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KR102317080B1 - 타우 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

타우 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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KR102317080B1
KR102317080B1 KR1020190050228A KR20190050228A KR102317080B1 KR 102317080 B1 KR102317080 B1 KR 102317080B1 KR 1020190050228 A KR1020190050228 A KR 1020190050228A KR 20190050228 A KR20190050228 A KR 20190050228A KR 102317080 B1 KR102317080 B1 KR 102317080B1
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Abstract

본 발명은 타우 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것으로, 특히 레보시멘단(Levosimendan)과 리바스티크민(Rivastigmine)을 함께 포함하는 것을 특징으로 해서, 레보시멘단을 단독으로 사용했을때보다 타우 응집 저해 효과가 현저히 우수하고, 다른 화합물의 조합보다 타우 응집 저해 효과가 우수하며, 세포 독성도 없어서, 신경퇴행성 질환을 비롯한 타우 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

타우 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating tau related disease}
타우(tau)의 응집 또는 인산화에 의해 야기되는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용되는, 화합물, 그의 광학 활성 이성질체, 또는 그의 약학적 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물에 대한 것이다.
타우(Tau)는 분자량이 50,000~70,000인 신경세포의 축색돌기에 주로 발현되는 미세소관 결합단백질(microtubule-associated protein, MAP)로, microtubules(MT)를 안정화시키는 역할을 하며, 인산화에 의해 분자 다양성을 나타낸다. 사람의 경우 타우는 N말단부분의 29 또는 58 아미노산 잔기의 삽입, C 말단의 3개 또는 4개의 반복구조(미소관 결합부위라고 함)의 mRNA 이어맞추기(alternative splicing)에 의해 6개의 동형이 생성된다.
건강한 신경에서, 타우는 축색돌기 (axon)로부터의 성장 및 신경 세포 분극화 (polarization)를 촉진함으로써 마이크로세관 (microtubules)을 안정화한다. 병리학적으로 과다인산화 (hyperphosphorylation)되는 경우에, 타우는 마이크로세관으로부터 분리되어 불용성 응집을 유도한다 (Gendron TF, Petrucelli L (2009) The role of tau in neurodegeneration. Mol. Neurodegener. 4: 13). 타우 응집을 유도하는 구조적 골격 제안된 바가 있다. 10개의 가용성 모노머들로부터 불용성 필라멘트가 형성되고, 이러한 필라멘트가 신경섬유매듭 (neurofibrillary tangles, NFTs)이라 불리우는 고차원 구조로 결합된다는 증거들이 제시되었다. 인간의 전장 타우는 4개의 보존된 서열 반복으로 구성되는 마이크로세관 결합 도메인을 포함한다. 이러한 서열 반복 중의 양으로 대전된 잔기들은 높은 정도로 음으로 대전된 마이크로세관 (αβ-튜불린 다이머 당 20-30개 전자들)과 결합하는데 중요한 기능을 한다 (Minoura I, Muto E (2006) Dielectric measurement of individual microtubules using the 5 electroorientation method. Biophys. J. 90: 3739-3748.; Mukrasch MD, Biernat J, von Bergen M, Griesinger C, Mandelkow E, et al. (2005) Sites of tau important for aggregation populate beta-structure and bind to microtubules and polyanions. J. Biol. Chem. 280: 24978-24986). 타우의 마이크로세관에 대한 결합 친화도는 또한 인산화에 의해서 능동적으로 조절되는데, 이와 같은 인산화에 의해서 마이크로세관 네트워크의 동적 재배열이 야기된다. 타우가 비정상적으로 과도하게 인산화되는 경우에는 이러한 동적 재배열의 균형을 방해하고, 마이크로세관에 대한 친화도를 급격하게 감소시킨다 (Drewes G, Trinczek B, Illenberger S, Biernat J, Schmitt-Ulms G, et al. (1995) Microtubule-associated protein/microtubule affinity-regulating kinase (p110mark). A novel protein kinase that regulates taumicrotubule interactions and dynamic instability by phosphorylation at the Alzheimer-specific site serine 262. J. Biol. Chem. 270: 7679-7688.; Biernat J, Gustke N, Drewes G, Mandelkow EM, Mandelkow E (1993) Phosphorylation of Ser262 strongly reduces binding of tau to microtubules: distinction between PHF-like immunoreactivity and microtubule binding. Neuron 11: 153-163).
타우 질환(tauopathy)은 타우(tau) 단백질의 과인산화 및 응집이 신경세포에 비정상적으로 축적되어 발생하는 퇴행성 신경질환으로 여러 가지 퇴행성 뇌질환의 원인으로 지목되고 있다. 타우 질환 환자에게서 보이는 타우 단백질의 응집체는 주로 신경세포의 세포체와 수상돌기에서 발견되며, 이를 신경원섬유덩굴 (Neurofibrillary tangles, NFT)과 신경그물 실(neuropil threads)이라 부른다. 신경원섬유덩굴을 살펴보면 타우 단백질이 가는 실 같이 엉켜있는 이중 나선 섬유(paired helical filaments, PHFs)로 이루어지며 이는 정상적인 타우 단백질과는 다르게 응집되고 과인산화가 일어나 있다. 비록 타우병증에서 보이는 비정상적인 타우 단백질의 응집현상이 질병 심화 단계에서 어떤 역할을 하는지 정확히 알려지진 않았지만 퇴행성 뇌질환에서 공통적으로 나타나는 응집현상과 비슷하다.
대표적인 타우 관련 질환으로는 알츠하이머병이 있으며, 이 외에도 파킨슨 질환, 타우병증(tauopathy), 혈관성 치매, 급성 뇌졸중, 외상, 뇌혈관 질환, 뇌 코드 외상, 척수 외상, 말초 신경병증, 망막병증, 녹내장, 진행성 핵상 마비, 피질-기저핵 퇴행증, 아지오필릭 그레인질환(Argyrophilic Grain Disease), 피크 질환 및 유전성 전측두엽 치매가 있다. 해당 분야의 활발한 연구에도 불구하고, 타우단백질이 매개하는 질환은 구체적으로 어떠한 기작으로 신호를 전달하고 독성을 나타내는지 명확히 규명되지 않았다. 또한, 타우 관련 질환에 아직까지 뚜렷한 치료법이나 치료제가 존재하지 않는다.
이에 본 발명자들은 새로운 타우 응집 저해 물질을 선별하기 위하여, 다양한 수십 종의 화합물과 그것들의 조합에 대하여 연구하던 중, 레보시멘단(Levosimendan)과 리바스티크민(Rivastigmine)의 조합이 다른 화합물의 조합보다 타우 응집 및 인산화를 감소시키는 효과가 현저히 우수하다는 사실을 확인한 후, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 레보시멘단을 단독으로 사용했을때보다 타우 응집 저해 효과가 현저히 우수한 화합물의 조합을 제공하는 것이 목적이다.
또한, 본 발명은 여러가지 화합물의 조합 중에서도, 타우 응집 저해 효과가 우수하고, 세포 독성도 없는 새로운 화합물의 조합을 제공해서, 신경퇴행성 질환을 비롯한 타우 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있는 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시형태는, 레보시멘단(Levosimendan) 및 리바스티크민(Rivastigmine)을 포함하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물이다.
여기서, 상기 레보시멘단은 레보시멘단 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체 또는 용매화물인 것이 가능하다.
그리고, 상기 리바스티크민은 리바스티크민 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체 또는 용매화물인 것이 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은, 도네페질(donepezil), 갈란타민(galantamine), 메만틴(Memantine), 타크린(Tacrine), 커큐민(Curcumin), 도파민(Dopamine) 및 리튬클로라이드(LiCl)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1개 이상의 화합물을 더 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은, 항산화제, 콜린에스테라제 저해제 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성 제제를 더 포함하는 것이 가능하다.
또한, 상기 타우(tau) 응집 관련 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 타우병증(tauopathy) 및 혈관성 치매로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 상기 타우병증은 알츠하이머병, 진행성 핵상 마비, 피질-기저핵 퇴행증, 아지오필릭 그레인질환(Argyrophilic Grain Disease), 피크 질환 및 유전성 전측두엽 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는, 레보시멘단(Levosimendan) 및 리바스티크민(Rivastigmine)을 포함하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 레보시멘단(Levosimendan) 및 리바스티크민(Rivastigmine)을 투여하는 단계를 포함하는 방법이다. 그 중에서도, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 방법 또는 치료 방법일 수 있다. 포유류, 동물, 인간, 및/또는 비인간에게 투여하는 것이 가능하다. 상기 레보시멘단 및 리바스티크민을 투여하는 순서는 상관없고, 연속적으로 또는 동시에 투여하는 것이 가능하다. 투여 방법 또한 특별히 제한되지 않고, 경구 투여, 복강 투여, 피하 투여, 근육 투여, 복강내 주사, 근육 내 주사 등의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 레보시멘단(Levosimendan) 및 리바스티크민(Rivastigmine)을 포함하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 치료용 화합물이다. 레보시멘단과 리바스티크민을 포함하는 화합물은 타우(tau) 응집 저해 효과가 우수하기 때문에, 타우 응집 관련 질환의 예방 또는 치료용 화합물로 사용되기에 적합하다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 레보시멘단(Levosimendan) 및 리바스티크민(Rivastigmine) 화합물의 타우(tau) 응집 저해제로서의 용도이다. 예를 들어서, 본 발명은 레보시멘단 및 리바스티크민 화합물의 타우 응집 관련 질환의 치료제 제조용 용도인 것이 가능하다. 본 발명은 레보시멘단 및 리바스티크민 화합물의 타우 응집 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 용도일 수 있다.
본 발명은 레보시멘단(Levosimendan)과 리바스티크민(Rivastigmine)을 함께 포함하는 것을 특징으로 해서, 레보시멘단을 단독으로 사용했을때보다 타우 응집 저해 효과가 현저히 우수하다.
또한, 본 발명에 따른 레보시멘단과 리바스티크민의 조합은 다른 화합물의 조합보다 타우 응집 저해 효과가 우수하고, 세포 독성도 없어서, 신경퇴행성 질환을 비롯한 타우 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 레보시멘단 화합물의 약물 라이브러리 스크리닝 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 레보시멘단 화합물의 세포 내 타우 응집 저해효과와 세포독성을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 레보시멘단 화합물의 농도 의존적 세포 내 타우 응집저해 효과를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 레보시멘단 화합물의 타우 인산화 감소 효과를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 레보시멘단 화합물의 신경세포 손상을 보호하는 효과를 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라, in vitro 상에서 레보시멘단 화합물의 직접적인 타우 응집화 억제 효과를 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따라, in vitro 상에서 레보시멘단 화합물의 타우 응집체 분해능을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 레보시멘단 화합물 유도체의 타우 응집저해 효과를 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따라, 타우 병증 동물 모델을 이용해서 레보시멘단 화합물의 인지 기능 개선 효과를 확인한 신물체 탐색시험(Novel object recognition test) 결과이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따라, 타우 병증 동물 모델을 이용해서 레보시멘단 화합물의 인지 기능 개선 효과를 확인한 수동회피 실험(Passive avoidance test) 결과이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따라, 타우 병증 동물 모델을 이용해서 레보시멘단 화합물의 신경퇴행 억제 효과를 확인한 뇌조직 절편에 대한 광학 현미경 측정 사진과 상기 뇌조직 절편에 포함된 신경세포 수를 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따라, 레보시멘단 및 메틸렌 블루(Methylene blue) 각각에 대하여, 농도별로 도네페질(donepezil), 타크린(Tacrine), 리바스티크민(Rivastigmine), 갈란타민(galantamine), 메만틴(Memantine), 도파민(Dopamine), 커큐민(Curcumin), 및 리튬 클로라이드(LiCl) 각각을 병용 처리한 후, 세포 내 타우 응집 저해를 측정한 결과이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따라, 레보시멘단 및 메틸렌 블루(Methylene blue) 각각에 대하여, 농도별로 도네페질(donepezil), 타크린(Tacrine), 리바스티크민(Rivastigmine), 갈란타민(galantamine), 메만틴(Memantine), 도파민(Dopamine), 커큐민(Curcumin), 및 리튬 클로라이드(LiCl) 각각을 병용 처리한 후, 세포 생존능력(cell viability)을 측정한 결과이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 따라, 레보시멘단 화합물 및 메틸렌 블루(Methylene blue) 각각의 농도에 대하여, 리바스티크민(Rivastigmine)을 농도별로 병용 처리한 후, 세포 내 타우 응집 저해와 세포 독성을 측정한 결과이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 발명은 타우(tau) 병리 또는 그 증상을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 레보시멘단(Levosimendan) 등의 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체 또는 용매화물, 유도체에 관한 것이다.
상기 레보시멘단(Levosimendan)은 칼슘 민감제(calcium sensitiser)로 울혈성 심부전 치료에 이용되는 약물로 알려져 있다. 이 약물은 심장의 Troponin C에 결합하여 Ca2 + 근육 잔섬유 반응성을 증가시킴으로써 수축력을 증가시킨다. 또한, 심근세포의 KATP 통로를 개방함으로써 반허혈(anti-ischemic) 효과 및 반기절(antistunning) 효과를 나타내는 혈관확장제로써 작용하게 된다 (최인철 (2006) 새로운 수축력촉진제-Levosimendan. Korean J Anesthesiol 51: 519-27).
그러나, 현재까지 레보시멘단(Levosimendan) 화합물이 타우의 응집 또는 인산화에 의해 야기되는 질환의 예방 및/또는 치료에 유용한지 여부는 정확하게 알려진 바가 없다. 신약재창출(drug repositioning)은 기존의 약물 및 의약품들을 재검토하여 새로운 적응증(질병)에 적용하고자하는 시도를 일컫는데, 약물개발에 소요되는 시간과 비용을 줄일 수 있고 약물독성 및 임상 연구의 실패도가 낮아 신약개발 전략으로 사용되고 있다. 본 발명은 이러한 신약재창출의 일환으로 레보시멘단(Levosimendan) 화합물을 타우의 응집 또는 인산화에 적용한 것이 특징이다.
현재까지 타우 응집과 인산화에 영향을 미칠 수 있는 제제 및 기전은 명확하게 밝혀진 바가 없으고, 연구가 진행 중인 치료타깃은 CDK5(Cyclin-dependent kinase 5) 억제제, propentofylline (PPE), N-phenylamines, quinoxalines, 메틸렌블루(Methylene blue) 등이 있다. 그 중에서도 메틸렌블루는 타우단백질 응집을 저해하는데 효과가 있다고 알려져 있다. 상기 메틸렌블루는 하기 실시예에서 비교예로 사용되었으며, 본 발명에 따른 레보시멘단(Levosimendan)화합물 보다 세포독성이 높은 것으로 나타났다(도 2 참조).
상기 레보시멘단(Levosimendan) 화합물은 하기 화학식1로 표시되는 것이 가능하다.
[화학식1]
Figure 112019044308924-pat00001
상기 화합물은, 화합물 그 자체, 약제학적으로 허용되는 그것의 염, 수화물, 용매화물, 이성질체 및 전구약물을 모두 포함하는 개념으로 사용된다.
상기 화합물은 타우 응집과 인산화를 저해하는 것을 특징으로 하며, 타우 인산화 효소의 활성 증감에 영향에 미치지 않는다. 또한 응집화가 진행된 타우의 추가적인 응집화를 막고 상기 응집화가 진행된 타우의 응집을 분해하는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 후술하는 본 발명의 실시예에 의하면, 타우 응집을 유도하는 화합물(Forskolin)을 처리한 세포주에 레보시멘단 화합물을 처리한 경우, 타우응집 저해효과(도 3 참조), 타우 인산화 감소 효과(도 4 참조), 및 신경세포 보호 효과(도 5 참조)가 있음을 확인하였다. 또한, in vitro 상에서 타우 응집을 실시간으로 측정한 결과 레보시멘단은 직접적으로 타우 응집 과정에 관여하여 저해 효과를 나타냈었고(도 6, 7 참조), 레보시멘단의 대사체가 타우 응집 저해 효과를 갖는 것은 아니라는 것을 확인하였다(도 8 참조). 나아가, 동물 모델(마우스)을 이용한 신물질탐색시험 (Novel object recognition test)에서도 레보시멘단을 투여하면 새로운 물체에 대해 높은 인식지수를 나타내었고(도 9 참조), 수동회피실험(Passive avoidance test)에서도 레보시멘단을 투여하면 인지능력 개선 효과가 있었으며(도 10 참조), 상기 동물 모델의 뇌조직 절편을 확인해 보아도 레보시멘단을 투여하면 신경세포수가 더 많아서 신경세포 퇴행을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다(도 11 참조).
한편, 본 발명의 일 실시형태는, 레보시멘단(Levosimendan) 및 리바스티크민(Rivastigmine)을 포함하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물이다.
상기 리바스티크민(Rivastigmine) 화합물은 하기 화학식2로 표시되는 것이 가능하다.
[화학식2]
Figure 112019044308924-pat00002
여기서, 상기 레보시멘단은 레보시멘단 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체 또는 용매화물인 것이 가능하다. 그리고, 상기 리바스티크민 역시 리바스티크민 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체 또는 용매화물인 것이 가능하다.
본 발명자들은 새로운 타우 응집 저해 물질을 선별하기 위하여, 다양한 수십 종의 화합물과 그것들의 조합에 대하여 연구하던 중, 레보시멘단과 리바스티크민의 조합이 다른 화합물의 조합보다 타우 응집 및 인산화를 감소시키는 효과가 현저히 우수하다는 사실을 확인한 후, 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 후술하는 본 발명의 실시예에 나타난 바와 같이, 레보시멘단(Levosimendan) 화합물과 함께 도네페질(donepezil), 타크린(Tacrine), 리바스티크민(Rivastigmine), 갈란타민(galantamine), 메만틴(Memantine), 도파민(Dopamine), 커큐민(Curcumin), 및 리튬클로라이드(LiCl)으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 화합물을 각각 병용 처리하여, 타우 응집 저해 효과를 확인하였다.
그 결과, 레보시멘단 (Levosimendan, Levo.)(3 μM) 화합물과 리바스티크민(Rivastigmine) 또는 리튬 클로라이드(LiCl)를 병용처리했을 때, 레보시멘단 화합물을 단독으로 처리하였을 때보다 우수한 타우 응집 억제 효과를 가지고 있음을 확인하였다(도 12 참조). 그리고, 상기 타우 응집 저해 효과가 세포 독성에 기인한 것인지를 확인한 결과, 레보시멘단 화합물(3 μM)과 리튬 클로라이드 화합물(5, 10, 20 mM)의 병용 처리에서 보여지는 타우 응집 억제의 시너지 효과는 리튬 클로라이드 화합물의 세포 독성에 따른 것으로 판단할 수 있었다(도 13 참조). 또한, 레보시멘단 화합물 각각의 농도에 대하여, 리바스티크민을 농도별로 병용 처리한 후, 세포 내 타우 응집 저해와 세포 독성을 측정한 결과, 상기 레보시멘단과 리바스티그민 각각의 농도에 따라 타우 응집 억제 효과가 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 그래서, 레보시멘단과 리바스티그민을 병용 처리하면, 타우 억제 효능이 시너지 효과를 가져서 단독 투여할때 보다 현저히 우수하다는 것을 확인할 수 있었다(도 14 참조).
이에 따르면, 본 발명은 레보시멘단과 리바스티크민을 함께 포함하는 것을 특징으로 해서, 레보시멘단을 단독으로 사용했을때보다 타우 응집 저해 효과가 현저히 우수하다. 또한, 본 발명에 따른 레보시멘단과 리바스티크민의 조합은 다른 화합물의 조합보다 타우 응집 저해 효과가 우수하고, 세포 독성도 없어서, 신경퇴행성 질환을 비롯한 타우 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 조성물은, 도네페질(donepezil), 갈란타민(galantamine), 메만틴(Memantine), 타크린(Tacrine), 커큐민(Curcumin), 도파민(Dopamine) 및 리튬클로라이드(LiCl)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1개 이상의 화합물을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 기본적으로 레보시멘단과 리바스티크민을 함께 포함해서, 타우 응집 저해 효과가 우수하고, 세포 독성도 없는 것을 특징으로 한다. 또한, 레보시멘단과 함께 도네페질(donepezil), 갈란타민(galantamine), 메만틴(Memantine), 타크린(Tacrine), 커큐민(Curcumin), 도파민(Dopamine) 및 리튬클로라이드(LiCl) 각각을 병용 처리하면, 전이성 타우 단백체 TauK18P301L 처리에 의해 유도된 타우 응집을 억제할 수 있었다(도 12 참조).
이에 따르면, 기본적으로 레보시멘단과 리바스티크민을 포함하고, 여기에 더해서 도네페질(donepezil), 갈란타민(galantamine), 메만틴(Memantine), 타크린(Tacrine), 커큐민(Curcumin), 도파민(Dopamine) 및 리튬클로라이드(LiCl)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1개 이상의 화합물을 더 포함하는 경우에도, 타우 응집을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 보여진다.
한편, 본 발명은 상기한 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체 또는 용매화물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 조성물은 유효성분으로 상기한 화합물 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 희석제, 활택제, 윤활제, 결합제, 붕해제, 감미제, 분산제, 계면활성제, 방부제, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제, 향료, 비타민류 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 환약제, 캡슐제, 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.
더 나아가 본 발명은 항산화제, 콜린에스테라제 저해제 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성제제를 더 포함할 수 있다.
상기 항산화제는 α-토코페롤, 비타민C(Ascorbic aicd), 비타민C 팔미트산염, 부틸히드록시아니솔, 디부틸히드록시톨루엔, 구연산(Citric acid), 에리쏘르빈산(Erythorbic acid), 푸마르산, 말릭산, 말토덱스트린, 칼륨 메타비아황산칼륨(Potassium metabisulfide), 메타비아황산나트륨, 프로피온산(propionic acid), 프로필갤레이트(Propyl gallate), 아스코르빈산나트륨, 황산나트륨, 타이몰(Tymol), 사이클로덱스트린 또는 설포부틸에테르 β-사이클로덱스트린 등 으로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 콜린에스테라제 저해제는 콜린에스테라아제의 작용을 저해하고 생체 내에서의 아세틸콜린의 가수 분해를 억제하는 물질로, 콜린 작동 신경(부교감 신경, 운동신경)의 기증 증진을 일으키는데 관여하며, 예를 들어 도네페질(Donepezil), 리바스티그민(Rivastigmin), 갈란타민(Galantamine), Butylcholinesterase, 펜세린(Phenserine), 후페리진(Huperzin A) 등으로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기한 화합물을 포함하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서, 우수한 타우 응집 억제 활성을 가지고, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 타우병증(tauopathy), 혈관성 치매, 급성 뇌졸증, 외상, 뇌혈관 질환, 뇌 코드 외상, 척수 외상, 말초 신경병증, 망막병증, 및 녹내장으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환을 예방 및/또는 치료 처치를 하기 위한 약제의 활성 성분으로 유용하다. 상기 타우(tau) 응집 관련 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 타우병증(tauopathy), 혈관성 치매, 급성 뇌졸증, 외상, 뇌혈관 질환, 뇌 코드 외상, 척수 외상, 말초 신경병증, 망막병증, 및 녹내장으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 타우병증은 알츠하이머병, 진행성 핵상 마비, 피질-기저핵 퇴행증, 아지오필릭 그레인질환(Argyrophilic Grain Disease), 피크 질환 및 유전성 전측두엽 치매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
이와 함께, 본 발명은 상기한 화합물 또는 이의 유도체를 처리하는 것을 포함하는, 타우(tau) 응집 저해 방법에 관한 것이다.
예를 들어, 레보시멘단 및 리바스티크민 화합물을 시험관 내에 세포주에 처리하여 타우의 과인산화를 저해하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명자들은 레보시멘단 화합물을 in vitro로 세포주에 처리하는 경우, 타우의 과인산화를 저해한다는 것을 처음 확인하였고, 레보시멘단 및 리바스티크민 화합물의 병용 투여가 레보시멘단 단독 투여보다 그 효과가 우수하다는 것을 새롭게 알게되었다.
나아가, 본 발명은 상기한 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체 또는 용매화물을 포함하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 다른 실시형태는, 레보시멘단(Levosimendan) 및 리바스티크민(Rivastigmine)을 포함하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품이다.
상기 건강기능식품은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 보조 식품류, 분말, 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 차, 젤리, 또는 음료인 형태로 제조될 수 있다. 상기 제조시에는 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 추가적으로 함유할 수 있다. 예를 들어, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린, 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제 및 향미증진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
또한, 하기의 실시예는 타우-BiFC 세포 모델을 기반으로 하여 수행하였다. 상기 타우-BiFC 세포 모델은 올리고머 형태의 타우 상호작용을 모니터링하기 위한 신뢰성 있는 시스템으로서 비너스 단백질(Venus protein)의 N-말단 및 C-말단 비형광 부분들을 타우에 융합시킨 비너스 단백질 기반의 BiFC 방법이며, 더욱 상세한 정의 및 방법은 대한민국 등록특허 10-1546485에 기재된 바와 같다.
[ 실시예 1 : 레보시멘단의 선별 및 효과 확인]
실시예 1-1 : 세포 내 타우 응집 저해 효과 확인
새로운 타우 응집 저해 물질을 선별하기 위하여, FDA 승인 약물 라이브러리(총 1018개 화합물)를 살아있는 세포 내 타우 올리고머 형성 관찰이 용이한 타우-BiFC 세포 모델에 처리하였다. 도 1 모식도에서 보는 것과 같이 먼저 타우-BiFC 세포를 384 well 플레이트에 플레이팅 하였다. 다음날, 타우 인산화 효소 PKA를 활성화 시켜 타우 응집을 유도하는 화합물인 Forskolin(처리 농도 30 uM)과 함께 FDA-승인 약물들(처리농도 10 uM)을 타우-BiFC 세포에 처리하였다. 46 시간 후, 약물들의 타우 응집 저해 정도와 함께, Hoechst를 이용한 세포 핵 염색을 통해 화합물에 의한 세포 생존력을 분석하였다. 총 1,018 개 약물 중, 응집 억제 효과를 보인다고 기존에 알려진 Methylene blue(MB) 정도의 타우 응집 억제 효과를 보이면서, 약물을 처리하지 않은 정상 상태 (타우-BiFCoff) 정도의 세포 생존력을 보이는 약물 Levosimendan을 선별하였다 (도 1).
선별된 Levosimendan 약물의 타우 응집 저해 효과를 한번 더 확인하기 위하여, 타우 인산화 효소 PKA를 활성화 시켜 타우 응집을 유도하는 화합물인 Forskolin(처리 농도30 uM)과 함께 DMSO, MB, Levosimendan(처리 농도 10 uM)을 타우-BiFC 세포에 처리하였다. 이때 타우 응집 억제 효과를 보인다고 기존에 알려진 Methylene blue(MB)를 비교 화합물(양성대조군)로 사용하였다. 48 시간 후, 타우 응집 저해 효과와 Hoechst를 이용한 세포 핵 염색을 통해 화합물에 의한 세포 생존력을 같이 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 타우-BiFC 세포 모델이 작동하는 상태(Tau-BiFCON)에서 음성대조군(DMSO)에 비해 실험군(Levosimendnan)은 형광값(relative fluorescence units, RFU)이 감소하였다. 또한, 양성대조군으로 사용한 MB에 비교했을 때, 형광값이 유사하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 그리고 세포독성을 평가하기 위해 hoechst로 염색한 Nuclei 숫자를 확인하였을 때, 음성대조군(DMSO)와 양성대조군(MB)은 그 수가 감소한 반면에, 실험군(Levosimendnan)은 정상대조군(Basal)과 유사한 수를 보였다.
이에 따라, MB와 비슷한 정도의 세포 내 타우 응집 저해 효과를 보이면서 세포 독성이 적은 화합물 Levosimendnan이 타우 응집 저해 물질로 선별됨을 확인하였다.
또한, 선별된 Levosimendan 화합물의 살아있는 세포 내 타우 응집화 저해 효과를 좀 더 자세히 확인하고자, 타우 응집 유도 물질인 Forskolin (처리농도 30 uM)과 함께 Levosimendan 화합물을 1, 3, 10, 30 100 uM의 농도로 타우-BiFC 세포에 처리하였다. 48 시간 후의 타우-BiFC 반응 분석을 통해 세포 내 타우 응집 반응과 화합물 독성에 따른 세포 생존 정도를 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 양성대조군(MB)과 실험군(Levosimendan)은 농도에 따라 형광 값이 감소하는 것을 확인하였으며 IC50는 2.2 uM였다. Levosimendan 화합물 (처리농도10 uM)은 아무것도 처리하지 않은 세포와 비슷한 정도의 타우 응집 저해 효과 및 세포 생존 능력을 보였다.
실시예 1-2 : 타우 인산화 저해 효과 확인
Levosimendan 화합물이 타우 인산화 억제에 따른 타우 응집화 저해 효과를 보이는지 확인하기 위하여, 타우 응집 유도 물질인 Forskolin (처리농도30 uM)과 Levosimendan 화합물(처리농도 15 uM)을 Tau-BiFC 세포에 처리하였다. 36 시간 후 타우-BiFC세포 용해물을 가지고 타우 인산화 웨스턴 블랏을 진행하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, Forskolin을 처리한 세포(+)에 비해 양성대조군(+,MB)과 실험군(+,Levosimendan)에서 타우 인산화가 감소되었다는 것을 확인하였다. 실험군(+,Levosimendan)은 타우 인산화 잔기 Ser199에서 34%, Ser396에서 35% 정도의 타우 인산화 감소 효과를 보였다.
실시예 1-3 : 신경세포 보호효과를 확인
Levosimendan 화합물의 타우 응집 저해 효과가 신경세포 손상의 상황에서 신경보호 효과로 이어지는지 확인하였다. Levosimendan 화합물(처리농도 10 uM)을 쥐의 대뇌 피질성 신경 세포(E18, DIV8)에 먼저 처리 한 뒤, 2 시간 후에 신경 세포 손상 및 세포 내 타우 응집 효과를 보이는 타우 단백질 TauK18P301L (처리농도 20ug/mL)을 처리하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 실험군(Levosimendan)은 음성대조군(DMSO)과 양성대조군(MB)에 비해 신경 세포와 신경돌기 길이(neurite length) 손상이 적었다. 이에 반해, 대조군(control)과는 신경세포 모양과 신경돌기 길이(neurite length)가 유사하였다. 즉, Levosimendan 화합물이 TauK18P301L에 의한 신경세포 손상에 보호효과가 있음을 확인하였다.
실시예 1-4 : in vitro상에서 Levosimendan 화합물의 타우 응집 저해 효과를 확인
타우 응집 저해 효과를 보이는 Levosimendan 화합물은 타우 인산화를 저해하고 있으나, 타우 인산화 효소의 활성 증감에는 관여하지 않았다. 따라서 Levosimendan 화합물이 직접적으로 타우 응집 과정에 관여하여 저해의 효과를 보이는지 확인하고자 했다. in vitro상에서 Levosimendan 화합물의 타우 응집화 과정 억제 효과 확인 및 이미 응집화가 진행된 타우의 추가적인 응집화를 막아 응집을 풀어주는 역할을 하는지 확인하였다. in vitro상의 타우 응집화 과정(Tau pre-Agg + 100 uM DTT + 0.1mg/mL Heparin, 37도 배양)에 Levosimendan 화합물을 농도 별로 같이 처리하여, 타우 응집 정도를 ThS(Thioflavin S)로 확인하였다. 상기 ThS는 invitro에서 타우응집을 실시간으로 측정할 수 있는 염료(dye)로, β-sheet 응집을 센싱하는 형광프로브로 쓰인다.
그 결과, 도 6에 나타낸 그래프와 같이, Levosimendan 화합물은 in vitro 상에서 직접적인 타우 응집화 억제 효과를 확인하였다. in vitro상에서 Levosimendan 화합물의 IC50 은 4.71 uM였다.
또한, in vitro상에서 이미 응집된 타우 응집체에 Levosimendan 화합물을 처리하여 (Tau-Agg + 100 uM DTT + 0.1mg/mL Heparin, 37도 배양) 농도에 따른 Levosimendan 화합물의 타우 응집체 분해효과를 확인하였다 (도 7).
실시예 1-5 : Levosimendan 화합물 유도체의 타우 응집 저해 효과 확인
Levosimendan 화합물은 2가지의 비활성화 (OR-1855) 또는 활성화(OR-1896)된 대사체 형태를 가지고 있다. OR-1855화합물의 아세틸 과정을 거친 OR-1896화합물은 체내 오랫동안 남아 약물의 효과를 보인다고 알려져 있다. 따라서, Levosimendan 화합물과 2 가지 대사체를 타우-BiFC 세포에 처리하여 어떤 형태가 타우 응집 저해 효과를 더 보이는지 세포에서 확인하였다. MB, Levosimendan, OR-1855, OR-1896화합물을 농도 별로 타우 응집 유도 물질인 forskolin (처리농도30 uM)과 함께 타우-BiFC세포에 처리하였다. 48 시간 후의 타우 응집 정도를 분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바 같이, 실험군(Levosimendan)은 양성대조군(MB)과 유사하게 타우 응집을 감소시켰다. 즉, Levosimendan 화합물은 농도 의존적인 타우 응집 저해 효과를 보였다.
반면, OR-1855 과 OR-1896 화합물은 타우 응집 저해 효과를 보이지 않았다. 따라서, 세포 내에서 Levosimendan의 대사체 형태가 타우 응집 저해 효과를 보이는 것은 아니다.
실시예 1-6 : Levosimendan 화합물 유도체의 인지 기능 개선 효과를 확인
Levosimendan 화합물의 타우 응집 저해 효과가 인지 기능의 개선에도 영향을 미치는지를 동물 모델을 이용하여 확인하였다. 동물 모델로는 타우 병증을 나타내는 Tau-P301L BiFC 형질전환 마우스를 기반으로 수행하였으며, 구체적으로는 대한민국 등록특허 10-1876423호(발명의 명칭 : 치매 모델 형질전환 마우스 및 이를 이용한 스크리닝 방법)에 기재된 마우스를 이용하였다.
Levosimendan 화합물, 양성대조군(MB), 음성대조군(DMSO)을 30% PEG 400의 생리식염수에 용해 후, 이를 9개월의 마우스에게 5mg/kg (body weight)의 용량으로 3개월 동안 1주일에 3번 복강 투여하였다. Levosimendan 화합물의 투여로 인한 인지 기능 개선 정도를 측정하기 위하여 약물 투여 3개월 후, 신물질탐색시험 (Novel object recognition test) 및 수동회피실험(Passive avoidance test)을 수행하였다.
신물질탐색시험 (Novel object recognition test)을 위해서, 내부에서 외부가 보이지 않도록 제작된 상자 (40 x 40 x 40 cm) 내에 두 개의 모양과 크기가 같은 물체 (O)를 고정시킨 후, 각 군의 마우스가 10분간 물체를 학습하도록 하였다. 24 시간이 지난 후, 두 개의 물체 중 하나를 새로운 물체(N)로 교체하고, 10분의 시간 동안 기존에 학습시켰던 물체(O)와 새로운 물체(N)를 탐색한 시간을 기록하고, 이를 인식지수(Recognition index = 개별물체 (O 또는 N) 탐색시간/전체물체 탐색시간)로 수치화하였다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따라, 타우 병증 동물 모델을 이용해서 레보시멘단 화합물의 인지 기능 개선 효과를 확인한 신물체 탐색시험(Novel object recognition test) 결과이다. 그 결과, 도 9에서 나타낸 바와 같이 Levosimendan 화합물을 투여한 실험군이 음성대조군이나 양성대조군(MB)에 비교하여 새로운 물체에 대해 높은 인식지수를 가지는 것을 확인하였다.
수동회피실험 (Passive avoidance test)을 위해서, 마우스를 수동회피실험 장치 내 밝게 유지되는 A 공간에 위치시킨 후, 약 30초의 탐색시간이 경과한 후 출입구를 개방하여 마우스가 어둡게 유지되는 B 공간으로 들어갈 수 있게 하였다. 마우스가 B 공간으로 들어가게 되면 출입구가 닫히고, 3mA의 전기 충격을 2초 동안 바닥의 격자를 통해 흘려보내 마우스가 어두운 B 공간과 전기 충격을 기억 할 수 있도록 학습시켰다. 24시간이 지난 후, 다시 마우스를 A 공간에 위치시키고 30초 후 출입문을 개방하였을 때 어두운 쪽으로 건너가는 데 걸리는 시간을 최대 540초까지 측정하였다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따라, 타우 병증 동물 모델을 이용해서 레보시멘단 화합물의 인지 기능 개선 효과를 확인한 수동회피 실험(Passive avoidance test) 결과이다. 그 결과, 도 10에서 나타낸 바와 같이 Levosimendan 화합물을 투여한 실험군이 음성대조군이나 양성대조군(MB)에 비교해 어두운 공간에서의 자극을 기억하여 어두운 쪽으로 넘어가는 데에 더 오랜 시간이 걸림을 확인하였다. 상기 결과들을 통해, Levosimendan 화합물이 인지능력 개선 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 1-7 : Levosimendan 화합물 유도체의 신경세포 퇴행 억제 효과를 확인
타우 병증 동물 모델에서 Levosimendan 화합물의 타우 응집저해 효과가 신경세포의 퇴행 억제에도 영향을 미치는지를 확인하였다. 뇌조직 확보를 위하여 약물 투여 및 행동 평가실험(상기 실시예 1-6의 실험)이 끝난 마우스를 2 % 에버틴을 이용하여 과마취 시키고, 생리식염수를 이용하여 심장관류를 통한 perfusion을 진행하였다. perfusion 후, 4 % 파라포름알데하이드를 이용하여 조직을 고정하고 뇌를 적출하였다. 적출한 뇌는 하루 정도 4 % 파라포름알데하이드에 추가 고정한 후, 동결절편 샘플 제작을 위해 30% sucrose 용액에 보관하였다. 이후, OCT compound를 이용하여 동결절편용 몰드를 제작하고 cryosection을 이용하여 40 μm 두께의 조직 절편을 확보하였다.
신경세포체를 염색하기 위하여 1% 크레실 바이올렛을 이용하여 각 투여군의 뇌조직 절편들을 염색하였고 광학 현미경을 이용하여 이미징 하였다, 신경세포의 퇴행을 확인하기 위하여 뇌조직 절편 내 피질부분(somatosensory cortex)과 해마 (dorsal hippocampus) 영역 중 CA1의 세포 수를 측정하였다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따라, 타우 병증 동물 모델을 이용해서 레보시멘단 화합물의 신경퇴행 억제 효과를 확인한 뇌조직 절편에 대한 광학 현미경 측정 사진과 상기 뇌조직 절편에 포함된 신경세포 수를 나타내는 그래프이다. 그 결과, 도 11에서 나타낸 바와 같이 Levosimendan 화합물을 투여한 실험군의 뇌조직 절편에서 음성대조군에 비해 신경 세포의 수가 피질에서 약 42.4%, 해마에서 약 36.0 % 정도 많이 관찰되었다. 즉, Levosimendan 화합물이 타우 병증으로 인한 신경세포 퇴행을 억제하는 데에 효과가 있음을 확인하였다.
[ 실시예 2 : 레보시멘단과 8종 화합물의 병용 처리 효과 확인]
실시예 2-1 : 세포 내 타우 응집 저해 효과 확인
Levosimendan 화합물과 함께 도네페질(donepezil), 타크린(Tacrine), 리바스티크민(Rivastigmine), 갈란타민(galantamine), 메만틴(Memantine), 도파민(Dopamine), 커큐민(Curcumin), 및 리튬클로라이드(LiCl)으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 화합물을 각각 병용 처리하였을 때, 세포 내에서 타우 응집 저해 효과를 확인하였다.
타우 응집을 모니터링할 수 있는 Tau-BiFC 세포에 정제된 전이성 타우 단백체 TauK18P301L(처리농도 5 μg/ml)를 타우 응집 유도체로 처리하였다. 이와 동시에 레보시멘단 (Levosimendan, Levo.) 화합물 (처리농도 3 μM)과 8 종의 화합물로서 도네페질(donepezil)(처리농도 3, 10, 30 μM), 타크린(Tacrine)(처리농도 2.5, 5, 10 μM), 리바스티크민(Rivastigmine)(처리농도 1, 10, 100 μM), 갈란타민(galantamine)(처리농도 2, 10, 50 μM), 메만틴(Memantine)(처리농도 2.5, 5, 10 μM), 도파민(Dopamine)(처리농도 1, 10, 100μM), 커큐민(Curcumin)(처리농도 1, 5 μM), 및 리튬클로라이드(LiCl)(처리농도 5, 10, 20 mM)를 각각 농도별로 병용 처리하였다. 이때 타우 응집 억제 효과를 보인다고 기존에 알려진 메틸렌 블루 (Methylene blue, MB)(처리농도 3 μM)를 비교 화합물(양성대조군)로 사용하였다. 약물 처리 46시간 뒤 세포 내 타우 응집 정도를 Tau-BiFC 형광 intnesity로 정량화 하였다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따라, 레보시멘단 및 메틸렌 블루(Methylene blue) 각각에 대하여, 농도별로 도네페질(donepezil), 타크린(Tacrine), 리바스티크민(Rivastigmine), 갈란타민(galantamine), 메만틴(Memantine), 도파민(Dopamine), 커큐민(Curcumin), 및 리튬 클로라이드(LiCl) 각각을 병용 처리한 후, 세포 내 타우 응집 저해를 측정한 결과이다. 그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 레보시멘단(Levosimendan, Levo.) 화합물과 상기 8종의 화합물을 각각 병용처리 하였을 때, 전이성 타우 단백체 TauK18P301L 처리에 의해 유도된 타우 응집(100 %)을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
그 중에서도, 레보시멘단 (Levosimendan, Levo.)(3 μM) 화합물과 리바스티크민(Rivastigmine) 또는 리튬 클로라이드(LiCl)를 병용처리한 경우, 레보시멘단 화합물을 단독으로 처리하였을 때보다 우수한 타우 응집 억제 효과를 보였다. 나아가, 레보시멘단과 리바스티크민의 조합 및 레보시멘단과 리튬 클로라이드의 조합은 상기 리바스티크민과 리튬 클로라이드의 농도 증가에 따라, 농도 의존적으로 더욱 현저히 우수한 타우 응집 억제 효과를 보여서, 상기 타우 응집 억제 효과가 레보시멘단과 리바스티크민의 조합 및 레보시멘단과 리튬 클로라이드의 조합에 따른 시너지 효과임을 다시 한번 확인할 수 있었다.
이와 비교하여, 메틸렌 블루 (Methylene blue, MB)의 경우, 상기 8종의 화합물과 각각 병용처리 하였을 때, 전이성 타우 단백체 TauK18P301L 처리에 의해 유도된 타우 응집(100%)을 억제할 수는 있었지만, 메틸렌 블루 단독으로 사용했을때 보다 농도 의존적으로 우수한 효과를 보이는 조합은 없음을 확인할 수 있었다.
실시예 2-2 : 세포 독성 확인
레보시멘단(Levosimendan) 화합물과 상기 8종의 도네페질(donepezil), 타크린(Tacrine), 리바스티크민(Rivastigmine), 갈란타민(galantamine), 메만틴(Memantine), 도파민(Dopamine), 커큐민(Curcumin) 및 리튬클로라이드(LiCl) 화합물로 이루어진 군에서 선택된 1종의 화합물을 각각 병용 처리하였을 때 보이는 타우 응집 저해 효과가 세포 독성에 기인한 것인지를 확인하였다.
상기 실시예 2-1의 농도 조건에서 약물 처리 후 46시간 뒤 세포 핵을 염색하는 Hoechst (2 μg/ml)을 처리하여 세포 수를 정량화 하였고, 이는 화합물 처리에 따른 세포 독성 정도를 반영한다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따라, 레보시멘단 및 메틸렌 블루(Methylene blue) 각각에 대하여, 농도별로 도네페질(donepezil), 타크린(Tacrine), 리바스티크민(Rivastigmine), 갈란타민(galantamine), 메만틴(Memantine), 도파민(Dopamine), 커큐민(Curcumin), 및 리튬 클로라이드(LiCl) 각각을 병용 처리한 후, 세포 생존능력(cell viability)을 측정한 결과이다. 그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 레보시멘단 화합물을 단독으로, 그리고 상기 8종의 화합물 중 도네페질(donepezil), 타크린(Tacrine), 리바스티크민(Rivastigmine), 갈란타민(galantamine), 메만틴(Memantine)과 각각 병용 처리하였을 때는, 모두 90% 이상의 세포가 살아있음을 확인하였다.
그러나, 레보시멘단을 도파민(Dopamine) 및 리튬클로라이드(LiCl) 화합물과 각각 병용 처리하였을 경우에는, 고농도에서 75%이하 및 50%이하의 세포 생존율을 보였다. 이는 레보시멘단 화합물(3 μM)과 리튬 클로라이드 화합물(5, 10, 20 mM)의 병용 처리에서 보여지는 타우 응집 억제의 시너지 효과는 리튬 클로라이드 화합물의 세포 독성에 따른 것으로 판단할 수 있다.
또한, 메틸렌 블루의 경우, 단독 처리하거나 상기 8종의 화합물과 각각 병용 처리 하였을 경우, 25%-60% 사이의 세포 생존율을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 메틸렌 블루와 상기 8종의 화합물의 병용투여시 보여지는 세포 내 타우 응집 저해 효과는 화합물의 세포 독성에 기인한 것으로 판단되었다.
실시예 2-3 : 농도별 세포 내 타우 응집 저해 효과 및 세포 생존 확인
레보시멘단(Levosimendan) 화합물과 리바스티크민(Rivastigmine, RV) 화합물의 타우 응집 억제 효과를 세포 내에서 농도별로 확인하였다. 타우 응집 모니터링 세포주인 Tau-BiFC cells에 타우 응집 유도체인 전이성 타우 단백체 TauK18P301L(처리농도 5 μg/ml)을 처리하였고, 레보시멘단(Levosimendan)(처리농도 1, 3, 10 μM)과 리바스티크민(Rivastigmine)(처리농도 1, 10, 100 μM)을 농도별로 병용 처리하였다. 약물 처리 후 46시간 뒤, 세포 내 타우 응집 정도를 Tau-BiFC intensity로 정량화 하고, Hoechst를 이용한 세포 핵 염색에 따른 세포 수 counting으로 cell viability를 정량화하였다.
도 14는 본 발명의 실시예에 따라, 레보시멘단 화합물 및 메틸렌 블루(Methylene blue) 각각의 농도에 대하여, 리바스티크민(Rivastigmine)을 농도별로 병용 처리한 후, 세포 내 타우 응집 저해와 세포 독성을 측정한 결과이다. 그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 레보시멘단과 리바스티그민 병용 처리시에는 상기 레보시멘단과 리바스티그민 각각의 농도에 따라 타우 응집 억제 효과가 농도 의존적으로 증가하는 것을 세포 이미지와 함께 Tau-BiFC intensity 감소로 확인하였다. 이에 따르면, 레보시멘단과 리바스티그민을 병용 처리하면, 타우 억제 효능이 시너지 효과를 가져서 단독 투여할때 보다 현저히 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
이와 비교하여, 메틸렌 블루(Methylene blue, MB) 의 경우, 메틸렌 블루(처리농도 1, 3, 10 μM) 화합물을 단독으로 처리하였을 때와 리바스티크민(Rivastigmine, RV)(처리농도 1, 10, 100 μM) 화합물과 병용 처리하였을 때 보여지는 세포 내 타우 응집 억제 정도는, 농도별 메틸렌 블루 화합물의 세포 독성에 따른 세포 수 감소에 기인한 것으로 보여진다.
상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims (8)

  1. 레보시멘단(Levosimendan) 및 리바스티크민(Rivastigmine)을 포함하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서,
    상기 타우(tau) 응집 관련 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 타우병증(tauopathy) 및 혈관성 치매로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 레보시멘단은 레보시멘단 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체 또는 용매화물인 것을 특징으로 하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 리바스티크민은 리바스티크민 화합물, 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 입체 이성질체 또는 용매화물인 것을 특징으로 하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    도네페질(donepezil), 갈란타민(galantamine), 메만틴(Memantine), 타크린(Tacrine), 커큐민(Curcumin), 도파민(Dopamine) 및 리튬클로라이드(LiCl)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1개 이상의 화합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    항산화제, 콜린에스테라제 저해제 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 타우병증은 알츠하이머병, 진행성 핵상 마비, 피질-기저핵 퇴행증, 아지오필릭 그레인질환(Argyrophilic Grain Disease), 피크 질환 및 유전성 전측두엽 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 레보시멘단(Levosimendan) 및 리바스티크민(Rivastigmine)을 포함하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서,
    상기 타우(tau) 응집 관련 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 타우병증(tauopathy) 및 혈관성 치매로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 타우(tau) 응집 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.

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