KR102235011B1 - 약물 함유 plga 미립구 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 트라메티닙을 함유하는 생체분해성 고분자 미립구 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 고분자 미립구는 트라메티닙을 유효성분으로 하는 서방성 비경구 제형의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면 소수성의 약물이 미립구에 봉입되지 않고 수상에서 결정화되는 문제점을 극복하고 트라메티닙 함유 고분자 미립구를 양호한 구형의 모양으로 얻을 수 있으며, 거의 100 %에 가까운 약물 봉입률을 달성할 수 있다.

Description

약물 함유 PLGA 미립구 및 그의 제조방법{DRUG-CONTAINING PLGA MICROSPHERES AND THE PREPARATION METHODS THEREOF}

본 발명은 트라메티닙을 함유하는 생체분해성 고분자 미립구 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 고분자 미립구는 트라메티닙을 유효성분으로 하는 서방성 비경구 제형의 제조에 사용될 수 있다.

알츠하이머병을 비롯한 치매는 임상적으로 인지력 감퇴와 기억력 손상을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환이다. 병이 진행됨에 따라 환자들은 기억 손상과 사고력 장애를 겪기 시작한다. 따라서 환자들이 약을 복용하는 것을 잊어버리거나 과다 복용하지 않도록 보호자가 주의를 기울여야 한다. 중증의 알츠하이머 환자는 정신적 문제가 발생하여 약의 복용을 거부할 수도 있다. 더욱이 알츠하이머 환자군의 대부분이 노인이므로, 알츠하이머병 이외에도 다른 질환들을 갖고 있을 가능성이 높으며, 그로 인해 다양한 종류의 약을 복용해야 하기 때문에 복약법이 복잡해지고 복약순응도가 심각하게 낮아질 수 있다. 또한, 현재 시판되고 있는 항치매 약물은 대부분 정제 형태로 경구 투여되고 있는데, 노인들은 약을 삼키기 어려워하는 경우가 많다. 따라서, 비경구 경로를 통한 장기간 방출 서방성 제제가 치매 환자의 복약순응도를 향상시키는 데 바람직할 수 있다. 또한, 비경구 서방성 제제는 연하장애가 있는 환자들의 투약에 유용하다.

비경구 서방성 제형은 경구 제형에 비하여 평탄한 혈장 농도를 제공할 수 있으므로 약물 혈장 농도의 급상승과 관련된 부작용을 최소화할 수 있고, 약물 혈장 농도의 변동(fluctuation)을 줄일 수 있으며, 위장관 흡수와 초회-통과 대사와 관련된 생체이용률 문제를 피할 수 있어서 약물 용량을 감소시킬 수 있고, 투약 빈도를 줄임으로써 복약순응도를 향상시킬 수 있다.

알츠하이머 치료제의 일종인 도네페질의 경우, 비경구 서방성 제형으로 만들려는 시도가 이루어지고 있다. 예를 들어 한국특허등록 1811797호에는 도네페질, 방출조절제로서 도네페질의 난용성 염인 크시나포에이트 또는 나파디실레이트, 및 생체적합성 고분자를 포함하며 도네페질 함량이 15 중량% 이상인 것을 특징으로 하는 도네페질 함유 고분자 미립구 제형이 개시되어 있다.

트라메티닙(trametinib)은 화학명이 N-(3-{3-사이클로프로필-5-[(2-플루오로-4-아이오도페닐)아미노]-6,8-디메틸-2,4,7-트리옥소-3,4,6,7-테트라하이드로피리도[4,3-d]피리미딘-1(2H)-일}페닐)아세트아미드(N-(3-{3-Cyclopropyl-5-[(2-fluoro-4-iodophenyl)amino]-6,8-dimethyl-2,4,7-trioxo-3,4,6,7-tetrahydropyrido[4,3-d]pyrimidin-1(2H)-yl}phenyl)acetamide)인 화합물로서, 상품명 MEKINIST®로 흑색종 및 비소세포암에 항암제로 사용되고 있다. 트라메티닙은 항암제로서 1일 1회 경구 투여하는 정제로 시판되고 있다. 시판 정제 중에 트라메티닙은 디메틸술폭사이드(DMSO) 용매화물의 형태로 존재한다. 트라메티닙 DMSO 용매화물은 물에 거의 녹지 않으며(37 ℃, pH 2 내지 8의 수성 매질에서 0.2-0.3 ㎍/mL), 디메틸술폭사이드에 대한 용해도는 3.8 mg/mL (20 ℃)이고, 그 이외의 유기용매에 대한 용해도는 알려져 있지 않다.

최근 트라메티닙이 치매를 비롯한 신경퇴행성 질환의 치료제로서 효과가 있을 것임을 제시하는 연구가 진행됨에 따라(PCT/KR2017/013444), 신경퇴행성 질환 환자에 투여하기에 용이한 트라메티닙 함유 신규 제형의 개발이 필요하다.

본 발명은 트라메티닙을 장기간 지속 방출하는 서방성 제형에 사용하기 위한 트라메티닙 함유 생체분해성 고분자 미립구를 제공하고, 그 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은

a) 트라메티닙 또는 그의 디메틸술폭사이드(DMSO) 용매화물, 및 폴리글리콜라이드, 폴리락타이드, 및 폴리글리콜라이드와 폴리락타이드의 공중합체로 구성된 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 생분해성 생체적합성 고분자를 메틸렌클로라이드에 용해시켜서 유기용매상을 제조하는 단계;

b) 상기 유기용매상을, 유기용매상 부피의 2 내지 20 배 부피의 수용액에 가하여 1차 유제를 제조하는 단계; 및

c) 상기 유제를, 단계 a)의 유기용매상 부피의 40 내지 100 배 부피의 수용액에 추가하고 메틸렌클로라이드를 제거하는 단계

를 포함하는 트라메티닙을 함유하는 고분자 미립구의 제조 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 d) 단계인 c)에서 제조된 미립구를 수거하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 트라메티닙은 유리 염기 또는 그의 디메틸술폭사이드(DMSO) 용매화물의 형태이다. 이하에서 “트라메티닙”은 달리 언급이 없는 한 트라메티닙의 DMSO 용매화물 형태를 지칭한다.

본 발명에서는 트라메티닙을 용해시키기 위한 유기용매로서 메틸렌클로라이드를 사용한다. 트라메티닙은 메틸렌클로라이드 이외에 고분자 미립구의 제조에 자주 사용되는 다른 유기 용매, 예를 들어 메틸 프로피오네이트, 에틸 아세테이트, 에틸 포르메이트, 또는 이소프로필 포르메이트 등에 잘 녹지 않아 선택할 수 있는 유기용매가 매우 제한적이었다.

소수성 약물 함유 고분자 미립구 제조시 사용된 유기용매를 제거하기 위하여 용매증발법 또는 용매추출법을 통상적으로 사용한다. 용매증발법은 고분자 화합물을 녹인 유기용매 상에 약물을 분산 또는 용해시킨 후, 물과 같은 분산매에 유화시켜 수중유형(O/W) 유제를 제조한 다음, 유제에 있는 유기용매를 분산매로 확산시켜 공기/물 계면을 통하여 유기용매를 서서히 증발시킴으로써 약물 함유 고분자 미립구를 형성한다.

한편 용매추출법은 유기용매를 대량의 가용화 용매를 사용하여 추출하여 제거하는 방법이다. 유기용매가 가용화 용매에 의해 유제방울로부터 추출되면 녹아 있던 고분자 화합물이 경화되어 유제방울이 미립구로 전환된다. 일반적으로 사용되는 가용화 용매는 물인데, 유기용매의 물 용해도 정도가 용매추출법의 사용 여부에 영향을 미친다.

예를 들어 유기용매로 메틸렌클로라이드를 사용할 경우, 메틸렌클로라이드는 물에 대한 용해도가 매우 낮으므로(1.32 중량%), 메틸렌클로라이드를 추출해 내려면 너무 많은 양의 물이 필요하게 되어 용매추출법은 적합하지 않은 경우가 많다. 그 대신 메틸렌클로라이드는 비점이 39.8 ℃로 비교적 낮으므로 용매증발법을 사용하여 제거하기가 수월하다. 한편 에틸 아세테이트는 물에 대한 용해도가 8.7 중량%에 달하여 메틸렌클로라이드보다 상대적으로 적은 양의 물로도 추출이 가능한 반면 비점이 77 ℃로서 비교적 높아 통상 용매증발법보다는 용매추출법을 사용하여 제거한다.

본 발명자는 트라메티닙과 고분자(폴리-d,l-락타이드-코-글리콜리드; PLGA)를 용해시킨 메틸렌클로라이드 용액을 수상에 유화시켜 유제를 형성시킨 후 통상의 용매증발법을 이용하여 메틸렌클로라이드를 제거하는 경우, 시간이 경과함에 따라 유제 방울로부터 메틸렌클로라이드가 제거되면서 수상에 약물 결정이 석출되고 PLGA가 침전되며, 그 결과 PLGA는 구형의 미립구 형태를 띄지 못하게 되고, 동시에 트라메티닙의 대부분은 PLGA 미립구에 봉입되지 않고 수상에서 결정 형태로 석출하게 된다는 점을 발견하였다(비교예, 도 2).

이러한 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, 트라메티닙과 PLGA를 용해시킨 메틸렌클로라이드 용액을 먼저 소량의 수용액에 가하여 1차 유제를 만든 후, 일정 시간 이내에 이 유제를 다시 다량의 수용액에 첨가하여 용매추출 및 용매증발을 통해 메틸렌클로라이드를 제거하는 과정을 통해 우수한 수득율로 구형의 미립구를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 거의 100 %에 가까운 약물 봉입률을 달성할 수 있음을 발견하였다.

메틸렌클로라이드를 사용하는 통상의 용매증발법에서는 유기용매상을 수용액에 첨가하여 유제를 만든 후 4 내지 5 시간, 또는 밤새(overnight) 교반할 때 메틸렌클로라이드가 유제방울로부터 물로 서서히 확산되어 나오고 수상에 출현한 메틸렌클로라이드가 물과 공기 계면을 통해 증발되게 된다. 그 결과 유제방울로부터 메틸렌클로라이드가 제거되고 PLGA에 싸인 약물이 남아 구형의 고체 미립구가 형성된다(경화 과정). 그러나 트라메티닙의 경우에는 고분자와 약물이 분자 수준에서 잘 섞이지 않고 분리되며, 장시간의 경화 과정 동안 고분자와 약물이 서로 다른 속도로 석출되어 구형의 미립자를 형성하지 못하고 약물의 결정화 및 석출과 PLGA의 침전 현상이 발생하는 것으로 생각된다.

반면, 본 발명의 방법에서는 1차 유제를 만든 후 단시간 내에 다량의 물을 유제에 첨가하여 유제방울의 표면을 급격히 경화시켜 약물의 수상 전이를 방지하고 물에 존재하는 메틸렌클로라이드를 상대적으로 빨리 증발 제거시킴으로써 위와 같은 현상을 막을 수 있는 것으로 추정된다.

이하에서 본 발명에 따른 미립구의 제조 방법을 단계별로 나누어 구체적으로 설명한다.

a) 단계: 유기용매 상의 제조 단계

본 발명에서 고분자 미립구를 제조하는 데 사용되는 고분자인 폴리-d,l-락타이드-코-글리콜라이드(poly-d,l-lactide-co-glycolide, “PLGA”는 폴리글리콜라이드, 폴리락타이드, 또는 폴리글리콜라이드와 폴리락타이드의 공중합체로서, 생체 내에서 가수분해되어 무독성의 락트산(lactic acid)과 글리콜산(glycolic acid)으로 변환되는 생체친화적인 고분자 화합물이다.

본 발명에서 PLGA의 락티드:글리콜리드 단량체 비율은 100:0 내지 40:60, 예를 들면 100:0, 85:15, 82:18, 75:25, 65:35, 50:50 등일 수 있고, 바람직하게는 75:25 내지 40:60, 더욱 바람직하게는 65:35 내지 40:60이다. 본 발명에 따른 PLGA의 말단 기는 히드록시, 카르복실, 에스테르 등일 수 있다. 바람직하게는, 락티드:글리콜리드 단량체 비율이 50:50이고 말단기가 카르복실기인 PLGA를 사용하면 월 1회의 주기로 투여하는 서방성 제형에 적합한 시험관내 용출 프로파일을 얻을 수 있다. 본 발명에서 PLGA의 분자량 (Mw) 범위는 예를 들면 1,000 내지 500,000 Da, 고유 점도(inherent viscosity (IV))는 0.9 dl/g 미만일 수 있다. 바람직하게는 PLGA의 분자량 (Mw) 범위는 10,000 내지 50,000 Da, 더욱 바람직하게는 10,000 내지 30,000 Da이다.

PLGA와 트라메티닙에 메틸렌클로라이드를 첨가하여 약 10분간 용해시킨다. PLGA는 트라메티닙 DMSO 용매화물 1 중량부에 대하여 1 내지 20 중량부, 바람직하게는 2 내지 10 중량부, 예를 들어 10 중량부, 9 중량부, 8 중량부, 7 중량부, 6 중량부 또는 5 중량부 첨가할 수 있다.

메틸렌클로라이드는 트라메티닙과 PLGA를 충분히 용해시킬 수 있는 양으로 사용한다. 예를 들어 트라메티닙 DMSO 용매화물 50 mg과 PLGA 250 mg을 메틸렌클로라이드 4 ml에 용해시킬 수 있다.

b) 단계: 1차 유제 제조 단계

단계 a)에서 제조한 유기용매상을, 교반하고 있는 수용액에 첨가하여 1차 유제를 제조한다.

이때 수용액은 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol (PVA))과 같은 유화제를 포함할 수 있다. 추가할 수 있는 유화제 및/또는 안정화제로는 디도데실디메틸암모늄 브로마이드(didodecyldimethylammonium bromide), 폴리비닐 피롤리돈, 솔루톨, 폴리소르베이트, 폴록사머, 카르보폴, 폴리에틸렌글리콜, 소듐 도데실설페이트 등이 있다. 이들 유화제 및/또는 안정화제는 물의 중량에 대하여 0.1 내지 5 중량 % (w/w), 바람직하게는 0.2 내지 2 중량 %, 0.3 내지 1 중량%, 예를 들면 0.5 중량%로 사용할 수 있다. 바람직하게는 수용액으로 0.5 중량% 폴리비닐알콜 용액을 사용한다.

유기용매상 대 수용액의 부피비는 1:20 내지 1:2, 바람직하게는 1:10 내지 1:5이다. 예를 들어 4 ml의 메틸렌클로라이드 용액을 40 ml의 수용액에 첨가한다. 이러한 유기용매상 대 수상의 부피비를 사용함으로써, 저에너지 혼합기를 사용하더라도 손쉽게 유제를 제조할 수 있는 장점이 있다.

메틸렌클로라이드 용액을 수용액에 첨가한 후 10분 내지 1시간, 바람직하게는 20분 내지 40분, 예를 들면 30분 동안 교반한다. 이와 같은 짧은 교반 시간 동안에는 약물의 수상으로의 전이 및 결정화 현상이 발생하지 않게 된다.

c) 단계: 메틸렌클로라이드의 제거 단계 (경화 단계)

단계 b)에서 교반한 유제를 수용액에 첨가한다.

이 때 수용액은 폴리비닐알콜과 같은 유화제를 포함할 수 있으며, 단계 b)에서 언급한 유화제 및/또는 안정화제를 포함할 수 있다. 유화제 및/또는 안정화제는 물의 중량에 대하여 0.01 내지 2 중량 % (w/w), 바람직하게는 0.05 내지 0.5 중량 %, 예를 들면 0.1 중량% 로 사용할 수 있다. 바람직하게는 수용액으로 0.1 중량% 폴리비닐알콜 용액을 사용한다. 수용액은 단계 a)에서 첨가한 메틸렌클로라이드의 부피에 비하여 40 내지 200 배, 바람직하게는 70 내지 100 배, 예를 들면 87.5 배의 양으로 사용할 수 있다. 유제의 첨가 후 메틸렌클로라이드를 제거하여 미립구를 경화시킨다. 메틸렌클로라이드의 제거는 교반 시간, 온도의 증가 및/또는 감압 등의 방법을 적절히 조합 및 조절하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 유제를 첨가한 후 1 시간 실온에서 교반하고, 그 후에 온도를 약 30 ℃로 올리면서 교반할 수도 있다.

d) 단계: 미립구의 수거

경화된 미립구를 여과하고 수거하여 진공 건조함으로써 트라메티닙 함유 PLGA 미립구를 얻는다.

본 발명에서 제조된 미립구 중 트라메티닙 DMSO 용매화물의 함량(w/w)은 5 내지 30%, 바람직하게는 10 내지 20 %이다.

또한, 본 발명에서는 트라메티닙을 포함하는 미립구 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 비경구투여용 약제학적 조성물을 제공한다. 여기에서, 비경구투여용 약제학적 조성물은 특히 주사제인 것이 바람직하고, 피하 주사 또는 근육 주사의 방법으로 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 트라메티닙을 포함하는 약제학적 조성물은 알츠하이머병을 비롯한 신경퇴행성 질환의 치료제로서 사용될 수 있으며, 투여 용량은 환자의 연령, 증상, 투여 제형 등에 따라 다양하게 조절 가능하나, 트라메티닙(유리 염기)으로서 1일 0.1 mg 내지 5 mg, 바람직하게는 1일 0.175 내지 2 mg, 또는 1일 0.5 내지 2 mg, 1일 0.5 내지 1 mg의 용량으로 투여할 수 있다. 또한 예를 들면 주 1 내지 2회, 또는 월 1 내지 2회, 또는 2개월에 1회의 간격으로 투여되는 서방성 주사제로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 트라메티닙 미립구는 최종 투여시 주사 가능한 현탁용제에 현탁하여 투여되는 제제로 제공될 수 있다. 주사 가능한 현탁용제는 수용성 유기 담체로서, 예를 들어, 등장화제, 점증제, 계면활성제, 완충제 등을 포함할 수 있다. 사용 가능한 등장화제는 만니톨, 수크로스, 소르비톨, 트레할로스, 락토스, 염화나트륨 등의 수용성 부형제 또는 당류가 될 수 있고, 점증제로는 카멜로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 포비돈 등을 예로 들 수 있다. 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 종류로 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등을 사용할 수 있고, 소르비탄 에스터 종류로 스판 80, 스판 20 등이 가능하다. 또한 완충제로는 인산일수소나트륨, 무수구연산, 수산화나트륨, 염화나트륨 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면 트라메티닙을 함유하는 고분자 미립구를 양호한 구형의 모양으로 얻을 수 있다. 또한, 종래의 기술에 따라 미립구를 제조하면 소수성의 약물이 미립구에 봉입되지 않고 수상에서 결정화되는 경향을 보여주기 때문에 약물봉입률이 매우 낮다. 하지만 본 발명에 따르면 이러한 현상을 극복할 수 있어 거의 100 %에 가까운 약물 봉입률을 달성할 수 있다. 또한 본 발명에 따르면 장기간 동안 적절한 속도로 약물 방출이 이루어지는 트라메티닙 함유 고분자 미립구를 얻을 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 제조 방법에서 시간에 따른 유제/미립자의 상태를 관찰하여 촬영한 광학현미경 사진 및 주사전자현미경 사진이다.
도 1a는 유제 제조 후 3.5 시간 경과하였을 때의 광학 현미경 사진이다. 바의 크기는 100 ㎛를 나타낸다.
도 1b 및 1c는 여과 건조한 후 최종적으로 얻은 미립자의 주사전자현미경(SEM; Scanning Electron Microscope) 사진이다.
도 2는 비교예에 따른 제조 방법에서 시간에 따른 유제/미립자의 상태를 관찰하여 촬영한 광학현미경 사진이다. (a)는 유제 제조 후 2.5 시간 경과시, (b)는 5 시간 경과시, (c)는 7 시간 경과시 촬영한 것이다. (d)는 (c)를 고배율로 찍은 것이다. (a), (b), (c)에서 바의 크기는 100 ㎛를, (d)에서 바의 크기는 20 ㎛를 나타낸다.
도 3은 실시예 1에 따라 0.35 g의 PLGA1과 50 mg의 트라메티닙 DMSO 용매화물을 사용하여 제조한 미립구의 입도 분포를 나타낸다.
도 4는 실시예 1에 따라 0.35 g의 PLGA1과 50 mg의 트라메티닙 DMSO 용매화물을 사용하여 제조한 미립구의 열질량분석 결과를 나타낸다.
도 5는 트라메티닙 DMSO 용매화물 50 mg과 PLGA4 (5050 DLG 2A) 0.35 g을 사용하여 제조한 미립구의 주사전자현미경 사진이다.
도 6은 트라메티닙 DMSO 용매화물 50 mg과 PLGA4 (5050 DLG 2A) 0.35 g을 사용하여 제조한 미립구의 시험관내 용출율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 트라메티닙 DMSO 용매화물 50 mg과 PLGA2 (5050 DLG 2E) 0.35 g을 사용하여 제조한 미립구의 시험관내 용출율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 트라메티닙 DMSO 용매화물 50 mg과 PLGA3 (Resomer R202H) 0.35 g을 사용하여 제조한 미립구의 시험관내 용출율을 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 : PLGA 및 트라메티닙 DMSO 용매화물의 미립구의 제조

실시예1에 사용한 PLGA 고분자는 다음과 같다.

기호	상품명	락티드:글리콜리드 비율	고유점도(inherent viscosity) (dL/g)	분자량 (kDa)	제조원
PLGA1	8515 DLG A2	85:15	0.20	15	Evonik
PLGA2	5050 DLG 2E	50:50	0.21	22	Lakeshore Biomaterials
PLGA3	Resomer R202H	100:0	0.16-0.24	Not specified	Evonik

0.25 내지 0.45 g의 PLGA1과 50 mg의 트라메티닙 DMSO 용매화물을 4 ml의 메틸렌클로라이드에 첨가하고 10분동안 용해시켰다. 이 용액을 420 rpm으로 교반되고 있는 40 ml의 0.5 % 폴리비닐알콜 수용액에 한번에 첨가하였다. 30분간 실온에서 교반한 후 제조된 유제 전체를 420 rpm에서 교반하고 있는 350 ml의 0.1 % 폴리비닐알콜 수용액에 넣었다. 실온에서 1 시간 교반한 후 온도를 30 ^oC로 올리고 2 시간 추가로 교반하였다. 그 후 미립자를 여과 수거하여 진공건조하였다.

제조 결과를 도 1에 나타낸다.

도 1a는 0.25 g의 PLGA1과 50 mg의 트라메티닙 DMSO 용매화물을 사용하였을 때(표 2의 배치 1), 유제 제조 후 3.5 시간 경과(30분 실온 교반 후 0.1 % 폴리비닐알콜 수용액에 추가하고 실온에서 1시간 교반 후 30 ℃에서 2시간 추가 교반) 후 촬영한 광학 현미경 사진들이다. 본 발명의 제조공정에 따를 때 유제방울이 완전하게 구형의 미립구로 잘 경화되었음을 보여준다.

도 1b의 미립구는 0.35 g의 PLGA1과 50 mg의 트라메티닙 DMSO 용매화물을 사용하여 제조한 것이고(표 2의 배치 2), 도 1c의 미립구는 0.45 g의 PLGA1과 50 mg의 트라메티닙 DMSO 용매화물을 사용하여 제조한 것이다(표 2의 배치 3). 도 1b 및 1c에서 보는 바와 같이 최종적으로 얻은 미립자는 겉면이 매끄러운 구형의 형태를 보였다.

고분자를 PLGA1 대신 PLGA2 또는 PLGA3으로 변화시켜서 제조하거나(표 2의 배치 4, 5, 7), PLGA1으로 반복 실험하였을 때에도(표 2의 배치 6) 위와 유사한 결과를 얻을 수 있었다.

비교예

0.25 g의 PLGA1과 트라메티닙 DMSO 용매화물 50 mg을 4 ml의 메틸렌클로라이드에 녹이고, 이를 420 rpm으로 교반되고 있는 40 ml의 0.5 % 폴리비닐알콜 수용액에 첨가하였다. 총 7시간 동안 실온에서 교반하여 용매를 제거시키면서 시간별(2.5시간, 5시간, 7시간)로 유제/미립자 현탁액의 상태를 광학현미경을 사용하여 관찰하였다.

도 2의 (a)에서 보는 바와 같이 2.5 시간 경과시까지는 유제 방울의 상태가 유지되었지만, 5 시간(b), 7 시간(c 및 d) 경과시 관찰하였을 때는 구형의 미립자가 형성되지 않고 비규칙적인 고분자 침전물이 형성되었으며 또한 약물 대부분은 수상에서 결정 상태로 석출되었다.

실시예 2: 미립자 내 약물 봉입률의 측정

실시예 1에서 제조한 약물 함유 미립자 25 내지 35 mg을 바이알에 취하고, 4 ml의 테트라하이드로푸란을 적가하였다. 5분 정도 진탕한 후, 육안으로 관찰하여 약물이 충분히 녹을 때까지 약 2 내지 4분간 초음파 분쇄(sonication)를 실시하였다.

이 용액을 16 ml의 HPLC 분석용 이동상과 혼합하였다.

0.45 ㎛ 공극 크기를 가진 시린지 필터를 사용하여 여과한 후, 여액 20 ㎕를 HPLC에 주입하여 분석하였다. HPLC에 사용된 이동상, 컬럼, 및 디텍터는 다음과 같다.

컬 럼: C18 Luna 5 ㎛ column (150 x 4.6 mm)

이동상: 아세토니트릴/메탄올/물/트리플루오로아세트산 = 380/380/240/1

디텍터: UV detector at 254 nm

이동상 속도: 1.2 ml/min

검체의 약물농도를 정량하기 위해 트라메티닙 DMSO 용매화물 표준액들을 사용하여 표준검량곡선식을 확립하였다. 약물 봉입률은 아래의 식을 통해 구하였다.

약물 봉입률 (%) = 100 × (실제부하량 % ÷ 이론부하량 %)

여기에서 실제부하량 %는 100 ×(미립구 검체에 존재하는 약물 양 ÷ 미립구 검체 양)이며, 이론부하량 %는 100 ×(미립구 제조에 사용된 약물 양 ÷ 미립구 제조에 사용된 PLGA와 약물을 합친 양)이다.

그 결과는 다음과 같았다.

배치코드	배치 조성		약물 이론부하량 (%)	약물 실제부하량 (%)	봉입률 (%)
	고분자 (mg)	약물 (mg)
배치 1	PLGA1, 250	50	16.667	16.753	100.5
배치 2	PLGA1, 350	50	12.500	12.450	99.6
배치 3	PLGA1, 450	50	10.000	9.8125	98.1
배치 4	PLGA2, 350	50	12.500	11.602	92.8
배치 5	PLGA3, 350	50	12.500	11.643	93.1
배치 6	PLGA1, 250	50	16.667	16.255	97.5
배치 7	PLGA3, 350	75	17.647	17.55	99.5

상기 표에서 보는 바와 같이 약물 이론 부하율을 10 %에서 17.647 %까지 변경시켜 보았을 때 모든 경우 거의 완벽한 봉입률을 나타냈다. 이러한 결과들은 미립구 제조공정에 사용된 트라메티닙의 거의 모두가 미립구 내로 봉입되었음을 제시한다.

실시예 3: 미립구의 입도 분석 및 열질량분석

PLGA1 0.35 g과 트라메티닙 DMSO 용매화물 50 mg을 미립구 조성으로 사용하여 실시예 1의 제조공정을 통해 만든 미립구의 입자 크기 및 입도, 그리고 열질량 분석을 실시하였다. 본 실험을 위해 각각 Mastersizer 3000E 입도분석기(Malvern Instruments 회사)와 Q50 TGA (TA Instruments 회사) 열질량분석기를 사용하였다.

미립구의 d_10%, d_50%, 그리고 d_90%는 각각 49.2, 83.1, 그리고 156 mm로 측정되었다(도 3). 이들 결과로부터 계산된 Span 수치는 1.29이었는데, 이는 곧 미립구 크기의 균일성을 나타낸다. 또한 이들 미립구들은 근육 또는 피하주사를 통하여 체내에 투여할 수 있는 크기를 지니고 있음을 보여준다.

도 4는 위 미립구의 열질량분석법의 결과를 제시하고 있다. 메틸렌클로라이드의 비점은 39.8 ℃로 알려져 있다. 상온에서 60 ℃까지 미립구의 질량 감소는 0.17 %에 불과하였다. 이는 곧 본 발명의 제조 방법에 따를 때 메틸렌클로라이드가 효과적으로 제거되어 미립구 경화가 달성될 수 있음을 나타낸다.

실시예 4: 미립구의 약물 방출 시험

실시예 1의 제조방법에 따라 트라메티닙 DMSO 용매화물 50 mg과 하기 [표 3]의 고분자 0.35 g을 사용하여 미립구를 제조하였다.

기호	상품명	락티드:글리콜리드 비율	고유점도(inherent viscosity) (dL/g)	분자량 (kDa)	제조원
PLGA2	5050 DLG 2E	50:50	0.21	22	Lakeshore Biomaterials
PLGA3	Resomer R202H	100:0	0.16-0.24	Not specified	Evonik
PLGA4	5050 DLG 2A	50:50	0.18	14	Lakeshore Biomaterials

제조한 미립구 25 mg을 2 % SDS 수용액 15 ml에 넣고, MyLab SLRM-3 mixer를 사용하여 17 rpm 속도로 교반하면서, 일정 시간 간격을 두고 5 ml의 상등액을 취하였다. 상등액을 취한 후에는 5 ml의 2 % SDS 수용액을 용출액에 보충하면서 24일간 시험을 진행하였다.

채취한 상등액 시료는 아세토니트릴과 메탄올 혼합용액(1:1, by v/v)을 사용해 1:1 비율로 희석한 후 HPLC를 사용하여 분석하여 용출률을 측정하였다. 그 결과를 도 6내지 8에 나타내었다.

3가지 종류의 고분자 중에서 PLGA4(5050 DLG2A)를 사용하여 제조한 미립자는 시험 기간동안 시간의 경과에 따라 약물방출이 서서히 증가하는 양상이 관찰되었으며, 24일째에 약 80% 정도의 약물이 방출되어, 월 1회 투여하는 서방형 제형에 적합한 시험관내 용출 프로파일을 보였다. 반면 PLGA2(5050 DLG 2E)는, PLGA4와 비교하였을 때 말단이 에스테르기라는 점에서 차이가 있고 다른 성질은 유사하나, 시험기간 동안 의미 있는 약물의 서방출 양상이 관측되지 않았다. PLGA4에 비하여 분해속도가 훨씬 느린 PLGA3(R202H)을 사용하여 제조한 미립자의 경우에는 시험기간 동안 약물의 방출이 거의 일어나지 않았다. PLGA4(5050 DLG 2A)를 이용하여 제조된 미립구는 도 5에서 보는 바와 같이 겉면이 매끄러운 구형의 형태를 보였다.

Claims (17)

1. a) 트라메티닙 또는 그의 디메틸술폭사이드(DMSO) 용매화물, 및 폴리글리콜라이드, 폴리락타이드, 및 폴리글리콜라이드와 폴리락타이드의 공중합체로 구성된 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 생분해성 생체적합성 고분자를 메틸렌클로라이드에 용해시켜서 유기용매상을 제조하는 단계;
   b) 상기 유기용매상을, 유기용매상 부피의 2 내지 20 배 부피의 수용액에 가하여 1차 유제를 제조하는 단계;
   c) 상기 유제를, 단계 a)의 유기용매상 부피의 40 내지 100 배 부피의 수용액에 첨가하고 메틸렌클로라이드를 제거하여 미립구를 얻는 단계; 및
   d) 미립구를 수거하는 단계
   를 포함하는 트라메티닙을 함유하는 고분자 미립구의 제조 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 트라메티닙이 트라메티닙 디메틸술폭사이드(DMSO) 용매화물인 방법.
4. 제1항에 있어서, 단계 b) 및 c)에서 수용액이 폴리비닐알콜, 디도데실디메틸암모늄 브로마이드, 폴리비닐 피롤리돈, 솔루톨, 폴리소르베이트, 폴록사머, 카르보폴, 폴리에틸렌글리콜, 및 소듐 도데실설페이트에서 선택된 유화제 또는 안정화제를 포함하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 단계 b)가 유기용매상을 수용액에 가한 후 10분 내지 1시간 동안 교반하는 것을 포함하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 단계 c)에서 메틸렌클로라이드의 제거가 교반, 온도의 증가 및 감압 중에서 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어지는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 단계 b)에서 유기용매상 대 수용액의 부피비가 1:10 내지 1:5인 방법.
8. 제1항에 있어서, 단계 c)에서 수용액의 부피가 단계 a)의 유기용매상 부피의 70 내지 100 배인 방법.
9. 제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 트라메티닙 함유 고분자 미립구.
10. 제9항의 미립구를 포함하는, 신경퇴행성 질환 치료용 비경구 서방성 제형.
11. 트라메티닙 또는 그의 디메틸술폭사이드(DMSO) 용매화물, 및
    폴리글리콜라이드와 폴리락타이드의 공중합체를 함유하는 고분자 미립구로서,
    상기 폴리글리콜라이드와 폴리락타이드의 공중합체는 락티드 대 글리콜리드 단량체 비율이 85:15내지 40:60이고, 분자량이 1,000 내지 500,000 달톤인 것인 고분자 미립구.
12. 제11항에 있어서, 락티드 대 글리콜리드 단량체 비율이 75:25 내지 40:60인 고분자 미립구.
13. 제12항에 있어서, 락티드 대 글리콜리드 단량체 비율이 50:50인 고분자 미립구.
14. 제13항에 있어서, 폴리글리콜라이드와 폴리락타이드의 공중합체의 분자량이 10,000 내지 50,000 달톤인 고분자 미립구.
15. 제11항에 있어서, 폴리글리콜라이드와 폴리락타이드의 공중합체의 말단기가 카르복실기인 고분자 미립구.
16. 제11항에 있어서 미립구 중 트라메티닙 또는 그의 디메틸술폭시드 용매화물의 함량이 10 내지 20 중량%인 미립구.
17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항의 미립구 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 비경구투여용 약제학적 조성물.
    
    

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