[go: up one dir, main page]

KR102318994B1 - 치료학적 목적을 위한 항체-우레아제 접합체 - Google Patents

치료학적 목적을 위한 항체-우레아제 접합체 Download PDF

Info

Publication number
KR102318994B1
KR102318994B1 KR1020177023319A KR20177023319A KR102318994B1 KR 102318994 B1 KR102318994 B1 KR 102318994B1 KR 1020177023319 A KR1020177023319 A KR 1020177023319A KR 20177023319 A KR20177023319 A KR 20177023319A KR 102318994 B1 KR102318994 B1 KR 102318994B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
urease
antibody
single domain
conjugate
domain antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020177023319A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170131365A (ko
Inventor
차오 헤맨
야우 웡 와흐
티안 바오민
케인 가스파 킴벌리
쿰마르 프라빈
Original Assignee
헬릭스 바이오파마 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 헬릭스 바이오파마 코포레이션 filed Critical 헬릭스 바이오파마 코포레이션
Publication of KR20170131365A publication Critical patent/KR20170131365A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102318994B1 publication Critical patent/KR102318994B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01005—Urease (3.5.1.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

항체-우레아제 접합체를 포함하고 접합되지 않은 우레아제를 실질적으로 포함하지 않는 약제학적 조성물이 개시되어 있다. 이들 조성물은 크로마토그래피 정제를 필요로 하지 않는 방법으로 제조된다. 이들 약제학적 조성물은 항체-지시된 효소 전구약물 치료요법에 의해 암의 치료시 유용성을 가지며, 여기서 우레아제는 동일계내에서 내인성 우레아를 암모니아로 전환시켜 세포독성을 유도한다.

Description

치료학적 목적을 위한 항체-우레아제 접합체{ANTIBODY-UREASE CONJUGATES FOR THERAPEUTIC PURPOSES}
관련 출원에 대한 전후 참조
본 출원은 2015년 1월 23일자로 출원된 미국 가특허원 제62/107,210호의 출원일의 이점을 청구한다. 상기 출원은 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 양식으로 전자적으로 제출되어 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 서열 목록을 포함한다. 상기 ASCII 복사본은 2016년 1월 14일자로 생성되어 105013-1610_SL.txt로 명명되었으며 크기가 11,000 바이트이다.
발명의 분야
본 개시내용은 치료학적 유용성을 갖는 항체-우레아제 접합체(antibody-urease conjugate)를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 우레아제에 접합된 하나 이상의 항체를 갖는 치료학적 접합체, 이의 조성물, 용도 및 제조방법에 관한 것이다.
우레아제는 우레아를 이산화탄소와 암모니아로 가수분해시키는 것을 촉매하는 효소이다. 구체적으로, 우레아제는 우레아의 가수분해를 촉진시켜서 암모니아 및 카바메이트를 생산하며, 생산된 카바메이트는 자발적인 가수분해에 의해 후속적으로 분해되어 다른 암모니아 및 카본산을 생산한다. 이와 관련하여, 우레아제 활성은, 이것이 일반적인 독성을 지닌 염기성 분자인, 암모니아를 생산하는 국소 환경의 pH를 증가시키는 경향이 있다.
암의 치료시 종양 관련 항원을 표적화하는 항체를 사용하는 개념은 일찍이 인식되어 왔다(Herlyn et. al.,(1980) Cancer Research 40, 717). 그러나, 우레아제와 관련하여, 독성 성분은 우레아의 효소 분해에 의해 생산되고, 고 친화성 항체 단편이 사용된 알칼리성 환경이다.
발명의 요약
본 기술은 항체-우레아제 접합체에 관한 것이다. 본 기술은 정맥내 주사에 적합한 약제학적으로 허용되는 수용액 및 우레아제를 실질적으로 포함하지 않고/않거나, 접합되지 않은 항체를 포함하지 않고/않거나, 비-수성 HPLC 용매를 포함하지 않는 항체-우레아제 접합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기당 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기당 약 6개 이상의 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기당 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기당 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기당 약 6개 이상의 항체 잔기의 평균 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기 당 약 8 내지 11개의 항체 잔기의 평균 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 우레아제는 작두콩 우레아제(Jack bean urease)이다.
일부 국면에서, 항체는 사람화되거나 사람화되지 않은 항체이다. 일부 국면에서, 항체의 분자량은 약 5kDa 내지 약 200kDa이다. 일부 국면에서, 항체의 분자량은 약 5kDa 내지 약 50kDa이다. 일부 국면에서, 항체는 단일 도메인 항체이다. 일부 국면에서, 단일 도메인 항체는, 크기가 110개 아미노산 잔기, 또는 약 90 내지 130개 아미노산 잔기이다. 일부 국면에서, 단일 도메인 항체의 분자량은 약 10kDa 내지 약 50kDa이다. 일부 국면에서, 단일 도메인 항체의 분자량은 약 12kDa 내지 약 15kDa이다. 일부 국면에서, 항체는 종양 세포의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 일부 국면에서, 항체는 비-소 세포 폐 암종에 의해 발현된 종양 항원에 대해 특이성을 갖는다. 일부 국면에서, 항체는 CEACAM6에 대해 특이성을 갖는다.
일부 국면에서, 항체는, CEACAM6에 대한 결합 친화도가 약 1 x 10-6M 이상의 Kd 값이다. 일부 국면에서, 접합체는 CEACAM6에 대한 결합 친화도가 약 1 x 10-8M 이하의 Kd 값이다. 일부 국면에서, 접합체는, CEACAM6에 대한 결합 친화도가 약 1 x 10-10M 이하의 Kd 값이다. 일부 국면에서, 접합체는 CEACAM6에 대한 결합 친화도가 약 5nM 이하의 IC50 값이다. 일부 국면에서, IC50 값은 약 3nM 내지 약 5nM이다. 일부 국면에서, IC50 값은 약 3.22nM이다. 일부 국면에서, 접합체는 CEACAM6에 약 10μg/mL 내지 약 30μg/mL의 IC50 값으로 결합한다. 일부 국면에서, 접합체는 CEACAM6에 약 20μg/mL의 IC50 값으로 결합한다.
일부 국면에서, 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 국면에서, 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 변형을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 기술은 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에서 제공된 치료학적 유효량의 조성물을 투여함으로써, 대상체에서 암을 치료함을 포함하여, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 국면에서, 암은 비-소 세포 폐 암종, 유방암, 췌장암, 난소암, 폐암, 결장암, 또는 이의 조합 중 하나 이상이다. 일부 국면에서, 암은 비-소 세포 폐 암종이다. 일부 국면에서, 대상체는 사람이다.
본 기술은, pH가 약 6.0 내지 7.0, 예를 들면, 약 6.5인 수성 완충액 속에서 활성화된 항체 및 우레아제를 조합하는 단계, pH를 8.0 내지 9.0, 예를 들면, 약 8.3으로 조절하여 항체-우레아제 접합체를 형성시키는 단계, 및 항체-우레아제 접합체를 정제하는 단계를 포함하여, 우레아제가 실질적으로 없는 항체-우레아제 접합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서, 당해 방법은 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피, 액체-고체 흡착 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 역상 크로마토그래피(RPC), 및 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등을 포함하여, 단백질 정제를 위해 일반적으로 사용된 크로마토그래피 방법과 같은 크로마토그래피 정제 단계를 포함하지 않는다. 일부 국면에서, 항체-우레아제 접합체는 울트라다이아필트레이션(ultradiafiltration)에 의해 정제된다.
일부 국면에서, 항체-우레아제 접합체는 우레아제 잔기 당 8 내지 11개의 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, pH가 약 6.5인 완충액은 아세트산나트륨 완충액이다. 일부 국면에서, pH는 붕산나트륨 용액을 첨가함을 포함하는 방법에 의해 약 8.3으로 조절된다.
본 기술은 다수의 항체 분자를 우레아제 분자에 접합시켜 항체-우레아제 접합체를 형성시킴을 포함하여, 종양 항원에 대한 항체 결합 친화성을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 접합체는 종양 항원에 대한 결합 친화성이 접합되지 않은 항체보다 적어도 약 100배 더 높다.
일부 국면에서, 항체는 사람화된 항체 또는 비-사람 항체이다. 일부 국면에서, 항체는 단일 도메인 항체이다. 일부 국면에서, 종양 항원은 비-소 세포 폐 암종에 의해 발현된다. 일부 국면에서, 항체는 CEACAM6에 대해 특이성을 갖는다.
본 기술은 본원에 제공된 조성물을 포함하는 키트(kit) 및 당해 조성물의 사용을 위한 지시사항을 포함하는 키트(kit)를 추가로 제공한다.
본 개시내용의 이들 및 다른 국면은 하기에 추가로 기술되어 있다.
도 1의 A 및 B는 암 세포주에서 L-DOS47의 예시된 결합 및 세포독성 연구를 나타낸다.(A) 5개의 암 세포주: BxPC-3, Capan-1, ZR-75-30, LS174T, 및 MDA-MB231에 대한 L-DOS47의 직접적인 결합. 결합 시그날은 20mM의 우레아와 함께 항온처리시 생성된 암모니아의 양으로 나타내었다. 양호한 L-DOS47 결합은 BxPC-3(●), Capan-1(▼), 및 ZR-75-30(◆) 세포에서 관찰된 반면, 중간 결합은 LS174T 세포(▲)에서 관찰되었고 MDA-MB231 세포(■)에서는 결합이 발견되지 않았다. 또한, 상응하는 세포주에서 접합되지 않은 DOS47 대조군을 사용하여서는 결합이 관찰되지 않았으며(데이타는 나타내지 않음), 이는 L-DOS47 결합이 특이적이며 항체 잔기에 의해 기여되었음을 나타낸다.(B) L-DOS47은 20mM 우레아의 첨가시 암 세포주에서 세포독성을 유도하였다. MDA-MB231 세포(■)에서 효과가 관찰되지 않았으며, 이는 결합 연구와 일치하였다. BxPC-3(●) 및 ZR-75-30(◆)는 L-DOS47에 대해 매우 민감하였지만, Capan-1(▼) 및 LS174T 세포(▲)에서는 중간 효과만이 발견되었다.
도 2의 A 및 B는 BxPC-3 세포에 대한 L-DOS47, DOS47, 및 AFAIKL2 항체의 예시적인 직접적이고 경쟁적인 결합을 나타낸다.(A) 류테늄-태그된(ruthenium-tagged) L-DOS47, AFAIKL2 항체, 및 접합되지 않은 DOS47의 BxPC-3 세포에 대한 결합. 전기화학발광성 검정은 BxPC-3 세포에 대한 L-DOS47 및 AFAIKL2 항체 결합의 적접적인 측정을 제공한다. 약한 결합 시그날은 AFAIKL2 항체(▲)를 사용하여 관찰되었지만, L-DOS47은 항체 접합체 상에 표시된 다수의 AFAIKL2 항체의 결합활성(avidity)로 인하여, 훨씬 더 강력한 결합 시그날(●)을 나타내었다. 음성 대조군 DOS47(◇)을 사용하여서는 아무런 결합도 관찰되지 않았다.(B) BxPC-3 세포에 대한 L-DOS47-태그의 결합은 L-DOS47, AFAIKL2 항체, 또는 DOS47과 경쟁하였다. L-DOS47 및 AFAIKL2 항체 둘 다의 명백한 결합 친화성은 시험 물품의 IC50(결합에 있어서 50% 감소를 유발하는데 필요한 경쟁인자의 양)으로 비교할 수 있다. L-DOS47(●) 및 AFAIKL2 항체(▲)의 IC50은 각각 2 및 20μg/mL(또는 3.22nM 및 1.55μΜ)로 평가되었으며, 이는 L-DOS47의 결합 친화성이 AFAIKL2 항체의 것의 약 500배임을 나타낸다. 음성 대조군 DOS47(◇)을 사용한 억제는 관찰되지 않았다. 결과는 대표적인 실험의 평균(n=3)을 나타낸다.
도 3의 A 내지 C는 CEACAM6 유전자의 예시적인 과발현 및 녹다운(knockdown)을 나타낸다. (A) CEACAM6-형질감염된 H23 세포에 대한 L-DOS47의 결합. 형질감염된 세포주(▲)의 집단을 증가된 양의 선택 항생제와 함께 FACS 세포 분류로 농축시켰다. 천연의 H23 세포(○) 및 A549 세포(Δ)의 결합 프로파일과 비교한 것으로서의 결합 프로파일은, CEACAM6이 A549 세포의 것보다 더 낮은 수준으로 형질감염된 세포에서 발현되었음을 나타내었다. (B) CEACAM6-형질감염됨 H23 세포에서 L-DOS47의 세포독성 검정. H23 세포에서 CEACAM6 과발현(▲)은 BxPC-3(●), A549(Δ), 및 천연의 H23(○) 세포와 비교하여 L-DOS47 세포독성에 대한 현저히 향상된 이들의 민감성을 가진다. 흥미롭게도, 형질감염된 H23 세포는 보다 약한 L-DOS47 결합이 (A)에서 관찰되었음에도 불구하고, A549 및 BxPC-3 세포 둘 다에서보다 L-DOS47 세포독성에 대해 보다 민감하였다. (C) CEACAM6 유전자가 녹다운된 BxPC-3 세포에 대한 L-DOS47의 결합. 우수한 결합 시그날이 천연(●) 및 대조군(HUSH-TR3 ▲) BxPC-3 세포에서 관찰되었다. 그러나, L-DOS47 결합은, CEACAM6 유전자가 shRNA(HUSH#6 ▼ 및 HUSH#7 Δ)에 의해 사일런스(silence)되었으므로 상실되었으며, 이는, CEACAM6이 항체 접합체에 의해 인식되는 표면 항원임을 나타낸다. 당해 결과는 대표적인 실험의 평균(n=3)을 나타낸다. 표준 편차(SD)는 모든 값의 10% 미만이었다.
도 4는 L-DOS47을 사용한 사람 결장 및 폐 암종의 면역조직화학 염색을 나타낸다. 양성의 염색은 어두운 색상으로 나타낸다.
도 5는 AFAIKL2 항체의 아미노산 서열(서열 번호: 1)을 나타낸다.
도 6은 2단계 반응에 의한 L-DOS47 접합체 생성물의 합성을 예시한다. 단계 1은 SIAB를 사용한 항체의 활성화이고, 단계 2는 활성화된 항체와 우레아제 효소를 접합시켜 바이오접합체 L-DOS47을 형성함을 포함한다.
도 7은 제형 블랭크(formulation blank), AFAIKL2, 고 순도 우레아제(HPU) 및 접합체 L-DOS47의 예시적인 크기 배제 크로마토그램을 나타낸다. 각각의 성분에 대한 이량체의 매우 작은 피크는 각각의 단량체 피크의 앞쪽에 나타난다. 제형 블랭크는 lOmM 히스티딘, 1% 슈크로즈, 0.2mM EDTA, pH 6.8을 함유한다.
도 8은 제형 블랭크(A), L-DOS47(B) 및 2.4%로 스파이크된 L-DOS47(C), 4.8%(D) 및 7.2%(E) HP 우레아제(HPU)의 예시적인 이온 교환 크로마토그램을 나타낸다. 제형 블랭크는 lOmM 히스티딘, 1%(w/v) 슈크로즈, 0.2mM EDTA, pH 6.8을 함유한다.
도 9는 엑스페리온(Experion) SDS 윈도우(window)의 예시적인 스냅사진(snapshot)을 나타낸다. 패널 1: 레인 2 및 4의 전기영동도의 오버레이(overlay). 패널 2: 레인 L, 분자량(MW) 래더(ladder); 레인 1,2,7 및 8: 추가의 IEC 정제를 거친 활성화된 AFAIKL2로 생산된 L-DOS47; 레인 3-6: 추가의 IEC를 겪지 않은 AFAIKL2로 생산된 L-DOS47; 레인 9 및 10, HPU. 패널 1에서, x-축의 패널 1에서 번호 2 내지 14는 레인 1으로부터의 전기영동도의 피크 번호이다; 3*는 최저 분자량 마커 피크를 나타내고 14*는 내부 MW 표준에 대한 최대 MW 마커 피크를 나타낸다.
도 10은 0 내지 4번 항체 분자와 연결된 우레아제 소단위에 대한 별개의 피크를 나타내는 L-DOS47(도 9로부터의 레인 2)의 예시적인 전기영동도를 나타낸다. x-축의 번호 1 내지 11은 피크 번호이고; 3*은 최저 분자량 마크 피크를 나타내며 11*는 내부 MW 표준에 대한 최대 MW 마커 피크를 나타낸다.
도 11은 L-DOS47의 결합 활성에 있어서 접합 비의 예시적인 효과를 나타낸다. L-DOS47은 상이한 항체 접합 비(1.8 내지 12)로 제조하였다. 고정화된 CEACAM6-A 분자에 대한 L-DOS47 샘플의 직접적인 결합을 측정하였다.
도 12는 AFAIKL2, 우레아제, 및 L-DOS47의 예시적인 웨스턴 블롯(western blot)을 나타낸다. 좌측 패널: L-DOS47, 우레아제, 및 AFAIKL2(꼬마지에 블루 염색됨)의 겔 전기영동. 중간 패널: 항-AFAIKL2 항체로 프로브된 AFAIKL2, 우레아제, 및 L-DOS47(표준 로드 및 5x 오버로드)의 웨스턴 블롯. 우측 패널: 항-우레아제 항체로 프로브된 AFAIKL2, 우레아제, 및 L-DOS47(표준 로드 및 5x 오버로드)의 웨스턴 블롯. 삽도 박스(inset box): L-DOS47의 확대.
도 13은 AFAIKL2-Cys-FL의 트립신 분해의 420nm에서 예시적인 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 확인된 접합된 펩타이드 및 이들의 펩타이드 질량은 상응하는 HPLC 피크에서 나타낸다.
도 14는 암 세포주 BxPC-3, A549, 및 MCF7에 대한 L-DOS47의 예시적인 직접적인 결합을 나타낸다. 결합 시그날은 20 mM 우레아와의 항온처리시 생성된 암모니아의 양으로 나타내었다. 상승된 L-DOS47 결합은 BxPC-3(●)에서 관찰된 반면, 중간 결합은 A549 세포(▲)에서 관찰되었고 MCF7 세포(▼)에서는 결합이 발견되지 않았다. 또한, 상응하는 세포주(○, △, ▽)에서 접합되지 않은 DOS47 대조군을 사용하여 결합은 발견되지 않았으며, 이는 L-DOS47 결합이 BxPC-3 및 A549 세포에 대해 특이적이었음을 나타낸다.
도 15는 20mM의 우레아의 첨가시 BxPC-3 및 A549 세포에서 L-DOS47 유도된 세포독성의 예를 나타낸다. MCF7 세포(▼)에서 효과가 관찰되지 않았다. BxPC-3(●)는 L-DOS47에 대해 매우 민감했으나, A549 세포(▲)에서는 중간 효과 만이 관찰되었다. 또한, 상응하는 세포주(○, △, ▽)에 대해 접합되지 않은 DOS47 대조군을 사용하여서는 결합이 관찰되지 않았다. 그래프의 결과는 대표적인 실험의 평균(n=3)을 나타낸다. 표준 편차(SD)는 모든 값의 10% 미만이었다.
상세한 설명
본 개시내용은 물론 변할 수 있으므로, 기술된 특수한 국면 또는 구현예에 한정되지 않음이 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 영역은 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 것이므로, 본원에 사용된 기술은 특수한 국면 또는 구현예만을 기술하기 위한 목적이며, 한정되는 것으로 의도되지 않는다.
본 개시내용의 상세한 설명은 독자의 편의를 위해서만 다양한 단락으로 나누어져 있으며 어떠한 단락에서 발견된 개시내용도 다른 단락에서의 내용과 합해질 수 있다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
정의
본원 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 것으로서, 단수형("a", "an", 및 "the")는, 내용이 달리 명확하게 기술하지 않는 한 다수의 참고를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "화합물"에 대한 참고는 다수의 화합물들을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "약"은, 수치 지정, 예를 들면, 온도, 시간, 양, 농도, 및 범위를 포함하는 이러한 다른 것에 사용되는 경우, 기술된 값의 (+) 또는 (-) 10%, 5% 또는 1%까지 변할 수 있는 대략치를 나타낸다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "투여"는 1회 투여량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 또는 응집체 속에서 단일 투여량을 위해 제공되는 수회의 소-투여량(sub-dose)에 의해 시행될 수 있다. 투여는 치료 과정 전체에서 수행될 수 있다. 가장 효과적인 투여 수단 및 투여 용량을 결정하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 치료요법, 치료요법의 목적, 치료되는 표적 세포 및 치료되는 대상체에 대해 사용된 조성물에 따라 변할 것이다. 단일 또는 다중 투여가 치료하는 주치의에 의해 선택되는 투여량 수준 및 양식으로 수행될 수 있다. 적합한 용량 제형 및 제제를 투여하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 투여 경로를 또한 결정할 수 있으며 가장 효과적인 투여 경로를 결정하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있고 치료에 사용된 조성물, 치료 목적, 치료되는 대상체의 건강 조건 또는 질병 단계 및 표적 세포 또는 조직에 따라 변할 것이다. 투여 경로의 비-제한적 예는 경구 투여, 질, 비강 투여, 주사, 국소 적용, 설하, 폐, 및 좌제를 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "친화성"은 예를 들면, 항체와 이의 항원 사이의 수용체와 이들의 리간드 사이의 결합 강도를 말한다. 용어 "Kd" 또는 "해리 상수"는 항체와 항원 사이의 친화성, 즉, 항체가 특수한 항원에 얼마나 강하게 결합하는지를 말한다. 용어 "IC50" 또는 "최대 억제 농도의 1/2"은 시험 물품의 결합에 있어서 50% 감소를 유발하는데 요구되는 경쟁인자의 양을 나타낸다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "아미노산"은 바람직한 작용 특성이 폴리펩타이드에 의해 보유되는 한, 천연 아미노산 및 합성 아미노산 둘 다 등을 포함하는, L-아미노산 또는 D-아미노산 또는 이의 혼합물을 말한다. NH2는, 펩타이드 서열의 시작시에 사용되는 경우, 폴리펩타이드의 아미노 말단(또는 N-말단)에 존재하는 유리 아미노 그룹을 말한다. COOH는, 펩타이드 서열의 말단에서 사용되는 경우, 폴리펩타이드의 카복시 말단(또는 C-말단)에 존재하는 유리 아미노 그룹을 말한다. 아미노산 잔기에 대한 표준 폴리펩타이드 약어는 다음과 같다: A(Ala 또는 알라닌); C(Cys 또는 시스테인); D(Asp 또는 아스파르트산); E(Glu 또는 글루탐산); F(Phe 또는 페닐알라닌); G(Gly 또는 글리신); H(His 또는 히스티딘); I(Ile 또는 이소루이신); K(Lys 또는 라이신); L(Leu 또는 루이신); M(Met 또는 메티오닌); N(Asn 또는 아스파라긴); P(Pro 또는 프롤린); Q(Gln 또는 글루타민); R(Arg 또는 아르기닌); S(Ser 또는 세린); T(Thr 또는 트레오닌); V(Val 또는 발린); W(Trp 또는 트립토판); X(Xaa 또는 알려지지 않거나 다른 것); Y(Tyr 또는 타이로신); Z(Glx/Gln/Glu 또는 글루탐산/글루타민); 및 Dpr(2,3-디아미노프로피온산). 화학식으로 본원에 나타낸 모든 아미노산 잔기 서열은 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지의 통상의 방향에서 좌측-내지-우측 배향을 갖는다. 아미노산 잔기 서열의 시작부 또는 말단부에서 줄표(dash)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가의 서열에 대한 펩타이드 결합 또는 NH2 또는 아세틸과 같은 아미노-말단 그룹에 대한 또는 COOH와 같은 카복시-말단 그룹에 대한 공유 결합을 나타낸다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "포함하는(comprising)" 또는 "포함하다(comprise)"는, 조성물 및 방법이 인용된 성분을 포함하지만, 다른 것들을 배제하지는 않음을 의미하는 것으로 의도된다. "조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 경우 "필수적으로 이루어진"은 기술된 목적을 위한 조합에 대한 어떠한 필수적인 유의성의 다른 성분을 배제함을 의미할 것이다. 따라서, 본원에 정의된 것으로서 성분들로 필수적으로 이루어진 조성물 또는 공정은 개시내용의 기본적인 및 신규 특징(들)에 물질적으로 영향을 미치지 않는 다른 물질 또는 단계들을 배제하지 않을 수 있다. "로 이루어진"은 다른 성분들의 미량 이상의 요소 및 실제 방법 단계들을 배제함을 의미할 것이다. 이들 이행 용어들 각각으로 정의된 구현예는 본 개시내용의 영역내에 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "활성제", "약물" 및 "약리학적 활성제"는 본원에서 상호교환적으로 사용되어, 대상체에게 투여되는 경우 바람직한 약리학적 효과를 유도하며, 방사핵, 약물, 항암제, 독소 등을 포함하는 치료제를 포함하는 것으로 의도되는 화학적 물질 또는 화합물을 말한다. 예시적인 활성제는 항체 우레아제 접합체이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체"는 항원에 대해 결합 친화성을 지닌 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질을 말한다. 대표적인 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 폴리펩타이드 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경" 쇄 및 하나의 "중"쇄를 갖는다. 각각의 쇄의 N-말단은 항원 인식에 주로 관여하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 "가변 경쇄"(VL) 및 "가변 중쇄"(VH)는 이들 경쇄 및 중쇄 각각을 말한다. 항체는 완전한 면역글로불린으로서 또는 자체가 이황화물 결합에 의해 VH-CHl에 결합된 경쇄인 Fab의 이량체인 F(ab)'2와 같은 단편으로서 또는 힌지 영역(hinge region)에서 이황화물 연결의 파괴로 생성될 수 있는, Fab' 단량체와 같은 단편으로서 존재한다. Fab' 단량체는 필수적으로 힌지 영역의 일부를 지닌 Fab이다(다른 항체 단편의 보다 상세한 설명에 대해서는 Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y.(1993) 참고). 항체 단편은 예를 들면, 다양한 펩티다제에 의한 완전한 항체의 절단에 의해 생산될 수 있거나, 화학적으로 새로이(de novo) 합성되거나, 재조합체 DNA 기술을 사용함으로서 생산될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체"는 또한 항체의 변형에 의해 생산되거나 재조합체 DNA 방법을 사용하여 새로이 합성된 항체 단편을 포함한다. 항체는 일본쇄 Fv(sFv) 항체를 포함하는, 일본쇄 항체를 포함하며, 여기서 VH 및 VL은 함께(직접 또는 펩타이드 링커(peptide linker)를 통해) 연결되어 연속적인 폴리펩타이드를 형성한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "단일 도메인 항체"(sdAb 또는 "VHH")는 당해 유형의 항체의 단일 중쇄 가변 도메인을 말하고 일부 국면에서 경쇄가 천연적으로 결여된 낙타과 포유동물에서 발견할 수 있다. 일부 국면에서, 단일 도메인 항체는 VH 영역, VHH 영역 또는 VL 영역으로부터 기원할 수 있다. 일부 국면에서, 단일 도메인 항체는 사람 기원이다. 일부 국면에서, 사람 단일 도메인 항체는, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 제WO2006/099747호 및 제WO2009/079793호 및 제WO2012/100343호에 개시된 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다. 일 국면에서, 사람 단일 도메인 항체는 제WO2012/100343호에 논의된 바와 같은 골격 영역내에 이황화물 결합을 지닌 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체 단편"은 또한 특이적인 항원에 결합하여 복합체를 형성함으로써 항체와 같이 작용하는 어떠한 합성 또는 유전적으로 가공된 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "접합체"는 공유 연결되어 보다 큰 작제물을 형성하는 2개 이상의 분자를 말한다. 일 국면에서, 2개의 분자는 직접적인 연결에 의해 연결되며, 여기서 우레아제의 반응성 작용 그룹은 아스파르트산 또는 글루탐산의 카복실 작용기에 결합하는 라이신의 아미노 작용성과 같이 항체에서 상보성인 반응성 작용 그룹에 결합한다. 이러한 반응은 카복실 그룹이 보다 반응성이 되도록 하는 통상의 변형을 필요로 할 수 있는 것으로 이해되어지고 있다. 다른 국면에서, 2개의 분자는 링커(linker) 잔기를 통해 연결된다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "단백질", "폴리펩타이드", 또는 "펩타이드"는, 본원에 사용된 것으로서, 상호교환적으로 언급된다. 단백질은 이의 소단위 서열에 의해 나타낸 1차 구조를 가지며, 나선 또는 주름 구조, 및 전체적인 3-차원 구조를 가질 수 있다. "단백질"이 일반적으로 예를 들면, 100개 이상의 아미노산을 함유하는 비교적 큰 폴리펩타이드를 일반적으로 언급하고 "펩타이드"는 보다 작은 폴리펩타이드를 언급하지만, 이들 용어들은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 즉, 용어 "단백질"은 보다 큰 폴리펩타이드, 및 또한 보다 작은 펩타이드, 및 이의 역으로 언급될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "표적화 잔기"는 세포 또는 선택된 세포 유형의 정의된 집단에 결합하는 분자를 말한다. 표적화 잔기는 수용체, 올리고뉴클레오타이드, 효소 기질, 항원성 결정인자, 또는 표적 세포 또는 세포 집단 위에 또는 속에 존재하는 다른 결합 부위에 결합할 수 있다. 예시적인 표적화 잔기는 항체이다. 발현된 항체를 인식할 수 있는 항체 단편 및 소 펩타이드 서열은 또한 고려된 표적화 잔기이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는, 본원에 사용된 것으로서, 질병 또는 상태 또는 이의 하나 이상의 증상을 완화시키거나, 약화시키거나 개선시키거나, 추가의 증상을 예방하거나, 증상의 근본적인 대사 원인을 개선시키거나 예방하거나, 질병 또는 상태를 억제, 예를 들면, 질병 또는 상태의 발달을 정지시키거나 제어하거나, 질병 또는 상태를 완화시키거나, 질병 또는 상태의 회귀(regression)를 유발하거나, 질병 또는 상태에 의해 유발된 상태를 경감시키거나, 질병 또는 상태의 증상을 제어함을 포함하며, 예방을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 또한 질병 또는 상태를 경감시키는 것, 예를 들면, 임상 증상의 회귀를 유발하는 것을 포함한다. 상기 용어는 또한 치료학적 이점 및/또는 예방학적 이점을 달성하는 것을 포함한다. 치료학적 이점은 치료되는 근본적인 장애의 근절 또는 개선을 의미한다. 또한, 치료학적 이점은 근본적인 장애와 관련된 하나 이상의 생리학적 증상의 근절 또는 개선에 의해 달성되므로 개인이 여전히 근본적인 장애로 고통받고 있다고 해도, 이러한 개선은 상기 개인에서 관찰된다.
용어 "대상체", "개인" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되어 치료의 어떠한 표적도 언급한다. 또한 본 기술에 의해 제자리에서(in situ), 또는 이들의 일반적인 위치 또는 자리에서의 종양 세포, 예를 들면, 유방 종양 또는 전립샘 종양의 신생물 세포를 치료하는 방법이 제공된다. 이들 제자리 종양은 광범위한 숙주; 예를 들면 사람 대 숙주, 개과 숙주, 고양이과 숙주, 말 숙주, 소 숙주, 돼지 숙주 등의 내부 또는 외부에 위치할 수 있다. 종양 또는 종양 세포가 발견된 어떠한 숙주도 치료할 수 있으며 본 기술에 따른다. 따라서, 대상체는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 사람을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 입자 "가 실질적으로 포함되지 않은"은 입자를 완전히 결여하거나, 또는 효과가 입자가 완전히 결여된 경우와 동일한 수 있도록 입자를 거의 완전히 결여한 것일 수 있다. 다시 말해서, 성분 또는 요소"가 실질적으로 포함되지 않은" 조성물은 이의 측정가능한 효과가 없는 한 이러한 항목을 여전히 실제적으로 함유할 수 있다. 용어 "실질적으로"는 달리 나타내지 않는 한 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상을 의미한다. 일부 구현예에서, 항체-우레아제 접합체를 포함하는 조성물은 접합되지 않은 우레아제가 실질적으로 포함되지 않으며 이는 조성물이 약 90% 이상의 항체-우레아제 접합체, 약 95% 이상의 항체-우레아제 접합체, 약 96% 이상의 항체-우레아제 접합체, 약 97% 이상의 항체-우레아제 접합체, 약 98% 이상의 항체-우레아제 접합체, 또는 약 99% 이상의 항체-우레아제 접합체를 함유함을 의미한다. 다시 말해서, 조성물은 약 0.1% 미만의 접합되지 않은 우레아제, 약 0.5% 미만의 접합되지 않은 우레아제, 약 1% 미만의 접합되지 않은 우레아제, 약 2% 미만의 접합되지 않은 우레아제, 약 3% 미만의 접합되지 않은 우레아제, 약 4% 미만의 접합되지 않은 우레아제, 약 5% 미만의 접합되지 않은 우레아제, 또는 약 10% 미만의 접합되지 않은 우레아제를 함유한다. 용어 "접합되지 않은 우레아제"는 항체에 접합된 접합체가 없는 우레아제를 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "우레아제"는 천연적으로 존재하거나 예를 들면, 재조합체 핵산 기술 및/또는 화학 합성에 의해 수득된, 우레아 아미도하이드롤라제(E.C. 3.5.1.5)의 효소 활성을 갖는 효소를 말한다. 우레아제는 또한 전체 우레아제, 이의 소단위, 또는 단편, 및/또는 폴리펩타이드의 우레아 아미도하이드롤라제 활성을 보존하는 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 지닌 우레아제를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "DOS47"은 정제된 우레아제를 말한다.
항체-우레아제 접합
본 기술은 항체-우레아제 접합에 관한 것이다. 본 기술은 정맥내 주사용으로 적합한 약제학적으로 허용되는 수용액 및 우레아제가 실질적으로 포함되지 않은, 접합되지 않은 항체가 포함되지 않는, 및 비-수성 HPLC 용매가 포함되지 않는 항체-우레아제 접합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 비-수성 HPLC 용매는 제조 HPLC 또는 HPLC 정제에 일반적으로 사용된 유기 용매, 예를 들면, 메탄올, 아세토니트릴, 트리플루오로아세트 산 등을 포함한다. 일부 국면에서, 항체-우레아제 접합체는 포스페이트 완충액으로부터 인산염을 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 국면에서, lOmM 포스페이트, 50mM NaCl을 함유하는 포스페이트 완충액, pH 7.0이 SEC 정제용으로 사용된다. 일부 국면에서, HPLC 정제는 항체-우레아제 접합체를 생산 제조하는데 있어서 실행된다.
일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기 당 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기 당 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기 당 약 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기 당 약 6개 이상의 항체 잔기의 평균 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기 당 약 8, 9, 10, 또는 11개의 항체 잔기의 평균 접합 비를 갖는다.
일부 국면에서, 연결은 공유 결합 또는 직접적인 연결이며, 여기서 우레아제 상의 반응성 작용 그룹은 항체에서 상보성인 반응성 작용 그룹, 예를 들면, 아스파르트산 또는 글루탐산의 카복실(COOH) 작용기, 또는 시스테인의 설프하이드릴(SH)에 결합하는 라이신의 아미노(NH2) 작용기에 결합한다. 이러한 반응은 카복실 그룹을 보다 더 반응성이 되도록 하는 카복실 그룹의 통상적인 변형을 필요로 할 수 있다.
반응성 작용기는 옥살산, 석신산 등과 같이 동일할 수 있거나 아미노(이는 접합 후 NH가 된다) 및 카복실(이는 접합 후 CO 또는 COO가 된다) 그룹과 같은 직교 작용기(orthogonal functionality)일 수 있다. 또한, 항체 및/또는 우레아제는 유도체화되어 추가의 반응성 작용 그룹을 노출시키거나 부착시킬 수 있다. 유도체화는 Pierce Chemical Company, Rockford 111로부터 이용가능한 것들과 같은 다수의 링커 분자(linker molecule) 중의 어느 것의 부착을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "링커"는 우레아제에 대한 항체와 같이, 활성제에 대해 표적화 잔기를 연결시키기 위해 사용된 분자이다. 링커는 표적화 잔기 및 활성제 둘 다에 대해 공유 결합을 형성할 수 있다. 적합한 링커는 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있으며 직쇄 또는 측쇄 탄소 링커, 헤테로사이클릭 탄소 링커, 또는 펩타이드 링커를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 표적화 잔기 및 활성제 분자가 폴리펩타이드인 경우, 링커는 이들의 측면 그룹을 통해(예를 들면, 시스테인에 대한 이황화물 연결을 통해) 구성성분 아미노산에 결합할 수 있다. 하나의 바람직한 국면에서, 링커는 말단 아미노산의 알파 탄소 아미노 및 카복실 그룹에 결합될 것이다. 일부 국면에서, 연결은, 우레아제 및 항체 둘 다와 반응하도록 하는, 카복시 또는 아미노와 같은 2개 이상의 작용기를 갖는 링커를 통할 수 있다. 링커는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 전형적으로 탄소, 질소, 수소, 산소, 황 등을 포함한 1 내지 20개의 원자를 포함한다.
우레아제의 그룹과 반응성인 하나의 작용성 그룹, 및 항체와 반응성인 다른 그룹를 갖는 이작용성 링커를 사용하여 바람직한 면역접합체를 형성할 수 있다. 또한, 유도체화는 표적화 잔기의 화학적 처리, 예를 들면, 유리 알데하이드 그룹을 생성하기 위한 과옥소산염을 사용한 당단백질 항체의 당 잔기의 글리콜 전달을 포함할 수 있다. 항체에서 유리 알데하이드 그룹은 이에 대한 제제와 결합하기 위해 제제에서의 유리 아민 또는 하이드라진 그룹과 반응할 수 있다(참고: 미국 특허 제4,671,958호). 항체 또는 항체 단편과 같은, 폴리펩타이드에서의 유리 설프하이드릴 그룹의 생성을 위한 과정은 또한 알려져 있다(참고: 미국 특허 제4,659,839호).
다른 링커 분자 및 이의 용도는 예를 들면, 유럽 특허원 제188,256호; 미국 특허 제4,671,958호, 제4,659,839호, 제4,414,148호, 제4,699,784호; 제4,680,338호; 제4,569,789호; 및 제4,589,071호; 및 Borlinghaus et al.(1987) Cancer Res. 47: 4071-4075)에 기술된 것들을 포함한다.
일부 국면에서, 연결은 표적 부위에서 또는 이의 근처에서 절단될 수 있으며 우레아제는, 접합체 분자가 이의 표적 부위에 도달하는 경우 표적 잔기로부터 유리된다. 연결을 절단하여 표적화 잔기로부터 우레아제를 방출하는 것은, 접합체가 표적 세포 내부 또는 표적 부위와 근접하여 처해지는 조건 또는 효소 활성에 의해 촉진될 수 있다. 일부 국면에서, 종양 부위(예를 들면, 종양-관련 효소 또는 산성 pH에 노출된 경우)에 존재하는 조건 하에서 절단될 수 있는 링커를 사용할 수 있다.
절단가능한 링커는 예를 들면, 미국 특허 제4,618,492호, 제4,542,225호, 및 제4,625,014호에 기술된 것들을 포함한다. 이들 링커 그룹으로부터 활성제의 방출을 위한 메카니즘은 예를 들면, 광분해성 결합의 조사(irradiation) 및 산-촉매된 가수분해를 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 제4,671,958호는 환자의 보체계(complement system)의 단백질분해 효소에 의해 생체내에서(in vivo) 표적 부위에서 절단되는 링커를 포함하는 면역접합체의 설명을 포함한다. 일부 국면에서, 적합한 링커는 아미노산의 잔기 또는 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 스페이서(peptide spacer)의 잔기이다.
일부 국면에서, 적합한 링커는 R1-L-R2이며, 여기서 R1 및 R2는 동일하거나 상이한 작용 그룹이고, 이들 중 하나는 항체에 연결되어 있고 다른 것은 우레아제에 연결되어 있다. R1 및 R2는 -NH-, -CO-, -COO-, -0-, -S-, -NHNH-, -Ν=Ν-, =N-NH- 등으로부터 독립적으로 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. L은 알킬쇄와 같은 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 쇄일 수 있으며, 여기서 탄소중 하나 이상은 산소, 질소, 아미드, 황, 설폭사이드, 설폰, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 등으로 임의 대체된다. 일부 국면에서, 링커는 아미노산 잔기 또는 펩타이드일 수 있다. 일부 상황에서, 링커는 표적 부위에서의 또는 이와 근접한 pH에서 효소 또는 변화에 의해 절단될 수 있다. 특정의 링커 및 접합체를 제조하기에 적합한 과정은 미국 특허 제4,414,148호, 제4,545,985호, 제4,569,789호, 제4,671,958호, 제4,659,839호, 제4,680,338호, 제4,699,784호, 제4,894,443호, 및 제6,521,431호에 기술되어 있다. 일부 국면에서, 링커는
Figure 112017080901044-pct00001
이고, 여기서
Figure 112017080901044-pct00002
및 -----는 항체 또는 우레아제에 대한 연결점을 나타낸다. 일부 국면에서,
Figure 112017080901044-pct00003
는 항체의 아미노 그룹에 대한 연결점을 나타내고 ----는 우레아제의 티오 그룹의 S 원자에 대한 연결점을 나타낸다. 당해 링커는 항체 및 우레아제를 접합시키기 위해 연결제(linking agent) SIAB(N-석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노-벤조에이트)를 사용하는 잔기이다. 일부 국면에서, 울트라필트레이션(ultrapurification)은 교차 연결제(cross linking agent)로서 SIAB를 사용하는 접합 방법에 적합한 분리 방법이다.
일부 국면에서, 링커는 다음 화학식의 링커제를 사용하는 잔기이다:
Figure 112017080901044-pct00004

상기식에서,
X는 브로모 또는 요오도이고,
L은 본원에 기술된 바와 같은 링커이다.
일부 국면에서, 링커제는 SBAP(석신이미딜 3-[브로모아세트아미노]프로피오네이트) 또는 SIA(N-석신이미딜 요오도아세테이트)이며, 이는 SIAB의 경우와 같이, 유사한 조건(예를 들면, HPLC 크로마토그래피 정제가 필요하지 않고 울트라다이아필트레이션 만이 필요할 수 있음) 하에서 접합을 위해 사용될 수 있다. 일부 국면에서, SIAB의 연결 아암 길이(arm length)(10.6 옹스트롱(Anstrong))는 SBAP(6.2Å) 및 SIA(1.5Å)의 것보다 더 적합하고/굴곡성이다. 일부 국면에서, 연결제는 SPDP(석신이미딜 3-(피리딜디티오)프로피오네이트), SMPT(석신이미딜옥시카보닐-메틸-(2-피리딜디티오)톨루엔) 또는 SMCC(석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-카복실레이트)이며, 이는 접합에 사용될 수 있으나, IEC 및 에탄올 분획화와 같은 하나 이상의 분리 방법이 접합 반응 용액으로부터 반응하지 않는 우레아제를 보다 낮은 수율로 분리하는데 필요할 수 있다.
심지어 추가로, 항암제와 같은 치료제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 추가의 성분을 또한 항체에 결합시켜 치료학적 효과를 추가로 향상시킬 수 있다.
우레아제
다수의 연구는 여러 가지의 진화론적으로 다양한 세균, 식물, 진균 및 바이러스로부터 우레아제의 유전학에 대한 상세한 정보를 제공하여 왔다(참고: Mobley, H. L. T. et al.(1995) Microbiol. Rev. 59: 451-480; Eur J. Biochem., 175, 151-165(1988); Labigne, A.(1990) 국제 특허 공보 제WO 90/04030호; Clayton, C. L. et al.(1990) Nucleic Acid Res. 18, 362; 및 미국 특허 제6,248,330호 및 제5,298,399호, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다). 특히 흥미있는 것은 식물에서 발견되는 우레아제이다(참고: Sirko, A. and Brodzik, R.(2000) Acta Biochim Pol 47(4): 1189-95). 하나의 예시적인 식물 우레아제는 작두콩 우레아제이다. 다른 유용한 우레아제 서열은 공지된 데이타베이스, 예를 들면, Entrez(ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)에서 확인할 수 있다.
일부 국면에서, 우레아제는 작두콩 우레아제이다. 작두콩 우레아제는 하기 나타낸 바와 같은 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112017080901044-pct00005

(서열 번호: 2)
유용한 우레아제 서열은 공지된 데이타베이스, 예를 들면, Entrez(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)에서 확인할 수 있다. 또한, 광범위한 유기체로부터 우레아제를 증폭시키는데 유용한 프라이머는 베이커, 케이. 엠.(Baker, K. M.) 및 콜리어, 제이. 엘(Collier, J. L.)에 의해 기술된 바와 같이(http : //www. science. smith. edu/departments/Biology/lkatz/NEMEB_webpage/abstracts.html) 또는 문헌(참고: Rose, et al.(1998) Nucl. Acids Res. 26: 1628)에 기술된 바와 같이 CODEHOP(콘센수스-퇴화된 하이브리드 올리고뉴클레오타이드 프라이머: COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer)를 사용하여 활용할 수 있다.
우레아제는 기질 우레아를 암모니아 및 카바메이트로 전환시킬 수 있다. 당해 효소 활성은 pH를 증가시켜 환경을 보다 염기성으로 만들 수 있다. 암 세포 주변의 환경은 전형적으로 산성이다(참고: Webb, S.D., et al.(2001) Novartis Found Symp 240: 169-81). 따라서, 이러한 방식으로 세포외 환경의 pH를 상승시킴으로써 암 세포의 성장을 억제한다. 따라서, 본 기술의 특정 국면에서, 항체-우레아제 접합체의 첨가는 간질액의 pH를 약 0.1 pH 단위, 예를 들면, 0.1 내지 0.5 pH 단위 이상으로 상승시킬 수 있다.
본 기술의 우레아제는 우레아제의 천연적으로 발생하는 형태 및 이의 작용적으로 활성인 변이체를 포함한다. 아미노산 서열 변이체의 2개의 일반적인 유형이 고려된다. 아미노산 서열 변이체는 우레아제 활성을 파괴하지 않는 구체적인 아미노산내에 하나 이상의 치환을 갖는 것들이다. 이들 변이체는 사일런트 변이체(silent variant) 및 천연 단백질과 실질적으로 상동성이고 작용적으로 동등한 보존적으로 변형된 변이체를 포함한다. 천연 단백질의 변이체는, 이의 아미노산 서열의 적어도 약 80%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 여전히 심지어 보다 바람직하게는 98%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 99%가 천연 단백질의 아미노산 서열과 동일한 경우 천연 단백질에 대해 "실질적으로 상동성"이다. 변이체는 1개 정도로 적은 아미노산 또는 10개 이하 또는 그 이상의 아미노산으로 상이할 수 있다.
변이체의 제2의 유형은 우레아제의 분리된 활성 단편인 우레아제의 크기 변이체를 포함한다. 크기 변이체는 예를 들면, 우레아제의 단편화, 화학적 변형, 단백질분해성 효소 분해, 또는 이의 조합에 의해 형성될 수 있다. 또한, 유전 가공 기술, 및 아미노산 잔기로부터 폴리펩타이드를 직접 합성하는 방법을 사용하여 크기 변이체를 생산할 수 있다.
"작용적으로 동등한"은, 변이체의 서열이 천연 우레아제와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생산하는 쇄를 규정하는 것으로 의도된다. 실질적인 서열 변이를 포함하는 이러한 작용적으로 동등한 변이체는 또한 본 기술에 포함된다. 따라서, 천연의 우레아제 단백질의 작용적으로 동등한 변이체는 치료학적으로 유용하게 되기에 충분한 생물학적 활성을 가질 것이다. 작용적 등가물을 측정하기 위한 방법이 당해 분야에서 이용가능하다. 생물학적 활성은 천연 우레아제 단백질의 활성을 측정하도록 특이적으로 고안된 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 생물학적으로 활성인 천연 단백질에 대해 생성된 항체를 이들의 능력에 대해 시험하여 작용적으로 동등한 변이체에 결합시킬 수 있으며, 여기서 효과적인 결합은 천연 단백질의 구조와 유사한 구조를 갖는 단백질의 지표이다.
보존적으로 치환된 서열을 포함하는, 본 기술의 우레아제 단백질 서열은 단백질의 정제를 위한 하나 이상의 도메인(예를 들면, 폴리 His 분절, FLAG 태그 분절 등)의 첨가시 발생하는 것과 같은 보다 큰 폴리펩타이드 서열의 부분으로 존재할 수 있으며, 여기서 추가의 작용성 도메인은 단백질의 우레아제 단백질 부위의 활성에 영향을 거의 또는 전혀 미치지 않거나, 추가의 도메인은 프로테아제를 사용한 처리와 같은 후 합성 과정 단계에 의해 제거될 수 있다.
본 기술의 핵산 분자의 암호화된 활성을 변경시키지 않는 하나 이상의 핵산 또는 서열의 첨가, 예를 들면, 비-작용성 서열의 첨가는 기본 핵산 분자의 보존적 변이이며, 본 기술의 폴리펩타이드의 활성을 변경시키지 않는 하나 이상의 아미노산 잔기의 첨가는 기본 폴리펩타이드의 보존적 변이이다. 이러한 유형의 첨가 둘 다는 본 기술의 특징이다. 당해 분야의 통상의 기술자는, 개시되는 핵산 작제물의 많은 보존적 변화가 작용적으로 동일한 작제물을 생성함을 인식할 것이다.
수동 정렬, 및 컴퓨터 보조된 서열 정렬 및 분석을 포함하는, 서열 관계를 측정하는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 후자의 시도가 컴퓨터-보조된 방법에 의해 증가된 처리율이 수득되므로, 본 기술에서 바람직한 시도이다. 서열 정렬을 수행하기 위한 다양한 컴퓨터 프로그램이 이용가능하거나 숙련가에 의해 생산될 수 있다.
위에서 나타낸 바와 같이, 본 기술에 사용된 핵산 및 폴리펩타이드(및 이의 단편)의 서열은 본 기술의 우레아제 폴리펩타이드 또는 핵산 분자(또는 이의 단편) 또는 관련 분자의 상응하는 서열에 대해 동일할 필요가 없지만, 실질적으로 동일(또는 실질적으로 유사)할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는, 보존적 또는 비-보존적인, 하나 이상의 아미노산 또는 핵산 삽입, 결실, 및 치환과 같은 다양한 변화가 이들의 용도, 예를 들면, 이들의 치료학적 또는 투여 적용시 특정의 장점을 제공할 수 있는 경우를 포함하는 각종 변화를 겪을 수 있다.
표적화 잔기
표적화 잔기는 본 기술의 화학적 실체로 고려되며 암 세포와 같은 정의되고, 선택된 세포 유형 또는 표적 세포 집단에 결합한다. 이와 관련하여 유용한 표적화 잔기는 항체 및 항체 단편, 펩타이드 및 호르몬을 포함한다. 공지된 세포 표면 수용체(저 밀도 지단백질, 트랜스페린 및 인슐린 포함), 섬유소분해 효소, 안넥신과 같은 혈소판 결합 단백질, 및 생물학적 반응 개질인자(인터루킨, 인터페론, 에리트로포이에틴 및 콜로니-자극 인자 포함)에 상응하는 단백질이 또한 표적화 잔기로서 고려된다. 올리고뉴클레오타이드, 예를 들면, 표적 세포 핵산의 부위에 대해 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드도 본 기술에서 표적화 잔기로 사용될 수 있다. 표적화 잔기는 또한 표적 세포 표면에 결합하는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 규정된 표적 세포 집단에 결합하는 능력을 보유하고 있는 상기-나열된 표적화 잔기를 또한 표적화 잔기로서 사용할 수 있다.
상술한 표적화 잔기의 작용성 등가물은 또한 본 기술의 표적화 잔기로서 유용하다. 예시적인 표적화 잔기 작용성 등가물은 표적화 잔기 표적 세포 결합에 적절한 구조 및/또는 배향을 모사하도록 설계된 유기 화학 작제물이다. 다른 표적화 잔기 작용성 등가물은 표적화 잔기의 결합 친화성을 나타내는 짧은 폴리펩타이드이다.
일부 국면에서, 본 개시내용의 표적화 잔기는 표적 세포의 표면의 항원과 반응성인 항체, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 등이다. 상업적으로 이용가능하거나 문헌에 기술된 폴리클로날 및 모노클로날 항체 둘 다를 사용할 수 있다. 항체는 전체 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 모노클로날 항체 및 단편은 하이브리도마 합성, 재조합체 DNA 기술 및 단백질 합성과 같은 통상의 기술에 따라 생산할 수 있다. 유용한 모노클로날 항체 및 단편은 어떠한 종(사람 포함)으로부터 기원할 수 있거나 하나 이상의 종으로부터의 서열을 사용하는 키메라 단백질로서 형성될 수 있다.
일부 국면에서, 표적화 잔기는 사람화된 또는 비-사람 항체이다. 일부 국면에서, 표적화 잔기는 단일 도메인 항체이다. 일부 국면에서, 단일 도메인 항체(sdAb) 또는 "VHH"는 천연적으로 경쇄가 없는 낙타 포유동물에서 발견될 수 있는 유형의 항체의 단일 중쇄 가변 도메인을 말한다. 일부 국면에서, 단일 도메인 항체는 VH 영역, VHH 영역 또는 VL 영역으로부터 기원할 수 있다. 일부 국면에서, 단일 도메인 항체는 사람 기원이다. 일부 국면에서, 사람 단일 도메인 항체는 이의 전문이 참고로 본원에 포함된 제WO2006/099747호 및 제WO2009/079793호 및 제WO2012/100343호에 개시된 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다. 일 국면에서, 사람 단일 도메인 항체는 제WO2012/100343호에 논의된 바와 같이 골격 영역내에 이황화물 결합을 지닌 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다.
일부 국면에서, 표적화 잔기(예를 들면, 항체)는 암종, 백혈병, 림프종 및 육종에 의해 발현된 종양 항원에 대한 특이성을 갖는다. 암종은 항문, 담즙관, 방광, 유방, 결장, 직장, 폐, 구강, 인두, 식도, 위, 췌장, 간, 신장, 방광 및 담즙관, 소장, 뇨관, 난소, 결장, 소 세포 폐 암종, 생식관, 내분비선, 전립선, 및 피부의 암종일 수 있다. 일부 국면에서, 표적화 잔기(예를 들면, 항체)는 유암종 종양, 위장관 기질 종양, 두경부 종양, 원발성 종양, 혈관종, 흑색종, 악성 중피종, 다발성 골수종, 및 뇌, 신경, 눈, 및 뇌막의 종양에 의해 발현된 종양 항원에 대해 특이성을 갖는다. 일부 국면에서, 표적화 잔기(예를 들어, 항체)는 암종, 유방, 췌장, 난소, 폐, 및 결장 암에 의해 발현된 종양 항원에 대해 특이성을 갖는다. 일부 국면에서, 표적화 잔기(예를 들어, 항체)는 비-소 세포 폐 암종에 의해 발현된 종양 항원에 대해 특이성을 갖는다.
일부 국면에서, 항체는 비-소 세포 폐 암종에 의해 발현된 종양 항원에 대해 특이성을 갖는다. 일부 국면에서, 비-소 세포 폐 암종에 의해 발현된 종양 항원은 CEACAM6(암배아 항원-관련 세포 부착 분자 6)이고, 항체는 CEACAM6에 대해 특이성을 갖는다. 비-특이적인 교차-반응 항원(NCA) 또는 CD66c로서 또한 공지된 CEACAM6는 잘 특성화된 암 항원이다(11, 12). 이는 CEACAM1, CEACAM7, 및 CEACAM8과 같은 다른 사람 암배아 항원과 고도의 서열 상동성을 공유한다. 이는 글리코실포스포이노시톨(GPI)-연결된 세포 표면 단백질이지만 공지된 세포질 도메인을 가지지 않는다. CEACAM6 발현은 유방, 췌장, 난소, 폐, 및 결장 암 조직에서 유의적으로 상승된다. 이의 증가된 발현은 종양 세포의 침입성 및 전이 거동과 관련되어 있다(13). 일부 국면에서, 항체는 CEACAM6에 대해 약 1 x 10-6M 이상의 Kd 값의 결합 친화성을 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 CEACAM6에 대해 약 1 x 10-8M, 1 x 10-9M, 1 x 10-10M, 또는 1 x 10-20M 이하의 Kd 값의 결합 친화성을 갖는다. 일부 국면에서, 항체는 폐 선암종 세포에서 CEACAM6을 인식하는 단일-도메인 낙타 항체 단편(AFAIKL2, 서열 번호: 1)이다. 일부 국면에서, 항체는 도 5에 나타낸 바와 같은 서열 번호; 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 국면에서, 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 변형을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 국면에서, 항체는 서열 번호; 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 및 99%의 서열 상동성을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 국면에서, CEACAM6 항체는 항-CEACAM6 항체(9A6): Santa Cruz Biotech로부터 이용가능한 sc-59899이다. CEACAM6 항체(9A6)는 200μg/ml에서 제공된 마우스 모노클로날 IgGl이며, 이는 사람 기원의 CEACAM6-발현 종양 세포주에 대해 생성된다. 이는 사람 기원의 CEACAM6을 검출하기 위해 추천된다.
일부 국면에서, CEACAM6 항체는 abcam으로부터 이용가능한 항-CEACAM6 항체(ab56234)이다. 항-CEACAM6 항체(ab56234)는 CEACAM6에 대한 토끼 폴리클로날이다. 이는 합성 펩타이드(IQNPASANRS DPVTLNVLYG PDGPTISPSK ANYRPGENLN LSCHAASNPP(서열 번호: 3))내 영역에 대해 생성되며, 이는 사람 CEACAM6의 내부 서열 아미노산 217 내지 266번에 상응한다.
일부 국면에서, CEACAM6 항체는 Novus Biologicals로 부터 이용가능한 항-CEACAM-6/CD66c 항체이며, 이는 CEACAM6에 대한 토끼 폴리클로날 항체이고 웨스턴 블롯(Western Blot) 및 면역조직화학-P에서 승인되었다. 이는 사람CEACAM6(NP_002474)의 중간 영역에 대해 지시된 합성 펩타이드(EIQNPASANRSD(서열 번호: 4))에 대해 생성된다.
일부 국면에서, CEACAM6 항체는 OriGene으로부터 이용가능한 항-CEACAM6 항체 EPR4403이며, 이는 CEACAM6(클론 EPR4403)에 대한 토끼 모노클로날 항체이다. 이는 사람 CEACAM6내 잔기에 상응하는 합성 펩타이드에 대해 생성된다. 이는 마우스, 랫트, 및 사람 CEACAM6에 대해 반응성을 갖는다.
일부 국면에서, 접합체는 CEACAM6에 대해 약 10nM 이하의 IC50 값의 결합 친화성을 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 CEACAM6에 대해 약 5nM 이하의 IC50 값의 결합 친화성을 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 CEACAM6에 대해 약 4nM 이하의 IC50 값의 결합 친화성을 갖는다. 일부 국면에서, IC50 값은 약 3.22nM이다. 일부 국면에서, 접합체는 CEACAM6에 대해 약 10 내지 30μg/mL의 IC50 값으로 결합한다. 일부 국면에서, 접합체는 CEACAM6에 대해 약 20μg/mL의 IC50 값으로 결합한다. 표적 항원에 대한 항체 또는 접합체의 결합 친화성은 본원에 기술되어 있거나 당해 분야에 공지된 방법에 따라 측정할 수 있다. 일부 국면에서, 본 기술은 이러한 항-CEACAM6-우레아제 접합체(L-DOS47)를 기술한다. 일부 국면에서, 본 기술은 항체-우레아제 접합체, 예를 들면, AFAIKL2-우레아제를 기술한다. 라마(Ilama)의 중쇄 항체 레퍼토리로부터 기원한 파아지 라이브러리(phage library)를 사용하여 비-소 세포 폐 암종 A549에 대해 패닝(panning)함으로써 단일-도메인 항체(sdAb)를 확인한다. sdAb는 AFAI로 지정된다. AFAI의 유전자 서열은 접합 목적을 위해 최적화되고 AFAIKL2로 재명명되어 있다. 일부 국면에서, AFAIKL2 항체는 클로닝되어 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) pT7-7 시스템내에서 발현된다.
사람화된 표적화 잔기는 숙주 수용체내에서 항체 또는 폴리펩타이드의 면역반응성을 감소시켜, 반감기의 증가 및 역 면역 반응(adverse immune reaction)의 감소를 허용할 수 있다. 쥐 모노클로날 항체는 예를 들면, 쥐 Fv 영역 또는 이의 상보성 결정 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 불변 도메인 영역 및 Fc 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 유전적으로 재조합시킴으로써 사람화시킬 수 있다. 쥐 잔기는 또한 사람 가변 영역 골격 도메인내에 보유시켜 적절한 표적 부위 결합 특성을 보증할 수 있다. 다양한 활성제를 암 세포에 전달하기 위한 유전적으로 가공된 항체는 Bodey, B.(2001) Expert Opin Biol. Ther. 1(4):603-17에서 고찰된다.
일부 국면에서, 표적화 잔기는 표적 세포의 표면에서 수용체와 반응성인 리간드이다. 따라서, 표적화 잔기는 제한 없이, 세포 결합 성분, 세포 결합 성분에 의해 인식된 탄수화물 잔기를 함유하는 어떠한 잔기 및 세포 결합 성분에 결합하는 약물 또는 소 분자를 포함할 수 있다. 어구 "결합 성분"은 수용체 및 수용체 분자 둘 다를 포함한다. 바람직하게는, 결합 성분은 세포 표면 결합 성분이다. 일 국면에서, 표적화 잔기는 천연적으로 존재하는 단백질, 예를 들면, 표적 부위에 결합하는 인슐린이다. 인터루킨을 포함하는 사이토킨 및 과립구/대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 종양 괴사 인자(TNF)와 같은 인자는 또한 고 수준의 이들의 수용체를 발현하는 특이적인 세포에 결합하는 것으로 알려진 특이적인 표적화 잔기이다(Terlikowski, SJ(2002) Toxicology 174(3): 143-152).
비-표적 세포 또는 조직에 대한 우레아제 또는 다른 활성제 노출을 감소시키기 위하여, 표적화 잔기를 스크리닝하여 최소의 비-표적 반응성을 나타내지만, 표적 특이성 및 반응성을 보유하는 것들을 확인할 수 있다. 비-표적 노출(및 역 비-표적 국재화 및/또는 독성)을 감소시킴으로써, 증가된 투여량의 우레아제 또는 다른 활성제를 투여할 수 있다. 이는 최대로 가능한 농도의 우레아제 또는 다른 치료제의 투여를 허용함으로써 허용되지 않는 비-표적 세포 독성의 역치 이하를 유지하면서, 표적 세포의 노출을 최대화시킬 수 있다.
일부 국면에서, 2개 이상의 활성제-표적화 잔기 접합체가 사용되며, 여기서 각각의 접합체는 상이한 표적화 잔기, 예를 들면, 상이한 항체 종을 포함한다. 이용된 표적화 잔기 각각은 동일하거나 상이한 표적 부위와 관련될 수 있는 상이한 표적 부위 영역에 결합한다. 각각의 투여된 접합체의 활성제 성분은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들면, 이들 각각이 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 제4,867,962호 및 제5,976,535호를 참고한다. 일부 국면에서, 표적 부위에 대한 활성제 접합체의 표적 부위 부착은, 각각의 표적화 잔기, 예를 들면, 항체 종이 상이한 표적 부위 영역(즉, 에피토프)를 인식하므로, 증진된다. 당해 대안적인 표적 부위 영역 시도는 활성제에 대한 보다 잠재적인 표적 부위 결합점을 제공한다. 결과적으로, 예를 들면, 에피토프 포화 및/또는 입체 장애를 통한, 실제적이거나 효과적인 표적 부위 포화를 피할 수 있다. 따라서, 활성제, 예를 들면, 우레아제의 추가의 축적이 달성될 수 있다. 또한, 또는 함께, 추가의 우레아제 특이적인 유전자 생성물을 예를 들면, 표적 부위에서 촉매적으로 활성인 홀로효소(holoenzyme)의 생산을 위한 활성제로서 사용할 수 있다. 예시적인 우레아제 아포효소(apoenzyme)는 세균 ureABC 유전자에 의해 암호화된 감마, 베타 및 알파 소단위를 포함한다(참고: Burne, R.A. and Chen, Y.M.(2000) Microbes and Infection 2:533-542).
특수한 표적 부위에 대해 지시된 모노클로날 항체에 대한 교차-반응성의 양식을 분석하여 치료학적 적용시 사용하기 위한 비-오버랩된 교차-반응성을 지닌 2개 이상의 표적-특이적인 모노클로날 항체의 세트를 확인할 수 있다. 어구 "교차-반응성의 비-오버랩된 양식"은, 하나의 항체 종에 의해 결합된 비-표적 조직이 다른 항체 종에 의해 결합된 비-표적 조직과는 실질적으로 상이함을 나타낸다. 교차-반응성의 양식은 치료학적 적용을 위한 활성제의 노출을 잠재적으로 감소시키는데 필수적인 정도로 상이하다. 항체 쌍(또는 항체의 보다 큰 세트) 오버랩이 거의 없는 것이 바람직하다.
항체는 다양한 방법으로 스크리닝할 수 있다. 면역조직화학 검정을 사용하여 표적 조직 및 비 표적 조직과의 교차-반응성을 측정할 수 있다. 항체 종이 결합하는 조직은 조직을 항체에 노출시키고; 조직을 세척하여 어떠한 결합되지 않은 항체도 제거하고; 결합된 항체의 존재를 검출함으로써 확인할 수 있다. 시험관내(in vitro) 조직화학적 과정은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, Sanchez-Islas, E. and Leon-Olea, M.(2001) Nitric Oxide 5(4):302-16을 참고한다.
표적화 잔기가 비교적 짧은 경우, 이는 표준 화학 펩타이드 합성 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 서열의 C-말단 아미노산이 불용성 지지체에 부착된 후 서열내 나머지 아미노산이 순차적으로 첨가되는 고체 상 합성이 폴리펩타이드의 화학적 합성을 위한 방법의 하나의 국면을 위해 고려된다. 고체 상 합성을 위한 기술은 Barany and Merrifield, Solid -Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc, 85: 2149-2156(1963), 및 Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, III.(1984)에 기술되어 있다.
항체 또는 우레아제를 암호화하는 DNA는 예를 들면, 적절한 서열의 클로닝 및 제한 또는 Narang et al.(1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99의 포스포트리에스테르 방법; Brown et al.(1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151의 포스포디에스테르 방법; Beaucage et al.(1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862의 디에틸포스포르아미디트 방법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고체 지지체 방법과 같은 방법에 의한 직접적인 화학 합성을 포함하는 어떠한 적합한 방법에 의해서도 제조할 수 있다.
화학 합성은 일본쇄(single stranded) 올리고뉴클레오타이드를 생산한다. 이는 상보성 서열과의 하이브리드화에 의해, 또는 주형으로서 일본쇄를 사용한 DNA 폴리머라제를 사용한 중합에 의해 이본쇄 DNA로 전환될 수 있다. 숙련가는, DNA의 전체 화학 합성이 약 100개 염기의 서열에 한정되지만, 보다 긴 서열이 보다 짧은 서열의 연결에 의해 수득될 수 있음을 인식할 수 있다.
또한, 서열을 클로닝하여 적절한 서열을 적절한 제한 효소를 사용하여 절단할 수 있다. 이후에, 단편을 연결하여 목적한 DNA 서열을 생산할 수 있다.
항체-우레아제 접합체의 제조 방법
본 기술은 항체-우레아제 접합체를 포함하고 접합되지 않은 우레아제를 실질적으로 포함하지 않는, 예를 들면, 항체-우레아제 접합체의 중량을 기준으로 하여 약 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하인 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 당해 방법은 (1) 활성화된 항체 및 우레아제를 활성화된 항체 및 우레아제가 실질적으로 반응하지 않는, 예를 들면, 시간당 반응이 10%, 5 % 또는 1% 이하인 용매 속에서 합하여 용매 속에서 활성화된 항체와 우레아제의 분포가 균일한 반응 혼합물을 형성시키는 단계, 및 (2) (1)의 혼합물의 특성을 변경시켜 활성화된 항체가 우레아제와 용이하게 반응하여 항체-우레아제 접합체를 형성하도록 하는 단계를 포함한다. 일부 국면에서, (1)의 혼합물의 특성은 pH 값이다. 일부 국면에서, (1)의 혼합물의 특성을 변경시키는 것은 pH를 우레아제와 용이하게 반응하는 활성화된 항체의 값으로 증가시켜 항체-우레아제 접합체를 형성시킴을 포함한다. 일부 국면에서, 활성화된 항체, 예를 들면, 활성화된 항체의 적어도 90% 또는 적어도 95%는, (2)의 우레아제와 혼합물이 혼합물의 특성이 변경된 후 약 6시간, 약 5시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 또는 약 1시간 동안 접합되지 않은 우레아제를 실질적으로 포함하지 않는 비율로 용이하게 반응한다.
일부 국면에서, 상기 방법은 활성화된 항체와 우레아제를 pH가 약 6.0 내지 7.0, 예를 들면, 약 6.5인 산성의 수성 완충액 속에서 합하고, pH를 약 8.0 내지 9.0, 예를 들면, 약 8.3의 염기성 pH로 조정하여 항체-우레아제 접합체를 형성시키는 단계, 및 항체-우레아제 접합체를 울트라다이아필트레이션로 정제하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 방법은 크로마토그래피 정제 단계를 포함하지 않는다. 일부 국면에서, 수성 완충액은 pH가 약 5 내지 8이다. 일부 국면에서, 활성화된 항체 및 우레아제는 산성의 수성 완충액 속에서 합해진다. 일부 국면에서, 활성화된 항체 및 우레아제의 비는 약 3 대 약 12이다. 일부 국면에서, 항체-우레아제 접합체는 우레아제 잔기 당 6 내지 15개 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 항체-우레아제 접합체는 우레아제 잔기 당 8 내지 11개 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, pH 조절인자는 완충액 또는 완충 용액이다. 일부 국면에서, p조절인자는 하나 이상의 염산, 황산, 질산, 붕산, 카본산, 중탄산, 글루콘산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수성 암모니아, 시트르산, 모노에타올아민, 락트산, 아세트산, 석신산, 푸마르산, 말레산, 인산, 메탄설폰산, 말산, 프로피온산, 트리플루오로아세트산, 이의 염, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 국면에서, 완충제는 하나 이상의 글리신, 아세트산, 시트르산, 붕산, 프탈산, 인산, 석신산, 락트산, 타르타르산, 카본산, 염산, 수산화나트륨, 이의 염, 또는 이의 조합물을 포함한다. 일부 국면에서, 완충 용액은 하나 이상의 글리신 하이드로클로라이드 완충액, 아세테이트 완충액, 시트레이트 완충액, 락테이트 완충액, 포스페이트 완충액, 시트라산-포스페이트 완충액, 포스페이트-아세테이트-보레이트 완충액, 프탈레이트 완충액, 또는 이의 조합물을 포함한다. 일부 국면에서, 완충액은 포스페이트 완충액이 아니다. 일부 국면에서, 산성 완충액은 아세트산나트륨 완충액이다. 일부 국면에서, pH는 붕산나트륨 용액과 같은 수성 염기 용액(예를 들면, 0.1 내지 5M, 또는 1M)의 첨가를 포함하는 방법에 의해 염기성 pH로 조절한다. 이론에 얽메이지는 않지만, 아세트산나트륨 완충액은 낮은 완충능을 가지며, pH 8.5. 1M 보레이트 완충액에 의해 pH를 8.3으로 조절하는데 적합하다. 일부 국면에서, 트리스-HCl 완충액(예를 들면, 1M 트리스-HCl)을 사용하여 혼합물을 pH 8 내지 9, 예를 들면, 8.3으로 조절한다.
일부 국면에서, 반응 시간 및 항체/우레아제 비는 일정하게 유지된다. 일부 국면에서, 반응 혼합물 속의 항체/우레아제의 몰 비는 약 25 또는 약 21, 또는 약 1.8 내지 12의 항체/우레아제이다. 일부 국면에서, 항체/우레아제 몰 비는 4 내지 25로 조절된다. 일부 국면에서, 항체/우레아제 몰 비는 적어도 6이다.
일부 국면에서, 1% 또는 2% 이하의 반응하지 않은 항체가 울트라다이아필트레이션와 같은 정제 후 혼합물 속에 존재한다. 일부 국면에서, 다른 비-HPLC 정제 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 에탄올 결정화/분획화를 보다 낮은 수율의 정제에 사용할 수 있다. 일부 국면에서, 항체의 몰 중량은 50kDa 이하, 예를 들면, 약 10 내지 20kDa, 또는 약 13kDa이고, 정제는 울트라다이아필트레이션이다. 일부 국면에서, 상기 방법은 항체-우레아제 접합체를 총 단백질의 중량당 적어도 약 60%, 총 단백질의 중량당 약 70%, 총 단백질의 중량당 약 80%, 또는 총 단백질의 중량당 적어도 90%를 제공한다. 총 단백질은 우레아제 및 AFAIKL2 항체의 조합된 양(중량)을 의미한다. 일부 국면에서, 10 내지 20%(총 단백질 중량당) 이하의 접합되지 않은 항체가 정제 전에 반응 혼합물 속에 남는다.
본 기술은 산성 수성 용매(위에서 기술한 바와 같음) 중의 활성화된 항체 및 우레아제를 포함하고, 항체-우레아제 접합체를 실질적으로 포함하지 않는, 예를 들면, 우레아제의 중량을 기준으로 하여 약 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%의 항체-우레아제 접합체를 포함하는 안정한 조성물을 제공한다. 본 기술은 또한 항체-우레아제 접합체를 포함하고, 접합되지 않은 우레아제를 실질적으로 함유하지 않는, 예를 들면, 수성 용매 속에 항체-우레아제 접합체의 중량을 기준으로 약 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하의 우레아제를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서, 수성 용매는, pH가 약 8 내지 9, 예를 들면, 8.3(위에서 기술한 바와 같음)이다. 일부 국면에서, 항체-우레아제 접합체를 포함하는 조성물은 총 항체(활성화된 항체 및 반응하지 않는 항체)당 약 40 내지 60% 이하의 접합되지 않은 항체를 추가로 포함한다. 일부 국면에서, 항체-우레아제 접합체를 포함하는 조성물은 총 단백질당 약 10 내지 20% 이하의 접합되지 않은 항체를 추가로 포함한다.
우레아제는 일반적으로 독성을 가지며 자체가 종양을 표적하지 않는 암모니아의 방출을 생체내에서 유도하므로, 접합되지 않은 우레아제의 존재는 우레아제의 존재 위험성 및 정상 조직에 대산 독성의 생산 위험성을 증가시킨다. 그러나, 우레아제의 크기 및 다른 특성으로 인하여, 우레아제에 대한 항체의 접합은 특히 대량의 크로마토그래피 정제 방법에 의해 접합되지 않은 우레아제로부터 항체-우레아제 접합체의 용이한 분리를 가능하도록 하는 충분한 크기 또는 다른 차이를 생성하지 않는다.
본 기술은 놀랍게도 우레아제와 항체의 실질적으로 완전한 접합을 제공함으로써, 수득되는 생성물이 어떠한 크로마토그래피 정제없이도 접합되지 않은 우레아제를 실질적으로 포함하지 않도록 한다. 우레아제를 실질적으로 포함하지 않음으로서, 본원에 기술된 조성물은 조성물 속의 우레아제 잔기의 전부를 전신계 투여를 통해 표적 부위에 실질적으로 전달한다. 표적 부위에 대한 우레아제의 표적 전달은 우레아제에 의해 생산된 암모니아의 일반적인 독성을 감소시키거나 제거하고 치료학적 효과를 생산하기 위하여 투여될 필요가 있는 우레아제의 양을 감소시킨다. 본 기술은 임상 용도를 위해, 특히 우레아제의 국소 투여에 의해 치료되기 어렵거나 불가능한 전이성 종양을 치료하기 위해 우레아제를 실질적으로 포함하지 않는 항체-우레아제 접합체를 적어도 약 1g, 10g, 100g, 또는 1kg과 같은 대규모로 제조하기에 특히 적합하다.
본 기술은 또한 다수의 항체 분자를 우레아제 분자에 접합시켜 항체-우레아제 접합체를 형성시킴을 포함하여, 종양 항원에 대한 항체 결합 친화성을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 접합체는 종양 항원에 대해 접합되지 않은 항체보다 적어도 약 100배, 예를 들면, 약 200배, 약 300배, 약 400배, 및 약 500배 더 높은 결합 친화성을 갖는다. 일부 국면에서, 경쟁적 결합 검정은, 항체-우레아제 접합체에 대한 결합 친화성이 증가된 결합활성으로 인하여 천연의 단일 도메인 항체의 것보다 약 100배, 약 200배, 약 300배, 약 400배, 및 약 500배 더 강하다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기 당 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기 당 약 6 이상의 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기 당 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기 당 8, 9, 10, 또는 11개의 항체 잔기의 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 우레아제 잔기 당 약 8, 9, 10, 또는 11개의 항체 잔기의 평균 접합 비를 갖는다. 일부 국면에서, 우레아제는 작두 콩 우레아제이다. 일부 국면에서, 항체는 사람화된 또는 비-사람 항체이다. 일부 국면에서, 항체는 단일 도메인 항체이다. 일부 국면에서, 종양 항원은 비-소 세포 폐 암종에 의해 발현된다. 일부 국면에서, 항체는 CEACAM6에 대해 특이성을 갖는다. 일부 국면에서, 항체는 CEACAM6에 대해 약 1 x 10-6M 이상의 Kd 값의 결합 친화성을 갖는다. 일부 국면에서, 접합체는 약 1 x 10-8M 이하의 Kd 값으로 CEACAM6에 결합한다. 일부 국면에서, 접합체는 약 1 x 10-10M 이하의 Kd 값으로 CEACAM6에 결합한다. 일부 국면에서, 접합체는 약 5nM 이하의 IC50 값으로 CEACAM6에 결합한다. 일부 국면에서, IC50 값은 약 3.22 nM이다. 일부 국면에서, 접합체는 약 약 20μg/mL의 IC50 값으로 CEACAM6에 결합한다. 비-특이적인 교차-반응 항원(NCA) 또는 CD66c로서 또한 공지된 CEACAM6은 잘 특징화된 암 항원이다. 이는 CEACAM1, CEACAM7, 및 CEACAM8과 같은 다른 사람 암배아 항원과 높은 서열 상동성을 공유한다. 이는 공지되지 않은 세포질성 도메인을 지닌 글리코실포스포이노시톨(GPI)-연결된 세포 표면 단백질이다. CEACAM6 발현은 유방, 췌장, 난소, 폐, 및 결장 암 조직에서 유의적으로 상승한다.
조성물 제형
본 기술의 조성물은 우레아제를 실질적으로 포함하지 않고 비-수성 HPLC 용매를 임의로 포함하지 않는 항체-우레아제 접합체를 포함한다. 일부 국면에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 조성물이다. 당해 조성물은 생적합성 약제학적 담체, 보조제, 또는 비히클(vehicle)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 국면에서, 상기 조성물은 고체 형이다. 일부 국면에서, 상기 조성물은 약 0.1 내지 10mg/mL, 약 0.5 내지 5mg/mL, 약 1 내지 5mg/mL, 또는 약 1.5 내지 2.0mg/mL의 접합체를 포함하는 수용액으로 존재한다. 일부 국면에서, 수용액은 하나 이상의 히스티딘, 슈크로즈, 및 EDTA와 같은 부형제를 추가로 포함한다. 일부 국면에서, 수용액은 약 1 내지 20mM , 예를 들면, 10mM의 히스티딘, 약 0.1 내지 5 w/v%, 예를 들면, 1 w/v% 슈크로즈, 약 0.1 내지 0.5mM, 예를 들면, 0.2mM의 EDTA를 포함한다. 일부 국면에서, 수용액은, pH가 약 6.5 내지 7, 예를 들면, 약 6.8이다. 일부 국면에서, 수용액은 포스페이트를 함유하지 않는다. 일부 국면에서, 조성물은 수용액의 동결건조에 의해 수득된 고체형이다. 일부 국면에서, 고체형은 포스페이트를 함유하지 않는다.
조성물은 또한 부형제(들) 또는 다른 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합된 다른 뉴클레오타이드 서열, 폴리펩타이드, 약물, 또는 호르몬을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물 이외의 조성물은 액체, 즉, 물 또는 수-계 액체(water-based liquid)를 임의로 포함한다.
약제학적 조성물에 첨가될 약제학적으로 허용되는 부형제는 또한 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있으며, 용이하게 이용가능하다. 부형제의 선택은 생성물을 투여하기 위해 사용된 특수 방법에 의해 일부 결정될 것이다. 따라서, 본 기술과 관련하여 사용하기에 적합한 제형이 다양하게 존재한다.
약제학적 조성물의 제형 및 투여를 위한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., 19th Ed., Williams & Wilkins, 1995에서 찾을 수 있으며, 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 부형제의 선택은 본 기술에 따라 생성물을 투여하는데 사용된 특수한 방법에 의해 일부 결정될 것이다. 따라서, 본 기술과 관련하여 사용하기에 적합한 제형이 다양하게 존재한다. 다음의 방법 및 부형제는 단지 예시적인 것이며 제한되지 않는다.
본 기술의 약제학적 조성물은 어떠한 통상의 방법, 예를 들면, 혼합, 용해, 과립화, 분쇄(levigating), 유화, 캅셀화, 포획(entrapping), 융용-스피닝(melt-spinning), 분무-건조, 또는 동결건조 공정을 사용하여 제조할 수 있다. 그러나, 최적의 약제학적 제형은 투여 경로 및 바람직한 용량에 따라 당해 분야의 숙련가가 결정할 것이다. 이러한 제형은 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출율, 및 투여제의 생체내 청소율에 영향을 미칠 수 있다.
약제학적 조성물은 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하도록 제형화되며, 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 활성 화합물의 가공을 촉진시키는 보조제를 임의로 포함할 수 있다. 투여 방식은 일반적으로 담체의 특성을 결정할 것이다. 예를 들면, 비경구 투여용 제형은 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함할 수 있다. 비경구 투여에 적합한 담체는 염수, 완충된 염수, 덱스트로즈, 물, 및 다른 생리학적으로 혼화성인 용액 중으로부터 선택될 수 있다. 비경구 투여용의 바람직한 담체는 생리학적으로 혼화성인 완충제, 예를 들면, 행크스-용액(Hank's-용액), 링거액(Ringer's 용액), 또는 생리학적으로 완충된 염수이다. 조직 또는 세포 투여를 위해, 침투될 특수한 장벽에 대해 적절한 침투제를 제형 속에 사용한다. 이러한 침투제는 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 단백질을 포함하는 제제의 경우, 제형은 안정화 물질, 예를 들면, 폴리올(예를 들면, 슈크로즈) 및/또는 표면활성제(예를 들면, 비이온성 표면활성제) 등을 포함할 수 있다.
또한, 비경구 용도를 위한 제형은 적절한 오일성 주사 현탁액으로서 제조된 활성 화합물의 현탁액을 포함할 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들면, 참깨 오일, 및 합성 지방산 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드, 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 화합물의 가용성을 증가시켜 고 농도 용액을 제조하도록 하는 적합한 안정화제 또는 제제를 함유할 수 있다. 유화제, 예를 들어, 수중 오일(oil-in-water) 및 오일중 수(water-in-oil) 분산액을 또한 사용하고, 유화제 또는 분산제(표면-활성 물질; 표면활성제)로 임의로 안정화시킬 수 있다. 활성제를 함유하는, 상기 기술된, 리포좀을 또한 비경구 투여용으로 사용할 수 있다.
또한, 경구 투여용으로 적합한 용량의 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 당해 분야에 잘 공지된 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 제형화할 수 있다. 경구 투여용으로 제형화된 제제는 정제, 환제, 캅셀제, 카쉐제(cachet), 로젠지제(lozenge), 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리, 현탁제, 또는 산제의 형태로 존재할 수 있다. 예증하기 위해, 경구용 약제학적 제제는 활성 화합물을 고체 부형제와 합하고, 수득되는 혼합물을 임의로 분쇄하고, 과립의 혼합물을 가공하고, 경우에 따라 적합한 보조제를 가한 후, 정제를 수득함으로써 수득할 수 있다. 경구 제형은 비경구 사용을 위해 기술된 것들, 예를 들면, 완충된 수용액, 현탁액 등과 유사한 유형의 액체 담체를 사용할 수 있다.
이들 제제는 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있으며, 이는 제한 없이, a) 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함하는 당과 같은 희석제; b) 마그네슘 암모늄 실리케이트, 옥수수, 밀, 벼, 감자로부터의 전분 등과 같은 결합제; c) 메틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필에틸 셀룰로즈, 및 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈와 같은 셀룰로즈 물질, 폴리비닐 피롤리돈, 검 아라빅 및 검 트라가칸트와 같은 검, 및 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질; d) 가교-결합된 폴리비닐 피롤리돈, 전분, 한천, 알긴산 또는 알긴산나트륨과 같은 이의 염과 같은 분해제 또는 가용화제; 또는 비등성 조성물; e) 실리카, 활석, 스테아르산 또는 이의 마그네슘 또는 칼슘 염, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제; f) 풍미제 및 감미제; g) 예를 들면, 생성물을 확인하거나 활성제의 양(용량)을 특성화시키기 위한 착색제 또는 안료; 및 h) 방부제, 안정화제, 팽윤제, 유화제, 용액 증진제, 삼투압 조절을 위한 염, 및 완충제와 같은 다른 성분들을 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 활성제의 염으로 제공될 수 있으며, 이는 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 석신산 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 많은 산으로 형성될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 다른 양성자성 용매 속에서 보다 가용성인 경향이 있다.
접합체 자체의 특성 및 접합체의 제형은 투여된 접합체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출율, 및 생체내 청소율에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 약동학적 및 약력학적 정보는 전-임상 시험관내 및 생체내 연구를 통해 수집될 수 있으며, 후자는 임상 시험 과정 동안 사람에서 확인된다. 생체내 동물 데이타를 기준으로 한 사람 임상 시험을 수행하기 위한 안내는 예를 들면, http://www.clinicaltrials.gov를 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득할 수 있다. 따라서, 본 기술의 방법에 사용된 어떠한 화합물에 대해서도, 포유동물, 특히 사람에서 치료학적 유효 투여량을 생화학적 및/또는 세포-계 검정으로부터 초기에 평가할 수 있다. 이후에, 용량을 동물 모델에서 제형화하여 접합체 활성을 조절하는 바람직한 순환하는 농도 범위를 달성할 수 있다. 사람 연구를 수행함에 따라, 추가의 정보가 적절한 용량 수준 및 다양한 질병 및 상태에 대한 치료 기간과 관련하여 나타날 것이다.
접합체의 독성 및 치료학적 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서, 예를 들면, LD50(집단의 50%에 대해 치사량인 투여량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 효과적인 투여량)을 측정하기 위해 측정할 수 있다.
추가의 활성제
추가의 활성제가 또한 본 기술의 조성물 속에 포함될 수 있다. 추가의 활성제, 예를 들면, 항-종양제(증식하는 세포에 대해 활성인 제제)를 세포가 제1의 활성제와 접촉하기 전, 동시에, 또는 후속적으로 조성물 속에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 우레아제가 종양 세포에 표적화된 후, 이는 예를 들면, pH 변화를 통해 종양 외부 환경을 조정하거나 조절하는 능력을 가질 수 있다. 염기성 환경을 선호하는 항-종양제 세포와 같은 활성제가 이후 보다 효과적일 것이다.
특정의 국면에서, 우레아제에 의해 효소적으로 가공될 수 있는 기질이 활성제로서 사용하기 위해 고려된다. 일부 국면에서, 활성제는 우레아제가 이용되어 암모늄 이온, 예를 들면, 우레아를 형성할 수 있는 기질이다.
예시적인 항-종양제는 사이토킨 및 다른 잔기, 예를 들면, 인터루킨(예를 들면, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 등), 형질전환 성장 인자-베타, 림프독소, 종양 괴사 인자, 인터페론(예를 들면, 감마-인터페론), 콜로니 자극 인자(예를 들면, GM-CSF, M-CSF 등), 혈관 침투 인자, 렉틴 염증 반응 조절제(셀렉틴), 예를 들면, L-셀렉틴, E-셀렉틴, P-셀렉틴, 및 단백질성 잔기, 예를 들면, Clq 및 NK 수용체 단백질을 포함한다. 추가의 적합한 항-종양제는 혈관형성을 억제함으로써 전이를 억제하는 화합물을 포함한다. 이러한 제제의 예는 프로타민 메드록시프로게스테론, 펜토산 폴리설페이트, 수라민, 탁솔, 탈리도마이드, 안지오스타틴, 인터페론-알파, 메탈로프로테이나제 억제제, 혈소판 인자 4, 소마토스타틴, 트롬보스폰딘을 포함한다. 본 기술에 따라 유용한 활성제의 다른 대표적이고 비-제한적인 예는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 부설판, 클로람부실, 스피로플라틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 미토마이신, 블레오마이신, 사이토신 아라비노사이드, 아라비노실 아데닌, 머캅토푸린, 미토탄, 프로카바진, 닥티노마이신(안티노마이신 D), 다우노루비신, 옥소루비신 하이드로클로라이드, 탁솔, 플리카마이신, 아미노글루테쓰이미드, 에스트라무스틴, 플루타미드, 류프롤라이드, 메게스트롤 아세테이트, 타목시펜, 테스톨락톤, 트릴로스탄, 암사크린(m-AMSA), 아스파라기나제(L-아스파라기나제), 에토포시드, 혈액 생성물, 예를 들면, 헤마토포피린 또는 이들의 유도체를 포함한다. 활성제의 다른 예는 유전 물질, 예를 들면, 재조합체 RNA 및 DNA를 포함하는 천연 또는 합성 기원의 RNA, 및 DNA를 포함한다. 특정의 단백질을 암호화하는 DNA가 많은 상이한 유형의 질병에 사용될 수 있다. 예를 들면, 종양 괴사 인자 또는 인터루킨-2 유전자를 제공하여 진전된 암을 치료할 수 있으며; 티미딘 키나제 유전자를 제공하여 난소 암 또는 뇌 종양을 치료할 수 있고; 인터루킨-2 유전자를 제공하여 신경아세포종, 악성 흑색종 또는 신장암을 치료할 수 있다. 본 기술에서 사용하기 위해 고려되는 추가의 활성제는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 제6,261,537호에 기술되어 있다. 항-종양제 및 이러한 제제를 검출하기 위한 스크리닝은 Monga, M. and Sausville, E.A.(2002) Leukemia 16(4):520-6에 고찰되어 있다.
일부 국면에서, 활성제는 약염기성 항-종양 화합물이며 이의 효능은 고형 종양 속에서 보다 높은 세포내/보다 낮은 세포외 pH 구배에 의해 감소된다. 예시적인 약 염기성 항-종양 화합물은 독소루비신, 다우노루비신, 미톡산트론, 에피루비신, 미토마이신, 블레오마이신, 빈카 알칼로이드, 예를 들면, 빈블라스틴 및 빈크리스틴, 알킬화제, 예를 들면, 사이클로포스파미드 및 메클로레타민 하이드로클로라이드, 및 항신생물성 푸린 및 피리미딘 유도체를 포함한다.
일부 국면에서, 조성물은 우레아제를 포함하여, 어떠한 사이토킨, 예를 들면, 종양 괴사 인자 및/또는 인터페론을 실질적으로 결여하고 있다. 당해 국면에서, 우레아제는 단독으로, 또는 사이토킨 이외의 다른 활성제와 함께, 소 분자 항-종양제와 조합하여 암 세포 성장을 억제하는데 효과적이다. 따라서, 당해 국면에서, 조성물은 치료하는 대상체 속에 존재하는 내인성 또는 천연의 사이토킨과 함께 작용하거나 작용하지 않을 수 있으나, 투여되는 조성물은 추가의 외인성 사이토킨을 함유하지 않는다.
일부 국면에서, 추가의 활성제는 페메트렉세드 및/또는 카르보플라틴이 아니다. 일부 국면에서, 추가의 활성제는 엽산 대사길항물질 및/또는 백금 제제가 아니다.
전달 및 투여 방법
항체-우레아제 접합체 조성물은 당해 분야에 공지된 다수의 방법에 의해 암세포로 전달될 수 있다. 치료학적 적용에서, 조성물은 암세포를 지닌 환자에게 암 세포(들)의 성장을 억제하는데 충분한 양으로 투여된다. 약제학적 조성물은 비경구, 장내, 상피(transepithelial), 경점막, 경피, 및/또는 외과를 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 경로에 의한 투여로 암세포에게 노출될 수 있다.
비경구 투여 양식은, 조성물이 예를 들면, 정맥내, 동맥내, 복강내, 척수내, 근육내, 관절내, 수막내, 및 심실내 주사, 피하, 생식선내 또는 종양내 침 거환 주사, 또는 연장된 연속성, 박동성(pulsatile) 또는 계획된 관류 또는 적절한 펌프 기술을 사용하는 미세주입에 의해 투여된다. 장내 투여 양식은 예를 들면, 경구(볼내 및 설하 포함) 및 직장 투여를 포함한다. 상피 투여 양식은 예를 들면, 경점막 투여 및 경피 투여를 포함한다. 경점막 투여는 예를 들면, 장내 투여 및 비강, 흡입, 및 깊은 폐 투여, 질 투여, 및 직장 투여를 포함한다. 경피 투여는 예를 들면, 패취(patch) 및 이온도입 장치를 포함하는 수동적이거나 활성인 경피 또는 경피부(transcutaneous) 양식, 및 또한 패이스트(paste), 샐브(salve), 또는 연고의 국소 적용을 포함한다. 외과적 기술은 데포트(depot)(저장기) 조성물, 삼투압 펌프 등의 이식을 포함한다.
활성제의 단일 또는 다중 투여는 대상체에 의해 요구되어 견디는 용량 및 빈도에 따라 투여될 수 있다. 어떠한 경우에도, 조성물은 대상체를 효과적으로 치료하기에 충분한 양의 활성제를 제공하여야 한다.
일부 국면에서, 본 기술은 항체-우레아제 접합체를 포함하는 약제학적 조성물의 암 세포로의 전달을 위한 화학 실체로서 리포좀 및/또는 나노캅셀과 같은 비히클의 사용을 고려한다. 이러한 제형은 본원에 개시된 폴리펩타이드, 약제, 및/또는 항체의 약제학적으로 허용되는 제형의 도입을 위해 바람직할 수 있다. 리포좀의 제형 및 사용은 일반적으로 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다(예를 들면, Backer, M.V., et al.(2002) Bioconjug Chem 13(3):462-7). 바람직한 국면에서, 개시된 조성물은 리포좀 속에 포획될 수 있다.
나노캅셀제는 일반적으로 화합물을 안정되고 재생가능한 방식으로 포획할 수 있다(Whelan, J.(2001) Drug Discov Today 6(23): 1183-84). 세포내 중합체성 과부하(overloading)로 인한 부작용을 피하기 위하여, 이러한 초미세 입자(약 0.1μm의 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 고안될 수 있다. 이러한 요건을 충족시키는 생분해성 폴리이소부틸시아노아크릴레이트 나노입자는 예를 들면, Lambert, G., et al.(2001) Int J Pharm 214(1-2): 13-6에 기술된 바와 같이, 용이하게 제조될 수 있다. 생물학적으로 활성인 물질을 함유하는 폴리알킬-시아노-아크릴레이트 나노입자를 제조하는 방법 및 이들의 용도는 미국 특허 제4,329,332호, 제4,489,055호 및 제4,913,908호에 기술되어 있다. 나노입자는 Capsulution, Inc.(www.capsulution.com)과 같은 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하다.
조성물의 전달을 위한 나노캅셀을 함유하는 약제학적 조성물은 미국 특허 제5,500,224호, 제5,620,708호 및 제6,514,481호에 기술되어 있다. 미국 특허 제5,500,224호는 속에 용해된 표면활성제, 및 속에 현탁된 직경이 500나노미터 미만인 다수의 나노캅셀을 함유하는 오일로 필수적으로 이루어진 오일 상을 포함하는 나노캅셀의 콜로리드성 현탁액의 형태인 약제학적 조성물을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,620,708호는 약물 및 다른 활성제의 투여를 위한 조성물 및 방법을 기술하고 있다. 조성물은 포유동물 장세포의 표면에 존재하는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 결합 잔기에 부착된 활성제 담체 입자를 포함한다. 결합 잔기는 표적 분자에 입자화된 활성제 담체의 세포내이입(endocytosis) 또는 대식작용(phagocytosis)을 개시하는데 충분한 결합 친화성 또는 결합활성으로 결합한다. 이후에, 활성제는 담체로부터 숙주의 전신 순환계로 방출될 것이다. 이러한 방식으로, 장관으로부터 단백질 및 폴리펩타이드의 흡수를 증가시키면서, 장에서 폴리펩타이드와 같은, 분해-민감성 약물의 분해를 피할 수 있다. 또한, 본 기술은 표적 세포를 둘러싸는 환경에서 활성제의 방출을 고려한다. 예를 들면, 일 국면에서, 항체-우레아제 접합체는 표적 세포에 대한 표적 잔기 결합 후 나노캅셀로부터 방출되어, 우레아제가 표적 세포를 둘러싸는 미세환경내로 방출되도록 한다. 미국 특허 제6,379,683호 및 제6,303,150호는 나노캅셀의 제조 방법 및 이의 용도를 기술하고 있으며, 본원에 참고로 포함된다.
사용된 약제학적 조성물은 유효량으로 대상체에게 투여된다. 일반적으로, 유효량은 (1) 치료하고자 하는 질병의 증상을 감소시키거나; (2) 치료하고자 하는 질병의 치료와 관련된 약리학적 변화를 유도하는데 효과적인 양이다. 암의 경우, 유효량은 종양의 크기를 감소시키거나; 종양의 성장을 지연시키거나; 전이를 예방 또는 억제하거나; 영향받은 대상체의 기대 수명을 증가시키는데 효과적인 양을 포함할 수 있으며, 상기 접촉은 표적화 잔기 및 선택된 전하 및 제2의, 반대로 하전된 코일-형성 펩타이드와 상호작용하여 안정한 α-나선 코일된-코일 이종이량체를 형성하는 능력에 의해 특징화된 제1의 코일-형성 펩타이드를 포함하는 접합체를 세포에 가함을 포함한다. 후속적으로 , 리포좀을 세포에 가한다. 리포좀은 외부 표면 및 내부 구획; 리포좀의 내부 구획내에 위치한, 활성제, 예를 들면, 우레아제; 및 다수의 제2의 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 제2의 펩타이드는 리포좀의 외부 표면에 연결된다.
일부 국면에서, 상기 접촉은 리포좀을 세포에 가함을 포함하며, 여기서 리포좀은 포획된 형태의 활성제, 예를 들면, 항체-우레아제 접합체를 가지며, 리포좀의 외부 표면은 표적 표면에 특이적으로 결합하는데 효과적인 세포 표적화 잔기, 및 표적 표면과의 상호작용으로부터 표적화 잔기를 차폐하는데 효과적인 친수성 중합체 코팅을 포함한다. 친지성 중합체 코팅은 방출될 수 있는 연결을 통해 리포좀내에서 표면 지질 성분에 공유결합한 중합체 쇄로 제조될 수 있다. 일부 국면에서, 방출제는 가해진 리포좀 속에서 연결의 실질적인 부위의 방출을 유발하는데 효과적인 양으로 종양 세포에 가해져서 표적화 잔기를 표적 표면에 노출시킨다. 방출가능한 연결은 이황화물, 에스테르 및 펩타이드 연결과 같은 환원가능한 화학적 연결일 수 있다.
일부 국면에서, 포유동물 대상체에 대한 리포좀-계 치료요법의 방법이 고려된다. 당해 방법은 대상체에게 표면-결합된 표적화 잔기 및 친수성 중합체 코팅을 가진 리포좀을 전신계 투여, 예를 들면, 정맥내 투여함을 포함한다. 방출가능하게 부착된 중합체 쇄로 구성된 친수성 중합체 코팅은 이의 표적과의 상호작용으로부터 표적화 잔기를 차폐하는데 효과적이다. 투여된 리포좀은 리포좀의 바람직한 생분포가 달성될 때까지 전신계적으로 순환하도록 한다. 방출제는 대상체에게 실질적인 부위의 절단을 유발하는데 효과적인 양, 예를 들면, 투여된 리포좀 속의 방출가능한 절단의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 및 보다 바람직하게는 약 90% 이상으로 투여된다. 표적화 잔기는 이의 표적과의 상호작용을 위해 친수성 중합체 쇄의 방출시 노출된다.
일부 국면에서, 리포좀은 고형 종양의 치료에 사용된다. 리포좀은 항체-우레아제 접합체, 및 임의로, 추가의 활성제, 예를 들면, 포획된 형태의 항-종양 약물을 포함하며 종양-특이적인 항원에 대해 특이적으로 결합하는데 효과적인 표적화 잔기에 의해 종양 영역에 대해 표적화된다. 예시적인 방법에서, 리포좀은 증식하는 종양 내피 세포에서 발현된 Flk-1,2 수용체에 대한 선택적인 부착을 위해, 리포좀내에 VEGF 리간드를 포함시킴으로써 종양의 혈관 내피 세포에 대해 표적화된다(Niederman, T.M., et al.(2002) Proc Natl Aced Sci 99(10):7009-14).
일부 국면에서, 리포좀은 크기가 약 30 내지 400nm이다. 당해 크기 범위의 리포좀은 종양 혈관화의 내피 세포 라이닝(lining) 속에 존재하는 "갭(gap)"을 통해 종양내로 도입될 수 있는 것으로 밝혀졌다(Maruyama, K, et al.(1999) Adv Drug Deliv Rev 40(l-2):89-102).
리포좀의 투여, 예를 들면, 정맥내 투여에 이어, 충분한 시간이 경과되어 리포좀이 대상체 전체에 분포되어 종양에 결합하도록 한 후, 방출제를 대상체에게 투여하여 리포좀으로부터 친수성 표면 코팅을 방출할 수 있다. 표면 코팅의 방출은 표적화 잔기를 노출시켜 표적 세포에 리포좀을 결합하도록 하는데 효과적이다. 일 국면에서, 친수성 표면 코팅은 pH 민감성 연결에 의해 리포좀에 부착된다. 연결은 리포좀이 종양에 결합한 후 방출된다.
위에서 기술한 국면 중의 어떠한 리포좀도 임의로 하나 이상의 포획된 항-종양 약물 또는 영상화제 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 리포좀이 가해지고 분포되도록 한 후, 방출제를 투여하여 친수성 표면 코팅을 방출시킴으로써 부착된 표적화 잔기를 노출시키고 결합을 개시할 수 있다. 리포좀은 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 제6,043,094호에 기술된 바와 같이 제조하고 투여할 수 있다.
본원에 참고로 포함된 미국 특허 제6,180,114호에 기술된 바와 같은, 소 단일라멜라 소낭(SUV)와 같은 추가의 전달제를 본 기술에 사용할 수 있다.
혈류 속에 존재하는 거대분자의 도입을 감소시키거나 방지하는 강력한 접합부 및/또는 활성 수송 메카니즘에 의해 결합된 세포에 의해 보호되거나 강하게 혈관화되지 않은 일부 영역이 존재한다는 것은 당해 분야의 숙련가에 의해 이해된다. 따라서, 예를 들면, 신경교종, 또는 다른 뇌암을 치료하기 위한 치료제의 전신계 투여는 거대분자의 지주막아래 공간으로의 도입을 막은 혈관-뇌 장벽(barrier)에 의해 구속될 수 있다. 이러한 유형의 종양에서, 치료학적 조성물은 바람직하게는 종양 부위에 직접 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 뇌 종양은 거환 주사, 미세주입, 또는 외과적으로 이식된 카테터(catheter)를 통해 종양 부위에 직접 투여함으로써 치료할 수 있다.
용량
본 기술의 방법을 위해, 투여량의 시기 및 순서를 조절하는 어떠한 효과적인 투여 요법도 사용할 수 있다. 사람 대상체에 대한 예시적인 용량 수준은 투여 방식, 종양의 정도(크기 및 분포), 환자 체격, 및 우레아제 치료에 대한 암의 반응성에 의존할 것이다.
항체-우레아제 접합체 조성물을 종양내에 투여, 예를 들면, 직접 주사하는 경우, 예시적인 투여량은 약 0.1 내지 1,00010μg/kg의 체중, 예를 들면, 약 0.2 내지 5μg/kg, 또는 약 0.5 내지 2 μg/kg이다. 주사 침의 대체는 통상의 영상 안내 기술, 예를 들면, 형광투시법에 의해 안내되어 주치의가 표적 조직과 관련하여 침의 위치를 고찰할 수 있도록 할 수 있다. 이러한 안내 도구는 초음파, 형광투시법, CT 또는 MRI를 포함할 수 있다.
일부 국면에서, 항체-우레아제 접합체의 투여된 투여량의 효능 또는 분포는 항체-우레아제 접합체를 종양내로 투여하는 동안 또는 후에, 대상체의 암 조직 영역내에서 pH에 있어서의 변화를 검출할 수 있는 도구에 의해 종양 조직을 모니터링함으로서 모니터링할 수 있다. 이러한 도구는 종양내로 직접 삽입할 수 있는 pH 프로브(probe), 또는 가시화 도구, 예를 들면, 자기 공명 영상(MRI), 컴퓨터처리된 단층촬영(CT), 또는 형광현미경을 포함할 수 있다. MRI 질의(interrogation)는 단순히 pH의 작용으로서 조직의 자기 특성에 있어서의 차이를 기준으로 하여, 추가의 영상화제의 부재하에서 수행할 수 있다. CT 또는 형광현미경 영상은 추가의 pH-민감성 영상화제를 필요로 할 수 있으며 이의 불투명도는 조직 매질의 pH에 의해 영향받는다. 이러한 제제는 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다.
어떠한 항체-우레아제 접합체를 투여하기 전에, 종양 조직을 주변의 정상 조직보다 비교적 더 낮은 이의 pH로 가시화시킬 수 있다. 따라서, 정상 조직은 약 7.2의 정상 pH를 가질 수 있는 반면, 종양 조직은 0.1 내지 0.4 이상의 pH 단위보다 더 낮을 수 있다. 즉, 어떠한 항체-우레아제 접합체를 주사하기 전에, 종양 조직의 정도는 이의 보다 낮은 pH에 의해 규정될 수 있다. 우레아제 투여 후, 우레아제를 가진 종양 영역의 pH는 상승하기 시작할 것이며, 앞서의 투여전 영상과 수득되는 영상을 비교함으로써 확인할 수 있다.
이러한 방식으로 조직에서 정보를 얻음(interrogating)으로써, pH에 있어서 변화의 정도 및 영향받은 조직의 정도를 모티터할 수 있다. 이러한 얻어진 정보(interrogation)를 기준으로 하여, 주치의는 추가의 조성물을 부위에 투여하고/하거나 종양 부위내 추가의 부위에 조성물을 투여할 수 있다. 당해 과정은 바람직한 정도의 pH 변화, 예를 들면, 0.2 내지 0.4 pH 단위가 고형 종양의 전체 영역에 걸쳐 달성될 때까지 반복할 수 있다.
직접적인 주사에 의한 것과 같은 투여는, 바람직한 종점, 바람직하게는 종양 덩어리의 실질적이거나 완전한 회귀가 관찰될 때까지, 적합한 간격, 예를 들면, 매주 또는 주당 2회로 반복될 수 있다. 치료 효능은 치료 과정 동안에 치료된 조직의 pH에 있어서의 변화를 가시화함으로써 모니터링할 수 있다. 따라서, 각각의 추가의 주사 전에, 조직의 pH를 가시화하여 종양의 현재 존재하는 정도를 측정한 후, 조직의 pH에 있어서의 변화를 사용하여 조직에 대한 항체-우레아제 조성물의 신규 투여량의 투여를 모니터할 수 있다.
어떠한 항체-우레아제 조성물이 직접적인 주사 이외의 방법에 의해 비경구적으로 투여되는 경우, 항체-우레아제 조성물의 예시적인 투여량은 100 내지 100,000의 국제 단위/kg의 우레아제 활성/kg의 대상체 체중이다. 본원에 나타낸 바와 같이, 당해 방법에서 항체-우레아제 조성물은 암 세포, 예를 들면, 고형 종양의 부위로 우레아제를 표적화하기 위한, 또는 종양 부위에서 선택적으로 우레아제를 봉쇄(sequestering)하기 위한, 예를 들면, 리포좀 형태의 항체를 포함한다.
조직 pH에서의 변화에 대해 민감한 영상 기술을 사용하여 투여된 투여량의 효능을 모니터할 수 있다. 이러한 표적화는 수시간 이상 이루어질 수 있으므로, 당해 방법은 항체-우레아제 조성물의 주사 전, 및 투여 후 수기간, 예를 들면, 12 내지 24시간 후에, 상기한 바와 같은 종양 pH를 모니터링 하여, 종양 영역의 pH의 상승에 의해 확인된 것으로서, 종양 부위가 부적절하게 투여되었는지를 확인한다. 이러한 얻은 정보의 결과에 의존하여, 상기 방법은, pH에 있어서의 바람직한 상승, 예를 들면, 0.2 내지 0.4 pH 단위가 관찰될 때까지 추가의 투여를 지시할 수 있다. 당해 투여량이 달성되면, 환자를 종양 크기 또는 상태에 있어서의 변화가 달성될 때까지, 규칙성을 기준으로, 예를 들면, 주당 1 또는 2회 우레아제 조성물의 유사한 투여량을 사용하여 치료할 수 있다.
최종의 투여량 요법은 약물의 작용을 개질시키는 다양한 인자, 예를 들면, 제제의 특이적인 활성, 질병 상태의 중증도, 환자의 반응성, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별, 및 식이, 어떠한 감염의 중증도 등을 고려하여, 우수한 의학적 실시의 측면에서 관여하는 주치의에 의해 결정될 것이다. 고려할 수 있는 추가의 인자는 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감성, 및 치료요법에 대한 내성/반응을 포함한다. 본원에 언급된 제형중 어느 것을 포함하는 치료를 위해 적절한 용량의 추가의 개선은 숙련가에 의해, 특히 개시된 용량 정보 및 검정, 및 또한 임상 시험에서 관찰된 약동학적 데이타의 측면에서 정규적으로 이루어진다. 적절한 용량은 투여량 반응 데이타와 함께 체액 또는 다른 샘플 속에서 제제의 농도를 측정하기 위한 확립된 검정의 사용을 통해 확인될 수 있다.
투여 빈도는 제제의 약동학적 매개변수 및 투여 경로에 의존할 것이다. 용량 및 투여를 조절하여 충분한 수준의 활성제를 제공하거나 바람직한 효과를 유지한다. 따라서, 약제학적 조성물은 제제의 바람직한 최소 수준을 유지하는데 요구되는 것으로서, 단일 투여량, 별개의 다중 투여량, 연속 주입, 지속된 방출 데포트(depot), 또는 이의 조합으로 투여될 수 있다.
짧게 작용하는 약제학적 조성물(즉, 짧은 반감기)은 1일 1회 또는 1일 1회 이상(예를 들면, 하루에 2회, 3회, 또는 4회) 투여될 수 있다. 오래 작용하는 약제학적 조성물은 매 3 내지 4일, 매주, 또는 2주당 1회 투여될 수 있다. 피하, 복강내, 또는 연속 주입을 위한 경막하 펌프와 같은 펌프.
약제학적으로 허용되는 담체 속에 상기 접합체를 포함하는 조성물은 적절한 용기 속에서 제조되어 위치하며, 나타낸 상태의 치료를 위해 표지될 수 있다. 표지에 나타낸 상태는 다양한 암 유형의 치료를 포함하나, 이에 한정되지 않을 수 있다. 하기 기술된 바와 같은, 키트가 또한 고려되며, 여기서 키트는 약제학적 조성물의 용량형 및 의학 상태의 치료시 조성물의 사용을 위한 지시사항을 포함하는 포장 삽입물을 포함한다.
일반적으로, 접합체 조성물은 대상체에게 유효량으로 투여된다. 일반적으로, 유효량은 (1) 치료하고자 하는 질병의 증상을 감소시키거나; (2) 치료하고자 하는 질병의 치료와 관련된 약리학적 변화를 유도하는데 효과적인 양이다. 암의 경우, 유효량은 종양의 크기를 감소시키거나; 종양의 성장을 지연시키거나; 전이를 예방 또는 억제하거나; 영향받은 대상체의 기대 수명을 증가시키는데 효과적인 양을 포함할 수 있다.
치료 방법
본 기술은 대상체에게 본원에서 제공된 치료학적 유효량의 조성물을 투여함으로써, 대상체에서 암을 치료함을 포함하여, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본원의 방법에 의한 치료에 적합한 암은 일반적으로 암종, 백혈병, 림프종, 및 육종을 포함한다. 본원의 방법에 의한 치료에 적합한 암은 일반적으로 암종, 백혈병, 림프종, 및 육종을 포함한다. 암종은 항문, 담즙관, 방광, 유방, 결장, 직장, 폐, 구강, 인두, 식도, 위, 췌장, 간, 신장, 방광 및 담즙관, 소장, 뇨관, 난소, 결장, 소 세포 폐 암종, 생식관, 내분비선, 전립선, 및 피부의 암종일 수 있다. 다른 적합한 암은 유암종 종양, 위장관 기질 종양, 두경부 종양, 원발성 종양, 혈관종, 흑색종, 악성 중피종, 다발성 골수종, 및 뇌, 신경, 눈, 및 뇌막의 종양을 포함한다.
일부 국면에서, 치료될 암은 고형 종양, 예를 들면, 암종, 육종, 흑색종 및 림프종을 형성한다. 일부 국면에서, 암은 하나 이상의 비-소세포 폐 암종, 유방, 췌장, 난소, 폐, 결장 암, 또는 이의 조합 중의 하나 이상이다. 일부 국면에서, 암은 비-소 세포 폐 암종이다. 일부 국면에서, 대상체는 사람이다.
치료학적 유효량은 당해 분야에 잘 공지된 방법으로 평가할 수 있다. 암 동물 모델, 예를 들면, 쥐 종양을 지닌 면역 적격 마우스 또는 사람 종양 이종이식체를 지닌 면역 절충된 마우스(예를 들면, 누드 마우스(nude mouse))는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 본원에 참고로 포함된 많은 문헌에 집중적으로 기술되어 있다. 이러한 정보는 랫트, 개 및/또는 비-사람 영장류에서 안전성 연구와 함께 사용되어 사람에서 안전하고 잠재적으로 유용한 초기 투여량을 결정한다. 유기체의 투여량을 평가하기 위한 추가의 정보는 실제 사람 암에서의 연구, 보고된 임상 시험으로부터 올 수 있다.
일부 국면에서, 암에 대한 치료 방법은 암의 적어도 하나의 증상의 치유, 및 완화를 포함하는 것으로 의도된다. 암 환자는, 당해 환자가 암으로부터 치유되고, 암이 차도가 있으며, 생존이 통계적으로 유의적인 방식으로 증가되고, 각각의 유형의 림프구 또는 조혈성 악성종양에 대해 확립된 표준 기준을 기준으로 하여 림프구 또는 조혈성 종양 크기(burden)에 있어서의 감소가 존재하거나, 고형 종양 크기가 고형 종양에 있어서의 반응 평가 기준(RECIST 1.0 또는 RECIST 1.1, Therasse et al. J Natl. Cancer Inst. 92(3):205-216, 2000 및 Eisenhauer et al. Eur. J. Cancer 45 :228- 247, 2009)에 의해 정의된 바와 같이 감소된 경우 치료된다. 본원에 사용된 것으로서, "차도"는 암의 증거를 이미 가진 환자에서 암 세포의 성장의 부재를 말한다. 따라서, 차도가 있는 암 환자는 이들의 암이 치유되거나 암이 존재하지만 용이하게 검출되지 않는다. 따라서, 암은, 종양이 확장하지 못하거나 전이하지 않는 경우 차도가 있을 수 있다. 본원에 사용된 것으로서 완전한 차도는 x-선, MRI, CT 및 PET와 같은 영상, 또는 혈액 또는 골수 생검과 같은 진단 방법에 의해 나타낸 것으로서 질병의 부재이다. 암 환자가 차도가 있는 경우, 이는 암이 다시 나타나는 경우인, 재발을 수반할 수 있다.
일부 국면에서, 치료는 페메트렉세드 및/또는 카르보플라틴과 조합되지 않는다. 일부 국면에서, 치료는 폴레이트 대사길항물질 화합물 및/또는 백금제와 조합되지 않는다.
키트
일부 국면에서, 본 기술은 본원에 기술된 방법을 사용하여 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 키트를 제공한다. 당해 키트는 하나 이상의 활성제를 함유하는 용기를 포함한다. 당해 키트는 본 기술의 방법의 실시를 위해 본원에 기술된 다른 성분들 중 어느 것도 추가로 포함할 수 있다.
키트는 종양 세포 성장을 억제하기 위한 활성제의 사용을 개시하는 지시사항(즉, 프로토콜)을 함유하는 지시 물질을 임의로 포함할 수 있다. 따라서, 일 국면에서, 키트는 활성제, 바람직하게는 우레아제 효소를 함유하는 약제학적 조성물, 및 대상체에서 암의 치료를 위해 대상체에 대한 조성물의 투여를 교시하는 지시사항 물질을 포함한다. 일 국면에서, 지시사항 물질은 우레아제 조성물을 대상체에게 종양의 크기에 의존하며, 조성물이 종양내로의 직접적인 주사에 의해 투여되는 경우, 종양 mm3당 0.1 내지 100의 국제 단위 우레아제 활성인 양, 및 조성물이 종양내로의 직접적인 주사 외에 환자에게 비경구적으로 투여되는 경우 100 내지 100,000의 국제 단위/kg의 국제 단위 우레아제 활성/kg의 양으로 투여함을 교시한다.
다른 국면에서, 지시사항 물질은 우레아제 조성물을 효능이 고형 종양내에서 보다 높은 세포내/보다 낮은 세포외 pH 구배에 의해 감소되는 약 염기성 항-종양 화합물을 또한 제공받는 대상체에게, 고형 종양내에서 보다 높은 세포내/보다 낮은 세포외 pH 구배를 감소시키거나 역전시키는데 효과적인 우레아제의 양으로 투여함을 교시한다.
또한, 지시사항 물질은 우레아제 조성물을 고형 종양을 함유하거나, 함유하는 것으로 의심되는 대상체에게 대상체에서 고형 종양내에 우레아제를 국재화하는데 효과적인 조건 하에서 투여하고, 대상체를 대상체 조직내 세포외 pH에 있어서의 변화를 검출할 수 있는 진단 도구로 정보를 얻고, 상기 투여 후 세포외 pH에 있어서의 상승을 나타내는 대상체내에서 조직 영역을 확인함을 교시한다.
지시사항 물질은 전형적으로 서면의 또는 인쇄된 물질을 포함하지만 이들이 이에 한정되지는 않는다. 이러한 지시사항을 저장하고 최종 사용자에 대해 이들과 통신할 수 있는 어떠한 매체도 본 기술에 의해 고려된다. 이러한 매체는 전자 저장 매체(예를 들면, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예를 들면, CD ROM) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 매체는 이러한 지시사항 물질을 제공하는 인터넷 사이트에 대한 주소를 포함할 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 본 개시내용의 다양한 국면을 예증할 목적으로 제공된다. 이들은 어떠한 방식으로도 본 개시내용을 한정함을 의미하지 않는다. 당해 분야의 숙련가는 본 개시내용이 목적을 수행하고 언급된 목표 및 장점, 및 본원에서 고유한 어떠한 목적, 목표 및 장점을 수득하기 위해 잘 채택됨을 인식할 것이다. 본 실시예(본원에 기술된 방법과 함께)는 바람직한 국면을 현재 대표한다. 이들은 예시적이며, 개시내용의 영역을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 청구범위의 영역에 의해 정의된 개시내용의 취지내에 포함되는 변화 및 다른 용도도 당해 분야의 숙련가에게서 발생할 것이다.
실시예 1: L-DOS47: CEACAM6-발현 종양을 표적화하는 항체-우레아제 접합체
종양의 미세환경은 정상 조직에 대비하여 흔히 산성이다. 비정상적인 혈관화로부터 부위별 저산소증에 대한 반응시 혐기성 당분해로부터 락테이트의 축적이 직접적인 원인인 것으로 여겨진다(1, 2). 그러나, 암 세포는 산소의 존재하에서조차 혐기적으로 글루코즈를 지속적으로 대사한다(3). 이는 전환된 대사 표현형 및 생성되는 산성 환경이 암 세포에게 성장 장점을 부여할 수 있음을 암시한다(4).
우레아를 암모니아로 전환시키고 용액 pH를 상승시키는 작두콩 우레아제는 암 세포에 대해 세포독성인 것으로 밝혀졌다(8). 사람 유방 및 폐 이종이식체를 지닌 마우스에서 효소의 종양내 주사는 또한 종양 성장을 유의적으로 지연시켰다(8). 그러나, 임상 셋팅에서 암 치료제의 종양내 전달은 실시하기 어렵다. 진전되고 유의적인 대사 질병을 지닌 환자에서, 종양내 주사는 실행가능한 선택사항이 아니다. 보다 실제적인 시도는 정맥내 주사를 통해 효소를 전달하는 것이다. 그러나, 우레아제는 표적화 도메인을 결여하며 효소의 전신적 전달은 표적을 벗어난 독성(off-target toxicity)을 생성할 수 있다. 종양을 특이적으로 표적화하는 항체-효소 접합체를 사용하여 암 부위로 우레아제를 전달한다. 접합체 속에서 사용된 당해 항체는 비-소 세포 폐암 환자에서 CEACAM6을 특이적으로 인식한다.
폐 선암종 세포에서 CEACAM6를 인식하는 단일-도메인 낙타 항체 단편(AFAIKL2, 서열 번호: 1)(17)을 작두콩 우레아제(DOS47)에 대한 접합을 위해 선택하여 암 치료제를 생성하였다. 본 기술은 이러한 항-CEACAM6-우레아제 접합체(L-DOS47)에서 수행된 적절한 전임상 연구중 일부를 기술하며, 이는 현재 사람 제I상 임상 연구이다.
작두콩 우레아제의 항-종양 활성을 항체-우레아제 접합체(L-DOS47)의 형태로 항-CEACAM6 단일 도메인 항체의 특이성과 결합시켰다. L-DOS47은 CEACAM6-발현 암 세포주에 특이적으로 결합하여 강력한 세포독성 효과를 발휘하였다. 경쟁적 결합 검정은, L-DOS47의 결합 친화성이 증가된 결합활성으로 인하여 천연의 단일 도메인 항체의 것보다 약 500배 더 강하였음을 나타내었다. L-DOS47의 세포독성은 반응계내에서 우레아의 이용가능성 및 암모니아 독성에 대한 표적화된 세포의 민감성에 의존한다. BxPC-3 세포는 CEACAM6 유전자를 사일런싱(silencing)시킴으로써 L-DOS47 효과로부터 보호되었지만, CEACAM6 과발현은 형질감염된 H23 세포가 L-DOS47 세포독성에 대해 민감해지도록 하였다. 사람 정상 및 암 조직의 면역화학적 염색은, L-DOS47이 폐 선암종에 대해 우선적으로 결합하였으며, 결장 및 췌장 선암종에 대해 양성이지만 보다 약하게 염색됨을 나타내었다. 마우스에서 폐 선암종 A549 세포의 전이 연구는 또한 L-DOS47이 10μg/mL의 농도에서 폐내 암 세포 수를 감소시키는데 효과적이었음을 나타내었다.
물질. 작두콩(카나발리아 엔시포르미스(Canavalia ensiformis) 우레아제는 BioVectra Inc.(PEI, 캐나다)로부터 구입하여 산 침전, 알코올 분획화, 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 효소의 순도는 SDS-PAGE, HPLC, 및 질량 분광법으로 측정한 것으로서 >97%이었다. 우레아제의 1 단위는 25℃ 및 pH 7.6에서 암모니아의 분당 1μmole의 생산으로서 정의된다.
낙타의 중쇄 항체 레퍼토리로부터 기원한 파아지 라이브러리(phage library)를 사용하여 비-소 세포 폐 암종 A549에 대해 패닝함으로써 단일-도메인 항체(sdAb)를 확인하였다. sdAb를 AFAI으로 지정하였다(17). AFAI의 유전자 서열은 접합 목적을 위해 최적화하여 AFAIKL2로 재명명하였다. AFAIKL2 항체를 이후에 클로닝하여 이. 콜라이 BL21(DE3) pT7-7 시스템내에서 발현시켰다. 항체는 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 봉입체로부터 정제하였다. 우레아제에 대한 항체의 접합은 이종 이작용성 교차-링커 N-석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노-벤조에이트(SIAB)를 사용하여 수행하였다. AFAIKL2 항체를 1차 아민 그룹을 통해 SAIB 링커의 NHS 에스테르 부위로 먼저 활성화시켰다. 활성화된 항체는 효소에 존재하는 유리된 설프하이드릴 그룹에 대한 교차-링커의 요오도아세틸 그룹을 통해 우레아제에 결합시켰다. 표적화된 접합 비(1:6 내지 1:10, 우레아제 대 항체 비)는 고 순도 우레아제 및 활성화된 항체를 2:1의 질량 비에서 혼합합으로써 조절하였다. 항체-우레아제 접합체는 울트라다이아필트레이션로 정제하였다.
우레아, 트립신(조직 배양 등급), 페나진 에토설페이트(PES), 나트륨 니트로프루시드, 차아염소산나트륨 용액, 페놀, NaCl, KH2PO4, MgSO4, NaHC03, 및 글루타르알데하이드는 Sigma Chemical Co.(미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨(MTS) 및 트립신(펩타이드 단편화 및 질량 분광법 분석에서 사용하기 위해)은 Promega Corp.(위스콘신주 매디슨 소재)로부터 구입하였다. 과산화수소(30%), SIAB, KC1, D-글루코즈, HCl, Na2HP04, 및 NaH2P04는 Fisher Scientific(온타리오주 오타와 소재)로부터 구입하였다. 소 혈청 알부민 분획 V(BSA)는 Roche(인디애나주 인디애나폴리스 소재)로부터 구입하였다. 염화암모늄(0.100 M)은 Ricca Chemical(텍사스주 아를링톤 소재)로부터 구입하였다. 항-AFAIKL2-퍼옥시다제 접합체는 Rockland Immunochemicals(펜실베니아주 길버츠빌 소재)로부터 생산되었다. 세포 배양 배지(RPMI), 태아 소 혈청, 및 항생제는 Life Technologies(온타리오주 벌링톤 소재)로부터 입수하였다. 암컷 CrTac:NCr-Foxnl nu 누드 마우스는 Taconic(뉴욕주 허드슨 소재)으로부터 공급되었다. 실험에 사용된 변형된 크렙 링거 완충액(Modified Krebs Ringer 완충액: KRB)은 NaCl(98.3 mM), KC1(4.73 mM), KH2P04(1.19 mM), MgS04(1.19 mM), D-글루코즈(11.7 mM), Na2HP04(11.1 mM), 및 NaH2P04(2.77 mM), pH 7.2를 함유하였다.
인도페놀 검정
우레아제 효소 반응에 의해 생산된 암모니아의 양은 변형된 인도페놀 검정(18)을 사용하여 측정하였다. 요약하면, 용액 A를 lOmL의 물 속에 165mg의 페놀 및 132mg의 NaOH 펠렛(pellet)을 용해시킨 후, 66μL의 니트로푸르시드나트륨 용액(lOmg/mL)을 첨가함으로써 새로이 제조하였다. 용액 B는 40μL의 아염소산나트륨을 5mL의 물에 첨가하여 제조하였다. 전체-세포 결합 검정(하기 참고)로부터의 샘플 용액(각각 30μL)을 5μL/웰의 5N NaOH:H20(3.3:46.7) 및 20μL/웰의 물을 함유하는 새로운 96-웰 플레이트에 이전시켰다. 용액 A(50μL/웰) 및 용액 B(50μL/웰)을 가하고 이후에, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 색상 전개를 위하 미세플레이트 판독기로 이전시켰다. OD를 630nm에서 측정하였다. 웰에서 생산된 암모니아의 양을 표준물로서 염화암모늄을 사용하여 교정 곡선으로부터 계산하였다(0 내지 150μΜ).
L-DOS47의 전체-세포 결합 검정
세포 단층을 96-웰 배양 플레이트 속에서 100μL/웰의 종양 세포(4x104개의 세포/웰)을 씨딩(seeding)함으로써 제조하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배지를 플레이트로부터 제거하고 세포 단층을 100μL/웰의 0.05% 글루타르알데하이드(포스페이트 완충된 염수, PBS)로 10분 동안 실온(RT)에서 고정시켰다. 이후에, 플레이트를 PBS로 세척하고 120μL/웰의 글리신 용액(50mM)을 가하고 37℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트를 120μL/웰의 1% BSA/PBS로 30분 동안 차단시켰다. 이후에, 플레이트를 완충액 A(PBS 중 0.05% BSA)로 3회 세척하고 80μl/웰의 희석된 L-DOS47 또는 DOS47 용액을 가하고 37℃에서 1.5시간 동안 항온처리하였다. 결합 시그날(binding signal)을 우레아 또는 항체 방법으로 생성시켰다: (1) 우레아 시도를 사용하여 플레이트를 완충액 A로 4회 세척하고 80μL/웰의 20mM 우레아(0.1M 포스페이트 완충액, pH7.6 속에서 제조)를 가하고 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 40μL/웰의 1N HCl을 가하여 반응을 중지시켰다. 각각의 웰에서 생산된 암모니아의 양을 인도페놀 검정을 사용하여 측정하였다. (2) 항체 방법을 위해, 차단 단계 전에 내인성 퍼옥시다제를 우선 100μL/웰의 0.3% 과산화수소를 30분 동안 사용하여 퀀칭(quenching)시켰다. 시험 물품과 함께 항온처리한 후, 플레이트를 PBS로 세척하고 희석된 항-AFAIKL2-퍼옥시다제 항체 접합체(1:8000)를 0.05% 트윈-20 및 0.1% 우유 분말을 함유하는 완충액 A 속에서 제조하였다. 플레이트를 완충액 A로 3회 세척하고 100μL/웰의 항체-퍼옥시다제 접합체를 플레이트에 가하였다. 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, 플레이트를 완충액 A로 3회 세척하였다. 퍼옥시다제 기질을 0.03% H2O2을 함유하는 시트르산나트륨 완충액 속에 1mM에서 제조하고 100μL/웰의 기질 용액을 가하고 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 플레이트를 미세플레이트 판독기로 405nm에서 OD 측정을 위해 이전시켰다.
L-DOS47의 세포독성 검정
세포 단층을 100μL/웰의 종양 세포(4x104개의 세포/웰)를 96-웰 배양 플레이트에 씨딩함으로써 제조하고 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 배지를 각각의 웰로부터 제거하고 80μL/웰의 L-DOS47 또는 DOS47을 가하고 37℃에서 2시간 동안 추가로 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트를 완충액 A로 3회 세척하였다. 이후에, KRB 중 100μL/웰의 우레아(20mM)를 플레이트에 가하고, 이를 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 배지를 제거하고 100μL/웰의 플레인 배지(plain medium)로 대체하였다. 세포 생존능을 MTS 세포 생존능 검정을 사용하여 측정하였으며, 여기서 MTS/PES 용액의 혼합물(20:1 vol/vol; MTS, 2mg/mL; PES, lmg/mL)을 제조하고 20μL/웰의 혼합물을 플레이트에 가하였다. 이후에, 플레이트를 37℃에서 1 내지 2시간 동안 항온처리하고 OD를 630nm에서 490nm에서의 참조물을 사용하여 측정하였다.
세포-계 전기화학발광(ECL) 결합 검정
L-DOS47, AFAIKL2 항체, 및 DOS47을 루테늄-NHS-에스테르(Sulfo-Tag, Meso Scale Discovery MSD; 매릴랜드주 록크빌 소재)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 표지하였다. 이들 루테늄-태그된 단백질은 표적 항원에 대한 L-DOS47 및 AFAIKL2의 결합의 직접적인 측정을 허용하였다. 직접적인 결합 검정을 위해, BxPC-3 세포 단층을 96-웰 섹터 PR 고-결합 플레이트(SECTOR PR High-Bind plate: MSD)에서 제조하였다. 고정 및 차단 후, 다양한 양의 L-DOS47-태그 또는 AFAIKL2-태그를 가하였다. 플레이트를 37℃에서 1.5시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트를 2회 세척하고 판독 완충액(MSD)으로 충전하였다. ECL 시그날을 이후에 SECTOR PR-100 판독기(MSD)를 사용하여 즉시 판독하였다. 경쟁적 결합 검정의 경우, L-DOS47 또는 AFAIKL2 항체를 사용하여 BxPC-3 세포에 대한 L-DOS47-태그의 결합을 억제하였다. 1μg/mL에서 L-DOS47-태그를 사용하여 BxPC-3 세포에 결합시켰다. 다양한 농도의 경쟁인자(L-DOS47 또는 AFAIKL2)를 사용하여 태그된 L-DOS47의 결합을 완료하였다. 항온처리 후, 플레이트를 2회 세척하고 판독 완충액으로 충전시켰다. 이후에, 플레이트를 SECTOR PR-100 판독기를 사용하여 즉시 판독하였다.
BxPC-3 세포에서 CEACAM6 유전자 녹다운(Gene Knockdown)
CEACAM6이 L-DOS47에 의해 인식된 특이적인 항원인지를 확인하기 위해, 양성 세포주 BxPC-3의 CEACAM6 유전자를 OriGene(매릴랜드주 록크빌 소재)로부터의 HuSH-29 헤어핀 발현 클론을 사용하여 사일런싱하였다. 이들 플라스미드는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 서열을 전사하며, 이는 RNA 방해를 통해 표적 유전자 전사를 차단한다. BxPC-3 세포를 HuSH 플라스미드로 형질감염시키고 안정하게 형질감염된 세포를 푸로마이신을 사용하여 선택하였다. 상이한 클론을 HuSH6(AAGGCGAAAGAGTGGATGGCAACAGTCTA(서열 번호: 5)), HuSH7(AAGAAGCAACCGGACAGTTCCATGTATAC(서열 번호: 6)), 및 대조군 플라스미드 HuSH-TRS의 형질감염으로부터 수득하였다. 2개의 양성의 안정한 세포주(HUSH#6 및 HUSH#7) 대조군(HUSH-TRS)을 항생제 선택으로 수득하였다. 이들 클론을 이후에 사용하여 전체-세포 결합 검정을 사용하여 L-DOS47과의 결합에 대해 점검하였다. L-DOS47과의 항온처리 후, 플레이트를 완충액 A로 3회 세척하고 80μL/웰의 20 mM 우레아(0.1M 포스페이트 완충액, pH 7.6에서 제조)를 가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 40μL/웰의 1N HCl을 가하여 효소 반응을 중지하였다. 생산된 암모니아의 양은 인도페놀 검정을 사용하여 측정하였다.
H23 세포에 대한 CEACAM6 유전자의 형질감염
G418 선택성 마커를 함유하는 포유동물 발현 벡터를 PMP-GFP(혈장 막 단백질-녹색 형광성 단백질) 및 CEACAM6 유전자로 클로닝하였다. 셀펙틴 시약(Cellfectin reagent)(Life Technologies)을 사용하여 발현 벡터를 H23 세포내로 형질감염시켰다. 요약하면, 2mL의 완전 RPMI 배지(10% 태아 소 혈청 및 50 U/ml의 페니실린 및 50μg/ml의 스트렙토마이신을 함유함) 속의 2x106개의 세포/웰의 H23 세포를 6-웰 배양 플레이트 속에 씨딩하고 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 셀펙틴 시약(10μL) 및 DNA(1 내지 2μL)를 100μL의 혈청 유리된 RPMI 배지 각각에 희석시켰다. 2개의 희석된 용액을 이후에 합하고, 온화하게 혼합하여 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 플레이트를 1.5mL의 혈청-유리된 RPMI 배지로 2회 세척하였다. 합한 용액을 0.8mL의 혈청-유리된 RPMI 배지 속에 희석하고, 온화하게 혼합하고, 세포에 가하였다. 세포를 37℃에서 CO2 항온처리기 속에서 밤새 항온처리하였다. 다음날, 배지를 2mL의 완전 RPMI 배지로 교체하였다. 형질감염된 세포는 CEACAM6와 동일한 mRNA로부터 GFP를 동시-발현하였다. 형질감염된 세포를 400μg/mL G418 항생제를 함유하는 배지 속에서 항온처리함으로써 선택하였다. 세포를 직접 또는 CEACAM6의 표면 발현을 나타내는, cy5.5 표지된 L-DOS47와 함께 항온처리한 후 분류하였다.
L-DOS47에 의한 사람 종양 조직의 면역화학적 염색
42개의 암 및 정상 조직을 나타내는 총 400개의 조직 샘플을 스크리닝하였다(Axel Wellmann, University Hospital Aachen, 독일 RWTH 아첸 소재). 슬라이드를 우선 건조 오븐 속에서 62℃에서 1시간 동안 수직 배향으로 항온처리하여 파라핀을 제거하였다. 이후에, 슬라이드를 크실렌 치환체 속에서 5x4 분 동안 탈왁스하였다. 슬라이드를 100%, 95%, 및 75% 에탄올로 각각 2x3분 동안 수화시킨 후, 수돗물 속에 5분 동안 침지시켰다. 내인성 퍼옥시다제를 0.3% H2O2로 30분 동안 퀀칭시켰다. 벡타스타인 엘라이트(Vectastain Elite) ABC 키트(Vector Labs, 온타리오주 벌링톤 소재)를 사용하여 슬라이드에서 L-DOS47 결합을 검출하였다. 요약하면, PBS 속에서 3x5분 동안 세척한 후, 슬라이드를 차단 혈청 속에서 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이후에, 슬라이드를 L-DOS47 용액(완충액 A 중 20μg/mL) 속에서 37℃에서 1.5시간 동안 항온처리하였다. PBS로 세척한 후, 슬라이드를 마우스 항-우레아제 항체(Sigma, 1:1500)와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. PBS로 세척한 후, 슬라이드를 바이오티닐화된 제2 항체 용액(Vector Labs)으로 30분 동안 항온처리하였다. PBS로 세척한 후, 슬라이드를 벡타스타인 엘라이트 ABC 시약과 함께 30분 동안 항온처리하였다. PBS로 세척한 후, 슬라이드를 새로운 DAB(3,3'-디아미노벤지딘)퍼옥시다제 기질 용액 혼합물(Vector Labs) 속에서 RT에서 2분 동안 항온처리하였다. 반응을 수돗물 속에서 5분 동안 세척하여 정지시켰다. 이후에 슬라이드를 메이어 헤마톡실린 속에서 10초 동안 역염색(counterstaining)하였다. 슬라이드를 75%, 80%, 95%, 및 100% 에탄올 속에서 탈수시켰다. 크실렌 속에서 세정한 후, 슬라이드를 클라리온 마운팅 배지(Clarion Mounting Medium)로 고정시켰다.
A549 전이 연구
A549 종양 세포(5x106)를 씨딩하고 저 결합 배양 플레이트 속에서 성장시켰다. 일단 충분한 수가 수득되면, 세포를 수거하고 배양 배지 속에 5x106개의 세포/mL의 농도에서 재현탁시켰다. 이후에, 세포를 6-웰, 저-결합 조직 배양 플레이트 내로 lmL/웰에서 두었다. 이후에, 10 또는 15μg/mL의 최종 농도에서 L-DOS47(lmL)을 각각의 웰에 가하였다. 동형 대조군을 10μg/mL의 V21-DOS47 접합체(혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체를 표적화하는 항체-우레아제 접합체)로 처리하였다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 원심분리하고 멸균 PBS로 3회 세척하고 멸균 PBS 속에 lxlO7개의 세포/mL로 재현탁시켰다. 각각의 마우스는 이후에 1x106개의 처리된 세포의 단일 접종을 제공받았다. 당해 연구는 암컷 CrTac:NCr-Foxn1 nu 마우스(처리되지 않음, 동형, 및 L-DOS47(10 및 15μg/mL))의 4개 그룹으로 이루어졌다. 총 40마리의 마우스(각각의 그룹 당 10마리)를 A549 종양 세포를 사용하여 꼬리 정맥을 통해 정맥내 접종하였다.
그룹당 5마리의 동물을 22일째(3주)에 마취시키는 한편, 나머지 동물은 71일째(10주)에 걸쳐 유지시켰다. 희생시킨 후, 동물을 인디아 잉크(India ink)(Calvert Labs; Olyphant, PA)로 기도내에 주사하고; 이후에, 폐를 절개하여 페케트 용액(Fekete's 용액)(Calvert Labs) 속에 후속적으로 고정시켰다. 종양 전이에 있어서 시험 물품의 효과를 해부용 현미경 하에 각각의 폐에서 전이성 종양의 수를 계수함으로써 측정하였다. 각각의 그룹으로부터의 대표적인 폐를 사진찍었다.
다양한 암 세포주에 대한 L-DOS47의 결합
L-DOS47의 상이한 결합 프로파일을 5개의 종양 세포주-BxPC-3, Capan-1, ZR-75-30, LS 174T, 및 MDA-MB231에서 관찰하였다(도 1의 A). 당해 결과는, L-DOS47이 2개의 췌장(BxPC-3 및 Capan-1) 및 유방(ZR-75-30) 세포주에 잘 결합하였음을 나타내었으며, 이는 CEACAM6 항원이 세포 표면에서 발현되었음을 나타낸다. 중간의 결합이 또한 결장 세포주 LS174T에서 관찰되었으나 유방 세포주 MDA-MB231에서는 발견되지 않았다(음성 대조군). AFAIKL2 항체는, 우레아제 효소에 접합되는 경우, CEACAM6-발현 세포를 향한 특이적인 표적화를 제공하였다. 이는 DOS47로 처리한 세포에서 결합 시그날의 부재로 확인하였다(데이타는 나타내지 않음).
L-DOS47의 세포독성
도 1의 B는, BxPC-3 및 ZR-75-30 둘 다가 L-DOS47 세포독성에 대해 민감성임을 나타내었다. 세포 생존에 있어서의 신속한 강하가 1μg/mL 미만의 L-DOS47로 처리한 이들 2개의 세포주에서 관찰되었다. 중간의 효과는 Capan-1 및 LS 174T 세포에서 관찰되었다. L-DOS47은 음성 대조군 세포주 MDA-MB231에서 어떠한 효과도 가지지 않는다. 보다 많은 세포주로부터의 결합 및 세포독성 결과의 목록은 표 1에 나타내었다. L-DOS47 세포독성은 상응하는 세포주에서 L-DOS47의 결합 활성에 직접 의존한다. A549 및 Capan-1의 보다 약한 세포독성 반응은 암모니아 독성에 대한 이들 2개의 세포주의 보다 내성인 것이 기인한다(데이타는 나타내지 않음). 한편, H23 세포는 암모니아에 대해 매우 민감하다(데이타는 나타내지 않음). 세포 표면에서 CEACAM6 항원의 부재에도 불구하고, H23 세포는 아마도 웰에서 비-특이적으로 결합된 L-DOS47의 존재에 기인하여, L-DOS47에 대해 어느 정도 약한 세포독성 반응을 여전히 나타낸다.
9개의 사람 종양 세포주에서 L-DOS47의 다양한 결합 및 세포독성 연구로부터 수득한 결과의 요약
세포주 결합 검정 세포독성 검정
MDA-MB231 유방 선암종 - -
MCF-7 유방 암종 - -
ZR-75-30 유방 도관 암종 +++ +++
LS 174T 결장 선암종 ++ ++
A549 폐 선암종 ++ +
H23 폐 선암종 - +
BxPC-3 췌장 선암종 +++ +++
Capan-1 췌장 선암종 +++ ++
MIA PaCa-2 췌장 암종 + +
여기서: +, 양성(+의 수는 활성의 강도를 나타낸다); -, 음성
4개의 사람 조직으로부터 5개의 세포주(BxPC-3, Capan-1, ZR-75-30, LS 174T, 및 A549)는 표 1에 나타낸 바와 같이 강한 L-DOS47 결합 및 L-DOS47 세포독성에 대해 양호한 민감성(A549는 제외)을 나타내었다. L-DOS47의 세포독성 효과는 암 세포에 대한 상대적인 결합 강도에 거의 의존한다. 그래프에서의 결과는 대표적인 실험의 평균(n=3)을 나타낸다. 표준 편차(SD)는 모든 값에 대해 10% 미만이었다.
BxPC-3 세포에 대한 L-DOS47의 직접적인 및 경쟁적인 결합
세포계 전자화학발광성 결합 검정은 종양 세포에 결합된 루테늄-표지된 항체 접합체의 직접적인 검출을 허용한다. 도 2의 A에서, 루테늄-태그된 L-DOS47 및 AFAIKL2 항체는 BxPC-3 세포에 결합하는 것으로 밝혀졌지만, 루테늄-태그된 DOS47은 음성 대조군으로서 작용하였다. L-DOS47은 L-DOS47에서 나타낸 보다 높은 항체 결합활성(6 내지 10개 항체)으로 인하여 AFAIKL2 항체보다 훨씬 더 높은 결합 친화성을 나타내었다. 당해 결과를 경쟁인자로서 L-DOS47 및 AFAIKL2 항체를 사용하여 추가로 확인함으로써 BxPC-3 세포에 대한 루테늄-태그된 L-DOS47의 결합을 억제하였다(도 2의 B). L-DOS47 및 AFAIKL2 항체 둘 다는 BxPC-3에 대한 루테늄-태그된 L-DOS47의 결합을 억제하였으며, 예측된 바와 같이, L-DOS47은 보다 우수한 결합 친화성을 입증하였으므로 AFAIKL2 항체보다 BxPC-3에 대한 루테늄-태그된 L-DOS47 결합의 보다 강력한 억제를 입증하였다. L-DOS47 및 AFAIKL2 항체 둘 다의 명백한 결합 친화성은 시험 물품의 IC50(결합에서 50% 감소를 유발하는데 필요한 경쟁인자의 양)으로 비교할 수 있다. L-DOS47 및 AFAIKL2 항체의 IC50은 각각 2 및 20μg/mL; 또는 L-DOS47(1개의 우레아제에 대해 6개의 항체의 접합 비의 경우 MW=622k)에 대해 3.22nM 및 AFAIKL2(MW=12.9k)에 대해 1.55μΜ인 것으로 추정되었다. 당해 결과는, L-DOS47의 결합 친화성이 AFAIKL2 항체의 결합 친화성의 약 500배임을 제안하였다.
H23 세포내에서 형질감염된 CEACAM6 유전자의 과발현
CEACAM6 유전자로 형질감염 후, 양성 클론 H23-CC6 #7을 확인하였다. A549 세포의 것에 보다 근접한 CEACAM6 수준을 갖는 클론은 H23-CC6 #7 클론을 L-DOS47-cy5.5로 재분류함으로써 수득하였다. 당해 클론을 보다 많은 양의 G418 항생제(800μg/mL)와 함께 추가로 항온처리하는 것은 보다 높은 수준의 CEACAM6 발현을 지닌 것을 선택하는 것을 도왔다. H23-CC6 #7이 A549 및 BxPC-3 세포보다 세포 표면에서 CEACAM6을 거의 발현하지 않았지만, 당해 CEACAM6-형질감염된 클론은 암모니아 독성에 대한 이의 고도의 민감성으로 인하여(데이타는 나타내지 않음) L-DOS47 세포독성에 대한 BxPC-3 세포보다 심지어 더 민감하였다(도 3의 B).
BxPC-3 세포내에서 CEACAM6 유전자 녹다운
2개의 CEACAM6 녹다운 클론(HUSH#6 및 HUSH #7)에 대한 L-DOS47의 결합은 천연의 BxPC-3 세포 및 대조군 클론(HUSH-TR3)의 것과 비교하여 유의적으로 감소하였다(도 3의 C). 당해 실험은, 세포 표면에서 CEACAM6의 존재가 L-DOS47 결합에 중요하였음을 나타내었다. 유전자의 사일런싱은 L-DOS47의 결합을 실질적으로 감소시켰다.
L-DOS47에 의한 사람 종양 조직의 면역화학적 염색
정상 및 암 조직 스크리닝은, L-DOS47이 거의 전적으로 선암종 아형을 인식하였음을 입증하였다(표 2). 다양한 암 및 매치된(matched) 정상 조직으로 이루어진 42개 그룹을 나타내는, 스크리닝된 400개 이상의 조직 샘플 중에서, 폐 선암 조직은 인식되는 세포의 80%에 걸쳐 고려할만한 염색을 나타내었다. 상응하는 연령-매치된 정상의 폐 조직은 약간의 활성화된 폐세포에서 병소 착색(focal staining)의 힌트(hint)와 함께 음성이었다. 일부 양성이지만 약한 염색을 나타내는 다른 조직은 결장 및 췌장 선암종이었다. 도 4는 L-DOS47을 사용한 결장 및 폐 선암종의 면역화학적 염색을 나타낸다.
L-DOS47 결합의 사람 정상 및 암 조직 스크리닝
샘플 종양 조직 연령-매치된 정상 조직
양성 음성 음성
신장 암종 12/12 12/12
부갑상샘 선종 1/1 n/a
태반, 제대혈, 요막 n/a 1/1
근육 섬유 모세포 종양 1/1 n/a
전립샘 암종 4/4 4/4
갑상샘 암종 2/2 2/2
췌장 선암종 7/57주 8/57 v. 약함 42/57 25/25
신경내분비 종양 9/9 n/a
뇌, 심장 근육, 고환, 비장 n/a 30/30
고환-기형종 및 정상피종 3/3 3/3
이하선 종양(Parotis tumor) 1/1 1/1
자궁경부 평편 암종 2/2 n/a
가슴샘종 2/2 n/a
결장 선암종 14/24주 10/24 24/24
-림프절 전이 3/3
유방 선암종 13/13 13/13
-림프절 전이 2/2
평활근종-폐 전이 1/1 n/a
난소 암종 4/4 n/a
방광 암종 42/42
36/36
-림프절 전이 1/1 강력
-편평 암종 전이 2/2
폐- 소 세포 암종 1/1 5/5
-선암종 5/5 강함
위 선암종 3/3 3/3
간 암종 4/4 4/4
연 조직 종양 3/3 n/a
흑색종 48/48 18/18
-전이 18/18
L-DOS47을 사용한 사람 결장 및 페 선암종의 면역조직화학 염색은 도 4에 나타낸 바와 같다.
A549 전이 연구
3주째에, 10 및 15μg/ml의 L-DOS47로 치료한, A549 세포를 제공받은 마우스는 감소된 폐 종양 수를 나타내었으며, 치료되지 않은 대조군 그룹과 비교하여 유의적인 감소(p < 0.05)를 입증하였다(표 3). 그러나, 종양 세포 수의 평균 수치에 있어서 유의적인 감소는 10주째에 주목되지 않았다. 통계적으로 유의적이지는 않지만, 치료 3 및 10주 후 둘 다에서 10μg/ml의 L-DOS47을 사용한 치료는 치료되지 않은 대조군 그룹과 비교하여 평균 종양 세포의 수치에 있어서 일관된 감소를 나타내었다. 흥미롭게도, 동형 대조군(V21-DOS47)은 폐에서 종양 수의 수치에 영향을 미쳐 감소시켰다. 요약하면, L-DOS47을 10μg/mL에서 사용한 A549 세포의 치료는 치료 3주 후 폐 종양의 평균 수치를 감소시켰지만, 평균 종양 수치에 있어서 유의적인 감소가 치료 10주 후까지 관찰되지 않았기 때문에 당해 효과는 일시적이었다.
A549 전이 연구에서 계수된 폐 종양의 평균 수치
그룹 세포 치료 최종 농도
(μg/mL)		 폐 종양의 평균수#
3주		 폐 종양의 평균 수#
10주
1 치료되지 않음 - 103.8±30.0 110.6±50.0
2 동형 10 44.6±5.1 60.4±14.3
3 L-DOS47 10 28.0*±7.2 50.0±17.7
4 L-DOS47 15 18.2*±7.8 112.2±52.5
#평균±sem; 치료되지 않은 대조군 그룹과 비교하는 경우 *p < 0.05
표 3에 나타낸 바와 같이, A549 사람 폐 선암종 세포를 시험관내에서 L-DOS47 또는 동형 대조군(V21-DOS47)으로 치료하였다. 37℃에서 4시간 동안 항온처리한 후, 세포를 PBS로 3회 세척하고 PBS 속에서 lxlO7개 세포/mL에서 재현탁시켰다. 이후에, 각각의 마우스에게 1x1O6개의 치료된 세포의 단일 접종물을 제공하였다. 그룹당 5마리의 동물을 주사 후 3주째 및 10주째에 희생시켰다. 종양 전이에 있어서 시험 물품의 효과는 해부 현미경 하에서 각각의 폐에서 전이성 종양의 수치를 계수함으로써 측정하였다. L-DOS47 치료된 그룹에서 전이성 종양 성장을 쌍을 이루지 않은 t 시험에 의해 치료되지 않은 대조군 그룹과 비교하였다. 치료 후 3주째에 L-DOS47을 사용한 동시-주사는 종양 수의 수치를 유의적으로 감소시켰다.
효소에 의해 중재된 암모니아 생산 및 국소 pH 상승을 기준으로 잠재적인 암 치료제로서 우레아제의 용도를 입증하였다(8). 그러나, 정상 세포보다 종양 세포에 대한 효소의 선택성의 결여는 암 치료제로서 이의 적용을 제한하였다. 당해 기술의 항체-약물 접합체(ADC) 또는 보다 구체적으로, 항체-지시된 효소 전구약물 치료요법(ADEPT)의 적용은 이러한 제한을 피할 수 있다. 당해 실시예에서, 항체-우레아제 접합체(L-DOS47)의 특이적인 형태는 CEACAM6-특이적인 라마 단일 도메인 항체(AFAIKL2)를 우레아제(DOS47)에 접합시켜 제조하였다. 접합된 AFAIKL2 항체는 특이성을 제공하므로 CEACAM6-발현 종양을 향한 우레아제 효소의 효능을 향상시킨다. 세포 표면에서 CEACAM6을 발현하는 암 세포에 대한 L-DOS47의 특이성을 시험관내 결합 연구를 통해 평가하였다(도 1 및 2). 이들 연구의 결과는, L-DOS47이 CEACAM6-발현 세포주(BxPC-3, Capan-1, ZR-75-30, 및 LS174T)에 결합하였지만, 비-발현 세포주(MDA-MB231)에는 결합하지 않았음을 입증하였다. 또한, CEACAM6의 작용성 역활을 암 세포에서 CEACAM6 녹다운 및 과발현 실험에 의해 확인하였다(도 3). CEACAM6는 CEACAM6-암호화된 플라스미드를 H23 세포내로 형질감염시킴으로써 과발현되었지만, 유전자 녹다운은 BxPC-3 세포 속에서 CEACAM6의 작은 헤어핀(small hairpin) RNA-중재된 고갈에 의해 수행되었다. 결합 연구는, L-DOS47이 천연의 BxPC-3 세포에 고 친화성으로 결합하였지만 CEACAM6 유전자가 녹다운된 BxPC-3 세포에는 결합하지 않음을 나타내었다(도 3의 C). 대조적으로, H23 세포에서 CEACAM6의 과발현은 세포가 L-DOS47 결합 및 세포독성에 대해 민감해지도록 하였다(도 3의 A 및 도 3의 B). 이들 결과는, CEACAM6 항원에 대한 L-DOS47의 유의적인 결합이 종양 세포독성을 유도하기 위한 항체 접합체에 중요함을 나타내었다. 개개 항체보다 우레아제에 대해 항체를 접합시키는 것의 다른 이점은 결합활성에 있어서 전체적인 증가이다. ECL 결합 검정은 접합 비가 1개의 우레아제에 대해 6 내지 10개 항체인 L-DOS47이 BxPC-3 세포에 대한 단일 항체보다 500배 더 우수하게 결합하였음을 나타내었다(도 2의 B). 추가의 결합 연구는, 6:1보다 큰 항체 대 효소 접합 비가, CEACAM6에 대한 L-DOS47의 결합에 최적임을 제안하였다(데이타는 나타내지 않음).
작용 메카니즘은 시험관내 및 생체내 연구를 통해 시험하였다. 우레아제는 L-DOS47의 활성 성분이며 앞서의 연구는, 우레아제가 시험관내에서 사람 종양 세포에 대해 세포독성임을 입증하였다(8). 누드 마우스에서 A549(폐) 및 MCF-7(유방) 종양에 대한 우레아제의 종양내 투여는 종양 성장을 유의적으로 억제하였다(8). 그러나, 우레아제 또는 L-DOS47의 세포독성 효능은 또한 암모니아에 대한 종양 세포주의 민감성에 의존한다. 예를 들면, 도 1의 A에서, L-DOS47은 BxPC-3, ZR-75-30, 및 Capan-1에 거의 동등하게 잘 결합하였지만, Capan-1은 다른 2개의 세포주와 비교하여 중간의 세포독성 반응을 나타내었다(도 1의 B). Capan-1은 BxPC-3 및 ZR-75-30과 비교하여 암모니아 세포독성 효과에 거의 민감하지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 유사하게, 사람 폐 선암종 H23 세포는 암모니아의 존재에 대해 민감하며; CEACAM6 유전자로 형질감염되면, 당해 세포주는, CEACAM6 항원이 BxPC-3(데이타는 나타내지 않음) 및 A549 세포(도 3의 A)와 비교하여 세포 표면에서 거의 나타나지 않음에도 불구하고, L-DOS47 세포독성에 대해 민감하에 되었다(도 3의 B). 결론적으로, 종양에서 세포독성 효과를 발휘하는 L-DOS47의 경우, 세포 표면에서 CEACAM6 발현 및 암모니아에 대한 민감성은 2개의 중요한 요건이다.
사람 암 조직의 면역조직화학 스크리닝은, L-DOS47이 폐, 결장, 및 췌장 선암종에 대해 특이적이었으나(표 2) 상응하는 정상 조직에 대해서는 특이적이지 않았음을 나타내었다. 우레아제의 표면에서 다수의 항체의 접합체는 CEACAM6 항원에 대한 특이성을 크게 향상시켰고(도 1의 A 및 도 2) 효소의 비특이적인 결합 특성을 감소시켰다(데이타는 나타내지 않음). 생체내 연구는 종양 이종이식체에 대한 L-DOS47의 효능을 추가로 입증하였다. 종양 성장 억제는 누드 마우스 종양 이종이식체에 대한 L-DOS47의 정맥내 투여(데이타는 나타내지 않음) 및 A549 폐 선암종의 전이 연구(표 3)에서 관찰되었다. 폐 병소의 유의적인 감소가 10 또는 15μg/mL의 L-DOS47로 치료한 A549 세포에서 주사 3주 후에 관찰되었다(표 3). 그러나, 10주 후 유의적인 차이는 발견되지 않았으며, 이는 가능하게는 동물로부터 L-DOS47의 청소(clearance)에 기인한다. 동형 대조군(V21-DOS47, 항-VEGFR2-DOS47 접합체)는, 또한 A549 세포가 정상 조건 하에서 VEGFR2를 발현하지 않음에도 불구하고, 어느 정도의 폐 병소 감소를 유발하였다. 오와다(Ohwada) 등(19)은, VEGFR 작용성이 50mM HCl을 사용한 노출 후 A549 세포에서 유도되었음을 보고하였다. 허약한 A549 세포의 억제된 증식은 외인성 VEGF 투여로 회복될 수 있었지만, 중화 항-VEGFRl 및 항-VEGFR2 항체의 첨가는 세포 증식을 재-억제하였다. 그러나, VEGF 및 항-VEGFR 항체 둘 다는 대조군 세포에서 효과를 가지지 않았다. 이론에 얽메이지 않더라도, A549 세포에서 VEGFR2 작용성은 당해 전이 연구에서 세포 제조 공정 동안 유도될 수 있음이 가능하다. 이는, 세포 수 감소가 동형 대조군 그룹에서 관찰되었던 이유를 설명한다. 시험관내 및 생체내 연구 둘 다로부터의 결과는, 우레아제에서 항체 접합체가 항체-접합체를 CEACAM6-발현 종양에 대해 우수한 선택성 및 효능으로 특이적으로 표적화하도록 함을 입증하였으며, 이는 L-DOS47의 임상 개발을 위한 개념 증명을 제공한다.
실시예 2. 재발성 또는 전이성 비-편평상피 NSCLC(비-소 세포 폐암)에서 L-DOS47의 투여량 상승 연구
당해 조사 연구의 주요 목적은 제IV단계(TNM Mla 및 Mlb) 재발 또는 전이성 비-평편 비-소 세포 폐암을 지닌 환자에서 페메트렉세드/카르보플라틴의 표준 이중 치료요법과 조합된 L-DOS47의 투여량 범위가 얼마나 안전한지, 잘 견디어지는지 및 얼마나 효과적인지를 평가하기 위한 것이다.
주요 결과 측정은 다음과 같다. 페메트렉세드/카르보플라틴과의 조합 치료에서 L-DOS47의 안전성 및 내성 측정으로서 부작용을 지닌 환자의 수치가 12주 동안 동반될 것이다. 이는 안전성 쟁점으로 지정한다. AE 보고 기간은 주기 1의 1일 부터 시작하여 마지막 연구 방문까지이다. 제2의 결과 측정은 다음과 같다. RECIST 1.1에 따른 조합 치료를 제공받은 환자의 목적 반응 비율은 12주 까지이며, 안전성 쟁점으로 지정되지 않는다. 목적 종양 반응은 연구 치료의 적어도 2주기를 마치고, 적어도 1회 질병 치료후 평가를 한 환자에서 RECIST 버젼 1.1에 따라 평가할 것이다. 지속적인 임상 이점을 제공받은 환자의 수치는 12주까지 이어지며, 안전성 쟁점으로 지정되지 않는다. L-DOS47+페메트렉세드/카르보플라틴과의 조합 치료 후 완전한 반응, 부분 반응, 및 안정한 질병을 이룬 환자의 퍼센트로서 정의한다. 페메트렉세드/카르보플라틴과의 조합 치료시 투여 후 L-DOS47의 최대 관찰된 혈장 농도(Cmax)는 12주까지이며, 안전성 쟁점으로서 지정되지 않는다. L-DOS47에 대한 약동학적 매개변수는 L-DOS47를 투여받은 모든 환자로부터 수집한 혈장 샘플로부터 측정할 것이다. 페메트렉세드/카르보플라틴과의 조합 치료시 투여 후 L-DOS47의 최대 관찰된 혈장 농도까지의 시간(Tmax)은 12주까지이며, 안정성 쟁점으로 지정되지 않는다. L-DOS47에 대한 약동학적 매개변수는 L-DOS47을 투여한 모든 환자로부터 수집한 혈장 샘플로부터 측정할 것이다. 페메트렉세드/카르보플라틴과의 조합 치료시 투여 후 L-DOS47의 농도하 영역(AUC) 대 시간 곡선은 12주까지이며, 안전성 쟁점으로 지정되지 않는다. L-DOS47에 대한 약동학적 매개변수는 L-DOS47를 투여받은 모든 환자로부터 수집된 혈장 샘플로부터 측정될 것이다. 페메트렉세드/카르보플라틴과의 조합 치료시 투여 후 L-DOS47의 말기 제거 반감기는 12주까지이며, 안전성 쟁점으로 지정되지 않는다. L-DOS47에 대한 약동학적 매개변수는 L-DOS47를 투여받은 모든 환자로부터 수집한 혈장 샘플로부터 측정될 것이다. 페메트렉세드/카르보플라틴과의 조합치료시 L-DOS47을 투여받은 환자에 대한 항-L-DOS47 항체의 존재는 12주까지이며, 안전성 쟁점으로 지정된다. 혈청 샘플을 수집하여 L-DOS47를 투여받은 모든 환자로부터 분석할 것이다.
페메트렉세드 및 카르보플라틴과 L-DOS47을 포함하는 실험을 수행할 것이다. 환자를 집단당 최소 3명 및 최대 6명의 환자를 지닌, L-DOS47 상승 투여량의 집단으로 모집할 것이다. LDOS47의 출발 투여량은 0.59μg/kg일 것이며; 평가될 수 있는 추가의 가능한 투여량 수준은 0.78, 1.04, 1.38 및 1.84μg/kg이다. L-DOS47과 함께 투여될, 페메트렉세드[500 mg/m2] 및 카르보플라틴[AUC6] 각각의 보호 투여량의 표준은 집단에 걸쳐 일정하게 유지될 것이다. 치료 주기는 21일일 것이고, 환자는 1, 8, 및 15일의 주기 일에 L-DOS47을 및 각각의 치료 주기 1일에 페메트렉세드/카르보플라틴을 제공받을 것이다. 환자는 4 주기의 L-DOS47+페메트렉세드/카르보플라틴을 사용한 조합 치료를 제공받을 것이다. 4 주기의 조합 치료 후 진행되지 않고 허용되지 않는 독성을 경험하지 않은 환자는 연구자의 의견에서 임상 이점이 존재하고 잘 견디어지는 한, 질병 진행까지 L-DOS47 치료를 계속 제공받을 기회를 가질 것이다. 페메트렉세드/카르보플라틴 독성으로 인하여 4 주기의 L-DOS47 + 페메트렉세드/카르보플라틴 조합 치료를 완료할 수 없는 환자는, 연구자의 의견시, 임상적 이점이 존재하고 잘 견디어지는 한, 질병 진행까지 페메트렉세드/카르보플라틴의 중지 후 L-DOS47 치료를 계속 제공받을 기회를 가질 것이다.
실시예 3. 비-소 세포 폐암을 치료하기 위한 면역접합체 L-DOS47의 제I/II 상 개방-표지된, 비-무작위의 투여량 상승 연구
당해 조사 연구의 1차 목적은 단독치료요법으로서 제공되는 경우 비-편평 비-소 세포 폐암을 지닌 환자에서 L-DOS47의 투여량의 범위가 어느 정도 안전한지, 잘 견디어지는지 및 얼마나 효과적인지를 평가하기 위한 것이다.
1차 결과 측정은 다음과 같다. L-DOS47의 안전성 및 내성의 측정으로서 약물 관련 부작용의 발생 및 중증도는 12주까지이며, 안전성 쟁점으로 지정한다. 이는 주기 1의 1일로부터 시작하여 마지막 연구 방문까지의 AE 보고 기간 동안 평가한다.
제2의 결과 측정은 다음과 같다. 주입 후 처음 2시간 동안 L-DOS47 관련된 독성은 주입 후 처음 2시간 동안이며, 안전성 쟁점으로 지정된다. 이는 AE 및 SAE의 발생 및 중증도 및 활력 신호에 있어서의 변화로 평가한다. 모든 보고된 부작용 및 심각한 부작용의 발생 및 중증도는, 참여자가 12주 동안 및 30일의 후속 기간을 따르는 시간 간격 하에 있다. 이들은 안전성 쟁점으로 지정되며 주기 1의 1일째에서 시작하여 마지막 연구 방문까지의 AE 보고 기간 동안 평가된다. 추가의 안전성 매개변수(임상 실험실 평가, 활력 신호, 체중, 산소 요구도 및 12-리드 ECG)에 대한 기본선으로부터의 변화는 12주까지의 시간 간격하에 있으며, 안전성 쟁점으로 지정한다. 안전성 매개변수는 임상 실험 평가, 활력 신호, 체중, 산소 요구도 및 12-리드 ECG를 포함한다. 시간에 걸쳐 항-L-DOS47 항체의 평가는 12주까지이며, 안전성 쟁점으로 지정된다. 혈청 샘플을 L-DOS47을 투여받은 모든 환자로부터 수집하여 분석할 것이다.
다른 결과 측정은 다음과 같다. 각각의 투여량 수준에서 L-DOS47의 최대 관찰된 혈장 농도(Cmax)는 12주까지의 기간하에 있으며, 안전성 쟁점으로서 지정되지 않는다. L-DOS47에 대한 약동학적 매개변수는 L-DOS47를 투여받은 모든 환자로부터 수집한 혈장 샘플로부터 측정될 것이다. 각각의 투여량 수준에서 L-DOS47의 최대 관찰된 혈장 농도까지의 시간(Tmax)은 12주까지이며, 안정성 쟁점으로 지정되지 않는다. L-DOS47에 대한 약동학적 매개변수는 L-DOS47을 투여한 모든 환자로부터 수집한 혈장 샘플로부터 측정할 것이다. 각각의 투여량 수준에서 L-DOS47의 농도하 영역(AUC) 대 시간 곡선은 12주까지이며, 안전성 쟁점으로 지정되지 않는다. L-DOS47에 대한 약동학적 매개변수는 L-DOS47를 투여받은 모든 환자로부터 수집된 혈장 샘플로부터 측정될 것이다. 각각의 투여량 수준에서 L-DOS47의 말기 제거 반감기는 12주까지의 기간하에 있으며, 안전성 쟁점으로 지정되지 않는다. L-DOS47에 대한 약동학적 매개변수는 L-DOS47를 투여받은 모든 환자로부터 수집한 혈장 샘플로부터 측정될 것이다. 환자는 집단당 최소 3명 및 최대 6명의 환자를 지닌, L-DOS47 상승 투여량의 집단으로 모집할 것이다. L-DOS47의 출발 투여량은 0.12μg/kg일 것이며; 추가로 가능한 투여량 수준은 0.21, 0.33, 0.46, 0.59, 0.78, 1.04, 1.38, 1.84, 2.45, 3.26 및 4.33μg/kg일 것이다. 치료 주기는 주기 1일 및 8일 째에 L-DOS47을 제공받은 환자를 이용하여 21일이 될 것이다.
환자는 집단 당 최소 3명 및 최대 6명의 환자를 갖는, 집단으로 모집될 것이다. 제공된 투여량 수준에서 모든 환자는 주기 1(3주 기간)을 완료한 후 후속적인 환자에서 상승이 진행될 수 있다. 다음 투여량 수준으로의 투여량 상승을 위한 결정은 안전성 및 이용가능한 약동학적(PK) 데이타가 Trial Steering Committe(TSC)에 의해 고찰된 후 이루어질 것이다. L-DOS47의 상승은, 최대 내성 투여량(MTD)이 도달할 때까지 지속될 것이다. L-DOS47의 MTD가 제I상에서 측정된 후, 20명까지의 환자를 포함시켜(상 I으로부터 앞서 취해짐) L-DOS47의 예비 효능(즉, 고형 종양에 있어서 반응 평가 기준[RECIST] 버젼 1.1 기준을 사용한 반응율, 질병 진행 및 생존)을 평가하고; 모니터링은 제2 주기마다 방사선 평가를 포함할 것이다. L-DOS47의 안전성 및 내성을 추가로 평가할 것이다. 약동학적 정보 및 L-DOS47의 활성에 있어서 관련된 관찰을 수립할 것이다.
모든 환자에 대해, L-DOS47을 사용한 치료는, 어느쪽이 먼저 발생하던지 간에, 환자가 질병 진행, 허용되지 않는 독성을 경험하고, 환자가 동의를 포기하거나 4회의 치료 주기를 완료하여 추가의 주기를 지속하기를 원하지 않을 때까지, 지속할 것이다. 4회의 주기 후, 환자는, 연구자의 의견에서, 지속된 임상적 이점이 존재하고, 잘 견디어지는 한 L-DOS47을 계속 제공받을 수 있다.
실시예 4: 비-소 세포 폐 암(NSCLC)의 치료를 위한 낙타 단일 도메인 항체-우레아제 효소 접합체의 생산 및 특징화
가장 일반적으로 사용된 암 화학치료요법 약물의 효능은 종양 세포에 있어서 이들의 협소한 치료학적 지표 및 선택적인 효과의 결여에 의해 제한된다. 항체 지시된 효소 전구약물 치료요법(ADEPT)은 항체-효소 접합체를 종양 부위로 전달시킴으로써 선택성을 증진시키며 여기서 이들은 종양 관련 항원에 결합하지만 나머지 결합하지 않는 접합체는 혈류로부터 제거된다[20]. 항체-효소 접합체가 축적되면, 전구약물을 투여하고 이를 종양 부위에서 항체-효소 접합체의 효소 부위에 의해 이의 활성 세포독성 형태로 전환시켜, 선택적인 종양 세포 사멸을 달성한다. ADEPT 개념은 1987년 바그스샤위(Bagshawe)에 의해 도입되었으므로[20-22], 연구자들은 보다 강력하고 특이적인 항암 약물을 개발하기 위한 당해 개념의 변형을 적용시켰다.[22-24]. 상이한 세대의 갈락토시드성 전구약물 및 항체-갈락토시다제 접합체를 개발하여 활성화된 약물의 세포독성을 증가시키면서 전신계 독성을 감소시켰다[25]. 사람 푸린 뉴클레오사이드 포스포릴라제의 돌연변이된 형태를 가공하여 기질로서 아데노신-계 전구약물에 대한 특이성을 향상시켰다[26]. 또한, 상이한 유형의 면역효소 주입 단백질을 개발하여 효소 활성 및 항체 결합활성을 증진시켰다[27-29].
L-DOS47의 제조 및 특성화가 기술되어 있으며, 이는 단일-도메인 재조합 항체 및 천연의 우레아제 분자 당 약 10개의 항체의 접합 비를 갖는 작두콩 우레아제의 화학 접합체이다. L-DOS47 면역접합체는 우레아를 사용하며, 이는 암모니아를 생산하기 위한 전구약물로서, 종양 조직에서 천연적으로 풍부하다. 표적 종양 세포에서 종양 관련 항원 CEACAM6[33]에 대한 AFAIKL2 항체의 선택적인 결합은 우레아제의 축적 및 세포외 우레아의 후속적인 가수분해를 생성하여 암모니아를 생산하며, 당해 암모니아는 세포독성이고 암 세포에게 불리한 알칼리성 환경을 생성한다[34]. 분자량이 680kDa 이하일 수 있는, 접합체의 크기 및 복잡성으로 인하여, 접합 화학, 반응 및 분리 과정을 개발하여 대규모 생산시 챌린지에 촛점을 맞추었다. 우레아제는 선택된 항체에 대해 다수의 잠재적인 접합 부위를 가지므로, 약물 효능에 필수적인 L-DOS47의 접합 비는 엑스페리온(Experion) SDS 마이크로-채널 겔 전기영동 시스템을 사용하여 특성화하였다[31,32]. L-DOS47 접합체 순도는 크기 배제 크로마토그래피로 측정하였다. L-DOS47의 화학적 실체는 질량 분광계 펩타이드 맵핑 및 웨스턴 블롯으로 특징화하였다. 1급 아민(K32)이 단일-도메인 항체의 CDR3 영역에 수반되므로, 항체 부위에서 접합 부위의 분포는 RP-HPLC 및 MALDI 질량 분광분석법으로 측정하였다. 항체 및 우레아제 측면 둘 다에 대한 접합 부위는 또한 ESI 질량 분광분석법으로 특성화하였다. CEACAM6에 대한 L-DOS47 결합의 친화성에 있어서 접합 비의 효과는 ELISA로 평가하였다. 시험관내 연구를 수행하여 L-DOS47 결합 및 CEACAM6-발현 암 세포주에서 세포독성을 유발하는 이의 능력을 확인하였다.
면역접합체(L-DOS47)를 개발하고 CEACAM6을 발현하는 종양에 대한 치료제로서 특징화하였다. CEACAM6을 표적화하는 단일 도메인 항체 AFAIKL2는 이. 콜라이 BL21(DE3) pT7-7 시스템에서 발현시켰다. 고 순도 우레아제(HPU)를 작두콩 분쇄물로부터 추출하여 정제하였다. AFAIKL2를 교차-링커로서 N-석신이미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조에이트(SIAB)를 사용하여 활성화시킨 후 우레아제에 접합시켰다. 활성화 및 접합 반응은 pH를 변경시켜 조절하였다. 이들 조건 하에서, 물질 비는 우레아제 분자 당 8 내지 11개의 항체의 접합 비를 달성하였고, 잔류하는 유리 우레아제 함량은 실질적으로 무시할 정도이며(< 2%) 고 순도(> 95%) L-DOS47 접합체는 울트라다이아필트레이션 만을 사용하여 생산함으로써 반응하지 않은 항체 및 가수분해된 교차-링커를 제거하였다. L-DOS47을 SEC, IEC, 웨스턴 블롯, ELISA 및 LC-MSE 펩타이드 맵핑을 포함하는 분석 기술의 패널로 특징화하였다. 항체-우레아제 접합비가 증가하면서, 보다 높은 결합 시그날이 관찰되었다. 그러나, 당해 효과는 우레아제 당 6개 이상의 항체의 접합 비에서 거의 명백하지 않았다. L-DOS47의 특이성 및 세포독성은 3개의 세포주(BxPC-3, A549, 및 MCF7)에서 스크리닝함으로써 확인하였다. BxPC-3, CEACAM6-발현 세포주는 L-DOS47에 대해 가장 민감한 것으로 밝혀졌다. L-DOS47은 비-소 세포 폐암(NSCLC)에 대해 사람 제I상 임상 연구에서 잠재적인 치료제로서 시험되고 있다.
고 순도 우레아제 중간체 우레아제(이후 조 우레아제 또는 DOS47로 언급됨)의 생산은 BioVectra Inc.(캐나다 PE 샤를로테타운 소재)로부터 구입하였다. 접합시 사용하기 전에, 조 우레아제를 정제하여 카나발린 및 콘카나발린 A와 같은 작두콩 매트릭스 단백질 오염물을 제거하였다. 조 우레아제를 고 순도 물 속에 용해하고 pH를 10mM 아세트산을 사용하여 5.15로 되도록 한 후, 0.2 mM EDTA(아세테이트-EDTA 완충액)을 셀라이트 503의 슬러리를 사용하여 진공하에 여과하였다. 케이크를 lOmM 아세트산나트륨, 1mM EDTA, pH 5.15로 세척하고 진공하에 건조시켰다. 우레아제-함유 여액을 0 내지 4℃로 냉각시키고 급냉시킨 에탄올을 25%(v/v)의 최종 농도로 가하여 분획화하였다. 혼합물을 15분 동안 교반한 후 진공하에 세척된 셀라이트 503을 사용하여 여과하였다. 케이크를 25%(v/v) 에탄올을 함유하는 아세테이트-EDTA 완충액으로 세척한 후 진공하에 건조시켰다.
케이크를 아세테이트-EDTA 완충액 속에 재현탁시키고 슬러리를 셀라이트를 통해 진공하에 여과하여 여액을 수집하였다. 수득되는 케이크를 아세테이트-EDTA 완충액으로 세척하고 진공하에 건조시켰다. 세척 및 초기 여액을 0.65μm 캅셀을 통해 여과하였다. 당해 에탄올 분획화된 우레아제 여액을 2개의 사르토리우스 사르토콘(Sartorius Sartocon) 100000 Da MWCO 폴리에테르설폰 막을 사용하여 ~2X로 농축시킨 후 아세테이트-EDTA 완충액으로 완충액 교환하였다.
이미다졸 및 TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드)를 당해 중간 순도 우레아제에 각각 20mM 및 1mM의 최종 농도에서 가하고 pH를 6.5로 조절하였다. 단백질 용액을 20mM 이미다졸, 1mM TCEP, pH 6.5(이미다졸-TCEP 완충액)으로 예비-평형화시킨 DEAE-세파로즈 패스트 플로우 컬럼(Sepharose Fast Flow column)에 로딩하였다. 모든 단계를 500 mL/분의 유동 속도에서 수행하였다. 컬럼을 이미다졸-TCEP 완충액에 이어서 80mM NaCl을 함유하는 이미다졸-TCEP 완충액으로 세척하여 결합하지 않은 불순물을 제거하였다. 우레아제를 180mM NaCl을 함유하는 이미다졸-TCEP 완충액으로 용출시켰다. A280 >0.1을 지니고 SEC에 의한 순도가 ≥ 90-97%인 분획을 혼주시켰다.
혼주된 분획을 2개의 사르토리우스 사르토콘 100000 Da MWCO PESU 막을 사용하여 6 내지 8mg/mL의 표적 단백질 농도로 농축시킨 후, 10mM 아세트산나트륨, 1mM EDTA를 함유하는 아세테이트-EDTA 완충액, pH 6.5에 대해 다이아필트레이션(diafiltration)하였다. 당해 단계로부터의 수율은 전형적으로 출발 활성의 > 55%이었다. AFAIKL2 약물 중간체의 발현 및 정제 후, AFAIKL2 항체의 아미노산 서열은 도 5에 나타낸다(서열 번호: 1).
항체 유전자는 이. 콜라이 BL21(DE3) pT7-7 시스템에서 발현시켰다. 마스터 세포 뱅크의 1개 바이알을 3개의 씨딩 단계를 통해 500L의 발효기 속에서 50 mg/L 가나마이신, 1g/L 세렐로즈, 0.02g/L MgSO4, 및 0.01% Biospumex 항발포 시약이 보충된 350L의 루리아(Luria) HiVeg(20 g/L)에 멸균 접종하였다. 당해 공정은 >20%에서의 용존 산소, 37℃ ± 2℃의 온도, 5 내지 20psi의 역 압력(back pressure), 7.0 ± 0.2의 pH, 0.5 내지 40의 OD600, 및 1 내지 3g/L의 글루코즈 농도를 유지하도록 조절하였다. 배양물이 7 내지 10의 OD600에 이르면, 항체 발현을, IPTG를 1mM의 최종 농도로 첨가하여 유도하고 6 내지 8시간 동안 지속하였다. 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 세척하고 분해하여 봉입체(inclusion body)를 방출시킨 후, 10 용적의 50mM의 이미다졸 pH 6.8 속에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 배취 속에서 균질화하고 균질물을 75 마이크론 강철 위생 체(stainless steel sanitary screen)를 통해 처음 통과시킨 다음 10,000 psi의 최소 압력을 사용한 미세유동화기를 통해 온도를 10℃ 이하로 유지시키면서 총 3회 통과시켰다. 세포 분해물을 원심분리하고, 불용성 물질을 혼주시키고 펠렛을 5mM DTT가 들어있는 10 용적의 1% 트리톤 X-100 속에 균질화하여 재현탁시켰다. 세척된 펠렛을 원심분리로 수집하였다. 당해 세척을 반복한 후 5mM DTT를 함유하는 25mM 아세트산나트륨, pH 4.0으로 2회 세척하여 잔류 트리톤 X-100을 제거하고 펠렛을 pH 4로 완충시켰다.
세척된 봉입체를 함유하는 펠렛을 8M 우레아, 25mM DTT, 125mM 아세트산나트륨, pH 4.0 속에 재현탁시킨 후, 달리 로스 균질화기(Ross homogenizer)에 이어서 오버헤드 혼합기(overhead mixer)를 사용하여 가시적인 외형에 있어서 추가의 변화가 없을 때까지 가용화시킨 후, 오버헤드 혼합기 만을 사용하여 총 3시간의 시간 동안 혼합하였다. 가용화된 봉입체를 원심분리하고 투명한 상층액을 550mL/분에서 125mM 아세트산나트륨 pH 4.0(SP 평형 완충액) 중 8M 우레아로 예비-평형화시킨 SP-세파로즈 XL 컬럼에 로딩하였다. 투명한 상층액을 로딩한 후, 컬럼을 평형 완충액으로, 용출물 A280이 0.05이하로 강하할 때까지, 이어서 50mM NaCl이 들어있는 아세트산나트륨, pH 4.0중 8M 우레아로 용출물 A280이 0.05로 강하할 때까지 세척하였다. 펌프 속도를 275 mL/분으로 감소시키고 25 mM 아세트산나트륨, 180 mM NaCl, pH 4.0을 함유하는 3cv의 8M 우레아를 컬럼에 적용시켜 AFAIKL2을 용출시켰다. A280이 > 0.4이고 A280/A260 비가 > 1.5인 분획을 혼주시켜 순도 및 단백질 함량에 대해 분석하였다. 당해 단계로부터의 수율 퍼센트는 전형적으로 35 내지 45%이었다. 혼주된 물질을 SP 평형화 완충액을 사용하여 ≤ 2.5 g/L로 희석시키고, pH를 2M 트리스-Cl pH 8.0을 사용하여 8.0로 조절하였다, DTT를 2.5mM에 가하고, 조건화된 혼주물을 60분 동안 혼합하여 변성된 단백질을 완전히 감소시켰다. 변성된 단백질 용액을 이어서 25mM 트리스-Cl을 함유하는 리폴딩 완충액, pH 8.5 속에서 0.1mg/mL 미만의 최종 단백질 농도로 희석하였다. 리폴딩을 2 내지 8℃에서 수행하고, 엘람 검정(Ellman's assay) 및 C18 역상 HPLC로 유리 설프하이드릴의 수준이 <0.75μΜ이 될 때까지 트래킹하여 완전히 산소화된 단백질 만을 검출할 수 있었다.
리폴딩된 단백질 용액을 25mM 이미다졸 pH 6.8로 예비-평형화시킨 Q-세파로즈 XL 컬럼에 로딩하고 컬럼을 평형 완충액을 사용하여 A280가 <0.05가 될 때까지,이어서 50mM NaCl을 함유하는 25mM 이미다졸, pH 6.8를 사용하여 A280가 <0.01이 될 때까지 세척하였다. 이후에, 단백질을 150mM NaCl을 함유하는 25mM 이미다졸 pH 6.8로 용출시키고 분획을 A280이 ≤ 0.3이 될 때까지 수집하였다. 분획을 합하여 순도가 97% 이상이고 수율이 45% 이상인 표적 혼주물을 생성시켰다. 이후에, 혼주물을 하이드로사르트 재생된 셀룰로즈(Hydrosart regenerated cellulose) 5000 MWCO 카트리지가 장착된 UF/DF 시스템을 사용하여 3-5 g/L로 농축시킨 후, 10mM 포스페이트 완충액, pH 7.0에 대해 완충액 교환 후 동결건조시켰다.
접합 화학
접합은 2 단계(도 6)로 수행하였다. 제1 단계에서, AFAIKL2 상의 1차 아민 그룹을 SIAB의 NHS 에스테르 부위와 반응시켜 활성화시켰다. 제2 단계에서, 활성화된 AFAIK2를 SIAB의 요오도아세트아미드 말단을 통해 우레아제 상의 티올 그룹에 커플링하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, L-DOS47 접합체 생성물의 합성은 2-단계 반응이다. 단계 1은 SIAB를 사용한 항체의 활성화이고 단계 2는 바이오접합체 L-DOS47을 형성하기 위한 활성화된 항체와 우레아제 효소의 접합을 포함한다.
AFAIKL2 항체 동결건조된 AFAIKL2(25g)의 활성화물을 주사용수(WFI) 속에 용해하였다. SIAB(2.00 g)를 무수 DMF 속에 용해하고 AFAIKL2 용액을 3개의 동일한 분취량으로 각각의 첨가 후 60분간 교반하면서 가하였다. SIAB를 최종 첨가한 지 1시간 후, 어떠한 남아있는 반응하지 않은 NHS 그룹도 가해진 SIAB의 원래의 양보다 10x 몰 과량인 글리신을 첨가하여 퀀칭시켰다. 가수분해되고 글리신 퀀칭된 SIAB를 제거하기 위해, 반응 용액을 사르토리우스 사르토콘 5000 Da MWCO을 사용하여 10mg/mL AFAIKL2으로 농축시킨 후 10 mM 아세트산나트륨, pH 6.5, 1mM EDTA로 완충액 교환하였다.
우레아제 고 순도 우레아제(50g)에 대한 활성화된 항체의 접합체를 10mM 아세트산나트륨 pH 6.5, 1mM EDTA 속에서 AFAIKL2와 혼합하였다. 이후에, pH를 1M 붕산나트륨, pH 8.5을 가하여 8.3이 되도록 하며, 이는 활성화된 항체 상의 요오도아세틸 그룹이 우레아제 상의 이용가능한 시스테인 잔기와 반응하도록 한다. 반응을 교반하면서 90분 동안 진행하도록 하였다. 반응하지 않은 요오도아세틸 그룹을 이후에 첨가된 원래의 양의 SIAB의 10x 몰 과량인 시스테인을 첨가하여 퀀칭시키고 용액을 60분 동안 혼합하였다. 접합되지 않은 AFAIKL2을 제거하기 위해, L-DOS47을 100000 Da MWCO 사르토리우스 사르토콘을 사용하여 6mg/mL의 표적으로 농축시킨 후 10mM L-히스티딘, pH 6.8, 0.2mM EDTA로 완충액 교환하였다. 슈크로즈를 1% w/v의 최종 농도로 가하고 L-DOS47을 10mM L-히스티딘, pH 6.8, 0.2mM EDTA를 사용하여 1.8 g/L의 표적 농도로 희석시켰다.
996 PAD가 장착된 순도 평가 A Waters 2695 HPLC 시스템을 위한 크기 배제 크로마토그래피를 데이타 획득 및 가공을 위한 엠파워 2 소프트웨어와 함께 사용하였다. 크로마토그램을 과정 동안 추출된 280nm에서의 시그날을 사용하여 210 내지 400 ± 4nm에 걸쳐 기록하였다. 분리를 슈퍼로즈 6 100/300 GL 컬럼(GE)에서 수행하였다. 단백질을 lOmM 포스페이트, 50mM NaCl, 0.2mM EDTA, pH 7.2 속에서 용출시켰다. 분리를 100μL의 순수한 샘플을 주사한 후 0.5mL/분에서의 등용매 유동으로 수행하였다. 샘플 온도를 5 ± 2℃로 유지시키면서 컬럼을 실온에서 작동하였다.
996 PAD 및 엠파워(Empower) 소프트웨어가 장착된 잔류 우레아제 A Waters 2695 HPLC 시스템용 이온 교환 크로마토그래피(IEC)를 사용하였다. 크로마토그램을 과정동안 추출된 280nm에서의 시그날을 사용하여 210 내지 400 ± 4nm에 걸쳐 획득하였다. 샘플 온도를 5 ± 2℃로 조절하면서 컬럼(모노-Q 5/50 GL, GE)을 실온에서 작동시켰다. 용출 완충액은 (완충액 B)의 존재 또는 (완충액 A)의 부재하에 50mM 아세테이트, 0.025% 폴리소르베이트 80(초 순수, HX2, NOF Corporation, 도쿄 소재) 0.70M NaCl, pH 5.50를 함유하였다. 컬럼을 15% 완충액 B 및 85% 완충액 A로 6분 동안 lmL/분의 유동 속도(6 CV)에서 평형화시킨 후 샘플을 주사하였다. 세척 주기(1.OmL/분에서 15% 완충액 B로 6분 동안) 후, 단백질을 15 내지 60% 구배의 완충액 B로 20분 동안 0.5 mL/분의 유속을 사용하여 용출시켰다. 100% 완충액 B로 6분동안 1.OmL/분에서 세정한 후, 컬럼을 15% 완충액 B로 재-평형화시킨 후 다음 샘플을 주입하였다. 800μ1의 순수한 L-DOS47 샘플을 HP 우레아제 참고 표준을 사용하여 0 내지 8% w/w의 최종 퍼센트로 스파이크(spike)하고 50μl/샘플을 주사하였다. 피크 높이를 사용하여 교정 방법으로서 표준 첨가를 사용하여 잔기 우레아제 함량을 계산하였다.
엑스페리온 SDS 마이크로 채널 겔 전기영동을 접합 비의 측정을 위해 사용한다. 바이오라드 엑스페리온 자동화 전기영동 시스템(BioRad Experion automated electrophoresis system) 및 바이오라드(BioRad) SDS 겔 전기영동 키트(Pro260 Kit)를 사용하여 L-DOS47 접합체 비를 분석하였다. 샘플을 트리스-HCl 완충액(lOmM, 0.2mM EDTA, pH 7.0)으로 0.5 mg/ml의 표적 단백질 농도로 희석한 후, 4μl의 희석된 샘플 또는 분자량 래더를 2μl의 샘플 완충액과 혼합하고 약하게 원심분리하였다. 샘플을 70℃에서 10분 동안 가열한 후 시스템 및 채널이 겔-염색 용액으로 프라임(prime)된 후 마이크로-채널 칩위에 로딩하였다. 전기영동도를 엑스페리온 소프트웨어로 자동 기록하였다.
L-DOS47 시험 샘플 및 AFAIKL2/HPU 대조군의 실체 특성화를 위한 웨스턴 블롯을 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 분석한 후 Invitrogen iBlot 시스템을 사용하여 니트로셀룰로즈 막으로 이전하였다. 이중 블롯을 겔 수행물로부터 평행하게 제조하였다. AFAIKL2 실체의 확인은 토끼 항-AFAIKL2 IgG 1차 항체(Rockland)를 사용한 검출과 알칼린 포스파타제(AP)(Sigma)에 접합된 염소 항-토끼 IgG를 사용하는 제2 검출을 필요로 한다. 우레아제 실체의 확인은 토끼 항-우레아제 IgG 1차 항체(Rockland)를 사용한 검출과 AP(Sigma)에 접합된 염소 항-토끼 IgG를 사용하는 제2 검출을 필요로 한다. 항-AFAIKL2 IgG를 사용한 검출을 위해, L-DOS47 샘플을 0.1 mg/mL BSA를 함유하는 1xTBS 속에서 0.002 mg/mL로 희석시킨 후 단백질 겔 로딩 완충액으로 1:1로 혼합하고, 70℃로 10분 동안 가열하고, 0.01μg의 L-DOS47을 레인당 로딩하였다. 항-우레아제 IgG를 사용한 검출을 위해, L-DOS47 샘플을 0.1 mg/mL BSA를 함유하는 1xTBS 속에서 0.02 mg/mL로 희석시킨 후 단백질 겔 로딩 완충액으로 1:1로 혼합하고, 70℃로 10분 동안 가열하고 0.1μg의 L-DOS47을 레인당 로딩하였다. 웨스턴 블롯의 최종 전개를 NBT/BCIP를 함유하는 AP 완충액을 사용하여 수행하였다.
상이한 접합 비를 사용한 L-DOS47의 ELISA
이의 표적 항원 CEACAM6에 대한 L-DOS47 결합의 친화성에 있어서 접합 비의 효과를 연구하기 위해, 상이한 접합 비를 갖는 L-DOS47 접합체를 벤치 규모로 접합 동안 AFAIKL2/HPU 몰 비를 조절함으로써 생산하였다. 수득되는 접합체의 접합 비는 SDS-엑스페리온(Experion)으로 측정하고 단백질 농도는 마이크로 로우리(micro Lowry)에 의해 총 단백질 키트(Sigma, TP0200)를 사용하여 측정하였다. 미세역가 플레이트를 100μL/웰의 CEACAM6-A, 완전한 CEACAM6 항원의 도메인-A(PBS중 2.5 μg/ml)으로 피복하고 실온에서 6시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 완충액 A(PBS중 0.05% BSA)로 2회 세척하고, 150μL/웰 3% BSA/PBS를 사용하여 4℃에서 밤새 차단한 후, 완충액 A로 2회 세척하였다. 모든 후속적인 단계를 온화하게 진탕시키면서 실온에서 수행하였다. L-DOS47(100μL/웰)을 가하고 2시간 동안 항온처리하고, 플레이트를 완충액 A로 3회 세척한 후 100μL/웰의 항-우레아제 IgG(1:12000, Rockland)를 가하고 1시간 동안 항온처리하였다. 완충액 A로 3회 세척한 후, 100μL/웰의 염소 항-토끼 IgG-AP(1:6000, Sigma)를 가하고 1시간 동안 항온처리하였다. 완충액 A로 3회 세척한 후, 100μL/웰의 AP 기질 용액을 가하고 25분 동안 항온처리하였다. 흡광도를 405nm에서 측정하였다.
AFAIKL2 항체에서 활성화 부위의 측정
플루오레세인-표지된 시스테인(Cys-FL)을 제조하기 위하여, 시스테인을 1M의 보레이트, pH 8.0중 과량의 NHS-에스테르 플루오레세인(Pierce)과 60분 동안 실온으로 반응시켰다. 반응 용액을 C8 컬럼을 사용하는 RP-HPLC로 분리하였다. Cys-FL 피크 분획을 MALDI 질량 분광분석법으로 확인하고 이의 농도를 493nm 및 pH 7에서 이의 흡광 계수에 따라 분광분석법으로 측정하였다. 피크 분획 분취량을 동결건조시키고 암실에서 -20℃에서 저장하였다. AFAIKL2 항체를 우선 SIAB 교차-링커를 사용하여 벤치 규모로 활성화시키고 가수분해된 SIAB를 내부(in-house)에서 제조된 G25 탈염 컬럼으로 제거하였다. 활성화된 항체를 플루오레세인-표지된 시스테인(Cys-FL)과 lOOmM 보레이트 완충액 pH 8.3 속에서 90분 동안 실온에서 반응하도록 하였다. 반응 용액은 30mM 탄산수소암모늄을 사용하여 G25 탈염 컬럼으로 교환된 완충액이었으며 수득되는 AFAIKL2-Cys-FL은 20% 아세토니트릴을 함유하는 30mM 탄산수소암모늄 속에서 0.5 내지 0.8mg/mL로 희석시켰다. 트립신(Promega)을 최종 단백질에 20:1의 트립신 비로 가하고 분해를 37℃에서 36시간 동안 수행하였다. 수득되는 트립신 분해물은 0.1M TCEP를 2mM의 최종 농도로 가하여 환원시킨 후 역상 HPLC(Zobax 300SB-C18 컬럼이 장착된 Agilent 1100 시스템, 5μm, 4.6x150mm, 0 내지 45% 구배의 아세토니트릴, 0.025% TFA, 55분 이내)로 분리하고, 흡수를 420nm에서 기록하였다. AFAIKL2 상의 SIAB 활성화된 라이신은 플루오레세인 표지된 시스테인에 연결되므로, 이는 트립신에 의해 접근가능하지 않을 수 있으며 펩타이드(XnKXm)-Cys-FL이 생성되어야 했다. 플루오레세인 개질된 펩타이드를 함유하는 피크 분획을 수집하고 반사 방식(Micromass Tof 2e)의 MALDI-질량 분광분석법을 적용하였다. 상응하는 펩타이드의 HPLC 피크 영역을 사용하여 각각의 활성화 부위의 분포 퍼센트를 계산하였다.
접합된 펩타이드의 펩타이드 맵핑 및 확인은 ESI 질량 분광분석법으로 수행하였다. Waters Xevo G2 QTOF 질량 분광계 및 BEH300 C18 컬럼(1.7μm, 2.1 x 150mm)이 장착된 Acquity UPLC system H 부류를 사용하였다. 각각의 L-DOS47 샘플(1.5-2.0mg/mL, 50.0μ1)을 0.063 ± 0.003g의 구아니딘-HCl과 혼합하였다. 염을 완전히 용해시킨 후, 1.50μL의 0.7M DTT를 가하고 용액을 60℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 10.0μL의 0.20M 요오도아세트아미드(IAA)를 가하고 pH를 포화된 트리스-염기 용액을 사용하여 8.0 내지 8.5로 조절하였다. 샘플을 37℃에서 60분 동안 항온처리하였다. 50.0μL의 각각의 알킬화된 샘플을 15.0μL의 0.1M CaCl2 및 80.0μL의 트리스 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 8.0)과 혼합한 후, 3.00μL의 0.5mg/ml 트립신 용액을 가하였다. 트립신 분해를 37℃에서 20 내지 24시간 동안 수행하였다. 트립신 분해 후, 50.0μL의 분해물을 0.50μL의 순수한 포름산과 LC-MS 분석을 위해 혼합하였다. 컬럼 온도를 60℃로 설정하고 용매 A(수중 0.075% v/v 포름산) 및 용매 B(아세토니트릴중 0.075% 포름산)을 UPLC 분리에 사용하였다. UPLC를 0.15mL/분의 유동 속도로 0 내지 55% 용매 B를 사용하여 80분동안 수행하였다.
LC-MS 분석을 Masslynx V4.1 소프트웨어로 조절하였다. LC-MSE TIC(총 이온 수) 데이타 획득을 0.3/s의 스캔 비율, 3.0kV의 모세관 전압, 25V의 샘플 콘 전압(sample cone voltage), 4.0kV의 추출 콘 전압(extraction cone voltage)을 사용하는 분해 방식으로 50 내지 2000Da의 M/Z 범위에서 수행하였다. 고 에너지 충돌 유도된 단편화 TIC 데이타 획득을 20 내지 40V 범위의 충돌 에너지로 수행하였다. 이온 공급원 온도를 100℃로 설정하고 탈용매화 온도를 30℃로 설정하였다. 탈용매화 가스 유동은 600L/시간이었다. 실시간 록 질량(real time lock mass) TIC 미가공 데이타 세트(스캔/20초)를 100fmole/μL의 Glu-Fib B를 사용하여 3.0μ1/분의 유동 속도에서 획득하였다.
질량 분광분석 미가공 데이타를 BioPharmalynx(vl.2) 속에서 펩타이드 맵 방식으로 20000의 해상도를 사용하여 가공하였다. 785.8426Da의 록 질량(lock mass)을 실시간 시점을 위해 점 질량 교정에 적용하였다. 저 에너지 MS 이온 밀도 역치(ion intensity threshold)를 3000 수(count)로 설정하고, MSE 고 에너지 이온 강도 역치를 300 수에서 설정하였다. 질량 매치 내성(Mass match tolerance)을 MS 및 MSE 데이타 세트 둘 다에 대해 15ppm으로 설정하였다. AFAIKL2 및 우레아제 아미노산 서열을 펩타이드 매칭/확인을 위해 서열 라이브러리에 투입하였다. 탈아미드화 N, 탈아미드화 석신이미드 N, 산화 M, 산화 2xM, +K, +Na, 및 카바미도메틸 C(알킬화된 시스테인에 대해)의 고정된 개질제를 포함하는 다양한 개질제를 펩타이드 맵 분석에 적용하였다. AFAIKL2 측면에 접합된 펩타이드를 확인하기 위해, 우레아제의 시스테인-함유 펩타이드 및 교차-링커 SIAB(C9H7O2N, 161.0477Da)의 연결 단면을 가변 개질제로서 생성하여 가변 개질제 라이브러리 속에 포함시켰다. 이 경우에, 카바미도메틸 C를 가변 개질제로서 포함시켰다. 우레아제 측에서 접합된 펩타이드를 확인하기 위해, AFAIKL2의 중간 펩타이드 속의 라이신(lysine-in-middle peptide) XnKXm및 SIAB의 연결 단면을 가변 개질제로 생성하여 가변 개질제 라이브러리에 포함시켰다.
L-DOS47의 전체 세포 결합 검정
세포 단층을 100μl/웰의 MCF-7, BxPC-3, 및 A549 세포(4xl04개 세포/웰)을 96-웰 배양 플레이트에 씨딩하고 밤새 37℃에서 항온처리하여 제조하였다. 이어서 배지를 플레이트로부터 제거하고 세포 단층을 PBS중 100μL/웰의 0.05% 글루타르알데하이드를 사용하여 10분 동안 실온(RT)에서 고정시켰다. 이후에 플레이트를 PBS로 세척하고 120μL/웰의 50mM 그릴신을 가하였다. 37℃에서 20분 동안 항온처리한 후, 플레이트를 120μL/웰의 1% BSA/PBS로 37℃에서 30분 동안 차단하였다. 이후에, 플레이트를 완충액 A(PBS 중 0.05% BSA)로 3회 세척하고 80μL/웰의 희석된 L-DOS47 또는 DOS47를 가하고 37℃에서 1.5 시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 완충액 A로 4회 세척하고 0.1M PBS, pH 7.6 중 80μL/웰의 20 mM 우레아를 가하고 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 40μL/웰의 1N HCl을 가하여 반응을 중지시켰다. 각각의 웰에서 생산된 암모니아의 양을 개질된 인도페놀 검정을 사용하여 측정하였다. 요약하면, 용액 A를 lOmL의 물 중 165mg의 페놀 및 132mg의 NaOH를 용해한 후, 66μL의 나트륨 니트로프루시드 용액(lOmg/mL)을 가하여 새로이 제조하였다. 용액 B는 40μL의 차아염소산나트륨을 5mL의 물에 가하여 제조하였다. 전체 세포 결합 검정으로부터 샘플 용액(각각 30μL)를 50μL/웰의 5N NaOH:H20(3.3:46.7) 및 20μL/웰의 물을 함유하는 새로운 96-웰 플레이트에 이전시켰다. 용액 A(50μL/웰) 및 용액 B(50μL/웰)을 가한 후 플레이트를 미세플레이트 판독기에 발색을 위해 37℃에서 30분 동안 이전시켰다. OD를 630nm에서 측정하였다. 웰에서 생산된 암모니아의 양을 표준물로서 0 내지 150mM 염화암모늄을 사용하여 교정 곡선으로부터 계산하였다.
L-DOS47 세포 단층의 세포독성 검정을 lOOμL/웰의 MCF-7, BxPC-3, 및 A549 세포(4x104개의 세포/웰)을 96-웰 배양 플레이트 속에 씨딩하고 밤새 37℃에서 항온처리하여 제조하였다. 이후에, 배지를 플레이트로부터 제거하고 80μL/웰의 희석된 L-DOS47 또는 DOS47을 가하고 37℃에서 2시간 동안 추가로 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트를 KR-II 완충액/0.05% BSA로 3회 세척하고 100μL/웰의 20mM 우레아 용액을 가하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리한 후 배지를 제거하고 100μL/웰의 플레인 배지로 교체하였다. 세포 생존능을 MTS 세포 생존능 검정을 사용하여 측정하였으며, 여기서 MTS/PES(MTS, 2mg/mL; PES, lmg/mL)의 21:1 v/v 용액을 제조하고 20μL/웰의 혼합물을 플레이트에 가하였다. 이후에, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고 OD를 630 nm에서 490nm에서의 참고물을 사용하여 측정하였다.
작두콩 우레아제는 소단위당 각각 15개의 결합하지 않은 시스테인 잔기를 지닌 대략 91kDa의 6개의 동일한 소단위로 이루어진 육량체 효소이다. AFAIKL2 항체는 7개의 주요 아민 및 이황화물 결합을 함유한다. 항체 상의 주요 아민 및 우레아제 상의 시스테인 잔기는 이종이작용성 교차 링커를 통한 화학 접합용 염기이다. 그러나, 접합체의 분자 크기 및 2개의 단백질의 특성은 대규모 생산, 정제, 및 접합체 생성물의 특성화에 있어서 챌린지를 생성하였다. 면역접합체는 비경구 약물로서 사용하기 위한 거의 생리학적 pH인 수성 배지 속에서 가용성이고 안정해야 하므로; 우레아제가 식물 공급원으로부터 추출되고 이의 등전점(pI)(pI 4.8 내지 5.1에서 관찰됨)이 변경될 수 없으므로 재조합체 항체의 등전점(pI)은 조심스러운 서열 설계를 필요로 하였다. 반응 균일성 및 잔류 반응물 및 측면 생성물의 제거를 보증하기 위한 최적화는 접합 화학에서 중요하였다. 수개의 교차 링커[24, 30]가 단백질 접합을 위해 광범위하게 사용되고 개발 동안 스크리닝되었지만, 2개의 교차-연결 반응을 위한 최적 pH에서의 차이로 인하여 N-석신이미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조에이트(SIAB)가 L-DOS47 접합체 생산을 위해 선택되었다. 생산 동안, 항체를 pH 7.0에서 교차-링커로 활성화시킨 후 완충제를 pH 6.5로 교환하고 우레아제와 혼합하였다. 이후에, 항체를 반응 매질의 pH를 8.3으로 증가시킴으로써 우레아제에 연결시켰다. 우레아제에 활성화된 AFAIKL2를 연결시키는 반응 속도가 pH 6.5에서 매우 낮으므로, 거대한 반응 용기 속에서의 물질 균일성은 pH 6.5에서 예비혼합하여 보증한다. 따라서, 잔류 유리 우레아제 및 우레아제-(Ab)x의 아종을 확률 및 물질 몰 비로 단독으로 측정하였다. 8 내지 11의 항체/우레아제의 접합 비에서 잔류 우레아제 함량은 이론적으로 무시할만한 정도이며, L-DOS47 접합체는 울트라다이아필트레이션를 사용하여 정제함으로써 반응하지 않은 항체 및 가수분해된 교차-링커를 제거하였다. L-DOS47 접합체, 유리 AFAIKL2, 및 유리 우레아제의 크기 배제 크로마토그램은 도 7에 나타낸다.
L-DOS47 접합체는 ~24.6분에 용출하며, 이량체(가능하게는 이황화물 결합에 의해 또는 2개의 DIAB에 의해 활성화된 AFAIKL2 분자에 의해 연결됨)는 20.5 분에서 분해되지 않은 작은 피크로 용출되며, 중합체는 빈 시간(~15분)에 미량의 피크로서 용출한다. ~40분째에 미량의 피크는 완충액 성분을 나타낸다. L-DOS47 접합체 피크 너비는 유리 우레아제의 것보다 약간 더 크지만 비교가능하였으며, 이는 균일하게 분포된 접합 반응을 나타낸다. 유리 항체는 37분에 용출된다. 항체 피크의 앞에서 분해되지 않은 작은 피크는 비-공유결합 이량체를 나타낸다. 고 순도의 항체(>95%)가 5%를 초과하지 않는 이량체를 포함하는 이의 고 분자량 종과 함께, 생산 로트(lot)에서 전형적으로 관찰된다. HPU는 전형적으로 ~26.9분에서 주요 피크와 함께 용출되고, 작은 이량체 피크는 24분에, 및 미량의 중합체 피크는 15분에 용출된다. HPU에 대한 조(crude) 우레아제의 정제는 ~97%의 단량체를 생산하였으나 이량체와 중합체의 합은 3% 이하이다. 95% 이상의 L-DOS47 순도는 전형적으로 울트라다이아필트레이션 만을 사용한 단순 정제로부터 달성된다. SEC가 천연 조건 하에서 작동되므로, 이는 단백질 4차 구조의 분해 및 해리로 인하여 효과적인 분자량에 있어서의 변화를 측정할 수 있으므로; 당해 방법을 또한 L-DOS47에 대한 안전성 지시 검정으로 사용한다. L-DOS47에서 잔류 유리 우레아제의 존재는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 평가하였다(도 8).
잔류 유리 우레아제는 15.33분에서 용출되며, 이는 스파이크된 우레아제 피크(15.42분)과 매우 근접하다. HPU 피크는 거대한 L-DOS47 피크(1.48의 Rs)로부터 매우 잘 해석된다. 도 8의 삽화에 나타낸 바와 같이, 잔류 우레아제 함량을 측정하기 위한 표준 첨가 방법(2.4%, 4.8% 및 7.2% w/w HPU로 스파이크된 L-DOS47)은 우수한 직선성(0.9995의 R2)을 나타낸다. 당해 샘플의 계산된 잔류 우레아제 함량은 0.72%이며, 잔류 우레아제는 지금까지의 모든 생산 로트에서 2%를 초과하지 않고, 이는 잔류 우레아제가 이들 조건하에서 실제적으로 무시할 수 있으며 제고 공정은 접합되지 않은 우레아제로부터 L-DOS47 접합체를 분리하는 추가의 단계를 필요로 하지 않음을 입증한다.
L-DOS47 생산 동안, 6개의 단량체성 우레아제 소단위 각각을 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 AFAIKL2 분자와 접합시킬 수 있으므로, 변성 조건 하에서 L-DOS47의 SDS-엑스페리온은 ~90 내지 155kDa로부터 다수의 구별가능한 피크/밴드의 양식을 생산한다. 또한, 항체 활성화 반응 동안, 항체의 작은 부위는 항체 분자당 2개의 SIAB(AFAIKL2-(SIAB)2)로 무작위로 활성화될 수 있으며 이는 2개의 우레아제 소단위에 대한 이들 항체 분자 각각의 접합을 생성한다. 1개-항체-2개 소단위는 결과적으로 200 내지 260kDa의 범위에서 불량하게 분해된 피크/밴드의 보다 작은 제2 세트를 생산한다.
도 9에서, 패널 2는 실제 겔 영상을 나타내고 패널 1은 레인 1 및 4로부터의 전기영동도의 오버레이(overlay)를 함유한다. 레인 1-2 및 7-8에서 L-DOS47 벤치 규모 샘플을 제2의 접합 반응 전에 이온 교환 크로마토그래피로 정제된 활성화된 AFAIKL2로 생산하였다. AFAIKL2-(SIAB)2 종은 제거되었으므로, 수득되는 접합체는 내부-교차-연결된 소단위를 결여하였으며 단지 1개의 세트의 피크/밴드가 관찰되었다. 레인 3-6에서의 L-DOS47 샘플에서, AFAIKL2는 추가의 정제없이 활성화 단계 후 접합에 직접 사용되었으며 결과적으로 작은 제2 세트의 피크/밴드가 존재한다. 레인 9 및 10은 HPU 샘플을 사용하여 오버로딩하였다.
피크 영역(도 9, 패널 1) 및 밴드 강도(도 9, 패널 2)는 항체 분자의 상응하는 수와 연결된 우레아제 소단위의 상대적인 풍부성에 의존한다. 피크 부위는 기본선 교정 후 소프트웨어에 의해 통합되며 L-DOS47 접합 비(CR)는 다음과 같이 계산된다(도 9로부터 겔의 레인 2를 나타내는 도 10 참고):
CR= 6*(PK1 *0+PK2 *1+PK3 *2+PK4 *3+PK5 *4)/(PKi+PK2+PK3+PK4+PK5)
상기식에서,
PKi(i=l-5)는 i-1 항체 분자에 연결된 우레아제 소단위의 피크 영역이다.
활성화된 항체는 L-DOS47의 대규모 생산 동안 이온 교환 크로마토그래피 정제를 겪지 않으므로, 피크의 제2의 불량하게 분해된 세트는 이들 샘플의 전기영동도인 것으로 여겨진다. 그러나, 2개 세트의 피크는 활성화 부위 분포가 확률 및 SIAB에 대한 항체의 몰 비에 의해 측정되므로 유사한 강도 양식을 갖는 것으로 예측된다. 따라서, 피크의 당해 제2 세트는, 밴드가 불량하게 분해되고 260kDa 분자량 마커와 오버랩되기 때문에 접합 비를 계산하는데 사용되지 않는다. 따라서, AFAIKL2-(SIAB)2 종이 상이한 천연의 우레아제 분자로부터의 2개의 소단위를 연결시킴에 의해 이량체 또는 중합체 접합체를 이론적으로 생성할 수 있다고 해도, L-DOS47 샘플의 크기 배제 크로마토그램에서 관찰된 조합된 이량체 및 중합체 피크 영역의 최소 수준(3% 미만)(도 7)은, AFAIKL2-(SIAB)2 종의 대부분이 단일의 천연 우레아제 분자의 소단위간 연결에 기여하여 단량체 L-DOS47을 생산하며 분자간 연결에는 기여하지 않아 이량체 및 중합체 접합체를 생산함을 나타낸다. 또한, SEC 크로마토그램에서 이들 이량체 및 중합체 피크의 존재는, 유사한 피크가 또한 HP 우레아제의 크기 배제 크로마토그램에서 나타나므로, 이황화물 연결에 논리적으로 기여할 수 있었다. 따라서, 전기영동도에서 피크의 제2 세트는 품질 조절을 위한 매개변수로서 사용되지 않는다.
L-DOS47의 접합 비는 항체에 의해 표적화된 종양 항원인, CEACAM6에 대한 이의 친화성에 있어 중요하다. 상이한 접합 비(우레아제 당 1.8 내지 12개의 AFAIK)를 갖는 L-DOS47를 AFAIKL2/HP 우레아제 몰 비를 조절하여 생산함으로써 결합 친화성에 있어서 접합 비의 효과를 평가하였다. 고정화된 CEACAM6-A에 대한 L-DOS47의 결합 친화성은 우레아제에 접합된 항체의 수에 직접적으로 비례하는 것으로 밝혀졌다(도 11). 접합된 항체가 많을 수록 관찰된 결합 시그날이 더 많이 관찰되었다. 그러나, 당해 효과는 6 이상의 접합 비에서 거의 크지 않았다.
이중 웨스턴 블롯팅(Western blotting)(도 12)에 의한 L-DOS47의 분석은 SDS-엑스페리온을 통해 관찰된 밴드 양식을 확인한다. 삽입 박스는, 주요 블롯의 박스쳐진 영역의 확대를 나타내며, 여기서 우레아제 및 접합된 종(각각 1 내지 4개의 접합된 AFAIKL2를 지닌 우레아제에 상응하는 N1-N4)이 표지되어 있다. 항-우레아제 항체로 프로브하는 경우, 91kDa 우레아제 밴드는 가장 강력하게 가시화되며 고 분자량 밴드(보다 고도로 접합된 종에 상응)의 강도는 감소한다. 대조적으로, 항-AFAIKL2 항체를 사용하여 프로브하는 경우, 91kDa 밴드는 거의 가시적이지 않으며 다음의 2개의 보다 높은 분자량 밴드가 가장 강력하다(Nl 및 N2). 이는, 이들이 접합체 속에서 우세한 밴드라는 사실에 기인한다. 항-AFAIKL2 및 항-우레아제 항체 둘 다에 의해 가시화될 L-DOS47의 능력은 접합체 속에서 종 둘 다의 존재를 입증하며, 항체의 특이성은, 항-AFAIKL2 항체가 우레아제에 결합하지 않고 항-우레아제 항체는 AFAIKL2에 결합하지 않는다는 사실에 의해 확인된다.
L-DOS47는 AFAIKL2 및 우레아제의 화학적 접합체이므로, 항체 및 우레아제 효소 둘 다 및 단백질 둘 다의 공유 가교 연결된 펩타이드를 접합체의 트립신 분해로부터 검출하여야 한다. ESI LC-MSE 펩타이드 맵핑을 수행하여 접합체를 특성화하였다. 관련 내용에서 나타낸 바와 같이, AFAIKL2로부터의 펩타이드는 L-DOS47 스펙트럼에서 나타났지만 HP 우레아제 스펙트럼에서는 나타나지 않았다. L-DOS47의 트립신 분해로부터, AFAIKL2 및 우레아제 아미노산 서열 둘 다에 대한 펩타이드 범위는 100%이었으며 전형적인 질량 오차는 6 ppm 미만이고 각각의 펩타이드는 ±15ppm 미만의 질량 오차와 함께 이의 고 에너지 MS/MS b/y 단편 이온으로 확인되었다.
AFAIKL2의 활성화 부위를 확인하고 각각의 접합체 부위의 분포를 측정하기 위하여, AFAIKL2를 SIAB를 사용하여 활성화시킨 후 플루오레세인 표지된 시스테인(Cys-FL)에 접합하였다. 수득되는 AFAIKL2-Cys-FL의 트립신 분해 및 RP-HPLC 크로마토그래피에 의한 분리 후, 피크 분획을 MALDI-MS에 대해 수집하여 Cys-FL 연결된 항체 트립신 펩타이드를 확인하였다. SIAB 활성화된 부위만이 Cys-플루오레세인에 연결되며, 0.025% TFA 속에서 이에 대한 최대 흡수 파장은 420 nm이므로, 활성화 펩타이드 피크만이 420 nm에서 검출될 수 있다. 예를 들면, AFAIKL2의 라이신 #32가 SIAB에 의해 활성화되는 경우, 이는 Cys-FL에 연결되어야 하며 이러한 트립신 분해 부위는 트립신 분해 동안 손실되므로; 분자 질량이 2768.113Da인 피크가 관찰되어야 하며, 이는 L2K32-Cys-FL로 나타낸 Cys-FL 연결된 펩타이드 중간내 라이신, (LSCAAHDPIFDK32NLMGWG)-Cys-FL(서열 번호: 7)를 나타낸다. AFAIKL2-Cys-FL의 트립신 분해의 RP-HPLC 크로마토그램은 도 13에 나타낸다.
검출된 질량 값을 갖는 확인되고 접합된 펩타이드를 도 13에서 상응하는 HPLC 피크에서 표지한다. 항체의 아미노산 서열에 따라, 6개의 라이신 잔기로부터의 1차 아민 및 N-말단 아민은 이론적으로 활성화 반응에 이용가능하다. 그러나, 실제로 이들중 4개만이 실질적으로 활성화되었다. 이는 표면에서 4개의 1차 아민을 노출하지만 천연의 구조 내부에 다른 것을 감추는 항체의 3차 구조에 기인하는 경향이 있다. 각각의 활성화 부위의 분포(표 4)는 이의 피크 영역 및 도 13에서 모든 확인된 HPLC 피크 영역의 합에 따라 계산하였다.
AFAIKL2에서 각각의 활성화 부위의 HPLC 피크 영역 및 분포 퍼센트
Lys76(L2K76) Lys44(L2K44) Met1(L2M1) Lys32(L2K32)
영역 % 영역 % 영역 % 영역 %
185 35 107 20 140 26 97 18
표 4에 나타낸 바와 같이, 교차 링커를 위한 항체의 가장 활성인 부위는 L2K76에 이어서 L2M1 및 이어서 L2K44이다. L2K32는 항체 결합에 필수적이며 또한 적어도 활성 부위이지만, 총 반응의 ~18%에 여전히 기여한다. L-DOS47의 경우, 교차-링커 활성화된 AFAIKL2는 우레아제 4차 구조의 표면에 노출된 시스테인 잔기에 공유 연결되었다. 따라서, 공유 교차-연결된 펩타이드는 L-DOS47의 트립신 분해의 펩타이드 스펙트럼으로부터 검출될 수 있다.
공유 교차-연결된 펩타이드를 확인하기 위하여, L-DOS47 샘플로부터 트립신 분해의 ESI LC-MSE 미가공 데이타를 BiopharmaLynx에 의해 진행시켰으나 우레아제 측면에서 모든 15개의 시스테인 잔기에 대한 사용자-생성한 개질제의 세트를 함유하는 다양한 개질제 라이브러리를 사용하여 조사하였다. 표 4에서의 활성화 분포에 따라서, 사용자 생성 개질제는 3개의 펩타이드 중간내 라이신 및 SIAB(C9H5O2N, 159.0320Da)(L2K76, L2K44 및 L2K32로 나타냄), 및 N-말단 메티오닌 및 연결(L2M1으로 나타냄)이었다. 당해 결과(관련 내용에서 상세히 나타냄)는 각각의 우레아제 소단위의 15개의 시스테인 잔기 중에서, 6개만이 실질적으로 접합되었음을 입증하였다. 가장 접근가능한 시스테인은 UC824에 이어서, UC663, UC59, UC207, UC329 및 UC268의 순서이다. 우레아제 효소 활성에 필수적인, 시스테인 잔기 Cys592는 실질적으로 접합되지 않았다. 우레아제 측면에서 6개의 시스테인 잔기 각각에 대한 4개의 교차-링커 활성화된 AFAIKL2 부위의 상대적인 접근성은 또한 상이하였다. 예를 들면, UC329는 L2M1에 대해서만 접근가능하였다. 이들 실질적인 접합 부위는 또한 이들의 MS/MS 단편 프로파일에 의해 확인되었다. 예로서, 접합된 펩타이드, 이의 서열이 (LSCAAHDPIFDKNLMGWGR(서열 번호: 8))-연결-(CDSSDNDNFR(서열 번호: 9))이고 3517.4873의 펩타이드 질량을 갖는 L2K32UC663은 이를 개질제로서 AFAIKL2 측면으로부터 (LSCAAHDPIFDKNLMGWGR(서열 번호: 8))-연결(2346.0674Da)로 개질된 우레아제 펩타이드(서열 번호: 9)를 CDSSDNDNFR로서 조사함으로써 2.1ppm의 질량 매치 오차로 확인하였다. 동일한 펩타이드는 또한, 이를 개질제로서 우레아제 측면으로부터 연결-(CDSSDNDNFR(서열 번호: 9))(1330.4520 Da)로 개질된 AFAIKL2 펩타이드를 LSCAAHDPIFDKNLMGWGR(서열 번호: 8)로서 조사함으로써 2.1ppm의 질량 매치 오차로 확인하였다. 당해 접합된 펩타이드의 고 에너지 충돌 유도된 MS/MS 스펙트럼은, 이를 AFAIKL2 측면으로부터 개질제로 개질시킨 우레아제 펩타이드로서 조사함으로써 우레아제 측면으로부터 9 b/y 단편으로 맵핑하였다. 동일한 스펙트럼을 또한, 이를 우레아제 측면으로부터 개질제를 사용하여 AFAIKL2 펩타이드로서 조사함으로써 AFAIKL2 측면으로부터 14 b/y 이온으로 맵핑하였다.
상이한 L-DOS47 결합 프로파일을 BxPC-3, A549, 및 MCF7 세포주(도 14) 중에서 관찰하였다(도 14). 당해 결과는, L-DOS47이 췌장 세포주 BxPC-3에 잘 결합하였음을 나타내었으며, 이는, CEACAM6 항원이 세포 표면에서 발현되었음을 나타낸다. 중간 결합은 폐 세포주 A549에서 관찰되었으나, 유방 세포주 MCF7에서는 결합이 발견되지 않았다. AFAIKL2 항체는, 우레아제 효소(DOS47)에 접합되는 경우 CEACAM6-발현 세포에 대해 특이적인 표적화를 제공하였다. 이는 접합되지 않은 DOS47 대조군으로 처리한 3개의 세포주에서 결합 시그날의 부재로 확인되었다.
BxPC-3 세포는, 세포를 1μg/mL 미만의 L-DOS47로 처리하는 경우 관찰된 세포 생존율에 있어서 급격한 하강에 의해 나타난 바와 같이, L-DOS47 세포독성에 매우 민감하였다(도 15). 중간 세포독성이 A549 세포에서 관찰되었으나, MCF7에서 관찰된 효과는 없었으며, 이는 결합 연구의 결과와 일치하였다. 또한, 음성 대조군 DOS47는 세포주들 중 어느 것에서도 세포독성 효과가 없었다.
L-DOS47 면역접합체의 접합 및 정제를 위해 개발된 과정을 대규모 생산에서 성공적으로 사용하였다. 확립된 접합 화학 및 반응 조건을 사용하여, 교차-링커 활성화된 항체를 HP 우레아제 중간체와 예비-혼합하고 pH를 조절하여 접합 반응을 활성화시킴으로써 우수한 균일성을 달성하였다. 우레아제 분자당 8 내지 11개의 항체의 접합 비에서, 잔류 우레아제 함량은 실제적으로 무시할 정도이었으며 L-DOS47 접합체는 울트라다이아필트레이션 만을 사용하여 정제함으로써 반응하지 않은 항체 및 가수분해된 교차-링커를 제거할 수 있고 최종 면역접합체로부터 잔류 우레아제를 분리하는 챌린징 단계는 피하였다. 당해 과정은 고 순도의 L-DOS47 생성물(>95%)을 2% 미만의 유리 우레아와 함께 수득하였다. ELISA에 의해 평가된 것으로서 고정된 CEACAM6-A에 대한 L-DOS47의 결합 친화성은 우레아제에 접합된 항체의 수에 직접 비례하였으며, 접합 비가 6 이상인 경우 하강하였다. 접합 비는 모든 대규모 배치(batch)에 대해 우레아제 분자 당 9 내지 11개 항체의 범위였으며, 이는 최적의 접합이 이들 조건 하에서 달성되었음을 입증한다. 이중 항체 웨스턴 블롯 검정은 접합체의 화학적 실체를 입증하였다. ESI LC-MSE 펩타이드 맵핑 분석은 L-DOS47 면역접합체로부터 항체 및 우레아제 둘 다에 대한 100% 서열 회복을 달성하였다. AFAIKL2 및 우레아제의 C-말단 및 N-말단을 포함하는 3개 이상의 아미노산 잔기를 지닌 펩타이드 서열을 상응하는 펩타이드의 MS/MS b/y 단편 맵으로 확인하였다. 유효 접합 부위(AFAIKL2 측면에서 4개 및 우레아제 측면에서 6개)를 L-DOS47 샘플의 ESI LC-MSE 펩타이드 맵핑 분석에 의해 확인하였다. 이들 교차-연결된 펩타이드는 항체 및 우레아제 측면 둘 다로부터 관련 펩타이드의 MS/MS b/y 단편 맵핑에 의해 확인하였다.
2개의 CEACAM6-발현 세포주 BxPC-3 및 A549에 대한 L-DOS47의 특이성은 L-DOS47 대 항체-접합된 L-DOS47 대응부의 결합 및 세포독성 활성의 부재로 예증되었다. 시험한 3개의 세포주 중에서, BxPC-3은 가장 강력한 결합 시그날을 나타낸 반면, A549 만이 중간 결합을 입증하였다. BxPC-3의 결합 시그날은 A549의 것의 약 5배였다. 당해 결과는 세포독성 검정에서 관찰된 것과 일치하였다. L-DOS47은 A549보다 BxPC-3에서 훨씬 더 높은 세포독성 효과를 유도하였다. 세포독성 반응은 L-DOS47 결합의 결여로 인하여 MCF-7에서는 관찰되지 않았다. L-DOS47는 비-소 세포 폐암에 대한 사람 제I상 임상 연구에서 잠재적인 치료제로서 시험되고 있다.
본 개시내용이 상기 국면들과 관련하여 기술되어 있지만, 상기한 설명 및 실시예는 본 개시내용의 영역을 예증하고 한정하지 않는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 영역내 다른 국면, 장점 및 변형은 본 개시내용이 속한 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
본 개시내용은 본 개시내용의 개개 국면의 단일의 예증으로 의도되는, 기술된 구체적인 국면에 의한 영역으로 한정되지 않으며, 작용적으로 등가물인, 어떠한 조성물 또는 방법도 본 개시내용의 영역내에 있다. 다양한 변형 및 변화가 본 개시내용의 취지 또는 영역으로부터 벗어남이 없이 본 개시내용의 방법 및 조성물에서 이루어질 수 있음이 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 따라서, 본 개시내용은, 이들이 첨부된 청구범위의 영역 및 이들의 등가물에 속해있는 한 본 개시내용의 변형 및 변화를 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허원은, 각각의 개개 공보 또는 특허원이 참고에 의해 구체적이고 개별적으로 포함되는 것으로 나타내는 바와 동일한 정도로 참고로 본원에 포함된다.
참고 문헌
Figure 112017080901044-pct00006
Figure 112017080901044-pct00007
Figure 112017080901044-pct00008
Figure 112017080901044-pct00009

Claims (51)

  1. 단일 도메인 항체-우레아제 접합체(conjugate) 및
    정맥내 주사용으로 적합한 약제학적으로 허용되는 수용액
    를 포함하는, 개체에서의 암 치료용 약제학적 조성물로서,
    상기 접합체는 우레아 잔기 당 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 단일 도메인 항체 잔기의 접합 비를 가지며,
    상기 조성물은 항체-우레아제 접합체의 중량을 기준으로 10% 미만의 접합되지 않은 우레아제를 함유하는,
    약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 접합되지 않은 우레아제는 5% w/w 미만, 2% w/w 미만 또는 1% w/w 미만이거나, 상기 조성물은 비수성-HPLC 용매를 포함하지 않거나, 상기 접합되지 않은 우레아제는 5% w/w 미만, 2% w/w 미만 또는 1% w/w 미만이고 상기 조성물은 비수성-HPLC 용매를 포함하지 않으며, 또는
    상기 조성물의 pH는 6.8(+/- 10%)인, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단일 도메인 항체-우레아제 접합체는
    우레아 잔기 당 6개 이상의 단일 도메인 항체 잔기의 접합 비를 가지거나,
    우레아 잔기 당 8-11개의 단일 도메인 항체 잔기의 접합비를 갖는,
    약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 우레아제는 작두콩(Jack bean) 우레아제인, 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단일 도메인 항체는 인간화된 또는 비-인간 항체인, 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단일 도메인 항체는 비-소 세포 폐 암종에 의해 발현된 종양 항원에 대해 특이성을 갖는, 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단일 도메인 항체는 CEACAM6에 대해 특이성을 가지며, 추가로
    (i) 상기 단일 도메인 항체는 1 x 10-6M(+/- 10%) 초과의 Kd 값으로 CEACAM6에 대해 결합 친화성을 가짐;
    (ii) 상기 단일 도메인 항체 접합체는 1 x 10-8M(+/- 10%) 이하의 Kd 값으로 CEACAM6에 대해 결합 친화성을 가짐;
    (iii) 상기 단일 도메인 항체 접합체는 1 x 10-10M(+/- 10%) 이하의 Kd 값으로 CEACAM6에 대해 결합 친화성을 가짐;
    (iv) 상기 단일 도메인 항체 접합체는 5nM(+/- 10%) 이하의 IC50 값으로 CEACAM6에 대해 결합 친화성을 가짐;
    (v) 상기 단일 도메인 항체 접합체는 3.22nM(+/- 10%)의 IC50 값으로 CEACAM6에 대해 결합 친화성을 가짐; 및
    (vi) 상기 단일 도메인 항체 접합체는 20μg/mL(+/- 10%)의 IC50 값으로 CEACAM6에 결합 친화성을 가짐
    중 하나 이상의 특징을 갖는, 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단일 도메인 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하거나, 상기 단일 도메인 항체는 상기 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 변형을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 약제학적 조성물.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 암은 비-소 세포 폐 암종, 유방, 췌장, 난소, 폐, 결장 암 및 이의 조합 중 하나 이상인, 약제학적 조성물.
  11. 항체-우레아제 접합체의 중량을 기준으로 5% 미만의 접합되지 않은 우레아제를 함유하는 단일 도메인 항체-우레아제 접합체(conjugate)를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,
    상기 방법은:
    (1) 활성화된 단일 도메인 항체 및 우레아제를 활성화된 단일 도메인 항체 및 우레아제가 반응하지 않는 용매에서 결합시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계로서, 용매 내에서 활성화된 단일 도메인 항체와 우레아제의 분포가 균일한, 반응 혼합물을 형성하는 단계;
    (2) 단계 (1)의 혼합물의 pH를 증가시켜 활성화된 단일 도메인 항체가 우레아제와 용이하게 반응하여 우레아제 잔기 당 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 단일 도메인 항체 잔기의 접합 비를 갖는 단일 도메인 항체-우레아제 접합체를 형성하는 단계로서, 총 단백질 중량 당 10-20% 이하의 접합되지 않은 항체가 반응 혼합물에 남아있는, 단일 도메인 항체-우레아제 접합체를 형성하는 단계; 및
    (3) 상기 단일 도메인 항체-우레아제 접합체를 정제 단계에 의해 정제하는 단계
    를 포함하고,
    상기 방법은 크로마토그래피 정제 단계를 포함하지 않으며,
    조성물은 상기 정제 단계 후에 총 단백질 중량당 2%(+/- 10%) 이하의 접합되지 않은 단일 도메인 항체를 포함하는,
    단일 도메인 항체-우레아제 접합체를 포함하는 조성물의 제조 방법.
  12. 종양 항원에 대한 항체 결합 친화성을 증가시키는 생체외(ex vivo) 방법으로서,
    상기 방법은
    복수의 단일 도메인 항체 분자를 우레아제 분자에 접합시켜 우레아제 분자 당 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 항체 분자의 접합 비를 갖는 단일 도메인 항체-우레아제 접합체를 형성하는 단계로서, 단일 도메인 항체 접합체는 접합되지 않은 항체보다 적어도 100 배 높은 종양 항원에 대한 결합 친화성을 가지는, 단일 도메인 항체-우레아제 접합체를 형성하는 단계; 및
    상기 단일 도메인 항체-우레아제 접합체의 조성물을 형성하는 단계로서, 상기 조성물은, 항체-우레아제 접합체의 중량을 기준으로 10% 미만의 접합되지 않은 우레아제를 함유하거나 총 단백질 중량 당 2%(+/- 10%) 이하의 접합되지 않은 단일 도메인 항체를 포함하는, 단일 도메인 항체-우레아제 접합체의 조성물을 형성하는 단계
    를 포함하는,
    종양 항원에 대한 항체 결합 친화성을 증가시키는 생체외 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 우레아제는 작두콩 우레아제인, 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 단일 도메인 항체는 인간화된 또는 비-인간 항체인, 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 종양 항원은 비-소 세포 폐 암종에 의해 발현되는, 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단일 도메인 항체는 CEACAM6에 대해 특이성을 가지며, 추가로
    (i) 상기 단일 도메인 항체는 1 x 10-6M(+/- 10%) 초과의 Kd 값으로 CEACAM6에 대해 결합 친화성을 가짐;
    (ii) 상기 단일 도메인 항체 접합체는 1 x 10-8M(+/- 10%) 이하의 Kd 값으로 CEACAM6에 대해 결합 친화성을 가짐;
    (iii) 상기 단일 도메인 항체 접합체는 1 x 10-10M(+/- 10%) 이하의 Kd 값으로 CEACAM6에 대해 결합 친화성을 가짐;
    (iv) 상기 단일 도메인 항체 접합체는 5nM(+/- 10%) 이하의 IC50 값으로 CEACAM6에 대해 결합 친화성을 가짐;
    (v) 상기 단일 도메인 항체 접합체는 3.22nM(+/- 10%)의 IC50 값으로 CEACAM6에 대해 결합 친화성을 가짐; 및
    (vi) 상기 단일 도메인 항체 접합체는 20μg/mL(+/- 10%)의 IC50 값으로 CEACAM6에 대해 결합 친화성을 가짐
    중 하나 이상의 특징을 갖는, 방법.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 및
    상기 조성물의 사용을 위한 지시사항
    을 포함하는 키트.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
KR1020177023319A 2015-01-23 2016-01-22 치료학적 목적을 위한 항체-우레아제 접합체 Active KR102318994B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562107210P 2015-01-23 2015-01-23
US62/107,210 2015-01-23
PCT/IB2016/050342 WO2016116907A1 (en) 2015-01-23 2016-01-22 Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170131365A KR20170131365A (ko) 2017-11-29
KR102318994B1 true KR102318994B1 (ko) 2021-10-29

Family

ID=56416507

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177023319A Active KR102318994B1 (ko) 2015-01-23 2016-01-22 치료학적 목적을 위한 항체-우레아제 접합체

Country Status (18)

Country Link
US (2) US11931422B2 (ko)
EP (1) EP3261678B8 (ko)
JP (2) JP6876618B2 (ko)
KR (1) KR102318994B1 (ko)
CN (2) CN107206103A (ko)
AU (1) AU2016210551B2 (ko)
BR (1) BR112017015582A2 (ko)
CA (1) CA2973538C (ko)
ES (1) ES2852001T3 (ko)
IL (1) IL253549B (ko)
MX (1) MX382911B (ko)
NZ (1) NZ733669A (ko)
PL (1) PL238187B1 (ko)
RU (1) RU2689689C2 (ko)
SG (1) SG11201705982PA (ko)
UA (1) UA121881C2 (ko)
WO (1) WO2016116907A1 (ko)
ZA (1) ZA201704709B (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201705982PA (en) 2015-01-23 2017-08-30 Helix Biopharma Corp Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes
CA3045327A1 (en) 2016-09-24 2018-03-29 Helix Biopharma Corp. Restoring function of tumour acidified t cells
JP2020504761A (ja) * 2017-01-05 2020-02-13 へリックス バイオファーマ コープ． 抗ｖｅｇｆｒ−２ウレアーゼコンジュゲート
CN110382540A (zh) * 2017-01-05 2019-10-25 赫利克斯生物药品公司 Vegfr-2抗体
JP6899560B2 (ja) * 2017-05-23 2021-07-07 株式会社島津製作所 質量分析データ解析装置及び質量分析データ解析用プログラム
JP7403479B2 (ja) 2018-06-03 2023-12-22 ランカプ バイオ ベータ リミテッド Ｃｅａｃａｍ５およびｃｄ４７に対する二重特異性抗体
KR102260478B1 (ko) 2019-08-19 2021-06-02 연세대학교 산학협력단 일나트륨 요소화물 결정 용해용 조성물
HUE067160T2 (hu) 2019-09-18 2024-10-28 Lamkap Bio Alpha AG Bispecifikus antitestek CEACAM5 és CD3 ellen
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013185215A1 (en) 2012-06-12 2013-12-19 Amorfix Life Sciences Ltd. Antibodies and conjugates that target misfolded prion protein
WO2014165985A1 (en) 2013-04-08 2014-10-16 Helix Biopharma Corp. Use of antibody-urease conjugates for diagnostic and therapeutic purposes

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0007895B1 (fr) 1978-07-19 1983-06-22 Patrick Couvreur Nanoparticules biodégradables, compositions pharmaceutiques les contenant et procédé pour leur préparation
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
FR2504408B1 (fr) 1981-04-24 1986-02-14 Couvreur Patrick Procede de preparation de particules submicroscopiques, particules ainsi obtenues et compositions pharmaceutiques les contenant
FR2523445A1 (fr) 1982-03-17 1983-09-23 Sanofi Sa Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues
US4867962A (en) 1988-02-26 1989-09-19 Neorx Corporation Functionally specific antibodies
FR2637612B1 (fr) 1988-10-06 1993-09-10 Pasteur Institut Sequences de nucleotides codant pour une proteine a activite ureasique
NZ237688A (en) 1990-04-19 1993-01-27 Res Dev Foundation Antibody-cytotoxic immunoconjugate-containing compositions and cancer treatment
US5298399A (en) 1990-08-10 1994-03-29 Sapporo Breweries Limited Gene and process for producing a thermostable urease
FR2683159B1 (fr) 1991-10-31 1994-02-25 Coletica Procede de fabrication de nanocapsules a paroi a base de proteines reticulees; nanocapsules ainsi obtenues et compositions cosmetiques, pharmaceutiques et alimentaires en comportant application.
US5976535A (en) 1992-06-09 1999-11-02 Neorx Corporation Pretargeting protocols for the enhanced localization of cytotoxins to target sites and cytotoxic combinations useful therefore
GB9300875D0 (en) 1993-01-18 1993-03-10 Ucb Sa Nanocapsule containing pharmaceutical compositions
AU6268894A (en) 1993-02-22 1994-09-14 Alza Corporation Compositions for oral delivery of active agents
JPH08509873A (ja) 1993-05-19 1996-10-22 アンスティテュ・パストゥール ヘリコバクター感染に対する免疫組成物、該組成物に用いられるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸配列
CA2130072C (en) * 1994-08-12 2003-02-18 John W. Cherwonogrodzky Method of detecting a pathogen using a virus
WO1997015316A1 (en) * 1995-10-27 1997-05-01 Merck & Co., Inc. Conjugates of gonadotropin releasing hormone
EP0824019B1 (en) 1996-08-13 2002-11-20 Quest International B.V. Inhibition or reduction of oral malodour
EP0932390A1 (en) 1996-10-11 1999-08-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method
US6261537B1 (en) 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
US6180114B1 (en) 1996-11-21 2001-01-30 University Of Washington Therapeutic delivery using compounds self-assembled into high axial ratio microstructures
FR2790405B1 (fr) 1999-03-02 2001-04-20 Oreal Nanocapsules a base de polymeres dendritiques
AU4305101A (en) 1999-11-22 2001-06-04 Research Foundation Of The State University Of New York, The Magnetic nanoparticles for selective therapy
MXPA05000778A (es) * 2002-07-18 2005-08-29 Helix Biopharma Corp Uso de ureasa para inhibir el crecimiento de celulas cancerosas.
CA2547034C (en) * 2003-11-28 2014-02-18 National Research Council Of Canada Anticarcinoma antibodies and uses thereof
WO2006032705A2 (en) 2004-09-23 2006-03-30 Guerbet Contrast agents encapsulating systems for cest imaging
JP5171611B2 (ja) 2005-03-25 2013-03-27 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ 可溶性ポリペプチドの単離方法
EP2254909A4 (en) 2007-12-21 2012-05-02 Ca Nat Research Council NON-AGGREGATING HUMANS VH DOMAINS
SI2408807T1 (sl) * 2009-03-18 2021-11-30 Ac Immune Sa Postopek za terapevtsko uporabo
CN106928344A (zh) 2010-11-16 2017-07-07 奥克塔法马股份有限公司 用于从含有凝血因子的溶液中减少和/或除去FXI和FXIa的方法
AU2012211011A1 (en) 2011-01-28 2013-08-15 National Research Council Of Canada Engineering of immunoglobulin domains
SG11201705982PA (en) 2015-01-23 2017-08-30 Helix Biopharma Corp Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013185215A1 (en) 2012-06-12 2013-12-19 Amorfix Life Sciences Ltd. Antibodies and conjugates that target misfolded prion protein
WO2014165985A1 (en) 2013-04-08 2014-10-16 Helix Biopharma Corp. Use of antibody-urease conjugates for diagnostic and therapeutic purposes

Also Published As

Publication number Publication date
PL423259A1 (pl) 2018-03-26
US11931422B2 (en) 2024-03-19
ZA201704709B (en) 2019-11-27
NZ733669A (en) 2019-03-29
RU2017129729A (ru) 2019-02-25
EP3261678A4 (en) 2018-12-05
JP6876618B2 (ja) 2021-06-02
MX2017009537A (es) 2018-04-10
CA2973538C (en) 2021-01-12
IL253549A (en) 2019-08-29
JP2020143084A (ja) 2020-09-10
ES2852001T3 (es) 2021-09-10
IL253549B (en) 2021-07-29
CA2973538A1 (en) 2016-07-28
CN118873680A (zh) 2024-11-01
RU2017129729A3 (ko) 2019-02-25
US20180000963A1 (en) 2018-01-04
BR112017015582A2 (pt) 2018-03-13
EP3261678B1 (en) 2020-11-11
EP3261678A1 (en) 2018-01-03
KR20170131365A (ko) 2017-11-29
EP3261678B8 (en) 2021-03-17
JP2018506581A (ja) 2018-03-08
US20240277863A1 (en) 2024-08-22
AU2016210551B2 (en) 2019-03-07
WO2016116907A1 (en) 2016-07-28
AU2016210551A1 (en) 2017-07-27
MX382911B (es) 2025-03-13
RU2689689C2 (ru) 2019-05-28
SG11201705982PA (en) 2017-08-30
UA121881C2 (uk) 2020-08-10
CN107206103A (zh) 2017-09-26
PL238187B1 (pl) 2021-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102318994B1 (ko) 치료학적 목적을 위한 항체-우레아제 접합체
US11738090B2 (en) Plant virus particles for delivery of antimitotic agents
CN113613679A (zh) 基于甘氨酸的接头的转谷氨酰胺酶缀合方法
US10112999B2 (en) Anti-PRLR antibody-drug conjugates (ADC) and uses thereof
Jin et al. An anti-EGFR× cotinine bispecific antibody complexed with cotinine-conjugated duocarmycin inhibits growth of EGFR-positive cancer cells with KRAS mutations
JP7436710B2 (ja) 新規のヌクレオリン－結合ペプチド及びその用途
KR20240139054A (ko) 가교 항체
HK40117905A (zh) 用於治疗目的的抗体-脲酶缀合物
EP4201431A1 (en) Intermediate for preparing antibody-drug conjugate (adc), preparation method therefor, and use thereof
HK1238557A1 (en) Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes
JP2026501108A (ja) ソルチリンの標的化
WO2024231224A2 (en) Antibody-drug conjugates employing novel linker-payload systems for enhanced targeting of cancer-associated antigens

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A15-nap-PA0105

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R18-oth-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

R17-X000 Change to representative recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R17-oth-X000

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

PA0302 Request for accelerated examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D17-exm-PA0302

St.27 status event code: A-1-2-D10-D16-exm-PA0302

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

T11-X000 Administrative time limit extension requested

St.27 status event code: U-3-3-T10-T11-oth-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

St.27 status event code: A-1-2-D10-D22-exm-PE0701

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

St.27 status event code: A-2-4-F10-F11-exm-PR0701

PR1002 Payment of registration fee

St.27 status event code: A-2-2-U10-U12-oth-PR1002

Fee payment year number: 1

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 4

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 5

U11 Full renewal or maintenance fee paid

Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: A-4-4-U10-U11-OTH-PR1001 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE)

Year of fee payment: 5