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KR102239781B1 - Gpnmb 및 cd3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Gpnmb 및 cd3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR102239781B1
KR102239781B1 KR1020190040612A KR20190040612A KR102239781B1 KR 102239781 B1 KR102239781 B1 KR 102239781B1 KR 1020190040612 A KR1020190040612 A KR 1020190040612A KR 20190040612 A KR20190040612 A KR 20190040612A KR 102239781 B1 KR102239781 B1 KR 102239781B1
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Abstract

본 발명은 CD3 및 GPNMB에 특이적으로 결합하는 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 이중특이적 항체는 CD3 및 GPNMB에 대한 높은 친화도 및 특이성을 가지므로, GPNMB를 발현하는 암세포의 사멸을 유도하고 이의 증식을 억제할 수 있다. 이에 따라, 상기 이중특이적 항체는 GPNMB를 발현하는 암에 대해 효과적인 치료제로 사용될 수 있다.

Description

GPNMB 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 용도{BISPECIFIC ANTIBODY THAT SPECIFICALLY BINDS TO GPNMB AND CD3 AND USE THEREOF}
본 발명은 GPNMB 및 CD3에 특이적으로 결합하는 신규한 이중특이적 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
다양한 사망 원인 중 암에 의한 사망은 2번째로 높은 비중을 차지할 정도로 빈번하게 일어나고 있다. 암을 치료하기 위한 다양한 방법이 계속 시도되고 있으며, 대표적인 방법으로는 항암제 투여나 방사선 조사, 외과적 수술 등이 이루어지고 있다. 그러나, 발병 초기 암의 경우에는 이와 같은 방법을 단독 또는 복합적으로 사용하여 치료할 수 있으나, 말기 암의 경우나 혈액을 통해 다른 조직으로 전이되거나 재발이 일어난 암의 경우에는 치료 효과가 저조한 것으로 알려져 있다.
이에 따라, 면역세포 치료기술에 대한 연구가 주목을 받고 있다. 구체적으로 환자의 혈액에서 추출한 면역세포를 시험관에서 대량으로 증식시킨 뒤 환자에게 재투여함으로써, 면역세포 내에 존재하는 암세포 특이적인 독성 T 세포가 암세포를 제거하도록 하는 기술이 개발되고 있다. 더욱이, 재조합 기술의 발전에 따라 암과 같이 T 세포 매개 사멸이 요구되는 치료 분야에 사용되는 이중특이적 항체 또한 개발되고 있으며, 이에 대한 효과가 확인되고 있다(Buhler, P., et al., Cancer Immunology, Immunotherapy 57.1, 2008: 43-52). 그럼에도 불구하고, 보다 우수한 항암 효과를 가지면서도 부작용을 최소화할 수 있는 이중특이적 항체의 개발이 여전히 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 GPNMB를 발현하는 암세포에 CD3를 발현하는 면역세포를 위치시켜, GPNMB를 발현하는 세포의 사멸을 효과적으로 유도할 수 있는 이중특이적 항체를 개발하고 이의 우수한 항암 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에 따라, 본 발명의 목적은 CD3 및 GPNMB에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 이중특이적 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GPNMB에 특이적으로 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 이중특이적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 GPNMB 및 CD3에 대한 높은 친화도 및 특이성을 가지므로, GPNMB를 발현하는 암세포의 사멸을 유도하거나 이의 증식을 억제할 수 있다. 이에 따라, 상기 이중특이적 항체는 GPNMB를 발현하는 암에 대해 효과적인 치료제로 사용될 수 있다.
도 1은 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체를 수득한 결과를 나타낸 것이다. 이때, 가로축은 mL (Buffer flow), 세로축은 mAu (OD at 280 nm)을 의미한다.
도 2는 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 암세포주에 대한 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체의 결합 양상을 나타내는 FACS 결과이다.
도 4는 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체 존재 시, PBMC 매개에 의한 SK-MEL-2, U87MG 및 T98G 암세포 사멸 효능을 나타낸 것이다.
도 5는 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체 존재 시, SK-MEL-2, U87MG 및 T98G 암세포주에 의한 T 림포사이트 활성화를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 측면은 GPNMB에 특이적으로 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "GPNMB"란, Glycoprotein Non-Metastatic Melanoma Protein B의 약자로서, 유방암 및 흑색종 등 다양한 암 환자에서 과발현되는 당단백질을 지칭한다. 현재까지 GPNMB 기능이 명확히 밝혀진 것은 아니지만, 암세포에서 GPNMB의 과발현이 나타난다. 또한, 상기 GPNMB는 동물, 바람직하게는 인간 및 원숭이 내에 존재하는 GPNMB를 의미한다. 즉, 용어 "인간 GPNMB"는 인간 유래의 GPNMB를 의미하며, "마우스 GPNMB"는 마우스 유래의 GPNMB를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "CD3(Cluster of differentiation 3)"란, T 세포 수용 복합체와 관련하여, T 세포 상에 발현되는 동종 이량체성 또는 이종 이량체성 단백질을 의미하며, 이는 T 세포 활성화에 필수적인 요소이다. 기능성 CD3는 ε, ζ, δ, γ와 같은 4개의 상이한 사슬 중 2개 이상의 이량체성 회합으로 형성되며, CD3 이량체성 배열로는 γ/ε, δ/ε 및 ζ/ζ가 존재한다. CD3에 대한 항체는 T 세포 상에 존재하는 CD3에 결합하여, T 세포 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 CD3는 동물, 바람직하게는 인간 및 원숭이 내에 존재하는 CD3를 의미한다. 즉, 용어 "인간 CD3"는 인간 유래의 CD3를 의미하며, "원숭이 CD3"는 원숭이 유래의 CD3를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"란, 특정 항원과 면역학적 반응성을 가지는 면역글로불린 분자로, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할의 단백질 분자를 의미한다. 상기 항체는 전체 항체(whole antibody) 및 항체 단편(antibody fragment)을 포괄하는 개념으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "이중특이적 항체"란, 두 가지의 서로 다른 항원에 동시 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 특히, 이중특이적 항체가 결합하는 항원의 종류를 적절히 선택할 경우, T 세포 등의 면역세포가 암세포와 같은 특정 타겟 세포에 대해서만 독성을 나타내고 그 외의 정상세포들에 대해서는 독성을 나타내지 않을 수 있다. 따라서, 이중특이적 항체는 치료 효과를 극대화하면서도 부작용을 최소화할 수 있어 T 세포 매개 사멸이 요구되는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 CD3 및 GPNMB에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 "항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체"로 표기될 수 있다.
본 발명의 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체의 일 구체예로, 상기 항체의 가변 영역 중 하나는 GPNMB에 특이적으로 결합하는 제1 도메인과, 다른 가변 영역은 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 이때, 상기 GPNMB에 특이적으로 결합하는 제1 도메인은 인간 및 원숭이 GPNMB에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 상기 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 도메인은 인간 및 원숭이 CD3에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다.
상기 제1 도메인 및 제2 도메인은 각각 GPNMB 및 CD3에 대한 친화도 및 특이성 등 본 발명의 목적에 부합하는 특성이 유지되는 한, 일부 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실될 수 있다. 예컨대, 아미노산의 보존적 치환이 일어날 수 있으며, 보존적 치환이란 본래의 아미노산 서열과 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산 잔기로의 치환을 의미한다.
예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘은 염기 곁사슬을 가지고 있어 유사한 특성을 가지고, 아스팔틱산과 글루타믹산은 산 곁사슬을 가진다는 점에서 유사한 특성을 가진다. 또한, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판은 비전하 극성 곁사슬을 가진다는 점에서 특성이 유사하며, 알라닌, 발린, 루신, 트레오닌, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌은 비극성 곁사슬을 가지고 있다는 점에서, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘은 방향족 곁사슬을 가지고 있다는 점에서 유사한 특성을 가진다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제1 도메인은 서열번호 1, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR2; 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR1; 서열번호 5 또는 12의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR2; 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 제1 도메인은 서열번호 1, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR2; 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR1; 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR2; 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 제1 도메인은 서열번호 1로 표시되는 H-CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR2; 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR1; 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR2; 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1 도메인의 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호 26, 27, 28, 29, 30 또는 31의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 또한, 상기 제1 도메인의 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호 32 또는 33의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
또한, 제1 도메인은 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 링커를 통해 연결된 형태인 scFv 형태를 포함할 수 있다. 이때, 링커는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 연결할 수 있는 한 어떠한 아미노산 링커도 이용될 수 있다. 이러한 scFv의 일 실시예로는 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제2 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR1; 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR2; 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR1; 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR2; 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있다.
또한, 상기 제2 도메인의 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호 44, 45 또는 46의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 또한, 상기 제2 도메인의 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호 42 또는 43의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
또한, 제2 도메인은 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 링커를 통해 연결된 형태인 scFv 형태를 포함할 수 있다. 이때, 링커는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 연결할 수 있는 한 어떠한 아미노산 링커도 이용될 수 있다. 이러한 scFv의 일 실시예로는 서열번호 49 또는 서열번호 51의 아미노산 서열로 표시되는 서열을 가질 수 있다. 또한, 이를 코딩하는 핵산은 각각 서열번호 50 및 서열번호 52의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제1 도메인 및 제2 도메인은 각각 Fc 영역을 더 포함할 수 있으며, 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역(CH)에서 유래된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 영역"이란, 불변 영역의 일부분을 내포하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 의미한다. 상기 Fc 영역은 통상 항체 중쇄 불변 영역의 CH2 및 CH3를 포함할 수 있으며, 상기 Fc 영역은 야생형 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제1 도메인 및 제2 도메인의 Fc 영역 중 어느 하나는 놉(knob) 구조를 갖고, 다른 하나는 홀(hole) 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 도메인의 Fc 영역이 놉 구조를 갖는 경우에는 상기 제2 도메인의 Fc 영역은 홀 구조를 가지며, 상기 제1 도메인의 Fc 영역이 홀 구조를 갖는 경우에는 상기 제2 도메인의 Fc 영역은 놉 구조를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "놉-인투-홀(knob-into-hole) 구조"란, 각기 다른 2개의 Ig 중쇄의 CH3 영역에 돌연변이를 유발하여 하나의 Ig 중쇄 CH3 영역에는 놉 구조를 유도하고, 다른 하나의 Ig 중쇄 CH3 영역에는 홀 구조를 유도하여 이들 간 이형이합체(heterodimer)를 형성하도록 하는 구조를 의미한다.
통상적으로, 상기 놉 구조를 형성하는 아미노산 잔기는 측쇄의 크기가 큰 소수성 잔기에서 측쇄가 작은 소수성 아미노산으로 치환되고, 홀 구조를 형성하는 아미노산 잔기는 측쇄의 크기가 작은 소수성 아미노산 잔기에서 측쇄가 큰 소수성 아미노산 잔기로 치환되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 제1 도메인의 Fc 영역 중 CH3 영역의 아미노산 일부(Q347R, S354C, D399V 및 F405T)가 치환된 것일 수 있고, 상기 제2 도메인의 Fc 영역 중 CH3 영역의 아미노산 일부(Y349C, K360E 및 K409W)가 치환된 것일 수 있다. 이에 따라, 상기 제1 도메인 및 제2 도메인은 이황화결합 또는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 구조, 바람직하게는 놉-인투-홀 구조를 통해 상호 결합되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 때, 상기 아미노산 번호는 EU 넘버링에 따른 것이다.
일 구체예로 홀 구조를 가진 Fc 영역은 서열번호 47의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 놉 구조를 가진 Fc 영역은 서열번호 48의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 따라서, 제1 도메인은 서열번호 47 또는 서열번호 48의 아미노산 서열을 가지는 Fc 영역을 포함할 수 있으며, 이러한 경우, 제2 도메인은 서열번호 48 또는 서열번호 47의 아미노산 서열을 가지는 Fc 영역을 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1 도메인 및 제2 도메인의 각각의 Fc 영역에 LALA 돌연변이(L243A, L245A)가 존재할 수 있다. Fc 영역에 LALA 돌연변이가 존재하는 경우 항체-의존적 세포독성 효능(ADCC, antibody-dependent cell cytotoxicity efficacy)을 나타내지 않으므로, GPNMB를 발현하는 세포가 존재하는 암세포에 대해서만 선택적 독성을 나타내고, 그 외의 정상 세포에 대해서는 비독성을 나타낼 수 있다. 이 때, 상기 아미노산 번호는 EU 넘버링에 따른 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 제1 도메인은 서열번호 34 또는 35의 아미노산 서열로 표시될 수 있으며, 상기 제2 도메인은 서열번호 36, 40 또는 41의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면은 상기 제1 도메인의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2 도메인의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일 구체예로 제1 도메인의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 53 또는 서열번호 54의 핵산 서열일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 이중특이적 항체의 아미노산 서열로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 도출할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 제1 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "발현벡터"란, 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 삽입된 유전자가 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 제1 도메인 및 제2 도메인의 아미노산 서열을 코딩하는 각각의 폴리뉴클리오티드는 별개의 벡터에 삽입될 수도 있고, 하나의 벡터에 삽입된 형태로 이용될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이란, 목적하는 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 재조합 벡터와의 작동 가능한 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위 특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.
상기 이중특이적 항체를 발현시키기 위해 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현벡터로는 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, colE1, pCR1, pBR322, pMB9, 및 이들의 유도체와 같이 대장균에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면은 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 제1 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터는 각각 숙주세포에 삽입되어 형질전환체를 형성할 수 있다. 상기 벡터의 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스, 스트렙토마이세스 속, 슈도모나스 속과 같은 원핵 세포일 수 있다. 사카로마이세스 세레비지애와 같은 효모, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다.
또한, 상기 숙주세포는 식물, 포유동물로부터 유래할 수도 있다. 바람직하게는, 원숭이 신장 세포7(COS7) 세포, NSO 세포(마우스 기원의 골수종 세포), SP2/0 세포(마우스 기원의 골수종 세포), 기타 골수종 세포주, 차이니즈 햄스터 난소(CHO, Chinese hamster ovary) 세포, MDCK, HuT 78 세포 및 HEK293 세포 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 CHO 세포를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 일 측면은 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 항-GPNMB/항-CD3 항체를 정제하는 단계를 포함하는 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 항체의 제조방법은 상기 제1 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 제2 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 배양하는 단계; 및 상기 배양된 형질전환체로부터 이중특이적 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 재조합 벡터가 발현되는 형질 전환체를 영양배지에서 배양함으로써 이중특이적 항체를 대량으로 생산할 수 있으며, 배지와 배양조건은 숙주세포에 따라 관용되는 것을 적절히 선택할 수 있다. 배양 시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면은 상기 이중특이적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 이중특이적 항체는 CD3를 발현하는 T 세포 및 GPNMB 발현 암세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 이때, 상기 암은 대장암, 폐암, 뇌암, 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선암, 간암, 갑상선암, 두경부암, 위암, 방광암, 비호지킨 림프종암, 피부암, 흑색종, 백혈병, 신경모세포종 및 아교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, GPNMB가 발현되는 모든 암을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 이중특이적 항체는 CD3와의 특이적 결합을 통해 T 세포를 유도함으로써 GPNMB 발현 암세포의 사멸을 유도하거나 이의 증식을 억제할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 제형은 상술한 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조될 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 암세포 또는 그들의 전이를 치료하거나 암의 성장을 억제하기 위해 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 암 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분과 함께 투여되거나 순차적으로 투여될 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "개체"는 상기 약학적 조성물을 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학적 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 경로를 통해서도 투여될 수 있다. 이러한 투여 방법으로 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만 경구 투여시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있도록 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체 제조
실시예 1.1. 항-GPNMB 항체 선별
GPNMB 특이적 항체를 선별하기 위해, 유전자 재조합 기술을 이용하여 대장균(E. coli)에 기생하는 박테리오 파지(Bacteriophage)에 발현시키려는 DNA 서열을 박테리오 파지의 게놈(genome)에 삽입하였다. 이후, 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여 상기 삽입된 단백질을 파지의 외피 단백질(coat protein) 중 하나와 융합된 형태로 파지의 표면에 발현시켰다.
파지 디스플레이 합성 scFv 라이브러리 최종 증폭집단의 단일 콜로니를 채취한 다음 SB/카베니실린 1.5 mL에서 OD600 값이 약 0.8 내지 1.0 정도가 되도록 37℃에서 220 rpm으로 배양한 후 1mM IPTG, 30℃ 및 200 rpm의 조건으로 12시간 이상 배양하였다. 이 반응물을 5,500 rpm으로 5분간 원심분리한 후 각각의 상층액만을 GPNMB 항원이 깔려있는 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 2시간 동안 상온에서 반응시킨 다음 PBST(1XPBS, 0.05% tween 20)로 4회 세척한 후, HRP/AntihFab-HRP 접합체를 1% BSA/1XPBS로 1/5000 희석한 것을 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이후, 다시 PBST(1XPBS, 0.05% tween 20)로 4회 세척한 후, TMB 용액을 첨가하여 5 내지 10분간 반응시키고, TMB 반응정지액을 첨가하였다.
이어서, TECAN사의 Sunrise를 이용하여 450 nm 측정 파장에서 그 값을 읽고 높은 OD 값을 갖는 클론을 개별클론으로 확보하였다. 그 결과, 인간 GPNMB에 특이적으로 결합하는 23개의 클론을 선별하였고, 이들의 아미노산 서열을 확인하였다. 선별된 클론들로 GPNMB 발현 암세포주에 대한 결합력을 확인한 결과, 1종의 클론만이 상기 세포주에 결합되는 것을 확인하였다. 이를 기반으로 친화도 성숙(affinity maturation) 과정을 통해 상기 클론보다 단백질 및 세포에 대한 결합력이 향상된 6종의 클론을 추가적으로 확보하였다.
결과적으로, GPNMB 단백질 및 GPNMB 발현 암세포주에 결합하는 총 7종의 클론을 얻었고, 선별된 클론들을 각각 클론 GPNMB1(서열번호 55), 클론 GPNMB2(서열번호 56), 클론 GPNMB3(서열번호 57), 클론 GPNMB4(서열번호 58), 클론 GPNMB5(서열번호 59), 클론 GPNMB6(서열번호 60), 클론 GPNMB7(서열번호 61)로 명명하였다.
상기 클론들의 가변 영역 서열을 각각 서열번호 26 내지 33에 각각 나타내었고, Kabat numbering 기준으로 확인한 상기 가변 영역 내의 CDR 아미노산 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
클론 가변 영역 CDR1 CDR2 CDR3
GPNMB1 중쇄 GFTFSNYAMS SISHSGGSK KWSTFDY
(서열번호 1) (서열번호 2) (서열번호 3)
경쇄 SSNIGNNYVS ADSQRP GAWDSSLNAYV
(서열번호 4) (서열번호 5) (서열번호 6)
GPNMB2 중쇄 GFTFRKLNMS SISHSGGSK KWSTFDY
(서열번호 7) (서열번호 2) (서열번호 3)
경쇄 SSNIGNNYVS ADSQRP WDSSLNAYV
(서열번호 4) (서열번호 5) (서열번호 6)
GPNMB3 중쇄 GFTFRARPMS SISHSGGSK KWSTFDY
(서열번호 8) (서열번호 2) (서열번호 3)
경쇄 SSNIGNNYVS ADSQRP GAWDSSLNAYV
(서열번호 4) (서열번호 5) (서열번호 6)
GPNMB4 중쇄 GFTFQRYPMS SISHSGGSK KWSTFDY
(서열번호 9) (서열번호 2) (서열번호 3)
경쇄 SSNIGNNYVS ADSQRP GAWDSSLNAYV
(서열번호 4) (서열번호 5) (서열번호 6)
GPNMB5 중쇄 GFTFIRRPMS SISHSGGSK KWSTFDY
(서열번호 10) (서열번호 2) (서열번호 3)
경쇄 SSNIGNNYVS ADSQRP GAWDSSLNAYV
(서열번호 4) (서열번호 5) (서열번호 6)
GPNMB6 중쇄 GFTFAARPMS SISHSGGSK KWSTFDY
(서열번호 11) (서열번호 2) (서열번호 3)
경쇄 SSNIGNNYVS ADSQRP GAWDSSLNAYV
(서열번호 4) (서열번호 5) (서열번호 6)
GPNMB7 중쇄 GFTFSNYAMS SISHSGGSK KWSTFDY
(서열번호 1) (서열번호 2) (서열번호 3)
경쇄 SSNIGNNYVS DTPLRP GAWDSSLNAYV
(서열번호 4) (서열번호 12) (서열번호 6)
또한, 항-GPNMB 항체 중 가장 우수한 친화도를 보이는 클론 GPNMB6(서열번호 18)을 놉-인투-홀(knob-into-hole) 구조를 갖도록 형성하였다.
실시예 1.2. 항-CD3 항체 선별
인간과 원숭이의 CD3에 특이적인 항체를 선별하기 위해 마우스 SP34 항체를 인간화하여 CD3에 다양한 친화도로 결합하는 항체를 선별하였다. 이들 중에서 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어진 A15, 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어진 E15 클론을 얻었다. 또한, 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어진 항체(Genentech사의 Hu38E4.v1)를 제작하여 사용하였다. 또한, 이중특이적 항체는 항-CD3 항체(Hu38, A15, E15)를 놉-인투-홀(knob-into-hole) 구조를 갖도록 형성하였다.
실시예 1.3. 항체 발현을 위한 벡터의 도입
형질주입 24시간 전, Expi293 배지를 이용하여 2.0×106 세포/㎖ 농도의 Expi293F 세포를 37℃, 8% CO2 진탕 배양기(shaking incubator)에서 125±10 rpm으로 계대하였다. 형질주입 시, 세포 수와 세포 생존율(viability)을 측정하여 95% 이상의 세포 생존율을 나타내는지 확인하였다. 500 ㎖ 배양 플라스크에 5×108 세포를 넣고, Expi293 배지를 첨가하여 최종 170 ㎖로 조정하였다(200㎖ 기준). Opti-MEM I 배지를 이용하여 200 ㎍의 항체 발현벡터가 총 1,500 ㎕가 되도록 섞어 주고 실온에서 5분간 배양하였다.
Opti-MEM I 배지를 이용하여 540 ㎕의 transfection reagent가 총 1,500 ㎕가 되도록 섞어 주고 상온에서 5 분간 배양하였다. 벡터와 transfection reagent가 각각 들어있는 Opti-MEM I을 부드럽게 섞어주고 20분간 상온에서 반응시킨 후, Expi293F 세포가 포함된 플라스크에 넣어주었다. 37℃, 8% CO2 진탕 배양기에서 125±10 rpm으로 16~20시간 동안 배양한 후, transfection enhancer I을 1 ㎖, enhancer II를 10 ㎖ 첨가하고, 6일간 배양하여 후보 항체들을 수득하였다.
실시예 1.4. 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체의 제조
배양액을 4,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 0.22 ㎛ 필터로 여과한 뒤 세포 파괴물(cell debris)을 제거하고 상층액을 얻었다. Mabselect Xtra resin 1 ㎖을 컬럼에 넣고, 레진 부피의 10배에 해당하는 단백질 A 결합 버퍼를 이용하여 평형을 수행하였다.
이후 중력을 이용하여 상층액을 컬럼에 로딩(loading)하고, 로딩이 완료된 뒤 레진 부피의 10배에 해당하는 단백질 A 결합 버퍼를 이용하여 컬럼을 세척하였다. 그 다음 IgG 용출 버퍼를 컬럼에 넣고, 용출을 수행하였다. 1.5M Tris-Cl을 용출액 1 ㎖ 당 25 ㎕를 넣어 중화한 후, OD 280 ㎚에서 농도를 측정하였다. 농도가 측정된 용출액을 투석하여 PBS로 버퍼를 치환하였다.
다음으로, 시료를 약 1.0 g/L 내지 2.0 g/L이 되도록 농축 또는 희석하고, 이를 AKTA purifier 900에 장착된 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg(GE healthcare, 28989335) 컬럼에 로딩하였다. 이동상은 200 mM의 염화나트륨을 포함하는 20 mM 소듐 포스페이트(pH 7.0)를 사용하고, 유속 1.0 ㎖/분으로 흘려준 뒤, 시료 로딩 약 50~70분 후에 용출되는 분획을 취하였다. 용출된 분획 중 4-12% Bis-Tris PAGE(Invitrogen, 0321BOX)를 사용하여 coomassie blue로 염색한 뒤, 150 kDa 크기의 항체가 포함된 분획을 취하였다. 이후 30 kDa Amicon 원심 필터 유닛(Merck, UFC803024)을 사용하여 농축하였다.
도 1은 항-GPNMB 항체 단편(서열번호 22) 및 항-CD3 항체 단편(서열번호 1)을 포함하는 이중특이적 항체를 공발현 및 정제하여 150 kDa에 해당하는 단백질 시료를 수득한 결과를 나타낸 것이다.
실시예 1.5. HPLC 분석을 통한 이중특이적 항체의 순도 확인
HPLC 분석을 위해 평형 버퍼로서 50 mM 소듐 포스페이트(pH 6.0)를 사용하였고, 용출 버퍼는 50 mM 소듐 포스페이트(pH 6.0)에 염화나트륨을 500 mM의 농도가 되도록 넣은 후 0.45 ㎛ bottle top filter(Nalgene, 597-4520)를 사용하여 여과하였다. HPLC(Waters, 2695/2489) system에 양이온 컬럼(Thermofisher, 054993)을 연결한 후 평형 버퍼를 사용하여 평형을 잡았다. 분석 시료를 평형버퍼에 10배 이상 희석하여 로딩 샘플을 준비하였다. 이동상은 평형버퍼를 10분간 0.5 ㎖/분으로 흘려준 후 40분에 걸쳐 용출버퍼의 농도를 0%에서 100%로 직선농도구배 방법으로 흘려 주는 방법으로 분석하였다. 분석이 완료된 후 UV 280 ㎚에서 측정된 크로마토그램의 면적을 측정하여 순도를 확인하였다.
도 1의 결과와 같이 정제한 단백질 시료에 대해 HPLC 분석을 수행한 결과, GPNMB/CD3 이중특이적 항체 시료에는 항-GPNMB 항체 절편 및 항-CD3 항체 절편이 거의 없는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 2. 이중특이적 항체의 GPNMB 단백질 친화도 분석
정제된 이중특이적 항체의 재조합 인간 GPNMB에 대한 정량적인 결합력(친화도)을 Biacore T-200(GE Healthcare, 미국) 바이오센서를 이용하여 측정하였다. HEK293 세포로부터 정제된 GPNMB를 아민-카르복실 반응을 이용하여 CM5칩(GE Healthcare)에 200 Rmax가 되도록 고정시켰다. 다음, HBS-EP 완충용액(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20)에 순차적으로 희석한 GPNMB/CD3 이중특이적 항체를 0.078 nM 내지 5 nM 농도 범위에서 120초 동안 결합시키고, 1,800 초간 유속 30 μL/분으로 흘려주어 해리시켰다. 10 mM 글라이신-HCl pH 1.5를 30초 동안 유속 30μL/분으로 흘려줌으로써 GPNMB에 결합된 항체의 해리를 유도하였다(표 2). Biacore T-200 evaluation software를 이용하여 친화도를 운동속도상수(Kon 및 Koff)와 평형해리상수(KD)로 얻었다(표 3).
SPR Biacore T200
칩(Chip) CM5
러닝 버퍼(Running Buffer) HBS-EP, pH 7.4
유속률(Flow rate) 30 ㎕/분
결합(Association)/해리(dissociation time) 120초/600초
IgG 농도 0.078~5 nM, 1/2 계단희석(serial dilution)
재생(Regeneration) 10 mM Glycine-HCl, pH 1.5, 30초
Kon Koff KD
GPNMB(서열번호35)/A15(서열번호36) 3.41x105 3.74x10-4 1.10x10-9
실시예 3. GPNMB 및 CD3 발현 세포에 대한 이중특이적 항체의 친화도 분석실시예 3.1. 인간 GPNMB 발현 암세포주에 대한 이중특이적 항체의 친화도 분석
유세포분석(Flow cytometry)을 이용하여 GPNMB를 발현하는 세포에서 이중특이적 항체가 친화도를 나타내는지 확인하였다. 구체적으로, 100 ㎕의 FACS 버퍼(2% FBS/PBS)에 SK MEL2, U87MG 및 T98G 3종류 암세포를 각각 3×105 세포 농도로 첨가한 5 ㎖ 튜브를 준비하고, 1차 항체를 튜브당 0.5 ㎍씩 처리한 뒤 30분간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 이후, 1 ㎖ FACS 버퍼를 넣어주고 4℃에서 1,500 rpm으로 3분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하였다.
다음으로, 1차 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 형광색소 표지된 2차 항체를 100 ㎕의 FACS 버퍼에 0.2 ㎍씩 처리한 뒤 30분간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 이후, 1 ㎖ FACS 버퍼를 넣어주고 4℃에서 1,500 rpm으로 3분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거하여 시료를 수득하였다. 그 후 시료를 FACS 버퍼 : BD CytofixTM = 1:4의 비율로 만든 버퍼 200 ㎕를 넣어주고 세포를 현탁시켜 BD FACSCalibur로 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 결과와 같이 3종류의 암세포주에 대해 GPNMB(서열번호 35)/A15 (서열번호 36) 이중특이적 항체가 결합하는 것을 확인할 수 있었다. irrelevant control로 사용하는 음성 대조군 항체에 대해서는 3종의 세포 모두 결합하지 않았다.
실시예 3.2. 인간 CD3 발현 암세포주에 대한 이중특이적 항체의 친화도 분석
유세포분석(Flow cytometry)을 이용하여 CD3를 발현하는 세포에도 상기 실시예 1.에 따라 제조된 이중특이적 항체가 친화도를 나타내는지 확인하였다. 구체적으로, 100 ㎕의 FACS 버퍼(2% FBS/PBS)에 Jurkat 세포주를 3×105 세포 농도로 첨가한 5 ㎖ 튜브를 준비하고, 1차 항체를 튜브당 0.5 ㎍씩 처리한 뒤 30분간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 이후, 3 ㎖ FACS 버퍼를 넣어주고 4℃에서 1,500 rpm으로 3분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하였다.
다음으로, 1차 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 형광색소 표지된 2차 항체를 100 ㎕의 FACS 버퍼에 0.2 ㎍씩 처리한 뒤 30분간 빛을 차단하고 4℃에서 배양하였다. 이후, 1 ㎖ FACS 버퍼를 넣어주고 4℃에서 1,500 rpm으로 3분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거하여 시료를 수득하였다. 그 후 시료를 FACS 버퍼 : BD CytofixTM = 1:4의 비율로 만든 buffer 200 ㎕를 넣어주고 세포를 현탁시켜 BD FACS Calibur로 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 결과와 같이 Jurkat 세포주에 대해 GPNMB(서열번호 35)/A15 (서열번호 36) 이중특이적 항체가 결합하는 것을 확인할 수 있었다. irrelevant control로 사용하는 음성 대조군 항체에 대해서는 3종의 세포 모두 결합하지 않았다.
실시예 4. 종양 세포주에 대한 이중특이적 항체의 세포 사멸 효능 평가
인간 말초혈액 단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cell)와 상기 실시예 1에 따라 제조된 이중특이적 항체를 이용하여, GPNMB+ 종양 세포 3종(SK-MEL-2, U87MG, T98G)에 대해 GPNMB 특이적 종양 세포 사멸 효능을 아래 방법에 따라 확인하였다.
실시예 4.1. 타겟 세포주 구축
GPNMB+ 종양 세포 3종(SK-MEL-2, U87MG, T98G)을 1× 트립신-EDTA 용액으로 세포들을 수확하고 1,200 rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리하였다. 이후, 상층액을 제거하고 cRPMI(RPMI, A10491-01+10% FBS+55μM β-ME)에 재현탁한 뒤 세포 수를 정량하였다. 각 세포주 현탁액을 1.0×105 세포/㎖ 농도로 준비하고, 6-웰 플레이트에 1 ㎖/웰씩 넣고, 플레이트들을 37℃의 CO2 인큐베이터에서 하루 동안 배양하여 세포주를 준비하였다. 그 다음, IncuCyte® NucLight Red Lentivirus Reagent(EF-1 Alpha Promoter, Puromycin selection)를 3 MOI(Multiplicity of Infection)로 사용하여 세포감염(transduction)하였다. 다음 날 배지를 교체하고 퓨로마이신을 1 ㎍/㎖ 농도로 선별하여 최종적으로 타겟 세포주를 구축하였다.
실시예 4.2. 타겟 세포주 준비
구체적으로, 1Х 트립신-EDTA 용액으로 세포들을 수확(harvest)하고 1,200 rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리하였다. 이후, 상층액을 제거하고 cRPMI(RPMI, A10491-01 + 10% FBS + 55μM β-ME)에 재현탁한 뒤 세포 수를 정량하였다. 각 세포주 현탁액을 1Х105 세포/㎖로 준비하고, 96-웰 플레이트에 100 ㎕/웰씩 넣고, 플레이트들을 37℃의 CO2 인큐베이터에서 하루 동안 배양하여 타겟 세포주를 준비하였다.
실시예 4.3. 말초혈액단핵세포 준비
냉동보존된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 37℃ 수조에서 신속하게 녹인 후, 50 ㎖ 코니컬 튜브로 옮겨 흔들어주면서 해동 배지(RPMI, 11875-093+10% FBS+55 μM β-ME)를 한 방울씩 점적하여 섞어 주었다. 그 다음 1,200 rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 30 ㎖의 해동 배지에 재현탁한 뒤 세포 수를 정량하였으며, 각 공여자(donor)별로 cRPMI에 현탁하여 1.0×106 세포/㎖ 농도로 맞추었다.
실시예 4.4. 말초혈액단핵세포 및 항체 플레이팅
각 항체를 cRPMI로 희석한 후 20 nM에서부터 1/5씩 희석하여 하루 전에 타겟 세포를 플레이팅한 웰에 처리하였다. 그 다음 앞서 준비한 PBMC를 타겟 : PBMC = 1 : 10(SK-MEL-2) 또는 1 : 20(U87MG, T98G) 비율이 되도록 100 ㎕/웰씩 넣어 주었다.
실시예 4.5. IncuCyteS3를 이용한 실시간 세포 영상 분석
37℃의 CO2 인큐베이터에서 2일 동안 배양하면서 IncuCyteS3를 이용하여 10Х 배율에서 2시간 간격으로 bright field, red fluorescence를 측정하였다. 측정 결과, GPNMB를 발현하는 3종의 암세포들에 대한 상기 이중특이적 항체의 세포 사멸 효과가 용량 의존적으로 나타나는 것을 확인하였다(도 4). 반면, Irrelevant Ab와 A15 항체를 연결한 이중특이적 항체(Irerelevant/A15)는 세포 사멸을 유도하지 않았다. 한편, 상기 GPNMB(서열번호 35)/A15(서열번호 36)와 유사한 세포 결합능을 보인 타사 항체와 A15(서열번호 36)를 가지고 이중특이적 항체를 만들어 세포 사멸 효과를 확인한 결과, 상기 GPNMB 클론에 비해 효능이 떨어짐을 확인하였다. 이를 바탕으로 상기 GPNMB 항체(서열번호 35)가 T 세포 유도 이중특이적 항체로써 유효한 에피토프를 인지한다고 보여진다.
실시예 5. 이중특이적 항체에 의한 T 세포 활성 측정
실시예 1.에 따라 제조된 이중특이적 항체의 T 세포 활성화 정도를 분석하기 위해, GPNMB이 과발현되는 3가지 암세포주(SK MEL2, U87MG 및 T98G)에 IL2-luc2P Jurkat 세포주(Promega)을 이용하여 T 세포 활성능을 분석하였다.
구체적으로, GPNMB를 발현하는 SK MEL2, U87MG 및 T98G 세포를 각각 96-웰 플레이트에 웰당 3×104 세포로 100 ㎕ 배양 배지(Culture Medium)를 이용해 깔아주고, 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터(humidified incubator)에서 18시간 동안 배양하여 타겟 세포주를 준비하였다. 37℃ 수조에서 2분간 GloResponseTM Frozen Thaw and Use(FTU) IL-2-luc2P Jurkat 이펙터 세포를 녹이고, 15 ㎖ 코니컬 원심분리 튜브(conical centrifuge tube)에 4 ㎖ pre-warmed Assay Medium(10% FBS가 포함된 RPMI 배지)을 넣은 후, 녹여 놓은 이펙터 세포 1 ㎖을 첨가해 천천히 섞어주어 Effector 세포주를 준비하였다. 다음으로, 타겟 세포가 깔려있는 96-웰 플레이트에서 배지 75 ㎕를 제거하고, FTU IL2-Luc2P Jurkat 세포를 웰당 1×105 세포가 되도록 25 ㎕씩 플레이트에 첨가하였다.
항체는 10 nM에서부터 1/3씩 희석하여 3X 도즈(dose)를 10 포인트(points) 만들어 준비하였다. 그 다음, 앞서 준비한 FTU IL2-Luc2P Jurkat 세포가 포함된 96-웰 플레이트에 준비된 10개 농도의 항체를 1X 도즈(dose)가 되도록 25 ㎕씩 넣어주었다. 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터(humidified incubator)에서 5시간 동안 배양한 후에 인큐베이터에서 꺼내 실온에 맞게 10~15분간 방치하였다. 이후, Bio-Glo™ 시약을 웰당 75 ㎕씩 넣어주고 5분간 방치한 뒤, GloMax™Multi 및 멀티웰 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. 측정 결과, 3종의 암세포에서 모두 상기 이중특이적 항체에 의한 T 세포 활성화를 확인할 수 있었고, 항체의 CD3에 대한 친화도가 감소함에 따라 EC50값이 증가함을 관찰하였다. Irrelevant Ab와 Hu38을 이용하여 제작한 이중특이적 항체는 T 세포 활성을 유도하지 않았다(도 5).
<110> Green Cross Corporation Mogam Institute for Biomedical Research <120> BISPECIFIC ANTIBODY THAT SPECIFICALLY BINDS TO GPNMB AND CD3 AND USE THEREOF <130> FPD201901-0011c <160> 61 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR1 of anti-GPNMB antibody <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR2 of anti-GPNMB antibody <400> 2 Ser Ile Ser His Ser Gly Gly Ser Lys 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 of anti-GPNMB antibody <400> 3 Lys Trp Ser Thr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR1 of anti-GPNMB antibody <400> 4 Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR2 of anti-GPNMB antibody <400> 5 Ala Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR3 of anti-GPNMB 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Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile 145 150 155 160 Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly 165 170 175 Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser 180 185 190 Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln 195 200 205 Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser 210 215 220 Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Gly Gly Gly Ser 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly 245 250 255 Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln 260 265 270 Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 275 280 285 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser 290 295 300 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile 305 310 315 320 Ser His Ser Gly Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 325 330 335 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 340 345 350 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys 355 360 365 Trp Ser Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 370 375 380 Ser 385

Claims (25)

  1. GPNMB에 특이적으로 결합하는 제1 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 포함하는 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체로서,
    상기 제1 도메인은 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR2; 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR1; 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR2; 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고,
    상기 제2 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR1; 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR2; 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR1; 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR2; 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 도메인은 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역이 링커를 통해 연결된 가변 영역을 가지는 것인, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제1 도메인의 가변 영역은 서열번호 24의 아미노산 서열을 가지는 것인, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제2 도메인은 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역이 링커를 통해 연결된 가변 영역을 가지는 것인, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제2 도메인의 가변 영역은 서열번호 49의 아미노산 서열을 가지는 것인, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1 도메인은 Fc 영역을 더 포함하는, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제2 도메인은 Fc 영역을 더 포함하는, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역(CH)에서 유래된 것인, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 제1 도메인 및 제2 도메인의 Fc 영역 중 어느 하나는 놉(knob) 구조를 갖고, 다른 하나는 홀(hole) 구조를 갖는, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 제1 도메인은 서열번호 47 또는 48의 아미노산 서열로 표시되는 Fc 영역을 포함하는, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 제2 도메인은 서열번호 48 또는 47의 아미노산 서열로 표시되는 Fc 영역을 포함하는, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 제1 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 제2 도메인은 서열번호 36의 아미노산 서열로 표시되는, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 이중특이적 항체는 T 세포 및 GPNMB 발현 암세포에 특이적으로 결합하는, 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체.
  17. 제1항의 제1 도메인의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 제1항의 제2 도메인의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제17항에 따른 폴리뉴클레오티드가 적재된 발현벡터.
  20. 제18항에 따른 폴리뉴클레오티드가 적재된 발현벡터.
  21. 제19항의 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
  22. 제20항의 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
  23. 제19항의 발현벡터 및 제20항의 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    항-GPNMB/항-CD3 항체를 정제하는 단계를 포함하는 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체의 제조방법.
  24. 제1항에 따른 항-GPNMB/항-CD3 이중특이적 항체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 암은 대장암, 폐암, 뇌암, 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선암, 간암, 갑상선암, 두경부암, 위암, 방광암, 비호지킨 림프종암, 피부암, 흑색종, 백혈병, 신경모세포종 및 아교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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AU2020272376A AU2020272376B2 (en) 2019-04-08 2020-04-06 Bispecific antibody specifically binding to GPNMB and CD3, and use thereof
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130022597A1 (en) * 2004-11-30 2013-01-24 Meina Liang Antibodies Directed To GPNMB And Uses Thereof
WO2016004108A2 (en) * 2014-07-01 2016-01-07 Amphivena Therapeutics, Inc. Bispecific cd33 and cd3 binding proteins

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2627890A1 (en) * 2005-10-31 2007-05-10 The Government Of The United States As Represented By The Secretary Of H Ealth And Human Services, National Institutes Of Health Antibodies and immunotoxins that target human glycoprotein nmb
WO2008133641A2 (en) * 2006-10-11 2008-11-06 Curagen Corporation Antibodies directed to gpnmb and uses thereof
MX2011010158A (es) * 2009-04-07 2011-10-17 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-2/anti-c-met.
EA036577B1 (ru) * 2013-11-04 2020-11-25 Икнос Сайенсиз Са Получение переориентирующих т-клетки гетеродимерных иммуноглобулинов
EP3083689B1 (en) * 2013-12-17 2020-05-27 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
AU2015353409B2 (en) * 2014-11-26 2019-05-09 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
WO2017046061A1 (en) * 2015-09-14 2017-03-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-gpnmb antibodies and diagnostic uses thereof
CN108348603B (zh) * 2015-11-03 2023-12-29 Ambrx公司 抗cd3叶酸结合物和其用途
WO2018054484A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Biontech Ag Bispecific trivalent antibodies binding to claudin 6 or claudin18.2 and cd3 for treatment of claudin expressing cancer diseases
JOP20190100A1 (ar) * 2016-11-19 2019-05-01 Potenza Therapeutics Inc بروتينات ربط مولد ضد مضاد لـ gitr وطرق استخدامها
WO2018199593A1 (ko) * 2017-04-24 2018-11-01 재단법인 목암생명과학연구소 Her3 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
WO2019034580A1 (en) * 2017-08-14 2019-02-21 Morphosys Ag HUMANIZED ANTIBODIES FOR CD3

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130022597A1 (en) * 2004-11-30 2013-01-24 Meina Liang Antibodies Directed To GPNMB And Uses Thereof
WO2016004108A2 (en) * 2014-07-01 2016-01-07 Amphivena Therapeutics, Inc. Bispecific cd33 and cd3 binding proteins

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