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CN104981476A - 一种纯化治疗性蛋白质的方法 - Google Patents

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CN104981476A CN201380063945.1A CN201380063945A CN104981476A CN 104981476 A CN104981476 A CN 104981476A CN 201380063945 A CN201380063945 A CN 201380063945A CN 104981476 A CN104981476 A CN 104981476A
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Abstract

本发明总体上涉及一种减少溶液中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶组成的组的蛋白质水平的方法，所述溶液包舍至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和血管性血友病因子(VWF)组成的组的蛋白质，该方法包含：(i)在选择的条件下，使包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的原料通过疏水性电荷诱导的色谱树脂，所述选择的条件使得存在于原料中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质结合至树脂上；和(ii)回收通过树脂的包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液，其中溶液中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50％。也提供了通过此方法回收的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液和药物制剂，以及它们的应用。

Description

一种纯化治疗性蛋白质的方法
技术领域
本发明通常涉及一种在包含至少一种治疗性蛋白质的溶液中减少杂质水平的方法并涉及所得的包含治疗性蛋白质的溶液。更具体地，涉及一种在包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或血管性血友病因子(VWF)的原料中减少纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶水平的方法。本发明还通常涉及通过这些方法回收的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液和药物制剂，以及它们的应用。
背景技术
当前从包含天然存在的或重组的治疗性蛋白质的溶液中纯化所述蛋白质的方法，通常携带至少某些杂质进入到最终的制剂中。在一些情况下，杂质的存在，如蛋白酶，将使溶液中治疗性蛋白质不稳定，尤其是在存储期间。基于这个原因，许多治疗性蛋白质被存储为冻干的或冷冻的制剂。
虽然杂质的不稳定性水平可能会影响许多不同类型的治疗性蛋白，它们特别与那些用于保持止血的治疗性蛋白质相关。止血是一个重要的生理过程，其防止损害(如破裂)血管后的出血。促进止血有三个基本的机制：(i)血管收缩，(ii)血小板在破裂部位聚集；和(iii)凝血。在凝血期间，受损的内皮细胞释放组织因子(因子III)，其在Ca2+的帮助下依次激活因子VII。通过活化的血小板释放的因子XII激活因子XI。活化的因子VII和因子XI促进级联的酶促反应，导致因子X的活化。活化的因子X(因子Xa)以及因子III，因子V，Ca2+，和血小板凝血因子(PF3)级联，激活凝血酶原激活物。凝血酶原激活物转化凝血酶原为凝血酶，其转化纤维蛋白原(因子I)为纤维蛋白，在损伤部位形成初始网格。该初始网格随后经由因子XIII而被转变为致密的纤维蛋白凝块，密封破裂直到该位置被修复。在凝血级联过程中，凝血酶也将激活因子VIII，激活因子VIII是在循环过程中主要络合到血管性血友病因子(VWF)的一种糖蛋白亲辅因子。因子VIII与因子IXa相互作用以在Ca+2和磷脂存在的情况下激活因子X。
任意一个或多个参与凝血的蛋白的水平缺乏，包含纤维蛋白原，因子VIII，和/或先天性或后天性的血管性血友病因子(VWF)，可以导致血液凝固的不足和出血的风险。目前的治疗选择局限于给予一种或多种治疗性蛋白的药物制剂，以恢复所述蛋白质的内源性水平和保持止血。但是，现有的药物制剂，其通常来自于捐献的血液血浆或重组来源，包含酶原和蛋白酶(如凝血酶原，纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物(tPA)和/或其它蛋白酶)，其可以在储存过程中使该治疗性蛋白质不稳定，如纤维蛋白原，因子VIII，或VWF。因此，这样的制剂在水溶液中是相对不稳定的，长期储存限于冻干的或冷冻的制剂。
为了临床应用，纤维蛋白原是通常从人血浆中纯化的，在血浆中它仅占总血浆蛋白的约2-5％(1.5-4.0g/L)。传统上，纤维蛋白原从血浆的纯化是通过经典的血浆分级实施的，其中纤维蛋白原是随后用任一种的乙醇，硫酸铵，β丙氨酸/甘氨酸，聚合物(例如，聚乙二醇)或低离子强度溶液沉淀而从血浆中冷沉淀。这些方法可以达到较高的产量和均匀性。在需要更高水平的纯度的情况下，经常使用色谱技术。但是，现有的适合于商业规模制造工艺的沉淀和色谱技术通常生产出包含污染性蛋白质，如酶原或蛋白酶(例如，凝血酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物(tPA)和纤维蛋白溶酶原)的纤维蛋白原制剂，污染性蛋白质可以使溶液中纤维蛋白原不稳定。例如，当凝血酶原存在时，它可以被激活成为丝氨酸蛋白酶凝血酶，这将反转转变纤维蛋白原成纤维蛋白。同样地，当tPA和纤维蛋白溶酶原都存在时，tPA可以激活纤维蛋白溶酶原成为其活性形式纤溶酶，这反过来将水解纤维蛋白原为纤维蛋白。其结果是，纤维蛋白原制剂在水溶液中是相对不稳定的，长期储存限于冻干的或冷冻的制剂。
特定的污染物可以被吸附出来；例如，在固定化明胶上的纤连蛋白和在固定化赖氨酸上的纤维蛋白溶酶原(Vuento et al.1979，Biochem.J.，183(2)：331-337)。然而，具体的亲和树脂的应用是不适于大规模工业方法的。其原因包含亲和树脂本身不具有足够的强度以便于被反复使用，并且通常显著增加工艺时间和成本。
EP 1240200(US6960463)涉及使用离子交换(IEX)色谱法从包含纤维蛋白原的溶液中纯化纤维蛋白原的方法。具体的方法涉及在下列条件下应用包含纤维蛋白原的溶液至离子交换基质，使纤维蛋白原结合到基质上，然后用包含至少一种ω氨基酸的溶液冲洗离子交换基质。这样做是为了促进纤维蛋白溶酶原在树脂上差异化移动。结合在所述基质的纤维蛋白原随后从基质中洗脱。
WO2012038410提供了一种使用阴离子交换树脂纯化纤维蛋白原的方法，该阴离子交换树脂包含接枝有结合纤维蛋白原的叔胺或季胺的羟基化的聚合物支持物。
EP1519944教导了在下列条件下使用固定化金属离子亲和色谱基质，纤维蛋白原和纤维蛋白溶酶原结合到基质中，并且分别选择性地洗脱所述纤维蛋白原和纤维蛋白溶酶原，使得主要的纤维蛋白原级分包含大约每毫克蛋白质的600ng蛋白溶酶原。
本发明提供了在包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或血管性血友病因子(VWF)的溶液中减少纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶水平的方法。纯化的蛋白质作为液体制剂在存储过程中是稳定的，并且可用于临床或兽医应用，包含治疗或预防与所述蛋白质水平缺乏相关的病症。
发明简介
在本发明的一个方面，提供了一种减少包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和血管性血友病因子(VWF)组成的组蛋白质的溶液中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶组成的组的蛋白质水平的方法，该方法包含：
(i)在选择的条件下，使包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的原料通过疏水性电荷诱导的色谱树脂，所述选择的条件使得存在于原料(feedstock)中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质结合至树脂上；和
(ii)回收通过树脂的包含所述至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液，其中该溶液中所述至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50％。
在本发明的另一个方面，提供了一种减少包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和血管性血友病因子(VWF)组成的组的蛋白质的溶液中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的蛋白质水平的方法，该方法包含：
(i)使包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的原料通过第一疏水电荷诱导色谱树脂；
(ii)回收通过第一疏水电荷诱导色谱树脂的包含所述至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液；
(iii)使所述在步骤(ii)中回收的溶液通过第二疏水电荷诱导色谱树脂；和
(iv)回收通过第二疏水电荷诱导色谱树脂的包含所述至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液；
其中色谱步骤的条件使得存在于原料中的至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的蛋白质结合到第一和/或第二树脂上，和其中在步骤(iv)回收的溶液中所述至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于所述原料减少了至少50％。
在另一个方面，提供了一种经由如本文所述的本发明的方法所回收的包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液。
在另一个方面，提供了一种包含至少5mL稳定的药学上可接受的纤维蛋白原溶液的容器，其中纤维蛋白原的浓度为至少20mg/mL。
在另一个方面，提供了一种药物制剂，包含包括经由如本文所述的本发明的方法所回收的至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液，和药学上可接受的载体。
在本发明的另一个方面，提供了一种溶液，其包含：
(a)至少75％总蛋白质的纤维蛋白原；
(b)少于50pg/mg总蛋白质的组织纤维蛋白溶酶原激活物；和/或
(c)少于1μg/mg总蛋白质的纤维蛋白溶酶原。
在本发明的另一个方面，提供了一种溶液，其包含：
(a)至少90％总蛋白质的纤维蛋白原；
(b)少于50pg/mg总蛋白质的组织纤维蛋白溶酶原激活物；和/或
(c)少于150ng/mg总蛋白质的纤维蛋白溶酶原。
在本发明的另一个方面，提供了一种溶液，其包含：
(a)至少90％总蛋白质的纤维蛋白原；
(b)少于20pg/mg总蛋白质的组织纤维蛋白溶酶原激活物；和/或
(c)少于10ng/mg总蛋白质的纤维蛋白溶酶原。
在另一个方面，提供了一种治疗或预防与纤维蛋白原缺乏相关的病症的方法，该方法包含给予有此需求的患者如本文所述的本发明的溶液或药物制剂。
在另一个方面，提供了一种如本文所述的本发明的溶液在制备用于治疗或预防与纤维蛋白原缺乏相关的病症的药物中的应用。
在另一个方面，提供了一种包含如本文所述的本发明溶液的纤维蛋白胶。
在另一个方面，提供了一种生产稳定的液体纤维蛋白原溶液的方法，该方法包含：
(i)在选择的条件下，使包含纤维蛋白原的原料通过疏水性电荷诱导色谱树脂，所述选择的条件使得存在于原料中的至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织型纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质结合至树脂上；和
(ii)回收通过树脂的包含纤维蛋白原的溶液，其中溶液中的所述至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50％。
在另一个方面，提供了一种生产稳定的液体纤维蛋白原溶液的方法，该方法包含：
(i)使包含纤维蛋白原的原料通过第一疏水电荷诱导色谱树脂；
(ii)回收通过第一疏水电荷诱导色谱树脂的包含纤维蛋白原的溶液；
(iii)使所述在步骤(ii)中回收的溶液通过第二疏水电荷诱导色谱树脂；和
(iv)回收通过所述第二疏水电荷诱导色谱树脂的包含纤维蛋白原的溶液；
其中色谱步骤的条件使得存在于原料中的至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的蛋白质结合到第一和/或第二树脂上，和其中在步骤(iv)回收的溶液中所述至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50％。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于纯化纤维蛋白原的方法，该方法包含以下步骤：
(i)在选择的条件下，使包含纤维蛋白原的溶液通过离子交换色谱树脂，使得纤维蛋白原单体(fibrinogen monomer)结合到树脂上；所述选择的条件使得纤维蛋白原单体结合到树脂上；
(ii)用洗脱缓冲液从树脂上洗脱纤维蛋白原单体；和
(iii)经由具有从约15nm至约35nm范围孔径的过滤器，过滤来自步骤(ii)的所述的洗脱的纤维蛋白原单体。
附图的简要说明
图1显示出当溶液通过HEA HypercelTM时，相对于纤维蛋白原在负模式下，在不同的pH水平范围，从纤维蛋白原溶液回收纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原和t-PA的百分比。每个组内的条代表(从左到右)：纤维蛋白原回收，纤维蛋白溶酶原回收和t-PA回收。
图2显示出当溶液通过PPa HypercelTM时，相对于纤维蛋白原在负模式下，在不同的pH水平范围，从纤维蛋白原溶液回收纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原，t-PA和因子II的百分比。每个组内的条代表(从左到右)：纤维蛋白原回收，纤维蛋白溶酶原回收，t-PA回收和因子II。
图3显示出当溶液通过MEP HypercelTM时，相对于纤维蛋白原在负模式下，在不同的pH水平范围，从纤维蛋白原溶液回收纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原，t-PA和因子II的回收百分比。每个组内的条代表(从左到右)：纤维蛋白原回收，纤维蛋白溶酶原回收，t-PA回收和因子II。
图4a显示出当溶液通过HEA HypercelTM时，相对于纤维蛋白原在负模式下，在不同的pH水平范围，从包含纤维蛋白原溶液回收纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原，t-PA和因子II的百分比。每个组内的条代表(从左到右)：纤维蛋白原回收，纤维蛋白溶酶原回收，t-PA回收和因子II回收。
图4b显示出在室温(约20℃)下，经由6天，从通过HEA HypercelTM柱的直通级分(图4a)中回收的含纤维蛋白原溶液的稳定性，通过初始可凝固蛋白质％而测量。每个组内的条代表(从左至右)：T＝1天，T＝3天，T＝6天。
图4c显示出在室温(约20℃)下，经由6天，从通过HEA HypercelTM柱的直通级分(图4a)中回收的含纤维蛋白原溶液的稳定性，通过可凝固蛋白质％而测量。每个组内的条代表(从左至右)：T＝1天，T＝3天，T＝6天。
图5显示出得自根据本发明的实施方案的方法，从血浆冷沉淀通过MacroPrepTM-HQ洗脱的级分中纤维蛋白原，t-PA，纤维蛋白溶酶原和因子II的过程回收百分比。每个组内的条代表(从左至右)：纤维蛋白原，纤连蛋白，纤维蛋白溶酶原，t-PA和因子II。
图6显示出从MacroPrepTM-HQ色谱树脂回收的单体纤维蛋白原的纯度，通过分析型尺寸排阻HPLC色谱法而测量。
图7显示出从MacroPrepTM-HQ色谱树脂回收的纤维蛋白原的过滤性，使用具有不同电导率的洗脱缓冲液(190mM NaCl，21.5mS/cm(菱形)；200mM NaCl，22.5mS/cm(正方形)；210mM NaCl，23.5mS/cm(三角形)；1％(w/w)精氨酸/200mMNaCl，25mS/cm(交叉))。
图8显示出从MacroPrepTM-HQ色谱树脂回收的液体纤维蛋白原存储在2-8℃(菱形)下9周期限或在30℃(正方形)下7周期限，纤维蛋白原的活性作为在t＝0时初始纤维蛋白原活性的百分比。
发明详述
在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”，或变体如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为暗示包含所述成分或整体或成分或整体的群组，但是不排除任何其他成分或整体或成分或整体的群组。
在本说明书中涉及的任何现有出版物(或从它衍生的信息)，或以任何已知事项，不是，并且不应该被视为承认或认可或任何形式的建议该现有出版物(或者从它衍生的信息)或已知的物质形成本说明书涉及的领域中的公知常识的一部分。
必须注意到，在本说明书所使用的，单数形式的“一种(a)”，“一种(an)”和“该(the)”包含复数方面，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一种制剂”包含单一制剂，以及两种或两种以上的制剂。
在缺乏对相反的任何指示，贯穿于整个说明书中，涉及“％”的内容是指％w/w(重量/重量)的含义。例如，包含至少80％总蛋白的纤维蛋白原溶液是指包含至少80％w/w总蛋白质浓度的纤维蛋白原溶液。这可以通过，例如将得自可凝固蛋白测定的纤维蛋白原的量除以从标准蛋白测定法(例如缩二脲)得到的总蛋白量并乘以100而计算。在可凝固蛋白测定法中，在样品中加入凝血酶以形成凝块，其几乎全是纤维蛋白。该凝块可以通过离心从含非可凝固蛋白质上清液中分离。随后用碱性尿素或其它物质冲洗凝块和溶解，并通过分光光度法测定蛋白质浓度。由于大多数凝块是纤维蛋白，该蛋白质浓度将相当于纤维蛋白原浓度。因此，一个样本中可凝固蛋白质的量是相当于样品中总蛋白质和非可凝固蛋白质成分之间的差值。
纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF从原料中的纯化(例如，血浆或细胞培养物上清液)通常是通过常规级分而实施的，其中所述纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF从使用的溶液中被沉淀，例如，乙醇，硫酸铵，β丙氨酸/甘氨酸，聚合物(例如，聚乙二醇)和/或低离子强度溶液。目前采用不同层析步骤的血浆纯化方法可以获得目标蛋白质相对高的产率和均质制剂。然而，这些方法通常产生包含残余量杂质的制剂，这些杂质可能不适合用于配制用于临床应用的稳定液体制剂。杂质如凝血酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物(tPA)和纤维蛋白溶酶原是特别有问题的，因为去稳定化水平的这些杂质可以水解水溶液中的纤维蛋白原，从而使纤维蛋白原不稳定，特别是在制造和/或长期储存过程中。
基于以下发现，本发明是可以预期的，至少是部分可预期的，即包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的原料通过疏水电荷诱导层析(HCIC)树脂并且回收通过该树脂的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液是一种有效替代现有的用于减少溶液中纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它的蛋白酶不稳定水平的纯化方法的方法。
因此，在本发明的一个方面，提供了一种减少至少一种包含选自由纤维蛋白原，凝血因子VIII和血管性血友病因子(VWF)组成的组的蛋白质的溶液中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的蛋白质的方法，该方法包含：
(i)在选择的条件下，使包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的原料通过疏水性电荷诱导色谱树脂，所述选择的条件使得存在于原料中的至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质结合至树脂上；和
(ii)回收通过树脂的包含所述至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液，其中该溶液中所述至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50％。
在一个实施方案中，在包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的回收溶液中，纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的浓度，相比于原料减少了至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％或至少95％或至少98％。
在另一个方面，提供了一种生产稳定的纤维蛋白原液体溶液的方法，该方法包含：
(i)在选择的条件下，使包含纤维蛋白原的原料通过疏水性电荷诱导色谱树脂，所述选择的条件使得存在于原料中的至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质结合至树脂上；和
(ii)回收通过树脂的包含纤维蛋白原的溶液，其中该溶液中所述至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50％。
在一个实施方案中，在包含纤维蛋白原的回收溶液中，纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的浓度，相比于原料减少了至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％或至少95％或至少98％。
色谱工艺通常使用固体载体，也在本文中互换称为树脂或基质。合适的固体载体是本领域技术人员所熟悉的。实例包含无机载体，如玻璃和硅胶，有机的，合成的或天然存在的载体，如琼脂糖，纤维素，葡聚糖，聚酰胺，聚丙烯酰胺，双官能团的丙烯酸酯乙烯基共聚物，以及各种羟基化的单体，和类似物。商业上可获得的载体以SephadexTM，SepharoseTM，HypercelTM，CaptoTM，FractogelTM，MacroPrepTM，UnosphereTM，GigaCapTM，TrisacrylTM，UltrogelTM，DynospheresTM，MacrosorbTM和XADTM树脂的名称销售。
色谱步骤通常是在非变性条件和在约+10℃至+30℃范围的常规温度下进行，更通常在约环境温度下进行。因为方便，该色谱步骤可以分批或连续地进行。任何适宜的分离方法都可以被采用，例如柱子，离心，过滤，倾析等。
疏水电荷诱导层析(HCIC)，其通常也被称为混合模式，或多模式层析，是本领域技术人员所熟悉的。HCIC采用附着于固体载体的结合部分，其中所述结合部分可以对一种或多种蛋白质具有特异性，在根据本发明的方法中，其表示在原料中的杂质(例如，酶原和蛋白酶例如凝血酶原，tPA和纤维蛋白溶酶原)。
可以使用本领域技术人员所公知的任何合适的HCIC树脂。在一个实施方案中，HCIC树脂包含选自由巯基乙基吡啶(4-巯基乙基吡啶，例如，MEPHypercelTM)，正己胺(例如，HEA HypercelTM)和苯基丙基胺(例如，PPAHypercelTM)组成的配合基。在一个实施方案中，HCIC树脂包含正己胺。
HCIC配合基，如HEA，MEP和PPA，具有一个优点，即它们允许基于蛋白质的表面疏水性而分离，但不要求加入使用疏水层析纯化纤维蛋白原的其它工艺(例如，疏水相互作用层析；HIC)中常见的易溶盐。相对于传统的疏水相互作用层析，HCIC是基于pH值控制，而不是基于盐的浓度。HCIC树脂还提供高结合能力和高流速，非常适用于实验室-和工业化-规模的纯化。
HCIC树脂经常填充具有从约2cm至约40cm柱床高度的柱子。工业化规模的柱床高度通常至少为10厘米和通常在从约15cm至约25cm的范围内。工业化柱子的直径范围可以是从20cm至高达约1.5m。这样的柱子是根据HCIC树脂制造说明书的流速而操作的，流速通常是在50-100cm/hr范围内。流速的上限是部分由于HCIC树脂压力的约束。对于HEA树脂例如工作压力的上限是＜3巴(＜300kPa)。用于HCIC树脂的通常的动态结合能力(结合蛋白的10％穿透)是每毫升树脂结合蛋白质约20至30mg。对于本发明，这使得能负载到HCIC柱上相对大量的蛋白质，因为如纤维蛋白原的丰富蛋白质可以通过柱子而如纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的低量蛋白质结合到HCIC树脂。这对于工业规模的制备是有利的，因为处理一个批次需要更小尺寸的柱子和/或更短的柱周期。
本发明人还发现，可以调节按照本发明的方法通过HCIC树脂的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液或原料的pH值而控制纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的回收和杂质的去除。因此，在本文所公开的一个实施方案中，通过HCIC树脂的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液或原料具有从约6.0至约9.5的pH。在具体实施方案中，包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液或原料优选在约4.0，5.0，5.25，5.5，5.75，6.0，6.25，6.5，6.75，7.07.25，7.5，7.75，8.0，8.25，8.5，8.75，9.0，9.25，9.5或10.0的pH通过HCIC树脂。在一个具体的实施方案中，通过HCIC树脂的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液或原料具有约7.0的pH。在具体的实施方案中，在装载溶液或原料之前，HCIC树脂在约4.0，5.0，5.25，5.5，5.75，6.0，6.25，6.5，6.75，7.0，7.25，7.5，7.75，8.0，8.25，8.5，8.75，9.0，9.25，9.5或10.0的pH平衡。
如果必要的话，本发明的方法也可以采取使用一个以上的附加的色谱步骤进一步除去杂质，并因此改善最终制剂的纯度。附加的色谱纯化步骤可以在根据本发明通过HCIC树脂纯化纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF之前或之后实施。例如，从涉骤(ii)中HCIC树脂回收的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液可通过另一个色谱树脂。
附加的色谱纯化步骤可以采用另一种HCIC树脂。因此，在本发明的另一个方面，提供了一种减少包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和血管性血友病因子(VWF)组成的组的蛋白质的溶液中减少至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的蛋白质水平的方法，该方法包含：
(i)使包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的原料通过第一疏水电荷诱导色谱树脂；
(ii)回收通过第一疏水电荷诱导色谱树脂的包含所述至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液；
(iii)在步骤(ii)中回收的溶液通过第二疏水电荷诱导色谱树脂；和
(iv)回收通过第二疏水电荷诱导色谱树脂的包含所述至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液；
其中色谱步骤的条件使得存在于原料中的至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活剂和其他蛋白酶组成的组的蛋白质结合到第一和/或第二树脂，和其中在步骤(iv)回收的溶液中选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的至少一种蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50％。
在一个实施方案中，在步骤(iv)回收的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液中，纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的浓度，相比于原料减少了至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％或至少95％或至少98％。
在另一个方面，提供了一种生产稳定的纤维蛋白原液体溶液的方法，该方法包含：
(i)使包含纤维蛋白原的原料通过第一疏水电荷诱导色谱树脂；
(ii)回收通过第一疏水电荷诱导色谱树脂的包含纤维蛋白原的溶液；
(iii)使在步骤(ii)回收的溶液通过第二疏水电荷诱导色谱树脂；和
(iv)回收通过第二疏水电荷诱导色谱树脂的包含纤维蛋白原的溶液；
其中色谱步骤的条件使得存在于原料中的至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的蛋白质结合到第一和/或第二树脂上，和其中在步骤(iv)回收的溶液中所述至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50％。
在一个实施方案中，在步骤(iv)回收的包含纤维蛋白原的溶液中，纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的浓度，相比于原料减少了至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％或至少95％或至少98％。
在本文公开的一个实施例，第二HCIC树脂是与第一HCIC树脂不同的。在本发明另一个实施例，第一和第二疏水电荷诱导色谱树脂是相同的。其中，从步骤(ii)中HCIC树脂回收的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液通过相同HCIC树脂，可能有利的是在步骤(ii)之后和该回收的溶液在步骤(iii)中再次通过HCIC树脂之前冲洗该HCIC树脂，以除去可能结合到树脂上的任何杂质。
该附加的色谱树脂也可以是阴离子交换色谱树脂。在阴离子交换层析中，带负电荷的分子被吸附到带正电荷的固相载体。带正电荷的固相载体可以通过本领域技术人员所公知的任何方法来制备，并且通常涉及负电官能配合基(ligand)共价连接到固相载体上。合适的带负电的官能配合基将不变地取决于从溶液中分离出来的分子。合适的阴离子交换树脂的例子是那些包含官能性季胺基(Q)和/或叔胺基(DEAE)或二乙基氨基丙基(ANX)的树脂。市售的阴离子交换层析基质包含但不限于，来自Applied Biosystems的DEAE-纤维素，PorosTM PI 20，PI 50，HQ 10，HQ 20，HQ 50，D 50，来自GE Healthcare的MonoQTM，MiniQTM，SourceTM 15Q和30Q，Q，DEAE和ANX Sepharose Fas t FlowTM，Q Sepharose high PerformanceTM，QAE SEPHADEXTM和FAST Q SEPHAROSETM，来自J.T.Baker的WP PEITM，WP DEAMTM，WP QUATTM，来自Biochrom Labs公司的HydrocellTM DEAE和HydrocellTM QA，来自BioRad的UNOsphereTM Q，Macro-PrepTMDEAE和Macro-PrepTM high Q，来自Pall Technologies的Ceramic HyperDTM Q，ceramic HyperDTM DEAE，QHyperZTM，TrisacrylTM M和LSTM DEAE，SpherodexTM LSDEAE，QMA SpherosilTM LS，QMA SpherosilTM M，来自Dow Liquid Separations的DOWEXTM Fine Mesh强碱I型和II型阴离子基质和DOWEXTM MONOSPHER E 77，弱碱性阴离子，来自Millipore的Matrex CellufineTM A200，A500，Q500和Q800，来自EMD的FractogelTM EMD TMAE3FractogelTM EMD DEAE和FractogelTM EMD DMAE，来自Sigma-Aldrich的AmberliteTM弱和强阴离子交换I型和II型，DOWEXTM弱和强阴离子交换I型和II型，DiaionTM弱和强阴离子交换I型和II型，DuoliteTM，来自Tosoh的TSKTM gel Q和DEAE 5PW和5PW-HR，ToyopearlTMSuperQ-650S，650M和650C3 QAE-26-550C和650S，DEAE-650M和650C，和来自Whatman的QA52TM，DE23TM，DE32TM，DE51TM，DE52TM，DE53TM，Express-IonTMD和Express-IonTM Q。
如果需要的话，可以使用阴离子交换层析膜替代阴离子交换色谱基质。市售的阴离子交换膜包含，但不限于，来自Sartorius的SartobindTM Q，来自PallTechnologies的MustangTM Q，来自Millipore的InterceptTM Q。
在本文公开的一个实施方案中，阴离子交换树脂是强阴离子交换树脂。在本发明的另一个实施方案中，强阴离子交换树脂包含季胺基官能配合基(如，-N+(CH3)3，例如，在MacroPrepTM-HQ中所看到；Bio-Rad Laboratories)。在又一个实施方案中，阴离子交换树脂是通过连接基团接枝到羟基化的甲基丙烯酸聚合物的三甲胺基如GigaCap
在一个实施方案中，阴离子交换层析以相对于所述纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的正模式实施的。也就是说，所用的条件是这样的，当包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液或原料通过阴离子交换色谱树脂时，纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF与连接到树脂的带正电官能基结合，从而使溶液中的杂质在流经(直通)级分中通过树脂，在那里它们可以被丢弃或回收用于其它目的。一旦流经级分通过树脂，可以用本领域技术人员公知的适当的冲洗缓冲液冲洗阴离子交换色谱树脂。冲洗缓冲液的组成和冲洗步骤的条件将典型地选择以在该冲洗步骤过程中保留纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF结合到树脂上。本领域技术人员也将认识到，与色谱法有关的涉及的冲洗缓冲液，洗脱缓冲液，或类似物可以包含具有有限的或没有缓冲能力的溶液。
在本文公开一个实施方案中，在从阴离子交换色谱树脂洗脱纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF之前，用包含ε-氨基己酸(ε-ACA)的冲洗溶液冲洗树脂。加入ε-ACA到洗脱缓冲液可以促进蛋白酶(如纤维蛋白溶酶原)的洗脱，该蛋白酶在第一次通过柱子期间可能结合至阴离子交换色谱树脂上。适宜的冲洗步骤的一个实例描述在美国专利6,960,463中。
为了洗脱仍结合在阴离子交换色谱树脂上的纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF，可以使用本领域技术人员已知的任何适宜的洗脱缓冲液。为了从包含纤维蛋白原的溶液中去除纤维蛋白溶酶原和/或t-PA和/或其它蛋白酶，本发明的发明人已经发现，包含从约150mM至约300mM NaCl的洗脱缓冲液使得可以从阴离子交换树脂上洗脱纤维蛋白原单体，同时尽量减少也可以结合到树脂上的纤维蛋白原聚集体和/或其他蛋白质(例如，因子VIII，VWF，纤连蛋白或蛋白酶)的洗脱。因此，在本文公开的一个实施方案中，纤维蛋白原是用包含从约150mM至约300mM NaCl的洗脱缓冲液从阴离子交换树脂上洗脱的。这相当于具有从约18mS/cm(150mM NaCl)至约32mS/cm(300mM NaCl)的电导率范围的洗脱缓冲液。
在另一个实施方案中，纤维蛋白原是用包含从约150mM至约270mM NaCl的洗脱缓冲液从阴离子交换树脂上洗脱的。这相当于具有从约18mS/cm(150mMNaCl)至约29mS/cm(270mM NaCl)的电导率范围的洗脱缓冲液。
在另一个实施方案中，纤维蛋白原是用包含从约170mM至约230mM NaCl的洗脱缓冲液从阴离子交换树脂上洗脱的。这相当于具有从约19mS/cm(170mMNaCl)至约25mS/cm(230mM NaCl)的电导率范围的洗脱缓冲液。
在另一个实施方案中，纤维蛋白原是用包含从约200mM至约220mM NaCl的洗脱缓冲液从阴离子交换树脂上洗脱的。这相当于具有从约22mS/cm(200mMNaCl)至约24mS/cm(220mM NaCl)的电导率范围的洗脱缓冲液。
在另一个实施方案中，纤维蛋白原是用包含从约190mM至约210mM NaCl的洗脱缓冲液从阴离子交换树脂上洗脱的。
在另一个实施方案中，纤维蛋白原是用包含从约150mM至约190mM NaCl的洗脱缓冲液从阴离子交换树脂上洗脱的。
在另一个实施方案中，洗脱缓冲液具有18至32mS/cm范围的电导率；或20至25mS/cm；或21至23.5mS/cm；或22至23mS/cm。在一个优选的实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为约22.5mS/cm。
在本文公开的一个实施方案中，所述洗脱缓冲液包含促进纤维蛋白原单体相对于其聚集物洗脱浓度的游离氨基酸，。在另一个实施方案中，所述洗脱缓冲液包含以约0.5至10％(w/w)浓度的游离氨基酸。任何适合的游离氨基酸可以应用于该能力中。在一个实施方案中，游离氨基酸是精氨酸。在另一个实施方案中，洗脱缓冲液包含在约4至约10％(w/w)范围的精氨酸。
在其它实施方案中，洗脱缓冲液包含200mM NaCl，0.5％(w/w)精氨酸；或160mM NaCl，1％(w/w)精氨酸。
在一个实施方案中，阴离子交换色谱是以相对于纤维蛋白原的负模式和相对于因子VIII和/或VWF的正模式实施的。也就是说，所用的条件是这样的，当包含纤维蛋白原和因子VIII和/或VWF的溶液或原料通过阴离子交换色谱树脂时，因子VIII和/或VWF与连接到树脂的带正电官能基结合，从而使溶液中的纤维蛋白原在流经(直通)级分中通过树脂。。一旦包含纤维蛋白原的流经级分通过树脂，可以用本领域技术人员公知的适当的冲洗缓冲液冲洗阴离子交换色谱树脂。通常选择冲洗缓冲液的组成和冲洗步骤以在该冲洗步骤过程中保留因子VIII和/或VWF结合在树脂上。
在一个实施方案中，在约150mM至约270mM NaCl存在的条件下，包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液或原料通过阴离子交换色谱树脂。这相当于从约18mS/cm(150mM NaCl)至约29mS/cm(270mM NaCl)的电导率范围。在这些条件下，纤维蛋白原、特别是单体形式通过阴离子交换色谱树脂，同时包含聚集体的纤维蛋白原和例如IgG和纤连蛋白的其他杂质结合到树脂上。在进一步的实施方案中，在约170mM至约230mM NaCl(约19mS/cm至约25mS/cm)或约200mM至约220mM NaCl(约22mS/cm至约24mS/cm)存在的条件下，包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液或原料通过阴离子交换色谱树脂。在这些类型的条件下，预期因子VIII和/或vWF将结合到阴离子交换色谱树脂上。
因子VIII和/或VWF可以用包含至少300mM的盐，如NaCl，的洗脱缓冲液从阴离子交换树脂上洗脱。在一个具体的实施方案中，因子VIII和/或VWF用约500mM NaCl从阴离子交换树脂上进行洗脱。在纤维蛋白原和因子VIII和/或VWF结合至阴离子交换树脂的情况下，可以进行洗脱步骤，使得纤维蛋白原首先被洗脱(例如使用在上述实施方案中描述的条件)，然后使用更高浓度的盐，如500mM NaCl，将因子VIII和/或VWF洗脱。
在使用阴离子交换色谱步骤的情况下，它可以在包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF原料通过该HCIC树脂之前和/或之后进行。在本文所公开的一个实施方案中，该方法进一步包含使在步骤(ii)回收的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液通过阴离子交换色谱树脂。在另一个实施方案中，其中如本文所述使用第一和第二HCIC色谱步骤，所述方法还包含使在步骤(ii)和/或步骤(iv)回收的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液通过阴离子交换色谱树脂。
在本文公开的一个实施方案中，该方法进一步包含在步骤(i)之前，使包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液通过阴离子交换色谱树脂。
本领域技术人员将理解，按照本发明使用附加的色谱步骤的数量将取决于最终制剂所需的纯度水平。例如，本发明的方法可以如本文所公开的包含2，3，4或5个色谱步骤。例如，其中该方法包含2个色谱步骤，步骤的顺序将是HCIC/IEX或HCIC/HCIC或IEX/HCIC；其中该方法包含3个层析步骤，步骤的顺序将是HCIC/IEX/HCIC或HCIC/HCIC/IEX或HCIC/HCIC/HCIC或HCIC/IEX/IEX或IEX/HCIC/HCIC或IEX/HCIC/IEX或IEX/IEX/HCIC；其中该方法包含4个层析步骤，步骤的顺序将是HCIC/IEX/HCIC/HCIC或HCIC/HCIC/IEX/HCIC或HCIC/HCIC/HCIC/IEX或HCIC/HCIC/HCIC/HCIC或HCIC/IEX/IEX/HCIC或HCIC/IEX/IEX/IEX或HCIC/HCIC/IEX/IEX或HCIC/IEX/HCIC/IEX或IEX/HCIC/IEX/HCIC或IEX/HCIC/HCIC/IEX或IEX/HCIC/HCIC/HCIC或IEX/HCIC/IEX/IEX或IEX/IEX/HCIC/HCIC或IEX/IEX/HCIC/IEX或IEX/IEX/IEX/HCIC；等等(其中“IEX”表示阴离子交换色谱法)。纯度所需的水平可以通过溶液的预期用途(例如，用于治疗纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF缺乏的患者)和/或作为水性制剂所需的较长的贮存期而规定。
可以使用本领域技术人员所公知的任何方法来实施色谱法。例如，根据本发明的色谱步骤可以使用轴流的柱子，例如可以从GE Heal thcare，Pall公司和Bio-Rad公司获得的，或径流的柱子，如可以从Proxcys获得的。根据本发明的色谱步骤还可以使用膨胀床技术进行。
在一个实施方案中，在包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的回收溶液中纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的浓度，相比于原料减少了至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％或至少95％。
最大限度地去除杂质是特别有利的，杂质如纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶，因为决定性的改善了溶液中纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的稳定性和效力，特别是在长期储存中。液体形式存储对于包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液是特别有利的，因为使得在患者中即时使用成为可能。这是在相比于纯化的纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的冻干制剂的应用，冻干制剂在施用到有此需求的受试者之前需要立即使用注射用适宜的缓冲液和/或水重构冻干蛋白。
从包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液中消耗蛋白酶或其酶原(如纤维蛋白溶酶原)的一个优点是，它最大限度地减少了添加抗纤维蛋白溶解剂的需求，抗纤维蛋白溶解剂抑制任何残留的蛋白酶和或酶原(例如，纤维蛋白溶酶或纤维蛋白溶酶原)。这些试剂的实例包含抑肽酶，纤维蛋白溶酶的牛蛋白抑制剂；传明酸，其是也与神经毒性副作用相关的一种合成的纤溶酶抑制剂。
另一个有利的特征是纤维蛋白溶酶原，其已经通过HCIC从包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液中分离出来，可以进一步处理以产生纤维蛋白溶酶原浓缩物，用于例如，临床使用。因此，从单一起始溶液HCIC可用于制备纤维蛋白溶酶原和包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液。
另一个有利的特征是，HCIC树脂的生产成本远远比在亲和色谱过程中使用的赖氨酸-SepharoseTM或固定化的赖氨酸树脂的成本更经济。
另一个有利的特征是HCIC可以用来替代用于去除蛋白酶(如凝血因子II)的氢氧化铝(例如AlhydrogelTM)步骤。AlhydrogelTM目前广泛用于因子VIII和VWF的商业化生产。但是，这种材料相对昂贵，通常每批使用100Kg的数量级别。此外，AlhydrogelTM往往需要人工处理并且在使用一次后该材料就被丢弃。与此相反，HCIC步骤可以完全自动化并且该树脂可以在多个批次的制造中使用。
另一个有利特征是HCIC树脂是与1M NaOH相容的，1M NaOH可用于在柱子的清洗和树脂消毒工序期间失活和去除包含病毒和朊病毒的病原体。
从本发明的方法得到的液体制剂也比使用冷冻制剂具有优势，冷冻制剂需要昂贵的储存和运输装置并且在立即使用之前必须解冻。即使是在纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF存储为冻干或冷冻制剂的情况下，重构或解冻的蛋白质稳定较长时间也是有利的。这是显而易见的，例如，在作为医疗过程的预防措施原料已经被重构的情况下，但是基于医学上考虑不需要应用它。这种原料通常被丢弃，因为由于凝血酶原和/或t-PA和/或其它蛋白酶的存在，纤维蛋白原仅在一个短期的期间内是稳定的。
在具体实施方案中，本发明的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的液体制剂存储为液体或冻干或冷冻制剂。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于纯化纤维蛋白原的方法，该方法包含以下步骤：
(i)在选择的条件下，使包含纤维蛋白原的溶液通过离子交换色谱树脂，所述选择的条件使得纤维蛋白原单体结合到树脂上；
(ii)用洗脱缓冲液从树脂上洗脱纤维蛋白原单体；和
(iii)经由具有从约15nm至约35nm范围孔径的过滤器，过滤来自步骤(ii)的所述洗脱纤维蛋白原单体。
在一个实施方案中，在选择的条件下，在包含纤维蛋白原的原料通过疏水电荷诱导色谱树脂之后回收包含纤维蛋白原的溶液(步骤(i))，所述选择的条件使得纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶结合到树脂上并且纤维蛋白原通过树脂。
在一个实施方案中，离子交换色谱树脂选自阴离子交换色谱树脂或阳离子交换色谱树脂。
在一个实施方案中，阴离子交换色谱树脂是强阴离子交换色谱树脂或弱阴离子交换色谱树脂。在一个实施方案中，阴离子交换色谱树脂包含季铵基基团。实例包含季烷基胺和季烷基烷醇胺，或胺，二乙胺，二乙基氨基丙基，氨基，三甲铵甲基，三甲基苄基铵，二甲基乙醇基苄铵和聚胺。在一些实施方案中，阴离子交换色谱树脂是接枝有叔胺基或季胺基的聚合物载体或是接枝有叔胺基或季胺基的羟基化聚合物的载体。在一些实施方案中，阴离子交换色谱树脂包含甲基丙烯酸酯聚合物载体。在一个实施方案中，阴离子交换色谱树脂是MacroPrepTM HQ。在另一个实施方案中，阴离子交换色谱树脂是GigaCapTMQ-650M。在其它实施方案中，阴离子交换色谱树脂被填充到柱子中。
如果需要的话，可以使用阴离子交换层析膜替代阴离子交换色谱树脂。市售的阴离子交换膜包含，但不限于，来自Sartorius的SartobindTM Q，来自PallTechnologles的MustangTM Q，来自Millipore的InterceptTM Q膜。
在一个实施方案中，阳离子交换色谱树脂是强阳离子交换色谱树脂或弱阳离子交换色谱树脂。
市售的阳离子交换色谱树脂包含，但不限于，例如，那些具有磺酸基团的树脂(例如，来自Ge Heal thcare的MonoS，MiniS，SourceTM 15S和30S，SPSepharose Fast FlowTM，SP Sepharose High PerformanceTM，来自Tosoh的ToyopearlTMSP-650S和SP-650M，来自BioRad的Macro-Prep HiggTM S，来自Pall Technologies的Ceramic HyperDTM S，TrisacrylTM M和LSTM SP和SpherodexTM LS SP)；具有磺基基团的树脂(例如，来自EMI)的FractogelTM SE，来自AppliedBiosystems的PorosTM S-10和S-20)；具有磺基基团的树脂(例如，来自Tosoh的TSKTM Gel SP 5PW和SP-5PW-HR，来自Applied Biosystems的PorosTM HS-20和HS 50)；具有sulfoisobutyl基团的树脂(例如，来自EMI)的FractogelTMEMDS03”)；具有亚磺酰基基团的树脂(例如，来自Whatman的SE52，SE53和Express-Ion S)，具有羧甲基化基团的树脂(例如，来自Ge Healthcare的CMSepharose Fast FlowTM，来自Biochrom Labs Inc.的HydrocellTM CM，来自BioRad的Macro-PrepTM CM，来自Pall Technologies的Ceramic HyperDTM CM，TrisacrylTMM CM，TrisacrylTM LS CM，来自Millipore的Matrex CellufineTM C500和C200，来自Whatman的CM52TM，CM32TM，CM23TM和ExpressTM-Ion C，来自Tosoh的ToyopearlTM CM-650S，CM-650M和CM-650C)；具有磺酸和羧酸基团的树脂(例如，来自J.T.Baker的BAKERBONDTM Carboxy-Sulfon)；具有羧酸基团的树脂(例如，来自J.T.Baker的WPTM CBX，来自Dow Liquid Separations的DOWEX MAC-3TM，来自Sigma-Aldrich的AmberliteTM弱阳离子交换剂，DOWEXTM弱阳离子交换，和DiaionTM弱阳离子交换剂和来自EMD的FractogelTM MMID C00-)；具有磺酸基团的树脂(例如，来自Biochrom Labs Inc.的HydrocellTM SP，来自Dow Liquid Separations的DOWEXTM Fine Mesh Strong Acid Cation Matrix，来自J.T.Baker的UNOsphereTM S，WP Sulfonic，来自Sartorius的SartobindTM S membrane，来自Sigma-Aldrich的AmberliteTM强阳离子交换剂，DOWEXTM强阳离子和Diaion强阳离子交换剂)；和具有磷酸基团的树脂(例如来自Whatman的PI 1)。如果需要的话，可以使用阳离子交换层析膜替代阳离子交换基质，例如，SartobindTM S(Sartorius；Edgewood，NY)。
在一个实施方案中，包含纤维蛋白原的溶液具有约pH 7至pH 10范围内的pH值。在一个实施方案中，所述包含纤维蛋白原溶液的pH为约pH 8。在一些实施方案中，在所述阴离子交换色谱树脂负载纤维蛋白原后，用具有与包含纤维蛋白原的溶液相类似pH的缓冲液预平衡和冲洗柱子。
在一个实施方案中，洗脱缓冲液具有从约18至约30mS/cm范围的电导率。例如，洗脱缓冲液的电导率可以是在约18至约25mS/cm的范围内；或约19至约24mS/cm；或约20至约24mS/cm；或约21至约23mS/cm。在一个实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为约22mS/cm。在其它实施方案中，洗脱缓冲液包含NaCl。在一个实施方案中，洗脱缓冲液包含约180mM至约230mM，或约190mM至约210mM范围浓度的NaCl。在一个实施方案中，洗脱缓冲液中NaCl的浓度为约200mM。
在一个实施方案中，包含纤维蛋白原的洗脱缓冲液包含约0.5至约10mg/mL浓度的蛋白质。在一些实施方案中，包含纤维蛋白原的洗脱缓冲液中蛋白质的浓度范围是从约4至约8mg/mL。在具体实施方案中，包含纤维蛋白原的洗脱缓冲液是约6mg/mL。
在一个实施方案中，在过滤(步骤(iii))之前，用一个或多个氨基酸配制洗脱的纤维蛋白原单体。在一个实施方案中，氨基酸为精氨酸或甘氨酸或其组合。在一些实施方案中，在包含纤维蛋白原的洗脱缓冲液中氨基酸的浓度范围是从约0.5至约10％(w/w)。在一个实施方案中，在包含纤维蛋白原的洗脱缓冲液中氨基酸的浓度是约1％至约6％(w/w)，或约2％至约6％(w/w)或约2％至约5％(w/w)。在一个实施方案中，用约2％，或约3％，或约4％或约5％(w/w)的精氨酸配制包含纤维蛋白原的洗脱缓冲液。
在一个实施方案中，洗脱的纤维蛋白原单体的pH是从约pH 7至约pH 9。
在一个实施方案中，步骤(ii)的过滤器具有从约15nm至约35nm范围的孔径；或从约15nm至约30nm；或从约15nm至约25nm；或从约15nm至约20nm。
可以使用切向流过滤(TFF)或“死端(dead-end)”过滤(也称为正常流动过滤)实施过滤病毒。病毒过滤器最初设计为原料流入相邻的非对称膜的上层而于TFF中应用。通过扫膜表面以减少极化浓度和污染，TFF提供了高通量。然而，死端过滤的简单性和较低的资金成本，已经导致了专为死端过滤设计的病毒过滤器的普遍使用。与TFF相对比，这些死端过滤器通常在膜的朝向进料流的更开放的一面进行操作，使蛋白质聚集体和其它大污物在大孔亚结构内被捕获从而保护了保持病毒的皮层。使用一次性的死端过滤器的优点包含，它们既简化系统设计和验证，又降低了劳动力和资金成本。
死端过滤通常涉及使用单个泵使流体从表面通过膜。
切向流过滤通常需要第一个泵以在过滤膜的表面保持恒定的流速和第二个人泵通过在膜的背面产生一个负压而驱动蛋白质通过所述膜。
在一个实施方案中，过滤是通过死端过滤进行的。
在一个实施方案中，死端过滤过程是使用恒压过滤或等速过滤进行的。在一个实施方案中，死端过滤过程是使用恒压过滤进行的。
过滤通常在过滤压力下实施的，过滤压力与所述膜可以承受的水平相同或在低于所述膜可以承受的水平，这取决于这里打算使用的病毒除去膜的材料，例如具有约0.2至3.4巴的压力。在一个实施方案中，过滤压力保持在约0.2bar至约3.4巴。在另一个实施方案中，过滤压力保持在约1至约3巴；或在约1至约2巴；或在约1.2到约2巴。在另一个实施方案中，过滤压力保持在约1.5巴至约1.9巴。
温度可能影响病毒除去膜上的蛋白质溶液粘度和过滤的通量。本领域技术人员可以理解的是，在过滤步骤中使用的溶液将通常具有从约0℃到至多相关蛋白质变性温度的范围内的温度。溶液的适宜温度在从约10℃至约50℃的范围内。在一个实施方案中，溶液的温度在从约18℃到上至约35℃的范围内。在另一个实施方案中，溶液在从约18℃至约26℃的室温下过滤。
在一个实施方案中，病毒过滤器容量是过滤器表面积每m2至少0.20kg或至少0.50kg或至少0.75kg或至少1.00kg或者至少1.25kg或至少1.50kg或至少2kg纤维蛋白原。
任选地，为了除去宏观尺寸的颗粒，可以在病毒过滤前进行预过滤或净化过滤步骤。在一个实施方案中，用包含比病毒除去膜孔径更大的膜的预过滤器进行预过滤。在一个实施方案中，预过滤器是具有约0.1μm孔径的膜滤器。在另一个实施方案中，预过滤器选自Pall Nylon膜过滤器(SKL 7002 NTP 0.1μm或FTKNI)或具有用于除去蛋白聚集体和/或颗粒的类似性质的市售其它预过滤器。预过滤可以是相对于病毒过滤器在线进行的或者与病毒过滤器相脱线的。在一个实施方案中，预过滤是相对于病毒过滤器在线进行的。
根据本发明的这个方面的用于病毒过滤方法的适合的过滤器将是本领域技术人员所公知的。一个实例特别是包含Planova BioExTM。这种过滤器有时被称为“小病毒”去除过滤器。
在一个实施方案中，过滤膜是一个平板或中空纤维膜。平板膜的实例包含亲水化PVDF滤膜，如PegasusTMGrade SV4小病毒清除过滤器(Pall公司)。在一个实施方案中，过滤器是PegasusTMGrade SV4。
在其它实施方案中，过滤器是中空纤维膜。中空纤维膜可以包含稻草形的中空纤维束，每个中空纤维的壁含有由通过细的毛细管互连的孔隙构成的多孔三维网络结构。中空纤维过滤器的实例包含PlanovaTMBioEXTM过滤器(AsahiKasei Corporation)，其在中空纤维膜格式中结合亲水改性聚偏二氟乙烯(PVDF)。在一个实施方案中，过滤器是PlanovaTMBioEX。
在一个实施方案中，串联使用两个或多个小病毒过滤器。在一个实施方案中，过滤，串联使用具有从约15至约20nm范围孔径的两个过滤器。对于细小病毒样MVM来说，这种过滤步骤具有使得用至少LRV 6.9 Log LRV制备纤维蛋白原的潜力。
在本发明的另一个方面，在选择的条件下，包含纤维蛋白原的溶液通过离子交换色谱树脂，所述选择的条件使得存在于溶液中的纤维蛋白原通过树脂。即，在选择的条件下，离子交换层析是相对于纤维蛋白原在负模式下进行的，所述选择的条件使得当该溶液通过树脂时，杂质如溶液中存在的纤维蛋白原聚集体，纤维蛋白溶酶原和纤连蛋白与附着在树脂上的带电的官能基结合，使溶液中存在的纤维蛋白原，特别是纤维蛋白原单体，在流经(直通)级分中通过树脂。一旦包含纤维蛋白原的流经级分通过树脂，用本领域技术人员所公知的适当的冲洗缓冲液冲洗离子交换色谱树脂。通常将选择冲洗缓冲液的组成和冲洗步骤的条件以在冲洗步骤期间保留结合到树脂上的杂质。
在一个实施方案中，离子交换色谱树脂选自阴离子交换色谱树脂或阳离子交换色谱树脂。
在一个实施方案中，在约150mM至约270mM NaCl存在的条件下，包含纤维蛋白原的溶液通过阴离子交换色谱树脂。这相当于约18mS/cm(150mM NaCl)至约29mS/cm(270mM NaCl)范围的电导率。在这些条件下，纤维蛋白原，特别是其单体形式，通过阴离子交换色谙树脂，同时包含聚集体的纤维蛋白原和其它杂质如纤溶酶和纤连蛋白结合到树脂上。在进一步的实施方案中，在约170mM至约230mM NaCl(约19mS/cm至约25mS/cm)存在的条件下，或约200mM至约220mM NaCl(约22mS/cm至约24mS/cm)下，使包含纤维蛋白原的溶液通过阴离子交换色谱树脂，。在这些类型的条件下，预期杂质将结合到阴离子交换色谱树脂上，使得纤维蛋白原在流经级分中通过树脂。
通过本发明的方法回收的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液是有利的，因为它们提供了，即使在室温下，比现有的冻干制剂具有更高稳定性的纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF制剂。在不能在整个运输和/或储存中确保低温(如果适合的话)的冗长的运输路线中，这可能是特别有利的。溶液中纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的稳定存储在许多方面也是便利的，生产，使用，运输和给予有此需求的患者。由于按照本发明制备的纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的增加的稳定性，有可能在许多药物制剂中免除额外加入稳定剂以减少潜在的风险，这些稳定剂如纤维蛋白溶解或纤维蛋白原溶液抑制剂，其可能在某些情况下导致不希望的副作用或应该避免的作用。
如本文所用的术语“稳定的”，意味着相比于纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF保存前(例如，相比于按照本发明包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液回收之后，立即测定的活性水平)，在存储一段时间之后，纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的活性具有很少的或者没有显著性损失。在本文所公开的一个实施方案中，在约0℃至约30℃的温度下存储一段时间之后，包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液保持至少70％的活性，优选至少80％的活性，更优选至少90％的活性，甚至更优选至少95％的活性和最优选100％的活性。本领域技术人员应当理解，在开始储存期之前可以为纤维蛋白原制剂立即测定纤维蛋白原活性，并且该初始值可以用来指定为100％的活性，在储存期间从在不同时间点测定的纤维蛋白原活性可以进行比较并且表示为这个初始值的百分比。
在本文所公开的一个实施方案中，在约2℃至约8℃的温度下存储至少4周后的溶液中，根据本发明的方法回收的纤维蛋白原保持从约90％至100％的活性，优选在约2℃至约8℃的温度下存储4周后的溶液中保持约90％的活性。在本文所公开的另一个实施方案中，在约30℃的温度下存储至少4周后的溶液中，纤维蛋白原保持从约60％到约80％的活性，优选在约30℃的温度下存储5周后的溶液中保持从约60％到约70％的活性。纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的活性水平可以通过本领域技术人员所公知的任何方法来确定。用于确定纤维蛋白原活性的适合方法的实例，例如，由Mackie等等概述(BritishJ.Haematol.121：396-404，2003)。具体的方法包含Clauss法(Clauss，1957，Acta-Haematol.17，237-246)和/或可凝固蛋白质法(Jacobsson K.，Scand JClin Lab Invest 1955；7(supp 14)：1-54或Fibrin sealant Ph.Eur.Monograph903，2012)。结果可以报告为使用Clauss法或类似方法所测定的％可凝固蛋白；％初始可凝固蛋白质，和/或％初始纤维蛋白原的活性。
本领域技术人员将理解，在包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的回收溶液中纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的浓度可能决定存储期限和/或储存条件(例如，温度)。例如，可以的理解是，当与包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的回收溶液中纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的浓度相比于原料仅减少50％的制剂相比时，在回收的溶液中纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的浓度相比于原料减少80％的制剂，可以存储较长的一段时间和/或在更高的温度下而没有纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF活性的显著不稳定。
虽然本发明的方法可以在实验室规模进行，它们可以在不显著改变的条件下放大到工业化规模。因此，在本文公开的实施方案中，本发明的方法是在工业化或商业化规模上实施的。优选的，本发明的方法是适用于纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的商业化模制造。例如，当在本发明的方法中使用血浆级分作为起始原料时，则商业化规模的制造将涉及使用从至少约500kg血浆衍生的血浆级分。更优选的是，起始的血浆级分将来自于每批次至少约5000kg，7500kg，10000kg和/或15000kg血浆。在具体的实施方案中，包含本发明的纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液和药学上的制剂是在商业化规模上从血浆级分或重组原料制备的。
包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液被用于临床或兽医应用(例如，用于给予纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF缺乏患者或用作纤维蛋白胶)，本领域技术人员将理解，可能期望减少溶液中活性病毒的含量(病毒滴度)和其它潜在的感染剂(例如朊病毒)的水平。其中来自于血浆的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的原料(即，起始原料)可能是特别期待的。在溶液中减少病毒滴度的方法是本领域技术人员所公知的。实例包含巴氏灭菌法(例如，在高浓度灭菌剂存在下，如甘氨酸(例如2.75M)和蔗糖(例如50％)和/或其它选择的赋形剂或盐，在60℃下温育该溶液10小时)，干热处理，病毒过滤(溶液通过纳米过滤器；例如，20nm的截止限)和/或在一定条件下用合适的有机溶剂和清洁剂处理溶液一段时间以灭活溶液中的病毒。溶剂冲洗剂已经使用了20多年以灭活特别是在血浆衍生产品中的包膜病毒，血浆衍生产品包含纤维蛋白原和因子VIII和/或VWF。因此，可以使用各种试剂和本领域中已知的方法实施(参见，例如，US 4540573和US4764369，在此通过引用并入本文)。合适的溶剂包含三-正丁基磷酸盐(TnBP)和乙醚，优选TnBP(通常在约0.3％)。合适的清洁剂包含聚山梨酸酯(吐温)80，聚山梨醇酯(吐温)20和Triton X-100(通常为约0.3％)。包含溶剂和冲洗剂浓度的处理条件的选择是部分取决于具有低纯度原料的原料特性，低纯度原料通常需要更高浓度的试剂和更极端的反应条件。优选的清洁剂是聚山梨酯80和一个特别优选的组合是聚山梨酯80和TnBP。所述原料可以在一定温度下与溶剂和清洁剂试剂搅拌充足的时间以灭活任何可能存在的包膜病毒。例如，溶剂清洁剂处理可以在25℃下进行约4小时。随后去除溶剂冲洗剂的化学品，通过例如在色谱介质如C-18疏水树脂上吸附或在吸附相关蛋白质条件下从离子交换树脂的直通级分中洗脱。
该病毒灭活步骤可以在本文所公开方法的任何适合阶段进行。在一个实施方案中，包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的原料是在步骤(i)前进行病毒灭活步骤。在另一个实施方案中，从疏水电荷诱导色谱树脂中回收(即，从步骤(ii)和/或(iv))的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和或VWF的溶液进行病毒灭活步骤。在本文公开的一个实施方案中，病毒灭活步骤包含巴氏灭菌法处理或用有机溶剂和清洁剂处理。在本文公开的另一个实施方案中，病毒灭活步骤包含病毒过滤。其中，在使用病毒过滤的情况下，本发明人已经发现在过滤步骤之前加入游离的氨基酸(例如精氨酸)可以显著提高通过过滤器的通量速率和纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的回收。这种方法的一个实例在US7919592中描述。
在本文所公开的一个实施方案中，包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的原料或溶液在通过阴离子交换色谱树脂之前进行病毒灭活步骤。在处理过的溶液或原料通过阴离子交换色谱树脂之前进行例如溶剂清洁剂处理的病毒灭活步骤的优点在于，通过利用促进纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF结合到树脂上和去除流经(直通)级分中的有机溶剂和清洁剂的条件，阴离子交换树脂可用于从处理过的溶液中除去有机溶剂和清洁剂。
巴氏灭菌法可以产生蛋白质聚集体和聚合物，特别是在包含纤维蛋白原的溶液中(在此也称为“纤维蛋白原溶液”)。因此，在一些情况下可能理想的是，减少巴氏杀菌溶液中聚集体/聚合物的水平。这可以通过本领域技术人员所知的任何手段而实现，不过可以通过进一步的层析纯化而方便的实现。在本文公开的一个实施方案中，巴氏杀菌溶液或原料相对于纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF在正模式下通过阴离子交换色谱树脂，使得从流经(直通)级分中去除任何聚集体或聚合物。
在本文中使用的术语“原料”表示包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的任何溶液。原料也可以包含本领域技术人员所公知的其它蛋白质(例如，治疗性蛋白质)。实例包含参与凝血级联的蛋白质。在本文公开的一个实施方案中，所述原料包含纤维蛋白原。
包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的适合的原料将是本领域技术人员所公知的。实例包含血浆或血浆级分，如来自于人类或动物血浆或血浆级分的溶解的血浆冷沉淀或溶解的级分I相，来自重组技术的细胞培养级分，来自转基因动物的乳汁级分。重组来源的纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF蛋白也适合用作根据本发明的原料。其中该原料是血浆或血浆级分，它可以是收集的血浆捐赠或者它可以是来自个体供体。在本文公开的一个实施例中，包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的原料是溶解的血浆冷沉淀物。这种成分，无论是来自于全血或通过单采血液成分收集，是在1-6℃之间受控解冻新鲜冷冻血浆并且回收沉淀而制备的。冷不溶性沉淀物再次冷冻。冷沉淀单采的一个单位是大致相当于2个单位的从全血中获得的冷沉淀物。它包含大部分的纤维蛋白原，因子VIII和VWF，连同来自新鲜冷冻血浆的其它蛋白质如因子XIII和纤连蛋白。纤维蛋白原的替代来源是级分I沉淀，其可以通过离心或过滤经由解冻并除去冷沉淀物而从冷冻血浆中制备。然后用乙醇混合所得的冷上清液以沉淀级分I。例如，在pH 7.2和控制温度至-3℃左右时，级分I沉淀可以通过加入约8％(v/v)的乙醇获得(Cohn等人1946，J.Am.Chem.Soc.62：459-475)。在一个实施方案中，包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的原料是冷沉淀物。
在本申请说明书中小涉及的“蛋白酶”可以是存在于包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的原料或溶液中的任何蛋白酶和/或其酶原，当暴露于HCIC树脂时，其能够结合至HCIC树脂，其中在所述纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF通过树脂的条件下。蛋白酶可以是任何类型的，包含丝氨酸蛋白酶(例如，纤维蛋白溶酶，凝血酶，胰蛋白酶)，苏氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶(例如，组织蛋白酶B和组织蛋白酶H)，天冬氨酸蛋白酶(例如，胃蛋白酶)，金属蛋白酶(例如，胶原酶和明胶酶)和谷氨酸蛋白酶。其中包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的原料是来源于人或动物的血浆，该蛋白酶/酶原可以包含纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物(tPA)，凝血酶，弹性蛋白酶，因子VIIa，因子IXa，因子Xa，因子XIa，因子XIIa，因子XIIIa，血浆激肽释放酶和它们的类似物。在考虑到包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液，被去除的特别优选的蛋白酶/酶原是纤维蛋白溶酶原。从包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液中去除的其它优选的蛋白酶/酶原是t-PA，pro-/或活性凝血酶(因子II/IIa)。当包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的原料是来自细胞培养物上清液时，该蛋白酶/酶原可以包含任何宿主细胞蛋白酶，例如，尤其是丝氨酸蛋白酶(例如，酪蛋白酶)，金属蛋白酶{例如，明胶酶，包含MMP3，MMP10或MMP12的基质金属蛋白酶(MMP))，天冬氨酸蛋白酶(组织蛋白酶D)，酸性蛋白酶。
在一些情况下，可能期望在步骤(i)中该原料通过HCIC树脂之前从原料中去除或减少杂质水平。从原料中去除或减少杂质水平可以在包谱纯化期间降低HCIC树脂上的负载，从而提高了从原料中分离纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的效率。杂质可以被除去或减少，例如，通过从原料中沉淀纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF并且回收沉淀的蛋白质。从包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的原料中沉淀纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的适宜方法，将是本领域技术人员所公知的。一个实例包含添加氢氧化铝悬浮液至原料中，这特别有用于从血浆或血浆的冷沉淀物中去除维生素K-依赖性蛋白质(例如，凝血因子II，VII，IX和X)和对氢氧化铝具有结合亲和力的其它蛋白质，如凝血酶原(因子II)和t-PA。
因此，在本文公开的实施方案中，在步骤(i)之前，从原料中去除或减少维生素K依赖性蛋白质。在进一步的实施方案中，通过加入氢氧化铝至原料中去除或减少维生素K依赖性蛋白质。氢氧化铝可以是形式的，加入到原料中至约10％至约80％w/w的最终浓度。在一些实施方案中，氢氧化铝加入到原料中至从约10％至约50％(w/w)范围的最终浓度。在其他实施方案中，氢氧化铝加入到原料中至从约10％至约30％(w/w)范围的最终浓度。在优选的实施方案中，该浓度是从约15％至约30％(w/w)。最优选的是，为了最佳的纤维蛋白原回收和除去杂质如凝血酶原，氢氧化铝以约15％至约25％(w/w)的浓度加入到原料中。在另一个实施方案中，通过使用氢氧化铝进行批吸附，从原料中去除维生素K依赖性蛋白质。
在本发明的另一个方面，提供了一种如本文所述的通过本发明的方法回收的包含纤维蛋白原和或因子VIII和/或VWF的溶液。在一个实施方案中，溶液中纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的水平将少于总蛋白质的20％，优选少于总蛋白质的10％，并且更优选少于总蛋白质的5％，或少于总蛋白质的1％，或少于总蛋白质的0.1％，或少于总蛋白质的0.01％或少于总蛋白质的0.001％，或少于总蛋白质的0.0001％。本领域技术人员应当理解，在包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液中存在的纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的水平可能取决于溶液的预期用途或存储的长度。例如，如果该溶液是在约0℃至约8℃的温度下存储至少4周，那么该溶液包含超过约10％的纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶(占总蛋白)可能是可接受的。如果溶液是在约30℃的温度下存储至少4周，那么可能理想的是该溶液包含低于约10％的纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶(占总蛋白)。
在本文所公开的一个实施方案中，提供了一种通过本发明的方法回收的包含纤维蛋白原的溶液。在另一个实施方案中，该溶液包含至少80％的总蛋白的纤维蛋白原。
在本发明的另一个方面，提供了一种溶液，其包含：
(a)至少75％总蛋白质的纤维蛋白原；
(b)少于50pg/mg总蛋白质的组织纤维蛋白溶酶原激活物；和/或
(c)少于1μg/mg总蛋白质的纤维蛋白溶酶原。
在一个实施方案中，所述溶液还包含少于1.5×10-5U/mg总蛋白质的因子II。
在本发明的另一个方面，提供了一种溶液，其包含：
(a)至少90％总蛋白质的纤维蛋白原；
(b)少于50pg/mg总蛋白质的组织纤维蛋白溶酶原激活物；和/或
(c)少于150ng/mg总蛋白质的纤维蛋白溶酶原。
在一个实施方案中，所述溶液还包含：
(a)少于3.5×10-6U/mg总蛋白质的因子II；和/或
(b)少于150μg/mg总蛋白质的纤连蛋白。
在本发明的另一个方面，提供了一种溶液，其包含：
(a)至少90％总蛋白质的纤维蛋白原；
(b)少于50pg/mg总蛋白质的组织纤维蛋白溶酶原激活物；和/或
(c)少于10ng/mg总蛋白质的纤维蛋白溶酶原。
在本发明的另一个方面，提供了一种溶液，其包含：
(a)至少90％总蛋白质的纤维蛋白原；
(b)少于20pg/mg总蛋白质的组织纤维蛋白溶酶原激活物；和/或
(c)少于10ng/mg总蛋白质的纤维蛋白溶酶原。
在一个实施方案中，所述溶液还包含：
(a)少于2.7×10-6U/mg总蛋白质的因子II；和/或
(b)少于15μg/mg总蛋白质的纤连蛋白。
通过本文公开的方法回收的溶液中纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的浓度和杂质的浓度(例如，纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶)可以通过本领域技术人员公知的任何方法而测量。，用于测量纤维蛋白原的适宜测定法的实例由Mackieet等人描述(Br J Haema tol.2003May；121(3)：396-404)。尺寸排阻HPLC也可以用于测量包含纤维蛋白原和/或因子VIII的溶液中纤维蛋白原和/或因子VIII或杂质的浓度(例如，Cardinali等人2010，Arch.Biochem.Biphys.493(2)：157-168；和Kosloski等人2009，AAPS J.11(3)；424-431)。HPLC也允许技术人员用于区分纤维蛋白原的单体和聚集体。此外，纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的浓度可能不同，取决于所使用的该测定的灵敏度。例如，使用Clauss法测得的溶液中纤维蛋白的浓度可能略低于通过HPLC测量的在同一溶液中的浓度。
在本文公开的一个实施方案中，溶液中单体的纤维蛋白原浓度是总蛋白的至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％，通过尺寸排阻HPLC测定。
在本发明的另一个方面，提供了一种药物制剂，包含由本文公开的方法回收的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液和药学上可接受的载体。适宜的药学上可接受的载体，包含其药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂，将是本领域技术人员所公知的。实例包含溶剂，分散介质，抗真菌和抗细菌剂，表面活性剂，等渗剂和吸收剂等。
所述的药物制剂也可以通过加入适合的稳定剂组合而配制，例如，氨基酸，碳水化合物，盐和清洁剂。在具体实施方案中，该稳定剂包含糖醇和氨基酸的混合物。该稳定剂可以包含糖(例如蔗糖或海藻糖)，糖醇(例如甘露醇或山梨醇)，和氨基酸(例如脯氨酸，甘氨酸和精氨酸)的混合物。在一个优选的实施方案中，该制剂包含如精氨酸的氨基酸。在其它实施方案中，该制剂包含如在US7045601中所述的浓度高达100mM的二价金属离子和配位剂。具体实施方案包含如US7045601实施例1中所述的制剂1至7。在具体的实施方案中，在不添加任何抗纤维蛋白溶解剂或如白蛋白的稳定蛋白时，配制该制剂。在实施方案中，该制剂包含纤维蛋白原，pH优选是约6.5至7.5并且渗透压是至少240mosmol/kg。
该药物制剂也可以在分配和长期存储之前通过过滤灭菌。优选的，该制剂将在至少2，4，6，8，10，12，18，24，36或更多个月中基本上保留其原有的稳定性特点。例如，当保存6个月或更长的时间，在2-8℃或25℃存储的制剂通常可以保持经由HPLC-SEC测量的基本相同的分子大小分布。当存储在2-8℃和/或室温时，药物制剂的具体实施方案可以是稳定的和适用于商业上药物应用至少6个月，12个月，18个月，24个月，36个月或者甚至更长时间。
如本文所述的本发明的溶液和药物制剂，可以配制成任意的许多可能剂型，例如注射剂。该制剂和它们随后的施用(给药)属于本领域技术范围内。给药是依赖于受治疗患者的反应，但不变地持续为所需的理想效果(例如，恢复到纤维蛋白原的正常血浆水平)。普通技术人员可以很容易地确定最佳剂量，给药方法和重复率。
在本文公开的一个实施方案中，本发明的药物制剂具有至少5mL的体积并且包含至少5mg/mL的纤维蛋白原。在另一个实施方案中，该药物制剂具有至少5mL的体积并且包含至少20mg/mL的纤维蛋白原。在具体的实施方案中，该药物配制剂具有至少5mL的体积并且包含约20mg/mL，25mg/mL，30mg/mL，35mg/mL，40mg/mL，45mg/mL，50mg/mL，55mg/mL，60mg/mL，65mg/mL，70mg/mL，75mg/mL，80mg/mL，90mg/mL或100mg/mL浓度的纤维蛋白原。在另一个方面，提供了一种包含至少5mL稳定的药学上可接受的纤维蛋白原溶液的容器，其中纤维蛋白原的浓度为至少20mg/mL。
在本发明的另一个方面，提供了一种治疗或预防与纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF缺乏相关的病症的方法，该方法包含给予有此需求的受试者如本文所公开的通过本发明的方法回收的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液，或如本文所公开的本发明的药物制剂。
在本发明的另一个方面，提供了一种使用如本文所公开的通过本发明的方法回收的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液在制备用于治疗或预防与纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF缺乏相关的病症的药物中的用途。本领域的技术人员熟悉与纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF缺乏相关的病症的类型。在一个实施例中，纤维蛋白原的疾病选自纤维蛋白原血症，低纤维蛋白原血症和纤维蛋白原生成不良症。在一个实施方案中，因子VIII和/或VWF的疾病是选自血友病A，出血性疾病(例如，血小板功能缺损，血小板减少或血管性血友病)，血管损伤，外伤或手术出血，由于抗凝疗法的出血，由于肝病的出血。
使用如本文所公开的通过本发明的方法回收的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液可能治疗的其他状况，包含大的创伤和严重出血和烧伤。在纤维蛋白原减少症和纤维蛋白原缺乏血症的病例中，包含按照本发明制备的纤维蛋白原的溶液可以经由静脉内注射到有此需求的患者，以补偿由技术人员基于缺乏的程度而确定的纤维蛋白原缺乏和剂量的状态。
由于缺乏去稳定水平的纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶，通过本发明的方法回收的包含纤维蛋白原的溶液在纤维蛋白胶(也称为纤维蛋白封闭剂)使用上也具有优点。tPA转化纤维蛋白溶酶原为其活性形式纤溶酶，而纤溶酶又消化纤维蛋白凝块，从而降低了在局部应用的凝块形成(例如，用于止血)。
纤维蛋白胶通常地包含两个组分：(i)纤维蛋白原(经常连同因子XIII和如抑肽酶的纤维蛋白溶解抑制剂)，和(ii)凝血酶(经常连同钙离子)。重构这两种组分以制备准备使用的胶。纤维蛋白胶用于临床和兽医应用，以在钙和XIII因子存在下应用纤维蛋白原与凝血酶的组合，刺激经由交联纤维蛋白纤维形成的凝血最后一步。纤维蛋白胶在临床和兽医学具有各种应用，包含止血，伤口缝合，粘附预防和伤口愈合。纤维蛋白胶也可用于封闭皮肤伤口(包含皮肤移植)，用于密封缝线和用于粘合结缔组织，诸如骨，软骨和肌腱。因此，在本文所公开的另一个方面，提供了一种纤维蛋白胶，其包含如本文所公开的通过本发明的方法回收的包含纤维蛋白原的溶液。
本领域技术人员将理解，本文所述的发明包括其所具体描述那些方案的其它变体和改变。应当理解的是，本发明包含落入其精神和范围内的所有这些变体和改变。本发明还包含单独或共同的在本说明书中所提及的或所指出的所有步骤，特征，组合物和化合物，以及任意两个或多个所述步骤或特征的任意的和全部的组合。
现在将参考下面的实施例而描述本发明的某些实施方案，下面的实施例仅意欲用于说明的目的并且不打算限制上文所描述的一般性范围。
实施例
实施例1-通过HEA，PPA和MEP疏水性电荷诱导色谱(HCIC)树脂纯化纤维蛋白原
人类收集的血浆的冷沉淀物被用作起始材料(即，包含纤维蛋白原的原料)。简而言之，在31±2℃下，收集的血浆冷沉淀物在包含20mM柠檬酸三钠，200mMε-氨基己酸(ε-ACA)，60IU/mL肝素和500mM NaCl(pH为7.2±2)的提取缓冲液中溶解30分钟(每4g缓冲液含1g冷沉淀物)。随后2％(w/w)的氢氧化铝加入到25％浓度(w/w)的溶解的冷沉淀物中。通过离心或深度过滤去除氢氧化铝凝胶之后，回收的含纤维蛋白原的上清液通过HCIC色谱树脂用于进一步色谱纯化。
将含纤维蛋白原的上清液应用到填充有1.8mL的任一HEA，PPA或MEPHypercelTM树脂的层析柱上。用范围从6.5至8.5的不同pH值的25mM Tris预平衡层析柱。将含纤维蛋白原的上清液以约11mL/mL树脂的比率上样到层析柱。相对于纤维蛋白原在负离子模式下进行HCIC纯化，其中纤维蛋白原是在未结合的流经级分的直流中，而大多数的t-PA，纤维蛋白溶酶原和因子II仍然结合到树脂上。
图1至图3显示出使用HEA HypercelTM，PPA HypercelTM或MEP HypercelTM的纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原，t-PA和因子II后色谱纯化的回收步骤。结果表明，pH对结合到这些树脂上的纤维蛋白溶酶原具有很少或没有影响，而t-PA结合到树脂上似乎是在较低的pH范围最有效。与在PPA HypercelTM和MEPHypercelTM柱中所观测的结果相比，HEA HypercelTM柱显示在直流级分中最高的纤维蛋白原回收并且测试的操作用pH范围似乎对纤维蛋白原的回收影响不大。PPA和MEP柱在pH 8.5下显示在直流级分中最高的纤维蛋白原回收。
实施例2-通过HEA Hypercel在纤维蛋白原溶液中减少的杂质水平
将根据实施例1制备的包含溶解的冷沉淀物的约48.5mL纤维蛋白原应用到5mL HEA HypercelTM柱上，该柱子用任一的pH 6.5，7.0，7.5，8.0或8.5的25mM Tris中预平衡。相对于纤维蛋白原在负模式下进行HCIC纯化，其中纤维蛋白原是在未结合的流出级分的直流中，而t-PA，纤维蛋白溶酶原和因子II仍然结合到树脂上。图4a显示在使用HEA HypercelTM的后色谱纯化期间纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原，t-PA和因子II的回收步骤。结果表明，pH对结合到HCIC树脂上的纤维蛋白溶酶原和因子II具有很少或没有影响，而结合到树脂上的t-PA似乎是在6.5-7.0的较低pH范围内最有效。尽管没有冲洗柱子，在不同pH条件下，在直流级分中回收的纤维蛋白原高于90％。如图4a所示，这些结果证明通过HCIC树脂有效除去含纤维蛋白原的粗原料中的蛋白酶，该粗原料如溶解的冷沉淀物。例如，在pH 7.0下进行的该实验条件证实从溶解的冷沉淀物溶液中减少了≥99.9％的因子II，88.3％的t-PA和≥98.2％的纤维蛋白溶酶原。
在室温(约20℃)下存储至少6天，纤维蛋白原在溶液中保持稳定。结果显示在图4b和4c中。
实施例3-通过HEA Hypercel纯化的纤维蛋白原溶液中的杂质水平
将根据实施例1产生的alhydrogelTM吸附步骤后所获得的约500mL含纤维蛋白原的上清液加样到一个装填有36mL HEA HypercelTM树脂的XK 16/30柱上，该柱子用pH 7.0的25mM Tris预平衡。通过直流级分收集测试的纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原，t-PA和因子II。结果的总结在下表1中提供。
表1
实施例4-甘氨酸沉淀对通过HEA Hypercel纯化的纤维蛋白原溶液中杂质水平的影响
通过加入包含2.4M甘氨酸、2.7M NaCl、2.1mM CaCl2和23mM柠檬酸三钠的盐水溶液(pH 6.6-7.3)，将根据实施例1产生的铝胶吸附步骤后的含纤维蛋白原的上清液进行进一步的沉淀步骤。温热溶解沉淀物至30℃，然后添加到甘氨酸缓冲液中，这也孵育至30℃，产品与缓冲液的比例为1∶2。让该混合物搅拌10分钟，并且通过离心从液相中回收所得的沉淀。丢弃主要包含纤连蛋白和IgG的液相，收集包含纤维蛋白原的沉淀物，并且再次悬浮于包含100mM NaCl，1.1mM CaCl2，10mM柠檬酸三钠，10mM Tris-(羟甲基甲胺)和4.5mM蔗糖(pH7.0)的溶解(solubilisation)缓冲液中。在通过装填有36mL HEA HypercelTM树脂的用pH 7.0的25mMTris预平衡过的XK 16/30柱之前，使用1μm的过滤器澄清溶解的纤维蛋白原中间物(250mL)。通过直流级分收集测试的纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原，t-PA和因子II，并且结果的总结在下表2中提供。
结果表明，与在实施例2所述的这些条件下所观测到的结果相比，结合到HEA HypercelTM树脂上的纤维蛋白溶酶原，t-PA和因子II在这些工艺条件下更有效。这些特性结果显示约纤维蛋白原93％，纤溶酶6％，t-PA 12％，和因子II5％的步骤回收。
表2
实施例5-从血浆冷沉淀中制备纯化的纤维蛋白原
工艺步骤1-血浆冷沉淀的溶解；
工艺步骤2-溶解的血浆冷沉淀的AlhydrogelTM(氢氧化铝)吸附(AlhydrogelTM浓度：目标15至20％w/w，从10至50％w/w的范围)，和使用如离心或在助滤剂存在下的深度过滤而回收包含纤维蛋白原的上清液。可选地，该步骤可以被替换为相对于纤维蛋白原在负模式下(直流)的HCIC色谱步骤或相对于纤维蛋白原在负模式下的HCIC和阴离子交换色谱法的组合。如果HCIC和阴离子交换层析组合使用，则工艺步骤3中是可选的；
工艺步骤3-来自步骤2中含纤维蛋白原上清液的纤维蛋白原的甘氨酸沉淀。可选地，该步骤可以被替换为相对于纤维蛋白原在负模式下的阴离子交换色谱；
工艺步骤4-使来自步骤3的溶解的甘氨酸沉淀通过相对于纤维蛋白原在负模式下的HCIC色谱树脂；
工艺步骤5步-用溶剂或清洁剂或巴氏灭菌法处理从步骤4中回收的纯化的纤维蛋白原溶液以灭活病原体；
工艺步骤6-使来自步骤5的经处理的溶液通过相对于纤维蛋白原在正模式下的阴离子交换色谱树脂，从树脂上冲洗弱结合的蛋白和从树脂上洗脱纤维蛋白原；
工艺步骤7-将在步骤6中从阴离子交换树脂上洗脱的纤维蛋白原进行纳滤器过滤(35nm或20nm或35/20nm的组合)；和
工艺步骤8-将步骤7中经过滤的纤维蛋白原进行超滤(50，100，200和300kDa的膜过滤器)。
实施例6-通过HCIC和阴离子交换层析组合的纯化纤维蛋白原的制备
三个实验室规模的实验已经完成，其中根据实施例1-3描述的步骤，通过使用HEA HypercelTM柱的混合模式色谱步骤制备约100g冷沉淀物。
来自HEA HypercelTM柱的直流级分，主要包含纤维蛋白原，进行溶剂/清洁剂过夜处理以实施病毒灭活。
随后在上样到阴离子交换柱(XK50/30，GE Heal thcare)之前，用25mM Tris(pH 8.0)稀释该病毒灭活的溶液至≤10mS/cm，该柱子填充有大约412mLMacroPrepTM-HQ树脂并且用25mM的Tris(pH 8.0)预平衡。丢弃流经的级分，并且用4倍柱体积的包含90mM NaCl，50mM Tris，20mM EACA(pH 8.0)的冲洗缓冲液冲洗MacroPrepTM-HQ柱。在这些色谱条件下，初始的流经级分和冲洗级分主要包含纤维蛋白溶酶原和t-PA，而纤维蛋白原保持结合到色谱树脂上。用包含200mM的NaCl，10mMTris，10mM柠檬酸三钠，46mM蔗糖和1.1mM CaCl2(pH7.0)的洗脱缓冲液从MacroPrepTM-HQ柱上选择性洗脱纤维蛋白原的单体形式，留下的纤维蛋白原聚集体和低分子量的蛋白质结合在MacroPrepTM-HQ树脂上。
通过MacroPrepTM-HQ色谱洗脱液而从溶解的冷沉淀产生的产品中间物被表征为纤维蛋白原，t-PA，纤维蛋白溶酶原，纤维连接蛋白和因子II水平和在各工艺阶段的对每个这些蛋白质的工艺步骤回收率。结果显示在表3中，其代表来自于三个独立实验室规模的一致性批次的平均值。通过MacroPrepTM-HQ洗脱液而起始于血浆冷沉淀物的纤维蛋白原和共纯化蛋白质的整个过程的回收显示在图5中。
经由分析型尺寸排阻HPLC色谱法所揭示，从MacroPrepTM-HQ色谱树脂中回收的纤维蛋白原纯度高于95％。在TSKGelTM G4000SWXL(Tosoh Croporation)中进行分析的代表性的纤维蛋白原的HPLC图谱显示于图6中。如图6所示，纤维蛋白原单体在约17.4分钟的保留时间被洗脱，并且归属于96.6％的总峰面积，而纤维蛋白原二聚体和/或其它高分子量蛋白质在约14.8分钟的保留时间被洗脱。
按照实施例5和6所述的工艺，另外的纤维蛋白原批次以中试规模进行生产(81kg血浆等价物)。纤维蛋白原制剂的特征在表4中提供。
实施例7-纯化纤维蛋白原的病毒过滤
通过一个20nm的病毒过滤器检查按照实施例6的方法获得的纤维蛋白原制剂的过滤性，其中MacroPrepTM-HQ洗脱步骤使用190mM NaCl(21.5mS/cm)，200mMNaCl(22.5mS/cm)，210mM NaCl(23.5mS/cm)或包含1％(w/w)精氨酸(25mS/cm)的200mM NaCl缓冲液。
该方法涉及在pH为约7.5下用3％(W/W)精氨酸配制制剂(样品的蛋白质浓度为约6g/L)。随后在病毒过滤步骤之前，用0.1μm过滤器过滤所述配制的制剂。使用47mm Pall SV4TM过滤器，在死端模式下使用1.8bar的恒定压力进行该病毒过滤步骤。结果表明，使用190mM，200mM或210mM NaCl缓冲液从MacroPrepTM HQ柱获得的纤维蛋白原制剂产生相似的过滤特性。与此相反，使用包含1％(W/W)精氨酸的200mM NaCl缓冲液从MacroPrepTM HQ柱上洗脱的纤维蛋白原制剂迅速阻塞所述过滤器(图7)。
实施例8-稳定性研究
将通过上述实施例5描述的方法回收的纯化纤维蛋白原溶液进行无菌过滤并且进行一个在2°-8℃或30℃下9/7周期限的稳定性研究。在9周贮存期后，放置在2°-8℃下的液体纤维蛋白原制剂保持经由Clauss法测量的约90％的原有活性。在2周贮存期后，放置在30℃下的液体纤维蛋白原制剂保持约70％的原有活性，并且在至少5周中没有进一步失去活性。在30℃下温育7周观测到活性进一步降低到60％。纤维蛋白原在30℃下活性的丧失似乎更归因于热变性而不是蛋白水解降解，因为加入蛋白酶抑制剂(C1酯酶)在5周的贮存期内没有抑制纤维蛋白原活性的丧失。稳定性数据的总结在图8中提供。
表4
实施例9-在包含因子VIII和/或VWF的溶液中使用HEA Hypercel减少血浆蛋白酶的水平
本实施例证明也可以采用HCIC层析步骤以减少在包含因子VIII和/或含VWF的制剂中的蛋白酶。该方法涉及使用深度过滤器澄清从实施例4获得的包含纤维蛋白原的溶液，然后使澄清的溶液通过第二疏水性电荷诱导色谱(HCIC)树脂。所述HCIC步骤在条件下进行以允许蛋白酶如纤维蛋白溶酶原结合到树脂上，同时因子VIII和VWF能够通过树脂。尤其是XK50/30柱是用340mL HEAHypercelTM树脂填充的。用pH 6.7的50mMTris预平衡柱子。根据实施例4制备的澄清的纤维蛋白原溶液随后上柱并且用pH 6.7的50mM Tris冲洗柱子。收集直流级分并且确定因子VIII，VWF，纤维蛋白溶酶原和t-PA的水平(VWF：RCo＝Von Willebrand利托菌素辅助因子)。从4个单独运行获得的平均结果的总结在表5中提供。这些结果表明该HCIC色谱步骤从包含因子VIII和VWF的级分中有效地去除蛋白酶如纤维蛋白溶酶原和tPA。另外，也观察到因子VIII和VWF的良好的回收率。
表5
实施例10-从不同方法纯化的纤维蛋白原的对比研究
将根据如实施例6所述的本发明的方法而制成的纤维蛋白原制剂与通过在WO2001048016，WO2012038410和WO2013135684中描述的方法制造的纤维蛋白原制剂进行比较。
(a)通过WO2001048016中描述的优选实施方案制备的纤维蛋白原制剂。
简而言之，该方法涉及在提取缓冲液(0.8M NaCl，5mM EACA(ε-氨基己酸)，20mM柠檬酸钠，60IU/ml肝素，pH值7.3)中的悬浮级分I相(1g级分I：8.33g提取缓冲液)。然后，在37℃下混合该溶液1.5小时，之后每克级分I加入50g 2％的Al(OH)3(铝胶)溶液(10.8％)。在室温下搅拌该混合物15分钟，然后以5000g离心10分钟，弃去沉淀。向所述经铝胶处理的上清液中加入甘氨酸/氯化钠缓冲液(2.1M甘氨酸，20mM柠檬酸钠，3.6M NaCl和2.4mMCaCl2)(两种溶液预平衡至30℃)中。添加上清液到缓冲液中在约4.5分钟完成(1份上清液：2.05份缓冲液)。将混合物在30℃下搅拌20分钟，然后以5010g离心10分钟(上清液丢弃)。随后，在室温下将沉淀在缓冲液D(100mM NaCl，1.1mM CaCl2，10mM柠檬酸钠，10mM Tris，45mM蔗糖，pH6.9)中再溶解并且混合2小时(1/3的用于再悬浮级分I体积)(实施例1，章节1.1.1-1.1.6，WO0148016)。随后，将包含再溶解纤维蛋白原的溶液上样到MacroPrepTM HQ柱(具有20cm柱床高的XK26)。该柱用至少1.5柱体积(CV)的MQ缓冲液(50mMTris，100mM NaCl，20mM EACA，pH 8.0)以10mL/min(113cm/hr)进行预平衡。平衡继续进行直到柱后的电导率是制备缓冲液的90-110％。随后将纤维蛋白原溶液上样到柱子上并且用6CV的MQ缓冲液冲洗柱子。使用ME缓冲液500mM NaCl，1.1mM CaCl2，10mM柠檬酸钠，10mM Tris和45mM蔗糖，pH 7.0)洗脱纤维蛋白原，为一个单峰。该柱子可以使用2CV 1M NaCl再生(实施例2，WO2001048016)。
(b)通过先前在WO2012038410和WO2013135684中描述方法的优选实施方案制造纤维蛋白原制剂。
将通过已经建立的方法从血浆中制备的冷沉淀在约中性pH下重组或溶解，用Al(OH)3进行吸附和通过离心去除所得的凝胶。随后通过溶剂/清洁剂(S/D)处理而对上清液进行病毒灭活。用植物油提取S/D的化合物，Triton和TnBP并且水相与EMD-TMAE相接触。使用色谱条件(pH值6.9-7.1和570-610mosmol/l的重量摩尔渗透压浓度)，在该条件下纤维蛋白原不结合到凝胶上，因此在流经液或上清液中发现纤维蛋白原。未结合的纤维蛋白原的溶液在20mM EDTA存在下加入甘氨酸后搅拌约90分钟(1mol/l最终浓度和pH＝7.4)以沉淀纤维蛋白原。然后通过离心分离包含纤维蛋白原的沉淀，产生一个中间的纤维蛋白原糊状物。将中间纤维蛋白原糊状物再次悬浮于20mM的Tris缓冲液(pH值＝约8.0)。随后过滤获得的悬浮液，并且进行超/渗滤。然后将包含所得纤维蛋白原的溶液上样到GigaCap上，并且在应用纤维蛋白原溶液之前，使用与用于再悬浮相同的Tris缓冲液预平衡色谱凝胶或树脂。用平衡缓冲液冲洗松散结合的物质，然后用冲洗缓冲液(1.5g/L柠檬酸钠，6.0g/L氯化钠，调节至约pH＝7.0和大约12.0mS/cm的电导率)冲洗。然后从用洗脱缓冲液(1.5g/L柠檬酸钠，和10.0g/L甘氨酸，调节到与冲洗缓冲液相同的pH并且用约7.0g/L NaCl调节电导率至13.1-15mS/cm)从色谱柱上洗脱纤维蛋白原。
在WO2001048016，WO2012038410和WO2013135684中描述的方法获得的包含纤维蛋白原的溶液被测定其总蛋白(缩二脲法)，纤连蛋白和纤维蛋白溶酶原水平。此外，将样品放置在2-8℃和30℃下进行稳定性试验。
所述的纤维蛋白原制剂性能的比较在表6中提供。该研究的结果表明，相比于其它方法，由本发明的方法制造的纤维蛋白原包含较低水平的纤维蛋白溶酶原。
表6

Claims (48)

1.一种减少包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和血管性血友病因子(VWF)组成的组的蛋白质的溶液中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的蛋白质水平的方法，该方法包含：
(i)在选择的条件下，使包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的原料通过疏水性电荷诱导色谱树脂，所述选择条件使得存在于原料中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质结合至树脂上；和
(ii)回收通过树脂的包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液，其中溶液中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50％。
2.一种减少包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和血管性血友病因子(VWF)组成的组的蛋白质的溶液中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的蛋白质水平的方法，该方法包含：
(i)使包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的原料通过第一疏水电荷诱导色谱树脂；
(ii)回收通过第一疏水电荷诱导色谱树脂的包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液；
(iii)使在步骤(ii)中回收的溶液通过第二疏水电荷诱导色谱树脂；和
(iv)回收通过第二疏水电荷诱导色谱树脂的包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液；
其中色谱步骤的条件使得原料中存在的至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的蛋白质结合到第一和/或第二树脂上，和在步骤(iv)回收的溶液中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50％。
3.权利要求2的方法，其中第一和第二疏水电荷诱导色谱树脂是相同的。
4.权利要求1的方法，进一步包含使在步骤(ii)中回收的包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液通过阴离子交换色谱树脂。
5.权利要求2或3的方法，进一步包括使在步骤(ii)和/或步骤(iv)中回收的包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液通过阴离子交换色谱树脂。
6.权利要求1至5任一项的方法，进一步包含在步骤(i)之前使原料通过阴离子交换色谱树脂。
7.权利要求4至6任一项的方法，其中所述阴离子交换树脂是强阴离子交换树脂。
8.权利要求4至7任一项的方法，其中在约150mM至约270mM NaCl存在下，使包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液通过阴离子交换色谱树脂。
9.权利要求4至7任一项的方法，其中所述纤维蛋白原是用包含从约150mM至约300mM NaCl的洗脱缓冲液从阴离子交换色谱树脂上洗脱的。
10.权利要求7的方法，其中所述纤维蛋白原是用包含约0.5-10％w/v浓度游离氨基酸的洗脱缓冲液从阴离子交换色谱树脂上洗脱的。
11.权利要求10的方法，其中所述游离氨基酸是精氨酸。
12.权利要求1至11任一项的方法，其中该原料在步骤(i)之前进行病毒灭活步骤。
13.权利要求1至12任一项的方法，其中，从疏水电荷诱导色谱树脂回收的包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液进行病毒灭活步骤。
14.权利要求4至11任一项的方法，其中所述包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的原料或溶液在通过阴离子交换色谱树脂之前进行病毒灭活步骤。
15.权利要求12至14任一项的方法，其中所述病毒灭活步骤包含巴氏灭菌法或用有机溶剂和清洁剂处理。
16.权利要求1至15任一项的方法，其中该原料是溶解的血浆冷沉淀物。
17.权利要求1至16任一项的方法，其中，在步骤(i)之前，从原料中去除或减少维生素K-依赖性蛋白质。
18.权利要求17的方法，其中通过添加氢氧化铝至原料而从原料中沉淀维生素K依赖性蛋白质，去除或减少所述维生素K-依赖性蛋白质。
19.权利要求1至18任一项的方法，进一步包含在步骤(i)之前，通过加入甘氨酸到原料中而从原料中沉淀至少一种选自由纤维蛋白原，凝血因子VIII和VWF组成的组的蛋白质，回收沉淀的蛋白质，溶解沉淀的蛋白质，并且在步骤(i)中使该溶解的蛋白质通过疏水电荷诱导色谱树脂。
20.权利要求1至19任一项的方法，其中所述通过疏水电荷诱导色谱树脂的包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的原料或溶液具有从约6.5至约8.5的pH。
21.权利要求1至20任一项的方法，其中在使包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的原料和/或溶液通过疏水电荷诱导色谱树脂之前，在约6.5至约8.5的pH平衡所述疏水电荷诱导色谱树脂。
22.权利要求1至21任一项的方法，其中所述疏水电荷诱导色谱树脂包含选自由巯基乙基吡啶，正己胺和苯丙胺组成的组的配基。
23.权利要求22的方法，其中所述疏水电荷诱导色谱树脂包括正己胺。
24.根据权利要求1至23任一项的方法回收的包含至少一种选自由纤维蛋白原，凝血因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液。
25.权利要求24的溶液，包含至少80％总蛋白质的纤维蛋白原。
26.一种溶液，其包含：
(a)至少75％总蛋白质的纤维蛋白原；
(b)少于50pg/mg总蛋白质的组织纤维蛋白溶酶原激活物；和/或
(c)少于1μg/mg总蛋白质的纤维蛋白溶酶原。
27.权利要求26的溶液，进一步包含少于1.5×10-5U/mg总蛋白质的因子II。
28.一种溶液，其包含：
(a)至少90％总蛋白质的纤维蛋白原；
(b)少于50pg/mg总蛋白质的组织纤维蛋白溶酶原激活物；和/或
(c)少于150ng/mg总蛋白质的纤维蛋白溶酶原。
29.权利要求28的溶液，进一步包含：
(a)少于3.5×10-6U/mg总蛋白质的因子II；和/或
(b)少于150μg/mg总蛋白质的纤连蛋白。
30.一种溶液，其包含：
(a)至少90％总蛋白质的纤维蛋白原；
(b)少于20pg/mg总蛋白质的组织纤维蛋白溶酶原激活物；和/或
(c)少于10ng/mg总蛋白质的纤维蛋白溶酶原。
31.权利要求30的溶液，进一步包含：
(a)少于2.7×10-6U/mg总蛋白质的因子II；和/或
(b)少于15μg/mg总蛋白质的纤连蛋白。
32.权利要求24至31任一项的溶液，包含至少80％总蛋白质的单体纤维蛋白原。
33.权利要求24至32任一项的溶液，其中所述溶液在约0℃至约8℃的温度下存储至少4周后，所述纤维蛋白原保持约90％至100％的活性。
34.权利要求24至32任一项的溶液，其中所述溶液在约30℃的温度下存储5周后，所述纤维蛋白原保持约60％至70％的活性。
35.一种药物制剂，其包含权利要求24至34任一项的溶液和药学上可接受的载体。
36.权利要求35的药物制剂，具有至少5mL的体积，并且包含至少5mg/mL的纤维蛋白原。
37.权利要求35的药物制剂，具有至少5mL的体积，并且包含至少20mg/mL的纤维蛋白原。
38.一种治疗或预防与纤维蛋白原缺乏相关病症的方法，该方法包含给予有此需求的受试者权利要求24至34任一项的溶液或权利要求35至37任一项的药物制剂。
39.权利要求38的方法，其中所述病症选自纤维蛋白原血症，低纤维蛋白原血症和纤维蛋白原生成不良症。
40.权利要求24至34任一项的溶液在制备用于治疗或预防与纤维蛋白原缺乏相关的病症的药物中的应用。
41.权利要求40的应用，其中所述病症选自纤维蛋白原血症，低纤维蛋白原血症和纤维蛋白原生成不良症。
42.包含权利要求24至34任一项的溶液的纤维蛋白胶。
43.一种产生稳定的液体纤维蛋白原溶液的方法，该方法包含：
(i)在选择的条件下，使包含纤维蛋白原的原料通过疏水性电荷诱导色谱树脂，所述选择条件使得存在于原料中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质结合至树脂上；和
(ii)回收通过树脂的包含纤维蛋白原的溶液，其中该溶液中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50％。
44.一种产生稳定的液体纤维蛋白原溶液的方法，该方法包含：
(i)使包含纤维蛋白原的原料通过第一疏水电荷诱导色谱树脂；
(ii)回收通过第一疏水电荷诱导色谱树脂的包含纤维蛋白原的溶液；
(iii)使在步骤(ii)中回收的溶液通过第二疏水电荷诱导色谱树脂；和
(iv)回收通过第二疏水电荷诱导色谱树脂的包含纤维蛋白原的溶液；
其中色谱步骤的条件使得存在于原料中的至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质结合到第一和/或第二树脂，和其中在步骤(iv)回收的溶液中选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的至少一种蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50％。
45.权利要求43或权利要求44的方法，其中在约0℃至约8℃的温度下存储至少4周后，回收溶液中的纤维蛋白原保持约90％至100％的活性。
46.权利要求43或权利要求44的方法，其中在约30℃的温度下存储至少5周后，回收溶液中的纤维蛋白原保持约60％至70％的活性。
47.一种包含至少5mL稳定的药学上可接受的纤维蛋白原溶液的容器，其中纤维蛋白原的浓度为至少20mg/mL。
48.一种用于纯化纤维蛋白原的方法，该方法包含以下步骤：
(i)在选择的条件下，使包含纤维蛋白原的溶液通过离子交换色谱树脂，所述选择的条件使得存在于溶液中的纤维蛋白原单体结合至树脂上；
(ii)用洗脱缓冲液从树脂上洗脱纤维蛋白原单体；和
(iii)通过具有约15nm至约35nm范围孔径的过滤器过滤来自步骤(ii)所述的洗脱纤维蛋白原单体。
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