KR102712588B1

KR102712588B1 - 사람 파필로마바이러스의 구조적으로 변형된 키메라 폴리펩타이드 및 그 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 단백질 및 그 단백질의 용도

Info

Publication number: KR102712588B1
Application number: KR1020210059219A
Authority: KR
Inventors: 김수옥; 홍선표; 김석준; 김진; 이상현; 장선옥
Original assignee: (주)진매트릭스
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2024-10-02
Anticipated expiration: 2041-05-07
Also published as: KR20210145672A

Abstract

본 발명은 사람 파필로마바이러스 고위험군 유형 16의 발암 형성 유발 단백질인 E6, E7의 유전자 변형 및 면역원성 증가를 위한 융합단백질을 융합하여 자궁경부암 치료 효과가 있는 키메라 재조합 단백질에 관한 것으로, 본 발명에서 플라젤린의 융합단백질과 융합시킨 HPV 16형 E6, E7 키메라 재조합 단백질을 주입하였을때, 종양세포의 부피가 가장 낮게 나타났으며 재조합 항원에 따른 특이적 T 세포의 면역반응이 유의적으로 확인되었다. 또한, 플라젤린의 융합단백질과 융합시킨 HPV 16형 E6, E7 키메라 재조합 단백질의 예방 효과를 측정하였을 때, 종양세포의 부피가 낮게 나타났으며, 항체 역가가 증가하는 것이 확인되었다. 이렇게 조제된 사람 파필로마바이러스 재조합항원은 종양 치료 및 예방효과를 보이며 치료/예방 백신 조성물로 적용 가능하다.

Description

사람 파필로마바이러스의 구조적으로 변형된 키메라 폴리펩타이드 및 그 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 단백질 및 그 단백질의 용도{A STRUCTURALLY MODIFIED CHIMERIC POLYPEPTIDE OF HPV, A RECOMBINANT PROTEIN COMPRISING THE SAME AND USE OF THE SAME}

본 발명은 사람 파필로마바이러스 (Human papillomavirus, HPV) 단백질을 변형시킨 키메라 폴리펩타이드, 그 폴리펩타이드를 융합 단백질과 결합시킨 재조합 단백질과 그 재조합 단백질을 이용한 자궁경부암을 포함하는 치료용 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는, 사람 파필로마바이러스의 고위험군 유형 16의 E6, E7 재조합 단백질의 발현양과 용해도를 증가시키도록 3차구조적 변형한 키메라 재조합 단백질과 면역원성 증가를 위한 융합 단백질을 포함시켜 HPV 타입 16 특이적 면역반응을 유도하여 HPV에 의한 자궁경부암 치료/예방 백신의 가능성을 제시한다.

암은 세계적인 사망 원인이며 (I. Abubakar 등, Lancet, 385:117-171, 2015), 사람 파필로마바이러스(HPV) 관련 암이 모든 인간 암의 5%를 차지하는 것으로 추정된다 (C. de Martel 등, Lancet Oncol, 13:607-615, 2012; C. de Martel 등, Int. J. Cancer, 2017). HPV는 1970 년대 Zur Hansen 그룹에 의해 자궁 경부암의 주된 원인으로 밝혀졌고 (Zur Hausen H., Curr Top Microbiol Immunol, 78:1-30, 1977), 여성에서 4번째로 흔한 암으로 매년 약 528,000건이 발생하며, 266,000명이 사망하였다 (J. Ferlay 등, Int. J. Cancer, 136:E359-E386, 2015).

HPV는 약 170가지의 HPV 유전자형이 있으며, 크게 고위험군(high risk, hr) 과 저위험군으로 두가지로 분류된다. 생식기 사마귀를 유발하는 저위험군에는 HPV-6/11/40/42/43/44/54/61 및 72 유형이 있으며, 고위험군 유형에는 HPV-16/18/31/35/39/45/51/52/56/58/66 및 68을 포함하며, 고위험 유형은 자궁 경부암의 99.7% 정도의 원인이 된다 (E.-M. de Villiers 등, Virology, 445:2-10, 2013; D.M. Parkin 등, Vaccine, 24:S11-S25, 2006; H. zur Hausen 등, Nat. Rev. Cancer, 2:342-350, 2002).

특히 HPV-16과 18 유형은 전 세계 자궁 경부암과 관련된 가장 보편적인 유형으로, 발병의 70% 이상을 차지한다. HPV는 또한 많은 음경, 외음부 및 항문 관련 암종의 원인이 되며 구강인두암의 40% 이상을 차지하기도 한다 (C.A. Moody 등, Nat. Rev. Cancer, 10:550, 2010; J.M. Walboomers 등, J. Pathol, 189:12-19, 1999).

이러한 고위험군 HPV에 의한 지속적인 감염은 편평 상피내 병변 (Squamous intraepithelial lesion, SIL)의 발생을 초래한다. 이는 자궁 경부에서는 자궁 경부 상피내 종양 (Cervical intraepithelial neoplasia, CIN), 외음부에서는 외음부 상피내 신 종양 (Vulva intraepithelial neoplasia, VIN)이라 하며, 이러한 SIL은 악성 암으로 진행 될 수 있다 (H. zur Hausen 등, Nat. Rev. Cancer, 2:342-350, 2002).

HPV는 외피가 없으며 유전체 크기가 약 8kb인 이중 가닥 DNA로 이루어진 바이러스로(E.M. de Villiers 등, Virology, 324:17-27, 2004)유전체는 6개의 초기 조절 단백질 (E1, E2, E4, E5, E6 및 E7)과 2개의 후기 구조 단백질 (L1 및 L2)를 암호화한다. 초기 유전자는 바이러스 DNA 복제, 전사 및 발암성 형질 전환과 관련이 있는 단백질을 암호화하고, 후기 유전자는 바이러스 캡시드 단백질을 암호화한다 (M.H. Brentjens 등, Dermatol. Clin, 20:315-331, 2002; K. Munger 등, Virus Res, 89:213-228, 2002). 일반적인 고위험군 HPV 암 형성 과정에서, 바이러스의 유전체가 숙주의 염색체 DNA에 통합(integration)되고 E2 유전서열은 유전자의 선형화(Linearization) 동안 파괴된다. E2 단백질은 E6 및 E7의 전사 억제 인자이기 때문에 E2가 파괴되면 E6 및 E7 단백질의 발현이 시작된다. E6 단백질은 숙주의 세포자연사를 조절하는 단백질 p53의 분해를 촉진하고, telomerase를 활성화시켜 세포의 수명을 연장 시킨다. 또한 E7 단백질은 종양 억제 단백질인 망막아세포종 단백질(pRb)을 표적으로 하여 이 단백질을 분해시킨다. 이렇듯 E6 및 E7은 세포주기 조절을 방해하고 숙주세포의 수명을 연장시켜, 유전적 불안정성과 세포의 악성 형질 전환 및 암을 발병 시킨다 (H. zur Hausen 등, Nat. Rev. Cancer, 2:342-350, 2002; Hancock G 등, Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 47:59-72, 2018).

현재, 시중 상용화된 HPV 예방 백신은 3가지로, 2가 (HPV-16/18) 백신인 Cervarix®, 4가 (HPV-6/11/16/18) 백신 Gardasil®및 9가 (HPV-6/11/16/18/31/33/45/52/58) 백신인 Gardasil®이 있다. 이러한 백신은 HPV L1 단백질이 발현되어 형태학적 및 항원적으로 일반적 바이러스와 매우 유사한 바이러스 유사 입자 (VLP)를 형성 할 수 있다는 사실을 이용한다 (R. Kirnbauer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:12180-12184, 1992).

이 세 가지 백신은 바이러스 입자에 결합하고 숙주 세포로의 유입을 차단하는 중화 항체의 생성을 유도함으로써 표적 유형에 의해 유발된 HPV 감염을 효과적으로 예방한다 (D.M. Harper 등, Lancet, 364:1757-1765, 2004; E.A. Joura 등, N. Engl. J. Med, 372:711-723, 2015; L.L. Villa 등, Lancet Oncol, 6:271-278, 2005).

그러나, 이러한 백신의 항원인 L1 캡시드 단백질은 이미 감염된 기저 상피 세포에서 발현되지 않기 때문에, 이들 백신은 기존의 감염을 제거하는데 효과적이지 않다 (A. Hildesheim 등, Am. J. Obstet. Gynecol, 215:212.e1-212.e15, 2016; A. Hildesheim 등, JAMA, 298:743-753, 2007; C.-F. Hung 등, Expert Opin. Biol. Ther, 8:421-439, 2008).

그렇기 때문에 이미 HPV에 감염이 된 사람은 이러한 백신의 효과를 받을 수 없게 된다. 또한 개발 도상국에서는 효율적인 예방 접종 및 선별 프로그램을 시행 할 수 있는 자원이 부족하여 HPV 감염 및 악성 종양의 가장 큰 문제점을 가지고 있다 (D.M. Parkin 등, Vaccine, 24:S11-S25, 2006). 또한, 이 백신의 비용이 높아 저소득층에서는 백신 접종이 이루어지지 않으며, 전 세계 76 개국 및 지역에서 HPV 예방 접종 프로그램이 시행되었지만 중, 저소득 국가에서는 여성 중 단 1%만이 이러한 프로그램에 의해 접종이 이루어진다 (L. Bruni 등, Lancet Glob. Health, 4:e453-e463, 2016). 따라서, 발암성 HPV 유형을 광범위하게 표적화하고 저렴한 치료 백신이 필요한 시점이다.

HPV 치료 백신에서는 체액성 면역 반응보다는 세포성 면역에서의 감염 제거가 중요하다. HPV E6, E7 종양 단백질은 악성 종양의 발병 및 유지에 필수적이며, 전 악성 및 침습성 병변에서 발현되지만 건강한 세포에는 존재하지 않는다 (Hancock G 등, Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 47:59-72, 2018).

따라서 이러한 종양 단백질 (E6, E7)은 돌연변이에 의한 면역 반응을 피할 수 없으며, HPV 감염 및 병변에 대한 치료 백신의 개발의 가장 이상적인 타겟이다 (H. zur Hausen 등, Nat. Rev. Cancer, 2:342-350, 2002; K. Lin 등, J. Formos. Med. Assoc, 109:4-24, 2010; M.P. Morrow 등, Expert Rev. Vaccin, 12:271-283, 2013). 이상적인 치료 백신은 E6, E7 단백질을 표적화하여 강한 종양 특이적 T세포 유형 1 및 세포 독성 림프구 (cytotoxic T lymphocyte, CTL) 반응을 유도하여 감염 및 악성 세포를 사멸시킬 수 있다 (S.H. van der Burg 등, Curr. Opin. Immunol, 23:252-257, 2011).

현재 인간에게 사용하도록 승인 된 HPV 치료 백신은 없으며, 임상 시험을 하고 있는 다양한 형태의 백신 후보 물질에 대한 광범위한 연구가 진행 중이다 (P. Vici 등, Expert Rev. Vaccin, 15:1327-1336, 2016; A. Yang 등, J. Biomed. Sci, 23:75, 2016; H.J. Kim 등, Arch. Pharm. Res, 1-14, 2017).

HPV 치료 백신은 생 벡터, 핵산, 단백질, 전 세포 (live vector, nucleic acid, protein, whole cell) 등을 이용하는 다양한 방법으로 개발 되고 있다. 이러한 방법 중 서브유닛백신 플랫폼을 이용한 백신은 펩티드 또는 전체 단백질 형태로 전달되는 항원을 사용함으로써 숙주 세포에 일시적으로 존재하여 독성 가능성을 감소시키기 때문에 살아있는 벡터 백신보다 더 안전한 것으로 간주된다 (A. Chabeda 등, Papillomavirus Res, 5:46-58, 2018).

이 중 단백질 기반 백신은 안전성, 대규모 생산성 및 안정성의 이점이 있으며(Hung C-F 등, Immunol Rev, 222:43-69, 2008), 펩티드 기반 백신과 달리 모든 항원에 대한 HLA 항원결정부위를 함유하므로 MHC 제한되지 않는 장점을 가진다. 그러나, 이들은 낮은 면역원성을 나타내고 MHCI 보다 우선적으로 MHCII 복합체로의 제시를 통한 T세포 반응으로 항체 반응을 촉진시킨다 (J.H. Su 등, BioDrugs, 24:109-129, 2010).

따라서 면역원성 및 MHCI 경로에 대한 제시 및 CD8+ T 세포의 활성화를 증가시키기 위해서는 항원을 수지상 세포 (DC)에 표적화할 수 있어야 한다. 이를 위해 단백질 기반 백신에서는 융합 단백질의 생성하거나 면역보조제를 첨가하여 개발하여야 한다 (K. Lin 등, J. Formos. Med. Assoc, 109:4-24. 2010; J. Banchereau 등, Nature, 392:245-252, 1998).

이와 같은 치료 단백질 백신의 효능을 시험하는 여러 임상 시험이 진행 중이며, 단백질 백신의 면역원성 및 CD8+ T세포 반응을 향상 시키는 것이 가장 중요한 관점으로 보여진다 (P. Vici 등, Expert Rev. Vaccin, 15:1327-1336, 2016; A. Yang 등, J. Biomed. Sci, 23:75, 2016).

단백질 기반 백신은 안전성, 생산성, 안정성에 대한 장점이 있지만, 낮은 면역원성과 우선적인 MHCII 복합체로의 제시로 인하여 세포 독성 T림프구 (Cytotoxic T lymphocyte, CTL)보다 항체반응을 우선적으로 한다.

따라서 면역원성을 증가시키기 위한 융합 단백질 및 면역보조제를 사용하여 개발하여야 한다. 면역원성을 증가시키기 위한 융합 단백질로는 Fms-like tyrosine kinase-3 ligand (Flt3L), N domain of calreticulin (NCRT), Heat shock protein, adenylate cyclase (CyaA), 유비퀴틴(Ubiquitine), 플라젤린(Flagellin), 콜레라 톡신(Cholera toxin) 등 여러 가지 단백질이 존재한다.

이 중, 유비퀴틴은 여러 연구에서 단백질의 N-말단에 유비퀴틴의 융합시킴으로써 proteasome 분해를 증가 시켜 MHC-1 항원 제시를 향상시키는 것으로 나타났으며 (Papagatsias, T 등, Retrovirology, 6(Suppl3):P303, 2009; Rodriguez, F 등, Journal of Virology, 72:5174-5181, 1998; Setz, C 등, PLoS ONE, 8, e55567, 2013, Zhang, M 등, Immunology, 112:567-574, 2004),

콜레라 톡신은 면역 보조제 특성이 여러 연구에서 기술되었고, 장내 상피의 투과성을 증가시킴으로써 공동 투여된 항원의 흡수를 향상시키며, APC (antigen presenting cell, APC)에 의해 항원의 제시를 향상시키도록 유도 해주며, B 세포에서의 IgA의 형성을 증가시켜준다고 알려져 있다 (Sanchez J 등, Indian J Med Res, 133:153-163, 2011).

또한, 플라젤린은 주로 그람 음성 박테리아와 관련된 편모의 구조적 구성 요소로 가변 영역 (D2, D3)과 아미노 말단 (N-) 및 카르복시 (C-) 말단 보존적인 영역 (D0 및 D1 도메인)을 가지고 있다 (Yuan Lu 등, Sci Rep, 6:18379, 2016; Molly A.B 등, Infect Immun, 11:7226-35, 2005).

플라젤린은 염증성 및 선천성 면역 활성과 관련있는 TLR 5 (Toll-like receptor, TLR5) 수용체의 작용제 (Agonist)로 여러 연구에서 확인되었다 (Hayashi F 등, Blood, 102: 2660-2669, 2003). 또한 면역보조제로서 플라젤린의 융합은 안전하고 잠재력을 있는 백신 생산 가능성이 있으며, 일부 백신에서 임상 시험이 진행 중이다 (Liu G 등, PLoS ONE, 6:e20928, 2011; Taylor DN 등, Vaccine, 29: 4897-4902, 2011). John T 등의 연구에서, 플라젤린의 융합 항원의 프로세싱을 촉진함으로써 항원결정부위 특이적 CD8+ T 세포 반응을 유도한다고 하였으며 (John T, Bates　J Immunol,　186:6255-62,　2011), 또한, 선천성 면역계의 활성화는 몇몇 실험 동물 모델에서 생체 내 종양 성장에 대한 다양한 효과를 유도 할 수 있음이 입증되었다 (Burdelya LG 등, Science 320(5873):226-30, 2008; Rhee SH 등, Gastroenterology, 135(2):518-28, 2008; Sfondrini L 등, J Immunol, 176(11):6624-30, 2006; Cai Z 등, Cancer Res, 71(7):2466-75, 2011).

Salmonella enterica 균은 편모 상 변이로 알려진 과정에서 두 개의 유전자가 편모의 항원을 암호화하며, 다른 편모 필라멘트 단백질인 FliC (phase 1 항원) 및 FljB (phase 2 항원)를 교대로 발현한다 (Andrewes F.W, J. Pathol. Bacteriol, 25:1509-1514, 1922; Zieg, J 등, Science 196:170-172, 1977). FliC 및 FljB 플라젤린 단백질은 처음 71개의 아미노산과 마지막 46개의 아미노산은 동일하지만, 중간에 노출된 아미노산은 서로 다르며 각각의 구분된 항원성을 가진다 (Namba, K, Genes Cells, 6:1-12, 2001). Hayashi F 그룹에서는 살모넬라 FliC 단백질을 포함한 박테리아 플라젤린 단백질에 의한 TLR5 톨-유사 수용체의 자극함으로써, 핵 인자 NF-κB의 동원 및 종양괴사인자알파 (tumor necrosis factor alpha) 생성의 자극을 초래 함을 보여 주었다 (Hayashi, F 등, Nature, 410:1099-1103, 2001). 또한, 살모넬라 감염에 반응하여 생성 된 대부분의 살모넬라 특이적 CD4+ T 림프구는 플라젤린 에피토프에 의해 나타나는 것을 보였다 (Cookson, B.T 등, J. Immunol, 158:4310-4319, 1997).

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허공개번호 제1020200022467호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 개발 되었으며, 본 발명의 목적은 HPV에 의해 야기되는 질병을 치료/예방하기 위해서 고위험군 HPV 16 유형의 E6, E7의 3차구조 변형 및 융합단백질을 포함한 면역원성이 증강된 키메라 폴리펩타이드 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 단백질을 발현하는 재조합 벡터, 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용한 재조합 단백질의 가용화를 포함한 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 발명하기 위해서 본 발명은 사람 파필로마바이러스 유형 16형 유래의 E6 단백질의 1번부터 155번, E7 단백질의 아미노산 1번부터 37번, 및 E7 단백질의 아미노산 33번부터 98번 잔기를 포함하며, 여기서 상기 E6 단백질은 54번, 및 57번의 잔기에 치환돌연변이를 가지며, 상기 E7 단백질은 2번, 24번, 80번, 및 81번 잔기의 치환돌연변이를 가지는 E6 및 E7의 구조가 변형된 키메라 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키메라 폴리펩타이드는 E6 단백질의 54번 아미노산이 페닐알라닌에서 아르기닌으로 치환되고, 57번 아미노산은 루신에서 글라이신으로 치환된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 키메라 폴리펩타이드는 상기 E7 단백질의 2번 아미노산이 히스티딘에서 프롤린으로 치환되고, 24번 아미노산이 시스틴에서 글라이신으로 치환되고, 80번 아미노산이 글루타메이트에서 아르기닌으로 치환되고 81번 아미노산이 아스파테이드에서 아르기닌으로 치환된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 E6 및 E7의 구조가 변형된 키메라 폴리펩타이드는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 해당 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 통하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 키메라 폴리펩타이드 및 상기 키메라 폴리펩타이드의 면역증강을 위한 단백질을 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역 증강을 위한 단백질은 유비퀴틴 (Ubiquitin), 플라젤린 (Flagellin), 콜레라 톡신 A1B (Cholera toxin A1B)의 군으로부터 선택된 것이 바람직하고,

상기 플라젤린 단백질은 1번부터 143번의 아미노산 잔기와 409번부터 495번의 아미노산 잔기를 포함하는 것이 더욱 바람직하며,

상기 콜레라 톡신 A1B는 A1 서브유닛의 19에서 212번 아미노산 잔기와 B 서브유닛의 22에서 124번 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 A1 서브유닛의 81번, 124번, 130번 잔기의 치환돌연변이를 가지는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 재조합 단백질은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 해당 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 통하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 키메라 폴리펩타이드 및 상기 키메라 폴리펩타이드의 면역증강을 위한 단백질을 포함하는 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환된 세포를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환 세포를 이용하여 재조합 단백질을 포함하는 단백질을 발현하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 본 발명의 방법에 의하여 생성된 불용성 펠렛(pellet)의 가용화 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 본 발명의 방법에 의해 얻어진 재조합 단백질을 동물모델에서 항원으로 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 단백질을 사용하여 마우스 종양세포 치료의 효능을 제공한다.

본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 항원에 따른 특이적 T 세포의 면역반응에 대한 효능을 제공한다.

본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 단백질을 사용하여 마우스 종양세포 예방의 효능을 제공한다.

본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 항원에 따른 예방 효과에 의한 항체 역가를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 키메라 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질을 포함하는 사람 파필로마바이러스 관련 질병의 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 사람 파필로마바이러스 관련 질병은 자궁경부암 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에 따른 다른 면역원성 조성물은 체액성 면역 반응을 유발할 수 있는 조성물이다.

면역 반응을 유발하는 본 발명의 면역원성 조성물의 능력을 향상시키기 위하여, 활성 성분을 보조제 및/또는 계면 활성제 및/또는 (시토카인 또는 케모카인과 같은)면역 조절 물질과 혼합하는 것이 바람직하다.

보조제는 예를 들어 일반적으로 수상을 가진 에멀젼 형태로 사용되는 프로인트(Freund)형 보조제와 같은 유상의 리포솜, 또는 수산화알루미늄, 황산아연, 콜로이드성 수산화철, 인산칼슘 또는 염화칼슘과 같은 불수용성 무기염을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 면역원성 조성물은 바람직하게는 특히 면역 요법을 위해, 숙주에서 면역 반응을 준비시키거나 및/또는 증가시킴으로써 그 면역 반응을 유발하기 위해 사용된다. 특히, 본 발명의 면역원성 조성물은 숙주의 HPV 감염으로 인한 악성 혈질 전환의 개시 또는 유지에 대한 예방 또는 HPV 감염, 특히 HPV-16 또는 HPV-18 감염으로 인한 악성 형질 전환에 걸린 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.

이러한 면역치료 조성물은 숙주에서 종양을 유발하는 제어되지 않은 세포 증식 치료를 위해, 특히 HPV 감염과 연관된 자궁암 면역요법을 위한 암 면역 요법을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역치료 조성물은 종양 상태를 포함하여 종양 바이러스 감염으로 인한 악성 상태의 치료를 위해 특히 적절한 치료 백신의 개발을 위한 수단을 제공한다.

본 발명에서, "치료"와 같은 용어는 치료를 받은 환자에게 유익한 효과를 초래하는 본 발명에 서 개시된 단백질의 효과를 포함하며, 이러한 효과는 치료의 결과로서 환자 상태의 개선 또는 완화 상태, 또는 건강 상태의 회복을 포함하여 세포 수준에서 관찰되거나 또는 임상 수준에서 관찰된다. 치료되는 악성 상태가 제어되지 않은 세포 증식 또는 종양 발생 또는 지속일 때, 유익한 효과는 안정화 또는 바람직하게는 제어되지 않은 종양의 증식 방지, 멈춤 또는 반전 또는 종양의 퇴화를 포함할 수 있다.

상기한 것처럼 악성 상태를 치료하기 위한 조성물은 바람직하게는 재조합 단백질 약 1 내지 약 1000 ㎍, 바람직하게는 약 10 내지 약 500 ㎍ 분량인 활성 성분 투여량을 포함할 수 있다. 그 조성물이 활성 성분으로서 본 발명의 재조합 단백질을 포함할 때, 투여량은 재조합 단백질 약 10 내지 약 100 ㎍, 바람직하게는 약 50㎍을 포함할 수 있다.

치료될 환자의 상태에 따라, 조성물은 증상의 수준에서 국지적으로 한 번 또는 여러 번, 예를 들어 몇 일 간격, 예를 들어 5 내지 10일 간격으로 일정하게 투여될 수 있다. 또는, 그 조성물은 온몸 전체에 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 세포 매개 면역 반응 및/또는 체액성 반응을 포함하여 면역 반응을 유발하기 위하여 특히 포유류 숙주, 바람직하게는 인간에게 투여하기 위해 제제된, 상기한 재조합 단백질 또는 상기한 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 적절하다면 약제학적으로 수용할 수 있는 매개체를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 HPV 감염을 예방하거나 치료하기 위해, 본 발명의 재조합 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터, 및 약제학적으로 수용할 수 있는 매개체를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다.

다른 실시 형태에 따르면, 약제 조성물은 숙주에서 HPV 감염으로 인한 악성형질 전환의 개시 또는 유지의 예방 또는 치료하기 위해, 본 발명에 따른 재조합 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터, 및 약제학적으로 수용할 수 있는 매개체를 포함한다.

본 발명의 상기 “예방”은 본 발명의 상기 조성물을 이용하여 암에 기인한 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시킬 수 있는 모든 행위라면 제한없이 포함될 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 키메라 재조합 단백질을 이용한 것으로, 사람 파필로마바이러스의 유형 16의 항암유발 E6, E7을 면역항원으로 사용하며, 이의 면역원성 증가를 위한 유비퀴틴, 플라젤린, 콜레라 톡신A1B 의 융합 단백질을 이용함으로써 키메라 재조합 항원을 제공한다.

본 발명은 사람 파필로마바이러스 16 유형 유래의 종양 단백질인 E6, E7의 아미노산이 치환, 결실된 선형(Linear; E6E7) 및 키메라 (Chimeric; NE7-E6-CE7) 형태의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

상기 키메라 펩타이드의 경우 E6, E7단백질의 선형 형태와는 다른 키메라(chimeric; E7NE6E7C) 형태로, E7의 아미노 말단 영역 (N-terminal domain; CR1, CR2)의 구조적인 불안정성과 카복시 말단 영역 (C-terminal domain, CR3)을 고려함과 동시에 MHC I (Major Histocompatibility Complex I) 분자에 항원결정기 (epitope)를 제시하고자 하였다 (Karosiene, E 등, Immunogenetics, 64:177-186, 2012). 또한, MHC분자와의 결합력 예측, 외부서열이 아닌 E6, E7단백질의 자체 서열을 이용한 연결 (internal linker)을 통하여 세포성 면역반응에 대한 E6E7 접합부위의 영향을 최소화화였으며, 재조합 E6E7 단백질이 가진 발암유도 능력을 제거하기 위해, 연구된 HPV의 E6 및 E7의 3차 구조를 통하여 단백질의 안정성과 용해도와 같은 물리, 화학적 측면에서 이로운 잔기를 선별하여 변이를 유도하였다.

또한, 키메라 폴리펩타이드의 구조예측을 통하여 치료백신 단백질 제제의 구조를 이루는 핵심 아미노산의 수용성 환경에의 노출여부 등 생산과정에서의 안정성을 확인하였다 (Drozdetskiy, A 등, Nucleic Acids Res, 43:W389-W394, 2015)

“키메라 단백질”또는 "키메라 폴리펩타이드"란 일반적으로 복수의 단백질 성분으로 구성된 단백질을 말하며, 각각 아미노 말단 (N 말단) 및 카르복시 말단 (C 말단)의 결합을 통해 연결된 연속의 폴리펩타이드를 의미한다.

본 발명에서는 상기 파필로마바이러스 16 유형 유래의 종양단백질 E6, E7 폴리펩타이드에서 아미노 말단 E7 폴리펩타이드와 카르복시 말단 E7 폴리펩타이드 사이에 E6 폴리펩타이드가 포함된 것을 키메라 단백질 또는 폴리펩타이드(Chimeric; NE7-E6-CE7)라 한다.

본 발명은 상기 융합 단백질 중 플라젤린의 가변성영역(D2, D3)을 제외하고, 아미노 말단 도메인 (아미노산 1번부터 143번)과 카르복시 말단 도메인 (아미노산 409번부터 495번)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 발명된 융합단백질 플라젤린의 아미노 말단 도메인과 카르복시 말단 도메인 사이에 키메라 단백질이 위치한 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 재조합 단백질의 발현 벡터에 있어서, 상용화된 벡터인 pET-28a 벡터를 사용하였으며 구체적인 설명은 생략한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합벡터를 형질전환 하기 위한 대장균세포를 제공한다. 본 발명에 있어서 숙주세포로 사용하는 세포는 원핵세포인 대장균이 바람직하며, 본 발명에서의 재조합 벡터의 발현을 위한 BL21(DE3) 균주를 사용하였으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 형질전환된 대장균 세포의 과발현 유도 시, O.D₆₀₀은 0.5-0.6이였으며, IPTG 농도 1mM, 유도 후 발현 시간은 4시간으로 하는 것이 바람직하였다.

본 발명은 상기 재조합 단백질의 발현이 불용성 펠렛에서 확인되었고, 수득한 균체에서 세포파쇄용액 버그버스터(Novagen) 사용하여 불용성 펠렛을 분리하였다. 상기 불용성 펠렛은 8M 우레아, 트리스, 소듐클로라이드, GSH, GSSG의 변성용액을 사용하여 단백질 변성 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 가용화 된 재조합 단백질을 프로본드 니켈 레진을 사용하여 결합한 뒤, 우레아가 첨가된 정제 완충용액을 이용하여 pH별로 타깃 단백질을 수득하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 수득한 변성 상태의 단백질의 가용화 조건을 설정하고 그 48종의 조성물을 제공한다.

본 발명의 실시예에서 재조합 단백질의 가용화 조성물은 Tris-HCl pH8.5 버퍼와 0.5M Arginine이 포함 된 조성물에서 적합함을 확인하였으나 이에 한정하지 않는다.

본 발명은 상기 방법으로 생산된 사람 파필로마바이러스와 융합단백질이 융합된 키메라 재조합 단백질을 항원으로 제공한다.

본 발명은 상기 방법으로 생산된 총 8종의 재조합 단백질 항원은 마우스 종양세포 치료의 효능을 제공한다.

본 발명에서 사람 파필로마바이러스에 의한 자궁경부암 치료 효과의 효능을 확인 하기 위하여, TC-1 종양세포와 생산된 재조합 항원을 주입하였다. 본 발명의 실시예에 따르면 재조합 항원 주입 후 종양부피를 측정함으로써 치료효능을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 플라젤린이 융합된 HPV 유형 16 키메라 E6, E7 (NE7-E6-CE7)의 재조합 항원에서 대조군에 비하여 종양부피에 대한 치료 효능을 확인하였다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 생산된 총 8총의 재조합 항원에 대한 특이적 T 세포의 면역반응에 대한 효능을 제공한다.

본 발명에서 생산된 항원의 특이적 T 세포의 면역반응 효능을 확인하고자 ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot, ELISPOT) 실험 기법을 사용하였다. 본 발명에서 종양세포와 항원이 주입된 마우스 비장세포를 분리하여 각 항원에 대한 면역반응을 확인하였다. 그 결과, 상기 종양세포 치료 효능 검증 결과와 같이 플라젤린이 융합된 HPV 유형 16 키메라 E6, E7 (NE7-E6-CE7)의 재조합 항원에서 항원에 대한 면역반응이 유도되는 것으로 사료된다.

본 발명은 상기 방법으로 생산된 총 8종의 재조합 단백질에서 가장 우수한 치료 효과가 확인된 2종의 항원에 대한 마우스 종양세포 예방 효능을 제공한다. 본 발명에서 사람 파필로마바이러스에 의한 자궁경부암 예방 효과를 확인 하기 위하여, 생산된 재조합 항원과 TC-1 종양세포를 주입하였다. 본 발명에서 재조합 항원을 주입한 뒤 종양세포를 주입하여 암 발생에 대한 예방 효과를 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 플라젤린이 융합된 HPV 유형 16 키메라 E6, E7 (NE7-E6-CE7)의 재조합 항원의 다양한 농도에서 대조군에 비하여 종양부피에 대한 예방 효과를 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 총 8종의 재조합 항원 중 치료 효능이 가장 높은 2종의 항원에 대한 항체 역가를 제공한다.

본 발명에서 생산된 총 8종의 재조합 항원 중 2종의 항원에 대한 항체 역가를 확인하고자 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 실험법을 사용하였다. 마우스에 총 2회의 항원을 주입하고 혈청을 분리하여 각 항원에 대한 항체가를 확인하였다. 그 결과, 플라젤린이 융합된 HPV 유형 16 키메라 E6, E7 (NE7-E6-CE7)의 재조합 항원에서 항체 역가가 크게 유도되는 것을 확인하였다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 HPV 16 유형의 발암 형성 유발 단백질인 E6, E7 과 융합 단백질을 융합하여 면역원성을 증가시키는 항원을 생산할 수 있다. 본 발명에서 개발한 3차 구조를 변형시킨 HPV 16 유형의 E6, E7 키메라 형태의 항원을 통해 선형 형태 구조 보다 재조합 단백질 생산에서 더 높은 발현양을 나타내었고, 가용화의 단계에서도 구조적으로 더 안정적인 특성을 나타내었다. 또한, 면역원성 증가를 위해 융합 단백질 후보 3종을 융합하여 재조합 단백질 항원 총 8가지를 마우스에서의 종양 치료 및 예방 효과를 보기 위해 종양세포와 항원을 주입하여 종양부피를 측정하고, 재조합 항원에 따른 특이적 T 세포의 면역반응과 항체 역가를 검증함에 따라 HPV의 서브유닛 재조합 치료/예방 백신으로 적용 가능할 것으로 사료된다.

도 1은 HPV16 E6, E7 단백질을 암호화하는 유전자 변형 위치를 나타낸 모식도이다. A는 HPV16 유형의 발암 유발 단백질인 E6, E7이 선형 형태 구조의 모식도이고, B는 E6, E7 단백질이 키메라 형태의 구조를 가진 모식도이다.
도 2은 HPV16 E6, E7 단백질과 융합단백질(Fusion protein) 후보 3가지(유비퀴틴, 플라젤린, 콜레라 톡신A1B)의 융합 위치를 나타낸 모식도이다.
도 3는 E6, E7 단백질과 플라젤린 융합단백질의 발현 벡터 구조를 나타낸 모식도이다.
도 4는 쿠마시 블루염색법을 이용하여 HPV16-E6E7 선형 또는 HPV16-NE7-E6-CE7 키메라 및 융합단백질 또는 비융합단백질의 크기를 확인한 결과이다. M은 분자량 마커, 1은 비융합 HPV 16_E6-E7, 2는 비융합 HPV 16_NE7-E6-CE7, 3은 유비퀴틴 융합 HPV 16_E6-E7, 4는 유비퀴틴 융합 HPV 16_ NE7-E6-CE7, 5는 플라젤린 융합 HPV 16_E6-E7, 6은 플라젤린 융합 HPV 16_ NE7-E6-CE7, 7은 콜레라 톡신A1B 융합 HPV 16_E6-E7, 8은 콜레라 톡신A1B 융합 HPV 16_ NE7-E6-CE7 재조합 항원이다.
도 5는 종양의 크기를 측정한 결과로, C57BL/6 쥐에 종양세포주인 TC-1 세포를 피하 주입 한 후, 각각의 재조합 항원을 주입하여 시간에 따른 암의 크기를 측정한 결과이며, 플라젤린 융합 HPV 16_ NE7-E6-CE7의 군에서 종양부피가 가장 낮게 나타나는 것을 확인하였다.
도 6는 ELISPOT 결과로, HPV 재조합 항원에 따라서 특이적 T 세포 면역반응을 나타낸 결과로, 플라젤린 융합 HPV 16_ NE7-E6-CE7에서 항원에 따른 면역반응이 유도된 것을 확인하였다.
도 7은 C57BL/6 마우스에 2종의 재조합 항원을 주입한 뒤 종양세포주인 TC-1 세포를 피하주입하여 예방 효과에 따른 종양의 크기를 측정한 결과로, 총 3가지 농도(50㎍, 75㎍, 100㎍)의 플라젤린 융합 HPV 16_ NE7-E6-CE7의 군에서 종양부피가 낮게 나타나는 것을 확인하였다.
도 8은 ELISA 결과로, 2종의 재조합 항원에 따른 항체 역가를 측정하여 플라젤린 융합 HPV 16_ NE7-E6-CE7을 포함하는 모든 군에서 항체 역가가 증가하는 것을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 다음 실시예에 의해 국한되지, 않는다는 것은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : HPV E6, E7 단백질을 암호화하는 유전자 변형

HPV 유형 16의 항암 유발 단백질의 유전자 변형을 위해서, E6 단백질의 경우 항암단백질 p53의 불안정화, PDZ binding domain으로 인한 발암 유도성 단백질과의 상호작용을 억제하기 위해 54번, 57번의 잔기에 치환돌연변이 및 156-158번 잔기의 결실 돌연변이를 유도하였다. E7 단백질의 경우 주된 표적인 pRb와의 상호작용을 강하게 저해하며 E7 자체의 변형활성능력을 억제하기 위해 2번, 24번, 80번, 81번 잔기의 치환돌연변이를 유도하였다.

사람 파필로마바이러스 유형 16 유래의 종양 단백질인 E6, E7의 아미노산이 치환, 결실된 선형(Linear; E6E7) 형태의 폴리펩타이드를 포함하였으며, 또한, 선형 형태의 폴리펩타이드와 돌연변이를 동일하게 포함한 서열번호 1의 서열은 키메라 형태의 폴리펩타이드를 포함하였다. 구체적으로, E7 단백질의 아미노산 1번부터 37번, E6 단백질의 1번부터 155번, E7 단백질의 아미노산 33번부터 98번이 순서대로 결합된 융합단백질이다. (도 1 참조)

실시예 2 : 융합단백질의 유전자 서열 및 유전자 변형

융합 단백질 중 유비퀴틴 폴리펩타이드 서열 1번부터 76번까지의 아미노산을 사용하였으며, 유비퀴틴 가수분해 효소에 의한 분열을 피하기 위해 76번 잔기의 치환돌연변이를 유도하였으며, 도 1의 유전자 변형이 된 HPV 16 E6, E7의 2가지 형태의 폴리펩타이드를 유비퀴틴의 카르복시 말단에 결합하였다. 플라젤린 폴리펩타이드는 보존적인 영역의 아미노 말단 도메인인 1번부터 143번의 아미노산과 카르복시 말단 도메인인 409번부터 495번의 아미노산 서열을 포함하였으며, 유전자 변형이 된 HPV 16 E6, E7의 2가지 형태의 폴리펩타이드를 플라젤린의 아미노 말단 도메인과 카르복시 말단 도메인 사이에 포함하였다. 또한, 콜레라 톡신 A1B의 폴리펩타이드에서는 A1 서브유닛 (19-212 아미노산)과 B 서브유닛 (22-124 아미노산)의 폴리펩타이드를 포함하였으며, 독성을 저하시키기 위해 A1 서브유닛의 81번, 124번, 130번 잔기의 치환돌연변이를 유도하였고, 콜레라 톡신의 A1 서브유닛의 아미노 말단에 유전자 변형이 된 HPV 16 E6, E7의 2가지 형태의 폴리펩타이드를 결합하였다. (도 2 참조)

실시예 3 : 유전자 변형된 HPV16 E6, E7과 비융합/융합단백질로 사용될 유전자 합성

종양단백질인 E6, E7의 유전자를 변형시키고 이 단백질을 암호화하는 합성 유전자를 확보하였으며, 면역증강을 위한 융합단백질 3종에 대한 합성 유전자를 확보하였다. 각각의 단백질은 표1과 같이 Strain을 선정하여 대장균에서 발현이 용이하도록 코돈 최적화를 하였다.

	Accession no.
HPV 16_E6-E7 (Linear form)	E6; NP_041325.1, E7; NP_041326.1
HPV 16_NE7-E6-CE7 (Chimeric form)	E6; NP_041325.1, E7; NP_041326.1
유비퀴틴 (Ubiquitin, Ubi)	NP_003324.1
플라젤린 (Flagellin, FliC)	NP_460912.1
콜레라 톡신A1B (Cholera toxin A1B, CTA1B)	CTA; NP_231100.1, CTB; NP_231099.1

표 1은 HPV16 유형 E6, E7 및 융합단백질 후보의 유전자 정보

실시예 4 : HPV16-E6E7-비융합/융합단백질 재조합단백질 클로닝

HPV 16유형의 선형 형태 또는 키메라 형태의 합성 유전자와 유비퀴틴, 플라젤린, 콜레라 톡신A1B의 합성 유전자를 융합시켜 대장균 유래 재조합 단백질을 발현하고자 하였다. 해당 유전자를 얻기 위하여 우선적으로 세 가지의 융합단백질의 유전자와 HPV 16유형의 선형형태 또는 키메라형태의 합성 유전자를 표 2의 1차 클로닝 사용 제한효소와 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 융합단백질을 융합하는 1차 클로닝을 수행하였다. 또한, 비융합 형태의 DNA를 얻기 위하여 표 3의 프라이머를 이용해 종결코돈을 추가해주는 PCR을 수행하였다. 비융합 형태와 융합형태의 타깃 DNA를 얻은 후, 표 2의 2차 클로닝 사용 제한효소와 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 발현 벡터 pET-28a에 타깃 DNA를 서브 클로닝하였다. 표 4과 같이 총 8종의 재조합 단백질을 클로닝 하였다. 또한 카나마이신을 포함하는 배지를 이용해 표 4의 총 8종의 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질 전환시킨 후 각각의 균주를 선별하였다.

	1차 클로닝 사용 제한 효소	2차 클로닝 사용 제한 효소
비융합 (Non-fusion)	-	NdeI, XhoI (NEB, USA)
유비퀴틴 융합	BamHI, PstI (Roche, Swiss)	NdeI, XhoI (NEB, USA)
플라젤린 융합	BamHI, HindIII (Roche, Swiss)	NdeI, XhoI (NEB, USA)
콜레라 톡신A1B 융합	MfeI, HindIII (Takara, Japan)	BamHI, XhoI (NEB, USA)

표 2는 클로닝에 사용된 제한 효소 목록

정방향 프라이머 1	CGACGCG CATATG ATGCATCAAAAACGCAC (서열번호 7)
정방향 프라이머 2	GAACGCG CATATG ATGCCGGGCGACAC (서열번호 8)
역방향 프라이머	CTCGC CTCGAG TTA CGGCTTCTGAGAGCAG (서열번호 9)

표 3는 종결코돈 삽입을 위한 프라이머 서열

pET-28a_HPV 16_E6-E7 (Linear form)	pET-28a_HPV 16_NE7-E6-CE7 (Chimeric form)
pET-28a_Ubi_HPV 16_E6-E7	pET-28a_Ubi_HPV 16_ NE7-E6-CE7
pET-28a_FliC_HPV 16_E6-E7	pET-28a_FliC_HPV 16_ NE7-E6-CE7
pET-28a_CTA1B_HPV 16_E6-E7	pET-28a_CTA1B_HPV 16_ NE7-E6-CE7

표 4은 재조합 단백질 클로닝 종류

실시예 5 : HPV16-E6E7-비융합/융합단백질-pET-BL21 재조합 단백질의 발현

표 4의 총 8종의 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위해 선별 된 균주는 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)의 유도를 통해 단백질을 발현하였다. 선별된 균을 발현할 때, 발현 온도, 흡광도 (OD600), 발현 유도물질인 IPTG의 농도, 진탕배양 조건 및 유도 후 발현 시간 등이 실험 조건으로 적용된다. 조건시험을 통해 흡광도(OD600=0.5-0.6)에서 유도물질 IPTG 1.0mM을 사용하여 37℃, 200rpm 진탕 배양기 (shaker incubator)에서 4시간 동안 발현하는 최적의 조건을 확립하였다.

박테리아 세포에서의 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위해, 균체 1g 당 세포파쇄용액 버그버스터(Novagen) 5ml을 사용하여 상온에서 20분 교반 후 단백질 추출(protein extraction) 하였고, 10% SDS-PAGE을 통해 각각의 위치에서 과발현 양상을 확인하였다. 발현된 재조합 단백질은 모두 가용성 상층액이 아닌 불용성 펠렛(Insoluble pellet)에서 확인되었다.

실시예 6 : HPV16-E6E7-비융합/융합단백질-pET-BL21 재조합 단백질 내포체 분리 수득

불용성 펠렛 부분에서 발현된 재조합 단백질은 세포 파쇄 용액과 교반 후 원심분리를 통해 상층액을 제거하였고, 상층액과 동일 부피의 50mM 트리스((Tris-(hydroxymethyl) aminomethane)버퍼로 펠렛을 부유하여 초음파 파쇄 및 원심분리를 총 3회 반복하였다. 최종 불용성 펠렛은 카오트로픽 변성제(chaotropic denaturant) 8M 우레아(Urea)와 2mM 환원형 글루타치온(reduced glutathione, GSH)과 1mM 산화형 이황화 글루타치온(glutathione disulfide, GSSG)를 첨가 후 펠렛을 부유하여 초음파 파쇄를 하여 16시간 동안 4°C 보관하면서 단백질의 3차 구조를 풀어내는 단백질 변성 단계를 거쳐 변성 단백질을 수득하였다.

실시예 7 : HPV16-E6E7-비융합/융합단백질-pET-BL21 재조합 단백질 정제

상기 수득한 변성 단백질의 정제를 위해 6x His-tag이 있는 재조합 단백질과 니트릴로트리아세트산(Ni-NTA)의 결합을 이용하여 오픈컬럼 정제를 수행하였다. 정제 전 상기 가용화 단계를 거친 변성 단백질을 원심분리를 통해 상등액을 수득한 후, 시린지 필터를 이용해 불순물을 제거하였다. 이 상등액은 프로본드 니켈 레진(Probond nickel resin, NOVEX)을 사용하여 타깃 재조합 단백질 N-term 말단의 6x His-tag과 결합시키기 위해 상온에서 2시간 교반하였다. 단백질 정제시 사용된 버퍼는 모두 8M urea가 포함되었으며, 20Mm sodium phosphate, 0.5M sodium chloride 가 들어간 버퍼를 사용했다. 워싱에 사용되는 버퍼의 경우 pH 7.8, pH 6.5, pH 5.9, pH 5.5를 사용하였으며, 단백질 용출시키는 버퍼의 경우 pH 4.0, pH 3.5, pH 3.0을 사용하였다.

정제 시, 컬럼에 프로본드 니켈 레진을 5ml 첨가한 뒤 증류수로 세척해준다. 그리고 세척한 레진에 pH 7.8 완충 버퍼를 레진부피의 5배로 흘려준다. 완충 버퍼가 모두 빠진 후, 변성 단백질을 컬럼에 주입하고 레진과 함께 섞어준 뒤 15ml 튜브에 옮겨 상온에서 2시간 교반하였다. 교반이 끝나고 레진과 결합된 변성단백질을 컬럼으로 다시 옮긴 뒤, pH 7.8, pH 6.5, pH 5.9, pH 5.5의 순서로 버퍼를 흘려준다. 그리고 최종적으로 단백질을 용출 시키기 위해 pH 4.0, pH 3.5, pH 3.0의 순서대로 버퍼를 흘려주어 용출 단백질을 확보하였다. 확보된 단백질을 확인하기 위해, 10% SDS/PAGE를 통해 용출 된 단백질을 확인하였다.

실시예 8 : HPV16-E6E7-비융합/융합단백질-pET-BL21 재조합 단백질의 가용화 방법

상기 방법으로 정제한 변성 단백질 가용화하기 위해 표 5와 같은 조성물 48종을 시험하였다. 각각의 조성물 1ml에 8M urea로 변성된 정제 단백질을 1/100 부피 비로 첨가하여 혼합한 후, 4℃에서 16시간 이상 반응하였다. 반응 후 4℃, 16,000g에서 10분 이상 원심분리 하여도 불용성 침전물의 형성이 확인되지 않은 조성을 가용화 방법으로 확립하였다.

표 5와 같이 재조합 단백질의 가용화 가능한 조성 범위는 Tris-HCl pH8.5 버퍼와 0.5M Arginine이 포함 된 31~36번, 43~48번 조성물에서 적합함을 확인하였다. 그 중 총 8종의 재조합 단백질의 가용화가 가장 적합하게 가능한 조성은 표 4의 31번 조성물로 확인되었으며, 이 조성물에는 50mM Tris-HCl pH8.5, 2mM GSH, 0.2mM GSSG, 20mM NaCl, 0.5M Arginine이 포함된다. 이렇게 확인된 가용화 조성물을 통하여 8종의 용출된 변성 단백질을 1/20의 부피 비로 첨가하여 혼합 한 후, 4℃에서 16시간 이상 반응하였다(인용특허_KR20170103473A).

Buffer 50mM	Arginine 0M						Arginine 0.5M
HEPES (pH 7.5)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11		12	GSH/GSSG 2/0.2mM
HEPES (pH 7.5)	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23		24	GSH/GSSG 10/2mM
Tris-HCl (pH 8.5)	25	26	27	28	29	30	31	32	33	34	35		36	GSH/GSSG 2/0.2mM
Tris-HCl (pH 8.5)	37	38	39	40	41	42	43	44	45	46	47		48	GSH/GSSG 10/2mM
	MgCl2/CaCl2 0mM			MgCl2/CaCl2 2mM			MgCl2/CaCl2 0mM			MgCl2/CaCl2 2mM
NaCl	20mM	60mM	180mM	20mM	60mM	180mM	20mM	60mM	180mM	20mM		60mM	180mM	NaCl

표 5는 48종 가용화 버퍼 스크리닝 조성

실시예 9 : HPV16-E6E7-비융합/융합단백질-pET-BL21의 투석과 농축을 통한 단백질 확보

가용화된 단백질을 포함하는 조성에는 희석된 타깃단백질과 다양한 화학 조성물을 포함하므로 항원 물질로 사용하기에는 어려움이 따른다. 따라서 투석막을 이용하여 최종 완충용액으로 교환하여 남아있는 화학 조성물을 제거 하였다. 최종 완충용액은 10mM 카보네이트 pH9.8 버퍼를 사용하였으며, 1시간 간격으로 투석용액을 교체하여 잔여 화학 조성물을 제거하였다. 이 후, 10kDa의 단백질 분리막을 포함하는 원심분리형 아미콘(Amicon) 튜브를 이용하여 농축 과정을 거쳐 농축 된 재조합 단백질을 수득하였다. 최종적으로 수득한 단백질을 확인하기 위해, 10% SDS/PAGE를 통해 단백질을 확인하였다(도 4 참조).

실시예 10 : HPV16-E6E7-비융합/융합단백질-pET-BL21 재조합 항원의 면역학적 검증

상기 최종 수득된 8종의 재조합 항원의 면역학적 검증을 하고자 웨스턴 블랏을 시하였다. 각각의 재조합 단백질에 5X loading dye를 첨가하여 100도에서 15분간 중탕하고, 이를 10% SDS/PAGE를 이용하여 전기영동 하였다. 이 후, Immobilon-P PVDF 막 (Merck, Germany)에 Mini Trans-Blot (Bio-Rad)를 이용해 100V에서 1시간 30분 동안 단백질을 옮겨주고, PVDF막은 5% 스킴밀크 용액에서 1시간 교반하여 블로킹하였다. 블로킹 이후, TBST 용액으로 교반해 반복 워싱하고, 블로킹으로 사용하였던 5% 스킴밀크 용액에 1:800으로 마우스 유래 항 HPV16 E7 단일클론항체를 희석해주고, 4도에서 16시간 교반하여 단백질에 항체를 결합시켰다. TBST 용액으로 교반해 반복 워싱 진행 후, HRP가 결합된 염소 유래 항-마우스 면역글로블린G 2차 항체를 5% 스킴밀크 용액에 1:5000으로 희석한 뒤 상온에서 1시간 교반하여 반응시켰다. 이를 TBST 용액으로 교반해 반복 워싱하고, DAB　(3, 3 -diaminobenzidine) 기질을 이용하여 발색 한 후 확인하였다.

총 8가지의 재조합 단백질 항원에서 모두 항체 특이적으로 반응하였으며, 1, 2 항원은 약 31.5kDa, 3, 4 항원은 약 41.5kDa, 5, 6 항원은 약 59kDa, 7, 8 항원은 약 67kDa 크기의 단백질이 검출되었다. 동일 실험 조건에서 밴드의 진한 정도가 전반적으로 HPV 16 유형 E6, E7 선형 형태의 구조 보다 키메라 형태 구조에서 더 진하게 나타났으며,

융합단백질의 차이로는 플라젤린을 융합한 재조합 단백질 항원에서 가장 진하게 나타났다.

실시예 11 : HPV16-E6E7-비융합/융합단백질-pET-BL21 재조합 항원의 종양 치료 효과 확인

재조합 단백질 항원의 자궁경부암 치료 효과를 확인하기 위하여, 6주령의 C57BL/6 암컷 쥐에 TC-1 종양세포를 1X10⁵ 세포를 옆구리 피하주사를 하였으며, 그룹마다 6마리의 쥐를 사용하였다. TC-1세포 주입 7일 후, 각각의 재조합 단백질을 50ug의 양으로 종양세포를 주입한 부근에 피하주사를 실시 하였으며, 종양세포 주입 21일째 되는 날 50ug의 재조합 단백질을 종양세포 부근에 피하주사로 2차 주입을 하였다. 종양세포는 4-5 일마다 디지털 캘리퍼를 사용하여 가장 긴 (길이) 및 가장 짧은 치수 (너비)를 측정하여 마우스의 종양 크기를 추정 하였다. 종양 부피는 다음과 같은 식에 의해 계산되었다: 종양부피=(길이X너비²)/2.

도 5와 같이 재조합 단백질을 통한 종양부피를 측정한 결과, HPV16 유형 E6, E7 단백질이 키메라 형태의 구조의 그룹에서 선형 형태의 구조 그룹보다 종양부피가 더 낮게 나타났으며, 플라젤린 융합단백질을 포함한 키메라 형태의 구조 그룹에서 대조군에 비해 가장 낮은 종양부피를 확인할 수 있었다. (도 5 참조)

실시예 12 : ELISPOT; HPV16-E6E7-비융합/융합단백질-pET-BL21 재조합 항원에 의한 특이적 T 세포 면역반응

TC-1 세포를 주사한 날로부터 35일째 되는 날, 각각의 그룹에서 쥐 3마리씩에서 비장을 적출하였다. Cell strainer (Falcon) 제품을 이용하여 비장을 잘게 부순 뒤 비장세포를 회수하고, 이 비장세포들을 PBS 완충용액을 이용하여 워싱하였다. 이 후, 적혈구 용해 버퍼를 이용하여 적혈구를 제거해주었으며, ELISPOT실험에 사용하기 위하여 세포의 수를 세어 계산하였다. 본 실험은 R&D system의 mouse IFN-gamma ELISpot kit를 사용하였다. 그리고 mouse IFN-gamma 단일클론 항체가 코팅된 플레이트에 각각의 마우스에서 회수한 비장세포 2X10⁵ cells, 4X10⁴ cells와 각 마우스에 주입한 재조합단백질 항원을 well당 10ug씩 함께 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 16시간 배양하였다. 1X Wash버퍼를 이용하여 4번의 세척을 하고, 비오틴이 결합되어있는 IFN-gamma 검출 항체를 100ul씩 넣어주고 상온에서 2시간 교반하여 배양하였다. 배양 후 1X Wash버퍼를 이용하여 4번의 세척하였고, streptavidin-AKP(alkaline phosphate)을 100ul씩 넣어주고 상온에서 2시간 배양하였다. 1X Wash버퍼를 이용하여 4번의 세척 후, 100ul의 BCIP/NBT 기질을 첨가하여 상온에서 45분 동안 배양하였고, 반응에 의한 발색이 나타나게 되면 멸균된 물로 세척한 후 발색 된 점의 개수를 카운팅 하였다.

각각의 재조합 단백질 항원에 대한 특이적 T 세포 면역반응을 ELISPOT으로 측정한 결과, HPV16 유형 E6, E7 단백질 키메라 형태에 플라젤린을 융합시킨 그룹에서 대조군에 높은 결과를 나타내어, 항원에 대한 특이적 면역반응을 유도하는 것을 확인할 수 있었다. (도 6 참조)

실시예 13: HPV16-E6E7-비융합/융합단백질-pET-BL21 재조합 항원의 종양 예방 효과 확인

재조합 단백질 항원의 자궁경부암 예방 효과를 확인하기 위하여, 6주령의 C57BL/6 암컷 쥐를 각 그룹별 6마리씩 사용하였다. 도 5와 6의 치료 효과를 확인한 결과에서 가장 우수한 재조합 단백질 항원 2종을 선정하여 예방 효과를 확인하였다. 먼저 대조군(PBS)과 1종의 비융합 재조합단백질 50ug을 주입하였으며, 1종의 융합 재조합단백질의 경우 50, 75, 100ug의 항원을 피하주사 2회 (종양세포 주입 14일 전 그리고 28일 전) 실시하였다. 대조군 및 재조합단백질 주입 14일째 되는 날 TC-1 종양세포를 1X10⁵ 세포를 옆구리 피하주사를 하였으며, 종양세포는 4-5 일마다 디지털 캘리퍼를 사용하여 가장 긴 (길이) 및 가장 짧은 치수 (너비)를 측정하여 마우스의 종양 크기를 추정하였다. 종양 부피는 다음과 같은 식에 의해 계산되었다: 종양부피=(길이X너비²)/2.

도 7과 같이 재조합 단백질을 통한 종양부피를 측정한 결과, 비융합 키메라 재조합단백질 대비, 모든 농도의 플라젤린 융합단백질을 포함한 키메라 형태의 구조 그룹에서 종양부피가 낮게 나타났으며, 100ug의 플라젤린 융합단백질을 주입한 그룹에서 가장 낮은 종양부피를 확인할 수 있었다. (도 7 참조)

실시예 14: ELISA; HPV16-E6E7-비융합/융합단백질-pET-BL21 재조합 항원의 예방 효과에 의한 항체가 확인

대조군 및 재조합 항원을 2회 피하주사를 진행하였으며, 첫번째 주사한 날로부터 1주, 2주, 3주, 4주 되는 날, 각 그룹별 6마리 쥐에 마취하여 채혈을 진행하였다. 채혈한 혈액에서 원심 분리하여 혈청을 분리하여 얻었다. 본 실험에서 각각의 재조합 항원을 면역 플레이트에 4℃에서 16시간동안 코팅을 진행하였다. 1X Wash버퍼를 이용하여 3번이상 세척을 하고, 항체의 비 특이적 결합을 막기 위하여 블로킹 버퍼를 이용하여 37℃에서 1시간 블로킹하였다. 블로킹 후, 각각의 분리된 혈청을 1:100으로 희석하여 37℃에서 1시간 반응시키고, 1X Wash버퍼를 이용하여 3번이상 세척한 후 Goat anti-mouse IgG-HPR 항체를 37℃에서 1시간 반응시켰다. 1X Wash버퍼를 이용하여 3번의 세척 후, 50ul의 TMB 기질을 첨가하여 상온에서 20분 동안 반응하였고, 2M 황산액으로 반응을 중단시킨 후 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

각각의 재조합 단백질 항원에 대한 항체가를 ELISA로 측정한 결과, 대조군과 비교 시 비융합 재조합 단백질은 역가 상승이 보이지 않았지만, 플라젤린 융합단백질을 주입한 모든 그룹에서는 3주차, 4주차에 항체가가 크게 증가하는 결과를 확인할 수 있었다. (도 8 참조)

[서열 정보]

SEQ ID NO: 1 - Human papillomavirus type 16, E6, E7 modified amino acid sequence (E6 underlined)

MPGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYEQLNDSSEEEDEMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDGCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRREEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLRRLLMGTLGIVCPICSQKP

SEQ ID NO: 2 - Human papillomavirus type 16, E6, E7 modified nucleic acid sequence (E6 underlined)

ATG CCG GGC GAC ACG CCG ACC TTA CAT GAG TAC ATG CTT GAT TTA CAG CCG GAA ACG ACC GAT TTA TAC GGT TAC GAA CAG TTG AAC GAC TCT AGC GAG GAA GAA GAC GAG ATG CAT CAA AAA CGC ACC GCC ATG TTC CAA GAT CCG CAA GAA CGT CCG CGC AAA CTG CCG CAG CTT TGC ACC GAG CTG CAA ACT ACC ATT CAT GAC ATT ATC CTT GAG TGC GTG TAC TGT AAA CAG CAA TTA TTG CGT CGC GAA GTA TAC GAC TTC GCG CGC CGT GAC GGT TGT ATT GTG TAC CGT GAC GGT AAC CCG TAT GCA GTC TGC GAC AAA TGC CTG AAG TTT TAC AGC AAG ATA AGC GAG TAC CGT CAT TAT TGT TAT TCT TTG TAT GGC ACC ACC CTT GAG CAG CAG TAC AAT AAG CCG CTT TGT GAT TTG TTG ATC CGT TGC ATT AAT TGC CAG AAA CCG TTG TGC CCG GAA GAA AAG CAG CGC CAT TTA GAC AAG AAG CAG CGT TTC CAT AAT ATT CGC GGG CGC TGG ACC GGT CGT TGT ATG AGC TGT TGC CGT TCT AGC CGC ACT CGT CGT GAA GAG GAA GAA GAC GAG ATT GAC GGT CCG GCA GGG CAG GCC GAG CCG GAT CGC GCT CAT TAT AAT ATC GTG ACT TTT TGT TGT AAG TGT GAT AGC ACC CTT CGC CTT TGT GTG CAA AGC ACC CAT GTT GAC ATT CGT ACT TTG CGC CGC TTA TTA ATG GGC ACG CTT GGT ATT GTG TGC CCG ATC TGC TCT CAG AAG CCG

SEQ ID NO: 3 - Salmonella typhimurium　str. LT2, Flagellin (FliC) modified amino acid sequence (Linker underlined, Arrow HPV 16 E6, E7 location)

MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTGGGGSGGGGSGSG↓GKLGGGGSGGGGSLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLTSARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR

SEQ ID NO: 4 - Salmonella typhimurium　str. LT2, Flagellin (FliC) modified nucleic acid sequence (Linker underlined, Arrow HPV 16 E6, E7 location)

ATG GCG CAG GTT ATT AAC ACC AAT AGC TTA TCT TTG CTT ACC CAG AAT AAC TTA AAC AAA TCT CAA AGC GCT CTT GGG ACG GCA ATC GAG CGT TTA TCT AGC GGG CTG CGC ATT AAT TCT GCT AAA GAC GAC GCG GCA GGT CAA GCA ATC GCC AAC CGT TTC ACG GCA AAC ATT AAG GGC CTT ACC CAA GCC AGC CGT AAT GCT AAC GAC GGG ATC TCT ATC GCG CAG ACC ACC GAA GGC GCT CTG AAC GAG ATC AAC AAC AAC TTG CAG CGC GTT CGT GAG TTA GCG GTG CAA TCT GCC AAC AGC ACG AAT AGC CAA TCT GAC TTA GAC AGC ATC CAG GCC GAG ATC ACC CAG CGT CTT AAT GAA ATT GAT CGC GTA TCT GGC CAG ACG CAA TTT AAC GGG GTC AAG GTT CTT GCG CAA GAT AAT ACC GGT GGC GGT GGT TCT GGT GGG GGC GGC AGC GGA TCC GGC↓GGT AAG CTT GGT GGG GGC GGC AGC GGC GGT GGC GGT TCT TTG CAG AAA ATT GAC GCG GCA CTT GCG CAG GTC GAC ACC CTT CGC AGT GAC CTG GGG GCA GTT CAG AAC CGC TTT AAT TCT GCC ATT ACG AAC CTG GGG AAC ACT GTG AAC AAC CTT ACG TCT GCG CGC TCT CGC ATC GAG GAC TCT GAT TAT GCA ACT GAA GTG AGC AAT ATG AGC CGC GCC CAA ATC TTG CAG CAG GCA GGC ACC AGC GTT CTT GCC CAG GCA AAC CAA GTT CCG CAA AAT GTC CTT TCT CTT CTT CGT

SEQ ID NO: 5 - FliC. HPV16 E6, E7 modified amino acid sequence (E6 underlined)

MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTGGGGSGGGGSGSGGLQMPGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYEQLNDSSEEEDEMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDGCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRREEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLRRLLMGTLGIVCPICSQKPQLGGKLGGGGSGGGGSLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLTSARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR

SEQ ID NO: 6 - FliC. HPV16 E6, E7 modified nucleic acid sequence (E6 underlined)

ATG GCG CAG GTT ATT AAC ACC AAT AGC TTA TCT TTG CTT ACC CAG AAT AAC TTA AAC AAA TCT CAA AGC GCT CTT GGG ACG GCA ATC GAG CGT TTA TCT AGC GGG CTG CGC ATT AAT TCT GCT AAA GAC GAC GCG GCA GGT CAA GCA ATC GCC AAC CGT TTC ACG GCA AAC ATT AAG GGC CTT ACC CAA GCC AGC CGT AAT GCT AAC GAC GGG ATC TCT ATC GCG CAG ACC ACC GAA GGC GCT CTG AAC GAG ATC AAC AAC AAC TTG CAG CGC GTT CGT GAG TTA GCG GTG CAA TCT GCC AAC AGC ACG AAT AGC CAA TCT GAC TTA GAC AGC ATC CAG GCC GAG ATC ACC CAG CGT CTT AAT GAA ATT GAT CGC GTA TCT GGC CAG ACG CAA TTT AAC GGG GTC AAG GTT CTT GCG CAA GAT AAT ACC GGT GGC GGT GGT TCT GGT GGG GGC GGC AGC GGA TCC GGC GGT CTG CAG ATG CCG GGC GAC ACG CCG ACC TTA CAT GAG TAC ATG CTT GAT TTA CAG CCG GAA ACG ACC GAT TTA TAC GGT TAC GAA CAG TTG AAC GAC TCT AGC GAG GAA GAA GAC GAG ATG CAT CAA AAA CGC ACC GCC ATG TTC CAA GAT CCG CAA GAA CGT CCG CGC AAA CTG CCG CAG CTT TGC ACC GAG CTG CAA ACT ACC ATT CAT GAC ATT ATC CTT GAG TGC GTG TAC TGT AAA CAG CAA TTA TTG CGT CGC GAA GTA TAC GAC TTC GCG CGC CGT GAC GGT TGT ATT GTG TAC CGT GAC GGT AAC CCG TAT GCA GTC TGC GAC AAA TGC CTG AAG TTT TAC AGC AAG ATA AGC GAG TAC CGT CAT TAT TGT TAT TCT TTG TAT GGC ACC ACC CTT GAG CAG CAG TAC AAT AAG CCG CTT TGT GAT TTG TTG ATC CGT TGC ATT AAT TGC CAG AAA CCG TTG TGC CCG GAA GAA AAG CAG CGC CAT TTA GAC AAG AAG CAG CGT TTC CAT AAT ATT CGC GGG CGC TGG ACC GGT CGT TGT ATG AGC TGT TGC CGT TCT AGC CGC ACT CGT CGT GAA GAG GAA GAA GAC GAG ATT GAC GGT CCG GCA GGG CAG GCC GAG CCG GAT CGC GCT CAT TAT AAT ATC GTG ACT TTT TGT TGT AAG TGT GAT AGC ACC CTT CGC CTT TGT GTG CAA AGC ACC CAT GTT GAC ATT CGT ACT TTG CGC CGC TTA TTA ATG GGC ACG CTT GGT ATT GTG TGC CCG ATC TGC TCT CAG AAG CCG CAA TTG GGT GGC AAG CTT GGT GGG GGC GGC AGC GGC GGT GGC GGT TCT TTG CAG AAA ATT GAC GCG GCA CTT GCG CAG GTC GAC ACC CTT CGC AGT GAC CTG GGG GCA GTT CAG AAC CGC TTT AAT TCT GCC ATT ACG AAC CTG GGG AAC ACT GTG AAC AAC CTT ACG TCT GCG CGC TCT CGC ATC GAG GAC TCT GAT TAT GCA ACT GAA GTG AGC AAT ATG AGC CGC GCC CAA ATC TTG CAG CAG GCA GGC ACC AGC GTT CTT GCC CAG GCA AAC CAA GTT CCG CAA AAT GTC CTT TCT CTT CTT CGT

<110> Genematrix Inc. <120> A STRUCTURALLY MODIFIED CHIMERIC POLYPEPTIDE OF HPV, A RECOMBINANT PROTEIN COMPRISING THE SAME, AND USE OF THE SAME <130> P20-0077HS <150> KR 10-2020-0062519 <151> 2020-05-25 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimera polypeptide <400> 1 Met Pro Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp 35 40 45 Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln 50 55 60 Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln 65 70 75 80 Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Arg Arg Asp Gly Cys Ile 85 90 95 Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys 100 105 110 Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr 115 120 125 Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu 130 135 140 Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln 145 150 155 160 Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp 165 170 175 Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu 180 185 190 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 195 200 205 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 210 215 220 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Arg 225 230 235 240 Arg Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 245 250 255 Lys Pro <210> 2 <211> 774 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding Chimera polypeptide <400> 2 atgccgggcg acacgccgac cttacatgag tacatgcttg atttacagcc ggaaacgacc 60 gatttatacg gttacgaaca gttgaacgac tctagcgagg aagaagacga gatgcatcaa 120 aaacgcaccg ccatgttcca agatccgcaa gaacgtccgc gcaaactgcc gcagctttgc 180 accgagctgc aaactaccat tcatgacatt atccttgagt gcgtgtactg taaacagcaa 240 ttattgcgtc gcgaagtata cgacttcgcg cgccgtgacg gttgtattgt gtaccgtgac 300 ggtaacccgt atgcagtctg cgacaaatgc ctgaagtttt acagcaagat aagcgagtac 360 cgtcattatt gttattcttt gtatggcacc acccttgagc agcagtacaa taagccgctt 420 tgtgatttgt tgatccgttg cattaattgc cagaaaccgt tgtgcccgga agaaaagcag 480 cgccatttag acaagaagca gcgtttccat aatattcgcg ggcgctggac cggtcgttgt 540 atgagctgtt gccgttctag ccgcactcgt cgtgaagagg aagaagacga gattgacggt 600 ccggcagggc aggccgagcc ggatcgcgct cattataata tcgtgacttt ttgttgtaag 660 tgtgatagca cccttcgcct ttgtgtgcaa agcacccatg ttgacattcg tactttgcgc 720 cgcttattaa tgggcacgct tggtattgtg tgcccgatct gctctcagaa gccg 774 <210> 3 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Salmonella typhimurium str. LT2, Flagellin (FliC) modified amino acid sequence <400> 3 Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn 1 5 10 15 Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu 20 25 30 Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln 35 40 45 Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala 50 55 60 Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly 65 70 75 80 Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala 85 90 95 Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile 100 105 110 Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly 115 120 125 Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Lys Leu Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala 165 170 175 Leu Ala Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn 180 185 190 Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu 195 200 205 Thr Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val 210 215 220 Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val 225 230 235 240 Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg 245 250 255 <210> 4 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding Salmonella typhimurium str. LT2, Flagellin (FliC) modified amino acid sequence <400> 4 atggcgcagg ttattaacac caatagctta tctttgctta cccagaataa cttaaacaaa 60 tctcaaagcg ctcttgggac ggcaatcgag cgtttatcta gcgggctgcg cattaattct 120 gctaaagacg acgcggcagg tcaagcaatc gccaaccgtt tcacggcaaa cattaagggc 180 cttacccaag ccagccgtaa tgctaacgac gggatctcta tcgcgcagac caccgaaggc 240 gctctgaacg agatcaacaa caacttgcag cgcgttcgtg agttagcggt gcaatctgcc 300 aacagcacga atagccaatc tgacttagac agcatccagg ccgagatcac ccagcgtctt 360 aatgaaattg atcgcgtatc tggccagacg caatttaacg gggtcaaggt tcttgcgcaa 420 gataataccg gtggcggtgg ttctggtggg ggcggcagcg gatccggcgg taagcttggt 480 gggggcggca gcggcggtgg cggttctttg cagaaaattg acgcggcact tgcgcaggtc 540 gacacccttc gcagtgacct gggggcagtt cagaaccgct ttaattctgc cattacgaac 600 ctggggaaca ctgtgaacaa ccttacgtct gcgcgctctc gcatcgagga ctctgattat 660 gcaactgaag tgagcaatat gagccgcgcc caaatcttgc agcaggcagg caccagcgtt 720 cttgcccagg caaaccaagt tccgcaaaat gtcctttctc ttcttcgt 768 <210> 5 <211> 520 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FliC. HPV16 E6, E7 modified amino acid sequence <400> 5 Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn 1 5 10 15 Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu 20 25 30 Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln 35 40 45 Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala 50 55 60 Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly 65 70 75 80 Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala 85 90 95 Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile 100 105 110 Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly 115 120 125 Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Leu Gln Met 145 150 155 160 Pro Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro 165 170 175 Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu 180 185 190 Glu Glu Asp Glu Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro 195 200 205 Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr 210 215 220 Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu 225 230 235 240 Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Arg Arg Asp Gly Cys Ile Val 245 250 255 Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe 260 265 270 Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly 275 280 285 Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile 290 295 300 Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg 305 310 315 320 His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr 325 330 335 Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Glu 340 345 350 Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg 355 360 365 Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu 370 375 380 Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Arg Arg 385 390 395 400 Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys 405 410 415 Pro Gln Leu Gly Gly Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 420 425 430 Ser Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr Leu Arg 435 440 445 Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn 450 455 460 Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Thr Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu 465 470 475 480 Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile 485 490 495 Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro 500 505 510 Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg 515 520 <210> 6 <211> 1560 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FliC. HPV16 E6, E7 modified nucleic acid sequence <400> 6 atggcgcagg ttattaacac caatagctta tctttgctta cccagaataa cttaaacaaa 60 tctcaaagcg ctcttgggac ggcaatcgag cgtttatcta gcgggctgcg cattaattct 120 gctaaagacg acgcggcagg tcaagcaatc gccaaccgtt tcacggcaaa cattaagggc 180 cttacccaag ccagccgtaa tgctaacgac gggatctcta tcgcgcagac caccgaaggc 240 gctctgaacg agatcaacaa caacttgcag cgcgttcgtg agttagcggt gcaatctgcc 300 aacagcacga atagccaatc tgacttagac agcatccagg ccgagatcac ccagcgtctt 360 aatgaaattg atcgcgtatc tggccagacg caatttaacg gggtcaaggt tcttgcgcaa 420 gataataccg gtggcggtgg ttctggtggg ggcggcagcg gatccggcgg tctgcagatg 480 ccgggcgaca cgccgacctt acatgagtac atgcttgatt tacagccgga aacgaccgat 540 ttatacggtt acgaacagtt gaacgactct agcgaggaag aagacgagat gcatcaaaaa 600 cgcaccgcca tgttccaaga tccgcaagaa cgtccgcgca aactgccgca gctttgcacc 660 gagctgcaaa ctaccattca tgacattatc cttgagtgcg tgtactgtaa acagcaatta 720 ttgcgtcgcg aagtatacga cttcgcgcgc cgtgacggtt gtattgtgta ccgtgacggt 780 aacccgtatg cagtctgcga caaatgcctg aagttttaca gcaagataag cgagtaccgt 840 cattattgtt attctttgta tggcaccacc cttgagcagc agtacaataa gccgctttgt 900 gatttgttga tccgttgcat taattgccag aaaccgttgt gcccggaaga aaagcagcgc 960 catttagaca agaagcagcg tttccataat attcgcgggc gctggaccgg tcgttgtatg 1020 agctgttgcc gttctagccg cactcgtcgt gaagaggaag aagacgagat tgacggtccg 1080 gcagggcagg ccgagccgga tcgcgctcat tataatatcg tgactttttg ttgtaagtgt 1140 gatagcaccc ttcgcctttg tgtgcaaagc acccatgttg acattcgtac tttgcgccgc 1200 ttattaatgg gcacgcttgg tattgtgtgc ccgatctgct ctcagaagcc gcaattgggt 1260 ggcaagcttg gtgggggcgg cagcggcggt ggcggttctt tgcagaaaat tgacgcggca 1320 cttgcgcagg tcgacaccct tcgcagtgac ctgggggcag ttcagaaccg ctttaattct 1380 gccattacga acctggggaa cactgtgaac aaccttacgt ctgcgcgctc tcgcatcgag 1440 gactctgatt atgcaactga agtgagcaat atgagccgcg cccaaatctt gcagcaggca 1500 ggcaccagcg ttcttgccca ggcaaaccaa gttccgcaaa atgtcctttc tcttcttcgt 1560 1560 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 cgacgcgcat atgatgcatc aaaaacgcac 30 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 8 gaacgcgcat atgatgccgg gcgacac 27 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 9 ctcgcctcga gttacggctt ctgagagcag 30

Claims

사람 파필로마바이러스 유형 16형 유래의 E6 단백질의 1번부터 155번, E7 단백질의 아미노산 1번부터 37번, 및 E7 단백질의 아미노산 33번부터 98번 잔기를 포함하며, 여기서 상기 E6 단백질은 54번, 및 57번의 잔기에 치환돌연변이를 가지며, 상기 E7 단백질은 2번, 24번, 80번, 및 81번 잔기의 치환돌연변이를 가지는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 E6 및 E7의 구조가 변형된 키메라 폴리펩타이드.
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제1항의 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 재조합 단백질.
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제 1항의 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제5항의 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제10항 또는 제11항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 12항의 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 인체 내의 세포를 제외한 분리된 형질전환 세포.
제 13항의 형질전환 세포를 이용하여 재조합 단백질을 포함하는 단백질을 인 비트로에서 발현하는 방법.
제 1항의 키메라 폴리펩타이드 또는 제5항의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 사람 파필로마바이러스 관련 질환의 치료 및 예방용 조성물.
제 15항에 있어서, 상기 사람 파필로마바이러스 관련 질환은 자궁경부암 질환인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 사람 파필로마바이러스 관련 질환의 치료 및 예방용 조성물.