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CN118389553A - 免疫增效rna分子及其组合物、疫苗与试剂盒 - Google Patents

免疫增效rna分子及其组合物、疫苗与试剂盒 Download PDF

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CN118389553A
CN118389553A CN202410234227.6A CN202410234227A CN118389553A CN 118389553 A CN118389553 A CN 118389553A CN 202410234227 A CN202410234227 A CN 202410234227A CN 118389553 A CN118389553 A CN 118389553A
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antigen
seq
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李敏
邓吴娴
张宝文
汪义媛
刘洋
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University of Science and Technology of China USTC
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Abstract

本发明提供了一种免疫增效RNA分子及其组合物、疫苗与试剂盒，属于生物技术领域。本发明提供了一种RNA分子，其特征在于，所述RNA分子的编码区中包括HSP结构区域、SIG结构区域、AN结构区，所述HSP结构区域编码HSP蛋白家族或其变体、片段或衍生物。所述HSP蛋白家族包括HSP70及其同家族蛋白的全长、截短、突变形式，对抗原的摄取、活化水平和抗原提呈，多角度提高抗原特异性免疫应答。此外，本发明提供了包含所述RNA分子的组合物、疫苗与试剂盒可用于预防和治疗多种疾病，例如癌症、感染性疾病、自身免疫病、变态反应或移植物抗宿主病。

Description

免疫增效RNA分子及其组合物、疫苗与试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及免疫增效RNA分子及其组合物、疫苗与试剂盒。
背景技术
DNA疫苗是一种将编码特定抗原的DNA序列转染到免疫物种细胞上的疫苗。DNA疫苗的工作原理是注射含有编码所需免疫反应的抗原的DNA序列的基因工程质粒，因此细胞直接产生抗原，从而引起保护性免疫反应。与传统的蛋白亚单位疫苗和病毒载体疫苗不同，DNA疫苗在接种时将DNA序列注入人体，然后人体的细胞使用这些DNA来合成抗原蛋白，从而引发免疫反应。一些公司和研究机构一直在进行DNA疫苗的研究，包括艾滋病、流感、疟疾、肿瘤等疾病。然而，到目前为止，在全球范围内尚未有获得批准的DNA疫苗产品，很大程度上因为DNA疫苗仍然面临一些挑战，包括：(1)效力和持久性：DNA疫苗的效力和持久性尚未与传统疫苗相媲美，因此需要进一步的研究和改进；其中一部分原因可能是因为DNA疫苗在细胞内难以产生足够的抗原蛋白来激发强烈的免疫反应。(2)递送方式：DNA疫苗需要特殊的递送系统，以确保DNA可以被细胞摄取及后续的转录和翻译，这一过程可能需要更高的技术要求。目前常用的递送方式为电击，可能会限制DNA疫苗的应用。(3)安全性：DNA疫苗的长期安全性问题仍然需要深入研究，尤其是与潜在的遗传改变或不良反应有关。
为提高DNA疫苗的效果，多种增强元件被设计加入到DNA中，主要分为以下几类：(1)促分泌元件。因经电击后DNA疫苗主要被注射部位的肌肉细胞摄取，此类细胞提呈抗原、激活抗原特异性T细胞的能力较差，加入分泌元件可将抗原蛋白分泌至胞外，提高DC等APC对抗原蛋白的摄取。如VGX-3100HPV DNA疫苗中加入了IgE的前导肽，帮助指导蛋白质的合成和分泌；GX-188DNA疫苗中加入了组织纤溶酶原激活剂(tPA)的前导肽，帮助融合蛋白进入分泌途径。(2)促进抗原提呈的元件。完整的抗原蛋白不能被T细胞识别，须经DC摄取、加工后形成的多肽与MHC形成复合物提呈至DC表面，激活抗原特异性T细胞应答。加入促抗原提呈的元件可增强抗原提呈，提高抗原特异性T细胞应答强度。如GX-188DNA疫苗中加入了Flt3L，CRT和HSP70等也被用于DNA疫苗中。(3)靶向DC的元件。融合抗原更多地被DC等靶细胞摄取，可更好地增强抗原被DC加工和提呈及后续激活抗原特异性T细胞应答的水平。如CTLA-4被应用于临床前研究中。
尽管加入了不同的增强元件，DNA疫苗的效果仍不尽如人意，这可能与DNA疫苗本身有限的有效性相关。与DNA疫苗不同的是，编码抗原的mRNA仅需要进入胞质进行翻译，产生目标蛋白。近年来，mRNA疫苗领域发展迅速。mRNA是生物医药领域的一项颠覆性技术，可应用于包括肿瘤治疗、预防性疫苗和代谢疾病等领域的药物开发。mRNA疫苗的核心是将含有编码抗原蛋白的mRNA导入体内，翻译形成相应的抗原蛋白，诱导机体产生特异性免疫应答，从而达到治疗疾病的目的。相较于传统药物，mRNA药物具有起效快、安全性高、靶点选择多样、易于生产转化等优势。目前，mRNA技术的临床应用正在逐步推广，被广泛应用于包括新冠疫苗、肿瘤疫苗等药物的研发中，其优异的短期保护效果得到了大规模的验证，mRNA肿瘤疫苗也被美国FDA列为突破疗法。鉴于mRNA疫苗的优异表现，2023年诺贝尔生理或医学奖授予了美国科学家卡塔林·卡里科(Katalin Karikó)和德鲁·魏斯曼(Drew Weissman)，表彰他们发明了核苷酸基修饰，从而帮助开发出有效的新冠mRNA疫苗。这无疑将会进一步推动mRNA疫苗领域的发展。
目前，mRNA疫苗的增强元件研究较少，BioNTech使用MHC I类分子的N末端前导肽与C末端的MHC I类运输信号(MITD)结合，加入至编码靶抗原的mRNA序列里，可改善MHCI类和II类表位在人和鼠DC中的呈递。除此之外，尚无其它用于mRNA疫苗的增强元件。另外，如何发展策略同时实现增强mRNA疫苗中抗原的DC靶向、活化DC、增强抗原提呈，从而大幅提高抗原特异性T细胞应答尚无研究。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了免疫增效RNA分子及其组合物、疫苗与试剂盒。本发明提供了一种RNA分子，其特征在于，所述RNA分子编码区中包括HSP结构区域、SIG结构区域、AN结构区，所述HSP结构区域编码HSP蛋白家族或其变体、片段或衍生物。所述HSP蛋白家族包括HSP70及其同家族蛋白的全长、截短、突变形式，对抗原的摄取、活化水平和抗原提呈，多角度提高抗原特异性免疫应答。此外，本发明提供了包含所述RNA分子的组合物、疫苗与试剂盒可用于预防和治疗多种疾病，例如癌症、感染性疾病、自身免疫病、变态反应或移植物抗宿主病。
本发明部分基于出人意料的发现，即在RNA疫苗中抗原融合功能性组合元件有利地使这些抗原靶向DC、活化DC、增强抗原的提呈，提高抗原特异性T细胞免疫应答和抗体产生水平。该功能性组合元件包括HSP70及其同家族蛋白的全长、截短和突变形式，HSP70蛋白及相关形式的序列有利地增强DC等APC对抗原的摄取、提呈及其活化水平。所述的HSP70蛋白及相关形式包括野生型与突变形式的HSP70，HSP10，HSP27，HSP40，HSP60，HSP90，HSP110，gp96，钙网蛋白等，及其截短、突变等衍生形式，所述的促分泌序列可促进抗原分泌至胞外，抗原向胞外的分泌可增强DC等APC对HSP70-抗原融合蛋白的摄取、加工和抗原提呈。因此，本发明的免疫增效方法与其它现有技术方法的不同之处在于，本发明可同时促进RNA疫苗免疫后DC对抗原的摄取、提呈及DC活化水平，多角度增强抗原特异性免疫应答。对于摄取了核酸疫苗的DC等APC，其可直接增强抗原提呈和活化水平；对于在注射原位摄取了核酸疫苗、不具有抗原提呈能力的肌肉细胞，其可将融合抗原蛋白分泌至胞外，促进DC对其的摄取和后续的加工及抗原提呈。
通过使用HSP70及其同家族蛋白的全长氨基酸序列或优选其特定结构域(例如SBD)，优选与合适的具有靶向和促分泌功能的信号肽一起，可以实现靶向和增强抗原提呈、同时活化DC的目的。本文提出的免疫增效策略利用了HSP70及其同家族蛋白的全长、截短和突变形式的靶向DC、增强抗原提呈和促进DC活化的能力。HSP70可通过与DC表面CD91的结合促进DC对抗原的摄取，通过下游信号激活DC共刺激分子和细胞因子的表达，同时HSP70可通过辅助降解的肽段进入内质网，增强抗原提呈。因此，本文介绍的免疫增效方法利用了HSP70及相关蛋白介导的增强DC摄取、DC抗原提呈和活化水平的特性，从多层面增强抗原特异性免疫应答。
为此，本发明制备了编码这种抗原融合蛋白的RNA分子，并研究了它们在肿瘤模型中的治疗潜力。因此，将目的抗原性蛋白、肽或表位连接到衍生自几种HSP70及相关蛋白的选定结构域或全长蛋白。通常，通过将抗原/表位与HSP70及相关蛋白的选定结构域或全长蛋白来设计核酸构建体。可以包括信号肽，以优化向胞内囊泡区室和质膜外部位点的转运和锚定。另外，引入合适的接头以使得MHC I类和II类分子正确呈递免疫原性肽。可以包括T辅助细胞表位以增加针对编码的表位的抗原特异性免疫应答的诱导。设计策略允许将特定表位或完整抗原靶向富集MHC I类和II类的细胞区室。
出人意料地，免疫增效-抗原RNA复合物能够有效诱导抗原特异性T细胞应答，并在小鼠模型中显示出有效减少肿瘤的生长。
本文提出的新颖免疫增效方法提供了方便且有效的手段，以优选地确保抗原提呈的增强。因此，所述免疫增效策略优选增强针对抗原性肽或蛋白质或表位的抗原特异性免疫应答的诱导，并为提高RNA疫苗的治疗功效开辟了新的可能性。
本发明中，术语“RNA分子”可以理解为非天然RNA分子。此类RNA分子由于其单独的序列(其不是天然存在的)和/或由于不是天然存在的其他修饰例如核苷酸的结构修饰而可能是非天然的。通常，可以通过基因工程方法设计和/或产生人工核酸分子以对应于所需的人工核苷酸序列(异源序列)。在这种情况下，人工序列通常是可能天然不存在的序列，即，其与野生型序列相差至少一个核苷酸。本发明的RNA分子，可以编码抗原多肽构建体，其包含几个(相同或不同的)衍生自HSP70及其同家族蛋白的全长、截短和突变形式的氨基酸序列、几个(相同或不同的)RNA抗原性肽或蛋白质以及任选的本文公开的任何组合的其他(多)肽、蛋白质或蛋白质结构域(例如信号肽、肽接头和T辅助表位)。然而，设想本发明的RNA分子，编码“抗原多肽构建体”，其包含至少一种抗原性肽或蛋白质和至少一种HSP70及其同家族蛋白的全长、截短和突变形式的氨基酸序列。
本发明中，术语“野生型RNA分子”可以理解为天然存在的序列。
本发明中，术语“稳定化的RNA分子”是被修饰，使得其比未修饰的RNA分子对分解或降解，例如通过环境因素或酶消化，例如通过外切核酸酶或内切核酸酶降解更稳定的RNA分子。优选地，在本发明的上下文中，稳定化的核酸分子在细胞如原核或真核细胞，优选哺乳动物细胞如人细胞中是稳定的。稳定作用还可以例如在缓冲溶液等的细胞外部实现，例如在包含稳定的核酸分子的药物组合物的制造过程中实现。
本发明中，术语“RNA”是核糖核酸的常用缩写，是核酸分子，即由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常是腺苷单磷酸单体、尿苷单磷酸单体、鸟苷单磷酸单体和胞苷单磷酸酯单体，它们沿着所谓的骨架相互连接。骨架是由第一单体的糖部分即核糖和第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成的。单体的特定顺序称为RNA序列。
本文涉及的工程化组合RNA序列，包含一段编码前导/信号肽的序列，该区域表达的蛋白会行使辅助抗原序列达到a.细胞器靶向，和b.向胞外分泌的功能，最终影响RNA药物所表达蛋白的DC靶向和摄取。优选的，所述至少一种前导序列/信号肽蛋白有此功能。不希望被特定理论所束缚，设想任何一种细胞器定位蛋白或分泌蛋白均有一段可被运用的序列。改变抗原蛋白的定位命运，影响RNA药物疗效。
本发明中，术语“前导序列”是指结构基因中编码区之前的一段序列，这部分序列能被转录，但不被翻译。前导肽含有作为细胞器蛋白定位所需的所有信息。
在本发明中，术语“信号肽”是指引导新合成的蛋白质向胞外分泌的短肽链，也指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移的N-末端的氨基酸序列。几乎所有的分泌蛋白都含有信号序列，信号序列一般有20-40个氨基酸长，在跨膜运输过程中，最终被信号肽酶除去。
本发明中，术语“细胞器驻留蛋白”是指多肽链进入到内质网腔内后，需进行折叠与组装才能形成有功能的蛋白。这些蛋白有些被运送到细胞其它部位，有些留在内质网中，后者称为内质网驻留蛋白，这类蛋白羧基端有4个特定的氨基酸残基作为驻留的信号。这些驻留蛋白可协助需转移的蛋白的折叠与组装。
本发明中，术语“分泌蛋白”是指酶(主要由附着型核糖体合成)、抗体、部分激素(例如：蛋白质类激素)等在细胞内合成后，分泌到细胞外起作用的蛋白质。在核糖体上合成的分泌蛋白，要经过内质网和高尔基体，而不是直接运输到细胞膜。
所述细胞器驻留蛋白或信号肽蛋白包括但不限于如下所示的蛋白：
因此，本发明中所运用的前导序列/信号肽与抗原融合表达，但最终不会在抗原蛋白中呈现，对于抗原蛋白的细胞器定位或分泌命运有所影响。另外，本发明中所指出的细胞器驻留或分泌蛋白也可以直接与抗原序列融合表达，从而赋予抗原蛋白相应功能。优选前导序列/信号肽，可以辅助抗原翻译或极大程度上促进抗原分泌，被其他免疫细胞摄取，促使核酸药物发挥最大利用效率，进而拥有更强免疫效能。
本发明中，术语“接头”又称为接头分子是指在融合蛋白中起到对抗原与增效免疫蛋白起连接作用短肽，与抗原与增效免疫蛋白融合表达。作为融合蛋白重组不可或缺的组成部分，接头分子在构建稳定、具有生物活性的融合蛋白中发挥着重要的作用。接头分子为两个融合蛋白间起连接作用的氨基酸链，具有一定的柔性以允许两侧的蛋白完成各自独立的功能。蛋白接头分子通常分为3种，分别为柔性接头分子、刚性接头分子和可剪切接头分子。接头分子一般在10-15个氨基酸之间，不宜过长或过短。接头分子序列过长可能会降低融合蛋白产量，同时会产生免疫原性问题；接头分子序列过短可能会使2个蛋白间距太近，影响彼此高级结构的折叠，从而相互干扰，导致蛋白功能丧失。接头分子中的二级结构也会限制融合蛋白的伸缩性，从而影响融合蛋白的功能活性；
所述刚性接头分子，多为螺旋结构，富含脯氨酸，主要结构为(EAAAK)m、(XP)n。维持两融合蛋白结构域之间的距离；
所述可剪切接头分子，通常由能形成二硫键的氨基酸组成，序列可被蛋白酶所降解，在体内常使连接的两个蛋白组分分开；
所述柔性接头分子，成分多为小、亲水性氨基酸，主要结构为(GSSS)m、(G)n，可以提高两结构域的空间上的分离，进而保证两融合蛋白特定结构域的相互作用；
本发明选择序列为GS的柔性连接分子，使抗原与增效免疫蛋白末端保持一定自由度，防止两蛋白之间相互干扰的同时极大的缩短核酸序列的长度，避免产生冗余的二级结构，使核酸序列更易于表达。
本发明中，术语“肽”或“多肽”通常是通过肽键连接的氨基酸单体的聚合物。它通常包含少于50个单体单元。然而，术语“肽”并不否认具有超过50个单体单元的分子。长肽也称为多肽，通常具有50个至600个单体单元。
本发明中，术语“蛋白质”通常包含一个或多于一个肽或多肽。蛋白质通常折叠成3维形式，这可能是蛋白质发挥其生物学功能所必需的。
本发明中，术语“衍生自”通常表示序列可以从参考序列分离、与参考序列相关、基于参考序列或与参考序列同源。因此，“衍生自”参考序列的序列包括与所述参考序列相同的序列(即，与所述参考序列表现出100％序列同一性的全长序列)以及所述参考序列的变体、片段和衍生物。该定义比照适用于氨基酸序列和核酸序列。
本发明中，术语“衍生物”是指参考或亲本(多)肽、蛋白质或氨基酸序列的修饰，从而包括或缺少额外的生物学特性或功能。例如，衍生物可以通过引入或去除赋予特定生物学功能例如结合(另一)靶标的能力或酶活性的结构域来修饰。其他修饰可以调节药代动力学/药效学特性，例如稳定性、生物半衰期、生物利用度、吸收；分布和/或减小的清除率。可通过在翻译后或在核酸序列水平上引入或删除氨基酸序列来制备“衍生物”。“衍生物”可以衍生自，即对应于经修饰的全长野生型(多)肽、蛋白质或氨基酸序列，或其异形体、同源物、片段或变体。术语“衍生物”还包括在翻译后被化学修饰或是可修饰的，例如通过PEG化或PAS化修饰的(多)肽、蛋白质或氨基酸序列。
本发明中，术语“(多)肽/蛋白质变体”通常是指“序列变体”，即包含与参考(多)肽或蛋白质的参考氨基酸序列的至少一个氨基酸残基不同的氨基酸序列的(多)或肽蛋白质。因此，与它们各自的参考序列相比，变体(多)肽或变体蛋白质可优选在其氨基酸序列中包含至少一个氨基酸突变、置换、插入或缺失。置换可以选自保守或非保守置换。(多)变体肽或蛋白质变体可包含至少一个保守氨基酸置换，其中源自同一类别的氨基酸彼此交换。本发明中，(多)变体肽或蛋白质变体优选是指，与各自天然存在的野生型(多)肽/蛋白质或其片段或衍生物的氨基酸序列具有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％或甚至97％的序列同一性的(多)肽/蛋白质。
本发明中，术语“(多)肽/蛋白质变体片段”通常是指由参考(多)肽/蛋白质的全长氨基酸序列的连续子序列组成的(多)肽/蛋白质就其氨基酸序列而言，与所述参考(多)肽/蛋白质的氨基酸序列相比，在N-末端、C-末端和/或序列内被截短。这种截短可分别在氨基酸水平或核酸水平上发生。换句话说，“片段”通常可以是氨基酸序列的全长序列的较短部分。因此，片段通常由与全长氨基酸序列内的相应片段相同的序列组成。该术语包括天然存在的片段(例如由天然存在的体内蛋白酶活性产生的片段)以及工程片段。本发明中，(多)肽/蛋白质片段可以指包含参考蛋白/(多)肽或其变体或衍生物的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的(多)肽/蛋白质。在本发明的上下文中，优选的序列片段由核酸的连续片段组成，该核酸的连续片段对应于衍生该片段的核酸或基因实体的连续片段，其代表衍生该片段的全部(即全长)核酸序列或基因的至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％和最优选至少80％。关于这样的片段指示的序列同一性优选是指整个核酸序列或基因。优选地，“片段”可以包含与衍生它们的参考核酸序列或基因具有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、优选至少70％、优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％或甚至97％的序列同一性的核酸序列。
本发明中，术语“HSP蛋白家族”是生物细胞受到应激原刺激后产生的一类细胞伴侣蛋白，其在淋巴细胞和巨噬细胞的活化、抗原经典呈递和交叉呈递途径以及作为佐剂增强抗原的免疫原性，调节机体的免疫应答水平方面发挥了重要作用。热休克蛋白作为免疫佐剂具有重要的调节作用。其包括但不限于HSP70、HSP10、HSP27、HSP40、HSP60、HSP90、HSP110、HSPE1、HSPB1、HSPB3、gp96或钙网蛋白的全长元件、截短元件或突变形式元件。所述HSP蛋白家族包括但不限于如下所示的蛋白：
UniProt ID 蛋白名称 简称
P0DMV8 热休克蛋白70 HSP70
H2RF71 热休克蛋白A HSP70
A0A0G2JIW1 热休克蛋白70 HSP70
P0DMV9 热休克蛋白70 HSP70
P34931 热休克蛋白70 HSP70
P61604 热休克蛋白10 HSPE1
P10809 热休克蛋白60 HSP60
P04792 热休克蛋白β1 HSPB1
Q12988 热休克蛋白β3 HSPB3
P11142 热休克同源蛋白71 HSC70
P41887 热休克蛋白90 HSP90
P46598 热休克蛋白90 HSP90
Q92598 热休克蛋白110 HSP110
Q61699 热休克蛋白110 HSP110
P14625 热休克蛋白90B1 HSP90B1
Q96L12 钙网蛋白3 CALR3
根据优选的实施方案，根据本发明的免疫增效RNA组合物，可以在其至少一个编码区中编码至少一种HSP及其同家族蛋白的全长、截短、突变形式的氨基酸序列。
本发明中，术语“HSP结构区域”为功能性组合元件，包含HSP蛋白家族蛋白的全长、截短、突变形式；HSP结构区域优选地将抗原性蛋白质或多肽靶向至目的细胞区室、并增强抗原提呈，增强抗原特异性免疫应答。将抗原性肽或蛋白质融合至功能性组合元件序列可同时提高抗原对DC的靶向能力、增强DC活化和抗原的提呈，从而提高抗原特异性T细胞免疫应答和抗体产生水平；HSP结构区域能够将抗原性蛋白或肽(优选与其融合)引导至MHC I类，MHC II类加工区室，从而增强CD8+T/CD4+T细胞应答，并因此增加CD8+CTL/CD4+CTL和/或抗体介导的免疫力。
本发明中，HSP70由45kDa N端核苷酸结合域和25kDa C末端底物结合域组成：
N端核苷酸结合域(Nucleotide-binding domain，NBD)，也称为ATP酶结构域。NBD具有结合和水解ATP的功能，由两个亚结构域(I和II)组成，两个亚结构域又被进一步分成4个子域(IA、IIA、IB、IIB)。在I和II两个亚结构域间有裂缝，核苷酸结合位点位于裂缝的底部。ATP水解成ADP导致NBD的构象发生变化。
C末端底物结合域(Substrate-binding domain，SBD)，也称为肽结合域，位于第394-509位氨基酸。SBD由具有底物结合位点的β夹层结构域(β-SBD)和能够调节错误折叠蛋白亲和力的柔性α螺旋盖结构域(α-SBD)组成。SBD结构域的种类及构象均异质性极大，包括N-端结构域、C-端结构域、中间结构域等，不同SBD结构域的共同之处在于其表面具有一定的亲水性、亲脂性或电荷等特性，以适应底物分子的识别和结合。
HSP70通过SBD与底物蛋白内的短疏水性肽片段瞬时缔合，从而协助蛋白质折叠，而底物结合和释放的循环过程是由NBD中ATP/ADP转换所驱动的。HSP70发挥分子伴侣功能的关键之处在于SBD的开放与闭合构象之间的转变。在NBD与ATP结合的状态下，SBD的底物结合腔处于开放构象，α-SBD与β-SBD彼此分离并对接于NBD的不同面，从而使得SBD对底物产生低亲和力和快速交换速率。当ATP与NBD结合时，SBD与底物蛋白的结合相对较弱。当ADP与NBD结合时，构象变化增强了SBD对底物蛋白的亲和力。
本发明中的“RNA分子”编码全长抗原性肽或蛋白质、或优选其片段。所述片段可以包含所述抗原性肽或蛋白质的(功能性)表位或由其组成。优选地，所述片段或表位针对MHCI类、优选MHCII类加工区室在宿主细胞中表达，并被适应性免疫系统的免疫细胞、免疫细胞受体和抗体识别。抗原性肽或蛋白质被细胞内机制加工以呈递给MHC分子上的免疫细胞，优选地导致抗原特异性免疫应答“抗原性肽或蛋白质”可以是本发明的RNA分子，优选RNA的翻译产物。
本发明中的“抗原性肽或蛋白质”通常是指在适当条件下能够与免疫系统的组分(例如抗体或免疫细胞)相互作用/被其识别的任何(多)肽或蛋白质。抗原性肽或蛋白质优选通过其“表位”或“抗原决定簇”与免疫系统的组分相互作用/被其识别。抗原性肽或蛋白质包含至少一个(功能性)表位的(多)肽、由至少一个(功能性)表位组成的(多)肽或能够提供至少一个(功能性)表位的(多)肽。合适的抗原性肽或蛋白质的选择通常取决于待治疗或预防的病症或疾病。通常，RNA分子可以在其至少一个编码区中编码任何抗原性肽或蛋白质(或抗原性肽或蛋白质的任何所需组合)。或者抗原性肽或蛋白质的多个任意组合。
本发明中，术语“肿瘤抗原”指在肿瘤发生、发展过程中新出现或过度表达的抗原物质。机体产生肿瘤抗原的可能机制为：①基因突变；②细胞癌变过程中使原本不表达的基因被激活；③抗原合成过程的某写环节发生异常(如糖基化异常导致蛋白质特殊降解产物的产生)；④胚胎时期抗原或分化抗原的异常、异位表达；⑤某些基因产物尤其是信号转导分子的过度表达；⑥外源性基因(如病毒基因)的表达。肿瘤抗原有多种分类方法，其中被普遍接受的有两类方法。一种是根据肿瘤抗原特异性进行分类，将肿瘤抗原分为：肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原；另一种是根据肿瘤诱发和发生情况进行分类，将肿瘤抗原分为：化学或物理因素诱发的肿瘤抗原、病毒诱发的肿瘤抗原、自发性肿瘤的抗原、胚胎抗原、分化抗原和过度表达的抗原。
所述“肿瘤特异性抗原”是肿瘤细胞特有的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的新抗原。此类抗原乃通过肿瘤在同种系动物间的移植而被证实，故也称为肿瘤特异性移植抗原或肿瘤排斥抗原，化学或物理因素诱生的肿瘤抗原、自发肿瘤抗原和病毒诱导的肿瘤抗原等多属此类。
所述“肿瘤相关抗原”是指非肿瘤细胞所特有的、正常细胞和其他组织上也存在的抗原，只是其含量在细胞癌变时明显增高。此类抗原只表现出量的变化，而无严格肿瘤特异性。如胚胎性抗原是其中的典型代表。
所述“化学或物理因素诱发的肿瘤抗原”是指特异性高而抗原性弱，表现出明显的个体特异性。同一种化学致癌剂或物理辐射诱发的肿瘤，在不同种系、同种系的不同个体、甚至是同一个体的不同部位，其免疫原性各异。由于突变的肿瘤抗原间很少有交叉成分，故应用免疫学技术诊断和治疗此类肿瘤有一定困难。
所述“病毒诱发的肿瘤抗原”是指由病毒(包括DNA病毒和RNA病毒)引起的。如乙型和丙型肝炎病毒(HBV，HCV)与原发性肝癌有关。其特点为具有较强的抗原性。此类抗原是由病毒基因编码、又不同于病毒本身的抗原，因此称为病毒肿瘤相关抗原。
所述“自发性肿瘤的抗原”是指一种无明确诱发因素的肿瘤。特点为某些类似于化学诱发，具有各自独特的抗原性；另一些则类似于病毒诱发，具有共同的抗原性。
所述“胚胎抗原”是在胚胎发育阶段由胚胎组织产生的正常成分，在胚胎后期减少，出生后逐渐消失，或仅存留极微量，但当细胞癌变时，此类抗原可重新合成。分为两种：甲胎蛋白和癌胚抗原。
所述“分化抗原”是机体器官和细胞在发育过程中表达的正常分子。恶性肿瘤细胞通常停留在细胞发育的某个幼稚阶段，其形态和功能均类似于未分化的胚胎细胞，称为肿瘤细胞的去分化(dedifferentiation)或逆分化(retro-differentiation)，故肿瘤细胞可表达其他正常组织的分化抗原，如胃癌细胞可表达ABO血型抗原，或表达该组织自身的胚胎期分化抗原。Melan-A、gp100和tyrosinase等属于此类抗原。
所述“过度表达的抗原”组织细胞发生癌变后，多种信号转导分子的表达量远高于正常细胞。这些信号分子可以是正常蛋白，也可以是突变蛋白，其过度表达还具有抗凋亡作用，可使瘤细胞长期存活。这类抗原包括ras、c-myc等基因产物。这些抗原被识别，并且抗原呈递细胞可以被细胞毒性T细胞破坏。另外，肿瘤抗原也可以以例如突变受体的形式存在于肿瘤表面，可以被抗体识别。
本发明中，术语“同种异体抗原”又称同种抗原或异体抗原，是存在于人和同种动物的不同个体(同卵孪生者除外)的抗原物质。当一个个体的细胞或组织进入另一机体时，可引起免疫应答。人类血液中的红细胞血型抗原和白细胞抗原均属此类。例如A型红细胞输入B型机体，B型机体内的抗A抗体能凝集A型红细胞，在补体参与下，导致A型红细胞溶解，发生输血反应。提供编码衍生自同种异体抗原的抗原性蛋白或肽的RNA，例如可以用于诱导对所述同种异体抗原的免疫耐受。
本发明中，术语“自身抗原”指能引起自身免疫应答的自身组织成分，包括隐蔽的自身抗原和修饰的自身抗原。
所述“隐蔽的自身抗原”在胚胎期从未与自身淋巴细胞接触过，机体不能识别为自身物质，如晶状体蛋白、脑组织、精子等。
所述“修饰的自身抗原”在感染、药物、烧伤、电离辐射等因素影响下，自身组织的构象发生改变，成为自身抗原。尽管它是正常的身体成分，但会在宿主中诱导自身免疫反应。
本发明中，术语“T细胞表位”是指被T细胞受体识别的抗原表位，表位成分为蛋白质降解后的多肽，多存在于抗原分子内部，需要经过抗原递呈细胞加工后与MHC分子结合成为复合物才能被TCR识别。T细胞表位又可分为两种：a.CD8+T细胞识别的表位，含8-10个氨基酸，其中第2、9位氨基酸为锚定氨基酸。b.CD4+T细胞识别的表位，含13-17个氨基酸。表位类型大多属于线性表位，T细胞对其的识别具有MHC限制性。
T细胞表位供T细胞识别诱导产生细胞介导免疫，而B细胞不能识别表位。T细胞的抗原受体露出膜外部分较少，不能像抗体分子那样结合游离的抗原，只能识别由抗原递呈细胞递呈的与MHC结合的表位。所以被T细胞识别的抗原必须先经过一定的处理，即：从蛋白质降解为多肽，再与MHC分子结合。但构象表位在蛋白质降解时会遭到破坏，可能导致肽段无法被T细胞识别，所以T细胞表位主要是顺序表位，也不一定位于抗原分子表面。如抗体分子，T细胞也可以由共同抗原引起交叉反应，但总不如与原诱导抗原的结合那么有效。
T细胞表位可以诱导细胞免疫应答，作为细胞毒性T细胞攻击的靶子，同时对诱导抗体应答也是必需的；因为B细胞的活化需要活化T细胞的辅助，而T细胞活化必须由T细胞表位来启动。由此看来，每个抗原分子必须至少有一个T细胞表位，才能使抗原具有免疫原性。只具有B细胞表位的分子可以作为抗体的靶子，但本身不能诱导抗体应答。只有少数分子可能例外。
优选地，如本文所用增效RNA药物免疫序列可以通过促进抗原分泌、抗原递呈细胞捕获、抗原递呈细胞提呈、抗原递呈细胞激活等过程大大提高抗原特异性T细胞表位被呈递给T细胞，从而诱导细胞免疫应答，促进T细胞针对特定抗原行使功能。
本发明中，术语“RNA药物”指药物通常由含工程化基因构建体的载体或递送系统组成，其活性成分为RNA。通过将外源基因导入靶细胞或组织，替代、补偿、阻断、修正特定基因，以达到治疗和预防疾病的目的。优选地，RNA药物则可在其DNA模板上进行改造。将增效免疫序列引入工程化基因构建体，可以通过特定的限制酶对目的位点进行剪切，通过DNA连接酶将修饰有同样粘性末端的增效免疫序列构如载体中，使增效免疫序列与抗原融合表达，形成融合蛋白。
本发明中，术语“限制酶”指限制性内切酶是一种能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在特定位置切割DNA链中的磷酸二酯键的一类酶，简称限制酶。
本发明中，术语“DNA连接酶”也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链，连接酶的催化作用需要消耗ATP。
本发明中，术语“粘性末端”是指双链DNA的末端被特定限制性内切酶切割后，形成的带有未配对碱基的单链DNA的末端。这种单链DNA可以与另一段具有互补的粘性末端序列的DNA片段相互结合，从而进行重组或连接。相同的粘性末端是指它们的核苷酸序列相同，具有相同的单链DNA序列。
本发明中，术语“融合蛋白”是指融合蛋白是通过DNA重组技术将要表达的目的蛋白基因和表达载体上融合蛋白基因相连，通过这种方式表达出来的蛋白质，就是既含有目的基因蛋白又含有融合基因蛋白的重组蛋白。融合蛋白表达是重组蛋白表达的一种策略，融合表达是一种方法。另外，也可以通过化学从头合成的方法构建增效免疫序列与抗原融合表达的序列。先把要合成的序列设计成多条互补的单链引物；通过化学合成方法合成这些引物；用PCR的方法拼接合成的引物成双链基因；克隆双链基因到载体；测序验证所合成基因的正确性。
如本文所用，得到的RNA药物的DNA模板则需要进一步通过化学或生物的方法得到相应的RNA产物，发挥所需的药物活性。在优选的实施方案中，核酸药物是RNA疫苗，RNA疫苗包括mRNA疫苗、circRNA疫苗、saRNA疫苗。
其中优选为mRNA疫苗，信使核糖核酸是由DNA模板转录而来，携带遗传信息，指导细胞生产胞内蛋白、膜蛋白及胞外蛋白。理论上可以作为一种通用技术平台表达任何蛋白质，目前可应用于传染病预防性疫苗、肿瘤疫苗、蛋白替代疗法、CAR-T、基因编辑等。
其中优选为circRNA疫苗，circRNA是一种新型的非编码RNA，由mRNA前体(pre-mRNA)的反向剪接产生。与传统的线性RNA不同，circRNA具有以共价键形成的闭合环状结构，不存在5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴，不受RNA核酸外切酶影响，表达更稳定且不易降解。
其中优选为saRNA疫苗，自扩增RNA即saRNA是目前使用RNA研发新型药物和疫苗的新兴技术。IVT saRNA在保持了传统mRNA的可快速开发、模块化设计、无细胞化生产、高安全性等特点的同时，最大的特点是其进入细胞后具备自我复制扩增的能力，提升了IVT mRNA的表达效果。作为正链RNA分子，进入细胞后首先被核糖体翻译出四个非结构蛋白组分nsP1、nsP2、nsP3和nsP4，这四个组分以多聚蛋白的形式组装成一个RNA复制酶复合物。nsP1-4均具有其特有的功能，其中nsP4扮演着以RNA为模版的RNA聚合酶的角色。Rep首先利用初次进入细胞的saRNA合成saRNA负链，再以负链为模版合成新的saRNA拷贝，从而实现saRNA的自扩增。同时，Rep也识别sgPr，然后自其下游开始合成亚基因组RNA。这些亚基因组RNA在宿主细胞中大量累积，可接近106拷贝数。在saRNA疫苗设计中，亚基因组RNA编码的抗原基因将翻译出大量的抗原分子并触发细胞抗原呈递。
本发明中，术语“RNA体外转录”或“体外转录”涉及RNA在无细胞体系(体外)中合成的过程。DNA，特别是质粒DNA(或PCR产物)通常用作生成RNA转录本的模板。RNA可以通过合适的DNA模板的DNA依赖性体外转录而获得，根据本发明，合适的DNA模板优选为线性化质粒DNA模板，主要是含有T7启动子(TAATACGACTCACTATAGGG)或SP6启动子(ATTTAGGTGACACTATAG)序列。用于体外RNA转录的DNA模板可通过克隆核酸，特别是对应于待体外转录的各个RNA的cDNA，并将其引入用于体外转录的合适载体例如质粒DNA中而获得。在本发明的一个优选实施方案中，在体外转录之前，用合适的限制酶将DNA模板线性化。cDNA可以通过mRNA的逆转录或化学合成获得。此外，用于体外RNA合成的DNA模板也可以通过基因合成获得。常用的是以线性化质粒DNA或PCR扩增产物为模板利用RNA聚合酶在体外转录合成。在T7或SP6 RNA聚合酶的条件下，以NTP为底物合成与模板DNA中一条链互补的mRNA，简单快速获得大量的mRNA分子，通过在5’端加上帽子结构和3’端加ployA尾加强mRNA的稳定性。并经一系列分离纯化等过程制备得到高纯度的mRNA。
核酸药物进入体内一部分被吞噬细胞清除，一部分行使相应功能，而这部分药物的效率则最终决定核酸药物的命运，本发明中指出的增效免疫序列对于以上两种形式的核酸药物发挥功能十分重要。其可以增强核酸药物的表达以及扩大其体内分布范围，提高效应细胞反应性，增强疗效。
本发明构建的优选RNA免疫增强元件包括化学修饰、糖修饰、骨架修改、碱基修饰、脂质修饰、序列修饰、G/C含量修饰、密码子优化、罕见密码子替代、A/U含量修饰、不稳定序列元件(DSE)修饰，组合修饰，5’帽、聚腺嘌呤、聚胞嘧啶、UTR的改造优化。本发明的RNA免疫增强元件，可以以修饰核酸的形式提供。
本发明中，术语“修饰”可以指包括对功能结构以及信号肽骨架修饰以及糖修饰或碱基修饰的化学修饰。本发明中，术语“修饰的”免疫增强元件，可以包含核苷酸类似物/修饰(修饰的核苷酸或核苷)，例如骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。与本发明有关的骨架修饰是其中对所述免疫增强元件，优选本文的RNA中所含核苷酸的磷酸骨架进行化学修饰的修饰。与本发明有关的糖修饰是免疫增强元件的核苷酸核糖部位的化学修饰。此外，与本发明有关的碱基修饰是对免疫增强元件相关部位核苷酸的碱基部分的化学修饰。在本文中，核苷酸类似物或修饰优选自核苷酸类似物，其有利于于转录和/或翻译。
“糖修饰”即在核苷/核苷酸部分进行修饰改造。例如，2′羟基(OH)可以被许多不同的“氧”或“脱氧”取代基修饰或取代。
“氧”取代基的-2′羟基修饰的实例包括但不限于烷氧基或芳氧基(-OR，例如，R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；“锁”核酸(LNA)，其中2′羟基例如通过亚甲基桥连接到相同核糖的4′碳上；氨基(-O-氨基，其中氨基例如NRR可以是烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)或氨基烷氧基；
“脱氧”修饰包括氢、氨基(例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基、或氨基酸)；或可以通过接头连接至糖的氨基，其中该接头包含原子C、N和O中的一个或多于一个；
糖基团还可包含一个或多于一个碳，其立体构型与核糖中相应碳的立体构型相反。因此，修饰的免疫增强元件可以包含含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。
“骨架修饰”即在其磷酸骨架中修饰的核苷/核苷酸。可以通过用不同的取代基替代一个或多于一个氧原子来修饰骨架的磷酸基团。此外，修饰的核苷和核苷酸可包括用本文所述的修饰的磷酸酯完全替代未修饰的磷酸酯部分。修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸硼、硼代磷酸酯、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫替代。磷酸酯接头也可以通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替代连接氧进行修饰。
“(核)碱基修饰”即对其核碱基部分中进行化学修饰和改造。RNA序列中采用的核碱基的包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和假尿嘧啶。例如，本文所述的核苷和核苷酸可在大沟面上进行化学修饰。在一些实施方案中，大沟化学修饰可包括氨基、硫醇基、烷基或卤素基团。
“脂质修饰”的免疫增强元件，优选本发明的RNA通常包含(i)免疫增强元件，优选如本文定义的RNA，(ii)与所述免疫增强元件，优选RNA共价连接的至少一个接头，(iii)与各自的接头共价连接的至少一种脂质。脂质修饰的免疫增强元件包含至少一种免疫增强元件，以及与所述免疫增强元件共价连接(无接头)的至少一种(双功能性)脂质。脂质修饰的免疫增强元件包含(i)免疫增强元件，(ii)与所述免疫增强元件，共价连接的至少一个接头，和(iii)与各自的接头共价连接的至少一种脂质，以及(iv)与所述免疫增强元件共价连接(无接头)的至少一种(双功能性)脂质。在这种情况下，特别优选脂质修饰存在于线性免疫增强元件的末端。
“序列修饰”即可以包含至少一种如下所述的序列修饰。不希望受特定理论的束缚，这样的序列修饰可以增加本发明的免疫增强元件的稳定性和/或增强本发明的免疫增强元件的表达。
“G/C含量修饰”G/C修饰的RNA序列通常是指包含以下序列的核酸，该RNA序列基于修饰的野生型RNA序列，并且与所述野生型RNA序列相比，包含改变数量的鸟嘌呤和/或胞嘧啶核苷酸。可以通过用含有鸟苷或胞苷的“同义”密码子替代含有腺苷或胸苷的密码子来产生这种改变的G/C核苷酸数目。相应地，密码子替代优选不改变编码的氨基酸残基，而是专门改变RNA的G/C含量。
在优选的实施方案中，与相应的野生型，即未修饰的RNA的编码序列的G/C含量相比，本发明的免疫增强元件的编码序列的G/C含量被修饰，特别是增加。与由相应的野生型RNA编码的氨基酸序列相比，由本发明的免疫增强元件编码的氨基酸序列优选未改变。
本发明的免疫增强元件的这种修饰基于以下事实：编码区的任何RNA区域的序列对于所述RNA的有效翻译是重要的。因此，RNA的组成和各种核苷酸的序列是重要的。需要说明的是，具有更高比例的G(鸟嘌呤)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有更高比例的A(腺嘌呤)/U(尿嘧啶)含量的序列更稳定。
根据本发明，因此，与相应的野生型序列比较，本发明的免疫增强元件的密码子可以选择性优化，在保留翻译的氨基酸序列同时，增加它们包括的G/C核苷酸含量。
由于多个密码子可以编码一个相同氨基酸(遗传密码的简并性)，需要选择对于稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子选用)。取决于由本发明的免疫增强元件优选RNA编码的氨基酸，与其野生型序列相比，存在多种修饰其核酸序列的可能性。对于由仅包含G或C核苷酸的密码子编码的氨基酸，不需要密码子的修饰。
本发明的免疫增强元件的另一优选修饰基于以下发现：翻译效率也由细胞中tRNA出现的不同频率决定。因此，如果所谓的“罕见密码子”在本发明的免疫增强元件中以增加的程度存在，则与编码相对“常见的”tRNA的密码子存在的情况相比，相应修饰的RNA序列被翻译至明显较差的程度。
在一些优选的实施方案中，与野生型核酸的相应区域相比，在修饰的免疫增强元件，优选本文定义的RNA中，编码蛋白质的区域被修饰，以使得编码细胞中相对罕见的tRNA的野生型序列的至少一个密码子被替代为编码在细胞中相对常见并运载与相对罕见tRNA相同的氨基酸的tRNA的密码子。
由此，对本发明的免疫增强元件的序列进行修饰，以使得可以插入常见的tRNA的密码子。换句话说，根据本发明，通过这种修饰，可以将编码在细胞中相对罕见的tRNA的野生型序列的所有密码子在各种情况下替代为编码细胞中相对常见并在各种情况下携带与相对罕见tRNA相同的氨基酸的tRNA的密码子。本领域技术人员已知哪些tRNA在细胞中相对常见，而哪些相对较少地出现特别优选tRNA最常见的用于特定氨基酸的密码子，例如使用tRNA的Gly密码子，其在人细胞中最常见。
根据本发明，特别优选地，将本发明的修饰的免疫增强元件中序列G/C含量的增加，特别是最大化与“常见”密码子组合，而不修饰由所述免疫增强元件，优选RNA的编码序列编码的氨基酸序列。这样的优选实施方案允许提供特别有效地翻译和稳定化的(修饰的)免疫增强元件。
“A/U含量修饰”与其各自的野生型核酸相比较，本发明的免疫增强元件，优选RNA的核糖体结合位点环境中的A/U含量增加。该修饰(核糖体结合位点周围的A/U含量增加)提高了核糖体与所述免疫增强元件，优选RNA结合的效率。核糖体与核糖体结合位点的有效结合(Kozak序列)转而实现有效翻译免疫增强元件的作用。
“DSE修饰”本发明的免疫增强元件可以针对潜在的不稳定序列元件进行修饰。特别地，所述免疫增强元件的编码序列和/或5′和/或3′非翻译区可以相对于各自的野生型核酸进行修饰，使得其不包含不稳定序列元件，修饰的免疫增强元件的编码氨基酸序列相对于其各自的野生型核酸的编码氨基酸序列优选不改变。
已知例如在真核RNA的序列中会出现DSE，其与信号蛋白在体内结合并调节RNA的酶促降解。为了进一步稳定修饰的免疫增强元件，因此任选地在其至少一个编码区，可以相对于野生型核酸的相应区域进行一种或多于一种这样的修饰，从而使得该区域中不包含或基本上不包含不稳定序列元件。
本发明的免疫增强元件的进一步优选的修饰基于以下发现：编码相同氨基酸的密码子通常以不同的频率出现。根据另外的优选实施方案，在修饰的免疫增强元件中，与相应的野生型核酸的相应区域相比，对编码序列进行修饰，以使得编码相同氨基酸的密码子的频率根据人类密码子选用而对应于该密码子的自然出现频率。
如上所述，可以将编码细胞中相对罕见的tRNA的野生型序列的所有密码子替代为编码细胞中相对常见并在各种情况下运载与相对罕见tRNA相同的氨基酸的tRNA的密码子。
因此，特别优选将最常见的密码子用于每个编码的氨基酸。这种优化程序增加了密码子适应指数(CAI)并最终使CAI最大化。在本发明的上下文中，具有增加或最大化的CAI的序列通常被称为“密码子优化的”序列和/或“CAI增加的”和/或“CAI最大化的”序列。优选地，本发明的免疫增强元件可以包含至少一个编码序列，其中该编码序列是如本文所述的密码子优化的。更优选地，至少一个编码序列的密码子适应指数(CAI)为至少0.5、至少0.8、至少0.9或至少0.95。编码序列的密码子适应指数(CAI)可以是1。
例如，在氨基酸丙氨酸(Ala)存在于由本发明的免疫增强元件的至少一个编码序列编码的氨基酸序列中的情况下，野生型编码序列以下方式进行调整：最常见的人类密码子“GCC”总是用于所述氨基酸或用于氨基酸半胱氨酸(Cys)，野生型序列以下方式进行调整：最常见的人类密码子“TGC”总是用于所述氨基酸等。
“C优化序列”本发明的免疫增强元件可以通过改变，优选增加所述免疫增强元件，优选RNA的胞嘧啶(C)含量来修饰，特别是在其至少一个编码序列中进行修饰。
与相应的野生型(未修饰的)核酸的编码序列的C含量相比，本发明的免疫增强元件的编码序列的C含量被改变，优选被增加。与由相应的野生型核酸编码的氨基酸序列相比，由本发明的免疫增强元件的至少一种编码序列编码氨基酸序列优选不改变。
对所述修饰的免疫增强元件进行修饰，以获得理论上可能的最大胞嘧啶含量的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％、或至少90％或甚至最大胞嘧啶含量。“胞嘧啶含量可优化”的野生型核酸序列的密码子的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％被其中胞嘧啶含量高于野生型序列中存在的胞嘧啶含量的密码子所替代。
可能进一步优选的是，野生型编码序列的一些密码子可以另外被修饰，使得细胞中相对罕见的tRNA的密码子被细胞中相对常见的tRNA的密码子替换，条件是相对常见的tRNA的密码子运载与原始野生型密码子的相对罕见的tRNA相同的氨基酸。优选地，除编码氨基酸(其仅由不含任何胞嘧啶的密码子编码)的密码子之外或除谷氨酰胺(Gln)(其由两个密码子编码，每个密码子含有相同数量的胞嘧啶)的密码子之外，细胞中相对罕见的tRNA的所有密码子被相对常见的tRNA的密码子替代。
修饰的免疫增强元件被修饰，以使得通过编码细胞中相对常见的tRNA的密码子来达到理论上可能的最大胞嘧啶含量的至少80％或至少90％，或者甚至最大胞嘧啶含量，其中氨基酸序列保持不变。
由于遗传密码的天然简并性，一个以上的密码子可以编码特定的氨基酸。因此，在20种天然存在的氨基酸中，有18种由一个以上的密码子编码(Tryp和Met除外)，例如由2个密码子编码(例如Cys、Asp、Glu)、由3个密码子编码(例如Ile)、由4个密码子编码(例如Al、Gly、Pro)或由6个密码子编码(例如Leu、Arg、Ser)。但是，并非所有编码相同氨基酸的密码子在体内条件下都以相同的频率使用。根据每个单一生物体，建立典型的密码子选用简况。
在本发明的上下文中使用的术语“胞嘧啶含量可优化的密码子”是指与编码相同氨基酸的其他密码子相比，胞嘧啶含量更低的密码子。因此，可以被编码相同氨基酸并且在密码子中表现出更高的胞嘧啶数量的另一个密码子替代任何野生型密码子都可被视为胞嘧啶可优化的(C可优化的)。野生型编码序列内用特定的C可优化密码子对C可优化的野生型密码子进行的任何此类替代均会增加其总体C含量，并反映出富含C的修饰RNA序列。
优选地，本发明的免疫增强元件，特别是在其至少一个编码序列中可以包含C最大化的序列或由其组成，该C最大化的序列包含针对所有潜在的C可优化密码子的C优化密码子。因此，优选100％或全部理论上可替代的C可优化密码子在编码序列的整个长度上被C优化密码子替代。
“组合修饰”特别地，设想本文所述的序列修饰应用于本文所述的免疫增强元件，优选RNA的编码序列。如果合适或必要，修饰(包括化学修饰、脂质修饰和序列修饰)可以以任何组合彼此组合，条件是组合的修饰彼此不干扰，并且优选地，条件是所编码的抗原融合蛋白优选保留它们的如上文所述的期望功能或性质。
优选地，根据本发明的人工核酸包含至少一个如本文所定义的编码序列，其中所述编码序列如上文所述进行修饰，并编码如本文所定义的抗原融合蛋白。
根据优选的实施方案，本发明的免疫增强元件包含至少一个如本文定义的编码序列，其中(a)所述免疫增强元件的至少一个编码序列的G/C含量与相应的野生型核酸的相应编码序列的G/C含量相比增加，和/或(b)其中所述免疫增强元件的至少一个编码序列的C含量与相应野生型核酸的相应编码序列的C含量相比增加，和/或(c)其中所述免疫增强元件的至少一个编码序列中的密码子适应于人类密码子选用，其中密码子适应指数(CAI)优选在所述免疫增强元件的至少一个编码序列中增加或最大化，且其中由所述免疫增强元件编码。
本发明中，术语“5′帽”或“5'CAP”根据优选的实施方案，可以通过添加所谓的“5′帽”结构来修饰如本文中定义的RNA分子，所述“5′帽”结构优选地使如本文所述的免疫增强元件稳定化。“5′帽”是实体，通常是修饰的核苷酸实体，其通常在成熟mRNA的5′端“加帽”。5′帽通常可以由修饰的核苷酸，特别是由鸟嘌呤核苷酸的衍生物形成。优选地，5′帽通过5′-5′-三磷酸键连接至5′末端。5′帽可被甲基化，例如m7GpppN，其中N是带有5′帽(通常是mRNA的5′端)的核酸的5′末端核苷酸。m7GpppN是5′帽结构，其天然存在于由聚合酶II转录的mRNA中，因此在这种情况下，优选不被视为“修饰的”mRNA中所包含的修饰。因此，“修饰的”免疫增强元件可包含m7GpppN作为5′帽，但是另外地，所述修饰的免疫增强元件，优选RNA通常包含至少一种本文所定义的其他修饰。可以使用帽类似物在化学RNA合成或RNA体外转录(共转录加帽)中形成5′-帽(帽0或帽1)结构。
本发明中，术语“脂质纳米颗粒”也称为“LNP”，不限于任何特定的形态，并且包括当阳离子脂质和任选的一种或多于一种其他脂质在例如水性环境中和/或存在RNA的情况下组合时生成的任何形态。例如，脂质体、脂质复合物、脂质复合体等在LNP的范围内。可以将本发明的RNA分子和/或本文公开的任何其他核酸配制成氨基醇类脂质。可用于本发明的氨基醇类脂质可以通过美国专利第8450298号中描述的方法制备，其通过引用整体并入本文。
LNP通常包含阳离子脂质和一种或多于一种选自中性脂质、带电荷脂质、类固醇和聚合物缀合脂质(例如PEG化脂质)的赋形剂。RNA可以被包封在LNP的脂质部分中或被包封在LNP的一些或整个脂质部分包围的水性空间中。RNA或其一部分也可以与LNP缔合并复合。LNP可以包含能够形成颗粒的任何脂质，该颗粒上附着有核酸或该颗粒中包封有一个或多个核酸。优选地，包含核酸的LNP包含一种或多于一种阳离子脂质和一种或多于一种稳定化脂质。稳定化脂质包括中性脂质和PEG化脂质。
LNP的阳离子脂质可以是可阳离子化的，即当pH降低到脂质的可电离基团的pK以下时，该脂质会质子化，但在较高的pH值下逐渐变为中性。在低于pK的pH值下，脂质能够与带负电荷的核酸缔合。在某些实施方案中，阳离子脂质包括在pH降低时呈现正电荷的两性离子脂质。
LNP可以包含适合于形成脂质纳米颗粒的任何阳离子脂质。优选地，阳离子脂质在约生理pH下带有净正电荷。阳离子脂质可以是氨基脂质。
本发明中，术语“氨基脂质”是指包括具有一个或两个脂肪酸或脂肪烷基链和氨基头部基团(包括烷基氨基或二烷基氨基)的脂质，其可以在生理pH下质子化以形成阳离子脂质。
本发明中，术语“聚阳离子化合物”通常是指带电荷的分子，其在通常在1至9的pH值下，优选在9或低于9(例如5至9)的pH值下、8或低于8(例如5至8)的pH值下、7或低于7(例如5至7)的pH值下，最优选在生理pH(例如7.3至7.4)的pH值下带正电荷(阳离子)。因此，“聚阳离子化合物”可以是在生理条件下，特别是在体内生理条件下带正电荷的任何带正电荷化合物或聚合物，优选阳离子肽或蛋白质。“聚阳离子肽或蛋白质”可包含至少一种带正电的氨基酸、或多于一种带正电的氨基酸。
本发明中，术语“疫苗”通常理解为提供至少一种抗原，优选抗原性肽或蛋白质的预防或治疗材料，提供至少一种抗原是指例如疫苗包含抗原或疫苗包含例如编码抗原的分子。
本发明中，所述“药物发挥最佳功效的安全性剂量”是指能够在“患者”、“个体”、“对象”、非人类动物、组织和/或器官中产生能达到预期生物学效应的治疗量。“药物发挥最佳功效的安全性剂量”可以诱导治疗对象病症的消退、减轻治疗对象的症状和/或预防病症的发生。同时，“药物发挥最佳功效的安全性剂量”足以避免严重的不良反应；“药物发挥最佳功效的安全性剂量”还应随治疗对象的性别、年龄、体重、身体健康状况、饮食结构、自身基础疾病、药物服用情况、疾病的发病时间、进展速度、严重程度、治疗进程、伴随治疗的状况、所用的特定的辅药和/或附加物等类似因素而改变。还可以依据其施用的核酸序列，优选线性mRNA而改变。使药物发挥最佳功效的安全性剂量通过药物功效与安全性评价、药理药效评价、药物不良反应评价和体内药效评价确定。如在活细胞或实验动物中评价治疗指数和安全范围作为药物安全度的指标。治疗指数为LD50(群体中50％致死的剂量)和ED50(群体中50％有效的剂量)的比值，表现为LD50/ED50大的治疗指数，则安全度愈高。安全范围指LD1(群体中1％致死的剂量)与ED99(群体中99％有效的剂量)的比值或LD5(群体中5％致死的剂量)与ED95(群体中95％有效的剂量)之间的距离，表现为距离大的安全范围，则安全度愈高。表现为安全度高的剂量通常是优选的。通过活细胞实验和动物实验筛选出的安全、有效剂量可应用于人体药剂配制中。例如，本发明提供的一段RNA序列，制成的药物(疫苗)、试剂套装或试剂盒的安全和有效治疗量每剂量单位约10μg-500μg，优选治疗量每剂量单位约50μg-400μg，更优选治疗量每剂量单位约50μg-200μg。进一步，本发明提供的RNA分子或组合物制成的药物(疫苗)、试剂套装或试剂盒的安全和有效治疗量每剂量单位可以为10μg-500μg每人次，优选治疗量每剂量单位约50μg-400μg每人次，更优选治疗量每剂量单位约50μg-200μg每人次。安全和有效治疗量根据动物实验确定，所应用的动物模型包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬以及非人灵长类动物。根据动物耐受性更大，通过动物实验获得的安全和有效治疗量需换算为可应用于人体的等效剂量。
本发明中，术语“药学上可接受的”是指与一种或多于一种活性剂(在此为RNA分子)相容并且不干扰和/或基本上不降低其药物活性的化合物或试剂。药学上可接受的载剂和/或赋形剂优选具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使其适于施用于待治疗的对象。
本发明中，术语“赋形剂”指的是在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；中药丸剂中的酒、醋、药汁等；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。对赋形剂的一般要求是性质稳定，与主药无配伍禁忌，不产生副作用，不影响疗效，在常温下不易变形、干裂、霉变、虫蛀、对人体无害、无生理作用，不与主药产生化学或物理作用，不影响主药的含量测定等。一种不发生化学反应的药用混合物(如糖浆、猪油或液态凡士林)，其中加入一种具有疗效的药物或者通过它使其他成分胶合在一起。构成药物或抗原的辅料的无活性物质(如阿拉伯胶、糖浆、羊毛脂或淀粉)；尤指在药物混合物中有足够量液体情况下，为使混合物有粘性，以便制备丸剂或片剂而加入的物质。例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲盐水、固定油、植物油例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)；卵磷脂；表面活性剂；防腐剂例如苯甲醇、对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等；等渗剂例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠；单硬脂酸铝或明胶；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖；微晶纤维素，黄蓍胶或明胶；淀粉或乳糖；糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉或马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、乙酸纤维素；崩解剂等。
本发明中，术语“载体”包含免疫增强元件的完整RNA分子可以与脂质(特别是阳离子脂质和/或中性脂质)以复合或缔合的形式构建一种或多于一种LNP或CLAN。
本发明中，术语“复合”根据优选的实施方案，本发明的RNA分子，与一种或多于一种阳离子或聚阳离子化合物复合，优选与阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子肽或蛋白质例如鱼精蛋白、阳离子或聚阳离子多糖和/或阳离子或聚阳离子脂质复合。
提供“复合的”RNA分子的手段和方法在“复合”部分中描述，并且经必要的修改后同样适用于本发明的组合物或药物(疫苗)。具体而言，形成本发明的(药物)组合物或疫苗的一部分的RNA分子，可以与脂质、(聚)阳离子化合物和载体(其优选选自(聚)阳离子氨基酸、肽和蛋白质、(聚)阳离子多糖、(聚)阳离子脂质、(聚)阳离子聚合物或如上所述的聚合物载体)复合。
根据优选的实施方案，形成本发明的组合物或药物(疫苗)的一部分的RNA分子，可以与由二硫键交联的阳离子组分形成的聚合物载体、优选二硫键交联的阳离子肽复合，该聚合物载体优选包含如上所述的根据式(CAT-I)、(CAT-Ia)和/或(CAT-Ib)的肽和/或根据式(Cat-II)(L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L)的化合物。
本发明中，术语“全身施用”的途径包括例如静脉给药(静注和推注)、肌肉给药(肌内、皮下、皮内注射)、消化道给药(口服)、粘膜给药(舌下含服、口腔喷雾、口腔贴膜、滴眼剂、直肠和阴道栓剂)或皮肤给药(经皮肤吸收入血)。
本发明中，术语“局部施用”的途径包括经腔管-关节腔、气管、呼吸道，阴道、肛门等器官给药，也包括在病灶内、瘤内、瘤周、颅内、肺内、心内、结节内等病症区给药。
进一步可认为本发明的不同药物(疫苗)或试剂盒的不同部分可以使用不同的施用途径。
本发明中，“试剂盒”可以是两个或多于两个部分的套装，并且通常在合适的容器中包含本文所述的每种组分。例如，每个容器可以是小瓶、瓶子、挤压瓶、广口瓶、密封的套筒、封套或小袋、管或泡罩包装的形式，或任何其他合适的形式，条件是该容器被配置为防止组分的过早混合。可以分别提供每个不同的组分，或者可以与一些不同的组分一起提供(即，在同一容器中)。容器也可以是小瓶、管、广口瓶、或封套、或套筒、或泡罩包装或瓶子内的区室或隔室，条件是在药剂师或医生有意混合之前，一个隔室的内容物不能与另一个隔室的内容物物理关联。任选地，试剂套装可包含至少一种在药物组合物的上下文中如本文所定义的其他试剂、抗微生物剂、RNA酶抑制剂、增溶剂、缓冲剂等。在优选的实施方案中，试剂盒可以包含乳酸林格溶液作为一部分。
本发明中，术语“患者”、“个体”或“对象”包括哺乳类、鱼类、两栖类、爬行类和鸟类等人以及非人动物。例如灵长类动物包括原始猴类、嬉猴科、大狐猴科、指猴科、懒猴科、婴猴科、鼠狐猴科、进步的猴类、猿类、白颊长臂猿、眼镜猴科、卷尾猴科、青猴科、僧面猴科、蜘蛛猴科、猴科、长臂猿科、猩猩科；哺乳类动物包括虎、狼、鼠、鹿、貂、猴、貘、树懒、斑马、狗、狐、熊、象、豹子、麝牛、狮子、小熊猫、疣猪、羚羊、驯鹿、考拉、犀牛、猞猁、穿山甲、长颈鹿、熊猫、食蚁兽、猩猩、海牛、水獭、灵猫、海豚、海象、鸭嘴兽、刺猬、北极狐、无尾熊、北极熊、袋鼠、犰狳、河马、海豹、鲸鱼、鼬；以及多种转基因动物、基因工程动物和模式动物；在本发明中，术语“患者”、“个体”和“对象”优选指非人灵长类动物或人，最优选人。
术语“治疗”、“医治”或“处理”应理解为预防病症(即，导致疾病不发生)；抑制病症(即，导致疾病不发展)；根除病症(即，导致疾病消失)；和/或稳定病症(即，导致疾病无进展)。然而，临床病症的发生发展是多因素、多层次的，无法总是明确的区分“预防”、“抑制”和/或“稳定”症状，因此，术语“预防”一定程度上涵盖“预防”、“抑制”和/或“稳定”的“治疗”和“医治”类型。因此，术语“治疗”和“医治”包括“预防”和“根除”。
本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种RNA分子，所述RNA分子的编码区域包括HSP结构区域、SIG结构区域、AN结构区；所述HSP结构区域编码HSP蛋白家族或其变体、片段或衍生物；所述SIG结构区域编码信号肽；所述AN结构区域编码相同或不同的RNA抗原性肽或蛋白质。
具体地，所述HSP蛋白家族包括HSP70、HSP110、HSP10、HSP27、HSP40、HSP60、HSP90、HSPE1、HSPB1、HSPB3、gp96或钙网蛋白的全长元件、截短元件或突变形式元件。
进一步具体地，所述HSP蛋白家族包括HSP70或HSP110的全长元件、截短元件或突变形式元件。
优选地，所述HSP蛋白家族为HSP70全长元件、HSP70 SBP元件、HSP110全长元件或HSP110 SBP元件。
进一步优选地，所述HSP蛋白家族包括如SEQ ID NO.5-8所示的任一项氨基酸序列或其片段、变体或衍生物；
具体地，所述HSP结构区域具有如SEQ ID NO.1-4所示的任一项或多项和核苷酸序列。
进一步具体地，所述HSP70全长元件具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，SEQID NO.5所示的氨基酸序列；
所述HSP70 SBP元件具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
所述HSP110全长元件具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；
所述HSP110 SBP元件具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
具体地，所述AN结构区域编码一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种相同或不同的RNA抗原性肽或蛋白质。
进一步具体地，所述RNA抗原性肽或蛋白质包括肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、原生动物抗原、真菌抗原、同种异体抗原或自身抗原。
优选地，所述RNA抗原性肽或蛋白质为肿瘤抗原。
进一步优选地，所述肿瘤抗原包括HPV16 E6、HPV16 E7、Adpgk或MAGE-1。
具体地，所述信号肽包括但不限于LAMP1、CRT、IgE、tPA、IL12、HLA Ⅰ的全长或片段。
进一步具体地，所述信号肽具有如SEQ ID NO.9-14中任一项所示的氨基酸序列或其片段、变体或衍生物；所述SIG结构区域包括如SEQ ID NO.15-20中任一项所示的核酸序列或其片段、变体或衍生物。
优选地，所述LAMP1具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列；
所述CRT具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列；
所述IgE具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列；
所述tPA具有如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列；
所述IL12具有如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列；
所述HLA Ⅰ具有如SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列。
进一步优选地，信号肽为LAMP1，具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.15所示的核苷酸序列。
具体地，所述RNA分子的编码区域具有如下结构：
5'-(SIG)a-(L)b-[(AN)c-(L)d]e-(HSP)m-3'；
或5'-(SIG)a-(L)b-[(HSP)m-(L)d]e-(AN)c-3'；
或5'-(HSP)m-(L)b-[(SIG)a-(L)d]e-(AN)c-3'；
其中，所述L结构区域编码接头序列；所述b、d各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数；所述a、c、e、m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数。
进一步具体地，所述接头为非免疫原性接头，包括但不限于柔性接头分子、刚性接头分子和可剪切接头分子。
优选地，所述接头包括GS柔性linker-1、GS柔性linker-2、GS柔性linker-3、短肽-1、短肽-2、T2A、P2A、E2A、Furin clevage linker。
优选地，所述接头具有如GS、AAA、AGA或SEQ ID NO.21-26中任一项所示的氨基酸序列或其片段、变体或衍生物；所述L结构区域包括如GGCAGC、GCCGCCGCC、GCCGGCGCC或SEQID NO.27-32中任一项所示的核酸序列或其片段、变体或衍生物；
所述GS柔性linker-1具有如GS所示的氨基酸序列，GGCAGC所示的核苷酸序列；
所述GS柔性linker-2具有如SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列，SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列；
所述GS柔性linker-3具有如SEQ ID NO.22所示的氨基酸序列，SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列；
所述短肽-1具有如AAA所示的氨基酸序列，GCCGCCGCC所示的核苷酸序列；
所述短肽-2具有如AGA所示的氨基酸序列，GCCGGCGCC所示的核苷酸序列；
所述T2A具有如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列，SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列；
所述P2A具有如SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列，SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列；
所述E2A具有如SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列，SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列；
所述Furin clevage linker具有如SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.33所示的核苷酸序列。
进一步优选地，接头为GS柔性linker-1，具有如GS所示的氨基酸序列，GGCAGC所示的核苷酸序列。
具体地，所述RNA分子的编码区域核酸序列中G/C含量与相应的野生型RNA分子核酸序列中G/C含量相比增加；
或编码区域核酸序列中C含量与相应的野生型RNA分子核酸序列中C含量相比增加；
或编码区域核酸序中的密码子适应于人类密码子选用，其中密码子适应指数优选在RNA分子核酸序列中增加或最大化；由RNA分子核酸序列编码的氨基酸序列与由相应的野生型RNA分子核酸序列编码的氨基酸序列相比未改变。
具体地，RNA分子的编码区域包含如SEQ ID NO.33-42中任一项所示的核酸序列；或根据SEQ ID NO.33-42中任一项所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
在本发明实施例1中所述RNA分子的编码区域具有如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列；或根据SEQ ID NO.33所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
在本发明实施例2中所述RNA分子的编码区域具有如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列；或根据SEQ ID NO.34所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
在本发明实施例3中所述RNA分子的编码区域具有如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列；或根据SEQ ID NO.35所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
在本发明实施例4中所述RNA分子的编码区域具有如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列；或根据SEQ ID NO.36所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
在本发明实施例5中所述RNA分子的编码区域具有如SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列；或根据SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.38所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
在本发明实施例6中所述RNA分子的编码区域具有如SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列；或根据SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.40所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
在本发明实施例7中所述RNA分子的编码区域具有如SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列；或根据SEQ ID NO.41所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
在本发明实施例8中所述RNA分子的编码区域具有如SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列；或根据SEQ ID NO.42所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
具体地，所述RNA分子的编码区域位于5'UTR和3'UTR之间。
优选地，所述RNA分子的编码区域位于5'UTR的下游和3'UTR的上游。
具体地，所述RNA包括mRNA、病毒RNA、复制子RNA或环状RNA。
优选地，所述RNA为mRNA。
具体地，所述RNA包括单顺反子RNA、双顺反子RNA或多顺反子RNA。
具体地，所述RNA为被修饰的RNA。
优选地，所述RNA为被稳定化的RNA。
具体地，所述RNA分子包含聚腺嘌呤序列。
优选地，所述RNA分子包含10个至200个、10个至100个、40个至80个或50个至70个腺嘌呤核苷酸。
具体地，所述RNA分子包含聚胞嘧啶序列
优选地，所述RNA分子包含10个至200个、10个至100个、20个至70个、20个至60个或10个至40个胞嘧啶核苷酸。
具体地，所述RNA分子具有如下结构：
5'CAP-5'UTR-(SIG)a-(L)b-[(AN)c-(L)d]e-(HSP)m-3'UTR-3'Ploy；
或5'CAP-5'UTR-(SIG)a-(L)b-[(AN)c-(L)d]e-(HSP)m-3'UTR-3'Ploy；
或5'CAP-5'UTR-(HSP)m-(L)b-[(SIG)a-(L)d]e-(AN)c-3'UTR-3'Ploy。
具体地，所述5'CAP包括m7GpppN、ARCA帽或帽1。
优选地，所述5'CAP的氨基酸序列为AG。
具体地，所述5'-UTR包括如SEQ ID NO.43-48所示的核酸序列或其片段、变体或衍生物；或根据SEQ ID NO.43-48中任一项所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
在本发明实施例1中，5'-UTR具有如SEQ ID NO.43所示的核酸序列。
在本发明实施例2中，5'-UTR具有如SEQ ID NO.44所示的核酸序列。
在本发明实施例3中，5'-UTR具有如SEQ ID NO.45所示的核酸序列。
在本发明实施例4中，5'-UTR具有如SEQ ID NO.46所示的核酸序列。
在本发明实施例5中，5'-UTR具有如SEQ ID NO.47所示的核酸序列。
在本发明实施例6中，5'-UTR具有如SEQ ID NO.48所示的核酸序列。
在本发明实施例7中，5'-UTR具有如SEQ ID NO.44所示的核酸序列。
在本发明实施例8中，5'-UTR具有如SEQ ID NO.44所示的核酸序列。
具体地，所述3'-UTR包括如SEQ ID NO.49-54所示的核酸序列或其片段、变体或衍生物；或根据SEQ ID NO.49-54中任一项所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
在本发明实施例1中，3'-UTR具有如SEQ ID NO.49所示的核酸序列。
在本发明实施例2中，3'-UTR具有如SEQ ID NO.50所示的核酸序列。
在本发明实施例3中，3'-UTR具有如SEQ ID NO.51所示的核酸序列。
在本发明实施例4中，3'-UTR具有如SEQ ID NO.52所示的核酸序列。
在本发明实施例5中，3'-UTR具有如SEQ ID NO.53所示的核酸序列。
在本发明实施例6中，3'-UTR具有如SEQ ID NO.54所示的核酸序列。
在本发明实施例7中，3'-UTR具有如SEQ ID NO.50所示的核酸序列。
在本发明实施例8中，3'-UTR具有如SEQ ID NO.50所示的核酸序列。
具体地，3'Ploy包括聚腺嘌呤尾或聚胞嘧啶尾。
优选地，所述聚腺嘌呤尾包括由10个至1000个、10个至500个、10个至300个、10个至200个、10个至100个、40个至80个或50个至70个腺嘌呤核苷酸组成。
优选地，所述聚胞嘧啶尾包括由10个至200个、10个至100个、20个至70个、20个至60个或10个至40个胞嘧啶核苷酸组成。
优选地，所述3'Ploy具有的氨基酸序列如SEQ ID NO.55所示。
又一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括上述RNA分子及其药学上可接受的载体或赋形剂。
具体地，所述RNA分子与一种或多种阳离子化合物或聚阳离子化合物复合。
优选地，所述阳离子化合物包括阳离子聚合物、阳离子肽或蛋白质、阳离子多糖或阳离子脂质。
优选地，所述聚阳离子化合物包括聚阳离子聚合物、聚阳离子肽或蛋白质聚阳离子多糖或聚阳离子脂质。
进一步优选地，所述RNA分子与一种或多种阳离子脂质或聚阳离子脂质复合，形成脂质纳米颗粒、脂质复合体或脂质体。
优选地，所述RNA分子与阳离子化合物或聚阳离子化合物的N/P比包括0.1-10：1。
进一步优选地，所述RNA分子与阳离子化合物或聚阳离子化合物的N/P比为6：1。
又一方面，本发明提供了上述RNA分子或组合物在制备药物或试剂盒中的应用。
具体地，所述药物的剂型包括软膏剂、栓剂、气雾剂、糊剂、凝胶剂、汤剂、散剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、注射剂、雾化剂、冻干剂。
根据进一步优化的实施方案，由本发明组成的药物主要以冻干剂的形式提供，以维持药物的最佳稳定性。冻干制品的药物在施用前需在适当的缓冲液中稀释到合适浓度，该缓冲液主要基于水性载剂，例如枸橼酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液等。
根据进一步优化的实施方案，由本发明组成的药物以基于脂质的制剂形式提供。基于纳米递送系统的制剂可包括脂质纳米颗粒、蛋白/多肽纳米颗粒、阳离子/脂质纳米颗粒、无机材料纳米颗粒。
根据进一步优化的实施方案，由本发明组成的药物以雾化制剂的形式提供。基于雾化递送系统的制剂通过雾化器如鼻腔接种喷雾装置递送。优选地，所述药物为疫苗。
具体地，所述应用包括在预防、治疗或诊断肿瘤、癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病、移植物抗宿主病或变态反应中的应用。
优选地，所述感染性疾病可表现为局部反应或全身性反应。
优选地，所述自身免疫性疾病包括但不限于Ⅰ型糖尿病、类风湿关节炎、牛皮癣/银屑病关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、炎症性肠病、艾迪生氏病、格雷夫斯病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性血管炎、恶性贫血、乳糜泻。
优选地，所述应用还包括联合治疗，所述联合治疗的治疗对象除接受作用于本文所述肿瘤、癌症或感染性疾病的手术、放疗、化疗、免疫疗法、靶向治疗、内分泌治疗、干细胞移植、RNA精准治疗、抗真菌、抗病毒和/或抗感染治疗外，可联合本发明提供的药物(疫苗)或试剂盒接受治疗。联合疗法的施用取决于疾病的类型、恶性程度、进展程度以及药物当前疗效。联合疗法通常于本发明提供的药物(疫苗)或试剂盒治疗前或治疗后或者同时施用。
优选地，所述药物(疫苗)或试剂盒的应用对象可以是接受过或正在接受手术(外科麻醉手术、冷冻手术、激光治疗、热疗、光动力疗法)、放疗(外照射、内照射)、化疗(新辅助化疗、辅助化疗)、免疫疗法(如CTLA-4和PD-1免疫检查点抑制剂、过继细胞疗法、治疗性抗体疗法)、靶向治疗(单克隆抗体、小分子药物)、内分泌治疗、干细胞移植和DNA精准治疗的肿瘤或癌症患者，或接受过上述疗法中的一种或多种后复发的患者。
优选地，预防或治疗包括但不限于施用常规疗法与本发明提供的药物(疫苗)、试剂套装或试剂盒的任意组合，如常规疗法手术(外科麻醉手术、冷冻手术、激光治疗、热疗、光动力疗法)、放疗(外照射、内照射)、化疗(新辅助化疗、辅助化疗)、免疫疗法(如CTLA-4和PD-1免疫检查点抑制剂、过继细胞疗法、治疗性抗体疗法、)、靶向治疗(单克隆抗体、小分子药物)、内分泌治疗、干细胞移植和DNA精准治疗与本发明提供的试剂盒的任意组合。
优选地，所述药物(疫苗)或试剂盒可施用于本文所述病症的另一种治疗之前、同时和/或之后。
具体地，所述应用通过向有需要的对象施用有效剂量的RNA分子或组合物实现。
优选地，所述应用通过向有需要的对象施用药物发挥最佳功效的安全性剂量的RNA分子或组合物实现；
优选地，所述施用的方案包括：所述药物(疫苗)或试剂盒可以一天多次、一天一次、一周多次、一周一次或每月施用于作用对象、患者或个体；或所述药物(疫苗)或试剂盒可以通过全身施用或局部施用；或所述药物(疫苗)或试剂盒可以同时或依次施用。
又一方面，本发明提供了一种疫苗，所述疫苗包括上述RNA分子或组合物。
具体地，所述疫苗适用于皮下、皮肤内、皮内、皮内、局部或经皮施用。
优选地，所述疫苗适用于病灶内、瘤内给药。
又一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述RNA分子或组合物。
具体地，所述试剂盒还包括液体载剂或所述RNA分子或组合物的施用和剂量信息的技术说明。
又一方面，本发明提供了一种体外细胞处理方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)在体外提供细胞；
(2)使步骤(1)所述的细胞与上述RNA分子、组合物、疫苗、试剂盒接触。
具体地，所述方法包括转染，即将包含本发明提供的核酸序列的外源性核酸导入特定细胞，外源性核酸翻译为编码的特定蛋白，通过MHC分子可递呈给APC如DC，用以激活体内外的T细胞。
本发明的积极和有益效果在于：
本发明提供了一种RNA分子，其特征在于，所述RNA分子编码区中包括HSP结构区域、SIG结构区域、AN结构区，所述HSP结构区域编码HSP蛋白家族或其变体、片段或衍生物。所述HSP蛋白家族包括HSP70及其同家族蛋白的全长、截短、突变形式，对抗原的摄取、活化水平和抗原提呈，多角度提高抗原特异性免疫应答。此外，本发明提供了包含所述RNA分子的组合物、疫苗与试剂盒可用于预防和治疗多种疾病，例如癌症、感染性疾病、自身免疫病、变态反应或移植物抗宿主病。
附图说明
图1为HSP70全长元件用于HPV抗原RNA疫苗ELISpot检测免疫后IFN-γ产生。
图2为HSP70全长元件用于HPV抗原RNA疫苗ICS检测免疫后IFN-γ产生。
图3为HSP70全长元件用于HPV抗原RNA疫苗的肿瘤治疗结果。
图4为HSP70 SBD元件用于HPV抗原RNA疫苗ELISpot检测免疫后IFN-γ产生。
图5为HSP70 SBD元件用于HPV抗原RNA疫苗ICS检测免疫后IFN-γ产生。
图6为HSP70 SBD元件用于HPV抗原RNA疫苗的肿瘤治疗结果。
图7为HSP110全长元件用于HPV抗原RNA疫苗ICS检测免疫后IFN-γ产生。
图8为HSP110全长元件用于HPV抗原RNA疫苗的肿瘤治疗结果。
图9为HSP110 SBD元件用于HPV抗原RNA疫苗ICS检测免疫后IFN-γ产生。
图10为HSP110 SBD元件用于HPV抗原RNA疫苗的肿瘤治疗结果。
图11为不同构建顺序的HSP70全长元件用于HPV抗原RNA疫苗ICS检测免疫后IFN-γ产生。
图12为不同构建顺序的HSP70全长元件用于HPV抗原RNA疫苗的肿瘤治疗结果。
图13为不同构建顺序的HSP70 SBD元件用于HPV抗原RNA疫苗ICS检测免疫后IFN-γ产生。
图14为不同构建顺序的HSP70 SBD元件用于HPV抗原RNA疫苗的肿瘤治疗结果。
图15为HSP70 SBD元件用于结肠癌癌胚抗原RNA疫苗ICS检测免疫后IFN-γ产生。
图16为HSP70 SBD元件用于结肠癌癌胚抗原RNA疫苗的肿瘤治疗结果。
图17为HSP70 SBD元件用于黑色素瘤相关抗原RNA疫苗ICS检测免疫后IFN-γ产生。
图18为HSP70 SBD元件用于黑色素瘤相关抗原RNA疫苗的肿瘤治疗结果。
具体实施方式
尽管下面详细描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于这里描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文所使用的术语并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求来限制。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列出，但是，应该理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建其他实施方案。各种描述的示例和优选实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选要素相结合的实施方案。此外，除非上下文另有指示，否则应认为本申请的描述中公开了本申请中所描述的所有要素的任何排列和组合。
在整个本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则术语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变体将被理解为暗示包括陈述的成员、整数或步骤，但不排除任何其他未陈述的成员、整数或步骤。术语“由......组成”是术语“包含”的特定实施方案，其中排除了任何其他未陈述的成员、整数或步骤。在本发明的上下文中，术语“包含”涵盖术语“由......组成”。因此，术语“包含”涵盖“包含”以及“由......组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包含其他内容，例如X+Y。
在描述本发明的上下文中，特别是在权利要求的上下文中，要素前不使用数字应被解释为包括单数和复数，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。本文中数值范围的列举仅意图用作分别指代该范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另外指出，否则每个单独的值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独引用一样。说明书中的任何语言都不应解释为表示对实施本发明必不可少的任何未要求保护的要素。
词语“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。在必要时，可以从本发明的定义中省略词语“基本上”。
相对于数值x的术语“约”是指x±10％。
在本发明中，如果没有另外指示，则替代方案和实施方案的不同特征可以彼此组合。
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
实验动物
本发明采用实验动物为C57BL/6小鼠，购买自北京华阜康生物科技股份有限公司，选用6-8周雌鼠，体重18g左右。
实验方法1mRNA脂质纳米颗粒的制备方法
1、配制总浓度为10mM的脂质母液，其中四种脂质的摩尔比例为SM102：DSPC：胆固醇：DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5；
2、配制枸橼酸钠盐缓冲液；pH 4.0
(1)配制100mmol/L枸橼酸钠溶液；(称取14.705g枸橼酸钠粉末溶于500mL MilliQ中)；
(2)配制100mmol/L枸橼酸溶液；(称取10.507g枸橼酸钠粉末溶于500mL MilliQ中)；
(3)将配制好的枸橼酸钠溶液和枸橼酸溶液合并，调至pH4.0；
(4)枸橼酸钠盐缓冲液工作浓度为10mmol/L；用DEPC水稀释10倍，然后用0.22μm滤头过滤；
3、制备mRNA-LNP；
(1)计算出每次小鼠免疫所需的mRNA质量，按照mRNA的质量除以0.09174(脂质母液配方里的氮磷比是确定的，已知mRNA的质量、单个核苷酸的分子量就可以算出mRNA的摩尔量，规定氮磷比为6：1，来计算出其他脂质的摩尔量，根据摩尔两和分子量反推回质量，然后再根据mRNA水相体积：脂质相体积比为3：1，回算浓度)，得出水相的体积(吸取mRNA的体积+枸橼酸钠盐缓冲液)
(2)脂质母液的体积与水相体积之比为1：3
(3)脂质相与水相分别从微流控仪器的左右管道吸取；
脂质相与水相送液流速左右分别为4mL/min和12mL/min；
(5)收集合成的收集液，立即用超纯水稀释10倍；
(6)3000rpm超滤离心，超滤过程中加DEPC水洗一次，继续浓缩至所需的注射体积，注射前10*PBS调等渗。
实施例1HSP70全长元件用于HPV抗原RNA疫苗的效果
采用实验方法1中所述的制备方法制备mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP70)，其中mRNA的编码区从5'端到3'端依次编码信号肽、HPV抗原、HSP70全长元件。所述mRNA的编码区，具有如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列，其中HSP结构区域具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
1、IFN-γ的检测
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为两组(实验组和对照组)。用表达HPV16 E6及HPV16 E7的TC-1细胞(购买自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司，货号iCell-m080)对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
实验组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒(mRNA-HSP70)；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验组和对照组小鼠在免疫结束一周后取脾脏，分离淋巴细胞，将淋巴细胞分为两部分，用于后续IFN-γ的检测。
1.1、ELISpot检测免疫后IFN-γ产生
用终浓度为10μg/mL HPV16 E7抗原肽段(由武汉丹港生物科技有限公司合成)刺激淋巴细胞48小时后，收集细胞培养上清液用于酶联免疫吸附实验，参照ELISpot试剂盒(购买自深圳达科为生物工程有限公司，货号2210005)说明书步骤，检测免疫后IFN-γ产生。
测定结果如图1所示，mRNA-HSP70组可观察到抗原特异性T细胞应答。
1.2、ICS检测免疫后IFN-γ产生
用终浓度为10μg/mL HPV16 E7抗原肽段刺激淋巴细胞6小时后，收集细胞，流式细胞术分析CD8+细胞中IFN-γ产生的水平。
测定结果如图2所示，mRNA-HSP70组可观察到抗原特异性T细胞应答。
2、肿瘤治疗结果
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为两组(实验组和对照组)。用表达HPV16 E6及HPV16 E7的TC-1细胞对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
实验组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP70)；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验期间，每天2次观察动物一般状态，每周3次测量小鼠体重，连续测定30天以上，通过使用卡尺在三个维度测量肿瘤尺寸来监测肿瘤的生长。根据以下公式计算肿瘤体积：
体积(mm3)＝长度(mm)×宽度2(mm)÷2
小鼠肿瘤体积变化如图3所示，mRNA-HSP70组可观察到小鼠肿瘤生长显著抑制。
实施例2HSP70 SBD元件用于HPV抗原RNA疫苗的效果
采用实验方法1中所述的制备方法制备mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP70SBD)，其中mRNA的编码区从5'端到3'端依次编码信号肽、HPV抗原、HSP70 SBD元件。所述mRNA的编码区，具有如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列，其中HSP结构区域具有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
1、IFN-γ的检测
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为两组(实验组和对照组)。用表达HPV16 E6及HPV16 E7的TC-1细胞对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
实验组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP70 SBD)；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验组和对照组小鼠在免疫结束一周后取脾脏，分离淋巴细胞，将淋巴细胞分为两部分，用于后续IFN-γ的检测。
1.1、ELISpot检测免疫后IFN-γ产生
用终浓度为10μg/mL HPV16 E7抗原肽段刺激淋巴细胞48小时后，收集细胞培养上清液用于酶联免疫吸附实验，参照ELISpot试剂盒说明书步骤，检测免疫后IFN-γ产生。
测定结果显示(图4)，mRNA-HSP70 SBD组可观察到抗原特异性T细胞应答。
1.2、ICS检测免疫后IFN-γ产生
用终浓度为10μg/mL HPV16 E7抗原肽段刺激淋巴细胞6小时后，收集细胞，流式细胞术分析CD8+细胞中IFN-γ产生的水平。
测定结果如图5所示，mRNA-HSP70 SBD组可观察到抗原特异性T细胞应答。
2、肿瘤治疗结果
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为两组(实验组和对照组)。用表达HPV16 E6及HPV16 E7的TC-1细胞对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg。)：
实验组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP70 SBD)；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验期间，每天2次观察动物一般状态，每周3次测量小鼠体重，连续测定30天以上，通过使用卡尺在三个维度测量肿瘤尺寸来监测肿瘤的生长。根据以下公式计算肿瘤体积：
体积(mm3)＝长度(mm)×宽度2(mm)÷2
小鼠肿瘤体积变化如图6所示，mRNA-HSP70 SBD组可观察到小鼠肿瘤生长显著抑制。
实施例3HSP110全长元件用于HPV抗原RNA疫苗的效果
采用实验方法1中所述的制备方法制备mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP110)，其中mRNA的编码区从5'端到3'端依次编码信号肽、HPV抗原、HSP110全长元件。所述mRNA的编码区，具有如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列，其中HSP结构区域具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
1、ICS检测免疫后IFN-γ产生
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为两组(实验组和对照组)。用表达HPV16 E6及HPV16 E7的TC-1细胞对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
实验组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP110)；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验组和对照组小鼠在免疫结束一周后取脾脏，分离淋巴细胞，用终浓度为10μg/mL HPV16 E7抗原肽段刺激淋巴细胞6小时后，收集细胞，流式细胞术分析CD8+细胞中IFN-γ产生的水平。
测定结果如图7所示，mRNA-HSP110组可观察到抗原特异性T细胞应答。
2、肿瘤治疗结果
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为两组(实验组和对照组)。用表达HPV16 E6及HPV16 E7的TC-1细胞对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
实验组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP110)；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验期间，每天2次观察动物一般状态，每周3次测量小鼠体重，连续测定30天以上，通过使用卡尺在三个维度测量肿瘤尺寸来监测肿瘤的生长。根据以下公式计算肿瘤体积：
体积(mm3)＝长度(mm)×宽度2(mm)÷2
小鼠肿瘤体积变化如图8所示，mRNA-HSP110组可观察到小鼠肿瘤生长显著抑制。
实施例4HSP110 SBD元件用于HPV抗原RNA疫苗的效果
采用实验方法1中所述的制备方法制备mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP110SBD)，其中mRNA的编码区从5'端到3'端依次编码信号肽、HPV抗原、HSP110 SBD元件。所述mRNA的编码区，具有如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列，其中HSP结构区域具有如SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。
1、ICS检测免疫后IFN-γ产生
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为两组(实验组和对照组)。用表达HPV16 E6及HPV16 E7的TC-1细胞对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
实验组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP110 SBD)；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验组和对照组小鼠在免疫结束一周后取脾脏，分离淋巴细胞，用终浓度为10μg/mL HPV16 E7抗原肽段刺激淋巴细胞6小时后，收集细胞，流式细胞术分析CD8+细胞中IFN-γ产生的水平。
测定结果如图9所示，mRNA-HSP110 SBD组可观察到抗原特异性T细胞应答。
2、肿瘤治疗结果
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为两组(实验组和对照组)。用表达HPV16 E6及HPV16 E7的TC-1细胞对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
实验组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP110 SBD)；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验期间，每天2次观察动物一般状态，每周3次测量小鼠体重，连续测定30天以上，通过使用卡尺在三个维度测量肿瘤尺寸来监测肿瘤的生长。根据以下公式计算肿瘤体积：
体积(mm3)＝长度(mm)×宽度2(mm)÷2
小鼠肿瘤体积变化如图10所示，mRNA-HSP110 SBD组可观察到小鼠肿瘤生长显著抑制。
实施例5HSP70全长元件不同构建顺序用于HPV抗原RNA疫苗
采用实验方法1中所述的制备方法制备mRNA脂质纳米颗粒1-3，mRNA脂质纳米颗粒1-3的信息如下：
mRNA脂质纳米颗粒1的编码区从5'端到3'端依次编码信号肽、HPV抗原、HSP70全长元件，具有如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列，其中HSP结构区域具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
mRNA脂质纳米颗粒2的编码区从5'端到3'端依次编码信号肽、HSP70全长元件、HPV抗原，具有如SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列，其中HSP结构区域具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
mRNA脂质纳米颗粒3的编码区从5'端到3'端依次编码HSP70全长元件、信号肽、HPV抗原，具有如SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列，其中HSP结构区域具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
1、ICS检测免疫后IFN-γ产生
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为四组(1组、2组、3组和对照组)。用表达HPV16 E6及HPV16 E7的TC-1细胞对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
1组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒1；
2组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒2；
3组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒3；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
1组、2组、3组和对照组小鼠在免疫结束一周后取脾脏，分离淋巴细胞，用终浓度为10μg/mL HPV16 E7抗原肽段刺激淋巴细胞6小时后，收集细胞，流式细胞术分析CD8+细胞中IFN-γ产生的水平。
测定结果如图11所示，疫苗免疫组均可观察到抗原特异性T细胞应答，与对照组相比具有显著性差异。虽然三种疫苗间的免疫应答无统计学差异，但可看出1组的效果最好，依次为2组和3组。
2、肿瘤治疗结果
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为四组(1组、2组、3组和对照组)。用表达HPV16 E6及HPV16 E7的TC-1细胞对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
1组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒1；
2组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒2；
3组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒3；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验期间，每天2次观察动物一般状态，每周3次测量小鼠体重，连续测定30天以上，通过使用卡尺在三个维度测量肿瘤尺寸来监测肿瘤的生长。根据以下公式计算肿瘤体积：
体积(mm3)＝长度(mm)×宽度2(mm)÷2
测定结果如图12所示，3种疫苗免疫组均可观察到小鼠肿瘤生长显著抑制，与对照组相比具有显著性差异。虽然三种疫苗间的肿瘤体积无统计学差异，但可看出1组的效果最好，依次为2组和3组。
实施例6HSP70 SBD元件不同构建顺序用于HPV抗原RNA疫苗
采用实验方法1中所述的制备方法制备mRNA脂质纳米颗粒1-3，mRNA脂质纳米颗粒1-3的信息如下：
mRNA脂质纳米颗粒1的编码区从5'端到3'端依次编码信号肽、HPV抗原、HSP70 SBD元件，具有如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列，其中HSP结构区域具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
mRNA脂质纳米颗粒2的编码区从5'端到3'端依次编码信号肽、HSP70 SBD元件、HPV抗原，具有如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列，其中HSP结构区域具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
mRNA脂质纳米颗粒3的编码区从5'端到3'端依次编码HSP70 SBD、信号肽、HPV抗原，具有如SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列，其中HSP结构区域具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
1、ICS检测免疫后IFN-γ产生
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为四组(1组、2组、3组和对照组)。用表达HPV16 E6及HPV16 E7的TC-1细胞对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
1组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒1；
2组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒2；
3组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒3；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
1组、2组、3组和对照组小鼠在免疫结束一周后取脾脏，分离淋巴细胞，用终浓度为10μg/mL HPV16 E7抗原肽段刺激淋巴细胞6小时后，收集细胞，流式细胞术分析CD8+细胞中IFN-γ产生的水平。
测定结果如图13所示，疫苗免疫组均可观察到抗原特异性T细胞应答，与对照组相比具有显著性差异。虽然三种疫苗间的免疫应答无统计学差异，但可看出1组的效果最好，依次为2组和3组。
2、肿瘤治疗结果
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为四组(1组、2组、3组和对照组)。用表达HPV16 E6及HPV16 E7的TC-1细胞对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
1组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒1；
2组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒2；
3组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒3；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验期间，每天2次观察动物一般状态，每周3次测量小鼠体重，连续测定30天以上，通过使用卡尺在三个维度测量肿瘤尺寸来监测肿瘤的生长。根据以下公式计算肿瘤体积：
体积(mm3)＝长度(mm)×宽度2(mm)÷2
测定结果如图14所示，3种疫苗免疫组均可观察到小鼠肿瘤生长显著抑制，与对照组相比具有显著性差异。虽然三种疫苗间的肿瘤体积无统计学差异，但可看出1组的效果最好，依次为2组和3组。
实施例7HSP70 SBD元件用于结肠癌癌胚抗原RNA疫苗的效果
采用实验方法1中所述的制备方法制备mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP70SBD)，其中mRNA的编码区从5'端到3'端依次编码信号肽、Adpgk新抗原、HSP70 SBD元件。所述mRNA的编码区，具有如SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列，其中HSP结构区域具有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
1、ICS检测免疫后IFN-γ产生
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为两组(实验组和对照组)。用表达Adpgk新抗原的MC38细胞(购买自碧云天，货号C7399)对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
实验组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP70 SBD)；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验组和对照组小鼠在免疫结束一周后取脾脏，分离淋巴细胞，用终浓度为10μg/mL Adpgk新抗原肽ASMTNMELM(由武汉丹港生物科技有限公司合成)刺激淋巴细胞6小时后，收集细胞，流式细胞术分析CD8+细胞中IFN-γ产生的水平。
测定结果如图15所示，mRNA-HSP70 SBD组可观察到抗原特异性T细胞应答。
2、肿瘤治疗结果
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为两组(实验组和对照组)。用表达Adpgk新抗原的MC38细胞对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
实验组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP70 SBD)；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验期间，每天2次观察动物一般状态，每周3次测量小鼠体重，连续测定30天以上，通过使用卡尺在三个维度测量肿瘤尺寸来监测肿瘤的生长。根据以下公式计算肿瘤体积：
体积(mm3)＝长度(mm)×宽度2(mm)÷2
小鼠肿瘤体积变化如图16所示，mRNA-HSP70 SBD组可观察到小鼠肿瘤生长显著抑制。
实施例8HSP70 SBD元件用于黑色素瘤相关抗原RNA疫苗的效果
采用实验方法1中所述的制备方法制备mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP70SBD)，其中mRNA的编码区从5'端到3'端依次编码信号肽、MAGE-1抗原、HSP70 SBD元件。所述mRNA的编码区，具有如SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列，其中HSP结构区域具有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
1、ICS检测免疫后IFN-γ产生
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为两组(实验组和对照组)。用表达MAGE-1抗原的B16-F10细胞(购买自中国科学院细胞库，货号SCSP-5233)对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
实验组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP70 SBD)；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验组和对照组小鼠在免疫结束一周后取脾脏，分离淋巴细胞，用终浓度为10μg/mL MAGE-1抗原肽库(由武汉丹港生物科技有限公司合成)刺激淋巴细胞6小时后，收集细胞，流式细胞术分析CD8+细胞中IFN-γ产生的水平。
测定结果如图17所示，mRNA-HSP70 SBD组可观察到抗原特异性T细胞应答。
2、肿瘤治疗结果
健康C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，随机分为两组(实验组和对照组)。用表达MAGE-1抗原的B16F10细胞对C57BL/6小鼠右侧皮下注射植瘤，每只小鼠100万细胞(体积为50μL PBS)。肿瘤接种后第4、7、13天向实验组和对照组小鼠大腿肌肉注射相应药物(注射量：50μL，含药物5μg)：
实验组注射药物：mRNA脂质纳米颗粒(记为mRNA-HSP70 SBD)；
对照组注射药物：空载脂质纳米颗粒(记为eLNP)。
实验期间，每天2次观察动物一般状态，每周3次测量小鼠体重，连续测定30天以上，通过使用卡尺在三个维度测量肿瘤尺寸来监测肿瘤的生长。根据以下公式计算肿瘤体积：
体积(mm3)＝长度(mm)×宽度2(mm)÷2
小鼠肿瘤体积变化如图18所示，mRNA-HSP70 SBD组可观察到小鼠肿瘤生长显著抑制。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围。应当指出的是，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附要求为准。

Claims (42)

1.一种RNA分子，其特征在于，所述RNA分子的编码区域包括HSP结构区域、SIG结构区域、AN结构区；所述HSP结构区域编码HSP蛋白家族或其变体、片段或衍生物；所述SIG结构区域编码信号肽；所述AN结构区域编码相同或不同的RNA抗原性肽或蛋白质；
所述HSP蛋白家族包括HSP70、HSP110、HSP10、HSP27、HSP40、HSP60、HSP90、HSPE1、HSPB1、HSPB3、gp96或钙网蛋白的全长元件、截短元件或突变形式元件。
2.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述HSP蛋白家族包括HSP70或HSP110的全长元件、截短元件或突变形式元件。
3.根据权利要求2所述的RNA分子，其特征在于，所述HSP蛋白家族为HSP70全长元件、HSP70 SBP元件、HSP110全长元件或HSP110 SBP元件。
4.根据权利要求3所述的RNA分子，其特征在于，所述HSP蛋白家族包括如SEQ ID NO.5-8所示的任一项氨基酸序列或其片段、变体或衍生物。
5.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述HSP结构区域具有如SEQ ID NO.1-4所示的任一项核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述AN结构区域编码一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种相同或不同的抗原性肽或蛋白质。
7.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述RNA抗原性肽或蛋白质包括肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、原生动物抗原、真菌抗原、同种异体抗原或自身抗原。
8.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述肿瘤抗原包括HPV16E6、HPV16 E7、Adpgk或MAGE-1。
9.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述信号肽包括如SEQ ID NO.9-14中任一项所示的氨基酸序列或其片段、变体或衍生物；所述SIG结构区域包括如SEQ IDNO.15-20中任一项所示的核酸序列或其片段、变体或衍生物。
10.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述RNA分子的编码区域具有如下结构：
5'-(SIG)a-(L)b-[(AN)c-(L)d]e-(HSP)m-3'；
或5'-(SIG)a-(L)b-[(HSP)m-(L)d]e-(AN)c-3'；
或5'-(HSP)m-(L)b-[(SIG)a-(L)d]e-(AN)c-3'；
其中，所述L结构区域编码接头序列；所述b、d各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数；所述a、c、e、m各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数。
11.根据权利要求10所述的RNA分子，其特征在于，所述接头为非免疫原性接头，包括如GS、AAA、AGA或SEQ ID NO.21-26中任一项所示的氨基酸序列或其片段、变体或衍生物；所述L结构区域包括如GGCAGC、GCCGCCGCC、GCCGGCGCC或SEQ ID NO.27-32中任一项所示的核酸序列或其片段、变体或衍生物。
12.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述RNA分子的编码区域的核酸序列中G/C含量与相应的野生型RNA分子核酸序列中G/C含量相比增加；
或编码区域的核酸序列中C含量与相应的野生型RNA分子核酸序列中C含量相比增加；
或编码区域的核酸序列中的密码子适应于人类密码子选用，其中密码子适应指数在RNA分子核酸序列中增加或最大化；由RNA分子核酸序列编码的氨基酸序列与由相应的野生型RNA分子核酸序列编码的氨基酸序列相比未改变。
13.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述RNA分子的编码区域具有如SEQID NO.33-42中任一项所示的核酸序列；或根据SEQ ID NO.33-42中任一项所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述RNA分子的编码区域位于5'UTR和3'UTR之间。
15.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述RNA包括mRNA、病毒RNA、复制子RNA或环状RNA。
16.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述RNA包括单顺反子RNA、双顺反子RNA或多顺反子RNA。
17.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述RNA为被修饰的RNA。
18.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述RNA分子包含聚腺嘌呤序列，包含10个至200个、10个至100个、40个至80个或50个至70个腺嘌呤核苷酸。
19.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述RNA分子包含聚胞嘧啶序列，包含10个至200个、10个至100个、20个至70个、20个至60个或10个至40个胞嘧啶核苷酸。
20.根据权利要求1所述的RNA分子，其特征在于，所述RNA分子具有如下结构：
5'CAP-5'UTR-(SIG)a-(L)b-[(AN)c-(L)d]e-(HSP)m-3'UTR-3'Ploy；
或5'CAP-5'UTR-(SIG)a-(L)b-[(AN)c-(L)d]e-(HSP)m-3'UTR-3'Ploy；
或5'CAP-5'UTR-(HSP)m-(L)b-[(SIG)a-(L)d]e-(AN)c-3'UTR-3'Ploy。
21.根据权利要求20所述的RNA分子，其特征在于，所述5'CAP包括m7GpppN、ARCA帽或帽1。
22.根据权利要求21所述的RNA分子，其特征在于，所述5'CAP的氨基酸序列为AG。
23.根据权利要求20所述的RNA分子，其特征在于，所述5'-UTR包括如SEQ ID NO.43-48所示的核酸序列或其片段、变体或衍生物；或根据SEQ ID NO.43-48中任一项所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
24.根据权利要求20所述的RNA分子，其特征在于，所述3'-UTR包括如SEQ ID NO.49-54所示的核酸序列或其片段、变体或衍生物；或根据SEQ ID NO.49-54中任一项所示的核酸序列编码的相应的氨基酸序列。
25.根据权利要求20所述的RNA分子，其特征在于，所述3'Ploy包括聚腺嘌呤尾或聚胞嘧啶尾。
26.根据权利要求25所述的RNA分子，其特征在于，所述聚腺嘌呤尾包括由10个至1000个、10个至500个、10个至300个、10个至200个、10个至100个、40个至80个或50个至70个腺嘌呤核苷酸组成。
27.根据权利要求26所述的RNA分子，其特征在于，所述聚胞嘧啶尾包括由10个至200个、10个至100个、20个至70个、20个至60个或10个至40个胞嘧啶核苷酸组成。
28.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1-27任一项中所述的RNA分子及其药学上可接受的载体或赋形剂。
29.根据权利要求28所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子与一种或多种阳离子化合物或聚阳离子化合物复合。
30.根据权利要求29所述的组合物，其特征在于，所述阳离子化合物包括阳离子聚合物、阳离子肽或蛋白质、阳离子多糖或阳离子脂质；所述聚阳离子化合物包括聚阳离子聚合物、聚阳离子肽或蛋白质聚阳离子多糖或聚阳离子脂质。
31.根据权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子与一种或多种阳离子脂质或聚阳离子脂质复合，形成脂质纳米颗粒、脂质复合体或脂质体。
32.根据权利要求29所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子与阳离子化合物或聚阳离子化合物的N/P比包括0.1-10：1。
33.根据权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子与阳离子化合物或聚阳离子化合物的N/P比为6：1。
34.权利要求1-27任一项中所述的RNA分子或权利要求28-33任一项中所述的组合物在制备药物或试剂盒中的应用。
35.根据权利要求34所述的应用，其特征在于，所述应用通过向有需要的对象施用有效剂量的RNA分子或组合物实现。
36.根据权利要求35所述的应用，其特征在于，所述应用包括在制备预防、治疗或诊断肿瘤、癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病、移植物抗宿主病或变态反应中的药物或试剂盒中的应用。
37.根据权利要求34所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗。
38.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1-27任一项中所述的RNA分子或权利要求28-33任一项中所述的组合物。
39.根据权利要求38所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗适用于皮下、皮肤内、皮内、皮内、局部或经皮施用。
40.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-27任一项中所述的RNA分子或权利要求28-33任一项中所述的组合物。
41.根据权利要求40所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括液体载剂或所述RNA分子或组合物的施用和剂量信息的技术说明。
42.一种体外细胞处理方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)在体外提供细胞；
(2)使步骤(1)所述的细胞与权利要求1-27任一项中所述的RNA分子、权利要求28-33任一项中所述的组合物、权利要求38-39任一项中所述的疫苗或权利要求40-41任一项中所述的试剂盒接触。
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