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KR102351555B1 - Hpv 및 관련 질환용 면역 증강 치료 백신 - Google Patents

Hpv 및 관련 질환용 면역 증강 치료 백신 Download PDF

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KR102351555B1
KR102351555B1 KR1020167020050A KR20167020050A KR102351555B1 KR 102351555 B1 KR102351555 B1 KR 102351555B1 KR 1020167020050 A KR1020167020050 A KR 1020167020050A KR 20167020050 A KR20167020050 A KR 20167020050A KR 102351555 B1 KR102351555 B1 KR 102351555B1
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Abstract

재조합 아데노바이러스에 기반한 유전자 벡터, 및 중요한 3가지 요소: 1) HPV 타입 16 및 18의 E6 및 E7 다가 융합 단백질을 포함하는 HPV 항원; 2) 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 열 쇼크 단백질 (HSP)일 수 있는, 상기 항원과 융합된 면역학적 애주번트 단백질; 3) 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)일 수 있는 면역자극제를 포함하는 면역 증강 치료 백신을 제공한다. 본 백신은 인간 유두종 바이러스 감염 및 관련된 질환을 치료하는 데 사용된다.

Description

HPV 및 관련 질환용 면역 증강 치료 백신 {IMMUNITY ENHANCING THERAPEUTIC VACCINE FOR HPV AND RELATED DISEASES}
본 발명은 백신 분야, 및 특히, 인간 유두종 바이러스 (HPV) 지속 감염, 및 그에 의해 유도된 자궁경부암 및 다른 병변에 대한 치료 백신, 더욱 특히, 면역 증강제를 포함하는, HPV용 치료 백신에 관한 것이다.
자궁경부암은 전 세계적으로 여성들에게서 두 번째로 높은 발병률로 나타나는 암이며, 매년 대략 274,000여 명의 환자가 상기 암으로 사망하고 있다. 모든 자궁경부암은 HPV 감염과 함께 검출될 수 있다. 추가로, 항문암, 질암, 음경암, 일부 구강암, 및 후두암 또한 HPV 감염과 연관이 있다. 비록 지금까지 2종의 예방 백신이 시판되고 있기는 하지만, 병변 악성 종양의 진행을 예방하는 것은 고사하고, 현존 HPV 감염을 치료하는 데에도 효과가 없다. 또한, HPV로 감염된 매우 많은 환자 집단이 이미 존재하는 것으로 추정되고 있다. 그 결과, 실질적으로 자궁경부암의 발병률 감소를 달성하기 위해서는 대규모의 예방적 백신접종은 적어도 20년이 소요될 수 있다. 심지어 자궁경부암 또는 전암성 병변을 발생시킬 수 있는 바이러스로 감염된 큰 집단을 고려해 볼 때, 감염된 상기 세포 및 암 세포를 제거하기 위한 목적의 치료 백신 개발이 절실히 요구되고 있다. HPV E6 및 E7 단백질은 HPV 바이러스가 갖는 두 온코진에 의해 코딩되는 종양 단백질이고, 비-자가, 외인성 단백질 항원에 속하고, 전암성 병변으로부터 자궁경부암 발생까지 안정적으로 발현되면서 지속되고, 따라서, 면역요법을 위해 이상적인 표적이 된다. 재조합 바이러스, 폴리펩티드, 단백질 및 DNA 백신에 관한 연구를 비롯한, 상기 두 종양 단백질을 표적하는 많은 임상 연구가 시도되어 왔다. 이러한 치료 백신은 탁월한 안전성을 보이고, 일부 환자에서는 병변 퇴화 및 생존 기간 연장을 나타낸다. 또한, 연구 결과, 백신접종에 의해 유도된 T 세포 면역 정도는 치료법의 치료 효과와 연관이 있을 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 지속 감염을 완전하게 치유하고, 암을 제거하기 위한 목적을 위해서는, 비록 일부 임상 연구에서는 이미 가망이 있기는 하지만, 특이적인 항원에 대하여 충분한 항-종양 T 세포 면역 반응을 유도하는 새로운 전략법이 여전히 요구되고 있다.
세포 기능을 조절하고, 면역 반응을 증강시키는 데 열 쇼크 단백질 (HSP)이 효과적일 수 있다. 첫째, 이는 단백질 수송 및 위치 결정 및 단백질 폴딩을 지원하는 "샤페론"으로서 작용할 수 있고; 둘째, 이는 전용의 항원 제시 세포 (APC)를 활성화시킬 수 있다. HSP70은 대식세포 상의 수용체에 결합함으로써 그의 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있다. SGN-00101은 HPV 타입 16으로부터의 E7 단백질 및 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)로부터의 HSP65와 함께 융합된 융합 단백질로서, 이는 우수한 안전성을 보였고, 자궁경부의 상피 세포에서 고도의 비정형 증식을 억제시키는 데 어느 정도 영향을 미쳤다.
과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)는 널리 연구되었고, 가장 효과적인 치료제 중 하나로 인정받고 있다. 이는 자연 살세포를 매개하고, 항-종양 효과를 발휘하기 위해, 항원 제시 세포를 통해 종양에 대해 특이적인 CD8+ 살해 T 림프구를 활성화시킬 수 있다. 장기간 동안 종양 억제 면역 반응을 효과적으로 자극시킬 수 있는 능력에 대해 많은 동물 및 임상 시험에서 입증되었다. 예를 들어, 면역요법 약물로서 시푸류셀-T(Sipuleucel-T)는 GM-CSF와 함께 항원 제시 세포의 활성화를 이용하는 것이며, 이는 현재 시판용으로 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration)의 승인을 받은 상태이다. 제네렉스(Jennerex) 등으로부터의 최근 임상 연구는 또한 GM-CSF의 발현과 함께 종양 분해성 백시니아 (Vaccinia)가 다양한 암 병변을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 이러한 면역 증강 방법들은 모두 종양 항원에 대한 불충분한 특이성 또는 충분하지 않은 면역 자극이라는 만족스럽지 못한 치료 효과를 가진다.
종양 항원에 대한 불충분한 특이성 또는 충분하지 않은 면역 자극이라는 선행 기술의 면역 증강 방법의 만족스럽지 못한 치료 효과를 해결하기 위해, 본 발명은 HPV 감염 및 관련된 질환에 대한 치료학적 면역 증강 백신을 제공한다.
첫째, 본 발명은 HPV 타입 16으로부터의 E6 및 E7 단백질, HPV 타입 18로부터의 E6 및 E7 단백질, 및 면역 증강 인자로서 애주번트 단백질을 포함하는 5가지 유전자형의 HPV 및 면역 증강 인자를 가지는 융합 항원을 제공한다.
본 발명은 다가 항원으로 이루어진 선형 배열 형태를 취하며, 이로써 융합 단백질의 T 세포 에피토프에는 어떤 영향도 미치지 않는다. T 세포 면역 반응은 치료학적 백신접종에서 중요한 역할을 한다. T 세포 항원 결정기는 항원 제시 과정에서 선형의 짧은 펩티드로 분해될 수 있고, 인식 부위는 전형적으로 단지 약 8개의 아미노산만을 가지게 된다. 그러므로, 항원 배열에서 순서 변동은 또한 면역 자극에 대해서 어떤 실질적인 영향을 미치지 않을 것이다. 본 발명에서, 본 발명자들은 HPV 타입 16 및 18로부터의 4개의 항원 단백질을 열 쇼크 단백질 분자와 융합하고, 더 많은 HPV 항원의 융합이, 더 많은 잠재적인 항원 결정기를 제공하고 항원 제시를 증강시키고 면역 반응을 증가시키고 상이한 유전자형을 가지는 더 많은 HPV 감염에 대해 작용할 수 있도록 하여, 백신 면역화로부터 잠재적으로 이익을 얻는 집단을 효과적으로 증가시키는 데 있어서 더욱 유익할 수 있으며; 추가로, 더욱 강력한 면역 반응을 자극시키기 위하여 더 큰 단백질이 쉽게 분해되고 제시될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 융합 항원은 하기: HPV 타입 16으로부터의 E6 단백질 중 121번 위치의 글루탐산이 글리신으로 치환된 돌연변이 부위, 및 122번 위치의 리신이 글리신으로 치환된 돌연변이 부위; HPV 타입 16으로부터의 E7 단백질 중 24번 위치의 시스테인이 글리신으로 치환된 돌연변이 부위, 및 26번 위치의 글루탐산이 글리신으로 치환된 돌연변이 부위; HPV 타입 18로부터의 E6 단백질 중 116번 위치의 글루탐산이 글리신으로 치환된 돌연변이 부위, 및 117번 위치의 리신이 글리신으로 치환된 돌연변이 부위; 및 HPV 타입 18로부터의 E7 단백질 중 27번 위치의 시스테인이 글리신으로 치환된 돌연변이 부위, 및 29번 위치의 글루탐산이 글리신으로 치환된 돌연변이 부위를 포함하는, 하나 이상의 돌연변이 부위를 가진다.
본 발명에서, 세포의 p53 단백질에 결합하는 HPV E6 단백질의 영역에서, 및 세포의 pRb 단백질에 결합하는 E7 단백질의 영역에서, 아미노산의 점 돌연변이가 수행될 수 있다. 돌연변이화된 단백질은 상기 두 단백질 중 어느 것에 특이적으로 결합하지 않을 것이며, 이에 HPV E6 및 E7 단백질이 정상 세포를 잠재적으로 형질전환시킬 수 있는 가능성의 위험은 제거된다. 본 발명에서, 점 돌연변이는 오직 수개의 중요한 위치에서만 수행될 수 있으며, 따라서, 단백질의 항원성에는 어떠한 영향도 미치지 않을 것이라는 점에 주의하여야 한다.
본 발명에서, 면역 증강 인자인 애주번트 단백질은 원핵생물로부터의 또는 포유동물로부터의, 바람직하게, 미코박테리움 투베르쿨로시스로부터의 열 쇼크 단백질일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, HPV 및 면역 증강 인자의 5개의 유전자로 된 융합 항원은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가진다.
추가로, 본 발명은 융합 항원을 발현하는 재조합 유전자 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 바람직하게, 벡터는 또한 면역자극제의 발현 카세트를 가질 수 있다.
바람직하게, 면역자극제는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터루킨, 인터페론 또는 케모카인, 바람직하게, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 발현 벡터는 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA 단편을 가질 수 있다.
본 발명에서, 벡터는 재조합 아데노바이러스 벡터, 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터, 재조합 레트로바이러스 벡터, 재조합 렌티바이러스 벡터, 재조합 헤르페스 바이러스 벡터, 재조합 백시니아 벡터, 또는 재조합 산다이(Sandai) 바이러스 벡터일 수 있고; 이는 또한 네이키드 DNA 벡터, 나노입자, 중합체 또는 리포솜으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-바이러스성 벡터일 수 있다.
추가로, 본 발명은 또한 치료학상 유효량의 기술된 융합 항원, 또는 치료학상 유효량의 기술된 재조합 유전자 발현 벡터를 포함하는, HPV 감염에 의해 유도된 질환을 치료하기 위한 제약 제제를 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 제약 제제는 치료학상 유효량의 융합 항원 및 면역자극제를 포함한다.
제약 제제에서, 면역자극제는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터루킨, 인터페론, 또는 케모카인, 바람직하게, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 제약 제제는 HPV 타입 16 및 18로부터의 E6 및 E7의 다중 유전자 융합 항원인 항원; 미코박테리움 투베르쿨로시스로부터의 열 쇼크 단백질이고, 상기 언급된 다가 융합 단백질과 재융합된 면역 증강 인자인 애주번트; 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)인 면역자극제를 발현하는 것을 목표로 한다.
본 발명의 또 다른 특정 실시양태에서, 제약 제제는 제약상 허용되는 담체, 부형제, 보조제 및/또는 다른 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 제약 제제는 면역 자극 및 증강 효과를 달성하기 위해 단일 주사 또는 1회 이상의 면역 증강 주사를 통한 백신으로서 환자 내로 직접 주사될 수 있다. 대안적으로, 제약 제제는 시험관내 프로세싱을 위한, 및 림프구, 가지 세포, 종양 세포, 제대혈 세포 등을 비롯한, 환자로부터의 자가 세포 또는 기증자로부터의 세포를 인큐베이션시키기 위한 항원으로서 간접적으로 사용될 수 있으며, 여기서, 세포는 면역 자극 및 증강 효과를 달성하기 위해 1회 이상의 주사를 통해 환자 내로 추가로 주사될 수 있다.
추가로, 본 발명은 기술된 재조합 유전자 발현 벡터를 갖는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 HPV 타입 16 및 18로부터의 E6 및 E7, 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)의 발현을 허용한다.
본 발명의 또 다른 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 바람직하게, HPV 타입 16 및 18로부터의 E6, E7 단백질, 미코박테리움 투베르쿨로시스로부터의 열 쇼크 단백질, 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 발현한다.
재조합 아데노바이러스에서, HPV 타입 16 및 18로부터의 E6 및 E7 단백질은 미코박테리움 투베르쿨로시스로부터의 열 쇼크 단백질과 융합되어 다가 융합 단백질을 생성할 수 있고, 융합 단백질의 발현 카세트는 동일한 벡터에서 GM-CSF의 발현 카세트와 함께 공동 발현될 수 있다.
재조합 아데노바이러스에서, HPV 타입 16 및 18로부터의 E6 및 E7 단백질은 다가 융합 단백질로 형성될 수 있고, 이는 열 쇼크 단백질과 융합되지 않은 것일 수도 있으며, 융합 단백질의 발현 카세트는 동일한 벡터에서 GM-CSF의 발현 카세트와 함께 공동 발현될 수 있다.
추가로, 본 발명은 추가로 HPV 감염에 의해 유도된 질환 치료용 의약의 제조에서 융합 항원, 재조합 유전자 벡터, 아데노바이러스, 또는 제약 제제의 용도를 제공한다.
HPV 감염에 의해 유도된 질환은 HPV 만성 감염과 연관된 질환, 특히, 자궁경부암, 음경암, 항문암, 후두암, 구강암, 두부경부암, 자궁경부 전암성 병변, 및/또는 자궁경부 증식증에 속한다.
시험관내 T 림프구 활성화 실험 결과, HSP와 HPV 항원의 융합 단백질을 발현하는 벡터, 및 HPV 항원 및 GM-CSF를 공동 발현하는 벡터, 둘 모두, 단독으로 HPV 항원 용량을 발현하는 벡터보다 더욱 강력한 T 세포 면역 반응을 유도할 수 있으며, HSP와 HPV 항원의 융합 단백질 및 GM-CSF, 둘 모두를 발현하는 벡터가 가장 강력한 유도된 T 세포 면역 반응을 보일 수 있는 것으로 나타났다. 추가로, GM-CSF의 발현을 통해 각각의 고용량 및 저용량군에서 T 세포 면역 수준은 유의적으로 개선될 수 있고, 더 많은 종양 침윤 T 세포가 유도될 수 있다. HPV 항원이 마우스에서 발현되는 종양 치료 실험에서, 각 군으로부터의 마우스에서의 종양 발병률 및 종양 크기 평가 결과, HSP 융합을 포함하는 벡터, 및 GM-CSF를 발현하는 벡터는 종양을 더욱 잘 제거할 수 있고, 재발을 억제할 수 있으며, HSP와 HPV 항원의 융합 단백질 및 GM-CSF, 둘 모두를 발현하는 벡터는 시험관내 실험으로부터 얻은 결과와 일관되게, 가장 강력한 효과를 보일 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명은 최초로 GM-CSF와 함께 HSP 융합 단백질로부터 면역자극의 시너지 효과를 제시하고, 자궁경부암을 치료하는 데 있어서 백신의 효과를 증강시키는 신규한 방법을 제공한다.
마우스에서의 현행 실험 결과에 따라, 동일한 기전으로 본 백신은 또한 인간에서, HPV 감염된 세포 및 자궁경부암 상의 T 세포와 같은 특이적인 면역 세포의 강력한 사멸 효과를 활성화시키고, 증강시키기 위해, HPV 바이러스에 의해 발현된 항원에 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있을 것으로 추정된다. 상기 백신은, 장기간 발현되고, 감염된 세포의 만성 증식을 유도하여 최종적으로는 암을 발생시킬 수 있는 2개의 암 항원 단백질인, HPV 바이러스의 중요한 두 종양 단백질, 즉, E6 및 E7에 특이적인 면역 반응을 유도할 것이라는 점에 비추어 볼 때, 백신은 HPV 만성 감염에 의해 유도된 자궁경부암, 자궁경부 전암성 병변, 및 자궁경부 증식증, 및 HPV 만성 감염에 의해 유도된 다른 암, 예컨대, 후두암 및 구강암 등을 치료하는 데 사용될 수 있다.
도 1은 재조합 아데노바이러스의 구성 및 식별이며, 여기서, a는 Ad-이지 시스템 (Ad-easy system)을 사용하여 제조된 상응하는 재조합 아데노바이러스의 5개의 cDNA의 구조적 패턴을 보여주는 것이고; b는 웨스턴 블롯에 의해 측정된, HEK 293 세포에서의 재조합 아데노바이러스 벡터의 발현을 보여주는 것으로서, 여기서, HEK293 세포는 아데노바이러스로 감염되고, 외인성 유전자의 발현은 음성 대조군으로서 Ad-GFP를 사용하여 항-HPV16E7 항체를 사용하여 측정되고; c는 웨스턴 블롯에 의해 측정된, HEK 293 세포에서의 상응하는 재조합 아데노바이러스로부터의 GM-CSF의 발현을 보여주는 것이고; d는 코돈 최적화 없이 수행된 것의 결과와 비교하였을 때, 코돈 최적화의 결과로서 재조합 아데노바이러스 Ad-E6E7hsp-GM에 의한 융합 단백질 HPV18/16E6E7-HSP의 발현이 유의적으로 증가되었음을 보여주는 것이다.
도 2는 T 림프구 증식 실험, 특히, E7 폴리펩티드에 의한 자극하에 상응하는 재조합 아데노바이러스로 면역화된 마우스에서의 비장 세포의 증가 배수를 보여주는 것으로서, 여기서, 세로 좌표는 상대적인 증가 배수, 즉, E7 폴리펩티드로 자극받은 비장 세포의 O.D. 값 대 E7 폴리펩티드로 자극받지 않은 비장 세포의 O.D. 값의 비를 나타내고 (n＝3; 막대, SE); 기호 "*"는 p<0.05를 나타낸다.
도 3은 EISPOT 실험을 보여주는 것으로서, 여기서, a는 E6 폴리펩티드에 의한 자극하에 상응하는 재조합 아데노바이러스로 면역화된 마우스에서의 IFNγ 분비 비장 세포의 양을 보여주는 것이고; b는 E7 폴리펩티드에 의한 자극하에 상응하는 재조합 아데노바이러스로 면역화된 마우스에서의 IFNγ 분비 비장 세포의 양을 보여주는 것이고, 여기서, 세로 좌표는 106개의 비장 세포당 스폿 형성 세포의 양을 나타내는 것이고 (n＝3; 막대, SE); 기호 "*"는 p<0.05를 나타낸다.
도 4는 종양 침윤 T 림프구를 보여주는 것이다. 재조합 아데노바이러스로 면역화시키면, 종양 침윤 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 양은 증가될 수 있다. 세로 좌표는 4개 시야 (view)의 계수의 평균으로서, 각 시야에서의 CD4+ 또는 CD8+ T 림프구의 계수를 나타내는 것이고 (막대, SE); 기호 "*"는 대조군 Ad-GFP와 비교하였을 때, p<0.05를 나타낸다.
도 5는 재조합 아데노바이러스 벡터의 용량 실험을 보여주는 것이다. ELISPOT 실험을 위해 마우스를 각각 3가지 용량의 상응하는 재조합 아데노바이러스로 면역화시키고, IFNγ 분비 비장 세포의 양을 비교한다 (n＝3; 막대, SE).
하기 실시예는 본 발명의 예시 목적으로 제공하는 것이며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1. 플라스미드 구축 및 바이러스 패키징
주형으로서 HPV 타입 18로부터의 E6 [진뱅크(Genbank) 수탁 번호: AF373109] 및 E7 (AF373110), HPV 타입 16으로부터의 E6 (AB818691) 및 E7 (KC736931), 및 미코박테리움 투베르쿨로시스로부터의 HSP (EU747334)의 유전자를 이용하여, 인간에서의 발현을 위해 코돈을 최적화시키고, 융합 유전자의 오픈 리딩 프레임 내로 연속하여 스플라이싱하여 중간 종결 코돈(들)은 제거하였다. 진스크립트 코포레이션(Genescript Corporation)에 의해 완전한 서열을 합성하였다. E6 및 E7에 기인한 세포 악성 형질전환의 위험을 제거하기 위해, HPV 18 및 16으로부터의 E6 및 E7 단백질 중의 일부 필수적인 위치에서 점 돌연변이를 수행하였다: HPV 18 E6 단백질 (Glu116Gly; Lys117Gly); HPV 16 E6 단백질 (Glu121Gly; Lys122Gly); HPV 18 E7 단백질 (Cys27Gly; Glu29Gly); HPV 16 E7 단백질 (Cys24Gly; Glu26Gly). HPV18&16/E6/E7은 서열번호 1에 의해 표시되는 아미노산 서열을 가지고, HPV18&16/E6/E7HSP는 서열번호 2에 의해 표시되는 아미노산 서열, 및 서열번호 3에 의해 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가진다. 인간 유래의 GM-CSF 유전자의 cDNA는 RT-PCR 증폭에 의해 수득하였다 (서열번호 4).
[애질런트 테크놀러지즈(Agilent Technologies: 미국 캘리포니아주 산타클라라)로부터 구입한] Ad-이지 아데노바이러스 패키징 시스템을 사용하여 5개의 재조합 아데노바이러스를 제조하였다. 먼저, 상이한 유전자가 삽입되어 있고, CMV 프로모터를 가지는 5개의 pshuttle 플라스미드를 구축하였다: (1) HPV16 E6 및 E7의 융합 단백질의 발현을 위한 pshuttle-E6E7; (2) hsp와 HPV16 E6 및 E7의 융합 단백질의 발현을 위한 pshuttle-E6E7hsp; (3) (1)을 기반으로 하여 인간 유래의 GM-CSF를 공동 발현하기 위한 pshuttle-E6E7-GM; (4) hsp와 HPV18/16E6 및 E7의 융합 단백질 및 인간 유래의 GM-CSF를 공동 발현하기 위한 pshuttle-E6E7hsp-GM; 및 (5) 대조군으로서 eGFP를 발현하기 위한 pshuttle-GFP (도 1a). 이어서, 종래 방법을 이용하여 5개의 재조합 아데노바이러스를 각각 Ad-E6E7, Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM, Ad-E6E7hsp-GM, 및 Ad-GFP로 패키징하였다.
실시예 2. 재조합 외인성 단백질 발현 측정
아메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC: 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 구입한 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포를 실시예 1에서 제조된 패키징된 재조합 아데노바이러스를 이용하여 2 플라크 형성 단위 (pfu)/세포인 감염 역가로 감염시키고, 감염 후 2일째 PBS로 2회에 걸쳐 세척한 후; 이어서, 세포를 램리(Laemmli) 용해 완충제로 용해시키고, 변성시키기 위해 전체 세포 단백질을 5분 동안 끓인 후, SDS 전기영동시키고; 이어서, 단백질을 셀룰로스 아세테이트 막으로 전기충격 형질전환시키고, 상응하는 항체: 항-HPV16 E7 단백질 항체 [산타 크루즈 바이오테코놀러지(Santa Cruz Biotechnology: 미국 캘리포니아주 산타 크루즈)] 및 항-GM-CSF 항체 [바이오레전드(Biolegend: 미국 캘리포니아주 샌디에고)]를 이용하여 측정하였다. 발색을 위해, 증강 화학발광 (ECL) 시스템을 사용하였다. 마우스에서의 GM-CSF의 농도를 측정하기 위하여 GM-CSF용 ELISA 어세이 키트(ELISA Assay Kit) (바이오레전드: 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하였다.
표준 방법에 따라 5개의 재조합 아데노바이러스를 제조하고, 2회에 걸친 초원심분리에 의해 정제하였다. 웨스턴 블롯에 의해, 재조합 바이러스로 감염된 293 세포를 외인성 유전자의 발현에 대하여 검출하였다. 그 결과, 예측 분자량의 밴드 위치에서는 발현 밴드가 검출되었지만, Ad-GFP로 감염된 음성 대조군의 샘플에 대한 상응하는 위치에서는 어떤 것도 관찰되지 않은 것으로 나타났다 (도 1b, c). 본 결과는 HPV 항원과 연관된 융합 단백질 및 GM-CSF가 고효율로 발현되었다는 것을 나타낸다. ELISA 검정법 결과, 마우스에서의 GM-CSF의 혈청 농도의 경우, 주사 후 5일째 시험군이 대조군보다 약 7배만큼 더 높았고, 주사 후 2개월이 경과하였을 때에도 여전히 약 1.5배만큼 더 높은 것으로 나타났다.
HPV 항원의 발현 효율은 코돈 최적화 이후에 유의적으로 개선되었고, 그의 발현은 최적화 이전의 것보다 3배 초과만큼 증가되었다 (도 1d).
실시예 3. 시험관내 림프구 증식 및 ELISPOT
암컷 C57BL/6 마우스 (H-2b; 6-8주령)를 잭슨 랩(Jackson Lab: 미국 매사추세츠주 바하버)으로부터 구입하고, 그에 바이러스 Ad-E6E7, Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM, Ad-E6E7hsp-GM 및 Ad-GFP를 107 pfu/마우스 용량으로 피하로 주사하였다. 4주 후, 마우스로부터의 비장 세포 (1x105/웰)를 단리시키고, 배양하고, 각 마우스로부터의 비장 세포를 10 ㎍/ml의 E7 폴리펩티드와 함께, 또는 그를 포함하지 않고 5일 동안 인큐베이션시켰다. 4일째 BrdU를 첨가하였다. 세포 내로 융합된 BrdU의 양을 칼바이오켐 셀 프로리퍼레이션 키트[Calbiochem Cell Proliferation Kit) (밀리포어(Millipore: 미국 매사추세츠주 빌레리카]를 사용하여 측정하였다. 측정 결과는 E7 폴리펩티드와 함께 인큐베이션된 경우의 O.D. 판독값을 E7 폴리펩티드를 포함하지 않는 경우의 O.D. 판독값으로 나눔으로써 계산된 상대적인 증가 배수로서 나타내었다.
E6 및 E7 폴리펩티드에 특이적인 인터페론 IFNγ 분비 T 림프구를 계수하고, T 세포로부터의 면역 반응을 평가하는 방식으로 ELISPOT 실험을 수행하였다. 먼저, 면역화를 위하여 상기와 같이 암컷 C57BL/6 마우스에 재조합 바이러스를 접종하였다. 2-4주 후, 마우스로부터의 비장 세포를 단리시키고, 항-IFNγ 항체 코팅된 96 웰 플레이트 중에서 1x105개의 세포/웰로 배양하였다. 배양을 위하여 각 마우스로부터의 세포를 E6 폴리펩티드 자극군 및 E7 폴리펩티드 자극군으로 나누고, 각각 2 ㎍의 E648-57 (EVYDFAFRDL, H-2Db-제한) 폴리펩티드 및 E749-57 (RAHYNIVTF, H-2Db-제한) 폴리펩티드로 자극시키고, 폴리펩티드로 자극시키지 않은 세포는 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포를 버리고, 웰 중의 잔류물을 PBS 중 0.5% 트윈(Tween) 20 (PBST)으로 3회에 걸쳐 세척한 후, 이어서, 효소로 표지된 항-IFNγ 항체와 함께 다시 인큐베이션시키고, 최종적으로 ACE 기질을 전개시켰다. 전개 종결 및 건조 후, ELISPOT 계수기에 의해 IFNγ 반응 스폿을 계수하고, 분석하였다.
항원 특이 T 세포 면역 반응을 시험관내에서 T 세포 증식 및 ELISPOT 실험의 결과로부터 측정할 수 있다. T 세포 증식 실험에서, 5일째 상대적인 세포량을 세포 DNA 내로 혼입된 BrdU의 함량으로서 나타낼 수 있다. E7 특이 폴리펩티드에 의한 자극하에서, HPV 항원을 발현하는 재조합 바이러스를 접종받은 마우스로부터의 모든 비장 세포는 Ad-GFP로 면역화된 음성 대조군 마우스로부터의 비장 세포보다 훨씬 더 많이 증가되었다 (도 2). 각각 재조합 바이러스 Ad-E6E7hsp 및 Ad-E6E7-GM으로 면역화된 뮤린의 비장 세포는 Ad-E67을 접종받은 것보다 더 높은 증가 배수를 가졌고, Ad-E6E7hsp-GM으로 면역화된 마우스가 가장 높은 증가를 보였다. 항원 특이 살해 T 세포로부터의 면역 반응 정도는 ELISPOT 실험의 결과로부터 알 수 있다. 본 결과는, E6 폴리펩티드에 의한 자극하에서 HPV 항원을 발현하는 재조합 바이러스로 면역화된 모든 마우스는 항원에 특이적인 살해 T 세포의 면역 반응을 획득하였다는 것을 나타낸다. 특히, Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM 및 Ad-E6E7hsp-GM, 각각의 것으로 면역화된 마우스는 Ad-E6E7로 접종받은 마우스보다 훨씬 더 많은 IFNγ 분비 비장 세포를 가졌고, Ad-E6E7hsp-GM으로 면역화된 마우스가 가장 많은 양의 IFNγ 분비 비장 세포를 가졌다 (도 3a). E7 폴리펩티드에 의한 자극하에서, IFNγ 분비 비장 세포는 E6 폴리펩티드에 의한 자극하의 것과 유사한 상대적인 분포를 가졌는데, 단, 예외적으로, 각 군에서의 절대량은 E6 폴리펩티드에 의한 자극하의 것보다 훨씬 더 높았다. E7 폴리펩티드는 또한 마우스에서 E6 폴리펩티드로 자극받은 것보다 훨씬 더 강력한 살해 T 세포의 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다 (도 3b). 요약하면, T 세포 증식 및 ELISPOT 실험의 결과는 일관되게 HSP 및 GM-CSF가 E6, E7 항원에 특이적인 T 림프구 면역 반응을 별개로 또는 시너지적으로 증강시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 4. 종양 침윤 T 림프구 분석
C57BL/6 마우스에 TC-1 세포를 접종하였다 [HPV 타입 16 E6 및 E7 종양 항원으로 형질전환된 C57BL/6 마우스 종양 세포는 가장 일반적인 자궁경부암 모델 세포주 중 하나이며, 존스 홉킨스 대학교(Johns Hopkins University)의 T. C. Wu 교수로부터 기증받았다]. C57BL/6 마우스 TC-1 세포를, 10% 우태아 혈청 (FBS) 및 50 U/ml의 2종의 항생제를 함유하는 RPMI1640 완전 배지 중에서 성장시키고, 다른 세포는 DMEM 완전 배지 [기브코(Gibco)] 중에서 성장시켰다. 일단 피하 종양이 직경 약 5 mm까지 성장하고 나면, 마우스에 1x107의 재조합 아데노바이러스 Ad-E6E7, Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM, Ad-E6E7hsp-GM 및 Ad-GFP를 각각 피하로 접종하였다. 7일 후, 종양을 수집하고, H&E 염색을 수행하고, 항-CD4+ 및 CD8+ 세포에 대하여 면역형광 분석을 수행하였으며, 이는 하기 방법으로 실시하였다: 종양 조직을 제거하고, 냉동시키고, OCT 포매시키고, 5.0 ㎛ 두께 절편으로 절단한 후, 4% 아세톤으로 고정시킨 후, 30분 동안 10% 말 혈청으로 차단시켰다. 이어서, 절편을 실온에서 1시간 동안 항-마우스 CD4 및 CD8 항체 [BD 바이오사이언스(BD Bioscience: 미국 캘리포니아주 산호세)]와 함께 인큐베이션시키고, PBS로 세척한 후, 2 mg/mL의 염소 항-래트 2차 항체 알렉사647(Alexa647) [인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)]과 함께 인큐베이션시켰다. 이후, DAPI로 핵 염색을 수행하고, 현미경으로 분석하였다. 4개 시야에서 양성 세포를 계수하고, 통계학적 분석을 위하여 평균값 ± 표준 오차로 나타내었다.
종양을 갖는 마우스의 종양의 직경이 약 5 mm 정도까지 성장하였을 때, 마우스에 대해 상이한 재조합 아데노바이러스를 이용한 면역요법을 수행하였다. 7일 후, 조직학적 분석을 위해 종양을 제거하여 상이한 바이러스로 면역화된 마우스로부터의 종양 중의 T 림프구 침윤 정도를 평가하였다. CD8+ 세포 염색 결과, HPV 항원을 발현하는 재조합 바이러스를 받은 마우스가 Ad-GFP로 면역화된 음성 대조군 마우스보다 종양 조직 중에 더 많은 CD8+ T 림프구 침윤을 가지는 것으로 나타났고 (도 4); HSP와 융합된 융합 단백질 및 GM-CSF가 별개로 발현되거나, 또는 공동 발현된 벡터, 둘 모두 종양을 갖는 마우스에서 CD8+ T 림프구 침윤을 유의적으로 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다 (도 4). CD4+ 세포 염색 결과, 비록 HSP가 CD8+ T 림프구 침윤을 유의적으로 증가시킬 수는 있지만, Ad-E6E7 및 Ad-GFP로 면역화된 마우스와 비교하였을 때, 그 안에서 GM-CSF를 발현하는 재조합 아데노바이러스로 면역화된 마우스는 종양 조직 중 유의적으로 증가된 양의 CD4+ T 림프구 침윤을 가졌지만, HSP 융합 단백질의 발현을 받은 마우스는 종양 조직 중 CD4+를 발현하는 T 림프구를 유의적으로 증가된 양으로 가지지 못한 것으로 나타났다 (도 4).
실시예 5. 재조합 아데노바이러스의 면역화 용량
각각 Ad-E6E7, Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM, Ad-E6E7hsp-GM 및 Ad-GFP로 마우스를 면역화시키는 데 3가지 용량의 2x105, 1x106 및 1x107 pfu/마우스를 사용하였다. 면역화 후 4주 경과하였을 때 마우스를 희생시키고, ELISPOT 실험을 위해 비장 세포를 수집하였다. 각각의 상이한 용량의 각각의 다양한 재조합 아데노바이러스로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포의 IFNγ 반응 스폿를 판독하고, 분석하여 상이한 용량에 의해 유도된 T 세포의 면역 정도를 평가하였다.
상이한 용량에서 T 세포 면역 반응을 유도할 수 있는 상이한 재조합 바이러스의 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 용량 실험을 수행하였다. 2x105 및 1x106 pfu/마우스인 저용량 조건에서, IFNγ 분비 세포 측정량에 따르면, 재조합 바이러스 Ad-E6E7-GM 및 Ad-E6E7hsp-GM은 다른 바이러스보다 더욱 강력한 T 세포 면역 반응을 유도하였고, Ad-E6E7hsp-GM이 가장 강력한 T 세포 면역 반응을 유도하였다. 1x107 pfu/ 마우스인 고용량 조건에서, HPV 항원을 발현하는 모든 재조합 바이러스는 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있었다. 흥미롭게도, 재조합 바이러스 Ad-E6E7hsp로 면역화된 마우스는 Ad-E6E7-GM으로 면역화된 마우스보다 더 많은 양의 IFNγ 분비 비장 세포를 생성하였고, Ad-E6E7hsp-GM으로 면역화된 군 역시 가장 많은 양의 IFNγ 분비 비장 세포를 가졌다 (도 5). 본 결과는 GM-CSF 발현이 저용량 군에서 T 세포 면역 반응을 효과적으로 증강시킬 수 있는 반면, HSP 융합 단백질은 고용량에서 더욱 우수한 결과를 초래할 수 있으며, 둘 모두의 공동 발현은 시너지 효과를 가져올 수 있다는 것을 나타낸다.
GM-CSF는 상대적으로 낮은 저용량에서 살해 T 림프구의 면역 반응을 증가시킬 수 있는 바, 이에 잠재적인 부작용은 감소시키면서, 더욱 우수한 면역화 결과를 얻기 위해서는 보다 낮은 저용량이 사용될 수 있다.
실시예 6. 마우스에서의 생체내 종양 치료
본 실험은 재조합 아데노바이러스의 치료 효과를 평가하는 데 있어 가장 중요하다. 먼저, 마우스 대상체에 1x105/마우스의 TC-1 세포를 피하로 접종하고; 약 9일 후 마우스에서 촉지성 종양 덩어리가 피하로 형성되고 나면, Ad-E6E7, Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM, Ad-E6E7hsp-GM 및 Ad-GFP를 각각 1x106 및 1x107 pfu/마우스 용량으로 피하로 주사하였다. 초기 치료 후 2주 경과하였을 때 동일한 용량으로 면역화를 증강시켰다. 초기 치료 후 2개월이 경과하였을 때, 마우스로부터 모든 종양을 제거하고, 마우스에 다시 동일한 TC-1 세포를 접종하였다. 4개월 동안 매 3일마다 종양에 대해 마우스를 관찰하였다. 상이한 재조합 바이러스로 접종받은 마우스 사이의 종양 발생률 및 종양 크기를 비교하여 상이한 재조합 아데노바이러스의 치료 및 종양 제거 효과를 측정하였다.
상기와 같은 종양 치료 실험 결과, 상이한 재조합 바이러스는 생체내에서 다양한 종양 세포 제거 능력을 가질 수 있는 것으로 나타났다. 조기 용량 시험 결과에 따르면, 2가지 용량의 1x106 및 1x107 pfu/마우스가 치료 실험을 위해 사용되었다. 용량이 1x106 pfu/마우스인 경우, Ad-GFP로 처리된 대조군 마우스 5마리 모두에서 종양이 발생하였다. 처리 후 2개월째, Ad-E6E7로 처리된 마우스 10마리 중 단 2마리, Ad-E6E7hsp로 처리된 마우스 10마리 중 6마리, Ad-E6E7-GM으로 처리된 마우스 10마리 중 5마리, 및 Ad-E6E7hsp-GM으로 처리된 마우스 10마리 중 7마리는 종양을 갖지 않았다. 본 결과는 후자가 가장 우수한 치료 효과를 가졌다는 것을 보여준다. 추가로, 용량이 1x107 pfu/마우스인 경우, 2개월이 경과하였을 때, Ad-GFP로 처리된 대조군 마우스 5마리 모두에서 종양이 발생하였지만, Ad-E6E7로 처리된 마우스 5마리 중 4마리는 종양을 갖지 않았고, Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM 및 Ad-E6E7hsp-GM으로 처리된 마우스는 모두 종양을 갖지 않았다 (하기 표 1). 추가로, 같은 기간 동안 Ad-E6E7hsp로 처리된, 종양을 갖는 마우스의 종양 크기는 Ad-E6E7로 처리된 마우스의 것보다 작았다 (제시되지 않음). 초기 치료 후 2개월이 경과하였을 때, 종양을 갖지 않는 마우스 모두에 TC-1 종양 세포를 다시 접종하였다. 6개월 간의 실험 종료시까지, 종양과 함께 다시 인큐베이션된 마우스 모두 여전히 종양을 갖지 않았다. 요약컨대, 본 결과는 HSP 및 GM-CSF는 HPV 특이 T 세포 면역 반응을 증가시킴으로써, 결국에는 마우스에서 종양을 제거하고, 재발을 예방하는 효과를 달성하는 데 있어 별개로 또는 시너지적으로 작용할 수 있다는 것을 나타낸다. 본 결과는 GM-CSF와 HSP의 조합이 가장 우수한 시너지적인 치료 효과를 발휘할 수 있다는 것을 나타낸다.
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상기에는 단지 본 발명의 바람직한 실시양태만이 기술되어 있다. 당업계의 숙련가는 본 발명의 원리로부터 벗어남 없이 일부는 수정 및 변형될 수 있으며, 상기와 같은 수정 및 변형은 본 발명의 보호 범주 내에 포함되어 있는 것으로 간주되어야 한다는 것에 주의하여야 한다.
산업상 적용가능성
본 발명의 백신은 면역 반응을 증강시키고, 종양을 제거하는 데 효과적이며, 자궁경부암, 자궁경부 전암성 병변, 자궁경부 증식증 및 HPV 만성 감염에 의해 유도된 다른 암, 예컨대, 일부 후두암, 구강암, 항문암 등을 치료하는 데 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Shenzhen Tailai Biopharmaceuticals, LLC <120> IMMUNITY ENHANCING THERAPEUTIC VACCINE FOR HPV AND RELATED DISEASES <130> IPA160409-CN <150> CN 201410017909.8 <151> 2014-01-15 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 520 <212> PRT <213> HPV18 E6/HPV18 E7/HPV16 E6/HPV16 E7 fusion protein amino acid sequence <400> 1 Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp 1 5 10 15 Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala 35 40 45 Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala 50 55 60 Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr 85 90 95 Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Gly Gly Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His 115 120 125 Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg 130 135 140 Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Met His 145 150 155 160 Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln 165 170 175 Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Gly His Gly Gln Leu Ser Asp Ser 180 185 190 Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu Pro 195 200 205 Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys 210 215 220 Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp 225 230 235 240 Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys 245 250 255 Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln Ser Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met 260 265 270 Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr 275 280 285 Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys 290 295 300 Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp 305 310 315 320 Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys 325 330 335 Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr 340 345 350 Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys 355 360 365 Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu 370 375 380 Gly Gly Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg 385 390 395 400 Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr 405 410 415 Arg Arg Glu Thr Gln Leu Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu 420 425 430 Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly 435 440 445 Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala 450 455 460 Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys 465 470 475 480 Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val 485 490 495 Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val 500 505 510 Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro 515 520 <210> 2 <211> 1145 <212> PRT <213> HPV18 E6/HPV18 E7/HPV16 E6/HPV16 E7/HSP70 fusion protein amino acid sequence <400> 2 Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp 1 5 10 15 Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala 35 40 45 Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala 50 55 60 Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr 85 90 95 Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu 100 105 110 Asn Pro Ala Gly Gly Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His 115 120 125 Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg 130 135 140 Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Met His 145 150 155 160 Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln 165 170 175 Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Gly His Gly Gln Leu Ser Asp Ser 180 185 190 Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu Pro 195 200 205 Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys 210 215 220 Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp 225 230 235 240 Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys 245 250 255 Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln Ser Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met 260 265 270 Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr 275 280 285 Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys 290 295 300 Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp 305 310 315 320 Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys 325 330 335 Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr 340 345 350 Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys 355 360 365 Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu 370 375 380 Gly Gly Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg 385 390 395 400 Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr 405 410 415 Arg Arg Glu Thr Gln Leu Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu 420 425 430 Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly 435 440 445 Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala 450 455 460 Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys 465 470 475 480 Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val 485 490 495 Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val 500 505 510 Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Met Ala Arg Ala Val Gly Ile Asp 515 520 525 Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val Ser Val Leu Glu Gly Gly Asp Pro 530 535 540 Val Val Val Ala Asn Ser Glu Gly Ser Arg Thr Thr Pro Ser Ile Val 545 550 555 560 Ala Phe Ala Arg Asn Gly Glu Val Leu Val Gly Gln Pro Ala Lys Asn 565 570 575 Gln Ala Val Thr Asn Val Asp Arg Thr Val Arg Ser Val Lys Arg His 580 585 590 Met Gly Ser Asp Trp Ser Ile Glu Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Thr Ala 595 600 605 Pro Glu Ile Ser Ala Arg Ile Leu Met Lys Leu Lys Arg Asp Ala Glu 610 615 620 Ala Tyr Leu Gly Glu Asp Ile Thr Asp Ala Val Ile Thr Thr Pro Ala 625 630 635 640 Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Gln Ile 645 650 655 Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala 660 665 670 Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly Glu Lys Glu Gln Arg Ile Leu Val 675 680 685 Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Glu Ile Gly 690 695 700 Glu Gly Val Val Glu Val Arg Ala Thr Ser Gly Asp Asn His Leu Gly 705 710 715 720 Gly Asp Asp Trp Asp Gln Arg Val Val Asp Trp Leu Val Asp Lys Phe 725 730 735 Lys Gly Thr Ser Gly Ile Asp Leu Thr Lys Asp Lys Met Ala Met Gln 740 745 750 Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu Leu Ser Ser Ser 755 760 765 Gln Ser Thr Ser Ile Asn Leu Pro Tyr Ile Thr Val Asp Ala Asp Lys 770 775 780 Asn Pro Leu Phe Leu Asp Glu Gln Leu Thr Arg Ala Glu Phe Gln Arg 785 790 795 800 Ile Thr Gln Asp Leu Leu Asp Arg Thr Arg Lys Pro Phe Gln Ser Val 805 810 815 Ile Ala Asp Thr Gly Ile Ser Val Ser Glu Ile Asp His Val Val Leu 820 825 830 Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro Ala Val Thr Asp Leu Val Lys Glu 835 840 845 Leu Thr Gly Gly Lys Glu Pro Asn Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val 850 855 860 Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln Ala Gly Val Leu Lys Gly Glu Val 865 870 875 880 Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu 885 890 895 Thr Lys Gly Gly Val Met Thr Arg Leu Ile Glu Arg Asn Thr Thr Ile 900 905 910 Pro Thr Lys Arg Ser Glu Ser Phe Thr Thr Ala Asp Asp Asn Gln Pro 915 920 925 Ser Val Gln Ile Gln Val Tyr Gln Gly Glu Arg Glu Ile Ala Ala His 930 935 940 Asn Lys Leu Leu Gly Ser Phe Glu Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro 945 950 955 960 Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly 965 970 975 Ile Val His Val Thr Ala Lys Asp Lys Gly Thr Gly Lys Glu Asn Thr 980 985 990 Ile Arg Ile Gln Glu Gly Ser Gly Leu Ser Lys Glu Asp Ile Asp Arg 995 1000 1005 Met Ile Lys Asp Ala Glu Ala His Ala Glu Glu Asp Arg Lys Arg 1010 1015 1020 Arg Glu Glu Ala Asp Val Arg Asn Gln Ala Glu Thr Leu Val Tyr 1025 1030 1035 Gln Thr Glu Lys Phe Val Lys Glu Gln Arg Glu Ala Glu Gly Gly 1040 1045 1050 Ser Lys Val Pro Glu Asp Thr Leu Asn Lys Val Asp Ala Ala Val 1055 1060 1065 Ala Glu Ala Lys Ala Ala Leu Gly Gly Ser Asp Ile Ser Ala Ile 1070 1075 1080 Lys Ser Ala Met Glu Lys Leu Gly Gln Glu Ser Gln Ala Leu Gly 1085 1090 1095 Gln Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Gln Ala Ala Ser Gln Ala Thr Gly 1100 1105 1110 Ala Ala His Pro Gly Gly Glu Pro Gly Gly Ala His Pro Gly Ser 1115 1120 1125 Ala Asp Asp Val Val Asp Ala Glu Val Val Asp Asp Gly Arg Glu 1130 1135 1140 Ala Lys 1145 <210> 3 <211> 3438 <212> DNA <213> HPV18&16/E6/E7HSP <400> 3 atggccagat tcgaggaccc caccagacgg ccctacaagc tgcctgatct gtgcaccgag 60 ctgaacacca gcctgcagga catcgagatc acctgtgtgt actgcaagac cgtgctggaa 120 ctgaccgagg tgttcgagtt cgccttcaag gacctgttcg tggtgtaccg ggacagcatc 180 cctcacgccg cctgccacaa gtgcatcgac ttctacagcc ggatcagaga gctgcggcac 240 tacagcgaca gcgtgtacgg cgacaccctg gaaaagctga ccaacaccgg cctgtacaac 300 ctgctgatcc ggtgcctgag atgccagaag cccctgaatc ctgccggcgg actgagacac 360 ctgaacgaga agcggcggtt ccacaatatc gccggccact acagaggcca gtgccacagc 420 tgctgcaacc gggccagaca ggaacggctg cagcggagaa gagaaaccca agtgatgcac 480 ggccccaagg ccaccctgca ggatattgtg ctgcacctgg aaccccagaa cgagatcccc 540 gtggatctgc tgggacacgg ccagctgagc gactccgagg aagagaacga cgagatcgac 600 ggcgtgaacc accagcatct gcctgccaga agggccgagc ctcagagaca caccatgctg 660 tgcatgtgct gcaagtgcga ggcccggatc gagctggtgg tggaaagcag cgccgacgac 720 ctgagagcct tccagcagct gttcctgaac accctgagct tcgtgtgccc ttggtgcgcc 780 agccagcaga gcatgcacca gaaacggacc gccatgttcc aggaccccca ggaaagaccc 840 agaaagctgc cccagctgtg taccgaactg cagaccacca tccacgacat catcctggaa 900 tgcgtgtact gtaaacagca gctgctgagg cgcgaggtgt acgactttgc ctttcgggac 960 ctgtgcatcg tgtacaggga cggcaacccc tacgccgtgt gcgacaagtg cctgaagttc 1020 tacagcaaga tcagcgagta ccgccactac tgctactccc tgtacggcac cacactggaa 1080 cagcagtaca acaagcccct gtgcgatctg ctgatcagat gcatcaactg ccagaaacct 1140 ctgtgccccg agggcggcca gaggcacctg gataagaagc agagattcca caacatccgg 1200 ggcagatgga ccggcagatg catgtcctgc tgcagaagca gccggaccag acgggaaaca 1260 cagctgatgc atggcgatac ccctaccctg cacgagtaca tgctggacct gcagcccgag 1320 acaaccgatc tgtacggcta cggacagctg aacgacagct ctgaagaaga ggacgaaatt 1380 gacggccctg ccggccaggc cgaacctgat agagcccact acaatatcgt gaccttctgt 1440 tgcaagtgtg acagcaccct gcggctgtgc gtgcagagca cacacgtgga catccggacc 1500 ctggaagatc tgctgatggg caccctgggc atcgtgtgtc ccatctgcag ccagaaaccc 1560 atggccagag ccgtgggcat cgatctgggc accaccaaca gcgtggtgtc tgtgctggaa 1620 gggggcgacc ctgtggtggt ggccaatagc gagggcagca gaaccacccc tagcatcgtg 1680 gccttcgccc ggaatggcga agtgctcgtg ggacagcccg ccaagaatca ggccgtgacc 1740 aacgtggaca gaaccgtgcg gagcgtgaag cggcacatgg gcagcgattg gagcatcgag 1800 attgacggca agaagtacac cgcccctgag atcagcgccc ggatcctgat gaagctgaag 1860 agggacgccg aggcctacct gggcgaggat atcaccgatg ccgtgatcac cacccccgcc 1920 tacttcaacg acgcccagag acaggccacc aaggacgccg gacagatcgc cggactgaac 1980 gtgctgcgga tcgtgaacga gcctacagcc gccgctctgg cctacggact ggacaagggc 2040 gagaaagaac agcggatcct ggtgttcgac ctgggcggag gcaccttcga tgtgtccctg 2100 ctggaaatcg gcgagggcgt ggtggaagtg cgggccacat ctggcgataa ccacctggga 2160 ggcgacgact gggaccagag agtggtggac tggctggtgg acaagttcaa gggcaccagc 2220 ggcatcgacc tgaccaagga caagatggcc atgcagcggc tgagagaggc cgccgagaag 2280 gccaagattg agctgagcag cagccagagc acctccatca acctgcccta catcaccgtg 2340 gacgccgaca agaaccccct gttcctggac gagcagctga ccagagccga gttccagcgg 2400 atcacccagg acctgctgga caggaccaga aagcccttcc agagcgtgat cgccgacacc 2460 ggcatcagcg tgtccgagat cgatcacgtg gtgctcgtgg gcggcagcac cagaatgcct 2520 gccgtgaccg acctcgtgaa agagctgacc ggcggcaaag aacccaacaa gggcgtgaac 2580 cccgacgagg tggtggctgt gggagctgca ctgcaggcag gcgtgctgaa gggcgaagtg 2640 aaggacgtgc tgctgctgga cgtgacccct ctgagcctgg gaatcgagac aaagggcgga 2700 gtgatgaccc ggctgatcga gagaaacacc acaatcccca ccaagcggag cgagagcttc 2760 accaccgccg acgataacca gcccagcgtg cagatccagg tgtaccaggg cgagagagag 2820 atcgccgccc acaacaagct gctgggcagc ttcgagctga caggcatccc accagccccc 2880 agaggaatcc ctcagatcga agtgaccttc gacatcgacg ccaacggcat cgtgcacgtg 2940 accgccaagg ataagggcac cggcaaagag aacaccatcc ggatccagga aggcagcggc 3000 ctgagcaaag aggatatcga cagaatgatc aaggatgccg aggcccacgc cgaagaggac 3060 cggaaaagac gggaagaggc cgacgtgcgg aaccaggctg agacactggt gtatcagacc 3120 gagaagtttg tgaaagagca gcgcgaggcc gagggcggat ctaaggtgcc agaggacacc 3180 ctgaacaagg tggacgctgc cgtggccgaa gccaaggctg ctctgggagg cagcgatatc 3240 agcgccatca agagcgccat ggaaaaactg ggccaggaaa gccaggccct ggggcaggcc 3300 atctatgaag ctgctcaggc tgccagccag gctacaggcg ctgctcatcc tggcggagaa 3360 ccaggcggag cccatccagg atctgccgat gacgtggtgg atgccgaagt ggtggacgac 3420 ggccgggaag ccaaatga 3438 <210> 4 <211> 435 <212> DNA <213> GM-CSF <400> 4 atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc 60 cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg 120 cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc 180 tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag 240 cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac 300 tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt 360 gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag 420 ccagtccagg agtga 435 　　

Claims (15)

  1. HPV 타입 16으로부터의 E6 및 E7 단백질, HPV 타입 18로부터의 E6 및 E7 단백질, 및 면역 증강 분자인 애주번트 단백질을 포함하는, 인간 유두종 바이러스 (HPV) 및 면역 증강 인자의 5가지 유전자의 융합 항원으로서, 상기 면역 증강 인자인 애주번트 단백질이 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)로부터의 열 쇼크 단백질이고, 상기 융합 항원이 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 항원.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 따른 융합 항원을 인코딩하는 핵산을 발현하기 위한 재조합 유전자 발현 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 융합 항원을 인코딩하는 핵산을 발현하기 위한 발현 카세트, 및 면역자극제를 발현하기 위한 발현 카세트를 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 유전자 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 면역자극제가 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터루킨, 인터페론, 또는 케모카인인 것을 특징으로 하는, 재조합 유전자 발현 벡터.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA 단편을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 유전자 발현 벡터.
  8. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 아데노바이러스 벡터, 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터, 재조합 레트로바이러스 벡터, 재조합 렌티바이러스 벡터, 재조합 헤르페스 바이러스 벡터, 재조합 백시니아 벡터, 또는 재조합 산다이(Sandai) 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 재조합 유전자 발현 벡터.
  9. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 네이키드 DNA 벡터, 나노입자, 중합체, 또는 리포솜으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는, 재조합 유전자 발현 벡터.
  10. 치료학상 유효량의 제1항에 따른 융합 항원을 포함하는, HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유도된 질환을 치료하기 위한 제약 제제로서, 상기 HPV 감염에 의해 유도된 질환이 자궁경부암, 음경암, 항문암, 후두암, 구강암, 두부경부암, 자궁경부 전암성 병변, 또는 자궁경부 증식증인, 제약 제제.
  11. 치료학상 유효량의 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 재조합 유전자 발현 벡터를 포함하는, HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유도된 질환을 치료하기 위한 제약 제제로서, 상기 HPV 감염에 의해 유도된 질환이 자궁경부암, 음경암, 항문암, 후두암, 구강암, 두부경부암, 자궁경부 전암성 병변, 또는 자궁경부 증식증인, 제약 제제.
  12. 제10항에 있어서, 치료학상 유효량의 제1항에 따른 융합 항원, 및 면역자극제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제약 제제.
  13. 제12항에 있어서, 면역자극제가 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터루킨, 인터페론, 또는 케모카인인 것을 특징으로 하는, 제약 제제.
  14. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 재조합 유전자 발현 벡터를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
  15. 삭제
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