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CN111849879A - 一种细胞培养基及细胞培养方法 - Google Patents

一种细胞培养基及细胞培养方法 Download PDF

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CN111849879A
CN111849879A CN202010790173.3A CN202010790173A CN111849879A CN 111849879 A CN111849879 A CN 111849879A CN 202010790173 A CN202010790173 A CN 202010790173A CN 111849879 A CN111849879 A CN 111849879A
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fibroblasts
serum
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张娇
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Abstract

本申请提供一种细胞培养基及细胞培养方法。细胞培养基包括培养液、角蛋白颗粒和血清，其中，所述血清为牛血清或自体血清。本申请提供的细胞培养基，可以从营养、凋亡、空间三个方面发挥作用，促进细胞的增殖和生长，提高细胞的增殖数量和成活率，提高细胞的培养效果。本申请提供提供的细胞培养方法，分别采用本申请所述的细胞培养基对成纤维细胞进行原代培养和传代培养，可以有效提高成纤维细胞的增殖数量和成活率，提高成纤维细胞的培养效果。

Description

一种细胞培养基及细胞培养方法
技术领域
本申请涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种细胞培养基及细胞培养方法。
背景技术
成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁形的星状，具有突起。自体真皮成纤维细胞注射移植是整形外科治疗凹陷和填充皱纹的一种新型方法，对于上述方法而言，前期工作培养足够数量的成纤维细胞是至关重要的。
目前，在成纤维细胞的培养过程中采用的培养基通常有两种，其一是采用含有牛血清的培养基对成纤维细胞进行培养，但是，牛血清的加入会带来异种血清免疫原性、携带的病原体和伦理学等众多相关问题；其二是采用无血清培养基对成纤维细胞进行培养，然而由于血清可以提供细胞生长所需的营养元素、激素以及细胞因子等，是细胞生长过程中不可或缺的一部分，血清的缺少必然会影响成纤维细胞的生长情况、增殖效率、保存情况以及应用范围。
此外，在培养完成后，增殖的成纤维细胞通常会黏附于培养皿或培养瓶的表面，如此易导致增殖的成纤维细胞成活率低，并且培养皿或培养瓶的表面面积有限，会限制成纤维细胞的增殖数量。
在现有技术中，有时候，人们会使用一些人工的组织工程架，这些结构整体体积比较大，需要用大烧杯或培养瓶之类的容器，无法使用培养皿等体积小的培养器，造成了实验室操作中的极大不便；而且这些结构对于细胞的成活率等没有任何的改善作用，甚至在很多操作中还会降低细胞的成活率，且还大大增加了操作的繁杂程度。因此，使用中存在很多的限制和不足。
因此，如何在提高成纤维细胞的增殖数量的同时，提高成纤维细胞的成活率、保证成纤维细胞的培养效果成为了亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本申请实施例提供了一种药物组合物及其应用，以解决现有技术中存在的技术缺陷。
本申请提供一种细胞培养基，包括：培养液、角蛋白颗粒和血清，其中，所述血清为牛血清或自体血清。
进一步地，所述血清的浓度为2％-5％，所述角蛋白颗粒在所述细胞培养基中的浓度为0.1-1％，所述角蛋白颗粒的粒径为20-40μm。
进一步地，所述细胞培养基，还包括壳聚糖，所述壳聚糖在所述细胞培养基中的浓度为0-1％。
进一步地，所述细胞培养基，还包括胶原蛋白，所述胶原蛋白在所述细胞培养基中的浓度为0-1％。
进一步地，所述培养液为DMEM培养液，该DMEM培养液包括以下质量份数的组分：DMEM干粉90-110份、碳酸氢钠30-50份、青霉素1-5份、链霉素1-5份、HEPES30-50份和L-谷氨酰胺1-5份。
进一步地，所述细胞培养基的酸碱度为5.0-7.2。
进一步地，所述细胞培养基为成纤维细胞的培养基。
本申请还提供一种细胞培养方法，包括：
取出皮肤组织块，对所述皮肤组织块进行冲洗处理后转移至培养皿中，加入消化液，过夜；
对所述皮肤组织块依次进行去皮、消化、离心处理，加入权利要求1-5任意一项所述的细胞培养基悬浮细胞，并将细胞接种在培养皿中，获得原代培养的成纤维细胞；
在所述成纤维细胞扩增达到预设数量的情况下，对所述成纤维细胞进行冲洗、消化、离心处理，加入上述的细胞培养基；
在所述细胞培养基中按照1:2～1:5的比例对所述成纤维细胞进行传代培养。
进一步地，对所述皮肤组织块进行冲洗处理后转移至培养皿中，加入消化液，过夜，包括：
将所述皮肤组织块冲洗3遍，去掉脂肪和血液，转移至培养皿中，加入0.25％中性蛋白酶消化液4℃过夜；
其中，所述0.25％中性蛋白酶消化液通过将中性蛋白酶溶解至磷酸缓冲盐溶液中，并将酸碱度调至7.4获得。
进一步地，对所述皮肤组织块进行消化处理，包括：
在培养皿中加入0.1％Ⅰ型胶原酶消化液，37℃消化；
其中，所述0.1％Ⅰ型胶原酶消化液通过将Ⅰ型胶原酶溶解至磷酸缓冲盐溶液中，并将酸碱度调至7.4获得。
进一步地，在所述成纤维细胞扩增达到预设数量的情况下，对所述成纤维细胞进行冲洗、消化、离心处理，包括：
在所述成纤维细胞扩增至培养皿面积的70％-80％的情况下，弃去上清液，采用磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化至细胞收缩呈圆球形，离心并收集细胞；
其中，所述0.25％胰蛋白酶通过将胰蛋白酶溶解至磷酸缓冲盐溶液中，并将酸碱度调至7.4获得。
本申请提供的细胞培养基，包括培养液、血清和角蛋白颗粒，三者可以形成一个能够满足细胞生长条件的、提高细胞增殖数量和增殖存活率的完整的细胞生长体系，适于细胞的贴壁培养。本申请首次将角蛋白颗粒加入至细胞培养基中，并使其与血清和其他的培养液进行相互配合，该角蛋白颗粒可以为细胞的生长提供足够的粘附空间，使细胞在角蛋白颗粒的三维空间中粘附生长，而培养液和血清可以在角蛋白颗粒外形成细胞生长屏障，提供细胞生长所需的营养物质，延长细胞的形态维持时间，抑制细胞毒作用，减少细胞凋亡，促使细胞增值旺盛，改善细胞的生长状况，从而提高细胞的增殖数量和成活率。更重要的是，角蛋白颗粒其本身为天然的生物活性蛋白结构，其一方面可与培养基中的其他组分作用实现上述的提供空间等等作用，而且其还能与其它组分配合实现营养供给等作用，该角蛋白颗粒对于在其内生长的细胞具有明显的辅助增加细胞生长和成活率的作用。所以，本实施例提供的细胞培养基，特别是角蛋白颗粒的加入，可以从营养、凋亡、空间三个方面发挥协同作用，促进细胞的增殖和生长，提高细胞的增殖数量和成活率，提高细胞的培养效果。
而且，角蛋白颗粒的粒径小，占用空间小，使得培养液可在很小的容器中承装生长，如培养皿等，无需占用很大的容器，导致配置于培养箱时带来很大的不便。为研究人员的日常操作带来很大的便利，且使得培养箱等有效利用率大大提高。
此外，本实施例提供的培养基，还可以包括壳聚糖和/或胶原蛋白，壳聚糖可以溶解于包含培养液、血清和角蛋白颗粒的培养基中，能够与培养液、血清、角蛋白颗粒相互作用释放氨基，进而结合细菌上的负电子抑制细菌活性，为细胞生长提供无菌环境，胶原蛋白同样可以与培养基中的培养液、血清和角蛋白颗粒相互作用，为细胞生长提供所需营养物质。特别是角蛋白颗粒可以与壳聚糖、胶原蛋白之间能够相互配合产生正向协同作用，有助于提高细胞活性，为细胞提供充足的营养与适宜的生长条件。所以壳聚糖、胶原蛋白与培养液、血清、角蛋白颗粒可以从抑菌、营养、生长、凋亡、空间五个方面发挥协同作用，一同构建有利于细胞生长和增殖的胞外环境，构建独特的细胞生长体系，更适合细胞贴壁生长，进一步提高细胞培养质量。
本申请提供提供的细胞培养方法，采用本申请所述的细胞培养基对成纤维细胞进行原代培养和传代培养，可以有效提高成纤维细胞的增殖数量和成活率，提高成纤维细胞的培养效果。
附图说明
图1是本申请一实施例的细胞培养方法的步骤流程示意图；
图2是本申请一试验例的第三代成纤维细胞培养状态观察图；
图3是本申请一试验例的成纤维细胞培养状态图；
图4是本申请一试验例的成纤维细胞光密度吸收值柱状对比图；
图5是本申请一试验例的对照组成纤维细胞培养状态观察图；
图6是本申请一试验例的试验组成纤维细胞培养状态观察图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请的具体实施方式进行描述。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试剂、材料和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
原代培养：是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。
传代培养：是指需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养皿或培养瓶内，再进行培养的过程。传代培养中的细胞传代培养(subculture)，当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
S期：即DNA合成期，又称DNA复制期。在这时期DNA含量增加一倍同时也有新的组蛋白合成，与DNA合成有关的酶，组蛋白及其mRNA的含量达到最高点。真核细胞新合成的DNA立刻与组蛋白结合共同组成核小体结构。一般情况下，细胞一旦进入S期，细胞分裂就会继续进行下去，直到下一周期的G1期。
G1期：是一个细胞周期的第一阶段。上一次细胞分裂之后，产生两个子代细胞，标志着G1期的开始。G1期，代谢旺盛，开始合成细胞生长需要的各种蛋白质，糖类，脂类、RNA等生化物质，细胞体积增大，为DNA合成做好准备，因此G1期也叫DNA合成预备期或复制前期。
MTT法：又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等，灵敏度高。
Vimentin免疫组织化学染色法：波形蛋白(Vimentin)是分布于间质细胞、黑色素细胞和朗罕氏细胞中的一种细胞膜表面抗原，成纤维细胞染色可呈特异性阳性免疫反应。
实施例1
本实施例提供一种细胞培养基，包括：培养液、角蛋白颗粒和血清，其中，所述血清为牛血清或自体血清。
其中，培养液优选为DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养液，在本实施例所述的细胞培养基中加入培养液，其含有丰富的营养物质，可以为细胞提供生长所需营养元素，为细胞提供适宜的生长环境。
具体地，培养液优选包括以下质量份数的组分：DMEM干粉90-110份、碳酸氢钠30-50份、青霉素1-5份、链霉素1-5份、HEPES 30-50份和L-谷氨酰胺1-5份。
在实际应用中，DMEM干粉的质量份数可以为90份、95份、100份、105份、110份等，优选为100份；碳酸氢钠的质量份数可以为30份、35份、40份、45份、50份等，优选为37份；青霉素的质量份数可以为1份、2份、3份、4份、5份等，优选为1份；链霉素的质量份数可以为1份、2份、3份、4份、5份等，优选为1份；HEPES的质量份数可以为30份、35份、40份、45份、50份等，优选为35.7份；L-谷氨酰胺的质量份数可以为1份、2份、3份、4份、5份等，优选为3份。
在本实施例中，培养液中的DMEM干粉中含有葡萄糖等丰富的营养物质，可以为细胞的生长和繁殖提供所需营养元素。培养液中的碳酸氢钠可以为细胞的培养提供缓冲系统，调节DMEM培养液的酸碱度，碳酸氢钠还有助于促进细胞对钾元素的吸收，有助于细胞的生长。培养液中的青霉素可以破坏细菌细胞的细胞壁，阻碍细胞壁的合成，导致细菌细胞泄露，进而在细菌细胞的合成期起到杀菌作用。培养液中的链霉素可以作用于细菌细胞的核糖体，阻碍细菌细胞的蛋白翻译，进而起到杀菌的作用。培养液中的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)可以防止培养基酸碱度迅速变动，比如在开放式培养条件下，细胞培养液或培养基脱离了5％CO2的环境，易导致CO2气体迅速逸出，酸碱度迅速升高，此时HEPES可以维持酸碱度值位于7.0左右。培养液中的L-谷氨酰胺是细胞生长的必须氨基酸，是细胞培养过程中的能量来源，可以参与细胞蛋白质的合成和核酸的代谢，有助于细胞的生长和繁殖，更适合细胞贴壁生长。
在本实施例细胞培养基的培养液中，DMEM干粉、碳酸氢钠、青霉素、链霉素、HEPES和L-谷氨酰胺配伍使用，青霉素与链霉素可以基于不同的作用位点，采用不同的方式发挥协同杀菌作用，杀菌效果好，可以有效提高DMEM培养液的杀菌能力；HEPES与碳酸氢钠有助于更加精确的将培养液的酸碱度控制在适宜范围内，有益于细胞的繁殖和生长；碳酸氢钠可以促进细胞对DMEM干粉、L-谷氨酰胺中营养物质的吸收，提高细胞吸收能力，进而促进细胞的高质量培养。
本实施例所述的细胞培养基中还加入了血清，其中，血清为牛血清或自体血清，具体地，血清的浓度优选为2％-5％，如：可以加入2％、3％、4％或5％牛血清，也可加入2％、3％、4％或5％自体血清等均可。
此外，细胞培养基中加入的血清还可以是除自体血清外其他的人血清，本申请对此不做限制。
在细胞培养基中加入牛血清或自体血清，可以有效延长成纤维细胞的形态维持时间，抑制丝裂霉素C的细胞毒作用，减少细胞凋亡，促使细胞增值旺盛，改善细胞的生长状况。牛血清或自体血清的浓度为2％-5％，有益于细胞保持未分化状态，促进细胞的培养。
优选地，细胞培养基中加入2％-5％自体血清可以有效提高细胞的活力，进一步改善细胞的生长状态，更适合细胞贴壁生长，培养效果更为突出。
角蛋白颗粒具有无抗原特性，不会引起淋巴细胞的增殖，不会被免疫系统识别为异物，也不会干扰正常的机体免疫应答，不会干扰细胞的培养。在本实施例所述的特定的细胞培养基中加入角蛋白颗粒，角蛋白颗粒能够组装和聚合成为多孔的纤维支架，并且其中还具有细胞结合单元，有助于待培养的细胞在角蛋白颗粒形成的纤维支架上进行粘附生长，由于通常细胞是在培养皿或培养瓶的表面进行粘附生长，本实施例中加入角蛋白颗粒，使得细胞在角蛋白颗粒形成的三维空间中粘附生长还可以有效节省培养空间，减少细胞收集过程中对细胞造成的损伤，更适合细胞贴壁生长。
更重要的是，角蛋白颗粒其本身为天然的生物活性蛋白结构，其一方面可与培养基中的其他组分作用实现上述的提供空间等等作用，而且其还能与其它组分配合实现营养供给等作用，比如，角蛋白颗粒可以与培养液、血清之间相互配合起到正向协同作用，为细胞不同生长阶段提供不同的营养元素，以提高细胞成活率并改善细胞的培养质量。
本实施例的培养基中加入角蛋白颗粒的浓度为0.1-1％，具体可以为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％等，优选为0.5％，角蛋白颗粒的粒径优选为20-40μm，具体可以为20μm、25μm、30μm、35μm、40μm等，本申请对此不做限制。在此浓度与粒径范围中，角蛋白颗粒与培养液、血清的协同效果最佳。在此条件下，角蛋白颗粒提供空间、供给营养的效果是最好的，且培养基整体的效果也是最好的，如果改变该浓度或粒径，培养基的效果必然会受到影响。所以，角蛋白颗粒的浓度为0.5％、粒径为20-40μm时，其作用最为显著，细胞培养效果最佳。
此外，所述细胞培养基优选呈弱酸性，其酸碱度可以为5.0-7.2，如此可以避免酸度或碱度过高对细胞造成的损坏，提高细胞的增殖速度和成活率，改善细胞培养效果。
在实际应用中，本实施例提供的细胞培养基优选为成纤维细胞培养基。
本实施例提供的细胞培养基，包括培养液、血清和角蛋白颗粒，三者可以形成一个能够满足细胞生长条件的、提高细胞增殖数量和增殖存活率的完整的细胞生长体系，角蛋白颗粒可以为细胞的生长提供足够的粘附空间，使细胞在角蛋白颗粒的三维空间中粘附生长，而培养液和血清可以在角蛋白颗粒外形成细胞生长屏障，提供细胞生长所需的营养物质，延长细胞的形态维持时间，抑制细胞毒作用，减少细胞凋亡，促使细胞增值旺盛，改善细胞的生长状况，从而提高细胞的增殖数量和成活率。所以，本实施例提供的细胞培养基，可以从营养、凋亡、空间三个方面发挥协同作用，促进细胞的增殖和生长，提高细胞的增殖数量和成活率，提高细胞的培养效果。
实施例2
在实施例1的基础上，本实施例提供一种细胞培养基，其还包括壳聚糖和/或胶原蛋白。
壳聚糖是具有生物降解性、细胞亲和性、生物效应，并且含有游离氨基的碱性多糖。壳聚糖在培养液、血清中易于溶解，溶解后的溶液中还含有氨基(NH2 +)，这些氨基可以通过结合负电子抑制细菌的活性，维持细胞生长的安全环境。在本实施例中，壳聚糖的浓度为0-1％，具体地，可以为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％等，可视具体情况而定，本申请对此不做限制，优选为0.3％。
胶原蛋白是生物高分子、动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，其具有良好的生物相容性、生物可降解性和生物活性，胶原蛋白作为重要的胞外基质蛋白添加至细胞培养基中可以与培养液、血清相互作用，支持细胞和组织生长，与培养液、角蛋白颗粒、血清一同形成的胞外环境有利于多种细胞的粘附和生长。在本实施例中，胶原蛋白的浓度为0-1％，具体地，可以为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％等，可视具体情况而定，本申请对此不做限制，优选为0.5％。
本实施例提供的细胞培养基，包括培养液、血清和角蛋白颗粒、壳聚糖、胶原蛋白，五者可以形成一个能够满足细胞生长条件的、提高细胞增殖数量和增殖存活率的完整的细胞生长体系，角蛋白颗粒可以为细胞的生长提供足够的粘附空间，使细胞在角蛋白颗粒的三维空间中粘附生长，而培养液和血清可以在角蛋白颗粒外形成细胞生长屏障，提供细胞生长所需的营养物质，延长细胞的形态维持时间，抑制细胞毒作用，减少细胞凋亡，促使细胞增值旺盛，改善细胞的生长状况，从而提高细胞的增殖数量和成活率。同时壳聚糖在弱酸溶剂中易于溶解，尤其是溶解后的溶液中含有氨基(NH2+)，这些氨基通过结合负电子来抑制细菌。故壳聚糖可以抑制细菌活性，维持细胞生长的安全环境。胶原蛋白是支持细胞和组织生长的重要胞外基质蛋白，其形成的胞外环境有利于多种细胞的粘附、生长。所以，本实施例提供的细胞培养基，可以从抑菌、营养、生长、凋亡、空间五个方面发挥协同作用，促进细胞的增殖和生长，提高细胞的增殖数量和成活率，提高细胞的培养效果。
实施例3
如图1所示，本实施例提供一种细胞培养方法，包括步骤S1至步骤S4。
S1、取出皮肤组织块，对所述皮肤组织块进行冲洗处理后转移至培养皿中，加入消化液，过夜。
具体地，可以将所述皮肤组织块冲洗3遍，去掉脂肪和血液，转移至培养皿中，加入0.25％中性蛋白酶消化液4℃过夜。
其中，所述0.25％中性蛋白酶消化液(DispaseⅡ)通过将中性蛋白酶溶解至磷酸缓冲盐溶液中，并将酸碱度调至7.4获得。
在实际应用中，磷酸盐缓冲溶液(PBS)的酸碱度优选为7.2，磷酸缓冲盐溶液可以包括氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠和磷酸氢钾。
在本实施例中，中性蛋白酶消化液可以提高蛋白质的分解能力，加速细胞之间蛋白质的分解，加入0.25％中性蛋白酶消化液对皮肤组织块进行消化处理，可以有效分解皮肤组织块中细胞之间粘连的蛋白，使皮肤组织块中的细胞分散开，有利于细胞之间进行营养交换，使其充分生长。
S2、对所述皮肤组织块依次进行去皮、消化、离心处理，加入细胞培养基悬浮细胞，并将细胞接种在培养皿中，获得原代培养的成纤维细胞。
优选地，可以在培养皿中加入0.1％Ⅰ型胶原酶消化液，37℃消化，以1500rpm的转速离心15min。
其中，所述0.1％Ⅰ型胶原酶消化液通过将Ⅰ型胶原酶溶解至磷酸缓冲盐溶液中，并将酸碱度调至7.4获得。
在本实施例中，加入0.1％Ⅰ型胶原酶消化液对皮肤组织块再次进行消化处理，可以进一步分解皮肤组织块中细胞之间粘连的蛋白，使皮肤组织块中的细胞更加分散，促进细胞之间的营养交换，提高细胞的生长质量。
细胞培养基包括培养液、牛血清或自体血清以及角蛋白颗粒，优选地细胞培养基中还可以包括壳聚糖和/或胶原蛋白，参见实施例1和实施例2。采用上述细胞培养基对成纤维细胞进行原代培养，可以有效提高成纤维细胞的培养质量，更适合细胞贴壁生长。
需要说明的是，角蛋白颗粒可以通过如下所示的方法制备：
(1)清洗除杂质：室温下，取人发样品中段，蒸馏水反复清洗，晾干；
(2)脱脂：室温下，将清洗干净的人发浸入乙醇脱脂液，1.5h-2h，蒸馏水清洗，干燥；
(3)氯化：加入0.32％NaClO和0.5％稀H2SO4，水浴比1:30，室温反应20分钟，流水冲洗；
(4)漂白：采用室温漂白法，清洗干净的人毛发20-30质量份，加入30％H2O2，焦磷酸钠8g/l，过硫酸钾3g/l，氨水14g/l，浴比1:100,40℃水浴3.5h；
(5)清洗烘干：待人发原料色泽变白后，蒸馏水反复清洗，去除残留物，过滤，烘干；
(6)人发角蛋白颗粒的制备：漂白烘干后的人发，按质量体积比为12-15:100的比例，将人发与生理盐水混合，经碾磨加工8-12h，形成粒径约为20-40μm的人发角蛋白颗粒，钴60辐照灭菌。
S3、在所述成纤维细胞扩增达到预设数量的情况下，对所述成纤维细胞进行冲洗、消化、离心处理，加入细胞培养基。
具体地，可以在所述成纤维细胞扩增至培养皿面积的70％-80％的情况下，弃去上清液，采用磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化至细胞收缩呈圆球形，离心并收集细胞。
其中，所述0.25％胰蛋白酶通过将胰蛋白酶溶解至磷酸缓冲盐溶液中，并将酸碱度调至7.4获得。
在本实施例中，0.25％胰蛋白酶可以使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散，加入0.25％胰蛋白酶对成纤维细胞再次进行消化处理，可以进一步分解成纤维细胞之间粘连的蛋白，使成纤维细胞更加分散，促进成纤维细胞之间的营养交换，提高成纤维细胞的生长质量。
此外，对成纤维细胞进行离心处理，有助于成纤维细胞的收集，减少收集过程中对成纤维细胞造成的损害。
S4、在所述细胞培养基中按照1:2～1:5的比例对所述成纤维细胞进行传代培养。
其中，细胞培养基包括DMEM培养液、2％-5％牛血清或自体血清、角蛋白颗粒、壳聚糖、胶原蛋白。采用上述细胞培养基对成纤维细胞进行传代培养，可以有效提高成纤维细胞的增殖数量和成活率，提高成纤维细胞的传代培养质量。
具体地，在对成纤维细胞进行传代培养时，每隔两天需要更换一次细胞培养基，以保证满足成纤维细胞的生长需求。
本实施例提供提供的细胞培养方法，分别采用本申请所述的细胞培养基对成纤维细胞进行原代培养和传代培养，可以有效提高成纤维细胞的增殖数量和成活率，更适合细胞贴壁生长，提高成纤维细胞的培养效果。
试验例1
本试验例设置试验组1-3，试验组1采用包含DMEM培养液、2％-5％自体血清和0.5％角蛋白颗粒、0.5％壳聚糖、0.5％胶原蛋白的细胞培养基培养成纤维细胞，试验组2采用包含DMEM培养液、2％-5％自体血清的细胞培养基培养成纤维细胞，试验组3采用包含DMEM培养液、10％自体血清和1％角蛋白颗粒、1％壳聚糖、1％胶原蛋白的细胞培养基培养成纤维细胞。
试验组1-3的DMEM培养液均包括低糖型DMEM干粉10.0g(美国GIBACO公司)、碳酸氢钠3.7g(上海虹光化工厂)、青霉素10万U(山东鲁抗医药股份有限公司)、链霉素10万U(山东鲁抗医药股份有限公司)、HEPES3.57g(美国SIGMA公司)和L-谷氨酰胺0.3g(AMRESCO公司)，DMEM培养液的配制步骤包括：加入上述组分，并加入双蒸水900ml，采用5.6％碳酸氢钠调节pH值至7.2，定容至1000ml；采用0.22μm孔径的一次性滤器抽滤除菌，分装100ml/瓶，-20℃保存，获得DMEM培养液。
试验组1-3均采用如下所述的方法进行培养：
(1)取出皮肤组织块，将所述皮肤组织块冲洗3遍，去掉脂肪和血液，转移至培养皿中，加入0.25％中性蛋白酶消化液4℃过夜；
(2)对所述皮肤组织块进行去皮处理，在培养皿中加入0.1％Ⅰ型胶原酶消化液，37℃消化，再进行离心处理，加入细胞培养基悬浮细胞，并将细胞接种在培养皿中，获得原代培养的成纤维细胞；
(3)在所述成纤维细胞扩增至培养皿面积的70％-80％的情况下，弃去上清液，采用磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化液至细胞收缩呈圆球形，离心并收集细胞，加入细胞培养基；
(4)在所述细胞培养基中按照1:2-1:5的比例对所述成纤维细胞进行传代培养。
其中，0.25％中性蛋白酶消化液通过如下步骤制得：将0.25mg中性蛋白酶(德国ROCHE公司)用100ml磷酸盐缓冲溶液溶解，调pH值至7.4，采用0.22μm针头式一次性滤器抽滤除菌，10ml/瓶分装，-20℃保存。
0.1％Ⅰ型胶原酶消化液通过如下步骤制得：将100mgⅠ型胶原酶消化液(美国Sigma公司)用100ml磷酸盐缓冲溶液溶解，调pH值至7.4，采用0.22μm针头式一次性滤器抽滤除菌，10ml/瓶分装，-20℃保存。
0.25％胰蛋白酶消化液通过如下步骤制得：将0.25mg胰蛋白酶(美国Sigma公司)用100ml磷酸盐缓冲溶液溶解，调pH值至7.4，采用0.22μm针头式一次性滤器抽滤除菌，10ml/瓶分装，-20℃保存。
磷酸盐缓冲溶液包括8.0gNaCl、0.2gKCl、3.49gNa2HPO4·12H2O和0.2gKH2PO4，在上述组分中加入双蒸水充分振荡溶解至约950ml，调节pH值至7.2，定容至1000ml，100ml/瓶分装，高压灭菌备用。
在倒置相差显微镜下分别观察试验组1-3的培养情况，结果如图2所示。图2分别是试验组1、2、3的成纤维细胞在原代培养的第3代分别在100倍显微镜、200倍显微镜和400倍显微镜下观察到的图像，可见试验组1-3培养的成纤维细胞，细胞均呈梭形或三角形，核圆居中，含1-3个明显的核仁细胞凸起，伪足呈，细胞形态一致性高。同时，从图中可以看出，试验组1和试验组3的细胞培养基在加入角蛋白颗粒、壳聚糖和胶原蛋白的情况下，成纤维细胞生长状态好，代谢物多，胞核凸起明显，增殖迅速，呈簇状、旋涡状生长，而试验组2的细胞培养基在未加入角蛋白颗粒的情况下，成纤维细胞形态扁平，易老化，伪足多，细胞生长稀疏。
所以，采用本申请提供的细胞培养基培养成纤维细胞，可以为成纤维细胞的生长和增殖提供良好的环境，有效提高成纤维细胞的增殖速度和数量，有效提高成纤维细胞的培养质量。
将试验组1培养得到的成纤维细胞进行波形蛋白(Vimentin)免疫细胞化学染色。其中，波形蛋白(Vimentin)免疫细胞化学染色的步骤如下所示：
染色前准备：用金刚石玻璃切割刀将正常载玻片按长款等份切割成4块面积相当的小载玻片，每小块约1.0×4.0cm2。置入酸缸中浸泡12h以去除载玻片上的异体蛋白，自来水反复冲洗。高温高压消毒后，浸入约含0.01％无菌多聚赖氨酸(poly-l-lysine)溶液中，置超净化工作台内10min，吸出培养皿内多聚赖氨酸溶液，并用大量PBS溶液冲洗3次，暴露于UV下直至干燥。无菌包扎后备用。由第2向第3代传代时，预先在培养瓶中置入预处理好的长条窄型载玻片，继续培养10d，制成细胞爬片。
将爬满细胞的载玻片置入PBS溶液中轻轻漂洗3次，每次1min；将载玻片立刻转入福尔马林固定液中固定5-10min，并制成石蜡切片；捞片，并放入37℃烘箱中烤片10h；在二甲苯溶液中脱蜡15min；在1/2体积乙醇+1/2体积二甲苯混合溶液浸泡5min；而后依次经100％、95％、80％和70％梯度乙醇进行脱水；蒸馏水过洗2min；3％H2O2去离子水孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性；双蒸水冲洗后，用PBS浸泡5min；滴加正常兔血清工作液，室温孵育15min，倾去而非冲洗；滴加1:100稀释比例的一抗50μl，37℃孵育3h；
用PBS冲洗3次，每次3min后，滴加生物素标记兔抗山羊IgG二抗工作液50μl，37℃孵育15min；用PBS冲洗3次，每次3min后，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液50μl，37℃孵育15min；用PBS冲洗3次，每次3min后，加入DAB显色剂工作3min；经自来水充分冲洗后，加入苏木素进行复染；经乙醇梯度脱水后，二甲苯透明处理，滴加中性树胶进行封片。
结果显示成纤维细胞胞浆染成深棕色为阳性，在200倍倒置显微镜下观察染色处理后的成纤维细胞得到图3。从图3中可以看出，采用试验组1所述细胞培养基培养得到的成纤维细胞呈多角形或长梭形，细胞形态好，增殖迅速。
对试验组1-3培养的成纤维细胞进行MTT检测，结果如表1和图4所示。
表1试验组1-3培养的成纤维细胞的光吸收值
Figure BDA0002623487450000101
其中，*表示实验组1和2比较，有统计学差异，即P<0.05；△表示实验组1和3比较，未见统计学差异，即P>0.05。
具体地，光密度值的大小代表细胞染色的深浅，反应细胞的相对浓度，从表1可以看出，试验组1和试验组3的细胞光密度值远大于试验组2的细胞光密度值，说明在培养基中加入角蛋白颗粒、壳聚糖和胶原蛋白可以有效提高成纤维细胞的增殖数量，提高成纤维细胞的培养效果。
采用流式细胞仪分别检测试验组1-3培养的成纤维细胞的生长周期，结果如表2所示。
表2试验组1-3成纤维细胞的生长周期中S期和G1期所占比例
组别 S期 G1期 S/G1
试验组1 59.3％ 26.7％ 2.221<sup>△</sup>
试验组2 34.1％ 42.5％ 0.802**
试验组3 65.8％ 21.4％ 3.074
其中，**表示实验组1和2比较，有统计学差异，即P<0.01；△表示表示实验组1和3比较，未见统计学差异，即P>0.05。
可以看出，对于试验组1和试验组3，人真皮成纤维细胞处于S期和G1期所占比例未见显著差异性(P>0.05)；而试验组2中的人真皮成纤维细胞S期和G1期所占比例明显低于10％和5％血清和角蛋白颗粒、壳聚糖和胶原蛋白的培养基中的S/G1值，P<0.01，说明在细胞培养基中加入角蛋白颗粒可以有效提高成纤维细胞的增殖速率，减少细胞凋亡，促使细胞增殖旺盛。
所以，本申请提供的细胞培养基，包括DMEM培养液、2％-5％牛血清或自体血清和角蛋白颗粒、壳聚糖和胶原蛋白，其中DMEM培养液可以提供细胞生长所需的营养物质，牛血清或自体血清，可以有效延长细胞的形态维持时间，抑制丝裂霉素C的细胞毒作用，减少细胞凋亡，促使细胞增值旺盛，改善细胞的生长状况，角蛋白颗粒可以为细胞的生长提供足够的粘附空间，以提高细胞的增殖数量和成活率。同时壳聚糖在弱酸溶剂中易于溶解，特别值得指出的是溶解后的溶液中含有氨基(NH2+)，这些氨基通过结合负电子来抑制细菌。壳聚糖的抑制细菌活性，维持细胞生长的安全环境。胶原则是支持细胞和组织生长的重要胞外基质蛋白，其形成的胞外环境有利于多种细胞的粘附、生长。所以，本实施例提供的细胞培养基，可以从抑菌、营养、生长、凋亡、空间五个方面发挥协同作用，促进细胞的增殖和生长，提高细胞的增殖数量和成活率，更适合细胞贴壁生长，提高细胞的培养效果。
试验例2
本试验例提供对照组1-9和试验组1-8，对照组1-9和试验组1-8采用的细胞培养基组分如表3所示。
表3对照组1-9和试验组1-8的细胞培养基组分
组别 细胞培养基
对照组1 DMEM培养液
对照组2 DMEM培养液、2％-5％牛血清
对照组3 DMEM培养液、2％-5％人血清
对照组4 DMEM培养液、2％-5％自体血清
对照组5 DMEM培养液、6％-15％自体血清
对照组6 DMEM培养液、2％-5％牛血清、角蛋白粉
对照组7 DMEM培养液、2％-5％人血清、角蛋白粉
对照组8 DMEM培养液、2％-5％自体血清、角蛋白粉
对照组9 DMEM培养液、2％-5％牛血清、组织工程架
试验组1 DMEM培养液、角蛋白颗粒
试验组2 DMEM培养液、2％-5％牛血清、角蛋白颗粒
试验组3 DMEM培养液、2％-5％人血清、角蛋白颗粒
试验组4 DMEM培养液、2％-5％自体血清、角蛋白颗粒
试验组5 DMEM培养液、2％-5％牛血清、角蛋白颗粒、壳聚糖、胶原蛋白
试验组6 DMEM培养液、2％-5％人血清、角蛋白颗粒、壳聚糖、胶原蛋白
试验组7 DMEM培养液、2％-5％自体血清、角蛋白颗粒、壳聚糖、胶原蛋白
试验组8 DMEM培养液、6％-15％自体血清、角蛋白颗粒、壳聚糖、胶原蛋白
对照组1-9和试验组1-8的DMEM培养液均包括低糖型DMEM干粉10.0g(美国GIBACO公司)、碳酸氢钠3.7g(上海虹光化工厂)、青霉素10万U(山东鲁抗医药股份有限公司)、链霉素10万U(山东鲁抗医药股份有限公司)、HEPES3.57g(美国SIGMA公司)和L-谷氨酰胺0.3g(AMRESCO公司)，DMEM培养液的配制步骤包括：加入上述组分，并加入双蒸水900ml，采用5.6％碳酸氢钠调节pH值至7.2，定容至1000ml；采用0.22μm孔径的一次性滤器抽滤除菌，分装100ml/瓶，-20℃保存，获得DMEM培养液。
角蛋白颗粒可以以人发为原料，将人发进行脱脂、氯化、漂白，反复清洗、烘干处理后，再经机械加工制成粒径20-40μm的角蛋白颗粒，并采用钴60灭菌备用。
角蛋白可以以上述角蛋白颗粒为原料，将其研磨成粉状即可，角蛋白粉的粒径为20-40um。
对照组1-8和试验组1-5均采用如下所述的方法进行培养：
(1)取出皮肤组织块，将所述皮肤组织块冲洗3遍，去掉脂肪和血液，转移至培养皿中，加入0.25％中性蛋白酶消化液4℃过夜；
(2)对所述皮肤组织块进行去皮处理，在培养皿中加入0.1％Ⅰ型胶原酶消化液，37℃消化，再进行离心处理，加入细胞培养基悬浮细胞，并将细胞接种在培养皿中，获得原代培养的成纤维细胞；
(3)在所述成纤维细胞扩增至培养皿面积的70％-80％的情况下，弃去上清液，采用磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化液至细胞收缩呈圆球形，离心并收集细胞，加入细胞培养基；
(4)在所述细胞培养基中按照1:2～1:5的比例对所述成纤维细胞进行传代培养。
其中，0.25％中性蛋白酶消化液通过如下步骤制得：将0.25mg中性蛋白酶(德国ROCHE公司)用100ml磷酸盐缓冲溶液溶解，调pH值至7.4，采用0.22μm针头式一次性滤器抽滤除菌，10ml/瓶分装，-20℃保存。
0.1％Ⅰ型胶原酶消化液通过如下步骤制得：将100mgⅠ型胶原酶消化液(美国Sigma公司)用100ml磷酸盐缓冲溶液溶解，调pH值至7.4，采用0.22μm针头式一次性滤器抽滤除菌，10ml/瓶分装，-20℃保存。
0.25％胰蛋白酶消化液通过如下步骤制得：将0.25mg胰蛋白酶(美国Sigma公司)用100ml磷酸盐缓冲溶液溶解，调pH值至7.4，采用0.22μm针头式一次性滤器抽滤除菌，10ml/瓶分装，-20℃保存。
磷酸盐缓冲溶液包括8.0gNaCl、0.2gKCl、3.49gNa2HPO4·12H2O和0.2gKH2PO4，在上述组分中加入双蒸水充分振荡溶解至约950ml，调节pH值至7.2，定容至1000ml，100ml/瓶分装，高压灭菌备用。
在倒置相差显微镜下分别观察对照组和试验组的培养情况，结果如图5、图6所示。
图5是对照组成纤维细胞培养情况图，图6是试验组成纤维细胞培养情况图。可以看出，试验组的细胞生长情况明显优于对照组的细胞生长情况，说明细胞培养基在加入角蛋白颗粒、壳聚糖和胶原蛋白的情况下，成纤维细胞生长状态好，代谢物多，增殖迅速，而细胞培养基在未加入角蛋白颗粒的情况下，成纤维细胞生长状态较差，易老化，伪足多，细胞生长稀疏。经过试验组2与对照组9的对比，可以明显看出，在培养基的其他成分完全相同的情况下，相对于采用组织工程架对细胞进行培养而言，采用角蛋白颗粒可以显著改善细胞的生长状态和细胞的培养质量。试验组2-8相对于对照组2-4、6-8细胞生长状态均得以显著改善，其中试验组7和8的细胞生长状态最好，说明在细胞培养基中加入2％-5％自体血清的效果优于加入相同浓度的牛血清、人血清以及高浓度的自体血清，同时与6-15％血清浓度培养效果无明显差异。本申请提供的细胞培养基及细胞培养方法有助于提高细胞的培养效果，改善细胞的培养质量更适合细胞贴壁生长。
对于对照组1-9和试验组1-8培养的成纤维细胞进行MTT检测，结果如表4所示。
表4对照组1-9和试验组1-8培养的成纤维细胞的光吸收值对照表
Figure BDA0002623487450000131
可以看出，试验组的细胞光密度值远大于对照组的细胞光密度值，说明细胞培养基在加入角蛋白颗粒、壳聚糖和胶原蛋白的情况下，成纤维细胞的增殖迅速，增殖数量多，而细胞培养基在未加入角蛋白颗粒、壳聚糖和胶原蛋白的情况下，成纤维细胞增殖缓慢，细胞生长稀疏；试验组7的细胞光密度值最大，说明在细胞培养基中加入2％-5％自体血清的效果优于加入相同浓度的牛血清、人血清以及高浓度的自体血清，本申请提供的细胞培养基及细胞培养方法有助于提高细胞的增殖速度和数量，更适合细胞贴壁生长。
采用流式细胞仪分别检测对照组1-9和试验组1-8培养的成纤维细胞的生长周期，结果如表5所示。
表5对照组1-9和试验组1-8细胞的生长周期中S期和G1期所占比例对比表
组别 S期 G1期 S/G1
对照组1 28.20％ 36.9％ 0.76
对照组2 34.1％ 42.5％ 0.80
对照组3 36.1％ 43.5％ 0.83
对照组4 38.5％ 44.7％ 0.86
对照组5 65.8％ 21.4％ 3.07
对照组6 42.6％ 54.1％ 0.79
对照组7 56.7％ 60.5％ 0.94
对照组8 63.7％ 58.5％ 1.09
对照组9 47.8％ 52.2％ 0.92
试验组1 30.9％ 35.9％ 0.86
试验组2 57.1％ 39.0％ 1.46
试验组3 64.9％ 38.2％ 1.70
试验组4 68.4％ 36.8％ 1.86
试验组5 69.3％ 38.5％ 1.80
试验组6 68.5％ 37.3％ 1.84
试验组7 69.0％ 36.4％ 1.90
试验组8 68.2％ 34.2％ 1.99
可以看出，试验组的成纤维细胞S期和G1期所占比例远大于对照组的成纤维细胞S期和G1期所占比例，说明细胞培养基在加入角蛋白颗粒的情况下，成纤维细胞的增殖迅速，增殖数量多，而细胞培养基在未加入角蛋白颗粒的情况下，成纤维细胞增殖缓慢，细胞生长稀疏；试验组7的成纤维细胞S期和G1期所占比例最大，说明在细胞培养基中加入2％-5％自体血清的效果优于加入相同浓度的牛血清、人血清以及高浓度的自体血清，本申请提供的细胞培养基及细胞培养方法有助于提高细胞的增殖速度和数量，更适合细胞贴壁生长。
所以，本申请提供的细胞培养基，包括培养液、2％-5％牛血清、人血清或自体血清和角蛋白颗粒，其中培养液可以提供细胞生长所需的营养物质，牛血清、人血清或自体血清，可以有效延长细胞的形态维持时间，抑制丝裂霉素C的细胞毒作用，减少细胞凋亡，促使细胞增值旺盛，改善细胞的生长状况，角蛋白颗粒可以为细胞的生长提供足够的粘附空间，不仅效果远超组织工程架，而且还可以配合培养液和血清为细胞生长提供丰富的营养物质，以提高细胞的增殖数量和成活率，更适合细胞贴壁生长。
在本文中，“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制，还包含本领域技术人员可以理解的且制造或使用等允许的误差。
除非另有说明，本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围，也包括含于其中的若干子范围。
上面结合附图对本申请优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本申请并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请构思的前提下做出各种变化。

Claims (10)

1.一种细胞培养基，其特征在于，包括：培养液、角蛋白颗粒和血清，其中，所述血清为牛血清或自体血清。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述血清的浓度为2-5％，所述角蛋白颗粒在所述细胞培养基中的浓度为0.1-1％。
3.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述角蛋白颗粒的粒径为20-40μm。
4.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，还包括壳聚糖，所述壳聚糖在所述细胞培养基中的浓度为0-1％。
5.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，还包括胶原蛋白，所述胶原蛋白在所述细胞培养基中的浓度为0-1％。
6.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述培养液为DMEM培养液，所述DMEM培养液包括以下质量份数的组分：DMEM干粉90-110份、碳酸氢钠30-50份、青霉素1-5份、链霉素1-5份、HEPES30-50份和L-谷氨酰胺1-5份。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基的酸碱度为5.0-7.2；
优选地，所述细胞培养基为成纤维细胞的培养基。
8.一种细胞培养方法，其特征在于，包括：
取出皮肤组织块，对所述皮肤组织块进行冲洗处理后转移至培养皿中，加入消化液，过夜；
对所述皮肤组织块依次进行去皮、消化、离心处理，加入权利要求1-7任意一项所述的细胞培养基悬浮细胞，并将细胞接种在培养皿中，获得原代培养的成纤维细胞；
在所述成纤维细胞扩增达到预设数量的情况下，对所述成纤维细胞进行冲洗、消化、离心处理，加入权利要求1-7任意一项所述的细胞培养基；
在所述细胞培养基中按照1:2-1:5的比例对所述成纤维细胞进行传代培养。
9.根据权利要求8所述的细胞培养方法，其特征在于，对所述皮肤组织块进行冲洗处理后转移至培养皿中，加入消化液，过夜，包括：
将所述皮肤组织块冲洗3遍，去掉脂肪和血液，转移至培养皿中，加入0.25％中性蛋白酶消化液4℃过夜；
其中，所述0.25％中性蛋白酶消化液通过将中性蛋白酶溶解至磷酸缓冲盐溶液中，并将酸碱度调至7.4获得；
对所述皮肤组织块进行消化处理，包括：
在培养皿中加入0.1％Ⅰ型胶原酶消化液，37℃消化；
其中，所述0.1％Ⅰ型胶原酶消化液通过将Ⅰ型胶原酶溶解至磷酸缓冲盐溶液中，并将酸碱度调至7.4获得。
10.根据权利要求8所述的细胞培养方法，其特征在于，在所述成纤维细胞扩增达到预设数量的情况下，对所述成纤维细胞进行冲洗、消化、离心处理，包括：
在所述成纤维细胞扩增至培养皿面积的70-80％的情况下，弃去上清液，采用磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化至细胞收缩呈圆球形，离心并收集细胞；
其中，所述0.25％胰蛋白酶通过将胰蛋白酶溶解至磷酸缓冲盐溶液中，并将酸碱度调至7.4获得。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115161264A (zh) * 2022-09-08 2022-10-11 昆明理工大学 一种体外培养老龄成纤维细胞的培养体系及培养方法和应用
WO2023061450A1 (zh) * 2021-10-13 2023-04-20 无锡赛比曼生物科技有限公司 一种脂肪组织运输保存液
CN116396928A (zh) * 2023-05-12 2023-07-07 细新(上海)医疗科技有限公司 一种原代成纤维细胞的培养体系、培养方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030064045A1 (en) * 2001-07-16 2003-04-03 Florence Tournilhac Mascara comprising a particle dispersion
US20110172107A1 (en) * 2008-04-30 2011-07-14 Fox Chase Cancer Center Assay for identifying agents that modulate epigenetic silencing, and agents identified thereby
CN102172337A (zh) * 2011-02-18 2011-09-07 中国人民解放军第四军医大学 具有皮脂腺样结构的组织工程皮肤及其制备方法
CN104080905A (zh) * 2011-12-22 2014-10-01 生命技术公司 细胞培养基和方法
CN105555955A (zh) * 2013-07-26 2016-05-04 京都府公立大学法人 成骨细胞和制备成骨细胞的方法
CN106635961A (zh) * 2017-01-10 2017-05-10 陕西九州生物医药科技集团有限公司 一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基和使用方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030064045A1 (en) * 2001-07-16 2003-04-03 Florence Tournilhac Mascara comprising a particle dispersion
US20110172107A1 (en) * 2008-04-30 2011-07-14 Fox Chase Cancer Center Assay for identifying agents that modulate epigenetic silencing, and agents identified thereby
CN102172337A (zh) * 2011-02-18 2011-09-07 中国人民解放军第四军医大学 具有皮脂腺样结构的组织工程皮肤及其制备方法
CN104080905A (zh) * 2011-12-22 2014-10-01 生命技术公司 细胞培养基和方法
CN105555955A (zh) * 2013-07-26 2016-05-04 京都府公立大学法人 成骨细胞和制备成骨细胞的方法
CN106635961A (zh) * 2017-01-10 2017-05-10 陕西九州生物医药科技集团有限公司 一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基和使用方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
季冬青等: "壳聚糖抗菌活性研究进展", 《辽宁中医药大学学报》 *
李希宁等: "自体可注射生物复合填充材料毛发角蛋白的应用", 《吉林大学学报（医学版）》 *
杨信: "角蛋白聚乙烯醇复合神经支架的构建及其细胞相容性的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 医药卫生科技辑》 *
赵娟等: "自体皮肤成纤维细胞与毛发角蛋白复合填充材料在医学美容中的应用", 《中国生物制品学杂志》 *
陈雪梅等: "成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性", 《生物技术通讯》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023061450A1 (zh) * 2021-10-13 2023-04-20 无锡赛比曼生物科技有限公司 一种脂肪组织运输保存液
CN115161264A (zh) * 2022-09-08 2022-10-11 昆明理工大学 一种体外培养老龄成纤维细胞的培养体系及培养方法和应用
CN116396928A (zh) * 2023-05-12 2023-07-07 细新(上海)医疗科技有限公司 一种原代成纤维细胞的培养体系、培养方法和应用

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