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CN118515779A - 抗hk2嵌合抗原受体（car） - Google Patents

抗hk2嵌合抗原受体（car） Download PDF

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CN118515779A
CN118515779A CN202410439531.4A CN202410439531A CN118515779A CN 118515779 A CN118515779 A CN 118515779A CN 202410439531 A CN202410439531 A CN 202410439531A CN 118515779 A CN118515779 A CN 118515779A
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amino acid
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light chain
heavy chain
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R·甘尼桑
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J·罗
T·麦克德维特
F·沈
S·辛格
D·宋
S·文卡塔拉马尼
F·易
Y·赵
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Janssen Biotech Inc
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Abstract

本公开提供了特异性靶向人激肽释放酶‑2(hK2)的嵌合抗原受体(CAR)和包含此类CAR的免疫应答细胞，其用于治疗癌症。

Description

抗HK2嵌合抗原受体(CAR)
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2020年6月30日，命名为JBI6124WOPCT1_SL.txt，并且大小为562,160字节。
技术领域
本发明涉及包含靶向hK2的单链可变片段的靶向hK2的嵌合抗原受体(CAR)和表达CAR的工程化靶向hK2的免疫细胞。还提供了编码CAR的核酸和表达载体、包含载体的重组细胞，以及包含表达靶向hK2的CAR的工程化免疫细胞的组合物。还提供了制备CAR和工程化免疫细胞的方法，以及使用工程化免疫细胞治疗包括癌症在内的病症的方法。
背景技术
对于男性而言，前列腺癌是第二常诊断出的癌症和第六大癌症致死原因，在全世界男性中占总新癌症病例的14％(903,500)以及总癌症死亡的6％(258,400)。基于疾病的程度、激素状态以及是否存在可检测到的转移，将前列腺癌从被诊断出到死亡的过程最恰当地分类为以下一系列临床分期：局部疾病、放射疗法或外科手术后前列腺特异性抗原(PSA)的水平升高但不存在可检测到的转移，以及在非去势或去势期的临床转移。虽然外科手术、放射或这两者的组合对于患有局部疾病的患者可能有效，但是这些患者中有相当比例会复发，如通过PSA的水平升高所证实，复发可导致转移进一步发展，特别是在高风险组中转变为该疾病的致死期。
雄激素耗竭疗法(ADT)是具有以下通常可预见到的结果的标准治疗：PSA水平下降，肿瘤不增殖的稳定期，然后是PSA水平升高并再生长为去势难治性疾病。在过去，ADT一直是转移性前列腺癌患者的护理标准。
激肽释放酶相关肽酶2(hK2、HK2)是具有对于前列腺组织和前列腺癌具有特异性的雄激素受体(AR)驱动表达的胰蛋白酶样酶。hK2被跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)活化并分泌到前列腺管中，在前列腺管中hK2引发裂解精囊蛋白(精液中的细胞外基质)的级联反应，以增强精子能动性。hK2表达限制于前列腺和前列腺癌组织，然而最近已证实，通过类固醇激素对AR通路进行适当活化后，hK2在乳腺癌细胞株和原代患者样品中可检测到(美国专利公布2018/0326102)。类似于PSA，当前列腺的高度结构化组织因肥大或恶性转化而受损时，无催化活性的hK2逆行释放到血液中。
T细胞疗法利用了分离的T细胞，这些T细胞已经被基因修饰以增强它们对特定肿瘤相关抗原的特异性。基因修饰可以涉及嵌合抗原受体(CAR)或外源性T细胞受体的表达，以将新的抗原特异性提供到T细胞上。表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)可以诱导肿瘤免疫反应性。需要利用CAR-T细胞的更好的癌症疗法。
发明内容
本文公开了嵌合抗原受体(CAR)(例如，靶向人激肽释放酶-2(hK2)的CAR)、包含CAR的细胞、编码CAR的载体(例如，重组表达载体)，以及编码CAR的核酸分子，制备CAR、组合物、多肽、蛋白质、核酸、宿主细胞、细胞群体的方法，以及使用所公开的CAR治疗疾病(例如，癌症)的方法。
在一个方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含：
(a)细胞外结构域，该细胞外结构域包含scFv并特异性地结合人激肽释放酶-2(hK2)抗原，
(b)跨膜结构域；和
(c)细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域任选地包括至少一个共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR还包含：
(d)CD8a-铰链区，
其中跨膜结构域包含CD8a跨膜区(CD8a-TM)多肽；并且
其中细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域和初级信号传导结构域，该共刺激结构域包含TNF受体超家族成员9(CD137)组分，该初级信号传导结构域包含T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(CD3z)组分。
在一些实施方案中，CD8a铰链区包含与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:269、SEQ IDNO:270、SEQ ID NO:271或SEQ ID NO:272具有至少90％同一性的氨基酸序列；
跨膜结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少90％同一性的氨基酸序列；并且/或者
细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域和初级信号传导结构域，该共刺激结构域具有与SEQ ID NO:27具有至少90％同一性的氨基酸序列，该初级信号传导结构域具有与SEQ ID NO:28具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:314的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:315的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:309的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:310的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3，
其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在另一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链CDR3，
其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域还包含：
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中细胞外抗原结合结构域包含：
轻链可变结构域(VL)，该轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:318的氨基酸序列；和/或
重链可变结构域(VH)，该重链可变结构域包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:317的氨基酸序列；
其中细胞外抗原结合结构域结合人激肽释放酶-2(hK2)抗原。
在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，scFv包含位于轻链可变区(VL)与重链可变区(VH)之间的接头多肽。在一些实施方案中，接头多肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，scFv包含选自SEQID NO:8-23、SEQ ID NO:169-184和SEQ ID NO:340-343的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含信号多肽。在一些实施方案中，信号多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含多肽组分，该多肽组分选自：TNF受体超家族成员9(CD137)组分、T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(CD3z)组分、分化簇(CD27)组分、分化簇超家族成员组分，以及它们的组合。在一些实施方案中，CD137组分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD3z组分包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8a跨膜区(CD8a-TM)多肽。在一些实施方案中，CD8a-TM多肽包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列。
在各种实施方案中，CAR还包含将跨膜结构域连接至细胞外抗原结合结构域的铰链区。在一些实施方案中，铰链区为CD8a铰链区。在一些实施方案中，CD8a铰链区包含SEQID NO:25、SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271或SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:29-44、SEQ ID NO:78-81、SEQ ID NO:221-236和SEQ ID NO:273-308的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含选自SEQ ID NO:46-61、SEQ ID NO:82-85和SEQ ID NO:205-220的氨基酸序列。
在另一方面，提供了表达上述CAR中的任一种CAR的分离的淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞为T淋巴细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
还提供了编码上述CAR中的任一种CAR的分离的核酸分子。还提供了包含核酸分子的载体。此外，还提供了表达核酸分子的细胞。
还提供了药物组合物，该药物组合物包含有效量的以上淋巴细胞中的任一种淋巴细胞和药学上可接受的赋形剂。
在一个方面，本公开提供了用于在治疗方法中使用的根据本公开的CAR。
在一个方面，本公开提供了用于在治疗方法中使用的根据本公开的淋巴细胞。
在一个方面，本公开提供了用于在治疗方法中使用的根据本公开的组合物，例如药物组合物。
在一个方面，本公开提供了用于在治疗癌症的方法中使用的根据本公开的CAR。
在一个方面，本公开提供了用于在治疗癌症的方法中使用的根据本公开的淋巴细胞。
在一个方面，本公开提供了用于在治疗癌症的方法中使用的根据本公开的组合物，例如药物组合物。
在一个实施方案中，癌症是前列腺癌。
在一个实施方案中，癌症是表达乳腺癌的雄激素受体(AR)。
在另一方面，提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法。该方法包括将治疗有效量的以上淋巴细胞中的任一种淋巴细胞施用于有需要的受试者，由此淋巴细胞诱导对受试者中的癌细胞的杀伤。在一些实施方案中，癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，癌症是表达乳腺癌的雄激素受体(AR)。
在另一方面，提供了一种对癌细胞进行靶向杀伤的方法，该方法包括使癌细胞与以上淋巴细胞中的任一种淋巴细胞接触，由此淋巴细胞诱导对癌细胞的杀伤。在一些实施方案中，癌细胞是前列腺癌细胞。在一些实施方案中，癌症是表达乳腺癌的雄激素受体(AR)。
在另一方面，提供了一种检测受试者中存在癌症的方法，该方法包括：
(a)使从受试者获得的细胞样品与以上CAR中的任一种CAR接触，
从而形成CAR-细胞复合物，以及
(b)检测该复合物，其中检测到复合物指示受试者中存在癌症。
附图说明
根据如附图所展示的示例性实施方案的以下更具体的描述，前述内容将显而易见。
本专利申请文件包含至少一张绘制成彩色的附图。在提出请求并且支付必要的费用后，美国专利和商标局将会提供本专利申请的带彩图副本。
图1A-图1C示出hK2 CAR在人T细胞上的构建和表达。图1A示出用于hK2 CAR的构建体的示意图；TM：跨膜。图1B和图1C示出T细胞表面上的hK2 CAR表达。采用下列方式对原代人T细胞进行电穿孔：未使用mRNA(MOCK)，或者10μg表达hK2 scFv CAR或不相关对照CAR的mRNA。在用2μg/mL生物素化的L蛋白和链霉亲和素缀合的PE(图1B)或者生物素化的hK2(1μg/mL)和链霉亲和素缀合的PE(图1C)染色后，通过流式细胞术测量电穿孔后24小时的CAR表面表达。
图2示出在指定效应子与靶细胞(E/T)比率下，在基于20小时流动的测定法中，CAR-T细胞对表达hK2的肿瘤细胞的细胞毒性。瞬时转染之后24小时，用Cell Trace Violet(CTV)荧光染料标记靶细胞(Vcap和DU145)，然后与hK2 CAR-T细胞共培养。Mock T细胞充当阴性效应子对照。杀灭百分比是共培养物中剩余的活(生存力染料阴性)靶(CTV阳性)细胞的绝对数目相对于不与CAR-T细胞一起培养的活靶标的数目的比率。
图3A-图3B示出实时hK2特异性CAR-T细胞介导的细胞毒性。在不同E:T比率下与Mock、10μg mRNA电穿孔(转染后24小时)hK2 11B6CAR LH或对照CAR-T细胞一起温育大约72小时的靶细胞(图3A)VCap(5E4个细胞)和(图3B)DU145(5E3个细胞)的归一化细胞指数(CI)曲线图。当单独接种时，靶细胞粘附到板并增殖，从而增大CI读数。当将T细胞添加到靶细胞中时，hK2 CAR和对照CAR-T细胞致使hK2(+)Vcap细胞溶解和随后在5:1至0.156:1的E/T比率下的CI递降。添加效应子细胞后CI值减小反映了靶细胞的生存力丧失。同样执行使用hK2(-)DU145靶细胞的平行实验，如(图3B)所示；在该实验中测试的E:T比率下，hK2和对照CART细胞不表现出细胞溶解活性，并在添加之后不会降低CI。Y轴是由RTCA软件生成并实时显示的归一化CI。X轴是以小时为单位的细胞培养时间和治疗时间。绘制CI的平均值±标准偏差。
图4示出抗原刺激的CAR-T细胞的Th1细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)产生。在基于xCELLigence的杀伤测定法中从大约70小时共培养物(VCap#5E4个、DU145#5E3个)收集上清液(参见图3A-图3B)。hK2CAR LH和对照CAR修饰的T细胞在与表达hK2的VCap细胞(但非hK2阴性DU145细胞)共培养期间分泌IFN-γ。示出了重复培养物的平均IFN-γ浓度±标准偏差(pg/mL)。
图5A-图5B示出，在JNL报告基因测定法中评估11B6热稳定的scFv CAR克隆的抗原依赖性活性。图5A示出，含有由信号传导响应性NFAT启动子驱动的荧光素酶基因的Jurkat细胞(称为JNL细胞)用各种hK2CAR构建体转导。通过生物素化的hK2，然后是链霉亲和素缀合的PE确定表达。图5B示出，CAR构建体与其同源细胞抗原(靶细胞上的hK2)之间的结合导致JNL细胞中的荧光素酶表达。将含有指定CAR克隆的JNL细胞和未转导的JNL细胞(UTD)与靶细胞系(VCap或DU145细胞)共培养，并且以发光强度测量荧光素酶活性。在存在表达抗原的细胞的情况下，当发光强度超过UTD细胞的水平的1.5倍时，认为克隆是活性的。
图6示出T细胞表面上的hK2 CAR表达。用11B6热稳定的且基于亲本scFv的CAR慢病毒属转导原代人T细胞(感染复数(MOI)：3)，并且在转导后14天通过生物素化的hK2(1μg/mL)，然后是链霉亲和素缀合的PE确定CAR表达。
图7A-图7B示出，在实时IncuCyte杀伤测定法中评估11B6热稳定的scFv CAR-T细胞的抗原依赖性细胞毒性。将热稳定的hK2 CAR-T细胞和亲本11B6 CAR-T与VCaP细胞(图7A)和PC3细胞(图7B)共温育88小时。基于CAR表达数据计算效应子与靶细胞(E/T)比率(参见图6)。靶细胞稳定地表达红色核染料，这通过IncuCyte成像系统以实时方式测量。肿瘤细胞生长抑制(％)＝(初始活靶细胞数-当前活靶细胞数)/初始活细胞数*100(％)。
图7C示出在评估抗原依赖性细胞毒性的实时IncuCyte杀伤测定法中，在1:1或0.5:1的效应子:靶细胞比率下用CAR1-10或者亲本11B6_HL或11B6_LH转导的T细胞对hK2阳性VCaP细胞的肿瘤细胞生长抑制百分比。肿瘤细胞生长抑制(％)＝(初始活靶细胞数-当前活靶细胞数)/初始活细胞数*100(％)。
图7D示出在评估抗原依赖性细胞毒性的实时IncuCyte杀伤测定法中，在1:1的效应子:靶细胞比率下用CAR1-10或者亲本11B6_HL或11B6_LH转导的T细胞对PC3细胞的肿瘤细胞生长抑制百分比。肿瘤细胞生长抑制(％)＝(初始活靶细胞数-当前活靶细胞数)/初始活细胞数*100(％)。
图7E示出在评估抗原依赖性细胞毒性的实时IncuCyte杀伤测定法中，用CAR17(图中的B413HL)、CAR18(图中的B413LH)、CAR19(图中的B359HL)和CAR20(图中的B359LH)转导的CAR-T细胞对hK2阳性VCaP细胞的肿瘤细胞生长抑制百分比。肿瘤细胞生长抑制(％)＝(初始活靶细胞数-当前活靶细胞数)/初始活细胞数*100(％)。
图7F示出在评估抗原依赖性细胞毒性的实时IncuCyte杀伤测定法中，用CAR17(图中的B413HL)、CAR18(图中的B413LH)、CAR19(图中的B359HL)和CAR20(图中的B359LH)转导的CAR-T细胞对hK2阴性DU145细胞的肿瘤细胞生长抑制百分比。肿瘤细胞生长抑制(％)＝(初始活靶细胞数-当前活靶细胞数)/初始活细胞数*100(％)。
图8示出由hK2 lenti-CAR-T细胞释放细胞因子。使用13-plex Milliplex人高灵敏度T细胞试剂盒(HSTCMAG28SPMX13)分析从hK2CAR-T细胞与VCap细胞在1:1的E/T比率下的过夜(大约20小时)共培养物收集的上清液，hK2 CAR修饰的T细胞在与表达hK2的VCap细胞共培养期间分泌细胞因子，但对于未转导的T细胞(UTD)来说分泌最少。示出了重复培养物的平均细胞因子浓度±标准偏差(pg/mL)。
图9示出由hK2 lenti-CAR-T细胞释放IFN-γ。从hK2 CAR-T细胞与VCap、DU145(5E4个细胞)细胞在1:1的E/T比率下的过夜(大约20小时)共培养物中收集上清液。hK2 CAR修饰的T细胞在与表达hK2的VCap细胞(但非hK2-阴性DU145细胞)共培养期间分泌IFN-γ。示出了重复培养物的平均IFN-γ浓度±标准偏差(pg/mL)。CD3/28珠粒刺激T细胞，并且仅T细胞分别用作阳性对照和阴性对照。
图10A-图10E示出hK2 CAR-T细胞增殖测定法的结果。(图10A、图10C)hK2 CAR和未转导的(UTD)T细胞用CellTrace Violet(CTV；5μM)标记并与hK2(+)VCap细胞和hK2(-)DU145细胞共培养。共培养后五天，收获细胞并用CD3、CD25、Live/dead近红外染料和hK2CAR染色。在配有Flowjo软件的Fortessa流式细胞仪上进行流式细胞术分析。通过活CD3鉴定淋巴细胞，并且确定具有CTV染料稀释和活化标志物CD25的CAR+T细胞的频率。(图10B、10D)CD3/28珠粒刺激T细胞，并且仅T细胞分别用作阳性对照和阴性对照。图10E中的数据示出，在与VCap细胞共培养5天后，hK2 CAR+T细胞比CD3/28珠粒阳性对照更稳健地增殖。不同的CAR构建体工程化T细胞具有不同的增殖活性并且表现出不同的CAR+T细胞计数。CAR+T细胞计数基于来自三次技术平行测定的平均绝对细胞计数+/-SEM。
图11A-图11B示出，使用生物素标记的hK2蛋白确定hK2 CAR在原代T细胞上的表达水平的测定结果。图11A是用于hK2 CAR的构建体的示意图；TM：跨膜。在图11B中，用新型基于hK2 scFv的KL2B413HL&LH和重人源化11B6 KL2B359 HL&LH CAR慢病毒属(MOI为3)转导原代人T细胞，并且在转导后14天通过生物素化的hK2(1μg/mL)，然后是链霉亲和素缀合的PE确定CAR表达。图11B提供了通过所分析的新型KL2B413 HL&LH和重人源化11B6 KL2B359HL&LH CAR检测的对hK2 CAR+T细胞(阳性％)的百分比的汇总。如图所示，不同的克隆具有不同的CAR表达水平，范围从45.1％至59.9％。将所有CAR T细胞归一化为相等的CAR+T细胞，以用于随后的功能测定。
图12A-图12B示出，在JNL报告基因测定法中评估新型hK2 KL2B413和重人源化11B6 CAR克隆的抗原依赖性活性的结果。在图12A中，含有由信号传导响应性NFAT启动子驱动的荧光素酶基因的Jurkat细胞(称为JNL细胞)用各种hK2 CAR构建体转导。通过生物素化的hK2，然后是链霉亲和素缀合的PE确定表达。对于46％-50％细胞在重人源化11B6KL2B359CAR上表达并且73.7％-96％细胞在KL2B413 CAR上表达的选定克隆，已证实经转导的JNL细胞中的CAR表达。图12B中示出的数据指示，hK2 CAR构建体与其同源细胞抗原(靶细胞上的hK2)之间的结合导致JNL细胞中的荧光素酶表达。将含有指定CAR克隆的JNL细胞和JNL细胞(UTD)与靶细胞系(VCap、LNCap/Hk2、LNCap、C4-2B、22Rv1或DU145细胞)共培养，并且以发光强度测量荧光素酶活性。在存在表达抗原的细胞的情况下，当发光强度超过UTD细胞的水平的1.5倍时，认为克隆是活性的。未发现新型KL2B413和重人源化11B6 HL&LH CAR的抗原依赖性活化。
图13A-图13B示出，在实时IncuCyte杀伤测定法中评估HK2 CAR-T细胞的抗原依赖性细胞毒性的结果。将HK2 CAR-T细胞与HK2+VCaP细胞(图13A)和HK2-DU145细胞(图13B)共温育96小时。基于CAR表达数据计算效应子与靶细胞(ET)比率(图11B)。靶细胞稳定地表达红色核染料，这通过IncuCyte成像系统以实时方式测量。肿瘤细胞生长抑制(％)＝(初始活靶细胞数-当前活靶细胞数)/初始活细胞数*100(％)
图14示出表明抗原刺激的CAR-T细胞的Th1细胞因子IFN-γ产生的数据。由细胞毒性T细胞产生的IFN-γ对于施加肿瘤的免疫监视至关重要，免疫监视可直接抑制增殖并诱导一些恶性肿瘤在体内和体外的细胞凋亡。为了确定hK2 CAR修饰的人T细胞是否能够识别hK2(+)肿瘤细胞并被这些肿瘤细胞活化，将含有指定CAR克隆和对照未转导的T细胞(UTD)的原代T细胞与靶细胞系(LNCap/Hk2、LNCap、C4-2B、22Rv1或DU145细胞)共培养，并收集上清液以进行IFN-g浓度测量。如图所示，hK2 CAR修饰的T细胞在与表达hK2的LNCap/hK2细胞(甚至非常少的表达Hk2的C4-2B和LNCap细胞，但非hK2阴性DU145细胞)共培养期间分泌IFN-γ。未公开的对照CAR因比hK2高得多的抗原表达水平而分泌更大量的IFN-γ。示出了重复培养物的平均IFN-γ浓度±SD(pg/mL)。
图15示出CD107a脱粒测定法的结果，以评估hK2 CAR T细胞抗肿瘤活性。将靶细胞(5×104个)在96孔板中与每孔0.1mL中相等数目的效应子细胞共培养。对照孔仅含有T细胞。除了1μL/莫能菌素样品(BD Biosciences)之外，添加抗CD107a(每孔5μL)，并在37℃下温育4小时。将细胞用PBS洗涤两次，进行染色以用于hK2 CAR、CD3和CD8的表达，并在流式细胞仪BD Fortessa上分析。如图所示，Vcap细胞上hK2抗原的存在导致CD107A+hK2 CAR(+)T细胞增加，但hK2 CAR(-)和UTD T细胞不增加，如通过流式细胞术测量的，而在仅不经肿瘤细胞刺激的CAR T细胞中观察到仅背景染色(<2％)。佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)与离子霉素(eBioscienceTM细胞刺激混合物；500X)的组合是在该4小时细胞培养物模型中CD107a细胞表面表达的一致诱导剂，并用作阳性对照。示出代表性供体T细胞的结果，并且这些结果在多个供体中是可重现的。
图16A-图16D示出hK2 CAR T细胞增殖测定法的结果。hK2 CAR和未转导的(UTD)T细胞用CellTrace Violet(CTV；5μM)标记并与HK2(+)VCap细胞和HK2(-)DU145细胞共培养。共培养后五天，收获细胞并用CD3、CD25、Live/dead近红外染料和hK2 CAR染色。在配有Flowjo软件的Fortessa流式细胞仪上进行流式细胞术分析。通过活CD3鉴定淋巴细胞，并且确定具有CTV染料稀释和活化标志物CD25的CAR+T细胞的频率。通过在CD3+T细胞上进行门控，如图16A-图16B所示，hK2(+)Vcap细胞但非hK2(-)DU145细胞促进所有CAR构建体工程化T细胞的增殖和活化标志物CD25的上调，如图16C-图16D所示。CD3/28珠粒刺激T细胞，并且仅T细胞分别用作阳性对照和阴性对照。仅不经任何刺激的T细胞未增殖，并且CD3/28珠粒刺激的T细胞表现出等效的增殖模式。如图所示，在与VCap细胞共培养5天后，hK2 CAR+T细胞比CD3/28珠粒阳性对照更稳健地增殖。不同的CAR构建体工程化T细胞具有不同的增殖活性并且表现出不同的CAR+T细胞计数。对基于重复培养物的平均绝对细胞计数+/-SEM的增殖T细胞和表达CD25的T细胞的百分比的汇总示于图16B和图16D。
图17A示出mu11B6、hu11B6、KL2B357、KL2B358、KL2B359、KL2B360、HCF3和HCG5的VH结构域的序列对比。图17A分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4和SEQID NO:345。图17B示出受保护的片段映射到hK2抗原的序列上，以可视化通过HDX-MS鉴定的hK2抗体的结合表位。图17B分别以外观顺序公开了SEQ ID NO:351、SEQ ID NO:351、SEQ IDNO:351、SEQ ID NO:351、SEQ ID NO:351和SEQ ID NO:351。
具体实施方式
对示例性实施方案的描述如下：
本公开提供了嵌合抗原受体(CAR)(其靶向人激肽释放酶-2(hK2))、包含此类CAR的细胞，以及使用本文所述的CAR治疗癌症(例如前列腺癌或表达AR的乳腺癌)的方法。
本发明的CAR对hK2具有抗原特异性。如本文所用，短语“具有抗原特异性”和“引发抗原特异性应答”意味着CAR可以特异性地结合并且免疫识别抗原，使得CAR与hK2抗原的结合引发免疫应答。测试CAR的抗原特异性和识别靶细胞的能力的方法是本领域已知的。
本公开还提供了相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体或其抗原结合部分，以及与本发明的CAR相关的药物组合物。
下文仅出于说明性目的参考实施例描述本发明的若干方面。应当理解，阐述了许多具体的细节、关系和方法来提供对本发明的全面理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易认识到，本发明可以在没有一种或多种具体细节的情况下实施，或者可以用其他方法、方案、试剂、细胞系和动物实施。本发明不受动作或事件的所展示次序的限制，因为一些动作可以以不同的次序发生和/或与其他动作或事件同时发生。此外，并非所有展示的动作、步骤或事件都是实施根据本发明的方法所必需的。本文所述或引用的许多技术和规程是本领域的技术人员熟知的，并且通常由本领域的技术人员使用常规方法加以采用。
除非另外限定，否则本文所用的所有专门术语、符号和其他科学术语或专门用语均旨在具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或为了易于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文包含的这些定义不应必须被解释为表示与本领域通常理解的含义存在显著性的差别。还应当理解，术语(诸如常用词典中定义的那些)应当被解释为具有与其在相关领域的语境中的含义一致的含义和/或如本文另外所定义的含义。
当提供一个列表时，除非另行指出，否则应当理解，该列表中的每个单独元素和该列表的每种组合都是单独的实施方案。例如，作为“A、B或C”呈现的实施方案的列表将被理解为包括实施方案“A”、“B”、“C”、“A或B”、“A或C”、“B或C”或者“A、B或C”。
定义
如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。
过渡术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”旨在暗示它们在专利用语中的公认含义；即，(i)“包括”与“包含”、“含有”或“其特征在于”同义，并且是包括端值在内或末端开放的，并且不排除附加的、未列出的要素或方法步骤；(ii)“由……组成”排除权利要求书未指定的任何要素、步骤或成分；以及(iii)“基本上由……组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤“以及本质上不影响受权利要求书保护的发明的基本及新颖特征的材料或步骤”。还提供了以短语“包括”(或其等同形式)描述的实施方案，如以“由……组成”和“基本上由……组成”独立描述的那些实施方案。
“活化”或“刺激”是指诱导细胞的生物状态变化，导致活化标志物的表达、细胞因子产生、增殖或介导靶细胞的细胞毒性。细胞可由初级刺激信号活化。共刺激信号可扩增初级信号的量值并抑制初始刺激后的细胞死亡，从而导致更持久的活化状态和因此更高的细胞毒性能力。“共刺激信号”是指与初级信号(诸如TCR/CD3连接)组合的信号导致T细胞和/或NK细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。
“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”是指蛋白质的结合抗原的部分。抗原结合片段可以是合成的、可酶促获得的或经遗传工程改造的多肽，并且包括免疫球蛋白的结合抗原的部分，诸如VH、VL、VH和VL；Fab、Fab'、F(ab')2、Fd和Fv片段；由一个VH结构域或一个VL结构域组成的结构域抗体(dAb)；鲨鱼可变IgNAR结构域；驼峰化VH结构域；VHH结构域；由模拟抗体的CDR诸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3以及LCDR1、LCDR2和/或LCDR3的氨基酸残基组成的最小识别单元；结合抗原的另选支架；以及包含抗原结合片段的多特异性蛋白质。抗原结合片段(诸如VH和VL)可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单抗体设计，其中在VH和VL结构域由单独的单链表达的情况下，VH/VL结构域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合结构域，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体。抗原结合片段也可与其他抗体、蛋白质、抗原结合片段或另选支架缀合，这些其他抗体、蛋白质、抗原结合片段或另选支架可以是单特异性或多特异性的以工程改造双特异性和多特异性蛋白质。
“癌症”是指广泛的各种疾病，其特征在于身体中异常细胞的不受控制的生长。未受控制的细胞分裂和生长导致形成侵入相邻组织的恶性肿瘤，并且还可通过淋巴系统或血流转移到身体的远侧部分。“癌症”或“癌症组织”可包括肿瘤。
“全长抗体”由通过二硫键以及它们的多聚体(例如IgM)互连的两条重链(HC)和两条轻链(LC)构成。每条重链由重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域构成，重链恒定结构域由亚结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)构成。VH和VL可进一步细分为称作互补决定区(CDR)的超变区，间插有框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
“人抗体”是指当施用于人受试者时被优化以具有最小限度的免疫应答的抗体。人抗体的可变区来源于人免疫球蛋白序列。如果人抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也来源于人免疫球蛋白序列。如果人抗体的可变区由使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统获得，则该人抗体包含“来源于”人起源序列的重链可变区和轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。由于用于获得人抗体和人免疫球蛋白基因座的系统之间的差异，体细胞突变的引入或有意将置换引入框架或CDR中或两者，因此“人抗体”与在人中表达的免疫球蛋白相比通常包含氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可以包含由人框架序列分析得出的共有框架序列(例如，如Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296:57-86中所述)，或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如，如Shi等人，(2010)JMol Biol 397:385-96和国际专利公开WO2009/085462中所述)。“人抗体”的定义中不包括至少一个CDR来源于非人物种的抗体。
“人源化抗体”是指其中至少一个CDR来源于非人物种并且至少一个框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架中可包含置换，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。
“分离的”是指已从产生分子的系统(诸如重组细胞)的其他组分中基本上分离和/或纯化出来的分子(诸如合成多核苷酸或多肽)的同质群体，以及已经受至少一个纯化或分离步骤的蛋白质。“分离的”是指基本上不含其他细胞材料和/或化学物质的分子，并且涵盖分离至更高纯度(诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度)的分子。
“调节”是指当与由对照或媒介物介导的应答相比时，测试分子介导增强或降低的 应答的增强或降低的能力(即，下游效应)。
“自然杀伤细胞”和“NK细胞”在本文中可互换使用并且在本文中同义使用。NK细胞是指具有CD16+CD56+和/或CD57+TCR-表型的分化淋巴细胞。NK细胞的特征在于其能够给通过活化特异性溶细胞酶来结合并杀死不能表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞，能够杀死表达NK活化受体的配体的肿瘤细胞或其他患病细胞，并且能够释放称为刺激或抑制免疫应答的细胞因子的蛋白质分子。
“特异性结合”或“结合”是指蛋白质类分子以比对其他抗原更大的亲和力与抗原或抗原内的表位结合。通常，蛋白质类分子以约1×10-7M或更小(例如约5×10-8M或更小、约1×10-8M或更小、约1×10-9M或更小、约1×10-10M或更小、约1×10-11M或更小或者约1×10-12或更小)的平衡解离常数(KD)与抗原或抗原内的表位结合，通常KD比其与非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的KD小至少一百倍。在本文所述的前列腺新抗原的上下文中，“特异性结合”是指蛋白质类分子与前列腺新抗原的结合，而没有与新抗原为其变体的野生型蛋白质的可检测结合。
“肿瘤细胞”或“癌细胞”是指在体内、离体或组织培养物中的癌性、癌前或转化的细胞，其具有自发或诱导的表型变化。这些变化未必涉及新遗传物质的摄取。然而转化可由感染转化病毒以及结合新基因组核酸、摄取外源核酸而发生，或者其也可自发地发生或在暴露于致癌物之后发生，从而使内源基因突变。转化/癌症示例为合适的动物宿主(诸如裸小鼠等)中体外、体内和离体的形态变化、细胞永生、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性肿瘤、肿瘤特异性标志物水平调节、侵入、肿瘤生长。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”被定义为细胞表面受体，该细胞表面受体包含细胞外靶结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，全部这些结构域的组合是在单个蛋白质上非天然地一起存在。这具体地包括其中细胞外结构域和细胞内信号传导结构域在单个受体蛋白质上非天然地一起存在的受体。本发明的嵌合抗原受体主要旨在与淋巴细胞诸如T细胞和自然杀伤(NK)细胞一起使用。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”是可互换的，并且在本文中同义使用。如本文所用，T细胞包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助性(Th)细胞，例如T辅助性1(Th1)或T辅助性2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)、CD4+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、肿瘤浸润性细胞毒性T细胞(TIL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞或T细胞的任何其他亚群。适用于特定实施方案的T细胞的其他例示性群体包括初始T细胞和记忆T细胞。还包括“NKT细胞”，是指表达半不变αβT细胞受体但也表达通常与NK细胞相关联的多种分子标志物(诸如NK1.1)的特化T细胞群。NKT细胞包括NK1.1+细胞和NK1.1-细胞，以及CD4+细胞、CD4-细胞、CD8+细胞和CD8-细胞。NKT细胞上的TCR的独特之处在于它识别由MHC I样分子CD Id递呈的糖脂抗原。由于NKT细胞能够产生促进炎症或免疫耐受的细胞因子，因此它们可具有保护作用或有害作用。还包括“γ-δT细胞(γδT细胞)”，是指特化的群体，即在其表面上具有独特TCR的T细胞的小子集，并且与其中TCR由被命名为α-TCR链和β-TCR链的两种糖蛋白链组成的大多数T细胞不同，γδT细胞中的TCR由γ-链和δ-链组成。γδT细胞可以在免疫监视和免疫调节中起作用，并且被发现是IL-17的重要来源且诱导强烈的CD8+细胞毒性T细胞应答。还包括“调节性T细胞”或“Treg”，它们是指抑制异常或过度免疫应答并在免疫耐受中起作用的T细胞。Treg通常是转录因子Foxp3-阳性CD4+T细胞，并且还可包括转录因子Foxp3-阴性调节性T细胞，它们是产生IL-10的CD4+T细胞。
术语“自然杀伤细胞”和“NK细胞”是可互换的并且在本文中同义使用。如本文所用，NK细胞是指具有CD 16+CD56+和/或CD57+TCR-表型的分化淋巴细胞。NK细胞的特征在于其能够给通过活化特异性溶细胞酶来结合并杀死不能表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞，能够杀死表达NK活化受体的配体的肿瘤细胞或其他患病细胞，并且能够释放称为刺激或抑制免疫应答的细胞因子的蛋白质分子。
如本文所用，术语“抗原”是指能够被T细胞受体结合的任何试剂(例如，蛋白质、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸、它们的部分或它们的组合)分子。抗原也能够引起免疫应答。免疫应答的示例可涉及但不限于抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或这两者。技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可通过合成方式生成或者可来源于生物样品，或者可以是除了多肽之外的大分子。此类生物样品可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体、生物体、蛋白质/抗原的亚基、杀死或灭活的全细胞或溶解物。
术语“抗体”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、细胞内抗体、微抗体、双抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如抗原特异性TCR的抗Id抗体)和上述抗体中任一者的表位结合片段。术语“抗体”也指共价双抗体，诸如美国专利申请公布2007/0004909中公开的那些；和Ig-DARTS，诸如美国专利申请公布2009/0060910中公开的那些。可用作TCR结合分子的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1和IgA2)或亚类的。
术语“宿主细胞”意指含有异源核酸的任何细胞。异源核酸可以是载体(例如，表达载体)。例如，宿主细胞可以是来自任何生物体的细胞，该细胞以任何方式选择、修饰、转化、生长、使用或操纵，以用于由细胞产生物质，例如由基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶的细胞表达。可以确定适当的宿主。例如，可以基于载体骨架和期望的结果来选择宿主细胞。以举例的方式，可以将质粒或粘粒引入原核宿主细胞中以复制若干类型的载体。细菌细胞(诸如但不限于DH5α、JM109和KCB)、感受态细胞和SOLOPACK Gold细胞可用作宿主细胞，以用于载体复制和/或表达。另外，细菌细胞诸如大肠杆菌LE392可用作针对噬菌体病毒的宿主细胞。可用作宿主细胞的真核细胞包括但不限于酵母(例如，YPH499、YPH500和YPH501)、昆虫和哺乳动物。用于载体的复制和/或表达的哺乳动物真核宿主细胞的示例包括但不限于HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、COS、CHO、Saos和PC12。
本公开的宿主细胞包括T细胞和自然杀伤细胞，这些细胞含有编码CAR的DNA或RNA序列并在细胞表面上表达CAR。宿主细胞可用于增强T细胞活性、自然杀伤细胞活性、癌症的治疗和自身免疫疾病的治疗。
“活化”或“刺激”意指诱导细胞的生物状态变化，通过该变化，细胞(例如T细胞和NK细胞)表达活化标志物，产生细胞因子、增殖和/或变得对靶细胞具有细胞毒性。所有这些变化都可由初级刺激信号产生。共刺激信号可扩增初级信号的量值并抑制初始刺激后的细胞死亡，从而导致更持久的活化状态和因此更高的细胞毒性能力。“共刺激信号”是指与初级信号(诸如TCR/CD3连接)组合的信号导致T细胞和/或NK细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。
术语“增殖”是指细胞分裂(细胞的对称或不对称分裂)增加。术语“扩增”是指细胞分裂和细胞死亡的结果。
术语“分化”是指降低细胞的效能或增殖或者使细胞进入发育更受限状态的方法。
术语“表达”意指允许或引起基因或DNA序列中的信息产生，例如通过激活相应基因或DNA序列的转录和翻译中所涉及的细胞功能来产生蛋白质。DNA序列在细胞中或通过细胞表达以形成“表达产物”，诸如蛋白质。据说表达产物本身(例如所得蛋白质)也可被细胞“表达”。表达产物可表征为细胞内、细胞外或跨膜的。
术语“转染”意指使用重组DNA技术将“外来”(即，外在或细胞外)核酸引入细胞中。术语“基因修饰”意指将“外来”(即，外在或细胞外)基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞，使得宿主细胞将表达所引入的基因或序列以产生期望的物质(通常是由所引入的基因或序列编码的蛋白质或酶)。所引入的基因或序列也可被称为“克隆”或“外来”基因或序列，可包括可操作地连接至编码嵌合抗原受体的多核苷酸的调节序列或对照序列，诸如由细胞的遗传机制使用的启动序列、终止序列、启动子、信号、分泌序列或其他序列。基因或序列可包括不具有已知功能的非功能性序列。接受和表达所引入的DNA或RNA的宿主细胞已经过“遗传工程改造”。引入宿主细胞的DNA或RNA可来自任何来源，包括与宿主细胞相同的属或物种的细胞，或来自不同的属或物种的细胞。
术语“转导”意指使用病毒载体将外来核酸引入细胞中。
术语“调控元件”是指控制核酸序列表达的一些方面的任何顺式作用遗传因子。在一些实施方案中，术语“启动子”基本上包括引发转录所需的最小序列。在一些实施方案中，术语“启动子”包括启动转录的序列，另外还包括可分别上调或下调转录的序列，通常被称为“增强子元件”和“阻遏子元件”。
如本文所用，当参考核酸或氨基酸使用时，术语“可操作地连接”和类似的短语是指分别以彼此的功能关系放置的核酸序列或氨基酸序列的操作连接。例如，可操作地连接的启动子、增强子元件、开放阅读框、5'和3'UTR、和终止子序列导致核酸分子(例如，RNA)的准确产生。在一些实施方案中，可操作地连接的核酸元件导致开放阅读框的转录并最终产生多肽(即，开放阅读框的表达)。又如，可操作地连接的肽是其中功能结构域距彼此适当距离放置以赋予每个结构域的预期功能的一种肽。
“增强”或“促进”或“增加”或“扩增”或“改善”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的应答相比，本文设想的组合物产生、引发或引起更大生理应答(即，下游效应)的能力。可测量的生理应答可包括T细胞扩增、活化、效应功能、持久性的增加，和/或癌细胞死亡杀伤能力的增加，以及从本领域的理解和本文的描述中显而易见的应答等。在某些实施方案中，“增加的”或“增强的”量可以是“统计意义上显著的”量，并且可包括比由媒介物或对照组合物产生的应答增加1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括其间和高于1的所有整数和小数点，例如1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍等)。
“降低”或“下降”或“减少”或“减小”或“减弱”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的应答相比，本文设想的组合物产生、引发或引起更小生理应答(即，下游效应)的能力。在某些实施方案中，“降低的”或“减少的”量可以是“统计意义上显著的”量，并且可包括比由媒介物、对照组合物产生的应答(参考应答)或特定细胞谱系中的应答降低1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括其间和高于1的所有整数和小数点，例如1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8等)。
应用于剂量或量的术语“有效”是指在向有需要的受试者施用时足以产生期望活性的化合物或药物组合物的量。需注意，当施用活性成分的组合时，该组合的有效量可包括或可不包括如果单独施用的话能够有效的每种成分的量。取决于受试者的物种、年龄和一般状况、所治疗病症的严重程度、所采用的特定药物、施用模式等，所需的确切量将因受试者而异。
与本文所述的组合物结合使用的短语“药学上可接受的”是指分子实体和此类组合物的生理学上耐受并当施用给哺乳动物(例如人类)时通常不会产生不良反应的其他成分。优选地，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的监管机构批准的或者在美国药典或其他公认的药典中列出的用于在哺乳动物，并且更具体地在人类中使用的。
本文使用的术语“蛋白质”涵盖所有种类的天然存在的和合成的蛋白质，包括所有长度的蛋白质片段、融合蛋白质和修饰的蛋白质，包括但不限于糖蛋白以及所有其他类型的修饰的蛋白质(例如由磷酸化、乙酰化、豆蔻酰化、棕榈酰化、糖基化、氧化、甲酰化、酰胺化、聚谷氨酰化、ADP-核糖基化、聚乙二醇化、生物素化等得到的蛋白质)。
除非另有说明，否则术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”涵盖DNA和RNA两者。“核酸序列”或“核苷酸序列”意指编码氨基酸的核酸序列；这些术语也可指这样的核酸序列，该核酸序列包括编码作为克隆制品添加的任何氨基酸的部分，包括由接头编码的任何氨基酸。
术语“载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类药用载体可以是无菌的液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或水溶液盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液优选地用作载体，尤其是注射溶液。另选地，载体可以是固体剂型载体，包括但不限于粘结剂(用于压缩丸剂)、助流剂、包囊剂、风味剂和着色剂中的一者或多者。合适的药用载体描述于由E.W.Martin编写的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中。
术语“约”或“大约”包括在统计学上有意义的值范围内。此类范围可以在给定值或范围的数量级内，优选地在50％以内，更优选地在20％以内，仍更优选地在10％以内，并且甚至更优选地在5％以内。由术语“约”或“大约”涵盖的允许偏差取决于研究中的特定系统，并且可容易由本领域普通技术人员理解。
“激肽释放酶相关肽酶2”、“hK2”或“klk2”是指已知的蛋白质，其也被称为激肽释放酶2、腺激肽释放酶2或HK2。hK2作为原前蛋白产生并在蛋白水解期间裂解以生成活性蛋白酶。所有hK2亚型和变体均涵盖在“hK2”中。各种亚型的氨基酸序列可从GenBank登录号NP_005542.1、NP_001002231.1和NP_001243009检索。全长hK2的氨基酸序列示出在SEQ IDNO:62中。序列包括信号肽(残基1-18)和前肽区(残基19-24)。
应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。如本文所用，除非上下文另外明确地指出，否则不定冠词“一个”、“一种”和“该”应当被理解为包括复数指代。
嵌合抗原受体
本发明整体涉及经基因修饰以稳定表达所需的嵌合抗原受体的T细胞的用途。嵌合抗原受体(CAR)是人工构建的杂合蛋白或多肽，其含有与T细胞信号传导结构域连接的抗体(scFv)的抗原结合结构域。CAR的特性可以包括它们能够以非MHC限制性方式将T细胞特异性和反应性重定向至所选靶标，从而利用单克隆抗体的抗原结合性质。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的T细胞不依赖于抗原加工而识别抗原的能力，因此绕过了肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)的α链和β链二聚化。
本文所述的CAR提供重组多肽构建体，所述重组多肽构建体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(在本文中也称为“细胞质信号传导结构域”)，该细胞内信号传导结构域包括来源于如下定义的刺激分子的功能性信号传导结构域。表达CAR的T细胞在本文中称为CAR T细胞、CAR-T细胞或经CAR修饰的T细胞，并且这些术语在本文中可互换使用。该细胞可以经基因修饰以在其表面上稳定地表达抗体结合结构域，从而赋予不依赖MHC的新型抗原特异性。
在一些情况下，T细胞经基因修饰以稳定地表达CAR，该CAR将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3-ζ链或FcγRI蛋白的细胞内结构域组合成单个嵌合蛋白。在一个实施方案中，刺激分子是与T细胞受体复合物缔合的ζ链。
如本文所用，术语“细胞内信号传导结构域”或“细胞质信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。蛋白质的功能性部分通过在细胞内传递信息起作用，以通过产生第二信使经由限定的信号传导通路调节细胞活性，或者通过响应于此类信使而起到效应子的作用。细胞内信号传导结构域产生促进含有CAR的细胞(例如，CAR-T细胞)的免疫效应子功能的信号。免疫效应子功能的示例(例如，在CAR-T细胞中)包括细胞溶解活性和辅助活性，包括分泌细胞因子。
在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包括初级细胞内信号传导结构域。示例的初级细胞内信号传导结构域包括来源于负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包括共刺激细胞内结构域。示例的共刺激细胞内信号传导结构域包括来源于负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，就CAR-T而言，初级细胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包含来自共受体或共刺激分子的细胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可以包含信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。包含ITAM的初级细胞质信号传导序列的示例包括但不限于来源于CD3-ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d DAP10以及DAP12的那些。
术语“ζ”或者替代性地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”被定义为以GenBank登录号BAG36664.1提供的蛋白质，或者来自非人物种(例如，鼠、兔、灵长类、小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基，并且“ζ刺激结构域”或者替代性地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”被定义为来自ζ链的细胞质结构域的足以在功能上传递T细胞活化所必需的初始信号的氨基酸残基。有时，例如，在本公开的方面和/或实施方案中，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”也称为“初级信号传导结构域”。在一个方面，CD3-ζ刺激结构域的细胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164，或者来自非人物种(例如小鼠、啮齿类、猴、猿等)的为其功能直系同源物的等同残基。在一个优选的实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ刺激结构域。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是作为SEQ IDNO:28提供的序列，或与SEQ ID NO:28具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性地结合，从而介导T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC 1类分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。
共刺激细胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。共刺激分子可以表示在下列蛋白质家族中：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞性活化分子(SLAM蛋白)和活化NK细胞受体。此类分子的示例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、MyD88、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3，以及与CD83特异性结合的配体，等等。
细胞内信号传导结构域可以包含其来源分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能片段。
术语“4-1BB”或另选地“CD137”是指TNFR超家族的成员，其具有作为GenBank登录号AAA62478.2提供的氨基酸序列，或者来自非人物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214至255，或者来自非人物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。有时，例如，在本公开的方面和/或实施方案中，“4-1BB共刺激结构域”也称为“共刺激结构域”。
在一个优选的实施方案中，细胞内信号传导结构域包括共刺激细胞内信号传导结构域，其中共刺激细胞内信号传导结构域是4-1BB共刺激结构域或“CD137共刺激结构域”。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”或“CD137共刺激结构域”是作为SEQ ID NO:27提供的序列，或者来自非人物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基，或者与SEQ ID NO:27具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个优选的实施方案中，4-1BB共刺激结构域是作为SEQ ID NO:27提供的序列。
在一个实施方案中，使用与CAR中的一个结构域天然缔合的跨膜结构域。在另一个实施方案中，跨膜结构域可以通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免此类结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。在一个示例的实施方案中，跨膜结构域包括CD8α铰链结构域。在一个实施方案中，CAR包含CD8α铰链结构域和CD8α跨膜结构域。
在一些实施方案中，细胞质信号传导结构域还包含一个或多个来源于至少一个如本文所定义的共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，共刺激分子选自4-1BB(即CD137)、CD27、CD3-ζ和/或CD28。CD28是在T细胞共刺激中很重要的T细胞标记物。CD27是肿瘤坏死因子受体超家族的成员并且充当共刺激免疫检查点分子。4-1BB将强效共刺激信号传递给T细胞，从而促进T淋巴细胞分化并且增强T淋巴细胞的长期存活。CD3-ζ与TCR缔合以产生信号，并且包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。在另一个实施方案中，共刺激分子是MyD88或CD40。
在一个实施方案中，CAR包含细胞内铰链结构域和细胞内T细胞受体信号传导结构域，其中细胞内铰链结构域包括CD8，细胞内T细胞受体信号传导结构域包括CD28、4-1BB和CD3-ζ。在另一个实施方案中，CAR包含细胞内铰链结构域和细胞内T细胞受体信号传导结构域，该细胞内T细胞受体信号传导结构域包括CD28、4-1BB和CD3-ζ，其中铰链结构域包括CD8、CD4或CD28的细胞外区的全部或部分；抗体恒定区的全部或部分；FcyRIIIa受体、IgG铰链、IgM铰链、IgA铰链、IgD铰链、IgE铰链或Ig铰链的全部或部分。IgG铰链可来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1、IgA2、IgD、IgE或它们的嵌合体。
本文所述的CAR提供重组多肽构建体，所述重组多肽构建体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(在本文中也称为“细胞质信号传导结构域”)，该细胞内信号传导结构域包括例如来源于如下定义的刺激分子的功能性信号传导结构域。
在一个实施方案中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包括来源于刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包括来源于共刺激分子的功能性信号传导结构域和来源于刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包括来源于一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域以及来源于刺激分子的功能性信号传导结构域。
本发明的CAR可以被设计成自身包含CD28信号传导结构域和/或4-1BB信号传导结构域，或者与可用于本发明的CAR的语境中的任何其他期望的细胞质结构域组合。在一个实施方案中，CAR的细胞质结构域可以还包含信号传导结构域CD3-ζ。例如，CAR的细胞质结构域可以包括但不限于CD3-ζ、4-1BB和CD28信号传导模块，以及它们的组合。
在一个实施方案中，CAR包含铰链结构域和细胞内信号传导结构域，其中铰链结构域包括CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域，细胞内信号传导结构域包括4-1BB和CD3-ζ。在一个实施方案中，CAR包含铰链结构域和细胞内信号传导结构域，其中铰链结构域包括CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域，细胞内信号传导结构域包括CD28、4-1BB和CD3-ζ。
在另一个实施方案中，CAR包含CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包括信号传导结构域CD3-ζ和4-1BB共刺激结构域。
在另一个实施方案中，CAR包含：CD8a铰链区，该CD8a铰链区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；跨膜结构域，该跨膜结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域和初级信号传导结构域，该共刺激结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，该初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
因此，本发明提供了CAR T细胞及其用于过继疗法的方法。
本公开还提供了本文所述的CAR、核酸、多肽和蛋白质的变体，例如功能性变体。“变体”是指因一处或多处修饰(例如，置换、插入或缺失)而不同于参考多肽或参考多核苷酸的多肽或多核苷酸。如本文所用，术语“功能性变体”是指与亲本CAR、多肽或蛋白质具有实质或显著的序列同一性或相似性的CAR、多肽或蛋白质，该功能性变体保留了它为其变体的CAR、多肽或蛋白质的生物活性。功能性变体涵盖例如本文所述的CAR、多肽或蛋白质(亲本CAR、多肽或蛋白质)的那些变体，所述变体保留了以与亲本CAR、多肽或蛋白质相似的程度、相同的程度或更高的程度识别靶细胞的能力。关于亲本CAR、多肽或蛋白质，该功能性变体可以例如与亲本CAR、多肽或蛋白质的氨基酸序列具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的同一性。
本文中，多肽的结构在基于与所述参考序列(具有给定的SEQ ID NO)的％序列同一性所定义的位置上。在该语境中，两条氨基酸序列之间的％序列同一性可以通过比较以最佳方式比对的这两条序列来确定，并且其中待比较的氨基酸序列可以包含相对于参考序列的添加或缺失，以用于这两条序列之间的最佳比对。同一性百分比通过如下方式计算：确定两条序列之间氨基酸残基相同的相同位置的数目，将相同位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并且将所得结果乘以100，以便获得这两条序列之间的同一性百分比。通常，比较窗口对应于被比较序列的全长。例如，可以使用BLAST程序，“BLAST 2序列”(Tatusova等人，“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotidesequences”，FEMS Microbiol Lett.174:247-250)，其可在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上获得，所使用的参数是默认给出的那些参数(特别是对于参数“开放空位罚分”：5，和“延伸空位罚分”：2；所选择的矩阵为例如由程序推荐的矩阵“BLOSUM 62”)，待比较的两条序列之间的同一性百分比由程序直接计算。确定查询序列与参考序列的序列同一性在技术人员的能力范围内，并且可以使用可商购获得的分析软件(诸如BLASTTM)进行。
功能性变体可以例如包含具有至少一个保守氨基酸取代的亲本CAR、多肽或蛋白质的氨基酸序列。在另一个实施方案中，功能性变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本CAR、多肽或蛋白质的氨基酸序列。在这种情况下，非保守氨基酸取代可以不干扰或抑制功能性变体的生物活性。非保守氨基酸取代可以增强功能性变体的生物活性，使得功能性变体的生物活性相比于亲本CAR、多肽或蛋白质增加。
本发明的CAR的氨基酸取代可以是保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是本领域已知的，并且包括其中具有特定的物理性质和/或化学性质的一种氨基酸被替换为具有相同或相似的化学性质或物理性质的另一种氨基酸的氨基酸取代。例如，保守氨基酸取代可以是酸性氨基酸被另一种酸性氨基酸(例如，Asp或Glu)取代、具有非极性侧链的氨基酸被另一种具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)取代、碱性氨基酸被另一种碱性氨基酸(Lys、Arg等)取代、具有极性侧链的氨基酸被另一种具有极性侧链的氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)取代，等等。
该CAR、多肽或蛋白质可以基本上由本文所述的一种或多种指定氨基酸序列组成，使得其他组分(例如其他氨基酸)不会实质上改变功能性变体的生物活性。
本公开的实施方案的CAR、多肽和蛋白质(包括功能性部分和功能性变体)可以具有任何长度，即，可以包含任何数量的氨基酸，前提条件是该CAR、多肽或蛋白质(或其功能性部分或功能性变体)保持其生物活性，例如特异性地结合抗原、检测宿主中的患病细胞(例如癌细胞)或者治疗或预防宿主中的疾病等的能力。例如，该多肽的长度可以为约50个至约5000个氨基酸，诸如约50个、约70个、约75个、约100个、约125个、约150个、约175个、约200个、约225个、约250个、约275个、约300个、约325个、约350个、约375个、约400个、约425个、约450个、约475个、约500个、约525个、约550个、约575个、约600个、约625个、约650个、约675个、约700个、约725个、约750个、约775个、约800个、约825个、约850个、约875个、约900个、约925个、约950个、约975个、约1000个或更多个氨基酸。本发明的多肽还包括低聚肽。
本发明的实施方案的CAR、多肽和蛋白质(包括本发明的功能性部分和功能性变体)可以包含替代一种或多种天然存在的氨基酸的合成氨基酸。此类合成氨基酸是本领域已知的，并且包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-羟脯氨酸和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、α-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、N'-苄基-N'-甲基-赖氨酸、N',N'-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺和α-叔丁基甘氨酸。
本发明的实施方案的CAR、多肽和蛋白质(包括功能性部分和功能性变体)可以经受翻译后修饰。它们可以被糖基化、酯化、N-酰化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、经由例如二硫桥环化，或者转化成酸加成盐。在一些实施方案中，它们是二聚的或聚合的，或者缀合的。
本发明的实施方案的CAR、多肽和/或蛋白质(包括其功能性部分和功能性变体)可以通过本领域已知的方法获得。从头合成多肽和蛋白质的合适方法在诸如下列的参考文献中有所描述：Chan等人，“Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”，Oxford UniversityPress,Oxford,United Kingdom，2000年；“Peptide and Protein Drug Analysis”，Reid,R.编辑，Marcel Dekker,Inc.，2000年；和Epitope Mapping，Westwood等人编辑，OxfordUniversity Press,Oxford,United Kingdom,2001。另外，可以使用标准重组方法，使用本文所述的核酸来重组产生多肽和蛋白质。参见例如Sambrook等人，“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”，第3版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，2001年；以及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and John Wiley&Sons,NY,1994。另外，本发明的CAR、多肽和蛋白质中的一些(包括其功能性部分和功能性变体)可以从诸如植物、细菌、昆虫、哺乳动物等来源分离和/或纯化。分离和纯化的方法是本领域已知的。替代性地，本文所述的CAR、多肽和/或蛋白质(包括其功能性部分和功能性变体)可以商业合成。在这方面，所述CAR、多肽和蛋白质可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
可以用于生成用于产生本文所述多肽的重组核酸的经修饰核苷酸的示例包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基喹啉、5″-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
该核酸可以包含任何分离的或纯化的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码CAR、多肽或蛋白质或者其功能性部分或功能性变体中的任一者。替代性地，该核苷酸序列可以包括与所述序列中的任一者简并的核苷酸序列或者简并序列的组合。
本发明的一些实施方案还提供了分离的或纯化的核酸，其包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或者在严格条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列可以在高严格条件下杂交。所谓“高严格条件”，意味着核苷酸序列以可检测到的比非特异性杂交更强的量与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高严格条件包括将具有精确互补序列的多核苷酸，或仅含有少量分散错配的多核苷酸与恰好具有与该核苷酸序列匹配的少量小区域(例如3个至12个碱基)的随机序列区分开的条件。这种小的互补区域比14个至17个或更多个碱基的全长互补序列更容易解链，并且高严格杂交使得它们能够容易区分。相对高严格条件将包括例如低盐条件和/或高温条件，诸如在约50℃至70℃的温度下由约0.02M NaCl至0.1M NaCl或等同物提供的。此类高严格条件容许核苷酸序列与模板或靶链之间的极少(如果有的话)错配，并且特别适用于检测本文所述的任何CAR的表达。一般认为，通过添加增量的甲酰胺可以使条件更严格。
在一个实施方案中，可以将本发明的核酸掺入到重组表达载体中。本公开提供了包含本发明的任何核酸的重组表达载体。如本文所用，术语“重组表达载体”意味着下述经基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体：当该构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列，并且载体在足以使所述mRNA、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下与宿主细胞接触时，其允许宿主细胞表达所述mRNA、蛋白质、多肽或肽。本文所述的载体整体上不是天然存在的；然而，这些载体的部分可以是天然存在的。所述重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链或双链的、合成的或部分地从天然来源获得的，并且其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸。所述重组表达载体可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间键，或这两种类型的键。非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间键不妨碍载体的转录或复制。
在一个实施方案中，本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括被设计用于增殖和扩增或用于表达或这两者的那些，诸如质粒和病毒。载体可以选自由以下项组成的组：pUC系列(Fermentas Life Sciences,Glen Burnie,Md.)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,Calif.)、pET系列(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,Calif.)。可以使用噬菌体载体，诸如λGT10、λGT11、λEMBL4和λNM1149、λZapII(Stratagene)。植物表达载体的示例包括pBI01、pBI01.2、pBI121、pBI101.3和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的示例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。重组表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒载体。
在一个实施方案中，使用例如Sambrook等人(出处同上)和Ausubel等人(出处同上)中所述的标准重组DNA技术来制备本发明的重组表达载体。可以制备环状或线性的表达载体构建体，以包含在原核或真核宿主细胞中有功能的复制系统。复制系统可来源于例如ColE1、SV40、2μ质粒、λ、牛乳头状瘤病毒等。
重组表达载体可以包含调控序列，诸如转录和翻译起始密码子和终止密码子，所述调控序列对于载体将被适当地引入其中的宿主类型(例如，细菌、植物、真菌或动物)具有特异性，并且考虑该载体是基于DNA的还是基于RNA的。
重组表达载体可以包含一种或多种标记物基因，其允许选择转化的或转染的宿主。标记基因包括杀生物剂抗性(例如对抗生素、重金属等的抗性)、营养缺陷型宿主中提供原养型的互补作用等等。用于所述表达载体的合适标记物基因包括例如新霉素/G418抗性基因、组氨醇x抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
该重组表达载体可以包含可操作地连接至编码所述CAR、多肽或蛋白质(包括其功能性部分和功能性变体)的核苷酸序列，或者可操作地连接至与编码所述CAR、多肽或蛋白质的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列的天然或标准启动子。启动子(例如强启动子、弱启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子和发育特异性启动子)的选择在普通技术人员的技能范围内。类似地，将核苷酸序列与启动子组合也在技术人员的技能范围内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如细胞巨化病毒(CMV)启动子、RSV启动子、SV40启动子，或在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。
可将重组表达载体设计用于瞬时表达、用于稳定表达或用于两者。而且，可将重组表达载体制备用于组成型表达或用于诱导型表达。
另外，可以将重组表达载体制备成包括自杀基因。如本文所用，术语“自杀基因”是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予表达该基因的细胞对试剂例如药物敏感并且在细胞与试剂接触或暴露于试剂时导致细胞死亡的基因。自杀基因是本领域已知的，包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
包括在本发明范围内的是包含下述各项中的任一者的缀合物(例如生物缀合物)：CAR、多肽或蛋白质(包括其功能性部分或功能性变体中的任一者)、宿主细胞、核酸、重组表达载体、宿主细胞群体，或者抗体或其抗原结合部分。一般来讲，缀合物以及合成缀合物的方法是本领域已知的(参见例如Hudecz,F.，Methods Mol.Biol.，第298卷，第209-223页，2005年和Kirin等人，Inorg Chem.，第44卷第15期，第5405-5415页，2005年)。
本发明的一个实施方案还提供了抗体或其抗原结合部分，其结合(例如，特异性结合)至本发明的CAR的表位。
该抗体可以是本领域已知的任何类型的免疫球蛋白。免疫球蛋白可以被分为五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG被进一步分为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。脊椎动物物种的抗体轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被指定为两种类型即κ和λ中的一种。抗体可以是任何类型或同种型。
抗体包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)、多克隆抗体、抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体，单体抗体、二聚抗体、四聚抗体或多聚抗体，单链抗体、结构域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。抗体可以是天然存在的抗体，例如从哺乳动物(例如鼠、灵长类、小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等)分离和/或纯化的抗体。替代性地，抗体可以是工程化(例如，基因工程化)的抗体。
人源化抗体具有来源于非人物种的抗原结合位点并且可变区框架来源于人免疫球蛋白序列。人抗体具有重链可变区和轻链可变区，其中框架和抗原结合位点均来源于人起源的序列。
另外，该抗体可以对CAR的功能性部分具有任何水平的亲和力或亲合力。在一些实施方案中，抗体可以以一系列亲和力(KD)结合hK2抗原。在根据本发明的一个实施方案中，并且在下文列出的带有编号的实施方案的每一者中的一些实施方案中，抗体以高亲和力结合hK2抗原，例如，由表面等离子体共振或Kinexa方法确定，KD等于或小于约10-7M，诸如但不限于1至9.9(或者其中的任何范围或值，诸如1、2、3、4、5、6、7、8或9)×10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或者其中的任何范围或值，如本领域的技术人员所实践。一种示例的亲和力等于或小于1×10-8M。另一种示例的亲和力等于或小于1×10-9M。
测试抗体结合CAR的任何功能性部分的能力的方法是本领域已知的，并且包括任何抗体-抗原结合测定，诸如放射性免疫测定(RIA)、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀和竞争性抑制测定。
制备抗体的合适方法是本领域已知的。例如，标准杂交瘤方法在以下文献中有所描述：例如和Milstein，Eur.J.Immunol.,5,511-519(1976)，Harlow和Lane(编辑)，Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press(1988)，以及C.A.Janeway等人(编辑)，Immunobiology，第5版，Garland Publishing,New York,N.Y.(2001))。替代性地，其他方法诸如EBV杂交瘤方法(Haskard和Archer，J.Immunol.Methods,74(2),361-67(1984)以及Roder等人，Methods Enzymol.,121,140-67(1986))以及噬菌体载体表达系统(参见例如Huse等人，Science,246,1275-81(1989))是本领域已知的。另外，在非人动物中产生抗体的方法在例如美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美国专利申请公布2002/0197266A1中有所描述。
噬菌体展示也可以用于产生抗体。就这一点而言，编码抗体的抗原结合可变(V)结构域的噬菌体文库可以使用标准分子生物学技术和重组DNA技术产生(参见例如Sambrook等人(出处同上)和Ausubel等人(出处同上))。选择编码具有期望的特异性的可变区的噬菌体，用于与期望的抗原(即，hK2)特异性结合，并且重建包含所选可变结构域的完整或部分抗体。将编码重建抗体的核酸序列引入合适的细胞系(诸如用于产生杂交瘤的骨髓瘤细胞)中，使得具有单克隆抗体特性的抗体由该细胞分泌(参见例如，Janeway等人(出处同上)、Huse等人(出处同上)和美国专利号6,265,150)。
抗体可以由转基因小鼠产生，所述转基因小鼠对于特定的重链免疫球蛋白基因和轻链免疫球蛋白基因是转基因的。此类方法是本领域已知的，并且描述于例如美国专利5,545,806和5,569,825以及Janeway等人(出处同上)中。
用于产生人源化抗体的方法是本领域已知的，并且描述于例如Janeway等人(出处同上)，美国专利5,225,539、5,585,089和5,693,761，欧洲专利0239400B1，以及英国专利2188638中。人源化抗体也可以使用描述于美国专利5,639,641和Pedersen等人，J.Mol.Biol.,235,959-973(1994)中的抗体表面重建技术产生。
如本文所用，抗体可以是多链或单链的，或完整的免疫球蛋白，并且可以来源于天然来源或重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指保留亲本全长抗体的抗原结合性质的完整抗体或其重组变体的至少一部分。它是指例如抗原结合结构域，例如，完整抗体的抗原决定可变区，其足以赋予识别和结合，例如抗体片段与靶标(诸如抗原)的特异性结合。“抗原结合片段”是指免疫球蛋白分子的一部分。抗体片段的示例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，单链抗体(scFv)、线性抗体、单结构域抗体诸如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“scFv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的蛋白质。在一些实施方案中，轻链可变区和重链可变区经由短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留了其来源完整抗体的特异性。除非另外指明，否则如本文所用，scFv可以具有任一顺序的VL可变区和VH可变区，例如，相对于多肽的N末端和C末端，该scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
本发明的一个实施方案还提供了本文所述抗体中的任一者的抗原结合部分。该抗原结合部分可以是具有至少一个抗原结合位点的任何部分，诸如Fab、F(ab')2、dsFv、sFv、双抗体和三抗体。
在一些实施方案中，抗原结合片段为重链互补决定区(HCDR)1、2和/或3，轻链互补决定区(LCDR)1、2和/或3，重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)，Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段，以及包含(例如，由下列中的任一者组成)一个VH结构域或一个VL结构域的结构域抗体(dAb)。VH结构域和VL结构域可以经由接头(例如合成接头)连接在一起。
“互补决定区(CDR)”是抗体中的抗原结合位点。CDR可以使用各种术语来定义：(i)三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的互补决定区(CDR)基于序列变异性(Wu和Kabat，J Exp Med 132:211-50,1970；Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。(ii)三个在VH中(H1、H2、H3)且三个在VL中(L1、L2、L3)的“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的在结构上高变的区域，如Chothia和Lesk所定义(Chothia和Lesk，Mol Biol 196:901-17,1987)。国际免疫遗传学(IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT描述之间的对应性在Lefranc等,Dev Comparat Immunol 27:55-77,2003中有所描述。除非另有明确地说明，本文所用的术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括由任何上述方法(Kabat、Chothia或IMGT)定义的CDR。
另外，抗体或其抗原结合部分可以经修饰以包含可检测标签，诸如放射性同位素、荧光团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如金颗粒)。
本公开还提供了包含编码本文所述的CAR、多肽或蛋白质(包括其功能性部分和功能性变体)中的任一者的核苷酸序列的核酸。
该CAR的包含抗体或其抗体片段的部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域被表示为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、scFv和人嵌合抗体或人源化抗体(Harlow等人，1999，载于：Using Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,N.Y.；Harlow等人，1989，载于：Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人，1988年，Science，第242卷，第423-426页)。在一个方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在一个方面，该CAR包含具有scFv的抗体片段。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，诸如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应当被理解为意味着已通过合成编码该抗体并且表达抗体蛋白质的DNA分子或者指定该抗体的氨基酸序列而产生的抗体，其中该DNA或氨基酸序列已使用本领域可用且已知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或这两者。技术人员将理解，任何大分子(包括几乎所有蛋白质或肽)均可以用作抗原。此外，抗原可以来源于重组DNA或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用的术语“抗原”。此外，本领域的技术人员将理解，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本公开包括但不限于使用不止一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引起期望的免疫应答的多肽。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
来自包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
来自包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3；
其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含来自包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列的可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3，以及来自包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列的可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
重链CDR1，其具有选自SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:115、SEQID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:309和SEQ ID NO:314以及它们的保守性修饰的氨基酸序列，其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
重链CDR2，其具有选自SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:310和SEQ ID NO:315以及它们的保守性修饰的氨基酸序列，其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
重链CDR3，其具有选自SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:311以及它们的保守性修饰的氨基酸序列，其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:314的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:315的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:309的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:310的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3，
其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:66的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:314的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:315的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:311的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:309的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:310的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:311的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:66的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:66的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:88的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:94的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:104的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:104的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:109的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:109的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:113的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:113的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:117的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:117的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:122的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ IDNO:122的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
轻链CDR1，其具有选自SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:136和SEQID NO:312以及它们的保守性修饰的氨基酸序列，其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
轻链CDR2，其具有选自SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:134、SEQID NO:137和SEQ ID NO:313以及它们的保守性修饰的氨基酸序列，其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
轻链CDR3，其具有选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139以及它们的保守性修饰的氨基酸序列，其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链CDR3，
其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ IDNO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ IDNO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ IDNO:91的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ IDNO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ IDNO:91的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ IDNO:91的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ IDNO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ IDNO:130的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ IDNO:132的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ IDNO:135的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ IDNO:138的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ IDNO:139的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:314的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:315的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；
其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:314的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:315的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:309的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:310的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:314的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:315的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:309的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:310的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)，或者包含选自SEQID NO:4-6的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)，或者包含选自由SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的LCVR与包含选自SEQ ID NO:4-6的氨基酸序列的HCVR的组合，其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含：
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的重链可变区；包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:1具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:4具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:4具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:3具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:6具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:3具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:4具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:6具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:3具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:4具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:1具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:6具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:3具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:5具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:1具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:5具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:5具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:74具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:76具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:75具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:77具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:147具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:140具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:75具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:141具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:75具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:140具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:148具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:142具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:149具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:143具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:150具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:144具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:151具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:145具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:152具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:146具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；
轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:318具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:317具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:1具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:4具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:4具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:3具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:6具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:3具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:4具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:6具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:3具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:4具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:1具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:6具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:3具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:5具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:1具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:5具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:5具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:74具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:76具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:75具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:77具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:147具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:140具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:75具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:141具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:75具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:140具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:148具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:142具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:149具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:143具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:150具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:144具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:151具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:145具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:152具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:146具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含：轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:318具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:317具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含scFv。在一些实施方案中，该scFv包含位于轻链可变区与重链可变区之间的接头多肽。在某些实施方案中，细胞外抗原结合结构域为scFv，其包含选自SEQ ID NO:8-23、SEQ ID NO:169-184和SEQ ID NO:340-343的氨基酸序列，并且特异性地结合至hK2多肽(例如，具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的人hK2多肽，或其片段)。
在重组表达系统中，接头是肽接头并且可以包含任何天然存在的氨基酸。可以被包含到接头中的示例性氨基酸为Gly、Ser、Pro、Thr、Glu、Lys、Arg、Ile、Leu、His和The。接头的长度应当足以使VH和VL以相对于彼此形成正确构象，从而使得它们保持期望的活性(诸如与hK2结合)的方式连接。
接头的长度可以为约5个至50个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为约10个至40个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为约10个至35个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为约10个至30个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为约10个至25个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为约10个至20个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为约15个至20个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为6个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为7个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为8个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为9个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为10个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为11个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为12个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为13个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为14个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为15个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为16个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为17个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为18个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为19个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为20个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为21个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为22个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为23个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为24个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为25个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为26个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为27个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为28个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为29个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为30个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为31个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为32个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为33个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为34个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为35个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为36个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为37个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为38个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为39个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为40个氨基酸。可以使用的示例性接头为富含Gly的接头、含有Gly和Ser的接头、含有Gly和Ala的接头、含有Ala和Ser的接头，以及其他柔性接头。
在一个实施方案中，该接头多肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一个实施方案中，接头多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，接头多肽包含SEQ ID NO:237至SEQ ID NO:268中的任一者的氨基酸序列。在一个实施方案中，接头多肽包含与SEQ ID NO:237至SEQ ID NO:268中的任一者具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，scFv包含选自SEQ ID NO:8-23、SEQ ID NO:169-184和SEQ IDNO:340-343的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:8的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:9的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:10的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:11的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:12的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:13的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:14的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:15的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:16的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:17的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:18的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:19的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:20的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:21的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:22的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:23的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:169或SEQ IDNO:169的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:170或SEQ ID NO:170的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:171的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:172或SEQ ID NO:172的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ IDNO:173或SEQ ID NO:173的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:174或SEQ ID NO:174的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:175或SEQ ID NO:175的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:176或SEQ ID NO:176的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:177或SEQ ID NO:177的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:178或SEQ ID NO:178的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:179或SEQ ID NO:179的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQID NO:180或SEQ ID NO:180的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:181或SEQ ID NO:181的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:182或SEQ ID NO:182的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:183的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:184或SEQ ID NO:184的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:340或SEQ ID NO:340的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:341或SEQ IDNO:341的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:342或SEQ ID NO:342的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO:343或SEQ ID NO:343的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该细胞外抗原结合结构域包含信号多肽。信号多肽可定位在结合hK2的细胞外抗原结合结构域的N末端。信号多肽可在细胞处理和将CAR定位到细胞膜期间任选地从细胞外抗原结合结构域裂解。本领域技术人员已知的各种信号多肽中的任一种信号多肽均可用作信号多肽。可衍生出信号多肽的肽的非限制性示例包括FcεR、人免疫球蛋白(IgG)重链(HC)可变区、CD8α或由T细胞分泌的各种其他蛋白质中的任一种蛋白质。在各种实施方案中，信号多肽与T细胞的分泌通路相容。在一些实施方案中，信号多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一个实施方案中，信号多肽包含与SEQ ID NO:24具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个方面，本公开提供了CAR，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:29-44、SEQ ID NO:78-81、SEQ ID NO:221-236和SEQ ID NO:273-308的氨基酸序列。具有包含选自SEQ ID NO:29-44、SEQ ID NO:78-81、SEQ ID NO:221-236和SEQ ID NO:273-308的氨基酸序列的细胞外抗原结合结构域的CAR的另一个特征是细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
在一个实施方案中，该细胞内信号传导结构域包含多肽组分，其选自由以下项组成的组：TNF受体超家族成员9(CD137)组分、T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(CD3z)组分、分化簇(CD27)组分、分化簇超家族成员(诸如，CD28或诱导型T细胞共刺激剂(ICOS))组分，以及它们的组合。
在一个实施方案中，CD137组分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一个实施方案中，CD137组分包含与SEQ ID NO:27具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，CD3z组分包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一个实施方案中，CD3z组分包含与SEQ ID NO:28具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与SEQ ID NO:45具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，跨膜结构域包含CD8a跨膜区(CD8a-TM)多肽。在一些实施方案中，CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD8a-TM多肽包含与SEQ ID NO:26具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，跨膜结构域至少包含以下项的跨膜区：T-细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD40、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在另一个实施方案中，跨膜结构域至少包含以下项的跨膜结构域：ζ、η或FcεR1γ和-β、MB1(Igα.)、B29或CD3-γ、ζ或η。在另一个实施方案中，该跨膜结构域是合成的，例如，主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸、苯丙氨酸三联体或色氨酸。
在一个实施方案中，该CAR还包含将跨膜结构域连接至细胞外抗原结合结构域的铰链区。在一些实施方案中，铰链区为CD8a铰链区。在一些实施方案中，CD8a铰链区包含SEQID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD8a铰链区包含与SEQ ID NO:25具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链区包含序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQID NO:269)，或者包含与EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:269)具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链区包含序列ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:270)，或者包含与ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:270)具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链区包含序列ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO:271)，或者包含与ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO:271)具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链区包含序列ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:272)，或者包含与ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:272)具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，CAR包含细胞外抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一个这样的实施方案中，铰链区为CD8α铰链区，跨膜结构域为CD8α-TM结构域，并且细胞内信号传导结构域包括CD3-ζ结构域和4-1BB/CD137结构域。
在一个这样的实施方案中，铰链区为包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CD8α铰链区，跨膜结构域为包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CD8α-TM结构域，并且细胞内信号传导结构域包括包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CD3-ζ结构域和4-1BB/CD137结构域。
在另一个实施方案中，铰链区为包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CD8α铰链区，跨膜结构域为包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CD8α-TM结构域，并且细胞内信号传导结构域包括包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的4-1BB/CD137结构域和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CD3-ζ结构域。
在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:29-44、SEQ IDNO:78-81、SEQ ID NO:221-236和SEQ ID NO:273-308的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:29的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:30的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:31的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:32或SEQID NO:32的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:33的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:34的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:35的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:36的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:37的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:38的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:39的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:40的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:41的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:42的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ IDNO:43或SEQ ID NO:43的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:44的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:78的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:79的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:80的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:81的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:221或SEQID NO:221的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:222的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:223或SEQ ID NO:223的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:224或SEQ ID NO:224的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:225或SEQ ID NO:225的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:226或SEQ ID NO:226的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:227或SEQ ID NO:227的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:228或SEQ ID NO:228的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:229或SEQ ID NO:229的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:230或SEQ ID NO:230的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:231的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:232或SEQ ID NO:232的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:233或SEQ ID NO:233的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:234或SEQ ID NO:234的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:235或SEQ ID NO:235的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:236或SEQ ID NO:236的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
CAR构建体和表达CAR的免疫应答细胞
术语“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列的用于在生物过程中充当合成其他聚合物和大分子的模板的固有性质，所述聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列和由此产生的生物学性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同)和非编码链(其用作基因或cDNA转录的模板)均可以称为编码该蛋白质，或者该基因或cDNA的其他产物。
除非另外指明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并型式并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的短语“核苷酸序列”还可以包括内含子，其程度使得编码该蛋白质的核苷酸序列在一些型式中可以含有内含子。
术语“表达载体”是指包含下述重组多核苷酸的载体：该重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括结合了重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸质粒或包含在脂质体中的质粒)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
在一个实施方案中，本公开提供了表达编码CAR的核酸分子的细胞。在一个实施方案中，本公开的CAR包含选自SEQ ID NO:46-61、SEQ ID NO:82-85和SEQ ID NO:205-220的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:46的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ IDNO:47或SEQ ID NO:47的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:48的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:49的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:50的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:51的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:52的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:53的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:54的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:55或SEQ IDNO:55的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:56的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:57的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:58的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:59的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:60的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:61的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:82的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:83的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ IDNO:84或SEQ ID NO:84的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:85的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:205或SEQ ID NO:205的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:206或SEQ ID NO:206的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:207或SEQ ID NO:207的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:208或SEQID NO:208的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:209或SEQ ID NO:209的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:210或SEQ ID NO:210的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:211或SEQ ID NO:211的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:212或SEQ ID NO:212的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:213或SEQ ID NO:213的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ IDNO:214或SEQ ID NO:214的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:215或SEQ ID NO:215的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:216或SEQ IDNO:216的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:217或SEQ ID NO:217的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:218或SEQ ID NO:218的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:219或SEQ ID NO:219的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的CAR包含与SEQ ID NO:220或SEQ ID NO:220的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，CAR可以包含信号多肽。在某些实施方案中，该信号肽位于CAR序列的N末端处。在某些实施方案中，该信号肽位于CAR序列的C末端处。在某些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。
本文中，核酸分子的结构在基于与所述参考序列(具有给定的SEQ ID NO)的％序列同一性所定义的位置上。在该语境中，关于核酸分子的％序列同一性是指至少两种不同核酸序列之间的相似性。当两个比较序列两者中的位置被相同碱基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一者中的位置被腺嘌呤占据，那么这些分子在该位置处是相同的。两条序列之间的同一性百分比是这两条序列所共享的匹配位置或同源位置的数目除以比较位置的数目并且乘以100的函数。例如，如果两条序列中10个位置中的6个是匹配的或同源的，那么这两条序列是60％相同的(或同源的)。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC共享50％的同一性(或同源性)。一般来讲，当比对两条序列以给出最大同源性时进行比较。相应的同一性百分比可以通过标准的比对算法来确定，例如，Altshul等人((1990)J.MoI.Biol.第215卷，第403-410页)描述的基本局部比对搜索工具(BLAST)；Needleman等人(1970年，J.MoI.Biol.48:444-53)的算法；或者Meyers等人((1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-17)的算法。一组参数可以是Blosum 62评分矩阵，其空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。两条核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用Meyers和Miller((1989)CABIOS4:11-17)的算法(该算法已经并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。百分比同一性通常通过比较相似长度的序列来计算。
在各种实施方案中，编码CAR的核酸分子包含SEQ ID NO:153至SEQ ID NO:160中的任一者的核酸序列。在各种实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:153至SEQ ID NO:160中的任一者具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
在各种实施方案中，编码CAR的核酸分子包含SEQ ID NO:161至SEQ ID NO:168中的任一者的核酸序列。在各种实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:161至SEQ IDNO:168中的任一者具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
在各种实施方案中，编码CAR的核酸分子包含SEQ ID NO:195至SEQ ID NO:204中的任一者的核酸序列。在各种实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:195至SEQ ID NO:204中的任一者具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
在各种实施方案中，编码CAR的核酸分子包含SEQ ID NO:320至SEQ ID NO:325中的任一者的核酸序列。在各种实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:320至SEQ ID NO:325中的任一者具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
在各种实施方案中，编码CAR的核酸分子包含SEQ ID NO:326至SEQ ID NO:331中的任一者的核酸序列。在各种实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:326至SEQ ID NO:331中的任一者具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
在各种实施方案中，编码CAR的核酸分子包含SEQ ID NO:336至SEQ ID NO:339中的任一者的核酸序列。在各种实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:336至SEQ ID NO:339中的任一者具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ IDNO:153或SEQ ID NO:153的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:154或SEQ ID NO:154的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:155的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQID NO:156或SEQ ID NO:156的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:157或SEQ ID NO:157的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:158或SEQ ID NO:158的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQID NO:159或SEQ ID NO:159的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:160或SEQ ID NO:160的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:161或SEQ ID NO:161的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQID NO:162或SEQ ID NO:162的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:163或SEQ ID NO:163的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:164或SEQ ID NO:164的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQID NO:165或SEQ ID NO:165的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:166或SEQ ID NO:166的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:167的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQID NO:168或SEQ ID NO:168的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:195或SEQ ID NO:195的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:196的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQID NO:197或SEQ ID NO:197的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:198或SEQ ID NO:198的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:199的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQID NO:200或SEQ ID NO:200的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:201或SEQ ID NO:201的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:202或SEQ ID NO:202的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQID NO:203或SEQ ID NO:203的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:204或SEQ ID NO:204的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:320或SEQ ID NO:320的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQID NO:321或SEQ ID NO:321的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:322或SEQ ID NO:322的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:323或SEQ ID NO:323的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQID NO:324或SEQ ID NO:324的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:325或SEQ ID NO:325的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:326或SEQ ID NO:326的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQID NO:327或SEQ ID NO:327的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:328或SEQ ID NO:328的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:329或SEQ ID NO:329的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQID NO:330或SEQ ID NO:330的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:331或SEQ ID NO:331的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:336或SEQ ID NO:336的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQID NO:337或SEQ ID NO:337的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:338或SEQ ID NO:338的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，编码CAR的核酸分子包含核酸序列，该核酸序列包括与SEQ ID NO:339或SEQ ID NO:339的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
在一个方面，本公开提供了包含本文所述CAR的分离的免疫应答细胞。在一些实施方案中，该分离的免疫应答细胞用CAR转导，例如，CAR在该免疫应答细胞的表面上组成型表达。在某些实施方案中，该分离的免疫应答细胞用至少一种共刺激配体进一步转导，使得该免疫应答细胞表达所述至少一种共刺激配体。在某些实施方案中，所述至少一种共刺激配体选自由以下项组成的组：4-1BBL、CD48、CD70、CD80、CD86、OX40L、TNFRSF14，以及它们的组合。在某些实施方案中，该分离的免疫应答细胞用至少一种细胞因子进一步转导，使得该免疫应答细胞分泌所述至少一种细胞因子。在某些实施方案中，所述至少一种细胞因子选自由以下项组成的组：IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21，以及它们的组合。在一些实施方案中，该分离的免疫应答细胞选自由以下项组成的组：T淋巴细胞(T细胞)、天然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞、淋巴祖细胞、T细胞前体细胞，以及可以从其分化淋巴样细胞的多能干细胞。
在一个实施方案中，本公开的CAR T细胞可以通过将包含期望的CAR(例如，包含抗hK2、CD8α铰链和跨膜结构域，以及人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的CAR)的慢病毒载体引入细胞中来产生。本发明的CAR T细胞能够在体内复制，从而导致可以引起持续肿瘤控制的长期持久性。
本发明的实施方案还提供了包含本文所述的任何重组表达载体的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以含有重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞(例如，植物、动物或藻类、真菌)，或者可以是原核细胞(例如，细菌或原生动物)。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞(即，直接从生物体(例如，人)分离的)。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞，即在悬浮液中生长的细胞。合适的宿主细胞是本领域已知的，并且包括例如DH5α大肠杆菌(E.coli)细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞，等等。为了扩增或复制重组表达载体，宿主细胞可以是原核细胞，例如DH5α细胞。为了产生重组CAR、多肽或蛋白质，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是人细胞。虽然宿主细胞可以是任何细胞类型，可以源自任何类型的组织，并且可以处于任何发育阶段，但是宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)。宿主细胞可以是T细胞。
出于本文的目的，T细胞可以是任何T细胞，诸如培养的T细胞(例如原代T细胞)，或者来自培养的T细胞系的T细胞(例如Jurkat、SupT1等)，或者从哺乳动物获得的T细胞。如果是从哺乳动物获得的，则T细胞可以从多种来源获得，包括但不限于骨髓、血液、淋巴结、胸腺或者其他组织或流体。T细胞也可以富集或纯化。T细胞可以是人T细胞。T细胞可以是从人分离的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以处于任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、CD4+辅助T细胞(例如，Th1细胞和Th2细胞)、外周血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、初始T细胞，等等。T细胞可以是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
还提供了包含至少一种本文所述宿主细胞的细胞群体。细胞群体可以是异质群体，其包含具有所述重组表达载体中的任一者的宿主细胞，此外还包含至少一种其他细胞，例如不具有所述重组表达载体中的任一者的宿主细胞(例如T细胞)，或者除T细胞之外的细胞，例如B细胞、巨噬细胞、红细胞、嗜中性粒细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞等。替代性地，细胞群体可以是基本上同质的群体，其中该群体主要包含具有重组表达载体的宿主细胞(例如，基本上由其组成)。该群体还可以是细胞的克隆群体，其中该群体的所有细胞是包含重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，使得该群体的所有细胞包含重组表达载体。在一个实施方案中，细胞群体是包含具有如本文所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。
药物组合物/施用
在本公开的实施方案中，表达CAR的细胞可以在组合物中提供，例如，包含表达CAR的细胞和药学上可接受的载剂的合适的药物组合物。在一个方面，本公开提供了药物组合物，其包含有效量的表达所述CAR中的一者或多者的淋巴细胞和药学上可接受的赋形剂。本公开的药物组合物可以包含表达CAR的细胞(例如，如本文所述的多个表达CAR的细胞)与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的组合。如本文所用，术语“与……组合”意指将两种或更多种治疗剂以混合物形式一起、作为单一药剂同时或作为单一药剂以任何顺序依次施用给受试者。
药学上可接受的载剂可以是药物组合物中除活性成分之外的成分，其对受试者无毒。
药学上可接受的载剂可以包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。药学上可接受的载剂的示例是生理上相容的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，诸如盐、缓冲剂、抗氧化剂、糖类、水性或非水性载剂、防腐剂、润湿剂、表面活性剂或乳化剂，或者它们的组合。药物组合物中的药学上可接受的载体的量可基于载体活性和所需制剂特征(例如稳定性和/或最低氧化)来通过实验确定。
此类组合物可以包含缓冲剂，诸如乙酸、柠檬酸、甲酸、琥珀酸、磷酸、碳酸、苹果酸、天冬氨酸、组氨酸、硼酸、Tris缓冲剂、HEPPSO、HEPES、中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；辅助剂(例如氢氧化铝)；抗细菌剂和抗真菌剂；以及防腐剂。
本公开的组合物可以被配制用于肠胃外施用或非肠胃外施用的多种方式。在一个实施方案中，所述组合物可以被配制用于输注或静脉内施用。本文所公开的组合物可以例如作为无菌液体制剂(例如等渗水溶液剂、乳剂、混悬剂、分散体或粘稠组合物)提供，其可以被缓冲至期望的pH。适用于口服施用的制剂可以包括液体溶液剂、胶囊剂、小药囊、片剂、锭剂和糖锭、散剂，以及在适当的液体和乳剂中的液体混悬剂。
如本文关于药物组合物所用的术语“药学上可接受的”，意味着由联邦或州政府的监管机构批准的或者在美国药典或其他公认的药典中列出的用于在动物和/或人类中使用的物质。
在一个方面，本公开涉及使用淋巴细胞输注来施用表达CAR的经基因修饰的T细胞，以治疗患有癌症或有患上癌症的风险的受试者。在至少一个实施方案中，在治疗中使用了自体淋巴细胞输注。从需要治疗的受试者收集自体PBMC，并且使用本文所述和本领域已知的方法将T细胞活化和扩增，然后输注回受试者中。
在一个方面，本公开整体涉及对有患上癌症的风险的受试者的治疗。本发明还包括治疗以下恶性肿瘤或自身免疫疾病：其中受试者的化学疗法和/或免疫疗法导致显著的免疫抑制，从而增加了受试者患上癌症的风险。在一个方面，本公开提供了预防癌症的方法，所述方法包括将一定量的表达所述CAR中的一者或多者的淋巴细胞施用于有需要的受试者。
在一个方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括将治疗有效量的表达所述CAR中的一者或多者的淋巴细胞施用于有需要的受试者，由此所述淋巴细胞诱导或调节杀伤受试者中的癌细胞。
在另一方面，本公开提供了减少患有癌症的受试者中的肿瘤负荷的方法，所述方法包括将治疗有效量的表达本文所述CAR中的一者或多者的淋巴细胞施用于有需要的受试者，由此所述淋巴细胞诱导对受试者中的癌细胞的杀伤。在另一方面，本公开提供了延长患有癌症的受试者的存活期的方法，所述方法包括将治疗有效量的表达所述CAR中的一者或多者的淋巴细胞施用于有需要的受试者，由此延长受试者的存活期。一般来讲，表达所述CAR的淋巴细胞诱导对受试者中的癌细胞的杀伤，并且导致受试者中的肿瘤细胞/癌细胞减少或根除。癌症(包括可以靶向的转移性病灶)的非限制性列表包括前列腺癌和前列腺来源的癌症。在一个实施方案中，在受试者中所治疗的癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，癌症是表达雄激素受体(AR)的乳腺癌。
在一个方面，本文所述的方法适用于治疗处于患上癌性病症风险的非癌性病症，诸如例如，前列腺肿大、良性前列腺增生(BPH)和未诊断出前列腺癌情况下的高PSA水平。
在一个方面，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，这些方法包括将治疗有效量的表达CAR(该CAR具有与hK2抗原结合的细胞外抗原结合结构域)的淋巴细胞施用于有需要的受试者，由此淋巴细胞诱导对受试者中的癌细胞的杀伤。在一些实施方案中，这些CAR中的至少一者包含选自SEQ ID NO:46-61、SEQ ID NO:82-85和SEQ ID NO:205-220的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:46的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:47的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:48的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:49的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:50的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:51的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:52的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:53的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:54的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:55的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:56或SEQID NO:56的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:57的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:58的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:59的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:60的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQID NO:61或SEQ ID NO:61的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:82的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:83的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:84的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:85的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:205或SEQ ID NO:205的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:206或SEQ ID NO:206的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:207或SEQ IDNO:207的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:208或SEQ ID NO:208的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:209或SEQ ID NO:209的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:210或SEQ ID NO:210的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:211或SEQ ID NO:211的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:212或SEQ ID NO:212的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:213或SEQ ID NO:213的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:214或SEQ IDNO:214的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:215或SEQ ID NO:215的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:216或SEQ ID NO:216的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:217或SEQ ID NO:217的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:218或SEQ ID NO:218的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:219或SEQ ID NO:219的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO:220或SEQ ID NO:220的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个方面，公开了对癌细胞进行靶向杀伤的方法，该方法包括使癌细胞与表达所述CAR中的一者或多者的淋巴细胞接触，由此所述淋巴细胞诱导对癌细胞的杀伤。可以靶向的癌细胞(包括转移性癌细胞)的非限制性列表包括前列腺癌及其组合。在一个实施方案中，癌细胞是前列腺癌细胞。
本公开的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的量和频率将由诸如受试者的病症以及受试者疾病的类型和严重性之类的因素确定，但适当的剂量可以通过临床试验来确定。
术语“治疗(treat或treatment)”是指治疗性处理，其中治疗对象将减慢(减轻)非期望的生理改变或疾病，或者在治疗期间提供有益或期望的临床结果。有益或期望的临床结果包括症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病的稳定(即，未恶化)状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及/或者缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，不论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可意指与受试者未接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的那些受试者包括已经患有非期望的生理改变或疾病的那些受试者、以及倾向于患有生理改变或疾病的那些受试者。
“预防”疾病或病症意味着防止受试者发生病症。本文中可互换使用的“治疗有效量”或“有效量”是指在必要的剂量下和时间段内有效实现期望的治疗结果的量。治疗有效量可根据以下因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括，例如：患者健康状况的改善、肿瘤负荷的减少、肿瘤生长的遏止或减慢和/或癌细胞没有向身体其他部位转移的情况。
如本文所用，术语“受治疗者”是指动物。术语“受试者”和“患者”在本文中在提及受试者时可以互换使用。因此，“受试者”包括作为患者的正在治疗疾病或预防疾病的人。本文所述的方法可以用于治疗属于任何分类的动物受试者。此类动物的示例包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于啮齿目(order Rodentia)的哺乳动物(诸如小鼠和仓鼠)和兔形目(order Logomorpha)的哺乳动物(诸如兔)。哺乳动物可以来自食肉目(order Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。所述哺乳动物可以来自偶蹄目(orderArtiodactyla)，包括牛科动物(奶牛)和猪科动物(猪)，或者奇蹄目(orderPerssodactyla)，包括马科动物(马)。哺乳动物可以是灵长目(order Primate)、四足猴目(order Ceboid)或猴目(order Simoid)(猴)，或者类人猿目(order Anthropoid)(人和猿)。在一个实施方案中，哺乳动物是人。
当指示治疗有效量时，待施用的本公开的组合物的精确量可以由医师考虑受试者的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和状况的个体差异来确定。通常可以说，包含本文所述T细胞的药物组合物可以以约104个细胞/kg体重至约1010个细胞/kg体重，在一些情况下约105个细胞/kg体重至约106个细胞/kg体重(包括在那些范围内的所有整数值)的剂量施用。在一些实施方案中，包含本文所述T细胞的药物组合物可以以约106个细胞/kg体重的剂量施用。T细胞组合物也可以以这些剂量施用多次。这些细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用(参见例如，Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
可用于本发明实施方案的语境中的递送体系可以包括定时释放递送体系、延迟释放递送体系和持续释放递送体系，使得T细胞组合物的递送在待治疗部位致敏之前发生，并且具有足够的时间以引起待治疗部位致敏。组合物可与其他治疗剂或疗法联合使用。此类体系可以避免组合物的重复施用，从而增加对受试者和医师的便利性，并且可以特别适用于本发明的某些组合物实施方案。
许多类型的释放递送体系是可用的，并且是本领域普通技术人员已知的。这些释放递送系统包括聚合物基础系统，诸如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚己内酯、聚羟基丁酸和聚酸酐。前述含有药物的聚合物的微胶囊描述于例如美国专利5,075,109中。递送体系还包括为脂质的非聚合物系统，这些脂质包括甾醇(诸如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪(诸如甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯))；硅橡胶系统；基于肽的系统；水凝胶释放体系；蜡涂层；使用常规粘合剂和赋形剂的压片；部分熔融的植入物；等。具体示例包括但不限于：(a)侵蚀体系，其中活性组合物以一定形式包含在基质内，诸如美国专利4,452,775、4,667,014、4,748,034、和5,239,660中所述的那些；以及(b)扩散体系，其中活性组分以受控速率从聚合物中渗透，诸如美国专利3,854,480和3,832,253中所述。此外，可使用基于泵的硬件递送系统，其中一些系统适于植入。
在某些方面，可能有利的是将活化的T细胞施用于受试者，然后重新抽取血液(或进行单采血液成分术)，根据本公开活化T细胞，并且向受试者重新输注这些经活化和扩增的T细胞。该过程可以每几周进行多次。在某些方面，可以活化10cc至400cc的抽血中的T细胞。在某些方面，可以活化20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中的T细胞。
CAR-T细胞和组合物的施用可以以任何方式进行，例如，通过肠胃外或非肠胃外施用，包括通过气溶胶吸入、注射、输注、摄取、输血、植入或移植。例如，本文所述的CAR-T细胞和组合物可以经动脉、皮内、皮下、肿瘤内、髓内、结节内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或腹膜内施用于患者。在一个方面，本公开的组合物通过i.v.注射施用。在一个方面，本公开的组合物通过皮内注射或皮下注射施用于受试者。T细胞的组合物可以被直接注射到例如肿瘤、淋巴结、组织、器官或感染部位中。
施用可以是自体施用或非自体施用。例如，表达人激肽释放酶-2(例如，hK2)特异性CAR的免疫应答细胞可以从一名受试者获得，并且施用于相同的受试者或不同的相容受试者。本公开的外周血衍生的T细胞，或扩增的T细胞(例如，体内、离体或体外衍生的)可以经由例如静脉内注射、局部注射、全身注射、导管施用或肠胃外施用来施用。
在特定实施方案中，受试者可以经受白细胞去除术，其中离体收集、富集或去除白细胞，以选择和/或分离感兴趣的细胞(例如T细胞)。这些T细胞分离物可以通过本领域已知的方法扩增，并且进行处理，使得可以引入本公开的一种或多种CAR构建体，从而形成CAR-T细胞。随后，有需要的受试者可以经受用高剂量化学疗法进行的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或与移植同时，受试者接受扩增的CAR-T细胞的输注。在一个方面，扩增细胞在手术之前或之后施用。
向患有恶性肿瘤的患者施用的剂量足以缓解或至少部分地遏止所治疗的疾病(“治疗有效量”)。待施用于受试者的上述治疗的剂量将随所治疗病症的确切性质和治疗接受者而变化。用于人类施用的剂量的缩放可以根据本领域通常接受的实践来进行。
本发明的CAR T细胞可以经受体内T细胞扩增并且可以建立在血液和骨髓中以高水平存留延长的时间量的hK2特异性记忆细胞。在一些情况下，输注到受试者中的本发明的CAR T细胞可以消除患有晚期化学疗法抗性癌症的受试者体内的癌细胞，例如前列腺癌细胞或表达AR的乳腺癌。
在一个实施方案中，本公开的CAR例如使用体外转录被引入T细胞中，并且受试者(例如，人)接受本公开的CAR-T细胞的初始施用，以及CAR-T细胞的一次或多次后续施用，其中该一次或多次后续施用在前一次施用之后不到15天(例如，14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天)施用。在一个实施方案中，每周向受试者(例如，人)施用CAR-T细胞的多于一次施用，例如，每周施用CAR-T细胞的2次、3次或4次施用。在一个实施方案中，受试者每周接受多于一次的CAR-T细胞施用(例如，每周2次、3次或4次施用)(在本文中也称为周期)，之后一周不接受CAR-T细胞施用，然后向该受试者施用一次或多次CAR-T细胞的附加施用(例如，每周多于一次的CAR-T细胞施用)。在另一个实施方案中，受试者接受多于一个CAR-T细胞周期，并且每个周期之间的时间少于10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。在一个实施方案中，每隔一天施用CAR-T细胞，每周施用3次。在一个实施方案中，将CAR-T细胞施用至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。
在一个实施方案中，可在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间之后重复施用。也可以重复治疗过程，按照慢性施用一样。重复施用可为相同剂量或不同剂量。
CAR-T细胞在本发明的方法中可以通过维持疗法施用，诸如每周一次，持续6个月或更长的时期。
在一个实施方案中，使用慢病毒载体(诸如慢病毒属(lentivirus))来产生CAR-T细胞。用此类病毒载体产生的CAR-T细胞通常将具有稳定的CAR表达。
在一个实施方案中，CAR-T细胞在转导后瞬时表达CAR载体4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天。CAR的瞬时表达可以受到RNA CAR载体递送的影响。在一个实施方案中，CAR RNA通过电穿孔被转导到T细胞中。
如果患者在瞬时CAR疗法的过程期间处于产生抗CAR抗体应答(诸如由RNA转导产生的那些)的高风险下，则CAR-T输注间歇不应持续超过十天至十四天。
本文所述的表达CAR的细胞可以与其他已知的作用剂和疗法组合使用。如本文所用，“组合”施用意味着在受试者的治疗过程期间将两种(或更多种)不同的治疗递送给受试者，例如，两种或更多种治疗在受试者已被诊断患有癌症之后并且在癌症已被治愈或消除之前或者出于其他原因已停止治疗之前递送。在一些实施方案中，一种治疗的递送在第二种治疗的递送开始时仍在进行，使得在施用方面存在重叠。这在本文中有时称为“同时”或“同时递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方案中，由于组合施用，治疗更有效。例如，与在不存在第一种治疗的情况下施用第二种治疗时、或者在使用第一种治疗时观察到的类似情况相比，第二治疗更有效，例如，在使用较少的第二种治疗时观察到等同的效果，或者第二种治疗更大程度地减轻了症状。在一些实施方案中，递送使得症状减轻或与疾病相关的其他参数减小的程度大于在递送一种治疗而不存在另一种治疗的情况下将观察到的减轻或减小的程度。两种治疗的效果可以是部分相加的、完全相加的，或比相加的结果大。所述递送可以使得递送的第一种治疗的效果在递送第二种治疗时仍然是可检测的。
在一个实施方案中，其他治疗剂(诸如因子)可以在CAR-T细胞之前、之后或同时(与之同时)施用，包括但不限于白介素以及集落刺激因子(诸如G-CSF、M-CSF和GM-CSF)和干扰素。
本文所述的表达CAR的细胞和至少一种附加的治疗剂可以同时施用、在相同或分开的组合物中施用，或相继施用。对于相继施用，可以首先施用本文所述的表达CAR的细胞，并且可以其次施用附加的作用剂，或者可以颠倒施用次序。
在另外的实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞可用于与外科手术、放射、化学疗法、免疫抑制剂、抗体或其他免疫消融剂组合的治疗方案中。在另一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞可以与抗雄激素治疗组合使用。在一个实施方案中，可以向受试者施用增强表达CAR的细胞的活性的作用剂。例如，在一个实施方案中，该作用剂可以是抑制抑制性分子的作用剂。
对示例性实施方案的描述如下：
1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(a)细胞外结构域，该细胞外结构域包含scFv并特异性地结合人激肽释放酶-2(hK2)抗原，
(b)跨膜结构域；和
(c)细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域任选地包括至少一个共刺激结构域。
2.根据实施方案1所述的CAR，该CAR还包含：
(d)CD8a-铰链区，
其中跨膜结构域包含CD8a跨膜区(CD8a-TM)多肽；并且
其中细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域和初级信号传导结构域，该共刺激结构域包含TNF受体超家族成员9(CD137)组分，该初级信号传导结构域包含T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(CD3z)组分。
3.根据实施方案2所述的CAR，其中：
(b)CD8a铰链区包含与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:270、SEQ IDNO:271或SEQ ID NO:272具有至少90％同一性的氨基酸序列；
(c)跨膜结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少90％同一性的氨基酸序列；并且/或者
(d)细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域和初级信号传导结构域，该共刺激结构域具有与SEQ ID NO:27具有至少90％同一性的氨基酸序列，该初级信号传导结构域具有与SEQ ID NO:28具有至少90％同一性的氨基酸序列。
4.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:314的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:315的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:309的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:310的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3；
其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
5.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链CDR3，
其中细胞外抗原结合结构域结合hK2抗原。
6.根据实施方案4所述的CAR，其中细胞外抗原结合结构域还包含：
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链CDR3。
7.根据实施方案6所述的CAR，其中细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQIDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:314的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:315的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3。
8.根据实施方案6所述的CAR，其中细胞外抗原结合结构域包含：具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3。
9.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含：
轻链可变结构域(VL)，该轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:
149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:318的氨基酸序列；和/或
重链可变结构域(VH)，该重链可变结构域包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:
142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ IDNO:317的氨基酸序列；
其中细胞外抗原结合结构域结合人激肽释放酶-2(hK2)抗原。
10.根据实施方案9所述的CAR，其中细胞外抗原结合结构域包含：
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；或者
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列的重链可变区。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的CAR，其中细胞外抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)。
12.根据实施方案11所述的CAR，其中scFv包含位于轻链可变区(VL)与重链可变区(VH)之间的接头多肽。
13.根据实施方案12所述的CAR，其中接头多肽包含SEQ ID NO:7
的氨基酸序列。
14.根据实施方案11至12中任一项所述的CAR，其中scFv包含选自SEQ ID NO:8-23、SEQ ID NO:169-184和SEQ ID NO:340-343的氨基酸序列。
15.根据实施方案1至14中任一项所述的CAR，其中细胞外抗原结合结构域包含信号多肽。
16.根据实施方案15所述的CAR，其中信号多肽包含SEQ ID NO:
24的氨基酸序列。
17.根据实施方案4至16中任一项所述的CAR，其中细胞内信号传导结构域包含多肽组分，该多肽组分选自TNF受体超家族成员9
(CD137)组分、T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(CD3z)组分、分
化簇(CD27)组分、分化簇超家族成员组分，以及它们的组合。
18.根据实施方案17所述的CAR，其中CD137组分包含SEQ ID NO:
27的氨基酸序列。
19.根据实施方案17或实施方案18所述的CAR，其中CD3z组分包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
20.根据实施方案17至19中任一项所述的CAR，其中细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
21.根据实施方案2至20中任一项所述的CAR，其中跨膜结构域包含CD8a跨膜区(CD8a-TM)多肽。
22.根据实施方案21所述的CAR，其中CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
23.根据实施方案4至22中任一项所述的CAR，该CAR还包含将跨膜结构域连接至细胞外抗原结合结构域的铰链区。
24.根据实施方案23所述的CAR，其中铰链区为CD8a铰链区。
25.根据实施方案24所述的CAR，其中CD8a铰链区包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:279、SEQ ID NO:280、SEQ ID NO:281或SEQ ID NO:282的氨基酸序列。
26.根据实施方案1至25中任一项所述的CAR，其中细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:29-44、SEQ ID NO:78-81、SEQ ID NO:221-236和SEQ ID NO:273-308的氨基酸序列。
27.根据实施方案1至26中任一项所述的CAR，其中CAR包含选自SEQ ID NO:46-61、SEQ ID NO:82-85和SEQ ID NO:205-220的氨基酸序列。
28.一种分离的淋巴细胞，该分离的淋巴细胞表达根据权利要求1至
27中任一项所述的CAR。
29.根据实施方案28所述的分离的淋巴细胞，其中淋巴细胞为T淋巴细胞。
30.根据实施方案28所述的分离的淋巴细胞，其中淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
31.一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子编码根据实施方案1至
30中任一项所述的CAR。
32.一种载体，该载体包含根据实施方案31所述的核酸分子。
33.一种细胞，该细胞表达根据实施方案31所述的核酸分子。
34.一种药物组合物，该药物组合物包含有效量的根据实施方案28
至30中任一项所述的淋巴细胞。
35.一种药物组合物，该药物组合物包含有效量的根据实施方案28至
30中任一项所述的淋巴细胞和药学上可接受的赋形剂。
36.根据实施方案1至27中任一项所述的CAR或者根据实施方案34
或35所述的药物组合物，其用于在疗法中使用。
37.根据实施方案1至27中任一项所述的CAR或者根据实施方案34
或35所述的药物组合物，其用于在治疗患有癌症的受试者的方法中使用。
38.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
将治疗有效量的根据实施方案28至30中任一项所述的淋巴细胞施用于有需要的受试者，由此淋巴细胞诱导对受试者中的癌细胞的杀伤。
39.根据实施方案38所述的方法，或者根据实施方案37所述的用于在方法中使用的CAR或药物组合物，其中癌症是前列腺癌或表达雄激素受体的乳腺癌。
40.根据实施方案38所述的方法，或者根据实施方案37所述的用于在方法中使用的CAR或药物组合物，其中癌症是前列腺癌。
41.根据实施方案38所述的方法，或者根据实施方案37所述的用于在方法中使用的CAR或药物组合物，其中癌症是表达雄激素受体的乳腺癌。
42.一种对癌细胞进行靶向杀伤的方法，所述方法包括：
使癌细胞与根据实施方案28至30中任一项所述的淋巴细胞接触，由此淋巴细胞诱导对癌细胞的杀伤。
43.根据实施方案42所述的方法，其中癌细胞是前列腺癌细胞或表达雄激素受体的乳腺癌细胞。
44.一种检测受试者中存在癌症的方法，所述方法包括：
(c)使从受试者获得的细胞样品与根据实施方案1至27中任一项所述的CAR接触，从而形成CAR-细胞复合物，以及
(d)检测该复合物，其中检测到复合物指示受试者中存在癌症。
优选地，该实施方案在体外进行。
45.根据实施方案1所述的CAR，其中跨膜结构域包含CD8a-TM多肽，该多肽包含SEQID NO:26的氨基酸序列。
46.根据实施方案2所述的CAR，其中跨膜结构域包含CD8a-TM多肽，该多肽包含SEQID NO:26的氨基酸序列。
47.根据实施方案2或46所述的CAR，其中CD8a铰链区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
48.根据实施方案2或47所述的CAR，其中CD137组分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
49.根据实施方案2、47或48所述的CAR，其中CD3z组分包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
50.根据实施方案3所述的CAR，其中：
(b)CD8a铰链区，该铰链区包含与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:
269、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271或SEQ ID NO:272具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％同一性的氨基酸序列；优选地其中CD8a铰链区包含与SEQ ID NO:25具有至少90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
(c)跨膜结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或
(d)细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域和初级信号传导结构域，该共刺激结构域具有与SEQ ID NO:27具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，该初级信号传导结构域具有与SEQ ID NO:28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
51.根据实施方案3所述的CAR，其中CD8a铰链区包含SEQ ID NO:
25的氨基酸序列。
52.根据实施方案3所述的CAR，其中CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
53.根据实施方案3所述的CAR，其中CD137组分包含SEQ ID NO:
27的氨基酸序列。
54.根据实施方案3所述的CAR，其中CD3z组分包含SEQ ID NO:
28的氨基酸序列。
55.根据实施方案3所述的CAR，其中：
(b)CD8a铰链区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
(c)跨膜结构域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；并且
(d)细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域和初级信号传导结构域，该共刺激结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，该初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
56.根据实施方案45至55所述的CAR，其中细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ IDNO:29-44、SEQ ID NO:78-81、SEQ ID NO:
221-236和SEQ ID NO:273-308的氨基酸序列。
57.根据实施方案45至55中任一项所述的CAR，其中CAR包含选自SEQ ID NO:46-61、SEQ ID NO:82-85和SEQ ID NO:205-220的氨基酸序列。
58.一种分离的淋巴细胞，该分离的淋巴细胞表达根据权利要求45至
55中任一项所述的CAR。
59.根据实施方案58所述的分离的淋巴细胞，其中淋巴细胞为T淋巴细胞。
60.根据实施方案58所述的分离的淋巴细胞，其中淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
61.一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子编码根据实施方案45
至55中任一项所述的CAR。
62.一种载体，该载体包含根据实施方案61所述的核酸分子。
63.一种细胞，该细胞表达根据实施方案61所述的核酸分子。
64.一种药物组合物，该药物组合物包含有效量的根据实施方案58
至60中任一项所述的淋巴细胞。
65.一种药物组合物，该药物组合物包含有效量的根据实施方案58至
60中任一项所述的淋巴细胞和药学上可接受的赋形剂。
66.根据实施方案45至55中任一项所述的CAR或者根据实施方案
64或65所述的药物组合物，其用于在疗法中使用。
67.根据实施方案45至55中任一项所述的CAR或者根据实施方案64或65所述的药物组合物，其用于在治疗患有癌症的受试者的方法中使用。
68.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
将治疗有效量的根据实施方案58至60中任一项所述的淋巴细胞施用于有需要的受试者，由此淋巴细胞诱导对受试者中的癌细胞的杀伤。
69.根据实施方案68所述的方法，或者根据实施方案67所述的用于在方法中使用的CAR或药物组合物，其中癌症是前列腺癌或表达雄激素受体的乳腺癌。
70.根据实施方案68所述的方法，或者根据实施方案67所述的用于在方法中使用的CAR或药物组合物，其中癌症是前列腺癌。
71.根据实施方案68所述的方法，或者根据实施方案67所述的用于在方法中使用的CAR或药物组合物，其中癌症是表达雄激素受体的乳腺癌。
72.一种对癌细胞进行靶向杀伤的方法，所述方法包括：
使癌细胞与根据实施方案58至60中任一项所述的淋巴细胞接触，由此淋巴细胞诱导对癌细胞的杀伤。
73.根据实施方案72所述的方法，其中癌细胞是前列腺癌细胞或表达雄激素受体的乳腺癌细胞。
74.一种检测受试者中存在癌症的方法，所述方法包括：
(a)使从受试者获得的细胞样品与根据实施方案45至55中任一项所述的CAR接触，从而形成CAR-细胞复合物，以及
(b)检测该复合物，其中检测到复合物指示受试者中存在癌症。
优选地，该实施方案在体外进行。
实施例
提供以下实施例以进一步描述本文所公开的实施方案中的一些。这些实施例旨在说明而非限制本发明所公开的实施方案。
实施例1：具有11B6 scFv的hK2 scFv CAR的构建和表达
如图1A所示构建包含衍生自靶向hK2的抗体11B6的scFv的hK2CAR构建体。使Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28刺激的T细胞经受电穿孔，然后用OPTI-MEM(Invitrogen)洗涤三次，并且以50E6个细胞/mL的最终浓度重悬于OPTI-MEM中。随后，将0.1mL细胞(5E6个细胞)与10μg编码RNA的IVT CAR混合，并使用BTX ECM830(HarvardApparatus BTX,Holliston,MA,USA)通过按压“脉冲”按钮一次在2mm间隙比色皿(HarvardApparatus BTX,Holliston,MA,USA)中进行电穿孔。(设置：500伏特，750微秒脉冲长度，单(1)个脉冲，100毫秒间隔)在电穿孔后，将T细胞转移到6孔板中，并立即放回37℃培养箱中。采用下列方式对原代人T细胞进行电穿孔：未使用mRNA(MOCK)，或者10μg表达hK2 scFv CAR或不相关对照CAR的mRNA。在用2μg/mL生物素化的L蛋白和链霉亲和素缀合的PE(图1B)或者生物素化的hK2(1μg/mL)和链霉亲和素缀合的PE(图1C)染色后，通过流式细胞术测量电穿孔后24小时的CAR表面表达。
电穿孔后二十四小时，对T细胞进行计数。每种样品收集1E5个T细胞。用FACS缓冲液洗涤细胞两次(对于微量滴定板，使用200μL/孔的FACS缓冲液)，并弃去上清液。所有孔用含有蛋白L的100μL染色缓冲液(Genscript，目录号M000971:500；2μg/mL)染色，在4℃下温育至少30分钟，同时避光。通过添加FACS缓冲液两次洗涤细胞，对于微量滴定板，使用150μL/孔的FACS缓冲液。在室温下，以400×g离心4分钟。然后弃去上清液。所有孔用100μL链霉亲和素-R-藻红蛋白(SA-PE；1:250)和Live/dead可固定近红外死细胞染色染料(1:1000)染色，在4℃下温育至少30分钟，同时避光。然后细胞准备用于流式细胞术分析。
如图1B所示，在HK2 HL和LH CAR两者(分别为41.4％和66.3％)上观察到蛋白L染色，而在对照T细胞(未经受mRNA电穿孔的T细胞)中仅观察到背景染色(约5.5％)。如图1C所示，也可以通过J&J内部生物素标记的重组HK2蛋白(生物素Hk2蛋白，批次号：20180810，CBIS ID：KL2W12.CB.003，2.4mg/mL，1mM苄脒)，然后是SA-PE来检测原代人T细胞上的CAR表达。如图所示，如通过流式细胞术所测量的，T细胞可以有效地表达HK2 LH CAR(82.7％)，而在对照T细胞(未经受mRNA电穿孔或未公开的对照CAR(非HK2特异性的))中仅观察到背景染色(约1.73％或1.19％)。示出代表性供体T细胞的结果，并且这些结果在多个供体(至少n＝3)+生物素标记(EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC生物素，Thermo Fisher Scientific目录号：21327)中是可重现的。
实施例2：hK2 CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤
如下进行用于使用流式细胞仪的基于CellTrace Violet(CTV，Thermo FisherScientific目录号：C34557)的细胞毒性测定法的共培养。
如下制备T细胞。EP后二十四小时，对T细胞计数并以最浓缩/期望的E:T所需的浓度重悬。以100μL/孔含量添加T细胞(2×106个细胞/mL；以10:1的E:T比率(即每2E4个靶细胞中2E5个T细胞)接种100μL)。制备E:T浓度为10:1的储备液，用完整的T细胞培养基制成0.3125:1的两倍系列稀释度(Optimizer w/CTS，5％人血清，1％GlutaMax)。使用96孔圆底组织培养物处理的板一式三份接种T细胞(100μL/孔)。
如下制备CTV标记的靶细胞。将20μL DMSO添加到CTV染色溶液的小瓶中。将该储备溶液稀释到20mL PBS(温热至37℃)中，形成5μM染色溶液。收集10E6个肿瘤细胞，用PBS洗涤两次并以4E6个细胞/mL(2.5mL)重悬。添加等体积(2.5mL)的CTV染色溶液。将细胞在37℃培育箱中温育20分钟。将40mL PRMI+20％FBS添加到细胞中以吸收任何未结合染料。将细胞温育5分钟。将细胞以400×g离心5分钟。将细胞团块重悬于预温热的RPMI+10％FBS培养基中。同时，以上述期望的E/T比率接种T细胞。对肿瘤细胞系Vcap(HK2+)和DU145(HK2-)重新计数，然后以2E5个细胞/mL重悬细胞并一式两份将细胞重悬于100μL中。将细胞与标记的肿瘤细胞系在平底96孔板中共温育。
使用流式细胞仪如下进行细胞毒性测定。共培养20小时后，将所有细胞转移到U形底96孔板中并洗涤。共培养20小时后，从平底96孔板收集所有细胞并将其转移到U形底96孔板中，然后洗涤。将30μL的0.25％胰蛋白酶添加到所有孔中，并在37℃培养箱中温育5分钟。5分钟后，将所有肿瘤细胞收集到U形底96孔板。以400×g将细胞离心5分钟，并洗涤两次。然后将细胞团块重悬于稀释(1:1000)的LIVE/DEADTM可固定近红外染色染料(100μL)中。将细胞在4℃下温育30分钟，并通过将细胞以400×g离心5分钟，用FACS缓冲液洗涤两次。洗涤后，使用100μL BD CytofixTM固定缓冲液(50μL FACS缓冲液+50μL固定缓冲液)将所有细胞固定10分钟。以400×g将细胞离心5分钟，并洗涤一次。将细胞团块重悬于FACS缓冲液中。在温育期结束后通过多色流式细胞术分析染色的样品。
使用以下公式计算细胞毒性活性百分比：
特异性死亡％＝近红外+CTV+(死)细胞％-自发近红外+CTV％/(100％-自发近红外+CTV+(死)细胞％)×100％。
瞬时转染之后二十四小时，用Cell Trace Violet(CTV)荧光染料标记靶细胞(Vcap和DU145)，然后与hK2 CAR-T细胞共培养。Mock T细胞充当阴性效应子对照。将细胞在图2所示的指定效应子与靶细胞(E/T)比率下共培养20小时。杀灭百分比是共培养物中剩余的活(生存力染料阴性)靶(CTV阳性)细胞的绝对数目相对于不与CAR-T细胞一起培养的活靶标的数目的比率。如图所示，在10:1至0.3125:1的E/T比率下，hK2CAR LH T细胞特异性地且有效地裂解hK2(+)人前列腺癌细胞系VCap细胞，但非K2(-)DU145细胞，而仅在Mock或hK2HL CAR的T细胞中观察到背景细胞毒性。
另外使用xCELLigence作为实时细胞分析系统测试了hK2特异性CAR-T细胞的实时细胞毒性，作为针对免疫细胞介导的靶细胞溶解的效能测定。
将50μL靶癌细胞培养基添加到96孔E-板(ACEA Biosciences)的每个孔中，并且测量背景阻抗并作为细胞指数显示。然后，将所粘附的靶细胞VCap和DU145解离并以5E4个(VCap)细胞/E板的孔、5E3个(DU145)细胞/E板的孔的密度接种100μL的体积，并且允许其被动地粘附在电极表面上。接种后，将E板在环境温度下在层流净化罩内保持30分钟，然后转移到细胞培养箱内的RTCA MP仪器中。在实验的整个持续时间(96小时)内，立即以15分钟间隔开始数据记录。
在施加处理(癌细胞接种后24小时)时，暂停数据采集，从每个孔去除50μL培养基，并且以不同的效应子与靶细胞(E:T)比率添加50μL体积的效应子CAR T细胞。将HK2 CAR+和未公开的对照CAR(非HK2特异性)T细胞重悬。然后在96孔板(从5:1到0.156:1E/T比率)中一式两份进行两倍稀释。还将靶细胞加Mock效应子对照(未经受RNA电穿孔的T细胞)添加到靶细胞中。
在不同E/T比率下将靶细胞VCap(5E4个细胞)和DU145(5E3个细胞)与Mock、10μgmRNA电穿孔(转染后24小时)hK2 11B6 CAR LH或对照CAR-T细胞一起温育大约72小时。VCap和DU145的归一化细胞指数(CI)曲线图分别示于图3A和图3B中。当单独接种时，靶细胞粘附到板并增殖，从而增大CI读数。当将T细胞添加到靶细胞中时，hK2CAR和对照CAR-T细胞致使细胞溶解和随后CI递降。
实施例3：hK2 CAR-T细胞的细胞因子产生
不受理论的束缚，由细胞毒性T细胞产生的IFN-γ可允许施加肿瘤的免疫监视，免疫监视可直接抑制增殖并诱导一些恶性肿瘤在体内和体外的细胞凋亡。为了确定hK2 CAR修饰的人T细胞是否能够识别hK2(+)肿瘤细胞并被这些肿瘤细胞活化，从基于xCELLigence的杀伤测定中收集上清液，如实施例2和图3A-3B中所述。在共培养约70小时后，收集上清液并且根据随ELISA试剂盒(人IFN-γELISA MAXTMDeluxe，BioLegend，目录号：430106)提供的说明书通过ELISA测定。
图4中示出抗原刺激的CAR-T细胞的Th1细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)产生。hK2CAR LH和对照CAR修饰的T细胞在与表达hK2的VCap细胞(但非hK2阴性DU145细胞)共培养期间以E:T比率依赖性方式分泌IFN-γ。未公开的对照CAR因比hK2高得多的抗原表达水平而分泌更大量的IFN-γ。示出了重复培养物的平均IFN-γ浓度±SD(pg/mL)。
实施例4：热稳定的scFv CAR构建体的生成和表征
通过等人(Clinical Chemistry，第50卷第9期，第1607-1617页，2004年)所述用重组HK2免疫BALB/c小鼠来鉴定抗HK2抗体克隆11B6。通过Singh等人，MAbs，2015年，第7卷第4期，第778-791页中所述的方法执行鼠衍生的克隆11B6的人源化。因为野生型11B6的胞外域作为scFv在高温(55℃)下不保持结合，因此以scFv进行人源化，并且将来自人源化变体的表达大肠杆菌的上清液在60℃下温育15分钟，然后使用ELISA筛选与重组HK2的结合。
生成十个靶向hK2的CAR，这些CAR含有衍生自抗体11B6的热稳定的scFv。
对含有热稳定的scFv的十个CAR构建体的描述及其SEQ ID NO提供于表1中。
表1.具有11B6热稳定的scFv的CAR构建体
构建体编号 说明 SEQ ID NO
1 HL_HCG5_LCD6_20AA 46
2 HL_HCG5_LCHumanized_20AA 47
3 HL_HCF3_LCB7_20AA 48
4 HL_HCG5_LCB7_20AA 49
5 LH_LCD6_HCG5_20AA 50
6 LH_LCHumanized_HCF3_20AA 51
7 LH_LCHumanized_HCG5_20AA 52
8 LH_LCB7_HCF3_20AA 53
9 LH_LCB7_HCG5_20AA 54
10 LH_LCD6_HCF3_20AA 55
通过Jurkat-LuciaTMNFAT细胞(JNL)鉴定具有抗原依赖性活化的基于不同scFv的CAR。活化的T细胞(NFAT)的核因子是首先被鉴定为免疫细胞调节剂的转录因子家族。T细胞活化导致钙流入，使钙调磷酸酶活化，钙调磷酸酶在NFAT的N末端使丝氨酸富集的核定位信号脱去磷酸，从而导致NFAT的核导入。不受理论的束缚，随后可通过在JNL报告基因细胞系中由NFAT启动子驱动的Firefly荧光素酶检测因scFv聚集引起的强直信号传导。
JNL细胞即含有由信号传导响应性NFAT启动子驱动的荧光素酶基因的Jurkat细胞用各种CAR构建体转导。CAR构建体与其同源细胞抗原(靶细胞上的hK2)之间的结合导致JNL细胞中的荧光素酶表达。
慢病毒转导如下进行。收获JNL细胞并将其重悬至1E6个细胞/mL。以3的MOI添加500μL的JNL细胞和慢病毒病毒，并且通过上下移液混合。将混合物在37℃培养箱中温育24小时。将500μL JNL培养基添加到每个孔中，在37℃培养箱中继续培养。在第4天将细胞转移到T25烧瓶中。在第5-6天，进行转导验证。收获150μL细胞以通过针对您正在使用的特定CAR的适当检测试剂来检查CAR表达(例如，生物素-hk2蛋白用于检测hk2 CAR)。将JNL细胞维持在5×105个细胞/mL直至获得足够的细胞以冷冻或在测定中使用。
在针对抗原依赖性活性的JNL报告基因测定中评估热稳定的scFv CAR。含有由信号传导响应性NFAT启动子驱动的荧光素酶基因的Jurkat细胞(称为JNL细胞)用各种hK2CAR构建体转导。测定法如下进行。以2:1的效应子与靶细胞比率进行与靶细胞系的共培养。将JNL细胞旋转以去除培养基中的任何分泌的荧光素酶；然后将JNL细胞以4×105个细胞/mL重悬于新鲜培养基中。收获细胞。然后，以2E5个细胞/mL制备抗原阳性靶细胞系和抗原阴性靶细胞系两者。将100μL JNL添加到100μL靶细胞中。对于仅JNL对照，添加100μL培养基而不是靶细胞。对于阳性对照，将仅JNL细胞或CAR JNL细胞添加到1X细胞刺激混合物中并在37℃培养箱中温育24小时。将150μL上清液收获到96孔板中并离心以去除细胞。将100μL上清液从板转移到实底黑色板。然后，添加100μL QUANTI-luc lucia检测试剂。将混合物在室温下温育5分钟，然后用Envision多功能读板仪读取。
通过生物素化的hK2，然后是链霉亲和素缀合的PE确定CAR表达，结果示于图5A。针对所有所选克隆，确认转导的JNL细胞中的CAR表达，其中60％-75％的细胞显示跨不同克隆和亲本11B6 CAR的可检测表达。将含有指定CAR克隆的JNL细胞和未转导的JNL细胞(UTD)与靶细胞系(VCap或DU145细胞)共培养，并且以发光强度测量荧光素酶活性。在存在表达抗原的细胞的情况下，当发光强度超过UTD细胞的水平的1.5倍时，认为克隆是活性的。
CAR构建体与其同源细胞抗原(靶细胞上的hK2)之间的结合导致JNL细胞中的荧光素酶表达(图5B)。将含有指定CAR克隆的JNL细胞和JNL细胞(未转导的，下文称为“UTD”)与靶细胞系(VCap或DU145细胞)共培养，并且以发光强度测量荧光素酶活性。在存在表达抗原的细胞的情况下，当发光强度超过UTD细胞的水平的1.5倍时，认为克隆是活性的。未发现所有10个克隆和亲本11B6 CAR HL和LH的抗原依赖性活化。
实施例5：T细胞上的热稳定的scFv CAR的表达
为了评估热稳定的11B6 CAR T细胞的功能并选择优质候选构建体，使用慢病毒转导生成11B6热稳定的和基于亲本scFv的CAR T细胞。用感染复数(MOI)为3的11B6热稳定的和基于亲本scFv的CAR慢病毒转导原代人T细胞。在转导后14天通过生物素化的hK2(1μg/mL)，然后是链霉亲和素缀合的PE确定CAR表达。
实验方案如下。
进行慢病毒包装。每150mm2圆底CorningTMBioCoatTMI型胶原蛋白包被的培养皿接种14E6个Lenti-XTM293T细胞，并在37℃下使用DMEM+10％FBS培养基温育过夜。
使用在80％-85％的理想融汇下的Lenti-XTM293T细胞，制备以下试剂。用21mL293T生长培养基代替培养基。将Lipofectamine 2000在室温和平衡的OptiMEM下稀释。将稀释的Lipofectamine 2000逐滴添加到混合质粒中，并且充分混合。将混合物在室温下温育25分钟。将转染混合物逐滴添加到Lenti-X 293T细胞中，并轻轻旋转板以加以混合。将混合物在37℃培养箱中温育。转染后24和48小时收获慢病毒。以上试剂汇总于表2中。
表2
试剂 每15cm培养皿中的量
pMDLg/p 18μg
pRSV.Rev 18μg
pMD2.G 7μg
转移(CAR)质粒 15μg
OptiMEM 1500μL
如下进行慢病毒浓缩。收获含有慢病毒的上清液，如果过量的293T细胞在过滤通过0.45μm乙酸纤维素过滤器之前四处浮动，则将上清液以500×g离心10分钟。将上清液转移到无菌容器中，与1/3体积的Lenti-X浓缩试剂(Clontech，目录号631232)组合，并且通过轻轻倒置混合。将混合物在4℃下温育过夜。将样品在4℃下以1,500×g离心45分钟，在离心后可见白色团块。小心地去除上清液而不扰乱团块。在以1,500×g短暂离心后，用移液管去除残留的上清液。使用冷T细胞生长将团块轻轻重悬于原始体积的1/10中。将病毒等分于200μL中并立即储存在-80℃下。
如下进行病毒滴度测定。对数生长期SupT1在完全RPMI中生长。将每孔100μL 20,000个SupT1细胞/mL接种在96孔平板中。然后在96孔圆底板中进行病毒滴度测定。将100μL培养基添加到板上的所有孔中。用一只手将病毒等分试样从-80℃冰箱中解冻。将等分试样上下移液以充分混合，并且将50μL病毒添加到第一孔中，然后完全混合。通过将50μL病毒移液到下一孔来进行连续1:3稀释。然后，将50μL培养基添加到仅第一抗体、仅第二抗体和未转导的对照。用多通道移液管将50μL各样品从滴定板转移到测定板中的100μL SupT1细胞，并在37℃下温育过夜。将100μL预热培养基添加到每个样品中，并且再温育两天。通过流式细胞术确定转导效率。将样品转移到圆底96孔板中，并以1400RPM旋转3分钟。快速弃去上清液，随后吸干以去除罩中的过量培养基。用150μL FACS缓冲液重复洗涤。然后进行适用于CAR构建体的染色方案。在流式细胞术分析之前，将样品重悬于150μL FACS缓冲液中。
病毒滴度计算：滴度＝(CAR阳性％/100)×2×104×20X稀释因子
为了排除多拷贝整合，使用最接近20％转导的滴度。
如下进行T细胞活化、转导和扩增。将初始T细胞的小瓶在水浴中解冻，并且逐滴添加到含有9mL预热T细胞培养基(TCM CTS OpTmizer T细胞扩增SFM+5％人血清+IL-2100IU/mL)的15mL锥形管中。将冷冻小瓶用1mL培养基洗涤以回收最大数目，并在室温下以300×g旋转8分钟。将团块重悬于10mL新鲜TCM中，计数，并重悬至每微升1E6个细胞。在24孔板中每孔添加5E5个细胞。每孔添加500μL的1.5×106个CD3/CD28珠粒，使得总体积为1mL/孔。活化后二十四小时，将病毒在室温下解冻。在感染复数(MOI)为3下添加病毒，轻轻旋转以加以混合，并在培养箱中回到板上。(慢病毒功能滴度先前已用SupT1滴度测定法确定。)保留一个孔用于其中不添加病毒的未转导的(UTD)细胞。
转导后二十四小时，将1mL TCM添加到每个孔中。自此添加青霉素-链霉素(第2天)。在第3-5天，每2mL细胞添加4mL TCM并将其转移到T25组织培养物处理的烧瓶中。将烧瓶水平放置在培养箱中(第3天)。添加等体积的TCM以用于T细胞培养(第4天)。在第5-14天，每隔一天检查细胞，并记录生存力、尺寸和总细胞计数。将细胞密度调节至每毫升一百万个细胞。收获的理想时间是供体依赖性的并且由细胞尺寸和扩增倍数确定。通常当基于MOXI流式细胞计数器细胞尺寸小于8μm并扩增100至200倍时，将细胞冷冻。
如下所述，在收获日检查慢病毒转导效率。将培养物充分混合。用100μL FACS缓冲液将100μL T细胞收获到96孔板中的对应孔中，加以混合，并在室温下以1300RPM旋转3分钟。将细胞重悬于200μL FACS缓冲液中，并在4℃下重复离心。
将细胞重悬于100μL生物素标记的hK2中(1μg/mL稀释于FACS缓冲液中)并在冰上温育30分钟。添加100μL的FACS缓冲液，并在4℃下旋转洗涤。再添加200μL FACS缓冲液之后，重复旋转洗涤。在冰上用100μL含有第二抗体SA-PE(1:250)、Live/dead可固定染色剂(1:500)、αCD3、αCD4和αCD8抗体的母液染色30分钟。添加100μL FACS缓冲液，并在4℃下旋转洗涤，弃去并且重悬于200μL FACS缓冲液中，然后在4℃下旋转洗涤。将样品重悬于100μLFACS缓冲液中，然后通过流式细胞术进行分析。
如下进行细胞收获和冷冻。确定最终细胞计数。收获培养物并在室温下以300×g离心10分钟。将培养物重悬于较小体积的培养基中以适合50mL锥形管。将管放置在磁体中，在4℃下保持10分钟以“去珠粒”。将细胞轻轻从管中转移，以最小程度地干扰珠粒/磁体，并记录确切体积。重复计数。在300×g下离心10分钟，弃去上清液。在冷却容器中将细胞冷冻在CS-10细胞低温保存培养基中。立即将容器转移到-80℃，保持24-48小时，然后在液氮中永久性存储。结果示于图6中，并确认转导的T细胞上的hK2 CAR表达。提供了由所分析的10个热稳定克隆和亲本11B6 HL&LH中的每一者检测到的hK2 CAR+T细胞百分比(阳性％)的汇总。如图所示，不同的克隆具有不同的CAR表达水平，范围从17.9％至42.7％。将所有CAR T细胞归一化为相等的CAR+T细胞，以用于随后的功能测定。
实施例6：11B6热稳定的scFv CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤
在实时IncuCyte杀伤测定法中评估11B6热稳定的scFv CAR-T细胞的抗原依赖性细胞毒性。将热稳定的hK2 CAR-T细胞和亲本11B6 CAR-T细胞与VCaP细胞(图7A)和PC3细胞(图7B)共温育88小时。基于CAR表达数据计算效应子与靶细胞(E/T)比率(图6)。靶细胞稳定地表达红色核染料，这通过IncuCyte成像系统以实时方式测量。肿瘤细胞生长抑制(％)＝(初始活靶细胞数-当前活靶细胞数)/初始活细胞数*100(％)。
在实时IncuCyte杀伤测定法中评估scFv CAR-T细胞的抗原依赖性细胞毒性。将热稳定的hK2 CAR-T细胞和亲本11B6 CAR-T细胞与VCaP细胞(图7C)或PC3细胞(图7D)在基于CAR表达数据计算的1:1或0.5:1的效应子:靶细胞比率下共温育88小时。将用CAR17、CAR18、CAR19和CAR20转导的CAR-T细胞与hK2阳性VCaP细胞和hK2阴性DU145细胞在基于T细胞上的CAR表达计算的1:1或0.5:1的效应子与靶细胞(ET)比率下共温育96小时。用CAR17、CAR18、CAR19和CAR20转导的CAR-T细胞随时间推移对VCap细胞和DU145细胞的肿瘤细胞生长抑制百分比示于图7E和图7F中。靶细胞稳定地表达红色核染料，这通过IncuCyte成像系统以实时方式测量。肿瘤细胞生长抑制(％)＝(初始活靶细胞数-当前活靶细胞数)/初始活细胞数*100(％)。所测试的CAR-T细胞达到大约100％TGI，而未转导的对照未表现出任何TGI。在hK2阴性DU145细胞中未观察到所测试的CAR-T细胞表现出TGI。
实施例7：11B6热稳定的scFv CAR-T细胞的细胞因子产生
使用13-plex Milliplex人高灵敏度T细胞试剂盒(HSTCMAG28SPMX13)分析从hK2CAR-T细胞与VCap细胞在1:1的E/T比率下的过夜(大约20小时)共培养物收集的上清液。hK2CAR修饰的T细胞在与表达hK2的VCap细胞共培养期间分泌细胞因子，但对于未转导的T细胞(UTD)来说分泌最少。由hK2 lenti-CAR-T细胞释放细胞因子的结果示于图8中。
从hK2 CAR-T细胞与VCap、DU145(5E4个细胞)细胞在1:1的E/T比率下的过夜(大约20小时)共培养物中收集上清液。hK2 CAR修饰的T细胞在与表达hK2的VCap细胞(但非hK2-阴性DU145细胞)共培养期间分泌IFN-γ。CD3/28珠粒刺激T细胞，并且仅T细胞分别用作阳性对照和阴性对照。由hK2 lenti-CAR-T细胞释放IFN-γ示于图9中。(使用实施例3的方案。)示出了重复培养物的平均IFN-γ浓度±SD(pg/mL)。CD3/28珠粒刺激T细胞，并且仅T细胞分别用作阳性对照和阴性对照。如图所示，不同的热稳定CAR T细胞在与hK2(+)VCap细胞共培养时产生不同量的IFN-γ，这与细胞介导的免疫应答期间的细胞毒性活性相关联。
实施例8：hK2 CAR-T细胞的增殖
在增殖测定中评估hK2 CAR-T细胞。T细胞增殖是体内免疫功能的一个重要的体外参数。为了进一步评估热稳定的11B6 CAR T细胞的功能并选择优质候选构建体，用CTV标记11B6热稳定的和基于亲本scFv的CAR T细胞。
hK2 CAR和未转导的(UTD)T细胞用CellTrace Violet(CTV；5μM)标记并与hK2(+)VCap细胞和hK2(-)DU145细胞共培养。共培养后五天，收获细胞并用CD3、CD25、Live/dead近红外染料和hK2 CAR染色。在配有Flowjo软件的Fortessa流式细胞仪上进行流式细胞术分析。通过活CD3鉴定淋巴细胞，并且确定具有CTV染料稀释和活化标志物CD25的CAR-T细胞的频率。通过在hK2 CAR+T细胞上进行门控，如图所示，hK2(+)Vcap细胞但非hK2(-)DU145细胞促进所有CAR构建体工程化T细胞的增殖和活化标志物CD25的上调(图10A、图10C)。CD3/28珠粒刺激T细胞，并且仅T细胞分别用作阳性对照和阴性对照。仅不经任何刺激的T细胞未增殖，并且CD3/28珠粒刺激的T细胞表现出等效的增殖模式(图10B、图10D)。如图10E所示，在与VCap细胞共培养5天后，hK2 CAR+T细胞比CD3/28珠粒阳性对照更稳健地增殖。不同的CAR构建体工程化T细胞具有不同的增殖活性并且表现出不同的CAR+T细胞计数。CAR+T细胞计数基于来自三次技术平行测定的平均绝对细胞计数+/-SEM。
方案如下。收集肿瘤细胞Vcap和DU145，用PBS洗涤两次，并以10E6个细胞/mL重悬于含有100μg/mL丝裂霉素C(MMC)的PBS中，在37℃培养箱中保持1.5小时，以便阻断肿瘤细胞增殖。将20μL的DMSO添加到CTV染色溶液的小瓶中。将5μL的溶液稀释到5mL(1:1000)PBS(温热至37℃)中以提供5μM染色溶液。对2E6个T细胞计数，收集，用PBS洗涤两次并以4E6个细胞/mL(0.5mL)重悬。添加等体积(0.5mL)的CTV染色溶液。将细胞在37℃下温育20分钟。然后，将4mL PRMI+20％FBS添加到细胞中以吸收任何未结合染料。将细胞温育5分钟，并以400×g离心5分钟。将细胞团块重悬于预温热的RPMI+10％FBS培养基中。对T细胞计数，并将1E5个细胞(100μL)接种在96孔平底板中。
同时，收集经MMC处理的肿瘤细胞hK2(+)VCap和HK2(-)DU145并在1.5小时后计数，然后以1E6个细胞/mL重悬。将1E5个细胞(100μL)与T细胞在96孔板中共培养。将单独的T细胞和以3:1CD3/28珠粒与细胞比率添加的T细胞分别用作阴性对照和阳性对照。
共培养5天后，从每个孔收集所有细胞。以400×g将细胞离心5分钟并洗涤两次，然后在96孔U形底板中用hK2 CAR、CD3、CD8和CD25、Live/dead(近红外)染料染色。洗涤后，使用100μL BD CytofixTM固定缓冲液(50μL FACS缓冲液+50μL固定缓冲液)将所有细胞固定10分钟。在温育期结束后通过多色流式细胞术分析染色的样品。
如下进行数据分析。制作CTV柱状图。将CTV未稀释的门设置为包围单独培养的T细胞的最右侧峰(CTV亮)，并且将CTV稀释的门设置为捕获其余群体。将其应用于所有样品。
实施例9：具有抗HK2 scFv的hK2 scFv CAR的构建和表达
如图11A所示构建包含衍生自新型抗HK2 scFv的scFv的hK2 CAR构建体。
为了评估这些新型抗HK2 scFv CAR T细胞的功能并选择优质候选构建体，使用慢病毒转导生成hK2 Hl和\LH CAR-T细胞。用感染复数(MOI)为3的hK2 CAR HL和LH—基于新型scFv的CAR慢病毒转导原代人T细胞。在转导后14天通过生物素化的hK2(1μg/mL)，然后是链霉亲和素缀合的PE确定CAR表达。
实验方案如下。
进行慢病毒包装。每150mm2圆底CorningTMBioCoatTMI型胶原蛋白包被的培养皿接种14E6个Lenti-XTM293T细胞，并在37℃下使用DMEM+10％FBS培养基温育过夜。
使用在80％-85％的理想融汇下的Lenti-XTM293T细胞，制备以下试剂。用21mL293T生长培养基代替培养基。将Lipofectamine 2000在室温和平衡的OptiMEM下稀释。将稀释的Lipofectamine 2000逐滴添加到混合质粒中，并且充分混合。将混合物在室温下温育25分钟。将转染混合物逐滴添加到Lenti-X 293T细胞中，并轻轻旋转板以加以混合。将混合物在37℃培养箱中温育。转染后24和48小时收获慢病毒。以上试剂汇总于表3中。
表3
试剂 每15cm培养皿中的量
pMDLg/p 18μg
pRSV.Rev 18μg
pMD2.G 7μg
转移(CAR)质粒 15μg
OptiMEM 1500μL
如下进行慢病毒浓缩。收获含有慢病毒的上清液，如果过量的293T细胞在过滤通过0.45μm乙酸纤维素过滤器之前四处浮动，则将上清液以500×g离心10分钟。将上清液转移到无菌容器中，与1/3体积的Lenti-X浓缩试剂(Clontech，目录号631232)组合，并且通过轻轻倒置混合。将混合物在4℃下温育过夜。将样品在4℃下以1,500×g离心45分钟，在离心后可见白色团块。小心地去除上清液而不扰乱团块。在以1,500×g短暂离心后，用移液管去除残留的上清液。使用冷T细胞生长将团块轻轻重悬于原始体积的1/10中。将病毒等分于200μL中并立即储存在-80℃下。
如下进行病毒滴度测定。对数生长期SupT1在完全RPMI中生长。将每孔100μL 20,000个SupT1细胞/mL接种在96孔平板中。然后在96孔圆底板中进行病毒滴度测定。将100μL培养基添加到板上的所有孔中。用一只手将病毒等分试样从-80℃冰箱中解冻。将等分试样上下移液以充分混合，并且将50μL病毒添加到第一孔中，然后完全混合。通过将50μL病毒移液到下一孔来进行连续1:3稀释。然后，将50μL培养基添加到仅第一抗体、仅第二抗体和未转导的对照。用多通道移液管将50μL各样品从滴定板转移到测定板中的100μL SupT1细胞，并在37℃下温育过夜。将100μL预热培养基添加到每个样品中，并且再温育两天。通过流式细胞术确定转导效率。将样品转移到圆底96孔板中，并以1400RPM旋转3分钟。快速弃去上清液，随后吸干以去除罩中的过量培养基。用150μL FACS缓冲液重复洗涤。然后进行适用于CAR构建体的染色方案。在流式细胞术分析之前，将样品重悬于150μL FACS缓冲液中。
病毒滴度计算：滴度＝(CAR阳性％/100)×2×104×20X稀释因子
为了排除多拷贝整合，使用最接近20％转导的滴度。
如下进行T细胞活化、转导和扩增。将初始T细胞的小瓶在水浴中解冻，并且逐滴添加到含有9mL预热T细胞培养基(TCM CTS OpTmizer T细胞扩增SFM+5％人血清+IL-2100IU/mL)的15mL锥形管中。将冷冻小瓶用1mL培养基洗涤以回收最大数目，并在室温下以300×g旋转8分钟。将团块重悬于10mL新鲜TCM中，计数，并重悬至每微升1E6个细胞。在24孔板中每孔添加5E5个细胞。每孔添加500μL的1.5×106个CD3/CD28珠粒，使得总体积为1mL/孔。活化后二十四小时，将病毒在室温下解冻。在感染复数(MOI)为3下添加病毒，轻轻旋转以加以混合，并在培养箱中回到板上。(慢病毒功能滴度先前已用SupT1滴度测定法确定。)保留一个孔用于其中不添加病毒的未转导的(UTD)细胞。
转导后二十四小时，将1mL TCM添加到每个孔中。自此添加青霉素-链霉素(第2天)。在第3-5天，每2mL细胞添加4mL TCM并将其转移到T25组织培养物处理的烧瓶中。将烧瓶水平放置在培养箱中(第3天)。添加等体积的TCM以用于T细胞培养(第4天)。在第5-14天，每隔一天检查细胞，并记录生存力、尺寸和总细胞计数。将细胞密度调节至每毫升一百万个细胞。收获的理想时间是供体依赖性的并且由细胞尺寸和扩增倍数确定。通常当基于MOXI流式细胞计数器细胞尺寸小于8μm并扩增100至200倍时，将细胞冷冻。
如下所述，在收获日检查慢病毒转导效率。将培养物充分混合。用100μL FACS缓冲液将100μL T细胞收获到96孔板中的对应孔中，加以混合，并在室温下以1300RPM旋转3分钟。将细胞重悬于200μL FACS缓冲液中，并在4℃下重复离心。
将细胞重悬于100μL生物素标记的hK2中(1μg/mL稀释于FACS缓冲液中)并在冰上温育30分钟。添加100μL的FACS缓冲液，并在4℃下旋转洗涤。再添加200μL FACS缓冲液之后，重复旋转洗涤。在冰上用100μL含有第二抗体SA-PE(1:250)、Live/dead可固定染色剂(1:500)、αCD3、αCD4和αCD8抗体的母液染色30分钟。添加100μL FACS缓冲液，并在4℃下旋转洗涤，弃去并且重悬于200μL FACS缓冲液中，然后在4℃下旋转洗涤。将样品重悬于100μLFACS缓冲液中，然后通过流式细胞术进行分析。
如下进行细胞收获和冷冻。确定最终细胞计数。收获培养物并在室温下以300×g离心10分钟。将培养物重悬于较小体积的培养基中以适合50mL锥形管。将管放置在磁体中，在4℃下保持10分钟以“去珠粒”。将细胞轻轻从管中转移，以最小程度地干扰珠粒/磁体，并记录确切体积。重复计数。在300×g下离心10分钟，弃去上清液。在冷却容器中将细胞冷冻在CS-10细胞低温保存培养基中。立即将容器转移到-80℃，保持24-48小时，然后在液氮中永久性存储。结果示于图11B中，并确认转导的T细胞上的hK2 CAR表达。提供了通过所分析的新型KL2B413HL&LH和重人源化11B6 KL2B359 HL&LH CAR检测的对hK2 CAR+T细胞(阳性％)的百分比的汇总。如图所示，不同的克隆具有不同的CAR表达水平，范围从45.1％至59.9％。将所有CAR T细胞归一化为相等的CAR+T细胞，以用于随后的功能测定。
实施例10：抗hK2抗体和scFv的生成
通过亲本m11B6抗体的人源化生成抗体。
亲本小鼠抗HK2抗体m11B6已描述于等人(Clinical Chemistry，第50卷第9期，第1607-1617页，2004年)中。人源化11B6(本文中称为hu11B6)已生成和描述于美国专利9,345,782和美国专利10,100,125。
开始hu11B6的工程化以产生具有改善特性(诸如改善的热稳定性)的附加抗HK2抗体。在hu11B6框架中鉴定残基位置，这些残基位置可以潜在地改变以使用建模来改善hu11B6的热稳定性。所鉴定的位置是VH中的残基P41、I49、M70和A88以及VL中的残基S80、L82、A88和Y91(残基根据SEQ ID NO:5的hu11B6_VH和SEQ ID NO:2的hu11B6_VL编号)。
在定向VH-接头-VL中生成二元组合scFv文库，其中可变区中的一者表示组合文库，另一者是亲本hu11B6 VH或VL。GGSEGKSSGSGSESKSTGGS(SEQ ID NO:7)的接头序列用于缀合VH/VL区。工程化scFv在大肠杆菌中表达，并且通过ELISA测试上清液中产生的scFv与人hK2的结合，并将其与hu11B6的结合进行比较。将表现出与hu11B6相当的结合的任何新变体合并并进一步测试其在55℃、60℃和65℃下温育10分钟后与人hK2的结合。在55℃、60℃和65℃下温育后保留与hu11B6相当的结合并改善热稳定性的分子在两个定向(VH-接头-VL；VL-接头-VH)中是矩阵排列的并且转化为哺乳动物scFv以供进一步表征。还将矩阵排列的scFv掺入CAR构建体中并且如实施例11中进一步所述进一步表征。
另外，按照Singh等人(MAbs.，2015年，第7卷第4期，第778-791页)概述的方法进行亲本小鼠11B6的另一种人源化，其中存在广泛的种系变异并小心筛选变体以用于增强热稳定性。基于序列保守性，选择人重链种系IGHV4-30和轻链种系IGKV3D-11用于框架适应。构建二元scFv文库，该文库具有包括选定体细胞超突变位点组和小鼠/人种系变异的残基。如上所述将变体克隆并在大肠杆菌中表达。在单点ELISA中在不同温度下筛选上清液，以用于增强热稳定性。小鼠/人嵌合11B6 scFv用作亲本对照。将保持与鼠11B6类似的结合活性和67℃的TM值的克隆KL2B359转化为scFv-Fc和CAR-T以进行另外的谱分析。通过SPR测量的KL2B359对hK2的亲和力(KD)为约0.7nM-1nM。HCF3-LCD6、HCG5-LCB7、KL2B357、KL2B358和KL2B360也由此活动产生并且进一步表征其功能性。
使用表达人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠 和转基因大鼠 生成抗体。
含有嵌合人/大鼠IgH基因座(包含22个人VH，全部的人D和JH片段以天然构型连接至大鼠CH基因座)连同完整人IgL基因座(连接至Jκ-Cκ的12个Vκ和连接至Jλ-Cλ的16个Vλ)。(参见例如，Osborn等人，2013年，J Immunol，第190卷，第4期，第1481-1490页)。因此，大鼠表现出大鼠免疫球蛋白的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生具有完全人可变区的高亲和力嵌合人/大鼠IgG单克隆抗体。WO14/093908中描述了的制备和用途以及由这些大鼠携带的基因组修饰。
小鼠生成具有与人CH1和CL结构域连接的人可变结构域、嵌合人/小鼠铰链区和小鼠Fc区的抗体。Ablexisκ小鼠和λ小鼠菌株通过其重链中的哪些重链是人或小鼠来区分，如下所述。由κ小鼠产生的抗体缺乏衍生自小鼠VH、DH和JH外显子以及小鼠Vκ、Jκ和Cκ外显子的序列。内源性小鼠Igλ在κ小鼠中是活跃的。人Igκ链包含大约90％-95％的初始库，并且小鼠Igλ链在该菌株中包含大约5％-10％的初始库。由λ小鼠产生的抗体缺乏衍生自小鼠VH、DH和JH外显子以及小鼠Vλ、Jλ和Cλ外显子的序列。内源性小鼠Igκ在λ小鼠中是活跃的。人Igλ链包含大约40％的初始库，并且小鼠Igκ链包含大约60％的初始库。WO11/123708中描述了的制备和用途以及由这些小鼠携带的基因组修饰。
用可溶性全长KLK2蛋白(人激肽释放酶-2 6-His蛋白)免疫Ablexis小鼠和OmniRat大鼠。
人激肽释放酶-2 6-His蛋白
VPLIEGRIVGGWECEKHSQPWQVAVYSHGWAHCGGVLVHPQWVLTAAHCLKKNSQVWLGRHNLFEPEDTGQRVPVSHSFPHPLYNMSLLKHQSLRPDEDSSHDLMLLRLSEPAKITDVVKVLGLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLRPRSLQCVSLHYSEKVTEFMLCAGLWTGGKDTCGGDSGGPLVCNGVLQGITSWGPEPCALPEKPAVYTKVVHYRKWIKDTIAANPHHHHHH(SEQ ID NO:319)
从淋巴结提取来自Ablexis小鼠和OniRat大鼠的淋巴细胞，并以群组进行融合。将细胞组合并分选以用于CD138表达。使用可溶性hK2抗原以高通量微型MSD形式进行杂交瘤筛选。将大约>300个样品鉴定为hK2结合剂。通过Biacore 8K SPR通过单循环动力学方法测量>300个抗hKLK2上清液样品与人KLK2蛋白的结合。另外，还测试了上清液样品与人KLK3蛋白的结合。并行地，还通过流式细胞术测试上清液与表达KLK2的细胞系VCap和阴性细胞系DU145的结合。如上所述，在VH-VL和VL/VH两种定向和热稳定性测试中，使选定细胞结合剂进一步进行scFv转化。Ablexis小鼠免疫活动产生KL2B413、KL2B30、KL2B53和KL2B242。OmniRat免疫活动产生KL2B467和KL2B494。
通过上述各种免疫和人源化活动生成的抗体以fab形式、mAb形式、VH-接头-VL定向中的scFv形式或VL-接头-VH定向中的scFv形式表达，并且如下所述进一步分析。上述SEQID NO:7的接头序列用于缀合VH/VL区。
实施例11.抗KLK2抗体的结构表征
本文提供了在细胞内测定中显示最高性能的抗体可变结构域和scFv抗体片段的序列。可变结构域以Fab形式、VH-接头-VL定向中的scFv形式或VL-连接子-VH定向中的scFv形式表达。
可变结构域VH、VL和CDR
表4示出选定抗hK2抗体的VH和VL氨基酸序列。表5示出选定抗hK2抗体的KabatHCDR1、HCDR2和HCDR3。表6示出选定抗hK2抗体的Kabat LCDR1、LCDR2和LCDR3。表7示出选定抗hK2抗体的AbM HCDR1、HCDR2和HCDR3。表8示出抗hK2的AbM LCDR1、LCDR2和LCDR3。表9汇总了选定hK2抗体的可变结构域序列和SEQ ID NO。表10示出VH和VL区的蛋白和DNA SEQ IDNO。
表4.选定抗hK2抗体的VH和VL氨基酸序列。
表5.选定抗KLK2抗体的Kabat HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。
表6.选定抗hK2抗体的Kabat LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
表7.选定抗hK2抗体的AbM HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。
表8.选定抗hK2抗体的AbM LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
表9.选定抗hK2抗体的可变结构域的氨基酸序列和SEQ ID NO概述
表10.选定hK2抗体的VH和VL结构域的DNA序列的SEQ ID NO。
共有VH和VL序列
图17A示出mu11B6、hu11B6、KL2B357、KL2B358、KL2B359、KL2B360、HCF3和HCG5的VH结构域的序列对比。图2示出mu11B6、hu11B6、KL2B357、KL2B358、KL2B359、KL2B360、LDC6和LCB7的VL结构域的序列对比。分别确定SEQ ID NO:344和SEQ ID NO:345的共有氨基酸序列的VH和VL结构域。HCDR和LCDR残基带下划线。
SEQ ID NO:344
QVQLQESGPGLVKPSX1TLSLTCX2VSGNSITSDYAWNWIRQX3PGKGLEWX4GYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTX5X6DTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
其中，
X1为D或Q；
X2为A或T；
X3为P或F；
X4为I或M；
X5为A或P；或者
X6为V或A。
SEQ ID NO:345
X1IVLTQSPX2x3LX4X5SX6GERATX6X8CX9ASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPX10LLIYAASNX11E SGX12PX13RFSGSGSGTDFTLTIX14SLQX15EDX16AVYX17CQQTRKVPYTFG X18GTKX19EIK
X1为D或E；
X2为D或A；
X3为S或T；
X4为A或S；
X5为V或L；
X6为L或P；
X7为I或L；
X8为N或S；
X9为R或K；
X10为K或R；
X11为V或R；
X12为V或I；
X13为A或D；
X14为Q或S；
X15为P或A；
X16为F或V；
X17为Y或F；
X18为Q或G；并且
X19为L或V。
Fab-Fc和scFv
hK2特异性VH/VL区被工程改造为VH-CH1-接头CH2-CH3和VL-CL，并且表达为IgG2或IgG4，或被工程改造为VH-接头-VL或VL-接头-VH定向中的scFv。在scFv中使用的接头是上述SEQ ID NO:7的接头。scFv用于生成如实施例7中所述的双特异性抗体或生成如实施例11中所述的CAR。
表11示出mAb形式的选定抗hK2抗体的HC氨基酸序列。表12示出mAb形式的选定抗hK2抗体的LC氨基酸序列。表13汇总了mAb形式的选定抗hK2抗体的HC和LC DNA SEQ ID NO。表14示出VH-接头-VL或VL-接头-VH定向中的选定scFv的氨基酸序列。
表11.mAb形式的选定抗hK2抗体的HC(VH-CH1-接头CH2-CH3)的氨基酸序列。
表12.mAb(Fab-Fc)形式的选定抗hK2抗体的LC(VL-CL)的氨基酸序列。
表13.选定hK2抗体的HC和LC的cDNA序列的SEQ ID NO。
表14.VH-接头-VL(HL)或VL-接头-VH(LH)形式的选定抗hK2scFv抗体的可变结构 域的氨基酸序列。
实施例12.抗hK2抗体的生物物理表征
抗hK2抗体的亲和力和热稳定性。
通过表面等离振子共振(SPR)测量选定hK2抗体对可溶性hK2的亲和力。SPR是一种无标记技术，通过测量复合物生成和解离时的质量变化来研究两个结合配偶体之间的相互作用的强度。在涂覆有抗Fc抗体的传感器芯片上捕获抗体，然后以各种浓度和指定的缔合和解离时间注射可溶性hK2。解离后，用适当的溶液再生表面以准备下一种相互作用。通过将传感图拟合到1:1Langmuir模型来提取动力学信息(缔合常数和解离常数)。将结合亲和力(KD)报告为速率常数的比率(koff/kon)。选定hK2抗体的KD值列于表15中。
使用自动化Prometheus仪器，通过差示扫描荧光测定法(NanoDSF)确定热稳定性。NanoDSF用于测量在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中浓度为0.5mg/mL的分子的Tm。通过将样品从384孔样品板装载到24孔毛细管中来进行测量。对每个样品进行重复运行。热扫描范围为20℃至95℃，速率为1.0℃/分钟。在330nm和350nm的发射波长下监测固有色氨酸和酪氨酸荧光，并且将F350nm/F330nm比率相对于温度绘制以产生未折叠曲线。所测量的Tm值列于表15中。
表15.选定分子的KD和Tm
分子 KD(nM) Tm(℃)
KL2B413(scFv) 34.3 67
KL2B359(scFv) 0.7-1 67
KL2B30(Fab) 0.460 >70
KL2B242(Fab) 0.040 >70
KL2B53(Fab) 0.080 >70
KL2B467(Fab) 0.078 >70
KL2B494(Fab) 0.053 >70
Ablexis免疫活动产生的KL2B413 scFv具有如通过Nano DSF测量的67℃的热稳定性(Tm)和约34nM的对人hK2的结合亲和力(KD)。将从重人源化活动获得并已经保持与鼠11B6类似的结合亲和力的克隆KL2B359转化为scFv-Fc和CAR-T以进行另外的谱分析。KL2B359 scFv表现出67℃的Tm和约0.7nM-1nM的与hK2的结合亲和力(KD)。KL2B30、KL2B242、KL2B53、KL2B467和KL2B494 Fab表现出低于0.5nM的结合亲和力和高于70℃的Tm值。
表位映射
通过氢-氘交换质谱法(HDX-MS)确定选定KL2B抗体上的表位。人KLK2抗原用于表位映射实验。
简而言之，将纯化的KLK2抗原在氧化氘标记缓冲液中与和不与抗KLK2抗体一起温育。通过在pH 3.0下添加8M尿素、1M TCEP，在不同时间点淬灭氢-氘交换(HDX)混合物。在室温下将用缓冲液A(1％乙腈，0.1％FA的H2O溶液)平衡的淬灭的样品以600μL/min通过固定的胃蛋白酶/FPXIII柱。用缓冲液A将胃蛋白酶片段以600μL/min装载到反相捕获柱上，并且脱盐1分钟(600μL缓冲液A)。将脱盐片段通过C18柱分离，其中线性梯度为8％至35％缓冲液B(95％乙腈、5％H2O、0.0025％TFA)，在20分钟内以100μL/min分离，并且通过质谱分析。使用LTQTM Orbitrap Fusion Lumos质谱仪(Thermo Fisher Scientific)进行质谱分析，其中毛细管温度为275℃，分辨率为150,000，并且质量范围(m/z)为300-1,800。BioPharmaFinder 3.0(Thermo Fisher Scientific)用于在HDX实验之前非氘代样品的肽鉴定。HDExaminer 2.5版(Sierra Analytics,Modesto,CA)用于从HDX实验的MS原始数据文件中提取质心值。
hK2抗体、hu11B6、KL2B494、KL2B467、KL2B30、KL2B413和KL2B53与可溶性hK2蛋白的温育导致氢气交换和整体保护的不同图案。将受保护的片段映射到hK2抗原的序列上以可视化结合表位(图17B)。KL2B494、KL2B467和KL2B30与由残基173-178(SEQ ID NO:346，KVTEF)和残基230-234(SEQ ID NO:347，HYRKW)组成的共同序列结合。KL2B53显示出不同的保护图案并与由残基27-32(Seq ID NO:348，SHGWAH)、残基60-75(SEQ ID NO:349，RHNLFEPEDTGQRVP)和残基138-147(SEQ ID NO:350，GWGSIEPEE)组成的序列结合。
实施例13.附加的scFv CAR构建体的生成和表征
克隆为scFv的11B6的胞外域在高温(55℃)下不保持结合，并因此开始附加的活动以由亲本11B6生成新的人源化抗体。
生成hK2 CAR，这些hK2 CAR含有衍生自抗体11B6的热稳定的scFv。对含有热稳定的scFv的CAR构建体的描述及其SEQ ID NO提供于表16中。描述中的名称往回参照上文鉴定的VH或VL链，20AA是指scFv中的VH/VL对之间的20个氨基酸长接头。将CAR中的scFv克隆在VH-L-VL或VL-L-VH定向中。
另外将所生成的scFvs KL2B413_HL、KL2B413_LH、KL2B359_HL和KL2B359_LH掺入CAR构建体中并进一步表征。表16示出所生成的CAR构建体及其SEQ ID NO。所用的信号序列为MAWVWTLLFLMAAAQSIQA(SEQ ID NO:24)。
表16.
实施例14：通过Jurkat-Lucia TM NFAT细胞鉴定具有抗原依赖性活化的基于不同 scFv的CAR。
活化的T细胞(NFAT)的核因子是首先被鉴定为免疫细胞调节剂的转录因子家族。不受理论的束缚，T细胞活化导致钙流入，这使钙调磷酸酶活化，钙调磷酸酶在NFAT的N末端使丝氨酸富集的核定位信号脱去磷酸，从而导致NFAT的核导入。随后可通过在JNL报告基因细胞系中由NFAT启动子驱动的Firefly荧光素酶检测因scFv聚集引起的强直信号传导。
含有由信号传导响应性NFAT启动子驱动的荧光素酶基因的Jurkat细胞(称为JNL细胞)用各种CAR构建体转导。CAR构建体与其同源细胞抗原(靶细胞上的hK2)之间的结合导致JNL细胞中的荧光素酶表达。根据以下方案，在JNL报告基因测定中评估新型hK2 KL2B413和重人源化11B6 CAR克隆的抗原依赖性活性。
慢病毒转导如下进行。收获JNL细胞并将其重悬至1E6个细胞/mL。以3的MOI添加500μL JNL细胞和慢病毒病毒，并且通过上下移液混合。将混合物置于37℃培养箱中保持24小时。然后，向每个孔中添加500μL的JNL培养基。在37℃培养箱中继续培养。在第4天将细胞转移到T25烧瓶中。在第5-6天，进行转导验证。收获150μL细胞以通过针对感兴趣的特定CAR的适当检测试剂来检查CAR表达(例如，生物素-hK2蛋白用于检测hK2 CAR)。将JNL细胞维持在5×105个细胞/mL直到存在足够的细胞以冷冻或用于下述JNL测定。
如下进行JNL测定。以2:1的效应子与靶细胞比率进行与靶细胞系的共培养。将JNL细胞旋转以去除培养基中的任何分泌的荧光素酶，并且以4×105个细胞/mL重悬于新鲜培养基中。收获JNL细胞。以2E5个细胞/mL制备抗原阳性靶细胞系和抗原阴性靶细胞系两者。然后，将100μL JNL添加到100μL靶细胞中。对于仅JNL对照，添加100μL培养基而不是靶细胞。对于阳性对照，将仅JNL细胞或CAR JNL细胞添加到1X细胞刺激混合物中并在37℃培养箱中温育24小时。将150μL上清液收获到96孔板中并离心以去除细胞。将100μL上清液从板转移到实底黑色板，然后添加100μL QUANTI-luc lucia检测试剂，并在室温下温育5分钟，然后用Envision多功能读板仪读取。
含有由信号传导响应性NFAT启动子驱动的荧光素酶基因的Jurkat细胞(称为JNL细胞)用各种hK2 CAR构建体转导。通过生物素化的hK2，然后是链霉亲和素缀合的PE确定表达。数据示于图12A中。对于46％-50％细胞在重人源化11B6 KL2B359 CAR上表达并且73.7％-96％细胞在KL2B413CAR上表达的选定克隆，已证实经转导的JNL细胞中的CAR表达。
图12B中的数据显示，hK2 CAR构建体与其同源细胞抗原(靶细胞上的hK2)之间的结合导致JNL细胞中的荧光素酶表达。将含有指定CAR克隆的JNL细胞和JNL细胞(UTD)与靶细胞系(VCap、LNCap/Hk2、LNCap、C4-2B、22Rv1或DU145细胞)共培养，并且以发光强度测量荧光素酶活性。在存在表达抗原的细胞的情况下，当发光强度超过UTD细胞的水平的1.5倍时，认为克隆是活性的。未发现新型KL2B413和重人源化11B6 HL&LH CAR的抗原依赖性活化。
实施例15：在实时IncuCyte杀伤测定法中评估HK2 CAR-T细胞的抗原依赖性细胞 毒性。
将HK2 CAR-T细胞与HK2+VCaP细胞和HK2-DU145细胞共温育96小时。基于图11A-11B所示的CAR表达数据计算效应子与靶细胞(ET)比率。靶细胞稳定地表达红色核染料，这通过IncuCyte成像系统以实时方式测量。对于与HK2+VCaP细胞共温育的HK2 CAR-T细胞，数据示于图13A中，并且对于与HK2-DU145细胞共温育的HK2 CAR-T细胞，数据示于图13B中。在这些图中，肿瘤细胞生长抑制(％)＝(初始活靶细胞数-当前活靶细胞数)/初始活细胞数*100(％)
实施例16.用KL2B413_HL、KL2B413_LH、KL2B359_HL或KL2B359_LH转导的CAR-T细 胞的表征。
CAR-T细胞的活化是抗原依赖性的
如实施例4中所述，在针对抗原依赖性活性的JNL报告基因测定中评估所生成的CAR-T细胞。简而言之，含有由信号传导响应性NFAT启动子驱动的荧光素酶基因的Jurkat细胞(称为JNL细胞)用CAR17(KL2B413_HL)、CAR18(KL2B413_LH)、CAR19(KL2B359_HL)或CAR20(KL2B359_LH)构建体转导。通过生物素化的hK2，然后是链霉亲和素缀合的PE确定每个CAR的表达。对于46％-50％细胞表达基于KL2B359的CAR并且73.7％-96％细胞表达基于KL2B413的CAR的选定克隆，已证实经转导的JNL细胞中的CAR表达，如图6所示。表达每个CAR的JNL细胞百分比如下：KL2B413_HL：73.7％，KL2B413_LH：93.6％，KL2B359_HL：46％，KL2B359_LH：50.8％。
hK2 CAR构建体与其同源细胞抗原(靶细胞上的hK2)之间的结合导致JNL细胞中的荧光素酶表达。为此，将用测试CAR构建体或未转导的JNL细胞(UTD)转导的JNL细胞与靶细胞系(VCap、LNCap/hK2(通过重组表达hK2的LNCaP细胞)、LNCaP、C4-2B、22Rv1或DU145细胞)共培养，并且以发光强度测量荧光素酶活性。在存在表达抗原的细胞的情况下，当发光强度超过UTD细胞的水平的1.5倍时，认为构建体是活性的。未发现所测试的CAR构建体的抗原依赖性活化。图13A示出从CAR-T细胞与测试靶细胞的结合得到的RLU(相对光单位)，如图中所指示。
CAR-T细胞在抗原刺激时产生细胞因子
由细胞毒性T细胞产生的IFN-γ对于施加肿瘤的免疫监视至关重要，免疫监视可直接抑制增殖并诱导一些恶性肿瘤在体内和体外的细胞凋亡。为了确定hK2 CAR修饰的人T细胞是否能够识别hK2阳性肿瘤细胞并被这些肿瘤细胞活化，将用指定CAR克隆和对照未转导的T细胞(UTD)转导的原代T细胞与靶细胞系(LNCap/hK2、LNCap、C4-2B、22Rv1或DU145细胞)共培养，并收集上清液以进行IFN-γ浓度测量。如图14所示，用hK2 CAR细胞转导的CAR-T细胞在与通过重组表达hK2细胞的LNCap细胞(LNCap/hK2)共培养期间分泌IFN-γ，并且也在与非常少的表达hK2的C4-2B和LNCap细胞共培养期间分泌IFN-γ，但在与hK2阴性DU145细胞共培养期间不分泌IFN-γ。重复培养物的平均IFN-γ浓度±SD(pg/mL)示于图14中。
CAR-T细胞以抗原依赖性方式增殖
使用实施例4中描述的T细胞增殖测定方案评估CAR-T细胞的增殖。hK2 CAR-T和未转导的(UTD)T细胞用CellTrace Violet(CTV；5μM)标记并与hK2阳性VCap细胞和hK2阴性DU145细胞共培养。共培养后五天，收获细胞并用CD3、CD25、Live/dead近红外染料和hK2CAR染色。在配有Flowjo软件的Fortessa流式细胞仪上进行流式细胞术分析。通过活CD3鉴定淋巴细胞，并且确定具有CTV染料稀释和活化标志物CD25的CAR-T细胞的频率。通过在CD3+T细胞上进行门控，hK2阳性Vcap细胞但非hK2阴性DU145细胞促进每种所测试CAR-T细胞系的增殖，如图10C、图10D和图10E所示；和活化标志物CD25的上调，如图11B和图12A所示。仅无任何刺激的T细胞未增殖并且CD3/28珠粒刺激的T细胞表现出等效的增殖模式。hK2 CAR+T细胞在与VCap细胞共培养5天后比CD3/28珠粒阳性对照更稳健地增殖。不同的所测试CAR-T细胞具有不同的增殖活性并且表现出不同的CAR-T细胞计数。增殖T细胞和表达CD25的T细胞的百分比基于重复培养物的平均绝对细胞计数+/-SEM。
实施例17：抗原刺激的CAR-T细胞的Th1细胞因子IFN-γ产生。
不受理论的束缚，由细胞毒性T细胞产生的IFN-γ对施加肿瘤的免疫监视至关重要，免疫监视可直接抑制增殖并诱导一些恶性肿瘤在体内和体外的细胞凋亡。
为了确定hK2 CAR修饰的人T细胞是否能够识别hK2(+)肿瘤细胞并被这些肿瘤细胞活化，将含有指定CAR克隆和对照未转导的T细胞(UTD)的原代T细胞与靶细胞系(LNCap/Hk2、LNCap、C4-2B、22Rv1或DU145细胞)共培养，并收集上清液以进行IFN-g浓度测量。数据作为重复培养物的平均IFN-γ浓度±SD(pg/mL)示于图14中。如图所示，hK2 CAR修饰的T细胞在与表达hK2的LNCap/hK2细胞(甚至非常少的表达Hk2的C4-2B和LNCap细胞，但非hK2阴性DU145细胞)共培养期间分泌IFN-γ。未公开的对照CAR因比hK2高得多的抗原表达水平而分泌更大量的IFN-γ。
实施例18：用以评估hK2 CAR T细胞的抗肿瘤活性的CD107a脱粒测定法。
不受理论的束缚，细胞毒性淋巴细胞(诸如CD8+T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞)可以识别肿瘤细胞并主要通过免疫分泌杀死靶细胞的溶解性颗粒来杀死肿瘤细胞。该过程涉及颗粒膜与免疫效应子细胞的细胞质膜的融合，导致通常存在于溶解性颗粒周围的脂质双层上的溶酶体相关蛋白诸如CD107a的表面暴露。因此，CD107a的膜表达构成免疫细胞活化和细胞毒性脱粒的标志物。
脱粒测定法如下进行。将靶细胞(5×104个)在96孔板中与每孔0.1mL中相等数目的效应子细胞共培养。对照孔仅含有T细胞。除了1μL/莫能菌素样品(BD Biosciences)之外，添加抗CD107a(每孔5μL)，然后在37℃下温育4小时。将细胞用PBS洗涤两次，进行染色以用于hK2 CAR、CD3和CD8的表达，并在流式细胞仪BD Fortessa上分析。数据示于图15中。
如图所示，Vcap细胞上hK2抗原的存在导致CD107A+hK2 CAR(+)T细胞增加，但hK2CAR(-)和UTD T细胞不增加，如通过流式细胞术测量的。在不存在肿瘤细胞刺激的情况下，在CAR T细胞中观察到仅背景染色(<2％)。佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)与离子霉素(eBioscienceTM细胞刺激混合物；500X)的组合是在该4小时细胞培养物模型中CD107a细胞表面表达的一致诱导剂，并用作阳性对照。图15中所示的结果用于代表性供体T细胞，并且这些结果在多个供体中是可重现的。
实施例19：T细胞增殖是体内免疫功能的一个重要的体外参数。
为了进一步评估新型KL2B413和重人源化11B6(KL2B359)CAR T的功能并有助于选择优质候选构建体，CAR T细胞用CellTraceTMViolet(CTV；5μM)标记以用于T细胞增殖测定。遵循以下方案，并将结果示于图16A-图16D。
收集肿瘤细胞Vcap和DU145，并用PBS洗涤两次。将细胞以10E6个细胞/mL重悬于含有100μg/mL丝裂霉素C(MMC)的PBS中，在37℃培养箱中保持1.5小时，以阻断肿瘤细胞的增殖。将20μL DMSO添加到CTV染色溶液的小瓶中。然后，将5μL的溶液稀释到5mL(1:1000)PBS(温热至37℃)中以提供5μM染色溶液。对2E6个T细胞计数，并收集，用PBS洗涤两次，然后以4E6个细胞/mL(0.5mL)重悬。添加等体积(0.5mL)的CTV染色溶液。将细胞在37℃下温育20分钟。20分钟后，将4mL PRMI+20％FBS添加到细胞中以吸收任何未结合染料，并将细胞温育5分钟。将细胞以400×g离心5分钟。然后将细胞团块重悬于预温热的RPMI+10％FBS培养基中。对T细胞计数，并将1E5个细胞(100μL)接种在96孔平底板中。
同时，收集经MMC处理的肿瘤细胞hK2(+)VCap和HK2(-)DU145并在1.5小时后计数，然后以1E6个细胞/mL重悬。将1E5个细胞(100μL)与T细胞在96孔板中共培养。将单独的T细胞和以3:1CD3/28珠粒与细胞比率添加的T细胞分别用作阴性对照和阳性对照。
共培养五天后，从每个孔收集所有细胞。以400×g将细胞离心5分钟并洗涤两次，并在96孔U形底板中用hK2 CAR、CD3、CD8和CD25、Live/dead(近红外)染料染色。洗涤后，使用100μL BD CytofixTM固定缓冲液(50μL FACS缓冲液+50μL固定缓冲液)将所有细胞固定10分钟。在温育期结束后通过多色流式细胞术分析染色的样品。
在配有Flowjo软件的Fortessa流式细胞仪上进行流式细胞术分析。通过活CD3鉴定淋巴细胞，并且确定具有CTV染料稀释和活化标志物CD25的CAR+T细胞的频率。
为了制作CTV柱状图，将CTV未稀释的门设置为包围单独培养的T细胞的最右侧峰(CTV亮)，并且将CTV稀释的门设置为捕获其余群体。将此设置应用于所有样品。增加统计量以包括CTV稀释群体中的绝对细胞数目。使用该统计量创建表格，然后将数据(细胞计数)导出到Excel，以在转移至Prism之前重新格式化。
图16A-图16D示出hK2 CAR T细胞增殖测定法的结果。通过在CD3+T细胞上进行门控，如图16A-图16B所示，hK2(+)Vcap细胞但非hK2(-)DU145细胞促进所有CAR构建体工程化T细胞的增殖和活化标志物CD25的上调，如图16C-图16D所示。将CD3/28珠粒刺激的T细胞用作阳性对照，并且将仅T细胞用作阴性对照。仅不经任何刺激的T细胞未增殖，并且CD3/28珠粒刺激的T细胞表现出等效的增殖模式。如图所示，在与VCap细胞共培养5天后，hK2 CAR+T细胞比CD3/28珠粒阳性对照更稳健地增殖。不同的CAR构建体工程化T细胞具有不同的增殖活性并且表现出不同的CAR+T细胞计数。对基于重复培养物的平均绝对细胞计数+/-SEM的增殖T细胞和表达CD25的T细胞的百分比的汇总示于图16B和图16D。
实施例20：hK2 scFv CAR的构建和表达
构建包含以下scFv序列的hK2 CAR构建体：
hK2 CAR构建体包含以下序列：
使Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28刺激的T细胞经受电穿孔，然后用OPTI-MEM(Invitrogen)洗涤三次，并且以50E6个细胞/mL的最终浓度重悬于OPTI-MEM中。随后，将0.1mL细胞(5E6个细胞)与10μg编码RNA的IVT CAR混合，并使用BTX ECM830(HarvardApparatus BTX,Holliston,MA,USA)通过按压“脉冲”按钮一次在2mm间隙比色皿(HarvardApparatus BTX,Holliston,MA,USA)中进行电穿孔。(设置：500伏特，750微秒脉冲长度，单(1)个脉冲，100毫秒间隔)在电穿孔后，将T细胞转移到6孔板中，并立即放回37℃培养箱中。采用下列方式对原代人T细胞进行电穿孔：未使用mRNA(MOCK)，或者10μg表达hK2 scFv CAR或不相关对照CAR的mRNA。在用2μg/mL生物素化的L蛋白和链霉亲和素缀合的PE或者生物素化的hK2(1μg/mL)和链霉亲和素缀合的PE染色后，通过流式细胞术测量电穿孔后24小时的CAR表面表达。
电穿孔后二十四小时，对T细胞进行计数。每种样品收集1E5个T细胞。用FACS缓冲液洗涤细胞两次(对于微量滴定板，使用200μL/孔的FACS缓冲液)，并弃去上清液。所有孔用含有蛋白L的100μL染色缓冲液(Genscript，目录号M000971:500；2μg/mL)染色，并在4℃下温育至少30分钟，同时避光。通过添加FACS缓冲液两次洗涤细胞，对于微量滴定板，使用150μL/孔的FACS缓冲液。在室温下，以400×g离心4分钟。然后弃去上清液。所有孔用100μL链霉亲和素-R-藻红蛋白(SA-PE；1:250)和Live/dead可固定近红外死细胞染色染料(1:1000)染色，在4℃下温育至少30分钟，同时避光。然后细胞准备用于流式细胞术分析。
对于hK2 CAR观察到蛋白L染色，而在对照T细胞(未经受mRNA电穿孔的T细胞)中仅观察到背景染色(约5.5％)。也可以通过J&J内部生物素标记的重组KLK2蛋白，随后是SA-PE来检测原代人T细胞上的CAR表达。如图所示，如通过流式细胞术所测量的，T细胞有效地表达hK2 CAR，而在对照T细胞(未经受mRNA电穿孔或未公开的对照CAR(非hK2特异性的))中仅观察到背景染色。
实施例21：hK2 CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤
如下进行用于使用流式细胞仪的基于CellTrace Violet(CTV，Thermo FisherScientific目录号：C34557)的细胞毒性测定法的共培养。
如下制备T细胞。EP后二十四小时，对T细胞计数并以最浓缩/期望的E:T所需的浓度重悬。以100μL/孔含量添加T细胞(2×106个细胞/mL；以10:1的E:T比率(即每2E4个靶细胞中2E5个T细胞)接种100μL)。制备E:T浓度为10:1的储备液，用完整的T细胞培养基制成0.3125:1的两倍系列稀释度(Optimizer w/CTS，5％人血清，1％GlutaMax)。使用96孔圆底组织培养物处理的板一式三份接种T细胞(100μL/孔)。
如下制备CTV标记的靶细胞。将20μL DMSO添加到CTV染色溶液的小瓶中。将该储备溶液稀释到20mL PBS(温热至37℃)中，形成5μM染色溶液。收集10E6个肿瘤细胞，用PBS洗涤两次并以4E6个细胞/mL(2.5mL)重悬。添加等体积(2.5mL)的CTV染色溶液。将细胞在37℃培育箱中温育20分钟。将40mL PRMI+20％FBS添加到细胞中以吸收任何未结合染料。将细胞温育5分钟。将细胞以400×g离心5分钟。将细胞团块重悬于预温热的RPMI+10％FBS培养基中。同时，将T细胞以上述期望的E/T比率接种。对hK2+肿瘤细胞系和hK2-肿瘤细胞系重新计数，然后以2E5个细胞/mL重悬细胞并一式两份将细胞重悬于100μL中。将细胞与标记的肿瘤细胞系在平底96孔板中共温育。
使用流式细胞仪如下进行细胞毒性测定。共培养20小时后，将所有细胞转移到U形底96孔板中并洗涤。共培养20小时后，从平底96孔板收集所有细胞并将其转移到U形底96孔板中，然后洗涤。将30μL的0.25％胰蛋白酶添加到所有孔中，并在37℃培养箱中温育5分钟。5分钟后，将所有肿瘤细胞收集到U形底96孔板。以400×g将细胞离心5分钟，并洗涤两次。然后将细胞团块重悬于稀释(1:1000)的LIVE/DEADTM可固定近红外染色染料(100μL)中。将细胞在4℃下温育30分钟，并通过将细胞以400×g离心5分钟，用FACS缓冲液洗涤两次。洗涤后，使用100μL BD CytofixTM固定缓冲液(50μL FACS缓冲液+50μL固定缓冲液)将所有细胞固定10分钟。以400×g将细胞离心5分钟，并洗涤一次。将细胞团块重悬于FACS缓冲液中。在温育期结束后通过多色流式细胞术分析染色的样品。使用以下公式计算细胞毒性活性百分比：
特异性死亡％＝近红外+CTV+(死)细胞％-自发近红外+CTV％/(100％-自发近红外+CTV+(死)细胞％)×100％。
瞬时转染之后二十四小时，用Cell Trace Violet(CTV)荧光染料标记靶细胞(hK2阳性Vcap细胞和hK2阴性DU145细胞)，然后与hK2CAR-T细胞共培养。Mock T细胞充当阴性效应子对照。将细胞在0.3125:1至10:1范围内的效应子与靶细胞(E/T)比率下共培养20小时。杀灭百分比被测量为共培养物中剩余的活(生存力染料阴性)靶(CTV阳性)细胞的绝对数目相对于不与CAR-T细胞一起培养的活靶细胞的数目的比率。如图所示，在10:1至0.3125:1的E/T比率下，hK2 CAR T细胞特异性地且有效地裂解hK2(+)人癌细胞系，但非hK2(-)细胞，而仅在Mock或hK2 CAR的T细胞中观察到背景细胞毒性。
另外使用xCELLigence作为实时细胞分析系统测试了hK2 CAR-T细胞的实时细胞毒性，作为针对免疫细胞介导的靶细胞溶解的效能测定。
将50μL靶癌细胞培养基添加到96孔E-板(ACEA Biosciences)的每个孔中，并且测量背景阻抗并作为细胞指数显示。然后，将所粘附的靶细胞hK2(+)和hK2(-)解离并以5E4个(VCap)细胞/E板的孔、5E3个(VCap)细胞/E板的孔的密度接种100μL的体积，并且允许其被动地粘附在电极表面上。接种后，将E板在环境温度下在层流净化罩内保持30分钟，然后转移到细胞培养箱内的RTCA MP仪器中。在实验的整个持续时间(96小时)内，立即以15分钟间隔开始数据记录。
在施加处理(癌细胞接种后24小时)时，暂停数据采集，从每个孔去除50μL培养基，并且以不同的效应子与靶细胞(E:T)比率添加50μL体积的效应子CAR-T细胞。将hK2(+)CAR-T和未公开的对照CAR(非hK2特异性)T细胞重悬。然后在96孔板(从5:1到0.156:1E/T比率)中一式两份进行两倍稀释。还将靶细胞加Mock效应子对照(未经受RNA电穿孔的T细胞)添加到靶细胞中。
在不同E/T比率下将靶细胞hK2(+)和hK2(-)与Mock、10μg mRNA电穿孔(转染后24小时)的hK2(+)和hK2(-)CAR-T细胞一起温育大约72小时。生成hK2(+)和hK2(-)的归一化细胞指数(CI)曲线图。当单独接种时，靶细胞粘附到板并增殖，从而增大CI读数。
实施例22：由hK2 CAR-T细胞产生细胞因子
由细胞毒性T细胞产生的IFN-γ允许施加肿瘤的免疫监视，免疫监视可直接抑制增殖并诱导一些恶性肿瘤在体内和体外的细胞凋亡。为了确定hK2CAR-T细胞是否能够识别hK2(+)肿瘤细胞并被这些肿瘤细胞活化，从基于xCELLigence的杀伤测定中收集上清液，如实施例21中所述。在共培养约70小时后，收集上清液并且根据随ELISA试剂盒(人IFN-γELISA MAXTM Deluxe，BioLegend，目录号：430106)提供的说明书通过ELISA测定。
发生抗原刺激的CAR-T细胞的IFN-γ产生。hK2 CAR和对照CAR-T细胞在与表达hK2的细胞共培养期间以E:T比率依赖性方式分泌IFN-γ，但与hK2阴性细胞共培养期间不分泌IFN-γ。未公开的对照CAR因比hK2高得多的抗原表达水平而分泌更大量的IFN-γ。
实施例21：hK2 CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤
在实时IncuCyte肿瘤杀伤测定法中评估hK2 CAR-T细胞的抗原依赖性细胞毒性。将hK2 CAR-T细胞和靶细胞在基于CAR表达数据计算的1:1或0.5:1的效应子:靶细胞比率下共温育88小时。鉴定稳定地表达红色核染料的靶细胞，如通过IncuCyte成像系统以实时方式测量的。执行以下计算：肿瘤细胞生长抑制(％)＝(初始活靶细胞数-当前活靶细胞数)/初始活细胞数*100(％)
实施例22：由hK2 CAR-T细胞产生细胞因子
使用13-plex Milliplex人高灵敏度T细胞试剂盒(HSTCMAG28SPMX13)分析从hK2CAR-T细胞与细胞在1:1的E/T比率下的过夜(大约20小时)共培养物收集的上清液。hK2 CAR修饰的T细胞在与表达hK2的细胞共培养期间分泌细胞因子，但对于未转导的T细胞(UTD)来说分泌最少。由hK2 CAR-T细胞释放细胞因子的结果。
从hK2 CAR-T细胞与细胞在1:1的E/T比率下的过夜(大约20小时)共培养物收集上清液。hK2 CAR-T细胞在与表达hK2的细胞共培养期间分泌IFN-γ，但与hK2阴性细胞共培养期间不分泌IFN-γ。CD3/28珠粒刺激T细胞，并且仅T细胞分别用作阳性对照和阴性对照。由hK2 CAR-T细胞释放IFN-γ。示出了重复培养物的平均IFN-γ浓度±SD(pg/mL)。不同的热稳定的CAR-T细胞在与hK2(+)细胞共培养期间产生不同量的IFN-γ。
实施例23：hK2 CAR-T细胞的增殖
在增殖测定中评估hK2 CAR-T细胞。T细胞增殖是体内免疫功能的一个重要的体外参数。为了进一步评估hK2 CAR-T细胞的功能，用CTV标记hK2 CAR-T细胞以评估T细胞增殖。
hK2 CAR-T和未转导的(UTD)T细胞用CellTrace Violet(CTV；5μM)标记并与hK2(+)细胞和hK2(-)细胞共培养。共培养后五天，收获细胞并用CD3、CD25、Live/dead近红外染料和hK2 CAR染色。在配有Flowjo软件的Fortessa流式细胞仪上进行流式细胞术分析。通过活CD3鉴定淋巴细胞，并且确定具有CTV染料稀释和活化标志物CD25的CAR-T细胞的频率。通过对hK2 CAR+T细胞进行门控，如图所示，hK2(+)细胞但非hK2(-)细胞促进所有CAR构建体。CD3/28珠粒刺激T细胞，并且仅T细胞分别用作阳性对照和阴性对照。仅无任何刺激的T细胞未增殖并且CD3/28珠粒刺激的T细胞表现出等效的增殖模式。hK2 CAR-T细胞在与细胞共培养5天后比CD3/28珠粒阳性对照更稳健地增殖。不同的CAR构建体工程化T细胞具有不同的增殖活性并且表现出不同的CAR-T细胞计数。CAR-T细胞计数基于来自三次技术平行测定的平均绝对细胞计数+/-SEM。
方案如下进行。收集肿瘤细胞，用PBS洗涤两次，并以10E6个细胞/mL重悬于含有100μg/mL丝裂霉素C(MMC)的PBS中，在37℃培养箱中保持1.5小时，以便阻断肿瘤细胞增殖。将20μL的DMSO添加到CTV染色溶液的小瓶中。将5μL的溶液稀释到5mL(1:1000)PBS(温热至37℃)中以提供5μM染色溶液。对2E6个T细胞计数，收集，用PBS洗涤两次并以4E6个细胞/mL(0.5mL)重悬。添加等体积(0.5mL)的CTV染色溶液。将细胞在37℃下温育20分钟。然后，将4mL PRMI+20％FBS添加到细胞中以吸收任何未结合染料。将细胞温育5分钟，并以400×g离心5分钟。将细胞团块重悬于预温热的RPMI+10％FBS培养基中。对T细胞计数，并将1E5个细胞(100μL)接种在96孔平底板中。
同时，收集经MMC处理的肿瘤细胞并在1.5小时后计数，然后以1E6个细胞/mL重悬。将1E5个细胞(100μL)与T细胞在96孔板中共培养。将单独的T细胞和以3:1CD3/28珠粒与细胞比率添加的T细胞分别用作阴性对照和阳性对照。
共培养5天后，从每个孔收集所有细胞。以400×g将细胞离心5分钟并洗涤两次，然后在96孔U形底板中用hK2 CAR、CD3、CD8和CD25、Live/dead(近红外)染料染色。洗涤后，使用100μL BD CytofixTM固定缓冲液(50μL FACS缓冲液+50μL固定缓冲液)将所有细胞固定10分钟。在温育期结束后通过多色流式细胞术分析染色的样品。
如下进行数据分析。制作CTV柱状图。将CTV未稀释的门设置为包围单独培养的T细胞的最右侧峰(CTV亮)，并且将CTV稀释的门设置为捕获其余群体。将其应用于所有样品。
实施例24：用本文所述的各种构建体转导的CAR-T细胞的表征。
在针对抗原依赖性活性的JNL报告基因测定中评估所生成的CAR-T细胞。简而言之，含有由信号传导响应性NFAT启动子驱动的荧光素酶基因的Jurkat细胞(称为JNL细胞)用包含SEQ ID NO:153-160、SEQ ID NO:161-168、SEQ ID NO:195-204、SEQ ID NO:320-325、SEQ ID NO:326-331和SEQ ID NO:336-339的一条或多条核酸序列的任何构建体转导。
另选地，构建体可包含核酸序列，该核酸序列编码：
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列的重链可变区。
通过生物素化的hK2，然后是链霉亲和素缀合的PE确定每个CAR的表达。
hK2 CAR构建体与其同源细胞抗原(靶细胞上的hK2)之间的结合导致JNL细胞中的荧光素酶表达。为此，将用测试CAR构建体或未转导的JNL细胞(UTD)转导的JNL细胞与靶肿瘤细胞系共培养，并且以发光强度测量荧光素酶活性。在存在表达抗原的细胞的情况下，当发光强度超过UTD细胞的水平的1.5倍时，认为构建体是活性的。
CAR-T细胞以抗原依赖性方式介导肿瘤细胞杀伤
将用CAR17、CAR18、CAR19和CAR20转导的CAR-T细胞与hK2阳性细胞和hK2阴性细胞在基于T细胞上的CAR表达计算的1:1或0.5:1的效应子与靶细胞(ET)比率下共温育96小时。靶细胞稳定地表达红色核染料，这通过IncuCyte成像系统以实时方式测量。肿瘤细胞生长抑制(TGI)(％)＝(初始活靶细胞数-当前活靶细胞数)/初始活细胞数*100(％)。所测试的CAR-T细胞可达到大约100％TGI，而未转导的对照可能未表现出任何TGI。在hK2阴性细胞中可能未观察到所测试的CAR-T细胞表现出TGI。
CAR-T细胞在抗原刺激时产生细胞因子
由细胞毒性T细胞产生的IFN-γ对于施加肿瘤的免疫监视至关重要，免疫监视可直接抑制增殖并诱导一些恶性肿瘤在体内和体外的细胞凋亡。为了确定hK2 CAR修饰的人T细胞是否能够识别hK2阳性肿瘤细胞并被这些肿瘤细胞活化，将用指定CAR克隆和对照未转导的T细胞(UTD)转导的原代T细胞与靶细胞系共培养，并收集上清液以进行IFN-γ浓度测量。用hK2 CAR细胞转导的CAR-T细胞在与通过重组表达hK2细胞的LNCap细胞共培养期间分泌IFN-γ，并且也在与非常少的表达hK2的细胞共培养期间分泌IFN-γ，但在与hK2阴性细胞共培养期间不分泌IFN-γ。
CAR-T细胞被活化并以抗原依赖性方式上调脱粒的标志物
细胞毒性淋巴细胞(诸如CD8+T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞)可以识别肿瘤细胞并主要通过免疫分泌杀死靶肿瘤细胞的溶解性颗粒来杀死肿瘤细胞。该过程涉及颗粒膜与免疫效应子细胞的细胞质膜的融合，导致通常存在于溶解性颗粒周围的脂质双层上的溶酶体相关蛋白诸如CD107a的表面暴露。因此，CD107a的膜表达构成免疫细胞活化和细胞毒性脱粒的标志物。
脱粒测定法如下所述进行。将靶细胞(5×104个)在96孔板中与每孔0.1mL中相等数目的效应子细胞共培养。对照孔仅含有T细胞。除了1μL/莫能菌素样品(BD Biosciences)之外，添加抗CD107a(每孔5μL)，并在37℃下温育4小时。将细胞用PBS洗涤两次，进行染色以用于hK2CAR、CD3和CD8的表达，并在流式细胞仪BD Fortessa上分析。
hK2 CAR-T细胞以抗原依赖性方式增殖
使用实施例23中描述的T细胞增殖测定方案评估CAR-T细胞的增殖。hK2 CAR-T和未转导的(UTD)T细胞用CellTrace Violet(CTV；5μM)标记并与hK2阳性细胞和hK2阴性细胞共培养。共培养后五天，收获细胞并用CD3、CD25、Live/dead近红外染料和hK2 CAR染色。在配有Flowjo软件的Fortessa流式细胞仪上进行流式细胞术分析。通过活CD3鉴定淋巴细胞，并且确定具有CTV染料稀释和活化标志物CD25的CAR-T细胞的频率。增殖T细胞和表达CD25的T细胞的百分比基于重复培养物的平均绝对细胞计数+/-SEM。
本文引用的所有专利、已公布的专利申请和参考文献的教导内容全文以引用方式并入。
虽然已经具体示出和描述了示例的实施方案，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离所附权利要求书所涵盖的实施方案的范围的前提下，可以在其中进行形式和细节上的各种改变。
序列表
SEQ ID NO:1—VL1(LCD6)
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SEQ ID NO:2—VL2(LCHumanized)
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SEQ ID NO:3—VL3(LCB7)
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SEQ ID NO:4—VH1(HCG5)
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SEQ ID NO:5—VH2(HCHumanized)
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SEQ ID NO:6—VH3(HCF3)
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SEQ ID NO:7—接头序列
GGSEGKSSGSGSESKSTGGS
SEQ ID NO:8—scFV1(HL_HCG5_LCD6_20AA)
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SEQ ID NO:9—scFV2(HL_HCG5_LCHumanized_20AA)
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SEQ ID NO:10—scFV3(HL_HCF3_LCB7_20AA)
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SEQ ID NO:11—scFV4(HL_HCG5_LCB7_20AA)
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SEQ ID NO:12—scFV5(LH_LCD6_HCG5_20AA)
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SEQ ID NO:13—scFV6(LH_LCHumanized_HCF3_20AA)
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SEQ ID NO:14—scFV7(LH_LCHumanized_HCG5_20AA)
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SEQ ID NO:15—scFV8(LH_LCB7_HCF3_20AA)
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SEQ ID NO:16—scFV9(LH_LCB7_HCG5_20AA)
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SEQ ID NO:17—scFV10(LH_LCD6_HCF3_20AA)
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SEQ ID NO:18—scFV11(HL_HCHumanized_LCB7_20AA)
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SEQ ID NO:19—scFV12(HL_HCHumanized_LCD6_20AA)
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SEQ ID NO:20—scFV13(HL_HCHumanized_LCHumanized_20AA)
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SEQ ID NO:21—scFV14(LH_LCD6_HCHumanized_20AA)
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SEQ ID NO:22—scFV15(LH_LCHumanized_HCHumanized_20AA)
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SEQ ID NO:23—scFV16(LH_LCB7_HCHumanized_20AA)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:24—信号序列
MAWVWTLLFLMAAAQSIQA
SEQ ID NO:25—CD8a-铰链
TSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO:26—CD8a-TM
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO:27—CD137
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO:28—CD3ζ
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:29—细胞外抗原结合结构域1(HL_HCG5_LCD6_20AA)
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SEQ ID NO:30—细胞外抗原结合结构域2(HL_HCG5_LCHumanized_20AA)
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SEQ ID NO:31—细胞外抗原结合结构域3(HL_HCF3_LCB7_20AA)
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SEQ ID NO:32—细胞外抗原结合结构域4(HL_HCG5_LCB7_20AA)
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SEQ ID NO:33—细胞外抗原结合结构域5(LH_LCD6_HCG5_20AA)
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SEQ ID NO:34—细胞外抗原结合结构域6(LH_LCHumanized_HCF3_20AA)
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SEQ ID NO:35—细胞外抗原结合结构域7(LH_LCHumanized_HCG5_20AA)
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SEQ ID NO:36—细胞外抗原结合结构域8(LH_LCB7_HCF3_20AA)
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SEQ ID NO:37—细胞外抗原结合结构域9(LH_LCB7_HCG5_20AA)
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SEQ ID NO:38—细胞外抗原结合结构域10(LH_LCD6_HCF3_20AA)
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SEQ ID NO:39—细胞外抗原结合结构域11(HL_HCHumanized_LCB7_20AA)
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SEQ ID NO:41—细胞外抗原结合结构域13(HL_HCHumanized_LCHumanized_20AA)
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO:42—细胞外抗原结合结构域14(LH_LCD6_ HCHumanized_20AA)
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SEQ ID NO:43—细胞外抗原结合结构域15(LH_LCHumanized_HCHumanized_20AA)
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SEQ ID NO:44—细胞外抗原结合结构域16(LH_LCB7_HCHumanized_20AA)
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SEQ ID NO:45—细胞内信号传导结构域
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:46—CAR1(HL_HCG5_LCD6_20AA；pDR000083431)
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SEQ ID NO:47—CAR 2(HL_HCG5_LCHumanized_20AA；pDR000083432)
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:48—CAR3(HL_HCF3_LCB7_20AA；pDR000083436)
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:49—CAR4(HL_HCG5_LCB7_20AA；pDR000083437)
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:50—CAR5(LH_LCD6_HCG5_20AA；pDR000083438)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:51—CAR 6(LH_LCHumanized_HCF3_20AA；pDR000083440)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:52—CAR 7(LH_LCHumanized_HCG5_20AA；pDR000083441)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:53—CAR8(LH_LCB7_HCF3_20AA；pDR000083443)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:54—CAR9(LH_LCB7_HCG5_20AA；pDR000083444)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:55—CAR10(LH_LCD6_HCF3_20AA；pDR000083446)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:56—CAR 11(HL_HCHumanized_LCB7_20AA；pDR000083433)
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:57—CAR 12(HL_HCHumanized_LCD6_20AA；pDR000083434)
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:58—CAR 13(HL_HCHumanized_LCHumanized_20AA；pDR000083435)
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:59—CAR 14(LH_LCD6_HCHumanized_20AA；pDR000083439)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:60—CAR 15(LH_LCHumanized_HCHumanized_20AA；pDR000083442)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:61—CAR 16(LH_LCB7_HCHumanized_20AA；pDR000083445)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:62—人激肽释放酶-2序列(信号序列：氨基酸1-18)
MWDLVLSIALSVGCTGAVPLIQSRIVGGWECEKHSQPWQVAVYSHGWAHCGGVLVHPQWVLTAAHCLKKNSQVWLGRHNLFEPEDTGQRVPVSHSFPHPLYNMSLLKHQSLRPDEDSSHDLMLLRLSEPAKITDVVKVLGLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLRPRSLQCVSLHLLSNDMCARAYSEKVTEFMLCAGLWTGGKDTCGGDSGGPLVCNGVLQGITSWGPEPCALPEKPAVYTKVVHYRKWIKDTIAANP
SEQ ID NO:63—重链CDR1序列
SDYAWN
SEQ ID NO:64—重链CDR2序列
YISYSGSTTYSPSLKS
SEQ ID NO:65—重链CDR2序列
YISYSGSTTYNPSLKS
SEQ ID NO:66—重链CDR3序列
GYYYGSGF
SEQ ID NO:67—轻链CDR1序列
RASESVEYFGTSLMH
SEQ ID NO:68—轻链CDR1序列
KASESVEYFGTSLMH
SEQ ID NO:69—轻链CDR2序列
AASNVES
SEQ ID NO:70—轻链CDR2序列
AASNRES
SEQ ID NO:71—轻链CDR3序列
QQTRKVPYT
SEQ ID NO:72—重链CDR1序列
GNSITSDYAWN
SEQ ID NO:73—重链CDR1序列
YISYSGSTT
SEQ ID NO:74—VL 4(KL2B413)
EIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:75—VL 5(KL2B359)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:76—VH4(KL2B413)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:77—VH5(KL2B359)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:78—细胞外抗原结合结构域17(KL2B413_HL)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:79—细胞外抗原结合结构域18(KL2B413_LH)
EIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:80—细胞外抗原结合结构域19(KL2B359-HL)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:81—细胞外抗原结合结构域20(KL2B359-LH)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:82—CAR17(KL2B413_HL；pBD000091628)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIKTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:83—CAR18(KL2B413_LH；pBD000091623)
EIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:84—CAR19(KL2B359-HL；pBD000091576)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:85—CAR20(KL2B359-LH；pBD000091577)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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GFTFSSYW
SEQ ID NO:87—重链CDR2序列
IKQDGSER
SEQ ID NO:88—重链CDR3序列
ARDQNYDILTGHYGMDV
SEQ ID NO:89—轻链CDR1序列
QGISSY
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ATS
SEQ ID NO:91—轻链CDR3序列
QQLNSYPRT
SEQ ID NO:92—重链CDR1序列
GNSITSDYA
SEQ ID NO:93—重链CDR2序列
ISYSGST
SEQ ID NO:94—重链CDR3序列
ATGYYYGSGF
SEQ ID NO:95—轻链CDR1序列
ESVEYFGTSL
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AAS
SEQ ID NO:97—轻链CDR3序列
GGNNIGSKSVH
SEQ ID NO:98—接头序列
GTSGSSGSGSGGSGSGGGG
SEQ ID NO:99—接头序列
GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS
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YISYSGSTTYNPSLKS
SEQ ID NO:101—重链CDR1序列
GNSITSDYAWN
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SYYWS
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YIYYSGSTNYNPSLKS
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TTIFGVVTPNFYYGMDV
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GGSISSYYWS
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YIYYSGSTN
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SYDIH
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IISYDGSKKDYTDSVKG
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ESGWSHYYYYGMDV
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GFTFSSYDIH
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IISYDGSKKD
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YYGMH
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FISYDGSNKYYADSVKG
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LPYSGSYWAFDY
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GFTFSYY
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HYAMS
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TIGGSGGSTYYADSVKG
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PHIVMVTALLYDGMDV
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TIGGSGGSTYY
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DDSDRPS
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QQLNSYPLT
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QKYNSAPYT
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GGDNIGSKSVH
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SEQ ID NO:138—轻链CDR3序列
QVWDSSSDHPVV
SEQ ID NO:139—轻链CDR3序列
QVWDSSSDHVV
SEQ ID NO:140—VH(KL2B357、KL2B357和KL2B360)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:142—VH(KL2B30)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:143—VH(KL2B53)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSKKDYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRVEDSAVYSCARESGWSHYYYYGMDVWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:144—VH(KL2B242)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWLRQPAGSGLEWIGRLYVSGFTNYNPSLKSRVTLSLDPSRNQLSLKLSSVTAADTAVYYCAGDSGNYWGWFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:145—VH(KL2B467)
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SEQ ID NO:146—VH(KL2B494)
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SEQ ID NO:147—VL(KL2B357)
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SEQ ID NO:148—VL(KL2B30)
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SEQ ID NO:149—VL(KL2B53)
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SEQ ID NO:150—VL(KL2B242)
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SEQ ID NO:151—VL(KL2B467)
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SEQ ID NO:152—VL(KL2B494)
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SEQ ID NO:153—VH(KL2B357)
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCAGGCCTGGTCAAGCCCTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCAACTCCATCACCTCTGACTACGCCTGGAACTGGATTCGGCAGTTCCCTGGCAAGGGCCTTGAGTGGATCGGCTACATCTCCTACTCCGGTTCCACCACCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGGTCACCATCTCCCGCGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCACCGGCTACTACTACGGCTCCGGCTTTTGGGGACAGGGCACACTGGTTACCGTGTCTAGT
SEQ ID NO:154—VH(KL2B358)
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCAGGCCTGGTCAAGCCCTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCAACTCCATCACCTCTGACTACGCCTGGAACTGGATTCGGCAGCCACCTGGCAAGGGCCTTGAGTGGATCGGCTACATCTCCTACTCCGGTTCCACCACCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGGTCACCATCTCCCGCGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCACCGGCTACTACTACGGCTCCGGCTTTTGGGGACAGGGCACACTGGTTACCGTGTCTAGT
SEQ ID NO:155—VH(KL2B360)
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCAGGCCTGGTCAAGCCCTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCAACTCCATCACCTCTGACTACGCCTGGAACTGGATTCGGCAGTTCCCTGGCAAGGGCCTTGAGTGGATCGGCTACATCTCCTACTCCGGTTCCACCACCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGGTCACCATCTCCCGCGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCACCGGCTACTACTACGGCTCCGGCTTTTGGGGACAGGGCACACTGGTTACCGTGTCTAGT
SEQ ID NO:156—VH(KL2B30)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGATATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGGGGACTACGATTTTTGGAGTGGTTACCCCCAACTTCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:157—VH(KL2B53)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGACATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATTTCATATGATGGAAGTAAAAAAGACTATACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGTTGAGGACTCGGCTGTGTATTCCTGTGCGAGAGAAAGTGGCTGGTCCCACTACTACTATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO:158—VH(KL2B242)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTATTGGAGCTGGCTCCGGCAGCCCGCCGGGTCGGGACTGGAGTGGATTGGGCGTTTATATGTCAGTGGGTTCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCTTGTCACTAGACCCGTCCAGGAACCAGTTGTCCCTGAAACTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTATATTATTGTGCGGGAGATAGTGGGAACTACTGGGGTTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:159—VH(KL2B467)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTTACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCCCACCTCCCTTATAGTGGGAGCTACTGGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO:160—VH(KL2B494)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTCATTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTGGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCTCATATTGTAATGGTGACTGCTCTTCTCTACGACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:161—VL(KL2B357)
GACATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGACTCTCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGGAATACTTCGGCACCTCTCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACGTGGAATCTGGCGTGCCCGATAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCTCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTTCTGTCAGCAGACCCGGAAGGTGCCCTACACATTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO:162—VL(KL2B358)
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAGAGAGCCACCCTCTCTTGTAGAGCCTCCGAGTCCGTGGAATACTTCGGCACCTCTCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAGACTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACGTCGAATCTGGCATCCCCGCTAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGGAACCCGAGGATTTCGCTGTGTACTTTTGCCAGCAGACCCGGAAGGTGCCCTACACATTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO:163—VL(KL2B360)
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAGAGAGCCACCCTCTCTTGTAGAGCCTCCGAGTCCGTGGAATACTTCGGCACCTCTCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAGACTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACGTCGAATCTGGCATCCCCGCTAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGGAACCCGAGGATTTCGCTGTGTACTTTTGCCAGCAGACCCGGAAGGTGCCCTATACATTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO:164—VL(KL2B30)
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SEQ ID NO:165—VL(KL2B53)
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SEQ ID NO:166—VL(KL2B242)
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SEQ ID NO:167—VL(KL2B467)
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SEQ ID NO:168—VL(KL2B494)
TCTTCTGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
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SEQ ID NO:171—KL2B358 ScFv-HL
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SEQ ID NO:172—KL2B358 ScFv-LH
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SEQ ID NO:174—KL2B360 ScFv-LH
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SEQ ID NO:179—KL2B242 ScFv-HL
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SEQ ID NO:180—KL2B242 ScFv-LH
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SEQ ID NO:181—KL2B467 ScFv-HL
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SEQ ID NO:182—KL2B467 ScFv-LH
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SEQ ID NO:183—KL2B494ScFv-HL
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SEQ ID NO:184—KL2B494 ScFv-LH
SSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:185—KL2B30 HC IgG4
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SEQ ID NO:186—KL2B30 LC IgG4
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SEQ ID NO:187—KL2B53 HC IgG4
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SEQ ID NO:188—KL2B53 LC IgG4
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKVPKFLIYAASTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:189—KL2B242 HC IgG4
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SEQ ID NO:190—KL2B242 LC IgG4
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SEQ ID NO:191—KL2B467 HC IgG4
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SEQ ID NO:192—KL2B467 LC IgG4
QSVLTQPPSVSVAPGQTASITCGGDNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDNSDRPSGIPERFSGSNSGTTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO:193—KL2B494 HC IgG4
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SEQ ID NO:194—KL2B494 LC IgG4
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SEQ ID NO:195—KL2B30 HC DNA
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGATATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGGGGACTACGATTTTTGGAGTGGTTACCCCCAACTTCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACTTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
SEQ ID NO:196—KL2B30 LC DNA
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAATAGTTACCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:197—KL2B53 HC DNA
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGACATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATTTCATATGATGGAAGTAAAAAAGACTATACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGTTGAGGACTCGGCTGTGTATTCCTGTGCGAGAGAAAGTGGCTGGTCCCACTACTACTATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACTTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
SEQ ID NO:198—KL2B53 LC DNA
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCACTCTGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAAGTATAACAGTGCCCCGTACACTTTTGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:199—KL2B242 HC DNA
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTATTGGAGCTGGCTCCGGCAGCCCGCCGGGTCGGGACTGGAGTGGATTGGGCGTTTATATGTCAGTGGGTTCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCTTGTCACTAGACCCGTCCAGGAACCAGTTGTCCCTGAAACTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTATATTATTGTGCGGGAGATAGTGGGAACTACTGGGGTTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAAACCTACACTTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
SEQ ID NO:200—KL2B242 LC DNA
TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGAGAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATCAATTGGGGGAAAATTATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGTTGGTCATCTATCAAGATAGTAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTCTGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAACAGTATTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
SEQ ID NO:201—KL2B467 HC DNA
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTTACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCCCACCTCCCTTATAGTGGGAGCTACTGGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:202—KL2B467 LC DNA
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCCGGGCAGACGGCCAGTATTACCTGTGGGGGAGACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATAATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGACCACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATCCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
SEQ ID NO:203—KL2B494 HC DNA
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTCATTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTGGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACCTCATATTGTAATGGTGACTGCTCTTCTCTACGACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:204—KL2B494 LC DNA
TCTTCTGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
SEQ ID NO:205—CAR(KL2B357 HL和KL2B357 LH)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:207—CAR(KL2B358 HL)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:208—CAR(KL2B358 LH)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:209—CAR(KL2B360 HL)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:210—CAR(KL2B360LH)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:211—CAR(KL2B30 HL)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIKTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:212—CAR(KL2B30 LH)
DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:213—CAR(KL2B53 HL)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSKKDYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRVEDSAVYSCARESGWSHYYYYGMDVWGQGTMVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKVPKFLIYAASTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTRLEIKTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:214—CAR(KL2B53 LH)
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKVPKFLIYAASTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTRLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSKKDYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRVEDSAVYSCARESGWSHYYYYGMDVWGQGTMVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:215—CAR(KL2B242 HL)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWLRQPAGSGLEWIGRLYVSGFTNYNPSLKSRVTLSLDPSRNQLSLKLSSVTAADTAVYYCAGDSGNYWGWFDPWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSSYELTQPPSVSVSPGETASITCSGDQLGENYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQALDEADYYCQAWDNSIVVFGGGTKLTVLTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:216—CAR(KL2B242 LH)
SYELTQPPSVSVSPGETASITCSGDQLGENYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQALDEADYYCQAWDNSIVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWLRQPAGSGLEWIGRLYVSGFTNYNPSLKSRVTLSLDPSRNQLSLKLSSVTAADTAVYYCAGDSGNYWGWFDPWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:217—CAR(KL2B467 HL)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAHLPYSGSYWAFDYWGQGTQVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQSVLTQPPSVSVAPGQTASITCGGDNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDNSDRPSGIPERFSGSNSGTTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVVFGGGTKVTVTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:218—CAR(KL2B467 LH)
QSVLTQPPSVSVAPGQTASITCGGDNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDNSDRPSGIPERFSGSNSGTTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVVFGGGTKVTVGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAHLPYSGSYWAFDYWGQGTQVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:219—CAR(KL2B494 HL)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSSSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:220—CAR(KL2B494 LH)
SSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:221—细胞外抗原结合结构域(KL2B357 HL)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:222—细胞外抗原结合结构域(KL2B357 LH)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:223—细胞外抗原结合结构域(KL2B358 HL)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:224—细胞外抗原结合结构域(KL2B358 LH)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:225—细胞外抗原结合结构域(KL2B360 HL)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:226—细胞外抗原结合结构域(KL2B360 LH)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:227—细胞外抗原结合结构域(KL2B30 HL)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:228—细胞外抗原结合结构域(KL2B30 LH)
DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:229—细胞外抗原结合结构域(KL2B53 HL)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSKKDYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRVEDSAVYSCARESGWSHYYYYGMDVWGQGTMVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKVPKFLIYAASTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTRLEIK
SEQ ID NO:230—细胞外抗原结合结构域(KL2B53 LH)
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKVPKFLIYAASTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTRLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSKKDYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRVEDSAVYSCARESGWSHYYYYGMDVWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:231—细胞外抗原结合结构域(KL2B242 HL)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWLRQPAGSGLEWIGRLYVSGFTNYNPSLKSRVTLSLDPSRNQLSLKLSSVTAADTAVYYCAGDSGNYWGWFDPWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSSYELTQPPSVSVSPGETASITCSGDQLGENYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQALDEADYYCQAWDNSIVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:232—细胞外抗原结合结构域(KL2B242 LH)
SYELTQPPSVSVSPGETASITCSGDQLGENYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQALDEADYYCQAWDNSIVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWLRQPAGSGLEWIGRLYVSGFTNYNPSLKSRVTLSLDPSRNQLSLKLSSVTAADTAVYYCAGDSGNYWGWFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:233—细胞外抗原结合结构域(KL2B467 HL)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAHLPYSGSYWAFDYWGQGTQVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQSVLTQPPSVSVAPGQTASITCGGDNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDNSDRPSGIPERFSGSNSGTTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVVFGGGTKVTV
SEQ ID NO:234—细胞外抗原结合结构域(KL2B467 LH)
QSVLTQPPSVSVAPGQTASITCGGDNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDNSDRPSGIPERFSGSNSGTTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVVFGGGTKVTVGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAHLPYSGSYWAFDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:235—细胞外抗原结合结构域(KL2B494 HL)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSSSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:236—细胞外抗原结合结构域(KL2B494 LH)
SSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:237—接头序列
GGGSGGGS
SEQ ID NO:238—接头序列
GGGSGGGSGGGS
SEQ ID NO:239—接头序列
GGGSGGGSGGGSGGGS
SEQ ID NO:240—接头序列
GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS
SEQ ID NO:241—接头序列
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:242—接头序列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:243—接头序列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:244—接头序列
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
SEQ ID NO:245—接头序列
IRPRAIGGSKPRVA
SEQ ID NO:246—接头序列
GKGGSGKGGSGKGGS
SEQ ID NO:247—接头序列
GGKGSGGKGSGGKGS
SEQ ID NO:248—接头序列
GGGKSGGGKSGGGKS
SEQ ID NO:249—接头序列
GKGKSGKGKSGKGKS
SEQ ID NO:250—接头序列
GGGKSGGKGSGKGGS
SEQ ID NO:251—接头序列
GKPGSGKPGSGKPGS
SEQ ID NO:252—接头序列
GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS
SEQ ID NO:253—接头序列
GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS
SEQ ID NO:254—接头序列
STAGDTHLGGEDFD
SEQ ID NO:255—接头序列
GEGGSGEGGSGEGGS
SEQ ID NO:256—接头序列
GGEGSGGEGSGGEGS
SEQ ID NO:257—接头序列
GEGESGEGESGEGES
SEQ ID NO:258—接头序列
GGGESGGEGSGEGGS
SEQ ID NO:259—接头序列
GEGESGEGESGEGESGEGES
SEQ ID NO:260—接头序列
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
SEQ ID NO:261—接头序列
PRGASKSGSASQTGSAPGS
SEQ ID NO:262—接头序列
GTAAAGAGAAGGAAAGAAG
SEQ ID NO:263—接头序列
GTSGSSGSGSGGSGSGGGG
SEQ ID NO:264—接头序列
GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS
SEQ ID NO:265—接头序列
GSGS
SEQ ID NO:266—接头序列
APAPAPAPAP
SEQ ID NO:267—接头序列
APAPAPAPAPAPAPAPAPAP
SEQ ID NO:268—接头序列
AEAAAKEAAAKEAAAAKEAAAAKEAAAAKAAA
SEQ ID NO:269—CAR铰链序列
EPKSCDKTHTCPPCP
SEQ ID NO:270—CAR铰链序列
ERKCCVECPPCP
SEQ ID NO:271—CAR铰链序列
ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3
SEQ ID NO:272—CAR铰链序列
ESKYGPPCPSCP
SEQ ID NO:273—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域1(HL_HCG5_LCD6_20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:274—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域2(HL_HCG5_LCHumanized_ 20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:275—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域3(HL_HCF3_LCB7_20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:276—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域4(HL_HCG5_LCB7_20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:277—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域5(LH_LCD6_HCG5_20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:278—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域6(LH_LCHumanized_HCF3_ 20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:279—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域7(LH_LCHumanized_HCG5_ 20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:280—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域8(LH_LCB7_HCF3_20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:281—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域9(LH_LCB7_HCG5_20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:282—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域10(LH_LCD6_HCF3_20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTPVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:283—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域11(HL_HCHumanized_ LCB7_20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:284—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域12(HL_HCHumanized_ LCD6_20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:285—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域13(HL_HCHumanized_ LCHumanized_20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:286—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域14(LH_LCD6_ HCHumanized_20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIQSVQAEDVSVYFCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:287—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域15(LH_LCHumanized_ HCHumanized_20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:288—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域16(LH_LCB7_ HCHumanized_20AA)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:289—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域17(KL2B413_HL)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:290—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域18(KL2B413_LH)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:291—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域19(KL2B359-HL)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:292—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域20(KL2B359-LH)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:293—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B357 HL)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:294—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B357 LH)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:295—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B358 HL)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:296—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B358 LH)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:297—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B360 HL)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:298—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B360 LH)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:299—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B30 HL)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:300—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B30 LH)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:301—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B53 HL)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSKKDYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRVEDSAVYSCARESGWSHYYYYGMDVWGQGTMVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKVPKFLIYAASTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTRLEIK
SEQ ID NO:302—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B53 LH)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQADIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKVPKFLIYAASTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQGTRLEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSKKDYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRVEDSAVYSCARESGWSHYYYYGMDVWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:303—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B242HL)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWLRQPAGSGLEWIGRLYVSGFTNYNPSLKSRVTLSLDPSRNQLSLKLSSVTAADTAVYYCAGDSGNYWGWFDPWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSSYELTQPPSVSVSPGETASITCSGDQLGENYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQALDEADYYCQAWDNSIVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:304—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B242 LH)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQASYELTQPPSVSVSPGETASITCSGDQLGENYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQALDEADYYCQAWDNSIVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWLRQPAGSGLEWIGRLYVSGFTNYNPSLKSRVTLSLDPSRNQLSLKLSSVTAADTAVYYCAGDSGNYWGWFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:305—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B467 HL)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAHLPYSGSYWAFDYWGQGTQVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQSVLTQPPSVSVAPGQTASITCGGDNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDNSDRPSGIPERFSGSNSGTTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVVFGGGTKVTV
SEQ ID NO:306—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B467 LH)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQSVLTQPPSVSVAPGQTASITCGGDNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDNSDRPSGIPERFSGSNSGTTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPVVFGGGTKVTVGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAHLPYSGSYWAFDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:307—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B494 HL)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSSSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:308—具有信号肽的细胞外抗原结合结构域(KL2B494 LH)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQASSELTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPHIVMVTALLYDGMDVWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:309—重链CDR1序列
GFTFSSYWMT
SEQ ID NO:310—重链CDR2序列
NIKQDGSERY
SEQ ID NO:311—重链CDR3序列
DQNYDILTGHYGMDV
SEQ ID NO:312—轻链CDR1序列
RASQGISSYLS
SEQ ID NO:313—轻链CDR2序列
ATSTLQS
SEQ ID NO:314—重链CDR1序列
SYWMT
SEQ ID NO:315—重链CDR2序列
NIKQDGSERYYVDSVKG
SEQ ID NO:316—重链CDR2序列
YISYSGSTTYSPSLKS
SEQ ID NO:317—VH(m11B6)
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGNSITSDYAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTTYSPSLKSRFSITRDTSKNQFFLQLNSVTPEDTATYFCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:318—VL(m11B6)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYFGTSLMHWYRQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIQPVEEDDFSMYFCQQTRKVPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:319—人激肽释放酶-2 6-His蛋白
VPLIEGRIVGGWECEKHSQPWQVAVYSHGWAHCGGVLVHPQWVLTAAHCLKKNSQVWLGRHNLFEPEDTGQRVPVSHSFPHPLYNMSLLKHQSLRPDEDSSHDLMLLRLSEPAKITDVVKVLGLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLRPRSLQCVSLHYSEKVTEFMLCAGLWTGGKDTCGGDSGGPLVCNGVLQGITSWGPEPCALPEKPAVYTKVVHYRKWIKDTIAANPHHHHHH
SEQ ID NO:320—VH cDNA(m11B6)
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCTGGACCCGGACTTGTTAAACCAAGTCAGTCTCTGTCCCTGACCTGTACCGTCACCGGCAACAGCATCACAAGCGATTACGCATGGAACTGGATCAGGCAGTTCCCTGGAAATCGACTCGAATGGATGGGCTACATTTCATACTCCGGTTCAACCACTTACTCTCCATCCTTGAAATCTAGGTTCAGCATCACCCGTGATACCTCAAAGAACCAATTTTTTCTGCAACTGAATAGCGTAACTCCAGAGGACACAGCCACATATTTCTGCGCCACTGGGTATTACTATGGCTCAGGTTTCTGGGGTCAGGGCACTCTCGTCACCGTCAGCAGC
SEQ ID NO:321—VH cDNA(hu11B6)
CAGGTCCAACTGCAAGAGAGCGGACCGGGCCTGGTAAAGCCATCCGACACATTGTCCCTGACGTGTGCGGTAAGTGGAAACTCTATCACTAGCGACTATGCGTGGAATTGGATAAGACAACCGCCGGGCAAGGGGCTGGAATGGATAGGATATATCAGCTATTCCGGTTCTACGACATACAATCCTTCCCTGAAAAGCAGAGTCACTATGTCACGCGACACGTCCAAGAATCAGTTCTCATTGAAATTGTCATCCGTAACGGCCGTTGACACTGCGGTTTATTATTGCGCAACCGGATATTACTACGGCTCTGGTTTTTGGGGACAGGGAACACTTGTTACTGTTAGTTCA
SEQ ID NO:322—VH cDNA(HCF3-LCD6)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCAAGCGACACCCTGAGCCTGACCTGCGCCGTGAGCGGCAACAGCATCACCAGCGACTACGCCTGGAACTGGATCCGCCAGTTCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCACCTACAACCCAAGCCTGAAGAGCCGCGTCACCATCAGCCGCGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCCCTGTGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCGGCTACTACTACGGCAGCGGCTTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:323—VH cDNA(HCG5-LCB7)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCAAGCGACACCCTGAGCCTGACCTGCGCCGTGAGCGGCAACAGCATCACCAGCGACTACGCCTGGAACTGGATCCGCCAGTTCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCACCTACAACCCAAGCCTGAAGAGCCGCGTCACCATCAGCCGCGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCCCTGTGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCGGCTACTACTACGGCAGCGGCTTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:324—VH cDNA(KL2B359)
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCAGGCCTGGTCAAGCCCTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCAACTCCATCACCTCTGACTACGCCTGGAACTGGATTCGGCAGTTCCCTGGCAAGCGCCTTGAGTGGATCGGCTACATCTCCTACTCCGGTTCCACCACCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGGTCACCATCTCCCGCGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCACCGGCTACTACTACGGCTCCGGCTTTTGGGGACAGGGCACACTGGTTACCGTGTCTAGT
SEQ ID NO:325—VH cDNA(KL2B413)
GAGGTGCAACTTGTGGAGAGCGGCGGAGGTCTGGTCCAACCCGGAGGAAGTCTCCGTCTCTCCTGTGCTGCTAGTGGCTTCACTTTCAGCTCATATTGGATGACATGGGTGAGACAAGCCCCAGGAAAGGGGCTCGAGTGGGTAGCTAACATTAAACAGGACGGCTCCGAACGGTACTATGTTGATTCTGTGAAGGGACGGTTCACTATATCCAGGGATAATGCAAAAAATTCACTCTATCTTCAAATGAACTCACTCAGAGCAGAGGACACTGCCGTGTATTATTGCGCCAGGGATCAAAATTATGACATACTGACCGGTCATTATGGAATGGATGTTTGGGGCCAGGGAACAACCGTTACCGTCTCAAGT
SEQ ID NO:326—VL cDNA(m11B6)
GACATTGTGCTGACACAGAGTCCAGCATCCTTGGCAGTATCTTTGGGGCAGCGGGCAACAATTTCATGCCGTGCATCTGAAAGTGTGGAGTATTTTGGAACTTCTCTTATGCACTGGTATCGCCAGAAGCCTGGGCAGCCTCCCAAACTCCTTATATATGCCGCTTCCAACGTGGAGTCCGGAGTACCAGCACGCTTTTCCGGCTCTGGGTCCGGCACAGACTTTTCCCTCAATATCCAACCTGTTGAAGAAGACGATTTTTCCATGTATTTTTGCCAACAGACACGCAAGGTTCCATATACATTCGGCGGCGGCACTAAACTTGAGATCAAA
SEQ ID NO:327—VL cDNA(hu11B6)
GACATAGTCTTGACTCAGAGCCCGGATTCCCTTGCTGTGTCTCTGGGAGAACGAGCTACGATCAACTGCAAGGCAAGTGAATCCGTAGAATACTTCGGGACATCATTGATGCATTGGTATCAACAGAAACCGGGGCAACCGCCCAAATTGCTGATATATGCGGCTAGTAATAGAGAATCAGGAGTACCGGATAGGTTTAGTGGTTCAGGATCAGGTACAGATTTCACCCTGACAATAAGTAGCTTGCAAGCCGAAGACGTAGCAGTGTATTACTGCCAACAAACCCGAAAGGTGCCATATACGTTTGGACAGGGTACAAAGTTGGAAATCAAA
SEQ ID NO:328—VL cDNA(HCF3-LCD6)
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCAAGGCCAGCGAGAGCGTGGAGTACTTCGGCACCAGCCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGCCACCAAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGCAACCGCGAGAGCGGCGTGCCAGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCCAGAGCGTGCAGGCCGAGGACGTCTCCGTGTACTTCTGCCAGCAGACCCGCAAGGTGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:329—VL cDNA(HCG5-LCB7)
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCAAGGCCAGCGAGAGCGTGGAGTACTTCGGCACCAGCCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGCCACCAAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGCAACCGCGAGAGCGGCGTGCCAGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGGCCGAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGACCCGCAAGGTGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
SEQ ID NO:330—VL cDNA(KL2B359)
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAGAGAGCCACCCTCTCTTGTAGAGCCTCCGAGTCCGTGGAATACTTCGGCACCTCTCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAGACTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACGTCGAATCTGGCATCCCCGCTAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGGAACCCGAGGATTTCGCTGTGTACTTTTGCCAGCAGACCCGGAAGGTGCCCTACACATTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO:331—VL cDNA(KL2B413)
GAAATCGTACTGACCCAGTCCCCTTCTTTCTTGAGTGCATCAGTTGGGGATAGAGTGACCATTACTTGTAGAGCATCTCAAGGTATTTCTTCATACTTGTCTTGGTATCAACAAAAACCTGGCAAGGCACCCAAACTCTTGATCTACGCCACCTCTACATTGCAAAGTGGGGTTCCTTCTAGGTTTTCAGGCTCCGGCTCTGGTACCGAGTTCACCCTCACTATAAGCAGTCTCCAACCTGAAGATTTCGCTACTTATTATTGTCAGCAGCTTAATTCTTATCCCCGAACCTTTGGTCAAGGAACTAAGGTCGAGATCAAA
SEQ ID NO:332—m11B6 HC IgG4
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGNSITSDYAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTTYSPSLKSRFSITRDTSKNQFFLQLNSVTPEDTATYFCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO:333—m11B6 LC IgG4
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYFGTSLMHWYRQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIQPVEEDDFSMYFCQQTRKVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:334—h11B6 HC IgG4
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGNSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:335—h11B6 LC IgG4
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRKVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:336—m11B6 HC DNA
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCTGGACCCGGACTTGTTAAACCAAGTCAGTCTCTGTCCCTGACCTGTACCGTCACCGGCAACAGCATCACAAGCGATTACGCATGGAACTGGATCAGGCAGTTCCCTGGAAATCGACTCGAATGGATGGGCTACATTTCATACTCCGGTTCAACCACTTACTCTCCATCCTTGAAATCTAGGTTCAGCATCACCCGTGATACCTCAAAGAACCAATTTTTTCTGCAACTGAATAGCGTAACTCCAGAGGACACAGCCACATATTTCTGCGCCACTGGGTATTACTATGGCTCAGGTTTCTGGGGTCAGGGCACTCTCGTCACCGTCAGCAGCGCCAAAACAACAGCACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACCGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:337—mu11B6 LC DNA
GACATTGTGCTGACACAGAGTCCAGCATCCTTGGCAGTATCTTTGGGGCAGCGGGCAACAATTTCATGCCGTGCATCTGAAAGTGTGGAGTATTTTGGAACTTCTCTTATGCACTGGTATCGCCAGAAGCCTGGGCAGCCTCCCAAACTCCTTATATATGCCGCTTCCAACGTGGAGTCCGGAGTACCAGCACGCTTTTCCGGCTCTGGGTCCGGCACAGACTTTTCCCTCAATATCCAACCTGTTGAAGAAGACGATTTTTCCATGTATTTTTGCCAACAGACACGCAAGGTTCCATATACATTCGGCGGCGGCACTAAACTTGAGATCAAACGGGCTGATGCTGCACCGACTGTGTCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
SEQ ID NO:338—hu11B6 HC DNA
CAGGTCCAACTGCAAGAGAGCGGACCGGGCCTGGTAAAGCCATCCGACACATTGTCCCTGACGTGTGCGGTAAGTGGAAACTCTATCACTAGCGACTATGCGTGGAATTGGATAAGACAACCGCCGGGCAAGGGGCTGGAATGGATAGGATATATCAGCTATTCCGGTTCTACGACATACAATCCTTCCCTGAAAAGCAGAGTCACTATGTCACGCGACACGTCCAAGAATCAGTTCTCATTGAAATTGTCATCCGTAACGGCCGTTGACACTGCGGTTTATTATTGCGCAACCGGATATTACTACGGCTCTGGTTTTTGGGGACAGGGAACACTTGTTACTGTTAGTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:339—hu11B6 LC DNA
GACATAGTCTTGACTCAGAGCCCGGATTCCCTTGCTGTGTCTCTGGGAGAACGAGCTACGATCAACTGCAAGGCAAGTGAATCCGTAGAATACTTCGGGACATCATTGATGCATTGGTATCAACAGAAACCGGGGCAACCGCCCAAATTGCTGATATATGCGGCTAGTAATAGAGAATCAGGAGTACCGGATAGGTTTAGTGGTTCAGGATCAGGTACAGATTTCACCCTGACAATAAGTAGCTTGCAAGCCGAAGACGTAGCAGTGTATTACTGCCAACAAACCCGAAAGGTGCCATATACGTTTGGACAGGGTACAAAGTTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:340—scFv 17(KL2B413HL)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:341—scFv 18(KL2B413LH)
EIVLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQNYDILTGHYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:342—scFv 19(KL2B359 HL)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSSGGSEGKSSGSGSESKSTGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：43—scFv 20(KL2B359 LH)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPRLLIYAASNVESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFAVYFCQQTRKVPYTFGGGTKVEIKGGSEGKSSGSGSESKSTGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGNSITSDYAWNWIRQFPGKRLEWIGYISYSGSTTYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:344 VH共有序列
QVQLQESGPGLVKPSX1TLSLTCX2VSGNSITSDYAWNWIRQX3PGKGLEWX4GYISYSGSTTYNPSLKSRVTMSRDTSKNQFSLKLSSVTX5X6DTAVYYCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
X1为D或Q；X2为A或T；X3为P或F；X4为I或M；X5为A或P；或者X6为V或A。HCDR残基带下划线。
SEQ ID NO:345 VL共有序列
X1IVLTQSPX2x3LX4X5SX6GERATX6X8CX9ASESVEYFGTSLMHWYQQKPGQPPX10LLIYAASNX11E SGX12PX13RFSGSGSGTDFTLTIX14SLQX15EDX16AVYX17CQQTRKVPYTFG X18GTKX19EIK
X1为D或E；X2为D或A；X3为S或T；X4为A或S；X5为V或L；X6为L或P；X7为I或L；X8为N或S；X9为R或K；X10为K或R；X11为V或R；X12为V或I；X13为A或D；X14为Q或S；X15为P或A；X16为F或V；X17为Y或F；X18为Q或G；并且X19为L或V。LCDR残基带下划线。
SEQ ID NO:346—表位
KVTEF
SEQ ID NO:347—表位
HYRKW
SEQ ID NO:348—表位
SHGWAH
SEQ ID NO:349—表位
RHNLFEPEDTGQRVP
SEQ ID NO:350—表位
GWGSIEPEE

Claims (42)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(a)细胞外结构域，所述细胞外结构域特异性地结合人激肽释放酶-2(hK2)抗原，
(b)跨膜结构域；和
(c)细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域任选地包括至少一个共刺激结构域。
2.根据权利要求1所述的CAR，所述CAR还包含：
(d)CD8a-铰链区，
其中所述跨膜结构域包含CD8a跨膜区(CD8a-TM)多肽；并且
其中所述细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域和初级信号传导结构域，所述共刺激结构域包含TNF受体超家族成员9(CD137)组分，所述初级信号传导结构域包含T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(CD3z)组分。
3.根据权利要求2所述的CAR，其中
所述CD8a铰链区包含与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271或SEQ ID NO:272具有至少90％同一性的氨基酸序列；
所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少90％同一性的氨基酸序列；并且/或者
所述细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域和初级信号传导结构域，所述共刺激结构域具有与SEQ ID NO:27具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述初级信号传导结构域具有与SEQ ID NO:28具有至少90％同一性的氨基酸序列。
4.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3；具有SEQ ID NO:314的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:315的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:309的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:310的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3；具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3；
具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3，
其中所述细胞外抗原结合结构域结合所述hK2抗原。
5.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链CDR3，
其中所述细胞外抗原结合结构域结合所述hK2抗原。
6.根据权利要求4所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域还包含：
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的轻链CDR3。
7.根据权利要求6所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含：
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:314的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:315的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:311的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:312的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:313的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:128的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:125的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:133的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的轻链CDR3；
具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:136的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3；或者
具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ IDNO:97的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链CDR3。
8.根据权利要求6所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含：具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链CDR3、以及具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链CDR2、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链CDR3。
9.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含：
轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:318的氨基酸序列；和/或
重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:317的氨基酸序列；
其中所述细胞外抗原结合结构域结合所述人激肽释放酶-2(hK2)抗原。
10.根据权利要求9所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含：
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列的重链可变区。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)，所述scFv包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。
12.根据权利要求11所述的CAR，其中所述scFv包含位于所述轻链可变区(VL)与所述重链可变区(VH)之间的接头多肽。
13.根据权利要求12所述的CAR，其中所述接头多肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的CAR，其中所述scFv包含选自SEQ ID NO:8-23、SEQ ID NO:169-184和SEQ ID NO:340-343的氨基酸序列。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含信号多肽。
16.根据权利要求15所述的CAR，其中所述信号多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
17.根据权利要求4至16中任一项所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含多肽组分，所述多肽组分选自：TNF受体超家族成员9(CD137)组分、T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(CD3z)组分、分化簇(CD27)组分、分化簇超家族成员组分，以及它们的组合。
18.根据权利要求17所述的CAR，其中所述CD137组分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的CAR，其中所述CD3z组分包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或任选地，所述细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域和初级信号传导结构域，所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，所述初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
21.根据权利要求4至20中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD8a跨膜区(CD8a-TM)多肽。
22.根据权利要求21所述的CAR，其中所述CD8a-TM多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
23.根据权利要求4至22中任一项所述的CAR，所述CAR还包含将所述跨膜结构域连接至所述细胞外抗原结合结构域的铰链区。
24.根据权利要求23所述的CAR，其中所述铰链区为CD8a铰链区。
25.根据权利要求24所述的CAR，其中所述CD8a铰链区包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271或SEQ ID NO:272的氨基酸序列。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的CAR，其中所述细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:29-44、SEQ ID NO:78-81、SEQ ID NO:221-236和SEQ ID NO:273-308的氨基酸序列。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含选自SEQ ID NO:46-61、SEQ ID NO:82-85和SEQ ID NO:205-220的氨基酸序列。
28.一种分离的淋巴细胞，所述分离的淋巴细胞表达根据权利要求1至27中任一项所述的CAR。
29.根据权利要求28所述的分离的淋巴细胞，其中所述淋巴细胞为T淋巴细胞。
30.根据权利要求28所述的分离的淋巴细胞，其中所述淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。
31.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据权利要求1至27中任一项所述的CAR。
32.一种载体，所述载体包含根据权利要求31所述的核酸分子。
33.一种细胞，所述细胞表达根据权利要求31所述的核酸分子。
34.一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的根据权利要求28至30中任一项所述的淋巴细胞。
35.一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的根据权利要求28至30中任一项所述的淋巴细胞和药学上可接受的赋形剂。
36.根据权利要求1至27中任一项所述的CAR或者根据权利要求34或35所述的药物组合物，其用于在疗法中使用。
37.根据权利要求1至27中任一项所述的CAR或者根据权利要求34或35所述的药物组合物，其用于在治疗患有癌症的受试者的方法中使用。
38.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
将治疗有效量的根据权利要求28至30中任一项所述的淋巴细胞施用于有需要的受试者，由此所述淋巴细胞诱导对所述受试者中的癌细胞的杀伤。
39.根据权利要求38所述的方法，或者根据权利要求37所述的用于在方法中使用的CAR或药物组合物，其中所述癌症是前列腺癌或表达雄激素受体的乳腺癌。
40.一种对癌细胞进行靶向杀伤的方法，所述方法包括：
使所述癌细胞与根据权利要求28至30中任一项所述的淋巴细胞接触，由此所述淋巴细胞诱导对所述癌细胞的杀伤。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述癌细胞是前列腺癌细胞或表达雄激素受体的乳腺癌细胞。
42.一种检测受试者中存在癌症的方法，所述方法包括：
使从所述受试者获得的细胞样品与根据权利要求1至27中任一项所述的CAR接触，从而形成CAR-细胞复合物，以及
检测所述复合物，其中检测到所述复合物指示所述受试者中存在癌症。
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