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CN110291190B - 骨骼肌细胞及其诱导方法 - Google Patents

骨骼肌细胞及其诱导方法 Download PDF

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CN110291190B CN201780081655.8A CN201780081655A CN110291190B CN 110291190 B CN110291190 B CN 110291190B CN 201780081655 A CN201780081655 A CN 201780081655A CN 110291190 B CN110291190 B CN 110291190B
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Abstract

一种诱导骨骼肌细胞的方法，该方法包括将MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物导入到哺乳动物的体细胞中的工序。

Description

骨骼肌细胞及其诱导方法
技术领域
本发明主要涉及一种骨骼肌细胞及其诱导方法，详细地，涉及一种基于基因直接重组的骨骼肌细胞的诱导方法。
背景技术
肌肉是动物运动所必须的组织，其由具有收缩能力的纤维状多核细胞构成。在骨骼肌的分化诱导中，单核的成肌细胞分化并融合而形成多核的肌细胞。已知骨骼肌的分化诱导被MyoD家族、MEF2家族等转录因子控制。
对于横隔膜全部缺损等肌先天异常、肌营养不良等肌遗传疾病、伴随高度外伤、外科治疗的肌缺损等疾病，如果能够将肌再生并移植，就有可能成为有效的新再生医疗。
以往就已知如果将骨骼肌特异性转录因子、MyoD家族的基因导入到小鼠成纤维细胞中，则能够诱导成肌细胞样的细胞。但是，对于人成纤维细胞而言，存在即使导入MyoD家族的基因也不能与小鼠同等程度地诱导成肌细胞的问题。
现有技术文献
非专利文献1：Davis RL,Weintraub H,Lassar AB.Expression of a singletransfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.Cell.1987Dec 24；51(6):987-1000。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于，提供一种能应用于对伴随肌缺损的疾病等的治疗的诱导骨骼肌细胞的方法。
解决问题的技术手段
本发明人发现了通过将MyoD基因和L-myc基因组合导入到哺乳动物的体细胞中，能直接得到(通过基因直接重组)骨骼肌细胞，而不用经由ES细胞、iPS细胞等多能干细胞。本发明是基于该发现不断进行进一步研究而完成的。
本发明包括以下的发明。
第一项，一种诱导(制备)骨骼肌细胞的方法，其中，包括将MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物导入到哺乳动物的体细胞中的工序。
第二项，如第一项所述的方法，其中，所述体细胞为成纤维细胞。
第三项，如第一项所述的方法，其中，所述体细胞为人的体细胞。
第四项，如第一项或第二项所述的方法，其中，MyoD家族基因为MyoD1基因，Myc家族基因为L-myc基因。
第五项，一种骨骼肌细胞，其中，其来自哺乳动物的体细胞，具有外源性MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物。
第六项，如第五项所述的骨骼肌细胞，其中，其通过第一项～第四项中任一项所述的方法得到。
第七项，一种移植材料，用于治疗基于骨骼肌缺损、不足或功能低下的疾病，所述移植材料包括通过第一项～第四项中任一项所述的方法得到的细胞或者第四项所述的骨骼肌细胞。
第八项，一种组合物，用于诱导(制备)骨骼肌细胞，所述组合物包括MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物。
发明效果
根据本发明，通过基因直接重组能够在短期间内由体细胞制备骨骼肌细胞。由于该骨骼肌细胞能够容易地由要进行移植的本人的体细胞诱导，因此，在移植得到的骨骼肌细胞时也不会产生免疫学排斥反应等问题。另外，由于能够直接由体细胞诱导骨骼肌细胞而不用经由iPS细胞、ES细胞，因此，能够避免癌化等由多能干细胞导致的问题。
附图说明
图1表示实验方法的概要。
图2表示肌细胞生成素基因和CKM基因的mRNA表达测定结果。
图3-1表示免疫荧光染色的结果(CKM)。
图3-2表示免疫荧光染色的结果(抗肌萎缩蛋白)。
图3-3表示免疫荧光染色的结果(肌细胞生成素)。
图4表示多核的肌管细胞的出现的观察结果。
图5表示多核的肌管细胞的出现的评价结果。
图6表示肌细胞生成素基因、CKM基因和MHC3基因的mRNA表达测定结果。
图7表示DMD基因的mRNA表达的随时间的测定结果。
图8A表示实施例8的方法的概要。
图8B表示移植一周后的移植部位和取出的组织的宏观图象。
图9-1表示移植了成纤维细胞后的组织的免疫组织化学染色的结果。石蜡切片、×200倍放大。
图9-2表示移植了导入有MyoD1和L-Myc的细胞后的组织的免疫组织化学染色的结果。石蜡切片、×200倍放大。
图10表示结蛋白阳性细胞的测定结果。值为平均值±标准偏差。各组N＝3个小鼠。*P<0.05，相对于非导入细胞移植组。
图11表示CKM阳性细胞的测定结果。值为平均值±标准偏差。各组N＝3个孔。*P<0.05，相对于非导入细胞。
图12(A)表示核染色的结果。(B)表示具有多于3个核的细胞数量相对于总细胞数量的百分比的测定结果。
图13(A)表示多核细胞的出现的测定结果。(B)表示肌细胞生成素基因、CKM基因和抗肌萎缩蛋白基因的mRNA表达测定结果。
图14表示移植了细胞后的组织的免疫组织化学染色的结果。
图15表示各种标志物基因的mRNA表达测定结果。值为平均值±标准偏差。各组N＝3。*P<0.05，相对于非导入细胞。
图16表示线粒体(MitoTracker Red)的检测结果。
图17表示结蛋白和CKM的免疫荧光染色的结果。
图18A表示与骨骼肌的产生有关的基因群的热图和聚类分析的结果。
图18B表示与骨骼肌的收缩有关的基因群的热图和聚类分析的结果。
图18C表示与肌球蛋白丝有关的基因群的热图和聚类分析的结果。
图18D表示与肌动蛋白丝有关的基因群的热图和聚类分析的结果。
图19表示rBC2LCN-FITC的染色的结果。
图20表示肌细胞生成素基因和CKM基因的mRNA表达测定结果。
具体实施方式
本发明涉及一种通过将哺乳动物的已分化的体细胞转化为骨骼肌细胞来诱导骨骼肌细胞的方法。“转化”是指将体细胞变换为目标骨骼肌细胞。本发明的方法的优选方式之一是将体细胞转化为骨骼肌细胞而不经过以iPS细胞的制备为代表的细胞的初始化工序的方法，该方法也称为“基因直接重组”、“直接转化”。
诱导为骨骼肌细胞能够以体外(in vitro)或体内(in vivo)中的任意一种方式进行。
在正常的骨骼肌的产生过程中，成肌细胞融合而成为多核的肌管细胞，进而成熟为肌纤维。另外，在正常的骨骼肌组织中存在能作为干细胞发挥作用的肌卫星细胞。在本说明书中，将成肌细胞、肌卫星细胞、肌管细胞、肌管、肌纤维、成熟肌纤维等统称为骨骼肌细胞或肌细胞。
骨骼肌是指动物的肌肉中的除心肌和平滑肌以外的肌肉。骨骼肌属于横纹肌和平滑肌中的横纹肌。骨骼肌细胞为多核细胞，由大量成肌细胞能生成肌纤维。
骨骼肌细胞来自间充质干细胞。在生物体内的分化中，间充质干细胞分化为成肌细胞，大量成肌细胞融合，从而形成肌管细胞。
能够通过肌细胞生成素、肌肉肌酸激酶(CKM，creatine kinase muscle)、肌球蛋白重链3(MHC3，Myosin heavy chain3)等骨骼肌特异性标志物的基因表达、蛋白质表达、多核、肌纤维的形成等形态特征、收缩能力等功能等来评价获得了骨骼肌细胞。
体细胞
只要体细胞来自哺乳动物即可。在将骨骼肌细胞移植至生物体中的情况下，使用来自待移植的受试体的体细胞(自身细胞)降低感染、排斥反应等危险，因此优选。然而，在以针对肌缺损等进行移植等为目的的情况下，能够使用预先由其他人、其他动物的体细胞准备的骨骼肌细胞进行移植，而不是自身细胞。或者能够由预先准备的其他人、其他动物的体细胞制成骨骼肌细胞，用于移植。即，能够预先制作骨骼肌细胞库来供于移植目的。在这种情况下，为了降低排斥反应等危险，能够预先将MHC分型。另外，能够预先确认骨骼肌细胞的细胞特性、致瘤性等。
在本说明书中，作为哺乳动物，可举出小鼠、大鼠、仓鼠、人、狗、猫、猴、兔、牛、马、猪等，特别地，可举出人。
作为本发明的方法(基因直接重组)的对象的体细胞，没有特别的限定。
体细胞能够使用能容易从生物体采取的体细胞。例如，可举出成纤维细胞、角质形成细胞、口腔粘膜上皮细胞、鼻腔粘膜上皮细胞、呼吸道粘膜上皮细胞、胃粘膜上皮细胞、肠道粘膜上皮细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、牙龈细胞(牙龈成纤维细胞、牙龈上皮细胞)、牙髓细胞、牙周膜细胞、骨髄细胞、骨髓基质细胞、白细胞、淋巴细胞、结膜上皮细胞、破骨细胞等，优选举出成纤维细胞、角质形成细胞、口腔粘膜上皮细胞、牙龈细胞、白细胞、淋巴细胞等。在本发明中，优选使用从生物体采取的上述细胞。
基因或其表达产物
在本发明的方法中，将MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物导入到体细胞中。此处，作为“表达产物”，可举出MyoD家族基因和L-myc基因的mRNA或蛋白质。
在本发明的方法中，除了MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物以外，也能够将微RNA、siRNA、shRNA、表达它们的DNA并用。另外，也能够将各种蛋白质并用。从能够获得骨骼肌细胞的效率的观点以及简便性的观点出发，优选的是，仅使用MyoD家族基因和Myc家族基因两种基因、例如MyoD1基因和L-myc基因两种基因。
MyoD家族基因是编码参与肌肉分化控制的bHLH(basic helix loop helix，碱性螺旋-环-螺旋)型转录因子的一组基因。作为MyoD家族基因，可举出MyoD1、Myf5、肌细胞生成素、MRF4。在本发明中，MyoD家族基因优选为MyoD1基因。
Myc家族基因也编码bHLH(basic helix loop helix，碱性螺旋-环-螺旋)型转录因子。作为Myc家族基因，可举出c-myc、N-myc、L-Myc。在本发明中，Myc家族基因优选为L-Myc。
上述基因均为在脊椎动物中高度保存的基因，在本说明书中，只要没有特殊示出动物名称，均表示包括同源物的基因。另外，包括多态性(多型)在内，作为具有突变的基因的具有与野生型基因产物同等功能的基因也包括在内。
例如，人(智人)的MyoD1基因、L-myc基因的cDNA碱基序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列在美国国立生物技术信息中心(NCBI；National Center for BiotechnologyInformation)提供的基因银行中以下述登录号登录(可理解为在登录有多个修订版(revision)的情况下是指最新的修订版)：
人MyoD1基因cDNA序列：NM_002478(例如，NM_002478.4)、
人MyoD1蛋白质氨基酸配位列：NP_002469(例如，NP_002469.2)；
人L-myc基因cDNA序列：NM_001033081、NM_001033082、NM_005376(例如，NM_001033081.2、NM_001033082.2、NM_005376.4)、
人L-myc蛋白质氨基酸配位列：NP_001028253.1、NP_001028254.2、NP_005367.2(例如，NP_001028253、NP_001028254、NP_005367)。
导入
除了选择特定的基因以外，本发明的方法能够按照公知的基因直接重组的方法进行，例如能够按照以下任意一个文献的方法进行：
1：Direct Reprogramming of Fibroblasts into FunctionalCardiomyocytesby Defined Factors；Masaki Ieda，Ji-Dong Fu，Paul Delgado-Olguin，Vasanth Vedantham，Yohei Hayashi，Benoit G.Bruneau，and Deepak Srivastava Cell142：375-386，2010.
2：Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by definedfactors.Thomas Vierbuchen，Austin Ostermeier，Zhiping P.Pang，Yuko Kokubu，ThomasC.Sudhof&Marius Wernig.Nature 46.
3：1035-1041，20103：Induction of human neuronal cells by definedtranscription factors.Pang ZP，Yang N，Vierbuchen T，Ostermeier A，Fuentes DR，Yang TQ，Citri A，Sebastiano V，Marro S，Sudhof TC，Wernig M.Nature 476：220-223，2011.
4：Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermalfibroblast culture by defined factors Kunihiko Hiramatsu，Satoru Sasagawa，Hidetatsu Outani，Kanako Nakagawa，Hideki Yoshikawa，and Noriyuki Tsumaki，Journal of Clinical Investigation，121：640-657，2011.
5：Induction of functional hepatocyte-like cells from mousefibroblasts by defined factors.Pengyu Huang，Zhiying He，Shuyi Ji，Huawang Sun，Dao Xiang，Changcheng Liu，Yiping Hu，XinWang&Lijian Hui,.Nature 475：386-389，2011.
6：Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells bydefined factors.Sayaka Sekiya&Atsushi Suzuki.Nature 475：390-393，2011.
7：Direct conversion of human fibroblasts into functional osteoblastsby defined factors.Yamamoto K，Kishida T，Sato Y，Nishioka K，Ejima A，Fujiwara H，Kubo T，Yamamoto T，Kanamura N&Mazda O.Proc Natl Acad Sci USA.112：6152-6157，2015.
8：Reprogrammed Functional Brown Adipocytes Ameliorate InsulinResistance and Dyslipidemia in Diet-Induced Obesity and Type2Diabetes.Kishida T，Ejima A，Yamamoto K，Tanaka S，Yamamoto T，Mazda O.Stem CellReports.5：569-581，2015.
9：Generation of directly converted human osteoblasts that are free ofexogenous gene and xenogenic protein.Yamamoto K.，Sato Y.，Honjo K.，Ichioka H.，Oseko F.，Sowa Y.，Yamamoto T.，Kanamura N.，Kishida T.，Mazda O.J Cell Biochem117：2538-2545，2016.
10：国际公开公报WO2014/010746号。
上述文献1～10的内容作为参考引入本说明书。
具体而言，优选的是，将目的基因插入一个或多个表达载体，将表达载体导入到作为对象的体细胞中，使其在细胞内表达。
作为导入基因的方法，除了感染逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、仙台病毒载体等病毒性载体的方法以外，在导入基因及其表达产物的情况下，也能够使用通过阳离子脂质体、阳离子聚合物、电穿孔法等的非病毒载体转染质粒载体、附加型载体、基因的表达产物(mRNA、蛋白质)的方法。另外，也能够导入mRNA。在本说明书中，将这些用于基因导入的全部方法统称为载体。
从导入效率和保持导入基因的稳定的观点出发，优选病毒载体，为了抑制癌化的风险，优选质粒。
另外，与目标基因一起导入作为药剂选择标志物的基因(嘌呤霉素耐受性、杀稻瘟菌素S耐受性、新霉素耐受性、潮霉素耐受性等)，然后进行药剂选择，从而能够在选择表达目的基因的细胞后使用。
本发明的基因的导入既可以用质粒进行，也可以使用病毒载体、例如逆转录病毒载体。从导入效率和保持导入基因的稳定的观点出发，优选病毒载体，为了抑制癌化的风险，优选质粒。
导入到体细胞的基因能够通过LTR启动子进行转录，也可以从载体内部的其他启动子开始表达。例如，能够利用CMV启动子、EF-1α启动子、CAG启动子等结构表达启动子、或所期望的诱导性启动子。另外，也可以利用将一部分LTR置换为其他启动子的嵌合启动子。
另外，在导入因子为基因的表达产物(例如蛋白质)的情况下，可以使称为蛋白转导结构域(PTD，Protein Transduction Domain)的肽等与作为表达产物的蛋白质结合，添加在培养基中，从而导入到体细胞内。
培养
在本发明的方法中，能够在导入基因后在培养基中培养哺乳动物的已分化的体细胞。例如，其是在体外诱导(制备)骨骼肌细胞的情况下的优选方式。
培养能够在用于容纳细胞和培养基的适当的容器中进行。作为进行优选的培养的方法，可举出在37℃左右且二氧化碳浓度约为5％左右的条件下培养的方法，但并不限定于此。上述条件下的培养能够使用例如公知的CO2培养箱进行。
在不损害本发明的效果的范围内，对进行培养的期间没有特别的限定。例如，能够设为12小时～1个月左右、1天～3周左右、3天～2周左右。根据需要，能够进行培养基交换。优选培养条件按照常规方法。
在培养中，必要时能够进行传代。当进行传代时，在达到汇合状态前回收细胞、或者在达到汇合状态后立即回收细胞，将细胞播种在新的培养基中。另外，在本发明的培养中，也能够适当地交换培养基。
培养基
对本发明的方法中使用的培养基没有特别的限定。能够使用DMEM(Dulbecco'sModified Eagle's Medium，杜尔贝科改良伊格尔培养基)、EMEM(Eagle's minimalessential medium，伊格尔氏最低必需培养基)、αMEM(alpha Modified MinimumEssential Medium，α改良最低必需培养基)等常规液体培养基。根据需要，能够添加血清成分(胎牛血清(FBS，Fetal Bovine Serum)、人血清(HS，Human Serum))、链霉素、青霉素等抗菌药、非必需氨基酸(NEAA，Non-Essential Amino Acids)等成分。
也能够添加IGF-1等生长因子。
从通过本发明的方法能够制备骨骼肌细胞的效率高的观点出发，优选使用用于使骨骼肌细胞分化的分化诱导培养基作为培养基。“用于使骨骼肌细胞分化的分化诱导培养基”是指包括能够使多能干细胞(ES细胞、iPS细胞等)分化为骨骼肌细胞的成分的培养基。
作为用于使骨骼肌细胞分化的分化诱导培养基，没有特别的限定。例如，可举出成肌细胞分化用培养基(加入有10ng/ml的IGF-1、100U/mL的青霉素和100μg/ml的链霉素的含1％非必需氨基酸(NEAA，Non-Essential Amino Acids)、5％马血清的αMEM培养基)。但是，并不限定于这些。
诱导(制备)
这样，由体细胞诱导骨骼肌细胞。
在某一方式中，诱导的骨骼肌细胞具有外源性MyoD家族基因和Myc家族基因。此处，“外源性”是指其为主要以上述导入方法导入的基因或其表达产物的方式，其为与天然的方式不同的方式。例如，可举出由除天然启动子以外的启动子控制表达的基因、除天然以外的染色体上的位置、或者存在于染色体外部的基因的方式等。
有时骨骼肌细胞作为与除骨骼肌细胞以外的细胞(例如，原体细胞)的混合物而得到。在这种情况下，根据需要，能够将骨骼肌细胞与除骨骼肌细胞以外的细胞分离。对用于分离的方法没有特别的限定。例如，能够使用细胞分类器、磁珠进行分离。
通过本发明诱导的骨骼肌细胞例如能够作为后述的移植材料优选使用。
通过本发明诱导的骨骼肌细胞还能够用于使用骨骼肌细胞的各种研究、技术开发等。例如，对于骨骼肌的产生、分化、形态形成的机制、力学压力、营养、激素等对其的影响的分析等基础研究是有用的。
如果使用通过本发明诱导的骨骼肌细胞，则能够由具有各种疾病、遗传背景的人、动物简便、迅速、廉价地建立骨骼肌细胞，因此，能够通过生物化学、分子生物学、免疫学等方法分析与疾病、遗传背景相关的骨骼肌细胞的异常，由此，能够有助于疾病的发病机制的阐明等的研究、诊断方法的开发。另外，如果使用这种骨骼肌细胞进行药剂的开发、药剂的毒性试验等，则能够有助于对于各种疾病的新治疗方法的开发。
移植材料
通过本发明得到的骨骼肌细胞能够用于治疗各种疾病。在该情况下，骨骼肌细胞能够以移植材料的形式提供。
移植材料是指为了进行肌组织(特别是肌纤维)的修复、重建而导入到生物体内的含有骨骼肌的材料。本发明中得到的骨骼肌细胞能够用于移植材料的制作。骨骼肌细胞自身也是移植材料。因此，既能够将骨骼肌细胞制成细胞制剂移植至患者，也能够将骨骼肌细胞与由人工材料构成的基材(支架材料(例如，羊膜、生物适应性聚合物等))一起移植、或者在与支架材料一起培养后移植。
作为成为上述治疗对象的疾病，
可举出由外伤、损伤造成的肌损伤、肌少症、先天性横膈膜疝气、脐带疝气、腹裂、脐疝、腹部手术后的腹壁切口疝等由骨骼肌细胞的缺损、不足造成的疾病；
梅干腹综合征、波兰氏综合症、肛门直肠畸形(肛门闭锁)、腹股沟疝、长期卧床后的废用综合征等由骨骼肌功能低下造成的疾病；
皮肌炎/多发性肌炎、包涵体肌炎、伴随病毒感染的肌炎、伴随支原体感染的肌炎等炎症性肌病；
糖原累积病II型(庞贝氏病(Pompe disease))、糖原累积病III型、糖原累积病V型(麦卡德尔氏病(McArdle disease))、糖原累积病VII型(垂井氏病(Tarui disease))等代谢性肌疾病；
肌营养不良、肌病、重症肌无力、先天性肌无力综合征、线粒体病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、其他肌疾病等。
在本说明书，除非特别说明，“治疗”的用语意在患者患有特定的疾病或障碍期间进行的处置，由此减轻疾病或障碍的严重程度或一个或多个其症状、或者延缓或减慢疾病或障碍的进展。在本说明书中，“治疗”包括“预防”。
本发明中得到的骨骼肌细胞不限于疾病的治疗，还能够以美容、功能增强为目的使用。此时，在本说明书中，为了方便，也将对于人的处置称为治疗，“患者”能够更替为“健康人”或“人”，“疾病”能够更替为“美容”或“功能”。
本发明不仅能够用于人的疾病的治疗，而且也能够用于包括狗、猫等宠物、牛、马、猪、绵羊、鸡等家畜的哺乳动物的疾病的治疗。在该情况下，将“患者”更替为“患畜”或“哺乳动物”。
组合物
如前所述，通过将MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物导入到体细胞中，能够诱导骨骼肌细胞。因此，本发明还提供一种用于诱导骨骼肌细胞的组合物，其包括MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物。优选的是，所述用于诱导骨骼肌细胞的组合物包含用于由体细胞诱导骨骼肌细胞的因子，MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物以能够导入到体细胞的形态包含。作为上述基因能够导入到体细胞的形态，具体而言，可举出插入有上述基因的载体。此处，上述基因既可以分别插入到单独的载体中，也可以在一个载体中同时插入两种以上的基因。
能够使用的载体的种类等如前所述。
上述组合物能够作为例如基因治疗中的药物(治疗药)使用。
在体内(in vivo)的基因直接重组
通过将MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物导入到存在于骨骼肌的缺损部位的成纤维细胞等中，从而在该损伤部位通过基因直接重组诱导骨骼肌细胞，由此能够有助于骨骼肌损伤的治疗、骨骼肌的再生。在MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物的导入中，能够优选使用上述本发明的组合物。
应该理解本发明的诱导方法不仅包含在体外(in vitro)的基因直接重组，而且也包含上述那样的在体内(in vivo)的基因直接重组。通过这种在体内(in vivo)的基因直接 重组，能够进行例如用于治疗各种疾病的基因治疗。作为疾病的具体例，可举出如上所述的 疾病。
对于在体内(in vivo)的基因直接重组，除了将MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物导入到骨骼肌的损伤部的成纤维细胞以外，能够按照例如下述文献中记载的在体内(in vivo)的向心肌细胞的基因直接重组来进行。
1：Ieda M.Heart regeneration using reprogramming technology.Proc JpnAcad Ser B Phys Biol Sci.2013；89(3):118-28.Review.
2：Ieda M，Fu JD，Delgado-Olguin P，Vedantham V，Hayashi Y，Bruneau BG，Srivastava D.Direct reprogramming of fibroblasts into functionalcardiomyocytes by defined factors.Cell.2010Aug 6；142(3)：375-86.
3：Qian L，Huang Y，Spencer CI，Foley A，Vedantham V，Liu L，Conway SJ，FuJD，Srivastava D.In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts intoinduced cardiomyocytes.Nature.2012May 31；485(7400)：593-8。
上述文献1～3的内容作为参考引入本说明书。
实施例
以下示出实施例，但本发明并不仅限于该实施例。
在实施例中，HDF表示人皮肤成纤维细胞(Human Dermal Fibroblast)。
实施例1(图1)
图1示出了方法的概要。采用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒(GeneArt SeamlessCloning&Assembly Kit，赛默飞世尔科技公司)将MyoD1、L-Myc、c-Myc、Oct4、Klf4和SOX2基因的cDNA编码序列插入到逆转录病毒载体质粒pMXs.puro。将包装细胞Plat GP细胞混悬在加入有100U/mL青霉素和100μg/ml链霉素的含1％NEAA、10％FBS的DMEM培养基(常规培养基)中，在涂布明胶的10cm培养皿中播种5×106个。
培养24小时后，采用X-tremeGENE9将插入有上述基因的pMXs载体以各种组合与pCMV VSV载体一起按以下的比例导入。
即，将导入基因5μg、2.5μg的pCMV.VSV、500μl的Opti-MEM、22.5μl的X-tremeGENE9的混合液加入至含10ml培养基的10cm培养皿中。
24小时后，交换至不含抗生素的常规培养基中。同一天，将作为人正常皮肤成纤维细胞株的aHDF以2.2×106个细胞/mL播种在10cm培养皿中。
24小时后，使Plat GP培养上清液通过孔直径为0.45μm的针筒过滤器后，与聚凝胺(最终浓度4μg/mL)混合(病毒溶液)。
吸引除去人正常皮肤成纤维细胞(aHDF)的培养上清液后，添加病毒溶液(第0天)。
培养24小时使其感染后，吸引除去培养上清液，加入成肌细胞分化用培养基(加入有10ng/ml的IGF-1、100U/mL的青霉素和100μg/ml的链霉素的含1％NEAA、5％马血清的αMEM培养基)。然后，每两天交换一次培养液，培养至第14天。
实施例2(图2)
在由人正常皮肤成纤维细胞向成肌细胞的转化中的肌细胞生成素基因和CKM基因的mRNA表达测定结果。
将人正常皮肤成纤维细胞(aHDF)接种于12孔板，按照图1的方法进行培养。
以记载的组合导入人MyoD1基因、人Oct4基因、人Sox2基因、人Klf基因、人L-Myc基因、人c-Myc基因。
基因导入14天后，回收总RNA，采用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix合成cDNA。以定量肌细胞生成素基因、CKM基因和β肌动蛋白基因的mRNA水平为目的，将Real-time PCR Master Mix、Taqman探针(Taqman probe)、特异性引物和cDNA混合，采用AB7300实时PCR系统(Real-time PCR sysytem)进行实时RT-PCR。算出各细胞的肌细胞生成素mRNA和CKM mRNA水平相对于β肌动蛋白mRNA水平的值。
将结果示于图2。确认了与对照相比，导入了MyoD1和L-Myc两种基因的细胞在基因水平表达作为骨骼肌细胞特异性标志物的肌细胞生成素基因、CKM基因的能力最强。另外，只有导入了人MyoD1基因、人L-Myc基因两种基因的一组表现出与原代人骨骼肌细胞(pSKM)同等的表达。
实施例3(图3)
用12孔板进行细胞培养，通过免疫荧光染色确认了骨骼肌细胞特异性标志物(肌细胞生成素、CKM、抗肌萎缩蛋白)的表达。
在12孔板上培养人正常皮肤成纤维细胞aHDF，像图1那样进行实验。基因导入14天后，从各孔吸引除去培养液，用PBS(-)清洗。用4％多聚甲醛固定后，用PBS(-)清洗三次，然后加入封闭液Blocking One，在室温条件下孵育60分钟。
使一次抗体(抗CKM抗体、抗抗肌萎缩蛋白抗体、抗肌细胞生成素抗体)在4℃条件下反应过夜后，用洗涤缓冲液清洗三次。使二次抗体(Alexa 488-标记抗兔IgG抗体、Alexa546-标记抗小鼠IgG抗体)在室温条件下反应1小时后，用洗涤缓冲液洗涤三次，使用美国生命技术公司(ライフテクノロジー社)制的带DAPI的SlowFadeGold抗淬灭试剂(SlowFadeGold anti fade reagent with DAPI)进行核染色。使用荧光显微镜(KeyenceBZ710)拍摄。
将结果示于图3-1、3-2、3-3。对于导入了MyoD1和LMyc的细胞，与仅导入了MyoD1的细胞相比，CKM、DMD、肌细胞生成素呈现更强的阳性。
另外，对于导入了MyoD1和LMyc的细胞而言，与原代人成肌细胞相比，在CKM、DMD、肌细胞生成素中更强烈地染色。
实施例4(图4)
用12孔板进行细胞培养，观察多核的肌管细胞的出现。
在12孔板上培养人正常皮肤成纤维细胞aHDF，按照图1的方法进行培养。基因导入14天后，从各孔吸引除去培养液，用PBS(-)清洗。用4％多聚甲醛固定后，用PBS(-)清洗三次，使用美国生命技术公司(ライフテクノロジー社)制的带DAPI的SlowFadeGold抗淬灭试剂(SlowFadeGold anti fade reagent with DAPI)进行核染色。使用荧光显微镜(KeyenceBZ710)拍摄。对于共转导MyoD1和L-Myc的组而言，高频率地观察到多核的肌管细胞。可知如果将L-Myc或c-Myc基因与MyoD1基因共转导，则细胞汇合加剧。
实施例5(图5)
用12孔板进行细胞培养，评价多核的肌管细胞的出现。
在12孔板上培养人正常皮肤成纤维细胞aHDF，按照图1的方法进行培养。基因导入14天后，从各孔吸引除去培养液，用PBS(-)清洗。用4％多聚甲醛固定后，用PBS(-)清洗三次，使用美国生命技术公司(ライフテクノロジー社)制的带DAPI的SlowFadeGold抗淬灭试剂(SlowFadeGold anti fade reagent with DAPI)进行核染色。用相位差显微镜观察，对细胞和核进行计数。
将结果示于图5。在导入了MyoD1和L-Myc的组中，具有多于3个(4个以上的)核的肌管细胞以高频率出现。
实施例6(图6)
由人正常皮肤成纤维细胞向成肌细胞的转化、肌细胞生成素基因、CKM基因、MHC3基因的mRNA表达测定结果。
在12孔板上培养人正常皮肤成纤维细胞(aHDF)，通过与图1同样的方法进行培养。
单独导入人MyoD1基因、人L-Myc基因或者同时导入两种基因，14天后，回收总RNA，使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix合成cDNA。以定量肌细胞生成素基因、CKM基因、MHC3基因和β肌动蛋白基因的mRNA水平为目的，将Real-time PCR Master Mix、Taqman探针(Taqman probe)、特异性引物和cDNA混合，使用AB7300实时PCR系统(Real-time PCRsysytem)进行实时RT-PCR。计算各细胞的肌细胞生成素mRNA和CKM mRNA水平相对于β肌动蛋白mRNA水平的值。
将结果示于图6。对于导入了MyoD1和L-Myc两种基因的细胞，与对照相比，在基因水平与原代骨骼肌细胞(pSKM)同等强度地表达了作为骨骼肌细胞特异性标志物的肌细胞生成素基因、CKM基因、MHC3基因。
实施例7(图7)
由人正常皮肤成纤维细胞向成肌细胞的转化、DMD基因的mRNA表达的随时间的测定结果。
在12孔板上培养人正常皮肤成纤维细胞(aHDF)，通过与图1同样的方法进行培养。
共转导人MyoD1基因和人L-Myc基因，在导入后第0、2、4、6、8、10、12和14天回收总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix合成cDNA。以定量DMD基因和β肌动蛋白基因的mRNA水平为目的，将Real-time PCR Master Mix、Taqman探针(Taqman probe)、特异性引物和cDNA混合，使用AB7300实时PCR系统(Real-time PCR sysytem)进行实时RT-PCR。计算各细胞的DMD mRNA水平相对于β肌动蛋白mRNA水平的值。
将结果示于图7。对于导入了MyoD1和L-Myc两种基因的细胞，作为骨骼肌细胞的功能表达所必须的蛋白的DMD基因的表达随时间增强，在第14天，表现出与原代骨骼肌细胞(pSKM)同等的表达。
实施例8(图8)
将导入了MyoD1和L-Myc的细胞培养7天，注入移植至小鼠的腹部皮下，由取出标本制作切片，实施免疫染色。
在图8示出方法的概要。采用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒(GeneArt SeamlessCloning&Assembly Kit，赛默飞世尔科技公司)将MyoD1、L-Myc基因的cDNA编码序列插入到逆转录病毒载体质粒pMXs.puro中。将包装细胞Plat GP细胞混悬在包含100U/mL青霉素和100μg/ml链霉素的含1％NEAA、10％FBS的DMEM(常规培养基)中，在涂布明胶的10cm培养皿中播种5×106个。
培养24小时后，使用X-tremeGENE 9将包含上述基因的pMXs载体以各种组合与pCMV VSV载体一起按以下比例导入。
即，将导入基因5μg、2.5μg的pCMV.VSV、500μl的Opti-MEM、22.5μl的X-tremeGENE9的混合液加入到含10ml培养基的10cm培养皿中。
24小时后，交换至不含抗生素的常规培养基。同一天，将人正常皮肤成纤维细胞株aHDF以2.2×106个细胞/mL播种在10cm培养皿中。
24小时后，使Plat GP培养上清液通过孔直径为0.45μm的针筒过滤器后，与聚凝胺(最终浓度4μg/mL)混合(病毒溶液)。
吸引除去aHDF的培养上清液后，加入病毒溶液(第0天)。
培养24小时使其感染后，吸引除去培养上清液，加入成肌细胞分化用培养基(加入有10ng/ml的IGF-1、100U/mL的青霉素和100μg/ml的链霉素的含1％NEAA、5％马血清的αMEM培养基)。接着，每两天交换一次培养液，培养至第14天。
第7天，采用accutase酶从培养皿剥离细胞，每3×105个细胞在冰上溶解在100μL的基质胶(CORNING REF354234)原液中。
在NOD/SCID小鼠的右侧上腹部皮下注入移植混悬于基质胶的细胞液。在对照的小鼠中注入移植了将每3×105个aHDF在冰上溶解于100μL基质胶(CORNING REF354234)原液而得的细胞。注入移植一周后，使小鼠安乐死，剥离上腹部皮下。连带着皮肤一起取出皮下的移植组织。
将移植一周后的移植部位与取出的组织的宏观图象示于图8B。在导入了MyoD1和L-Myc基因的细胞的移植部位观察到纤维性的结节样组织。
实施例9(图9)
用4％多聚甲醛将实施例8中取出的组织固定24小时。然后，用24小时进行石蜡包埋，制成石蜡块。
由石蜡固定的小鼠皮下组织标本制成厚度为3μm的薄切切片。将切片在60℃条件下孵育15分钟后，在二甲苯中浸渍5分钟，重复三次。进而在100％乙醇中浸渍3分钟，重复三次。然后，脱石蜡，用蒸馏水清洗5分钟。
然后，滴入BLOXALL以覆盖切片，在室温条件下静置10分钟。
用PBS清洗5分钟，滴入2.5％马血清以覆盖切片，在室温条件下静置20分钟。
在纸巾上轻轻敲打载玻片来除去血清。作为一次抗体，滴入结蛋白抗体、抗CKM抗体、抗抗肌萎缩蛋白抗体、抗ACTA抗体、或抗肌细胞生成素抗体以覆盖切片。在室温静置30分钟，用PBS清洗5分钟。在纸巾上轻轻敲打载玻片来除去PBS。
滴入ImmPRESS试剂以覆盖切片，静置30分钟，用PBS进行两次5分钟的清洗，在纸巾上轻轻敲打载玻片来除去PBS。
放入ImmPACT DAB稀释液1ml，加入1滴ImmPACT DAB色原体浓缩物，用涡旋充分混合。滴入酶底物溶液以覆盖切片，静置30秒至1分钟后，用蒸馏水清洗5分钟。
用蒸馏水再清洗5分钟，清洗两次，用苏木精液进行5分钟的核染色。用流水清洗5分钟，在50℃的水浴中浸入2分钟后，用流水清洗2分钟。进行三次在100％乙醇中的3分钟的浸渍，进行三次在二甲苯中的5分钟的浸渍后，滴入封固剂以覆盖切片，用盖玻片覆盖。
采用Keyence BZ710在明视野下进行组织的观察。
将结果示于图9。
在移植了成纤维细胞的组织中，在皮下组织内未观察到肌纤维样结构，未观察到多核细胞，也未观察到结蛋白阳性细胞(图9-1)。另一方面，在移植了导入有MyoD1和L-Myc的细胞的组织中，在皮下组织内观察到肌纤维样结构，其中，能够确认大量结蛋白阳性、CKM阳性、ACTA阳性多核细胞(图9-2)。根据这些结果，能够确认如果移植MyoD1和L-Myc基因诱导的细胞，则其会在生物体内成活，形成肌纤维样组织。
实施例10
与实施例8和9同样地，将未导入基因的人成纤维细胞(aHDFs)、或感染了插入有MyoD1基因的逆转录病毒载体及插入有L-Myc基因的逆转录病毒载体两者后培养7天的细胞(dMBs(directly converted myoblasts，直接转化的成肌细胞))与基质胶(BDBioscience，San Jose，CA)以体积比1：1混合，移植至NOG/SCID小鼠的侧腹部(细胞数量为3～5×105个/小鼠)。7天后，取出移植部位的组织，与实施例9同样地，用4％多聚甲醛固定8h后，用石腊包埋，切成薄片。进行使用了抗结蛋白抗体的免疫组织化学法，使用荧光显微镜(Keyence BZ710)以400倍的倍率观察，算出每个视野的结蛋白阳性细胞的百分比。
将结果示于图10。可知在移植了导入有ML的细胞的组(dMBs(directly convertedmyoblasts，直接转化的成肌细胞))中，结蛋白阳性细胞显著地存在于大量移植部位的组织中。值为平均值±标准偏差。各组N＝3个小鼠。*P<0.05，相对于非导入细胞移植组。
实施例11
与实施例1同样地，使插入有MyoD1基因的逆转录病毒载体(M)感染人成纤维细胞。另外，使插入有L-Myc基因的逆转录病毒载体(L)和插入有MyoD1基因的逆转录病毒载体(M)两者感染其他细胞(ML)。作为对照，也准备未感染逆转录病毒载体的细胞(-)。与实施例1同样地用成肌细胞分化用培养基培养。感染14天后，与实施例3同样地，进行使用了抗CKM抗体的免疫荧光染色和核染色。使用荧光显微镜(Keyence BZ710)拍摄，测量CKM阳性细胞相对于总细胞数量的百分比。
将结果示于图11。对于单独导入MyoD1基因的细胞，约26％呈CKM阳性，而对于共转导MyoD1基因和L-Myc基因的细胞，约90％呈CKM阳性。因此，可知如果共转导MyoD1和L-Myc基因，则约90％的人成纤维细胞转化为成肌细胞。值为平均值±标准偏差。N＝3个孔/组。*P<0.05，相对于非导入细胞。
实施例12
与实施例1同样地，使插入有MyoD1基因的逆转录病毒载体(M)、插入有L-Myc基因的逆转录病毒载体(L)、插入有c-Myc基因的逆转录病毒载体(C)以记载的组合感染人成纤维细胞。作为对照，也准备未感染逆转录病毒载体的细胞(-)。与实施例1同样地用成肌细胞分化用培养基培养它们。感染14天后，与实施例3同样地进行核染色。使用荧光显微镜(Keyence BZ710)拍摄(图12A)。另外，测量具有多于3个的核的细胞的百分比(图12B)。
单独导入了MyoD1基因的细胞是约6％具有多于3个核的细胞，而共转导MyoD1基因和L-Myc基因的细胞是约43％具有多于3个核的细胞。共转导MyoD1基因和c-Myc基因的细胞是约27％具有多于3个核的细胞。因此，可知共转导MyoD1基因和L-Myc基因的细胞以最高的效率成为多核细胞。图12B的值为平均值±标准偏差。各组N＝3个孔。*P<0.05，相对于非导入细胞。
实施例13
与实施例12同样地，使插入有MyoD1基因的逆转录病毒载体和插入有L-Myc基因的逆转录病毒载体两者感染人成纤维细胞(ML)。作为对照，也准备了未感染逆转录病毒载体的细胞(-)。在一部分组中，按记载的浓度加入ERK5通路抑制剂、XMD8-92。与实施例12同样地用成肌细胞分化用培养基培养。感染14天后，与实施例3同样地进行核染色。示出了使用荧光显微镜(Keyence BZ710)拍摄的图像(图13A上部)。另外，算出具有4个以上核的细胞、具有2～3个核的细胞、具有1个核的细胞的百分比(图13A下部)。
未导入基因的成纤维细胞均为单核细胞，而感染ML的细胞是约40％具有4个以上的核的细胞且约16％具有2～3个核的细胞。但是，通过添加2～5μm的作为ERK5抑制剂的XMD8-92，具有4个以上的核的细胞降低至约10～12％，具有2～3个核的细胞约为21～23％。
另外，感染14天后，从细胞中提取RNA。作为对照，也从原代人骨骼肌细胞(pSKMs(primary skeletal muscle cells，原代骨骼肌细胞))中提取RNA。通过实时RT-PCR定量肌细胞生成素、CKM、抗肌萎缩蛋白的mRNA。将结果示于图13B。基于导入ML基因的这些成肌细胞特异性基因的表达诱导不会因添加XMD8-92而被抑制。因此，可知由ERK5通路抑制导致的多核化的抑制并不会抑制向成肌细胞的转化。
根据这些结果可知，共转导MyoD1基因和L-Myc基因的细胞的多核化是由ERK5通路依赖性的细胞汇合导致的。
实施例14
进行与实施例8、9同样的实验后，通过与实施例10同样的方法将移植部位的组织切片提供于分别使用抗CKM抗体和抗α肌动蛋白抗体的免疫组织化学法。
将结果示于图14。可知在移植了导入有MyoD1基因和L-Myc基因的细胞(dMBs(directly converted myoblasts，直接转化的成肌细胞))的组中，在移植部位形成大量的CKM和α肌动蛋白呈阳性的肌纤维样组织。
实施例15
与实施例1同样地，使插入有MyoD1基因的逆转录病毒载体和插入有L-Myc基因的逆转录病毒载体两者感染人成纤维细胞后，用成肌细胞分化用培养基培养10天(ML)。作为对照，也使用未导入基因的人成纤维细胞(-)。对于作为褐色脂肪细胞标志物的UCP1基因和CIDEA基因、作为软骨细胞标志物的SOX9基因和聚蛋白多糖基因、作为成骨细胞标志物的Runx2基因和骨钙素基因，采用实时RT-PCR分别测量mRNA表达。
将结果示于图15。对于导入了MyoD1基因和L-Myc基因的细胞(ML导入细胞)，这些间叶系细胞的标志物的表达均未显著提高。值为平均值±标准偏差。各组N＝3组。*P<0.05，相对于非导入细胞。
实施例16
与实施例1同样地，使插入有MyoD1基因的逆转录病毒载体(M)、插入有L-Myc的逆转录病毒载体(L)、以及插入有c-Myc的逆转录病毒载体(C)如图记载那样以M单独、MC和ML的组合的方式感染人成纤维细胞。作为对照，也准备了未感染逆转录病毒载体的细胞(-)。与实施例1同样地用成肌细胞分化用培养基培养。感染14天后，用200nM的MitoTracker红色荧光探针(MitoTracker Red probe)(美国英杰生命技术公司(Invitrogen))在37℃条件下染色15分钟。使用荧光显微镜(Keyence BZ710)拍摄。
将结果示于图16。上侧照片为相位差图像，下侧照片为荧光图像。与未导入基因的人成纤维细胞、单独导入MyoD1基因的细胞相比，共转导MC的细胞具有大量线粒体，共转导ML的细胞具有更大量的线粒体。
实施例17
使插入有MyoD1基因的逆转录病毒载体和插入有L-Myc基因的逆转录病毒载体两者感染人成纤维细胞后，培养6天(ML)。作为对照，也使用未导入基因的人成纤维细胞(-)。像记载那样进行采用抗结蛋白抗体或抗CKM抗体的免疫染色和采用DAPI的核染色。
将结果示于图17。上侧照片为相位差图像，下侧照片为荧光图像。可知即使在基因导入后6天这样较短期的培养后，导入了ML的细胞也会表达成肌细胞特异性基因结蛋白和CKM。
实施例18
与实施例1同样地，使插入有MyoD1基因的逆转录病毒载体(M)感染人成纤维细胞。另外，还使插入有L-Myc基因的逆转录病毒载体(L)和插入有MyoD1基因的逆转录病毒载体两者(ML)也感染人成纤维细胞。用成肌细胞分化用培养基培养，在感染后第14天从各细胞中提取RNA。作为对照，也从未感染逆转录病毒载体的细胞(-)和原代人骨骼肌细胞(pSKMS)中提取RNA。将这些RNA提供于采用GeneChip human Gene 1.0ST(美国昂飞公司(Affymetrix))的DNA微阵列分析。
示出与骨骼肌的产生有关的基因群(图18A)、与骨骼肌的收缩有关的基因群(图18B)、与肌球蛋白丝有关的基因群(图18C)以及与肌动蛋白丝有关的基因群(图18D)的各热图和聚类分析结果。对于与骨骼肌有关的上述基因群的表达，导入了ML的细胞与pSKMS的相同性均最高，与成纤维细胞的相同性均较低。与pSKMS相比，单独导入M的细胞与成纤维细胞的相同性更高。
实施例19
与实施例1同样地，使插入有MyoD1基因的逆转录病毒载体和插入有L-Myc基因的逆转录病毒载体两者感染人成纤维细胞(ML)，用成肌细胞分化用培养基培养。感染后，每隔两天用rBC2LCN-FITC(Wako 180-02991)染色，再用Hoechst33342将细胞核染色。作为对照，逆转录病毒载体感染前的细胞(最左侧)也同样地染色。作为阳性对照，人iPS细胞(hiPS235G1)也同样地染色。使用荧光显微镜(Keyence BZ710)拍摄这些细胞。
将结果示于图19。上侧照片为相位差图像，下侧照片为荧光图像。对于成纤维细胞，虽然使ML进行感染但未被rBC2LCN-FITC染色，由此可知，在基于导入ML基因的由成纤维细胞向成肌细胞的转化中，在该过程中并未经由iPS细胞样干细胞。
实施例20
将MyoD1基因和L-Myc基因分别导入到质粒载体pCX中，构建表达载体。用电穿孔法在人成纤维细胞(HDFs)中仅导入MyoD1质粒或者导入MyoD1质粒和L-Myc质粒两者，在成肌细胞分化用培养基中培养14天。从这些细胞以及作为对照的未导入基因的成纤维细胞(HDF)中提取RNA，通过实时RT-PCR定量肌细胞生成素基因和CKM基因的mRNA。将结果示于图19。
与单独导入MyoD1基因的细胞相比，共转染MyoD1和L-Myc基因的细胞更强地表达肌细胞生成素和CKM基因。因此，表明了即使通过使用质粒载体进行转染，导入MyoD1+L-Myc基因也能够诱导从成纤维细胞转化为成肌细胞。

Claims (4)

1.一种诱导骨骼肌细胞的方法，其中，包括将MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物导入到哺乳动物的体细胞中的工序，Myc家族基因为L-myc基因，MyoD家族基因为MyoD1基因，
所述体细胞为成纤维细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述体细胞为人的体细胞。
3.组合物在生产用于由成纤维细胞诱导骨骼肌细胞的药物中的应用，其中，所述组合物包括MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物，Myc家族基因为L-myc基因，MyoD家族基因为MyoD1基因。
4.组合物在制备用于治疗基于骨骼肌缺损、不足或功能低下的疾病的药物中的用途，所述组合物包括MyoD家族基因或其表达产物以及Myc家族基因或其表达产物，Myc家族基因为L-myc基因，MyoD家族基因为MyoD1基因。
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