列的倾斜角ε'为约1/5弧度至约1/30弧度。
实施方案40.如实施方案33至37中任一项所述的方法，其中第二阵列的倾斜角ε'为约1/10弧度至约1/16弧度。
实施方案41.如实施方案33至40中任一项所述的方法，其中第二阵列的次要间隙尺寸为约15微米至约25微米。
实施方案42.如实施方案33至40中任一项所述的方法，其中第二阵列的次要间隙尺寸为约25微米至约40微米。
实施方案43.如实施方案33至42中任一项所述的方法，其中第二阵列的柱的直径为约30微米至约100微米(例如，约40微米至约85微米或约50微米至约70微米)。
实施方案44.如实施方案41或42所述的方法，其中第二阵列的柱的直径大于次要间隙尺寸(例如，大1.5至5倍)。
实施方案45.如实施方案41或42所述的方法，其中第二阵列的柱的直径比次要间隙尺寸大两至四倍。
实施方案46.如实施方案33至45中任一项所述的方法，其中第二阵列的列相对于第二通道的第一子区域的第二方向横向布置。
实施方案47.如实施方案33至46中任一项所述的方法，其中第二阵列的柱的横截面为圆形(例如，圆形或椭圆形)。
实施方案48.如实施方案33至46中任一项所述的方法，其中第二阵列的柱的横截面为多边形(例如，三角形、正方形、菱形或平行四边形形状)。
实施方案49.如实施方案47或48所述的方法，其中第二阵列的柱都具有相同定向，并且其中定向使得柱的横截面形状中没有对称轴平行于由第二方向限定的轴。
实施方案50.如实施方案33至49中任一项所述的方法，其中第二阵列的柱包含硅氧烷聚合物。
实施方案51.如实施方案33至50中任一项所述的方法，其中第二通道的第一子区域包括第三侧壁和第四侧壁，第三侧壁和第四侧壁一起限定第二方向，其中第二阵列的列中相邻柱之间的所有间隙等于第二阵列的次要间隙尺寸，除了与第三或第四侧壁最接近的同一列的相邻柱之间的间隙尺寸可以偏离次要间隙尺寸，并且其中第二阵列中柱之间的间隙尺寸的偏离减小了流体样品的第二部分流过第二阵列时由第三和第四侧壁另行引起的边界不规则性。
实施方案52.如实施方案33至51中任一项所述的方法，其中第二通道包括第二子区域，第二子区域被配置成在流体样品的第二部分穿过第一子区域之后接收流体样品的第二部分，第二子区域具有分隔器，其将第二通道分成第三通道和第四通道，第三通道接收来自流体样品的第二部分的流体的第一子部分，第四通道接收来自流体样品的第二部分的流体的第二子部分，并且其中将第二子区域的分隔器定位成使得相对于流体样品的第二部分，在流体的第二子部分中富集直径大于Dc的T淋巴细胞。
实施方案53.如实施方案52所述的方法，其中直径小于Dc的T淋巴细胞主要位于流体的第一子部分中。
实施方案54.如实施方案52所述的方法，其中流体的第一子部分包含流体样品的第二部分的至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多)。
实施方案55.如实施方案52所述的方法，其中流体的第一子部分包含流体样品的第二部分的约85％至约95％。
实施方案56.如实施方案52至55中任一项所述的方法，其中第三通道和第四通道被配置成使得跨第三通道的压差等于跨第四通道的压差。
实施方案57.如实施方案56所述的方法，其中第三通道包括第三长度，且第四通道包括第四长度，并且其中第四长度大于第三长度。
实施方案58.如实施方案57所述的方法，其中第四长度比第三长度长至少5倍。
实施方案59.如实施方案52至58中任一项所述的方法，其中微流体装置包括至少一个隔离坞，隔离坞具有连接区域，连接区域具有通向第三通道或第四通道的近端开口，并且进一步地，其中至少一个隔离坞具有隔离区域，隔离区域具有足够大的体积以容纳至少一个T淋巴细胞(例如，多个T淋巴细胞)。
实施方案60.如实施方案42至45中任一项所述的方法，其中微流体装置包括多个隔离坞，多个隔离坞的每个隔离坞均具有连接区域和隔离区域，连接区域具有通向第三通道(或第四通道)的近端开口，隔离区域具有足够大的体积以容纳至少一个T淋巴细胞(例如，多个T淋巴细胞)。
实施方案61.如实施方案59或60所述的方法，其中隔离坞或多个隔离坞的每个隔离坞的体积为约250pL至约3nL(例如，约250pL至约750pL、约400pL至约900pL、约500μL至约1.5nL、约1nL至约2nL、约1.5nL至约2.5nL、约2nL至约3nL，或由两个前述端点限定的任何范围)。
实施方案62.如实施方案1至61中任一项所述的方法，其中流体样品是从受试者获得的外周血样品或源自其的样品(例如，PBMC)。
实施方案63.如实施方案62所述的方法，其中流体样品是已经耗尽至少一种非T淋巴细胞类型(例如，骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、树突细胞、巨核细胞和血小板，B淋巴细胞，自然杀伤(NK)细胞，干细胞或其任何组合)的外周血样品。
实施方案64.如实施方案62或63所述的方法，其中流体样品是已经富集CD8+ T淋巴细胞的外周血样品。
实施方案65.如实施方案64所述的方法，其中流体样品已经耗尽效应T淋巴细胞(TEFF)和/或记忆T淋巴细胞(TCM)。(例如，以下细胞，该细胞具有CD45RO+表型，任选地与PD-1+、PD-L1+、CD137+或其任何组合的组合，或者，备选地与CCR7+和/或CD62L+组合)。
实施方案66.如实施方案64或65所述的方法，其中流体样品已经富集了未经免疫的T淋巴细胞(T未经免疫)或具有CD45RA+表型(任选地与CCR7+和/或CD62L+组合)的细胞。
实施方案67.如实施方案64或65所述的方法，其中流体样品已经富集了中枢记忆T淋巴细胞(TCM)或具有CD45RO+表型与CCR7+和/或CD62L+表型组合的细胞。
实施方案68.如实施方案62或63所述的方法，还包括：获得外周血样品或源自其的样品，其中外周血来源于人类受试者；且从外周血样品或源自其的样品产生流体样品。
实施方案69.如实施方案68所述的方法，其中产生流体样品包括：耗尽外周血样品或源自其的样品的至少一种非T淋巴细胞类型；和/或富集外周血样品或源自其的样品的CD8+ T淋巴细胞。
实施方案70.如实施方案69所述的方法，其中富集步骤包括富集外周血样品或源自其的样品的CD8+未经免疫的T淋巴细胞或具有CD45RA+表型(任选地与CCR7+和/或CD62L+组合)的细胞。
实施方案71.如实施方案1至61中任一项所述的方法，其中流体样品包含从受试者的实体瘤样品中分离的细胞。
实施方案72.如实施方案71所述的方法，其中实体瘤样品是细针抽吸物(FNA)。
实施方案73.如实施方案71所述的方法，其中实体瘤样品是活组织检查样本。
实施方案74.如实施方案71至73中任一项所述的方法，其中实体瘤是乳腺癌、泌尿生殖系统癌症(例如源自泌尿道的癌症，例如源自肾脏(例如肾细胞癌)、输尿管、膀胱或尿道的癌症；男性生殖道癌(例如睾丸癌、前列腺癌、精囊癌、精管癌或阴茎癌)；或女性生殖道癌(例如卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌或输卵管癌))、神经系统癌(例如成神经细胞瘤)、肠癌(例如结肠直肠癌)、肺癌、黑素瘤或其他类型的癌症。
实施方案75.如实施方案71至73中任一项所述的方法，其中实体瘤是髓性乳腺癌。
实施方案76.如实施方案71至73中任一项所述的方法，其中实体瘤是间皮瘤。
实施方案77.如实施方案71至73中任一项所述的方法，其中实体瘤是黑素瘤。
实施方案78.如实施方案71至77中任一项所述的方法，其中从实体瘤样品中分离的细胞已经耗尽至少一种非T淋巴细胞类型(例如，骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、树突细胞、巨核细胞和血小板，B淋巴细胞，自然杀伤(NK)细胞，干细胞或其任何组合)。
实施方案79.如实施方案71至78中任一项所述的方法，其中从实体瘤样品中分离的细胞富集了CD8+ T淋巴细胞。
实施方案80.如实施方案79所述的方法，其中从实体瘤样品中分离的细胞已经耗尽了具有CD4+表型的T淋巴细胞和/或具有CD45RA+表型(任选地与CCR7+和/或CD62L+表型组合)的细胞。
实施方案81.如实施方案1至80中任一项所述的方法，还包括：使流体样品中的T淋巴细胞与活化剂接触。
实施方案82.如实施方案81所述的方法，其中至少在使流体样品流过微流体装置的流动路径的第一区域之前，使T淋巴细胞与活化剂接触。
实施方案83.如实施方案81所述的方法，其中在流体样品流过微流体装置的流动路径的第一区域之后，使流体样品中的T淋巴细胞与活化剂接触。
实施方案84.如实施方案83所述的方法，其中在将T淋巴细胞移入隔离坞(例如，具有通向第二通道、第三通道或第四通道的近端开口的连接区域的隔离坞)之后，使T淋巴细胞与活化剂接触。
实施方案85.如实施方案81至84中任一项所述的方法，其中在使流体样品流过微流体装置的流动路径的第一区域之前，使流体样品中的T淋巴细胞与活化剂接触至少一小时的时间。
实施方案86.如实施方案81至85中任一项所述的方法，其中在使流体样品流过微流体装置的流动路径的第一区域之前，使流体样品中的T淋巴细胞与活化剂接触至少24小时的时间(例如，至少36小时、至少48小时、至少60小时、至少72小时、至少84小时、至少96小时、至少108小时、至少120小时，或由两个前述值限定的任何时间范围)。
实施方案87.如实施方案81至86中任一项所述的方法，其中活化剂包括人工抗原呈递细胞(aAPC)，并且其中aAPC包括与抗原肽(例如肿瘤相关肽)复合的MHC I类分子。
实施方案88.如实施方案87所述的方法，其中aAPC还包括CD28激动剂(例如，抗CD28激动抗体)。
实施方案89.如实施方案81至86中任一项所述的方法，其中活化剂包括树突细胞(DC)。
实施方案90.如实施方案89所述的方法，其中流体样品的DC和T淋巴细胞是自体同源细胞。
实施方案91.如实施方案89或90所述的方法，其中在与流体样品中的T淋巴细胞接触之前用抗原肽攻击DC。
实施方案92.如实施方案87、88或91所述的方法，其中在与流体样品的T淋巴细胞自体同源的肿瘤细胞中鉴定或分离抗原肽。(或者，可以在病原体(例如细菌、真菌、寄生虫或病毒病原体)中鉴定或分离抗原肽)。
实施方案93.如实施方案87、88或91所述的方法，其中通过肿瘤细胞(例如，与流体样品的T淋巴细胞自体同源的肿瘤细胞)的基因组分析来鉴定抗原肽。
实施方案94.如实施方案20至94中任一项所述的方法，还包括：在流体样品已经穿过流动路径的第一区域并进入微流体装置的第二通道(或微流体装置的第三或第四通道)之后，停止流体样品流动通过微流体装置的流动路径。
实施方案95.如实施方案94所述的方法，还包括：将至少一个活化的T淋巴细胞引入隔离坞。
实施方案96.如实施方案94所述的方法，还包括：将至少一个活化的T淋巴细胞引入多个隔离坞的每一个中。
实施方案97.如实施方案95或96所述的方法，其中隔离坞或多个隔离坞各自具有连接区域，连接区域具有通向微流体装置的流动路径的第二通道(或者通向微流体装置的流动路径的第三或第四通道)的近端开口。
实施方案98.如实施方案94至97中任一项所述的方法，其中微流体装置包括具有介电电泳(DEP)配置的衬底，并且其中将至少一个T淋巴细胞引入隔离坞(或多个隔离坞的每个隔离坞)包括使用DEP力选择至少一个T淋巴细胞，并将至少一个T淋巴细胞移入隔离坞(或多个隔离坞的每个隔离坞)。
实施方案99.如实施方案98所述的方法，其中选择至少一个T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是CD8+(和/或具有特异性检测目标抗原的TCR)。
实施方案100.如实施方案94至97中任一项所述的方法，其中将至少一个T淋巴细胞引入隔离坞(或多个隔离坞的每个隔离坞)包括倾斜微流体装置，使得重力将至少一个T淋巴细胞拉入隔离坞(或多个隔离坞的每个隔离坞)。
实施方案101.如实施方案94至100中任一项所述的方法，其中在将至少一个T淋巴细胞引入隔离坞(或多个隔离坞的每个隔离坞)之后，通过微流体装置的流动路径灌注培养基至少24小时(例如，至少48小时、至少72小时、至少96小时或更长)的时间。
实施方案102.如实施方案94至101中任一项所述的方法，其中在引入隔离坞(或多个隔离坞的每个隔离坞)之后，使至少一个T淋巴细胞与活化剂接触。
实施方案103.如实施方案20至102中任一项所述的方法，还包括：从微流体装置的流动路径的第二通道(或第三或第四通道)选择性地输出T淋巴细胞群，其中T淋巴细胞群与已经流过微流体装置的流动路径的第二区域的第一通道的任何细胞或T淋巴细胞分开输出。
实施方案104.如实施方案103所述的方法，其中T淋巴细胞群从微流体装置的流动路径的第二区域的第二通道的第二子区域的第三通道输出，并且其中T淋巴细胞群与已经流过第二通道的第二子区域的第四通道的任何细胞或T淋巴细胞分开输出。
实施方案105.如实施方案1至104中任一项所述的方法，其中在使流体流过微流体装置的流动路径的第一区域之前，微流体装置的流动区域用包含结合至微流体装置的内表面(例如，通道和/或任何隔离坞的表面)的阻断剂的阻断溶液处理。
实施方案106.如实施方案105所述的方法，其中阻断溶液包括血清、BSA或聚合物(例如，包括聚乙二醇(PEG)和/或聚丙二醇(PPG)的聚合物)。
实施方案107.如实施方案1至106中任一项所述的方法，其中微流体装置包括内表面，该内表面包含涂层材料。
实施方案108.如实施方案107所述的方法，其中涂层材料包含氟代烷烃部分。
实施方案109.如实施方案107所述的方法，其中涂层材料包含羧酸部分、糖部分(例如葡聚糖)或聚乙二醇(PEG)部分。
实施方案110.如实施方案1至109中任一项所述的方法，其中使流体样品流过微流体装置的流动路径的第一区域产生富集活化的T淋巴细胞的分选样品，并且其中富集至少2倍(例如，至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更大)。
实施方案111.一种微流体装置，包括：具有第一区域的流动路径，第一区域包括第一柱阵列，其中：第一区域包括第一侧壁和第二侧壁，第一侧壁和第二侧壁一起限定流体路径的第一区域中流体流动的总方向，总方向对应于第一区域的第一方向；第一阵列的柱布置成行和列；第一阵列中柱的行限定第一阵列方向，第一阵列方向与第一区域的第一方向相差倾斜角(ε)，并且第一阵列中柱的列周期性地重复，周期等于l/ε，其中ε以弧度测量；第一阵列中每个相应列中的相邻柱通过间隙分开，流体样品的流体可以相对于列整体上横向流动通过间隙，其中大部分间隙具有对应于第一阵列的主要间隙尺寸的特征尺寸，并且第一阵列的特征在于临界尺寸(Dc)为约4微米至约10微米。
实施方案112.如实施方案111所述的装置，其中流动路径的第一区域是主通道，主通道具有由第一和第二侧壁限定的宽度，并且其中第一柱阵列跨主通道的整个宽度延伸。
实施方案113.如实施方案111或112所述的装置，其中第一阵列的特征在于Dc为约4微米至约7微米。
实施方案114.如实施方案111或112所述的装置，其中第一阵列的特征在于Dc为约7微米至约10微米。
实施方案115.如实施方案111至114中任一项所述的装置，其中第一阵列的倾斜角ε为约1/3弧度至约1/100弧度。
实施方案116.如实施方案111至114中任一项所述的装置，其中第一阵列的倾斜角ε为约1/5弧度至约1/30弧度。
实施方案117.如实施方案111至114中任一项所述的装置，其中第一阵列的倾斜角ε为约1/10弧度至约1/16弧度。
实施方案118.如实施方案111至117中任一项所述的装置，其中第一阵列的主要间隙尺寸为约15微米至约25微米。
实施方案119.如实施方案111至117中任一项所述的装置，其中第一阵列的主要间隙尺寸为约25微米至约40微米。
实施方案120.如实施方案111至119中任一项所述的装置，其中第一阵列的柱的直径为约30微米至约100微米(例如，约40微米至约85微米，或约50微米至约70微米)。
实施方案121.如实施方案118或119所述的装置，其中第一阵列的柱的直径大于主要间隙尺寸(例如，大1.5至5倍)。
实施方案122.如实施方案118或119所述的装置，其中第一阵列的柱的直径比主要间隙尺寸大二至四倍。
实施方案123.如实施方案111至122中任一项所述的装置，其中第一阵列的列相对于第一区域的第一方向横向布置。
实施方案124.如实施方案111至123中任一项所述的装置，其中第一阵列的柱的横截面为圆形(例如，圆形或椭圆形)。
实施方案125.如实施方案111至123中任一项所述的装置，其中第一阵列的柱的横截面为多边形(例如，三角形、正方形、菱形或平行四边形形状)。
实施方案126.如实施方案124或125所述的装置，其中第一阵列的柱都具有相同定向，并且其中定向使得柱的横截面形状中没有对称轴平行于由第一方向限定的轴。
实施方案127.如实施方案111至126中任一项所述的装置，其中第一阵列的柱包含硅氧烷聚合物。
实施方案128.如实施方案111至126中任一项所述的装置，其中第一阵列的列中相邻柱之间的所有间隙等于第一阵列的主要间隙尺寸，除了与第一或第二侧壁最接近的同一列的相邻柱之间的间隙尺寸可以偏离主要间隙尺寸，并且其中第一阵列中柱之间的间隙尺寸的偏离减小了流体样品流过第一阵列时由第一和第二侧壁另行引起的边界不规则性。
实施方案129.如实施方案111至128中任一项所述的装置，其中微流体装置的流动路径包括第二区域，第二区域被配置成在流体样品穿过微流体装置的第一区域之后接收流体样品，第二区域具有分隔器，其将第二区域分成接收流体样品的第一部分的第一通道和接收流体样品的第二部分的第二通道。
实施方案130.如实施方案129所述的装置，其中第二区域的分隔器定位成使得相对于流体样品，在流体样品的第二部分中富集直径大于Dc的T淋巴细胞；并且直径小于Dc的T淋巴细胞主要位于流体样品的第一部分中。
实施方案131.如实施方案129或130所述的装置，其中流体样品的第一部分包含流体样品的至少50％(例如至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多)。
实施方案132.如实施方案129或130所述的装置，其中流体样品的第一部分包含流体样品的约85％至约95％。
实施方案133.如实施方案129至132中任一项所述的装置，其中第一通道和第二通道被配置成使得跨第一通道的压差等于跨第二通道的压差。
实施方案134.如实施方案129至133中任一项所述的装置，其中第一通道包括第一长度，且第二通道包括第二长度，并且其中第二长度大于第一长度(例如，其中第二通道的第二长度比第一通道的第一长度长至少5倍)。
实施方案135.如实施方案129至134中任一项所述的装置，其中微流体装置包括至少一个隔离坞，隔离坞具有连接区域，连接区域具有通向第二通道的近端开口，并且进一步地，其中至少一个隔离坞具有隔离区域，隔离区域具有足够大的体积以容纳至少一个T淋巴细胞(例如，多个T淋巴细胞)。
实施方案136.如实施方案129至134中任一项所述的装置，其中微流体装置包括多个隔离坞，每个隔离坞均具有连接区域，连接区域具有通向第二区域的第二通道的近端开口，并且每个隔离坞均具有隔离区域，隔离区域具有足够大的体积以容纳至少一个T淋巴细胞(例如，多个T淋巴细胞)。
实施方案137.如实施方案135或136所述的装置，其中隔离坞或多个隔离坞的每个隔离坞的体积为约250pL至约3nL(例如，约250pL至约750pL、约400pL至约900pL、约500μL至约1.5nL、约1nL至约2nL、约1.5nL至约2.5nL、约2nL至约3nL，或由两个前述端点限定的任何范围)。
实施方案138.如实施方案111至137中任一项所述的装置，其中第一区域的长度为约5mm至约15mm。
实施方案139.如实施方案129至138中任一项所述的装置，其中第二通道包括第一子区域，第一子区域包括第二柱阵列，其中使流体样品流过流动路径的第一区域引起流体样品的第二部分连同其中包含的任何细胞流过第二通道的第一子区域中的第二柱阵列，并且进一步地，其中：第二通道的第一子区域中流体流动的总方向限定第二方向；第二阵列中的柱布置成行和列；第二阵列中柱的行限定第二阵列方向，第二阵列方向与第二方向相差倾斜角(ε')，并且第二阵列中柱的列周期性地重复，周期等于1/ε'，其中ε'以弧度测量；第二阵列中的每个相应列中的相邻柱通过间隙分开，流体样品的第二部分的流体可以相对于列整体上横向流动通过间隙，其中大部分间隙具有对应于第二阵列的次要间隙尺寸的特征尺寸，并且第二阵列的特征在于临界尺寸(Dc)为约4微米至约10微米。
实施方案140.如实施方案139所述的装置，其中第二通道具有宽度，并且其中第二柱阵列在第二通道的整个宽度上延伸。
实施方案141.如实施方案139或140所述的装置，其中第一阵列的特征在于Dc为约4微米至约5微米、约4.5微米至约5.5微米、约5微米至约6微米、约5.5微米至约6.5微米、约6微米至约7微米、约6.5微米至约7.5微米、约7微米至约8微米、约7.5微米至约8.5微米、约8微米至约9微米、约8.5微米至约9.5微米、约9微米至约10微米，或由两个前述端点限定的任何范围。
实施方案142.如实施方案139或140所述的装置，其中第二柱阵列的特征在于Dc为约4微米至约7微米，或其中第二柱阵列的特征在于Dc为约7微米至约10微米。
实施方案143.如实施方案139至142中任一项所述的装置，其中第二阵列的倾斜角ε为约1/3弧度至约1/100弧度。
实施方案144.如实施方案139至142中任一项所述的装置，其中第二阵列的倾斜角ε'为约1/5弧度至约1/30弧度。
实施方案145.如实施方案139至144中任一项所述的装置，其中第二阵列的次要间隙尺寸为约15微米至约25微米。
实施方案146.如实施方案139至144中任一项所述的装置，其中第二阵列的次要间隙尺寸为约25微米至约40微米。
实施方案147.如实施方案139至146中任一项所述的装置，其中第二阵列的柱的直径为约30微米至约100微米(例如，约40微米至约85微米或约50微米至约70微米)。
实施方案148.如实施方案145或146所述的装置，其中第二阵列的柱的直径大于次要间隙尺寸(例如，大1.5至5倍)。
实施方案149.如实施方案145或146所述的装置，其中第二阵列的柱的直径比次要间隙尺寸大两至四倍。
实施方案150.如实施方案139至149中任一项所述的装置，其中第二阵列的列相对于第二通道的第一子区域的第二方向横向布置。
实施方案151.如实施方案139至150中任一项所述的装置，其中第二阵列的柱的横截面为圆形(例如，圆形或椭圆形)。
实施方案152.如实施方案139至150中任一项所述的装置，其中第二阵列的柱的横截面为多边形(例如，三角形、正方形、菱形或平行四边形形状)。
实施方案153.如实施方案151或152所述的装置，其中第二阵列的柱都具有相同定向，并且其中定向使得柱的横截面形状中没有对称轴平行于由第二方向限定的轴。
实施方案154.如实施方案139至153中任一项所述的装置，其中第二阵列的柱包含硅氧烷聚合物。
实施方案155.如实施方案139至154中任一项所述的装置，其中第二通道的第一子区域包括第三侧壁和第四侧壁，第三侧壁和第四侧壁一起限定第二方向，其中第二阵列的列中相邻柱之间的所有间隙等于第二阵列的次要间隙尺寸，除了与第三或第四侧壁最接近的同一列的相邻柱之间的间隙尺寸可以偏离次要间隙尺寸，并且其中第二阵列中柱之间的间隙尺寸的偏离减小了流体样品的第二部分流过第二阵列时由第三和第四侧壁另行引起的边界不规则性。
实施方案156.如实施方案139至155中任一项所述的装置，其中第二通道包括第二子区域，第二子区域被配置成在流体样品的第二部分穿过第一子区域之后接收流体样品的第二部分，第二子区域具有分隔器，将第二通道分成第三通道和第四通道，第三通道接收来自流体样品的第二部分的流体的第一子部分，第四通道接收来自流体样品的第二部分的流体的第二子部分。
实施方案157.如实施方案156所述的装置，其中将第二子区域的分隔器定位成使得相对于流体样品的第二部分，在流体的第二子部分中富集直径大于Dc的T淋巴细胞，并且其中直径小于Dc的T淋巴细胞主要位于流体的第一子部分中。
实施方案158.如实施方案156或157所述的装置，其中流体的第一子部分包含流体样品的第二部分的至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多)。
实施方案159.如实施方案156或157所述的装置，其中流体的第一子部分包含流体样品的第二部分的约85％至约95％。
实施方案160.如实施方案156至159中任一项所述的装置，其中第三通道和第四通道被配置成使得跨第三通道的压差等于跨第四通道的压差。
实施方案161.如实施方案160所述的装置，其中第三通道包括第三长度，且第四通道包括第四长度，并且其中第四长度大于第三长度(例如，其中第四长度比第三长度长至少5倍)。
实施方案162.如实施方案156至161中任一项所述的装置，其中微流体装置包括至少一个隔离坞，隔离坞具有连接区域，连接区域具有通向第三通道或第四通道的近端开口，并且进一步地，其中至少一个隔离坞具有隔离区域，隔离区域具有足够大的体积以容纳至少一个T淋巴细胞(例如，多个T淋巴细胞)。
实施方案163.如实施方案156至161中任一项所述的装置，其中微流体装置包括多个隔离坞，多个隔离坞的每个隔离坞均具有连接区域和隔离区域，连接区域具有通向第三通道(或第四通道)的近端开口，隔离区域具有足够大的体积以容纳至少一个T淋巴细胞(例如，多个T淋巴细胞)。
实施方案164.如实施方案162或163所述的装置，其中隔离坞或多个隔离坞的每个隔离坞的体积为约250pL至约3nL(例如，约250pL至约750pL、约400pL至约900pL、约500μL至约1.5nL、约1nL至约2nL、约1.5nL至约2.5nL、约2nL至约3nL，或由两个前述端点限定的任何范围。
实施方案165.如实施方案111至164中任一项所述的装置，其中微流体装置包括内表面(例如，第一区域、第二区域、第一子区域、第二子区域、第一通道、第二通道、第三通道、第四通道的至少一个内表面)，该内表面包含涂层材料。
实施方案166.如实施方案165所述的装置，其中涂层材料包含氟代烷烃部分。
实施方案167.如实施方案165所述的装置，其中涂层材料包含羧酸部分、糖部分(例如葡聚糖)或聚乙二醇(PEG)部分。
实施方案168.一种组合物，其包含根据实施方案20至51和62至110中任一项所述的方法分选的T淋巴细胞，其中通过从微流体装置的流动路径的第二通道输出细胞获得T淋巴细胞，其中T淋巴细群与已经流过微流体装置的流动路径的第一通道的任何细胞或T淋巴细胞分开输出。
实施方案169.一种组合物，其包含根据实施方案52至110中任一项所述的方法分选的T淋巴细胞，其中通过从微流体装置的流动路径的第三通道(或第四通道)输出细胞获得T淋巴细胞，并且其中T淋巴细胞群与已经流过微流体装置的流动路径的第四通道(或第三通道)的任何细胞或T淋巴细胞分开输出。
实施方案170.如实施方案168或169所述的组合物，还包含药学上可接受的载体。
实施方案171.一种治疗患有病原性病症或癌症的受试者的方法，该方法包括施用实施方案170所述的组合物。
等同
前述书面说明被认为足以使本领域技术人员能够实施这些实施方案。前面的描述和实施例详述了某些实施方案并描述了预期的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容在文本中看起来如何详细，实施方案可以以许多方式实施，并且应当根据所附权利要求及其任何等同来解释。

Claims (92)

1.一种使用微流体装置生产富集活化的T淋巴细胞的样品的方法，微流体装置包括具有第一区域的流动路径，第一区域包括第一柱阵列，所述方法包括：
使包含活化和静息T淋巴细胞的混合物的流体样品流过微流体装置的流动路径的第一区域，其中：
流动路径的第一区域中流体流动方向限定第一方向；
第一阵列中的柱布置成行和列；
第一阵列中柱的行限定第一阵列方向，第一阵列方向与第一区域的第一方向相差倾斜角(ε)，并且第一阵列中柱的列周期性地重复，周期等于l/ε，其中ε以弧度测量；
第一阵列中每个相应列中的相邻柱通过间隙分开，流体样品的流体可以相对于列整体上横向流动通过间隙，其中大部分间隙具有对应于第一阵列的主要间隙尺寸的特征尺寸，并且
第一阵列的特征在于临界尺寸(Dc)为4微米至10微米。
2.如权利要求1所述的方法，其中流动路径的第一区域由具有宽度的主通道限定，并且其中第一柱阵列跨主通道的整个宽度延伸。
3.如权利要求1所述的方法，其中第一阵列的特征在于Dc为4微米至7微米。
4.如权利要求1所述的方法，其中第一阵列的倾斜角ε为1/5弧度至1/30弧度。
5.如权利要求1所述的方法，其中第一阵列的主要间隙尺寸为15微米至25微米。
6.如权利要求1所述的方法，其中第一阵列的主要间隙尺寸为25微米至40微米。
7.如权利要求1所述的方法，其中第一阵列的柱的直径为30微米至100微米。
8.如权利要求1所述的方法，其中第一阵列的列相对于第一区域的第一方向横向布置。
9.如权利要求1所述的方法，其中第一阵列的柱的横截面为圆形或多边形。
10.如权利要求9所述的方法，其中第一阵列的柱都具有相同定向，并且其中定向使得柱的横截面形状中没有对称轴平行于由第一方向限定的轴。
11.如权利要求1所述的方法，其中微流体装置的流动路径包括第二区域，第二区域被配置成在流体样品穿过微流体装置的第一区域之后接收流体样品，第二区域具有分隔器，其将第二区域分成接收流体样品的第一部分的第一通道和接收流体样品的第二部分的第二通道，并且
其中第二区域的分隔器定位成使得相对于流体样品，在流体样品的第二部分中富集直径大于Dc的T淋巴细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其中流体样品的第一部分包含流体样品的85％至95％。
13.如权利要求11所述的方法，其中第一通道包括第一长度，且第二通道包括第二长度，并且其中第二通道的第二长度比第一通道的第一长度长至少5倍。
14.如权利要求11所述的方法，其中微流体装置包括至少一个隔离坞，隔离坞具有连接区域，连接区域具有通向第二通道的近端开口，并且其中至少一个隔离坞具有隔离区域，隔离区域具有容纳至少一个T淋巴细胞的体积。
15.如权利要求14所述的方法，其中微流体装置包括多个这样的隔离坞。
16.如权利要求14所述的方法，其中隔离坞的体积为250pL至3nL。
17.如权利要求11所述的方法，其中具有CD8+、CD45 RO+/RA-、CCR7-、CD62L-表型的T淋巴细胞富集在流体样品的第二部分中。
18.如权利要求11所述的方法，其中具有CD8+、CD45 RO+/RA-、CCR7+、CD62L-表型的T淋巴细胞富集在流体样品的第二部分中。
19.如权利要求11所述的方法，其中第一区域的长度为5mm至15mm。
20.如权利要求11所述的方法，其中流体样品流过流动路径的第一区域的速率为0.01微升/秒至10微升/秒。
21.如权利要求11所述的方法，其中第二通道包括第一子区域，第一子区域包括第二柱阵列，其中使流体样品流过流动路径的第一区域引起流体样品的第二部分连同其中包含的任何细胞流过第一子区域中的第二柱阵列，并且其中：
第二通道的第一子区域中流体流动的方向限定第二方向；
第二阵列中的柱布置成行和列；
第二阵列中柱的行限定第二阵列方向，第二阵列方向与第二方向相差倾斜角(ε')，并且第二阵列中柱的列周期性地重复，周期等于1/ε'，其中ε'以弧度测量；
第二阵列中的每个相应列中的相邻柱通过间隙分开，流体样品的第二部分的流体可以相对于列整体上横向流动通过间隙，其中大部分间隙具有对应于第二阵列的次要间隙尺寸的特征尺寸，并且
第二阵列的特征在于临界尺寸(Dc)为4微米至10微米。
22.如权利要求21所述的方法，其中第二通道具有宽度，并且其中第二柱阵列在第二通道的整个宽度上延伸。
23.如权利要求21所述的方法，其中第二柱阵列的特征在于Dc为4微米至7微米。
24.如权利要求21所述的方法，其中第二柱阵列的特征在于Dc为7微米至10微米。
25.如权利要求21所述的方法，其中第二阵列的倾斜角ε'为1/5弧度至1/30弧度。
26.如权利要求21所述的方法，其中第二阵列的次要间隙尺寸为15微米至25微米。
27.如权利要求21所述的方法，其中第二阵列的次要间隙尺寸为25微米至40微米。
28.如权利要求21所述的方法，其中第二阵列的柱的直径为30微米至100微米。
29.如权利要求21所述的方法，其中第二阵列的列相对于第二通道的第一子区域的第二方向横向布置。
30.如权利要求21所述的方法，其中第二阵列的柱的横截面为圆形或多边形。
31.如权利要求30所述的方法，其中第二阵列的柱都具有相同定向，并且其中定向使得柱的横截面形状中没有对称轴平行于由第二方向限定的轴。
32.如权利要求21所述的方法，其中第二通道包括第二子区域，第二子区域被配置成在流体样品的第二部分穿过第一子区域之后接收流体样品的第二部分，第二子区域具有分隔器，其将第二通道分成第三通道和第四通道，第三通道接收来自流体样品的第二部分的流体的第一子部分，第四通道接收来自流体样品的第二部分的流体的第二子部分，并且
其中将第二子区域的分隔器定位成使得相对于流体样品的第二部分，在流体的第二子部分中富集直径大于Dc的T淋巴细胞。
33.如权利要求32所述的方法，其中流体的第一子部分包含流体样品的第二部分的至少50％。
34.如权利要求32所述的方法，第三通道包括第三长度，且第四通道包括第四长度，并且其中第四长度大于第三长度。
35.如权利要求32所述的方法，其中微流体装置包括至少一个隔离坞，隔离坞具有连接区域，连接区域具有通向第三通道或第四通道的近端开口，并且其中至少一个隔离坞具有隔离区域，隔离区域具有容纳至少一个T淋巴细胞的体积。
36.如权利要求35所述的方法，其中微流体装置包括多个这样的隔离坞。
37.如权利要求32所述的方法，其中隔离坞的体积为250pL至3nL。
38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中流体样品是从受试者获得的外周血样品或源自其的样品。
39.如权利要求38所述的方法，其中流体样品是已经耗尽至少一种非T淋巴细胞类型的外周血样品。
40.如权利要求38所述的方法，其中流体样品是已经富集CD8+T淋巴细胞的外周血样品。
41.如权利要求40所述的方法，其中流体样品已经耗尽效应T淋巴细胞和/或记忆T淋巴细胞。
42.如权利要求40所述的方法，其中流体样品已经富集了未经免疫的T淋巴细胞或具有CD45RA+表型的细胞。
43.如权利要求40所述的方法，其中流体样品已经富集了中枢记忆T淋巴细胞或具有CD45RO+表型与CCR7+和/或CD62L+表型组合的细胞。
44.如权利要求38所述的方法，还包括：
获得外周血样品或源自其的样品，其中外周血来源于人类受试者；并且
从外周血样品或源自其的样品产生流体样品。
45.如权利要求44所述的方法，其中产生流体样品包括：
耗尽外周血样品或源自其的样品的至少一种非T淋巴细胞类型；和/或
富集外周血样品或源自其的样品的CD8+T淋巴细胞。
46.如权利要求45所述的方法，其中富集步骤包括富集外周血样品或源自其的样品的CD8+未经免疫的T淋巴细胞或具有CD45RA+表型的细胞。
47.如权利要求38所述的方法，还包括：
使流体样品中的T淋巴细胞与活化剂接触。
48.如权利要求47所述的方法，其中至少在使流体样品流过微流体装置的流动路径的第一区域之前，使T淋巴细胞与活化剂接触。
49.如权利要求48所述的方法，其中在使流体样品流过微流体装置的流动路径的第一区域之前，使流体样品中的T淋巴细胞与活化剂接触至少48小时的时间。
50.如权利要求48所述的方法，其中活化剂包括人工抗原呈递细胞(aAPC)，并且其中aAPC包括与抗原肽复合的MHC I类分子。
51.如权利要求50所述的方法，其中aAPC还包括CD28激动剂。
52.如权利要求48所述的方法，其中活化剂包括树突细胞(DC)。
53.如权利要求52所述的方法，其中流体样品的DC和T淋巴细胞是自体同源细胞。
54.如权利要求50所述的方法，其中在细菌病原体、真菌病原体、寄生虫病原体、病毒病原体或肿瘤细胞中鉴定或分离抗原肽。
55.如权利要求54所述的方法，其中在与流体样品的T淋巴细胞自体同源的癌症细胞中鉴定或分离抗原肽。
56.如权利要求15所述的方法，还包括：
在流体样品已经穿过流动路径的第一区域并进入微流体装置的第二通道之后，停止流体样品流动通过微流体装置的流动路径；并且
将至少一个活化的T淋巴细胞引入多个隔离坞的一个或多个隔离坞中。
57.如权利要求56所述的方法，其中微流体装置包括具有介电电泳(DEP)配置的衬底，并且其中将至少一个活化的T淋巴细胞引入一个或多个隔离坞包括使用DEP力选择至少一个T淋巴细胞，并将至少一个T淋巴细胞移入一个或多个隔离坞的每一个中。
58.如权利要求57所述的方法，其中选择至少一个T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面是CD8+。
59.如权利要求58所述的方法，其中选择至少一个T淋巴细胞，至少部分地因为其细胞表面具有特异性检测目标抗原的TCR。
60.如权利要求56所述的方法，其中在将至少一个T淋巴细胞引入一个或多个隔离坞的每一个之后，通过微流体装置的流动路径灌注培养基至少24小时的时间。
61.如权利要求11所述的方法，还包括：
从微流体装置的流动路径的第二通道选择性地输出T淋巴细胞群，其中T淋巴细胞群与已经流过微流体装置的流动路径的第一通道的任何细胞或T淋巴细胞分开输出。
62.如权利要求1至37或56至61中任一项所述的方法，其中在使流体流过微流体装置的流动路径的第一区域之前，微流体装置的流动区域用包含结合至微流体装置的至少一个内表面的阻断剂的阻断溶液处理，其中阻断溶液包括血清、BSA或包括聚乙二醇和/或聚丙二醇的聚合物。
63.如权利要求1至37和56至61中任一项所述的方法，其中微流体装置包括内表面，该内表面包含涂层材料。
64.如权利要求63所述的方法，其中涂层材料包含氟代烷烃部分。
65.如权利要求63所述的方法，其中涂层材料包含羧酸部分、糖部分或聚乙二醇部分。
66.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中使流体样品流过微流体装置的流动路径的第一区域产生富集活化的T淋巴细胞的分选样品，并且其中富集为至少2倍。
67.一种微流体装置，包括：
具有第一区域的流动路径，第一区域包括第一柱阵列，其中：
第一区域包括第一侧壁和第二侧壁，第一侧壁和第二侧壁一起限定流体路径的第一区域中流体流动的总方向，总方向对应于第一区域的第一方向；
第一阵列的柱布置成行和列；
第一阵列中柱的行限定第一阵列方向，第一阵列方向与第一区域的第一方向相差倾斜角(ε)，并且第一阵列中柱的列周期性地重复，周期等于l/ε，其中ε以弧度测量；
第一阵列中每个相应列中的相邻柱通过间隙分开，流体样品的流体可以相对于列整体上横向流动通过间隙，其中大部分间隙具有对应于第一阵列的主要间隙尺寸的特征尺寸，并且
第一阵列的特征在于临界尺寸(Dc)为4微米至10微米。
68.如权利要求67所述的装置，其中流动路径的第一区域是主通道，主通道具有由第一和第二侧壁限定的宽度，并且其中第一柱阵列跨主通道的整个宽度延伸，
其中第一阵列的特征在于Dc为4微米至7微米，
其中第一阵列的倾斜角ε为1/5弧度至1/30弧度，
其中第一阵列的主要间隙尺寸为15微米至40微米，并且
其中第一阵列的柱的直径为30微米至100微米。
69.如权利要求67所述的装置，其中第一阵列的列相对于第一区域的第一方向横向布置。
70.如权利要求67所述的装置，其中第一阵列的柱的横截面为圆形或多边形。
71.如权利要求70所述的装置，其中第一阵列的柱都具有相同定向，并且其中定向使得柱的横截面形状中没有对称轴平行于由第一方向限定的轴。
72.如权利要求67所述的装置，其中第一阵列的列中相邻柱之间的所有间隙都等于第一阵列的主要间隙尺寸，除了与第一或第二侧壁最接近的同一列的相邻柱之间的间隙尺寸可以偏离主要间隙尺寸，并且其中第一阵列中柱之间的间隙尺寸的偏离减小了流体样品流过第一阵列时由第一和第二侧壁另行引起的边界不规则性。
73.如权利要求67所述的装置，其中微流体装置的流动路径包括第二区域，第二区域被配置成在流体样品穿过微流体装置的第一区域之后接收流体样品，第二区域具有分隔器，其将第二区域分成接收流体样品的第一部分的第一通道和接收流体样品的第二部分的第二通道。
74.如权利要求73所述的装置，其中流体样品的第一部分包含流体样品的85％至95％。
75.如权利要求73所述的装置，其中第一通道包括第一长度，且第二通道包括第二长度，并且其中第二通道的第二长度比第一通道的第一长度长至少5倍。
76.如权利要求73所述的装置，其中微流体装置包括多个隔离坞，每个隔离坞均具有连接区域，连接区域具有通向流动路径的第二通道的近端开口，并且每个隔离坞具有隔离区域，隔离区域具有容纳多个T淋巴细胞的体积。
77.如权利要求76所述的装置，其中多个隔离坞的每个隔离坞的体积为250pL至3nL。
78.如权利要求67所述的装置，其中第一区域的长度为5mm至15mm。
79.如权利要求73所述的装置，其中第二通道包括第一子区域，第一子区域包括第二柱阵列，其中使流体样品流过流动路径的第一区域引起流体样品的第二部分连同其中包含的任何细胞流过第二通道的第一子区域中的第二柱阵列，并且其中：
第二通道的第一子区域中流体流动的总方向限定第二方向；
第二阵列中的柱布置成行和列；
第二阵列中柱的行限定第二阵列方向，第二阵列方向与第二方向相差倾斜角(ε')，并且第二阵列中柱的列周期性地重复，周期等于1/ε'，其中ε'以弧度测量；
第二阵列中的每个相应列中的相邻柱通过间隙分开，流体样品的第二部分的流体可以相对于列整体上横向流动通过间隙，其中大部分间隙具有对应于第二阵列的次要间隙尺寸的特征尺寸，并且
第二阵列的特征在于临界尺寸(Dc)为4微米至10微米。
80.如权利要求79所述的装置，其中第二通道具有宽度，并且其中第二柱阵列在第二通道的整个宽度上延伸，
其中第二阵列的倾斜角ε'为1/5弧度至1/30弧度，
其中第二阵列的次要间隙尺寸为15微米至40微米，并且
其中第二阵列的柱的直径为30微米至100微米。
81.如权利要求80所述的装置，其中第二柱阵列的特征在于Dc为4微米至7微米。
82.如权利要求80所述的装置，其中第二柱阵列的特征在于Dc为7微米至10微米。
83.如权利要求80所述的装置，其中第二阵列的列相对于第二通道的第一子区域的第二方向横向布置。
84.如权利要求80所述的装置，其中第二阵列的柱的横截面为圆形或多边形。
85.如权利要求84所述的装置，其中第二阵列的柱都具有相同定向，并且其中定向使得柱的横截面形状中没有对称轴平行于由第二方向限定的轴。
86.如权利要求80所述的装置，其中第二通道包括第二子区域，第二子区域被配置成在流体样品的第二部分穿过第一子区域之后接收流体样品的第二部分，第二子区域具有分隔器，其将第二通道分成第三通道和第四通道，第三通道接收来自流体样品的第二部分的流体的第一子部分，第四通道接收来自流体样品的第二部分的流体的第二子部分，
其中将第二子区域的分隔器定位成使得相对于流体样品的第二部分，在流体的第二子部分中富集直径大于Dc的T淋巴细胞。
87.如权利要求86所述的装置，其中流体的第一子部分包含流体样品的第二部分的至少50％。
88.如权利要求86所述的装置，其中微流体装置包括多个隔离坞，多个隔离坞的每个隔离坞具有连接区域和隔离区域，连接区域具有通向第三通道的近端开口，隔离区域具有容纳多个T淋巴细胞的体积。
89.如权利要求88所述的装置，其中多个隔离坞的每个隔离坞的体积为250pL至3nL。
90.如权利要求67至89中任一项所述的装置，其中微流体装置包括至少一个内表面，该内表面包含涂层材料。
91.如权利要求90所述的装置，其中涂层材料包含氟代烷烃部分。
92.如权利要求90所述的装置，其中涂层材料包含羧酸部分、糖部分或聚乙二醇部分。
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