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KR102379684B1 - 감소된 용해도를 갖는 효소로부터 생성된 바이오센서 및 이의 생성 및 사용 방법 - Google Patents

감소된 용해도를 갖는 효소로부터 생성된 바이오센서 및 이의 생성 및 사용 방법 Download PDF

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KR102379684B1
KR102379684B1 KR1020197034827A KR20197034827A KR102379684B1 KR 102379684 B1 KR102379684 B1 KR 102379684B1 KR 1020197034827 A KR1020197034827 A KR 1020197034827A KR 20197034827 A KR20197034827 A KR 20197034827A KR 102379684 B1 KR102379684 B1 KR 102379684B1
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KR
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biosensor
modified enzyme
oxidase
fluid
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마이클 에스. 윌슨
Original Assignee
지멘스 헬쓰케어 다이아그노스틱스 인크.
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Publication date
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Abstract

용해도를 감소시키기 위해 변형된 효소를 포함하는 다중-용도 바이오센서가 개시되며; 상기 다중-용도 바이오센서는 유체 생물학적 샘플에서 분석물을 검출하는 데 사용되고, 바이오센서는 또한 많은 사용 후에도 이의 효소 활성을 유지한다. 다수의 바이오센서를 포함하는 다중-센서 어레이가 개시된다. 이들 장치를 생성시키고 이용하는 방법이 또한 개시된다.

Description

감소된 용해도를 갖는 효소로부터 생성된 바이오센서 및 이의 생성 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조/참조 진술에 의한 통합
본 출원은 35 USC § 119(e) 하에서 2017년 5월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 62/501,322호의 이익을 주장한다. 상기 언급된 특허 출원의 전체 내용은 참조로서 명백히 본원에 포함된다.
미 연방 후원 연구 또는 개발에 관한 설명
해당사항 없음.
배경
검출기로도 언급되는 센서(sensor)는 물리량을 측정하고, 이를 관찰자 또는 기기에 의해 판독될 수 있는 신호로 변환하는 장치이다. 센서는 화학 및 생화학 시험에서 사용되어 표본 또는 샘플(sample) 내의 관심 분석물의 특징을 결정한다. 생체의학 및 생명공학에서, 세포, 단백질 또는 핵산과 같은 생물학적 성분을 갖는 분석물을 검출하는 센서는 바이오센서(biosensor)로 언급된다.
다수의 바이오센서가 단일 유닛(unit)으로 그룹화되는(grouped) 바이오센서 어레이(arrya)는 생물학적 분석물의 존재 및/또는 농도를 결정하기 위해 화학 및 의약에서 유용하다. 예를 들어, 환자 진단 및 요법과 관련된 다양한 유형의 분석 시험은 환자로부터 채취한 액체 샘플의 분석에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로 시험되는 체액은 소변, 혈액, 혈장, 타액, 뇌척수액, 흉막액 등을 포함한다. 예를 들어, 혈액 샘플은 일상적으로 분석되어 CO2 및 O2의 분압 및 혈액 내 전해질 및 대사물의 농도의 측정을 얻는다. 생물학적 분석물의 존재 및 농도를 결정하기 위해, 분석물을 끌어당기고 포획하기 위한 고정된 효소를 포함하는 바이오센서가 일반적으로 사용된다. 구체적으로, 이온(ion)-선택적 전극 또는 관심 이온이 선택적으로 확산될 수 있도록 하는 이온-투과성 막을 갖는 전극을 이용할 수 있는 전위차 바이오센서가 종종 사용된다. 작동 원리는 이온이 2개의 상 사이에서 평형을 이루는 경우에 생성되는 측정 가능한 전위차를 기반으로 한다.
강성 층 센서 어셈블리(assembly) 및 전기 회로를 이용하여 상기 측정을 수행하기 위한 다수의 상이한 분석기가 현재 존재한다. 상기 센서 어셈블리는 일차 임상 지표를 통해 의료 환자의 상태를 평가하는 데 사용된다. 많은 환자들이 검사되는 빈도로 인해, 분석을 수행하기 위해 작은 샘플 크기를 이용하는 능력이 바람직하다. 중환자실 환자는 혈액 가스(gas) 및 임상 화학 측정을 위해 하루에 12 내지 20회의 샘플링(sampling) 빈도가 필요할 수 있다. 이러한 경우, 비교적 짧은 기간에 비교적 많은 수의 샘플이 채취되므로 소량의 혈액 샘플을 분석하는 것이 바람직하다. 또한, 수행되는 검사의 수를 제한하기 위해, 각각의 검사마다 가능한 한 많은 정보를 수집하는 것이 바람직하다.
현재, 단일-용도 바이오센서 및 다중-용도 바이오센서는 미국 공개 번호 2015/0082874호 및 2011/0286888호 및 국제 공개 번호 WO 2015/155665호(이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 명백히 포함됨)에 기재된 센서 어레이와 같은 센서 어레이에서 사용하는 것이 가능하다. 바이오센서 측정에 적합한 검정의 한 예는 혈액 요소 질소(BUN) 검정이다. BUN 검정은 폐기물인 요소로부터의 혈액 내 질소의 양을 측정한다. 요소는 단백질이 분해되는 경우에 신장에 의해 생성되는 부산물이다. 요소가 간에서 생성되는 동안, 이는 신장을 통과하며, BUN을 측정하는 것은 의료 및 임상 종사자가 환자의 신장 기능을 평가하는 것을 가능하게 한다. 정상적인 BUN 수준보다 높은 것은 환자의 신장이 제대로 기능하지 않는 것을 나타낸다. 단일-용도 BUN 바이오센서가 현재 이용 가능하며; 상기 바이오센서는 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 가교와 같은 다양한 요소분해효소 고정 방법을 이용한다(예를 들어, Abbott Point of Care Inc., Princeton, NJ로부터 이용가능한 현재 이용 가능한 iSTAT™ 시험 카트리지(cartridge) 참조). 일반적으로, 요소분해효소는 전극에 침착되고, 중합체에 포획되도록 불용성 형태로 가교됨으로써 "제자리에 유지"된다. 이후, 커버(cover) 막이 전형적으로 효소를 추가로 보유하고, 파울링(fouling), 간섭물(interferent) 등으로부터의 보호를 제공하기 위해 적용된다. 그러나, 다중-용도 BUN 바이오센서를 생산하기 위해 상기 기술을 적용하려고 시도할 때 문제가 발생하였다. 다중-용도 BUN 바이오센서에 대해 열악한 사용 수명이 전형적으로 관찰되었으며; 열악한 사용 수명은 바이오센서에 종종 고정되는 불충분한 양의 활성 요소분해효소, 시간이 지남에 따른 리칭(leeching)으로부터의 요소분해효소의 손실로 인한 성능 저하, 및 사용-기반 효소 감손을 포함하는(이에 제한되지는 않음) 다양한 요인의 결과이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 구성된 다중-용도 바이오센서의 투시도이다.
도 2는 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 구성된 다중-용도 바이오센서 어레이 어셈블리의 투시도이다.
도 3은 0, 5 및 27 mg/dL의 BUN 캘리브레이터(calibrator) 용액(1, 2 및 3) 및 반복된 혈액 샘플(4)에 노출시 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 구성된 다중-용도 바이오센서의 검정 반응 동역학의 도표 표현이다.
도 4는 가교되지 않은 요소분해효소를 함유하는 통상적인 다중-용도 바이오센서(◇) 및 가교된 요소분해효소를 함유하는 통상적인 다중-용도 바이오센서(□)에 비한 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 구성된 다중-용도 바이오센서(○)의 37℃에서 5 및 27 mg/dL의 BUN 캘리브레이터 용액에서의 30일에 걸친 전위차 BUN(혈액 요소 질소) 센서 용량-반응 기울기의 도표 표현이다(하루에 10 혈액 샘플 및 62 캘리브레이터).
상세한 설명
예시적인 언어 및 결과를 통해 본 발명의 개념(들)의 적어도 하나의 구현예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명의 개념(들)은 이의 적용에 있어서 하기 설명에 기재된 구성의 세부사항 및 성분의 배열에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 본 발명의 개념(들)은 다른 구현예가 가능하거나, 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 이와 같이, 본원에서 사용되는 언어는 가장 넓은 범위 및 의미로 제공되도록 의도되며; 구현예는 예시적인 것을 의미하며 총망라된 것이 아니다. 또한, 본원에서 이용되는 어구 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며, 제한되는 것으로 간주되어선 안되는 것이 이해되어야 한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 현재 개시된 본 발명의 개념(들)과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이며, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 전술한 기술 및 절차는 일반적으로 당 분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적 및 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용된 명명법, 및 이들의 실험실 절차 및 기술은 당 분야에 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 화학 합성 및 화학 분석에는 표준 기술이 이용된다.
명세서 내에 언급된 모든 특허, 공개된 특허 출원, 및 비-특허 공개는 현재 개시된 본 발명의 개념(들)이 속하는 분야의 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 본 출원의 임의의 부분에서 언급된 모든 특허, 공개된 특허 출원, 및 비-특허 공개는 각각의 개별적 특허 또는 공개가 참조로서 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 전체내용이 참조로서 명백히 본원에 포함된다.
본원에 개시된 모든 물품, 조성물, 및/또는 방법은 본 발명의 개시에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 개념(들)의 물품, 조성물, 및 방법은 특정 구현예에 의해 기재되었으나, 본 발명의 개념(들)의 개념, 사상, 및 범위로부터 벗어남이 없이 본원에 기재된 물품, 조성물 및/또는 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 상기 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 개념(들)의 사상, 범위, 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
본 발명의 개시에 따라 이용되는 바와 같이, 하기 용어는 달리 지시되지 않는 한 하기 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다:
청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우 단수 용어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있으나, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와도 일치한다. 이와 같이, 단수 용어는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "화합물"에 대한 언급은 하나 이상의 화합물, 2개 이상의 화합물, 3개 이상의 화합물, 4개 이상의 화합물, 또는 더 많은 수의 화합물을 나타낼 수 있다. 용어 "복수"는 "2개 이상"을 나타낸다.
용어 "적어도 하나"의 사용은 하나뿐만 아니라 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 100개 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 초과의 임의의 양을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 용어 "적어도 하나"는 첨부되는 용어에 따라 100개 또는 1000개 이상으로 확장될 수 있으며; 또한, 100개/1000개의 양은 제한으로 간주되지 않고, 더 높은 한계가 또한 만족스러운 결과를 발생시킬 수 있다. 또한, 용어 "X, Y 및 Z 중 적어도 하나"의 사용은 X 단독, Y 단독 및 Z 단독뿐만 아니라 X, Y 및 Z의 임의의 조합을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 서수 용어(즉, "제1", "제2", "제3", "제4" 등)의 사용은 단지 2개 이상의 항목을 구별하기 위한 것이며, 예를 들어, 또 다른 항목에 비한 하나의 항목에 대한 임의의 차례 또는 순서 또는 중요성 또는 임의의 첨가 순서를 의미하지는 않는다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 단지 대안을 나타내기 위해 명백히 달리 지시되지 않는 한 또는 대안이 상호 배타적이지 않는 한 포괄적인 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 조건 "A 또는 B"는 다음 중 임의의 것에 의해 충족된다: A는 참(또는 존재)이고, B는 거짓(또는 존재하지 않음)이고, A는 거짓(또는 존재하지 않음)이고, B는 참(또는 존재)이고, A 및 B 둘 모두가 참(또는 존재)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "일 구현예", "구현예", "일부 구현예", "일 예", "예를 들어" 또는 "예"에 대한 임의의 언급은 구현예와 관련하여 기재된 특정 요소, 특색, 구조, 또는 특징이 적어도 하나의 구현예에 포함됨을 의미한다. 본 명세서의 다양한 곳에서 어구 "일부 구현예에서" 또는 "일 예"의 출현은, 예를 들어, 반드시 동일 구현예를 모두 지칭하는 것은 아니다. 또한, 하나 이상의 구현예 또는 예에 대한 모든 언급은 청구범위에 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다.
본 출원 전체에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 조성물/기구/장치에 대한 고유한 오차 변동, 값을 결정하기 위해 이용되는 방법, 또는 연구 대상 사이에 존재하는 변동을 포함하는 것을 나타내는 데 사용된다. 예를 들어, 비제한적인 예로, 용어 "약"이 사용되는 경우, 지정된 값은 특정된 값으로부터 플러스(plus) 또는 마이너스(minus) 20 퍼센트(percent), 또는 15 퍼센트, 또는 12 퍼센트, 또는 11 퍼센트, 또는 10 퍼센트, 또는 9 퍼센트, 또는 8 퍼센트, 또는 7 퍼센트, 또는 6 퍼센트, 또는 5 퍼센트, 또는 4 퍼센트, 또는 3 퍼센트, 또는 2 퍼센트, 또는 1 퍼센트만큼 가변적일 수 있는데, 이는 상기 변형은 개시된 방법을 수행하기에 적절하고, 당업자에게 이해되는 바와 같기 때문이다.
본 명세서 및 청구범위(들)에서 사용되는 바와 같이, 단어 "포함하는"(및 "-들을 포함하다" 및 "-을 포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는"(및 "-들을 갖다" 및 "-을 갖다"와 같은 갖는의 임의의 형태), "포함하는"(및 "-을 포함하다" 및 "-들을 포함하는"과 같은 포함하는의 임의의 형태), 또는 "함유하는"("-을 함유하다" 및 "-들을 함유하다"와 같은 함유하는의 임의의 형태)은 포괄적이거나 개방형이며, 추가의 언급되지 않는 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "또는 이들의 조합"은 상기 용어 앞에 열거된 항목의 모든 순열 및 조합을 나타낸다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이들의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC, 및 특정 상황에서 순서가 중요한 경우, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB 중 적어도 하나를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 예를 계속하여, BB, AAA, AAB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등과 같은 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복을 포함하는 조합이 명백히 포함된다. 당업자는 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한 전형적으로 임의의 조합의 항목 또는 용어의 수에 대한 제한이 없음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 이후에 기재되는 사건 또는 상황이 완전히 발생하거나 이후에 기재되는 사건 또는 상황이 더 큰 범위 또는 정도로 발생함을 의미한다. 예를 들어, 특정 사건 또는 상황과 관련되는 경우, 용어 "실질적으로"는 이후에 기재되는 사건 또는 상황이 시간의 적어도 80%, 또는 시간의 적어도 85%, 또는 시간의 적어도 90%, 또는 시간의 적어도 95%에서 발생하는 것을 의미한다. 용어 "실질적으로 인접한"은 2개의 항목이 서로 100% 인접하거나, 2개의 항목이 서로 근접하나, 서로 100% 인접하지 않거나, 2개의 항목 중 하나의 일부가 다른 항목에 100% 인접하지 않지만, 다른 항목에 근접한 것을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "관련된" 및 "결합된"은 2개의 모이어티(moiety)를 서로 직접 회합/결합시키는 것뿐만 아니라 2개의 모이어티를 서로 간접적으로 회합/결합시키는 것 둘 모두를 포함한다. 회합/결합의 비제한적인 예는, 예를 들어, 직접 결합에 의하거나 스페이서(spacer) 기를 통해 하나의 모이어티를 또 다른 모이어티에 공유 결합시키는 것, 직접적으로 또는 모이어티에 결합된 특정 결합쌍 구성원에 의해 하나의 모이어티를 또 다른 모어이티에 비-공유 결합시키는 것, 하나의 모이어티를 또 다른 모이어티에 용해시키거나 합성에 의한 것과 같은 하나의 모이어티의 또 다른 모이어티로의 통합, 및 하나의 모이어티를 또 다른 모이어티 상에 코팅(coating)시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "샘플"은 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 이용될 수 있는 임의의 유형의 생물학적 샘플을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 이용될 수 있는 유체 생물학적 샘플의 예는 전혈 또는 이의 임의의 일부(즉, 혈장 또는 혈청), 소변, 타액, 가래, 뇌척수액(CSF), 피부, 장액, 복강액, 낭포액, 땀, 간질액, 세포외액, 눈물, 점액, 방광 세척액, 정액, 분변, 흉막액, 비인두액, 이들의 조합 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "환자"는 인간 및 수의 대상체를 포함한다. 특정 구현예에서, 환자는 포유동물이다. 특정한 다른 구현예에서, 환자는 인간이다. 치료 목적의 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 비인간 영장류, 및 동물원, 스포츠(sports), 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "정제된"은 시작 물질 또는 천연 물질과 비교하여 적어도 1 크기 정도의 정제, 비제한적인 예로, 시작 물질 또는 천연 물질의 2, 3, 4 또는 5 크기 정도의 정제가 달성되는 것을 의미한다. 따라서, 본원에서 이용되는 용어 "정제된"은 반드시 물질이 100% 정제됨을 의미하지는 않으며, 따라서 상기 용어는 정제된 조성물에 존재하는 다른 물질(들)의 존재를 배제하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "전극"은 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 기능할 수 있는 임의의 유형의 도체 또는 매체를 나타낸다. 현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 범위에 속하는 전극의 비제한적인 예는 복수의 전극을 포함하는 전기화학 전지를 포함한다. 예시적인 전기화학 전지 구조물은 하나의 지시 전극 및 하나의 참조 전극을 포함하는 2-전극 전지, 하나의 애노드(anode) 및 하나의 캐쏘드(cathode)를 포함하는 2-전극 전지, 하나의 애노드, 하나의 캐쏘드 및 하나의 참조 전극을 포함하는 3-전극 전지, 및 2개의 작동 전극, 하나의 카운터(counter) 전극, 및 하나의 참조 전극을 포함하는 4-전극 전지를 포함한다.
현재, 다중-용도 바이오센서가 센서 어레이에 사용할 수 있다. 그러나, 이들 바이오센서는 일반적으로 바이오센서에 고정된 불충분한 활성 효소, 시간 경과에 따른 효소 리칭의 손실에 의해 야기되는 저하된 성능, 단순히 사용으로 인한 효소의 감손, 및/또는 파울링 및/또는 간섭물로 인한 불충분한 효소 활성으로 인한 짧은 사용 수명을 전형적으로 갖는다.
따라서, 종래 기술의 현재의 다중-용도 바이오센서의 문제를 해결하면서 또한 센서 어레이 어셈블리에 사용될 수 있는 새롭고 개선된 다중-용도 바이오센서가 당 분야에 필요하다. 특히, 적어도 14일의 사용 수명(비제한적인 예로, 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일의 사용 수명) 및 적어도 1000개의 샘플 용량(비제한적인 예로, 적어도 1500, 2000, 2500 또는 3000개의 샘플 용량)을 가지면서 바이오센서의 온전성, 반응 및 정밀도를 실질적으로 유지시키는 다중-용도 바이오센서(예를 들어, BUN 및 다른 효소-기반 바이오센서)가 당 분야에 필요하다.
이제 도면(특히 도 1)을 참조하여, 현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 특정 구현예는 유체 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 표적 분석물의 존재 및/또는 농도를 검출하기 위한 다중-용도 바이오센서(10)에 관한 것이다. 다중-용도 바이오센서(10)는 적어도 일부에 분배된 변형된 효소(14)를 갖는 전극(12), 및 변형된 효소(14)의 적어도 일부 상에 배치된 막(16)을 포함한다. 막(16)(본원에서 또한 "커버 막"으로 상호교환적으로 언급됨)은 전극(12) 상에 변형된 효소(14)를 고정시키는 기능을 한다. 효소(14)는 변형된 효소(14)가 유체 생물학적 샘플 및 다중-용도 바이오센서(10)와 함께 이용되는 캘리브레이션(calibration) 시약에 실질적으로 불용성이 되도록 효소 상의 적어도 하나의 작용기와 반응물의 반응을 통해 이의 용해도를 감소시키도록 변형되었다. 예를 들어(비제한적인 예로), 변형된 효소(14)는 유체 생물학적 샘플 및 다중-용도 바이오센서(10)와 함께 사용되는 캘리브레이션 시약에서 실질적으로 불용성이나, 유체 생물학적 샘플 및 캘리브레이션 시약보다 낮은 이온 강도를 갖는 완충액에서는 실질적으로 가용성일 수 있다. 또한, 변형 후, 효소(14)는 여전히 적어도 하나의 표적 분석물과 상호작용할 수 있는 활성 부위를 유지하여, 적어도 하나의 표적 분석물이 상기 상호작용(및 변형된 효소(14)에 의한 포획)을 통해 검출될 수 있다.
특정한(그러나, 비제한적인) 구현예에서, 다중-용도 바이오센서(10)는 다중-용도 혈액 요소 질소(BUN) 바이오센서로서 추가로 정의된다. 이러한 구현예에서, 바이오센서(10)에 존재하는 변형된 효소(14)는 변형된 요소분해효소이다. 특정한(그러나, 비제한적인) 예에서, 요소분해효소는 장쇄 바이오틴(biotin)과의 상호작요에 의해 변형되었다.
현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 다중-용도 바이오센서(10)는 효소(14)의 용해도를 감소시켜 바이오센서(10)로부터의 효소(14)의 리칭을 방지하고, 이에 의해 바이오센서(10)의 온전성을 유지시키고, 이에 따라 증가된 사용 수명 및 샘플 용량을 갖는 다중-용도 바이오센서(10)를 제공함으로써 종래 기술의 결함 및 단점을 극복한다. 예를 들어(비제한적인 예로), 다중-용도 바이오센서(10)는 적어도 약 14일의 사용 수명에 걸쳐 이의 온전성 및 적어도 약 3000개의 샘플의 샘플 용량을 실질적으로 유지시킬 수 있다.
현재, 다중-바이오센서 어레이 제품을 생산하는 데 2개의 일반적인 접근법이 이용된다. 이들 접근법에서, 개별 센서는 개별적으로 생산된 후, 각각의 센서에 대해 화학 작용이 수행된 후 어레이에서 함께 스티칭되고(stitched); 대안적으로, 어레이에 다수의 전극을 함유하는 단일 기판이 사용되고, 적절한 결합 화학 작용(예를 들어, 가교에 의한 효소 부착)이 각각의 전극에 대해 수행(전형적으로, 시약을 순차적으로 분배시킴에 의함)된다. 상기 두 번째 옵션(option)은 감소된 비용 및 감소된 샘플 부피의 이점을 가지나; 제조 동안 전극 화학 물질 중 어느 하나에서 임의의 문제가 발생하면 전체 어레이가 못쓰게 되는 증가된 위험이 존재한다.
따라서, 종래 기술의 표준 가교 방법의 결함 중 하나는 결합 화학 작용이 제조 동안 전극 상에서 직접 수행되고, 이러한 직접 상호작용은 특히 하나 이상의 결합 화학 작용이 "단일 기판" 다중-센서 어레이 제품에서 수행되는 다수의 전극이 존재하는 경우에 제조의 위험 및 복잡성을 증가시킨다는 점이다. 현재 개시된 본 발명의 개념(들)은 최종 어레이 제조 공정 외부에서 주요 효소 화학 작용을 수행함으로써 상기 결함을 극복함으로써 제조 공정과 관련된 위험을 상당히 감소시킨다. 샘플 및 시험 매트릭스(matrix)에서 효소의 용해도를 상당히 감소시키면서 효소가 자유롭게 가용성인 다른 매트릭스로부터 효소를 분배할 수 있으므로, 변형된 효소는 제조 동안 전극에 대한 부착 전에 검증(예를 들어, 활성, 동역학 등에 대함)될 수 있고, 이에 의해 어레이에 탑재된 효소를 가교시킬 필요성을 제거한다.
다중-용도 바이오센서(10)의 특정 구성요소를 다시 참조하여, 효소를 포함하는 바이오센서에 사용할 수 있는 것으로 당 분야에 공지된 임의의 유형의 센서가 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 이용될 수 있다. 예를 들어(비제한적인 예로), 바이오센서(14)는 전위차, 전류측정, 임피던스측정(impedimetric), 또는 전도도측정 센서일 수 있다. 또한, 상기 유형의 바이오센서 중 하나와 함께 사용될 수 있는 것으로 당 분야에 공지된 임의의 전극이 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 전극(12)으로 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 전극(12)의 비제한적인 예는 이온-특이적 또는 이온-선택적 전극(ISE)을 포함한다. 선택된 특정 유형의 전극은 센서 유형(즉, 전위차, 전류측정, 임피던스측정, 전도도측정 등)에 좌우될 것이다. 특정한 비제한적인 구현예에서, 전극(12)은 감지 층(18)을 함유할 수 있다. 전극(12)과 함께 이용될 수 있고, 당 분야에 공지되어 있거나 당업자에 의해 달리 고려될 수 있는 임의의 감지 층이 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 이용될 수 있다. 현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 범위 내에 속하는 감지 층(18)의 하나의 비제한적인 예는 NH4 + 감지 층이다.
전극(12)은 전극이 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 기능하도록 하는 임의의 형태를 가질 수 있다. 예를 들어, 특정한 비제한적인 구현예에서, 전극(12)은 평면 또는 원형 형태일 수 있다. 전극(12)은 당 분야에 공지되거나 본원에서 달리 고려되는 임의의 방법에 의해 제작될 수 있다. 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 이용될 수 있는 제작 방법의 예는 스크린(screen) 인쇄, 금속 스퍼터링(sputtering), 포토리쏘그래피(photolithography), 또는 임의의 다른 표준 전극 제조 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
표적 분석물(들)은 유체 생물학적 샘플에 존재하고, 당 분야에 공지되거나 효소-함유 바이오센서에 의해 검출 가능한 것으로 본원에서 달리 고려되는 임의의 분석물일 수 있다. 현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 다중-용도 바이오센서에 의해 검출 가능한 표적 분석물의 비제한적인 예는 혈액 요소 질소(BUN), 글루코스(glucose), 글루타메이트(glutamate), 락테이트(lactate), 에탄올(ethanol), 아스코르브산(ascorbic acid), 콜린 아세틸콜린(choline acetylcholine), 크레아티닌(creatinine), 콜레스테롤(cholesterol), 피루베이트(pyruvate), 빌리루빈(bilirubin) 등을 포함한다.
유체 생물학적 샘플에서 표적 분석물의 검출을 위해 바이오센서에서 사용될 수 있는 것으로 당 분야에 공지된 임의의 효소가 현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 범위에 따라 효소(14)로서 이용될 수 있다. 다중-용도 바이오센서(10)에 유용한 효소의 비제한적인 예는 요소분해효소, 글루코스 산화효소, 글루타메이트 산화효소, 락테이트 산화효소, 피루베이트 산화효소, 사르코신(sarcosine) 산화효소, 크레아티닌 아미드가수분해효소, 크레아틴 아미디노하이드롤라제(creatine amidinohydrolase), 아스코르베이트(ascorbate) 산화효소, 알콜(alcohol) 산화효소, 콜레스테롤 산화효소, 콜린 산화효소, 빌리루빈 산화효소, 락카제(laccase), 티로시나제(tyrosinase), 알콜 탈수소효소, 글루코스 탈수소효소, 글루타메이트 탈수소효소, 락테이트 탈수소효소, 피루베이트 탈수소효소, 이들의 조합물 등을 포함한다.
효소(14) 상에 존재하는 적어도 하나의 변형된 작용기는 반응물과의 반응을 통해 변형될 수 있는 당 분야에 공지된 임의의 작용기일 수 있다. 작용기의 예는 알데하이드(aldehyde)-, 아민(amine)-, 카르보닐(carbonyl)-, 카르복실(carboxyl)-, 하이드록실(hydroxyl)-, 케톤(ketone)-, 말레이미드(maleimide)-, 설프하이드릴(sulfhydryl)-, 및 티올(thiol)-반응성 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 방식으로 효소 상의 작용기와 상호작용할 수 있는 당 분야에 공지되거나 본원에서 달리 고려되는 임의의 반응물이 현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 범위 내에서 이용될 수 있다. 작용기-반응물 상호작용의 하나의 비제한적인 예는 효소 상의 아민기와 장쇄 바이오틴 사이의 상호작용을 포함한다. 작용기-반응물 상호작용의 또 다른 비제한적인 예는 효소 상의 COOH 작용기와 1-에틸-3-(-3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드("EDC")/N-하이드록시숙신이미드 에스테르("NHS") 사이의 상호작용을 포함한다. 그러나, 상호작용(들)이 효소(14)의 용해도에 영향을 미치고, 효소(14)의 활성 부위 및/또는 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 한 임의의 작용기-반응물 상호작용(및 다수의 작용기-반응물 상호작용의 임의의 조합)이 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 이용될 수 있다.
효소에 대한 변형은 당 분야에 공지되거나 달리 고려 가능한 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어(비제한적인 예로), 효소에 부착된 반응물은 변형되지 않은 효소의 분자량 및/또는 등전점과 비교하는 경우 변형된 효소의 분자량을 증가시킬 수 있고/있거나 등전점을 변화시킬 수 있다.
변형된 효소(14)는 바이오센서(10)가 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 수행할 수 있게 하는 임의의 백분율의 표면적으로 전극(12) 상에 존재할 수 있다. 예를 들어(비제한적인 예로), 변형된 효소(14)는 바이오센서(10)에 의한 표적 분석물의 충분한 포획을 가능하게 하기 위해 전극(14)의 충분한 양의 표면적에 존재해야 한다. 특정한 특정(그러나 비제한적인) 구현예에서, 변형된 효소(14)는 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%, 약 101%, 약 102%, 약 103%, 약 104%, 약 105%, 약 110%, 약 115%, 약 120% 이상의 백분율의 표면적으로 전극(12) 상에 존재할 수 있다. 달리 말하면, 변형된 효소(14)는 전극(12)의 표면적보다 작거나, 같거나, 큰 표면적을 가질 수 있다. 또한, 현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 범위는 또한 상기 열거된 2개의 값의 조합으로부터 형성된 임의의 범위(예를 들어, 약 10% 내지 약 120%의 범위, 약 20% 내지 약 105%의 범위, 약 30% 내지 약 100%의 범위, 약 40% 내지 약 75%의 범위 등) 내에 속하는 임의의 백분율의 표면적으로 전극(12) 상의 변형된 효소(14)의 존재를 포함한다.
특정한 비제한적인 구현예에서, 변형된 효소(14)와 전극(12) 사이에는 물리적 부착이 없다. 대신, 커버 막(16)이 변형된 효소(14) 위에 배치되어 변형된 효소(14)를 전극(12) 상의 제자리에 유지시킨다. 커버 막은 이전에 바이오센서의 구성요소로 사용되어 왔으며; 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 막(16)으로서 이용될 수 있는 이의 비제한적인 예는 미국 특허 번호 7,959,791호(이의 전체 내용은 참조로서 본원에 명백히 포함됨)에 개시되어 있다. 따라서, 당업자는 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 이용될 수 있는 커버 막을 인지할 것이다.
특정 구현예에서, 커버 막(16)은 검출될 표적 분석물에 대해 투과성이지만, 변형된 효소(14)에는 실질적으로 불투과성이다. 예를 들어(비제한적인 예로), 막(16)은 센서(10)를 통한 생물학적 분석물의 통과 및 센서(10)로부터의 임의의 부산물의 제거를 가능하게 하기 위해 반투과성일 수 있다. 또한, 막(16)은 바이오센서(10)가 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따라 기능할 수 있게 하는 당 분야에 공지되거나 본원에서 달리 고려되는 임의의 물질로 형성될 수 있다. 즉, 막(16)은 검출될 표적 분석물(들)에 투과성이지만 변형된 효소(15)에는 실질적으로 불투과성인 물질로 형성되어야 한다. 막(16)이 형성될 수 있는 물질의 비제한적인 예는 폴리우레탄(polyurethane), 실리콘(silicone), 폴리(비닐 클로라이드), 이들의 조합물 등을 포함한다. 막이 구성될 수 있는 물질의 한 특정한(비제한적인) 예는 폴리에스테르 기반 폴리우레탄인 HydroMed™ D7(AdvanSource Biomaterials Corp., Wilmington, MA)이다.
막(16)은 임의의 부산물을 제거하기 위해 사용 사이에 세척 용액으로 용이하게 세척될 수 있다. 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에서 감소된 용해도를 갖는(및 전극에 가교되지 않은) 변형된 효소의 사용 전에, 조밀한 가교된 효소 층은 부산물을 보유하고, 더 초기의 생물학적 샘플로부터의 이월을 야기시킬 수 있다.
효소의 용해도를 상당히 감소시키기 위한 효소의 변형은 바이오센서에 효소를 직접 공유 결합시키는 종래 기술의 방법에 비해 놀랍고 예상치 못한 개선을 제공한다. 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따른 변형된 효소의 사용은 (1) 가교되지 않은 변형되지 않은 효소의 사용보다 낫고, (2) 통상적인 탑재 가교 효소(그러나 가교의 사용을 필요로 하지는 않음)의 사용과 유사한 성능 이점을 제공하며; 이와 같은, 이들 성능 이점은 바이오센서의 더 긴 사용 수명을 발생시키는 동시에 바이오센서의 반응(및 이에 따라 또한 바이오센서의 정밀도)을 또한 최대화시킨다. 또한, 효소의 작용기의 반응을 통해 효소의 용해도를 감소시키기 위해 다양한 널리 공지된 화학 작용이 이용될 수 있고, 이들 다양한 화학 작용은 임의의 바이오센서 어레이의 전극 분배 및 어셈블리와 관련하여 오프라인(offline)으로 수행될 수 있고; 또한, 이들 화학 작용의 이용은 바이오센서 어레이 제조 동안 중요한 효소 변형이 오프라인으로 수행될 수 있게 하여 바이오센서의 더 긴 사용 수명을 발생시키고 바이오센서의 반응 및 정밀도를 또한 최대화시킨다. 변형된 효소는 임의의 분배가 시작되기 전에 제조되고 검증될 수 있어서 "나쁜" 바이오센서가 생성되고 이에 의해 전체 바이오센서 어레이 어셈블리의 생성을 망칠 가능성을 감소시킨다(즉, 전극 상에 불충분한 양의 활성 효소를 고정시킴에 의함). 효소의 용해도를 감소시키기 위해 적절한 반응물을 사용함으로써 우수한 효소 안정성이 또한 달성된다.
현재 개시된 본 발명의 개념(들)은 각각의 사용 후 또는 몇몇 사용 후 바이오센서를 교체할 필요성을 제거한다. 오히려, 현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 바이오센서는 향상된 사용 수명을 갖고, 사용 사이에 세척 용액으로 간단히 세척될 수 있다. 더욱이, 현재 개시된 본 발명의 개념(들)은 전극에 대한 효소의 가교의 결여가 가교된 매트릭스에서의 포획을 감소시키고, 생물학적 샘플 작업 사이에 더 나은 세정을 가능하게 하므로 생물학적 샘플 사이의 이월을 감소시킨다. 이와 같이, 현재 개시된 본 발명의 개념(들)은 처리 시간의 양을 감소(다수의 검사가 한번에 수행될 수 있으므로)시키고, 혈액 가스 분석기와 같은 기기에 소비되는 유지 시간의 양을 감소시킴으로써 종래 기술을 개선시킨다.
도 2에 제시된 바와 같이, 현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 특정 구현에는 기판(54)과 조합된 복수의 다중-용도 바이오센서(이 중 2개는 일반 참조 번호 52로 도 2에 표시됨)를 포함하는 다중-용도 바이오센서 어레이 어셈블리(50)에 관한 것으로, 다중-용도 바이오센서(52) 중 적어도 하나는 상기 본원에 상세히 설명되거나 본원에서 달리 고려되는 바와 같이 감소된 용해도를 갖는 변형된 효소(14)를 포함하는 임의의 바이오센서(10)이다. 기판(54)은 제1 표면(56) 및 제1 표면(56)에 대향하는 제2 표면(58)을 가지며, 복수의 다중-용도 바이오센서(52) 각각은 기판(54)의 제1 및 제2 표면(56 및 58) 중 적어도 하나 상에 공간적으로 위치된다.
다중-용도 바이오센서(52) 중 적어도 2개가 감소된 용해도를 갖는 변형된 효소(14)를 포함하는 다중-용도 바이오센서(10)인 경우, 2개의 다중-용도 바이오센서(10)에 존재하는 효소(14)는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 구현예에서, 어레이 어셈블리(50)에 존재하는 바이오센서(52)의 모든 효소는 상이할 수 있고; 대안적으로, 다중-용도 바이오센서 어레이 어셈블리(50)에 존재하는 복수의 다중-용도 바이오센서(52) 각각의 적어도 2개의 효소는 동일할 수 있다.
현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 다중-용도 바이오센서(10)는 당 분야에 공지되거나, 당업자에 의해 달리 고려될 수 있는 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 특정한 추가 구현예는 상기 본원에 기재되거나 본원에서 달리 고려되는 임의의 다중-용도 분석물 바이오센서를 생성시키는 방법에 관한 것이며, 바이오센서는 안정적이고 자격을 갖춘 제품을 제공하도록 제조되고 제작될 수 있다. 상기 방법에서, 제1 완충액에 존재하는 효소는 효소 상의 적어도 하나의 작용기와 반응물을 반응시킴으로써, 변형되지 않은 효소와 비교하는 경우 감소된 용해도를 갖는 변형된 효소를 생성시킴에 의해 변형되고; 생성된 변형된 효소는 유체 생물학적 샘플 및 다중-용도 바이오센서와 함께 이용되는 캘리브레이션 시약에서 실질적으로 불용성이고, 변형된 효소는 여전히 표적 분석물의 검출을 위해 표적 분석물과 상호작용할 수 있는 활성 부위를 보유한다. 이후, 변형된 효소의 침전물이 형성되고, 변형된 효소의 침전물은 제2 완충액에 재용해되어 변형된 효소 용액을 제공하고; 제2 완충액은 제1 완충액보다 낮은 이온 강도를 가지므로 변형된 효소는 제2 완충액에서 실질적으로 가용성이지만, 제1 완충액에서는 덜 가용성이거나 실질적으로 불용성이다. 특정량의 변형된 효소 용액은 전극의 적어도 일부 상에 분배되고, 그 위에서 건조된다. 이후, 막은 변형된 효소의 적어도 일부 및 전극 상에 배치되고, 막은 변형된 효소를 전극 상에 고정시킨다.
상기 방법은 또한 (i) 효소의 변형 전에 제1 완충액으로의 완충액 교환에 의해 부형제로부터 효소를 정제하고/하거나; (ii) 전극 상에 증착 전 및/또는 후에 효소의 활성을 적격화시키는 것과 같은(이에 제한되지는 않음) 하나 이상의 선택적 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일단 효소가 변형되고 전극 상에 증착되기 전에, 효소 활성을 결정하기 위한 검사가 수행될 수 있다. 이후, 이의 적격화시, 원하는 양의 변형된 효소가 전극 상에 분배되고, 막을 통해 그 위에 고정될 수 있다.
현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 다중-용도 바이오센서 어레이 어셈블리(50)는 당 분야에 공지되거나, 당업자에 의해 달리 고려될 수 있는 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 추가 구현예는 다중-용도 바이오센서 어레이 어셈블리의 생성 방법에 관한 것이다. 상기 방법에서, 복수의 다중-용도 바이오센서가 형성되고, 기판의 적어도 하나의 표면 상에 공간적으로 배치된다. 이렇게 형성된 복수의 다중-용도 바이오센서 중 적어도 하나는 상기 본원에 상세히 기재되거나 본원에서 달리 고려되는 바와 같이 감소된 용해도를 갖는 변형된 효소를 포함하는 임의의 다중-용도 바이오센서이고; 변형된 효소를 포함하는 다중-용도 바이오센서는 또한 상기 본원에 상세히 기재되거나 본원에서 달리 고려되는 임의의 방법에 의해 형성될 수 있다.
현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 또 다른 추가 구현예는 유체 생물학적 샘플에서 표적 분석물의 존재 및/또는 농도를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법에서, 유체 생물학적 샘플은 상기 본원에 상세히 기재된 임의의 다중-용도 바이오센서를 함유하는 혈액 가스, 전해질 및/또는 대사물 기기에 삽입된다. 이후, 상기 방법은 다중-용도 바이오센서에 의해 포획된 표적 분석물의 존재 및/또는 농도를 측정하고, 기기에 의해 이를 보고하는 것을 포함한다. 예를 들어(비제한적인 예로), 표적 분석물 이온은 다중-용도 바이오센서를 통해 분산되고, 다중-용도 바이오센서 상에 존재하는 상응하는 효소에 결합한다. 그 때, 이온 수준은 당 분야에 현재 공지되어 있거나 본원에서 달리 고려되는 임의의 다양한 방법(막 전위 또는 전류측정에서의 변화를 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 의해 측정될 수 있다.
또한, 현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 다른 구현예는 유체 생물학적 샘플에서 복수의 표적 분석물의 존재 및/또는 농도를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법에서, 유체 생물학적 샘플은 상기 본원에 상세히 기재된 임의의 다중-용도 바이오센서 어레이 어셈블리를 함유하는 혈액 가스, 전해질 및/또는 대사물 기기에 삽입된다. 이후, 상기 방법은 어레이 어셈블리의 개별적 다중-용도 바이오센서에 의해 포획된 복수의 표적 분석물 각각의 존재 및/또는 농도를 측정하고, 기기에 의해 이를 보고하는 것을 포함한다. 따라서, 현재 개시된 본 발명의 개념(들)은 다수의 다중-용도 바이오센서로부터 다수의 분석물에 대한 측정치를 동시에 얻는 것을 고려한다.
상기 검출 방법 각각에서, 유체 생물학적 샘플은 전혈 또는 이의 임의의 일부(즉, 혈장 또는 혈청), 소변, 타액, 가래, 뇌척수액(CSF), 피부, 장액, 복강액, 낭포액, 땀, 간질액, 세포외액, 눈물, 점액, 방광 세척액, 정액, 분변, 흉막액, 비인두액, 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
실시예
하기에 실시예가 제공된다. 그러나, 현재 개시된 본 발명의 개념(들)은 특정 실험, 결과 및 실험실 절차에 대한 이의 적용에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 오히려, 실시예는 단순히 다양한 구현예 중 하나로 제공되며, 예시적인 것을 의미하며, 총망라된 것은 아니다.
하기 실시예는 용해도를 감소시키기 위해 변형된 요소분해효소를 이용하여 생성된 BUN 다중-용도 바이오센서의 생성 및 용도에 관한 것이다.
1. 요소분해효소(474 mg, BBI Solutions, Cardiff, UK)를 100 mM 인산염 완충 염수(PBS, 0.936 ml)에 용해시키고, 부형제를 7K MWCO ZEBA™ 컬럼(Column)(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)을 이용하여 제거하였다. 요소분해효소 용액의 최종 부피를 PBS를 사용하여 1.26 ml로 조정하였다.
부형제가 반응의 효과를 감소시키므로, 상기 단계에서와 같이 부형제로부터의 요소분해효소의 정제가 유용하다는 것이 입증되었다. 그러나, 이러한 단계는 필요하지 않으며; 대안적으로, 높은 농도의 반응물이 부형제의 존재하에서 이용될 수 있다.
2. 이후, 요소분해효소를 2시간 동안 가벼운 혼합을 통해 적어도 30 몰당량(molar equivalent)의 Sulfo-NHS-LC-LC-바이오틴(160 μl의 물 중 125 mg/ml; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)과 반응시켰다.
3. 이후, 불용성 비오티닐화(biotinylated) 요소분해효소를 함유한 침전물을 형성시키고, 원심분리로 수집하였다.
4. 상층액을 따라 내고, 이후 변형된 요소분해효소를 10 mM PBS(2 ml)에 재용해시켰다. 이러한 PBS 완충액은 단계 1의 정제 반응에서 사용된 100 mM PBS보다 낮은 이온 강도를 갖는다.
선택적으로, 과량의 시약은 두 번째 ZEBA™ 컬럼 완충액 교환(10 mM PBS)을 이용하여 제거될 수 있다.
특정 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 여기서 메커니즘(mechanism)은 널리 공지된 "염석" 메커니즘을 포함할 수 있다. 이러한 단계의 핵심은 변형된 효소가 낮은 이온 강도 완충액/물에서 가용성이지만, 캘리브레이터 용액 및 환자 샘플(전형적으로, >130 mM)과 같은 보다 높은 강도의 완충액에서는 덜한 가용성/불용성이라는 것이다.
5. 변형된 효소의 활성은 표준 광학 요소분해효소 검정을 이용하여 측정하였다. 전형적으로, 이 시점에서 일부 활성 손실이 관찰될 수 있으나; 손실 수준은 최소이며, 여전히 바이오센서에 충분한 효소 활성을 제공한다.
6. 원하는 경우, 효소는 이 시점에서 장기 저장을 위해 바이알(vial)로 동결건조될 수 있다.
7. 비오티닐화 요소분해효소 용액을 원하는 활성/분배 농도(예를 들어, 26 KU/ml)로 조정하고, 비액틴(nonactin) 계열 NH4 +-감지 층을 함유하는 스크린-인쇄된 Ag/AgCl 전극(1.5 mm X 0.5 mm) 상에 분배하고, 건조시켰다(예를 들어, Butt and Cammann (1992) Anal. Lett ., 25:1597). 이 단계는 0.01초 동안 27 게이지(gauge) 바늘, 및 1.4 psi 분배 파라미터(parameter)를 이용하였다. 이러한 분배 단계를 각각의 분배 단계 사이에 15분으로 2회 더 반복하였다.
건조 후, 효소의 상부에 HydroMed™ D7 우레탄(urethane)(THF/사이클로헥사논(9:1) 중 4%, 0.01 s, 3.6 psi; AdvanSource Biomaterials Corp., Wilmington, MA))의 층을 분배하여 커버 막을 첨가하였다.
단계 (7) 후, 센서 제작이 완료되었다.
자유 표준 효소에 비한 BUN 센서(감소된 용해도를 갖는 변형된 요소분해효소를 함유함)의 개선된 성능이 도 3 및 4에 제시된다. 도 3 및 4는 5 mg/dL 및 27 mg/dL BUN 캘리브레이터 용액뿐만 아니라 혈액 샘플에 대한 센서의 검정 반응 동역학 및 용량-반응 기울기를 각각 나타낸다. 센서는 전형적으로 적어도 2주 동안, 및 최대 30일 동안 완전한 안전성을 유지하였다.
본 발명의 개념(들)의 비제한적인 구현예
특정 구현예는 유체 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 표적 분석물의 존재 및/또는 농도를 검출하기 위한 다중-용도 바이오센서에 관한 것이다. 다중-용도 바이오센서는 전극, 변형된 효소 및 막을 포함한다. 변형된 효소는 전극의 적어도 일부 상에 분배되고; 효소는 변형된 효소가 유체 생물학적 샘플 및 다중-용도 바이오센서와 함께 이용되는 캘리브레이션 시약에서 실질적으로 불용성이 되도록 효소 상의 적어도 하나의 작용기와 반응물의 반응을 통해 이의 용해도를 감소시키도록 변형되었으며, 변형된 효소는 표적 분석물의 검출을 위해 표적 분석물과 상호작용하는 활성 부위를 포함한다. 막은 변형된 효소의 적어도 일부 상에 배치되며, 막은 변형된 효소를 전극 상에 고정시킨다.
특정 구현예에서, 다중-용도 바이오센서는 전위차 분석물 바이오센서로서 추가로 정의될 수 있다.
특정 구현예에서, 변형된 효소 상의 적어도 하나의 작용기는 알데하이드-, 아민-, 카르보닐-, 카르복실-, 하이드록실-, 케톤-, 말레이미드-, 설프하이드릴-, 및 티올-반응기를 포함하는 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 반응물은 장쇄 바이오틴을 포함한다.
특정 구현예에서, 막은 검출될 표적 분석물에 대해 투과성이지만, 변형된 효소에는 실질적으로 불투과성이다.
특정 구현예에서, 막은 폴리우레탄, 실리콘, 폴리(비닐 클로라이드) 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 물질로 형성된다.
특정 구현예에서, 효소는 요소분해효소, 글루코스 산화효소, 글루타메이트 산화효소, 락테이트 산화효소, 피루베이트 산화효소, 사르코신 산화효소, 크레아티닌 아미드가수분해효소, 크레아틴 아미디노하이드롤라제, 아스코르베이트 산화효소, 알콜 산화효소, 콜레스테롤 산화효소, 콜린 산화효소, 빌리루빈 산화효소, 락카제, 티로시나제, 알콜 탈수소효소, 글루코스 탈수소효소, 글루타메이트 탈수소효소, 락테이트 탈수소효소, 및 피루베이트 탈수소효소를 포함하는 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 다중-용도 바이오센서는 다중-용도 혈액 요소 질소(BUN) 바이오센서로 추가로 정의되며, 적어도 하나의 변형된 효소는 변형된 요소분해효소이다.
특정 구현예에서, 바이오센서는 적어도 14일의 사용 수명을 갖는다.
특정 구현예에서, 변형된 효소는 유체 생물학적 샘플 및 다중-용도 바이오센서와 함께 사용되는 캘리브레이션 시약보다 낮은 이온 강도를 갖는 완충액에서 실질적으로 가용성이다.
특정 구현예에서, 효소에 부착된 반응물은 변형되지 않은 효소의 분자량 및/또는 등전점과 비교하는 경우 변형된 효소의 분자량을 증가시키고/시키거나 등전점을 변화시킨다.
특정 구현예는 기판 및 복수의 다중-용도 바이오센서를 포함하는 다중-용도 바이오센서 어레이 어셈블리에 관한 것이다. 복수의 다중-용도 바이오센서 각각은 기판의 적어도 하나의 표면 상에 공간적으로 위치되며, 복수의 다중-용도 바이오센서 중 적어도 하나는 상기 본원에 바로 기재된 임의의 다중-용도 바이오센서이다.
특정 구현예는 다중-용도 바이오센서를 생성시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 변형된 효소가 유체 생물학적 샘플 및 다중-용도 바이오센서와 함께 이용되는 캘리브레이션 시약에서 실질적으로 불용성이 되도록 효소 상의 적어도 하나의 작용기와 반응물을 반응시켜 변형되지 않은 효소와 비교하는 경우 감소된 용해도를 갖는 변형된 효소를 생성시킴으로서 제1 완충액에 존재하는 효소를 변형시키는 단계로서, 상기 변형된 효소가 표적 분석물의 검출을 위해 표적 분석물과 상호작용하는 활성 부위를 포함하는, 단계; (b) 변형된 효소의 침전물을 형성시키는 단계; (c) 제2 완충액에 변형된 효소의 침전물을 재용해시켜 변형된 효소 용액을 제공하는 단계로서, 상기 제2 완충액이 제1 완충액보다 낮은 이온 강도를 가져 변형된 효소가 제2 완충액에서 실질적으로 가용성이나, 제1 완충액에서 덜 가용성이거나 실질적으로 불용성인, 단계; (d) 전극의 적어도 일부 상에 특정량의 변형된 효소 용액을 분배하는 단계; (e) 전극 상의 변형된 효소 용액을 건조시키는 단계; 및 (f) 변형된 효소의 적어도 일부 및 전극 상에 막을 배치하는 단계로서, 상기 막이 전극 상의 변형된 효소를 고정시키는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 다중-용도 분석물 바이오센서는 전위차 분석물 바이오센서로서 추가로 정의된다.
특정 구현예에서, (i) 효소 상의 적어도 하나의 작용기는 알데하이드-, 아민-, 카르보닐-, 카르복실-, 하이드록실-, 케톤-, 말레이미드-, 설프하이드릴-, 및 티올-반응기를 포함하는 군으로부터 선택되고/되거나; (ii) 반응물은 장쇄 바이오틴을 포함하고/하거나; (iii) 막은 검출될 표적 분석물에 투과성이지만 변형된 효소에 실질적으로 불투과성이고/이거나; (iv) 막은 폴리우레탄, 실리콘, 폴리(비닐 클로라이드), 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 물질로 형성되고/되거나; (v) 효소는 요소분해효소, 글루코스 산화효소, 글루타메이트 산화효소, 락테이트 산화효소, 피루베이트 산화효소, 사르코신 산화효소, 크레아티닌 아미드가수분해효소, 크레아틴 아미디노하이드롤라제, 아스코르베이트 산화효소, 알콜 산화효소, 콜레스테롤 산화효소, 콜린 산화효소, 빌리루빈 산화효소, 락카제, 티로시나제, 알콜 탈수소효소, 글루코스 탈수소효소, 글루타메이트 탈수소효소, 락테이트 탈수소효소, 및 피루베이트 탈수소효소를 포함하는 군으로부터 선택되고/되거나; (vi) 효소에 부착된 반응물은 변형되지 않은 효소의 분자량 및/또는 등전점과 비교하는 경우 변형된 효소의 분자량을 증가시키고/시키거나 등전점을 변화시킨다.
특정 구현예에서, 다중-용도 바이오센서는 다중-용도 혈액 요소 질소(BUN) 바이오센서로 추가로 정의되며, 적어도 하나의 변형된 효소는 요소분해효소이다.
특정 구현예에서, 이렇게 생성된 바이오센서는 적어도 14일의 사용 수명을 갖는다.
특정 구현예에서, 상기 기재된 방법의 단계 (a)는 변형된 효소의 용해도를 변형된 효소가 유체 생물학적 샘플 및 다중-용도 바이오센서와 함께 이용되는 캘리브레이션 시약에서 실질적으로 불용성이나, 유체 생물학적 샘플 및 캘리브레이션 시약보다 낮은 이온 강도를 갖는 완충액에서는 실질적으로 가용성이 되도록 하는 수준으로 감소시킨다.
특정 구현예에서, 상기 기재된 방법은 (g) 단계 (a) 전에 제1 완충액으로의 완충액 교환에 의해 부형제로부터 효소를 정제하는 단계; 및 (h) 단계 (d) 전에 효소의 활성을 측정하는 단계 중 적어도 하나를 추가로 포함한다.
특정 구현예는 다중-용도 바이오센서 어레이 어셈블리를 생성하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 기판의 적어도 하나의 표면 상에 복수의 다중-용도 바이오센서를 형성시키는 것을 포함한다. 복수의 다중-용도 바이오센서 각각은 기판의 적어도 하나의 표면 상에 공간적으로 위치된다. 복수의 다중-용도 바이오센서 중 적어도 하나는 상기 본원에 바로 기재된 임의의 방법에 의해 형성된다.
특정 구현예는 유체 생물학적 샘플에서 표적 분석물의 존재 및/또는 농도를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 유체 생물학적 샘플을 상기 본원에 기재된 임의의 다중-용도 바이오센서를 함유하는 혈액 가스, 전해질 및/또는 대사물 기기에 삽입하는 단계; 및 (b) 다중-용도 바이오센서에 의해 포획된 표적 분석물의 존재 및/또는 농도를 측정하는 단계를 포함한다.
특정 구현예는 유체 생물학적 샘플에서 복수의 표적 분석물의 존재 및/또는 농도를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 유체 생물학적 샘플을 상기 본원에 기재된 임의의 다중-용도 바이오센서 어레이 어셈블리를 함유하는 혈액 가스, 전해질 및/또는 대사물 기기에 삽입하는 단계; 및 (b) 어레이 어셈블리의 개별적 다중-용도 바이오센서에 의해 포획된 복수의 표적 분석물 각각의 존재 및/또는 농도를 측정하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 유체 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 가래, 뇌척수액(CSF), 피부, 장액, 복강액, 낭포액, 땀, 간질액, 세포외액, 눈물, 점액, 방광 세척액, 정액, 분변, 흉막액, 비인두액, 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
따라서, 현재 개시된 본 발명의 개념(들)에 따르면, 상기 기재된 목적 및 장점을 완전히 충족시키는 조성물 및 장치뿐만 아니라 이를 생성하고 이용하는 방법이 제공되었다. 현재 개시된 본 발명의 개념(들)은 상기 기재된 특정 도면, 실험, 결과 및 언어와 관련하여 기재되었으나, 많은 대안, 변형 및 변화가 당업자에게 명백할 것이 분명하다. 따라서, 현재 개시된 본 발명의 개념(들)의 사상 및 넓은 범위 내에 속하는 모든 상기 대안, 변형 및 변화를 포함하도록 의도된다.

Claims (23)

  1. 유체 생물학적 샘플(sample)에서 적어도 하나의 표적 분석물의 존재 및/또는 농도를 검출하기 위한 다중-용도 바이오센서(biosensor)로서, 상기 다중-용도 바이오센서가,
    전극;
    상기 전극의 적어도 일부 상에 분배된 변형된 효소로서, 상기 변형된 효소가 상기 유체 생물학적 샘플 및 상기 다중-용도 바이오센서와 함께 이용되는 캘리브레이션(calibration) 시약에서 불용성이 되도록 상기 효소 상의 적어도 하나의 작용기와 반응물의 반응을 통해 상기 효소가 이의 용해도를 감소시키도록 변형되었으며, 상기 변형된 효소가 유체 생물학적 샘플 및 다중-용도 바이오센서와 함께 사용되는 캘리브레이션 시약보다 낮은 이온(ion) 강도를 갖는 완충액에서 가용성이며, 또한 상기 변형된 효소가 상기 표적 분석물의 검출을 위해 상기 표적 분석물과 상호작용하는 활성 부위를 포함하는, 변형된 효소; 및
    상기 변형된 효소의 적어도 일부 상에 배치된 막으로서, 상기 막이 상기 변형된 효소를 상기 전극 상에 고정시키는 것인, 막을 포함하고,
    상기 반응물이 장쇄 바이오틴(biotin)을 포함하는,
    다중-용도 바이오센서.
  2. 제1항에 있어서, 전위차 분석물 바이오센서로서 추가로 정의되는 다중-용도 바이오센서.
  3. 제1항에 있어서, 변형된 효소 상의 적어도 하나의 작용기가 알데하이드(aldehyde)-, 아민(amine)-, 카르보닐(carbonyl)-, 카르복실(carboxyl)-, 하이드록실(hydroxyl)-, 케톤(ketone)-, 말레이미드(maleimide)-, 설프하이드릴(sulfhydryl)-, 및 티올(thiol)-반응기를 포함하는 군으로부터 선택되는 다중-용도 바이오센서.
  4. 제1항에 있어서, 막이 검출될 표적 분석물에 대해 투과성이지만, 변형된 효소에 대해서는 불투과성인 다중-용도 바이오센서.
  5. 제1항에 있어서, 막이 폴리우레탄(polyurethane), 실리콘(silicone), 폴리비닐 클로라이드 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 물질로 형성되는 다중-용도 바이오센서.
  6. 제1항에 있어서, 효소가 요소분해효소, 글루코스(glucose) 산화효소, 글루타메이트(glutamate) 산화효소, 피루베이트(pyruvate) 산화효소, 사르코신(sarcosine) 산화효소, 크레아티닌(creatinine) 아미드가수분해효소, 크레아틴 아미디노하이드롤라제(creatine amidinohydrolase), 아스코르베이트(ascorbate) 산화효소, 알콜(alcohol) 산화효소, 콜레스테롤(cholesterol) 산화효소, 콜린(choline) 산화효소, 빌리루빈(bilirubin) 산화효소, 락카제(laccase), 티로시나제(tyrosinase), 알콜 탈수소효소, 글루코스 탈수소효소, 글루타메이트 탈수소효소, 락테이트 탈수소효소, 및 피루베이트 탈수소효소를 포함하는 군으로부터 선택되는 다중-용도 바이오센서.
  7. 제1항에 있어서, 다중-용도 혈액 요소 질소(BUN) 바이오센서로 추가로 정의되며, 적어도 하나의 변형된 효소가 변형된 요소분해효소인 다중-용도 바이오센서.
  8. 제1항에 있어서, 바이오센서가 적어도 14일의 사용 수명을 갖는 다중-용도 바이오센서.
  9. 제1항에 있어서, 효소에 부착된 반응물이 변형되지 않은 효소의 분자량 및/또는 등전점과 비교하는 경우 변형된 효소의 분자량을 증가시키고/시키거나 등전점을 변화시키는 다중-용도 바이오센서.
  10. 기판:
    복수의 다중-용도 바이오센서로서, 상기 복수의 다중-용도 바이오센서 각각이 상기 기판의 적어도 하나의 표면 상에 공간적으로 위치되고, 상기 복수의 다중-용도 바이오센서 중 적어도 하나가 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 다중-용도 바이오센서인, 복수의 다중-용도 바이오센서를 포함하는,
    다중-용도 바이오센서 어레이 어셈블리(array assembly).
  11. 다중-용도 바이오센서를 생성시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) 효소 상의 적어도 하나의 작용기와 반응물을 반응시킴으로써 제1 완충액에 존재하는 상기 효소를 변형시켜, 변형된 효소가 유체 생물학적 샘플 및 상기 다중-용도 바이오센서와 함께 이용되는 캘리브레이션 시약에서 불용성이 되도록, 변형되지 않은 효소와 비교하는 경우 감소된 용해도를 갖는 상기 변형된 효소를 생성시키는 단계로서, 상기 변형된 효소가 유체 생물학적 샘플 및 다중-용도 바이오센서와 함께 사용되는 캘리브레이션 시약보다 낮은 이온(ion) 강도를 갖는 완충액에서 가용성이며, 또한 상기 변형된 효소가 표적 분석물의 검출을 위해 상기 표적 분석물과 상호작용하는 활성 부위를 포함하고, 상기 반응물이 장쇄 바이오틴(biotin)을 포함하는, 단계;
    (b) 상기 변형된 효소의 침전물을 형성시키는 단계;
    (c) 제2 완충액에 상기 변형된 효소의 침전물을 재용해시켜 변형된 효소 용액을 제공하는 단계로서, 상기 제2 완충액이 상기 제1 완충액보다 낮은 이온 강도를 가져, 상기 변형된 효소가 상기 제2 완충액에서는 가용성이지만, 상기 제1 완충액에서는 덜 가용성이거나 불용성인, 단계;
    (d) 전극의 적어도 일부 상에 특정량의 상기 변형된 효소 용액을 분배하는 단계;
    (e) 상기 전극 상의 상기 변형된 효소 용액을 건조시키는 단계; 및
    (f) 상기 변형된 효소의 적어도 일부 및 상기 전극 상에 막을 배치하는 단계로서, 상기 막이 상기 전극 상에 상기 변형된 효소를 고정시키는 단계를 포함하는,
    방법.
  12. 제11항에 있어서, 다중-용도 분석물 바이오센서가 전위차 분석물 바이오센서로 추가로 정의되는 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    (i) 효소 상의 적어도 하나의 작용기가 알데하이드-, 아민-, 카르보닐-, 카르복실-, 하이드록실-, 케톤-, 말레이미드-, 설프하이드릴-, 및 티올-반응기를 포함하는 군으로부터 선택되고;
    (ii) 막이 검출될 표적 분석물에 대해 투과성이지만, 변형된 효소에는 불투과성이고;
    (iii) 상기 막이 폴리우레탄, 실리콘, 폴리비닐 클로라이드 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 물질로 형성되고;
    (iv) 상기 효소가 요소분해효소, 글루코스 산화효소, 글루타메이트 산화효소, 피루베이트 산화효소, 사르코신 산화효소, 크레아티닌 아미드가수분해효소, 크레아틴 아미디노하이드롤라제, 아스코르베이트 산화효소, 알콜 산화효소, 콜레스테롤 산화효소, 콜린 산화효소, 빌리루빈 산화효소, 락카제, 티로시나제, 알콜 탈수소효소, 글루코스 탈수소효소, 글루타메이트 탈수소효소, 락테이트 탈수소효소, 및 피루베이트 탈수소효소를 포함하는 군으로부터 선택되고;
    (v) 상기 효소에 부착된 상기 반응물이 변형되지 않은 효소의 분자량 및/또는 등전점과 비교하는 경우 상기 변형된 효소의 분자량을 증가시키고/시키거나 등전점을 변화시키는 것 중 적어도 하나인 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 다중-용도 바이오센서가 다중-용도 혈액 요소 질소(BUN) 바이오센서로 추가로 정의되고, 적어도 하나의 변형된 효소가 요소분해효소인 방법.
  15. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성된 바이오센서가 적어도 14일의 사용 수명을 갖는 방법.
  16. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (g) 단계 (a) 전에 제1 완충액으로의 완충액 교환에 의해 부형제로부터 효소를 정제하는 단계; 및
    (h) 단계 (d) 전에 상기 효소의 활성을 측정하는 단계 중 적어도 하나를 추가로 포함하는,
    방법.
  17. 다중-용도 바이오센서 어레이 어셈블리를 생성시키는 방법으로서,
    상기 방법이 기판의 적어도 하나의 표면 상에 복수의 다중-용도 바이오센서를 형성시키는 단계로서, 상기 복수의 다중-용도 바이오센서 각각이 상기 기판의 적어도 하나의 표면 상에 공간적으로 위치되고, 상기 복수의 다중-용도 바이오센서 중 적어도 하나가 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법에 의해 형성되는, 단계를 포함하는,
    방법.
  18. 유체 생물학적 샘플에서 표적 분석물의 존재 및/또는 농도를 검출하기 위한 방법으로서,
    (a) 상기 유체 생물학적 샘플을 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 다중-용도 바이오센서를 함유하는 혈액 가스(gas), 전해질 및/또는 대사물 기기에 삽입하는 단계; 및
    (b) 상기 다중-용도 바이오센서에 의해 포획된 상기 표적 분석물의 존재 및/또는 농도를 측정하는 단계를 포함하는,
    방법.
  19. 유체 생물학적 샘플에서 복수의 표적 분석물의 존재 및/또는 농도를 검출하기 위한 방법으로서,
    (a) 상기 유체 생물학적 샘플을 제10항의 다중-용도 바이오센서 어레이 어셈블리를 함유하는 혈액 가스, 전해질 및/또는 대사물 기기에 삽입하는 단계; 및
    (b) 상기 어레이 어셈블리의 개별적 다중-용도 바이오센서에 의해 포획된 상기 복수의 표적 분석물 각각의 존재 및/또는 농도를 측정하는 단계를 포함하는,
    방법.
  20. 제18항에 있어서, 유체 생물학적 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 가래, 뇌척수액(CSF), 피부, 장액, 복강액, 낭포액, 땀, 간질액, 세포외액, 눈물, 점액, 방광 세척액, 정액, 분변, 흉막액, 비인두액, 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
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