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JP2020143084A - 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート - Google Patents

治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート Download PDF

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JP2020143084A
JP2020143084A JP2020080945A JP2020080945A JP2020143084A JP 2020143084 A JP2020143084 A JP 2020143084A JP 2020080945 A JP2020080945 A JP 2020080945A JP 2020080945 A JP2020080945 A JP 2020080945A JP 2020143084 A JP2020143084 A JP 2020143084A
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antibody
urease
conjugate
pharmaceutical composition
cancer
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チャオ ヘマン
Heman Chao
チャオ ヘマン
ヤウ ウオング ワフ
Wah Yau Wong
ヤウ ウオング ワフ
ティアン バオミン
Baomin Tian
ティアン バオミン
ジェイン ガスパル キンバリー
Kimberly Jayne Gaspar
ジェイン ガスパル キンバリー
クマル プラベエン
Kumar Praveen
クマル プラベエン
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Helix Biopharma Corp
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Helix Biopharma Corp
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Abstract

【課題】抗体−ウレアーゼコンジュゲートを含む医薬組成物の提供。【解決手段】静脈内注射に適した医薬として許容し得る水性液剤と、非コンジュゲートウレアーゼを実質的に含まない抗体−ウレアーゼコンジュゲートとを含む医薬組成物。抗体−ウレアーゼコンジュゲート、及び該抗体-ウレアーゼコンジュゲートの重量基準で約５％を超えないウレアーゼを含む組成物は、クロマトグラフィー精製を必要としない方法によって調製される。当該医薬組成物は、抗体指示型酵素プロドラッグ療法によるがんの治療における有用性を有しており、ここで、該ウレアーゼはインサイチュで内在性尿素をアンモニアへと変換し細胞傷害性を誘導する。【選択図】なし

Description

(関連出願の相互参照)
本出願は、2015年1月23日出願の米国仮特許出願第62/107,210号の出願日の利益を主張
する。該出願は、本明細書に引用により組み込まれている。
(配列表)
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されており、その全体が引用により本明
細書に組み込まれている配列表を含んでいる。該ASCIIコピーは、2016年1月14日に作成さ
れ、105013-1610_SL.txtという名前であり、サイズが11,000バイトである。
(発明の分野)
本件開示は、治療的有用性を有する抗体-ウレアーゼコンジュゲートを提供する。より
詳細には、本開示は、ウレアーゼにコンジュゲートした1以上の抗体を有する治療用コン
ジュゲート、その組成物、使用、及び調製物に関する。
(背景)
ウレアーゼは、尿素の二酸化炭素及びアンモニアへの加水分解を触媒する酵素である。
具体的には、ウレアーゼは、尿素の加水分解を触媒して、アンモニア及びカルバメートを
生成させ、生成したカルバメートは、それに続き、自発的加水分解により分解され、別の
アンモニア及び炭酸を生成する。この点において、ウレアーゼ活性は、ウレアーゼが一般
毒性を有する塩基性分子であるアンモニアを生成させる局所的環境のpHを増加させる傾向
がある。
がんの治療において腫瘍関連抗原を標的とするよう抗体を用いる概念は、しばらくの間
高く評価されている(Herlynらの文献(1980) Cancer Research 40, 717)。しかしながら、
ウレアーゼに関しては、有毒な成分は、尿素の酵素分解によって生成するアルカリ性の環
境であり、高親和性抗体断片が採用されている。
(発明の概要)
本技術は、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを対象とする。本技術は、静脈内注射に適
した医薬として許容し得る水性液剤と、ウレアーゼを実質的に含まない抗体-ウレアーゼ
コンジュゲートとを含み、非コンジュゲート抗体を含まず、かつ/又は非水性HPLC溶媒を
含まない医薬組成物を提供する。
いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部
分が3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する。
いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分
が約6個以上であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コ
ンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が6、7、8、9、10、11、又は12個
であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲート
は、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲー
ション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分
1個あたり、抗体部分が約6個以上の平均コンジュゲーション比率を有する。いくつかの態
様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約8〜11個で
ある平均コンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記ウレアーゼは
、タチナタマメウレアーゼである。
いくつかの態様において、前記抗体は、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である。いくつかの
態様において、前記抗体の分子量は、約5kDa〜約200kDaである。いくつかの態様において
、前記抗体の分子量は、約5kDa〜約50kDaである。いくつかの態様において、前記抗体は
、単一ドメイン抗体である。いくつかの態様において、前記単一ドメイン抗体は、110ア
ミノ酸残基を超えないか、又は約90〜130アミノ酸残基のサイズを有する。いくつかの態
様において、前記単一ドメイン抗体の分子量は、約10kDa〜約50kDaである。いくつかの態
様において、前記単一ドメイン抗体の分子量は、約12kDa〜約15kDaである。いくつかの態
様において、前記抗体は、抗原、腫瘍細胞に対する特異性を有する。いくつかの態様にお
いて、前記抗体は、非小細胞性肺癌により発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する。
いくつかの態様において、前記抗体は、CEACAM6に対する特異性を有する。
いくつかの態様において、前記抗体は、Kd値が約1×10-6Mを超えるCEACAM6に対する結
合親和性を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、Kd値が約1×10-8M
を超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記コンジ
ュゲートは、Kd値が約1×10-10Mを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつ
かの態様において、前記コンジュゲートは、IC50値が約5nMを超えないCEACAM6に対する結
合親和性を有する。いくつかの態様において、前記IC50値は、約3nM〜約5nMである。いく
つかの態様において、前記IC50値は、約3.22nMである。いくつかの態様において、前記コ
ンジュゲートは、約10μg/mL〜約30μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合する。いくつかの態
様において、前記コンジュゲートは、約20μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合する。
いくつかの態様において、前記抗体は、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチド
を含む。いくつかの態様において、前記抗体は、前記配列番号1のアミノ酸配列に対する
少なくとも1つの改変を含むポリペプチドを含む。
本技術は、それを必要としている対象においてがんを治療する方法であって、該対象に
、治療的有効量の本明細書において提供される組成物を投与することを含み、それにより
、該対象におけるがんを治療する、前記方法を提供する。
いくつかの態様において、前記がんは、非小細胞性肺癌、乳がん、膵臓がん、卵巣がん
、肺がん、結腸がん、又はそれらの組合せのうちの1つ以上である。いくつかの態様にお
いて、前記がんは、非小細胞性肺癌である。いくつかの態様において、前記対象は、ヒト
である。
本技術は、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを含み、ウレアーゼを実質的に含まない組
成物を調製する方法であって、活性化された抗体及びウレアーゼを約6.0〜7.0、例えば、
約6.5のpHを有する水性緩衝液中で混ぜ合わせること、該pHを、8.0〜9.0、例えば、約8.3
へと調整して、該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成させること、及び該抗体-ウレア
ーゼコンジュゲートを精製することを含み、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、固定化金属アフィニテ
ィークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、固液吸着クロマト
グラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、逆相クロマトグラフィー(RPC)、
及び高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などを含む、タンパク質精製のためによく使用さ
れるクロマトグラフィー法などのクロマトグラフィー精製工程を含まない、前記方法を提
供する。いくつかの態様において、抗体-ウレアーゼコンジュゲートは、ウルトラダイア
フィルトレーションによって精製される。
いくつかの態様において、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個
あたり、抗体部分が8〜11個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様に
おいて、約6.5のpHを有する前記緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液である。いくつかの態
様において、前記pHは、ホウ酸ナトリウム溶液の添加を含む方法によって、約8.3へと調
整される。
本技術は、腫瘍抗原に対する抗体結合親和性を上昇させる方法であって、複数の該抗体
分子を、1つのウレアーゼ分子にコンジュゲートさせて、抗体-ウレアーゼコンジュゲート
を形成させることを含み、該コンジュゲートが、前記非コンジュゲート抗体よりも少なく
とも約100倍高い該腫瘍抗原に対する結合親和性を有する、前記方法を提供する。
いくつかの態様において、前記抗体は、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である。いくつかの
態様において、前記抗体は、単一ドメイン抗体である。いくつかの態様において、前記腫
瘍抗原は、非小細胞性肺癌により発現されるものである。いくつかの態様において、前記
抗体は、CEACAM6に対する特異性を有する。
本技術はさらに、本明細書において提供される組成物、及び該組成物の使用のための説
明書を含むキットを提供する。
本開示のこれらの態様及び他の態様を、以下でさらに説明する。
(図面の簡単な説明)
図1A及び1Bは、がん細胞株におけるL-DOS47の例示的な結合及び細胞傷害性研究を示す。(A)5つのがん細胞株:BxPC-3、Capan-1、ZR-75-30、LS174T、及びMDA-MB231へのL-DOS47の直接的な結合。結合シグナルは、20mM尿素とのインキュベーション時に生じたアンモニアの量によって表された。BxPC-3(●)、Capan-1(▼)、及びZR-75-30(◆)細胞において良好なL-DOS47結合が観察されたのに対して、LS174T細胞(▲)においては中程度の結合が観察され、MDA-MB231細胞(■)においては結合は見られなかった。加えて、対応する細胞株(データは示していない)に対して非コンジュゲートDOS47対照を用いた場合には結合が観察されず、L-DOS47結合が特異的であり、抗体部分がそれに寄与していることを示唆した。(B)20mM尿素の添加時にがん細胞株に対しL-DOS47により胞傷害性が誘導された。MDA-MB231細胞(■)において効果は観察されず、結合研究と一致した。BxPC-3(●)及びZR-75-30(◆)が、L-DOS47に対する高い感受性を有するのに対し、Capan-1(▼)及びLS174T細胞(▲)では、中程度の効果のみが見られた。
図2A及び2Bは、BxPC-3細胞に対する、L-DOS47、DOS47、及びAFAIKL2抗体の例示的な直接的かつ競合的な結合を示す。(A)ルテニウムタグ化L-DOS47、AFAIKL2抗体、及び非コンジュゲートDOS47の、BxPC-3細胞への結合。電気化学発光アッセイは、BxPC-3細胞に結合するL-DOS47及びAFAIKL2抗体の直接的な測定を提供する。AFAIKL2抗体(▲)では弱い結合シグナルが観察されたのに対して、L-DOS47は、抗体コンジュゲート上に提示された複数のAFAIKL2抗体のアビディティーのために、それよりもかなり強力な結合シグナル(●)を示した。陰性対照DOS47(◇)では結合は観察されなかった。(B)BxPC-3細胞に対するL-DOS47-タグの結合を、L-DOS47、AFAIKL2抗体、又はDOS47のいずれかと競争させた。L-DOS47及びAFAIKL2抗体双方の見かけの結合親和性は、被験物のIC50(結合の50％の減少を引き起こすのに必要とされる競合剤の量)によって比較可能である。L-DOS47(●)及びAFAIKL2抗体(▲)のIC50は、それぞれ、2及び20μg/mL(又は3.22nM及び1.55μM)と推定された。このことは、L-DOS47の結合親和性が、AFAIKL2抗体のそれの約500倍であることを示している。陰性対照DOS47(◇)では、阻害は観察されなかった。結果は、代表的な実験の平均(n=3)を示す。
図3A〜図3Cは、CEACAM6遺伝子の例示的な過剰発現及びノックダウンを示す。(A)CEACAM6でトランスフェクトされたH23細胞に対するL-DOS47の結合。トランスフェクトされた細胞株の集団(▲)を、増加した量の選択用抗生物質と共に、FACS細胞選別によって濃縮した。天然のH23細胞(○)及びA549細胞(△)のものと比較した結合プロファイルでは、CEACAM6が、A549細胞でのものを下回るレベルで、トランスフェクトされた細胞において発現していたことが示された。(B)CEACAM6でトランスフェクトされたH23細胞に対するL-DOS47の細胞傷害性アッセイ。BxPC-3(●)、A549(△)、及び天然のH23(○)細胞と比較して、H23細胞におけるCEACAM6の過剰発現(▲)は、それらのL-DOS47細胞傷害性に対する感受性を大きく上昇させた。興味深いことに、トランスフェクトされたH23細胞は、(A)において観察されたL-DOS47結合がより弱いにもかかわらず、A549及びBxPC-3細胞の双方よりもL-DOS47細胞傷害性に対して高い感受性を有していた。(C)CEACAM6遺伝子がノックダウンされたBxPC-3細胞に対するL-DOS47の結合。天然(●)及び対照(HUSH-TR3▲)BxPC-3細胞において、良好な結合シグナルが観察された。しかしながら、CEACAM6遺伝子が、shRNA(HUSH#6▼及びHUSH#7△)によってサイレンシングされるにつれて、L-DOS47結合は失われた。このことは、CEACAM6が、抗体コンジュゲートによって認識されている表面抗原であることを示している。結果には、代表的な実験の平均(n=3)が示されている。標準偏差(SD)は、全ての値について10％未満であった。
図4は、ヒト結腸及び肺腺癌のL-DOS47での免疫組織化学的染色を示す。陽性染色を、暗色で示した。
図5は、AFAIKL2抗体のアミノ酸配列(配列番号:1)を示す。
図6は、2工程反応によるL-DOS47コンジュゲート産物の合成を例示する。工程1は、SIABを用いる抗体の活性化であり、工程2は、活性化された抗体のウレアーゼ酵素とのコンジュゲーションによるバイオコンジュゲートL-DOS47の形成を伴う。
図7は、製剤ブランク、AFAIKL2、高純度ウレアーゼ(HPU)、及びコンジュゲートL-DOS47の例示的なサイズ排除クロマトグラムを示す。各構成成分の二量体の非常に小さなピークが、各モノマーピークの前に出現する。製剤ブランクは、10mMヒスチジン、1％スクロース、0.2mM EDTAを含有し、pH6.8である。
図8は、製剤ブランク(A)、L-DOS47(B)、並びに2.4％(C)、4.8％(D)、及び7.2％(E)のHPウレアーゼ(HPU)でスパイクされたL-DOS47の例示的なイオン交換クロマトグラムを示す。製剤ブランクは、10mMヒスチジン、1％(w/v)スクロース、0.2mM EDTAを含有し、pH6.8である。
図9は、Experion SDSウィンドウの例示的なスナップショットを示す。パネル1:レーン2及び4の電気泳動図のオーバレイ。パネル2:レーンL、分子量(MW)ラダー;レーン1、2、7、及び8:追加のIEC精製を受けた活性化されたAFAIKL2を用いて製造されたL-DOS47;レーン3〜6:追加のIECを受けていないAFAIKL2を用いて製造されたL-DOS47;レーン9及び10、HPU。パネル1において、x軸上のパネル1における数2〜14は、レーンの1電気泳動図のピーク番号である;3*は、内部MW標準のための最低分子量マーカーピークを示し、14*は、内部MW標準のための最高MWマーカーピークを示す。
図10は、0〜4抗体分子と連結されたウレアーゼサブユニットの個々に分離したピークを示す、L-DOS47の例示的な電気泳動図(図9のレーン2)を示す。x軸上の番号1〜11は、ピーク番号である;3*は、内部MW標準のための最低分子量マーカーピークを示し、11*は、内部MW標準のための最高MWマーカーピークを示す。
図11は、L-DOS47の結合活性に対するコンジュゲーション比率の例示的な効果を示す。L-DOS47を、異なる抗体コンジュゲーション比率(1.8〜12)で調製した。固定化CEACAM6-A分子へのL-DOS47サンプルの直接的な結合を決定した。
図12は、AFAIKL2、ウレアーゼ、及びL-DOS47の例示的なウエスタンブロットを示す。左パネル:L-DOS47、ウレアーゼ、及びAFAIKL2のゲル電気泳動(クーマシーブルーで染色)。中央のパネル:抗AFAIKL2抗体で探索されたAFAIKL2、ウレアーゼ、及びL-DOS47のウエスタンブロット(標準的な負荷及び5倍の過負荷)。右パネル:抗ウレアーゼ抗体で探索されたAFAIKL2、ウレアーゼ、及びL-DOS47のウエスタンブロット(標準的な負荷及び5倍の過負荷)。差し込まれたボックス:L-DOS47の拡大図。
図13は、420nmでのAFAIKL2-Cys-FLのトリプシン消化物の例示的なRP-HPLCクロマトグラムを示す。同定されたコンジュゲートしたペプチド及びそれらのペプチド質量を、対応するHPLCピークに示した。
図14は、がん細胞株BxPC-3、A549、及びMCF7に対する例示的なL-DOS47の直接的な結合を示す。結合シグナルは、20mM尿素とのインキュベーション時に生じたアンモニアの量によって示した。上昇したL-DOS47結合が、BxPC-3(●)において観察されたのに対して、A549細胞(▲)では中程度の結合が観察され、MCF7細胞(▼)では結合は見られなかった。加えて、対応する細胞株(○、△、▽)における非コンジュゲートDOS47対照では、結合は見られず、L-DOS47結合が、BxPC-3及びA549細胞に対して特異的であったことを示唆している。
図15は、20mM尿素の添加時のBxPC-3及びA549細胞に対するL-DOS47誘導性細胞傷害性の例を示す。MCF7細胞(▼)において効果は観察されなかった。BxPC-3(●)は、L-DOS47に対する高い感受性を有しているのに対して、A549細胞(▲)においては中程度の効果のみが観察された。加えて、非コンジュゲートDOS47対照では対応する細胞株(○、△、▽)に対する結合は観察されなかった。グラフの結果は、代表的な実験の平均(n=3)を示す。標準偏差(SD)は、全ての値について10％未満であった。
(詳細な説明)
本開示は、記載された特定の態様や実施態様に限定されないと理解されるべきであり、
そのために勿論変化し得る。また、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ
限定されるものであるので、本明細書で使用される術語は、特定態様や実施態様を説明す
るのみのためのものであり、限定を意図するものではないことも理解すべきである。
本開示の詳細な説明は、読み手の便益のみのために種々のセクションに分割されており
、任意のセクションにみられる開示を、別のセクションのものと組み合わせてもよい。別
途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属
する分野における通常の知識を有するものにより通常理解されるものと同じ意味を有する
。
(定義)
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「一つの(a)」、「一つの(an)
」、及び「該(the)」は、文脈により、そうでないことが明確に指示されない限り、複数
の指示物を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「1つの化合物(a comp
ound)」への言及は、複数の化合物も含む。
本明細書で使用される用語「約」は、例えば、温度、時間、量、濃度などの、範囲を含
む数値指定の前に用いられる場合、記載された値の(+)又は(-)10％、5％、又は1％変化し
得る近似値を示す。
本明細書で使用される用語「投与」は、一回用量で、連続的にもしくは断続的に、又は
全体として一回用量を提供するいくつかの副用量で達成することができる。投薬は、治療
の過程の始めから終わりまで行うことができる。投与の最も効果的な手段及び投薬量を決
定する方法は、当業者に公知であり、療法のために使用される組成物、該療法の目的、治
療されている標的細胞、及び治療されている対象に応じて変化するものである。単回又は
複数回の投与を、治療を行っている医師によって選択される用量レベル及びパターンで実
施することができる。該薬剤を投与する適当な投薬製剤及び方法は、当技術分野において
公知である。投与の経路も決定することができ、最も効果的な投与の経路を決定する方法
は、当業者に公知であり、治療のために使用される組成物、該治療の目的、治療されてい
る対象の健康状態又は疾患のステージ、及び標的細胞又は組織に応じて変化するものであ
る。投与の経路の非限定的な例としては、経口投与、経膣、経鼻投与、注射、外用、舌下
、経肺、及び坐剤によるものが挙げられる。
本明細書で使用される用語「親和性」は、レセプターとそのリガンドとの間、例えば、
抗体とその抗原との間の結合の強度を指す。用語「Kd」又は「解離定数」は、抗体と抗原
との間の親和性、すなわち、抗体が、どの程度しっかりと特定の抗原に結合するかを指す
。用語「IC50」又は「最大半量阻害濃度」は、試験物の結合を50％低減させるのに必要と
される競合剤の量を表す。
本明細書で使用される用語「アミノ酸」は、所望の機能的性質が、ポリペプチドによっ
て維持される限り、天然アミノ酸及び合成アミノ酸の双方などを含むL-アミノ酸もしくは
D-アミノ酸、又はそれらの混合物を指す。ペプチド配列の始めに用いられる場合、NH2は
、ポリペプチドのアミノ末端(又はN-末端)に存在する遊離のアミノ基を指す。COOHは、ペ
プチド配列の最後に用いられる場合、ポリペプチドのカルボキシ末端(又はC-末端)に存在
する遊離のカルボキシ基を指す。アミノ酸残基のための標準的なポリペプチド略号は以下
のとおりである:A(Ala又はアラニン);C(Cys又はシステイン);D(Asp又はアスパラギン酸);
E(Glu又はグルタミン酸);F(Phe又はフェニルアラニン);G(Gly又はグリシン);H(His又はヒ
スチジン);I(IIe又はイソロイシン);K(Lys又はリジン);L(Leu又はロイシン);M(Met又はメ
チオニン);N(Asn又はアスパラギン);P(Pro又はプロリン);Q(Gln又はグルタミン);R(Arg又
はアルギニン);S(Ser又はセリン);T(Thr又はトレオニン);V(Val又はバリン);W(Trp又はト
リプトファン);X(Xaa又は不明又はその他);Y(Tyr又はチロシン);Z(Glx/Gln/Glu又はグル
タミン酸/グルタミン);及びDpr(2,3-ジアミノプロピオン酸)。本明細書中に式により示さ
れるアミノ酸残基配列は全て、アミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向に、左から
右への配向性を有する。アミノ酸残基配列の始め又は終わりのダッシュは、1以上のアミ
ノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合を示すか、又はNH2もしくはアセチルなどのア
ミノ末端基又はCOOHなどのカルボキシ末端基への共有結合を示す。
本明細書で使用される用語「を含む(comprising)」又は「を含む(comprises)」は、組
成物及び方法が、記載された要素を含むが、他のものを排除しないことを意味することが
意図される。「から本質的になる」は、組成物及び方法を定義するのに用いられた場合、
記載された目的のための組合せに対し何らかの非常に重要な意義のある他の要素を排除す
ることを意味するべきである。従って、本明細書において定義されるような要素から本質
的になる組成物又はプロセスは、本開示の基礎的かつ新規の特徴に影響を実質的に及ぼさ
ない他の材料も工程も排除しない。「からなる」は、微量要素を超える他の成分及び実質
的な方法の工程を排除することを意味するものである。これらの移行句(transition term
)の各々により定義される実施態様は、本件開示の範囲内である。
本明細書で使用される用語「活性薬剤」、「薬物」、及び「薬理学的に活性な薬剤」は
、本明細書において互換的に使用され、対象に投与された場合に、所望の薬理的効果を誘
導する化学的な材料又は化合物を指し、放射性核種、薬物、抗がん剤、毒素などを含む治
療剤を含むことが意図される。例示的な活性薬剤は、抗体ウレアーゼコンジュゲートであ
る。
本明細書で使用される用語「抗体」は、抗原に対する結合親和性を有するペプチド、ポ
リペプチド、又はタンパク質を指す。典型的な抗体構造ユニットは、テトラマーを含む。
各々のテトラマーは、ポリペプチド鎖の同一の2つのペアから構成され、各々のペアは1本
の「軽」鎖及び1本の「重」鎖を有する。各々の鎖のN-末端は、主に抗原認識を担当する
約100〜110又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。「可変軽鎖」(VL)及び「可変
重鎖」(VH)という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。抗体は、インタクトな
免疫グロブリンとして、又はそれ自体がジスルフィド結合によりVH-CH1に連結された軽鎖
であるFabの二量体であるF(ab)’2、もしくはヒンジ領域におけるジスルフィドによる連
結の破壊の結果生じるFab’モノマーなどの断片として存在する。Fab’モノマーは本質的
に、ヒンジ領域の一部を伴うFabである(他の抗体断片のより詳細な説明については、Fund
amental Immunology, W. E. Paul編, Raven Press, N.Y. (1993)を参照されたい)。抗体
断片は、例えば、種々のペプチダーゼ(peeptidases)によるインタクトな抗体の消化によ
って製造することができ、化学的にか又は組換えDNA方法体系を利用することによってか
のいずれかで新たに合成することができる。従って、本明細書で使用される「抗体」とい
う用語はまた、抗体の修飾によって製造されたか、又は組換えDNA方法体系を用いて新た
に合成されたかのいずれかの抗体断片を含む。抗体には、VH及びVLが一緒に(直接的に、
又はペプチドリンカーを介して)連結されて連続するポリペプチドを形成している単鎖Fv(
sFv)抗体を含む単鎖抗体が含まれる。
本明細書で使用される用語「単一ドメイン抗体」(sdAb又は「VHH」)は、この種類の抗
体の単一重鎖可変ドメインを指し、かつ、いくつかの態様においては、生来軽鎖を欠くラ
クダ科の哺乳動物においてみられる。いくつかの態様において、該単一ドメイン抗体は、
VH領域、VHH領域、又はVL領域に由来し得る。いくつかの態様において、該単一ドメイン
抗体は、ヒト起源のものである。いくつかの態様において、該ヒト単一ドメイン抗体は、
引用によりその全体が本明細書中に組み込まれているWO2006/099747、及びWO2009/079793
、及びWO2012/100343に開示されている重鎖又は軽鎖配列を含む。一態様において、前記
ヒト単一ドメイン抗体は、WO2012/100343に述べられているような、フレームワーク領域
内にジスルフィド結合を有する重鎖又は軽鎖配列を含む。
本明細書で使用される用語「抗体断片」はまた、特異的抗原に結合して複合体を形成す
ることにより抗体のように作用する任意の合成の又は遺伝子操作されたタンパク質を含む
。
本明細書で使用される用語「コンジュゲート」は、共有結合的に連結されてより大きな
構築体を形成している2つ以上の分子を指す。一態様において、この2つの分子は、直接的
な連結によって連結されており、ここで、アスパラギン酸又はグルタミン酸のカルボキシ
ル官能基に結合するリジンのアミノ官能基のように、ウレアーゼ上の反応性官能基が、抗
体上の相補的な反応性官能基に結合する。このような反応には、カルボキシル基の従来の
修飾によりそれをより反応性のものとすることが必要となり得ることが理解されよう。別
の態様において、前記2つの分子は、リンカー部分を介して連結されている。
本明細書で使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、又は「ペプチド」は、
本明細書で使用される場合、互換的に言及される。タンパク質は、そのサブユニット配列
によって表される一次構造を有しており、かつ2次的ならせん状又はひだ状の構造、及び
全体的な三次元的構造を有し得る。一般的には、「タンパク質」は、比較的大きなポリペ
プチド、例えば、100個以上のアミノ酸を含有するものを指し、「ペプチド」は、より小
さなポリペプチドを指すが、これらの用語は、本明細書においては互換的に使用される。
即ち、「タンパク質」という用語が、より大きなポリペプチドを指すことも、より小さな
ペプチドを指すこともあり、逆もまた同じである。
本明細書で使用される用語「ターゲティング部分」は、規定された細胞集団又は選択さ
れた細胞型に結合する分子を指す。該ターゲティング部分は、該標的細胞または細胞集団
上にか、又はそれらの内部に存在するレセプター、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原
決定基、又は他の結合部位に結合し得る。例示的なターゲティング部分は、抗体である。
発現された抗原を認識することができる抗体断片及び小ペプチド配列もまた、想定される
ターゲティング部分である。
本明細書で使用される用語「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」又は「
治療(treatment)」は、本明細書で使用される場合、疾患もしくは状態、又はその1つ以上
の症状を軽減すること、やわらげること、又は改善すること、さらなる症状を予防するこ
と、症状の根底にある代謝的な原因を改善すること又は予防すること、疾患又は状態を阻
止すること、例えば、疾患又は状態の進展を停止させること又は抑制すること、疾患又は
状態を緩和すること、疾患又は状態の退縮(regression)を引き起こすこと、疾患又は状態
によって引き起こされた状態を緩和すること、又は疾患又は状態の症状を抑制することを
含み、かつ予防法を含むことが意図される。この用語はまた、疾患又は状態を緩和するこ
と、例えば、臨床症状の退縮を引き起こすことを含む。この用語はさらに、治療的利益及
び/又は予防的利益を達成することを含む。治療的利益は、治療されている根底にある障
害の根絶又は改善を意味する。また、治療的利益は、個体が、根底にある障害になおさい
なまれているものの、該個体における向上が観察されるような、該根底にある障害に伴う
生理学的な症状のうちの1つ以上の根絶又は改善とともに達成される。
用語「対象」、「個体」、及び「患者」は、本明細書において互換的に使用され、治療
の任意の標的を指す。また、腫瘍細胞をインサイチュで、それらの通常の位置(position)
もしくは場所(location)で、例えば、乳房腫瘍もしくは前立腺腫瘍の新生細胞で治療する
方法が、本技術によって提供される。これらのインサイチュの腫瘍は、多様な宿主;例え
ば、ヒト宿主、イヌ宿主、ネコ宿主、ウマ宿主、ウシ宿主、ブタ宿主などの内部又はそれ
の表面に位置し得る。腫瘍又は腫瘍細胞がみられる任意の宿主を治療することができ、か
つ本技術に従う。従って、対象には、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒ
トが含まれる。
本明細書で使用される用語、粒子を「実質的に含まない」は、粒子を完全に欠くか、又
は粒子をほとんど完全に欠いており、効果があたかも粒子を完全に欠いている場合のもの
と同じであるかのいずれかであり得る。言い換えれば、成分又は要素を「実質的に含まな
い」組成物は、測定可能なそれらの効果が存在しない限りは、実際にはそのような項目を
含有していてもよい。特に記載しない限り、用語「実質的に」は、約90％超、約95％超、
約96％超、約97％超、約98％超、又は約99％超を意味する。いくつかの実施態様において
、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートを含む組成物は、非コンジュゲートウレアーゼを
実質的に含まず、これは、該組成物が、約90％超の抗体-ウレアーゼコンジュゲート、約9
5％超の抗体-ウレアーゼコンジュゲート、約96％超の抗体-ウレアーゼコンジュゲート、
約97％超の抗体-ウレアーゼコンジュゲート、約98％超の抗体-ウレアーゼコンジュゲート
、又は約99％超の抗体-ウレアーゼコンジュゲートを含有することを意味する。言い換え
れば、該組成物は、約0.1％未満の非コンジュゲートウレアーゼ、約0.5％未満の非コンジ
ュゲートウレアーゼ、約1％未満の非コンジュゲートウレアーゼ、約2％未満の非コンジュ
ゲートウレアーゼ、約3％未満の非コンジュゲートウレアーゼ、約4％未満の非コンジュゲ
ートウレアーゼ、約5％未満の非コンジュゲートウレアーゼ、又は約10％未満の非コンジ
ュゲートウレアーゼを含有する。用語「非コンジュゲートウレアーゼ」は、抗体にコンジ
ュゲートしていないウレアーゼを指す。
本明細書で使用される用語「ウレアーゼ」は、天然に存在するか、又は例えば、組換え
核酸技術及び/もしくは化学合成によって得られるかのいずれかの、尿素アミドヒドラー
ゼ(E.C.3.5.1.5)の酵素活性を有する酵素を指す。ウレアーゼはまた、完全なウレアーゼ
、そのサブユニット、もしくはその断片、及び/又はポリペプチドの尿素アミドヒドラー
ゼ活性を保存するアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を伴うウレアーゼを含む融合タン
パク質を含む。
本明細書で使用される用語「DOS47」は、精製されたウレアーゼを指す。
(抗体-ウレアーゼコンジュゲーション)
本技術は、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを対象とする。本技術は、静脈内注射に適
した医薬として許容し得る水性液剤と、ウレアーゼを実質的に含まない抗体-ウレアーゼ
コンジュゲートとを含み、非コンジュゲート抗体を含まず、かつ非水性HPLC溶媒を含まな
い医薬組成物を提供する。非水性HPLC溶媒としては、メタノール、アセトニトリル、トリ
フルオロ酢酸などの、分取HPLC又はHPLC精製においてよく使用される有機溶媒が挙げられ
る。いくつかの態様において、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートは、リン酸緩衝液由
来のリン酸塩を実質的に含まない。いくつかの態様において、10mMのリン酸塩、50mMのNa
Clを含有しpHが7.0のリン酸緩衝液が、SEC精製のために使用される。いくつかの態様にお
いて、抗体-ウレアーゼコンジュゲートの工業的生産において、HPLC精製を行うことはな
い。
いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部
分が約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個であ
るコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、
ウレアーゼ部分1個あたり抗体部分が約6、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲ
ーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部
分1個あたり抗体部分約8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する
。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部
分が約6個以上の平均コンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記
コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約8、9、10、又は11個である
平均コンジュゲーション比率を有する。
いくつかの態様において、連結は、共有結合又は直接的な連結であり、ここで、例えば
、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のカルボキシル(COOH)官能基に結合する、例えば
、リジンのアミノ(NH2)官能基、又はシステインのスルフヒドリル(SH)などの、ウレアー
ゼ上の反応性官能基が、抗体上の相補的な反応性官能基に結合する。このような反応には
、カルボキシル基の従来の修飾によりそれをより反応性のものとすることが必要となり得
ることが理解されよう。
前記反応性の官能基は、シュウ酸、コハク酸などの同じものとすることができるか、又
はアミノ(これは、コンジュゲーション後NHとなる)及びカルボキシル(これは、コンジュ
ゲーション後COもしくはCOOとなる)基などのオルソゴナルな(orthogonal)官能基とするこ
とができる。あるいは、前記抗体及び/又はウレアーゼを誘導体化して、追加の反応性官
能基を露出させるか又は取りつけてもよい。該誘導体化は、Pierce Chemical Company, R
ockford Illから利用可能なものなどの、いくつかのリンカー分子のうちのいずれかの取
り付けを伴い得る。
本明細書で使用される「リンカー」は、ターゲティング部分の活性薬剤への連結、例え
ば、抗体のウレアーゼへの連結に用いられる分子である。該リンカーは、ターゲティング
部分及び活性薬剤の双方に対し共有結合を形成することができる。適当なリンカーは、当
業者に周知されており、直鎖又は分岐鎖炭素リンカー、ヘテロ環状炭素リンカー、又はペ
プチドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。ターゲティング部分及び活性薬
剤分子がポリペプチドである場合には、前記リンカーは、それらの側基を介して構成アミ
ノ酸に(例えば、ジスルフィドによる連結を介してシステインに)連結されていてもよい。
好ましい態様において、前記リンカーは、末端アミノ酸のアルファ炭素アミノ基及びカル
ボキシル基に連結される。いくつかの態様において、前記連結は、前記ウレアーゼ及び前
記抗体の双方と、それが反応することを可能とする、カルボキシ又はアミノなどの2つ以
上の官能基を有するリンカーを介するものである。リンカーは、当技術分野において周知
されており、典型的には、炭素、窒素、水素、酸素、硫黄などを含む1〜20個の原子を含
む。
ウレアーゼ上の基との反応性を有する1つの官能基及び抗体との反応性を有する別の基
を有する二官能性リンカーを用いて、所望のイムノコンジュゲートを形成してもよい。あ
るいは、誘導体化は、ターゲティング部分の化学的処理、例えば、遊離のアルデヒド基を
生じさせる過ヨウ素酸塩を用いる糖タンパク質抗体の糖部分のグリコール開裂を伴ってい
てもよい。抗体上の該遊離のアルデヒド基を、薬剤上の遊離のアミン又はヒドラジン基と
反応させて、該薬剤をそれに結合させてもよい(米国特許第4,671,958号を参照されたい)
。抗体又は抗体断片などのポリペプチド上に遊離のスルフヒドリル基を生じさせる手順も
公知である(米国特許第4,659,839号を参照されたい)。
他のリンカー分子及びその使用としては、例えば、欧州特許出願第188,256号;米国特許
第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号;第4,680,338号;第4,569
,789号;及び第4,589,071号;並びにBorlinghausらの文献(1987) Cancer Res. 47: 4071-40
75)に記載されているものが挙げられる。
いくつかの態様において、前記連結は、標的部位においてか又はその近傍において開裂
可能であり、前記コンジュゲート分子がその標的部位へと到達したときに、前記ウレアー
ゼが、ターゲティング部分から解放される。前記連結を開裂してターゲティング部分から
ウレアーゼを放出することは、酵素活性によってか、又は標的細胞の内部でか、もしくは
標的部位の近傍でのいずれかで前記コンジュゲートが曝されている条件によって促され得
る。いくつかの態様において、腫瘍部位に存在する条件下(例えば、腫瘍関連酵素又は酸
性のpHに曝された場合に)で開裂可能なリンカーを用いてもよい。
開裂可能なリンカーとしては、例えば、米国特許第4,618,492号;第4,542,225号、及び
第4,625,014号に記載されているものが挙げられる。これらのリンカー基からの活性薬剤
の放出の機構としては、例えば、感光性の結合の照射及び酸を触媒とする加水分解が挙げ
られる。米国特許第4,671,958号は、例えば、患者の補体系のタンパク質分解酵素によっ
て、インビボで標的部位において開裂されるリンカーを含むイムノコンジュゲートの記述
を含む。いくつかの態様において、適当なリンカーは、アミノ酸の残基又は2個以上のア
ミノ酸からなるペプチドスペーサーである。
いくつかの態様において、適当なリンカーは、R1-L-R2であり、ここでR1及びR2は、同
じ又は異なる官能基であり、そのうちの一方は前記抗体に結合しており、他方はウレアー
ゼに結合している。R1及びR2は、独立して-NH-、-CO-、-COO-、-O-、-S-、 NHNH-、-N=N-
、=N-NH-などから選択することができるが、これらに限定されない。Lは、アルキル鎖な
どの直線状又は分岐鎖状の炭化水素鎖とすることができ、ここで1つ以上の炭素が、任意
に、酸素、窒素、アミド、硫黄、スルホキシド、スルホン、シクロアルキル、ヘテロシク
ロアルキル、アリール、ヘテロアリールなどと置き換えられている。いくつかの態様にお
いて、前記リンカーは、アミノ酸残基又はペプチドとすることができる。ある状況では、
前記リンカーは、標的部位又はその近くで、酵素又はpHの変化によって開裂可能である。
ある種のリンカー及びコンジュゲートを調製するのに適した手順は、米国特許第4,414,14
8号、第4,545,985号、第4,569,789号、第4,671,958号、第4,659,839号、第4,680,338号、
第4,699,784号、第4,894,443号、及び第6,521,431号に記載されている。いくつかの態様
において、前記リンカーは、以下のものである:
Figure 2020143084
 (式中、
Figure 2020143084
 は、前記抗体又はウレアーゼへの結合点を示す)。いくつかの態様において、
Figure 2020143084
 は、抗体のアミノ基への結合点を示し、
Figure 2020143084
 は、ウレアーゼのチオ基のS原子への結合点を示す。このリンカーは、前記抗体及びウレ
アーゼをコンジュゲートするのに連結剤SIAB(N-サクシニミジル(4-ヨードアセチル)アミ
ノベンゾエート)を用いた残基である。いくつかの態様において、ウルトラ精製(ultrapur
ification)が、クロスリンク剤としてSIABを用いるコンジュゲーション法に適した分離法
である。
いくつかの態様において、前記リンカーは、以下の式の連結剤を用いた残基である:
Figure 2020143084
 (式中、Xは、ブロモ又はヨードであり、Lは、本明細書に記載されるようなリンカーであ
る)。
いくつかの態様において、前記連結剤は、SBAP(サクシニミジル 3-［ブロモアセトアミ
ノ］プロピオネート)又はSIA(N-サクシニミジル ヨードアセテート)であり、これらは、S
IABの条件と類似の条件(例えば、HPLCクロマトグラフィー精製が必要ではなく、かつ限外
濾過のみが必要とされ得る)下でコンジュゲーションに使用し得る。いくつかの態様にお
いて、SIABの連結アーム長(10.6アンストロング（Anstrong）)は、SBAP(6.2Å)及びSIA(1
.5Å)のそれよりも、より適している/反射可能(reflexable)である。いくつかの態様にお
いて、前記連結剤は、コンジュゲーションに使用し得る、SPDP(サクシニミジル 3-(ピリ
ジルジチオ)プロピオネート)、SMPT(サクシニミジルオキシカルボニル-メチル-(2-ピリジ
ルジチオ)トルエン)、又はSMCC(サクシニミジル 4-(N-マレイミドメチル) シクロヘキサ
ン-カルボキシレート)であるが、IEC及びエタノール分画などの2以上の分離法が、より低
い収率でのコンジュゲーション反応溶液からの未反応のウレアーゼの分離に必要となる可
能性がある。
さらに、これらに限定されないが、抗がん剤などの治療剤などの追加の成分を前記抗体
に結合させて、治療効果をさらに強化することもできる。
(ウレアーゼ)
いくつかの研究により、進化的に多様な多くの細菌、植物、真菌、及びウイルス由来の
ウレアーゼの遺伝学に関する詳細な情報が提供されている(各々が引用により本明細書中
に組み込まれている、Mobley, H. L. T.らの文献(1995) Microbiol. Rev. 59: 451-480;
Eur J. Biochem., 175, 151-165 (1988); Labigne, A. (1990)、国際公報第WO90/04030号
; Clayton, C. L.らの文献(1990) Nucleic Acid Res. 18, 362;並びに米国特許第6,248,3
30号及び第5,298,399号)。特に興味深いものは、植物にみられるウレアーゼである(Sirko
, A.及びBrodzik, R.の文献(2000) Acta Biochim Pol 47(4): 1189-95)。例示的な植物ウ
レアーゼの1つは、タチナタマメウレアーゼである。他の有用なウレアーゼ配列を、公共
のデータベース、例えば、Entrez(ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)で確認することもできる。
いくつかの態様において、前記ウレアーゼは、タチナタマメウレアーゼである。該タチ
ナタマメウレアーゼは、以下に示す配列番号2のアミノ酸配列を有する:
Figure 2020143084
 。
有用なウレアーゼ配列を、公共のデータベース、例えば、Entrez(http://www.ncbi.nlm
.nih.gov/Entrez/)で確認することもできる。更に、多様な生物由来のウレアーゼを増幅
するのに有用なプライマーを、Baker, K. M.及びCollier, J. L.(http://www.science.sm
ith.edu/departments/Biology/lkatz/NEMEB_webpage/abstracts.html)により記載されて
いるように利用することもでき、又はRoseらの文献(1998) Nucl. Acids Res. 26: 1628に
記載されているように、CODEHOP(コンセンサス縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプラ
イマー)を用いることもできる。
ウレアーゼは、基質である尿素をアンモニア及びカルバメートへと変換することができ
る。この酵素活性は、pHを上昇させ環境をより塩基性とし得る。がん細胞周囲の環境は、
典型的には酸性である(Webb、S.D.らの文献(2001) Novartis Found Symp 240: 169-81)。
従って、このように細胞外の環境のpHを上昇させることにより、がん細胞の増殖が阻害さ
れる。従って、本技術のある態様における抗体-ウレアーゼコンジュゲートの添加は、間
質液のpHを、約0.1pH単位、例えば、0.1〜0.5pH単位又はそれ以上上昇させる。
本技術のウレアーゼには、ウレアーゼの天然に存在する形態、及び機能的に活性なその
バリアントが含まれる。アミノ酸配列バリアントの2つの一般型が想定される。アミノ酸
配列バリアントは、特定のアミノ酸において、ウレアーゼ活性を破壊しない1つ以上の置
換を有するものである。これらのバリアントとしては、天然タンパク質と実質的に相同で
あり、かつ機能的に等価であるサイレントバリアント及び保存的に修飾されたバリアント
が含まれる。天然タンパク質のバリアントは、そのアミノ酸配列の少なくとも約80％、よ
り好ましくは少なくとも約90％、さらにより好ましくは少なくとも約95％、更により好ま
しくは98％、最も好ましくは少なくとも約99％が、天然タンパク質のアミノ酸配列と同一
である場合に、天然タンパク質と「実質的に相同」である。バリアントは、1個もしくは
最大で10個だけ、又はそれ以上のアミノ酸が異なり得る。
第2の種類のバリアントとしては、ウレアーゼの単離された活性な断片である、ウレア
ーゼのサイズバリアントが挙げられる。サイズバリアントは、例えば、化学的修飾により
、タンパク質分解酵素による消化により、又はそれらの組合せにより、ウレアーゼを断片
化させることによって形成してもよい。更に、遺伝子工学的技法、及びアミノ酸残基から
ポリペプチドを直接合成する方法を採用して、サイズバリアントを製造することができる
。
「機能的に等価である」とは、バリアントの配列が、天然のウレアーゼと実質的に同じ
生物活性を有するタンパク質を生じる鎖を規定することを意図している。実質的な配列の
バリエーションを含むこのような機能的に等価であるバリアントも、本技術に包含される
。従って、天然のウレアーゼタンパク質の機能的に等価であるバリアントは、治療的に有
用となるのに十分な生物活性を有することとなる。機能的同等性を決定するための方法が
、当該技術分野において利用可能である。生物活性は、天然のウレアーゼタンパク質の活
性を測定するために特別に設計されたアッセイを用いて測定可能である。更に、生物活性
天然タンパク質に対して産生された抗体を、機能的に等価であるバリアントに結合するそ
れらの能力について試験することができ、ここで、効果的な結合は、天然タンパク質のも
のと類似のコンホメーションを有するタンパク質を表す。
本技術のウレアーゼタンパク質配列は、保存的に置換された配列を含めて、該タンパク
質の精製のための1以上のドメイン(例えば、ポリHisセグメント、FLAGタグセグメントな
ど)を付加させて生じるものなどのより大きなポリペプチド配列の一部として存在し得、
ここで、該追加の機能的ドメインは、タンパク質のウレアーゼタンパク質部分の活性に対
する作用をほとんど有しないか、もしくは全く有しないか、又はここで、該追加のドメイ
ンは、プロテアーゼを用いた処理によるものなどの、合成後加工工程によって除去するこ
とができる。
非機能性配列の付加などの本技術の核酸分子のコードされた活性を変化させない1以上
の核酸又は配列の付加は、基礎となる核酸分子の保存的なバリエーションであり、本技術
のポリペプチドの活性を変化させない1以上のアミノ酸残基の付加は、基礎となるポリペ
プチドの保存的なバリエーションである。このような種類の付加は双方とも、本技術の特
徴である。当業者であれば、開示された核酸構築体の多くの保存的なバリエーションが、
機能的に同一な構築体を生じることを認めるであろう。
マニュアルアラインメント、並びにコンピューター支援配列アラインメント及び分析を
含む多様な配列の関係性を決定する方法を使用し得る。後者のアプローチは、コンピュー
ター支援法によりもたらされる増加した処理量のために、本技術において好ましいアプロ
ーチである。配列アラインメントを行うための多様なコンピュータープログラムが利用可
能であるか、又は当業者によって作成可能である。
上述のように、本技術において採用される核酸及びポリペプチド(並びにそれらの断片)
の配列は、本技術のウレアーゼポリペプチドもしくは核酸分子(もしくはその断片)又は関
連分子の対応する配列と同一である必要はないが、それと実質的に同一(又は実質的類似)
とすることができる。例として、前記ポリペプチドに対し、例えば、そのような変化が、
それらの使用において、例えば、それらの治療的用途又は投与用途においてある種の利点
を提供する場合を含む、保存的又は非保存的のいずれかの、1個以上のアミノ酸又は核酸
の挿入、欠失、及び置換のような種々の変化を行うことができる。
(ターゲティング部分)
ターゲティング部分は、本技術の化学的実体として想定され、がん細胞などの、規定さ
れた、選択された細胞型又は標的細胞集団に結合する。この点において有用であるターゲ
ティング部分は、抗体及び抗体断片、ペプチド、並びにホルモンを含む。公知の細胞表面
レセプター(低密度リポタンパク質、トランスフェリン、及びインスリンを含む)、線維素
溶解酵素、アネキシンなどの血小板結合タンパク質、並びに生物学的応答調節剤(インタ
ーロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン、及びコロニー刺激因子を含む)に対
応するタンパク質もまた、想定されるターゲティング部分である。オリゴヌクレオチド、
例えば、標的細胞核酸の一部に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、本技術にお
けるターゲティング部分として用いてもよい。ターゲティング部分は、標的細胞表面に結
合するオリゴヌクレオチドであってもよい。規定された標的細胞集団に結合する能力を保
持している、上で列記したターゲティング部分の類縁体もまた、ターゲティング部分とし
て用い得る。
上述のターゲティング部分の機能的均等物もまた、本技術のターゲティング部分として
有用である。例示的なターゲティング部分の機能的均等物は、ターゲティング部分の標的
細胞への結合に適切な立体配置及び/又は配向性を模倣するよう設計された有機化学的構
築体である。ターゲティング部分の別の機能的均等物は、ターゲティング部分の結合親和
性を示す短いポリペプチドである。
いくつかの態様において、本開示のターゲティング部分は、標的細胞の表面の抗原と反
応性である抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチドなどである。商業的に利用可能であるか
、文献に記載されているかのいずれかであるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体
の双方を用い得る。該抗体は、全抗体又はそれらの断片であってもよい。モノクローナル
抗体及び断片は、ハイブリドーマ合成、組換えDNA技術、及びタンパク質合成などの従来
技術に従って製造してもよい。有用なモノクローナル抗体及び断片は、任意の種(ヒトを
含む)に由来して得てもよく、2以上の種由来の配列を用いるキメラタンパク質として形成
されてもよい。
いくつかの態様において、前記ターゲティング部分は、ヒト化抗体又は非ヒト抗体であ
る。いくつかの態様において、前記ターゲティング部分は、単一ドメイン抗体である。い
くつかの態様において、前記単一ドメイン抗体(sdAb)又は「VHH」は、生来軽鎖を欠くラ
クダ科の哺乳動物にみられる種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。いくつかの態様
において、前記単一ドメイン抗体は、VH領域、VHH領域、又はVL領域に由来し得る。いく
つかの態様において、前記単一ドメイン抗体は、ヒト起源のものである。いくつかの態様
において、前記ヒト単一ドメイン抗体は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれ
ているWO2006/099747、及びWO2009/079793、及びWO2012/100343に開示されている重鎖又
は軽鎖配列を含む。一態様において、前記ヒト単一ドメイン抗体は、WO2012/100343に述
べられているように、フレームワーク領域内にジスルフィド結合を有する重鎖又は軽鎖配
列を含む。
いくつかの態様において、前記ターゲティング部分(例えば、抗体)は、癌腫、白血病、
リンパ腫、及び肉腫により発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する。癌腫は、肛門、
胆道、膀胱、乳房、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、腎臓、胆
嚢及び胆管、小腸、尿路、卵巣、結腸、非小細胞性肺癌、生殖器、内分泌腺、甲状腺、並
びに皮膚のものであってもよい。いくつかの態様において、前記ターゲティング部分(例
えば、抗体)は、カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、頭部及び頚部腫瘍、原発性腫瘍、
血管腫、黒色腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、並びに脳、神経、眼、及び髄膜の腫瘍によ
り発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する。いくつかの態様において、前記ターゲテ
ィング部分(例えば、抗体)は、癌腫、乳がん、膵臓の、卵巣の、肺、及び結腸がんにより
発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する。いくつかの態様において、前記ターゲティ
ング部分(例えば、抗体)は、非小細胞性肺癌により発現される腫瘍抗原に対する特異性を
有する。
いくつかの態様において、前記抗体は、非小細胞性肺癌により発現される腫瘍抗原に対
する特異性を有する。いくつかの態様において、前記非小細胞性肺癌により発現される腫
瘍抗原は、CEACAM6(癌胎児性抗原関連細胞接着分子6)であり、かつ前記抗体は、CEACAM6
に対する特異性を有する。非特異的交差反応性抗原(NCA)又はCD66cとしても知られるCEAC
AM6は、よくキャラクタリゼーションされたがん抗原である(11、12)。これは、CEACAM1、
CEACAM7、及びCEACAM8などのヒト癌胎児性抗原と高い配列相同性を共有する。これは、グ
リコシルホスホイノシトール(GPI)連結型細胞表面タンパク質であるが、細胞質ドメイン
は知られていない。CEACAM6の発現は、乳房、膵臓、卵巣、肺、及び結腸がん組織におい
て顕著に増加する。その増加した発現は、腫瘍細胞の浸潤性かつ転移性の挙動と関係して
いる(13)。いくつかの態様において、前記抗体は、Kd値が、約1×10-6Mを超えるCEACAM6
に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、Kd値が
、約1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、又は1×10-20Mを超えないCEACAM6に対する結合親
和性を有する。いくつかの態様において、前記抗体は、肺腺癌細胞上のCEACAM6を認識す
る単一ドメインのラクダ科動物抗体断片(AFAIKL2、配列番号1)である。いくつかの態様に
おいて、前記抗体は、図5に示されるような配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチド
を含む。いくつかの態様において、前記抗体は、前記配列番号1のアミノ酸配列に対する
少なくとも1つの改変を含むポリペプチドを含む。いくつかの態様において、前記抗体は
、前記配列番号1のアミノ酸配列に対し少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、及び9
9％の配列相同性を含むポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、CEACAM6抗体は、Santa Cruz Biotechから入手可能な抗CEACA
M6抗体(9A6):sc-59899である。CEACAM6抗体(9A6)は、200μg/mlで提供されるマウスモノ
クローナルIgG1であり、ヒト起源のCEACAM6発現腫瘍細胞株に対して産生されたものであ
る。これは、ヒト起源のCEACAM6の検出用に推奨される。
いくつかの態様において、CEACAM6抗体は、abcamから入手可能な抗CEACAM6抗体(ab5623
4)である。該抗CEACAM6抗体(ab56234)は、CEACAM6に対するウサギポリクローナル性のも
のである。これは、ヒトCEACAM6の内部配列アミノ酸217〜266に対応する合成ペプチド
Figure 2020143084
 内の領域に対して産生された。
いくつかの態様において、CEACAM6抗体は、Novus Biologicalsから入手可能な抗CEACAM
-6/CD66c抗体であり、これは、CEACAM6に対するウサギポリクローナル抗体であり、かつ
ウエスタンブロット及び免疫組織化学-Pで検証された。これは、ヒトCEACAM6の中間領域(
NP_002474)に対する合成ペプチド
Figure 2020143084
 に対して産生された。
いくつかの態様において、CEACAM6抗体は、OriGeneから入手可能な抗CEACAM6抗体EPR44
03であり、これは、CEACAM6に対するウサギモノクローナル抗体(クローンEPR4403)である
。これは、ヒトCEACAM6における残基に対する合成ペプチドに対して産生された。これは
、マウス、ラット、及びヒトのCEACAM6に対する反応性を有する。
いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、IC50値が約10nMを超えないCEACAM6
に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、IC50値
が約5nMを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記
コンジュゲートは、IC50値が約4nMを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する。いく
つかの態様において、前記IC50値は、約3.22nMである。いくつかの態様において、前記コ
ンジュゲートは、約10〜30μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合する。いくつかの態様におい
て、前記コンジュゲートは、約20μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合する。標的抗原に対す
る抗体又はコンジュゲートの結合親和性は、本明細書に記載される方法又は当技術分野に
おいて公知の方法によって決定することができる。いくつかの態様において、本技術は、
この抗CEACAM6-ウレアーゼコンジュゲート(L-DOS47)を記載する。いくつかの態様におい
て、本技術は、抗体-ウレアーゼコンジュゲート、例えば、FAIKL2-ウレアーゼを記載する
。ラマの重鎖抗体レパートリーに由来して得たファージライブラリーを用いて、非小細胞
性肺腺癌A549に対してパンニングすることによって、単一ドメイン抗体(sdAb)を特定する
。該sdAbを、AFAIと名付ける。AFAIの遺伝子配列は、コンジュゲーションの目的のために
最適化され、AFAIKL2と再命名される。いくつかの態様において、該AFAIKL2抗体は、クロ
ーニングされ、大腸菌(E. coli)BL21 (DE3) pT7-7系において発現される。
ヒト化ターゲティング部分は、宿主レシピエントにおける抗体又はポリペプチドの免疫
反応性を減少させることが可能であり、半減期の増加及び有害な免疫反応の減少を可能と
する。マウスのモノクローナル抗体を、例えば、マウスのFv領域又はその相補性決定領域
をコードするヌクレオチド配列を、ヒト定常ドメイン領域及びFc領域をコードするヌクレ
オチド配列と遺伝的に組み換えることによってヒト化してもよい。マウスの残基をヒト可
変領域フレームワークドメイン内に保持して、適切な標的部位結合特性を確保してもよい
。種々の活性薬剤をがん細胞へと送達するための遺伝子操作された抗体は、Bodey, B.の
文献(2001) Expert Opin Biol. Ther. 1(4):603-17に総説されている。
いくつかの態様において、前記ターゲティング部分は、標的細胞の表面上のレセプター
と反応性のリガンドである。従って、該ターゲティング部分は、これらに限定するもので
はないが、細胞結合成分に対する親和性を有するホルモン、細胞結合成分によって認識さ
れる炭水化物部分を含有する任意の分子、及び細胞結合成分に結合する薬物又は小分子を
含み得る。「結合成分」という句は、レセプター及びアクセプター分子の双方を含む。好
ましくは、該結合成分は、細胞表面結合成分である。一態様において、前記ターゲティン
グ部分は、インスリンなどの、標的部位に結合する天然に存在するタンパク質である。イ
ンターロイキン、並びに顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)及び腫瘍壊死
因子(TNF)などの因子を含むサイトカインもまた、高レベルのそれらのレセプターを発現
している特定の細胞に結合することが知られている具体的なターゲティング部分である(T
erlikowski, SJの文献(2002) Toxicology 174(3):143-152)。
ウレアーゼ又は他の活性薬剤の非標的細胞又は組織への曝露を低減するために、ターゲ
ティング部分をスクリーニングして、標的特異性及び反応性を保持しつつ、最小の非標的
反応性を示すものを特定してもよい。非標的曝露(及び有害な非標的局在化及び/又は毒性
)を減少することにより、増加したウレアーゼ又は他の活性薬剤の用量を投与し得る。こ
のことは、許容し得ない非標的細胞毒性の閾値未満を維持しつつ標的細胞の曝露を最大化
するための、可能な限り高い濃度のウレアーゼ又は他の治療剤の投与を可能とする。
いくつかの態様において、2つ以上の活性薬剤-ターゲティング部分コンジュゲートが採
用され、ここで、各々のコンジュゲートは、異なるターゲティング部分として、例えば、
異なる抗体種を含む。利用されるターゲティング部分の各々は、異なる標的部位領域に結
合し、これは同じ又は異なる標的部位と関連し得る。投与されたコンジュゲートの各々の
活性薬剤成分は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、各々が引用により本明細
書に組み込まれている米国特許第4,867,962号及び第5,976,535号を参照されたい。いくつ
かの態様において、活性薬剤コンジュゲートの標的部位への標的部位付着は、各々のター
ゲティング部分、例えば、抗体種が、異なる標的部位領域(すなわち、エピトープ)を認識
するために、向上する。この代替の標的部位領域アプローチは、より強力な標的部位結合
点を、活性薬剤に提供する。その結果、例えば、エピトープ飽和及び/又は立体障害を介
する実際の又は実効的な標的部位飽和が、回避され得る。従って、活性薬剤、例えば、ウ
レアーゼの相加的蓄積が達成され得る。代わりに、又は組み合わせで、追加のウレアーゼ
特異的遺伝子産物を、例えば、標的部位において触媒として活性なホロ酵素の製造のため
の活性薬剤として採用してもよい。例示的なウレアーゼアポ酵素としては、細菌のureABC
遺伝子(Burne, R.A.及びChen, Y.M.の文献(2000) Microbes and Infection 2:533-542)に
よってコードされるガンマ、ベータ、及びアルファサブユニットが挙げられる。
特定の標的部位に対するモノクローナル抗体の交差反応性のパターンを解析して、治療
的応用における使用のための重なり合わない交差反応性を有する2つ以上の標的特異的モ
ノクローナル抗体の組み合わせを特定可能である。「交差反応性の重なり合わないパター
ン」という句は、1つの抗体種により結合される非標的組織が、別の抗体種により結合さ
れる非標的組織とは実質的に異なることを示す。該交差反応性のパターンは、治療的応用
のための活性薬剤の曝露をその分だけ減少させるのに必要な程度まで異なる。抗体ペア(
又はより大きな抗体の組み合わせ)のより少ない重なり合いが好ましい。
抗体は、多様な方法によってスクリーニングし得る。免疫組織化学的分析を採用して、
標的組織との反応性及び非標的組織との交差反応性を決定し得る。抗体種が結合する組織
を、該組織を該抗体へと曝露すること;該組織を洗浄してすべての結合していない抗体を
除去すること;及び結合した抗体の存在を検出することによって特定し得る。インビトロ
の組織化学的な手順は、当技術分野において公知である。例えば、Sanchez-Islas, E.及
びLeon-Olea, M.の文献(2001) Nitric Oxide 5(4):302-16を参照されたい。
ターゲティング部分が比較的短い場合、それを標準的な化学的ペプチド合成技術を用い
て合成し得る。配列のC-末端アミノ酸を不溶性担体に取り付け、それに続き、配列内の残
りのアミノ酸を逐次添加する固相合成が、ポリペプチドの化学合成のための方法の1態様
として想定される。固相合成のための技術は、「ペプチド:分析、合成、生物学。第2巻:
ペプチド合成における特別な方法、パートA（The Peptides: Analysis, Synthesis, Biol
ogy. Vol. 2::Special Methods in Peptide Synthesis, Part A.)」内のBarany及びMerr
ifieldの文献、「固相ペプチド合成(Solid -Phase Peptide Synthesis)」;第3〜284頁:Me
rrifieldらの文献J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963)、並びにStewartらの文献「
固相ペプチド合成、第２版(Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed.)」 Pierce Chem.
Co., Rockford, III.(1984)に記載されている。
抗体又はウレアーゼをコードするDNAは、例えば、適切な配列のクローニング及び制限
、又はNarangらの文献(1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99のホスホトリエステル法;Brown
らの文献(1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151のホスホジエステル法;Beaucageらの文献(1
981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862のジエチルホスホロアミダイト法;及び米国特許第4,4
58,066号の固相担持法などの方法による直接的な化学合成を含む任意の適当な方法によっ
て調製し得る。
化学合成では、一本鎖オリゴヌクレオチドが製造される。これを、相補的配列とのハイ
ブリダイゼーションによって、又はDNAポリメラーゼを用い、該一本鎖をテンプレートと
して用いるポリメリゼーションによって二本鎖DNAへと変換してもよい。DNAの化学合成は
、約100塩基の配列に限定されるものの、より長い配列を、より短い配列のライゲーショ
ンによって得ることができることを当業者は認識するものである。
あるいは、サブシーケンスをクローニングして、適切なサブシーケンスを適切な制限酵
素を用いて切断することができる。その後、該断片をライゲーションして、所望のDNA配
列を製造することができる。
(抗体-ウレアーゼコンジュゲートを調製する方法)
本技術は、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを含み、かつ該抗体-ウレアーゼコンジュゲ
ートの重量基準で約5％、4％、3％、2％、又は1％を超えないウレアーゼなどの、非コン
ジュゲートウレアーゼを実質的に含まない組成物を調製する方法であって、(1)活性化さ
れた該抗体及び該ウレアーゼを、1時間あたり10％、5％、又は1％を超えない反応などの
、該活性化された抗体及び該ウレアーゼが実質的に反応しない溶媒中で混ぜ合わせて、反
応混合物を形成させることであって、該溶媒中の活性化された該抗体及び該ウレアーゼの
分布が一様である、前記形成させること、及び(2)該活性化された抗体が、該ウレアーゼ
と容易に反応して、該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成するように、前記(1)の混合
物の性質を変化させることを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、前記
(1)の混合物の性質は、前記pH値である。いくつかの態様において、前記(1)の混合物の性
質を変化させることは、前記pHを、前記活性化された抗体が、前記ウレアーゼと容易に反
応して、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成する値まで上昇させることを含む。
いくつかの態様において、活性化された該抗体は、容易に、例えば、少なくとも90％又は
少なくとも95％の活性化された抗体は、前記混合物が、前記混合物の性質を変化させてか
ら約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、又は約1時間後に非コンジュゲートウ
レアーゼを実質的に含まない速度で、(2)において前記ウレアーゼと反応する。
いくつかの態様において、前記方法は、約6.0〜7.0、例えば、約6.5のpHを有する酸性
の水性緩衝液中で活性化された抗体及びウレアーゼを混ぜ合わせること、該pHを、塩基性
のpHである約8.0〜9.0、例えば、約8.3へと調整して、該抗体-ウレアーゼコンジュゲート
を形成させること、及び該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを、ウルトラダイアフィルト
レーションによって精製することを含み、ここで該方法は、クロマトグラフィー精製工程
を含まない。いくつかの態様において、前記水性緩衝液は、約5〜8のpHを有する。いくつ
かの態様において、前記活性化された抗体及び前記ウレアーゼは、酸性の水性緩衝液中で
組み合わされる。いくつかの態様において、活性化された抗体及びウレアーゼの比は、約
3〜約12である。いくつかの態様において、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートは、ウレ
アーゼ部分1個あたり抗体部分が6〜15個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつ
かの態様において、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、
抗体部分が8〜11個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、
前記pH調整剤は、緩衝剤又は緩衝剤溶液である。いくつかの態様において、前記pH調整剤
は、塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸、炭酸、重炭酸、グルコン酸、水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、アンモニア水、クエン酸、モノエタノールアミン、乳酸、酢酸、コハク酸、フ
マル酸、マレイン酸、リン酸、メタンスルホン酸、リンゴ酸、プロピオン酸、トリフルオ
ロ酢酸、その塩、又はそれらの組み合わせのうちの1つ以上を含む。いくつかの態様にお
いて、前記緩衝剤は、グリシン、酢酸、クエン酸、ホウ酸、フタル酸、リン酸、コハク酸
、乳酸、酒石酸、炭酸、塩酸、水酸化ナトリウム、その塩、又はそれらの組み合わせのう
ちの1つ以上を含む。いくつかの態様において、前記緩衝剤溶液は、塩酸グリシンバッフ
ァー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、乳酸バッファー、リン酸バッファー、クエ
ン酸-リン酸バッファー、リン酸-酢酸-ホウ酸バッファー、フタル酸バッファー、又はそ
れらの組み合わせのうちの1つ以上を含む。いくつかの態様において、前記バッファーは
、リン酸バッファーではない。いくつかの態様において、前記酸性のバッファーは、酢酸
ナトリウムバッファーである。いくつかの態様において、前記pHは、ホウ酸ナトリウム溶
液(例えば、0.1〜5M、又は1M)などの塩基の水溶液の添加を含む方法によって、前記塩基
性のpHへと調整される。理論によって束縛されることは望まないが、酢酸ナトリウムバッ
ファーは、低い緩衝能を有しており、かつpHが8.5の1Mホウ酸バッファーによって、pHを
、8.3へと調整することに適している。いくつかの態様において、トリス-HClバッファー(
例えば、1Mトリス-HCl)は、前記混合物を、pH8〜9、例えば、8.3へと調整するのに用いら
れる。
いくつかの態様において、反応時間及び抗体/ウレアーゼ比は、定数として保たれてい
る。いくつかの態様において、反応混合物中の抗体/ウレアーゼのモル比は、約25、又は
約21、又は約1.8〜12抗体/ウレアーゼである。いくつかの態様において、抗体/ウレアー
ゼモル比は、4から25に調整される。いくつかの態様において、抗体/ウレアーゼモル比は
、少なくとも6である。
いくつかの態様において、1％又は2％を超えない未反応抗体が、ウルトラダイアフィル
トレーションなどの精製後に前記混合物中に存在する。いくつかの態様において、他の非
HPLC精製法を使用し得る。例えば、エタノール晶析/分画を、より低い収率での精製に使
用し得る。いくつかの態様において、前記抗体の分子量は、50kDaを超えず、例えば、約1
0〜20kDa、又は約13kDaであり、前記精製は、ウルトラダイアフィルトレーションである
。いくつかの態様において、前記方法は、少なくとも総蛋白の約60重量％、総蛋白の約70
重量％、総蛋白の約80重量％、又は少なくとも総蛋白の90重量％の収率で、前記抗体-ウ
レアーゼコンジュゲートを提供する。総蛋白は、ウレアーゼ及びAFAIKL2抗体を組み合わ
せた量(重量)を意味する。いくつかの態様において、(総タンパク質重量で)10〜20％を超
えない非コンジュゲート抗体が、精製前の反応混合物に残存している。
本技術は、酸性水性溶媒(上述のようなもの)中に活性化された抗体及びウレアーゼを含
み、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを実質的に含まない、例えば、ウレアーゼの重量基
準で抗体-ウレアーゼコンジュゲートが約5％、4％、3％、2％、又は1％を超えない、安定
な組成物を提供する。本技術はさらに、水性溶媒中に、抗体-ウレアーゼコンジュゲート
を含み、かつ非コンジュゲートウレアーゼを実質的に含まない、例えば、該抗体-ウレア
ーゼコンジュゲートの重量基準でウレアーゼが約5％、4％、3％、2％、又は1％を超えな
い組成物であって、該水性溶媒が、約8〜9、例えば、8.3(上述のように)のpHを有する、
前記組成物を提供する。いくつかの態様において、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲート
を含む組成物は、総抗体(活性化された抗体及び未反応抗体)で、約40〜60％を超えない非
コンジュゲート抗体をさらに含む。いくつかの態様において、前記抗体-ウレアーゼコン
ジュゲートを含む組成物は、総蛋白で約10〜20％を超えない非コンジュゲート抗体をさら
に含む。
ウレアーゼは、インビボで一般毒性を有するアンモニアの放出を引き起こし、かつそれ
自体は腫瘍を標的としないため、非コンジュゲートウレアーゼの存在は、ウレアーゼが正
常組織中に存在して正常組織に対する毒性を生じさせるリスクを増加させる。しかしなが
ら、ウレアーゼのサイズ及び他の性質のために、特に大規模では、抗体のウレアーゼへの
コンジュゲーションによって、クロマトグラフィー精製法による非コンジュゲートウレア
ーゼからの抗体-ウレアーゼコンジュゲートの迅速な分離を可能とするのに十分なサイズ
や他の相違がもたらされることはない。
本技術は、驚くべきことに、ウレアーゼと抗体との実質的に完全なコンジュゲーション
を提供し、得られる生成物は、何らクロマトグラフィー精製を行わずとも、非コンジュゲ
ートウレアーゼを実質的に含まない。ウレアーゼを実質的に含まないことで、本明細書に
記載される組成物は、全身投与によって、該組成物中の実質的に全てのウレアーゼの部分
を、標的部位へと送達する。ウレアーゼの標的部位への標的送達は、ウレアーゼによって
生成されるアンモニアの一般毒性を減少させるか、又は無くし、かつ治療効果を生じさせ
るために投与されるべきウレアーゼの量を減少させる。本技術は、大規模での、例えば、
少なくとも約1g、10g、100g、又は1kgでの、臨床での使用のための、特に、ウレアーゼの
局所投与によって治療することが難しい又は非実用的である転移性腫瘍を治療するための
、ウレアーゼを実質的に含まない前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートの調製に特に適し
ている。
本技術はまた、腫瘍抗原に対する抗体結合親和性を上昇させる方法であって、複数の該
抗体分子を、1つのウレアーゼ分子にコンジュゲートさせて、抗体-ウレアーゼコンジュゲ
ートを形成させることを含み、前記コンジュゲートが、非コンジュゲート抗体よりも少な
くとも約100倍、例えば、約200倍、約300倍、約400倍、及び約500倍高い、該腫瘍抗原に
対する結合親和性を有する、前記方法を提供する。いくつかの態様において、競合的結合
アッセイは、抗体-ウレアーゼコンジュゲートの結合親和性が、増加したアビディティー
のために、天然の単一ドメイン抗体のそれよりも約100倍、約200倍、約300倍、約400倍、
及び約500倍強力であることを示す。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、
ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個であるコ
ンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレ
アーゼ部分1個あたり、抗体部分が約6個以上であるコンジュゲーション比率を有する。い
くつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が6
、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様
において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8、9、10、又
は11個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュ
ゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約8、9、10、又は11個である平均コン
ジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記ウレアーゼは、タチナタマ
メウレアーゼである。いくつかの態様において、前記抗体は、ヒト化抗体又は非ヒト抗体
である。いくつかの態様において、前記抗体は、単一ドメイン抗体である。いくつかの態
様において、前記腫瘍抗原は、非小細胞性肺癌により発現されるものである。いくつかの
態様において、前記抗体は、CEACAM6に対する特異性を有する。いくつかの態様において
、前記抗体は、Kd値が約1×10-6Mを超えるCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつ
かの態様において、前記コンジュゲートは、約1×10-8Mを超えないKd値でCEACAM6に結合
する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、約1×10-10Mを超えないKd値でC
EACAM6に結合する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、約5nMを超えないI
C50値でCEACAM6に結合する。いくつかの態様において、前記IC50値は、約3.22nMである。
いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、約20μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合
する。非特異的交差反応性抗原(NCA)又はCD66cとしても知られるCEACAM6は、よくキャラ
クタリゼーションされたがん抗原である。CEACAM6は、CEACAM1、CEACAM7、及びCEACAM8な
どの他のヒト癌胎児性抗原と高い配列相同性を共有する。CEACAM6は、グリコシルホスホ
イノシトール(GPI)連結型細胞表面タンパク質であるが、細胞質ドメインは知られていな
い。CEACAM6発現は、乳房、膵臓、卵巣、肺、及び結腸のがん組織において顕著に上昇す
る。
(組成物製剤)
本技術の組成物は、ウレアーゼを実質的に含まない抗体-ウレアーゼコンジュゲートを
含み、かつ任意に非水性HPLC溶媒を含まない。いくつかの態様において、前記組成物は、
医薬として許容し得る組成物である。前記組成物は、生体適合性医薬担体、アジュバント
、又はビヒクルをさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、前記組成物は、固
体形態である。いくつかの態様において、前記組成物は、約0.1〜10mg/mL、約0.5〜5mg/m
L、約1〜5mg/mL、又は約1.5〜2.0mg/mLのコンジュゲートを含む水性液剤中のものである
。いくつかの態様において、前記水性液剤は、ヒスチジン、スクロース、及びEDTAのうち
の1つ以上などの賦形剤をさらに含む。いくつかの態様において、前記水性液剤は、約1〜
20mM、例えば、10mMのヒスチジン、約0.1〜5w/v％、例えば、1w/v％のスクロース、約0.1
〜0.5mM、例えば、0.2mMのEDTAを含む。いくつかの態様において、前記水性液剤は、約6.
5〜7、例えば、約6.8のpHを有する。いくつかの態様において、前記水性液剤は、リン酸
塩を含有しない。いくつかの態様において、前記組成物は、前記水性液剤の凍結乾燥によ
って得られる固体形態である。いくつかの態様において、前記固体形態は、リン酸塩を含
有しない。
前記組成物は、賦形剤(複数可)又は他の医薬として許容し得る担体と混合された他のヌ
クレオチド配列、ポリペプチド、薬物、又はホルモンも含んでいてもよい。医薬組成物以
外の組成物は、任意に、液体、すなわち、水又は水ベースの液体を含む。
医薬組成物に添加される医薬として許容し得る賦形剤もまた、当業者に周知されており
、容易に利用可能である。賦形剤の選択は、一つには前記生成物を投与するのに用いられ
る特定の方法によって決定されるものである。従って、本技術の文脈での使用に適した多
様な製剤が存在する。
医薬組成物の製剤及び投与のための技術は、「Remingtonの薬科学(Remington’s Pharm
aceutical Sciences)」、第19版、Williams & Wilkins、1995に見出すことができ、当業
者に周知されている。賦形剤の選択は、一つには本技術による生成物の投与に用いられる
特定の方法によって決定されるものである。従って、本技術の文脈での使用に適した多様
な製剤が存在する。以下の方法及び賦形剤は、単に例示的なものであり、決して限定する
ものではない。
本技術の医薬組成物は、任意の従来法、例えば、混合、溶解、造粒、湿式粉砕(levigat
ing)、乳化、カプセル化、封入、融解紡糸、噴霧乾燥、又は凍結乾燥プロセスを用いて製
造してもよい。しかしながら、最適な医薬製剤は、投与の経路及び所望の投薬量に応じて
当業者によって決定されるものである。このような製剤は、投与された薬剤の物理的状態
、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼし得
る。
前記医薬組成物は、適当な医薬として許容し得る担体を含有するよう製剤化され、かつ
任意に、活性化合物の医薬として使用し得る調製物への加工を容易にする賦形剤及び補助
剤を含んでいてもよい。一般に、投与様式が担体の性質を決定するものである。例えば、
非経口投与のための製剤は、水溶性形態の活性化合物の水性液剤を含んでいてもよい。非
経口投与に適した担体は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、及び他の生理学
的に適合性の溶液から選択することができる。非経口投与に好適な担体は、生理学的に適
合性のバッファー、例えば、ハンクス液、リンゲル液、又は生理緩衝食塩水である。組織
又は細胞投与のためには、透過されるべき特定のバリアーに適切な浸透剤が、前記製剤中
に用いられる。そのような浸透剤は、一般に、当技術分野において公知である。タンパク
質を含む調製物については、前記製剤は、安定化材料、例えば、ポリオール(例えば、ス
クロース)及び/又は界面活性剤(例えば、非イオン性の界面活性剤)などを含んでいてもよ
い。
また、非経口での使用のための製剤は、適当な油性の注射懸濁液として調製された活性
化合物の懸濁液を含んでいてもよい。適当な親油性の溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油
などの脂肪油及びオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、
又はリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、該懸濁液の粘度を増加させる物質、例
えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、又はデキストランを含有
していてもよい。任意に、前記懸濁液はまた、適当な安定化剤又は前記化合物の溶解性を
増加させて高度に濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤を含有してもよい。乳化剤又は
分散剤(界面活性材料;界面活性剤)によって任意に安定化された、乳剤、例えば、水中油
型及び油中水型分散剤も使用し得る。上述のように前記活性薬剤を含有するリポソームも
、非経口投与に採用し得る。
また、前記薬剤を経口投与に適した投薬量で含む医薬組成物を、当技術分野において周
知の医薬として許容し得る担体を用いて製剤化することができる。経口投与のために製剤
化された調製物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、ロゼンジ錠、液剤、ゲル剤、シ
ロップ剤、スラリー剤、懸濁液、又は散剤の形態であってもよい。例示のために、経口で
の使用のための医薬調製物は、前記活性化合物を固体賦形剤と組み合わせること、任意に
得られた混合物を粉砕すること、及び望ましい場合適当な補助剤を添加した後に顆粒の混
合物を加工して錠剤を得ることにより得ることができる。経口製剤は、非経口用途につい
て説明したものと類似の種類の液体の担体、例えば、緩衝水溶液、懸濁液、などを採用し
てもよい。
これらの調製物は:a)ラクトース、ブドウ糖、スクロース、マンニトール、又はソルビ
トールを含む糖類などの希釈剤;b)ケイ酸マグネシウムアルミニウム、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモなど由来のデンプンなどの結合剤;c)メチルセルロース、ヒドロキシ
プロピルネチルセルロース(hydroxypropyhnethyl cellulose)、及びナトリウムカルボキ
シメチルセルロースなどのセルロース材料、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム及びト
ラガカントガムなどのガム、並びにゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質;d)架橋ポ
リビニルピロリドン、デンプン、寒天、アルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸又はその
塩などの崩壊剤又は可溶化剤;又は発泡性の組成物;e)シリカ、タルク、ステアリン酸、も
しくはそのマグネシウムもしくはカルシウム塩、及びポリエチレングリコールなどの滑沢
剤;f)香料及び甘味料;g)例えば、製品を識別するため又は活性薬剤の量(投薬量)を表すた
めの着色料又は色素;並びにh)防腐剤、安定化剤、膨張剤、乳化剤、溶液プロモーター(so
lution promoter)、浸透圧を調節するための塩、及びバッファーなどの他の成分があげら
れるが、これらに限定されない、1以上の賦形剤を含有していてもよい。
前記医薬組成物は、前記活性薬剤の塩として提供されてもよく、この塩は、塩酸、硫酸
、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などが挙げられるがこれらに限定されない多
くの酸と形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性又は他のプロト
ン性溶媒により可溶性となる傾向にある。
前記コンジュゲートそれ自体及び該コンジュゲートの製剤の特性は、投与されたコンジ
ュゲートの物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス
速度に影響を与えることができる。そのような薬物動態学的及び薬力学的な情報は、後に
臨床試験の過程においてヒトで確認される前臨床インビトロ及びインビボ研究を通じて収
集することができる。インビボでの動物データに基づいてヒト臨床試験を行うためのガイ
ダンスは、例えば、http://www.clinicaltrials.govを含むいくつかのソースから得るこ
とができる。従って、本技術の方法において用いられる任意の化合物について、哺乳動物
、特にヒトにおいて治療に効果的な用量は、初めは、生化学的及び/又は細胞ベースのア
ッセイから推定することができる。その後、投薬量を動物モデルにおいて明確化して、コ
ンジュゲート活性を調節する所望の循環濃度範囲を達成することができる。ヒトでの研究
が行われるにつれ、種々の疾患についての適切な投薬量レベル及び治療期間、並びに条件
に関するさらなる情報が明らかになるであろう。
前記コンジュゲートの毒性及び治療有効性を、細胞培養液又は実験的動物において、例
えば、LD50(集団の50％に対して致死的な用量)及びED50(集団の50％において治療に効果
的な用量)を決定するための標準的な医薬的手順によって決定することができる。
(追加の活性薬剤)
追加の活性薬剤も、本技術の組成物に含まれていてもよい。該追加の活性薬剤、例えば
、抗腫瘍剤(増殖性の細胞に対して活性な薬剤)を、細胞を第1の活性薬剤に接触させる前
にか、それと同時にか、又はそれの後に、前記組成物において利用してもよい。例えば、
ウレアーゼが、腫瘍細胞に標的化された後に、それは、例えば、pH変化を介して腫瘍外部
環境を調節又は調整する能力を有する可能性がある。そうすると、塩基性の環境を好む抗
腫瘍剤などの活性薬剤は、より効果的となるであろう。
ある態様において、ウレアーゼによって酵素的に処理されることが可能である基質が、
活性薬剤としての使用に想定される。いくつかの態様において、該活性薬剤は、ウレアー
ゼに利用されて、アンモニウムイオンが生じる基質、例えば、尿素である。
例示的な抗腫瘍剤としては、サイトカイン及び他の部分、例えば、インターロイキン(
例えば、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12など)、トランスフォーミング増殖因子-ベータ、リン
ホトキシン、腫瘍壊死因子、インターフェロン(例えば、ガンマ-インターフェロン)、コ
ロニー刺激因子(例えば、GM-CSF、M-CSFなど)、血管透過性因子、レクチン炎症反応促進
因子(セレクチン)、例えば、L-セレクチン、E-セレクチン、P-セレクチン、及びタンパク
質性部分、例えば、C1q及びNKレセプタータンパク質が挙げられる。さらなる適切な抗腫
瘍剤としては、血管新生を阻害し、従って、転移を阻害する化合物が挙げられる。そのよ
うな薬剤の例としては、プロタミンメドロキシプロゲステロン、ペントサンポリサルフェ
ート、スラミン、タキソール、サリドマイド、アンギオスタチン、インターフェロン-ア
ルファ、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血小板第4因子、ソマトスタチン、トロモボスポ
ンジン(thromobospondin)が挙げられる。本技術によって有用な活性薬剤他の代表的かつ
非限定的な例としては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ブスルファン、
チオラムブシル(chiorambucil)、スピロプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、メト
トレキサート、アドリアマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノ
シド、アラビノシルアデニン、メルカプトプリン、ミトタン、プロカルバジン、ダクチノ
マイシン(アンチノマイシンD)、ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、タキソール、プ
リカマイシン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、フルタミド、ロイプロリド、酢
酸メゲストロール、タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン(m-A
MSA)、アスパラギナーゼ(L-アスパラギナーゼ)、エトポシド、ヘマトポルフィリンなどの
血液製剤、又は前述のものの誘導体が挙げられる。活性薬剤の他の例としては、遺伝子材
料、例えば、組換えRNA及びDNAを含む、天然又は合成起源の核酸、RNA、及びDNAが挙げら
れる。あるタンパク質をコードするDNAを、多くの異なる種類の疾患の治療において用い
てもよい。例えば、腫瘍壊死因子又はインターロイキン-2遺伝子が、進行したがんの治療
のために提供されてもよく;チミジンキナーゼ遺伝子が、卵巣がん又は脳腫瘍の治療のた
めに提供されてもよく;インターロイキン-2遺伝子が、神経芽腫、悪性のメラノーマ、又
は腎臓がんの治療のために提供されてもよい。本技術における使用に想定される追加の活
性薬剤は、その全体が、引用により本明細書に組み込まれている米国特許第6,261,537号
に記載されている。抗腫瘍剤及びそのような薬剤を検出するためのスクリーニングは、Mo
nga, M.及びSausville, E.A.の文献(2002) Leukemia 16(4): 520-6に総説されている。
いくつかの態様において、前記活性薬剤は、弱塩基性の抗腫瘍化合物であり、その有効
性は、固形腫瘍における細胞内でより高い/細胞外でより低いpHグラジエントによって減
少する。例示的な弱塩基性の抗腫瘍化合物としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、
ミトキサントロン、エピルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ビンカアルカロイ
ド、例えばビンブラスチン及びビンクリスチン、アルキル化剤、例えば、シクロホスファ
ミド及び塩酸メクロレタミン、及び抗悪性腫瘍性のプリン及びピリミジン誘導体が挙げら
れる。
いくつかの態様において、前記組成物は、ウレアーゼを含み、かつ、任意のサイトカイ
ン、例えば、腫瘍壊死因子及び/又はインターフェロンを実質的に欠く。この態様におい
て、ウレアーゼ単独でか、又はサイトカイン以外の活性薬剤と共に小分子抗腫瘍剤と組み
合わせたものは、がん細胞増殖の阻害に効果的である。従って、この態様において、該組
成物は、治療されている対象内に存在する内在性又は天然のサイトカインと協力して作用
してもしなくてもよいが、投与される組成物は、追加の外来性のサイトカインを含有しな
い。
いくつかの態様において、前記追加の活性薬剤は、ペメトレキセド及び/又はカルボプ
ラチンではない。いくつかの態様において、前記追加の活性薬剤は、葉酸代謝拮抗薬及び
/又は白金剤ではない。
(送達及び投与の方法)
前記抗体-ウレアーゼコンジュゲート組成物は、当技術分野において公知のいくつかの
方法によってがん細胞へ送達されてもよい。治療的応用において、前記組成物は、がん細
胞(複数可)の増殖を阻害するのに十分な量で、がん細胞を有する患者に投与される。前記
医薬組成物を、非経口的、経腸的、経上皮的、経粘膜的、経皮的、及び/又は外科的なも
のを含むが、これらに限定されないいくつかの経路による投与によってがん細胞に曝すこ
とができる。
非経口投与様式としては、前記組成物が、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、髄内、筋
肉内、関節内、くも膜下腔内、及び脳室内注射、皮下、性腺内、もしくは腫瘍内ニードル
ボーラス注入、又は長期連続的な、拍動性のもしくは計画的な灌流、又は適切なポンプ技
術を用いるマイクロ注入によって投与されるものが挙げられる。経腸投与様式としては、
例えば、経口(頬側及び舌下を含む)並びに直腸内投与が挙げられる。経上皮投与様式とし
ては、例えば、経粘膜投与及び経皮投与が挙げられる。経粘膜投与としては、例えば、経
腸投与、並びに経鼻、吸入、及び深肺投与(deep lung administration)、膣内投与、及び
直腸内投与が挙げられる。経皮投与としては、例えば、パッチ及び及びイオン泳動装置、
並びにペースト剤、軟膏剤(salve)、又は軟膏剤(ointment)の外用を含む、受動的な又は
能動的な経皮(transdermal)又は経皮(transcutaneous)様式が挙げられる。外科的技術と
しては、デポ(リザーバー)組成物、浸透圧ポンプなどのインプラント術が挙げられる。
対象が必要としかつ耐容性を示すような投薬量及び頻度によって、前記活性薬剤の単回
又は複数回の投与が実施され得る。いかなる場合でも、前記組成物は、該対象を効果的に
治療するのに十分な量の前記活性薬剤を提供すべきである。
いくつかの態様において、本技術は、がん細胞への抗体-ウレアーゼコンジュゲートを
含む医薬組成物の送達のための化学的実体としてのベシクル、例えば、リポソーム及び/
又はナノカプセルの使用を企図する。そのような製剤は、本明細書において開示されるポ
リペプチド、医薬、及び/又は抗体の医薬として許容し得る製剤の導入に好適である可能
性がある。リポソームの形成及び使用は、一般に当業者に公知である(例えば、Backer, M
.V.らの文献(2002) Bioconjug Chem 13(3):462-7を参照されたい)。好適な態様において
、開示される組成物は、リポソーム内に捕捉されていてもよい。
ナノカプセルは、一般に、化合物を安定かつ再現性のあるやり方で捕捉することができ
る(Whelan、J.の文献(2001) Drug Discov Today 6(23):1183-84)。細胞内での重合体の過
負荷が原因の副作用を回避するために、そのような超微粒子(およそ0.1μmのサイズ)を、
インビボで分解可能なポリマーを用いて設計してもよい。これらの要件を満たす生分解性
ポリイソブチルシアノアクリレートナノ粒子は、本技術における使用に想定され、そのよ
うな粒子は、例えば、Lambert, G.らの文献(2001) Int J Pharm 214(1-2):13-6に記載さ
れるように容易に作製され得る。生物活性物質を含有するポリアルキル-シアノ-アクリレ
ートナノ粒子を調製する方法、及びそれらの使用は、米国特許第4,329,332号、第4,489,0
55号、及び第4,913,908号に記載されている。ナノカプセルは、Capsulution, Inc. (www.
capsulution.com)などの供給者から商業的に利用可能である。
組成物の送達のためのナノカプセルを含有する医薬組成物は、米国特許第5,500,224号
、第5,620,708号、及び第6,514,481号に記載されている。米国特許第5,500,224号には、
その中に溶解した界面活性剤、及びその中に懸濁された500ナノメートル未満の直径を有
する複数のナノカプセルを含有する油から本質的になる油性相を含むナノカプセルのコロ
イド懸濁液の形態の医薬組成物が記載されている。米国特許第5,620,708号には、組成物
、並びに薬物及び他の活性薬剤の投与のための方法が記載されている。該組成物は、哺乳
動物の腸細胞の表面に存在する標的分子に特異的に結合する結合部分に取り付けられた活
性薬剤担体粒子を含む。該結合部分は、粒子状活性薬剤担体のエンドサイトーシス又はフ
ァゴサイトーシスを開始させるのに十分な結合親和性又はアビディティーで標的分子に結
合して、該担体を腸細胞によって吸収させる。該活性薬剤はその後、前記担体から宿主の
体循環へと放出されることとなる。このように、腸におけるポリペプチドなどの易分解性
薬物の分解を、腸管からのタンパク質及びポリペプチドの吸収を増加させつつ回避するこ
とができる。あるいは、本技術は、標的細胞周囲の環境における前記活性薬剤の放出を企
図する。例えば、一態様において、抗体-ウレアーゼコンジュゲートは、ウレアーゼが標
的細胞、例えば、腫瘍細胞の周囲のマイクロ環境内へと放出されるように、標的部分が標
的細胞に結合した後にナノカプセルから放出される。米国特許第6,379,683号及び第6,303
,150号には、ナノカプセルを作製する方法及びその使用が記載されており、これらは引用
により本明細書中に組み込まれている。
使用される医薬組成物は、有効量で対象に投与される。一般に、有効量は:(1)治療する
ことが求められる疾患の症状を減少させること;又は(2)治療することが求められる疾患を
治療することと関連性のある薬理学的変化を誘導することのいずれかに効果的な量である
。がんについては、有効量は:腫瘍のサイズを減少させること;腫瘍の成長を減速すること
;転移を予防もしくは阻害すること;又は罹患対象の期待生存時間を増加させることに効果
的な量を含んでいてもよい。接触させることは、細胞に、ターゲティング部分、及び選択
された電荷と、第2の反対に荷電したコイル形成性ペプチドと相互作用して安定であるα-
ヘリカルコイルドコイルヘテロ二量体(α-helical coiled-coil heterodimer)を形成する
能力とを特徴とする第1のコイル形成性ペプチドを含むコンジュゲートを添加することを
含む。それに続き、リポソームを該細胞に添加する。該リポソームは、外面及び内部コン
パートメント;該リポソームの該内部コンパートメント内部に位置する活性薬剤、例えば
、ウレアーゼ;及び複数の第2のペプチドであって、各々が該リポソームの該外面に接続さ
れている、前記第2のペプチドを含む。
いくつかの態様において、前記接触させることは、リポソームを細胞に添加することを
含み、ここで、該リポソームは、捕捉された形態の前記活性薬剤、例えば、抗体-ウレア
ーゼコンジュゲートを有し、かつ該リポソームの外表面は、標的表面に特異的に結合する
のに効果的な細胞ターゲティング部分、及びターゲティング部分を標的表面との相互作用
から守るのに効果的な親水性ポリマーコーティングを含む。該親水性ポリマーコーティン
グは、前記リポソーム内の表面脂質成分に、解放可能な結合を介して共有結合的に連結さ
れたポリマー鎖から形成されていてもよい。いくつかの態様において、解放剤が、添加さ
れたリポソームの結合の相当な部分の解放を引き起こすのに効果的な量で腫瘍細胞に添加
され、それにより、前記ターゲティング部分が、標的表面に曝される。前記解放可能な結
合は、ジスルフィド、エステル、及びペプチド結合などの還元可能な化学結合としてもよ
い。
いくつかの態様において、哺乳動物対象のためのリポソームベースの療法の方法が想定
される。該方法は、該対象に、表面結合ターゲティング部分及び親水性ポリマーコーティ
ングを有するリポソームを全身投与すること、例えば、静脈内投与することを含む。解放
可能に取り付けられたポリマー鎖から構成される該親水性ポリマーコーティングは、ター
ゲティング部分をその標的との相互作用から守るのに効果的である。投与されたリポソー
ムを、該リポソームの所望の生体内分布が達成されるまで、全身に循環させる。投与され
たリポソームの中の解放可能な結合のかなりの部分、例えば、約50％超、好ましくは約70
％超、より好ましくは約90％超の切断を引き起こすのに効果的な量で、解放剤が前記対象
に投与される。前記親水性ポリマー鎖が解放されると、前記ターゲティング部分は、その
標的との相互作用のために露出される。
いくつかの態様において、前記リポソームは、固形腫瘍の治療のために使用される。該
リポソームは、捕捉された形態の抗体-ウレアーゼコンジュゲート、及び任意に、追加の
活性薬剤、例えば、抗腫瘍薬を含み、かつ腫瘍特異的抗原に特異的に結合するのに効果的
であるターゲティング部分によって腫瘍領域を標的としている。例示的な方法において、
リポソームは、増殖性の腫瘍内皮細胞上に発現するFlk-1,2レセプターへの選択的な付着
のために、VEGFリガンドを該リポソームに含めることによって、腫瘍の血管内皮細胞を標
的としている(Niederman, T.M.らの文献(2002) Proc Natl Aced Sci 99(10):7009-14)。
いくつかの態様において、前記リポソームは、約30〜400nmの間のサイズを有する。こ
のサイズ範囲内のリポソームは、腫瘍血管系の内皮細胞ライニング内に存在する「ギャッ
プ」を通じて腫瘍に入ることができることが示されている(Maruyama, Kらの文献(1999) A
dv Drug Deliv Rev 40(1-2):89-102)。
前記リポソームの投与、例えば、静脈内投与の後、かつ該リポソームを前記対象全体に
分布させ腫瘍に結合させるのに十分な時間が経過した後に、解放剤が前記対象に投与され
て親水性表面コーティングが、該リポソームから解放される。前記表面コーティングの解
放は、前記ターゲティング部分を露出させ、該リポソームを前記標的細胞に結合させるの
に効果的である。一態様において、前記親水性表面コーティングは、pH感受性の結合によ
って前記リポソームに取り付けられる。該結合は、前記リポソームが、前記腫瘍に結合し
た後に解放される。
上述の態様のいずれかにおけるリポソームは、任意に、捕捉された抗腫瘍薬もしくはイ
メージング剤のうちの1つ以上、又は双方を含むことができる。該リポソームを添加して
、分布させてもよく、その後に、解放剤を投与して親水性表面コーティングを解放して、
取り付けられたターゲティング部分を露出させ、結合を開始させることができる。引用に
より本明細書中に組み込まれている米国特許第6,043,094号に記載されているように、リ
ポソームを調製して投与してもよい。
その全体は参照によって本明細書に組み込まれている米国特許第6,180,114号に記載さ
れているような小型の単層ベシクル(SUV)などの追加の送達剤を、本技術において採用し
てもよい。
高密度に血管形成されていないか、又は血流内に存在する巨大分子の侵入を減少又は予
防する堅固な接合部によって連結された細胞及び/もしくは能動輸送機構によって保護さ
れたある種の領域が存在することが当業者により理解される。従って、例えば、神経膠腫
又は他の脳がんを治療する治療学の全身への実施は、巨大分子のくも膜下腔への侵入に抵
抗する血液脳関門によって制約が加えられる可能性がある。これらの種類の腫瘍において
は、治療組成物は、好ましくは、腫瘍部位に直接投与されてもよい。従って、例えば、脳
腫瘍は、前記治療組成物を、例えば、ボーラス注入、マイクロ注入、又は外科的にインプ
ラントされたカテーテルを介して腫瘍部位に直接投与することによって治療することがで
きる。
(投薬量)
本技術の方法については、各用量のタイミング及び順序を調節する任意の効果的な投与
計画を用いてもよい。ヒト対象についての例示的な投薬量レベルは、投与様式、腫瘍の程
度(サイズ及び分布)、患者の大きさ、及びがんのウレアーゼ治療に対する応答性次第で決
まるものである。
抗体-ウレアーゼコンジュゲート組成物が腫瘍に投与される場合、例えば腫瘍内に直接
注射される場合には、例示的な用量は、約0.1〜1,00010μg/kg体重、例えば、約0.2〜5μ
g/kg、又は約0.5〜2μg/kgである。注射針の配置は、医師が、標的組織に対する針の位置
を見ることができるように、従来の画像誘導技術、例えば、蛍光透視法によって誘導され
てもよい。そのような誘導ツールとしては、超音波、蛍光透視法、CT、又はMRIを挙げる
ことができる。
いくつかの態様において、投与された用量の抗体-ウレアーゼコンジュゲートの有効性
又は分布を、抗体-ウレアーゼコンジュゲートの腫瘍への投与の間又は後に、腫瘍組織を
、対象のがん組織領域内のpHの変化を検出することができるツールでモニターすることに
よってモニターしてもよい。そのようなツールは、腫瘍内に直接挿入することができるpH
プローブ、又は磁気共鳴画像法(MRI)、コンピュータ断層撮影法(CT)、又は蛍光透視法な
どの可視化ツールを含んでいてもよい。追加の造影剤の非存在下で、単にpHの関数として
の組織の磁気的性質の違いに基づくMRI調査(interrogation)を行ってもよい。CT又は蛍光
透視イメージングは、不透明度が組織媒体のpHによって影響を受ける追加のpH感受性造影
剤を必要とする可能性がある。そのような薬剤は、当業者に周知されている。
何らかの抗体-ウレアーゼコンジュゲート投与の前に、腫瘍組織を、その周囲の正常組
織と比較してより低いpHによって可視化することができる。このように、正常組織は、約
7.2の正常なpHを有する可能性があり、一方で腫瘍組織は、0.1〜0.4pH単位又はそれ以上
低い可能性がある。即ち、何らかの抗体-ウレアーゼコンジュゲートを注射する前に、腫
瘍組織の程度を、そのより低いpHによって定めることができる。ウレアーゼ投与の後で、
ウレアーゼを有する腫瘍領域のpHは上昇し始め、得られる画像を以前の投薬前画像と比較
することによって特定することができる。
このように組織を調査することによって、pHの変化の度合い、及び罹患組織の程度をモ
ニターしてもよい。この調査に基づいて、医師は、追加の組成物を該部位に投与してもよ
く、かつ/又は組成物を腫瘍部位内の追加のエリアで投与してもよい。この手順を、所望
の度合いの変化、例えば、0.2〜0.4pH単位が固形腫瘍の全領域にわたり達成されるまで繰
り返してもよい。
直接的な注射によるものなどの投薬を、所望のエンドポイントが、好ましくは、腫瘍塊
の実質的な又は完全な退縮が観察されるまで、適当な間隔で、例えば、毎週又は週2回繰
り返してもよい。治療の有効性を、治療の過程で、治療された組織のpHの変化を可視化す
ることによって、上述のようにモニターすることができる。従って、各々の追加の注射の
前に、組織のpHを可視化して、現存している腫瘍の程度を決定することができ、その後、
組織のpHの変化を使用して、新たな用量の抗体-ウレアーゼ組成物の該組織への投与をモ
ニターすることができる。
前記抗体-ウレアーゼ組成物が、直接的な注射以外の方法によって非経口投与される場
合には、例示的な該抗体-ウレアーゼ組成物の用量は、100〜100,000国際単位/kgウレアー
ゼ活性/kg対象体重である。本明細書において注記されるように、本方法における抗体-ウ
レアーゼ組成物は、がん細胞、例えば、固形腫瘍の部位にウレアーゼをターゲティングす
るためか、又は腫瘍部位において選択的に、例えば、リポソーム形態でウレアーゼを隔離
するための抗体を含む。
組織pHの変化に対し高感度のイメージング技術を用いて、投与した用量の有効性をモニ
ターしてもよい。このようなターゲティングには、数時間以上かかる可能性があるため、
前記方法は、抗体-ウレアーゼ組成物の注射の前、及び投薬の数時間、例えば、12〜24時
間後に、上述のように腫瘍pHをモニターして、腫瘍領域のpHの上昇が証拠となる腫瘍部位
に適切に投与されていることを確認することを伴っていてもよい。調査の結果次第で、前
記方法は、所望のpHの上昇、例えば、0.2〜0.4pH単位の上昇が観察されるまで、追加の投
薬を指示してもよい。この用量がひとたび確立されれば、腫瘍サイズ又は状態の変化が達
成されるまで、患者を、類似のウレアーゼ組成物の用量で、定期的に、例えば、毎週1回
又は2回治療してもよい。
最終的な投薬計画は、担当の医師によって、優良医療規範(good medical practice)に
鑑み、薬物の作用を変化させる種々の因子、例えば、薬剤の比活性、疾患状態の重症度、
患者の応答性、患者の年齢、状態、体重、性別、及び食事、何らかの感染症の重症度など
を考慮して決定されるものである。考慮され得る追加の因子としては、投与の時間及び頻
度、薬物組合せ(複数可)、反応感度、及び療法に対する耐性/反応が挙げられる。本明細
書において言及された製剤のいずれかを伴う治療に適切な投薬量のさらなる改良は、熟練
した実務家によって、特に、開示された投薬量情報及びアッセイ、並びに臨床試験におい
て観察された薬物動態学的データを考慮してルーチンに行われる。適切な投薬量は、用量
反応データと共に、体液中又は他のサンプルの薬剤の濃度を決定するための確立されたア
ッセイを使用することによって確認してもよい。
投薬の頻度は、薬剤の薬物動態学的パラメーター及び投与経路次第で決まるものである
。投薬量及び投与は、十分なレベルの活性薬剤を提供するように、又は所望の効果を維持
するように調整される。従って、前記医薬組成物は、単回投与、複数の個々に分離した用
量、連続注入、持続放出デポ、又はそれらの組合せで、所望の最小限のレベルの薬剤を維
持するのに必要とされるように投与することができる。
短時間作用型医薬組成物(すなわち、短い半減期)は、1日1回又は1日1回を超える回数、
例えば、1日2、3、又は4回)投与することができる。長時間作用型医薬組成物は、3〜4日
毎、毎週、2週毎に1回投与してもよい。連続注入のための、皮下、腹腔内、又は硬膜下ポ
ンプなどのポンプ。
前記コンジュゲートを医薬として許容し得る担体中に含む組成物は、調製され、適切な
容器に入れられ、適応となる状態の治療のためにラベルされてもよい。ラベル上に適応と
なることが示される状態としては、様々な種類のがんの治療を挙げることができるが、こ
れらに限定されない。以下に示されるようなキットもまた想定され、ここで、該キットは
、医薬組成物の剤形、及び医学的状態の治療における該組成物の使用のための説明書を含
んだ添付文書を含む。
一般に、前記コンジュゲート組成物は、有効量で対象に投与される。一般に、有効量と
は、(1)治療することが求められる疾患の症状を減少させること;又は(2)治療することが
求められる疾患を治療することと関連性のある薬理学的変化を誘導することのいずれかに
効果的な量である。がんについては、有効量は:腫瘍のサイズを減少させること;腫瘍の成
長を減速すること;転移を予防もしくは阻害すること;又は罹患対象の期待生存時間を増加
させることに効果的な量を含んでいてもよい。
(治療の方法)
本技術は、対象におけるがんを治療する方法であって、該対象に、治療的有効量の本明
細書において提供される組成物を投与することを含み、それにより、該対象におけるがん
を治療する、前記方法を提供する。本明細書における方法による治療に適したがんとして
は、一般に、癌腫、白血病、リンパ腫、及び肉腫が挙げられる。癌腫は、肛門、胆道、膀
胱、乳房、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、腎臓、胆嚢及び胆
管、小腸、尿路、卵巣、結腸、非小細胞性肺癌、生殖器、内分泌腺、甲状腺、並びに皮膚
のものであってもよい。他の適したがんとしては、カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、
頭部及び頚部腫瘍、原発性腫瘍、血管腫、黒色腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、並びに脳
、神経、眼、及び髄膜の腫瘍が挙げられる。
いくつかの態様において、治療されるがんは、固形腫瘍、例えば、癌腫、肉腫、黒色腫
、及びリンパ腫を形成する。いくつかの態様において、前記がんは、非小細胞性肺癌、乳
がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、又はそれらの組合せのうちの1つ以上で
ある。いくつかの態様において、前記がんは、非小細胞性肺癌である。いくつかの態様に
おいて、前記対象は、ヒトである。
治療に効果的な用量は、当技術分野において周知の方法によって推定することができる
。マウス腫瘍を有する免疫正常(immune- competent)マウスや、ヒト腫瘍異種移植片を有
する免疫低下(immune-compromised)マウス(例えば、ヌードマウス)などのがん動物モデル
は、当技術分野において周知されており、かつ本明細書に引用のために組み込まれている
多くの引例に広く記載されている。そのような情報は、ヒトにおける安全でありかつ有用
である可能性のある初期用量を決定するために、ラット、イヌ、及び/又は非ヒト霊長類
における安全性研究と組み合わせて用いられる。生物の用量を推定するための追加の情報
が、実際のヒトのがんにおける研究、報告された臨床試験から得られる可能性がある。
いくつかの態様において、前記がんの治療の方法は、がんの少なくとも1つの症状を治
癒させる及び改善させることを包含することが意図される。該患者のがんが治癒した場合
、がんが寛解に達した場合、生存時間が、統計学的に有意に延長された場合、腫瘍増悪ま
での時間が統計学的に有意に増加した場合、各々の種類のリンパ球性又は造血性の悪性病
変に対して確立された標準基準に基づくリンパ球性の又は造血性の腫瘍負荷に減少が見ら
れた場合、又は固形腫瘍負荷が、固形腫瘍における反応評価基準に定義されるように低減
した場合(RECIST 1.0又はRECIST 1.1、Therasseらの文献J Natl. Cancer Inst. 92(3):20
5-216, 2000、及びEisenhauerらの文献Eur. J. Cancer 45:228- 247, 2009)に、がん患者
は治療されたこととなる。本明細書で使用される、「寛解」は、がんの証拠を以前には有
していた患者において、成長するがん細胞が存在しないことを指す。従って、寛解のがん
患者は、がんが治癒したか、又はがんが存在するが容易に検出可能ではないかのいずれか
である。従って、がんは、腫瘍が、増大化も転移もしない場合に、寛解にある可能性があ
る。本明細書で使用される完全寛解は、イメージング、例えば、x線、MRI、CT、及びPET
、又は血液もしくは骨髄生検などの診断法によって示される疾患の非存在である。がん患
者が寛解となった場合、これに再発が続く可能性があり、その場合該がんが再出現する。
いくつかの態様において、前記治療が、ペメトレキセド及び/又はカルボプラチンと組
み合わされることはない。いくつかの態様において、前記治療が、葉酸代謝拮抗薬化合物
及び/又は白金剤と組み合わされることはない。
(キット)
いくつかの態様において、本技術は、本明細書に記載される方法を用いて腫瘍細胞の増
殖を阻害するためのキットを提供する。該キットは、1つ以上の活性薬剤を含有する容器
を含む。該キットは、本技術の方法の実践のための本明細書に記載される他の成分のうち
の任意のものを更に含むことができる。
前記キットは、任意に、腫瘍細胞増殖を阻害するための活性薬剤の使用を開示する指示
書(すなわち、プロトコール)を含んだ説明資料を含んでいてもよい。従って、一態様にお
いて、前記キットは、活性薬剤、好ましくはウレアーゼ酵素を含有する医薬組成物、及び
対象におけるがんの治療のための、該対象への該組成物の投与を教示する説明資料を含む
。一態様において、前記説明資料は、前記組成物が、直接的な注射によって腫瘍内に投与
される場合には、腫瘍のサイズに依存し、かつ腫瘍1mm3あたり0.1〜100国際単位ウレアー
ゼ活性である量で、ウレアーゼ組成物が対象に投与されること、及び前記組成物が、腫瘍
内に直接的な注射以外で対象に非経口投与される場合には、100〜100,000国際単位/kg国
際単位ウレアーゼ活性/kg対象体重の量で、ウレアーゼ組成物が対象に投与されることを
教示する。
別の態様において、前記説明資料は、ウレアーゼ組成物を、固形腫瘍における前記細胞
内でより高く/細胞外でより低いpHグラジエントを減少又は反転させるのに効果的である
ウレアーゼの量で、その有効性が固形腫瘍における細胞内でより高く/細胞外でより低いp
Hグラジエントによって減少する弱塩基性の抗腫瘍化合物も投与されている対象に投与す
ることを教示する。
また、前記説明資料は、前記ウレアーゼを対象における固形腫瘍に局在化させるのに効
果的な条件下で、前記ウレアーゼ組成物を、固形腫瘍を含有するか、又は含有することが
疑われる対象に投与すること、該対象を、対象の組織における細胞外pHの変化を検出する
ことができる診断ツールを用いて調査すること、及び前記投与することの後に細胞外pHの
上昇を示す該対象内の組織領域を識別することを教示する。
前記説明資料は、典型的には、書かれた又は印刷された資料を含むが、これらはそのよ
うなものに限定されない。そのような説明書を保存し、かつそれを末端利用者へと伝達す
ることのできる任意の媒体が、本技術によって想定される。そのような媒体としては、電
子記憶媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えば
、CD ROM)などが挙げられるが、これらに限定されない。そのような媒体は、そのような
説明資料を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでいてもよい。
(実施例)
以下の実施例を、本開示の種々の態様の説明の目的のために記載する。これらは、いか
なる形においても本開示を限定することを意味しない。当業者は、本開示が、対象を実施
し、言及された目的及び利点を得るようによく適合されていることを認めるであろうし、
本明細書に固有のいかなる対象、目的、及び利点についても同様である。本実施例は(本
明細書に記載される方法と共に)、好適な態様の現時点での代表的なものである。これら
は、例示的なものであり、本開示の範囲に対する制限として意図してはいない。特許請求
の範囲により定義される本開示の主旨に包含される変形形態及び他の使用が、当業者の頭
に浮かぶであろう。
(実施例1:L-DOS47:CEACAM6発現腫瘍を標的とする抗体-ウレアーゼコンジュゲート)
腫瘍のマイクロ環境は、多くの場合、正常組織と比較して酸性である。異常な血管系に
由来する局所的な低酸素症に呼応する嫌気性解糖に由来する乳酸の蓄積が、直接の原因で
あるようである(1、2)。しかしながら、がん細胞は、酸素の存在下であっても、グルコー
スを嫌気的に代謝し続ける(3)。このことは、変化した代謝的な表現型及び結果として生
じる酸性環境が、がん細胞に増殖優位性を与えることを示唆する(4)。
尿素をアンモニアへと変換し、溶液のpHを上昇させるタチナタマメウレアーゼが、がん
細胞に対して細胞傷害性であることが示されている(8)。ヒト乳房及び肺異種移植片を有
しているマウスにおける該酵素の腫瘍内注射もまた、腫瘍増殖を顕著に遅らせた(8)。し
かしながら、臨床の現場でのがん治療の腫瘍内送達は、実践が困難である。進行しかつ著
しい転移性の疾患を有する患者において、腫瘍内注射は、実行可能な選択肢ではない。よ
り実践的なアプローチは、前記酵素を、静脈内注射で送達することである。しかしながら
、ウレアーゼは、ターゲティングドメインを欠いており、かつ該酵素の全身送達は、オフ
ターゲットの毒性をもたらし得る。腫瘍を特異的に標的とする抗体-酵素コンジュゲート
を用いて、ウレアーゼががん部位へと送達される。該コンジュゲートにおいて用いられる
この抗体は、非小細胞性肺がん患者においてCEACAM6を特異的に認識する。
肺腺癌細胞上のCEACAM6を認識する単一ドメインラクダ科動物抗体断片(AFAIKL2、配列
番号1)(17)が、タチナタマメウレアーゼ(DOS47)へのコンジュゲーションによりがん治療
薬を作成するために選択された。本技術は、現在ヒト第I相臨床試験中のこの抗CEACAM6-
ウレアーゼコンジュゲート(L-DOS47)に対して行った関係する前臨床研究のいくつかを記
載する。
タチナタマメウレアーゼの抗腫瘍活性を、抗体-ウレアーゼコンジュゲート(L-DOS47)の
形態で、抗CEACAM6単一ドメイン抗体の特異性と組み合わせた。L-DOS47は、CEACAM6発現
がん細胞株に特異的に結合し、強力な細胞傷害性効果を発揮した。競合的結合アッセイで
は、L-DOS47の結合親和性が、増加したアビディティーのために、天然の単一ドメイン抗
体のそれよりも約500倍強力であったことが示された。L-DOS47の細胞傷害性は、インサイ
チュでの尿素のアベイラビリティ、及び標的細胞のアンモニア毒性への感受性に依存する
。BxPC-3細胞は、CEACAM6遺伝子をサイレンシングすることによってL-DOS47の効果から保
護されたが、CEACAM6の過剰発現は、トランスフェクトされたH23細胞を、L-DOS47の細胞
傷害性に対し感受性のものとした。ヒトの正常組織及びがん組織の免疫化学的な染色では
、L-DOS47が、肺腺癌に優先的に結合し、また、陽性ではあるがより弱い染色で結腸及び
膵臓の腺癌に結合することが示された。マウスにおける肺腺癌A549細胞の転移研究におい
ても、L-DOS47が10μg/mLの濃度で、肺におけるがん細胞数の減少に効果的であることが
示された。
材料.タチナタマメ(Canavalia ensiformis)ウレアーゼは、BioVectra Inc.(PEI、Canad
a)から得て、酸析、アルコール分画、及びイオン交換クロマトグラフィーによって更に精
製した。SDS-PAGE、HPLC、及び質量分析によって決定された酵素の純度は、＞97％であっ
た。ウレアーゼの1単位は、25℃及びpH7.6で1マイクロモル/分のアンモニアの生成と定義
される。
ラマの重鎖抗体レパートリーに由来して得たファージライブラリーを使用して、非小細
胞性肺腺癌A549に対するパンニングによって単一ドメイン抗体(sdAb)を同定した。該sdAb
を、AFAIと名付けた(17)。コンジュゲーションを目的としてAFAIの遺伝子配列を最適化し
て、AFAIKL2と新たに命名した。該AFAIKL2抗体をその後、クローニングして、大腸菌BL21
(DE3) pT7-7システムで発現させた。該抗体を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて
封入体から精製した。該抗体のウレアーゼへのコンジュゲーションは、ヘテロ二官能性架
橋剤であるN-サクシニミジル(4-ヨードアセチル)アミノ-ベンゾエート(SIAB)を用いて行
った。該AFAIKL2抗体を、先ず、一級アミン基を介してSIABリンカーのNHSエステル部分で
活性化した。該活性化された抗体を、前記架橋剤のヨードアセチル基を介してウレアーゼ
に結合させ、酵素上に存在するスルフヒドリル基を遊離させた。目標コンジュゲーション
比率(1:6〜1:10、ウレアーゼ対抗体の比)は、高純度ウレアーゼ及び活性化された抗体を
、2:1の質量比で混合することにより制御した。該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを、限
外濾過によって精製した。
尿素、トリプシン(組織培養グレード)、フェナジンエトスルファート(PES)、ニトロプ
ルシドナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム溶液、フェノール、NaCl、KH2PO4、MgSO4、NaH
CO3、及びグルタルアルデヒドは、Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)から購入した。3
-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフ
ェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)、及びトリプシン(ペプチド断片化及び質量分析法によ
る分析における使用のためのもの)は、Promega Corp. (Madison, WI)から購入した。過酸
化水素(30％)、SIAB、KCl、D-グルコース、HCl、Na2HPO4、及びNaH2PO4は、Fisher Scien
tific (Ottawa, ON)から購入した。ウシ血清アルブミン分画V(BSA)は、Roche (Indianapo
lis, IN)から購入した。塩化アンモニウム(0.100M)は、Ricca Chemical (Arlington, TX)
から購入した。抗AFAIKL2-ペルオキシダーゼコンジュゲートは、Rockland Immunochemica
ls (Gilbertsville, PA)によって製造された。細胞培養培地(RPMI)、ウシ胎仔血清、及び
抗生物質は、Life Technologies (Burlington, ON)から得た。雌性CrTac:NCr-Foxn1nuヌ
ードマウスは、Taconic (Hudson, NY)によって供給された。本実験において用いられた変
法クレブス・リンゲル緩衝液(KRB)は、NaCl(98.3mM)、KCl(4.73mM)、KH2PO4(1.19mM)、Mg
SO4(1.19mM)、D-グルコース(11.7mM)、Na2HPO4(11.1mM)、及びNaH2PO4(2.77mM)を含有し
ていた、pH7.2。
(インドフェノールアッセイ)
ウレアーゼ酵素反応によって生成するアンモニアの量を、改良インドフェノールアッセ
イを用いて決定した(18)。手短にいうと、165mgのフェノール及び132mgのNaOHペレットを
10mLの水に溶解させ、それに続き66μLのニトロプルシドナトリウム溶液(10mg/mL)を添加
することによって、溶液Aを新たに調製した。40μLの次亜塩素酸ナトリウムを5mLの水に
加えることによって、溶液Bを調製した。ホールセル結合アッセイ(下記を参照されたい)
からのサンプル溶液(各々30μL)を、50μL/ウェルの5N NaOH:H2O(3.3:46.7)及び20μL/ウ
ェルの水を含有する新たな96ウェルプレートに移した。溶液A(50μL/ウェル)及び溶液B(5
0μL/ウェル)を加えて、該プレートをその後、37℃で30分間発色用のマイクロプレートリ
ーダーに移した。ODを630nmで測定した。ウェル内で生成されたアンモニアの量を、塩化
アンモニア(0〜150μM)を標準として用いた検量線から計算した。
(L-DOS47のホールセル結合アッセイ)
100μL/ウェルの腫瘍細胞(4×104細胞/ウェル)を96-ウェル培養プレート内に播種する
ことによって細胞単層を調製し、37℃で1晩インキュベートした。培地を、プレートから
取り除き、細胞単層を、100μL/ウェルの0.05％グルタルアルデヒド(リン酸緩衝生理食塩
水PBS中)で、10分間室温で(RT)固定した。プレートをその後、PBSで洗浄し、120μL/ウェ
ルのグリシン溶液(50mM)を加えて、37℃で20分間インキュベートした。インキュベーショ
ン後、プレートを、120μL/ウェルの1％ BSA/PBSで37℃で30分間ブロックした。その後、
プレートをバッファーA(PBS中0.05％ BSA)で3回洗浄し、80μL/ウェルの希釈されたL-DOS
47又はDOS47溶液を加え、37℃で1.5時間インキュベートした。結合シグナルは、尿素法又
は抗体法のいずれかによって発生させた:(1)尿素法では、プレートをバッファーAで4回洗
浄し、80μL/ウェルの20mM尿素(0.1Mリン酸緩衝液中に調製、pH7.6)を加え、37℃で30分
間インキュベートした。インキュベーション後、40μL/ウェルの1N HClを加えて反応を停
止させた。各ウェル内で生成されたアンモニアの量を、インドフェノールアッセイを用い
て決定した。(2)抗体法については、先ず、ブロッキング工程前に内在性ペルオキシダー
ゼを、100μL/ウェルの0.3％過酸化水素で30分間クエンチした。被験物とインキュベーシ
ョンした後に、プレートをPBSで洗浄し、希釈された抗AFAIKL2-ペルオキシダーゼ抗体コ
ンジュゲート(1:8000)を、0.05％のTween-20及び0.1％の粉乳を含有するバッファーA中に
調製した。プレートを、バッファーAで3回洗浄し、100μL/ウェルの抗体-ペルオキシダー
ゼコンジュゲートをプレートに加えた。37℃で1時間インキュベーション後、プレートを
バッファーAで3回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質を、0.03％のH2O2を含有するクエン酸
ナトリウムバッファー中に、1mMで調製し、100μL/ウェルの前記基質溶液を加え、RTで30
分間インキュベートした。プレートを、405nmでのOD測定のためにマイクロプレートリー
ダーに移した。
(L-DOS47の細胞傷害性アッセイ)
100μL/ウェルの腫瘍細胞(4×104細胞/ウェル)を、96-ウェル培養プレート内に播種す
ることによって細胞単層を調製し、37℃で1晩インキュベートした。培地を、各ウェルか
ら取り除き、80μL/ウェルのL-DOS47又はDOS47のいずれかを加え、37℃で2時間更にイン
キュベートした。インキュベーション後、プレートをバッファーAで3回洗浄した。その後
、KRB中100μL/ウェルの尿素(20mM)を、プレートに加え、37℃で1晩インキュベートした
。培地を取り除き、100μL/ウェルの単純培地(plain medium)と置き換えた。細胞生存率
を、MTS/PES溶液の混合物(20:1 vol/vol; MTS、2mg/mL; PES、1mg/mL)を調製し、20μL/
ウェルの該混合物を、プレートに加えるMTS細胞生存率アッセイを用いて決定した。プレ
ートをその後、37℃で1〜2時間インキュベートし、ODを、490nmを参照として630nmで測定
した。
(細胞ベースの電気化学発光(ECL)結合アッセイ)
L-DOS47、AFAIKL2抗体、及びDOS47を、製造業者の説明書に従いルテニウム-NHS-エステ
ル(スルホタグ(Sulfo-Tag), Meso Scale Discovery MSD; Rockville, MD)で標識した。こ
れらのルテニウムタグ化タンパク質は、L-DOS47及びAFAIKL2の標的抗原への結合の直接的
な測定を可能とした。直接的な結合アッセイのために、BxPC-3細胞単層を、96-ウェルSEC
TOR PR High-Bindプレート(MSD)上に調製した。固定化及びブロッキング後に、種々の量
のL-DOS47-タグ又はAFAIKL2-タグを加えた。プレートを、37℃で1.5時間インキュベート
した。インキュベーション後、プレートを、2回洗浄し、読み取りバッファー(Read Buffe
r)(MSD)で満たした。ECLシグナルを、その後SECTOR PR-100リーダー(MSD)を用いて直ちに
読み取った。競合的結合アッセイについては、L-DOS47又はAFAIKL2抗体を用いて、L-DOS4
7-タグのBxPC-3細胞への結合を阻害した。1μg/mLのL-DOS47-タグを用いてBxPC-3細胞に
結合させた。種々の濃度の競合剤(L-DOS47又はAFAIKL2)を用いて、タグ化L-DOS47の結合
を競争させた。インキュベーション後、プレートを2回洗浄し、読み取りバッファーで満
たした。その後、SECTOR PR-100リーダーを用いて、プレートを直ちに読み取った。
(BxPC-3細胞におけるCEACAM6遺伝子のノックダウン)
CEACAM6がL-DOS47によって認識される特異的抗原であることを確認するために、陽性細
胞株BxPC-3のCEACAM6遺伝子を、OriGene (Rockville, MD)からのHuSH-29ヘアピン発現ク
ローンを用いてサイレンシングさせた。これらのプラスミドは、RNA干渉を介して標的遺
伝子の転写をブロックする短いヘアピンRNA(shRNA)配列を転写する。BxPC-3細胞を、HuSH
プラスミドでトランスフェクトし、安定にトランスフェクトされた細胞を、ピューロマイ
シンを用いて選択した。異なるクローンを、
Figure 2020143084
 及び対照プラスミドHuSH-TRSのトランスフェクションから得た。2つの陽性安定細胞株(HU
SH#6及びHUSH#7)並びに対照(HUSH-TRS)を、抗生物質選択によって得た。その後、これら
のクローンを用いて、ホールセル結合アッセイを用いてL-DOS47との結合をチェックした
。L-DOS47とインキュベーションした後、プレートをバッファーAで3回洗浄し、80μL/ウ
ェルの20mM尿素(0.1Mリン酸緩衝中に調製、pH7.6)を加えた。プレートを、37℃で30分間
インキュベートした。酵素反応を、40μL/ウェルの1N HClを加えることにより停止させた
。生成されたアンモニアの量を、インドフェノールアッセイを用いて決定した。
(CEACAM6遺伝子のH23細胞へのトランスフェクション)
G418選択マーカーを含有する哺乳動物の発現ベクターを、PMP-GFP(形質膜タンパク質-
緑色蛍光タンパク質)及びCEACAM6遺伝子とクローニングした。セルフェクチン(Cellfecti
n)試薬(Life Technologies)を用いて、発現ベクターをH23細胞内にトランスフェクトした
。手短にいうと、2mLの完全RPMI培地(10％のウシ胎仔血清及び50U/mlのペニシリン及び50
μg/mlのストレプトマイシンを含有)中の2×106細胞/ウェルのH23細胞を、6-ウェル培養
プレートに播種し、37℃で1晩インキュベートした。セルフェクチン試薬(10μL)及びDNA(
1〜2μL)を、それぞれ、100μLの無血清RPMI培地に希釈した。その後、2つの希釈溶液を
合わせて、穏やかに混合して、RTで30分間インキュベートした。プレートを、1.5mLの無
血清RPMI培地で2回洗浄した。合わせた溶液を、0.8mLの無血清RPMI培地に希釈して、穏や
かに混合し、細胞に加えた。細胞を、CO2インキュベーター内で37℃で1晩インキュベート
した。翌日、培地を、2mLの完全RPMI培地と置き換えた。トランスフェクトされた細胞は
、CEACAM6と同じmRNA由来のGFPを共発現した。トランスフェクトされた細胞を、400μg/m
LのG418抗生物質を含有する培地中でのインキュベーションによって選択した。細胞を直
接、又はCEACAM6の表面発現を示すcy5.5で標識したL-DOS47とのインキュベーション後に
、ソーティングした。
(L-DOS47によるヒト腫瘍組織の免疫化学的染色)
42の癌性及び正常組織を代表する合計で400個の組織サンプルをスクリーニングした(Ax
el Wellmann, University Hospital Aachen, RWTH Aachen Germany)。初めに、スライド
を、乾燥機内で62℃で1時間垂直の向きでインキュベートして、パラフィンを除去した。
その後、スライドを、キシレン代替品中で、5×4分間脱ろうした。スライドを、100％、9
5％、及び75％エタノール中で、各々2×3分間水和して、その後水道水に5分間漬けた。内
在性ペルオキシダーゼを、0.3％H2O2で30分間でクエンチした。ベクタステインElite ABC
キット(Vector Labs, Burlington, ON)を用いて、スライド上のL-DOS47結合を検出した。
手短にいうと、PBS中で3×5分間洗浄した後に、スライドを、ブロッキング血清中で4℃で
1晩インキュベートした。その後、スライドを、L-DOS47溶液(バッファーA中20μg/mL)中
で37℃で1.5時間インキュベートした。PBSで洗浄した後に、スライドを、マウス抗ウレア
ーゼ抗体(Sigma, 1:1500)と37℃で1時間インキュベートした。PBSで洗浄した後に、スラ
イドを、ビオチン化された二次抗体溶液(Vector Labs)と30分間インキュベートした。PBS
で洗浄した後に、スライドを、ベクタステインElite ABC試薬と30分間インキュベートし
た。PBSで洗浄した後に、スライドを、新鮮なDAB(3、3’-ジアミノベンジジン)ペルオキ
シダーゼ基質溶液混合物(Vector Labs)中で、RTで2分間インキュベートした。反応を、水
道水中5分間洗浄することにより停止させた。その後、スライドを、マイヤーヘマトキシ
リン中で10秒間対比染色した。スライドを、75％、80％、95％、及び100％エタノール中
で脱水した。キシレン中で透明化した後に、スライドに、Clarion Mounting Mediumを載
せた。
(A549転移研究)
A549腫瘍細胞(5×106)を播種し、低結合性(low binding)培養プレート中で成長させた
。十分な数が得られたら、細胞を回収して、5×106細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁さ
せた。その後、細胞を、6-ウェルの低結合性組織培養プレートに、1mL/ウェルで入れた。
その後、終濃度が10又は15μg/mLのL-DOS47(1mL)を、各ウェルに加えた。アイソタイプ対
照を、10μg/mLのV21-DOS47コンジュゲート(血管内皮増殖因子(VEGF)レセプターを標的と
する抗体-ウレアーゼコンジュゲート)で処理した。細胞を、37℃で4時間インキュベート
した。インキュベーション後、細胞を、遠心分離して、無菌のPBSで3回洗浄し、無菌のPB
S中に1×107細胞/mLで再懸濁した。その後、各々のマウスは、1×106の処理された細胞の
接種を1回受けた。この研究は、4群の雌性のCrTac:NCr-Foxn1nuマウス(非処理、アイソタ
イプ、並びにL-DOS47(10及び15μg/mL))からなっていた。合計で40頭のマウス(各群あた
り10頭)に、尾静脈を介してA549腫瘍細胞を静脈内接種した。
1群あたり5頭の動物を、第22日(3週)に安楽死させ、残りの動物は、第71日(10週)まで
維持した。屠殺後、動物に墨汁(Calvert Labs; Olyphant, PA)を気管内注射して;その後
、肺を切除し、それに続きFeketeの溶液(Calvert Labs)で固定した。腫瘍転移に対する被
験物の効果を、解剖顕微鏡下で、各肺における転移性腫瘍(フォーカス)の数を数えること
によって決定した。各群からの代表的な肺を、撮影した。
(L-DOS47の種々のがん細胞株への結合)
5つの腫瘍細胞株 - BxPC-3、Capan-1、ZR-75-30、LS174T、及びMDA-MB231の間で、L-DO
S47の異なる結合プロファイルが観察された(図1A)。この結果は、L-DOS47が、2つの膵臓(
BxPC-3及びCapan-1)及び乳房(ZR-75-30)細胞株によく結合していたことを示しており、CE
ACAM6抗原が、細胞表面に発現されていたことを示している。中程度の結合が結腸細胞株L
S174Tにも観察されたが、乳房細胞株MDA-MB231では結合は見られなかった(陰性対照)。AF
AIKL2抗体は、ウレアーゼ酵素にコンジュゲートされた場合、CEACAM6発現細胞に対する特
異的なターゲティングを提供した。これは、DOS47で処理された細胞における結合シグナ
ルの非存在によって確認された(データは示していない)。
(L-DOS47の細胞傷害性)
図1Bにおいて、BxPC-3及びZR-75-30の双方が、L-DOS47細胞傷害性に対して感受性であ
ることが示された。細胞生存時間の急速な低下が、1μg/mL未満のL-DOS47で処理されたこ
れら2つの細胞株において観察された。中程度の効果が、Capan-1及びLS174T細胞において
観察された。陰性対照細胞株MDA-MB231に対しては、L-DOS47は、何ら効果を有しない。よ
り多くの細胞株からの結合及び細胞傷害性の結果の一覧を、表1に示した。L-DOS47細胞傷
害性は、対応する細胞株上のL-DOS47の結合活性に直接的に依存する。A549及びCapan-1の
より弱い細胞傷害性応答は、これら2つの細胞株がアンモニア毒性に対してより高い耐性
があることが原因である(データは示していない)。一方で、H23細胞は、アンモニアに対
し高い感受性を有する(データは示していない)。細胞表面にCEACAM6抗原が存在しないに
もかかわらず、H23細胞はなお、恐らくウェルにおいて非特異的に結合したL-DOS47の存在
が原因の、L-DOS47に対する幾分弱い細胞傷害性応答を示す。
表1. 9つのヒト腫瘍細胞株に対するL-DOS47の種々の結合及び細胞傷害性研究から得られ
た結果の概要
Figure 2020143084
 ここで:+、陽性(+の数は、活性の強度を示す);-、陰性
表1に示されるように、4つのヒト組織由来の5つの細胞株(BxPC-3、Capan-1、ZR-75-30
、LS174T、及びA549)は、強力なL-DOS47結合性及びL-DOS47細胞傷害性に対する良好な感
受性(A549を除く)を示した。L-DOS47の細胞傷害性効果は、がん細胞に対する相対結合強
度に多かれ少なかれ依存している。グラフ中の結果は、代表的な実験の平均(n=3)を示す
。全ての値について、標準偏差(SD)は、10％未満であった。
(BxPC-3細胞に対するL-DOS47の直接的及び競合的結合)
細胞ベースの電気化学発光結合アッセイは、腫瘍細胞に結合したルテニウムで標識され
た抗体コンジュゲートの直接的な検出を可能とする。図2Aにおいて、ルテニウムタグ化L-
DOS47及びAFAIKL2抗体の双方は、BxPC-3細胞に結合することが分かった。一方、ルテニウ
ムタグ化DOS47は、陰性対照として作用した。L-DOS47は、L-DOS47において呈されたより
高い抗体アビディティー(6〜10抗体)に起因して、AFAIKL2抗体よりもかなり高い結合親和
性を示した。この結果を、L-DOS47及びAFAIKL2抗体を競合剤として用いて、ルテニウムタ
グ化L-DOS47のBxPC-3細胞への結合を阻害してさらに確認した(図2B)。L-DOS47及びAFAIKL
2抗体の双方は、ルテニウムタグ化L-DOS47のBxPC-3への結合を阻害し、かつ、予想通りに
、L-DOS47は、AFAIKL2抗体よりもより良好な結合親和性、従ってそれよりもルテニウムタ
グ化L-DOS47のBxPC-3への結合のより強力な阻害を実証した。L-DOS47及びAFAIKL2抗体の
双方の見かけの結合親和性は、該被験物のIC50(結合の50％の減少を引き起こすのに必要
とされる競合剤の量)によって比較可能である。L-DOS47及びAFAIKL2抗体のIC50は、それ
ぞれ2及び20μg/mLと推定され;即ち、L-DOS47については3.22nM(1個のウレアーゼに対し
て6個の抗体のコンジュゲーション比率でMW=622k)及びAFAIKL2について1.55μM(MW=12.9k
)であった。この結果は、L-DOS47の結合親和性が、AFAIKL2抗体のそれの約500倍であるこ
とを示唆した。
(H23細胞におけるトランスフェクトされたCEACAM6遺伝子の過剰発現)
CEACAM6遺伝子をトランスフェクションした後に、陽性クローンH23-CC6 #7を特定した
。A549細胞のCEACAM6レベルに近いCEACAM6レベルを有するクローンを、L-DOS47-cy5.5を
用いてH23-CC6 #7クローンを再選別することによって得た。より多い量のG418抗生物質(8
00μg/mL)との該クローンのさらなるインキュベーションは、より高いレベルのCEACAM6発
現を伴うものを選択するのに役立った。H23-CC6 #7は、A549及びBxPC-3細胞よりも少ない
CEACAM6を細胞表面に発現していたが、このCEACAM6をトランスフェクトされたクローンは
、アンモニア毒性に対するその高い感受性に起因して、L-DOS47細胞傷害性に対してBxPC-
3細胞よりもいっそう高い感受性がある(図3B)(データは示していない)。
(BxPC-3細胞におけるCEACAM6遺伝子ノックダウン)
L-DOS47の2つのCEACAM6ノックダウンクローン(HUSH#6及びHUSH #7)に対する結合は、天
然のBxPC-3細胞及び対照クローン(HUSH-TR3)のそれと比べて顕著に減少した(図3C)。この
実験は、細胞表面におけるCEACAM6の存在が、L-DOS47結合にとって重要であることを明確
に示した。該遺伝子をサイレンシングすると、L-DOS47の結合がまさに実質的に減少した
。
(L-DOS47によるヒト腫瘍組織の免疫化学的染色)
正常組織及びがん組織のスクリーニングは、L-DOS47が、腺癌サブタイプをほとんど排
他的に認識することを実証した(表2)。種々の癌組織及びマッチさせた正常組織からなる4
2群を代表するスクリーニングされた400を超える組織サンプルのうち、肺腺癌組織は、か
なりの染色を示し、80％を超える細胞が認識された。対応する年齢をマッチさせた正常肺
組織は陰性であり、いくつかの活性化肺細胞におけるわずかな局所的染色を伴っていた。
いくらか陽性を示したが染色が弱かった他の組織は、結腸及び膵臓腺癌である。図4は、
結腸及び肺腺癌のL-DOS47での免疫化学的染色を示す。
表2.L-DOS47結合のヒトの正常組織及びがん組織スクリーニング
Figure 2020143084
ヒト結腸及び肺腺癌のL-DOS47による免疫組織化学的染色は、図4に示す通りである。
(A549転移研究)
10及び15μg/mlのL-DOS47で処理されたA549細胞を受けたマウスは、3週目に、低減した
肺腫瘍カウントを示し、非処理対照群と比較して有意な低減(p＜0.05)が実証された(表3)
。しかしながら、10週目において、腫瘍細胞カウントの平均数に有意な低減は見られなか
った。統計的に有意でないが、10μg/mlのL-DOS47による処理は、処理後3週目及び10週目
双方で、非処理対照群と比較した場合、平均腫瘍細胞の数の一貫した低減を示した(表3)
。興味深いことに、アイソタイプ対照(V21-DOS47)も、肺における腫瘍カウントの数に影
響を及ぼし、減少させた。まとめると、A549細胞の10μg/mLのL-DOS47による処理は、処
理後3週目で肺腫瘍の平均数を減少させたが、処理後10週までに平均腫瘍数には有意な低
減が観察されなかったため、この効果は一過性であった。
表3. A549転移研究においてカウントされた肺腫瘍の平均数
Figure 2020143084
 #平均値±平均値の標準誤差;*非処理対照群と比較した場合、p＜0.05。
表3に示されるように、A549ヒト肺腺癌細胞を、インビトロでL-DOS47又はアイソタイプ
対照(V21-DOS47)で処理した。37℃で4時間インキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し
、PBS中に1×107細胞/mLで再懸濁した。その後、各々のマウスは、1×106個の処理された
細胞の播種を1回受けた。1群あたり5頭の動物を、注射後3週後及び10週後に安楽死させた
。腫瘍転移に対する被験物の効果を、解剖顕微鏡下各肺における転移性腫瘍の数をカウン
トすることによって決定した。L-DOS47処理群における転移性腫瘍増殖を、独立t検定によ
って非処理対照群と比較した。処理後3週目でのL-DOS47との共注射は、腫瘍カウントの数
を顕著に減少させた。
ウレアーゼによって媒介されるアンモニア生成及び局所的pH上昇に基づく有望ながん治
療薬としての該酵素の使用が実証された(8)。しかしながら、該酵素が、正常細胞と比較
した腫瘍細胞に対する選択性を欠いていることは、がん治療薬としてのその応用を制限し
てきた。抗体-薬物コンジュゲート(ADC)、より詳細には、本技術の抗体指示型酵素プロド
ラッグ療法(ADEPT; antibody-directed enzyme prodrug therapy)の適用によって、この
制限を回避することができる。本実施例において、抗体-ウレアーゼコンジュゲートの特
定の形態(L-DOS47)を、CEACAM6特異的ラマ単一ドメイン抗体(AFAIKL2)をウレアーゼ(DOS4
7)にコンジュゲートさせることによって作製した。該コンジュゲートしたAFAIKL2抗体は
、特異性を提供し、従って、ウレアーゼ酵素のCEACAM6発現腫瘍に対する有効性を強化す
る。細胞表面にCEACAM6を発現するがん細胞へのL-DOS47の特異性を、インビトロ結合研究
によって評価した(図1及び図2)。これらの研究の結果は、L-DOS47が、CEACAM6発現細胞株
(BxPC-3、Capan-1、ZR-75-30、及びLS174T)に結合したが、非発現細胞株(MDA-MB231)には
結合しなかったことを実証した。加えて、CEACAM6の機能的役割を、がん細胞におけるCEA
CAM6のノックダウン実験及び過剰発現実験によって確認した(図3)。CEACAM6を、CEACAM6
にコードされたプラスミドをH23細胞中にトランスフェクトさせることによって過剰発現
させる一方、遺伝子ノックダウンを、BxPC-3細胞においてCEACAM6の低分子ヘアピン型RNA
介在性除去によって行った。結合研究において、L-DOS47が、天然のBxPC-3細胞に高い親
和性で結合したが、CEACAM6遺伝子がノックダウンされたBxPC-3細胞には結合しないこと
が示された(図3C)。対照的に、H23細胞におけるCEACAM6の過剰発現は、該細胞をL-DOS47
結合及び細胞傷害性に対して感受性なものとした(図3A及び図3B)。これらの結果は、L-DO
S47のCEACAM6抗原に対する特異的結合が、該抗体コンジュゲートが腫瘍細胞傷害性を誘導
するのに重要であることを示した。個々の抗体と比較した抗体をウレアーゼへコンジュゲ
ートさせることの別の利益は、アビディティーの総合的な増加である。ECL結合アッセイ
においては、1個のウレアーゼに対して抗体が6〜10個のモルコンジュゲーション比率を有
するL-DOS47は、BxPC-3細胞に、単一の抗体よりも500倍良く結合したことが示された(図2
B)。さらなる結合研究によって、6:1を超える抗体対酵素のコンジュゲーション比率が、C
EACAM6に結合するL-DOS47に最適であることが示唆されている(データは示していない)。
作用機序を、インビトロ及びインビボでの研究によって調査した。ウレアーゼは、L-DO
S47の活性成分であり、以前の研究により、ウレアーゼが、インビトロでヒト腫瘍細胞に
対して細胞傷害性であることが実証されている(8)。ヌードマウスにおけるA549(肺)及びM
CF-7(乳房)腫瘍に対するウレアーゼの腫瘍内投与は、腫瘍増殖を顕著に阻害した(8)。し
かしながら、ウレアーゼ又はL-DOS47の細胞傷害性の有効性もまた、腫瘍細胞株のアンモ
ニアに対する感受性に依存する。例えば、図1Aにおいて、L-DOS47は、BxPC-3、ZR-75-30
、及びCapan-1に対してほぼ等しく良好に結合したが、Capan-1は、他の2つの細胞株と比
較して中程度の細胞傷害性応答を示した(図1B)。Capan-1は、BxPC-3及びZR-75-30と比較
して、アンモニア細胞傷害性効果に対する感受性が低い(データは示していない)。同様に
、ヒト肺腺癌H23細胞は、アンモニアの存在に対して感受性である;ひとたびCEACAM6遺伝
子でトランスフェクトされると、該細胞株は、BxPC-3(データは示していない)及びA549細
胞(図3A)と比較してより少ないCEACAM6抗原が細胞表面に提示されていたにもかかわらず
、L-DOS47細胞傷害性に対して感受性となった(図3B)。結論として、L-DOS47が腫瘍に対し
て細胞傷害性効果を発揮するためには、細胞表面におけるCEACAM6の発現及びアンモニア
に対する感受性が、2つの重要な要件である。
ヒトがん組織の免疫組織化学的スクリーニングによって、L-DOS47が、肺、結腸、及び
膵臓腺癌に対して特異的であったことが示された(表2)が、対応する正常組織に対しては
そうではなかった。ウレアーゼの表面での複数の抗体のコンジュゲーションは、CEACAM6
抗原に対する特異性を大いに強化しており(図1A及び2)、該酵素の非特異的な結合の性質
を減少させている(データは示していない)。インビボでの研究により、腫瘍異種移植片に
対するL-DOS47の有効性がさらに確認された。腫瘍成長阻害が、ヌードマウス腫瘍異種移
植片へのL-DOS47のIV投与(データは示していない)及びA549肺腺癌の転移研究(表3)におい
て観察された。肺のフォーカスの有意な減少が、10又は15μg/mLのL-DOS47で処理されたA
549細胞において注射後3週間観察された(表3)。しかしながら、恐らく、L-DOS47の動物か
らのクリアランスが原因で、10週後には有意差は見られなかった。アイソタイプ対照(V21
-DOS47、抗VEGFR2-DOS47コンジュゲート)もまた、A549細胞は通常の条件でVEGFR2を発現
しないという事実にもかかわらず、ある程度の肺のフォーカスの減少を引き起こした。Oh
wadaらの文献(19)は、A549細胞において、50mMのHClへの曝露後にVEGFRの機能性が誘導さ
れることを報告している。この傷つけられているA549細胞の抑制された増殖は、外来性の
VEGF投与によって回復させることができた一方で、中和抗VEGFR1及び抗VEGFR2抗体の添加
は、細胞増殖を再抑制した。しかしながら、VEGF及び抗VEGFR抗体の双方は、対照細胞に
対する効果を有さなかった。理論によって束縛されることは望まないが、A549細胞におけ
るVEGFR2の機能性が、この転移研究における細胞調製プロセスの間に誘導されている可能
性がある。このことは、何故細胞数の減少がアイソタイプ対照群において観察されたのか
を説明する。インビトロ及びインビボ双方での研究の結果により、ウレアーゼ上の抗体コ
ンジュゲーションが、良好な選択性及び有効性で該抗体-コンジュゲートが、CEACAM6発現
腫瘍を特異的に標的とすることを可能としたことが実証されており、このことはL-DOS47
の臨床開発のための概念実証を提供する。
(実施例2.再発性又は転移性の非扁平上皮NSCLC(非小細胞性肺がん)におけるL-DOS47の用
量漸増試験)
本研究の主要な目的は、ステージIV(TNM M1a及びM1b)再発性又は転移性非扁平上皮非小
細胞性肺がんの患者において、ペメトレキセド/カルボプラチンの標準的なダブレット療
法と組み合わせたL-DOS47のある範囲の用量が、どの程度安全であるのか、どの程度良好
な耐容性を示すのか、及びどの程度効果的であるのかを評価することである。
主要な評価項目は、以下のとおりである。ペメトレキセド/カルボプラチンとの組合せ
治療におけるL-DOS47の測定安全性及び認容性としての有害事象を伴う患者の数は、参加
者が12週間追跡されることである。これを、安全性論点に指定する。AE報告期間は、第1
サイクルの第1日に開始され、最後の研究来診まで続く。2次的な評価項目は、以下のとお
りである。RECIST 1.1による組合せ治療を受けた患者の奏効率(objective response rate
)は、12週までであり、これは安全性論点には指定されない。客観的腫瘍応答は、少なく
とも2サイクルの研究治療を完了し、少なくとも1つの処理後疾患評価を受けた患者におい
て、RECISTバージョン1.1によって評価されるものとする。持続性の臨床的利益を受けた
患者の数を12週まで追跡し、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47+ペメトレキセ
ド/カルボプラチンとの組合せ治療後、完全奏効、部分奏効、及び安定となった患者の百
分率として定義される。ペメトレキセド/カルボプラチンとの組合せ治療における投薬後
のL-DOS47の最高観察血漿濃度(Cmax)は、12週までであり、これは安全性論点には指定さ
れない。L-DOS47の薬物動態学的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採
取された血漿サンプルから決定されるものとする。ペメトレキセド/カルボプラチンとの
組合せ治療における投薬後の、L-DOS47の最高観察血漿濃度までの時間(Tmax)は12週まで
であり、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47の薬物動態学的パラメーターは、L
-DOS47を投与された全ての患者から採取された血漿サンプルから決定されるものとする。
L-DOS47の濃度時間曲線下面積(AUC)は、ペメトレキセド/カルボプラチンとの組合せ治療
における投薬後の12週までであり、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47の薬物
動態学的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取された血漿サンプル
から決定されるものとする。L-DOS47の最終消失半減期は、ペメトレキセド/カルボプラチ
ンとの組合せ治療における投薬後の12週までであり、これは安全性論点には指定されない
。L-DOS47の薬物動態学的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取され
た血漿サンプルから決定されるものとする。ペメトレキセド/カルボプラチンとの組合せ
治療においてL-DOS47を投与された患者についての抗L-DOS47抗体の存在は12週までであり
、これは安全性論点に指定される。血清サンプルを、L-DOS47を投与された全ての患者か
ら採取し分析することとする。
ペメトレキセド及びカルボプラチンとL-DOS47とを伴う実験を行うこととする。患者は
、1つのコホートあたり最小で3名、最大で6名としたL DOS47の漸増用量のコホートにリク
ルートされるものとする。L DOS47の初期用量は、0.59μg/kgとし;評価される可能性のあ
るさらに用い得る用量レベルは0.78、1.04、1.38、及び1.84μg/kgである。それぞれ、L-
DOS47と組み合わせて投与されるべきペメトレキセド［500mg/m2］及びカルボプラチン［A
UC6］の標準治療用量は、コホート間で一定のままとする。1治療サイクルは21日とし、患
者は、L DOS47をサイクルの第1日、第8日、及び第15日に受け、ペメトレキセド/カルボプ
ラチンを各治療サイクルの第1日に受ける。患者が、L-DOS47とペメトレキセド/カルボプ
ラチンとの組合せ治療を4サイクル受けることが計画される。組合せ治療の4サイクルの後
に進行が見られず、かつ許容し得ない毒性を経験していない患者には、臨床的利益が存在
し、それに良好な耐容性が示されている限りは、治験責任医師の意見によってL-DOS47治
療を疾患の進行まで受け続ける機会があたえられるものとする。ペメトレキセド/カルボ
プラチンの毒性が原因で4サイクルのL-DOS47+ペメトレキセド/カルボプラチン組合せ治療
を完了することができない患者には、臨床的利益が存在し、それに良好な耐容性が示され
ている限りは、治験責任医師の意見によって、ペメトレキセド/カルボプラチンの中断後
に、L-DOS47治療を疾患の進行まで受け続ける機会が与えられるものとする。
(実施例3.非小細胞性肺がんを治療するためのイムノコンジュゲートL-DOS47の第I/II相非
盲検非無作為化用量漸増試験)
本研究の主要な目的は、L-DOS47のある範囲の用量が単剤療法として与えられた場合に
、非扁平上皮の非小細胞性肺がんの患者において、どの程度安全であるのか、どの程度良
好な耐容性を示すのか、及びどの程度効果的であるのかを評価することである。
主要な評価項目は、以下の通りである。L-DOS47の安全性及び認容性の尺度としての薬
物関連有害事象の発生率及び重症度は、12週までであり、これは安全性論点に指定される
。これらは、第1サイクルの第1日に始まり最後の研究来診まで続くAE報告期間の間評価さ
れる。
2次的な評価項目は、以下の通りである。注入後の初めの2時間のL-DOS47関連毒性は、
注入後の初めの2時間のものであり、これは安全性論点に指定される。これらは、AE及びS
AEの発生率及び重症度、並びにバイタルサインの変化によって評価される。報告された全
ての有害事象及び重篤な有害事象の発生率及び重症度は、12週間及び30日間の追跡期間参
加者が従うタイムフレーム下にある。これらは、安全性論点に指定され、第1サイクルの
第1日に始まり最後の研究来診まで続くAE報告期間の間評価される。追加の安全性パラメ
ーター(臨床検査評価、バイタルサイン、体重、酸素要求量及び12誘導ECG)のベースライ
ンからの変化は、12週までのタイムフレーム下であり、これは安全性論点に指定される。
安全性パラメーターとしては、臨床検査評価、バイタルサイン、体重、酸素要求量、及び
12誘導ECGが挙げられる。該経時的な抗L-DOS47抗体の評価は、12週までであり、これは安
全性論点に指定される。血清サンプルは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取され
、分析されるものとする。
他の評価項目は、以下の通りである。各々の用量レベルでのL-DOS47の最高観察血漿濃
度(Cmax)は、12週までのタイムフレーム下であり、これは安全性論点には指定されない。
L-DOS47の薬物動態学的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取された
血漿サンプルから決定されるものとする。各々の用量レベルでのL-DOS47の最高観察血漿
濃度(Tmax)までの時間は12週までであり、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47
の薬物動態学的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取された血漿サ
ンプルから決定されるものとする。各々の用量レベルでのL-DOS47の濃度時間曲線下面積(
AUC)は、12週まで測定され、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47の薬物動態学
的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取された血漿サンプルから決
定されるものとする。各々の用量レベルでのL-DOS47の最終消失半減期は、12週までのタ
イムフレーム下であり、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47の薬物動態学的パ
ラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取された血漿サンプルから決定さ
れるものとする。患者は、1つのコホートあたり最小で3名最大で6名としたL-DOS47の漸増
用量のコホートにリクルートされるものとする。L-DOS47の初期用量は、0.12μg/kgとし;
さらに用い得る用量レベルとしては、0.21、0.33、0.46、0.59、0.78、1.04、1.38、1.84
、2.45、3.26、及び4.33μg/kgが挙げられる。1治療サイクルは、21日とし、患者は、L-D
OS47をサイクルの第1日及び第8日に受けるものとする。
患者は、1つのコホートあたり最小で3名最大で6名としたコホートにリクルートされる
ものとする。後続の患者において漸増を許可する前に、所与の用量レベルの全ての患者が
、第1サイクル(3週間)を完了しなければならない。用量の漸増を次の用量レベルとする決
定は、安全性及び利用可能な薬物動態学的(PK)データが、治験運営委員会(TSC)によって
精査された後に行うものとする。L-DOS47の漸増は、最大耐用量(MTD)に達するまで続けら
れるものとする。第I相においてL-DOS47のMTDが決定された後に、最大で20名の患者が、
登録され(第I相からその先に進められ)、予備的なL-DOS47の有効性(すなわち、固体腫瘍
における反応評価基準［the Response Evaluation Criteria in Solid Tumours; RECIST
］バージョン1.1の基準を用いた奏効率、疾患の進行、及び生存時間)が評価されるものと
する;モニタリングは、2サイクルおきの放射線学的な評価を含むものとする。L-DOS47の
安全性及び認容性も、さらに評価するものとする。薬物動態学的情報を、L-DOS47の活性
に対する関連性のある観察と共に収集するものとする。
全ての患者について、L-DOS47での治療を、患者が疾患の進行、許容し得ない毒性を経
験するか、患者が同意を撤回するか、又は4回の治療サイクルを完了して、かつ追加のサ
イクルを継続することを望まないかのいずれか早い方まで継続するものとする。4回のサ
イクルの後に、患者は、持続性の臨床的利益が存在し、それが良好な耐容性を示す限りは
、治験責任医師の意見の下で、L-DOS47を受け続けてもよい。
(実施例4:非小細胞性肺がん(NSCLC)の治療のためのラクダ科動物単一ドメイン抗体-ウレ
アーゼ酵素コンジュゲートの製造及びキャラクタリゼーション)
最もよく使用されるがん化学療法薬の有効性は、それらの狭い治療係数及び腫瘍細胞に
対する選択的効果の欠如によって限定される。抗体指示型酵素プロドラッグ療法(ADEPT)
は、抗体-酵素コンジュゲートを、それらが腫瘍関連抗原に結合する場である腫瘍部位へ
と送達することによって選択性を向上する一方で、残りの非結合コンジュゲートは、血流
から除去される［20］。ひとたび抗体-酵素コンジュゲートが蓄積されると、プロドラッ
グが投与され、腫瘍部位で、該抗体-酵素コンジュゲートの酵素部分によってその活性な
細胞傷害性形態へと変換され、それによって、選択的な腫瘍細胞死が達成される。ADEPT
概念が、Bagshaweによって1987年に導入されて以来［20-22］、研究者らは、この概念の
変形を応用してより強力なかつ特異的な抗がん薬を開発してきた［22-24］。異なる世代
のガラクトシドプロドラッグ及び抗体-ガラクトシダーゼコンジュゲートが、活性化され
た薬物の細胞傷害性を増加させつつ全身毒性を減少するために開発された［25］。ヒトプ
リンヌクレオシドホスホリラーゼの変異型を操作して、基質としてのアデノシンベースの
プロドラッグに対する特異性が強化された［26］。加えて、異なる種類の免疫酵素インフ
ュージョンタンパク質が開発され、酵素活性及び抗体アビディティーが向上されている［
27-29］。
コンジュゲーション比率が、天然のウレアーゼ1分子あたり約10個の抗体である単一ド
メイン組換え抗体及びタチナタマメウレアーゼの化学的コンジュゲートであるL-DOS47の
生産及びキャラクタリゼーションが記載される。L-DOS47イムノコンジュゲートは、腫瘍
組織において天然に大量に存在する尿素を、アンモニアを生成させるためのプロドラッグ
として使用する。標的腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原CEACAM6［33］へのAFAIKL2抗体の選択的
結合は、ウレアーゼの蓄積、及びその結果として生じる細胞外尿素の加水分解をもたらし
、それが細胞傷害性であり、がん細胞にとって好ましくないアルカリ性の環境を生み出す
アンモニアが生成する［34］。最大で680kDaの分子量を有し得るコンジュゲートの複雑性
及びサイズのために、コンジュゲーション化学、反応、及び分離手順が、大スケール製造
における課題に対処するために開発された。ウレアーゼは、選択された抗体にとって複数
の可能なコンジュゲーション部位を有しているので、薬物の効力に重要であるL-DOS47の
コンジュゲーション比率を、Experion SDSマイクロチャンネルゲル電気泳動システムを用
いてキャラクタリゼーションした［31,32］。L-DOS47コンジュゲート純度は、サイズ排除
クロマトグラフィーによって決定した。L-DOS47の化学的素性は、質量分析ペプチドマッ
ピング及びウエスタンブロットによってによってキャラクタリゼーションした。一級アミ
ン(K32)が単一ドメイン抗体のCDR3領域に存在するために、抗体側でのコンジュゲーショ
ン部位の分布は、RP-HPLC及びMALDI質量分析によって決定された。抗体側及びウレアーゼ
側双方のコンジュゲーション部位もまた、ESI質量分析によってキャラクタリゼーション
した。L-DOS47結合のCEACAM6に対する親和性に対するコンジュゲーション比率の効果を、
ELISAによって評価した。インビトロ研究を行い、L-DOS47結合及びそのCEACAM6発現がん
細胞株において細胞傷害性を引き起こす能力を確認した。
イムノコンジュゲート(L-DOS47)を、CEACAM6を発現する腫瘍のための治療剤として開発
しキャラクタリゼーションした。CEACAM6を標的とする単一ドメイン抗体AFAIKL2を、大腸
菌 BL21 (DE3) pT7-7系で発現させた。高純度ウレアーゼ(HPU)を、タチナタマメミル(jac
k bean mill)から抽出し精製した。AFAIKL2を、N-サクシニミジル［4-ヨードアセチル］
ベンゾエート(SIAB)を架橋剤として用いて活性化して、その後ウレアーゼにコンジュゲー
トした。活性化及びコンジュゲーション反応を、pHを変化させることによって制御した。
これらの条件下、材料比はウレアーゼ1分子あたり8〜11個の抗体のコンジュゲーション比
率を達成し、残留遊離ウレアーゼ含量はほとんど無視できるほどであり(＜2％)、かつ高
純度(＞95％)L-DOS47コンジュゲートをウルトラダイアフィルトレーションのみを用いて
未反応抗体及び加水分解された架橋剤を除去することによって製造することができた。L-
DOS47は、SEC、IEC、ウエスタンブロット、ELISA、及びLC-MSEペプチドマッピングを含む
一連の分析技術によってキャラクタリゼーションした。抗体-ウレアーゼコンジュゲート
比が増加するにつれて、よい高い結合シグナルが観察された。しかしながら、この効果は
、1ウレアーゼあたり6個の抗体を超えるコンジュゲーション比率では、それほど明白では
なかった。L-DOS47の特異性及び細胞傷害性を、3つの細胞株(BxPC-3、A549、及びMCF7)に
おけるスクリーニングによって確認した。CEACAM6発現細胞株であるBxPC-3は、L-DOS47に
対して最も感受性が高いことが分かった。L-DOS47は、非小細胞性肺がん(NSCLC)のヒト第
I相臨床研究において有望な治療剤として試験されている。
高純度ウレアーゼ中間体ウレアーゼ(以下粗ウレアーゼ又はDOS47と称する)の製造は、B
ioVectra Inc. (Charlottetown, PE Canada)から調達した。コンジュゲーションにおける
使用の前に、粗ウレアーゼを精製して、カナバリン及びコンカナバリンAなどのタチナタ
マメマトリックスタンパク質夾雑物を除去した。粗ウレアーゼを、高純度水に溶解し、pH
を10mM酢酸、0.2mM EDTA(酢酸-EDTAバッファー)で5.15とした後に、セライト503のスラリ
ーを用いて真空下濾過した。ケーキを、10mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA、pH5.15で洗浄し
、真空乾燥した。ウレアーゼを含有する濾液を0〜4℃に冷却し、冷却したエタノールを25
％(v/v)の終濃度まで加えることにより分画した。混合物を15分間撹拌し、その後、洗浄
したセライト503を用いて真空下濾過した。ケーキを25％(v/v)のエタノールを含有する酢
酸-EDTAバッファーで洗浄し、その後、真空乾燥した。
ケーキを酢酸-EDTAバッファーに再懸濁させ、スラリーを真空下セライト濾過して、濾
液を採取した。結果として得られたケーキを、酢酸-EDTAバッファーで洗浄し、真空乾燥
した。洗浄液と初めの濾液を、0.65μmのカプセルで濾過した。このエタノール分画され
たウレアーゼ濾液を、2枚のSartorius Sartocon 100000 Da MWCOポリエーテルスルホン膜
を用いて〜2倍濃縮し、それに続き酢酸-EDTAバッファーにバッファー交換した。
イミダゾール及びTCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩)を、それぞれ20
mM及び1mMの終濃度でこの中純度ウレアーゼに加え、pHを6.5へと調整した。このタンパク
質溶液を、20mMイミダゾール、1mMTCEP、pH6.5(イミダゾール-TCEPバッファー)で前もっ
て平衡化させておいたDEAE-セファロースファストフローカラムに載せた。全ての工程は
、500mL/分の流速で行った。カラムを、イミダゾール-TCEPバッファーで洗浄し、それに
続き、80mMのNaClを含有するイミダゾール-TCEPバッファーで洗浄し非結合不純物を除去
した。ウレアーゼを、180mMのNaClを含有するイミダゾール-TCEPバッファーで溶出した。
A280＞0.1かつSECによる純度が≧90〜97％の画分をプールした。
プールされた画分を、2枚のSartorious Sartocon 100 000 Da MWCO PESU膜を用いて6〜
8mg/mLの目標タンパク質濃度まで濃縮し、その後、10mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA、pH6.
5を含有する酢酸-EDTAバッファーに対して透析濾過した。本工程からの収率は、典型的に
は出発活性の＞55％である。AFAIKL2薬物中間体の発現及び精製、AFAIKL2抗体のアミノ酸
配列を、図5に示した(配列番号1)。
前記抗体遺伝子を、大腸菌BL21 (DE3) pT7-7系において発現させた。1バイアルのマス
ター細胞バンクを、500L発酵槽中の、50mg/Lのカナマイシン、1g/Lのセレロース、0.02g/
LのMgSO4、及び0.01％のBiospumex消泡剤薬を追加した350 L Luria HiVeg(20g/L)に、3つ
の播種工程で無菌的に接種した。このプロセスは、＞20％の溶存酸素、37℃±2℃の温度
、5〜20psiの背圧、7.0±0.2のpH、0.5〜40のOD600、及び1〜3g/Lのグルコース濃度を維
持するように制御された。培養物が7〜10のOD600に達したら、1mMの終濃度までのIPTGの
の添加によって抗体発現を誘導し、6〜8時間継続させた。細胞を遠心分離によって回収し
、洗浄し、溶解して封入体を放出させ、その後、10体積の50mMイミダゾールpH6.8に再懸
濁した。細胞懸濁液を、バッチに分けて均質化して、ホモジネートを先ず75ミクロンステ
ンレス鋼の衛生的な篩に通し、その後、温度を10℃未満に維持しつつ、合計で3回10,000p
siの最低圧力でマイクロ流体化装置に通した。細胞可溶化物を遠心分離して、不溶物質を
プールして、ペレットを、5mMのDTTを含む10体積の1％Triton X-100における均質化で再
懸濁した。洗浄したペレットを、遠心分離によって回収した。この洗浄を繰り返し、それ
に続き、5mMのDTTを含有する25mMの酢酸ナトリウム、pH4.0で2回洗浄して、残留するTrit
on X-100を除去し、該ペレットをpH4に緩衝した。
洗浄した封入体を含有するペレットを、8M尿素、25mM DTT、125mM酢酸ナトリウム、pH4
.0に再懸濁し、その後、目視での外観にそれ以上の変化がなくなるまで、Rossホモジナイ
ザー、次いで、オーバーヘッドミキサーで交互に可溶化し、その後、オーバーヘッドミキ
サーのみで合計時間で3時間混合した。可溶化された封入体を遠心分離して、清澄化され
た上清を、125mM酢酸ナトリウム、pH4.0中の8M尿素(SP平衡化バッファー)で前もって平衡
化させておいたSP-セファロースXLカラムに550mL/分で載せた。清澄化された上清を載せ
た後に、カラムを、溶出液のA280が0.05未満に低下するまで平衡化バッファーで洗浄し、
それに続き、溶出液A280が0.05未満に低下するまで50mM NaClを含む酢酸ナトリウム中の8
M尿素、pH4.0で洗浄した。ポンプ速度を275mL/分まで低下させ、3cvの8M尿素含有25mM酢
酸ナトリウム、180mMNaCl、pH4.0をカラムに用いてAFAIKL2を溶出させた。A280が＞0.4、
かつA280/A260比が＞1.5の画分をプールして、純度及びタンパク質含量を分析した。本工
程からのパーセント収率は、典型的には35〜45％である。プールされた材料を、SP平衡化
バッファーで≦2.5g/Lまで希釈し、pHを、2Mトリス-Cl、pH8.0で8.0へと調整し、DTTを、
2.5mMまで加え、該調整済みプールを、60分間混合して、変性タンパク質を完全に還元し
た。変性タンパク質溶液を、その後、25mMトリス-Clを含有するリフォールディングバッ
ファー、pH8.5に、0.1mg/mL未満の最終タンパク質濃度まで希釈した。リフォールディン
グは、2〜8℃で行い、遊離のスルフヒドリルのレベルが＜0.75μmとなり、完全に酸化さ
れたタンパク質のみが検出できるまで、Ellmanのアッセイ及びC18逆相HPLCによって追跡
した。
リフォールドされたタンパク質溶液を、25mMイミダゾール、pH6.8で前もって平衡化さ
せておいたQ-セファロースXLカラムに載せ、A280が＜0.05となるまで該カラムを平衡化バ
ッファーで洗浄し、それに続き、A280が＜0.01となるまで50mM NaClを含有する25mMイミ
ダゾール、pH6.8で洗浄した。その後、タンパク質を、150mM NaClを含有する25mMイミダ
ゾール、pH6.8で溶出し、A280が≦0.3となるまで画分を採取した。画分を合わせて、97％
以上の純度かつ45％以上の収率で、標的プールを作製した。プールをその後、Hydrosart
再生セルロース5000 MWCOカートリッジを備えたUF/DFシステムを用いて3〜5g/Lまで濃縮
し、それに続き、10mMリン酸バッファー、pH7.0を用いてバッファー交換して凍結乾燥し
た。
(コンジュゲーション化学)
コンジュゲーションは、2工程で行った(図6)。第1工程では、AFAIKL2上の一級アミン基
を、SIABのNHSエステル部分との反応によって活性化した。第2工程では、活性化されたAF
AIK2を、SIABのヨードアセトアミド末端を介してウレアーゼ上のチオール基にカップリン
グさせた。図6に示されるように、L-DOS47コンジュゲート産物の合成は、2工程反応であ
る。工程1は、SIABを用いる抗体の活性化であり、工程2は、活性化された抗体のウレアー
ゼ酵素とのコンジュゲーションによるバイオコンジュゲートL-DOS47の形成を伴う。
AFAIKL2抗体の活性化。凍結乾燥したAFAIKL2(25g)を、注射用水(WFI)に溶解した。SIAB
(2.00g)を、無水のDMFに溶解し、3等分してAFAIKL2溶液に加え、各添加の後に60分間撹拌
した。SIABの最後の添加の1時間後、全ての残存する未反応NHS基を、添加したSIABの元の
量の10×モル過剰のグリシンの添加によってクエンチした。加水分解された及びグリシン
でクエンチされたSIABを除去し、反応溶液を、Sartorious Sartocon 5000 Da MWCOを用い
て10mg/mL AFAIKL2まで濃縮し、それに続き、10mM酢酸ナトリウム、pH6.5、1mM EDTAにバ
ッファー交換した。
活性化された抗体のウレアーゼへのコンジュゲーション。高純度ウレアーゼ(50g)を、1
0mM酢酸ナトリウム、pH6.5、1mM EDTA中で、活性化されたAFAIKL2と混合した。その後、1
M ホウ酸ナトリウム、pH8.5の添加によってpHを8.3とした。これにより、活性化された抗
体上のヨードアセチル基が、ウレアーゼ上の利用可能なシステイン残基と反応することが
可能となる。反応を、撹拌しながら90分間進行させた。未反応のヨードアセチル基を、そ
の後、添加したSIABの元の量に対して10×モル過剰のシステインの添加によってクエンチ
し、溶液を60分間混合した。非コンジュゲートAFAIKL2を除去するために、L-DOS47を、10
0000 Da MWCO Sartorious Sartoconを用いて6mg/mLの目標値まで濃縮し、それに続き、10
mM L-ヒスチジン、pH6.8、0.2mM EDTAにバッファー交換した。スクロースを、1％w/vの終
濃度まで加え、L-DOS47を、10mM L-ヒスチジン、pH6.8、0.2mM EDTAで1.8g/Lの目標濃度
まで希釈した。
純度評価のためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)。996 PADを備えたWaters 2695
HPLCシステムを、データ取得及びデータ処理のためのEmpower 2ソフトウェアと共に採用
した。クロマトグラムは、210〜400±4nmにわたり記録し、280nmのシグナルを処理のため
に抽出した。分離は、Superose 6 100/300 GL カラム(GE)で行った。タンパク質を、10mM
リン酸塩、50mM NaCl、0.2mM EDTA、pH7.2に溶出させた。分離は、100μlのニートサン
プル注入後に、0.5mL/分の一定組成流で行った。カラムは、室温で実施し、サンプル温度
は、5±2℃に制御した。
残留ウレアーゼのためのイオン交換クロマトグラフィー(IEC)。996 PAD及びEmpower ソ
フトウェアを備えたWaters 2695 HPLC システムを採用した。クロマトグラムは、210〜40
0nm±4nmにわたり取得して、280nmのシグナルを、処理のために抽出した。カラム(Mono-Q
5/50 GL, GE)を室温で使用し、サンプル温度は、5±2℃に制御した。溶出バッファーは
、50mMアセテート、0.025％ポリソルベート 80(超高純度, HX2, NOF Corporation, Tokyo
)を含有するとともに、0.70M NaCl、pH5.50を含有していた(バッファーB)か、又はしてい
なかった(バッファーA)。サンプルを注入する前に、カラムを、15％のバッファーB及び85
％のバッファーAで、6分間、1mL/分の流速(6CV)で平衡化させた。洗浄サイクル(15％のバ
ッファーB、1.0mL/分で6分間)の後に、タンパク質を、15〜60％のバッファーBのグラジエ
ントで、0.5mL/分の流速で20分間溶出させた。次のサンプルの注入の前に、100％のバッ
ファーBで1.0mL/分で6分間洗浄後、カラムを、15％のバッファーBで再度平衡化させた。8
00μlのニートのL-DOS47サンプルを、HPウレアーゼ参照標準品で0〜8％w/wの最終百分率
までスパイクし、50μl/サンプルを注入した。ピーク高さを使用して、標準的な添加を検
量法として用いて、残留ウレアーゼ含量を計算した。
Experion SDSマイクロチャネルゲル電気泳動を、コンジュゲーション比率の決定のため
に使用する。BioRad Experion自動電気泳動システム及びBioRad SDS ゲル電気泳動キット
(Pro260キット)を採用して、L-DOS47コンジュゲーション比率を分析した。サンプルを、
トリス-HClバッファー(10mM、0.2mM EDTA、pH7.0)で、0.5 mg/mlの目標タンパク質濃度ま
で希釈し、その後、4μlの希釈サンプル又は分子量マーカー(molecular weight ladder)
を、2μlのサンプルバッファーと混合し、手短に遠心分離した。サンプルを70℃で10分間
加熱し、その後、システム及びチャネルをゲル-ステイン溶液で準備してから、サンプル
をマイクロチャンネルチップに載せた。電気泳動図は、Experionソフトウェアによって自
動的に記録された。
素性のキャラクタリゼーションのためのウエスタンブロット。L-DOS47試験サンプル及
びAFAIKL2/HPU対照を、SDS-PAGEゲル電気泳動によって分離し、その後、Invitrogen iBlo
tシステムを用いてニトロセルロースメンブレンに移した。2連のブロットを、並行して実
施したゲルから作製した。AFAIKL2であることの確認には、ウサギ抗AFAIKL2 IgG一次抗体
(Rockland)を用いた検出と、アルカリホスファターゼ(AP)にコンジュゲートしたヤギ抗ウ
サギIgG(Sigma)を用いた二次検出とが必要である。ウレアーゼであることの確認には、ウ
サギ抗ウレアーゼIgG一次抗体(Rockland)を用いた検出と、APにコンジュゲートしたヤギ
抗ウサギIgG(Sigma)を用いた二次検出が必要である。抗AFAIKL2 IgGを用いた検出のため
には、L-DOS47サンプルを、0.1mg/mL BSAを含有する1×TBS中に0.002mg/mLとなるまで希
釈し、その後、1:1でタンパク質ゲルローディングバッファーと混合し、70℃に10分間加
熱し、1レーンあたり0.01μgのL-DOS47を載せる。抗ウレアーゼIgGを用いた検出のために
は、L-DOS47サンプルを、0.1mg/mL BSAを含有する1×TBS中に、0.02mg/mLとなるまで希釈
し、その後、1:1でタンパク質ゲルローディングバッファーと混合し、70℃に10分間加熱
し、1レーンあたり0.1μgのL-DOS47を載せた。ウエスタンブロットの最後の展開は、NBT/
BCIPを含有するAPバッファーで行った。
(異なるコンジュゲーション比率を有するL-DOS47のELISA)
標的抗原であるCEACAM6へ結合するL-DOS47の親和性に対するコンジュゲーション比率の
効果を研究するために、異なるコンジュゲーション比率を有するL-DOS47コンジュゲート
を、コンジュゲーションの際にAFAIKL2/HPUモル比を調整することによってベンチスケー
ルで製造した。結果として得られたコンジュゲートのコンジュゲーション比率を、SDS-Ex
perionによって決定し、タンパク質濃度を、Total Protein Kit(Sigma, TP0200)を用いる
マイクロLowryによって決定した。マイクロタイタープレートを、100μL/ウェルのCEACAM
6-A(全CEACAM6抗原のドメイン-A)(PBS中2.5μg/ml)でコートして、室温で6時間インキュ
ベートした。プレートを、バッファーA(PBS中0.05％ BSA)で2回洗浄し、150μL/ウェルの
3％ BSA/PBSで4℃で1晩ブロックし、その後、バッファーAで2回洗浄した。後続の工程は
全て、穏やかに振盪しながら室温で行った。L-DOS47(100μL/ウェル)を加え、2時間イン
キュベートし、プレートをバッファーAで3回洗浄し、その後100μL/ウェルの抗ウレアー
ゼIgG(1:12000、Rockland)を加え、1時間インキュベートした。バッファーAで3回洗浄し
た後に、100μL/ウェルのヤギ抗ウサギIgG-AP(1:6000, Sigma)を加えて、1時間インキュ
ベートした。バッファーAで3回洗浄後、100μL/ウェルのAP基質溶液を加え、25分間イン
キュベートした。吸光度を、405nmで決定した。
(AFAIKL2抗体上の活性化部位の決定)
フルオレセイン標識システイン(Cys-FL)を調製するために、システインを過剰に、NHS-
エステルフルオレセイン(Pierce)と、1Mホウ酸塩、pH8.0中で室温で60分間反応させた。
反応溶液を、C8カラムを用いたRP-HPLCによって分離した。Cys-FLピーク画分を、MALDI質
量分析によって特定し、その濃度を、493nm及びpH7でのその吸光係数に応じて分光分析に
よって決定した。ピーク画分分割量を凍結乾燥し、-20℃で暗所に保管した。AFAIKL2抗体
は、先ず、ベンチスケールでSIAB架橋剤で活性化され、加水分解されたSIABを、自社で調
製したG25脱塩カラムで取り除いた。活性化された抗体を、100mMホウ酸バッファー、pH8.
3中で、フルオレセイン標識システイン(Cys-FL)と室温で90分間反応させた。反応溶液を
、G25脱塩カラムにより30mM炭酸水素アンモニウムとバッファー交換し、結果として得ら
れたAFAIKL2-Cys-FLを、20％アセトニトリルを含有する30mM炭酸水素アンモニウム中に、
0.5〜0.8mg/mLとなるまで希釈した。トリプシン(Promega)を、最終のタンパク質対トリプ
シン比が20:1となるまで加え、37℃で36時間消化を行った。結果として得られたトリプシ
ン消化物を、0.1M TCEPを2mMの終濃度まで加えることにより減少させ、その後、逆相HPLC
(Zobax 300SB-C18カラム、5μm、4.6×150mmを備えたAgilent 1100システム、アセトニト
リルが0〜45％のグラジエント、0.025％TFA、55分)で分離し、420nmの吸収を記録した。A
FAIKL2上のSIABで活性化されたリジンは、フルオレセイン標識システインに連結されてい
たため、それにトリプシンが近づくことができる可能性は低く、ペプチド(XnKXm)-Cys-FL
が、生じたはずである。フルオレセイン修飾ペプチドを含有するピーク画分を採取し、リ
フレクトロン(Reflectron)モードのMALDI質量分析(2eのマイクロ質量T)を適用した。対応
するペプチドのHPLCピーク面積を用いて、各活性化部位の分布百分率を計算した。
コンジュゲートしたペプチドのペプチドマッピング及び同定は、ESI質量分析によって
行った。Waters Xevo G2 QTOF質量分析計及びBEH300 C18カラム(1.7μm, 2.1×150mm)を
備えたAcquity UPLCシステムHクラスを採用した。各L-DOS47サンプル(1.5〜2.0mg/mL, 50
.0μl)を、0.063±0.003gのグアニジン-HClと混合した。この塩を完全に溶解させた後に
、1.50μLの0.7M DTTを加え、溶液を60℃で30分間インキュベートした。10.0μLの0.20M
ヨードアセトアミド(IAA)を加え、pHを、飽和Tris-Base溶液で8.0〜8.5へ調整した。サン
プルを37℃で60分間インキュベートした。50.0μLの各アルキル化サンプルを、15.0μLの
0.1M CaCl2及び80.0μLのトリスバッファー(50mMトリス-HCl, pH8.0)と混合し、その後、
3.00μLの0.5mg/mlトリプシン溶液を加えた。トリプシン消化は、37℃で20〜24時間行っ
た。トリプシン消化の後に、50.0μLの消化物を、LC-MS分析のために0.50μLのニートの
ギ酸と混合した。カラム温度は、60℃に設定し、溶媒A(水中0.075％v/vギ酸)及び溶媒B(
アセトニトリル0.075％ギ酸)を、UPLC分離のために使用した。UPLCは、溶媒Bが0〜55％の
グラジエントを用いて0.15mL/分の流速で80分間で行った。
LC-MS分析は、Masslynx V4.1ソフトウェアで制御した。LC-MSE TIC(総イオンカウント)
データ取得は、0.3/sの走査速度、キャピラリー電圧3.0kV、サンプルコーン電圧25V、抽
出コーン電圧4.0kVで、レゾリューションモードにおいて、50〜2000DaのM/Z範囲で行った
。高エネルギー衝突誘起フラグメンテーションTICデータの取得は、衝突エネルギーを20V
から40Vまで上昇させて行った。イオン源温度は、100℃に設定し、脱溶媒温度は、300℃
に設定した。脱溶媒ガス流は、600L/時間である。リアルタイムロック質量TIC生データセ
ット(スキャン/20秒)を、3.0μl/分の流速で、100fmol/μLのGlu-Fib Bを用いて取得した
。
質量分析生データを、BioPharmalynx(v1.2)を用いて、ペプチドマップモードで、20000
の分解能で処理した。785.8426Daのロック質量を、リアルタイム2点間質量較正(real tim
e point to point mass calibration)に適用した。低エネルギーMSイオン強度閾値は、30
00カウントに設定し、MSE高エネルギーイオン強度閾値は、300カウントに設定した。質量
一致許容度(mass match tolerance)は、MS及びMSE データセットの双方に対し15ppmに設
定した。AFAIKL2及びウレアーゼアミノ酸配列を、ペプチドマッチング/同定のための配列
ライブラリーに入力した。脱アミド化N、脱アミド化コハク酸イミドN、酸化M、酸化2×M
、+K、+Naを含む可変修飾因子(variable modifier)、及びカルバミドメチル(アルキル化
システインに対するもの)の固定修飾因子(fixed modifier)を、ペプチドマップ分析に適
用した。AFAIKL2側でコンジュゲートしたペプチドを同定するために、ウレアーゼのシス
テイン含有ペプチド＋架橋剤SIAB(C9H7O2N, 161.0477Da)連結セクションを、可変修飾因
子として作成し、可変修飾因子ライブラリーに含めた。この場合、カルバミドメチルを、
可変修飾因子として含めた。ウレアーゼ側でコンジュゲートしたペプチドを同定するため
に、AFAIKL2のリジンを中間に含むペプチド(lysine-in-middle peptide)XnKXm＋SIABの連
結セクションを可変修飾因子として作成し、可変修飾因子ライブラリーに含めた。
(L-DOS47のホールセル結合アッセイ)
細胞単層を、100μL/ウェルのMCF-7、BxPC-3、及びA549細胞(4×104細胞/ウェル)を、9
6-ウェル培養プレート内に播種して、37℃で1晩インキュベートすることによって調製し
た。その後、培地をプレートから除去し、細胞単層を、100μL/ウェルのPBS中の0.05％グ
ルタルアルデヒドで室温で(RT)10分間固定した。その後、プレートを、PBSで洗浄し、120
μL/ウェルの50mMグリシンを加えた。37℃で20分間インキュベーション後、プレートを、
120μL/ウェルの1％BSA/PBSで37℃で30分間ブロックした。その後、プレートをバッファ
ーA(PBS中0.05％BSA)で3回洗浄し、80μL/ウェルの希釈されたL-DOS47又はDOS47を加え、
37℃で1.5時間インキュベートした。プレートをバッファーAで4回洗浄し、80μL/ウェル
の0.1M PBS中の20mM尿素、pH7.6を加え、37℃で30分間インキュベートした。インキュベ
ーション後、40μL/ウェルの1N HClを加えて、反応を停止した。各ウェル内で生成された
アンモニアの量を、改良インドフェノールアッセイを用いて決定した。手短にいうと、16
5mgのフェノール及び132mgのNaOHを、10mLの水に溶解させて、それに続き、66μLのニト
ロプルシドナトリウム溶液(10mg/mL)を添加することで溶液Aを新たに調製した。溶液Bは
、40μLの次亜塩素酸ナトリウムを5mLの水に加えることにより調製した。ホールセル結合
アッセイからのサンプル溶液(各30μL)を、50μL/ウェルの5N NaOH:H2O(3.3:46.7)及び20
μL/ウェルの水を含有する新たな96ウェルプレートに移した。溶液A(50μL/ウェル)及び
溶液B(50μL/ウェル)を加え、その後、プレートを37℃で30分間の発色のためにマイクロ
プレートリーダーに移した。ODを630nmで測定した。ウェル内に生成したアンモニアの量
を、0〜150mMの塩化アンモニウムを標準として用いた検量線から計算した。
L-DOS47の細胞傷害性アッセイ細胞単層を、100μL/ウェルのMCF-7、BxPC-3、及びA549
細胞(4×104細胞/ウェル)を96-ウェル培養プレート内に播種し、37℃で1晩インキュベー
トすることによって調製した。その後、培地をプレートから除去し、80μL/ウェルの希釈
されたL-DOS47又はDOS47を加え、さらに37℃で2時間インキュベートした。インキュベー
ション後、プレートをKR-IIバッファー/0.05％ BSAで3回洗浄し、100μl/ウェルの20mM尿
素溶液を加えた。プレートを、37℃で1晩インキュベートし、その後、培地を取り除き、1
00μL/ウェルの単純培地と交換した。細胞生存率を、MTS細胞生存率アッセイ用いて決定
した。該MTS細胞生存率アッセイでは、MTS/PES(MTS, 2mg/mL; PES, 1mg/mL)の21:1v/v溶
液を調製し、20μL/ウェルの混合物を、プレートに加えた。その後、プレートを37℃で1
時間インキュベートし、ODを、490nmを参照とし630nmで測定した。
タチナタマメウレアーゼは、各サブユニットあたり15個の結合していないシステイン残
基を有する、約91kDaの6個の同一サブユニットからなる六量体の酵素である。AFAIKL2抗
体は、7個の一級アミン及び1個のジスルフィド結合を含有する。抗体上の一級アミン及び
ウレアーゼ上のシステイン残基は、ヘテロ二官能性架橋剤を介する化学的コンジュゲーシ
ョンのためのベースである。しかしながら、コンジュゲートの分子サイズ及び2つのタン
パク質の性質が、コンジュゲート生成物のスケールアップ製造、精製、及びキャラクタリ
ゼーションにおける課題を生み出した。イムノコンジュゲートは、非経口薬物としての使
用のための生理学的なpHに近い水性媒体中で可溶性かつ安定でなければならない;故に、
組換え抗体の等電点(pI)は、ウレアーゼが植物源から抽出され、かつそのpI(観察されるp
I 4.8〜5.1)を変化させることができなかったという理由で、注意深い配列設計を必要と
した。反応均一性並びに残留する反応物質及び副生成物の除去を確実とするための最適化
は、コンジュゲーション化学に重大な意味を持っていた。いくつかの架橋剤［24,30］が
、タンパク質コンジュゲーションに広く用いられており、開発の間にスクリーニングされ
たが、2つの架橋反応の至適pHが異なるという理由で、N-サクシニミジル［4-ヨードアセ
チル］ベンゾエート(SIAB)がL-DOS47コンジュゲート製造に選択された。製造の間、抗体
は、pH7.0で架橋剤を用いて活性化され、その後、pH6.5にバッファー交換され、ウレアー
ゼを混合される。その後、反応媒体のpHを8.3へと上昇させることによって、抗体がウレ
アーゼに連結される。活性化されたAFAIKL2をウレアーゼに連結する反応速度は、pH6.5で
は非常に低いため、大型の反応容器内の材料の均一性は、pH6.5で予備混合することで確
実なものとされる。故に、残存する遊離のウレアーゼ及びウレアーゼ-(Ab)xの亜種の分布
は、確率及び材料モル比によってもっぱら決定されている。8〜11抗体/ウレアーゼのコン
ジュゲーション比率では、残留ウレアーゼ含量は、理論上は無視できるほどであり、ウル
トラダイアフィルトレーションを用いて未反応抗体及び加水分解された架橋剤を除去する
ことで、L-DOS47コンジュゲートを精製することができる。L-DOS47コンジュゲート、遊離
のAFAIKL2、及び遊離のウレアーゼのサイズ排除クロマトグラムを、図7に示す。
L-DOS47コンジュゲートは、〜24.6分で溶出し、二量体(おそらく、ジスルフィド結合に
よってか又は2つのSIABで活性化されたAFAIKL2分子によって連結されているもの)は、小
さい分離されていないピークとして20.5分に溶出し、ポリマーは、微量ピークとしてボイ
ド時間(〜15分)に溶出する。〜40分の微量ピークは、バッファー成分を示す。L-DOS47コ
ンジュゲートピーク幅は、遊離のウレアーゼのそれよりもわずかに大きいが同程度であり
、均一に分布したコンジュゲーション反応を示唆している。遊離の抗体は、37分に溶出す
る。抗体ピークの前の小さい分離されていないピークは、非共有結合性二量体を示す。通
常は、抗体の高い純度(＞95％)が、製造ロットにおいて観察され、その高分子量種は、5
％を超えない二量体を含んでいる。HPUは、通常、〜26.9分の主要ピーク、24分の小さい
二量体ピーク、及び15分の微量のポリマーピークを伴い溶出する。粗ウレアーゼのHPUへ
の精製は、結果として〜97％のモノマーをもたらした一方で、二量体及びポリマーの和は
、3％を超えない。95％を超えるL-DOS47純度は、通常、ウルトラダイアフィルトレーショ
ンのみを用いる単純な精製によって達成された。SECが自然の条件下で行われるために、
タンパク質四次構造の分解及び解離が原因の有効分子量の変化を決定することができ;従
って、本方法も、L-DOS47の安定性を示すアッセイとして用いられる。L-DOS47中の残存す
る遊離のウレアーゼの存在を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて評価した(図8)。
残存する遊離のウレアーゼは、15.33分に溶出し、これは、スパイクしたウレアーゼピ
ーク(15.42分)に非常に近い。HPUピークは、大きいL-DOS47ピーク(1.48のRs)からかなり
良く分離される。図8の差し込み部分に示されるように、残留ウレアーゼ含量を決定する
標準的な添加方法(2.4％、4.8％、及び7.2％w/wのHPUでスパイクされたL-DOS47)は、良好
な直線性(0.9995のR2)を示す。本サンプルの計算された残留ウレアーゼ含量は、0.72％で
あり、残留ウレアーゼは、現在まで全ての製造ロットで2％を超えたことが無く、これら
の条件下で、残留ウレアーゼがほとんど無視できるほどであり、生産プロセスが、L-DOS4
7コンジュゲートを非コンジュゲートウレアーゼから分離する追加の工程を必要としない
ことを実証している。
L-DOS47の製造の間、6個のモノマー性ウレアーゼサブユニットの各々を、0、1、2、3、
又は4分子のAFAIKL2とコンジュゲートすることができる;従って、変性させる条件下では
、L-DOS47のSDS-Experionは、〜90から155kDaまでの複数の個々に分離したピーク/バンド
のパターンを生じる。更に、抗体活性化反応の間には、抗体のごく一部を、抗体1分子あ
たり2つのSIABでランダムに活性化することができ(AFAIKL2-(SIAB)2)、これは、結果とし
て、これら抗体分子の各々のウレアーゼの2つのサブユニットへのコンジュゲーションを
もたらす。この1抗体-2サブユニット(one-antibody-two-subunits)は、その結果、200〜2
60kDaの範囲のよく分離されないピーク/バンドのより小さな第2のセットを生じさせる。
図9において、パネル2は仮想のゲル画像を示し、パネル1はレーン1及び4からの電気泳
動図のオーバレイを含む。レーン1及び2並びに7及び8のL-DOS47ベンチスケールサンプル
は、コンジュゲーションの第2の反応の前にイオン交換クロマトグラフィーによって精製
された活性化AFAIKL2を用いて製造された。AFAIKL2-(SIAB)2種を取り除いたために、結果
として得られたコンジュゲートは、サブユニット間で架橋されたサブユニット(inter-cro
ss-linked subunit)を欠いており、一組のピーク/バンドのみが観察された。レーン3〜6
のL-DOS47サンプルでは、AFAIKL2が、活性化工程の後に追加の精製をすることなく直接コ
ンジュゲーションに用いられたため、その結果、小さい第2の組のピーク/バンドが存在す
る。レーン9及び10は、HPUサンプルで過剰に負荷をかけられている。
ピーク面積(図9、パネル1)及びバンド強度(図9、パネル2)は、対応する数の抗体分子と
連結されたウレアーゼサブユニットの相対的な存在量に依存する。ピーク面積は、ベース
ライン補正後にソフトウェアによって積分し、L-DOS47コンジュゲーション比率(CR)を以
下のように計算する(図9のゲルのレーン2を示している図10を参照されたい):
CR=6*(PK1*0+PK2*1+PK3*2+PK4*3+PK5*4)/(PK1+PK2+PK3+PK4+PK5)
(式中、
PKi (i=1〜5)は、i-1個の抗体分子と連結されたウレアーゼサブユニットのピーク面積で
ある。
活性化された抗体は、L-DOS47の大量生産の間にイオン交換クロマトグラフィー精製を
受けないために、第2の良く分離されないピークの組が、これらのサンプルの電気泳動図
に出現する。しかしながら、活性化部位分布が、確率及び抗体のSIABに対するモル比によ
って決定されるために、2組のピークは、類似の強度パターンを有するものと期待される
。この第2のピークの組は、従って、バンドが良く分離されず、260kDaの分子量マーカー
と重なっているために、コンジュゲーション比率の計算には用いない。AFAIKL2-(SIAB)2
種は、理論上は、異なる天然のウレアーゼ分子由来の2つのサブユニットに連結すること
により二量体コンジュゲート又はポリマーコンジュゲートを生成し得るが、L-DOS47サン
プルのサイズ排除クロマトグラムに観察される最小レベル(3％未満)の二量体及びポリマ
ー合計ピーク面積(図7)は、大部分のAFAIKL2-(SIAB)2種が、モノマーL-DOS47を生成する
単一の天然のウレアーゼ分子のサブユニット間の連結に寄与し、二量体コンジュゲート及
びポリマーコンジュゲートを生成する分子間の連結には寄与しないことを示唆する。加え
て、SECクロマトグラムにおけるこれらの二量体及びポリマーピークの存在は、類似のピ
ークがHPウレアーゼのサイズ排除クロマトグラムにも出現したために、ジスルフィドによ
る連結に論理的に帰属し得る。従って、電気泳動図における第2のピークの組は、品質管
理のためのパラメーターとして採用されない。
L-DOS47のコンジュゲーション比率は、該抗体の標的とされる腫瘍抗原であるCEACAM6に
対する、L-DOS47の親和性に対して重大な意味を有する。異なるコンジュゲーション比率(
1ウレアーゼあたり1.8〜12のAFAIK)を有するL-DOS47を、AFAIKL2/HPウレアーゼモル比と
調整することによって製造し、結合親和性に対するコンジュゲーション比率の効果を評価
した。固定化CEACAM6-Aに対するL-DOS47の結合親和性は、ウレアーゼにコンジュゲートし
た抗体の数に直接比例することが分かった(図11)。より多くの抗体がコンジュゲートする
ほど、より高い結合シグナルが観察された。しかしながら、この効果は、6以上のコンジ
ュゲーション比率では、それほど大きくなかった。
デュアルウエスタンブロット法によるL-DOS47の分析(図12)により、SDS-Experionによ
って観察されるバンドパターンを確認する。挿入された四角は、主要ブロットの四角で囲
った領域の拡大を示し、ここでは、ウレアーゼ及びコンジュゲートした種(それぞれ、1〜
4個のコンジュゲートしたAFAIKL2を有するウレアーゼに対応するN1〜N4)に表示されてい
る。抗ウレアーゼ抗体で探索する場合、91kDaのウレアーゼバンドが、最も強く可視化さ
れ、より高分子量のバンド(より高度にコンジュゲートした種に対応する)の強度は減少す
る。対照的に、抗AFAIKL2抗体で探索するする場合、91kDaのバンドは、ほとんど見えず、
次の2本のより高分子量のバンドが、最も強い(N1及びN2)。これは、これらがコンジュゲ
ートにおいて支配的なバンドであるという事実に起因する。L-DOS47の、抗AFAIKL2及び抗
ウレアーゼ抗体の双方によって可視化される能力は、コンジュゲートにおける双方の種の
存在を実証し、該抗体の特異性が、抗AFAIKL2抗体が、ウレアーゼに結合せず、抗ウレア
ーゼ抗体が、AFAIKL2に結合しないという事実によって確認される。
L-DOS47は、AFAIKL2の及びウレアーゼの化学的コンジュゲートであるために、該抗体及
びウレアーゼ酵素双方由来のトリプシンペプチド、及び双方のタンパク質の共有結合的に
架橋されたペプチドが、該コンジュゲートのトリプシン消化物から検出されるはずである
。ESI LC-MSEペプチドマッピングを行って、コンジュゲートのキャラクタリゼーションを
行った。関連する内容に示されるように、AFAIKL2由来のペプチドが、L-DOS47スペクトル
には出現したが、HPウレアーゼスペクトルには出現しなかった。L-DOS47のトリプシン消
化物からは、AFAIKL2及びウレアーゼアミノ酸配列双方のペプチドカバレッジは、6ppm未
満の典型的な質量誤差で100％であり、各ペプチドは、その高エネルギーMS/MS b/yフラグ
メントイオンにより、±15ppm未満の質量誤差で確認された。
AFAIKL2の活性化部位を同定するため及び各コンジュゲーション部位の分布を決定する
ために、AFAIKL2を、SIABを用いて活性化し、その後、フルオレセイン標識システイン(Cy
s-FL)にコンジュゲートした。結果として得られたAFAIKL2-Cys-FLトリプシン消化及びRP-
HPLCクロマトグラフィーによる分離後に、ピーク画分をMALDI-MSのために採取し、Cys-FL
連結抗体トリプシンペプチドを同定した。SIABに活性化された部位のみが、0.025％TFA中
での最大吸収波長が420nmであるCys-フルオレセインに連結され得るために、活性化され
たペプチドのピークのみが420nmで検出されるはずである。例えば、AFAIKL2のリジン#32
がSIABによって活性化された場合、それは、Cys-FLに連結されるはずであり、かつこのト
リプシン消化部位は、トリプシン消化の間にみられなくなるであろう;従って、L2K32-Cys
-FLと名付けられた、Cys-FLで連結されたリジンが中間に含まれるペプチド
Figure 2020143084
 を示す2768.113Daの分子量のピークが観察されるはずである。AFAIKL2-Cys-FLのトリプシ
ン消化物のRP-HPLCクロマトグラムを、図13に示す。
検出された質量値であると同定されたコンジュゲートしたペプチドも、図13中の対応す
るHPLCピークに表示した。抗体のアミノ酸配列によれば、6個のリジン残基及びN-末端ア
ミン由来の一級アミンは、理論上は活性化反応に利用可能である。しかしながら、実際に
は、それらのうちの4個のみが実質的に活性化された。これは、表面上のこれら4個の一級
アミンを露出させる一方で、その他を該天然の構造の内部に埋め込んでいる、抗体の三次
構造が原因である可能性が最も高い。各活性化部位の分布(表4)は、図13におけるそれの
ピーク面積及び同定されたHPLCピーク面積全ての和により計算した。
表4.AFAIKL2上の各活性化部位のHPLCピーク面積及び分布百分率
Figure 2020143084
表4に示されるように、架橋剤に対して抗体の最も活性な部位は、L2K76であり、それに
L2M1が続き、その後L2K44が続く。L2K32は、抗体結合に必須であり、また最も低活性な部
位でもあるが、それでもなお、全体反応性の〜18％に寄与している。L-DOS47については
、架橋剤により活性化されたAFAIKL2は、ウレアーゼ四次構造の表面に露出したシステイ
ン残基に共有結合的に連結されていた。従って、共有結合的に架橋されたペプチドは、L-
DOS47のトリプシン消化物のペプチドスペクトルから検出されるはずである。
これらの共有結合的に架橋されたペプチドを特定するために、L-DOS47サンプル由来の
トリプシン消化物のESI LC-MSE生データをBioPharmaLynxによって処理したが、ウレアー
ゼ側の15個のシステイン残基全てに対するユーザー作成の修飾因子の組み合わせを含有す
る可変修飾因子ライブラリーを用いて検索した。表4の活性化分布にしたがい、これらの
ユーザー作成修飾因子は、3つのリジンが中間に含まれるペプチド＋SIABの連結部分(C9H5
O2N, 159.0320Da)(L2K76、L2K44、及びL2K32と名付ける)、及びN-末端のメチオニン＋該
連結(L2M1と名付ける)であった。この結果(詳細は関連する内容中)は、各ウレアーゼサブ
ユニットの15個のシステイン残基のうち、6個のみが実質的にコンジュゲートしたことを
実証した。最も利用しやすいシステインは、UC824であり、UC663、UC59、UC207、UC329、
及びUC268が順に続く。ウレアーゼ酵素活性に必須であるシステイン残基Cys592は、実質
的にコンジュゲートしなかった。ウレアーゼ側の6個のシステイン残基の各々にとっての4
つの架橋剤により活性化されたAFAIKL2部位の相対的な利用しやすさもまた異なっていた
。例えば、UC329は、L2M1にとってのみ利用可能であった。これらの実質的なコンジュゲ
ーション部位もまた、それらのMS/MSフラグメントプロファイルによって確認された。一
例として、
Figure 2020143084
 の配列を有し、3517.4873のペプチド質量を有するコンジュゲートしたペプチドであるL2K
32UC663を、それを、修飾因子としての、AFAIKL2側由来の
Figure 2020143084
 で修飾された
Figure 2020143084
 ウレアーゼペプチド(配列番号:9)として検索することによって、2.1ppmの質量一致誤差(m
ass match error)で同定した。また、同じペプチドを、それを修飾因子としての、ウレア
ーゼ側由来の
Figure 2020143084
 で修飾された
Figure 2020143084
 AFAIKL2ペプチドとして検索することによって、2.1ppmの質量一致誤差で同定した。この
コンジュゲートしたペプチドの高エネルギー衝突誘起MS/MSスペクトルを、それをAFAIKL2
側由来の前記修飾因子で修飾されたウレアーゼペプチドとして検索することによって、ウ
レアーゼ側由来の9 b/yフラグメントイオンでマッピングした。また、AFAIKL2側由来の14
b/yイオン同じスペクトルを、それを、ウレアーゼ側由来の前記修飾因子を伴うAFAIKL2
ペプチドとして検索することによってもマッピングした。
BxPC-3、A549、及びMCF7細胞株の間で異なるL-DOS47結合プロファイルが観察された(図
14)。この結果により、L-DOS47が、膵臓の細胞株BxPC-3によく結合したことが示され、CE
ACAM6抗原が細胞表面に発現されていたことを示している。中程度の結合が、肺細胞株A54
9で観察されたが、乳房細胞株MCF7では結合はみられなかった。ウレアーゼ酵素(DOS47)に
コンジュゲートした場合、AFAIKL2抗体は、CEACAM6発現細胞に対する特異的ターゲティン
グを提供した。このことは、非コンジュゲートDOS47対照で処理された3つの細胞株におけ
る結合シグナルの非存在によって確認された。
BxPC-3細胞は、細胞を1μg/mL未満のL-DOS47で処理した場合に観察された細胞生存時間
の急速な低下によって示されるように、L-DOS47細胞傷害性に対して非常に感受性が高か
った(図15)。中程度の細胞傷害性が、A549細胞において観察された一方で、MCF7において
は効果が観察されず、前記結合研究の結果と一致していた。加えて、陰性対照であるDOS4
7は、どの細胞株に対しても細胞傷害性効果を有しなかった。
L-DOS47イムノコンジュゲートのコンジュゲーション及び精製のために開発された手順
を、その大スケール製造に採用することに成功した。この確立されたコンジュゲーション
化学及び反応条件を用いて、良好な均一性が、架橋剤により活性化された抗体を、HPウレ
アーゼ中間体と予備混合し、その後pHを調整して、コンジュゲーション反応を活性化する
ことによって達成された。ウレアーゼ1分子あたり8〜11個の抗体のコンジュゲーション比
率では、残留ウレアーゼ含量は、ほとんど無視できるほどであり、L-DOS47コンジュゲー
トをウルトラダイアフィルトレーションのみを用いて未反応抗体及び加水分解された架橋
剤を除去することによって精製することができ、残留ウレアーゼを最終のイムノコンジュ
ゲートから分離する難工程が回避された。この手順により、遊離のウレアーゼが2％未満
である高純度L-DOS47生成物(＞95％)が得られた。ELISAによって評価されたL-DOS47の固
定化CEACAM6-Aに対する結合親和性は、ウレアーゼにコンジュゲートした抗体の数に直接
比率しており、コンジュゲーション比率が6を超えた場合は横ばいとなった。大スケール
バッチのすべてについて、コンジュゲーション比率は、ウレアーゼ1分子あたり9〜11個の
抗体の範囲であり、最適なコンジュゲーションがこれらの条件下で達成されていたことを
実証している。デュアル抗体ウエスタンブロットアッセイにより、コンジュゲートの化学
的素性が確認された。ESI LC-MSEペプチドマッピング分析において、L-DOS47イムノコン
ジュゲート由来の抗体及びウレアーゼ双方について100％の配列回収率(sequence recover
y)が達成された。AFAIKL2及びウレアーゼ双方の、C-末端及びN-末端配列を含む3個を超え
るアミノ酸残基を有するペプチド配列を、対応するペプチドのMS/MS b/yフラグメントマ
ップによって確認した。有効なコンジュゲーション部位(AFAIKL2側に4個及びウレアーゼ
側に6個)を、L-DOS47サンプルのESI LC-MSEペプチドマッピング分析によって特定した。
これらの架橋されたペプチドは、抗体側及びウレアーゼ側双方由来の関連ペプチドのMS/M
S b/yフラグメントマップによって確認された。
2つのCEACAM6発現細胞株BxPC-3及びA549に対するL-DOS47の特異性が、抗体にコンジュ
ゲートしたL-DOS47対応品と比較してDOS47の結合及び細胞傷害性活性が存在しないことに
よって例証された。試験した3つの細胞株のうち、BxPC-3が、最も強力な結合シグナルを
示した一方で、A549は、中程度の結合を示すのみであった。BxPC-3の結合シグナルは、A5
49のそれの約5倍であった。この結果は、細胞傷害性アッセイにおいて観察されたものと
一致していた。L-DOS47は、A549に対してよりもBxPC-3に対してかなり高い細胞傷害性効
果を誘導した。L-DOS47結合の欠如のために、MCF-7において細胞傷害性応答は観察されな
かった。L-DOS47は、有望な治療剤として、非小細胞性肺がんのためのヒト第I相臨床研究
において調査中である。
本開示は、上記の態様に関連して記載されているが、前述の説明及び実施例が本開示の
範囲を説明することを意図しており、限定することは意図していないことを理解すべきで
ある。本開示の範囲内の他の態様、利点、及び変更形態が、本開示が属する分野の通常の
知識を有する者には明らかとなるであろう。
本開示は、本開示の個々の態様の個々の実例として意図されている記載された具体的な
態様によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に等価であるいかなる組成物又は方
法も、本件開示の範囲内である。本開示の方法及び組成物において、本開示の主旨又は範
囲から離れることなく種々の改変及び変形を行うことができることが当業者には明らかで
あろう。このように、本件開示の改変及び変形が添付の特許請求の範囲及びそれらの均等
物の範囲内である限りは、本開示が、それらにも及ぶことが意図される。
本明細書において言及された刊行物及び特許出願は全て、各個の刊行物又は特許出願が
、具体的にかつ個別に引用により組み込まれていると示されているのと同じ程度に、本明
細書に引用により組み込まれている。
参考文献
Figure 2020143084
Figure 2020143084
Figure 2020143084
Figure 2020143084
本明細書において言及された刊行物及び特許出願は全て、各個の刊行物又は特許出願が
、具体的にかつ個別に引用により組み込まれていると示されているのと同じ程度に、本明
細書に引用により組み込まれている。
参考文献
Figure 2020143084
Figure 2020143084
Figure 2020143084
Figure 2020143084
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
静脈内注射に適した医薬として許容し得る水性液剤と、非コンジュゲートウレアーゼを
実質的に含まない抗体-ウレアーゼコンジュゲートとを含む医薬組成物。
（構成２）
前記非コンジュゲートウレアーゼが、5％未満である、構成1記載の医薬組成物。
（構成３）
非水性HPLC溶媒を含まない、構成1記載の医薬組成物。
（構成４）
pHが、約6.8である、構成1記載の医薬組成物。
（構成５）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が3、4、5、6、7、8、9、
10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する、構成1記載の医薬組成物。
（構成６）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が6、7、8、9、10、11、
又は12個であるコンジュゲーション比率を有する、構成5記載の医薬組成物。
（構成７）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8、9、10、11、又は12
個であるコンジュゲーション比率を有する、構成6記載の医薬組成物。
（構成８）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約6個以上の平均コンジ
ュゲーション比率を有する、構成1記載の医薬組成物。
（構成９）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約8〜11個である平均コ
ンジュゲーション比率を有する、構成1記載の医薬組成物。
（構成１０）
前記ウレアーゼが、タチナタマメウレアーゼである、構成1記載の医薬組成物。
（構成１１）
前記抗体が、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である、構成1〜10のいずれか1項記載の医薬組
成物。
（構成１２）
前記抗体が、単一ドメイン抗体である、構成1〜11のいずれか1項記載の医薬組成物。
（構成１３）
前記抗体が、非小細胞性肺癌により発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する、構成
1記載の医薬組成物。
（構成１４）
前記抗体が、CEACAM6に対する特異性を有する、構成1〜13のいずれか1項記載の医薬組
成物。
（構成１５）
前記抗体が、K d 値が約1×10 -6 Mを超えるCEACAM6に対する結合親和性を有する、構成1〜
14のいずれか1項記載の医薬組成物。
（構成１６）
前記コンジュゲートが、K d 値が約1×10 -8 Mを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有
する、構成15記載の医薬組成物。
（構成１７）
前記コンジュゲートが、K d 値が約1×10 -10 Mを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有
する、構成16記載の医薬組成物。
（構成１８）
前記コンジュゲートが、IC 50 値が約5nMを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する
、構成1記載の医薬組成物。
（構成１９）
前記IC 50 値が、約3.22nMである、構成18記載の医薬組成物。
（構成２０）
前記コンジュゲートが、約20μg/mLのIC 50 値でCEACAM6に結合する、構成1記載の医薬組
成物。
（構成２１）
前記抗体が、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、構成1記載の医薬組
成物。
（構成２２）
前記抗体が、配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも1つの改変を含むポリペプチ
ドを含む、構成1記載の医薬組成物。
（構成２３）
対象におけるがんを治療する方法であって、該対象に、治療的有効量の構成1〜22のい
ずれか1項記載の組成物を投与することを含み、それにより、該対象におけるがんを治療
する、前記方法。
（構成２４）
前記がんが、非小細胞性肺癌、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、又は
それらの組合せのうちの1つ以上である、構成23記載の方法。
（構成２５）
前記がんが、非小細胞性肺癌である、構成24記載の方法。
（構成２６）
前記対象が、ヒトである、構成24記載の方法。
（構成２７）
抗体-ウレアーゼコンジュゲート、及び該抗体-ウレアーゼコンジュゲートの重量基準で
約5％を超えないウレアーゼを含む組成物を調製する方法であって、(1)活性化された抗体
及びウレアーゼを、該活性化された抗体及び該ウレアーゼが実質的に反応しない溶媒中で
混ぜ合わせて、反応混合物を形成させることであって、該溶媒中の活性化された該抗体及
び該ウレアーゼの分布が一様である、前記形成させること、及び(2)該活性化された抗体
が、該ウレアーゼと容易に反応して、該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成するよう
に、前記(1)の混合物のpHを上昇させること、及び(3)任意に、精製工程によって該抗体-
ウレアーゼコンジュゲートを精製すること、を含み、クロマトグラフィー精製工程を含ま
ない、前記方法。
（構成２８）
前記精製工程が、ウルトラダイアフィルトレーションである、構成27記載の方法。
（構成２９）
前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8〜11
個であるコンジュゲーション比率を有する、構成27記載の方法。
（構成３０）
工程(1)における前記溶媒が、酢酸ナトリウムバッファーなどの、約6.0〜7.0のpHを有
する酸性の水性バッファーである、構成27記載の方法。
（構成３１）
工程(2)において前記pHを上昇させることが、該pHを約8〜9へと調整するホウ酸ナトリ
ウム溶液などの塩基性バッファーの添加を含む、構成27記載の方法。
（構成３２）
前記組成物が、前記精製工程の前に、総タンパク質重量で約10〜20％の非コンジュゲー
ト抗体を含む、構成27〜31のいずれか1項記載の方法。
（構成３３）
前記組成物が、前記精製工程の後に、総タンパク質重量で約1％未満の非コンジュゲー
ト抗体を含む、構成27〜31のいずれか1項記載の方法。
（構成３４）
腫瘍抗原に対する抗体結合親和性を上昇させる方法であって、複数の該抗体分子を、1
つのウレアーゼ分子にコンジュゲートさせて、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成さ
せることを含み、ここで、該コンジュゲートが、非コンジュゲート抗体よりも少なくとも
約100倍高い該腫瘍抗原に対する結合親和性を有する、前記方法。
（構成３５）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が3、4、5、6、7、8、9、
10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する、構成34記載の方法。
（構成３６）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約6個以上であるコンジ
ュゲーション比率を有する、構成34記載の方法。
（構成３７）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が6、7、8、9、10、11、
又は12個であるコンジュゲーション比率を有する、構成36記載の方法。
（構成３８）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8、9、10、又は11個で
あるコンジュゲーション比率を有する、構成36記載の方法。
（構成３９）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約8〜11個である平均コ
ンジュゲーション比率を有する、構成34記載の方法。
（構成４０）
前記ウレアーゼが、タチナタマメウレアーゼである、構成34記載の方法。
（構成４１）
前記抗体が、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である、構成34〜40のいずれか1項記載の方法
。
（構成４２）
前記抗体が、単一ドメイン抗体である、構成34〜41のいずれか1項記載の方法。
（構成４３）
前記腫瘍抗原が、非小細胞性肺癌により発現されるものである、構成34記載の方法。
（構成４４）
前記抗体が、CEACAM6に対する特異性を有する、構成34〜43のいずれか1項記載の方法。
（構成４５）
前記抗体が、K d 値が約1×10 -6 Mを超えるCEACAM6に対する結合親和性を有する、構成34
〜44のいずれか1項記載の方法。
（構成４６）
前記コンジュゲートが、約1×10 -8 Mを超えないK d 値でCEACAM6に結合する、構成45記載
の方法。
（構成４７）
前記コンジュゲートが、約1×10 -10 Mを超えないK d 値でCEACAM6に結合する、構成46記載
の方法。
（構成４８）
前記コンジュゲートが、約5nMを超えないIC 50 値でCEACAM6に結合する、構成34〜47のい
ずれか1項記載の方法。
（構成４９）
前記IC 50 値が、約3.22nMである、構成48記載の方法。
（構成５０）
前記コンジュゲートが、約20μg/mLのIC 50 値でCEACAM6に結合する、構成34〜47のいず
れか1項記載の方法。
（構成５１）
構成1〜22のいずれか1項記載の組成物、及び該組成物の使用のための説明書を含むキッ
ト。

Claims (51)

  1. 静脈内注射に適した医薬として許容し得る水性液剤と、非コンジュゲートウレアーゼを
    実質的に含まない抗体-ウレアーゼコンジュゲートとを含む医薬組成物。
  2. 前記非コンジュゲートウレアーゼが、5％未満である、請求項1記載の医薬組成物。
  3. 非水性HPLC溶媒を含まない、請求項1記載の医薬組成物。
  4. pHが、約6.8である、請求項1記載の医薬組成物。
  5. 前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が3、4、5、6、7、8、9、
    10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する、請求項1記載の医薬組成物。
  6. 前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が6、7、8、9、10、11、
    又は12個であるコンジュゲーション比率を有する、請求項5記載の医薬組成物。
  7. 前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8、9、10、11、又は12
    個であるコンジュゲーション比率を有する、請求項6記載の医薬組成物。
  8. 前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約6個以上の平均コンジ
    ュゲーション比率を有する、請求項1記載の医薬組成物。
  9. 前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約8〜11個である平均コ
    ンジュゲーション比率を有する、請求項1記載の医薬組成物。
  10. 前記ウレアーゼが、タチナタマメウレアーゼである、請求項1記載の医薬組成物。
  11. 前記抗体が、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である、請求項1〜10のいずれか1項記載の医薬
    組成物。
  12. 前記抗体が、単一ドメイン抗体である、請求項1〜11のいずれか1項記載の医薬組成物。
  13. 前記抗体が、非小細胞性肺癌により発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する、請求
    項1記載の医薬組成物。
  14. 前記抗体が、CEACAM6に対する特異性を有する、請求項1〜13のいずれか1項記載の医薬
    組成物。
  15. 前記抗体が、Kd値が約1×10-6Mを超えるCEACAM6に対する結合親和性を有する、請求項1
    〜14のいずれか1項記載の医薬組成物。
  16. 前記コンジュゲートが、Kd値が約1×10-8Mを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有
    する、請求項15記載の医薬組成物。
  17. 前記コンジュゲートが、Kd値が約1×10-10Mを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有
    する、請求項16記載の医薬組成物。
  18. 前記コンジュゲートが、IC50値が約5nMを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する
    、請求項1記載の医薬組成物。
  19. 前記IC50値が、約3.22nMである、請求項18記載の医薬組成物。
  20. 前記コンジュゲートが、約20μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合する、請求項1記載の医薬
    組成物。
  21. 前記抗体が、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項1記載の医薬
    組成物。
  22. 前記抗体が、配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも1つの改変を含むポリペプチ
    ドを含む、請求項1記載の医薬組成物。
  23. 対象におけるがんを治療する方法であって、該対象に、治療的有効量の請求項1〜22の
    いずれか1項記載の組成物を投与することを含み、それにより、該対象におけるがんを治
    療する、前記方法。
  24. 前記がんが、非小細胞性肺癌、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、又は
    それらの組合せのうちの1つ以上である、請求項23記載の方法。
  25. 前記がんが、非小細胞性肺癌である、請求項24記載の方法。
  26. 前記対象が、ヒトである、請求項24記載の方法。
  27. 抗体-ウレアーゼコンジュゲート、及び該抗体-ウレアーゼコンジュゲートの重量基準で
    約5％を超えないウレアーゼを含む組成物を調製する方法であって、(1)活性化された抗体
    及びウレアーゼを、該活性化された抗体及び該ウレアーゼが実質的に反応しない溶媒中で
    混ぜ合わせて、反応混合物を形成させることであって、該溶媒中の活性化された該抗体及
    び該ウレアーゼの分布が一様である、前記形成させること、及び(2)該活性化された抗体
    が、該ウレアーゼと容易に反応して、該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成するよう
    に、前記(1)の混合物のpHを上昇させること、及び(3)任意に、精製工程によって該抗体-
    ウレアーゼコンジュゲートを精製すること、を含み、クロマトグラフィー精製工程を含ま
    ない、前記方法。
  28. 前記精製工程が、ウルトラダイアフィルトレーションである、請求項27記載の方法。
  29. 前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8〜11
    個であるコンジュゲーション比率を有する、請求項27記載の方法。
  30. 工程(1)における前記溶媒が、酢酸ナトリウムバッファーなどの、約6.0〜7.0のpHを有
    する酸性の水性バッファーである、請求項27記載の方法。
  31. 工程(2)において前記pHを上昇させることが、該pHを約8〜9へと調整するホウ酸ナトリ
    ウム溶液などの塩基性バッファーの添加を含む、請求項27記載の方法。
  32. 前記組成物が、前記精製工程の前に、総タンパク質重量で約10〜20％の非コンジュゲー
    ト抗体を含む、請求項27〜31のいずれか1項記載の方法。
  33. 前記組成物が、前記精製工程の後に、総タンパク質重量で約1％未満の非コンジュゲー
    ト抗体を含む、請求項27〜31のいずれか1項記載の方法。
  34. 腫瘍抗原に対する抗体結合親和性を上昇させる方法であって、複数の該抗体分子を、1
    つのウレアーゼ分子にコンジュゲートさせて、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成さ
    せることを含み、ここで、該コンジュゲートが、非コンジュゲート抗体よりも少なくとも
    約100倍高い該腫瘍抗原に対する結合親和性を有する、前記方法。
  35. 前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が3、4、5、6、7、8、9、
    10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する、請求項34記載の方法。
  36. 前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約6個以上であるコンジ
    ュゲーション比率を有する、請求項34記載の方法。
  37. 前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が6、7、8、9、10、11、
    又は12個であるコンジュゲーション比率を有する、請求項36記載の方法。
  38. 前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8、9、10、又は11個で
    あるコンジュゲーション比率を有する、請求項36記載の方法。
  39. 前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約8〜11個である平均コ
    ンジュゲーション比率を有する、請求項34記載の方法。
  40. 前記ウレアーゼが、タチナタマメウレアーゼである、請求項34記載の方法。
  41. 前記抗体が、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である、請求項34〜40のいずれか1項記載の方
    法。
  42. 前記抗体が、単一ドメイン抗体である、請求項34〜41のいずれか1項記載の方法。
  43. 前記腫瘍抗原が、非小細胞性肺癌により発現されるものである、請求項34記載の方法。
  44. 前記抗体が、CEACAM6に対する特異性を有する、請求項34〜43のいずれか1項記載の方法
    。
  45. 前記抗体が、Kd値が約1×10-6Mを超えるCEACAM6に対する結合親和性を有する、請求項3
    4〜44のいずれか1項記載の方法。
  46. 前記コンジュゲートが、約1×10-8Mを超えないKd値でCEACAM6に結合する、請求項45記
    載の方法。
  47. 前記コンジュゲートが、約1×10-10Mを超えないKd値でCEACAM6に結合する、請求項46記
    載の方法。
  48. 前記コンジュゲートが、約5nMを超えないIC50値でCEACAM6に結合する、請求項34〜47の
    いずれか1項記載の方法。
  49. 前記IC50値が、約3.22nMである、請求項48記載の方法。
  50. 前記コンジュゲートが、約20μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合する、請求項34〜47のい
    ずれか1項記載の方法。
  51. 請求項1〜22のいずれか1項記載の組成物、及び該組成物の使用のための説明書を含むキ
    ット。
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