JP6899560B2 - 質量分析データ解析装置及び質量分析データ解析用プログラム - Google Patents

Description

本発明は、質量分析を行うことで得られたマススペクトルデータを解析処理する質量分析データ解析装置及びそのためのコンピュータプログラムに関し、さらに詳しくは、複数のサンプルグループの間での差異解析を行うのに好適な質量分析データ解析装置及びコンピュータプログラムに関する。

マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を用いた微生物（細菌、真菌類）の同定法は、近年、その経済性や迅速性から急速に普及が進んでいる（非特許文献１、特許文献１など参照）。特に、菌種以下のレベル（菌株等）での同定を行うことで、病原性の有無の判定や感染源の特定など、医療分野での非常に有用な情報の取得が可能となる。そうした解析のためには、それぞれ異なるグループに属する微生物の間で、発現が異なるマススペクトルピーク、つまりはバイオマーカーを見いだすことが必要になる。以下、バイオマーカーを単にマーカーといい、マーカーとなるマススペクトル上のピークをマーカーピークという。

一般に、マーカーピークを見いだすには、複数のグループにそれぞれ由来するサンプルを質量分析装置により測定し、それにより得られたデータについてグループ間でのピーク強度の相違を統計的に解析する差異解析を行う必要がある。従来一般的である、差異解析を利用した微生物同定のためのマーカーピークの探索の手順について、概略的に説明する。

［ステップＡ１］菌種・菌株又は培養条件等が相違する複数のグループに属するサンプルを、各グループＮ_g個ずつ用意する。グループの総数はＮ_G、サンプルの総数はＮ_sとする。
［ステップＡ２］各サンプルに対して質量分析を実行してマススペクトルをそれぞれ取得する。得られるマススペクトルの総数はサンプル総数と同じくＮ_s個である。
［ステップＡ３］Ｎ_s個のマススペクトルそれぞれについてピーク検出を行い、ピーク情報、つまり各ピークの質量電荷比値及び信号強度値を収集する。そして、サンプル毎にそのピーク情報をピークリストとして整理する。ピークリストは、ピークの質量電荷比値の順に、その質量電荷比値に対する信号強度値をまとめたものである。このピークリストの総数もＮ_s個である。

［ステップＡ４］一つの、つまりは一つのサンプルに対するピークリストを列ベクトルとし、同じ質量電荷比値に対する信号強度値が同一行に配置されるように、列ベクトルとしたピークリストを行方向つまり横方向に並べることによってピークマトリクスＭ_pを作成する。このとき、グループ毎にピークリストをまとめる。こうして作成されるピークマトリクスＭ_pの列数はサンプル総数と同じＮ_sであり、行数はサンプル全体について観測されたピークの総数Ｎ_p（ただし質量電荷比値が或る閾値内に収まるピークは重複しているものとして１とする）である。図３（ｂ）はピークマトリクスの一例である。

［ステップＡ５］ピークマトリクスＭ_pの各行にはＮ_s個の信号強度値が含まれ、それらはＮ_G個のグループのいずれかに属する。これらの信号強度値に対してグループ間の差異の有無を単変量解析にて解析し、行毎にｐ値を計算する。単変量解析の手法は、Ｎ_G＝２の場合にはｔ検定又はＵ検定、Ｎ_G≧３の場合にはANOVAが一般的である。
［ステップＡ６］ステップＡ５で求めたｐ値を予め定めた有意水準αと比較することにより、有意差のある行、つまりはピークを選択する。そして、有意差のあった行に対応するピークをマーカーピークの候補として挙げる。

マーカーピークの候補は、質量分析とは別の観点、具体的には生物学的な機序の考察や追加的な実験に基づく妥当性の検証などを経て選択され、十分な根拠を有するものがマーカーピークであると判定される。

特許第５７５０６７６号公報

「AXIMA微生物同定システム」、株式会社島津製作所、［online］、［平成２９年４月１１日検索］、インターネット＜URL： http://www.an.shimadzu.co.jp/ms/axima/mis.htm＞ 株木（S. Kabuki）ほか５名、「デベロップメント・オブ・アン・アトモスフェリック・チェビシェフ・イメージング・カメラ・フォー・ザ・カンガルーIII、エクスペリメント（Development of an atmospheric Cherenkov imaging camera for the CANGAROO-III experiment）」、Proceedings of The Universe Viewed in Gamma-rays、University of Tokyo Workshop 2002、September 25-38、2002年 リリーフォース（Lilliefors H. W.）、「オン・ザ・コルモゴロフ−スミルノフ・テスト・フォー・ノーマリティ・ウィズ・ミーン・アンド・バリアンス・アンノウン（On the Kolmogorov-Smirnov Test for Normality with Mean and Variance Unknown）」、Journal of the American Statistical Association、Vol. 62、No. 318、1967年、pp. 399-402

上記のような手順で差異解析を行うには、グループ毎に十分な個数のサンプルを用意して各サンプルを質量分析する必要がある。しかしながら、グループの数が多くなると、培養や前処理等のサンプル準備に掛かる手間が大きな負担となる。また、サンプルを質量分析する作業も非常に煩雑で時間が掛かる。

本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その主たる目的は、グループの数が多く、一つのグループ当たりのサンプル数が比較的少ない場合であっても、グループ間で差異のあるピーク（マーカーピーク）を高い確度で探索することができる質量分析データ解析装置及び質量分析データ解析用プログラムを提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明に係る質量分析データ解析装置は、それぞれが複数のグループのいずれかに属する複数のサンプルについて質量分析を行うことで得られたマススペクトルデータに基づいて、前記複数のグループの間で発現に差異があるマーカーピークを見つけるための質量分析データ解析装置であって、
a)与えられた複数のサンプルに対するマススペクトルデータに基づいて、いずれかのマススペクトルでピークが観測される質量電荷比値毎に、該複数のサンプルに対するマススペクトル上のピーク強度値をまとめるピーク情報収集部と、
b)前記ピーク情報収集部で求められた、一つの質量電荷比値に対する複数のピーク強度値に基づくピーク強度分布又はそれを補正したピーク強度分布が、所定のパラメータを用いた確率分布に従うか否かを質量電荷比値毎に判定し、該確率分布に従わないと判定されたピーク強度分布を与える質量電荷比値を、前記複数のグループの間で有意な差異があるとみなせるマーカーピークの候補として決定する有意差判定部と、
を備えることを特徴としている。

また上記課題を解決するために成された本発明に係る質量分析データ解析用プログラムは、コンピュータを用い、それぞれが複数のグループのいずれかに属する複数のサンプルについて質量分析を行うことで得られたマススペクトルデータに基づいて、前記複数のグループの間で発現に差異があるマーカーピークを見つけるための質量分析データ解析用プログラムであって、
a)与えられた複数のサンプルに対するマススペクトルデータに基づいて、いずれかのマススペクトルでピークが観測される質量電荷比値毎に、該複数のサンプルに対するマススペクトル上のピーク強度値をまとめるピーク情報収集ステップと、
b)前記ピーク情報収集ステップにおいて求められた、一つの質量電荷比値に対する複数のピーク強度値に基づくピーク強度分布又はそれを補正したピーク強度分布が所定のパラメータを用いた確率分布に従うか否かを質量電荷比値毎に判定し、該確率分布に従わないと判定されたピーク強度分布を与える質量電荷比値を、前記複数のグループの間で有意な差異があるとみなせるマーカーピークの候補として決定する有意差判定ステップと、
をコンピュータに実行させることを特徴としている。

本発明に係る質量分析データ解析装置及び質量分析データ解析用プログラムにおいて、質量分析の対象であるサンプルは例えば生体又は生物由来の試料であり、典型的には細菌などの微生物である。

例えば飛行時間型質量分析装置において或る一つの化合物由来の一種のイオンが検出器に到達するとき、そのイオンの個数の時間的な変化（つまりは質量電荷比値に対するイオン強度の変化）は正規分布に従うと想定される（厳密にいえば離散的な事象におけるポワソン分布であるが、通常、イオンの個数は非常に多いので連続量とみなしても問題ない）。この場合、同じ性質や特性を有する多数のサンプルについてのマススペクトルから得られる、或る一つの化合物由来の一種のイオンについてのピーク強度分布（ここでは、「ピーク強度値の度数分布」をピーク強度分布という）も正規分布に従うと考えられる。また、質量分析装置では検出器として二次電子増倍管やマイクロチャンネルプレート等の指数関数的な増幅特性を有する検出器が用いられることがしばしばあるが、この場合には、ピーク強度分布は通常の正規分布ではなく対数正規分布に従うと考えられる。

言い換えれば、或るイオンのピーク強度分布が正規分布や対数正規分布に従わない場合には、元の多数のサンプルは同じ性質や特性を有していない、つまりはその多数のサンプルは性質や特性が同じである一つのグループに属していない可能性が高い、ということができる。本発明に係る質量分析データ解析装置及び質量分析データ解析用プログラムは、こうした原理に基づいて、質量電荷比毎に複数のサンプルが一つのグループに属しているとみなせるか否かを判定しつつ、サンプルを性質や特性が相違する複数のグループに区分するのに有用なマーカーピークを探索する。

本発明に係る質量分析データ解析装置において、それぞれが複数のグループのいずれかに属する複数のサンプルについてのマススペクトルデータが与えられると、ピーク情報収集部はマススペクトルデータに基づいて、いずれかのマススペクトルでピークが観測される質量電荷比値毎に、マススペクトル上のピーク強度値の情報を収集する。或る一つの質量電荷比値に対する複数の（実際にはかなり多数の）ピーク強度値はピーク強度分布を表す。そこで、有意差判定部は、質量電荷比値が異なるピーク強度分布毎に、その分布が例えば正規分布や対数正規分布に従うか否かを判定する。或るピーク強度分布が正規分布又は対数正規分布に従うと判定された場合には、グループの間での差異がないと結論付ける。一方、或るピーク強度分布が正規分布又は対数正規分布に従わないと判定されると、グループの間での差異があると結論付ける。そして、そうしたピーク強度分布を与える質量電荷比値をマーカーピークの候補として決定する。

上述した従来の解析手法では、グループ間の差異の有無を判定する際に、各グループにそれぞれ属するサンプルについての分析結果から求めた値（例えば平均値）に有意差があるか否かを判定する。そのため、グループに属するサンプルの数が少なくなると一つのサンプルの分析結果の影響が大きくなり、実際にはグループ間で差異がない場合でも差異ありと判定される可能性が高まる傾向にある。それに対し本発明に係る質量分析データ解析装置では、複数のグループに属するサンプルについての析結果をまとめてピーク強度分布として解析するので、グループに属するサンプルの数が少なくなっても一つのサンプルの分析結果の影響が相対的には反映されにくい。その結果、グループに属するサンプルの数が少ない場合であっても、グループ間の差異の有無の判定の精度が向上する。

本発明に係る質量分析データ解析装置において、好ましくは、
前記確率分布は正規分布又は対数正規分布であり、前記有意差判定部は、
b1)補正なし又は補正済みのピーク強度分布から平均及び分散を推算する平均・分散推定部と、
b2)前記平均・分散推定部で推算された平均及び分散に基づいて、該補正なし又は補正済みのピーク強度分布が正規分布又は対数正規分布に従うことの仮説検定を行う検定部と、
を含む構成とするとよい。

仮説検定の手法は特に限定されない。仮説検定では出力としてｐ値を得ることができるから、そのｐ値を適宜の有意水準と比較することで仮説を棄却するか否かを決めることができる。この構成によれば、ピーク強度分布が正規分布又は対数正規分布に従うか否かを的確に且つ効率的に判定することができる。

また上記構成の本発明に係る質量分析データ解析装置において、前記有意差判定部は、質量分析装置における検出器の出力の飽和特性の影響を除去するようにピーク強度分布を補正する飽和特性補正部をさらに含み、該飽和特性補正部により補正されたあとのピーク強度分布が正規分布又は対数正規分布に従うか否かを判定する構成とするとよい。

この構成によれば、質量分析装置の検出器において実際の信号強度が大きくなるに伴い出力が飽和する現象が起こる場合でも、その飽和の影響を除去又は軽減し、グループ間に差異があるか否かを正確に判定することができる。

なお、上記飽和特性補正部は、予め求めた検出器特性関数の逆関数を用いてピーク強度分布を補正する構成とすることができる。通常、検出器特性関数は例えば装置の製造メーカが実測により求めておくことができる。

また本発明に係る質量分析データ解析装置の一実施態様において、
前記ピーク情報収集部は、
a1)与えられた複数のサンプルに対するマススペクトルについてそれぞれピークを検出するピーク検出部と、
a2)マススペクトル毎に検出されたピークの情報に基づいて、ピークの質量電荷比値を列方向又は行方向に、サンプルを識別する情報を行方向又は列方向に割り当て、ピーク強度値を要素として配置したピークマトリクスを作成するピークマトリクス作成部と、
を含み、前記有意差判定部は、前記ピークマトリクスにおいて同じ質量電荷比値に対するピーク強度値が並べられた同一行又は同一列毎にピーク強度分布を求める構成とすることができる。

この構成では、サンプルに関する全てのピーク情報を網羅したピークマトリクスが作成されるので、ピークが得られる全ての質量電荷比について確実にピーク強度分布を判定することができる。

なお、本発明に係る質量分析データ解析装置では、質量電荷比値毎のピーク強度分布を可視化するために、質量電荷比値毎に、ピーク強度値の階級と度数との関係を示すヒストグラムを作成し、使用者からの指示に応じて該ヒストグラムを表示したり印刷出力したりできるようにしてもよい。

本発明に係る質量分析データ解析装置及び質量分析データ解析用プログラムによれば、それぞれ複数のサンプルが属する複数のグループの間で有意な差異があるマーカーピークを探索する際に、一つのグループ当たりのサンプル数が比較的少ない場合であっても、マーカーピークを高い確度で以て見つけることができる。それによって、差異解析に際して、グループ毎に用意するサンプルの数を少なくすることができ、サンプルを準備する作業者の負担を軽減し、サンプル準備に要するコストを削減することができる。また、質量分析を行うサンプルの数も少なくなるので、分析に要する時間も短縮し、効率的に微生物同定等の作業を行うことができる。

本発明に係る質量分析データ解析装置を含む質量分析システムの一実施例の概略ブロック構成図。 本実施例の質量分析システムにおけるマーカーピーク候補選定処理のフローチャート。 ピークマトリクスの概念図（ａ）、及び、複数のサンプルに対するマススペクトルに基づいて作成されるピークマトリクスの一例を示す図（ｂ）。 ピークマトリクス中の一つの行に含まれるピーク強度値に基づいて作成されるヒストグラムの一例を示す図。 図４に示したヒストグラムを横軸をピーク強度値の対数とした場合のヒストグラムを示す図。 図５に示すピーク強度分布から推定される平均・分散を有する対数正規分布を仮定したときのＱ−Ｑプロットを示す図。 検出器の出力飽和を見込んだ特性関数を用いて図６に示したＱ−Ｑプロットをフィッティングした結果を示す図。 検出器の出力飽和を補正したあとのピーク強度分布のヒストグラムを示す図。 ピークマトリクス中の別の一つ行に含まれるピーク強度値に基づいて作成されるヒストグラムの一例を示す図。 図９に示したヒストグラムを横軸をピーク強度値の対数とした場合のヒストグラムを示す図。 図１０に示すピーク強度分布から推定される平均・分散を有する対数正規分布を仮定したときのＱ−Ｑプロットを示す図。 二つのピーク強度分布の重畳であると仮定した場合のピーク毎の強度分布のヒストグラムを示す図。

以下、本発明に係る質量分析データ解析装置の一実施例について、添付図面を参照して説明する。図１は、本発明に係る質量分析データ解析装置を含む質量分析システムの一実施例の概略ブロック構成図である。

本実施例の質量分析システムは、質量分析装置本体１と、データ解析部２と、入力部３と、表示部４と、を備える。ここでは質量分析装置本体１は、マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）であり、ＭＡＬＤＩイオン源、飛行時間型質量分離器、及び、検出器、を含む。検出器は、指数関数的な増幅特性を有する、多段ダイノード型二次電子増倍管やマイクロチャンネルプレートを用いたものである。

データ解析部２は、機能ブロックとして、データ格納部２０、ピークリスト作成部２１、ピークマトリクス作成部２２、ピーク強度分布作成部２３、確率分布判定部２４、及び出力処理部２５、を備える。確率分布判定部２４は、平均・分散推定部２４１、飽和特性情報記憶部２４２、飽和特性補正部２４３、及び分布関数検定部２４４、を含む。

一般に、このデータ解析部２の実体はパーソナルコンピュータ又はより高性能なワークステーション等のコンピュータである。そして、該コンピュータにインストールされた専用のデータ解析ソフトウェアを該コンピュータ上で実行することによって、上記各機能ブロックが具現化される。こうした構成では、コンピュータにインストールされたデータ解析ソフトウェアが本発明に係る質量分析データ解析用プログラムに相当する。

本実施例の質量分析システムにおける差異解析の手順を図２を参照して説明する。図２は本実施例の質量分析システムにおけるマーカーピーク候補選定処理のフローチャートである。ここでは、異なるグループ（例えば菌種や菌株が相違する）にそれぞれ属する複数のサンプルに基づいて、そのグループ間で発現に差異があるマーカーピーク（つまりはマーカーとなる質量電荷比値）を見つける処理を行う場合を例に挙げて説明する。グループの総数はＮ_G（＞１）、一グループ当たりのサンプル数はＮ_g（＞１）、サンプルの総数はＮ_s（＝Ｎ_G×Ｎ_g）であるとする。

質量分析装置本体１は用意されたＮ_s個のサンプルについてそれぞれ質量分析を実行し、所定の質量電荷比範囲に亘るマススペクトルデータを取得する（ステップＳ１）。質量分析装置本体１で得られたマススペクトルデータはデータ解析部２に送られ、データ格納部２０に格納される。ただし、或る特定の１台の質量分析装置本体１により得られたマススペクトルのみならず、他の質量分析装置において同様に得られたマススペクトルデータもデータ格納部２０に格納することが可能である。即ち、データ解析部２において解析対象である多数のサンプルに対するマススペクトルデータは、特定の１台の質量分析装置で得られたデータでもよいし、異なる複数の質量分析装置で得られたデータでもよい。後述するように検出出力の飽和特性を補正する場合には、その飽和特性がほぼ同じである検出器を搭載した質量分析装置で得られたデータである必要がある。

データ格納部２０にはＮ_s個のサンプルに対するＮ_s個のマススペクトルデータのデータセットが格納される。所定のタイミングで以てピークリスト作成部２１はデータ格納部２０からマススペクトルデータを読み出し、データセット毎にマススペクトルに対して所定の基準に従ってピークを検出する。そして、検出された各ピークの質量電荷比値とピーク強度値とを求め、マススペクトル毎に、つまりはサンプル毎に、質量電荷比値とピーク強度値との組を多数集めたピークリストを作成する（ステップＳ２）。作成されるピークリストの数はサンプルの数と同数でＮ_s個である。

ピークマトリクス作成部２２は、Ｎ_s個のピークリストに基づいて、縦方向がm/z値、横方向がサンプル名、要素がピーク強度値であるピークマトリクスを作成する（ステップＳ３）。図３（ａ）はピークマトリクスの概念図、図３（ｂ）はピークマトリクスの実例を示す図である。m/z値は全てのピークリストのいずれか一つに存在するものが全て挙げられる。このピークマトリクスの各行にはそれぞれ、少なくとも一つのサンプルで観測されたピークについて、全てのサンプルにおけるピーク強度値が含まれる。したがって、一つの行の複数のピーク強度値は、一つの質量電荷比におけるピーク強度分布を表すものである。ここではそのピーク強度分布を可視化するために、ピーク強度分布作成部２３はピークマトリクスの行毎に、そのピーク強度値が、強度値を所定範囲毎に区切った階級のいずれに入るのかを判定しながらその度数を計数することで、ピーク強度値の階級と度数（頻度）との関係、つまりはピーク強度分布を示すヒストグラムを作成する（ステップＳ４）。なお、このステップＳ４は省略しても構わない。

次に確率分布判定部２４は、それぞれ異なる質量電荷比値に対応するピーク強度分布毎に、つまりはピークマトリクスにおける各行の複数のピーク強度値毎に、そのピーク強度分布に基づいてＮ_G個のグループ間の差異の有無を判定する処理を実行する（ステップＳ５）。具体的な手順は以下のとおりである。

まず、ピークマトリクス中の一つの行に対応するピーク強度分布に基づいて、平均・分散推定部２４１はその分布の平均及び分散を推算する（ステップＳ５１）。このとき、ピーク強度分布としてはピークマトリクス中の該当する行に含まれる全てのピーク強度値をそのまま用いてもよいし、或いは、ステップＳ４で作成したヒストグラムを利用してもよい。

一方、飽和特性補正部２４３は飽和特性情報記憶部２４２に予め格納されている、質量分析装置本体１の飽和飽和特性情報に基づいて、ステップＳ５１で平均及び分散を求めたピーク強度分布を補正する（ステップＳ５２）。質量分析装置に利用される検出器では、入力−出力特性上の出力が大きい領域において頭打ちとなる、つまり出力が飽和する現象がみられることがよくある。そのため、この検出出力の飽和による強度値の落ち込みを補正しないと、ピーク強度分布が正確なものとならない。一般的には、検出器の出力の飽和特性は実験的に又はシミュレーションによって求めることができる。そこで、ここで、予め求めておいた検出器の特性関数を飽和特性情報記憶部２４２に記憶しておき、その特性関数の逆関数を用いてピーク強度分布を補正する。もちろん、こうした出力飽和が生じない検出器を用いる場合、或いは、検出器の出力飽和が生じない入力−出力特性の範囲でのみ該検出器を利用する場合には、ステップＳ５２の処理を省くことができる。

分布関数検定部２４４は、ステップＳ５１で求まった平均・分散の推定値に基づいて、ステップＳ５２で補正されたあとのピーク強度分布が対数正規分布に従っているか否かの仮説検定を実行する（ステップＳ５３）。ここで、正規分布ではなく対数正規分布に従うか否かの仮説検定を行うのは、質量分析装置本体１の検出器が指数関数的な増幅特性を有するものであるためである。したがって、仮に質量分析装置本体１の検出器が線形的な増幅特性を有するものである場合には、対数正規分布ではなく通常の正規分布に従うか否かの仮説検定を行えばよい。

正規性の仮説検定には例えば、χ²分布を用いた適合度検定、コルモゴロフ−スミノルフ検定、リリーフォース検定、シャピロ−ウィルクのＷ検定など、様々な手法があり、適宜の手法を用いることができる。ステップＳ５３での仮説検定の結果、対数正規分布に従っているとの仮説が棄却されなければ、そのm/z値において全てのサンプルが一つのグループであるとみなすことが妥当であると判定できる。即ち、この場合には、グループ間での差異がないと判定される。一方、上記仮説が棄却されれば、グループ間での差異がある可能性が高いと判定される。

そして、分布関数検定部２４４は、ピークマトリクス中の全ての行についてステップＳ５１〜Ｓ５３によるグループ間での差異の有無の判定を実施したか否かを判定し（ステップＳ５４）、未判定の行があればステップＳ５４からＳ５１へと戻る。したがって、ステップＳ５１〜Ｓ５４の繰り返しによって、ピークマトリクス中の全ての行についてグループ間での差異の有無の判定が実施される。そして、出力処理部２５は、仮説検定が棄却された行、つまりグループ間で有意な差異があったと判定された行に対応するm/z値をマーカーピーク候補に選定し、その結果を表示部４の画面上に表示する（ステップＳ６）。
なお、ステップＳ４で作成したヒストグラムは、使用者が入力部３で所定の操作を行ったときに、それに対応して表示部４の画面上に表示されるようにすればよい。

以上のようにして、本実施例の質量分析システムでは、複数のグループに属するサンプル全体の情報を利用して、それらサンプルが一つのグループに属するとみなせるか否かを判定する。そのため、各グループに属するサンプルの数Ｎ_gが比較的少なくても、全体のサンプル数Ｎ_sが或る程度大きければ、精度の高い差異解析が可能である。

次に、上記実施例の質量分析システムにおいて実施した差異解析の具体例を説明する。
この差異解析では、３４株（Ｎ_G＝３４）の微生物について同一株から８個ずつ（Ｎ_g＝８）、つまり全体で２７２個（Ｎ_s＝２７２）のサンプルを用意した。この２７２個のサンプルについてそれぞれ質量分析装置本体１で質量分析を実行し、マススペクトルを取得した。そして、その２７２個のマススペクトルに基づいて、上述したステップＳ２、Ｓ３の手順でピークマトリクスを作成し、微生物の各株をそれぞれ一つのグループとしてグループ間でピーク強度分布に差異があるか否かを検証した。

図４は、ピークマトリクスの中で或る一つの行に基づいて作成したピーク強度分布を示すヒストグラムである。また図５は、同じピーク強度分布について横軸をピーク強度の対数としたときのヒストグラムである。これらピーク強度分布について、グループ間（つまり株間）で差異があるか否かを以下の手順で解析した。

まず、図４に示したピーク強度分布に対し対数正規分布を仮定したフィッティングを行うことで、ピーク強度分布の平均及び分散の値を推算した。次に、推算された平均及び分散を有する対数正規分布を理論分布として、ピーク強度分布のＱ−Ｑプロットを作成した。図６が得られたＱ−Ｑプロットである。ピーク強度分布が対数正規分布であれば、図６中に１点鎖線で示した傾きが４５°である直線上に各点がプロットされる筈である。しかしながら、図６から分かるように、ピーク強度値が大きな領域（図６中の右方）では各点のプロットは頭打ちになっている。

このようになるのは、質量分析装置本体１の検出器の出力の飽和の影響であると想定される。そこで、検出器の理想的な出力ｘと実際の出力との関係を、非特許文献２を参照して、次の(1)式で表される検出器特性関数Ｓ(ｘ)で以てモデル化した。
Ｓ(ｘ)＝ｘ （０≦ｘ≦ａである場合）
Ｓ(ｘ)＝ａ＋｛（ｘ−ａ＋ｃ）^b−ｃ^b｝×（ｃ^1-b／ｂ） （ａ＜ｘである場合） …(1)
ここで、ａ（＞０）、ｂ（＜０）、ｃ（＞０）はいずれもフィッティングにより求まる係数である。なお、Ｓ(ｘ)はｘ＝ａでも微分可能であり、Ｓ'(ａ)＝１である。

図６に示したＱ−Ｑプロットを、出力飽和を見込んだ上記(1)式を用いてフィッティングし直すと、Ｑ-Ｑプロットは図７に示すようになる。図７では１点鎖線で示す理想的な曲線にプロットが沿って分布している。そこで、ここで求めた検出器特性関数Ｓ(ｘ)の逆関数Ｓ^-1(ｘ)を用いて、ピーク強度値を補正すれば、検出器の出力飽和の影響を軽減することができる。図８は補正後のピーク強度分布を強度の対数に基づいて作成したヒストグラムである。この「補正後のピーク強度分布が対数正規分布に従う」という仮説をリリーフォース（Lilliefors）検定（非特許文献３参照）を用いて検定したところ、ｐ値は０．１８４５と求まった。

一般に、ｐ値が０．０５以下であれば仮説は棄却されるから、この場合、十分に高い信頼度で以て上記仮説は棄却されない。この結果、ピークマトリクスの上記行に対応したピーク（m/z値）では、グループ間の差異はないと判定される。

一方、同じピークマトリクス中の別の行から作成したピーク強度分布を図９、図１０に示す。図９は横軸を単なる強度値、図１０は横軸を強度値の対数としたヒストグラムである。このようなピーク強度分布に対して上記と同様の仮説検定を試みた。

即ち、図１０に示したピーク強度分布から平均及び分散を推算し、その平均及び分散を有する対数正規分布を理論分布として仮定したＱ−Ｑプロットを作成すると図１１に示すようになった。この図１１と図６とを比較すると、プロット点の関係が全く異なることが分かる。この場合、(1)式によるフィッティングは適切ではない。そのため、出力飽和特性の補正を行っても実質的にその効果はないので、補正後のピーク強度は元のピーク強度と等しいとみなすことができる。そして、「補正後のピーク強度分布（＝元のピーク強度分布）が対数正規分布に従う」という仮説を先と同様にリリーフォース検定を用いて検定した。その結果、ｐ値は０．００１未満となり、この場合、上記仮説は棄却される。即ち、ピークマトリクスの上記行に対応したピークでは、グループ間の差異がある可能性が高いと判定される。したがって、このピークはマーカーピークの候補として選定される。
なお、このときのピーク強度分布は、図１２に示すように、平均及び分散が相違する二つのピーク強度分布が重畳されているとみるのが妥当である。

上記具体例で示したように、上記実施例の質量分析システムによれば、ピークマトリクスの行毎に、つまりは多数のサンプルにそれぞれ対応するマススペクトルにおいて観測されるピークの質量電荷比毎に、グループ間での差異があるか否かを判定することができる。それによって、グループ間での差異に寄与する可能性が高いマーカーピークの候補を的確に見つけることができる。

なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

１…質量分析装置本体
２…データ解析部
２０…データ格納部
２１…ピークリスト作成部
２２…ピークマトリクス作成部
２３…ピーク強度分布作成部
２４…確率分布判定部
２４１…平均・分散推定部
２４２…飽和特性情報記憶部
２４３…飽和特性補正部
２４４…分布関数検定部
２５…出力処理部
３…入力部
４…表示部

Claims (10)

1. それぞれが複数のグループのいずれかに属する複数のサンプルについて質量分析を行うことで得られたマススペクトルデータに基づいて、前記複数のグループの間で発現に差異があるマーカーピークを見つけるための質量分析データ解析装置であって、
   a)与えられた複数のサンプルに対するマススペクトルデータに基づいて、いずれかのマススペクトルでピークが観測される質量電荷比値毎に、該複数のサンプルに対するマススペクトル上のピーク強度値をまとめるピーク情報収集部と、
   b)前記ピーク情報収集部で求められた、一つの質量電荷比値に対する複数のピーク強度値に基づくピーク強度分布又はそれを補正したピーク強度分布が、所定のパラメータを用いた確率分布に従うか否かを質量電荷比値毎に判定し、該確率分布に従わないと判定されたピーク強度分布を与える質量電荷比値を、前記複数のグループの間で有意な差異があるとみなせるマーカーピークの候補として決定する有意差判定部と、
   を備えることを特徴とする質量分析データ解析装置。
2. 請求項１に記載の質量分析データ解析装置であって、
   前記確率分布は正規分布又は対数正規分布であり、前記有意差判定部は、
   b1)補正なし又は補正済みのピーク強度分布から平均及び分散を推算する平均・分散推定部と、
   b2)前記平均・分散推定部で推算された平均及び分散に基づいて、前記補正なし又は補正済みのピーク強度分布が正規分布又は対数正規分布に従うことの仮説検定を行う検定部と、
   を含むことを特徴とする質量分析データ解析装置。
3. 請求項２に記載の質量分析データ解析装置であって、
   前記有意差判定部は、質量分析装置における検出器の出力の飽和特性の影響を除去するようにピーク強度分布を補正する飽和特性補正部をさらに含み、該飽和特性補正部により補正されたあとのピーク強度分布が正規分布又は対数正規分布に従うか否かを判定することを特徴とする質量分析データ解析装置。
4. 請求項３に記載の質量分析データ解析装置であって、
   前記飽和特性補正部は、予め求めた検出器特性関数の逆関数を用いてピーク強度分布を補正することを特徴とする質量分析データ解析装置。
5. 請求項１に記載の質量分析データ解析装置であって、
   前記ピーク情報収集部は、
   a1)与えられた複数のサンプルに対するマススペクトルについてそれぞれピークを検出するピーク検出部と、
   a2)マススペクトル毎に検出されたピークの情報に基づいて、ピークの質量電荷比値を列方向又は行方向に、サンプルを識別する情報を行方向又は列方向に割り当て、ピーク強度値を要素として配置したピークマトリクスを作成するピークマトリクス作成部と、
   を含み、前記有意差判定部は、前記ピークマトリクスにおいて同じ質量電荷比値に対するピーク強度値が並べられた同一行又は同一列毎にピーク強度分布を求めることを特徴とする質量分析データ解析装置。
6. コンピュータを用い、それぞれが複数のグループのいずれかに属する複数のサンプルについて質量分析を行うことで得られたマススペクトルデータに基づいて、前記複数のグループの間で発現に差異があるマーカーピークを見つけるための質量分析データ解析用プログラムであって、
   a)与えられた複数のサンプルに対するマススペクトルデータに基づいて、いずれかのマススペクトルでピークが観測される質量電荷比値毎に、該複数のサンプルに対するマススペクトル上のピーク強度値をまとめるピーク情報収集ステップと、
   b)前記ピーク情報収集ステップにおいて求められた、一つの質量電荷比値に対する複数のピーク強度値に基づくピーク強度分布又はそれを補正したピーク強度分布が所定のパラメータを用いた確率分布に従うか否かを質量電荷比値毎に判定し、該確率分布に従わないと判定されたピーク強度分布を与える質量電荷比値を、前記複数のグループの間で有意な差異があるとみなせるマーカーピークの候補として決定する有意差判定ステップと、
   をコンピュータに実行させることを特徴とする質量分析データ解析用プログラム。
7. 請求項６に記載の質量分析データ解析用プログラムであって、
   前記確率分布は正規分布又は対数正規分布であり、前記有意差判定ステップでは、補正なし又は補正済みのピーク強度分布から平均及び分散を推算し、推算されたその平均及び分散に基づいて、該補正なし又は補正済みのピーク強度分布が正規分布又は対数正規分布に従うことの仮説検定を行うことを特徴とする質量分析データ解析用プログラム。
8. 請求項７に記載の質量分析データ解析用プログラムであって、
   前記有意差判定ステップは、質量分析装置における検出器の出力の飽和特性の影響を除去するようにピーク強度分布を補正する飽和特性補正ステップを含み、その補正されたあとのピーク強度分布が正規分布又は対数正規分布に従うか否かを判定することを特徴とする質量分析データ解析用プログラム。
9. 請求項８に記載の質量分析データ解析用プログラムであって、
   前記飽和特性補正ステップでは、検出器の出力の飽和特性の影響を除去するために予め求めた検出器特性関数の逆関数を用いてピーク強度分布を補正することを特徴とする質量分析データ解析用プログラム。
10. 請求項６に記載の質量分析データ解析用プログラムであって、
    前記ピーク情報収集ステップは、
    c1)与えられた複数のサンプルに対するマススペクトルについてそれぞれピークを検出するピーク検出ステップと、
    c2)マススペクトル毎に検出されたピークの情報に基づいて、ピークの質量電荷比値を列方向又は行方向に、サンプルを識別する情報を行方向又は列方向に割り当て、ピーク強度値を要素として配置したピークマトリクスを作成するピークマトリクス作成ステップと、
    を含み、前記有意差判定ステップでは、前記ピークマトリクスにおいて同じ質量電荷比値に対するピーク強度値が並べられた同一行又は同一列毎にピーク強度分布を求めることを特徴とする質量分析データ解析用プログラム。

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