KR102250027B1

KR102250027B1 - 골아 세포 및 그 조제 방법

Info

Publication number: KR102250027B1
Application number: KR1020167004965A
Authority: KR
Inventors: 겐타 야마모토; 츠나오 기시다; 도시로 야마모토; 오삼 마즈다
Original assignee: 교토후고리츠다이가쿠호진
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2014-07-24
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2034-07-24
Also published as: US20160160180A1; US10557120B2; EP3026112A1; KR20160034416A; EP3026112B1; WO2015012377A1; BR112016001487A2; ES2929549T3; CA2919324A1; CN105555955B; EP3026112A4; JP6516672B2; JPWO2015012377A1; AU2014294010A1; CN105555955A

Abstract

본 발명은, 포유 동물의 체세포에 골관련 유전자 또는 그 발현 산물과 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물, 혹은 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물을 단독으로 도입함으로써, 상기 체세포로부터 골아 세포를 조제하는 방법으로서, 상기 골관련 유전자가 Runx2 (R), Osterix (O), Dlx5 (D) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종이고, 리프로그래밍 관련 유전자가 Oct 패밀리, c-Myc (M), L-Myc (L), Klf 패밀리, Lin-28, Sox2 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 골아 세포를 조제하는 방법 및 그 방법에 의해 조제된 골아 세포에 관한 것이다.

Description

골아 세포 및 그 조제 방법{OSTEOBLAST AND METHOD FOR PREPARING SAME}

본 발명은, 골아 세포 및 그 조제 방법에 관한 것으로, 상세하게는 다이렉트·리프로그래밍에 의한 골아 세포의 조제 방법에 관한 것이다.

골종양, 외상이나 골수염 등에 수반되는 골결손, 또 골종양 등의 소파 (搔爬) 후의 골결손의 수복 목적에서, 병변부에 골아 세포를 이식하면, 골형성을 촉진시켜, 기능적 형태적인 예후가 향상되는 것으로 기대할 수 있다. 실제로, 예를 들어 환자의 해면골로부터 채취한 골수 세포를 자가 이식하는 치료가 실시되고 있고, 그 유효성이 알려져 있다. 이 경우, 자가 골수 세포에 포함되는 간엽계 (間葉系) 간세포로부터 골아 세포가 분화 유도되어, 골형성과 리모델링에 기여하고 있는 것으로 생각된다. 한편, 고령화에 수반하여 골다공증의 이환률이 증가하고 있고, 고령자가 골절되면 장기 와상 (臥床) 으로 이어지는 경우도 있다. 골아 세포의 이식은, 골다공증이나 외상 등에 수반되는 골절, 난치성 골절이나 위골절 (僞骨折) 의 치유를 촉진시킬 수 있을 것으로 생각된다. 골아 세포의 이식은 또, 관절 류머티즘, 돌발성 대퇴골두 괴사, 변형성 관절증, 요추 변형성 척추증, 척주관 협착증, 추간판 헤르니아, 척추 분리증, 척추 분리 미끄럼증, 척추 측만증, 경추증성 척수증, 후종인대 골화증, 척수 손상, 변형성 고관절증, 변형성 슬관절증, 대퇴골두 미끄럼증, 골연화증, 수술 후의 골의 수복 (심장 수술 후의 흉골의 수복 등), 인공 족관절 수술에 수반되는 결손부의 수복, 골수염, 골괴사 등에도 유용할 가능성이 있다.

한편, 치주병은 제 4 의 생활 습관병이라고도 불리며, 이환률이 매우 높고, 또 다양한 전신 질환의 원인으로 되어 있다. 치주병의 진행에 수반하여, 치조골의 골흡수가 일어나므로, 골아 세포를 효율적으로 국소의 골흡수부에 공급할 수 있으면, 치조골의 재생 치료로 이어질 것으로 생각된다.

또, 골아 세포의 이식을, 골이식, 인공 골이식, 인공 관절이나 임플란트와 병용하면, 치료 효과를 높일 수 있을 가능성이 있다.

이와 같은 이식 목적의 골아 세포로서, 지금까지 골수 간엽계 간세포나 골수 간엽계 간세포를 포함하는 골수 세포 등이 사용되어 왔다. 그러나 골수의 채취는 환자에 대한 침습이 크고, 또 충분한 수의 골수 세포를 공급할 수 없는 경우가 있거나 한 문제점이 있다. 한편, 인간 배성 간세포 (ES 세포) 를 사용하면, 환자로부터 골수를 채취할 필요는 없고, 또 충분한 수의 골아 세포를 공급할 수 있을 가능성이 있지만, 윤리적 문제에 더하여 이식 후에 잔존 ES 세포가 종양화될 위험성이 있다. 또 iPS 세포를 사용해도, 환자로부터 골수를 채취할 필요는 없고, 또 충분한 수의 골아 세포를 공급할 수 있을 가능성이 있지만, 이식 후에 잔존 iPS 세포가 종양화될 위험성이 있다.

비특허문헌 1 은, 인간 ES 세포에 대한 Osterix 의 Lentivirus 벡터 도입 ＋ Osteogenic 배지에서의 골아 세포에 대한 분화 유도를 실시하고 있다.

비특허문헌 2, 3 은, 마우스 iPS 세포로부터 MSC 를 거쳐 Osteogenic 배지에서 분화 유도하여 골아 세포를 얻고 있다.

비특허문헌 4 는, 마우스 iPS 세포에 Runx2 의 Adenovirus 벡터를 도입하고, Osteogenic 배지에서 분화 유도하여 골아 세포를 얻고 있다.

비특허문헌 1 ∼ 4 에 나타내는 바와 같이, 골아 세포는 ES 세포나 iPS 세포등의 다능성 간세포로부터 분화 유도하여 제조되고 있기 때문에, 장기간의 배양을 필요로 하고, 또 암화 (癌化) 의 위험성이 있었다.

체세포에, 조직 특이적인 전사 인자의 유전자군을 도입하여, iPS 세포를 거치지 않고 직접 그 조직 세포로 분화 유도할 수 있는 것 (다이렉트·리프로그래밍 (다이렉트·컨버전)) 에 대하여, 예를 들어, 이하의 보고가 있다：

마우스 선유아 세포 → 연골 세포 (SOX9 ＋ Klf4 ＋ c-Myc 유전자를 도입)

마우스 선유아 세포 → 심근 세포 (GATA4 ＋ Mef2c ＋ Tbx5 유전자를 도입)

마우스 선유아 세포 → 간세포 (Hnf4α＋ (Foxa1 또는 Foxa2 또는 Foxa3) 유전자를 도입)

마우스 선유아 세포 → 신경 간세포 (Sox2 ＋ FoxG1 유전자를 도입 등),

마우스, 인간 세포 → 조혈 간세포 등

그러나, 체세포를 골아 세포에 다이렉트·컨버전하였다는 보고는 없다.

Karner E et al. J Cell Physiol. 2009. Li F et al. J Cell Biochem. 2010. Biloussova G et al. Stem cells. 2011. Tashiro K et al. Stem cells. 2009.

본 발명은, 다양한 종양이나 외상이나 수술 등에 수반되는 골결손의 수복이나, 치주병으로 대표되는 골흡수, 골절이나 골다공증 등에 대한 치료에 응용 가능하고, 암화의 위험성이 적은 골아 세포를 조제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 포유 동물의 체세포에 특정한 유전자를 조합하여 도입함으로써, ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 간세포를 경유하지 않고, 직접 (다이렉트·리프로그래밍) 골아 세포가 얻어지는 것을 알아내었다.

본 발명은, 이하의 골아 세포 및 그 조제 방법을 제공하는 것이다.

항 1. 포유 동물의 체세포에 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물을 도입함으로써, 상기 체세포로부터 골아 세포를 조제하는 방법으로서, 리프로그래밍 관련 유전자가 Oct 패밀리, c-Myc (M), L-Myc (L), GLIS 패밀리, Klf 패밀리, Lin-28, Sox2 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 골아 세포를 조제하는 방법.

항 2. 포유 동물의 체세포에 골관련 유전자 또는 그 발현 산물과 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물을 도입함으로써, 상기 체세포로부터 골아 세포를 조제하는 방법으로서, 상기 골관련 유전자가 Runx2 (R), Osterix (O), Dlx5 (D) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종이고, 리프로그래밍 관련 유전자가 Oct 패밀리, c-Myc (M), L-Myc (L), GLIS 패밀리, Klf 패밀리, Lin-28, Sox2 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 골아 세포를 조제하는 방법.

항 3. 상기 체세포가 선유아 세포 또는 치육 세포인, 항 1 또는 2 에 기재된 방법.

항 4. 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물이 Oct4 를 포함하는, 항 1 ∼ 3 중 어느 한 항에 기재된 방법.

항 5. 체세포에 도입되는 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물이 Oct4, Oct4L, Oct4M, Oct4LM, Oct4LGlis1, Oct4LMGlis1 (여기서, M 은「c-Myc」를 나타내고, L 은「L-Myc」를 나타낸다)

중 어느 것인, 항 4 에 기재된 골아 세포를 조제하는 방법.

항 6. 체세포에 도입되는 골관련 유전자 또는 그 발현 산물과 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물의 조합이,

Oct4, Oct4LMGlis1, ROD Oct4L, RD Oct4L, RO Oct4ML, D Oct4ML, ROD Oct4M, OD Oct4L, O Oct4ML, O Oct4L, O Oct4M, OD Oct4, D Oct4L, Oct4ML, ROD Oct4ML, RD Oct4ML, OD Oct4ML, O Oct4MLGlis1, RD Oct4M, R Oct4L Glis1, R Oct4ML, OD Oct4M, O Oct4L Glis1, ROD Oct4, RO Oct4M, RO Oct4L, RO Oct4, O Oct4 Glis1, RD Oct4, Oct4L Glis1, D Oct4M, D Oct4 Glis1, O Oct4, Oct4L, Oct4M, D Oct4, RO Oct4 K, RO Oct4Sox2 및 RO Oct4Lin28

(여기서, R 은「Runx2」를 나타내고, O 는「Osterix」를 나타내고, D 는「Dlx5」를 나타내고, M 은「c-Myc」를 나타내며, L 은「L-Myc」를 나타낸다)

로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 조합인, 항 1 ∼ 3 중 어느 하나에 기재된 방법.

항 7. 체세포에 도입되는 골관련 유전자 또는 그 발현 산물과 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물의 조합이, ROD Oct4L, RD Oct4L, RO Oct4ML, D Oct4ML, ROD Oct4M, OD Oct4L, O Oct4ML, O Oct4L, O Oct4M, OD Oct4, D Oct4L 및 Oct4ML

항 8. 체세포에 도입되는 골관련 유전자 또는 그 발현 산물과 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물의 조합이, ROD Oct4L, RD Oct4L, RO Oct4ML, D Oct4ML 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 조합인, 항 2 또는 3 에 기재된 방법.

항 9. 포유 동물의 체세포에서 유래하고, 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물을 갖는 골아 세포로서, 리프로그래밍 관련 유전자가 Oct4, c-Myc (M), L-Myc (L), GLIS 패밀리, Klf 패밀리, Lin-28, Sox2 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 골아 세포.

항 10. 포유 동물의 체세포에서 유래하고, 골관련 유전자 또는 그 발현 산물과 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물을 갖는 골아 세포로서, 상기 골관련 유전자가 Runx2 (R), Osterix (O), Dlx5 (D) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종이고, 리프로그래밍 관련 유전자가 Oct4, c-Myc (M), L-Myc (L), GLIS 패밀리, Klf 패밀리, Lin-28, Sox2 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 골아 세포.

본 발명은, 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물, 혹은 골관련 유전자 또는 그 발현 산물과 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물을 도입함으로써, 체세포로부터 골아 세포를 조제하는 기술이다. 이 중 골관련 유전자로는, Runx2 (R), Osterix (O), Dlx5 (D) 로 이루어지는 군에서 적어도 1 종을 선택할 수 있다. 바람직하게는 Oxterix 와 Dlx5 중 어느 것이 적어도 1 종류 포함되어 있는 것이 좋다. 또, 리프로그래밍 관련 유전자로는, Oct4 패밀리, c-Myc (M), L-Myc (L), Glis 패밀리, Klf 패밀리 (KLF1, KLF2, KLF3, KLF4, KLF5, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KLF10, KLF11, KLF12, KLF13, KLF14, KLF15, KLF16, KLF17), Lin-28, Sox2 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 선택할 수 있다. 바람직하게는 Oct4 패밀리 중 어느 것이 적어도 1 종류 포함되어 있는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는, Oct4 패밀리 중 어느 것이 적어도 1 종류와 L-Myc 및/또는 c-Myc 가 포함되어 있는 것이 좋다. 이 Oct4 패밀리로는 바람직하게는 Oct4 이다. 따라서, Oct4 와 L-Myc 및/또는 c-Myc 의 양방을 포함하는 것이 가장 바람직하다.

Oct4 대신에 그 밖의 Oct 패밀리의 유전자를 동일하게 사용할 수도 있다. 일반적으로 Oct4 는 Oct3/4 로서 표기되는 경우도 있지만, 본 명세서에서는,「Oct4」로 표기한다. 본 명세서에서는 Oct 패밀리의 대표로서「Oct4」를 사용하여 설명하고 있지만, Oct 패밀리의 그 밖의 유전자 (Oct1A, Oct6) 등도 Oct4 와 동일하게 사용할 수 있다.

Oct4 는, Sox2, Klf4, 및 c-Myc 와 함께 체세포에 유전자 도입함으로써, 체세포를 리프로그래밍하여 다능성을 유도할 수 있는 인자이다 (Takahashi K, Yamanaka S. Cell, 126 (4)：663-76, 2006；Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Cell. 131 (5)：861-72, 2007). Oct4 대신, GATA3, GATA6, SOX7, PAX1, GATA4, CEBPa, HNF4a, GRB2 등의 어느 것을 Sox2, Klf4, 및 c-Myc 와 함께 체세포에 유전자 도입함으로써, 체세포를 리프로그래밍하여 다능성을 유도할 수 있는 것이 알려져 있다 (Shu et al. Cell 153：963, 2013). GATA3, GATA6, SOX7, PAX1, GATA4, CEBPa, HNF4a, GRB2 와 같이, 리프로그래밍 인자가 아니고, Oct 패밀리도 아니지만, 리프로그래밍에 있어서의 Oct 의 기능을 대체할 수 있는 인자에 대해서도, 본 발명에 있어서는 Oct4 대신 사용할 수 있다. 즉 본 명세서 중에서는, 리프로그래밍에 있어서의 Oct4 의 기능을 할 수 있는 인자의 대표로서「Oct4」를 사용하여 설명하고 있지만, GATA3, GATA6, SOX7, PAX1, GATA4, CEBPa, HNF4a, GRB2 등의, 리프로그래밍에 있어서의 Oct 의 기능을 대체할 수 있는 인자도, Oct4 와 동일하게 사용할 수 있다.

KLF-4 는 그 밖의 Klf 패밀리 (KLF1, KLF2, KLF3, KLF5, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KLF10, KLF11, KLF12, KLF13, KLF14, KLF15, KLF16, KLF17) 의 유전자로 치환하는 것도 가능하다. 본 명세서에서는 Klf 패밀리의 대표로서「KLF-4」를 사용하여 설명하고 있지만, Klf 패밀리의 그 밖의 유전자도 KLF-4 와 동일하게 사용할 수 있다.

GLIS 패밀리로는, GLIS1 (GLIS family zinc finger 1) 등을 들 수 있다.

체세포 리프로그래밍 (iPS 세포 유도) 에 있어서의 KLF-4 의 기능을 대체할 수 있는 유전자로서, KLF 패밀리의 유전자 이외에도, IRX 패밀리의 멤버 (IRX6 (iroquois homeobox protein 6) 등), PTX 패밀리의 멤버 (PITX2 (paired-like homeodomain transcription factor 2) 등), DMRTB1 (DMRT-like family B with proline-rich C-terminal 1) 등이 알려져 있다 (WO2010/098419 (2010/9/2)). 본 명세서에서는「KLF-4」를 사용하여 설명하고 있지만, 체세포 리프로그래밍 (iPS 세포 유도) 에 있어서의 KLF-4 의 기능을 대체할 수 있는 유전자를 KLF-4 와 동일하게 사용할 수 있다. 이들 유전자의 산물, mRNA 도 사용할 수 있다.

SOX2 대신에 그 밖의 SOX 패밀리의 유전자를 동일하게 사용할 수도 있다. 본 명세서에서는 SOX 패밀리의 대표로서「SOX2」를 사용하여 설명하고 있지만, SOX 패밀리의 그 밖의 유전자도 SOX2 와 동일하게 사용할 수 있다.

본 발명에서는 간단히 하기 위해, 모두 SOX2 라고 부른다.

골관련 유전자와 리프로그래밍 관련 유전자는, 그것들의 하나 이상을 유전자를 대신하여 그 발현 산물로 대용할 수 있다. 또 하나 이상을 유전자를 대신하여 유전자를 유도 또는 미믹하는 약제 등의 분자로 대용할 수 있다. 예를 들어, iPS 세포 유도에 있어서의 Oct4 의 기능을 대체할 수 있는 유전자로서, GATA3, GATA6, SOX7, PAX1, GATA4, CEBPa, HNF4a, GRB2 가 알려져 있으므로 (Jian Shu et al., Cell 153, 963-975, 2013), Oct4 유전자의 도입을 대신하여 이와 같은 화합물을 사용할 수 있다. 또 신경 전구 세포의 리프로그래밍에 있어서의 Oct4 의 기능을 대체할 수 있는 소분자 화합물로서, BIX-01294 가 알려져 있으므로 (Bo Feng et al., Cell Stem Cell 4：301, 2009), Oct4 유전자의 도입을 대신하여 이와 같은 화합물을 사용할 수 있다. 또, iPS 세포 유도에 있어서의 Klf-4 의 기능을 대체할 수 있는 화합물로서, kenpaullone (Lyssiotis, CA, 외에, Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 June 2；106 (22)：8912-8917) 이 알려져 있으므로, Klf-4 유전자의 도입을 대신하여 이와 같은 화합물을 사용할 수 있다. 본 명세서에서는 간단히 하기 위해, 유전자와 그 발현 산물을 종합하여「유전자」라고 부르는 경우가 있다. 그 때에는「유전자 도입」은「분자의 첨가」「약제의 첨가」「화합물의 첨가」「분자의 투여」「약제의 투여」「화합물의 투여」 등으로 바꾸어 읽는 것으로 한다.

본 발명의 유전자의 조합에, 추가로 그 밖의 유전자를 더하는 것도 가능하다.

본 발명은, 체세포로부터 골아 세포를 유도하는 방법을 포함한다. 또 이 방법에 의해 제조한 골아 세포를 포함한다. 또 이 골아 세포를 포함하는 치료용의 세포 제제나 이식용 재료를 포함한다.

본 기술을, 체내의 체세포에 응용하면, 체내에서 직접 골아 세포를 만드는 것이 가능하다. 이 방법, 직접 유도를 위한 제제도 본 발명에 포함된다.

본 발명에서는, 다이렉트·리프로그래밍에 의해 체세포로부터 단기간에 골아 세포를 제공할 수 있다. 이 골아 세포는, 이식하는 본인의 체세포로부터 용이하게 유도할 수 있으므로, 골아 세포 자체 또는 그것으로부터 제조한 골조직을 이식한 경우에도 면역학적 거절 응답 등의 문제는 발생하지 않는다. 또, iPS 세포나 ES 세포를 경유하지 않고 직접 체세포로부터 골아 세포를 유도할 수 있기 때문에, 암화 등의 다능성 간세포에서 기인되는 문제를 회피할 수 있다.

도 1 은, 목적 유전자를 코드한 pMXs 벡터의 제조.
도 2 는, 실험의 개략.
도 3A 는, Alizarin Red S 염색. 도 3A 는 디쉬의 육안 이미지 사진. 붉게 물들어 있는 것은 석회화 골기질이며, 기능성 골아 세포가 유도된 것을 나타낸다. 웰의 숫자는 도 3H 를 참조 (도 3H 표 중의「1」은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 것을, 공란은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 것을 나타낸다).
도 3B 는, Alizarin Red S 염색. 도 3B 는 디쉬의 육안 이미지 사진. 붉게 물들어 있는 것은 석회화 골기질이며, 기능성 골아 세포가 유도된 것을 나타낸다. 웰의 숫자는 도 3H 를 참조 (도 3H 표 중의「1」은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 것을, 공란은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 것을 나타낸다).
도 3C 는, Alizarin Red S 염색. 도 3C 는 디쉬의 육안 이미지 사진. 붉게 물들어 있는 것은 석회화 골기질이며, 기능성 골아 세포가 유도된 것을 나타낸다. 웰의 숫자는 도 3H 를 참조 (도 3H 표 중의「1」은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 것을, 공란은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 것을 나타낸다).
도 3D 는, Alizarin Red S 염색. 도 3D 는 디쉬의 육안 이미지 사진. 붉게 물들어 있는 것은 석회화 골기질이며, 기능성 골아 세포가 유도된 것을 나타낸다. 웰의 숫자는 도 3H 를 참조 (도 3H 표 중의「1」은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 것을, 공란은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 것을 나타낸다).
도 3E 는, Alizarin Red S 염색. 도 3E 는 디쉬의 육안 이미지 사진. 붉게 물들어 있는 것은 석회화 골기질이며, 기능성 골아 세포가 유도된 것을 나타낸다. 웰의 숫자는 도 3H 를 참조 (도 3H 표 중의「1」은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 것을, 공란은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 것을 나타낸다).
도 3F 는, Alizarin Red S 염색. 도 3F 는 디쉬의 육안 이미지 사진. 붉게 물들어 있는 것은 석회화 골기질이며, 기능성 골아 세포가 유도된 것을 나타낸다. 웰의 숫자는 도 3H 를 참조 (도 3H 표 중의「1」은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 것을, 공란은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 것을 나타낸다).
도 3G 는, 96 well plate 의 육안 사진 (웰의 숫자는 도 3H 를 참조).
도 3H 는, 반응액의 흡광도 (550 ㎚ ∼ 650 ㎚) 를 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 측정한 결과를 도 3H 의 그래프에 나타낸다. 그래프의 세로축은 흡광도이고, 흡광도가 높을수록 석회화 골기질이 다량으로 산생된 것을 나타내고, 많은 선유아 세포가 기능성 골아 세포에 컨버트된 것을 나타낸다.
도 3I 는, 도 3H 에 나타낸 것과 동일한 실험으로, 반응액의 흡광도 (490 ㎚ ∼ 650 ㎚) 를 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 측정한 결과이다. 표 중의「1」은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 것을 나타내고, 공란은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 것을 나타낸다. 예를 들어, 27 번의 웰은, Osterix, Runx2, Oct4, L-Myc 와 Dlx5 의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시켰지만, c-Myc, Glis1 과 EGFP 의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터는 감염시키지 않은 세포이며, 많은 석회화 골기질을 산생하고 있는 것을 알 수 있다.
도 4 는, ALP 활성 시험.
도 5 는, ALP 염색 이미지.
도 6 은, 면역 염색, (a) control, (b) RO Oct4M, (c) RO Oct4L：× 100.
도 7 은, Alizarin Red S 염색, (a) Control, (b) RO Oct4M, (c) RO Oct4L：× 1, (d) Control, (e) RO Oct4M, (f) RO Oct4L：× 40.
도 8 은, von Kossa 염색.
도 9 는, 3 차원 배양 실험의 개략.
도 10 은, 3 차원 배양의 김자 염색, (a) background, (b) RO Oct4L：× 1
도 11 은, 3 차원 배양의 Alizarin Red S 염색, (a) background, (b) control, (c) RO Oct4M, (d) RO Oct4L：× 1.
도 12 는, ALP 염색 이미지 (aHDF), (a) control, (b) RO Oct4G, (c) RO Oct4L：× 1, (d) control, (e) RO Oct4G, (f) RO Oct4L：× 40.
도 13a 는, Alizarin Red S 염색 (aHDF).
도 13b 는, ALP 염색 이미지, 및 von Kossa 염색 이미지.
도 14 는, Alizarin Red S 염색.
도 15 는, 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 인간 골아 세포의 성상.
도 16 은, 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 인간 골아 세포의 해석.
도 17 은, 각 유전자의 발현량을 Real-time RT-PCR 해석에 의해 정량한 결과.
도 18 은, in vivo 에서의 골결손부에 있어서의 골재생. a：마이크로 CT (연속 단층 이미지), b：조직 이미지 (연속 절편), c：형광 면역 조직 화학 (항인간 항체).
도 19 는, in vivo 에서의 골결손부에 있어서의 골재생 (역학적 강도).
도 20 은, in vivo 에서의 골결손부에 있어서의 골재생.
도 21 은, 도 18a 의 마이크로·컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 의 데이터를 3 차원으로 재구축한 이미지.
도 22 는, 도 18 과 동일한 실험으로, μCT 투과 이미지를 나타낸다. 화살표는 골결손부. 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 골아 세포 (dOB) 를 이식한 골에서는, 인간 치육 선유아 세포를 이식한 골에 비해, 골결손부의 방사선 불투과성 (radiopacity) 이 높다.
도 23 은, RT-PCR 에 사용한 프라이머의 리스트.
도 24 는, 시퀀싱에 사용한 프라이머의 리스트.
도 25 는, Real-time RT-PCR 에 사용한 프라이머의 리스트.
도 26 은, 에피소말·벡터에 의한 골아 세포의 다이렉트·리프로그래밍.
도 27 은, 마우스의 골아 세포의 다이렉트·리프로그래밍.
도 28a 는, Real-time RT-PCR 에 의한 hOsteopontin (□) 및 hOsteocalcin (■) 의 mRNA 발현량의 측정, 도입된 유전자는,「＋」로 나타낸다.
도 28b 는, Real-time RT-PCR 에 의한 hOsteocalcin (■) 및 APL (□) 의 mRNA 발현량의 측정, 도입된 유전자는,「＋」로 나타낸다.
도 28c 는, von Kossa 염색. 도입된 유전자는,「＋」로 나타낸다.
도 29a 는, Real-time RT-PCR 에 의한 각 유전자의 mRNA 발현량의 측정.
도 29b 는, 시퀀싱에 사용한 프라이머의 리스트.
도 30 은, 인간 선유아 세포로부터 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 골아 세포의 망라적 유전자 발현 프로파일.
도 31 은, 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 인간 골아 세포의 해석. (a) 면역 염색, (b) 다이렉트·리프로그래밍의 효율.
도 32 는, 인간 선유아 세포로부터 골아 세포에 대한 리프로그래밍은, 다능성 간세포 유사의 단계를 거치지 않고 직접적인 conversion 인 것을 나타낸다. (a) 면역 염색, (b) Real-time RT-PCR.
도 33 은, Karyotype 해석.
도 34 는, 인간 선유아 세포에, 간엽계 간세포 (MSCs) 의 혼입은 없는 것을 나타낸다.
도 35 는, 인간 선유아 세포로부터 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 인간 골아 세포의 염색.
도 36 은, Real-time RT-PCR 에 의한 각 유전자의 mRNA 발현량의 측정.
도 37 은, in vivo 에서의 골결손부에 있어서의 골재생.
도 38 은, in vivo 에서의 골결손부에 있어서의 골재생.
도 39a 는, 플라스미드 벡터를 사용한 유전자 도입에 의한 인간 선유아 세포의 골아 세포에 대한 리프로그래밍.
도 39b 는, 플라스미드 벡터를 사용한 유전자 도입에 의한 인간 선유아 세포의 골아 세포에 대한 리프로그래밍.
도 40a 는, 플라스미드 벡터를 사용한 유전자 도입에 의한 인간 선유아 세포의 골아 세포에 대한 리프로그래밍.
도 40b 는, 플라스미드 벡터를 사용한 유전자 도입에 의한 인간 선유아 세포의 골아 세포에 대한 리프로그래밍.
도 41 은, 이종 단백을 첨가하지 않은 배지에서의, 인간 선유아 세포의 골아 세포에 대한 리프로그래밍.
도 42 는, 이종 단백을 첨가하지 않은 배지에서, 인간 선유아 세포로부터 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 인간 골아 세포의 동결 융해 후의 viability.

본 발명에 의해, 전골아 세포, 미숙 골아 세포, 성숙 골아 세포, 골세포 등도 조제할 수 있다. 본 명세서에서는 간단히 하기 위해 이것들을 모두 골아 세포라고 부른다.

본 발명에 의해 얻어지는 골아 세포 (이식 재료) 를 사용하여 치료하는 대상이 되는 질환으로는, 골종양, 외상이나 골수염 등에 수반되는 골결손, 또 골종양 등의 소파 후의 골결손, 골절, 골다공증, 치주병, 치조골 흡수, 관절 류머티즘, 돌발성 대퇴골두 괴사, 변형성 관절증, 요추 변형성 척추증, 척주관 협착증, 추간판 헤르니아, 척추 분리증, 척추 분리 미끄럼증, 척추 측만증, 경추증성 척수증, 후종 인대 골화증, 척수 손상, 변형성 고관절증, 변형성 슬관절증, 대퇴골두 미끄럼증, 골연화증, 하악 재건술 등의 복잡 골절에 의해 파괴된 골절 부위의 재건술, 수술 후의 골의 수복 (심장 수술 후의 흉골의 수복 등), 인공 족관절 수술에 수반되는 결손부의 수복, 골수염, 골괴사 등을 들 수 있다. 또, 골아 세포를 이식하면, 골이식, 인공 골이식, 인공 관절이나 임플란트와 병용하여 치료 효과를 높일 수 있을 가능성이 있다. 또 골아 세포를 3 차원적인 스캐폴드 등을 사용하여 배양하여 다양한 형태의 골조직을 체외에서 제조하고, 그 골조직을 이식하는 것에 의해, 상기 질환의 치료를 실시할 수도 있다. 그 이외에도 골아 세포의 결손, 부족 혹은 기능 저하에 관련된 다양한 질환이 대상이 된다.

본 명세서에 있어서, 특별히 명시가 없는 한,「치료」라는 용어는, 환자가 특정한 질환 또는 장해를 앓고 있는 동안에 실시하는 처치를 의도하고, 이로 인해 질환 혹은 장해의 중증도, 또는 하나 혹은 복수의 그 증상이 경감되는지, 또는 질환 혹은 장해의 진행이 지연 또는 감속되는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서,「치료」에는「예방」을 포함하는 것으로 한다.

본 발명에서 얻어지는 골아 세포는 또한, 질환의 치료에 한정되지 않고, 미용 목적으로 사용할 수도 있다. 예를 들어 사고나 수술 등에 의해 결손된 부위에 골아 세포 혹은 그것에 의해 제조된 골조직을 이식함으로써, 골기질을 산생시켜 결손 부위를 수복하고, 부풀게 하여 눈에 띄지 않게 할 수 있다. 그 때, 인간에 대한 처치도, 본 명세서에서는 편의상 치료라고 부르고,「환자」는「건강한 사람」혹은「인간」,「질환」은「미용」으로 바꾸어 읽을 수 있다.

본 발명은 또, 인간뿐만 아니라, 개, 고양이 등의 애완 동물이나 소, 말, 돼지, 양, 닭 등의 가축을 포함하는 포유 동물의 질환의 치료에도 사용하는 것이 가능하다. 그 경우,「환자」를「환축」혹은「포유 동물」로 바꾸어 읽기로 한다.

이식 재료란, 골조직의 수복, 재건을 위해서 생체 내에 도입하는, 골아 세포를 함유하는 재료를 말한다. 이식 재료는, 인비트로로 부분적 혹은 완전하게 골조직을 재생시키고, 동일 또는 다른 개체에 이식하는 재료를 포함한다. 본 발명에서 얻어진 골아 세포는, 이식 재료의 제조에 사용할 수 있다. 골아 세포 자체도 이식 재료가 된다. 따라서, 골아 세포를 세포 제제로서 환자에게 이식할 수도 있고, 하이드록시어퍼타이트나 생체 흡수성 세라믹 등의 인공 재료로 이루어지는 기재 (스캐폴드 (scaffold)) 와 함께 이식하거나, 스캐폴드와 함께 배양하고 나서 이식할 수 있다. 이것들의 경우, 스캐폴드는 이식 목적에 따라 여러 가지 3 차원적인 형상을 만들게 할 수 있다.

체세포는, 포유 동물 유래이면 된다. 골아 세포를 생체에 이식하는 경우에는, 이식되는 피험체 유래의 체세포 (자가 세포) 를 사용하는 것이, 감염이나 거절 응답 등의 위험을 저감시키기 위해서 바람직하다. 그러나, 갑작스런 골절 등에 대해 이식하거나 할 목적인 경우, 자가 세포가 아니고, 타인이나 그 밖의 동물의 체세포로부터 미리 준비해 둔 골아 세포를 이식에 사용할 수 있다. 또는 미리 준비해 둔 타인이나 그 밖의 동물의 체세포로부터 골아 세포를 만들어, 이식에 사용할 수 있다. 즉, 골아 세포 뱅크, 또는 골아 세포 전구 세포의 뱅크를 만들어 두어 이식 목적으로 제공할 수 있다. 이와 같은 경우, 거절 응답 등의 위험을 저감시키기 위해서, 미리 MHC 를 타이핑해 둘 수 있다. 또, 미리 골아 세포의 캐릭터나 조 (造) 종양성 등을 확인해 둘 수 있다.

본 명세서에 있어서, 포유 동물로는, 마우스, 래트, 햄스터, 인간, 개, 고양이, 원숭이, 토끼, 소, 말, 돼지 등을 들 수 있고, 특히 인간을 들 수 있다.

본 발명은 또, 골아 세포를 사용한 다양한 연구나 기술 개발 등에 사용할 수 있다. 예를 들어 골의 발생과 노화, 형태 형성, 리모델링의 기구, 이들에 대한 역학적 스트레스, 영양, 면역, 신경, 호르몬의 영향의 해석 등의 기초 연구에 유용하다. 또 스트론튬 90 등의 방사성 물질의 내부 피폭에 있어서의 골에 대한 영향의 해석과 골로부터의 스트론튬 90 의 제거 기술의 개발 등에도 유용하다.

본 발명을 사용하면, 다양한 질환이나 유전적 배경을 갖는 인간이나 동물로부터 간편, 신속, 저비용으로 골아 세포를 수립할 수 있으므로, 질환이나 유전적 배경에 관련된 골아 세포의 이상을 생화학적, 분자 생물학적, 면역학적 등 수법에 의해 해석하는 것이 가능하고, 이로써 질환의 발증 기전의 해명 등의 연구나 진단법의 개발에 도움을 줄 수 있다. 또 이와 같은 골아 세포를 사용하여, 약제의 개발, 약제의 독성 시험 등을 실시하면, 다양한 질환에 대한 신규 치료법의 개발에 도움을 줄 수 있다.

본 발명 방법 (다이렉트·리프로그래밍) 의 대상이 되는 체세포로는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 선유아 세포, 케라티노사이트, 구강 점막 상피 세포, 기도 점막 상피 세포, 위 점막 상피 세포, 장관 점막 상피 세포, 혈관 내피 세포, 평활근 세포, 지방 세포, 치육 세포 (치육 선유아 세포, 치육 상피 세포), 치수 세포, 치근막 세포, 백혈구, 임파구, 줄기 세포, 결막 상피 세포, 파골 세포 등을 들 수 있고, 바람직하게는 선유아 세포, 케라티노사이트, 구강 점막 상피 세포, 치육 세포, 백혈구, 임파구, 파골 세포 등을 들 수 있다.

본 발명 방법에서는, 체세포에, 적어도 1 종의 리프로그래밍 관련 유전자, 혹은, 적어도 1 종의 골관련 유전자 또는 그 발현 산물과, 적어도 1 종의 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물을 도입한다. 여기서,「발현 산물」로는, 골관련 유전자, 리프로그래밍 관련 유전자 등의 유전자의 mRNA 또는 단백질을 들 수 있다.

골관련 유전자는, 리프로그래밍된 골아 세포가 골아 세포로서 기능하기 위해서 도입되는 유전자이며, 구체적으로는, Runx2 (이하「R」로 약칭하는 경우가 있다), Osterix (이하「O」로 약칭하는 경우가 있다), Dlx5 (이하「D」로 약칭하는 경우가 있다) 로 이루어지는 군에서 적어도 1 종을 선택할 수 있다. 바람직하게는 Oxterix 와 Dlx5 중 어느 것이 적어도 1 종류 포함되어 있는 것이 좋다. 이들 유전자 혹은 그 발현 산물의 1 종 또는 2 종 이상을 필요에 따라 그 밖의 골관련 유전자 혹은 그 발현 산물과 조합하여 체세포에 도입하는 것이 바람직하다.

리프로그래밍 관련 유전자는, 체세포를 골아 세포로 변환하기 위해서 체세포에 도입되는 유전자이며, Oct4, Oct1A, Oct6, c-Myc (이하「M」으로 약칭하는 경우가 있다), L-myc (이하「L」로 약칭하는 경우가 있다), N-myc, Klf 패밀리 (KLF1, KLF2, KLF3, KLF4 (이하「K」로 약칭하는 경우가 있다), KLF5, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KLF10, KLF11, KLF12, KLF13, KLF14, KLF15, KLF16, KLF17), Lin-28, Sox1, Sox2, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17, Sox18 을 들 수 있고, 이들 유전자의 1 종 또는 2 종 이상을 체세포에 도입한다. 리프로그래밍 관련 유전자를 도입하는 것만으로 체세포는 골아 세포로 유도할 수 있다. 이론에 구속되기를 바라는 것은 아니지만, 이것은, 리프로그래밍 관련 유전자의 도입에 의해 내인성의 골관련 유전자의 발현이 촉진되기 때문인 것으로 본 발명자는 생각하고 있다.

Runx2, Osterix, Dlx5 등의 골관련 유전자는, 지금까지 골세포의 분화, 발생, 증식, 생존 등에 관여하는 것이 알려져 있었지만, 이들을 사용하여 선유아 세포 등의 체세포로부터 골아 세포를 직접 (다능성 간세포를 통하지 않고) 유도하는 기술은 알려져 있지 않다. 또, 리프로그래밍 관련 유전자의 조합으로, 체세포로부터 iPS 세포를 유도하는 것은 알려져 있지만, 골아 세포를 유도하는 것은 알려려 있지 않다. 본 발명자들에서는, 1 개 이상의 골관련 유전자와 1 개 이상의 리프로그래밍 관련 유전자의 조합, 혹은 1 개 이상의 리프로그래밍 관련 유전자를 사용함으로써, 선유아 세포 등의 체세포로부터 골아 세포를 직접 유도하는 기술을 확립하였다. 이 기술은 지금까지 알려져 있지 않다. 또한, 이 리프로그래밍 관련 유전자로서 Oct4 가 포함되어 있는 것이 매우 중요하지만, Oct4 를 사용하여 골아 세포를 직접 유도하는 기술도 지금까지 알려져 있지 않다. 또 Oct4 와 L-Myc 를 사용하여 골아 세포를 직접 유도하는 기술도 지금까지 알려져 있지 않다.

체세포에 도입되는 골관련 유전자와 리프로그래밍 관련 유전자의 바람직한 조합을 이하에 나타낸다：

체세포에 도입되는 골관련 유전자와 리프로그래밍 관련 유전자의 바람직한 조합을 이하에 나타낸다：R Oct4ML, O Oct4ML, D Oct4ML, RO Oct4ML, RD Oct4ML, OD Oct4ML, ROD Oct4ML, R Oct4L, O Oct4L, D Oct4L, RO Oct4L, RD Oct4L, OD Oct4L, ROD Oct4L, R Oct4M, O Oct4M, D Oct4M, RO Oct4M, RD Oct4M, OD Oct4M, ROD Oct4M, R Oct4, O Oct4, D Oct4, RO Oct4, RD Oct4, OD Oct4, ROD Oct4, R Oct4ML K, O Oct4ML K, D Oct4ML K, RO Oct4ML K, RD Oct4ML K, OD Oct4ML K, ROD Oct4ML K, R Oct4L K, O Oct4L K, D Oct4L K, RO Oct4L K, RD Oct4L K, OD Oct4L K, ROD Oct4L K, R Oct4M K, O Oct4M K, D Oct4M K, RO Oct4M K, RD Oct4M K, OD Oct4M K, ROD Oct4M K, R Oct4 K, O Oct4 K, D Oct4 K, RO Oct4 K, RD Oct4 K, OD Oct4 K, ROD Oct4 K, R Oct4ML Sox2, O Oct4ML Sox2, D Oct4ML Sox2, RO Oct4ML Sox2, RD Oct4ML Sox2, OD Oct4ML Sox2, ROD Oct4ML Sox2, R Oct4L Sox2, O Oct4L Sox2, D Oct4L Sox2, RO Oct4L Sox2, RD Oct4L Sox2, OD Oct4L Sox2, ROD Oct4L Sox2, R Oct4M Sox2, O Oct4M Sox2, D Oct4M Sox2, RO Oct4M Sox2, RD Oct4M Sox2, OD Oct4M Sox2, ROD Oct4M Sox2, R Oct4 Sox2, O Oct4 Sox2, D Oct4 Sox2, RO Oct4 Sox2, RD Oct4 Sox2, OD Oct4 Sox2, ROD Oct4 Sox2, R Oct4ML Lin28, O Oct4ML Lin28, D Oct4ML Lin28, RO Oct4ML Lin28, RD Oct4ML Lin28, OD Oct4ML Lin28, ROD Oct4ML Lin28, R Oct4L Lin28, O Oct4L Lin28, D Oct4L Lin28, RO Oct4L Lin28, RD Oct4L Lin28, OD Oct4L Lin28, ROD Oct4L Lin28, R Oct4M Lin28, O Oct4M Lin28, D Oct4M Lin28, RO Oct4M Lin28, RD Oct4M Lin28, OD Oct4M Lin28, ROD Oct4M Lin28, R Oct4 Lin28, O Oct4 Lin28, D Oct4 Lin28, RO Oct4 Lin28, RD Oct4 Lin28, OD Oct4 Lin28, ROD Oct4 Lin28, R Oct4ML KSox2, O Oct4ML KSox2, D Oct4ML KSox2, RO Oct4ML KSox2, RD Oct4ML KSox2, OD Oct4ML KSox2, ROD Oct4ML KSox2, R Oct4L KSox2, O Oct4L KSox2, D Oct4L KSox2, RO Oct4L KSox2, RD Oct4L KSox2, OD Oct4L KSox2, ROD Oct4L KSox2, R Oct4M KSox2, O Oct4M KSox2, D Oct4M KSox2, RO Oct4M KSox2, RD Oct4M KSox2, OD Oct4M KSox2, ROD Oct4M KSox2, R Oct4 KSox2, O Oct4 KSox2, D Oct4 KSox2, RO Oct4 KSox2, RD Oct4 KSox2, OD Oct4 KSox2, ROD Oct4 KSox2, R Oct4ML KLin28, O Oct4ML KLin28, D Oct4ML KLin28, RO Oct4ML KLin28, RD Oct4ML KLin28, OD Oct4ML KLin28, ROD Oct4ML KLin28, R Oct4L KLin28, O Oct4L KLin28, D Oct4L KLin28, RO Oct4L KLin28, RD Oct4L KLin28, OD Oct4L KLin28, ROD Oct4L KLin28, R Oct4M KLin28, O Oct4M KLin28, D Oct4M KLin28, RO Oct4M KLin28, RD Oct4M KLin28, OD Oct4M KLin28, ROD Oct4M KLin28,

R Oct4 KLin28, O Oct4 KLin28, D Oct4 KLin28, RO Oct4 KLin28, RD Oct4 KLin28, OD Oct4 KLin28, ROD Oct4 KSox2, R Oct4ML Sox2Lin28, O Oct4ML Sox2Lin28, D Oct4ML Sox2Lin28, RO Oct4ML Sox2Lin28, RD Oct4ML Sox2Lin28, OD Oct4ML Sox2Lin28, ROD Oct4ML Sox2Lin28, R Oct4L Sox2Lin28, O Oct4L Sox2Lin28, D Oct4L Sox2Lin28, RO Oct4L Sox2Lin28, RD Oct4L Sox2Lin28, OD Oct4L Sox2Lin28, ROD Oct4L Sox2Lin28, R Oct4M Sox2Lin28, O Oct4M Sox2Lin28, D Oct4M Sox2Lin28, RO Oct4M Sox2Lin28, RD Oct4M Sox2Lin28, OD Oct4M Sox2Lin28, ROD Oct4M Sox2Lin28, R Oct4 Sox2Lin28, O Oct4 Sox2Lin28, D Oct4 Sox2Lin28, RO Oct4 Sox2Lin28, RD Oct4 Sox2Lin28, OD Oct4 Sox2Lin28, ROD Oct4 Sox2Sox2, R Oct4ML KSox2Lin28, O Oct4ML KSox2Lin28, D Oct4ML KSox2Lin28, RO Oct4ML KSox2Lin28, RD Oct4ML KSox2Lin28, OD Oct4ML KSox2Lin28, ROD Oct4ML KSox2Lin28, R Oct4L KSox2Lin28, O Oct4L KSox2Lin28, D Oct4L KSox2Lin28, RO Oct4L KSox2Lin28, RD Oct4L KSox2Lin28, OD Oct4L KSox2Lin28, ROD Oct4L KSox2Lin28, R Oct4M KSox2Lin28, O Oct4M KSox2Lin28, D Oct4M KSox2Lin28, RO Oct4M KSox2Lin28, RD Oct4M KSox2Lin28, OD Oct4M KSox2Lin28, ROD Oct4M KSox2Lin28, R Oct4 KSox2Lin28, O Oct4 KSox2Lin28, D Oct4 KSox2Lin28, RO Oct4 KSox2Lin28, RD Oct4 KSox2Lin28, OD Oct4 KSox2Lin28, ROD Oct4 KSox2Lin28

R ML, O ML, D ML, RO ML, RD ML, OD ML, ROD ML, R L, O L, D L, RO L, RD L, OD L, ROD L, R M, O M, D M, RO M, RD M, OD M, ROD M, R ML K, O ML K, D ML K, RO ML K, RD ML K, OD ML K, ROD ML K, R L K, O L K, D L K, RO L K, RD L K, OD L K, ROD L K, R M K, O M K, D M K, RO M K, RD M K, OD M K, ROD M K, R K, O K, D K, RO K, RD K, OD K, ROD K, R ML Sox2, O ML Sox2, D ML Sox2, RO ML Sox2, RD ML Sox2, OD ML Sox2, ROD ML Sox2, R L Sox2, O L Sox2, D L Sox2, RO L Sox2, RD L Sox2, OD L Sox2, ROD L Sox2, R M Sox2, O M Sox2, D M Sox2, RO M Sox2, RD M Sox2, OD M Sox2, ROD M Sox2, R Sox2, O Sox2, D Sox2, RO Sox2, RD Sox2, OD Sox2, ROD Sox2, R ML Lin28, O ML Lin28, D ML Lin28, RO ML Lin28, RD ML Lin28, OD ML Lin28, ROD ML Lin28, R L Lin28, O L Lin28, D L Lin28, RO L Lin28, RD L Lin28, OD L Lin28, ROD L Lin28, R M Lin28, O M Lin28, D M Lin28, RO M Lin28, RD M Lin28, OD M Lin28, ROD M Lin28, R Lin28, O Lin28, D Lin28, RO Lin28, RD Lin28, OD Lin28, ROD Lin28, R ML KSox2, O ML KSox2, D ML KSox2, RO ML KSox2, RD ML KSox2, OD ML KSox2, ROD ML KSox2, R L KSox2, O L KSox2, D L KSox2, RO L KSox2, RD L KSox2, OD L KSox2, ROD L KSox2, R M KSox2, O M KSox2, D M KSox2, RO M KSox2, RD M KSox2, OD M KSox2, ROD M KSox2, R KSox2, O KSox2, D KSox2, RO KSox2, RD KSox2, OD KSox2, ROD KSox2, R ML KLin28, O ML KLin28, D ML KLin28, RO ML KLin28, RD ML KLin28, OD ML KLin28, ROD ML KLin28, R L KLin28, O L KLin28, D L KLin28, RO L

KLin28, RD L KLin28, OD L KLin28, ROD L KLin28, R M KLin28, O M KLin28, D M KLin28, RO M KLin28, RD M KLin28, OD M KLin28, ROD M KLin28, R KLin28, O KLin28, D KLin28, RO KLin28, RD KLin28, OD KLin28, ROD KSox2, R ML Sox2Lin28, O ML Sox2Lin28, D ML Sox2Lin28, RO ML Sox2Lin28, RD ML Sox2Lin28, OD ML Sox2Lin28, ROD ML Sox2Lin28, R L Sox2Lin28, O L Sox2Lin28, D L Sox2Lin28, RO L Sox2Lin28, RD L Sox2Lin28, OD L Sox2Lin28, ROD L Sox2Lin28, R M Sox2Lin28, O M Sox2Lin28, D M Sox2Lin28, RO M Sox2Lin28, RD M Sox2Lin28, OD M Sox2Lin28, ROD M Sox2Lin28, R Sox2Lin28, O Sox2Lin28, D Sox2Lin28, RO Sox2Lin28, RD Sox2Lin28, OD Sox2Lin28, ROD Sox2Sox2, R ML KSox2Lin28, O ML KSox2Lin28, D ML KSox2Lin28, RO ML KSox2Lin28, RD ML KSox2Lin28, OD ML KSox2Lin28, ROD ML KSox2Lin28, R L KSox2Lin28, O L KSox2Lin28, D L KSox2Lin28, RO L KSox2Lin28, RD L KSox2Lin28, OD L KSox2Lin28, ROD L KSox2Lin28, R M KSox2Lin28, O M KSox2Lin28, D M KSox2Lin28, RO M KSox2Lin28, RD M KSox2Lin28, OD M KSox2Lin28, ROD M KSox2Lin28, R KSox2Lin28, O KSox2Lin28, D KSox2Lin28, RO KSox2Lin28, RD KSox2Lin28, OD KSox2Lin28, ROD KSox2Lin28. 이 중 바람직한 것은,

R Oct4ML, O Oct4ML, D Oct4ML, RO Oct4ML, RD Oct4ML, OD Oct4ML, ROD Oct4ML, R Oct4L, O Oct4L, D Oct4L, RO Oct4L, RD Oct4L, OD Oct4L, ROD Oct4L, R Oct4M, O Oct4M, D Oct4M, RO Oct4M, RD Oct4M, OD Oct4M, ROD Oct4M, R Oct4, O Oct4, D Oct4, RO Oct4, RD Oct4, OD Oct4, ROD Oct4, R Oct4ML K, O Oct4ML K, D Oct4ML K, RO Oct4ML K, RD Oct4ML K, OD Oct4ML K, ROD Oct4ML K, R Oct4L K, O Oct4L K, D Oct4L K, RO Oct4L K, RD Oct4L K, OD Oct4L K, ROD Oct4L K, R Oct4M K, O Oct4M K, D Oct4M K, RO Oct4M K, RD Oct4M K, OD Oct4M K, ROD Oct4M K, R Oct4 K, O Oct4 K, D Oct4 K, RO Oct4 K, RD Oct4 K, OD Oct4 K, ROD Oct4 K, R Oct4ML Sox2, O Oct4ML Sox2, D Oct4ML Sox2, RO Oct4ML Sox2, RD Oct4ML Sox2, OD Oct4ML Sox2, ROD Oct4ML Sox2, R Oct4L Sox2, O Oct4L Sox2, D Oct4L Sox2, RO Oct4L Sox2, RD Oct4L Sox2, OD Oct4L Sox2, ROD Oct4L Sox2, R Oct4M Sox2, O Oct4M Sox2, D Oct4M Sox2, RO Oct4M Sox2, RD Oct4M Sox2, OD Oct4M Sox2, ROD Oct4M Sox2, R Oct4 Sox2, O Oct4 Sox2, D Oct4 Sox2, RO Oct4 Sox2, RD Oct4 Sox2, OD Oct4 Sox2, ROD Oct4 Sox2, R Oct4ML Lin28, O Oct4ML Lin28, D Oct4ML Lin28, RO Oct4ML Lin28, RD Oct4ML Lin28, OD Oct4ML Lin28, ROD Oct4ML Lin28, R Oct4L Lin28, O Oct4L Lin28, D Oct4L Lin28, RO Oct4L Lin28, RD Oct4L Lin28, OD Oct4L Lin28, ROD Oct4L Lin28, R Oct4M Lin28, O Oct4M Lin28, D Oct4M Lin28, RO Oct4M Lin28, RD Oct4M Lin28, OD Oct4M Lin28, ROD Oct4M Lin28, R Oct4 Lin28, O Oct4 Lin28, D Oct4 Lin28, RO Oct4 Lin28, RD Oct4 Lin28, OD Oct4 Lin28, ROD Oct4 Lin28, R Oct4ML KSox2, O Oct4ML KSox2, D Oct4ML KSox2, RO Oct4ML KSox2, RD Oct4ML KSox2, OD Oct4ML KSox2, ROD Oct4ML KSox2, R Oct4L KSox2, O Oct4L KSox2, D Oct4L KSox2, RO Oct4L KSox2, RD Oct4L KSox2, OD Oct4L KSox2, ROD Oct4L KSox2, R Oct4M KSox2, O Oct4M KSox2, D Oct4M KSox2, RO Oct4M KSox2, RD Oct4M KSox2, OD Oct4M KSox2, ROD Oct4M KSox2, R Oct4 KSox2, O Oct4 KSox2, D Oct4 KSox2, RO Oct4 KSox2, RD Oct4 KSox2, OD Oct4 KSox2, ROD Oct4 KSox2, R Oct4ML KLin28, O Oct4ML KLin28, D Oct4ML KLin28, RO Oct4ML KLin28, RDOct4ML KLin28,

OD Oct4ML KLin28, ROD Oct4ML KLin28, R Oct4L KLin28, O Oct4L KLin28, D Oct4L KLin28, RO Oct4L KLin28, RD Oct4L KLin28, OD Oct4L KLin28, ROD Oct4L KLin28, R Oct4M KLin28, O Oct4M KLin28, D Oct4M KLin28, RO Oct4M KLin28, RD Oct4M KLin28, OD Oct4M KLin28, ROD Oct4M KLin28, R Oct4 KLin28, O Oct4 KLin28, D Oct4 KLin28, RO Oct4 KLin28, RD Oct4 KLin28, OD Oct4 KLin28, ROD Oct4 KSox2, R Oct4ML Sox2Lin28, O Oct4ML Sox2Lin28, D Oct4ML Sox2Lin28, RO Oct4ML Sox2Lin28, RD Oct4ML Sox2Lin28, OD Oct4ML Sox2Lin28, ROD Oct4ML Sox2Lin28, R Oct4L Sox2Lin28, O Oct4L Sox2Lin28, D Oct4L Sox2Lin28, RO Oct4L Sox2Lin28, RD Oct4L Sox2Lin28, OD Oct4L Sox2Lin28, ROD Oct4L Sox2Lin28, R Oct4M Sox2Lin28, O Oct4M Sox2Lin28, D Oct4M Sox2Lin28, RO Oct4M Sox2Lin28, RD Oct4M Sox2Lin28, OD Oct4M Sox2Lin28, ROD Oct4M Sox2Lin28, R Oct4 Sox2Lin28, O Oct4 Sox2Lin28, D Oct4 Sox2Lin28, RO Oct4 Sox2Lin28, RD Oct4 Sox2Lin28, OD Oct4 Sox2Lin28, ROD Oct4 Sox2Sox2, R Oct4ML KSox2Lin28, O Oct4ML KSox2Lin28, D Oct4ML KSox2Lin28, RO Oct4ML KSox2Lin28, RD Oct4ML KSox2Lin28, OD Oct4ML KSox2Lin28, ROD Oct4ML KSox2Lin28, R Oct4L KSox2Lin28, O Oct4L KSox2Lin28, D Oct4L KSox2Lin28, RO Oct4L KSox2Lin28, RD Oct4L KSox2Lin28, OD Oct4L KSox2Lin28, ROD Oct4L KSox2Lin28, R Oct4M KSox2Lin28, O Oct4M KSox2Lin28, D Oct4M KSox2Lin28, RO Oct4M KSox2Lin28, RD Oct4M KSox2Lin28, OD Oct4M KSox2Lin28, ROD Oct4M KSox2Lin28, R Oct4 KSox2Lin28, O Oct4 KSox2Lin28, D Oct4 KSox2Lin28, RO Oct4 KSox2Lin28, RD Oct4 KSox2Lin28, OD Oct4 KSox2Lin28, ROD Oct4 KSox2Lin28. 이 중 특히 바람직한 것은, ROD Oct4L, RD Oct4L, RO Oct4ML, D Oct4ML, ROD Oct4M, OD Oct4L, O Oct4ML, O Oct4L, O Oct4M, OD Oct4, D Oct4L, Oct4ML, ROD Oct4ML, RD Oct4ML, OD Oct4ML, O Oct4MLGlis1, RD Oct4M, R Oct4L Glis1, R Oct4ML, OD Oct4M, O Oct4L Glis1, ROD Oct4, RO Oct4M, RO Oct4L, RO Oct4, O Oct4 Glis1, RD Oct4, Oct4L Glis1, D Oct4M, D Oct4 Glis1, O Oct4, Oct4L, Oct4M, D Oct4, RO Oct4 K, RO Oct4Sox2, RO Oct4Lin28 을 들 수 있다. 이 중 더욱 바람직한 것은 ROD Oct4L, RD Oct4L, RO Oct4ML, D Oct4ML, ROD Oct4M, OD Oct4L, O Oct4ML, O Oct4L, O Oct4M, OD Oct4, D Oct4L 이다. 이 중 더욱 바람직한 것은, ROD Oct4L, RD Oct4L, RO Oct4ML, D Oct4ML 이다. 이것들의 바람직한 조합은 특히 인간 세포의 다이렉트·리프로그래밍에 유효하다.

리프로그래밍 관련 유전자만으로 골아 세포를 유도하기 위한 체세포에 도입되는 리프로그래밍 관련 유전자의 바람직한 조합으로는, Oct4, Oct4L, Oct4M, Oct4LM, Oct4LGlis1, Oct4LMGlis1 을 들 수 있다.

상기 유전자는, 모두, 척추 동물에서 고도로 보존되어 있는 유전자이며, 본 명세서에서는, 특별히 동물명을 나타내지 않는 한, 호모 로그를 포함한 유전자를 나타내는 것으로 한다. 또, polymorphism 을 포함하고, 변이를 갖는 유전자여도, 야생형의 유전자 산물과 동등한 기능을 갖는 유전자도 또한, 포함되는 것으로 한다. 본 발명 방법은, 특정한 유전자를 선택하는 것 이외에는, 공지된 다이렉트·리프로그래밍의 수법에 준하여 실시할 수 있고, 예를 들어 이하의 어느 문헌의 방법에 준하여 실시할 수 있다：

문헌：1 Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytes by Defined Factors； Masaki Ieda, Ji-Dong Fu, Paul Delgado-Olguin, Vasanth Vedantham, Yohei Hayashi, Benoit G. Bruneau, and Deepak Srivastava Cell 142：375-386, 2010.

2 Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Thomas Vierbuchen, Austin Ostermeier, Zhiping P. Pang, Yuko Kokubu, Thomas C. Sudhof & Marius Wernig. Nature 463：1035-1041, 2010.

3 Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ, Citri A, Sebastiano V, Marro S, Sudhof TC, Wernig M. Nature 476：220-223, 2011.

4 Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors Kunihiko Hiramatsu, Satoru Sasagawa, Hidetatsu Outani, Kanako Nakagawa, Hideki Yoshikawa, and Noriyuki Tsumaki, Journal of Clinical Investigation, 121：640-657, 2011.

5 Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Pengyu Huang, Zhiying He, Shuyi Ji, Huawang Sun, Dao Xiang, Changcheng Liu, Yiping Hu, XinWang & Lijian Hui,. Nature 475：386-389, 2011.

6 Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors. Sayaka Sekiya & Atsushi Suzuki. Nature 475：390-393, 2011.

상기의 문헌 1 ∼ 6 의 내용은 본 명세서에 참고로서 원용된다.

구체적으로는, 골아 세포로 변환하기 위한 도입 유전자 (골관련 유전자와 리프로그래밍 관련 유전자의 조합, 혹은 리프로그래밍 관련 유전자 단독) 를 발현 벡터에 삽입하고, 대상으로 하는 체세포에 발현 벡터를 도입하여, 세포 내에서 발현시키는 것이 바람직하다.

유전자를 도입하는 방법으로는, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터 등의 바이러스성 벡터를 감염시키는 방법 이외에, 유전자와 그 발현 산물의 도입의 경우에는, 카티오닉·리포솜, 카티오닉·폴리머, 전기 천공법 등의 비바이러스 벡터이며, 플라스미드 벡터나 에피소말 벡터, 유전자의 발현 산물 (mRNA, 단백질) 을 트랜스펙션하는 방법도 이용할 수 있다. 또, mRNA 를 도입할 수도 있다. 이들 유전자 도입에 사용하는 수단을 모두 포괄하여, 본 명세서에서는 벡터라고 부른다.

또, 치료 목적의 유전자와 함께 약제 선택 마커가 되는 유전자 (퓨로마이신 내성, 블라스트사이진 S 내성, 네오마이신 내성, 하이그로마이신 내성 등) 를 도입하고, 그 후 약제 선택을 실시하는 것에 의해, 치료용 유전자를 발현시키는 세포를 선택하고 나서 사용할 수 있다.

또, 도입 인자가 골관련 유전자의 발현 산물과 리프로그래밍 관련 유전자의 발현 산물 (예를 들어 단백질) 인 경우에는, Protein Transduction Domain (PTD) 로 불리는 펩티드를 발현 산물인 단백질에 결합시켜, 배지에 첨가함으로써, 체세포내에 도입해도 된다. 골아 세포의 원료가 되는 체세포에서, 골관련 유전자의 일부가 발현되어 있는 경우에는, 그 단백질에 관해서는 외부로부터 도입할 필요가 없다. 또, 리프로그래밍 인자나 리프로그래밍 인자의 유전자를 도입하지 않아도, 소분자로 대체하여 골아 세포를 유도할 수 있다. 예를 들어, "Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins." Zhou H, Wu S, Joo JY, Zhu S, Han DW, Lin T, Trauger S, Bien G, Yao S, Zhu Y, Siuzdak G, Scholer HR, Duan L, Ding S. Cell Stem Cell. 2009 May 8；4 (5)：381-4. 나, "Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins." Kim D, Kim CH, Moon JI, Chung YG, Chang MY, Han BS, Ko S, Yang E, Cha KY, Lanza R, Kim KS. Cell Stem Cell. 2009 Jun 5；4 (6)：472-6. 에 기재된 방법이다.

골아 세포를 분화시키기 위한 분화 유도 배지로는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 이하의 골유도 배지를 사용할 수 있다.

골유도 배지 = 통상 배지에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-Glycerophosphate, 100 nM 덱사메타존 (모두 최종 농도) 을 더한 것.

골아 세포가 얻어진 것은, ALP 염색, 오스테오칼신 (Osteocalcin) 이나 오스테오폰틴 (Osteopontin) 의 mRNA 의 리얼타임 PCR 에 의한 측정, 알리자린 레드 S 에 의한 염색 (미네랄화된 골기질의 산생), von Kossa 염색 등에 의해 확인할 수 있다.

본 발명의 유전자의 도입은, 플라스미드에 의해 실시해도 되고, 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터를 사용해도 된다. 도입 효율과 도입 유전자의 안정 유지의 관점에서는 바이러스 벡터가 바람직하고, 암화의 리스크를 억제하기 위해서는 플라스미드가 바람직하다.

체세포에 도입되는 유전자는 LTR 프로모터에 의해 전사시킬 수도 있고, 벡터 내부의 다른 프로모터로부터 발현시켜도 된다. 예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터, CAG 프로모터 등의 구성적 발현 프로모터, 또는 원하는 유도성 프로모터를 이용할 수 있다. 또, LTR 의 일부를 그 밖의 프로모터로 치환한 키메라 프로모터를 이용해도 된다.

실시예

이하에 실시예를 나타내는데, 본 발명은 이 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

또한, 도 3 ∼ 도 11, 도 14 ∼ 16, 도 18 ∼ 22, 도 26, 도 28 ∼ 32, 도 34, 도 37 ∼ 38 은 인간 정상 치육 선유아 세포주인 Gin-1 을 사용한 결과를 나타낸다. 도 12 ∼ 13, 도 17, 도 33, 도 35 ∼ 36, 도 39 ∼ 42 는 aHDF (인간 정상 피부 선유아 세포) 를 사용한 결과를 나타낸다. 도 27 은, 마우스의 태자 선유아 세포를 사용한 결과를 나타낸다.

실시예 1

(1) 목적 유전자를 코드한 pMXs 벡터의 제조 (도 1)

목적하는 유전자 (Runx2 등) 를 포함한 플라스미드로부터 코드 영역의 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 목적 유전자를 증폭시켰다 (프라이머의 염기서열을 도 23 에 나타낸다). 또 pMXs puro 벡터를 EcoRI 로 절단하였다. 각각에 대해 전기 영동을 실시하여 분리한 후, 전기 영동 겔로부터 유전자와 벡터의 Back bone 을 추출. 양자를 Gene art 시스템에 의해 라이게이션함으로써 목적 유전자를 코드한 pMXs 벡터를 제조하였다. 이들 벡터의 염기서열은 도 24 에 나타내는 프라이머를 사용하여 확인하였다.

(2) 실험의 개략 (도 2)

3 × 10⁶ 개의 Plat GP 세포를 케라틴 코트한 10 ㎝ 디쉬에 파종, 100 U/㎖ Penicillin 그리고 100 ㎍/㎖ Streptomycin 을 함유한 1 ％ NEAA 10 ％ FBS DMEM (통상 배지) 에서 배양. 24 시간 후, 여러 가지의 유전자를 포함하는 pMXs 벡터를 여러 가지의 조합으로, pCMV VSV 벡터와 함께, 패키징 세포인 Plat GP 에 X-tremeGENE 9 를 사용하여 1：3 비로 리포펙션법에 의해 도입 (도입 유전자 5 ㎍, pCMV.VSV 2.5 ㎍, Opti-MEM 500 ㎕, X-tremeGENE 9 22.5 ㎕ 의 혼화액을 10 ㎖ 의 배지에 담은 10 ㎝ 디쉬의 첨가). 24 시간 후, 항생제 프리인 통상 배지로 배지 교환. 동일한 날에 인간 정상 치육 선유아 세포주인 Gin-1 및 인간 정상 피부 선유아 세포주인 aHDF 를 2 × 10⁴ ∼ 2 × 10⁵ cells/㎖ 로 배양 디쉬 또는 배양 플레이트 (예를 들어, 면역 염색의 목적에서는 12 well 플레이트, 24 well 플레이트, ALP 활성, PCR 의 목적에서는 12 well 플레이트, ALP 염색의 목적에서는 6 well 플레이트, Alizarin Red S 염색의 목적에서는, 24 well 플레이트, 6 well 플레이트, 35 ㎜ 디쉬, 60 ㎜ 디쉬 중 어느 것) 에 파종, 이 날을 배양 제 -1 일째로 하였다. 1 일 후 (배양 제 0 일째), Plat GP 배양 상청을 포어의 직경이 0.45 ㎛ 인 시린지 필터를 통과시킨 후, 폴리브렌 (최종 농도 4 ㎍/㎖) 과 혼화하였다 (바이러스액). Gin-1 및 aHDF 의 배양 상청을 흡인 제거한 후, 재빠르게 상기의 바이러스액을 더하여 (24 well 의 경우에는 500 ㎕, 12 well 의 경우에는 1 ㎖, 6 well 그리고 35 ㎜ 의 경우에는 1.5 ㎖, 60 ㎜ 의 경우에는 2.5 ㎖), 24 시간 배양하였다 (감염). 컨트롤군으로서, 바이러스 감염을 실시하지 않은 세포도 준비하였다. 1 일 후 (배양 제 1 일째), 배양 상청을 흡인 제거하고, 골유도 배지 (통상 배지에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-Glycerophosphate, 100 nM 덱사메타존 (모두 최종 농도) 을 더한 것) 를 더하여 배양하였다. 그 후 2 ∼ 3 일 간격으로 배양액을 교환하였다. 유전자를 도입하여 14 일 후에, ALP 염색, ALP 활성 시험, Real-time RT-PCR 을, 20 일 후에 면역 염색을, 20 일 또는 28 일 후에 Alizarin Red S 염색을, 28 일 후에 von Kossa 염색을 실시하였다. 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않고, 동일한 배양을 실시한 세포를 Control 로 하였다.

(3) Alizarin Red S 염색 (도 3)

인간 정상 치육 선유아 세포주 Gin-1 을 24 well 플레이트에 배양하고, 도 2 와 같이 실험하였다. 유전자 도입 28 일 후, 배양 디쉬로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 2 회 세정을 실시하고, 95 ％ 에탄올로 고정. 멸균 증류수로 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 더하여, 실온에서 15 분간 가만히 정지시킴. 도 3A-F 는 디쉬의 육안 이미지 사진이다. 붉게 물들어 있는 것은 석회화 골기질이며, 기능성 골아 세포가 유도된 것을 나타낸다. 웰의 숫자는 도 3H, 도 3I 를 참조 (도 3H, 도 3I 의 표 중의「1」은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 것을, 공란은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 것을 나타낸다). 예를 들어, 도 3B 의 27 번의 웰 (가장 상단, 좌로부터 3 번째의 웰) 은, 도 3H 에 나타내는 바와 같이, Osterix, Runx2, Oct4, L-Myc, Dlx5 의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 세포이며, 많은 석회화 골기질을 산생하고 있는 것을 알 수 있다. 또한 모든 웰로부터 알리자린 레드 S 염색액을 재거하고, 멸균 증류수로 세정 후, 10 ％ Triton X 를 더하여, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 각 웰로부터 액을 채취하고, 96 well plate 로 옮겼다. 그 육안 사진을 도 3G 에 나타낸다 (웰의 숫자는 도 3H 를 참조). 그 후 반응액의 흡광도 (550 ㎚ ∼ 650 ㎚, 도 3H；490 ㎚ ∼ 650 ㎚, 도 3I) 를 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 측정한 결과를 도 3H, 도 3I 의 그래프에 나타낸다. 그래프의 세로축은 흡광도이고, 흡광도가 높을수록 석회화 골기질이 다량으로 산생된 것을 나타내고, 많은 선유아 세포가 기능성 골아 세포에 컨버트된 것을 나타낸다. 예를 들어 27 번째의 Osterix, Runx2, Oct4, L-Myc, Dlx5 의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 세포는, 가장 많은 석회화 골기질을 산생한 것을 알 수 있다.

(4) ALP 활성 시험 (도 4)

인간 정상 치육 선유아 세포주 Gin-1 을 12 well 플레이트에 배양하고, 도 2 와 같이 실험하였다. 유전자 도입 14 일 후, 세포 배양 디쉬로부터, 배양액을 흡인 제거하고, 생리 식염수로 2 회 세정. 1 ％ NP-40 함유 생리 식염수로 세포를 용해시키고, 12000 rpm 으로 5 분간 원심. 상청을 회수하고, p-nitrophenol phosphate 를 함유하는 ALP 완충액과 반응시켜, 405 ㎚ 에서 흡광도계로 측정하였다. 또, 동시에 총 단백량도 측정하고, 총 단백질량당의 ALP 활성에 의해 보정하고, 표시하였다. 결과를 도 4 에 나타낸다.

ROOct4, ROOct4M, ROOct4L, ROOct4G 등에서 control 과 비교하여, 유의하게 높은 ALP 활성을 나타내었다. 또, ROOct4L 은 모든 그룹 중에서 가장 높은 ALP 활성을 나타내었다.

(5) ALP 염색 이미지 (도 5)

인간 정상 치육 선유아 세포주 Gin-1 을 6 well 플레이트에 배양하고, 도 2 와 같이 실험하였다. 유전자 도입 14 일 후, 웰로부터 배양액을 흡인 제거하고, 생리 식염수로 2 회 세정을 실시하고, 고정액을 첨가하여, 5 분간 고정시켰다. 멸균 증류수로 2 회 세정하였다. ALP 염색액을 더하고, 차광하여 실온에서 1 시간 가만히 정지시키고, 멸균 증류수로 2 회 세정한 후, 육안 및 도립 위상차 현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 5 에 나타낸다. ROOct4M, 또는 ROOct4L, 또는 Oct4L 을 도입한 세포의 일부가 ALP 양성이 되었다. 특히 ROOct4L 을 도입한 세포에서는, 웰의 바닥면 전체에 걸쳐서 ALP 염색 양성 세포가 확인되었다.

(6) 면역 염색 (도 6)

인간 정상 치육 선유아 세포주 Gin-1 을 24 well 플레이트에 배양하고, 도 2 와 같이 실험하였다. 유전자 도입 21 일 후, 배양 디쉬로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 2 회 세정을 실시하고, 4 ％ 파라포름알데히드로 30 분간 고정시켰다. 3 회 세정을 실시한 후, 실온에서 1 시간 블로킹하였다. 1 차 항체 (anti-hOsteocalcin) 를 4 ℃ 에서 24 시간 반응시키고, 3 회 세정한 후, FITC 가 라벨되어 있는 2 차 항체를 실온에서 1 시간 반응시켰다. 3 회 세정한 후, 형광 현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 6 에 나타낸다.

(a) control, (b) ROOct4M, (c) ROOct4L：× 100

ROOct4M, ROOct4L 을 도입한 세포에 있어서 Osteocalcin 의 발현을 확인하였다. 또 ROOct4L 을 도입한 세포에서 보다 다수의 Osteocalcin 양성 세포를 확인하였다.

(7) Alizarin Red S 염색 (도 7)

인간 정상 치육 선유아 세포주 Gin-1 을 35 ㎜ 디쉬에 배양하고, 도 2 와 같이 실험하였다. 유전자 도입 28 일 후, 배양 디쉬로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 2 회 세정을 실시하고, 95 ％ 에탄올로 고정. 멸균 증류수로 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 더하고, 실온에서 15 분간 가만히 정지시킴. 멸균 증류수로 세정한 후, 육안 및 도립 위상차 현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 7 에 나타낸다.

(a) control, (b) ROOct4M, (c) ROOct4L：× 1

(d) control, (e) ROOct4M, (f) ROOct4L：× 40

ROOct4M, 또는 ROOct4L 을 도입한 세포의 디쉬에서 석회화 기질의 침착을 확인하였다. 특히 ROOct4L 을 도입한 세포의 디쉬에서는, 배양 디쉬의 바닥면 전체에 걸쳐서 대량의 석회화 골기질의 침착을 확인하였다.

(8) von Kossa 염색 (도 8)

인간 정상 치육 선유아 세포주 Gin-1 을 35 ㎜ 디쉬에 배양하고, 도 2 와 같이 실험하였다. 유전자 도입 28 일 후, 배양 디쉬로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 2 회 세정을 실시하고, 10 ％ 포르말린으로 고정. 멸균 증류수로 세정한 후, 5 ％ Silver nitrate solution 을 더하고, UV 라이트 하에서 30 분간 가만히 정지시킴. 그 후 멸균 증류수로 세정하고, 5 ％ Thiosulfate solution 을 더하여 2 분간 반응시켰다. 멸균 증류수로 세정한 후, 육안 및 도립 위상차 현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 8 에 나타낸다.

ROOct4M 을 도입한 세포에서는 산재 (散在) 된 인산칼슘의 침착을 확인하였다. ROOct4L 과 Oct4L 을 도입한 세포에서는, 배양 디쉬의 바닥면 전체에 밀집된 인산칼슘의 침착을 확인하였다.

(9) 3 차원 실험 배양법의 개략 (도 9)

도 9 와 같이, 체세포를 제 -1 일에 배양 디쉬 또는 배양 플레이트에 뿌리고, 제 0 일에 유전자를 도입하고, 제 1 일에 배지를 골분화 유도 배지로 교환하였다. 이 제 -1 일째의 세포의 파종, 제 0 일째의 유전자 도입, 제 1 일째의 배지 교환의 상세한 것은 도 2 와 동일하다. 제 4 일에 세포를 디쉬로부터 떼어내고, 5 × 10⁵ 개를 Scaffold (3D insert-PCL) 상에 파종하여 3 차원 배양을 실시하였다. 제 28 일에 김자 염색 또는 Alizarin Red S 염색을 실시하였다. 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않고, 동일한 배양을 실시한 세포를 Control 로 하였다. 또, 세포를 더하지 않고 스캐폴드만으로 동일한 배양을 실시한 것을 Background 로 하였다.

(10) 3 차원 배양의 김자 염색 (도 10)

인간 정상 치육 선유아 세포주 Gin-1 을 60 ㎜ 디쉬에 배양하고, 도 9 와 같이 실험하였다. 유전자 도입으로부터 28 일 후, 배양 디쉬로부터 배양액을 흡인하고, PBS 로 2 회 세정을 실시하고, Scaffold 째로 세포를 메탄올로 고정. 멸균 증류수로 세정한 후, 김자 염색액을 더하고, 실온에서 15 분간 가만히 정지시킴. 멸균 증류수로 세정한 후, 육안으로 관찰하였다. 결과를 도 10 에 나타낸다.

(a) Background, (b) ROOct4L：× 1

유도 세포는, 이 Scaffold 에 생착되어, 증식하는 것이 판명되었다.

(11) 3 차원 배양의 Alizarin Red S 염색 (도 11)

인간 정상 치육 선유아 세포주 Gin-1 을 60 ㎜ 디쉬에 배양하고, 도 9 와 같이 실험하였다. 유전자 도입으로부터 28 일 후, 배양 디쉬로부터 배양액을 흡인하고, PBS 로 2 회 세정을 실시하고, Scaffold 째로 세포를 95 ％ 에탄올로 고정시켰다. 멸균 증류수로 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 더하고, 실온에서 15 분간 가만히 정지시키고, 멸균 증류수로 세정한 후, 육안으로 관찰하였다. 결과를 도 11 에 나타낸다.

(a) Background, (b) control, (c) ROOct4M, (d) ROOct4L：× 1

유도 세포는, 이 Scaffold 상에서 석회화 골기질 산생능을 나타내는 것이 판명되었다. 또 석회화 골기질의 산생은, ROOct4L 을 도입한 세포에서 현저하였다.

(12) ALP 염색 이미지 (도 12)

인간 정상 피부 선유아 세포주 aHDF 를 6 well plate 에 배양하고, 도 2 와 같이 실험하였다. 유전자 도입 14 일 후, 웰로부터 배양액을 흡인 제거하고, 생리 식염수로 2 회 세정을 실시하고, 고정액을 첨가하여, 5 분간 고정시켰다. 멸균 증류수로 2 회 세정하고, ALP 염색액을 더하고, 차광하여 실온에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 멸균 증류수로 2 회 세정한 후, 육안 및 도립 위상차 현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 12 에 나타낸다.

(a) control, (b) ROOct4 M, (c) ROOct4L：× 1

(d) control, (e) ROOct4 M, (f) ROOct4L：× 40

ROOct4M, 또는 ROOct4L 을 도입한 세포의 일부가 ALP 염색 양성이 되었다. 특히 ROOct4L 을 도입한 세포에서는, 웰의 바닥면 전체에 걸쳐서 다수의 ALP 염색 양성 세포를 확인하였다.

(13) Alizarin Red S 염색 (도 13a, b)

a) 인간 정상 피부 선유아 세포주 aHDF 를 6 well plate 에 배양하고, 도 2 와 같이 실험하였다. 유전자 도입 28 일 후, 웰로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 2 회 세정을 실시하고, 95 ％ 에탄올로 고정시켰다. 멸균 증류수로 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 더하고, 실온에서 15 분간 가만히 정지시켰다. 멸균 증류수로 세정한 후, 육안 및 도립 위상차 현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 13a 에 나타낸다.

(좌) control, (중앙) ROOct4 M, (우) ROOct4L：× 1

ROOct4 M, 또는 ROOct4L 을 도입한 세포의 웰에서 석회화 기질의 침착을 확인하였다. 특히 ROOct4L 을 도입한 세포에서는, 웰의 바닥면 전체에 걸쳐서 대량의 석회화 골기질의 침착을 확인하였다.

b) a 와 동일한 실험을 실시하고, 유전자 도입 14 일 후에 ALP 염색을 (상), 유전자 도입 28 일 후에 von Kossa 염색을 (하) 실시한 도립 위상차 현미경 이미지를 도 13b 에 나타낸다. 배율은 ×40.

(14) Alizarin Red S 염색 (도 14)

인간 정상 치육 선유아 세포 Gin-1 을 6 웰 플레이트에 배양하고, 인간의 Runx2, Osterix, Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4L), 또는 Runx2, Osterix, Oct4 와 c-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4M), 또는 Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (Oct4L) 을 감염시켰다. 감염 후, 기재된 일수 (1 일 ∼ 28 일) 배양하였다. (-) 는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 치육 선유아 세포 Gin-1 이다. 또 인간 골아 세포는, Lonza Walkersville, Inc. 로부터 구입한 NHost 세포이다. 알리자린 레드 S 염색은 이하와 같이 실시하였다. 배양 디쉬로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 2 회 세정을 실시하고, 95 ％ 에탄올로 고정. 멸균 증류수로 세정한 후, 알리자린 레드 S 염색액을 더하고, 실온에서 15 분간 가만히 정지시킴. 멸균 증류수로 세정한 후, 도립 위상차 현미경으로 관찰, 촬영하였다. ROOct4L 과 Oct4L 을 감염시킨 세포는, 다량으로 석회화 골기질을 산생하고, ROOct4M 을 감염시킨 세포여도, ROOct4L 보다는 약하지만 석회화 골기질을 산생한다. ND：Not determined.

(15) 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 인간 골아 세포의 성상 (도 15)

도 14 와 동일하게, 인간 치육 선유아 세포 (Gin-1) 에, 인간의 Runx2, Osterix, Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4L), 또는 Runx2, Osterix, Oct4 와 c-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4M) 을 감염시켜, 28 일간 배양하였다. (-) 는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 치육 선유아 세포 Gin-1 이다. 또 인간 골아 세포로서 Lonza Walkersville, Inc. 로부터 구입한 NHost 세포를 사용하였다. a, 칼슘 침착의 킬레이트법에 의한 정량. 세포를 PBS 로 잘 세정한 후, 스크레이퍼로 박리하고, 0.5 M 의 염산으로 용해시키고, 소니케이션을 실시하였다. 라이세이트를 10,000 rpm 으로 5 분간 원심하고, 상청을 회수하였다. 그 2 마이크로 리터를 240 마이크로 리터의 Chlorophosphonazo-III 용액 (LS-MPR CPZ III, AKJ Global Technology, 치바, 일본) 과 혼합하여, 10 분간 인큐베이트하였다. 마이크로 플레이트 리더로 690 ㎚ 의 흡광도를 측정하고, 표준 곡선과 비교하여 칼슘 농도 (mg/dL) 를 계산하였다. b-e, 세포로부터 ISOGEN II (Nippon Gene) 를 사용하여 RNA 를 회수하고, ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO) 를 사용하여 역전사를 실시하였다. 각각의 유전자에 특이적인 프라이머 (도 25 에 나타낸다) 와 Real-time PCR Master Mix (TOYOBO) 를 사용하고, 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems) 을 사용하여 real-time RT-PCR 해석을 실시하였다. 각 샘플의 mRNA 레벨은, β-액틴 mRNA 레벨에 의해 보정 후, 인간 치육 선유아 세포의 값에 대한 상대치로서 나타내었다. f, 세포에 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt 용액 (WST-8) (Cell Count Reagent SF；Nacalai Tesque) 을 더하고, 37 ℃ 에서 1 시간 배양하였다. 상청의 450 ㎚ 와 650 ㎚ 의 흡광도를 측정하고, 유전자 비도입 인간 치육 선유아 세포의 값을 100 ％ 로 하여, 각 세포의 viability 를 계산하였다. *P < 0.05 및 **P < 0.01, (유전자 비도입 인간 치육 선유아 세포 (Gin-1) 에 대한 유의차). ^#P < 0.05, ^##P < 0.01. 값은 평균치 ±S.D. (n = 4).

ROOct4L 을 감염시킨 세포는 인간 골아 세포 이상으로 칼슘을 침착할 수 있다. ROOct4M 을 감염시킨 세포여도 인간 골아 세포와 동일한 정도로 칼슘을 침착할 수 있다. ROOct4L 을 감염시킨 세포도 ROOct4M 을 감염시킨 세포도, 골아 세포 특이적인 유전자를 발현시킨다. 또 ROOct4L 을 감염시킨 세포는, 충분한 증식능을 가지고 있다.

(16) 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 인간 골아 세포의 해석 (도 16)

a, 인간 치육 선유아 세포 (Gin-1), 인간 치육 선유아 세포 (Gin-1) 에 ROOct4L 을 감염시킨 후 20 일간 배양한 세포 (이하의 문장과 도면 중에서는 dOB 라고 부른다), 및 인간 골아 세포 (Lonza Walkersville, Inc. 로부터 구입한 NHost 세포) 를 FITC 라벨한 항인간 오스테오칼신 항체 및 항오스테오폰틴 항체로 면역 염색하였다. 배율 ×100. b, 상기와 동일한 세포로부터 RNA 를 회수하고, GeneChip (등록 상표) human Gene 1.0 ST (Affymetrix 사) 를 사용하여 DNA 마이크로 어레이 해석을 실시하였다. 인간 치육 선유아 세포에서의 발현량에 대한 골아 세포에서의 발현량의 비로, 전체 유전자를 7 군으로 나누었다 (0.2 미만, 0.2 이상 0.33 미만, 0.33 이상 0.5 미만, 0.5 이상 2.0 미만, 2.0 이상 3.0 미만, 3.0 이상 5.0 미만, 5.0 이상) (X 축). 각 군에 속하는 유전자의 수를 괄호 내에 나타낸다. 각각의 군에 속하는 유전자에 대하여, 인간 치육 선유아 세포에서의 발현량에 대한 dOB 에서의 발현량의 비 (평균치 ±S.D.) 를 플롯하였다. 인간 치육 선유아 세포에 비해 골아 세포에서 강하게 발현되는 유전자는, dOB 에서도 강하게 발현되고, 반대로 골아 세포에서 약하게 발현되는 유전자는, dOB 에서도 약하게 발현되는 것을 알 수 있어, 유의한 상관이 보여진다 (상관 계수 R = 0.70, P < 0.01). c, 상기와 동일한 세포로부터 DNA 를 회수하고, 오스테오칼신 유전자 상류역의 CpG 메틸화를 해석하였다. DNA 의 회수는, Genomic DNA purification kit (Mag Extractor, Toyobo Life Science, Tokyo, Japan) 를 사용하여 실시하고, EZ DNA methylation kit (ZYMO research, Irvine, CA) 를 사용하여 바이설파이드 처리를 실시한 후, 오스테오칼신 유전자 상류역의 서열을, 센스 프라이머 (5＇-GTGTATTTGGTAGTTATAGTTATTTGG) 와 안티센스 프라이머 (5＇-CCTCAAATTAAACACTAACTAAACTC) 를 사용하여 PCR 에 의해 증폭시켰다. pTA2 벡터에 클로닝한 후, T7 과 T3 유니버설 프라이머를 사용하여 시퀀싱하였다. 흑색은 메틸화, 백색은 비메틸화 CpG 를 나타낸다. d-e, 인간 치육 선유아 세포 (Gin-1) 에 ROOct4L 을 감염 후, 감염 전 (-), 및 감염 후 7, 14, 21 일째에 세포로부터 RNA 를 회수하였다. 포지티브 컨트롤로서 인간 iPS 세포로부터도 RNA 를 회수하였다. 역전사 후 REX-1 (d) 및 Nanog (e) 특이적인 프라이머를 사용하여 real time RT-PCR 을 실시하였다. 각 샘플의 mRNA 레벨은 β-액틴 mRNA 레벨에 의해 보정 후, 인간 치육 선유아 세포 (Gin-1) 의 값에 대한 상대치로서 나타내고 있다. **P < 0.01, (유전자 비도입 인간 치육 선유아 세포에 대한 유의차). 값은 평균치 ±S.D. (n = 4).

인간 dOB 는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴을 다량으로 산생하는 것을 알 수 있다 (a). 또 인간 dOB 는 인간 골아 세포와 망라적인 유전자 발현 프로파일이 유사한 것을 알 수 있다 (b). 인간 dOB 는, 염색체 DNA 의 에피제네틱 마크가, 선유아 세포와는 상이한 것, 인간 골아 세포에 근접해 있는 것을 알 수 있다 (c). 또 ROOct4L 감염에 의한 선유아 세포로부터 dOB 로의 이행의 도상에서, 어느 시점에 있어서도 REX-1 (d) 와 Nanog (e) 유전자의 mRNA 의 유의한 발현은 보이지 않고, iPS 세포 유사의 세포를 경유하고 있지 않은 것을 알 수 있다 (d, e).

(17) 인간 피부 선유아 세포에 도입한 각 유전자의 발현량을 Real-time RT-PCR 해석에 의해 정량한 결과 (도 17)

인간 피부 선유아 세포에, 인간의 Runx2, Osterix, Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4L), 또는 Runx2, Osterix, Oct4 와 c-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4M) 을 감염시켜, 14 일간 배양하였다 (d0). (-) 는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 치육 선유아 세포 Gin-1 이다. 도 15b-e 와 동일하게, 각 유전자의 발현량을 Real-time RT-PCR 해석에 의해 정량하였다. 각 샘플의 mRNA 레벨은 β-액틴 mRNA 레벨에 의해 보정 후, 인간 치육 선유아 세포 (Gin-1) 의 값에 대한 상대치로서 나타내었다. *P < 0.05, **P < 0.01 (유전자 비도입 인간 치육 선유아 세포에 대한 유의차). ^#P < 0.05, ^##P < 0.01. 값은 평균치 ±S.D. (n = 4).

(18) in vivo 에서의 골결손부에 있어서의 골재생 (도 18)

dOB (다이렉트·리프로그래밍된 골아 세포) 는 생체 내에서 골재생에 기여한다.

동물 실험은, 쿄토 부립 의과 대학의 인가를 얻어 실시하였다. 8 주령 수컷인 NOD/SCID 마우스 (Charles River) 의 복강 내에 펜토바르비탈을 주사하여 마취하였다. 주수 (注水) 하에 치과 드릴을 사용하여 좌대퇴골 골간에 직경 약 4 ㎜ 의 부분 골결손을 제조하였다. 인간 치육 선유아 세포 (Gin-1), 및 Gin-1 에 인간의 Runx2, Osterix, Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4L) 을 감염시킨 후 14 일간 배양하여 유도한 세포 (이하의 문장과 도면 중에서는 dOB 라고 부른다) 를 25 마이크로 리터의 배지와 75 마이크로 리터의 마트리겔 (BD Bioscience, San Jose, CA) 에 현탁하고, 골결손부에 5 × 10⁵ 개/마우스의 농도로 이식하였다. 골결손과 이식은 실시하지 않고 그 이외의 동일한 수술을 실시한 마우스도 제조하였다 (위 (僞) 수술). a, 마이크로·컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 이미지. 이식 후 21 일째에 마우스의 복강 내에 펜토바르비탈를 주사하여 마취하였다. 대퇴를 절제하고, 중성 포르말린으로 고정 후, X-ray CT device (Scan Xmate-L090, Com Scan Techno, Yokohama, Japan) 로 촬영하였다. 10 ㎛ 의 연속 단층 이미지를 나타낸다. 삼각은 골결손을, 화살표 머리는 재생 골량 (骨梁) 을 나타낸다. b, 골결손부의 조직을 SCEM (Leica Microsystem) compound 로 포매하고, 급속 동결시켰다. 6 ㎛ 의 절편으로 슬라이스 후, 연속 절편을 헤마톡실린·에오진 (H＆E) (상) 및 Alizarin Red S (하) 로 염색하였다. 삼각은 골결손을, 화살표 머리는 재생 골량을 나타낸다. 배율은 ×40. c, 상기의 6 ㎛ 의 절편을 4 ％ 파라포름알데히드로 고정시키고, 인간 핵 특이적 마우스 모노클로날 항체 (Cat：MAB1281；clone：235-1；Millipore, Billerica, MA) 로 면역 염색하였다. # 은 재생 골량, * 은 골수를 나타낸다. 배율은 ×100.

마이크로 CT 화상 (a) 과 조직 이미지 (b) 에서는, 인간 dOB 를 이식한 골에 있어서, 정렬된 골량으로 이루어지는 골성화골 (骨性化骨) 이 형성되고, 결손부는 완전하게 피복되어 있는 것을 알 수 있다. 선유아 세포를 이식한 골에서는 화골은 미소하게 형성되어 있을 뿐, 골결손이 잔존하고 있다. 면역 형광 이미지 (c) 에서는, 인간 dOB 를 이식한 골에 있어서, 이식된 dOB 가 다수, 골재생부에 생착되어 있는 것을 알 수 있다. 선유아 세포를 이식한 골에서는, 이식된 선유아 세포는 소수만 생착되어 있다.

(19) in vivo 에서의 골결손부에 있어서의 골재생 (도 19)

도 18 과 동일한 이식 실험을 실시한 후, 이식 후 21 일째에, 마우스를 안락사시키고, 대퇴골을 채취하였다. three point bending test 를 실시하고, maximum loading value 를 계측하였다. RO Oct4L 을 감염시킨 후 14 일간 배양하여 유도된 골아 세포 (dOB) 를 이식한 군에서는, 치육 선유아 세포를 이식한 군에 비해, 유의하게 대퇴골의 역학적 강도가 증강되어 있다. Sham operated 는 골결손과 이식은 실시하지 않고 그 이외의 동일한 수술을 실시한 마우스의 대퇴골이다. *P < 0.05, **P < 0.01. 값은 평균치 ±S.D. (n = 3).

(20) in vivo 에서의 골결손부에 있어서의 골재생 (도 20)

도 18 과 동일한 실험으로, 인간 치육 선유아 세포 (좌) 및 dOB (우) 를 이식 후, 21 일째의 대퇴골의 골결손부의 실태 현미경 이미지 (상) (배율 10 배), 및 이것에 설명서를 병합한 것 (하) 을 나타낸다. * 은 골결손, # 은 재생화 골이다.

인간 dOB 를 이식한 골에 있어서, 정렬된 골량으로 이루어지는 골성화골이 형성되고, 결손부는 완전하게 피복되어 시인할 수 없다. 선유아 세포를 이식한 골에서는 화골은 미소하게 형성되어 있을 뿐, 골결손이 크게 잔존하고 있다.

(21) 도 18a 의 마이크로·컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 의 데이터를 3 차원으로 재구축한 이미지 (도 21).

삼각은 골결손을, 화살표 머리는 재생 골량을 나타낸다.

인간 dOB 를 이식한 골에 있어서, 정렬된 골량으로 이루어지는 골성화골이 형성되고, 결손부는 완전하게 피복되어 있다. 선유아 세포를 이식한 골에서는 화골은 미소하게 형성되어 있을 뿐, 골결손이 잔존하고 있다.

(22) 도 18a 의 실험의 μCT 투과 이미지 (도 22). 도 18a 와 동일한 실험의 μCT 투과 이미지를 나타낸다. 화살표는 골결손부. 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 골아 세포 (dOB) 를 이식한 골에서는, 인간 치육 선유아 세포를 이식한 골에 비하여, 골결손부의 방사선 불투과성 (radiopacity) 이 높다.

(23) 에피소말·벡터에 의한 골아 세포의 다이렉트·리프로그래밍 (도 26).

인간의 Runx2, Osterix, Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 pG.oriPP9.EBNA1 에피소말·벡터의 EcoRI 사이트에 삽입하였다 (도 26 의 a 에, Runx2 를 삽입한 pG.oriPP9.hRunx2.EBNA1 을 나타낸다). 2 × 10⁵ 개의 인간 치육 선유아 세포 (Gin-1) 를 도 1 의 실험과 동일한 통상 배지 (100 U/㎖ Penicillin 그리고 100 ㎍/㎖ Streptomycin 을 함유한 1 ％ NEAA 10 ％ FBS DMEM) 에 재현탁하고, 35 ㎜ 디쉬에 파종하여 1 일간 배양하였다. 상기의 4 개의 유전자의 에피소말·벡터의 혼합 (각 0.5 ㎍ 씩), Extreme GENE9 DNA Transfection Regent (6 ㎕) 및 Opti-MEM (200 ㎕) 을 혼화하고, 상기의 세포에 첨가하여 트랜스펙션하였다. 1 일간의 배양 후, 배지를 버리고, 골유도 배지 (통상 배지에 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 10 mM β-Glycerophosphate, 100 nM 덱사메타존 (모두 최종 농도) 을 더한 것) 로 교환하고, 다시 배양하였다. 유전자 도입 14 일 후에 ALP 염색을 시행하였다. 도립 위상차 현미경 이미지를 나타낸다 (b). a 의 도면 중, CAG promoter：CAG 프로모터, polyA：폴리 A 부가 시그널, oriP：에프스타인·바·바이러스 oriP 서열, EBNA1：에프스타인·바·바이러스 Nuclear antigen 1 유전자, KanR：카나마이신 내성 유전자.

(24) 마우스의 골아 세포에 대한 다이렉트·리프로그래밍 (도 27)

마우스의 태자 선유아 세포에, Runx2, Klf4 및 c-Myc 를 갖는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (RKM) 또는 Runx2, Klf4 및 Glis1 을 갖는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (RKG) 을 감염시키고, 그 후 X 일간 배양하였다. 일부의 세포는 감염시키지 않았다. a, 알칼리포스파타아제 (ALP) 염색, 알리자린 레드 S 염색 및 폰·콧사 염색을 실시하였다. 배율은 ×40 이다. b, 세포로부터 RNA 를 채취하고, 기재된 각 유전자의 발현량을 Real-time RT-PCR 해석에 의해 정량하였다. 각 샘플의 mRNA 레벨은 β-액틴 mRNA 레벨에 의해 보정 후, 유전자 비도입 마우스 태자 선유아 세포의 값에 대한 상대치로서 나타내었다. *P < 0.05, **P < 0.01 (유전자 비도입 마우스 태자 선유아 세포에 대한 유의차). ^#P < 0.05, ^##P < 0.01. 값은 평균치 ±S.D. (n = 4)

(25) 인간 정상 치육 선유아 세포주 Gin-1 의 다이렉트·리프로그래밍 (도 28a, b, c)

인간 정상 치육 선유아 세포주 Gin-1 을 35 ㎜ 디쉬에 배양하고, 도 2 와 같이 실험하였다. 도면 중의「＋」는, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 것을, 공란은, 각각의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 것을 나타낸다.

a, 유전자 도입 14 일 후, 세포로부터 RNA 를 회수하고, 오스테오칼신 (흑색 바) 과 오스테오폰틴 (백색 바) 의 mRNA 를 리얼타임 RT-PCR 에 의해 정량하였다. 바는 평균 ±표준 편차. N = 3. *P < 0.05 및 **P < 0.01 (비감염 세포와의 비교).

b, 유전자 도입 14 일 후, 세포로부터 RNA 를 회수하고, 오스테오칼신 (흑색 바) 과 ALP (백색 바) 의 mRNA 를 리얼타임 RT-PCR 에 의해 정량하였다. 바는 평균 ±표준 편차. N = 3. **P < 0.01 (비감염 세포와의 비교).

c, 유전자 도입 28 일 후에, 배양 디쉬로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 2 회 세정을 실시하고, 10 ％ 포르말린으로 고정. 멸균 증류수로 세정한 후, 5 ％ Silver nitrate solution 을 더하여, UV 라이트 하에서 30 분간 가만히 정지시킴. 그 후 멸균 증류수로 세정하고, 5 ％ Thiosulfate solution 을 더하여, 2 분간 반응시켰다. 멸균 증류수로 세정한 후, 육안 및 도립 위상차 현미경으로 관찰하였다.

Osterix ＋ Oct4 ＋ L-Myc 나 Runx2 ＋ Osterix ＋ Oct4 ＋ L-Myc 의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 세포는, 많은 석회화 골기질을 산생한 것을 알 수 있다. 또, Oct4 ＋ L-Myc 의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 세포도, 많은 석회화 골기질을 산생하였다.

(26) 인간 선유아 세포로부터 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 인간 골아 세포의 성상 (도 29a, b)

인간 치육 선유아 세포 (Gin-1) 에, 인간의 Runx2, Osterix, Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4L), 또는 Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (Oct4L) 을 감염시켜, 14 일간 배양하였다. (-) 는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 치육 선유아 세포 Gin-1 이다. 또 인간 골아 세포로서, Lonza Walkersville, Inc. 로부터 구입한 NHost 세포를 사용하였다. 도 15b ∼ e 와 동일하게, 세포로부터 ISOGEN II (Nippon Gene) 를 사용하여 RNA 를 회수하고, ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO) 를 사용하여 역전사를 실시하였다. 각각의 유전자에 특이적인 프라이머 (도 29b 에 나타낸다) 와 Real-time PCR Master Mix (TOYOBO) 를 사용하고, 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems) 을 사용하여 real-time RT-PCR 해석을 실시하였다. 결과를 도 29a 에 나타낸다. 각 샘플의 mRNA 레벨은, β-액틴 mRNA 레벨에 의해 보정 후, 인간 치육 선유아 세포의 값에 대한 상대치로서 나타내었다. *P < 0.05 및 **P < 0.01, (유전자 비도입 인간 치육 선유아 세포 (Gin-1) 에 대한 유의차). ^#P < 0.05, ^##P < 0.01. 값은 평균치 ±S.D. (n = 4). ROOct4L 을 감염시킨 세포도 Oct4L 을 감염시킨 세포도, 골아 세포 특이적인 유전자를 발현시킨다.

(27) 인간 선유아 세포로부터 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 골아 세포의 망라적 유전자 발현 프로파일 (도 30)

RNA 를 이하의 세포로부터 회수하였다. dOBs：인간 치육 선유아 세포 (Gin-1) 에, 인간의 Runx2, Osterix, Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4L) 을 감염시켜 유도한 골아 세포. Fibroblasts：감염시키지 않은 치육 선유아 세포 Gin-1. Osteoblasts：Lonza Walkersville, Inc. 로부터 구입한 인간 골아 세포 (NHost 세포). Affymetrix 사의 GeneChip (등록 상표) human Gene 1.0 ST 를 사용하여 망라적 유전자 발현 해석을 실시하였다. MSCs：인간 골수 간엽계 간세포. MSC-OBs：인간 골수 간엽계 간세포를 골아 세포 배지에서 배양하여 유도한 골아 세포. a), Fibroblasts 와 비교하여 발현량이 2 배보다 크게 증가 및 감소한 유전자의 Heat map 과 클러스터 해석 결과. b), 전체 유전자의 Heat map. 이들 결과로부터, dOBs 의 유전자 발현 프로파일은, 원래의 선유아 세포와는 크게 상이하고, 골아 세포에 유사한 것을 알 수 있다. 또 dOBs 와 골아 세포의 유사성은, MSC-OBs 와 골아 세포의 유사성보다 높다.

(28) 다이렉트·리프로그래밍의 효율은 약 80 ％ 이다. (도 31)

A), 인간 치육 선유아 세포 (Gin-1) 에 Runx2, Osterix, Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4L) 을 감염 후 21 일간 배양하여 유도한 골아 세포 (dOBs) 를 항인간 오스테오칼신 및 Alexa fluor 488 표지 2 차 항체와 DAPI 로 염색하였다. DAPI 는 모든 세포의 핵을 물들이지만, DAPI 양성인 세포의 대부분이 오스테오칼신을 산생하는 것을 알 수 있다. b), 상기의 오스테오칼신 (＋) DAPI (＋) 세포 수와 DAPI (＋) 세포 수를 카운트하였다. 오스테오칼신 산생 세포율 = 오스테오칼신 (＋) DAPI (＋) 세포 수/DAPI (＋) 세포 수 × 100 으로 하여 계산하였다. 약 80 ％ 의 선유아 세포가 골아 세포에 convert 된 것을 알 수 있다. means ±S.D. (n = 5). **P < 0.01.

(29) 인간 선유아 세포로부터 골아 세포에 대한 리프로그래밍은, 다능성 간세포 유사의 단계를 거치지 않고 직접적인 conversion 이다 (도 32)

인간 치육 선유아 세포 (Gin-1) 에 Runx2, Osterix, Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4L) 을 감염시켰다. 감염 후 day 1 에서 day 15 까지 1 일 간격으로, 세포를 파라포름알데히드로 4 ℃, 30 분간 고정시켰다. 0.2 ％ Triton X-100 로 실온에서 15 분간 permeabilize 한 후, 항 Nanog 항체와 Alexa fluor 488 표지 2 차 항체와 DAPI 에 의해 염색하였다. 형광 현미경으로 관찰하고, 각 샘플마다 1,000 개 이상의 DAPI 양성 세포를 관찰한 결과, Nanog 양성인 세포는 어느 시점에서도 0 개였다. 전형적인 형광 현미경 이미지를 나타낸다 (배율은 ×100). 포지티브 컨트롤로서, 인간 iPS 세포도 동일하게 염색한 결과, 모든 세포에서 강력한 Nanog 의 발현을 확인하였다.

(30) 인간 정상 피부 선유아 세포로부터 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 골아 세포의 캐리어 타입에 이상은 없다 (도 33)

인간 선유아 세포에 Runx2, Osterix, Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4L) 을 감염시켰다. 14 일 후, Karyotype 해석을 실시한 결과, 정상의 Karyotype 이 나타났다.

(31) 인간 선유아 세포에, 간엽계 간세포 (MSCs) 의 혼입은 없다 (도 34)

인간 치육 선유아 세포 (Gin-1), 및 포지티브 컨트롤로서 인간 지방 조직 유래 간엽계 간세포 MSC 를 이하의 배지 내에서 각각 배양하였다. 지방 세포로 분화 유도시키는 배지 (좌), 골아 세포로 분화 유도시키는 배지 (중앙), 및 연골 세포로 분화 유도시키는 배지 (우). 21 일간 배양 후, Oil O Red 염색 (좌), Alizarin Red S 염색 (중앙), Alcian blue 염색 (우) 을 실시하였다. MSC 로부터와 상이하게, Gin-1 로부터는, 지방 세포, 골아 세포, 연골 세포로 분화된 세포는 전혀 확인되지 않았다.

이것으로부터, 선유아 세포에 MSCs 가 혼입되어 있었으므로 그 MSCS 로부터 골아 세포가 분화되었다는 가능성을 배제할 수 있다.

(32) 인간 선유아 세포로부터 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 인간 골아 세포의 성상 (도 35)

인간 정상 피부 선유아 세포에, 인간의 Runx2, Osterix, Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4L), 또는 Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (Oct4L) 을 감염시켜 배양하였다. (-) 는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 정상 피부 선유아 세포이다. 유전자 도입 후 14 일 후에, ALP 염색을 도 5 와 동일한 방법으로 실시하였다. 또 유전자 도입 후 28 일 후에, Alizarin red S 염색을 도 14 와 동일한 방법으로 실시하였다. 또 유전자 도입 후 28 일 후에, von Kossa 염색을 도 8 과 동일한 방법으로 실시하였다.

(33) 인간 선유아 세포로부터 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 인간 골아 세포의 성상 (도 36)

인간 정상 피부 선유아 세포에, 인간의 Runx2, Osterix, Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (ROOct4L), 또는 Oct4 와 L-Myc 의 유전자를 각각 포함하는 레트로바이러스 벡터의 혼합 (Oct4L) 을 감염시켜 배양하였다. 도 15b ∼ e 와 동일하게, 세포로부터 ISOGEN II (Nippon Gene) 를 사용하여 RNA 를 회수하고, ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO) 를 사용하여 역전사를 실시하였다. 각각의 유전자에 특이적인 프라이머 (도 25 에 나타낸다) 와 Real-time PCR Master Mix (TOYOBO) 를 사용하고, 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems) 을 사용하여 real-time RT-PCR 해석을 실시하였다. 각 샘플의 mRNA 레벨은, β-액틴 mRNA 레벨에 의해 보정 후, 인간 정상 피부 선유아 세포의 값에 대한 상대치로서 나타내었다. **P < 0.01, (유전자 비도입 인간 정상 피부 선유아 세포에 대한 유의차). 값은 평균치 ±S.D. (n = 4).

ROOct4L 을 감염시킨 인간 정상 피부 선유아 세포도 Oct4L 을 감염시킨 인간 정상 피부 선유아 세포도, 골아 세포 특이적인 유전자를 발현시킨다.

(34) 인간 정상 치육 선유아 세포로부터 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 인간 골아 세포의 성상 (도 37)

인간 선유아 세포, 및 인간 선유아 세포에 ROOct4L 을 도입 후 배양하여 유도한 골아 세포 (dOBs) 를 도 18 과 동일하게, NOD/SCID 마우스의 대퇴골의 인위적 골결손부에 이식하였다. 3 주일 후, 대퇴골을 채취하고, 조직 절편 제조하고, HE 염색을 실시하였다. 그 조직 이미지로부터, 결손을 제조한 영역의 장축 방향의 거리와, 그 중의 화골이 형성되어 있던 거리를 계측하고, ％ of callus formation 를 이하의 수학식으로 구하였다. ％ of callus formation = 결손을 제조한 영역의 장축 방향의 거리에서 차지하는, 화골이 형성되어 있던 거리의 비율 (％). 값은 평균치 ±S.D. **P < 0.01.

(35) dOBs 는 생체 내에 이식 후, 골기질을 산생함으로써, 직접 골재생에 공헌하였다 (도 38)

인간 정상 치육 선유아 세포에 ROOct4L 을 도입 후 배양하여 유도한 골아 세포 (dOBs) 에, 레트로바이러스 벡터에 의해 GFP 유전자를 도입하였다. 이것들을 도 18 과 동일하게, NOD/SCID 마우스의 대퇴골의 인위적 골결손부에 이식하였다 (우). 네거티브 컨트롤로서, NOD/SCID 마우스의 대퇴골의 인위적 골결손부에 마트리겔만을 이식하였다 (좌). 3 주일 후, 대퇴골을 채취하고, 조직 절편을 제조하고, 항인간 오스테오칼신 항체 (마우스 OC 에는 반응하지 않는다) 및 DAPI 의 면역 염색을 실시하였다. dOBs 이식군에서는, 골결손부에 저명한 화골 형성이 확인되고, 이식된 dOBs 의 생착이 화골부의 골 주위에 보여진다. 또 화골 부위 및 화골부의 골 주위에 인간 오스테오칼신을 확인한다. 이들 점에서, 이식된 인간 dOBs 가, 생리적인 골재생과 마찬가지로 화골부의 골 주위에 생착되는 것을 알 수 있다. 또 dOBs 가, 산생된 인간 골기질에 의해, 직접 화골 형성에 공헌한 것을 알 수 있다.

(36) 플라스미드 벡터에 의한 유전자 도입에 의해, 인간 선유아 세포를 골아 세포에 리프로그래밍할 수 있다 (도 39a, b)

플라스미드 벡터, pCX.OXL (도 39a) 를 이하와 같이 구축하였다. Oct4, Osterix, L-myc 의 3 개의 유전자가, N 끝에서부터 이 순서로 연결되고, 또한 Oct4 와 Osterix 사이와 Osterixd 와 L-myc 사이에는 self cleaving 2A 펩티드가 삽입되어 있는 것과 같은, 키메라 단백의 발현 유닛을 플라스미드 벡터 pCX 에 삽입하였다. 이 pCX.OXL 을 일렉트로포레이션 (Neon) (중앙) 또는 리포펙션 (X-treme Gene 9) (우) 법에 의해, 인간 정상 피부 선유아 세포에 도입하고, 28 일간 유도 배지에서 배양하였다. 이들 세포, 및 유전자를 도입하지 않은 인간 정상 피부 선유아 세포 (좌) 를 Aalizarin Red S (상) 와 von Kossa 염색 (하) 에 제공하였다 (도 39b). 플라스미드 벡터에 의한 유전자 도입에 의해 Oct4, Osterix, L-myc 의 3 인자를 도입함으로써, 선유아 세포가 미네랄 화골 기질을 대량으로 산생하는 골아 세포에 convert 된 것을 알 수 있었다.

(37) 플라스미드 벡터에 의한 유전자 도입에 의해, 인간 선유아 세포를 골아 세포에 리프로그래밍할 수 있다 (도 40a, b)

플라스미드 벡터, pCX.XLO (도 40a) 를 이하와 같이 구축하였다. Osterix, L-myc, Oct4 의 3 개의 유전자가, N 끝에서부터 이 순서로 연결되고, 또한 Osterix 와 L-myc 사이와 L-myc 와 Oct4 사이에는 self cleaving 2A 펩티드가 삽입되어 있는 것과 같은, 키메라 단백의 발현 유닛을 플라스미드 벡터 pCX 에 삽입하였다. pCX.XLO 와 pCX.OXL (도 39a) 을 인간 정상 피부 선유아 세포에, 일렉트로포레이션 (Neon) 법에 의해 도입하고, 28 일간 유도 배지에서 배양하였다. 이들 세포, 및 유전자를 도입하지 않은 인간 정상 피부 선유아 세포 (좌) 를 Alizarin Red S 염색에 제공한 (도 40b) 플라스미드 벡터에 의해 Oct4, Osterix, L-myc 의 3 인자를 도입한 경우, 발현 유닛 내에서의 3 개의 유전자의 나열 순서에 따라, 골아 세포에 convert 되는 효율이 상이한 것을 알 수 있었다. pCX.OXL 이 pCX.XLO 보다 효율이 높았다.

(38) 이종 단백을 첨가하지 않은 배지에서, 인간 선유아 세포를 골아 세포에 리프로그래밍할 수 있다 (도 41)

도 39a 에서 구축한 pCX.OXL 을 인간 정상 피부 선유아 세포에, 일렉트로포레이션 (Neon) 법에 의해 도입하였다. 그 후, 소 태자 혈청을 첨가하지 않고 인간 혈청을 2 ％ 첨가한 골유도 배지에서 배양하였다. 5 일 후, ALP 염색을 도 5 와 동일한 방법으로 실시하였다 (도 41). 이종 단백을 첨가하지 않은 배지에서, 인간 선유아 세포를 골아 세포에 리프로그래밍할 수 있는 것을 알 수 있다.

(39) 이종 단백을 첨가하지 않은 배지에서, 인간 선유아 세포로부터 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 인간 골아 세포는, 동결 보존이 가능하다 (도 42)

도 39 에서 구축한 pCX.OXL 을 인간 정상 피부 선유아 세포에, 일렉트로포레이션 (Neon) 법에 의해 도입하였다. 14 일간 배양 후, 일부의 세포는 액체 질소로 동결시키고, 냉각기 내에서 -80 ℃ 에서 보존하고, 그 다음날 해동하고 나서, 추가로 5 일간 배양을 계속하였다 (우). 다른 일부의 세포는 동결 융해를 하지 않고 배양하였다 (중앙). 이들 세포, 및 유전자를 도입하지 않은 인간 정상 피부 선유아 세포 (좌) 를 WST8 을 사용한 테트라졸륨염 에세이에 제공하고, 세포의 viability 를 정량하였다 (도 42). 인간 선유아 세포로부터 다이렉트·리프로그래밍에 의해 유도된 골아 세포는, 동결 융해를 실시해도 viability 에 큰 저하는 없는 것을 알 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> KYOTO PREFECTURAL PUBLIC UNIVERSITY CORPORATION <120> Osteoblast cells and method for producing the same <130> P14-091 <150> JP 2013-156025 <151> 2013-07-26 <150> JP2014-012441 <151> 2014-01-27 <160> 44 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer for osteocalcin <400> 1 gtgtatttgg tagttatagt tatttgg 27 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer for osteocalcin <400> 2 cctcaaatta aacactaact aaactc 26 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward Primer for hRunx2 <400> 3 atcccagtgt ggtggtacgg gcccaccatg cgtattcccg tagat 45 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse Primer for hRunx2 <400> 4 tagcgaccgg cgctcagctg ggaggcccta atatggtcgc caaac 45 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward Primer for hOsterix <400> 5 atcccagtgt ggtggtacgg gctcaggatg gcgtcctccc tgctt 45 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse Primer for hOsterix <400> 6 tagcgaccgg cgctcagctg gcccggctca gatctccagc aagtt 45 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward Primer for hDlx5 <400> 7 atcccagtgt ggtggtacgg gatgacagga gtgtttgaca ga 42 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse Primer for hDlx5 <400> 8 tagcgaccgg cgctcagctg gctaatagag tgtcccggag gc 42 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hRunx2 <400> 9 gtccgccgac accagactaa g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hRunx2 <400> 10 agcctgcagc ccggcaaaat g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hRunx2 <400> 11 aacttcctgt gctcggtgct g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hRunx2 <400> 12 aattaaagtt acagtagatg g 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hRunx2 <400> 13 atgaccagtc ttacccctcc t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hRunx2 <400> 14 aatgcactat ccagccacct t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hRunx2 <400> 15 aatggcagca cgctattaaa t 21 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hOsterix <400> 16 cacgtgaagg ctgccgaccc cggg 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hOsterix <400> 17 gtgacctttc agcctccaaa acca 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hOsterix <400> 18 aacactccta ctccatggtg ggat 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hOsterix <400> 19 acggggtgca agcactgggg gtag 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hOsterix <400> 20 agttcacctg cctgctctgc tcca 24 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hDlx5 <400> 21 ttactaacag cccctctctc c 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hDlx5 <400> 22 agaagggtcc ccagcatccg a 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hDlx5 <400> 23 acaaccgcgt cccaagcgcc a 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for Sequencing pMXs.hDlx5 <400> 24 accctcatgc ccaccctccg a 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward Primer for hOC <400> 25 tgagagccct cacactcctc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse Primer for hOC <400> 26 acctttgctg gactctgcac 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward Primer for hBSP <400> 27 caatctgtgc cactcactgc 20 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse Primer for hBSP <400> 28 cagtcttcat tttggtgatt gc 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward Primer for hREX-1 <400> 29 ggatctccca cctttccaag 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse Primer for hREX-1 <400> 30 gcaggtagca cacctcctg 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward Primer for hNanog <400> 31 atgcctcaca cggagactgt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse Primer for hNanog <400> 32 cagggctgtc ctgaataagc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for hOC <400> 33 tgagagccct cacactcctc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for hOC <400> 34 acctttgctg gactctgcac 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for hBSP <400> 35 caatctgtgc cactcactgc 20 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for hBSP <400> 36 cagtcttcat tttggtgatt gc 22 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for hALP <400> 37 cctgccttac taactcctta gtgc 24 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 38 cgttggtgtt gagcttctga 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for hCOL1A <400> 39 ctggagaggc tggtactgct 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for hCOL1A <400> 40 agcaccaaga agaccctgag 20 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for endogenous Runx2 <400> 41 ctatgcgtat tcccg 15 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for endogenous Runx2 <400> 42 gggctcacgt cgctcattt 19 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for endogenous Osterix <400> 43 cagctctctc catctgcctg g 21 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for endogenous Osterix <400> 44 gggactggag ccatagtgaa ct 22

Claims

인비트로에서 포유 동물의 체세포에 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물을 도입함으로써, 상기 체세포로부터 골아 세포를 조제하는 방법으로서,
골아 세포는 iPS 세포나 ES 세포를 경유하지 않고 직접 체세포로부터 유도되는 것을 특징으로 하고,
체세포에 도입되는 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물이 Oct4L, Oct4M 또는 Oct4LM (여기서, M 은「c-Myc」를 나타내고, L 은「L-Myc」를 나타낸다) 인, 방법.
삭제
인비트로에서 포유 동물의 체세포에 골관련 유전자 또는 그 발현 산물과 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물을 도입함으로써, 상기 체세포로부터 골아 세포를 조제하는 방법으로서,
골아 세포는 iPS 세포나 ES 세포를 경유하지 않고 직접 체세포로부터 유도되는 것을 특징으로 하고,
리프로그래밍 관련 유전자가 Oct 패밀리를 포함하고,
체세포에 도입되는 골관련 유전자 또는 그 발현 산물과 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물의 조합이, RD Oct4L, D Oct4ML, OD Oct4L, O Oct4ML, O Oct4L, O Oct4M, OD Oct4, D Oct4L, RO Oct4L, D Oct4M, O Oct4, 및 D Oct4 (여기서, R 은「Runx2」를 나타내고, O 는「Osterix」를 나타내고, D 는「Dlx5」를 나타내고, M 은「c-Myc」를 나타내며, L 은「L-Myc」를 나타낸다) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 조합인, 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 체세포가 선유아 세포 또는 치육 세포인, 방법.
리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물을 포함하는, 포유 동물의 체세포를 골아 세포로 컨버트하기 위한 조성물로서,
골아 세포는 iPS 세포나 ES 세포를 경유하지 않고 직접 체세포로부터 유도되는 것을 특징으로 하고,
상기 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물이 Oct4L, Oct4M 또는 Oct4LM (여기서, M 은「c-Myc」를 나타내고, L 은「L-Myc」를 나타낸다) 인, 조성물.
삭제
골관련 유전자 또는 그 발현 산물과 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물을 포함하는, 포유 동물의 체세포를 골아 세포로 컨버트하기 위한 조성물로서,
골아 세포는 iPS 세포나 ES 세포를 경유하지 않고 직접 체세포로부터 유도되는 것을 특징으로 하고,
리프로그래밍 관련 유전자가 Oct 패밀리를 포함하고,
상기 골관련 유전자 또는 그 발현 산물과 리프로그래밍 관련 유전자 또는 그 발현 산물의 조합이, RD Oct4L, D Oct4ML, OD Oct4L, O Oct4ML, O Oct4L, O Oct4M, OD Oct4, D Oct4L, RO Oct4L, D Oct4M, O Oct4, 및 D Oct4 (여기서, R 은「Runx2」를 나타내고, O 는「Osterix」를 나타내고, D 는「Dlx5」를 나타내고, M 은「c-Myc」를 나타내며, L 은「L-Myc」를 나타낸다) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 조합인, 조성물.
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