KR102240978B1 - 치료학적 단백질의 정제 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 일반적으로, 피브리노겐, 인자 VIII 및 폰 빌레브란트 인자(VWF)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은: (i) 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 공급원료를, 상기 공급원료 중에 존재하는 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 결합되도록 선택되는 조건들 하에서, 상기 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계; 및 (ii) 상기 수지를 통과한 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액을 회수하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도는 상기 공급원료에 비해 50% 이상 감소되는, 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 방법들에 의해 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액들 및 약제학적 제형들, 및 이들의 용도가 제공된다.
Description
본 발명은, 일반적으로, 하나 이상의 치료학적 단백질을 함유하는 용액 중의 불순물들의 수준을 감소시키는 방법, 및 그 결과로 생긴 치료학적 단백질을 함유하는 용액들에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 폰 빌레브란트 인자(VWF: Von Willebrand factor)를 포함하는 공급원료(feedstock) 중의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 일반적으로, 상기 방법들에 의해 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액들 및 약제학적 제형들, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
천연-발생 또는 재조합 치료학적 단백질을 포함하는 용액으로부터 상기 단백질을 정제하는 최근의 방법들은 보통 최종 제제에 적어도 일부 불순물들을 운반시킨다. 몇몇의 경우, 프로테아제들과 같은 불순물들의 존재는, 특히 보관 동안에, 용액 중의 치료학적 단백질을 불안정화할 것이다. 이러한 이유로, 다수의 치료학적 단백질들은 감압 동결건조된 또는 냉동된 제제로서 보관된다.
불순물들의 불안정화 수준은 다수의 상이한 유형들의 치료학적 단백질들에 영향을 미칠 수 있지만, 이들은, 특히 지혈 유지에 사용되는 치료학적 단백질들과 관련되어 있다. 지혈은 혈관 손상(예를 들면, 파열)에 따른 출혈을 방지하는 중요한 생리학적 프로세스이다. 지혈을 촉진하는 세 가지의 기본 메커니즘: (i) 혈관 수축, (ii) 파열 부위에서의 혈소판 응집; 및 (iii) 응혈이 존재한다. 응혈 동안에, 손상된 내피 세포는 조직 인자(인자 III)를 방출하고, 상기 조직 인자는 결과적으로 Ca2 +의 보조하에 인자 VII을 활성화시킨다. 활성화된 혈소판에 의해 방출된 인자 XII는 인자 XI을 활성화시킨다. 활성화된 인자 VII 및 인자 XI은 효소 반응의 캐스케이드(cascade)를 촉진시켜 인자 X의 활성화를 초래한다. 활성 인자 X(인자 Xa)은, 인자 III, 인자 V, Ca2 + 및 혈소판 혈전형성 인자(PF3)와 함께, 프로트롬빈 활성화 인자를 활성화시킨다. 프로트롬빈 활성화 인자는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시키고, 트롬빈은 피브리노겐(인자 I)을 피브린으로 전환시키며, 피브린은 손상 부위에 걸쳐 신생 메쉬(initial mesh)를 형성한다. 이어서, 상기 신생 메쉬는 인자 XIII에 의해 농밀한 피브린 응괴(clot)로 전환되어, 손상 부위가 수복될 때까지 파열을 밀봉시킨다. 응혈 캐스케이드 동안에, 트롬빈은, 또한, 순환계에서 주로 폰 빌레브란트 인자(VWF)와 복합체화되는 당단백질 전-보조 인자(pro-cofactor)인 인자 VIII을 활성화시킬 것이다. 인자 VIII은 Ca+2 및 인지질의 존재 하에 인자 IXa와 상호작용하여 인자 X을 활성화시킨다.
피브리노겐, 인자 VIII 및/또는 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는, 응혈에 관여하는 단백질들 중 임의의 하나 이상의 단백질들의 수준의 결핍은, 선천적인 것이든 후천적인 것이든, 불충분한 혈액 응고 및 출혈의 위험을 초래할 수 있다. 최근의 치료 옵션들은, 상기 단백질들의 내인성 수준의 회복 및 지혈 유지를 목적으로 하는 하나 이상의 치료학적 단백질들의 약제학적 제제의 투여에 한정된다. 그러나, 전형적으로 헌혈된 혈장 또는 재조합 공급원으로부터 유도된 기존의 약제학적 제제들은, 보관 동안에 피브리노겐, 인자 VIII, 또는 VWF와 같은 치료학적 단백질들을 불안정화시킬 수 있는 지모겐(zymogen)들 및 프로테아제들(예를 들면, 프로트롬빈, 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자(tPA) 및/또는 다른 프로테아제들)을 포함한다. 그 결과, 이러한 제제들은, 수용액 중에서 비교적 불안정하여, 장기간 보관은 감압 동결건조된 또는 냉동된 제제에 한정된다.
임상 적용을 위해, 피브리노겐은 전형적으로 사람 혈장으로부터 정제되고, 여기서, 상기 피브리노겐은 총 혈장 단백질의 약 2 내지 5%(1.5 내지 4.0g/ℓ)만을 차지한다. 전통적으로, 혈장으로부터의 피브리노겐의 정제는, 피브리노겐을 혈장으로부터 한랭-침전시킨 후에 에탄올, 황산암모늄, β 알라닌/글리신, 중합체들(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜) 또는 저 이온 강도의 용액들을 사용하여 침전시키는 전형적인 혈장 분획화(plasma fractionation)에 의해 수행된다. 이러한 방법들은 비교적 높은 수율 및 균질성을 달성할 수 있다. 더 높은 수준의 순도가 요구되는 경우, 크로마토그래피 기술들이 종종 사용된다. 그러나, 상업적 규모의 제조 프로세스들에서 실행 가능한 기존의 침전 및 크로마토그래피 기술들은, 전형적으로, 용액 중의 피브리노겐을 불안정화시킬 수 있는 지모겐들 또는 프로테아제들(예를 들면, 프로트롬빈, 조직 플라스미노겐 활성화 인자(tPA) 및 플라스미노겐)과 같은 오염성 단백질들을 포함하는 피브리노겐 제제들을 생산한다. 예를 들면, 프로트롬빈이 존재하는 경우, 이는 세린 프로테아제 트롬빈으로 활성화될 수 있고, 세린 프로테아제 트롬빈은 결과적으로 피브리노겐을 피브린으로 전환시킬 것이다. 유사하게, tPA와 플라스미노겐이 둘 다 존재하는 경우, tPA는 플라스미노겐을 이의 활성 형태인 플라스민으로 활성화시킬 수 있고, 플라스민은 결과적으로 피브리노겐을 피브린으로 가수분해시킬 것이다. 그 결과, 피브리노겐 제제들은 수용액 중에서 비교적 불안정하여, 장기간 보관은 감압 동결건조된 또는 냉동된 제제에 한정된다.
특정한 오염물들, 예를 들면, 고정된 젤라틴 상의 피브로넥틴, 및 고정된 리신 상의 플라스미노겐은 흡수 제거될 수 있다[참조: Vuento et al. 1979, Biochem. J., 183(2):331-337]. 그러나, 특정한 친화성 수지의 사용은 대규모 상업적 프로세스들에 대해서는 실행가능하지 않다. 이의 이유로는, 친화성 수지 자체가 반복해서 사용되기에 충분히 강건하지 않으며, 일반적으로 프로세싱 시간과 비용이 둘 다 상당히 증가한다는 것이 포함된다.
EP 제1240200호(US 제6960463호)는, 이온 교환(IEX) 크로마토그래피를 사용하여 피브리노겐-함유 용액으로부터 피브리노겐을 정제하는 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 방법은, 피브리노겐-함유 용액을, 상기 피브리노겐이 이온 교환 매트릭스에 결합하도록 하는 조건들 하에서 이온 교환 매트릭스에 적용시킨 다음, 상기 이온 교환 매트릭스를, 하나 이상의 오메가 아미노산을 포함하는 용액으로 세척함을 포함한다. 이는, 상기 수지로부터의 플라스미노겐의 차등 제거(differential removal)를 촉진하기 위해 수행된다. 이어서, 상기 매트릭스에 결합된 피브리노겐은 상기 매트릭스로부터 용리된다.
WO 제2012038410호는, 피브리노겐을 결합시키는 3급 또는 4급 아민과 절편이식된 하이드록실화 중합체 지지체를 함유하는 음이온 교환 수지를 사용하여 피브리노겐을 정제하는 방법을 제공한다.
EP 제1519944호는, 피브리노겐과 플라스미노겐이 매트릭스에 결합하는 조건들 하에서, 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 매트릭스를 사용하여, 상기 피브리노겐과 플라스미노겐을 별도로 선택적으로 용리시켜서, 주요 피브리노겐 분획이 단백질 mg당 약 600ng의 플라스미노겐을 함유하도록 하는 것을 교시한다.
본 발명은, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액 중의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 정제된 단백질(들)은, 액체 제제들로서 보관되는 동안에 안정하며, 상기 단백질(들)의 수준의 결핍과 관련된 병태의 치료 또는 예방을 포함하는 임상 또는 수의학 적용에 사용될 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 양상에서, 피브리노겐, 인자 VIII 및 폰 빌레브란트 인자(VWF)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 공급원료를, 상기 공급원료 중에 존재하는 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 결합되도록 선택되는 조건들 하에서, 상기 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계; 및
(ii) 상기 수지를 통과한 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액을 회수하는 단계
를 포함하고,
여기서, 상기 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도는 상기 공급원료에 비해 50% 이상 감소되는, 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서, 피브리노겐, 인자 VIII 및 폰 빌레브란트 인자(VWF)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 공급원료를 제1 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계;
(ii) 상기 제1 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지를 통과한 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액을 회수하는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 회수된 용액을 제2 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계; 및
(iv) 상기 제2 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지를 통과한 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액을 회수하는 단계
를 포함하고,
여기서, 상기 크로마토그래피 단계들의 조건들은, 상기 공급원료 중에 존재하는 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이 상기 제1 수지 및/또는 상기 제2 수지에 결합되도록 하는 조건들이며, 단계 (iv)에서 회수된 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도는 상기 공급원료에 비해 50% 이상 감소되는, 방법이 제공된다.
다른 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 회수된, 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액이 제공된다.
다른 양상에서, 5mL 이상의 안정한 약제학적으로 허용되는 피브리노겐 용액을 함유하는 용기(vessel)로서, 피브리노겐의 농도가 20mg/mL 이상인, 용기가 제공된다.
다른 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 회수된, 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 제형이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서,
(a) 총 단백질의 75% 이상의 피브리노겐;
(b) 총 단백질 mg당 50pg 미만의 조직 플라스미노겐 활성화 인자; 및/또는
(c) 총 단백질 mg당 1㎍ 미만의 플라스미노겐
을 포함하는 용액이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서,
(a) 총 단백질의 90% 이상의 피브리노겐;
(b) 총 단백질 mg당 50pg 미만의 조직 플라스미노겐 활성화 인자; 및/또는
(c) 총 단백질 mg당 150ng 미만의 플라스미노겐
을 포함하는 용액이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서,
(a) 총 단백질의 90% 이상의 피브리노겐;
(b) 총 단백질 mg당 20pg 미만의 조직 플라스미노겐 활성화 인자; 및/또는
(c) 총 단백질 mg당 10ng 미만의 플라스미노겐
을 포함하는 용액이 제공된다.
다른 양상에서, 피브리노겐 결핍과 관련된 병태의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 방법은, 상기 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 용액 또는 약제학적 제형을 투여함을 포함하는, 방법이 제공된다.
다른 양상에서, 피브리노겐 결핍과 관련된 병태의 치료 또는 예방을 위한 의약(medicament)의 제조시의, 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 용액의 용도가 제공된다.
다른 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 용액을 포함하는 피브린 글루(fibrin glue)가 제공된다.
다른 양상에서, 안정한 액체 피브리노겐 용액의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 피브리노겐을 포함하는 공급원료를, 상기 공급원료 중에 존재하는 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 결합되도록 선택되는 조건들 하에서, 상기 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계; 및
(ii) 상기 수지를 통과한 피브리노겐을 포함하는 용액을 회수하는 단계
를 포함하고,
여기서, 상기 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도는 상기 공급원료에 비해 50% 이상 감소되는, 방법이 제공된다.
다른 양상에서, 안정한 액체 피브리노겐 용액의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 피브리노겐을 포함하는 공급원료를 제1 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계;
(ii) 상기 제1 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지를 통과한 피브리노겐을 포함하는 용액을 회수하는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 회수된 용액을 제2 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계; 및
(iv) 상기 제2 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지를 통과한 피브리노겐을 포함하는 용액을 회수하는 단계
를 포함하고,
여기서, 상기 크로마토그래피 단계들의 조건들은, 상기 공급원료 중에 존재하는 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이 상기 제1 수지 및/또는 상기 제2 수지에 결합되도록 하는 조건들이며, 단계 (iv)에서 회수된 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도는 상기 공급원료에 비해 50% 이상 감소되는, 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서, 피브리노겐의 정제 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 피브리노겐을 포함하는 용액을, 피브리노겐 단량체가 이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되도록 선택되는 조건들 하에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계;
(ii) 용리 완충액을 사용하여 상기 수지로부터 상기 피브리노겐 단량체를 용리시키는 단계; 및
(iii) 단계 (ii)로부터의 상기 용리된 피브리노겐 단량체를, 약 15㎚ 내지 약 35㎚ 범위의 세공 크기를 갖는 필터를 통해 여과하는 단계
를 포함하는, 방법이 제공된다.
도 1은, 피브리노겐 용액이 피브리노겐에 대해 네거티브 모드(negative mode)로 HEA Hypercel™을 통과할 때, 상기 피브리노겐 용액으로부터의 피브리노겐, 플라스미노겐 및 t-PA의 회수율(%)을 소정 범위의 pH 수준에 걸쳐 도시한다. 각각의 그룹 내의 막대들은 (좌측으로부터 우측으로): 피브리노겐 회수율, 플라스미노겐 회수율 및 t-PA 회수율을 나타낸다.
도 2는, 피브리노겐 용액이 피브리노겐에 대해 네거티브 모드로 PPA Hypercel™을 통과할 때, 상기 피브리노겐 용액으로부터의 피브리노겐, 플라스미노겐, t-PA 및 인자 II의 회수율(%)을 소정 범위의 pH 수준에 걸쳐 도시한다. 각각의 그룹 내의 막대들은 (좌측으로부터 우측으로): 피브리노겐 회수율, 플라스미노겐 회수율, t-PA 회수율 및 인자 II를 나타낸다.
도 3은, 피브리노겐 용액이 피브리노겐에 대해 네거티브 모드로 MEP Hypercel™을 통과할 때, 상기 피브리노겐 용액으로부터의 피브리노겐, 플라스미노겐, t-PA 및 인자 II의 회수율(%)을 소정 범위의 pH 수준에 걸쳐 도시한다. 각각의 그룹 내의 막대들은 (좌측으로부터 우측으로): 피브리노겐 회수율, 플라스미노겐 회수율, t-PA 회수율 및 인자 II를 나타낸다.
도 4a는, 피브리노겐-함유 용액이 피브리노겐에 대해 네거티브 모드로 HEA Hypercel™을 통과할 때, 상기 피브리노겐-함유 용액으로부터의 피브리노겐, 플라스미노겐, t-PA 및 인자 II의 회수율(%)을 소정 범위의 pH 수준에 걸쳐 도시한다. 각각의 그룹 내의 막대들은 (좌측으로부터 우측으로): 피브리노겐 회수율, 플라스미노겐 회수율, t-PA 회수율 및 인자 II 회수율을 나타낸다.
도 4b는, 초기 응고성 단백질(initial clottable protein) %로서 측정시, HEA Hypercel™ 컬럼의 낙하 통과(drop through) 분획으로부터 회수된 피브리노겐 함유 용액(도 4a)의 안정성을 실온(대략 20℃)에서 6일에 걸쳐 도시한다. 각각의 그룹 내의 막대들은 (좌측으로부터 우측으로): T = 1일, T = 3일, T = 6일을 나타낸다.
도 4c는, 응고성 단백질 %로서 측정시, HEA Hypercel™ 컬럼의 낙하 통과 분획으로부터 회수된 피브리노겐 함유 용액(도 4a)의 안정성을 실온(대략 20℃)에서 6일에 걸쳐 도시한다. 각각의 그룹 내의 막대들은 (좌측으로부터 우측으로): T = 1일, T = 3일, T = 6일을 나타낸다.
도 5는, 본 발명의 실시형태에 따른 방법으로부터 유도된 분획들 중의 피브리노겐, t-PA, 플라스미노겐 및 인자 II에 대한 프로세스 회수율(%)을, 혈장 한랭 침전물로부터 MacroPrep™-HQ 용리물에 이르기까지 도시한 것이다. 각각의 그룹 내의 막대들은 (좌측으로부터 우측으로): 피브리노겐, 피브로넥틴, 플라스미노겐, t-PA 및 인자 II를 나타낸다.
도 6은, 분석적 크기 배제 HPLC 크로마토그램에 의한 측정시, MacroPrep™-HQ 크로마토그래피 수지로부터 회수된 단량체 피브리노겐의 순도를 도시한다.
도 7은, 상이한 전도도를 갖는 용리 완충액들(190mM NaCl, 21.5mS/㎝(마름모); 200mM NaCl, 22.5mS/㎝(사각형); 210mM NaCl, 23.5mS/㎝(삼각형); 1%(w/w) 아르기닌/200mM NaCl, 25mS/㎝(십자형))을 사용하여 MacroPrep™-HQ 크로마토그래피 수지로부터 회수된 피브리노겐의 여과성을 도시한다.
도 8은, 9주 기간 동안 2 내지 8℃에서(마름모) 또는 7주 기간 동안 30℃에서(사각형) 보관된 MacroPrep™-HQ 크로마토그래피 수지로부터 회수된 액체 피브리노겐의 피브리노겐 활성을 t=0에서의 초기 피브리노겐 활성의 백분율로서 도시한 것이다.
도 2는, 피브리노겐 용액이 피브리노겐에 대해 네거티브 모드로 PPA Hypercel™을 통과할 때, 상기 피브리노겐 용액으로부터의 피브리노겐, 플라스미노겐, t-PA 및 인자 II의 회수율(%)을 소정 범위의 pH 수준에 걸쳐 도시한다. 각각의 그룹 내의 막대들은 (좌측으로부터 우측으로): 피브리노겐 회수율, 플라스미노겐 회수율, t-PA 회수율 및 인자 II를 나타낸다.
도 3은, 피브리노겐 용액이 피브리노겐에 대해 네거티브 모드로 MEP Hypercel™을 통과할 때, 상기 피브리노겐 용액으로부터의 피브리노겐, 플라스미노겐, t-PA 및 인자 II의 회수율(%)을 소정 범위의 pH 수준에 걸쳐 도시한다. 각각의 그룹 내의 막대들은 (좌측으로부터 우측으로): 피브리노겐 회수율, 플라스미노겐 회수율, t-PA 회수율 및 인자 II를 나타낸다.
도 4a는, 피브리노겐-함유 용액이 피브리노겐에 대해 네거티브 모드로 HEA Hypercel™을 통과할 때, 상기 피브리노겐-함유 용액으로부터의 피브리노겐, 플라스미노겐, t-PA 및 인자 II의 회수율(%)을 소정 범위의 pH 수준에 걸쳐 도시한다. 각각의 그룹 내의 막대들은 (좌측으로부터 우측으로): 피브리노겐 회수율, 플라스미노겐 회수율, t-PA 회수율 및 인자 II 회수율을 나타낸다.
도 4b는, 초기 응고성 단백질(initial clottable protein) %로서 측정시, HEA Hypercel™ 컬럼의 낙하 통과(drop through) 분획으로부터 회수된 피브리노겐 함유 용액(도 4a)의 안정성을 실온(대략 20℃)에서 6일에 걸쳐 도시한다. 각각의 그룹 내의 막대들은 (좌측으로부터 우측으로): T = 1일, T = 3일, T = 6일을 나타낸다.
도 4c는, 응고성 단백질 %로서 측정시, HEA Hypercel™ 컬럼의 낙하 통과 분획으로부터 회수된 피브리노겐 함유 용액(도 4a)의 안정성을 실온(대략 20℃)에서 6일에 걸쳐 도시한다. 각각의 그룹 내의 막대들은 (좌측으로부터 우측으로): T = 1일, T = 3일, T = 6일을 나타낸다.
도 5는, 본 발명의 실시형태에 따른 방법으로부터 유도된 분획들 중의 피브리노겐, t-PA, 플라스미노겐 및 인자 II에 대한 프로세스 회수율(%)을, 혈장 한랭 침전물로부터 MacroPrep™-HQ 용리물에 이르기까지 도시한 것이다. 각각의 그룹 내의 막대들은 (좌측으로부터 우측으로): 피브리노겐, 피브로넥틴, 플라스미노겐, t-PA 및 인자 II를 나타낸다.
도 6은, 분석적 크기 배제 HPLC 크로마토그램에 의한 측정시, MacroPrep™-HQ 크로마토그래피 수지로부터 회수된 단량체 피브리노겐의 순도를 도시한다.
도 7은, 상이한 전도도를 갖는 용리 완충액들(190mM NaCl, 21.5mS/㎝(마름모); 200mM NaCl, 22.5mS/㎝(사각형); 210mM NaCl, 23.5mS/㎝(삼각형); 1%(w/w) 아르기닌/200mM NaCl, 25mS/㎝(십자형))을 사용하여 MacroPrep™-HQ 크로마토그래피 수지로부터 회수된 피브리노겐의 여과성을 도시한다.
도 8은, 9주 기간 동안 2 내지 8℃에서(마름모) 또는 7주 기간 동안 30℃에서(사각형) 보관된 MacroPrep™-HQ 크로마토그래피 수지로부터 회수된 액체 피브리노겐의 피브리노겐 활성을 t=0에서의 초기 피브리노겐 활성의 백분율로서 도시한 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 문맥이 별도로 요구하지 않는 한, 용어 "포함하다(comprise)", 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형들은, 언급된 구성요소 또는 정수 또는 구성요소들 또는 정수들의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 구성요소 또는 정수 또는 구성요소들 또는 정수들의 그룹을 배제시키지 않음을 함축하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 모든 선행 문헌(또는 이로부터 얻은 정보) 또는 공지된 모든 사안에 대한 언급은, 해당 선행 문헌(또는 이로부터 얻은 정보) 또는 공지된 사안이, 본 명세서가 관련되어 있는 기술 분야에서의 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하거나 승인하거나 시사하는 형태로 해석되지 않으며 그렇게 해석되어서도 안된다.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태의 관사들 "a", "an" 및 "the"는, 문맥이 별도로 명확하게 지시하지 않는 한, 복수의 양상들을 포함한다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 예를 들면, "제형"에 대한 언급은 단일 제형 뿐만 아니라 2개 이상의 제형들을 포함한다.
반대되는 어떠한 지시도 없는 경우, 본 명세서 전체에 걸쳐 "%" 함량에 대한 언급은 % w/w(중량/중량)를 의미하는 것으로 해석된다. 예를 들면, 총 단백질의 80% 이상의 피브리노겐을 포함하는 용액은, 총 단백질의 80% w/w 이상의 농도의 피브리노겐을 포함하는 용액을 의미하는 것으로 해석된다. 이는, 예를 들면, 응고성 단백질 검정으로부터 유도된 피브리노겐의 양을 표준 단백질 검정(예를 들면, 뷰렛(Biuret))으로부터 유도된 총 단백질의 양으로 나누고 100을 곱해서 계산할 수 있다. 응고성 단백질 검정에서는, 트롬빈을 샘플에 첨가하여 응괴를 형성하는데, 이는 거의 모두 피브린이다. 상기 응괴는, 비응고성 단백질들을 함유하는 상청액으로부터 원심분리에 의해 분리시킬 수 있다. 후속적으로, 상기 응괴를 세척하고 알칼리성 우레아 또는 다른 물질들에 의해 용해시키고, 분광법에 의해 단백질 농도를 측정한다. 상기 응괴의 대부분은 피브린이기 때문에, 단백질 농도는 피브리노겐 농도와 동등할 것이다. 따라서, 샘플 중의 응고성 단백질의 양은, 상기 샘플의 총 단백질의 양과 비응고성 단백질 성분의 양의 차이와 동등하다.
공급원료(예를 들면, 혈장 또는 세포 배양물 상청액)로부터의 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 정제는 전형적으로, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를, 예를 들면, 에탄올, 황산암모늄, β 알라닌/글리신, 중합체들(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜) 및/또는 저 이온 강도의 용액들을 사용하여 상기 용액으로부터 침전시키는 통상적인 분획화에 의해 수행된다. 상이한 크로마토그래피 단계들을 사용하는 최근의 혈장 정제 방법들은 비교적 높은 수율 및 관심 단백질의 균질한 제제를 달성할 수 있다. 그러나, 이들 방법은 전형적으로, 임상 응용을 위한 안정한 액체 제제를 제형화하기에는 적합하지 않을 수 있는 잔여량의 불순물들을 포함하는 제제를 초래한다. 프로트롬빈, 조직 플라스미노겐 활성화 인자(tPA) 및 플라스미노겐과 같은 불순물들이 특히 문제가 되는데, 그 이유는, 이들 불순물의 불안정화 수준은, 특히 제조 및/또는 장기간 보관 동안에 수용액 중의 피브리노겐을 가수분해시켜 피브리노겐을 불안정화시킬 수 있기 때문이다.
본 발명은, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 공급원료를 소수성 전하-유도 크로마토그래피(HCIC) 수지에 통과시키고 상기 수지를 통과한 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액을 회수하는 방법은, 상기 용액 중의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 불활성화 수준을 감소시키기 위한 기존의 정제 프로세스들에 대한 효과적인 대안임을 발견한 데에 적어도 부분적으로 근거를 둔다.
따라서, 본 발명의 양상에서, 피브리노겐, 인자 VIII 및 폰 빌레브란트 인자(VWF)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 공급원료를, 상기 공급원료 중에 존재하는 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 결합되도록 선택되는 조건들 하에서, 상기 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계; 및
(ii) 상기 수지를 통과한 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액을 회수하는 단계
를 포함하고,
여기서, 상기 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도는 상기 공급원료에 비해 50% 이상 감소되는, 방법이 제공된다.
한 실시형태에서, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 상기 회수된 용액 중의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 농도는 상기 공급원료에 비해 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 감소한다.
다른 양상에서, 안정한 액체 피브리노겐 용액의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 피브리노겐을 포함하는 공급원료를, 상기 공급원료 중에 존재하는 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 결합되도록 선택되는 조건들 하에서, 상기 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계; 및
(ii) 상기 수지를 통과한 피브리노겐을 포함하는 용액을 회수하는 단계
를 포함하고,
여기서, 상기 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도는 상기 공급원료에 비해 50% 이상 감소되는, 방법이 제공된다.
한 실시형태에서, 피브리노겐을 포함하는 회수된 용액 중의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 농도는 상기 공급원료에 비해 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 감소한다.
크로마토그래피 프로세스들은 전형적으로 고체 지지체를 사용하며, 상기 고체 지지체는 본원에서 상호교환적으로 수지 또는 매트릭스라고도 지칭된다. 적합한 고체 지지체는 당해 기술분야의 숙련가들에게 친숙할 것이다. 이의 예에는 유리 및 실리카 겔과 같은 무기 담체, 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란, 폴리아미드, 폴리아크릴아미드, 2관능성 아크릴레이트의 비닐 공중합체 및 각종 하이드록실화 단량체 등과 같은 유기 담체, 합성 담체 또는 천연 담체가 포함된다. 시판 담체들은 상품명 Sephadex™, Sepharose™, Hypercel™, Capto™, Fractogel™, MacroPrep™, Unosphere™, GigaCap™, Trisacryl™, Ultrogel™, Dynospheres™, Macrosorb™ 및 XAD™ 수지 하에 판매된다.
상기 크로마토그래피 단계들은 일반적으로, 비-변성 조건들 하에, 약 +10℃ 내지 +30℃ 범위의 편리한 온도에서, 더욱 통상적으로는 대략 주위 온도에서 수행될 것이다. 상기 크로마토그래피 단계들은, 편리한 경우, 배치식으로 또는 연속식으로 수행될 수 있다. 컬럼, 원심분리, 여과, 디캔팅(decanting) 등과 같은 임의의 편리한 분리 방법이 사용될 수 있다.
종종 혼합 모드 또는 다중 모드 크로마토그래피라고도 지칭되는 소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC)는 당해 기술분야의 숙련가들에게 친숙할 것이다. HCIC는 고체 지지체에 부착된 결합 모이어티들을 사용하며, 여기서, 상기 결합 모이어티들은 본 발명의 방법들에 따른 공급원료 중의 불순물들(예를 들면, 프로트롬빈, tPA 및 플라스미노겐과 같은, 지모겐들 및 프로테아제들)을 나타내는 하나 이상의 단백질들에 대한 특이성을 가질 수 있다.
당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 적합한 HCIC 수지가 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, HCIC 수지는 머캅토에틸피리딘(4-머캅토에틸피리딘, 예를 들면, MEP Hypercel™), n-헥실아민(예를 들면, HEA Hypercel™) 및 페닐프로필아민(예를 들면, PPA Hypercel™)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 리간드를 포함한다. 한 실시형태에서, HCIC 수지는 n-헥실아민을 포함한다.
HEA, MEP 및 PPA와 같은 HCIC 리간드들은 단백질들의 표면 소수성에 기초하여 분리를 허용하면서도, 소수성 크로마토그래피(예를 들면, 소수성 상호작용 크로마토그래피; HIC)를 사용하는 다른 피브리노겐 정제 프로세스들에서 종종 관찰되는 이액염(lyotropic salt)의 첨가를 필요로 하지 않는다는 점에서 이점을 갖는다. 전통적인 소수성 상호작용 크로마토그래피와는 달리, HCIC는 염 농도보다는 pH에 기초하여 제어된다. HCIC 수지는 또한 높은 결합 용량 및 높은 유속을 제공하여, 실험실-규모 정제와 산업적-규모 정제 둘 다에 이상적이다.
HCIC 수지는 종종 약 2㎝ 내지 약 40㎝의 층 높이를 갖는 컬럼 내에 팩킹된다. 산업적 규모에서, 상기 층 높이는 통상적으로 10㎝ 이상이며, 전형적으로는 약 15㎝ 내지 25㎝ 범위이다. 산업적 컬럼의 컬럼 직경은 20㎝ 내지 약 1.5m 범위일 수 있다. 이러한 컬럼은 HCIC 수지 제조 지침에 따른 유속으로 작동되며, 상기 유속은 전형적으로 50 내지 100㎝/시간 범위이다. 유속의 상한치는 부분적으로 HCIC 수지의 압력 제약에 기인한다. 예를 들면, HEA 수지의 경우, 작동 압력 상한치는 < 3bar(< 300kPa)이다. HCIC 수지의 전형적인 동적 결합 용량(결합 단백질의 10% 파과점(breakthrough))은 수지 mL당 약 20 내지 30mg의 결합된 단백질이다. 본 발명의 경우, 피브리노겐과 같은 풍부한 단백질들이 상기 컬럼을 통과할 수 있고, 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)와 같은 덜 풍부한 단백질들이 HCIC 수지에 결합하기 때문에, 비교적 다량의 단백질이 HCIC 컬럼 상에 로딩되도록 할 수 있다. 이는 산업적 규모의 제조에 유리한데, 그 이유는, 배치를 처리하기 위해 더 작은 크기의 컬럼들 및/또는 더 적은 수의 컬럼 사이클들이 요구되기 때문이다.
본 발명자들은, 또한, 본 발명의 방법들에 따라 HCIC 수지를 통과하는 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액 또는 공급원료의 pH를 조정하여 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 회수율 및 불순물들의 제거율을 제어할 수 있다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 본원에 개시된 한 실시형태에서, HCIC 수지를 통과하는 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액 또는 공급원료는 약 6.0 내지 약 9.5의 pH를 갖는다. 특정한 실시형태에서, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액 또는 공급원료는 바람직하게는 약 4.0, 5.0, 5.25, 5.5, 5.75, 6.0, 6.25, 6.5, 6.75, 7.0, 7.25, 7.5, 7.75, 8.0, 8.25, 8.5, 8.75, 9.0, 9.25, 9.5 또는 10.0의 pH에서 HCIC 수지를 통과한다. 특정한 실시형태에서, HCIC 수지를 통과하는 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액 또는 공급원료는 약 7.0의 pH를 갖는다. 특정한 실시형태에서, HCIC 수지는 용액 또는 공급원료의 로딩 전에 약 4.0, 5.0, 5.25, 5.5, 5.75, 6.0, 6.25, 6.5, 6.75, 7.0, 7.25, 7.5, 7.75, 8.0, 8.25, 8.5, 8.75, 9.0, 9.25, 9.5 또는 10.0의 pH에서 평형화된다.
본 발명의 방법은, 또한, 필요한 경우, 추가의 불순물들을 제거하고 이에 의해 최종 제제의 순도를 개선시키기 위해, 둘 이상의 추가의 크로마토그래피 단계를 사용할 수 있다. 추가의 크로마토그래피 정제 단계들은, 본 발명에 따라 HCIC 수지를 통해 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 정제하기 전에 또는 정제한 후에 실행할 수 있다. 예를 들면, 단계 (ii)에서 HCIC 수지로부터 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액을 다른 크로마토그래피 수지에 통과시킬 수 있다.
상기 추가의 크로마토그래피 정제 단계들은 다른 HCIC 수지를 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양상에서, 피브리노겐, 인자 VIII 및 폰 빌레브란트 인자(VWF)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 공급원료를 제1 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계;
(ii) 상기 제1 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지를 통과한 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액을 회수하는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 회수된 용액을 제2 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계; 및
(iv) 상기 제2 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지를 통과한 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 용액을 회수하는 단계
를 포함하고,
여기서, 상기 크로마토그래피 단계들의 조건들은, 상기 공급원료 중에 존재하는 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이 상기 제1 수지 및/또는 상기 제2 수지에 결합되도록 하는 조건들이며, 단계 (iv)에서 회수된 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도는 상기 공급원료에 비해 50% 이상 감소되는, 방법이 제공된다.
한 실시형태에서, 단계 (iv)에서 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액 중의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 농도는 상기 공급원료에 비해 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 감소된다.
다른 양상에서, 안정한 액체 피브리노겐 용액의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 피브리노겐을 포함하는 공급원료를 제1 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계;
(ii) 상기 제1 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지를 통과한 피브리노겐을 포함하는 용액을 회수하는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 회수된 용액을 제2 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계; 및
(iv) 상기 제2 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지를 통과한 피브리노겐을 포함하는 용액을 회수하는 단계
를 포함하고,
여기서, 상기 크로마토그래피 단계들의 조건들은, 상기 공급원료 중에 존재하는 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이 상기 제1 수지 및/또는 상기 제2 수지에 결합되도록 하는 조건들이며, 단계 (iv)에서 회수된 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도는 상기 공급원료에 비해 50% 이상 감소되는, 방법이 제공된다.
한 실시형태에서, 단계 (iv)에서 회수된 피브리노겐을 포함하는 용액 중의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 농도는 상기 공급원료에 비해 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상 감소된다.
본원에 기재된 한 실시형태에서, 상기 제2 HCIC 수지는 상기 제1 HCIC 수지와 상이하다. 본원에 기재된 다른 실시형태에서, 상기 제1 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지와 상기 제2 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지는 동일하다. 단계 (ii)에서 HCIC 수지로부터 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액을 동일한 HCIC 수지에 통과시키는 경우, 상기 수지에 결합되어 있을 수 있는 임의의 불순물들을 제거하기 위해, 단계 (ii) 후에 상기 HCIC 수지를 세척하고, 회수된 용액을 단계 (iii)에서 상기 HCIC 수지에 통과시키기 전에 다시 상기 수지를 세척하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 추가의 크로마토그래피 수지는 또한 음이온 교환 크로마토그래피 수지일 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피에서, 음으로 하전된 분자들은 양으로 하전된 고체 지지체에 부착된다. 양으로 하전된 고체 지지체는 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 수단에 의해 제조될 수 있으며, 통상적으로는 음으로 하전된 관능성 리간드의 고체 지지체에의 공유 부착을 포함할 것이다. 적합한 음으로 하전된 관능성 리간드들은 예외없이, 용액으로부터 분리하고자 하는 분자에 좌우될 것이다. 적합한 음이온 교환 수지의 예는 관능성 4급 아민 그룹을 포함하는 수지(Q) 및/또는 3급 아민 그룹을 포함하는 수지(DEAE) 또는 디에틸아미노프로필 그룹을 포함하는 수지(ANX)이다. 시판되는 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스에는 DEAE 셀룰로스, Poros™ PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50(제조원: 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)), MonoQ™, MiniQ™, Source™ 15Q 및 3OQ, Q, DEAE 및 ANX Sepharose Fast Flow™, Q Sepharose high Performance™, QAE SEPHADEX™ 및 FAST Q SEPHAROSE™(제조원: 지이 헬스케어(GE Healthcare)), WP PEI™, WP DEAM™, WP QUAT™(제조원: 제이.티. 베이커(J.T. Baker)), Hydrocell™ DEAE 및 Hydrocell™ QA(제조원: 바이오크롬 랩스 인크.(Biochrom Labs Inc.)), UNOsphere™ Q, Macro-Prep™ DEAE 및 Macro-Prep™ High Q(제조원: 바이오래드(Biorad)), Ceramic HyperD™ Q, ceramic HyperD™ DEAE, Q HyperZ™, Trisacryl™ M 및 LS™ DEAE, Spherodex™ LS DEAE, QMA Spherosil™ LS, QMA Spherosil™ M(제조원: 팔 테크놀로지즈(Pall Technologies)), DOWEX™ 미세 메쉬 강염기 타입 I 및 타입 II 음이온 매트릭스 및 DOWEX™ MONOSPHER E 77 약염기 음이온(제조원: 다우 리퀴드 세퍼레이션스(Dow Liquid Separations)), Matrex Cellufine™ A200, A500, Q500 및 Q800(제조원: 밀리포어(Millipore)), Fractogel™ EMD TMAE3 Fractogel™ EMD DEAE 및 Fractogel™ EMD DMAE(제조원: 디엠디(EMD)), Amberlite™ 약 및 강 음이온 교환제 타입 I 및 II, DOWEX™ 약 및 강 음이온 교환제 타입 I 및 II, Diaion™ 약 및 강 음이온 교환제 타입 I 및 II, Duolite™(제조원: 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), TSK™ gel Q 및 DEAE 5PW 및 5PW-HR, Toyopearl™ SuperQ-650S, 650M 및 650C3 QAE-- 26 - 550C 및 650S, DEAE- 65OM 및 650C(제조원: 토소(Tosoh)), 및 QA52™, DE23™, DE32™, DE51™, DE52™, DE53™, Express-Ion™ D 및 Express-Ion™ Q(제조원: 와트만(Whatman))이 비제한적으로 포함된다.
바람직한 경우, 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스 대신에 음이온 교환 크로마토그래피 멤브레인이 사용될 수 있다. 시판되는 음이온 교환 멤브레인에는 Sartobind™ Q(제조원: 사르토리우스(Sartorius), Mustang™ Q(제조원: 팔 테크놀로지즈) 및 Intercept™ Q 멤브레인(제조원: 밀리포어)이 비제한적으로 포함된다.
본원에 기재된 한 실시형태에서, 상기 음이온 교환 수지는 강 음이온 교환 수지이다. 본원에 기재된 다른 실시형태에서, 상기 강 음이온 교환 수지는 4급 아민 관능성 리간드(예를 들면, MacroPrep™-HQ; 바이오-래드 래보러토리즈(Bio-Rad Laboratories)에서 보는 바와 같은 -N+(CH3)3)를 포함한다. 추가의 다른 실시형태에서, 상기 음이온 교환 수지는 연결 그룹을 통해 하이드록실화 메타크릴 중합체에 절편이식된 트리메틸아민 그룹, 예를 들면, GigaCap Q-650M®이다.
한 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF에 대해 포지티브 모드(positive mode)로 수행된다. 즉, 사용되는 조건들은, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액 또는 공급원료가 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 통과할 때, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF가 상기 수지에 부착된 양으로 하전된 관능 그룹들에 결합하여, 상기 용액 중의 불순물들이 유동-통과(flow-through)(낙하-통과) 분획 중에서 상기 수지를 통과하도록 하는 조건들이며, 상기 불순물들은 폐기되거나 기타 목적들을 위해 회수될 수 있다. 유동-통과 분획이 수지를 통과하고 나면, 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 적합한 세척 완충액으로 세척할 수 있다. 세척 완충액의 성분들 및 세척 단계의 조건들은 전형적으로, 수지에 결합된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF가 세척 단계 동안에 유지되도록 선택될 것이다. 당해 기술분야의 숙련가는 또한, 크로마토그래피와 관련하여, 세척 완충액, 용리 완충액 또는 이와 유사한 용어들에 대한 언급은 한정된 완충 용량을 갖거나 완충 용량을 전혀 갖지 않는 용액들을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본원에 기재된 한 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 용리시키기 전에, 상기 수지를 엡실론-아미노카프로산(ε-ACA)을 포함하는 세척 용액으로 세척한다. 세척 완충액에 ε-ACA를 첨가하면, 제1 통과 동안에 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되었을 수 있는 프로테아제들(예를 들면, 플라스미노겐)의 용리를 촉진시킬 수 있다. 적합한 세척 단계의 예는 미국 특허 제6,960,463호에 기술되어 있다.
음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합된 상태로 남아 있는 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 용리시키기 위해, 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 적합한 용리 완충액을 사용할 수 있다. 피브리노겐을 포함하는 용액으로부터 플라스미노겐 및/또는 t-PA 및/또는 다른 프로테아제(들)를 제거하기 위해, 본 발명자들은, 약 150mM 내지 약 300mM NaCl을 포함하는 용리 완충액은, 음이온 교환 수지로부터 피브리노겐 단량체들을 용리시키는 반면에, 상기 수지에 마찬가지로 결합되었을 수 있는 피브리노겐 응집물들 및/또는 다른 단백질들(예를 들면, 인자 VIII, VWF, 피브로넥틴 또는 프로테아제들)의 용리는 최소화시킨다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 본원에 기재된 한 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 약 150mM 내지 약 300mM NaCl을 포함하는 용리 완충액을 사용하여 음이온 교환 수지로부터 용리시킨다. 이는 약 18mS/㎝(150mM NaCl) 내지 약 32mS/㎝(300mM NaCl)의 전도도 범위를 갖는 용리 완충액과 동일시된다.
다른 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 약 150mM 내지 약 270mM NaCl을 포함하는 용리 완충액을 사용하여 음이온 교환 수지로부터 용리시킨다. 이는 약 18mS/㎝(150mM NaCl) 내지 약 29mS/㎝(270mM NaCl)의 전도도 범위를 갖는 용리 완충액과 동일시된다.
다른 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 약 170mM 내지 약 230mM NaCl을 포함하는 용리 완충액을 사용하여 음이온 교환 수지로부터 용리시킨다. 이는 약 19mS/㎝(170mM NaCl) 내지 약 25mS/㎝(230mM NaCl)의 전도도 범위를 갖는 용리 완충액과 동일시된다.
다른 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 약 200mM 내지 약 220mM NaCl을 포함하는 용리 완충액을 사용하여 음이온 교환 수지로부터 용리시킨다. 이는 약 22mS/㎝(200mM NaCl) 내지 약 24mS/㎝(220mM NaCl)의 전도도 범위를 갖는 용리 완충액과 동일시된다.
다른 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 약 190mM 내지 약 210mM NaCl을 포함하는 용리 완충액을 사용하여 음이온 교환 수지로부터 용리시킨다.
다른 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 약 150mM 내지 약 190mM NaCl을 포함하는 용리 완충액을 사용하여 음이온 교환 수지로부터 용리시킨다.
다른 실시형태에서, 상기 용리 완충액은 18 내지 32mS/㎝; 또는 20 내지 25mS/㎝; 또는 21 내지 23.5mS/㎝; 또는 22 내지 23mS/㎝ 범위의 전도도를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 상기 용리 완충액의 전도도는 약 22.5mS/㎝이다.
본원에 기재된 한 실시형태에서, 상기 용리 완충액은 피브리노겐 응집물들에 비해 피브리노겐 단량체의 용리를 촉진시키는 농도의 유리 아미노산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 용리 완충액은 약 0.5 내지 10%(w/w) 농도의 유리 아미노산을 포함한다. 임의의 적합한 유리 아미노산이 이러한 용량으로 사용될 수 있다. 한 실시형태에서, 상기 유리 아미노산은 아르기닌이다. 다른 실시형태에서, 상기 용리 완충액은 약 4 내지 약 10%(w/w) 범위의 아르기닌을 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 용리 완충액은 200mM NaCl, 0.5%(w/w) 아르기닌; 또는 160mM NaCl, 1%(w/w) 아르기닌을 포함한다.
한 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 피브리노겐에 대해 네거티브 모드로 그리고 인자 VIII 및/또는 VWF에 대해 포지티브 모드로 수행된다. 즉, 사용되는 조건들은, 피브리노겐 및 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액 또는 공급원료가 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 통과할 때, 인자 VIII 및/또는 VWF가 상기 수지에 부착된 양으로 하전된 관능 그룹들에 결합하여, 상기 용액 중의 피브리노겐이 유동-통과(낙하-통과) 분획 중에서 상기 수지를 통과하도록 하는 조건들이다. 피브리노겐 함유 유동-통과 분획이 수지를 통과하고 나면, 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 적합한 세척 완충액으로 세척할 수 있다. 세척 완충액의 성분들 및 세척 단계의 조건들은 전형적으로, 수지에 결합된 인자 VIII 및/또는 VWF가 세척 단계 동안에 유지되도록 선택될 것이다.
한 실시형태에서, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액 또는 공급원료를 약 150mM 내지 약 270mM NaCl의 존재 하에 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시킨다. 이는 약 18mS/㎝(150mM NaCl) 내지 약 29mS/㎝(270mM NaCl) 범위의 전도도와 동일시된다. 이들 조건 하에서, 피브리노겐, 특히 단량체 형태의 피브리노겐은 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 통과하는 반면, 피브리노겐 함유 응집물들, 및 IgG 및 피브로넥틴과 같은 기타 불순물들은 상기 수지에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액 또는 공급원료를 약 170mM 내지 약 230mM NaCl(약 19mS/㎝ 내지 약 25mS/㎝) 또는 약 200mM 내지 약 220mM NaCl(약 22mS/㎝ 내지 약 24mS/㎝)의 존재 하에 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시킨다. 이들 타입의 조건들 하에서, 인자 VIII 및/또는 vWF는 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합할 것으로 예상된다.
인자 VIII 및/또는 VWF는 300mM 이상의 NaCl과 같은 염을 포함하는 용리 완충액을 사용하여 음이온 교환 수지로부터 용리시킬 수 있다. 특정한 실시형태에서, 인자 VIII 및/또는 VWF는 약 500mM NaCl을 사용하여 음이온 교환 수지로부터 용리시킨다. 피브리노겐 및 인자 VIII 및/또는 VWF가 음이온 교환 수지에 결합된 경우, 용리 단계는, (예를 들면, 상기 실시형태에서 설명된 조건들을 사용하여) 먼저 피브리노겐을 용리시킨 다음, 500mM NaCl과 같은 더 고농도의 염을 사용하여 인자 VIII 및/또는 VWF를 용리시킬 수 있도록 수행될 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피 단계를 사용하는 경우, 이는 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 공급원료를 HCIC 수지에 통과시키기 전에 및/또는 통과시킨 후에 수행할 수 있다. 본원에 기재된 한 실시형태에서, 상기 방법은, 단계 (ii)에서 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같이, 제1 및 제2 HCIC 크로마토그래피 단계들이 사용되는 경우, 상기 방법은, 단계 (ii) 및/또는 단계 (iv)에서 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 한 실시형태에서, 상기 방법은, 단계 (i) 전에, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 공급원료를 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계를 추가로 포함한다.
당해 기술분야의 숙련가들은, 본 발명에 따라 사용되는 추가의 크로마토그래피 단계들의 수는 최종 제제에서 요구되는 순도의 수준에 좌우될 것임을 이해할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 바와 같은 2개, 3개, 4개 또는 5개의 크로마토그래피 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법이 2개의 크로마토그래피 단계들을 포함하는 경우, 상기 단계들의 순서는 HCIC/IEX 또는 HCIC/HCIC 또는 IEX/HCIC일 것이고; 상기 방법이 3개의 크로마토그래피 단계들을 포함하는 경우, 상기 단계들의 순서는 HCIC/IEX/HCIC 또는 HCIC/HCIC/IEX 또는 HCIC/HCIC/HCIC 또는 HCIC/IEX/IEX 또는 IEX/HCIC/HCIC 또는 IEX/HCIC/IEX 또는 IEX/IEX/HCIC일 것이고; 상기 방법이 4개의 크로마토그래피 단계들을 포함하는 경우, 상기 단계들의 순서는 HCIC/IEX/HCIC/HCIC 또는 HCIC/HCIC/IEX/HCIC 또는 HCIC/HCIC/HCIC/IEX 또는 HCIC/HCIC/HCIC/HCIC 또는 HCIC/IEX/IEX/HCIC 또는 HCIC/IEX/IEX/IEX 또는 HCIC/HCIC/IEX/IEX 또는 HCIC/IEX/HCIC/IEX 또는 IEX/HCIC/IEX/HCIC 또는 IEX/HCIC/HCIC/IEX 또는 IEX/HCIC/HCIC/HCIC 또는 IEX/HCIC/IEX/IEX 또는 IEX/IEX/HCIC/HCIC 또는 IEX/IEX/HCIC/IEX 또는 IEX/IEX/IEX/HCIC 등일 것이다(여기서, "IEX"는 음이온 교환 크로마토그래피를 의미한다). 요구되는 순도의 수준은 용액의 의도된 용도(예를 들면, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF 결핍을 갖는 환자의 치료를 위한 용도)에 의해 및/또는 수성 제제로서 더 장기간의 보관 기간이 요구되는지의 여부에 따라 지시될 수 있다.
크로마토그래피는 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 수단을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 크로마토그래피 단계들은 지이 헬스케어(GE Healthcare), 팔 코포레이션(Pall Corporation) 및 바이오-래드(Bio-Rad)로부터 구입가능한 것들과 같은 축류(axial flow) 컬럼, 또는 프록시스(Proxcys)로부터 구입가능한 것들과 같은 반경류(radial flow) 컬럼을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 크로마토그래피 단계들은 또한 확장 층 기술(expanded bed technology)들을 사용하여 수행될 수 있다.
한 실시형태에서, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 회수된 용액 중의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 농도는 공급원료에 비해 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상 감소한다.
플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)와 같은 불순물들의 제거를 최대화시키는 방법들이 특히 유리한데, 그 이유는, 특히 장기간 보관 동안에, 용액 중의 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 안정성 및 효능이 결정적으로 개선되기 때문이다. 액체 형태에서의 보관은, 환자에의 즉시 사용이 가능하기 때문에, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액에 특히 유리하다. 이는, 정제된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 동결건조된 제제를 사용할 때, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 직전에 주사를 위해 상기 동결건조된 단백질(들)을 적합한 완충액 및/또는 물로 재구성할 필요가 있는 경우와는 상반된다.
피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액으로부터 프로테아제들 또는 이들의 지모겐들(예를 들면, 플라스미노겐)을 고갈시키는 것의 이점은, 이것이, 임의의 잔류하는 프로테아제 및/또는 지모겐(예를 들면, 플라스민 또는 플라스미노겐)을 억제하기 위해 항-섬유소 용해 약물을 첨가할 필요성을 최소화시킨다는 것이다. 이러한 약물의 예에는, 소 단백질(bovine protein) 플라스민 억제제 아프로티닌; 또는 신경독성 부작용들과도 관련이 있는 합성 플라스민 억제제 오르트라넥삼산이 포함된다.
추가의 유리한 특징은, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액으로부터 HCIC에 의해 분리된 플라스미노겐을, 예를 들면, 임상 용도를 위한 플라스미노겐-함유 농축물을 수득하기 위해 추가로 가공할 수 있다는 것이다. 따라서, HCIC를 사용하여 단일 출발 용액으로부터, 플라스미노겐과, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액을 둘 다 제조할 수 있다.
추가의 유리한 특징은, HCIC 수지의 제조 비용이 친화성 크로마토그래피 절차에 사용되는 리신-Sepharose™ 또는 고정된 리신 수지의 비용보다 훨씬 더 경제적이라는 것이다.
추가의 유리한 특징은, HCIC는 프로테아제들(예를 들면, 인자 II)의 제거를 위한 수산화알루미늄(예를 들면, Alhydrogel™) 단계들을 대체하는데 사용될 수 있다는 것이다. Alhydrogel™은 인자 VIII 및 VWF의 상업적 제조에서 현재 광범위하게 사용되고 있다. 그러나, 상기 물질은 배치 1개당 전형적으로 100㎏이 사용되어 비용이 비교적 많이 든다. 더욱이, alhydrogel™은 종종 수동적 취급을 필요로 하며, 상기 물질은 1회 사용 후 폐기된다. 이와 달리, HCIC 단계들은 완전 자동화될 수 있고, 상기 수지는 복수개의 배치들의 제조에 사용될 수 있다.
다른 유리한 특징은, HCIC 수지는 컬럼 세정 및 수지 살균 절차 동안에 바이러스 및 프리온을 포함한 병원체들의 불활성화 및 제거에 사용될 수 있는 1M NaOH와 혼용가능(compatible)하다는 것이다.
본 발명의 방법들로부터 수득된 액체 제제들은 또한, 고가의 보관 및 운송 수단을 필요로 하고 즉시 사용 전에 해동되어야 하는 동결된 제제들의 사용에 비해 이점들을 갖는다. 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF가 동결건조된 또는 냉동된 제제로서 보관되는 경우에도, 재구성되거나 해동된 단백질은 더 장시간 동안 안정한 것이 유리하다. 이는, 예를 들면, 의료 절차를 위한 예방 수단으로서 물질을 재구성하였지만, 의학적 고찰에 기초하여 이의 사용을 요구하지 않는 경우에 명백하다. 피브리노겐은 프로트롬빈 및/또는 t-PA 및/또는 다른 프로테아제(들)의 존재로 인해 단기간에 걸쳐서만 안정하기 때문에, 상기 물질은 전형적으로는 폐기된다.
특정한 실시형태에서, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 함유하는 본 발명의 액체 제제들은 액체로서 또는 동결건조되거나 냉동된 제제로서 보관된다.
본 발명의 다른 양상에서, 피브리노겐의 정제 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 피브리노겐을 포함하는 용액을, 피브리노겐 단량체가 이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되도록 선택되는 조건들 하에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계;
(ii) 피브리노겐 단량체를 용리 완충액을 사용하여 상기 수지로부터 용리시키는 단계; 및
(iii) 단계 (ii)로부터의 상기 용리된 피브리노겐 단량체를 약 15㎚ 내지 약 35㎚ 범위의 세공 크기를 갖는 필터를 통해 여과하는 단계
를 포함하는, 방법이 제공된다.
한 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 포함하는 용액(단계 (i))은, 피브리노겐을 포함하는 공급원료를, 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)가 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 결합되고 피브리노겐이 상기 수지를 통과하도록 선택되는 조건들 하에서 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시킨 후에 회수된다.
한 실시형태에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 수지는 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 선택된다.
한 실시형태에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 약 음이온 교환 크로마토그래피 수지이다. 한 실시형태에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 4급 아미노 그룹을 포함한다. 이의 예에는 4급 알킬아민 및 4급 알킬알칸올 아민, 또는 아민, 디에틸아민, 디에틸아미노프로필, 아미노, 트리메틸암모늄메틸, 트리메틸벤질 암모늄, 디메틸에탄올벤질 암모늄, 및 폴리아민이 포함된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 3급 또는 4급 아민과 절편이식된 중합체 지지체이거나, 3급 또는 4급 아민과 절편이식된 하이드록실화 중합체 지지체이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 메타크릴레이트 중합체 지지체를 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 MacroPrep™ HQ이다. 다른 실시형태에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 GigaCap™ Q-650M이다. 다른 실시형태에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 컬럼 내에 팩킹된다.
바람직한 경우, 음이온 교환 크로마토그래피 수지 대신에 음이온 교환 크로마토그래피 멤브레인이 사용될 수 있다. 시판되는 음이온 교환 크로마토그래피 멤브레인에는 Sartobind™ Q(제조원: 사르토리우스), Mustang™ Q(제조원: 팔 테크놀로지즈) 및 Intercept™ Q 멤브레인(제조원: 밀리포어)이 비제한적으로 포함된다.
한 실시형태에서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 강 양이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 약 양이온 교환 크로마토그래피 수지이다.
시판되는 양이온 교환 크로마토그래피 수지에는, 예를 들면, 설포네이트계 그룹을 갖는 것들(예를 들면, MonoS, MiniS, Source™ 15S 및 30S, SP Sepharose Fast Flow™, SP Sepharose High Performance™(제조원: 지이 헬스케어), Toyopearl™ SP-650S 및 SP-650M(제조원: 토소), Macro-Prep High™ S(제조원: 바이오래드(BioRad), Ceramic HyperD™ S, Trisacryl™ M 및 LS™ SP 및 Spherodex™ LS SP(제조원: 팔 테크놀로지즈)); 설포에틸계 그룹을 갖는 것들(예를 들면, Fractogel™ SE(제조원: 이엠디(EMD)), Poros™ S-10 및 S-20(제조원: 어플라이드 바이오시스템즈)); 설포프로필계 그룹을 갖는 것들(예를 들면, TSK™ Gel SP 5PW 및 SP-5PW-HR(제조원: 토소), Poros™ HS-20 및 HS 50(제조원: 어플라이드 바이오시스템즈)); 설포이소부틸계 그룹을 갖는 것들(예를 들면, Fractogel™ EMD SO3"(제조원: 이엠디)); 설폭시에틸계 그룹을 갖는 것들(예를 들면, SE52, SE53 및 Express-Ion S(제조원: 와트만)), 카복시메틸계 그룹을 갖는 것들(예를 들면, CM Sepharose Fast Flow™(제조원: 지이 헬스케어), Hydrocell™ CM(제조원: 바이오크롬 랩스 인크.), Macro-Prep™ CM(제조원: 바이오래드), Ceramic HyperD™ CM, Trisacryl™ M CM, Trisacryl™ LS CM(제조원: 팔 테크놀로지즈), Matrex Cellufine™ C500 및 C200(제조원: 밀리포어), CM52™, CM32™, CM23™ 및 Express™ - Ion C(제조원: 와트만), Toyopearl™ CM-650S, CM-650M 및 CM-650C(제조원: 토소)); 설폰산 및 카복실산계 그룹을 갖는 것들(예를 들면, BAKERBOND™ Carboxy-Sulfon(제조원: 제이.태. 베이커)); 카복실산계 그룹을 갖는 것들(예를 들면, WP™ CBX(제조원: 제이.티. 베이커), DOWEX MAC-3™(제조원: 다우 리퀴드 세퍼레이션스), Amberlite™ 약 양이온 교환제, DOWEX™ 약 양이온 교환제, 및 Diaion™ 약 양이온 교환제(제조원: 시그마-알드리치) 및 Fractogel™ EMD COO-(제조원: 이엠디)); 설폰산계 그룹을 갖는 것들(예를 들면, Hydrocell™ SP(제조원: 바이오크롬 랩스 인크.), DOWEX™ 미세 메쉬 강산 양이온 매트릭스(제조원: 다우 리퀴드 세퍼레이션스), UNOsphere™ S, WP Sulfonic(제조원: 제이.티. 베이커), Sartobind™ S 멤브레인(제조원: 사르토리우스), Amberlite™ 강 양이온 교환제, DOWEX™ 강 양이온 및 Diaion 강 양이온 교환제(제조원: 시그마-알드리치)); 및 오르토포스페이트계 그룹을 갖는 것들(예를 들면, Pl 1(제조원: 와트만))이 비제한적으로 포함된다. 바람직한 경우, 양이온 교환 매트릭스 대신에 양이온 교환 크로마토그래피 멤브레인, 예를 들면, Sartobind™ S(사르토리우스; 뉴욕주 엣지우드 소재)가 사용될 수 있다.
한 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 포함하는 용액은 약 pH 7 내지 pH 10 범위의 pH를 갖는다. 한 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 포함하는 용액의 pH는 약 pH 8이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지는, 피브리노겐의 로딩 후에, 상기 피브리노겐을 포함하는 용액과 유사한 pH를 갖는 완충액(들)을 사용하여 예비-평형화되고 세척될 것이다.
한 실시형태에서, 상기 용리 완충액은 약 18 내지 약 30mS/㎝ 범위의 전도도를 갖는다. 예를 들면, 상기 용리 완충액의 전도도는 약 18 내지 약 25mS/㎝; 또는 약 19 내지 약 24mS/㎝; 또는 약 20 내지 약 24mS/㎝; 또는 약 21 내지 약 23mS/㎝ 범위일 수 있다. 한 실시형태에서, 상기 용리 완충액의 전도도는 약 22mS/㎝이다. 다른 실시형태에서, 상기 용리 완충액은 NaCl을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 용리 완충액은 NaCl을 약 180mM 내지 약 230mM, 또는 약 190mM 내지 약 210mM 범위의 농도로 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 용리 완충액 중의 NaCl 농도는 약 200mM이다.
한 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 포함하는 용리 완충액은 약 0.5 내지 약 10mg/ml의 단백질 농도를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 포함하는 용리 완충액의 단백질 농도는 약 4 내지 약 8mg/ml 범위이다. 특정한 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 포함하는 용리 완충액은 약 6mg/ml이다.
한 실시형태에서, 상기 용리된 피브리노겐 단량체는 여과(단계 (iii)) 전에 하나 이상의 아미노산과 함께 제형화된다. 한 실시형태에서, 상기 아미노산은 아르기닌 또는 글리신 또는 이들의 조합물이다. 몇몇 실시형태에서, 피브리노겐을 포함하는 용리 완충액 중의 아미노산 농도는 약 0.5 내지 약 10%(w/w) 범위이다. 한 실시형태에서, 피브리노겐을 포함하는 용리 완충액 중의 아미노산 농도는 약 1% 내지 약 6%(w/w), 또는 약 2% 내지 약 6%(w/w) 또는 약 2% 내지 약 5%(w/w)이다. 한 실시형태에서, 피브리노겐을 포함하는 용리 완충액은 약 2%, 또는 약 3%, 또는 약 4% 또는 약 5%(w/w) 아르기닌과 함께 제형화된다.
한 실시형태에서, 상기 용리된 피브리노겐 단량체는 약 pH 7 내지 약 pH 9의 pH를 갖는다.
한 실시형태에서, 단계 (ii)의 필터는 약 15㎚ 내지 약 35㎚; 또는 약 15㎚ 내지 약 30㎚; 또는 약 15㎚ 내지 약 25㎚; 또는 약 15㎚ 내지 약 20㎚ 범위의 세공 크기를 갖는다.
바이러스 여과는 접선 유동 여과(TFF: tangential flow filtration) 또는 '데드-엔드(dead-end)' 여과(정규 유동 여과로도 공지됨)를 이용하여 수행할 수 있다. 바이러스 필터는 원래 TFF에 사용하도록 설계되었으며, 비대칭 멤브레인의 상부 피층에 인접하여 공급물을 유동시킨다. TFF는 멤브레인 표면을 스위핑(sweeping)함으로써 높은 투과 속도(flux)를 제공하여 농도 분극과 오염을 감소시킨다. 그러나, 데드 엔드 여과는 간단하고 자본 비용이 더 낮기 때문에, 데드 엔드 여과를 위해 특정하게 설계된 바이러스 필터가 광범위하게 사용된다. TFF와 달리, 이들 데드-엔드 필터는 전형적으로, 멤브레인의 더 개방된 면이 공급물 스트림을 향하여 작동되어, 단백질 응집물들 및 기타 커다란 오염물들이 메크로다공성 구조 내에 포획되도록 하고 이에 의해 바이러스-보유 피층을 보호한다. 1회용 데드 엔드 필터 사용의 이점들에는, 이들이 시스템 설계와 시스템 검증을 둘 다 단순화시켜 노력과 자본 비용이 절감된다는 것이 포함된다.
데드-엔드 필터링은 전형적으로, 유체를 표면으로부터 멤브레인을 통해 유도하기 위한 단일 펌프의 사용을 포함한다.
접선 여과는 일반적으로, 필터 멤브레인의 표면에서 일정한 유속을 유지하기 위한 제1 펌프를 필요로 하고, 제2 펌프는 멤브레인의 후면에서 음압을 발생시킴으로써 멤브레인을 통해 단백질을 인출시킨다.
한 실시형태에서, 여과는 데드-엔드 여과에 의해 수행된다.
한 실시형태에서, 데드-엔드 여과 프로세스는 정압 여과 또는 정속 여과를 사용하여 수행된다. 한 실시형태에서, 데드-엔드 여과 프로세스는 정압 여과를 사용하여 수행된다.
여과는 전형적으로, 본원에서 사용되는 바이러스-제거 멤브레인의 물질에 따라, 멤브레인이 견딜 수 있는 수준의 여과 압력과 동일하거나 그보다 낮은 여과 압력으로, 예를 들면, 약 0.2 내지 약 3.4bar의 압력으로 수행된다. 한 실시형태에서, 상기 여과 압력은 약 0.2bar 내지 약 3.4bar로 유지된다. 다른 실시형태에서, 상기 여과 압력은 약 1 내지 약 3bar; 또는 약 1 내지 약 2bar; 또는 약 1.2 내지 약 2bar로 유지된다. 다른 실시형태에서, 상기 여과 압력은 약 1.5bar 내지 약 1.9bar로 유지된다.
온도는 단백질 용액의 점도에 그리고 바이러스-제거 멤브레인을 사용하는 여과 시의 투과 속도에 영향을 미칠 수 있다. 여과에 사용되는 용액은 전형적으로 약 0℃로부터 관심 단백질이 변성되는 온도까지의 범위 내의 온도를 갖는 것으로 당해 기술분야의 숙련가들에 의해 이해된다. 상기 용액의 온도는 적합하게는 약 10℃ 내지 약 50℃ 범위 내에 있다. 한 실시형태에서, 상기 용액의 온도는 약 18℃ 내지 약 35℃ 범위 내에 있다. 다른 실시형태에서, 상기 용액은 약 18℃ 내지 약 26℃의 실온에서 여과된다.
한 실시형태에서, 상기 바이러스 필터 용량은 필터 표면적 1㎡당 0.20㎏ 이상 또는 0.50㎏ 이상 또는 0.75㎏ 이상 또는 1.00㎏ 이상 또는 1.25㎏ 이상 또는 1.50㎏ 이상 또는 2㎏ 이상의 피브리노겐이다.
임의로, 거시적 크기의 입자들을 제거하기 위해 바이러스 여과 전에 예비-여과(pre-filtration) 또는 청징 여과(clarifying filtration) 단계를 수행할 수 있다. 한 실시형태에서, 예비-여과는 바이러스-제거 멤브레인의 세공 직경보다 더 큰 세공 직경을 갖는 멤브레인을 포함하는 예비-필터로 수행된다. 한 실시형태에서, 상기 예비-필터는 약 0.1㎛의 세공 크기를 갖는 멤브레인 필터이다. 다른 실시형태에서, 상기 예비-필터는 Pall Nylon 멤브레인 필터(SKL 7002 NTP 0.1㎛ 또는 FTKNI), 또는 단백질 응집물들 및/또는 미립자들의 제거를 위한 유사한 특성들을 갖는 다른 시판 예비-필터들로부터 선택된다. 예비-여과는 바이러스 필터와 일렬로 또는 바이러스 필터에 대해 열 외로 수행될 수 있다. 한 실시형태에서, 상기 예비-여과는 바이러스 필터에 대해 일렬로 수행된다.
본 발명의 이러한 양상에 따른 바이러스 여과 방법에 적합한 필터는 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지되어 있을 것이다. 하나의 예에는 여러가지 중에서도 Planova BioEx™이 포함된다. 이러한 필터는 때때로 '소형 바이러스(small virus)' 제거 필터라고 지칭된다.
한 실시형태에서, 상기 필터 멤브레인은 평면 시트 멤브레인 또는 중공 섬유 멤브레인이다. 평면 시트 멤브레인의 예에는 Pegasus™ Grade SV4 소형-바이러스 제거 필터(팔 코포레이션)와 같은 친수화된 PVDF 필터 멤브레인이 포함된다. 한 실시형태에서, 필터는 Pegasus™ Grade SV4이다.
다른 실시형태에서, 상기 필터는 중공 섬유 멤브레인이다. 중공 섬유 멤브레인은, 각각의 중공 섬유의 벽이 미세 모세관들에 의해 상호연결된 공극(void)들로 구성된 세공들의 3차원 웹(web) 구조를 함유하는, 스트로(straw) 모양의 중공 섬유들의 번들(bundle)을 함유할 수 있다. 중공 섬유 필터의 예에는, 친수성 개질된 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)를 중공 섬유 멤브레인 형식으로 혼입시킨 Planova™ BioEX™ 필터들(아사히 가세이 코포레이션(Asahi Kasei Corporation))이 포함된다. 한 실시형태에서, 상기 필터는 Planova™ BioEX이다.
한 실시형태에서, 2개 이상의 소형 바이러스 필터들이 직렬로 사용된다. 한 실시형태에서, 여과는 약 15 내지 약 20㎚ 범위의 세공 크기를 갖는 2개의 필터들을 직렬로 사용하여 수행된다. 이러한 여과 단계들은 파보바이러스-유사 MVM에 대해 적어도 LRV 6.9 log LRV로 피브리노겐을 제조할 수 있는 가능성을 갖는다.
본 발명의 다른 양상에서, 피브리노겐을 포함하는 용액을, 상기 용액 중에 존재하는 피브리노겐이 이온 교환 크로마토그래피 수지를 통과하도록 선택되는 조건들 하에서 이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시킨다. 즉, 상기 이온 교환 크로마토그래피는, 상기 용액이 상기 수지를 통과할 때, 상기 용액 중에 존재하는 피브리노겐 응집물들, 플라스미노겐 및 피브로넥틴과 같은 불순물들이 상기 수지에 부착된 하전된 관능 그룹들에 결합하여, 상기 용액 중에 존재하는 피브리노겐, 특히 피브리노겐 단량체가 유동-통과(낙하-통과) 분획 중에서 상기 수지를 통과하도록 하는 조건들 하에서, 피브리노겐에 대해 네거티브 모드로 수행된다. 피브리노겐 함유 유동-통과 분획이 수지를 통과하고 나면, 이온 교환 크로마토그래피 수지를 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 적합한 세척 완충액으로 세척할 수 있다. 세척 완충액의 성분들 및 세척 단계의 조건들은 전형적으로, 수지에 결합된 불순물들이 세척 단계 동안에 유지되도록 선택될 것이다.
한 실시형태에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 수지는 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 선택된다.
한 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 포함하는 용액을 약 150mM 내지 약 270mM NaCl의 존재 하에 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시킨다. 이는 약 18mS/㎝(150mM NaCl) 내지 약 29mS/㎝(270mM NaCl) 범위의 전도도와 동일시된다. 이들 조건 하에서 피브리노겐, 특히 단량체 형태의 피브리노겐은 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 통과하는 반면, 피브리노겐 함유 응집물들, 및 플라스미노겐 및 피브로넥틴과 같은 기타 불순물들은 상기 수지에 결합한다. 추가의 실시형태에서, 상기 피브리노겐을 포함하는 용액을 약 170mM 내지 약 230mM NaCl(약 19mS/㎝ 내지 약 25mS/㎝) 또는 약 200mM 내지 약 220mM NaCl(약 22mS/㎝ 내지 약 24mS/㎝)의 존재 하에 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시킨다. 이들 타입의 조건들 하에서, 상기 불순물들은 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합하여, 피브리노겐이 유동-통과 분획 중에서 상기 수지를 통과하도록 할 것으로 예상된다.
본 발명의 방법들에 의해 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액은, 상기 방법들이 심지어 실온에서도 기존의 동결건조된 제제들에 비해 더 높은 안정성을 갖는 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 제제를 제공하기 때문에 유리하다. 이는, 적절한 경우, 운송 및/또는 보관 내내 저온이 보장되지 않을 수 있는 장시간의 수송 경로 상에서 특히 유리할 수 있다. 용액 중의 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 안정한 보관은 또한, 다수의 측면에서, 제조, 사용, 운송 및 이를 필요로 하는 환자에의 투여를 용이하게 한다. 본 발명에 따라 제조된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 증가된 안정성으로 인해, 몇몇 환경에서 원치 않는 부작용들을 야기할 수 있거나 잠재적 위험을 줄이기 위해 피해야 하는 섬유소 분해 또는 피브리노겐 분해 억제제들과 같은 안정제들을 첨가하여 다수의 약제학적 제제들 중에서 분배하는 것이 가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "안정한"이란, 보관 전의 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 활성 수준에 비해(예를 들면, 본 발명에 따라 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액을 회수한 직후에 측정된 활성 수준에 비해), 소정 시간 동안 보관한 후의 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 활성 손실이 거의 없거나 실질적으로 전혀 없다는 것을 의미한다. 본원에 기재된 한 실시형태에서, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액은 약 0℃ 내지 약 30℃의 온도에서 소정 시간 동안 보관된 후에 70% 이상의 활성, 바람직하게는 80% 이상의 활성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 활성, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상의 활성, 가장 바람직하게는 100%의 활성을 보유한다. 당해 기술분야의 숙련가는, 보관 기간이 시작되기 직전의 피브리노겐 제제에 대해 피브리노겐 활성을 측정할 수 있고, 이러한 초기 값을 사용하여 100% 활성을 지정할 수 있으며, 이로부터 보관 기간 동안의 상이한 시점들에서 측정된 피브리노겐 활성을 비교하여 상기 초기 값의 백분율로서 표시할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에 기재된 한 실시형태에서, 본 발명의 방법들에 의해 회수된 피브리노겐은, 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 용액을 4주 이상 동안 보관한 후에 약 90% 내지 100%의 활성을 보유하며, 바람직하게는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 용액을 4주 동안 보관한 후에 약 90%의 활성을 보유한다. 본원에 기재된 다른 실시형태에서, 피브리노겐은 약 30℃의 온도에서 용액을 4주 이상 동안 보관한 후에 약 60% 내지 약 80%의 활성을 보유하며, 바람직하게는 약 30℃의 온도에서 용액을 5주 동안 보관한 후에 약 60% 내지 약 70%의 활성을 보유한다. 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 활성 수준은 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 수단에 의해 측정될 수 있다. 피브리노겐 활성의 적합한 측정 방법들의 예는, 예를 들면, 문헌[참조: Mackie et al., British J. Haematol. 121:396-404, 2003]에 요약되어 있다. 특정한 방법들에는 클라우스(Clauss)법[참조: Clauss, 1957, Acta-Haematol. 17, 237-246] 및/또는 응고성 단백질법[참조: Jacobsson K., Scand J Clin Lab Invest 1955;7 (supp 14):1-54 또는 Fibrin sealant Ph. Eur. Monograph 903, 2012]이 포함된다. 결과들은 응고성 단백질 %; 초기 응고성 단백질 %, 및/또는 클라우스법 또는 이와 유사한 방법을 사용하여 측정되는 바와 같은 초기 피브리노겐 활성 %으로서 보고될 수 있다.
당해 숙련가는, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 회수된 용액 중의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 농도는 보관 기간 및/또는 보관 조건들(예를 들면, 온도)을 지시할 가능성이 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 회수된 용액 중의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 농도가 공급원료에 비해 80% 감소된 제제는, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 회수된 용액 중의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 농도가 공급원료에 비해 단지 50% 감소된 제제에 비해, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 활성을 현저하게 불안정화시키지 않으면서 더 장시간 동안 및/또는 더 높은 온도에서 보관될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 방법들은 실험실 규모로 수행될 수 있지만, 이들은 조건들의 현저한 변화 없이 산업적 규모로 확장 가능하다. 따라서, 본원에 기재된 한 실시형태에서, 본 발명의 방법들은 산업적 또는 상업적 규모로 수행된다. 바람직하게, 본 발명의 방법들은 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 상업적 규모의 제조에 적합하다. 예를 들면, 본 발명의 방법에서 출발 물질로서 혈장 분획들을 사용하는 경우, 상업적 규모의 제조는 약 500㎏ 이상의 혈장으로부터 유도된 혈장 분획의 사용을 포함할 것이다. 더욱 바람직하게, 출발 혈장 분획은 배치 1개당 적어도 약 5,000㎏, 7,500㎏, 10,000㎏ 및/또는 15,000㎏의 혈장으로부터 유래될 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액들 및 약제학적 제형들은 혈장 분획 또는 재조합 공급원료로부터 상업적 규모로 제조된다.
피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액을 임상 또는 수의학 분야를 위해(예를 들면, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF 결핍을 갖는 대상체에게 투여하기 위해 또는 피브린 글루로서 사용하기 위해) 사용하려는 경우, 상기 용액 중의 활성 바이러스 함량(바이러스 역가) 및 다른 잠재적 감염원들(예를 들면, 프리온)의 수준을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다는 것을 당해 기술분야의 숙련가들이라면 이해할 것이다. 이는, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 공급원료(즉, 출발 물질)가 혈장으로부터 유래하는 경우에 특히 바람직할 수 있다. 용액 중의 바이러스 역가를 감소시키는 방법들은 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지되어 있을 것이다. 이의 예에는 저온 살균(예를 들면, 상기 용액을 고농도의 안정제, 예를 들면, 글리신(예를 들면, 2.75M) 및 수크로스(예를 들면, 50%) 및/또는 다른 선택된 부형제 또는 염의 존재 하에 60℃에서 10시간 동안 항온배양시킨다), 건식 열 처리, 바이러스 여과(상기 용액을 나노-필터; 예를 들면, 20㎚ 컷오프(cutoff)에 통과시킨다), 및/또는 상기 용액을 상기 용액 중의 바이러스를 불활성화시키기 위한 조건들 하에서 소정 시간 동안 적합한 유기 용매 및 세제로의 처리에 적용시키는 방법이 포함된다. 용매 세제는 외피성 바이러스, 특히 피브리노겐 및 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 혈장-유래 생성물 중의 외피성 바이러스를 불활성화시키는 데에 20년 넘게 사용되어 왔다. 따라서, 이는 당해 기술분야에 공지된 각종 시약들 및 방법들을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들면, US 제4540573호 및 US 제4764369호를 참조하기 바라며, 상기 특허문헌들은 인용에 의해 본원에 포함된다). 적합한 용매에는 트리-n-부틸 포스페이트(TnBP) 및 에테르, 바람직하게는 TnBP(전형적으로 약 0.3%)가 포함된다. 적합한 세제에는 폴리소르베이트(Tween) 80, 폴리소르베이트(Tween) 20 및 트리톤(Triton) X-100(전형적으로 약 0.3%)이 포함된다. 용매 및 세제 농도를 포함하는 처리 조건들의 선택은 공급원료의 특성들에 부분적으로 좌우되며, 덜 순수한 공급원료들은 일반적으로 더 높은 농도의 시약 및 더 극심한 반응 조건들을 필요로 한다. 바람직한 세제는 폴리소르베이트 80이고, 특히 바람직한 조합은 폴리소르베이트 80 및 TnBP이다. 공급원료를, 존재할 수 있는 모든 외피성 바이러스들을 불활성화시키기에 충분한 온도 및 시간으로 용매 및 세제 시약과 함께 교반할 수 있다. 예를 들면, 용매 세제 처리는 25℃에서 약 4시간 동안 수행될 수 있다. 이어서, 용매 세제 화학 물질들을, 예를 들면, C-18 소수성 수지와 같은 크로마토그래피 매체 상에서의 흡착에 의해 제거하거나, 관심 단백질을 흡착하는 조건들 하에서 이온 교환 수지의 낙하-통과 분획 중으로 이들을 용리시킴으로써 제거한다.
상기 바이러스 불활성화 단계는 본원에 기재된 방법들의 임의의 적합한 단계에서 수행될 수 있다. 한 실시형태에서, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 공급원료를 단계 (i) 전에 바이러스 불활성화 단계에 적용시킨다. 다른 실시형태에서, 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지로부터(즉, 단계 (ii) 및/또는 (iv)로부터) 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액을 바이러스 불활성화 단계에 적용시킨다. 본원에 기재된 한 실시형태에서, 상기 바이러스 불활성화 단계는 저온 살균 또는 유기 용매 및 세제로의 처리를 포함한다. 본원에 기재된 다른 실시형태에서, 바이러스 불활성화 단계는 바이러스 여과를 포함한다. 본 발명자들은, 바이러스 여과를 사용하는 경우, 여과 단계 전에 유리 아미노산(예를 들면, 아르기닌)을 첨가하면 필터를 통한 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 투과 속도 및 회수율이 크게 개선될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 이러한 방법의 예는 US 제7919592호에 기술되어 있다.
본원에 기재된 한 실시형태에서, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 공급원료 또는 용액을 바이러스 불활성화 단계에 적용시킨 후에 이것을 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시킨다. 용매 세제 처리와 같은 바이러스 불활성화 단계를 사용한 후에 상기 처리된 용액 또는 공급원료를 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시키는 것의 이점은, 상기 음이온 교환 수지는, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 수지에의 결합과, 유동-통과(낙하-통과) 분획에 의한 유기 용매 및 세제의 제거를 촉진시키는 조건들을 사용함으로써, 상기 처리된 용액으로부터의 유기 용매 및 세제의 제거를 가능하게 한다는 것이다.
저온 살균은, 특히 피브리노겐을 포함하는 용액(본원에서 "피브리노겐 용액"이라고도 지칭됨) 중에서, 단백질 응집물들 및 중합체들을 발생시킬 수 있다. 따라서, 몇몇 경우, 저온 살균된 용액 중의 응집물들/중합체들의 수준을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있지만, 편리하게는 추가의 크로마토그래피 정제에 의해 달성될 수 있다. 본원에 기재된 한 실시형태에서, 저온 살균된 용액 또는 공급원료를 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF에 대해 포지티브 모드로 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시켜서 모든 응집물들 또는 중합체들을 유동-통과(낙하-통과) 분획과 함께 제거한다.
용어 "공급원료(feedstock)"는 본원에서 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 임의의 용액을 의미하는데 사용된다. 공급원료는 또한 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 다른 단백질들(예를 들면, 치료학적 단백질들)을 포함할 수 있다. 이의 예에는 혈액 응고 연쇄 반응에 관련된 단백질들이 포함된다. 본원에 기재된 한 실시형태에서, 상기 공급원료는 피브리노겐을 포함한다.
피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 적합한 공급원료는 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지되어 있을 것이다. 이의 예에는 혈장 또는 혈장 분획들, 예를 들면, 사람 또는 동물 혈장 또는 혈장 분획으로부터 유래된 가용화된 혈장 한랭 침전물 또는 가용화된 분획 I 페이스트, 재조합 기술로부터의 세포 배양물 분획들, 형질전환 동물의 젖으로부터 유래된 분획들 등이 포함된다. 재조합 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF 단백질들의 공급원들도 본 발명에 따른 공급원료로서 사용되기에 적합하다. 상기 공급원료가 혈장 또는 혈장 분획인 경우, 이는 혼주 혈장 공여물일 수 있거나, 이는 개별 공여체로부터의 것일 수 있다. 본원에 기재된 한 실시형태에서, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 공급원료는 가용화된 혈장 한랭 침전물이다. 상기 성분은, 전혈로부터 유래되었든 성분 채집(apheresis)을 통해 수집되었든, 신선 냉동 혈장을 1 내지 6℃에서 제어 해동(controlled thawing)시키고 침전물을 회수함으로써 제조된다. 한랭-불용성 침전물은 다시 냉동된다. 하나의 단위의 성분 채집 한랭 침전물은 대략 2 단위의 전혈 유래 한랭 침전물과 동등하다. 이는, 피브리노겐, 인자 VIII 및 VWF의 대부분과, 신선 냉동 혈장으로부터의 인자 XIII 및 피브로넥틴과 같은 기타 단백질들을 함유한다. 피브리노겐의 다른 공급원은 분획 I 침전물이며, 이는 냉동 혈장을 해동시키고 한랭 침전물을 원심분리 또는 여과에 의해 제거함으로써 제조될 수 있다. 이후, 수득된 동결 상청액(cryosupernatant)을 에탄올과 혼합하여 분획 I을 침전시킨다. 예를 들면, 분획 I 침전물은 pH 7.2에서 약 8%(v/v) 에탄올을 첨가하고 온도를 약 -3℃로 제어하여 수득할 수 있다[참조: Cohn, et al. 1946, J. Am. Chem. Soc. 62: 459-475]. 한 실시형태에서, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 공급원료는 한랭 침전물이다.
본 명세서에서 "프로테아제(들)"에 대한 언급은, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 공급원료 또는 용액 중에 존재하는 임의의 프로테아제 및/또는 이의 지모겐에 대한 것일 수 있으며, 이는, HCIC 수지에 노출되었을 때, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF가 수지를 통과하는 조건들 하에서 HCIC 수지에 결합할 수 있다. 프로테아제는 세린 프로테아제(예를 들면, 플라스민, 트롬빈, 트립신), 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제(예를 들면, 카텝신 B 및 카텝신 H), 아스파르테이트 프로테아제(예를 들면, 펩신), 메탈로-프로테아제(예를 들면, 콜라게나제 및 젤라티나제) 및 글루탐산 프로테아제를 포함하는 임의의 타입일 수 있다. 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 공급원료가 사람 또는 동물의 혈장으로부터 유래된 경우, 프로테아제/지모겐에는 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자(tPA), 트롬빈, 엘라스타제, 인자 VIIa, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 XIa, 인자 XIIa, 인자 XIIIa, 혈장 칼리크레인 등이 포함될 수 있다. 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액에 관해, 제거되는 특정한 바람직한 프로테아제/지모겐은 플라스미노겐이다. 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액으로부터 제거되는 기타 바람직한 프로테아제/지모겐은 t-PA, 프로트롬빈 및/또는 활성 트롬빈(인자 II/IIa)이다. 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 공급원료가 세포 배양물 상청액으로부터 유래된 경우, 프로테아제/지모겐에는, 다른 것들 중에서도, 세린 프로테아제(예를 들면, 카제이나제), 메탈로프로테아제(예를 들면, 젤라티나제, 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)(MMP3, MMP10 또는 MMP12를 포함함), 아스파르트산 프로테아제(카텝신 D), 산 프로테아제와 같은 임의의 숙주 세포 프로테아제가 포함될 수 있다.
몇몇 경우, 단계 (i)에서 공급원료를 HCIC 수지에 통과시키기 전에 상기 공급원료로부터 불순물들을 제거하거나 불순물들의 수준을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 공급원료로부터 불순물들을 제거하거나 불순물들의 수준을 감소시키면, 크로마토그래피 정제 동안의 HCIC 수지 상의 부하를 감소시킬 수 있고 이에 따라 상기 공급원료로부터의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 분리 효율을 개선시킬 수 있다. 불순물들은, 예를 들면, 공급원료로부터 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 침전시키고, 상기 침전된 단백질(들)을 회수함으로써 제거되거나 감소될 수 있다. 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 공급원료로부터 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 침전시키는 적합한 방법들은 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지되어 있을 것이다. 이의 예에는, 상기 공급원료에 수산화알루미늄 현탁액을 첨가하는 것이 포함되는데, 이는 혈장 또는 혈장 한랭 침전물로부터 비타민 K-의존성 단백질들(예를 들면, 응고성 인자 II, VII, IX, 및 X) 및 프로트롬빈(인자 II) 및 t-PA와 같은 수산화알루미늄 결합 친화성을 갖는 기타 단백질들을 제거하는데 특히 유용하다.
따라서, 본원에 기재된 한 실시형태에서, 단계 (i) 전에, 비타민 K-의존성 단백질들을 공급원료로부터 제거하거나 감소시킨다. 추가의 실시형태에서, 상기 공급원료에 수산화알루미늄을 첨가함으로써 비타민 K-의존성 단백질들을 제거하거나 감소시킨다. 수산화알루미늄은 약 10% 내지 약 80% w/w의 최종 농도로 공급원료에 첨가되는 Alhydrogel®의 형태일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 수산화알루미늄은 약 10% 내지 약 50%(w/w) 범위의 최종 농도로 상기 공급원료에 첨가된다. 다른 실시형태에서, 상기 수산화알루미늄은 약 10% 내지 약 30%(w/w) 범위의 최종 농도로 상기 공급원료에 첨가된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 농도는 약 15% 내지 약 30%(w/w)이다. 가장 바람직하게는, 상기 수산화알루미늄은 최적의 피브리노겐 회수 및 프로트롬빈과 같은 불순물들의 제거를 위해 약 15% 내지 약 25%(w/w)로 상기 공급원료에 첨가된다. 다른 실시형태에서, 비타민 K-의존성 단백질들은 수산화알루미늄을 사용하는 배치 흡착(batch adsorption)에 의해 상기 공급원료로부터 제거된다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액이 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 용액 중의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 수준은 총 단백질의 20% 미만, 바람직하게는 총 단백질의 10% 미만, 더욱 바람직하게는 총 단백질의 5% 미만, 또는 총 단백질의 1% 미만, 또는 총 단백질의 0.1% 미만, 또는 총 단백질의 0.01% 미만, 또는 총 단백질의 0.001% 미만, 또는 총 단백질의 0.0001% 미만일 것이다. 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액 중에 존재하는 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 수준은 상기 용액의 의도된 용도 또는 보관 기간에 좌우될 수 있다는 것을 당해 기술분야의 숙련가라면 이해할 것이다. 예를 들면, 상기 용액을 약 0℃ 내지 약 8℃의 온도에서 4주 이상 동안 보관하려는 경우, 상기 용액은 (총 단백질의) 약 10%를 초과하는 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)를 포함하는 것이 허용 가능하다. 상기 용액을 약 30℃의 온도에서 4주 이상 동안 보관하려는 경우, 상기 용액은 (총 단백질의) 약 10% 미만의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)를 포함하는 것이 허용 가능하다.
본원에 기재된 한 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 회수된 피브리노겐을 포함하는 용액이 제공된다. 다른 실시형태에서, 상기 용액은 총 단백질의 80% 이상의 피브리노겐을 포함한다.
본 발명의 다른 양상에서,
(a) 총 단백질의 75% 이상의 피브리노겐;
(b) 총 단백질 1mg 당 50pg 미만의 조직 플라스미노겐 활성화 인자; 및/또는
(c) 총 단백질 mg당 1㎍ 미만의 플라스미노겐
을 포함하는 용액이 제공된다.
한 실시형태에서, 상기 용액은 총 단백질 mg당 1.5×10-5U 미만의 인자 II를 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 양상에서,
(a) 총 단백질의 90% 이상의 피브리노겐;
(b) 총 단백질 mg당 50pg 미만의 조직 플라스미노겐 활성화 인자; 및/또는
(c) 총 단백질 mg당 150ng 미만의 플라스미노겐
을 포함하는 용액이 제공된다.
한 실시형태에서, 상기 용액은
(a) 총 단백질 mg당 3.5×10-6U 미만의 인자 II; 및/또는
(b) 총 단백질 mg당 150㎍ 미만의 피브로넥틴
을 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 양상에서,
(a) 총 단백질의 90% 이상의 피브리노겐;
(b) 총 단백질 mg당 50pg 미만의 조직 플라스미노겐 활성화 인자; 및/또는
(c) 총 단백질 mg당 10ng 미만의 플라스미노겐
을 포함하는 용액이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서,
(a) 총 단백질의 90% 이상의 피브리노겐;
(b) 총 단백질 mg당 20pg 미만의 조직 플라스미노겐 활성화 인자; 및/또는
(c) 총 단백질 mg당 10ng 미만의 플라스미노겐
을 포함하는 용액이 제공된다.
한 실시형태에서, 상기 용액은
(a) 총 단백질 mg당 2.7×10-6U 미만의 인자 II; 및/또는
(b) 총 단백질 mg당 15㎍ 미만의 피브로넥틴
을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 방법들에 의해 회수된 용액 중의 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 농도 및 불순물들(예를 들면, 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들))의 농도는 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 수단에 의해 측정될 수 있다. 피브리노겐 측정을 위한 적합한 검정의 예는 문헌[참조: Mackie et al., Br J Haematol. 2003 May;121(3):396-404]에 기술되어 있다. 피브리노겐 및/또는 인자 VIII을 포함하는 용액 중의 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 또는 불순물의 농도를 측정하기 위해 크기 배제 HPLC를 사용할 수도 있다(예를 들면, 문헌[Cardinali et al. 2010, Arch. Biochem. Biphys. 493(2):157-168] 및 문헌[Kosloski et al. 2009, AAPS J. 11(3); 424-431] 참조). HPLC는 또한 당해 기술분야의 숙련가로 하여금 피브리노겐의 단량체들과 피브리노겐의 응집물들을 구별할 수 있도록 한다. 추가로, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF의 농도는 사용되는 검정의 민감도에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 클라우스 검정을 사용하여 측정된 용액 중의 피브리노겐 농도는 동일한 용액 중에서 HPLC에 의해 측정된 농도보다 약간 더 낮을 수 있다.
본원에 기재된 한 실시형태에서, 상기 용액 중의 단량체 피브리노겐의 농도는, 크기 배제 HPLC에 의한 측정시, 총 단백질의 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 기재된 방법들에 의해 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 제형이 제공된다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는, 약제학적으로 허용되는 희석제 및/또는 부형제를 포함하여, 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지되어 있을 것이다. 이의 예에는 용매, 분산 매질, 항진균제 및 항균제, 계면활성제, 등장제 및 흡수제 등이 포함된다.
상기 약제학적 제형은 또한, 적합한 안정제들, 예를 들면, 아미노산, 탄수화물, 염 및 세제의 조합물을 첨가하여 제형화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 안정제는 당 알코올과 아미노산의 혼합물을 포함한다. 상기 안정제는 당(예를 들면, 수크로스 또는 트레할로스), 당 알코올(예를 들면, 만니톨 또는 소르비톨) 및 아미노산(예를 들면, 프롤린, 글리신 및 아르기닌)의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 제형은 아르기닌과 같은 아미노산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 제형은, US 제7045601호에 기술된 바와 같이, 100mM 이하의 농도의 2가 금속 이온들 및 착물화제를 포함한다. 특정 실시형태에는 US 제7045601호의 실시예 1에 기술된 바와 같은 제형 1 내지 7이 포함된다. 특정 실시형태에서, 상기 제형은 임의의 항-섬유소 용해 약물 또는 알부민과 같은 안정화 단백질을 첨가하지 않고서 제형화된다. 상기 제형이 피브리노겐을 포함하는 실시형태에서, pH는 바람직하게는 약 6.5 내지 7.5이고, 삼투질 농도는 240mosmol/㎏ 이상이다.
상기 약제학적 제형은 또한, 분배 및 장기간 보관 전에, 여과에 의해 멸균될 수 있다. 바람직하게, 상기 제형은 적어도 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 10개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월 또는 그 이상 동안 실질적으로 이의 원래의 안정성 특성들을 유지할 것이다. 예를 들면, 2 내지 8℃ 또는 25℃에서 보관된 제형들은 전형적으로, 6개월 또는 그 이상 동안 보관될 때, HPLC-SEC에 의한 측정시 실질적으로 동일한 분자 크기 분포를 유지할 수 있다. 상기 약제학적 제형의 특정한 실시형태는, 2 내지 8℃ 및/또는 실온에서 보관될 때 적어도 6개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월 또는 심지어 그 이상 동안 안정할 수 있으며 상업적인 약제학적 용도에 적합할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 용액들 및 약제학적 제형들은 다수의 가능한 투여형들 중 어느 것, 예를 들면, 주사가능 제형으로 제형화될 수 있다. 제형화 및 이들의 후속 투여(투약)는 당해 기술분야의 숙련가들의 기량 내에 있다. 투약은 치료에 대한 대상체의 반응성에 좌우되지만, 원하는 효과(예를 들면, 정상적인 피브리노겐 혈장 수준으로의 회복)가 요구되는 만큼 오랫 동안 예외없이 지속될 것이다. 통상의 숙련가들은 최적의 투여량, 투약 방법 및 반복 횟수를 용이하게 결정할 수 있다.
본원에 기재된 한 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 제형은 5ml 이상의 용적을 갖고, 5mg/ml 이상의 피브리노겐을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 약제학적 제형은 5ml 이상의 용적을 갖고, 20mg/ml 이상의 피브리노겐을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 약제학적 제형은 5ml 이상의 용적을 갖고, 약 20mg/ml, 25mg/ml, 30mg/ml, 35mg/ml, 40mg/ml, 45mg/ml, 50mg/ml, 55mg/ml, 60mg/ml, 65mg/ml, 70mg/ml, 75mg/ml, 80mg/ml, 90mg/ml 또는 100mg/ml 농도의 피브리노겐을 포함한다. 다른 양상에서, 5ml 이상의 안정한 약제학적으로 허용되는 피브리노겐 용액을 함유하는 용기가 제공되며, 여기서 상기 피브리노겐의 농도는 20mg/ml 이상이다.
본 발명의 다른 양상에서, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF 결핍과 관련된 병태의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 방법은, 상기 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액 또는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 약제학적 제형을 투여함을 포함하는, 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에서, 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF 결핍과 관련된 병태의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조시의, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액의 용도가 제공된다. 당해 기술분야의 숙련가들은 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF 결핍과 관련된 병태들의 타입들에 친숙할 것이다. 한 실시형태에서, 상기 피브리노겐 병태는 무섬유소원혈증, 저섬유소원혈증 및 이상섬유소원혈증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 상기 인자 VIII 및/또는 VWF 병태는 혈우병 A, 출혈성 장애(예를 들면, 혈소판 기능 결손, 혈소판 감소증 또는 폰 빌레브란트병), 혈관 손상, 외상 또는 수술로부터의 출혈, 항응혈 요법으로 인한 출혈, 간 질환으로 인한 출혈로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법들에 의해 회수된 피브리노겐 및/또는 인자 VIII 및/또는 VWF를 포함하는 용액으로 치료될 수 있는 다른 병태들에는 중대한 상처 및 심한 출혈 및 화상이 포함된다. 저섬유소원혈증 및 무섬유소원혈증의 경우, 피브리노겐 결핍의 상태를 보상하기 위해, 이를 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따라 제조된 피브리노겐을 포함하는 용액을 정맥내 주사할 수 있으며, 투여량은 결핍의 정도에 기초하여 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법들에 의해 회수된 피브리노겐을 포함하는 용액은 또한, 불안정화 수준의 플라스미노겐 및/또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및/또는 다른 프로테아제(들)의 결여로 인해 피브린 글루(피브린 씰런트(sealant)로도 공지되어 있음)의 사용에서 이점들을 갖는다. tPA는, (예를 들면, 지혈을 위한) 국소 적용 시, 플라스미노겐을 이의 활성 형태인 플라스민으로 전환시키고, 상기 플라스민은 다시 피브린 응괴를 소화시키고 이에 따라 응괴 형성을 감소시킨다.
피브린 글루는 전형적으로 두 가지의 성분들: (i) (빈번하게는 인자 XIII 및 아프로티닌과 같은 섬유소 분해 억제제와 함께) 피브리노겐, 및 (ii) (빈번하게는 칼슘 이온들과 함께) 트롬빈을 포함한다. 상기 두 가지의 성분들은 즉석 사용 가능한 글루를 제조하기 위해 재구성된다. 피브린 글루는 임상 및 수의학 분야에서, 칼슘 및 인자 XIII의 존재 하에 피브리노겐과 트롬빈의 조합물을 사용하는 가교-결합된 피브린 섬유들의 형성을 통해 응고의 최종 단계를 모사하는데 사용된다. 피브린 글루는 지혈, 상처 봉합, 접착 예방 및 상처 치유를 포함하는, 임상 및 수의학에서의 각종 분야들을 갖는다. 피브린 글루는 또한, 피부 상처(피부 이식을 포함함)를 봉합하기 위해, 봉합선을 밀봉하기 위해, 그리고 골, 연골 및 힘줄과 같은 연결 조직을 결합하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 다른 양상에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법들에 의해 회수된 피브리노겐을 포함하는 용액을 포함하는 피브린 글루가 제공된다.
당해 기술분야의 숙련가들은, 본원에 기술된 본 발명은 구체적으로 기술된 것들 이외의 변화 및 변형을 허용한다는 것을 인지할 것이다. 본 발명은 본 발명의 취지 및 범위 내에 속하는 모든 이러한 변화 및 변형을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명은 또한, 본 명세서에 개별적으로 또는 일괄적으로 언급되거나 지시된 모든 단계들, 특징들, 조성물들 및 화합물들, 및 상기 단계들 또는 특징들 중 임의의 둘 이상의 임의의 모든 조합들을 포함한다.
이하, 본 발명의 특정한 실시형태를 하기 실시예를 참조로 하여 설명할 것이며, 이들 실시예는 단지 예시의 목적을 위해 의도되고, 위에 기술된 일반론의 범위를 한정하지 않는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1 - HEA, PPA 및 MEP 소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC) 수지를 통한 피브리노겐의 정제
사람 혼주 혈장 한랭 침전물을 출발 물질(즉, 피브리노겐-함유 공급원료)로서 사용하였다. 간략하게, 상기 혼주 혈장 한랭 침전물을 31±2℃에서 30분 동안 20mM 시트르산삼나트륨, 200mM 엡실론-아미노카프로산(ε-ACA), 60IU/mL 헤파린 및 500mM NaCl(pH 7.2±2)을 함유하는 추출 완충액 중에서 가용화시켰다(완충액 4g당 한랭 침전물 1g). 이어서, 상기 가용화된 한랭 침전물에 수산화알루미늄 2%(w/w)을 25%(w/w)의 농도로 첨가하였다. 이후, 상기 수산화알루미늄 겔을 원심분리 또는 심층 여과에 의해 제거하고, HCIC 크로마토그래피 수지를 통한 추가의 크로마토그래피 정제를 위해 피브리노겐-함유 상청액을 회수하였다.
상기 피브리노겐-함유 상청액을, HEA, PPA 또는 MEP Hypercel™ 수지 1.8ml로 팩킹된 크로마토그래피 컬럼에 적용시켰다. 상기 크로마토그래피 컬럼은 6.5 내지 8.5 범위의 상이한 pH에서 25mM 트리스(Tris) 중에서 미리 평형화되었다. 상기 피브리노겐-함유 상청액은 크로마토그래피 컬럼 상에 수지 mL당 대략 11mL의 비로 로딩되었다. HCIC 정제는 피브리노겐에 대해 네거티브 모드로 수행되었고, 여기서, 피브리노겐은 결합되지 않은 유동-통과 분획 중에 낙하-통과하도록 허용된 반면, 대부분의 t-PA, 플라스미노겐 및 인자 II는 상기 수지에 결합된 상태로 남아 있었다.
도 1 내지 도 3은, HEA Hypercel™, PPA Hypercel™ 및 MEP Hypercel™을 사용한 크로마토그래피 정제 후의 피브리노겐, 플라스미노겐, t-PA 및 인자 II의 단계 회수율을 도시한다. 상기 결과들은, pH가 이들 수지에 대한 플라스미노겐 결합에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 반면, 상기 수지들에 대한 t-PA의 결합은 더 낮은 pH 범위에서 가장 효과적인 것으로 나타났음을 보여준다. HEA Hypercel™ 컬럼은 낙하-통과 분획 중의 최고 피브리노겐 회수율을 나타냈고, 시험된 작동 pH 범위는 PPA 및 MEP Hypercel™ 컬럼들 둘 다에서 관찰된 것과 비교하여 피브리노겐 회수율에 거의 영향을 미치지 않은 것으로 밝혀졌다. PPA 컬럼과 MEP 컬럼은 둘 다 pH 8.5에서 낙하-통과 분획 중의 최고 피브리노겐 회수율을 나타냈다.
실시예
2 -
HEA
Hypercel
을 통해
감소된
피브리노겐 용액 중의 불순물들의 수준
실시예 1에 따라 제조된 대략 48.5mL의 피브리노겐 함유 가용화된 한랭 침전물을, pH 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 또는 8.5에서 25mM 트리스 중에서 미리 평형화시킨 5mL HEA Hypercel™ 컬럼 상에 적용시켰다. HCIC 정제는 피브리노겐에 대해 네거티브 모드로 수행되었고, 여기서, 피브리노겐은, 결합되지 않은 유동-통과 분획 중에 낙하-통과하도록 허용된 반면, t-PA, 플라스미노겐 및 인자 II는 상기 수지에 결합된 상태로 남아 있었다. 도 4a는, HEA Hypercel™을 사용한 크로마토그래피 정제 후 동안의 피브리노겐, 플라스미노겐, t-PA 및 인자 II의 단계 회수율을 도시한다. 상기 결과들은, pH가 HCIC 수지에 대한 플라스미노겐 및 인자 II의 결합에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 반면, 상기 수지에 대한 t-PA의 결합은 6.5 내지 7.0의 더 낮은 pH 범위에서 가장 효과적인 것으로 밝혀졌음을 보여준다. 컬럼 세척을 수행하지 않았음에도 불구하고, 피브리노겐의 회수율은, 상이한 pH 조건들 하의 낙하-통과 분획 중에서 90%를 초과하였다. 도 4a에 나타난 바와 같이, 이들 결과는, 가용화된 한랭 침전물과 같은 조(crude) 피브리노겐-함유 공급원료 중의 프로테아제들의 HCIC 수지에 의한 효과적인 제거를 입증한다. 예를 들면, pH 7.0에서 수행된 실험 조건은, 상기 가용화된 한랭 침전물 용액으로부터, 인자 II의 경우 ≥ 99.9%, t-PA의 경우 88.3%, 그리고 플라스미노겐의 경우 ≥ 98.2%의 감소율을 나타냈다.
상기 피브리노겐은 실온(대략 20℃)에서 6일 이상 동안 용액 중에서 안정하게 유지되었다. 상기 결과들은 도 4b 및 도 4c에 제시되어 있다.
실시예 3 - HEA Hypercel을 통해 정제된 피브리노겐 용액 중의 불순물들의 수준
실시예 1에 따라 생성된 alhydrogel™ 흡착 단계 후에 수득된 대략 500mL의 피브리노겐-함유 상청액을, 25mM 트리스 pH 7.0 중에서 미리 평형화된 36mL의 HEA Hypercel™ 수지로 팩킹된 XK 16/30 컬럼 상에 로딩하였다. 피브리노겐, 플라스미노겐, t-PA 및 인자 II 시험을 위해 낙하-통과 분획을 수집하였다. 상기 결과들의 요약이 하기 표 1에 제공된다.
실시예 4 - HEA Hypercel을 통해 정제된 피브리노겐 용액 중의 불순물들의 수준에 대한 글리신 침전의 효과
실시예 1에 따라 생성된 알하이드로겔(alhydrogel) 흡착 단계 후의 피브리노겐-함유 상청액을, 2.4M 글리신, 2.7M NaCl, 2.1mM CaCl2 및 23mM 시트르산삼나트륨을 포함하는 염수 용액(pH 6.6 내지 7.3)을 첨가함으로써 추가의 침전 단계에 적용시켰다. 상기 가용화된 침전물을 30℃로 승온시킨 후, 마찬가지로 30℃에서 항온배양된 글리신 완충액을 생성물 대 완충액 비 1:2로 첨가하였다. 상기 혼합물을 10분 동안 교반하고, 수득된 침전물을 원심분리에 의해 액체 상으로부터 회수하였다. 주로 피브로넥틴 및 IgG를 함유하는 액체 상을 폐기시키고, 피브리노겐-함유 침전물을 수집하고, 100mM NaCl, 1.1mM CaCl2, 10mM 시트르산삼나트륨, 10mM 트리스-(하이드록시메틸 메틸아민) 및 4.5mM 수크로스를 함유하는 가용화 완충액(pH 7.0)에 재현탁시켰다. 상기 가용화된 피브리노겐 중간체(250mL)를 1㎛ 필터를 사용하여 정화(clarified)시킨 후, 25mM 트리스 pH 7.0 중에서 미리 평형화된 36mL의 HEA Hypercel™ 수지로 팩킹된 XK 16/30 컬럼에 통과시켰다. 피브리노겐, 플라스미노겐, t-PA 및 인자 II 시험을 위해 낙하-통과 분획을 수집하였으며, 상기 결과들의 요약이 하기 표 2에 제공된다.
상기 결과들은, HEA Hypercel™ 수지에 대한 플라스미노겐, t-PA 및 인자 II의 결합이, 실시예 2에 기술된 조건들 하에서 관찰된 것과 비교하여 당해 프로세싱 조건들 하에서 더욱 효과적이었음을 입증한다. 상기 특성확인 결과들은, 피브리노겐의 경우 대략 93%, 플라스미노겐의 경우 6%, t-PA의 경우 12%, 그리고 인자 II의 경우 5%의 단계 회수율을 나타낸다.
실시예 5 - 혈장 한랭 침전물로부터의 정제된 피브리노겐의 제조
프로세스 단계 1 - 혈장 한랭 침전물의 가용화;
프로세스 단계 2 - 가용화된 혈장 한랭 침전물의 Alhydrogel™(수산화알루미늄) 흡착(Alhydrogel™ 농도: 표적 15 내지 20% w/w, 10 내지 50% w/w 범위) 및 여과 조제의 존재 하에 원심분리 또는 심층 여과와 같은 방법들을 사용하는 피브리노겐-함유 상청액의 회수. 대안으로, 당해 단계는 피브리노겐에 대해 네거티브 모드(낙하 통과)인 HCIC 크로마토그래피 단계, 또는 둘 다 피브리노겐에 대해 네거티브 모드인 HCIC와 음이온 교환 크로마토그래피의 조합으로 대체될 수 있다. HCIC와 음이온 교환 크로마토그래피를 둘 다 조합하여 사용하는 경우, 프로세스 단계 3은 선택 사항이다;
프로세스 단계 3 - 단계 2의 피브리노겐-함유 상청액으로부터의 피브리노겐의 글리신 침전. 대안으로, 당해 단계는, 피브리노겐에 대해 네거티브 모드인 음이온 교환 크로마토그래피로 대체될 수 있다;
프로세스 단계 4 - 단계 3으로부터의 가용화된 글리신 침전물을 피브리노겐에 대해 네거티브 모드로 HCIC 크로마토그래피 수지에 통과시킴;
프로세스 단계 5 - 단계 4에서 회수된 정제된 피브리노겐 용액을 용매 또는 세제로 처리하거나 저온 살균하여 병원체를 불활성화시킴;
프로세스 단계 6 - 단계 5로부터의 처리된 용액을 피브리노겐에 대해 포지티브 모드로 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시키고, 약하게 결합된 단백질들을 상기 수지로부터 세척하고, 상기 수지로부터 피브리노겐을 용리시킴;
프로세스 단계 7 - 단계 6에서 음이온 교환 수지로부터 용리된 피브리노겐을 나노여과(35㎚ 또는 20㎚ 또는 35/20㎚의 조합)에 적용시킴; 그리고
프로세스 단계 8 - 단계 7로부터의 여과된 피브리노겐을 한외여과(50, 100, 200 및 300kDa 멤브레인 필터)에 적용시킴.
실시예 6 - HCIC와 음이온 교환 크로마토그래피의 조합에 의한 정제된 피브리노겐의 제조
실시예 1 내지 실시예 3에 기술된 단계들로부터 HEA Hypercel™ 컬럼을 사용한 혼합 모드 크로마토그래피 단계에 이르기까지의 절차에 따라 대략 100g의 한랭 침전물을 제조하는 3가지의 실험실 규모 실험들을 완료하였다.
주로 피브리노겐을 함유하는 상기 HEA Hypercel™ 컬럼으로부터의 낙하-통과 분획을, 바이러스 불활성화를 위해 밤새 용매/세제 처리에 적용시켰다.
이어서, 상기 바이러스 불활성화된 용액을 25mM 트리스(pH 8.0)를 사용하여 ≤ 10mS/㎝로 희석시킨 다음, 25mM 트리스(pH 8.0)로 미리 평형화된 대략 412mL의 MacroPrep™-HQ 수지로 팩킹된 음이온 교환 컬럼(XK 50/30, 지이 헬스케어) 상에 로딩시켰다. 상기 유동-통과 분획을 폐기하고, MacroPrep™-HQ 컬럼을, 90mM NaCl, 50mM 트리스, 20mM EACA를 함유하는 4 컬럼 용적의 세척 완충액(pH 8.0)으로 세척하였다. 이들 크로마토그래피 조건 하에서, 초기의 유동-통과 분획 및 세척 분획들은 주로 플라스미노겐 및 t-PA를 함유하는 반면, 피브리노겐은 상기 크로마토그래피 수지에 결합된 상태로 남아 있었다. 단량체 형태의 피브리노겐을 200mM NaCl, 10mM 트리스, 10mM 시트르산삼나트륨, 46mM 수크로스 및 1.1mM CaCl2를 포함하는 용리 완충액(pH 7.0)을 사용하여 MacroPrep™-HQ 컬럼으로부터 선택적으로 용리시켰고, 피브리노겐 응집물 및 저분자량 단백질들은 상기 MacroPrep™-HQ 수지에 결합된 상태로 남아 있었다.
가용화된 한랭 침전물로부터 MacroPrep™-HQ 크로마토그래피 용리액에 이르기까지의 생성된 생성물 중간체들을, 다양한 프로세스 단계들에서의 피브리노겐, t-PA, 플라스미노겐, 피브로넥틴 및 인자 II 수준 및 이들 단백질들 각각에 대한 프로세스 단계 회수율에 대해 특성확인하였다. 상기 결과들은 표 3에 나타내고, 이는 세 가지의 개별적 실험실 규모의 지속성 배치들로부터의 평균값을 나타낸다. 혈장 한랭 침전물로부터 출발하여 MacroPrep™-HQ 용리액에 이르기까지의 피브리노겐 및 공동-정제된 단백질들에 대한 전체 프로세스 회수율을 도 5에 나타낸다.
MacroPrep™-HQ 크로마토그래피 수지로부터 회수된 피브리노겐의 순도는, 분석적 크기 배제 HPLC 크로마토그래피에 의해 밝혀진 바와 같이 95%를 초과하였다. TSKGel™ G4000SWXL(토소 코포레이션(Tosoh Corporation)) 상에서 분석된 피브리노겐의 대표적인 HPLC 프로파일을 도 6에 나타낸다. 도 6에서 나타난 바와 같이, 피브리노겐 단량체는 대략 17.4분의 체류 시간에서 용리되고 총 피크 면적의 96.6%를 차지하는 반면, 피브리노겐 이량체 및/또는 다른 고분자량 단백질들은 대략 14.8분의 체류 시간에서 용리된다.
실시예 5 및 실시예 6에 기술된 프로세스에 따라 추가의 피브리노겐 배치들을 파일롯 규모(pilot scale)(81㎏ 혈장과 등가임)로 제조하였다. 상기 피브리노겐 제제들의 특성들은 표 4에 제공된다.
실시예 7 - 정제된 피브리노겐의 바이러스 여과
실시예 6의 방법에 따라 수득된 피브리노겐 제제들에 대해 20㎚ 바이러스 필터를 통한 여과성을 조사하였으며, 상기 방법에서 MacroPrep™-HQ 용리 단계는 190mM NaCl(21.5mS/㎝), 200mM NaCl(22.5mS/㎝), 210mM NaCl(23.5mS/㎝) 또는 1%(w/w) 아르기닌 함유 200mM NaCl(25mS/㎝) 완충액을 사용하였다.
상기 방법은, 약 7.5의 pH에서 3%(w/w) 아르기닌을 갖는 제제를 제형화함을 포함하였다(샘플들의 단백질 농도는 대략 6g/L였다). 이어서, 상기 제형화된 제제들을, 바이러스 여과 단계 전에 0.1㎛ 필터를 사용하여 여과하였다. 바이러스 여과 단계는, 47㎜ Pall SV4™ 필터를 사용하여 데드-엔드(dead-end) 모드로 1.8bar의 정압을 사용하여 수행하였다. 상기 결과들은, 190mM, 200mM 또는 210mM을 사용하여 MacroPrep™ HQ 컬럼으로부터 수득된 피브리노겐 제제들은 유사한 여과 특성들을 초래한다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 1%(w/w) 아르기닌 함유 200mM NaCl 완충액을 사용하여 MacroPrep™ HQ 컬럼으로부터 용리된 피브리노겐 제제는 필터를 빠르게 오염시켰다(도 7).
실시예
8 - 안정성 연구
상기 실시예 5에 기술된 방법에 의해 회수된 정제된 피브리노겐 용액을 멸균 여과하고, 2 내지 8℃ 또는 30℃에서 9/7주의 기간에 걸친 안정성 연구를 수행하였다. 2 내지 8℃에 놓아둔 액체 피브리노겐 제제는 9주의 보관 기간 후에 클라우스(Clauss)법에 의한 측정시 이의 원래의 활성의 약 90%를 보유하였다. 30℃에 놓아둔 액체 피브리노겐 제제는 2주의 보관 기간 후에 이의 원래의 활성의 약 70%를 보유하였으며, 5주 이상 동안은 더 이상 활성을 손실하지 않았다. 30℃에서 7주의 항온배양까지 60% 미만으로의 추가의 활성 감소가 관찰되었다. 30℃에서의 피브리노겐 활성의 손실은 단백질 분해에 기인한 것이라기보다는 열 변성에 기인한 것일 가능성이 있는데, 그 이유는, 프로테아제 억제제(C1 에스테라제)의 첨가가 5주의 보관 기간에 걸쳐 피브리노겐 활성의 손실을 억제하지 않았기 때문이다. 상기 안정성 데이터의 요약은 도 8에 제공된다.
실시예 9 - HEA Hypercel을 사용하는 인자 VIII 및/또는 VWF 함유 용액 중의 혈장 프로테아제 수준의 감소
당해 실시예는, HCIC 크로마토그래피 단계가 또한 인자 VIII 및/또는 VWF 함유 제제들 중의 프로테아제를 감소시키는 데에도 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 당해 방법은, 실시예 4로부터 수득된 피브리노겐 함유 용액을 심층 필터를 사용하여 정화시킨 다음, 상기 정화된 용액을 제2 소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC) 수지에 통과시킴을 포함하였다. 상기 HCIC 단계는, 플라스미노겐과 같은 프로테아제는 상기 수지에 결합하는 반면에 인자 VIII 및 VWF는 상기 수지를 통과할 수 있도록 하는 조건들 하에서 작동되었다. 특히, XK 50/30 컬럼은 340mL의 HEA Hypercel™ 수지로 팩킹되었다. 상기 컬럼은 50mM 트리스 pH 6.7 중에서 미리 평형화되었다. 이어서, 실시예 4에 따라 제조된 상기 정화된 피브리노겐 용액을 상기 컬럼 상에 로딩하고, 상기 컬럼을 50mM 트리스 pH 6.7로 세척하였다. 낙하-통과 분획을 수집하고, 인자 VIII, VWF, 플라스미노겐 및 t-PA의 수준을 측정하였다(VWF:RCo = 폰 빌레브란트 리스토세틴 보조 인자(Von Willebrand Ristocetin Cofactor)). 4개의 개별 실행으로부터 얻은 평균 결과들의 요약이 표 5에 제공된다. 상기 결과들은, HCIC 크로마토그래피 단계가 인자 VIII 및 VWF를 포함한 분획으로부터 플라스미노겐 및 tPA와 같은 프로테아제들을 효과적으로 제거함을 나타낸다. 또한, 인자 VIII 및 VWF의 우수한 회수율이 관찰되었다.
실시예 10 - 상이한 방법들로부터 정제된 피브리노겐의 비교 연구
실시예 6에 기술된 바와 같은 본 발명의 방법에 따라 제조된 피브리노겐 제제를, WO 제2001048016호, WO 제2012038410호 및 WO 제2013135684호에 기술된 방법들에 의해 제조된 피브리노겐 제제들과 비교하였다.
(a) WO 제2001048016호에 기술된 방법들의 바람직한 실시형태에 의해 제조된 피브리노겐 제제.
간략하게, 당해 방법은 분획 I 페이스트를 추출 완충액(0.8M NaCl, 5mM EACA(엡실론-아미노카프로산), 20mM 시트르산나트륨, 60IU/mL 헤파린, pH 7.3)에 현탁시킴을 포함하였다(8.33g의 추출 완충액에 대해 1g의 분획 I). 이어서, 상기 용액을 37℃에서 1.5시간 동안 혼합한 다음, 분획 I g당 50g의 2% Al(OH)3(Alhydrogel) 용액을 첨가하였다(10.8%). 상기 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반한 후, 10분 동안 5000g로 원심분리하고, 펠렛은 폐기하였다. 상기 Alhydrogel-처리된 상청액에 글리신/NaCl 완충액(2.1M 글리신, 20mM 시트르산나트륨, 3.6M NaCl 및 2.4mM CaCl2)을 첨가하였다(상기 용액들은 둘 다 30℃에서 미리 평형화되었다). 상기 완충액에의 상청액의 첨가는 약 4.5분 내에 완료되었다(2.05부의 완충액에 대해 1부의 상청액). 이어서, 상기 혼합물을 30℃에서 20분 동안 교반한 후, 5010g로 10분 동안 원심분리하였다(상청액을 폐기하였다). 이어서, 상기 침전물을 실온에서 완충액 D(100mM NaCl, 1.1mM CaCl2, 10mM 시트르산나트륨, 10mM 트리스, 45mM 수크로스, pH 6.9) 중에서 2시간 동안 혼합하면서 재가용화시켰다(이의 용적의 1/3은 분획 I을 재현탁시키는데 사용됨)(WO 제0148016호의 실시예 1, 섹션 1.1.1 내지 1.1.6). 이어서, 상기 재가용화된 피브리노겐 함유 용액을 MacroPrep™ HQ 컬럼(층 높이 20㎝의 XK26) 상에 로딩시켰다. 상기 컬럼은 적어도 1.5 컬럼 용적(CV)의 MQ 완충액(50mM 트리스, 100mM NaCl, 20mM EACA, pH 8.0, 10mL/분(113㎝/시간))으로 미리-평형화되었다. 상기 평형화는, 컬럼 후 전도도(conductivity post column)가 상기 제조된 완충액의 90 내지 110%가 될 때까지 지속되었다. 이어서, 피브리노겐 용액을 상기 컬럼 상에 로딩시키고, 상기 컬럼을 6CV의 MQ 완충액으로 세척하였다. 피브리노겐을 ME 완충액(500mM NaCl, 1.1mM CaCl2, 10mM 시트르산나트륨, 10mM 트리스 및 45mM 수크로스, pH 7.0)을 사용하여 단일 피크로서 용리시켰다. 상기 컬럼은 2CV 1M NaCl을 사용하여 재생시킬 수 있다(WO 제2001048016호의 실시예 2).
(b) WO 제2012038410호 및 WO 제2013135684호에 선행하여 기술된 방법들의 바람직한 실시형태에 의해 제조된 피브리노겐 제제.
확립된 방법들에 의해 혈장으로부터 생성된 한랭 침전물을 대략 중성의 pH에서 재구성하거나 가용화시키고, Al(OH)3을 사용하여 흡착 처리하고, 수득된 겔을 원심분리에 의해 제거하였다. 이어서, 상기 상청액을 용매/세제(S/D) 처리에 의해 바이러스 불활성화시켰다. S/D 화합물들, 트리톤 및 TnBP를 식물성유로 추출하고, 수성-상을 Fractogel® EMD-TMAE와 접촉시켰다. 피브리노겐이 겔에 결합하지 않아 유동-통과 또는 상청액 중에서 발견되는 크로마토그래피 조건들(6.9 내지 7.1의 pH 값 및 570 내지 610mosmol/ℓ의 삼투질 농도)을 사용하였다. 결합되지 않은 피브리노겐의 용액을 20mM EDTA의 존재 하에 글리신 첨가(1mol/ℓ의 최종 농도 및 pH= 7.4) 후 약 90분 동안 교반하여 피브리노겐을 침전시켰다. 이어서, 상기 피브리노겐 함유 침전물을 원심분리에 의해 분리시켜, 중간체 피브리노겐 페이스트를 수득하였다. 상기 중간체 피브리노겐 페이스트를 20mM 트리스 완충액(pH= 약 8.0)에 재현탁시켰다. 이어서, 상기 수득된 현탁액을 여과하고, 한외여과/정용여과 처리하였다. 이어서, 상기 수득된 피브리노겐 함유 용액을 GigaCap Q-650M® 상에 로딩시키고, 크로마토그래피 겔 또는 수지를 재현탁에 사용된 것과 동일한 트리스 완충액으로 미리 평형화시킨 다음, 피브리노겐 용액을 적용시켰다. 느슨하게 결합된 물질들을 평형화 완충액으로 세척제거한 다음, 세척 완충액(1.5g/ℓ 시트르산나트륨, 6.0g/ℓ 염화나트륨, 약 pH= 7.0 및 약 12.0mS/㎝의 전도도로 조정됨)으로 세척하였다. 이어서, 피브리노겐을 용리 완충액(1.5g/ℓ 시트르산나트륨 및 10.0g/ℓ 글리신, 상기 세척 완충액과 동일한 pH로 조정되고, 약 7.0g/ℓ NaCl을 사용하여 13.1 내지 15mS/㎝의 전도도로 조정됨)을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리시켰다.
WO 제2001048016호, WO 제2012038410호 및 WO 제2013135684호에 기술된 방법들로부터 수득된 피브리노겐 함유 용액들을 총 단백질(뷰렛), 피브로넥틴 및 플라스미노겐 수준에 대해 시험하였다. 또한, 샘플들에 대해 2 내지 8℃ 및 30℃에서의 안정성 시험을 수행하였다.
피브리노겐 제제들의 특성들의 비교가 표 6에 제공되어 있다. 상기 연구 결과들은, 본 발명의 방법들로부터 제조된 피브리노겐이 기타 방법들에 비해 더 낮은 수준의 플라스미노겐을 함유한다는 것을 시사한다.
Claims (48)
- 피브리노겐을 포함하는 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 피브리노겐을 포함하는 공급원료(feedstock)를, 상기 공급원료 중에 존재하는 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지(hydrophobic charge-induction chromatographic resin)에 결합되도록 선택되는 조건들 하에서, 상기 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계; 및
(ii) 상기 수지를 통과한 피브리노겐을 포함하는 용액을 회수하는 단계로서, 상기 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도가 상기 공급원료에 비해 50% 이상 감소되는 단계를 포함하고,
여기서, 피브리노겐을 포함하는 상기 공급원료 및/또는 용액을 상기 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키기 전에, 상기 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지를 6.5 내지 8.5의 pH에서 평형화시키는, 방법. - 제1항에 있어서, 단계 (ii)에서 회수된 피브리노겐을 포함하는 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제2항에 있어서, 피브리노겐을 포함하는 상기 용액을 150mM 내지 270mM NaCl의 존재 하에 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시키는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 피브리노겐을, 150mM 내지 300mM NaCl을 포함하는 용리 완충액을 사용하여 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 용리시키는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 공급원료를 단계 (i) 전에 바이러스 불활성화 단계에 적용시키는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지로부터 회수된 피브리노겐을 포함하는 용액을 바이러스 불활성화 단계에 적용시키는, 방법.
- 제2항에 있어서, 피브리노겐을 포함하는 상기 공급원료 또는 용액을 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 통과시키기 전에 바이러스 불활성화 단계에 적용시키는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 공급원료가 가용화된 혈장 한랭 침전물 (cryoprecipitate)인, 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (i) 전에, 상기 공급원료로부터 비타민 K-의존성 단백질들을 제거하거나 감소시키는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지를 통과한 피브리노겐을 포함하는 상기 공급원료 또는 용액이 6.5 내지 8.5의 pH를 갖는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지가, 머캅토에틸피리딘, n-헥실아민 및 페닐프로필아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 리간드를 포함하는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지가 n-헥실아민을 포함하는, 방법.
- (a) 총 단백질의 75% 이상의 혈장-유래 피브리노겐;
(b) 총 단백질 mg당 50pg 미만의 조직 플라스미노겐 활성화 인자; 및
(c) 총 단백질 mg당 10ng 미만의 플라스미노겐
을 포함하는 용액. - 제13항에 있어서, 총 단백질 mg당 1.5×10-5U 미만의 인자 II를 추가로 포함하는, 용액.
- (a) 총 단백질의 90% 이상의 혈장-유래 피브리노겐;
(b) 총 단백질 mg당 50pg 미만의 조직 플라스미노겐 활성화 인자; 및
(c) 총 단백질 mg당 10ng 미만의 플라스미노겐
을 포함하는 용액. - 제15항에 있어서,
(a) 총 단백질 mg당 3.5×10-6U 미만의 인자 II; 및/또는
(b) 총 단백질 mg당 150㎍ 미만의 피브로넥틴
을 추가로 포함하는, 용액. - (a) 총 단백질의 90% 이상의 혈장-유래 피브리노겐;
(b) 총 단백질 mg당 20pg 미만의 조직 플라스미노겐 활성화 인자; 및
(c) 총 단백질 mg당 10ng 미만의 플라스미노겐
을 포함하는 용액. - 제17항에 있어서,
(a) 총 단백질 mg당 2.7×10-6U 미만의 인자 II; 및/또는
(b) 총 단백질 mg당 15㎍ 미만의 피브로넥틴
을 추가로 포함하는, 용액. - 제13항, 제15항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 총 단백질의 80% 이상의 단량체 피브리노겐을 포함하는, 용액.
- 제13항, 제15항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피브리노겐이, 상기 용액을 0℃ 내지 8℃의 온도에서 4주 이상 동안 보관한 후에 90% 내지 100% 활성을 보유하는, 용액.
- 제13항, 제15항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피브리노겐이, 상기 용액을 30℃의 온도에서 5주 동안 보관한 후에 60% 내지 70% 활성을 보유하는, 용액.
- 제13항, 제15항 및 제17항 중 어느 한 항의 용액 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형.
- 제13항, 제15항 및 제17항 중 어느 한 항의 용액 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형으로서, 5ml 이상의 용적을 갖고, 20mg/mL 이상의 피브리노겐을 포함하는, 약제학적 제형.
- 제22항에 있어서, 무섬유소원혈증, 저섬유소원혈증 및 이상섬유소원혈증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 피브리노겐 결핍과 관련된 병태의 치료를 위한, 약제학적 제형.
- 제13항, 제15항 및 제17항 중 어느 한 항의 용액을 포함하는 피브린 글루(fibrin glue).
- 안정한 액체 피브리노겐 용액의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 피브리노겐을 포함하는 공급원료를, 상기 공급원료 중에 존재하는 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 결합되도록 선택되는 조건들 하에서, 상기 소수성 전하-유도 크로마토그래피 수지에 통과시키는 단계; 및
(ii) 상기 수지를 통과한 피브리노겐을 포함하는 용액을 회수하는 단계
를 포함하고,
여기서, 상기 용액 중의 플라스미노겐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 다른 프로테아제(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 농도가 상기 공급원료에 비해 50% 이상 감소되는, 방법. - 제26항에 있어서, 상기 회수된 용액 중의 피브리노겐이, 0℃ 내지 8℃의 온도에서 4주 이상 동안 보관된 후에 90% 내지 100% 활성을 보유하는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 회수된 용액 중의 피브리노겐이, 30℃의 온도에서 5주 이상 동안 보관된 후에 60% 내지 70% 활성을 보유하는, 방법.
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