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KR102100817B1 - 이중 항원-유도된 이분 기능 상보성 - Google Patents

이중 항원-유도된 이분 기능 상보성 Download PDF

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KR102100817B1
KR102100817B1 KR1020147022652A KR20147022652A KR102100817B1 KR 102100817 B1 KR102100817 B1 KR 102100817B1 KR 1020147022652 A KR1020147022652 A KR 1020147022652A KR 20147022652 A KR20147022652 A KR 20147022652A KR 102100817 B1 KR102100817 B1 KR 102100817B1
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KR
South Korea
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cells
cell
antigen
polypeptide
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게르노트 스튤러
Original Assignee
율리우스-막시밀리안스 우니버지태트 뷔르츠부르크
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47715984&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR102100817(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 율리우스-막시밀리안스 우니버지태트 뷔르츠부르크 filed Critical 율리우스-막시밀리안스 우니버지태트 뷔르츠부르크
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Abstract

본 발명은 폴리펩타이드 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 각각 항원 "A"와 결합하는 표적 모이어티 "T" 및 기능성 도메인 "F"의 단편을 포함하는 두 개의 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 세트에 관한 것이며, 상기 두 개의 폴리펩타이드는 표면에 "A"를 가지는 기질이 존재하지 않는 경우 서로 연관되지 않고, 그리고 상기 "F"의 이합체화에 의한 이합체는 기능을 하게 된다. 게다가, 상기 세트의 의학적 및 진단적 용도를 설명한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 세트가 암호화하는 핵산 분자(들)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드 세트가 암호화하는 핵산 분자(들)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 세트를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 세트를 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

이중 항원-유도된 이분 기능 상보성{Dual Antigen-Induced Bipartite Functional Complementation}
본 발명은 폴리펩타이드 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 각각 항원 "A"와 결합하는 표적 모이어티 "T" 및 기능성 도메인 "F"의 단편을 포함하는 두 개의 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 세트에 관한 것이며, 상기 두 개의 폴리펩타이드는 표면에 "A"를 가지는 기질이 존재하지 않는 경우 서로 연관되지 않고, 그리고 상기 "F"의 이합체화에 의한 이합체는 기능을 하게 된다. 게다가, 상기 세트의 의학적 및 진단적 용도를 설명한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 세트가 암호화하는 핵산 분자(들)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드 세트가 암호화하는 핵산 분자(들)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 세트를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 세트를 포함하는 키트에 관한 것이다.
최근에 생체 외(in vitro), 전임상, 조기임상 시험에서 종양의 면역 치료를 위한 2중특이성항체 구조체의 뛰어난 효과를 보고하는 많은 주요 논문들이 있었다. 오늘날, 막대한 수의 다른 2중특이성항체 구조체가 이용가능한데, 이는 사이즈, 구성, 약물동력학, 및 직접적으로 종양 세포를 제거하거나 종양 세포 용해를 위한 면역 작동 세포에 관여하는 능력에 있어서 다르다.
항체-기반의 암 면역 전략은 표적 구조에 대한 뛰어난 민감성 및 특이성 때문에 매우 유망한 치료 옵션이다.
항체의 모듈식의 구조적 기능적 조직은 유전 공학에 의해 광범위한 조작이 가능하다. 다른 면역글로불린-유사 도메인은 특이적 도메인-관련 기능적 특징을 잃지 않고 분리되거나 및/또는 연결될 수 있다. 게다가, 그것은 이종 단백질뿐만 아니라 펩타이드가 아닌 모이어티와 결합되거나 연결될 수 있다. 그러므로 일반적인 항체의 자연적 제한이 없는 합리적인 방법으로 융합 구조체를 개발하는 것이 가능하다.
항체-기반 융합 단백질은 신규 생물학적 및/또는 약학적 성질과 함께 만들어질 수 있다. ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 및 CDC (complement-dependent cytotoxicity)를 유발하는 Fc 도메인의 능력을 돌연변이 유발에 의해 변형하기 위한 바람직한 노력이 있으며, 이 돌연변이 유발은, 계획된 어플리케이션에 의존하며, 부작용(억제 돌연변이)을 감소시키기 위한 것이거나 또는 치료적 효과(활성 돌연변이)를 증가시키기 위한 것이다. 유전 공학에 의해 가능해진 새로운 어플리케이션들은 항체의 도메인에 결합하는 항원을 고려할 때 더욱 다양해진다.
항체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 도메인을 인식하는 항원은 유전 공학을 통해 항원의 결합 능력을 보존하면서 펩타이드 링커(linker)에 의해 결합될 수 있다. 이러한 항원 결합 단일 사슬 가변 단편(scFvs)은 높은 조직 투과능 및 낮은 혈청 보유 시간을 가지며 임상 이미징 과정, 방사선 치료 및 다른 어플리케이션들에 작은 항체 대용물로 이용될 수 있다. 중요하게도, scFv 모이어티는 신규 재조합 치료법의 개발에 항원 특이적 모듈로서 쉽게 이용될 수 있다.
최근 보고는 항-종양 치료에 재조합 2중특이성항체의 엄청난 잠재력을 나타냈다. 이러한 2중특이성항체는 두 항원을 인식하는데, 그 중 하나는 종양에 의해 발현되는 반면, 다른 하나는 대개 면역 세포에서 찾을 수 있다. 항-종양 치료에 가장 2중특이적인 항체는 한편으로는 종양-관련 계통 마커(marker)를 그리고 다른 한편으로는 T-세포 수용체/CD3 복합체의 불변 분자인 CD3ε를 표적하고, 그리하여 T 세포를 모아서 종양을 파괴한다[Muller and Kontermann, Bispecific antibodies for cancer immunotherapy: Current perspectives. BioDrugs 2010, 24(2):89-98].
항체 구조 및 기능을 조작하기 위한 광범위한 선택에도 불구하고, 이러한 항체-기반의 시약의 치료적 효과는 다뤄지는 항원의 본성, 종양 및 종양-관련 조직에서 항원의 접근성, 및 예정된 세포 사멸 유도 기능을 유발하거나 매개하는 항체의 소질에 의해 제한된다.
예를 들어, 환자가 생명유지에 관련된 기능을 가지는 조직에서 발현되는 항원에 대해 직접적인 2중특이성구조에 의해 치료될 때, 심각한 부작용이 관찰된다. 이것은 심각한 문제이며, 왜냐하면 알 수 없는 수의 개별적인 돌연변이된 세포 표면 분자 및 림프종의 단일클론 B- 또는 T- 세포 수용체는 제외하고, 건강한 전구세포(progenitor cell)로부터 변형된 세포를 구별하는 종양 특이적 항원은 이용가능하지 않기 때문이다.
2중특이성항체의 이용을 기반으로 하는 치료적 개념은 대개 주효 세포(effector cell)의 모집에 의존하기 때문에, 더욱 효과적인 도구(2중특이성구조)일수록, 더욱 부작용이 일어날 가능성이 크고, 비-변형된 조직에 항원의 극미한 발현은 통제할 수 없는 부정확한 영향을 일으킬 수 있음이 분명하다.
2008년에, SCIENCE는 단일-사슬 2중특이성 T 세포 인게이징 (single-chain bispecific T cell engaging, BiTE) 항체 MT103/블리나투모맙(blinatumomab)의 임상적 효과에 대한 첫 번째 논문을 발행했다; 이 항체는 보고된 단일클론 항체 리툭시맙(rituximab)의 혈청 레벨보다 5배 낮은 혈청 레벨에서 표준 면역-화학 요법으로 재발하거나 난치의 림프종 환자의 약 80%에서 호전을 유도한다(Bargou, R. et al Science 321, 974-977, 2008). 전신 독성 및 거의 없는 치료적 활성 때문에 거의 20년 동안 지하에 잠들어 있을 때까지, 급성 림프성 백혈병 (ALL)에서 II상 시험에 대한 이 논문 및 뒤따른 보고들은 2중특이성 항체의 새로운 시대가 시작되게 했다. 이 SCIENCE 논문에 뒤이어, 2중특이성 항체들은 다시 성장 분야가 되었고 35개 이상의 다른 포맷이 카운트 되었다(Reichert, Drug Discov Today. 17 (2012) 954-963). 이러한 포맷들은 사이즈에 차이가 있고, 항원과의 친화성, 안정성, 주효 세포 (주로 T 세포)를 모으는 능력 및 약동학을 위해 최적화하였다. 구조체의 친화성 또는 결합력은 다양한 기술을 이용한 친화도 성숙에 의해 또는 간단히 다가구조체를 만들기 위해 다중 scFv 도메인을 직렬로 연결함에 의해 조정된다. 1 개의 표적 분자 대신에 2개를 다루는 것에 의하여 향상된 결합 능력을 나타내기 위해 디자인된 3중특이성 항체도 보고되었다. 포맷의 안정성은 자연적으로 발생하는 항체를 모방하기 위하여 및 동시에 혈청에서의 장기간 반감기와 같은 약동학적 성질 및 단백질분해효소에 의한 단백질 가수분해 소화로부터 보호를 향상시키기 위하여 면역글로불린-유사 도메인을 첨가함에 의하여 최적화될 수 있다. 게다가, 포맷의 안정성은 생산을 최적화함에 의하여 향상될 수 있다. scFv 도메인을 공유결합으로 결합하기 위하여 이용되는 링커(linker) 서열은 집합되는 것을 이끌기 때문에, 기능성 약물을 만들어 내기 위하여 쉽게 재조립될 수 있는 둘 또는 세 개의 폴리펩타이드를 먼저 생산하는 생산 라인이 설립되었다. 이러한 기술은 두 개의 다른 폴리펩타이드를 공유결합으로 결합하기 위하여 직접적인 이황화-결합 또는 가교(crosslinking) 시약을 이용한다. 다른 기술들은 류신(leucine)-지퍼(zipper) 도메인, Fc-도메인 및 구멍에 손잡이(knob into hole) 기술 등과 같은 헤테로- 또는 호모-이합체화 도메인을 이용한다 (예를 들어, WO 2007/062466 참고). 게다가, 항원의 결합에 의해 안정화될 수 있는 VH 및 VL 상호작용은 항원의 탐지를 위한 오픈-샌드위치(open-sandwich) 면역검정이라고 불리는 것에 이용되어왔다(Ueda, Nature Biotechnology 14 (1996), 1714-1718; Ohmuro-Matsuyama (2012) Detection of Protein Phosphorylation by Open-Sandwich Immunoassay, Integrative Proteomics, Dr. Hon-Chiu Leung (Ed.), ISBN: 978-953-51-0070-6; WO 2004/016782/EP-A1 1536005).
그러나, 본 기술분야에 알려진 2중/3중-특이성 및 2중- 또는 다가 구조체는 난점이 있다. 첫 번째, 표적화 분자에 보내질 수 있는 진정으로 특이적인 종양 항원의 부재이다. 사실, 2중특이성 항체 구성(format)이 강할수록, 더 심각한 부수적 피해가 있는데, 먼 거리까지 보내는 표적 항원은 종양 및 비-악성 세포에 의해 공유되는 분화항원(differentiation antigens)이기 때문이다. 결과적으로, 기존 기술의 2중- 또는 3중-특이성 포맷은 비-악성 세포로부터 악성을 구별할 수 없다. 이 점에 있어서, 표적화 세포에 결합하는 높은 결합을 위해 개발된 3중-특이성 구조체는 일반적으로 하나의 표적 분자의 결합은 다른 표적 분자를 발현하는 세포의 파괴를 위한 면역 세포를 모으는 데 충분하기 때문에 높은 정도의 부정확한 영향을 주는 것으로 나타날지도 모른다. 그러므로, 3중-특이성 구조체는 특이성에 드는 노력에서 결합력을 향상시킨다. 최근의 멀티-파라미터 분석은 이상 항원 징후의 표출 때문에 종양 세포가 기원(origin)의 각각의 비-변형된 조직으로부터 구별될 수 있음을 나타낸다. 오늘날, 이러한 발견은 혈액학적 신생물의 세계보건기구 (WHO) 분류 체계의 필수적인 부분으로 여겨지며, 또한 암 및 다른 기원의 암 줄기 또는 암 개시 세포에 적용된다. 그러므로, 함께 악성 상태를 보여주는 항원의 조합을 동시에 나타내는 세포를 표적하는 것이 유리할 것이다. 종래 기술에 의해 알려진 항체 중 어느 것도 표적 항원의 조합을 나타내는 세포와 단일 항원 양성 세포를 구별할 수 없다. 둘째, 2중특이성 항체 기술, 예를 들어, 완전한 CD3 모듈 (예를 들어, 항 Cd3 scFv)을 사용하는 기술의 주요 문제점은 표적 항원의 표적 세포에의 결합에 관계없이 T 세포를 자극 또는 예비-자극시키는 이러한 단백질의 내재된 능력이며, 관찰된 많은 부작용이 잘못된 T 세포 기능과 연관된 것으로 나타났다.
그러므로, 이 기술분야에 암 치료에서 더 특이적인 치료적 옵션에 대한 요구가 있고, 구체적으로 암 세포를 높은 특이성을 가지고 확인하고 및/또는 제거하고 그리고 부작용을 줄이기 위한 진보된 방법에 대한 요구가 있다.
동종 줄기세포 이식, 즉, 다른 사람으로부터 얻은 줄기 세포를 환자에게 이식하는 분야에서 유사한 요구가 존재한다. 재발 또는 난치의 백혈병 또는 다른 혈액학적 질병을 앓고 있는 환자는 이식제공자의 건강한 조혈 세포의 이식과 함께 화학요법/방사 (악성 조혈 세포를 제거하기 위해)에 의해 치료될지도 모른다. 악성 세포의 제거가 불완전하다면, 이식에 의해 제공된 건강한 세포의 존재에도 불구하고, 종양은 살아있는 악성 이식수여자 세포로부터 다시 자랄지도 모른다. 그 결과, 종양 치료 및 동종 이식을 겪은 환자의 생존률은 상당히 감소한다.
그러나, 살아있는 악성 세포를 높은 특이성을 가지고 제거하는 것(및, 유사하게는, 확인하는 것)은 어려우며, 그러므로 다양한 시도에도 불구하고, 이 문제에 대한 좋은 해답은 찾지 못한 실정이었다. 따라서, 이 기술분야에서 이러한 악성 이식수여자(recipient) 세포를 다른 세포에 부작용을 최소화하면서 특이적으로 확인 및/또는 제거하는 향상된 방법을 제공하기 위한 요구가 있다.
조건 치료 (방사선/화학요법) 후에 곧바로 받은 이식세포(동종 줄기 세포)는 혈액 생성을 조절하고 재구성할 수 있다. 이식세포는 골수로부터 또는 자극된 말초 혈액 세포로부터 채취되고, 새롭게 생성되는 혈액 세포의 근원이 되는 조혈 줄기 세포의 약 1 퍼센트를 포함한다. 게다가, 이식세포는 보통 거대한 양의 면역 세포, 특히 양자 면역 체계의 일부인 T 림프구를 포함하며, 이러한 T 세포는 백혈병 세포에 대해 면역 공격을 하는 경우에 매우 유용할 수 있다. 이 상황은 잘 설명되었고, 이식편 대 백혈병 반응으로 알려져 있다. 다른 한 편으로는, 대숙주성이식편병(graft versus host disease)으로 알려진 환자에 직접 T 세포를 향하게 하는 잘못된 면역 반응이 또한 흔히 발견된다.
대숙주성이식편병을 최소화하기 위하여, 이식편은 대개 HLA (human leukocyte antigen) 또는 MHC (major histocompatibility complex)을 기반으로 선택된다. 이식제공자와 이식수여자 사이의 항원이 더 비슷할수록 심각한 대숙주성이식편병의 개연성이 낮아진다. 그러나, 많은 환자에게, 완벽히 매치되는 이식편은 찾을 수 없다. 이러한 경우에, 골수 또는 말초혈 줄기세포는 하나 또는 더 많은 HLA 분자에서 차이가 있어 이용한다. 이러한 임상학적 상황은 이식 후에 T 세포 체계를 통제할 수 있게 하기 위하여 엄격한 면역 억제성의 양생법을 요구한다.
본 발명의 목적은 특정 종류의 세포를 특이적으로 확인하거나 및/또는 제거하는 개선된 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 세포 표면에 두 개의 특정 항원의 특정 조합을 가지는 세포를 특이적으로 확인하거나 및/또는 제거하는 개선된 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 암 세포를 특이적으로 확인하거나 및/또는 제거하는 개선된 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 (1) 특정 기원(origin)에 의한 세포(예를 들어, 조직 또는 세포 이식 시에, 이식대상자 및 기증자로부터 유래한 세포) 및 (2) 특정 세포 종류 또는 세포 계통(예를 들어, 조혈 세포)에 속하는 세포를 특이적으로 확인하거나 및/또는 제거하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 하기 제 1 폴리펩타이드 P1 및 제 2 폴리펩타이드 P2를 포함하는 폴리펩타이드 세트에 의해 해결된다:
상기 제 1 폴리펩타이드 P1은,
(i) 항원 A1에 특이적으로 결합하는 표적 모이어티 T1, 및
(ii) 기능성 도메인 F의 단편 F1
을 포함하고,
상기 단편 F1 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P1 단독으로는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하지 않고,
그리고
상기 제 2 폴리펩타이드 P2는,
(i) 항원 A2에 특이적으로 결합하는 표적 모이어티 T2, 및
(ii) 상기 기능성 도메인 F의 단편 F2
를 포함하고,
상기 단편 F2 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P2 단독으로는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하지 않고,
상기 항원 A1은 상기 항원 A2와 다르고,
상기 폴리펩타이드 P1 및 상기 폴리펩타이드 P2는 표면에 항원 A1 및 A2를 가지는 기질이 존재하지 않는 경우 서로 연관되지 않고, 및
상기 폴리펩타이드 P1의 상기 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 상기 단편 F2의 이합체화에 의한 이합체는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하는 것인, 폴리펩타이드 세트.
또한, 본 발명의 목적은 하기 제 1 폴리펩타이드 P1 및 제 2 폴리펩타이드 P2를 포함하는 폴리펩타이드 세트에 의해 해결된다:
상기 제 1 폴리펩타이드 P1은,
(i) 항원 A1에 특이적으로 결합하는 표적 모이어티 T1, 및
(ii) 기능성 도메인 F의 단편 F1
을 포함하고,
상기 단편 F1 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P1 단독으로는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하지 않고,
그리고
상기 제 2 폴리펩타이드 P2는,
(i) 항원 A2에 특이적으로 결합하는 표적 모이어티 T2, 및
(ii) 상기 기능성 도메인 F의 단편 F2
를 포함하고,
상기 단편 F2 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P2 단독으로는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하지 않고,
상기 항원 A1은 상기 항원 A2와 다르고,
상기에서,
(a) 상기 단편 F1은 항체의 VL 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 같은 항체의 VH 도메인을 포함하거나; 또는 상기 단편 F1은 항체의 VH 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 같은 항체의 VL 도메인을 포함하고; 또는
(b) 상기 단편 F1은 항체의 VL 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 같은 항체의 VH 도메인을 포함하거나; 또는 상기 단편 F1은 항체의 VH 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 같은 항체의 VL 도메인을 포함하고; 및
상기 폴리펩타이드 P1 및 상기 폴리펩타이드 P2는 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 기질, 더욱 구체적으로 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 세포가 존재하지 않는 경우 서로 연관되지 않고, 및
상기 폴리펩타이드 P1의 상기 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 상기 단편 F2의 이합체화에 의한 이합체는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하는 것인, 폴리펩타이드 세트.
또한, 본 발명의 목적은 하기 제 1 폴리펩타이드 P1 및 제 2 폴리펩타이드 P2 를 포함하는 폴리펩타이드 세트에 의해 해결된다:
상기 제 1 폴리펩타이드 P1은,
(i) 항원 A1에 특이적으로 결합하는 표적 모이어티 T1, 및
(ii) 기능성 도메인 F의 단편 F1
을 포함하고,
상기 단편 F1 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P1 단독으로는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하지 않고,
그리고
상기 제 2 폴리펩타이드 P2는,
(i) 항원 A2에 특이적으로 결합하는 표적 모이어티 T2, 및
(ii) 상기 기능성 도메인 F의 단편 F2
를 포함하고,
상기 단편 F2 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P2 단독으로는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하지 않고,
상기 항원 A1은 상기 항원 A2와 다르고,
상기에서
(c) 상기 단편 F1은 항체의 VL 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 같은 항체의 VH 도메인을 포함하거나; 또는 상기 단편 F1은 항체의 VH 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 같은 항체의 VL 도메인을 포함하고;
(d) 상기 폴리펩타이드 P1 및 상기 폴리펩타이드 P2는 표면에 항원 A1 및 A2 모두를 가지는 기질, 더욱 구체적으로 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 세포가 존재하지 않는 경우 서로 연관되지 않고; 또는
(e) 상기 단편 F1은 항체의 VL 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 같은 항체의 VH 도메인을 포함하거나; 또는 상기 단편 F1은 항체의 VH 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 같은 항체의 VL 도메인을 포함하고; 및
상기 폴리펩타이드 P1 및 상기 폴리펩타이드 P2는 표면에 항원 A1 및 A2 모두를 가지는 기질, 더욱 구체적으로 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 세포가 존재하지 않는 경우 서로 연관되지 않고, 및
상기 폴리펩타이드 P1의 상기 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 상기 단편 F2의 이합체화에 의한 이합체는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하고, 및 상기 폴리펩타이드 P1 및 P2, 특히 상기 단편 F1 및 F2는, 기질 또는 세포가 존재하지 않는 경우, 10-8 M 내지 10-2 M 범위의 해리상수 KD를 서로 가지는 것인, 폴리펩타이드 세트.
본 발명은 하기 항목과 더욱 관련이 있다:
1. 하기 제 1 폴리펩타이드 P1 및 제 2 폴리펩타이드 P2를 포함하는 폴리펩타이드 세트:
상기 제 1 폴리펩타이드 P1은,
(i) 항원 A1에 특이적으로 결합하는 표적 모이어티 T1, 및
(ii) 기능성 도메인 F의 단편 F1
을 포함하고,
상기 단편 F1 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P1 단독으로는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하지 않고,
그리고
상기 제 2 폴리펩타이드 P2는,
(i) 항원 A2에 특이적으로 결합하는 표적 모이어티 T2, 및
(ii) 상기 기능성 도메인 F의 단편 F2
를 포함하고,
상기 단편 F2 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P2 단독으로는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하지 않고,
상기 항원 A1은 상기 항원 A2와 다르고,
상기 폴리펩타이드 P1 및 상기 폴리펩타이드P2는 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 기질, 더욱 구체적으로 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 세포가 존재하지 않는 경우 서로 연관되지 않고, 및
상기 폴리펩타이드 P1의 상기 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 상기 단편 F2의 이합체화 하에, 결과적인 이합체는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하는 것인, 폴리펩타이드 세트.
2. 항목 1에 따른 폴리펩타이드 세트로서, 상기 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 가지는 세포는 상기 폴리펩타이드 P1의 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 단편 F2의 이합체화를 유도하는 반면, 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 가지지 않는 세포는 상기 폴리펩타이드 P1의 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 단편 F2의 이합체화를 유도하지 않는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
3. 항목 1 또는 2에 따른 폴리펩타이드 세트로서, 상기 표적 모이어티 T1은 면역글로불린 모듈, 바람직하게는 VH 도메인에 연결된 VL 도메인을 포함하는 면역글로불린 모듈 I1, 더욱 바람직하게는 항체의 scFv (single-chain variant fragment)를 포함하는 면역글로불린 모듈 I1, 또는 라마(llama) 항체, 낙타(camel) 항체 또는 상어(shark) 항체의 가변 도메인 VHH를 포함하는 면역글로불린 모듈을 포함하고,
및/또는 상기 표적 모이어티 T2는 면역글로불린 모듈, 바람직하게는 VH 도메인에 연결된 VL 도메인을 포함하는 면역글로불린 모듈 I2, 더욱 바람직하게는 항체의 scFv (single-chain variant fragment)를 포함하는 면역글로불린 모듈 I2, 또는 라마(llama) 항체, 낙타(camel) 항체 또는 상어(shark) 항체의 가변 도메인 VHH를 포함하는 면역글로불린 모듈을 포함하고,
또는 상기 표적 모이어티 T1 및/또는 상기 표적 모이어티 T2는 상기 항원 A1 또는 항원 A2 각각의 앱타머(aptamer) 또는 생체리간드(natural ligand)를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
4. 상기 항목 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 세트로서, 상기 항원 A1 및/또는 상기 항원 A2는 종양 세포의 표면 또는 종양 전구/선구(progenitor/precursor) 세포의 표면에 발현된 항원, 바람직하게는 혈액학적 종양(haematologic tumour) 세포의 표면에 발현되는 항원 또는 비혈액학적 종양(non-haematologic tumour) 세포의 표면에 발현되는 항원인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
5. 상기 항목 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 세트로서, 상기 항원 A1 및 항원 A2의 조합은 암세포에서만 발견되며, 암세포가 아닌 경우에는 발견되지 않고, 및 바람직하게는 상기 항원 A1 및 항원 A2의 조합은 특정 타입 암의 암세포에 특이적인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
6. 상기 항목 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 세트로서, 상기 항원 A1은 MHC 항원이고, 바람직하게는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 HLA-DM의 대립유전자 변이체이고, 더욱 바람직하게는 MHC 클래스 I 분자의 대립유전자 변이체이고, 더욱 바람직하게는 HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A25, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B35, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, 및 HLA-Cw7로 구성되는 군으로부터 선택되는 대립유전자 변이체이고, 및/또는 상기 항원 A2는 특정 세포 종류 또는 세포 계통에 특이적인 항원인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
7. 상기 항목 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 세트로서, 상기 기능성 도메인 F는 면역글로불린 모듈, 바람직하게는 항체의 scFv (single-chain variant fragment)이고, 또는 형광 분자, 바람직하게는 GFP 또는 GFP 변종(variant)이고, 또는 생체발광을 조정할 수 있는 모듈, 바람직하게는 Gaussia 루시퍼라제(luciferase)인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
8. 상기 항목 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 세트로서, 상기 기능성 도메인 F는 운반체(carrier molecule), 바람직하게는 펩타이드 또는 탄수화물 분자인 운반체, 또는 친화성 태그, 바람직하게는 FLAG-태그, myc-태그, 글루타티온(glutathione)-S-트랜스퍼라아제(GST)-태그, 헤마글루티닌(HA)-태그, 폴리히스티딘(His)-태그 및 말토오스 결합 단백질(MBP)-태그로 구성되는 군으로부터 선택되는 친화성 태그에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
9. 상기 항목 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 세트로서, 상기 기능성 도메인 F는 방사성 화합물에 특이적으로 결합하는 도메인, 단독으로는 인간 세포의 세포막을 통해 투과할 수 없으나 상기 세포의 세포막과 관련 하에 인간 세포 안으로 내포되는 독소 분자에 특이적으로 결합하는 도메인, 형광 분자에 특이적으로 결합하는 도메인, 또는 생체발광을 조정할 수 있는 분자에 특이적으로 결합하는 도메인인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
10. 상기 항목 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 세트로서, 상기 단편 F1은 항체의 VL 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 같은 항체의 VH 도메인을 포함하고, 바람직하게는, 상기 항체는 항-CD3 항체이며, 또는 상기 단편 F1은 항체의 VH 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 같은 항체의 VL 도메인을 포함하고, 바람직하게는 상기 항체는 항-CD3 항체인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
11. 종양을 앓고 있는 환자의 치료에 이용하기 위한 또는 종양을 앓고 있는 환자의 진단에 이용하기 위한 상기 항목 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 세트로서, 바람직하게는 종양을 앓고 있고 동종 조직 또는 세포 이식을 받거나 그러한 이식을 받기로 예정된 환자의 치료에 이용하기 위한 또는 종양을 앓고 있고 동종 조직 또는 세포 이식을 받거나 받기로 예정된 환자의 진단에 이용하기 위한 폴리펩타이드 세트이고, 바람직하게는, 상기 폴리펩타이드 세트는 상기 환자에 투여되는 것인 폴리펩타이드 세트.
12. 상기 항목 중 어느 것에 따른 폴리펩타이드 세트 또는 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드 중 하나를 암호화하는 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트.
13. 항목 12에 따른 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 항목 12에 따른 핵산 분자 세트의 핵산 분자들 중 하나의 서열을 포함하는 벡터.
14. 항목 1 내지 11 중 어느 것에 따른 폴리펩타이드 세트 또는 항목 12에 따른 핵산 분자/핵산 분자들의 세트 또는 항목 13에 따른 벡터를 포함하는 약학적 조성물로서, 바람직하게는 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것인 약학적 조성물.
15. 항목 1-11 중 어느 것에 따른 폴리펩타이드 세트를 포함하는 키트.
바람직하게는 상기 항원 A1은 세포 표면 분자이다. 바람직하게는, 상기 항원 A2는 세포 표면 분자이다. 바람직하게는, 상기 항원 A1은 세포의 악성 상태에 특이적이다. 바람직하게는, 상기 항원 A2는 특정 세포 타입 또는 세포 계통에 특이적이거나 세포의 악성 상태에 특이적이다. 바람직하게는, 상기 항원 A1은 악성 세포 타입에 특이적이다. 바람직하게는, 상기 항원 A2는 악성 세포 타입에 특이적이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 정의되고 설명된 폴리펩타이드 세트에 관한 것이며, 그러나 상기 항원 A1은 항원 A2와 같다. 이런 이유로, 이러한 폴리펩타이드 P1 및 P2의 세트에서, F1 단편은 표적 모이어티 T1에 연결될 수 있고 F2 단편은 표적 모이어티 T2에 연결될 수 있으며, 반면 T1 및 T2는 모두 같은 항원에 특이적으로 결합한다. 이와 관련하여, 표적 모이어티 T1이 결합하는 항원 A1의 에피토프는 표적 모이어티 T2가 결합하는 항원 A2의 에피토프와 같거나 다른 에피토프일 수 있다. 항원 A1의 에피토프가 항원 A2의 에피토프와 같은 경우에, 폴리펩타이드 P1은 P2를 구성하는 표적 모이어티와 동일한 표적 모이어티일 수 있다. 또한 본 발명의 이러한 측면은 분열된 F 도메인을 가지는 폴리펩타이드 P1 및 P2가 부정확한 효과를 보여주지 않는다는 이점을 기반으로 한다 (예를 들어, CD3-표시(displaying) T 세포의 전-활성이 없고 및, 이런 이유로 적은 유독성 특성 및/또는 부작용, 예를 들어 종래의 2중특이성 항체와 비교하였을 때를 말함).
일 실시예에서, 상기 단편 F1 및 상기 단편 F2는 함께 상기 기능성 도메인 F이다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 P1 및 상기 폴리펩타이드 P2는 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 기질, 더욱 구체적으로 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 가지는 세포의 부재 하에 서로 공유 결합으로 결합되어 있지 않다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 P1 및 상기 폴리펩타이드 P2은 서로 공유결합으로 결합되어 있지 않다.
상기 폴리펩타이드 P1 및 폴리펩타이드 P2 및/또는, 구체적으로, 그 안을 구성하고 있는 상기 단편 F1 및 단편 F2, 더욱 구체적으로 그 안에 포함된 VH 및 VL는 서로 연관되어 있지 않고, 구체적으로 의료 개입의 필요, 즉 치료 및/또는 진단의 필요하에 개체에게 투여될 때이다. 따라서, 본 명세서에서 제공된 약학적 또는 진단적 수단들은 비-연관된 형태로 본 명세서에서 정의된 "폴리펩타이드 세트" 안에 구성된 두 폴리펩타이드 P1 및 P2를 포함한다. 상기 두 폴리펩타이드의 연관은 상기 기질 또는 세포의 존재 하에 in vivo에서 일어난다. 상기 기질 또는 세포의 존재 하에, 상기 두 폴리펩타이드의 연관은 안정화제 (예를 들어, 본 명세서에서 설명된 CD3, HIS 또는 DIG 같은 항원)에 의해 (더욱) 안정화될 수 있다. 바람직하게는, 상기 기질 또는 세포의 부재 하에 그들은 서로 연관되지 않고 및/또는 상기 기질 또는 세포의 부재 하에 이합체화되지 않는다. 더욱 바람직하게는, 그들은 상기 기질 또는 세포의 부재 하에 서로 연관되지 않고 및/또는 상기 기질 또는 세포의 부재 하에 서로 이합체화되지 않는데, 심지어 폴리펩타이드 P1 및 폴리펩타이드 P2 및/또는, 구체적으로, 단편 F1 및 단편 F2의 연관 및/또는 이합체화를 안정화시키는 에이전트(agent)가 존재하는 경우, 즉, 상기 폴리펩타이드 P1 및 폴리펩타이드 P2 및/또는, 구체적으로, 상기 단편 F1 및 상기 F2가 안정화제/P1(F1)/P2(F2)-삼량체의 복합체에 (예를 들어 항원/VH/VL-삼량체의 복합체에) 존재하는 경우에 그렇다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 P1 및 폴리펩타이드 P2 및/또는, 구체적으로, 그 안에 포함된 상기 단편 F1 및 단편 F2, 더욱 구체적으로 그 안에 포함될 수 있는 VH 및 VL은 서로 연관되고 및/또는 3-부분-복합체-형태로 이합체화되고, 바람직하게는 폴리펩타이드 P1 및 폴리펩타이드 P2 및/또는, 구체적으로, 단편 F1 및 단편 F2의 연관 및/또는 이합체화를 안정화시키는 에이전트(agent)에 의해 조정된 상호작용에 의한다 (예를 들어 항원-매개 상호작용에 의해). 그러나, 가장 바람직하게는, 이러한 연관 및/또는 이합체화는 상기 기질 또는 세포의 존재 하에서만 일어난다.
예를 들어, 류신(leucine)-지퍼(zippers) 및/또는 면역글로불린 CH3 또는 Fc 단편 같은 불변 도메인(constant domain)과 헤테로- 및 호모이합체화되는 친화력(affinity strength)은 ~ 10-8 내지 10-11 M의 범위 내 해리상수(dissociation constant) KD에서 측정된다(예를 들어, Zhu (1997) Protein Sci. 6, 781-8; Pluckthun (1997) Immunotech. 3, 83-105 참고). 이러한 KD 범위는, 상기 기질 또는 세포가 존재하지 않는 경우에, 본 발명의 상기 폴리펩타이드 P1 및 P2, 특히 상기 단편 F1 및 F2의 연관 및/또는 이합체화가 일어나는 KD 이하임이 분명하다. 이러한 이유로, 일 실시예에서, 폴리펩타이드 P1 및 폴리펩타이드 P2 및/또는, 특히, 그 안에 포함된 단편 F1 및 단편 F2는, 더욱 구체적으로 그 안에 포함될지도 모르는 VH 및 VL는 상기 기질 또는 세포가 존재하지 않는 경우에 서로 연관되거나 및/또는 이합체화되며, 예를 들어, 류신(leucine)-지퍼(zippers) 및/또는 면역글로불린 CH3 또는 Fc 단편 같은 불변 도메인의 헤테로- 및 호모이합체화의 KD 이상의 KD를 가진다. 상기 기질 또는 세포가 존재하는 경우에, 폴리펩타이드 P1 및 폴리펩타이드 P2 및/또는, 특히, 그 안에 포함된 단편 F1 및 단편 F2, 더욱 구체적으로 그 안에 포함될 수 있는 VH 및 VL는 예를 들어, 류신(leucine)-지퍼(zippers) 및/또는 면역글로불린 CH3 또는 Fc 단편 같은 불변 도메인의 헤테로- 및 호모이합체화의 KD 범위 내 또는 그 이하의 범위의 KD 를 가지며 서로 연관되거나 및/또는 이합체화됨이 예상된다.
일반적으로, 예를 들어, 고립된 VH 및 VL 도메인의 상호작용력은 낮은 친화성의 힘이다. 열량 측정의, 형광의 또는 자외선 차이 분광학(spectroscopy) 및/또는 원형 디클로이즈마(dichroisma) 기술을 이용하여, 10-9 내지 10-6 M의 해리상수 KD가 측정되었다(예를 들어, Worn JMB (2001) 305, 989-1010; Pluckthun (1992) Immunological Reviews No 130 참고). 표면 플라즈몬 공명 기술 (SPR biosensor BIAcore or BIAcore 2000, Pharmacia) 및 항 HEL-항체 시스템 (항-hen 에그 리소자임 항체 HyHEL-10)를 이용하여, Ueda (loc. cit.) 및 Ohmuro-Matsuyama (loc. cit.)는 고립된 VH 및 VL 도메인은 결코 이합체화하지 않음을 발견했다 (Ka < 105/M, 검출 한계 이하). 그러나, VH 및 VL 펩타이드의 연관은 동계의 항원 (Ka ~ 109/M)이 존재하는 경우에 상당히 강화되고, 항원/VH/VL-삼량체의 복합체의 해리도의 현저한 감소를 가지는데, 항원의 1.4 μM에서 계산된 Kd ~ 2.73 x 10-5 + 1.43 x 10-6 /s를 가졌다. 이러한 이유로, 상기 기질 또는 세포가 존재하지 않는 경우에, 본 발명의 상기 폴리펩타이드 P1 및 P2, 특히 상기 단편 F1 및 F2의 연관 및/또는 이합체화가 일어날 때 가지는 KD는 본 발명과 관련하여 특히 예상된다. 이러한 이유로, 본 발명과 관련하여, 상기 기질 또는 세포가 존재하지 않는 경우, 본 발명의 상기 폴리펩타이드 P1 및 P2, 특히 상기 단편 F1 및 F2의 연관 및/또는 이합체화가 일어날 때 가지는 KD는 고립된 VH 및 VL 도메인의 KD 또는 KD의 범위에 있거나, 또는 그 이상이라는 것이 특히 예상되고, 이것은 예를 들어 Worn (loc. cit.), Pluckthun (1992; loc. cit.), Ueda (loc. cit.) 및 Ohmuro-Matsuyama (loc. cit.)와 관련하여 측정된 것으로서의 KD이고, 특히 Worn (loc. cit.), Pluckthun (1992; loc. cit.), Ueda (loc. cit.) 및 Ohmuro-Matsuyama (loc. cit.)와 관련하여 측정된 것으로서 항원/VH/VL-3량체 복합체의 KD 또는 KD의 범위 이상이다. 상기 기질 또는 세포가 존재하는 경우에, 폴리펩타이드 P1 및 폴리펩타이드 P2 및/또는, 특히, 그 안에 포함된 단편 F1 및 단편 F2, 더욱 구체적으로 그 안에 포함될 수 있는 VH 및 VL는 고립된 VH 및 VL 도메인의 KD 또는 KD의 범위 (매우) 이하의 KD를 가지면서 서로 연관되거나 및/또는 이합체화 되는 것이 예상되고, 이것은 예를 들어 Worn (loc. cit.), Pluckthun (1992; loc. cit.), Ueda (loc. cit.) 및 Ohmuro-Matsuyama (loc. cit.)와 관련하여 측정된 것으로서의 KD이고, 바람직하게는 Pluckthun (loc. cit.), Ueda (loc. cit.) 및 Ohmuro-Matsuyama (loc. cit.)와 관련하여 측정된 것으로서 항원/VH/VL-삼량체 복합체의 KD 또는 KD의 범위, 또는 심지어 그 이하이다.
일 측면에서, 폴리펩타이드 P1 및 폴리펩타이드 P2 및/또는, 구체적으로, 그 안에 포함된 단편 F1 및 단편 F2, 더욱 구체적으로 그 안에 포함될지도 모르는 VH 및 VL은 상기 기질 또는 세포의 부재 하에 연관되지 않거나 및/또는 상기 기질 또는 세포의 부재 하에 이합체화되지 않는다. 한다 하더라도, 그들은 상기 기질 또는 세포가 부재하나 10-8 M 이상, 바람직하게는 10-6 M 이상, 더욱 바람직하게는 10-5 M 이상, 그리고 더욱 바람직하게는 10-4M 이상의 KD를 가지는 경우에만 오직 서로 연관되거나 및/또는 이합체화된다. 또 다른 측면에서, 한다 하더라도, 상기 기질 또는 세포가 부재하나 10-8 M 내지 10-2 M, 바람직하게는 10-7 M 내지 10-3 M, 더욱 바람직하게는 10-6 M 내지 10-3 M 및 훨씬 더 바람직하게는 10-5 M 내지 10-3 M의 범위 내의 KD를 가지는 경우에만 오직 서로 연관되거나 및/또는 이합체화된다. 또 다른 측면에서, 폴리펩타이드 P1 및 폴리펩타이드 P2 및/또는, 특히, 그 안에 포함된 단편 F1 및 단편 F2, 더욱 구체적으로 그 안에 포함될지도 모르는 VH 및 VL은 상기 기질 또는 세포의 존재 하에 연관되고 및/또는 상기 기질 또는 세포의 존재 하에 이합체화된다. 특히, 그들은 10-6 M 이하, 바람직하게는 10-7 M 이하, 더욱 바람직하게는 10-8 M 이하 및 더욱 바람직하게는 10-9M 이하의 KD를 가지는 상기 기질 또는 세포의 존재 하에 서로 연관되고 및/또는 이합체화된다. 그들은 또한 10-11 M 내지 10-6 M, 더욱 바람직하게는 10-11 M 내지 10-7 M 및 훨씬 더 바람직하게는 10-11 M 내지 10-8 M의 범위 내의 KD를 가지는 상기 기질 또는 세포의 존재 하에 서로 연관되고 및/또는 이합체화될지도 모른다.
바람직한 실시예에서, 상기는 폴리펩타이드 P1 및 폴리펩타이드 P2 및/또는, 특히, 단편 F1 및 단편 F2의 연관 및/또는 이합체화를 안정화시키는 에이전트(agent)가 존재하는 경우에 적용한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 그러한 안정화 에이전트(agent)는 본 명세서에서 설명된 항원, 예를 들어, CD3, HIS 또는 DIG일 수 있고, 이는, 예를 들어, 항체의 VH 및 VL를 포함하는 도메인 F에 결합할 수 있다(F1 및 F2, 각각, 또는 F2 및 F3, 각각).
"존재(present)"한다는 것은, 본 발명과 관련하여 및, 특히, 상기와 관련하여 (즉, 상기 에이전트(agent) 및/또는 상기 기질 또는 세포 및/또는 상기 항원 A1 및 A2), 특히 0.01 μM 내지 1 mM의 범위 내, 0.1 내지 500 μM의 범위 내, 0.1 내지 300 μM의 범위 내, 0.1 내지 100 μM의 범위 내, 1 내지 500 μM의 범위 내, 10 내지 500 μM의 범위 내의 농도에서 존재하는 것을 의미한다. "부재(absent)"한다는 것은, 본 발명과 관련하여 및, 특히, 상기와 관련하여 (즉, 상기 에이전트(agent) 및/또는 상기 기질 또는 세포 및/또는 상기 항원 A1 및 A2), 특히 상기 범위 이하 또는 1 mM, 500 μM, 300 μM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0.1 μM, 0.01 μM, 0.001 μM 또는 1 nM 이하의 농도에서 존재한다는 것을 의미하고, 상기 더 낮은 값이 바람직하다.
본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 특히, P1 및 P2, 더욱 구체적으로 그 안에 포함된 F1 및 F2, 더욱 구체적으로 그 안에 포함될지도 모르는 VH 및 VL의 이합체화의 KD를 손쉽게 측정할 수 있는 위치에 있다. 각각의 측정 방법의 예들은 X-선 결정학(x-ray crystallography); 핵자기 공명(nuclear magnet resonance (NMR)); 등온선 열량측정법(isothermal calorimetry (ITC)); 극저온전자현미경관찰법(cryo-electro microscopy (CEM)); 질량 분석법(mass spectrometry (MS)); 표면 플라즈몬 공명법(surface Plasmon resonance (SPR))이다. 그러한 방법들은, 예를 들어, Protein Surface Recognition: Approaches for Drug Discovery: Approaches for the Inhibition of Protein-Protein Interactions for Drug Discovery (Eds: Ernest Giralt, Mark Peczuh, Xavier Salvatella John Wiley & Sons; 12. November 2010)에 설명되어 있다. 각각의 측정 방법의 추가적인 예들은 원편광이색성 분석(circular Dichroism Analysis); 스몰 존 겔 여과 크로마토그래피(small Zone Gel Filtratoion Chromatography); 형광 겔 지연법 (Fluorescence Gel Retardation); 침강평형(Sedimentation Equilibrium); 형광 편광 분석(Fluorescence Polarization Assay); 반점중첩(Blot Overlay) 또는 파 웨스턴 블랏(Far Western Blot) 분석; 친화성 모세관 전기영동 분석(Affinity Capillary Electrophoresis Analysis); 형광공명 에너지전달법(Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET))이고; 그러한 방법들은, 예를 들어 Protein'Protein Interactions: Methods and Applications: 261 (Methods in Molecular Biology); Haian Fu (Editor); Humana Press; 1 (23. Marz 2004)에 설명되어 있다. 본 발명에 따른 KD를 측정하기 위한 바람직한 방법은 형광 상관 분석기(Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS))이다. 이 방법은, 예를 들어, Douglas Magde에서 설명된다 (Physical Review Letters 29, 11, 1972, S.　705-708).
한 구체적인 측면에서, 본 명세서에서 언급된 KDs는 4 내지 38 ℃, 바람직하게는 4 내지 20 ℃ (예를 들어 10℃) 또는 20 내지 38 ℃ (예를 들어 30℃)의 온도, 및/또는 4.5 내지 8의 pH (예를 들어 7의 pH), (i) 에 적용되거나, (ii) 에 있거나 또는 (iii) 에서 측정된다.
본 발명과 관련하여 "연관되지 않다(not associated)"는 도메인 F의 기능성에 관하여 기능적으로 연관되지 않다는 것, 즉, F1 및 F2가 기능성 F를 형성하지 못하게 함을 특히 의미한다. 이러한 이유로, 본 발명의 일 측면에서, P1 및 P2는 기능성이 아닌 도메인 F가 F1 및 F2에 의해 형성될 때까지 서로 결합 (예를 들어 공유결합으로)될 수 있다. 그러나, P1 및 P2는 분리되어 있는 것이 바람직하다.
일 실시예에서, 상기 항원 A1 및/또는 상기 항원 A2는 분자이다.
일 실시예에서, 상기 항원 A1 및/또는 상기 항원 A2는 단백질성이다.
일 실시예에서, 상기 항원 A1 및/또는 상기 항원 A2는 비-단백질성이다.
일 실시예에서, 상기 표적 모이어티 T1은 상기 항원 A1에 비-공유적으로 결합한다.
일 실시예에서, 상기 표적 모이어티 T2는 상기 항원 A2에 비-공유적으로 결합한다.
일 실시예에서, 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 기질은 상기 폴리펩타이드 P1의 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 단편 F2의 이합체화를 유도하며, 반면 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 가지지 않는 기질은 상기 폴리펩타이드 P1의 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 단편 F2의 이합체화를 유도하지 않는다.
일 실시예에서, 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 세포는 상기 폴리펩타이드 P1의 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 단편 F2의 이합체화를 유도하며, 반면 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 가지지 않는 세포는 상기 폴리펩타이드 P1의 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 단편 F2의 이합체화를 유도하지 않는다. 이와 관련하여 "이합체화를 유도한다"는 구체적으로 "병렬 및 뒤따른 이합체화를 허용한다"를 의미한다.
일 실시예에서, 상기 표적 모이어티 T1은 면역글로불린 모듈을 포함하고 및/또는 상기 표적 모이어티 T2는 면역글로불린 모듈을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 표적 모이어티 T1은 면역글로불린 모듈 I1을 포함하며, 이것은 VH 도메인과 연결된 VL 도메인을 포함하며, 바람직하게는 항체 또는 완전 항체의 항체, Fab 또는 F(ab')2 (예를 들어 Fc 도메인의 추가적인 부분과 함께)의 scFv (단일-사슬 가변 단편)을 포함하는 면역글로불린 모듈 I1을 포함한다.
그리고/또는 상기 표적 모이어티 T2는 면역글로불린 모듈 I2를 포함하며, 이것은 VH 도메인과 연결된 VL 도메인을 포함하며, 바람직하게는 항체 또는 완전 항체의 항체, Fab 또는 F(ab')2 (예를 들어 Fc 도메인의 추가적인 부분과 함께)의 scFv (단일-사슬 가변 단편)을 포함하는 면역글로불린 모듈 I2를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 표적 모이어티 T1 및/또는 상기 표적 모이어티 T2는 라마(llama) 항체, 낙타(camel) 항체, 또는 상어(shark) 항체의 가변 도메인 VHH를 포함하는 면역글로불린 모듈을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 표적 모이어티 T1 및/또는 상기 표적 모이어티 T2는 상기 항원 A1 또는 항원 A2 각각의 앱타머(aptamer), 또는 생체 리간드이다.
일 실시예에서, 상기 표적 모이어티 T1 및/또는 상기 표적 모이어티 T2는 항체의 Fv 또는 scFv ((단일-사슬) 가변 단편)를 포함한다.
일 실시예에서, 표적 모이어티 T1 및 T2 안에 포함된 면역글로불린 모듈은 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 V 도메인을 포함한다:
(i) 서열번호 78 및 79 (CDRs 1 및 3) 및 DAS (CDR 2)를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 75-77 (CDRs 1-3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-HLA-A2 항체의 V 도메인;
(ii) 서열번호 83 및 84 (CDRs 1 및 3) 및 DDS (CDR 2)를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 80-82 (CDRs 1-3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-HLA-Cw6 항체의 V 도메인;
(iii) 서열번호 88 및 89 (CDRs 1 및 3) 및 WAS (CDR 2)를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 85-87 (CDRs 1-3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-EpCAM 항체의 V 도메인;
(iv) 서열번호 93 및 94 (CDRs 1 및 3) 및 SAS (CDR 2)를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 90-92 (CDRs 1-3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-Her2 항체의 V 도메인;
(v) 서열번호 98 및 99 (CDRs 1 및 3) 및 DAS (CDR 2)를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 95-97 (CDRs 1-3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-EGFR1 항체의 V 도메인;
(vi) 서열번호 103 및 104 (CDRs 1 및 3) 및 SAS (CDR 2)를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 100-102 (CDRs 1-3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CEA 항체의 V 도메인;
(vii) 서열번호 107 및 108 (CDRs 1 및 3) 및 LAS (CDR 2)를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 105 및 106 (CDRs 1 및 2) 및 CDR3 또는 서열번호 132-134 (CDRs 1-3)를 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD45 항체의 V 도메인;
(viii)서열번호 112 및 113 (CDRs 1 및 3) 및 YTS (CDR 2)를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 109-111 (CDRs 1-3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD138 항체의 V 도메인; 및
(ix) 서열번호 158 및 159 (CDRs 1 및 3) 및 DAS (CDR 2)를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 155-157 (CDRs 1-3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD19 항체의 V 도메인.
더욱 바람직한 실시예에서, 표적 모이어티 T1 및/또는 T2 안에 포함된 면역글로불린 모듈은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 V 도메인을 포함한다:
(i) 서열번호 52를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 51을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-HLA-A2 항체의 V 도메인;
(ii) 서열번호 54를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 53을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-HLA-Cw6 항체의 V 도메인;
(iii) 서열번호 56을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 55를 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-EpCAM 항체의 V 도메인;
(iv) 서열번호 58을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 57을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-Her2 항체의 V 도메인;
(v) 서열번호 60을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 59를 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-EGFR1 항체의 V 도메인;
(vi) 서열번호 62를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 61을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CEA 항체의 V 도메인;
(vii) 서열번호 64를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 63을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD45 항체의 V 도메인;
(viii)서열번호 66을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호65를 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD138 항체의 V 도메인; 및
(ix) 서열번호 153을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 152를 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD19 항체의 V 도메인.
더욱 바람직한 실시예에서, 표적 모이어티 T1 및/또는 T2 안에 포함되는 면역글로불린 모듈은 서열번호 67-74 및 154 중 어느 하나를 포함하는 V 도메인을 포함한다.
일 실시예에서, 폴리펩타이드 P1은 일반 구조 F1-T1을 가지고 및/또는 폴리펩타이드 P2는 일반 구조 F2-T2를 가진다. F 단편 및 T 모이어티는 링커에 의해 분리될 수 있고 (예를 들어, F1-링커-T1 및/또는 F2-링커-T2) 및/또는 추가적인 아미노산 스트레치(들) 1 및/또는 2이 측면에 있을 수 있다(스트레치-F1-(링커)-T1-스트레치2 및/또는 스트레치1-F2-(링커)-T2-스트레치2). 상기 일반 구조는 폴리펩타이드의 N 말단부터 C 말단까지인 것, 즉, N-F1-T1-C 및/또는 N-F2-T2-C, N-F1-링커-T1-C 및/또는 N-F2-링커-T2-C 및 N-스트레치1-F1-(링커)-T1-스트레치2-C 및/또는 N-스트레치1-F2-(링커)-T2-스트레치2-C이 바람직하다. 표적 모이어티가 Fv 또는 scFv 같은 면역글로불린 모듈 I이거나 이를 포함하는 경우에, 폴리펩타이드 P1은 일반 구조 F1-VH1-VL1를 가질 수 있고 및/또는 폴리펩타이드 P2는 일반 구조 F2-VH2-VL2를 가질 수 있고, 또는 폴리펩타이드 P1은 일반 구조 F1-VL1-VH1을 가질 수 있고 및/또는 폴리펩타이드 P2는 일반 구조 F2-VL2-VH2를 가질 수 있다. 또한 이러한 경우에 F 단편 및 T 모이어티가 링커에 의해 분리될 수 있고 (예를 들어, F1-링커-VH/VL1-VL/VH1 및/또는 F2-링커-VH/VL2-VL/VH2) 및/또는 추가적인 아미노산 스트레치(들) 1 및/또는 2이 측면에 있을 수 있다 (스트레치1-F1-(링커)-VH/VL1-VL/VH1-스트레치2 및/또는 스트레치1-F2-(링커)-VH/VL2-VL/VH2-스트레치2). 또한 이 경우에, 상기 일반 구조는 폴리펩타이드의 N 말단부터 C 말단까지인 것, 즉, N-F1-VH/VL1-VL/VH1-C 및/또는 N-F2-VH/VL2-VL/VH2-C, N-F1-링커-VH/VL1-VL/VH1-C 및/또는 N-F2-링커-VH/VL2-VL/VH2-C 및 N-스트레치1-F1-(링커)-VH/VL1-VL/VH1-스트레치2-C 및/또는 N-스트레치1-F2-(링커)-VH/VL2-VL/VH2-스트레치2-C이 바람직하다. 또한 VH 및 VL 또는 VL 및 VH 사이에 존재하는 링커가 있을 수 있다.
상기 설명된 링커, 특히 V 도메인 사이의 링커는 1 내지 25 아미노산, 바람직하게는 12 내지 20 아미노산, 바람직하게는 12 내지 16 또는 15 내지 20 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 설명된 링커는 하나 또는 그 이상의 (G3S) 및/또는 (G4S) 모티브(motive), 특히 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 (G3S) 및/또는 (G4S) 모티브(motive), 바람직하게는 3 또는 4 (G3S) 및/또는 (G4S) 모티브(motive), 더욱 바람직하게는 3 또는 4 (G4S) 모티브(motive)를 포함할지도 모른다.
일 실시예에서, 상기 면역글로불린 모듈 I1 및 상기 단편 F1은 1 내지 12, 바람직하게는 3 내지 12 아미노산으로 구성되는 링커에 의해 분리되고, 및/또는 상기 면역글로불린 모듈 I2 및 상기 단편 F2는 1 내지 12, 바람직하게는 3 내지 12 아미노산으로 구성되는 링커에 의해 분리된다.
일 실시예에서, I1의 VL 도메인은 12 내지 25 아미노산으로 구성된 링커에 의해, 바람직하게는 서열 (G3S)3 또는 (G3S)4 또는 (G4S)3 또는 (G4S)4를 가지는 링커에 의해 I1의 VH 도메인과 연결되어 있고, 및/또는 I2의 VL 도메인은 12 내지 25 아미노산으로 구성된 링커에 의해, 바람직하게는 서열 (G3S)3 또는 (G3S)4 또는 (G4S)3 또는 (G4S)4를 가지는 링커에 의해 I2의 VH 도메인과 연결되어 있다.
언급한 것처럼, 상기에서 설명된 링커는 (G3S) 및/또는 (G4S) 모티브(motive)를 포함할 수 있다. 대체가능한 링커는 GEGTSTGSGGSGGSGGAD 모티브로 구성되거나 포함할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 추가적인 노력 없이 해당 기술분야에서 알려진 (펩타이드) 링커를 찾고 이용할 수 있다.
상기 추가적인 아미노산 스트레치 1 및/또는 2는 1 내지 200, 1 내지 100, 1 내지 70, 1 내지 65, 1 내지 50, 1 내지 25 또는 1 내지 20 아미노산으로 구성되거나 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 항원 A1 및/또는 상기 항원 A2는 종양의 세포 표면에 또는 종양의 전구/선구 세포의 표면에 발현되는 항원, 바람직하게는 혈액학적 종양(haematologic tumour)의 세포의 표면에 발현되는 항원, 더욱 바람직하게는 급성 골수성 백혈병 세포(acute myeloic leukemia cells), 만성 골수성 백혈병 세포(chronic myeloic leukemia cells), 급성 림프성 백혈병 세포(acute lymphatic leukemia cells), 만성 림프성 백혈병 세포(chronic lymphatic leukemia cells), 림프종 세포(lymphoma cells), 골수증식증후군 세포(myeloproliferative syndrome cells), 골수형성이상 세포(myelodysplastic cells), 더욱 바람직하게는 골수종 세포(myeloma cells)로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포 표면에 발현되는 항원이고, 또는 상기 항원 A1 및/또는 상기 항원 A2는 비혈액학적 종양(non-haematologic tumour)의 세포 표면에 발현되는 항원, 바람직하게는 신장 세포 암종 세포(renal cell carcinoma cells), 방광암 세포(bladder cancer cells), 폐암 세포(lung cancer cells), 중피종 세포(mesothelioma cells), 전립선암 세포(prostate cancer cells), 뇌암 세포(brain cancer cells), 골암 세포(bone cancer cells), 육종 세포(sarcoma cells), 연부 조직암 세포(soft tissue cancer cells), 난소암 세포(ovarian cancer cells), 자궁경부암 세포(cervix cancer cells), 유방암 세포(breast cancer cells), 자궁내막암 세포(endometrial cancer cells), 자궁암 세포(uterine cancer cells), 생식 세포 종양 세포(germ cell tumour cells), 항문암 세포(anal cancer cells), 직장암 세포(rectal carcinoma cells), 결장암 세포(colon carcinoma cells), 소장암 세포(small intestine carcinoma cells), 위암 세포(gastric carcinoma cells), 위장 스트로마 종양 세포(gastrointestinal stroma tumour cells), 간암 세포(liver carcinoma cells), 췌장암 세포(pancreas carcinoma cells), 담관암 세포(bile duct carcinoma cells), 담낭암 세포(gall bladder carcinoma cells), 두경부암 세포(head and neck cancer cells), 하인두암 세포(hypopharyngeal cancer cells), 후두암 세포(laryngeal cancer cells), 식도(esophagus)암 세포, 피부암 세포(skin cancer cells), 바람직하게는 흑색종 세포(melanoma cells), 소아암(childhood cancer) 세포, 내분비 종양(endocrine tumour) 세포, 유암종 종양(carcinoid tumour) 세포, 흉선종 세포(thymoma cells), 갑상선암 세포(thyroid cancer cells), 섬세포 종양(islet cell tumour) 세포, 부신수질 세포 종양(adrenal cell tumour) 세포, 신경내분비 종양(neuroendocrine tumour) 세포 및 알려지지 않은 원발암의 세포 (알려지지 않은 1차 원점의 암)로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포 표면에 발현되는 항원이다. 이러한 암들의 자세한 정보는 관련 문헌 및 그 안에 인용된 참조에서 찾을 수 있고, 예를 들면 "Cancer Medicine", JF Holland, E Frei (editors), Mcgraw-Hill Professional, 8th edition (2010)가 있다.
일 실시예에서, 항원 A1 및 항원 A2의 조합은 오직 혈액 세포 또는 혈액 세포의 전구 세포, 바람직하게는 하나의 타입의 혈액 세포에서만 발견된다.
일 실시예에서, 항원 A1 및 항원 A2의 조합은 표적, 특히, 암세포에서만 발견되며, 표적 세포가 아닌, 특히, 암세포가 아닌 세포에서는 발견되지 않는다 (또는 무시할 정도로만 발견된다). 바람직한 실시예에서, 항원 A1 및 항원 A2의 조합은 특정 타입 암의 암세포에 특이적이다.
일 실시예에서, 항원 A1 및 항원 A2의 조합은 특정 종류의 세포, 바람직하게는 특정 타입의 암세포를 다른 세포로부터 구별한다.
이와 관련하여 "특정 타입 암"은 암이 형성되는 같은 기원에 의해 특징지어지는 타입의 암 또는, 바람직하게, (이상) 항원 A1 및 A2의 같은 쌍에 의해 특징지어지는 타입의 암을 의미할 수 있다.
일 실시예에서, 항원 A1 및 항원 A2의 조합은 종양의 전구/선구 세포인 전구(progenitor)/선구(precursor) 세포에서 발견되며, 종양의 전구/선구 세포가 아닌 전구/선구 세포에서는 발견되지 않는다.
일 실시예에서, 상기 항원 A1은 세포의 악성 상태에 특이적인 항원이고, 상기 항원 A2는 상기 세포의 세포 타입 또는 세포 계통에 특이적인 항원이다.
일 실시예에서,
a) 항원 A1은 EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) 및 항원 A2는 CD10 (cluster of differentiation 10), HER2/neu (human epidermal growth factor receptor 2), VEGF-R (vascular endothelial growth factor receptor), EGFR (epidermal growth factor receptor; HER1 (human epidermal growth factor receptor 1) 또는 ErbB1로도 불림) 또는 MDR (multidrug resistance protein), 또는
b) 항원 A1은 MCSP (melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan) 및 항원 A2는 멜라노페린(melanoferrin) 또는 EpCAM, 또는
c) 항원 A1은 CA125 (cancer antigen 125/carbohydrate antigen 125) 및 항원 A2는 CD227 (PEM (polymorphic epithelial mucin) 또는 MUC1 (mucin-1)), 또는
d) 항원 A1은 CD56 및 항원 A2는 CD140b (PDGFRβ (platelet-derived growth factor receptor beta)) 또는 GD3 강글리오사이드(ganglioside), 또는
e) 항원 A1은 EGFR 및 항원 A2는 HER2, 또는
f) 항원 A1은 PSMA (prostate-specific membrane antigen) 및 항원 A2는 HER2, 또는
g) 항원 A1은 Sialyl Lewis 및 항원 A2는 EGFR, 또는
h) 항원 A1은 CD44 및 항원 A2는 ESA (epithelial surface antigen) (CD326, EpCAM), CD24, CD133, MDR (multidrug resistance protein) 또는 CD117, 또는
i) 항원 A1은 CD34 및 항원 A2는 CD19, CD79a, CD2, CD7, HLA-DR (human leukocyte antigen DR), CD13, CD117, CD33 또는 CD15, 또는
j) 항원 A1은 CD33 및 항원 A2는 CD19, CD79a, CD2, CD7, HLA-DR (human leukocyte antigen DR), CD13, CD117 또는 CD15, 또는
k) 항원 A1은 MUC1 및 항원 A2는 CD10, CEA 또는 CD57, 또는
l) 항원 A1은 CD38 및 항원 A2는 CD138, 또는
m) 항원 A1은 CD 24 및 항원 A2는 CD29 또는 CD49f, 또는
n) 항원 A1은 탄산무수화효소(carbonic anhydrase) IX 및 항원 A2는 아쿠아포린(aquaporin), 바람직하게는 아쿠아포린(aquaporin)-2이다.
일 실시예에서, 상기 항원 A1 및/또는 상기 항원 A2는 HLA-A (HLA-A 주조직 적합성 유전자 복합체, 클래스 I, A [인간(Homo sapiens)]; 유전자 ID: 3105 updated on 13-Jan-2013; DAQB-90C11.16-002; 염색체(Chromosome): 6; NC_000006.11 (29910247..29913661); for HLA-A2: 1. mRNA = LOCUS NM_001242758 = Version NM_001242758.1 GI:337752169 = GenBank: AY191309.1 PRI 13-JAN-2013; 2. 단백질 = P79495 [UniParc]. Last modified May 1, 1997. Version 1.; for HLA-Cw6: mRNA = LOCUS HUMMHCCW6A = GenBank: VERSION M28160.1 GI:531197PRI (18-AUG-1994); 단백질 = Q29963 [UniParc]. Last modified August 22, 2003. Version 2.); EpCAM (EPCAM 상피 세포 접착 분자(epithelial cell adhesion molecule) [인간(Homo sapiens)]; 이것은 또한 ESA; KSA; M4S1; MK-1; DIAR5; EGP-2; EGP40; KS1/4; MIC18; TROP1; EGP314; HNPCC8; TACSTD1.로 알려져 있고; 유전자 ID: 4072, updated on 6-Jan-2013; mRNA = VERSION NM_002354.2 GI:218505669PRI 06-JAN-2013; 단백질 = P16422 [UniParc]. last modified November 13, 2007. Version 2.); CD45 (PTPRC 단백질 티로신 포스파타아제(protein tyrosine phosphatase), 수용체 타입(receptor type), C [인간(Homo sapiens)]; 이것은 또한 LCA; LY5; B220; CD45; L-CA; T200; CD45R; GP180로 알려져 있고; 유전자 ID: 5788, updated on 13-Jan-2013; mRNA = VERSION NM_002838.4 GI:392307006 PRI 13-JAN-2013; 단백질 = P08575-1 = 아이소폼(Isoform) 1, Last modified July 19, 2003. Version 2.; 단백질 = P08575-2 = 아이소폼(Isoform) 2); Her2 (ERBB2 v-erb-b2 적아세포 백혈병(erythroblastic leukemia) 바이러스성 암유전자(viral oncogene) 상동체(homolog) 2, 신경/교아세포종(neuro/glioblastoma) 유래 암유전자(oncogene) 상동체(homolog) (avian) [인간(Homo sapiens)]; 이것은 또한 NEU; NGL; HER2; TKR1; CD340; HER-2; MLN 19; HER-2/neu로 알려져 있고; 유전자 ID: 2064, updated on 13-Jan-2013; mRNA 전사 변이체(transcript variant) 1 = VERSION NM_004448.2 GI:54792095, PRI 06-JAN-2013; mRNA 전사 변이체(transcript variant) 2 = VERSION NM_001005862.1 GI:54792097, PRI 06-JAN-2013; 단백질 = P04626-1 = 아이소폼(Isoform) 1 , Last modified August 13, 1987. Version 1.; 단백질 = P04626-2= 아이소폼(Isoform) 2; 단백질 = P04626-3= 아이소폼(Isoform) 3; 단백질 = P04626-4= 아이소폼(Isoform) 4); EGFR (EGFR 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor) [인간(Homo sapiens)]; 이것은 또한 ERBB; HER1; mENA; ERBB1; PIG61로 알려져 있고; 유전자 ID: 1956, updated on 13-Jan-2013; mRNA 전사 변이체(transcript variant) 1 = VERSION NM_005228.3 GI:41327737, PRI 13-JAN-2013; mRNA 전사 변이체(transcript variant) 2 = VERSION NM_201282.1 GI:41327731, PRI 13-JAN-2013; mRNA 전사 변이체(transcript variant) 3 = VERSION NM_201283.1 GI:41327733, PRI 13-JAN-2013; mRNA 전사 변이체(transcript variant) 4 = VERSION NM_201284.1 GI:41327735, PRI 13-JAN-2013; 단백질 = P00533-1 = 아이소폼(Isoform) 1, Last modified November 1, 1997. Version 2.; 단백질 = P00533-2 = 아이소폼(Isoform) 2; 단백질 = P00533-3 = 아이소폼(Isoform) 3; 단백질 = P00533-4 = 아이소폼(Isoform) 4); CD138 (SDC1 신데칸(syndecan) 1 [인간(Homo sapiens)]; 유전자 ID: 6382, updated on 6-Jan-2013; mRNA 전사 변이체(transcript variant) 1 = VERSION NM_001006946.1 GI:55749479, PRI 06-JAN-2013; mRNA 전사 변이체(transcript variant) 2 = VERSION NM_002997.4 GI:55925657, PRI 06-JAN-2013; 단백질 = P18827 [UniParc]. Last modified May 5, 2009. Version 3.); CEA (CEACAM5 암배 항원 관련 세포 접착 분자(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule) 5 [인간(Homo sapiens)]; 이것은 또한 CEA; CD66e로 알려져 있고; 유전자 ID: 1048, updated on 13-Jan-2013; mRNA = VERSION NM_004363.2 GI:98986444, PRI 13-JAN-2013; P06731, Last modified January 11, 2011. Version 3.); 및 CD19 (CD19 CD19 분자 [인간(Homo sapiens)]; 이것은 또한 B4; CVID3로 알려져 있고; 유전자 ID: 930, updated on 5-Jan-2013; mRNA transcript 1 = VERSION NM_001178098.1 GI:296010920, PRI 06-JAN-2013; mRNA transcript 2 = VERSION NM_001770.5 GI:296010919, PRI 06-JAN-2013; 단백질 = P15391 [UniParc]. Last modified November 13, 2007. Version 6)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 상기 항원 A1 및/또는 상기 항원 A2는 MHC 항원, 바람직하게는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ, HLA-DR, 또는 HLA-DM 중 어느 것의 대립유전자 변이체, 더욱 바람직하게는 MHC 클래스 I 분자의 대립유전자 변이체, 더욱 바람직하게는 HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A25, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B35, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw6, 및 HLA-Cw7로 구성되는 군으로부터 선택되는 대립유전자 변이체이다.
일 실시예에서, 상기 항원 A1은 HLA-A2이다.
일 실시예에서, 상기 항원 A1 및/또는 상기 항원 A2는 CD45, 아쿠아포린(aquaporin), 바람직하게는 아쿠아포린(aquaporin)-2, SCARB1 (스캐빈저 수용체 클래스 B 멤버 1), CD34, CD33, CD138, CD15, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD20, CD23, CD31, CD43, CD56, CD57, CD68, CD79a, CD146, 신경접합단백질 (synaptophysin), CD56, CD57, 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nicotinic acetylcholine receptor), 근육-특이적 키나아제(muscle-specific kinase (MUSK)), 전압 의존성 칼슘 채널 (P/Q-type), 전압 의존성 칼륨 채널 (VGKC), N-메틸-D-아스파르트산수용체 (NMDA), TSH (티로이드(thyroid) 자극 호르몬) 수용체, 암피파이신(amphiphysin), HepPar-1, 강글리오사이드(ganglioside) GQ1B, 강글리오사이드(ganglioside) GD3, 강글리오사이드(ganglioside) GM1 및 글라이코포린(glycophorin)-A로 구성되는 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시예에서, 상기 항원 A1은 MHC 항원이고 상기 항원 A2는 특정 세포 타입 또는 세포 계통에 특이적인 항원이다.
일 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 면역글로불린 모듈, 바람직하게는 항체의 scFv (단일-사슬 가변 단편), 더욱 바람직하게는 항체의 Fv (가변 단편), 또는 형광 분자, 바람직하게는 2분자 형광 보완 분자, 더욱 바람직하게는 GFP 또는 GFP 변이체, 또는 생체발광을 조정할 수 있는 분자, 바람직하게는 루시퍼라아제(luciferase) 분자, 더욱 바람직하게는 Gaussia 루시퍼라아제(luciferase)이다.
일 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 항체의 Fv (가변 단편)이다.
일 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 항원과 특이적으로 결합하거나 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 구체적인 측면에서, 상기 항원은 인간 면역 체계의 세포에 나타나는 항원일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 결합은 인간 면역 체계의 상기 세포를 활성화한다.
일 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 T 세포 인게이징(engaging) 도메인, 바람직하게는 CD2, CD3, CD5, T 세포 수용체 또는 CD28에 특이적으로 결합하는 T 세포 인게이징 도메인, 더욱 바람직하게는 CD3ε에 특이적으로 결합하는 T 세포 인게이징 도메인, NK 세포 (Natural Killer cell) 인게이징 도메인, 바람직하게는 CD1a, CD16a 또는 CD56에 특이적으로 결합하는 NK 세포 인게이징 도메인, 도메인 인게이징 대식 세포, 바람직하게는 CD16a, CD32a, CD32b, CD89 또는 CD64에 특이적으로 결합하는 도메인 인게이징 대식 세포, 단핵구(monocyte) 인게이징 도메인, 바람직하게는 CD32a, CD32b, CD64 또는 CD89에 특이적으로 결합하는 단핵구 인게이징 도메인, 과립구(granulocyte) 인게이징 도메인, 바람직하게는 CD16b, CD32a, CD32b, CD64, 또는 CD89에 특이적으로 결합하는 과립구 인게이징 도메인, 도메인 인게이징 호중 과립구(neutrophil granulocytes), 바람직하게는 CD89 (FcaRI)에 특이적으로 결합하는 도메인 인게이징 호중 과립구, 또는 도메인 인게이징 활성된 호중 과립구, 단핵구 및/또는 대식 세포, 바람직하게는 CD64에 특이적으로 결합하는 도메인 인게이징 활성된 호중 과립구, 단핵구 및/또는 대식세포(FcγRI)이다.
일 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 진단적 또는 치료 화합물에 연결된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인이다.
일 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 운반체 또는 친화성 태그에 특이적으로 결합하는 도메인이다. 바람직하게는, 상기 운반체는 진단적 또는 치료 화합물에 연결되어 있다. 바람직하게는 상기 친화성 태그는 진단적 또는 치료 화합물에 연결되어 있다.
바람직하게는, 상기 친화성 태그는 FLAG-태그, myc-태그, 글루타티온(glutathione)-S-트랜스퍼라제(GST)-태그, 헤마글루티닌(HA)-태그, 폴리히스티딘(His)-태그, 다이옥시제닌(digoxigenin(DIG))-태그 및 말토오스 결합 단백질(MBP)-태그로 구성되는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 운반체는 펩타이드 또는 탄수화물(carbohydrate) 분자이다. 바람직한 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 운반체, 바람직하게는 진단적 또는 치료 화합물에 결합된 운반체에 특이적으로 결합하고, 상기 운반체는 젤라틴(gelatine), 이눌린(inulin), 덱스트란(dextrane) 및 하이드록시에틸 녹말(hydroxyethyl starch)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 상기 치료 화합물은 방사성 화합물(radioactive compound), 바람직하게는 90Y, 177Lu, 131I, 32P, 10B, 또는 213Bi를 포함하는 방사성 화합물이다. 일 실시예에서, 상기 치료 화합물은 독소(toxin)이다. 바람직하게는, 상기 독소는 B. anthracis 이디마(edema) 인자, B. anthracis 치사(lethal) 인자, C. perfringens 이오타(iota) 독소, C. botulinum C2 독소, C. difficile ADP -리보실트랜스퍼라아제( ribosyltransferase ), C. diphtheriae 디프테리아( diphteria ) 독소 단편 A, Burgholderia sp. shiga 독소 (서브유닛 A), Clostridium perfringens str. 13 독소 pfoA perfringolysin O, 리신(Ricin) A 사슬, 식물(plant) RIP 보우가닌(bouganin), 인간 RNASE3 리보뉴클라아제(ribonuclease) (RNase A 패밀리(family), 3) 및 탄저병 치사 인자 엔도펩티다아제(anthrax lethal factor endopeptidase)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따른 독소의 제한되지 않는 추가적인 예는 서열번호 160 내지 168로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열이거나 이를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 진단 화합물은 방사성 화합물, 바람직하게는 99 mTc, 111In, 82Rb 또는 201Tl를 포함하는 방사성 화합물이다. 일 실시예에서, 상기 진단 화합물은 형광 화합물, 바람직하게는 GFP, GFP 변이체, 또는 형광 저-분자 화합물이고, 형광 저-분자 화합물은 예를 들면 FITC (fluorescein isothiocyanate), PE (phycoerythrin), 알렉사 플루오르 염료 (예를 들어, 알렉사플루오르488(AlexaFluor488) 또는 관련 염료) 또는 시아닌(cyanine) 염료 (예를 들어, Cy3 (인도카보시아닌(Indocarbocyanine)) 또는 Cy5 (인도다이카보시아닌(Indodicarbocyanine)) 또는 관련 염료)이다. 일 실시예에서, 상기 진단 화합물은 생체발광을 조정할 수 있는 분자, 바람직하게는 루시퍼라아제 분자, 더욱 바람직하게는 Gaussia 루시퍼라아제이다.
일 실시예에서, 상기 단편 F1은 항체의 VL 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 같은 항체의 VH 도메인을 포함하며, 바람직하게는, 상기 항체는 항-CD3 항체, 더욱 바람직하게는 항-CD3ε 항체, 또는 항-His 또는 항-DIG 항체이고, 또는 상기 단편 F1은 항체의 VH 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 같은 항체의 VL 도메인을 포함하며, 바람직하게는 상기 항체는 항-CD3 항체, 더욱 바람직하게는 항-CD3ε 항체, 또는 항-His 또는 항-DIG 항체이다.
또 다른 실시예에서, F1 및 F2 단편 각각에 또는 F2 및 F1 단편 각각에 포함된 VL 및 VH 도메인은 두 다른 항체일 수도 있는데, 같은 항원에 특이적이거나 (및 같거나 다른 에피토프에 특이적) 또는 다른 항원에 특이적이다. 예를 들어, 이것은 새로운 스페시피케이션(specification)이 만들어지는 곳에 사용되는 것으로 예상된다(예를 들어 파지-발현 접근에서).
또 다른 실시예에서, F 도메인 안에 포함된 면역글로불린 모듈은 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 V 도메인을 포함한다:
(i) 서열번호 18-20 (CDRs 1-3)을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 15-17 (CDRs 1-3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인;
(ii) 서열번호 24-26 (CDRs 1-3)을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 21-23 (CDRs 1-3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인;
(iii) 서열번호 30-32 (CDRs 1-3)을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 27-29 (CDRs 1-3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인;
(iv) 서열번호 36 및 37 (CDRs 1 및 3) 및 DTS (CDR 2)를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 33-35 (CDRs 1-3)를 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인;
(v) 서열번호 41 및 42 (CDRs 1 및 3) 및 YTN (CDR 2)을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 38-40 (CDRs 1-3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인; 및
(vi) 서열번호 46 및 47 (CDRs 1 및 3) 및 KVS (CDR 2)을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 43-45 (CDRs 1-3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-His 항체의 V 도메인;
(vii) 서열번호 50 및 131 (CDRs 1 및 3) 및 YSS (CDR 2)를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 48 및 49 (CDRs 1 및 2) 및 A (CDR 3)을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-DIG 항체의 V 도메인.
또 다른 바람직한 실시예에서, F 도메인 안에 포함된 면역글로불린 모듈은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 V 도메인을 포함한다:
(i) 서열번호 2를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 1을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인;
(ii) 서열번호 4를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 3을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인;
(iii) 서열번호 6을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 5를 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인;
(iv) 서열번호 8을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 7을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인;
(v) 서열번호 10을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 9를 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인; 및
(vi) 서열번호 12를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 11을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-HIS 항체의 V 도메인;
(vii) 서열번호 14를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 30을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-DIG 항체의 V 도메인.
일 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 독소 분자에 특이적으로 결합하는 도메인이고, 바람직하게는 독소 분자는 단독으로는 인간 세포의 세포 막을 통하여 투과할 수 없고 및 바람직하게는 상기 세포의 세포 막에 관련 하에 인간 세포로 내포되며, 바람직하게는, 상기 세포의 세포막에 상기 연관은 두 분자, 바람직하게는 상기 세포막에 연관된 두 분자로부터 형성된 헤테로이합체에 특이적으로 결합함에 의하여 조정되며, 바람직하게는 상기 두 분자는 본 명세서에서 설명된 폴리펩타이드 P1 및 P2이다. 일 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 박테리아 2-구성요소 A-B 독소의 A-구성요소 (활성 구성요소)에 특이적으로 결합하는 도메인이다. 일 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 B. anthracis 이디마(edema) 인자, B. anthracis 치사(lethal) 인자, C. perfringens 이오타(iota) 독소, C. botulinum C2 독소, C. difficile ADP-리보실트랜스퍼라아제(ribosyltransferase), C. diphtheriae 디프테리아(diphteria) 독소 단편 A, Burgholderia sp. shiga 독소 (서브유닛 A), Clostridium perfringens str. 13 독소 pfoA perfringolysin O, 리신(Ricin) A 사슬(chain), 식물(plant) RIP 보우가닌(bouganin), 인간 RNASE3 리보뉴클라아제(ribonuclease) (RNase A 패밀리(family), 3) 및 탄저병 치사 인자 엔도펩티다아제(anthrax lethal factor endopeptidase)로 구성되는 군으로부터 선택된 독소에 특이적으로 결합하는 도메인이다. 본 발명에 따른 독소의 제한되지 않는 추가적인 예는 서열번호 160 내지 168로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열이거나 이를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 형광 분자, 바람직하게는 단독으로는 인간 세포의 세포 막을 통하여 투과할 수 없는 형광 분자에 특이적으로 결합하는 도메인이다. 바람직하게는, 상기 형광 분자는 GFP 또는 GFP 변이체 또는 형광 저-분자 화합물이거나 이를 포함하는 분자이며, 형광 저-분자 화합물은 예를 들어 FITC (fluorescein isothiocyanate), PE (phycoerythrin), 알렉사 플루오르 염료 (예를 들어, 알렉사플루오르488(AlexaFluor488) 또는 관련 염료) 또는 시아닌(cyanine) 염료 (예를 들어, Cy3 (인도카보시아닌(Indocarbocyanine)) 또는 Cy5 (인도다이카보시아닌(Indodicarbocyanine)) 또는 관련 염료)이다.
일 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 생체발광을 조정할 수 있는 분자, 바람직하게는 루시퍼라아제 분자, 더욱 바람직하게는 Gaussia 루시퍼라아제에 특이적으로 결합하는 도메인이다.
일 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 형광 분자, 바람직하게는 2분자 형광 보완 분자, 더욱 바람직하게는 GFP 또는 GFP 변이체, 예를 들어 YFP, CFP, 비너스(Venus), 또는 세루리안(Cerulean)이다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드 세트안에 포함된 구체적인 폴리펩타이드 P1 또는 P2의 예는 서열번호 114-129 및 197로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
일반적으로, 본 발명은 어떤 원하지 않은 세포 군(population)의 치료 또는 제거 및 원하지 않은 세포 군에 따른 어떤 질환 또는 질병의 치료 또는 예방과 관련된다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트는 종양 또는 암을 앓고 있는 환자의 치료, 또는 종양 또는 암을 앓고 있는 환자의 진단에 이용하기 위한 폴리펩타이드 세트이고, 바람직하게는 종양 또는 암을 앓고 있으며 동종 조직 또는 세포 이식을 받거나 그러한 이식을 받기로 예정된 환자의 치료에 이용하기 위한 것, 또는 종양 또는 암을 앓고 있으며 동종 조직 또는 세포 이식을 받거나 받기로 예정된 환자에 진단적 이용을 위한 것이고, 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 세트는 상기 환자에 투여된다.
치료되거나 진단될 종양의 예는 항원 A1 및/또는 A2에 관하여 상기에서 설명된 종양 또는 암 세포이다.
일 실시예에서, 상기 치료는 특정 세포 타입, 바람직하게는 암 세포 타입의 이식수여자(recipient) 조직/세포의 제거를 수반하고, 또는 특정 세포 타입, 바람직하게는 암 세포 타입을 일으키는 이식수여자 전구 세포의 제거를 수반하며, 선택적으로 같은 세포 타입의 이식제공자 조직/세포 또는 상기 같은 세포 타입을 일으키는 이식제공자 전구 세포를 이식수여자에게 이식 후 또는 이식과 동시에 수반한다.
일 실시예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 세트는 조혈 종양형성을 위해 세팅된 동종 이식, 예를 들어, 미스매치된 HLA 항원을 가지는 이식에서 이용하기 위한 것으로, 특히 치료적으로 이용되는 이러한 미스매치 상황에서 이용하기 위한 것이다. 이러한 예시적 상황에서, 이식수여자 HLA 단상형 (HLApatient) 및 조혈 계통 기원 (CD56)의 이중 정보는 백혈병 블라스트(blast) 및 환자의 다른 조혈 세포에서 독점적으로 나타난다. 이식수여자 기원의 모든 다른 세포는 이식수여자 단상형을 발현하나, 조혈 계통 항원 CD45는 발현하지 않는다(예를 들어, 이식수여자 비-조혈 세포는 HLA-A2 양성이나 CD45 음성이다). 이와 같이, 모든 이식제공자 조혈 세포는 이식제공자 HLA 단상형 분자을 발현하는데, 환자는 HLA-A2에 양성이나 이식제공자는 그렇지 않은 미스매치 이식 상황에서 그것이 CD45 양성이나 HLA-A2 음성이라는 것을 의미한다. 결과적으로, 본 발명은 또한 2중분자의 및 HLA-A2를 향하는 상보성 단일-사슬 항체 구조체에 관련되는데, 환자는 HLA-A2 양성이나 이식제공자는 그렇지 않은 상황에서 그러하고, 그리고 모든 혈액학적 종양(haematologic tumour)을 포함하여 환자의 모든 조혈 세포를 특이적으로 표적하는 조혈 계통 마커 CD45에 특이적인 두 번째 구조체에 관련된다. 이런 이유로, 제 1 폴리펩타이드 P1은 환자의 HLA를 향하는 단일-사슬 가변 단편 항체 구조체 (표적 모이어티 T1)가 F1 항CD3의 VL 단편 (예를 들어, 단편 F1)과 결합된 것을 포함할 수 있다. 제 2 폴리펩타이드 P2는 조혈 계통 마커에 특이적인 단일-사슬 가변 단편 구조체 (예를 들어, CD45; 표적 모이어티 T2)가 F2 항 CD3-Fv의 VH 스플릿(split)-단편과 결합된 것을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제거는 면역 체계의 세포에 의해, 독소에 의해 또는 방사성 화합물에 의해 상기 이식수여자 조직/세포 또는 상기 이식수여자 전구 세포의 파괴를 수반한다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트는 동종 조직 또는 세포 이식을 겪은 환자, 바람직하게는 상기 환자는 종양을 앓고 있는 환자에서 진단적 이용을 위한 폴리펩타이드 세트이다.
일 실시예에서, 상기 진단적 이용은 다른 세포 타입 또는 세포 계통의 이식수여자 세포들 및 같거나 다른 타입 또는 세포 계통의 이식제공자 세포들 사이에서 특정 세포 타입 또는 세포 계통의 이식수여자 세포의 특이적 감지를 수반한다.
일 실시예에서, 상기 진단적 이용은 악성이 아닌 이식수여자 세포 사이에서 및 이식제공자 세포 사이에서 악성 세포인 이식수여자 세포의 특이적 감지를 수반한다. 일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트는 환자에게 투여된다.
바람직하게는, 상기 환자는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간이다.
일 실시예에서, 상기 투여는 볼러스(bolus) 투여에 의해 또는 계속적인 투여에 의해 일어난다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드 P1 및 P2는 동시에 투여된다. 또 다른 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드 P1 및 P2는 연속적으로 투여된다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드 P1 또는 P2 중 하나는 볼러스(bolus) 투여에 의해 투여되고, 반면 다른 하나는 연속적인 투여에 의해 투여된다.
일 실시예에서, 투여되는 폴리펩타이드의 양은 폴리펩타이드 P1 또는 폴리펩타이드 P2 또는 폴리펩타이드 P1 및 P2의 각각 하루에 0.5　㎍/m2 부터 하루에 500 ㎍/m2 까지의 범위 내, 바람직하게는 폴리펩타이드 P1 또는 폴리펩타이드 P2 또는 폴리펩타이드 P1 및 P2의 각각 하루에 5 ㎍/m2 부터 하루에 200 ㎍/m2까지의 범위 내, 더욱 바람직하게는 폴리펩타이드 P1 또는 폴리펩타이드 P2 또는 폴리펩타이드 P1 및 P2의 각각 하루에 10 ㎍/m2 부터 하루에 80 ㎍/m2 까지의 범위 내이다.
일 실시예에서, 투여되는 폴리펩타이드의 양은 폴리펩타이드 P1 또는 폴리펩타이드 P2 또는 폴리펩타이드 P1 및 P2의 각각 하루에 0.05　㎍/m2 부터 하루에 0.5 ㎍/m2 까지의 범위 내이다.
일 실시예에서, 투여되는 폴리펩타이드 P1의 양은 투여되는 폴리펩타이드 P2의 양과 다르다.
일 실시예에서, 투여되는 폴리펩타이드의 양은 폴리펩타이드 P1 또는 폴리펩타이드 P2 또는 폴리펩타이드 P1 및 P2의 각각 하루에 0.5　㎍/m2 부터 하루에 50 ㎍/m2 까지의 범위 내이다. 일 실시예에서, 투여되는 폴리펩타이드의 양은 폴리펩타이드 P1 또는 폴리펩타이드 P2 또는 폴리펩타이드 P1 및 P2의 각각 하루에 50 ㎍/m2 부터 하루에 100 ㎍/m2 까지의 범위 내이다. 일 실시예에서, 투여되는 폴리펩타이드의 양은 폴리펩타이드 P1 또는 폴리펩타이드 P2 또는 폴리펩타이드 P1 및 P2의 각각 하루에 100 ㎍/m2 부터 하루에 200 ㎍/m2 까지의 범위 내이다. 일 실시예에서, 투여되는 폴리펩타이드의 양은 폴리펩타이드 P1 또는 폴리펩타이드 P2 또는 폴리펩타이드 P1 및 P2의 각각 하루에 200 ㎍/m2 부터 하루에 300 ㎍/m2 까지의 범위 내이다. 일 실시예에서,투여되는 폴리펩타이드의 양은 폴리펩타이드 P1 또는 폴리펩타이드 P2 또는 폴리펩타이드 P1 및 P2의 각각 하루에 300 ㎍/m2 부터 하루에 400 ㎍/m2 까지의 범위 내이다. 일 실시예에서, 투여되는 폴리펩타이드의 양은 폴리펩타이드 P1 또는 폴리펩타이드 P2 또는 폴리펩타이드 P1 및 P2의 각각 하루에 400 ㎍/m2 부터 하루에 500 ㎍/m2 까지의 범위 내이다. 일 실시예에서, 투여되는 폴리펩타이드의 양은 폴리펩타이드 P1 또는 폴리펩타이드 P2 또는 폴리펩타이드 P1 및 P2의 각각 하루에 500 ㎍/m2 부터 하루에 1 mg/m2 까지의 범위 내이다.
투여되어야 할 폴리펩타이드 P1 및 P2의 양을 얻기 위한 추가적인 참조 포인트는 2중특이성 항체 구조체에 대해 수행한 연구를 참조하여 얻을 수 있다(예를 들어, Bargou R et al., Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody. Science. 2008; 321(5891):974-7; 및 Topp MS et al. Targeted therapy with the T-cell-engaging antibody blinatumomab of chemotherapy-refractory minimal residual disease in B-lineage acute lymphoblastic leukemia patients results in high response rate and prolonged leukemia-free survival. J Clin Oncol. 2011, 29:2493-8).
일 실시예에서, 상기 투여는 최소 12시간 동안 또는 최소 1일 동안 또는 최소 2일 동안 또는 최소 3일 동안 또는 최소 4일 동안 또는 최소 5일 동안 또는 최소 6일 동안 또는 최소 7일 동안 또는 최소 8일 동안 또는 최소 9일 동안 또는 최소 10일 동안 또는 최소 11일 동안 또는 최소 12일 동안 또는 최소 13일 동안 또는 최소 14일 동안 또는 최소 15일 동안 또는 최소 16일 동안 또는 최소 17일 동안 또는 최소 18일 동안 또는 최소 19일 동안 또는 최소 20일 동안 또는 최소 21일 동안 또는 최소 22일 동안 또는 최소 23일 동안 또는 최소 24일 동안 또는 최소 25일 동안 또는 최소 26일 동안 또는 최소 27일 동안 또는 최소 28일 동안 또는 최소 29일 동안 또는 최소 30일 동안 또는 최소 5주 동안 또는 최소 6주 동안 연속적으로 일어난다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트의 투여 또는 상기 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드 중 하나의 투여는 정맥안으로, 바람직하게는 정맥 주사에 의해 일어난다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트의 투여 또는 상기 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드 중 하나의 투여는 피하로, 바람직하게는 피하 주사에 의해 일어난다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트는 면역조절제, 및/또는 스테로이드(steroid), 바람직하게는 프레드니솔론(prednisolone) 또는 프레드니손(prednisone)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 약물(drug)과 함께 조합하여 투여된다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트는 방사성 화합물, 바람직하게는 항원, 운반체 또는 친화성 태그에 연결된 방사성 화합물과 조합하여 투여되고, 상기 방사성 화합물, 상기 화합물, 상기 운반체 또는 상기 친화성 태그는 상기 기능성 도메인 F에 의해 특이적으로 결합된다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트는 독소, 바람직하게는 항원, 운반체 또는 친화성 태그에 연결된 독소와 조합하여 투여되고, 상기 독소, 상기 항원, 상기 운반체 또는 상기 친화성 태그는 상기 기능성 도메인 F에 의해 특이적으로 결합된다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트는 형광 분자, 바람직하게는 항원, 운반체 또는 친화성 태그에 연결된 형광 분자와 조합하여 투여되고, 상기 형광단, 상기 항원, 상기 운반체 또는 상기 친화성 태그는 상기 기능성 도메인 F에 의해 특이적으로 결합된다.
일 실시예에서, 상기 기능성 도메인 F는 상기 폴리펩타이드 세트가 투여되는 상기 환자의 면역 체계에 의해 이물질로 인식되지 않는 항원에 특이적으로 결합하는 도메인이다.
일 실시예에서, 상기에서 설명된 폴리펩타이드 두 세트(제 1 폴리펩타이드 세트 및 제 2 폴리펩타이드 세트)는 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 한 바람직한 실시예에서, 상기 제 1 폴리펩타이드 세트는 상기 제 2 폴리펩타이드 세트와 다른 단편 F1 및 F2를 가진다. 한 바람직한 실시예에서, 상기 제 1 폴리펩타이드 세트는 상기 제 2 폴리펩타이드 세트와 같은 단편 F1 및 F2를 가진다. 한 바람직한 실시예에서, 상기 제 1 폴리펩타이드 세트의 표적 모이어티 T1 및 T2는 상기 제 2 폴리펩타이드 세트의 표적 모이어티 T1 및 T2 각각과 같은 항원에 결합한다. 한 바람직한 실시예에서, 상기 제 1 폴리펩타이드 세트의 표적 모이어티 T1 및 T2는 상기 제 2 폴리펩타이드 세트의 표적 모이어티 T1 및 T2와 다른 항원에 결합한다.
일 실시예에서, 상기 환자는 상기 폴리펩타이드 세트로 치료하기 전에 암 치료를 겪었고, 상기 암 치료는 바람직하게는 화학요법, 방사선 치료 또는 종양의 수술적 제거이며, 또는 상기 폴리펩타이드 세트로의 치료와 병행하여 암 치료를 겪고, 상기 암 치료는 바람직하게는 화학요법, 방사선 치료 또는 종양의 수술적 제거이다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트 또는 상기 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드 중 하나는 원핵 또는 진핵 발현 시스템의 방법에 의해 또는 새로운(de novo) 펩타이드 합성에 의해 생산되었다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드 세트 또는 상기 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드 중 하나는 상기 환자 안에 도입된 핵산으로부터 단백질 발현에 의해 상기 환자 안에서 생성된다.
많은 환자들은 알레르기성 또는 자가-면역 질환을 겪고 있다. 많은 이러한 경우에, 클로날(clonal) B 세포 군(population)은 환자의 조직 또는 알레르겐(allergen)과의 복합체에 의해 발현되는 항원과 반응하는 잘못된 항체를 생산하고, 이것은 과민성 반응을 일으킨다. 두 가지 경우에, 잘못된 B 세포 클론을 특이적으로 제거하는 것이 바람직하다.
이것을 위하여, 하나의 팔 (P1 또는 P2, 특히 T1 또는 T2)은 항원 (예를 들어, CD19, CD20, CD38 또는 CD138)에 관련된 B 세포를 인식하고 다른 하나의 팔 (P2 또는 P1, 특히 T2 또는 T1, 각각)은 자가면역 질병을 일으키는 항체에 결합된 알레르겐 또는 기질이 되도록 조합 시스템을 어느 정도는 수정할지도 모른다. 이러한 두 구조체가 CD19 (CD20, CD38 또는 CD138) 양성이고 동시에 표면에 클로노타입의 항체를 나타내는 B 세포에 결합할 때, 부착된 항-CD3 VH 및 VL은 정확히 B 세포에 CD3 결합 부위와 상호작용하고 재구성할 수 있다. 이러한 알레르겐-특이적 또는 항원-특이적 조립은 결국 표적 B 세포의 클로날 감소를 초래할 것이다.
이런 이유로, 본 발명에 따라서, 상기 항원 A1 및 A2 중 어느 것은 B 세포, 특히 자가면역 질환을 일으키는 B 세포의 표면에 클로노타입의 항체일 수 있다.
이와 관련해서, 예를 들어, 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 CD19이고 다른 하나는 B 세포, 특히 자가면역 질환을 일으키는 B 세포의 표면에 클로노타입의 항체일 수 있다.
본 발명의 이러한 측면에 따라서, 상기 표적 모이어티 T1 및 T2 중 어느 하나는 B 세포의 표면에 클로노타입의 항체에 결합하거나 및/또는 클로노타입의 항체의 결합 하에 자가면역 질환을 일으킬 수 있는 알레르겐 또는 기질을 포함할지도 모른다. 상기 표적 모이어티 T1 및 T2 중 어느 하나에 포함된 알레르겐의 예로 헤어 알레르겐(hair allergens), 예를 들어, 개-털(dog-hair), 고양이-털(cat-hair) (예를 들어, Fel d 1, Feld d1A, Feld d1B) 또는 기니-피그-헤어 알레르겐(guinea-pig-hair allergens), 또는 꽃가루 알레르겐(pollen allergens), 예를 들어, 자작나무(birch), 풀(grass), 꽃가루(pollen) 알레르겐이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 추가적인 예로 진드기(mite) 알레르겐 (예를 들어 Tyr p 2, Der P1, Der f 2), 고양이 알레르겐 (예를 들어 Fel d 1, Feld d1A, Feld d1B), 땅콩(peanut) 알레르겐 (예를 들어 Conglutin-7), 부후균(rot fungus) 알레르겐 (예를 들어 Alt a 1), 개 알레르겐 (예를 들어 Can f 1), 스프루 밀(sprue wheat) 알레르겐 (예를 들어 알파/베타-글리아딘(gliadin)), 바퀴(german cockroach) 알레르겐 (예를 들어 Bla g 1.02 변이체 알레르겐), 자작나무(birch tree) 또는 (주요) 꽃가루 알레르겐 (예를 들어 Cyn d 1, Pha a 1, Dac g 3, Phl p 2, Phl p 1, 프로필린(Profilin), Bet v 1-L, Bet v 1-A), 주요 사과 알레르겐 (예를 들어 Mal d 1), 젖소 우유 알레르겐 (예를 들어 알파-락트알부민(lactalbumin), 알파-S1-카제인(casein)), 계란 알레르겐 (예를 들어 리소자임(lysozyme) C, ovalbumin) 및 말 알레르겐 (예를 들어 latherin, Equ c 1), 기타 같은 종류의 것들이 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 표적 모이어티 T1 및 T2 중 어느 하나에 포함된 알레르겐의 추가적인 바람직한 예로 인간 골수 세포주 U266 항체 IgE-ND에 대한 항원이 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 표적 모이어티 T1 및 T2 중 어느 하나에 포함된 알레르겐의 추가적인 바람직한 예로 서열번호 169 내지 195로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열이거나 이를 포함하는 알레르겐이 있으나, 이에 한정하지 않는다.
이와 관련해서, 또한 본 발명은, 특히 상기 측면에서, 하기로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본 명세서에서 설명된 폴리펩타이드 세트와 관련된다:
(i) 자가면역 질환; 및
(ii) 과민증 질환.
본 발명에 따라 치료 또는 예방되는 자가면역 질환의 예는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되나, 이에 한정하지 않는다:
(i) 알레르기성 질환(allergic disorders);
(ii) 다발성 경화증(Multiple Sclerosis);
(iii) 건선(Psoriasis);
(iv) 전신성 루푸스(Systemic Lupus Erythematosus);
(v) 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome);
(vi) 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis);
(vii) 특발성 혈소판 감소성 자반증(Idiopathic Thrombocytopenic Purpura);
(viii)당뇨병(Diabetes);
(xi) 혈관염(Vasculitis);
(x) 크론병(Crohn's disease); 및
(xi) 아밀로이드증(Amyloidosis).
본 발명에 따라 치료 또는 예방될 과민증 질환의 예는 알레르기 (Coombs와 Gell의 분류에 의한 유형 I 과민 반응), 항체 의존성 세포독성 반응 (유형 II 과민 반응), 면역 복합체 질병 (유형 III 과민 반응), 지연형 과민증 (유형 IV 과민 반응) 또는 수용체 매개 자가면역 질병 (유형 V 과민 반응)로 구성되는 군으로부터 선택되나, 이에 한정하지 않는다.
바람직한 실시예에서, 상기 자가면역 또는 과민증 질환은 동종 줄기세포 이식과 함께 또는 동종 줄기세포 이식에 의하여 초래된다 (즉, Coombs와 Gell의 분류에 의한 유형 I 내지 유형 V 과민증 질환 중 어느 것이라도).
병원체(예를 들어 HIV, EBV, CMV와 같은 바이러스)에 의해 감염된 많은 세포들은 세포 표면에 병원체-암호화된 단백질을 발현한다. 이런 이유로, 본 발명에 따라서, 상기 항원 A1 및 A2 중 어느 것은 또한 세포 표면에 그러한 병원체-암호화된 단백질, 예를 들어, HIV, EBV 또는 CMV 단백질일 수 있다. 이와 관련하여, 또한 본 발명은 전염병(infectious disease), 예를 들어 바이러스 감염병의 치료 또는 예방에 이용하기 위하여 본 명세서에서 설명된 폴리펩타이드 세트와 관련된다. 병원체-암호화된 단백질의 특정한 예는 http://www.uniprot.org/uniprot/ 로부터 얻을 수 있고, HIV gp120 (Q78706); EBV LMP-2 (P13285); CMV gB (P06473); HBV HBS (Q9JG36); HCV E1 (C4B751); HCV E2 (Q6TRB1); 인간 아데노바이러스 C 혈청형 2 HAdV-2 (P03276)이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 예에서 정의된 폴리펩타이드 세트 또는 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드 중 하나를 암호화하는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 세트에 의해 해결되고, 바람직하게는 상기 핵산 분자 세트의 상기 핵산 분자 또는 핵산 분자들은 박테리아 또는 진핵 세포에 의한 암호화된 폴리펩타이드(들)의 분비를 조정하는 배출 신호(export signal)를 포함한다.
본 발명에 다른 핵산 분자 또는 핵산 분자의 세트의 예는 서열번호 135-150 및 196 중 어느 하나로 표시되는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명의 목적은 상기에서 정의된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 상기에서 정의된 핵산 분자의 세트의 핵산 분자들 중 어느 하나의 서열을 포함하는 벡터에 의해 해결된다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 핵산/핵산 세트 또는 상기 벡터를 포함하는 세포에 의해 해결된다.
또한, 본 발명의 목적은 상기에서 정의된 폴리펩타이드 세트 또는 상기에서 정의된 핵산 분자/핵산 분자의 세트 또는 상기에서 정의된 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 의해 해결되며, 바람직하게는 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기에서 정의된 폴리펩타이드 세트 및/또는 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 핵산 분자 세트 및/또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 키트에 의해 해결된다.
일 실시예에서, 상기 키트에 의해 포함된 상기 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드들은 하나의 약병(vial)에 들어있다.
한 바람직한 실시예에서, 상기 키트에 의해 포함된 상기 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드들은 분리된 약병(vial)들에 들어있다.
일 실시예에서, 상기 키트에 의해 포함된 상기 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드 중 하나 또는 그 이상은 동결건조되어있다.
일 실시예에서, 상기 키트에 의해 포함된 상기 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드 중 하나 또는 그 이상은 용액 안에 있다.
또한, 본 발명의 목적은
(i) 종양 또는 암 및/또는 동종 세포 또는 조직 이식을 겪음;
(ii) 자가면역 질환; 또는
(iii) 과민증 질환
를 앓고 있는 환자의 치료 방법에 의해 해결된다.
상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
- 폴리펩타이드 세트를 얻는 단계, 상기 폴리펩타이드 세트는 하기 제 1 폴리펩타이드 P1 및 제 2 폴리펩타이드 P2를 포함하는 폴리펩타이드 세트로,
상기 제 1 폴리펩타이드 P1은,
(i) 항원 A1에 특이적으로 결합하는 표적 모이어티 T1, 및
(ii) 기능성 도메인 F의 단편 F1
을 포함하고,
상기 단편 F1 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P1 단독으로는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하지 않고,
그리고
상기 제 2 폴리펩타이드 P2는,
(i) 항원 A2에 특이적으로 결합하는 표적 모이어티 T2, 상기 항원 A2는 특정 세포 타입 또는 세포 계통에 특이적인 세포 표면 분자가 있고, 및
(ii) 상기 기능성 도메인 F의 단편 F2
를 포함하고,
상기 단편 F2 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P2 단독으로는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하지 않으며,
상기 항원 A1은 상기 항원 A2와 다르고,
상기 폴리펩타이드 P1 및 상기 폴리펩타이드 P2는 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 기질, 더욱 구체적으로 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 세포가 존재하지 않는 경우 서로 연관되지 않고, 및
상기 폴리펩타이드 P1의 상기 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 상기 단편 F2의 이합체화 하에, 결과적인 이합체는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하고,
- 상기 폴리펩타이드 세트를 상기 환자에 투여하는 단계.
이러한 치료 방법에서, 상기 폴리펩타이드 세트는 상기 예에서 정의된 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 세포 또는 조직 이식을 겪는 환자의 치료를 위하여 상기에서 정의된 폴리펩타이드 세트를 이용하는 방법에 의해 해결된다.
또한, 본 발명의 목적은 상기에서 정의되고 설명된 질병 또는 질환을 앓고 있는 환자 또는 예를 들어 암을 앓고 있거나 및/또는 세포 또는 조직 이식을 겪는 환자의 치료를 위한 약물의 제조를 위하여 상기 예에서 정의된 단백질 세트를 이용함에 의해 해결된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)"는 30개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산의 직선 분자 사슬을 말한다. 선택적으로, 폴리펩타이드는 하나 또는 그 이상의 이황화 결합을 포함하거나 또는 화학적으로 변형되어 있을 수 있다. 게다가, 선택적으로 비-단백질성 요소 (예를 들어, 형광단, RNA-앱타머, DNA-앱타머, 또는 저분자)가 상기 아미노산의 직선 분자 사슬에 부착될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드는 알려진 어떤 방법에 의해서라도 생산될 수 있다. 폴리펩타이드는 예를 들어 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산으로부터 발현됨에 의해 생성될 수 있고, 또는 고체상 합성 방법에 의해 합성될 수 있고, 또는 기존의 분자의 접합 또는 결합에 의해, 예를 들어, 화학적 결합에 의해 생산될 수 있다.
용어 "폴리펩타이드 P1"은 (i) 표적 모이어티, 상기 표적 모이어티는 항원에 특이적으로 결합하고, 및 (ii) 기능성 도메인의 단편, 상기 단편 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P1 단독으로는 상기 기능성 도메인의 기능에 관하여 작용하지 않는 것을 포함하는 폴리펩타이드를 말한다. 용어 "폴리펩타이드 P2"는 (i) 표적 모이어티, 상기 표적 모이어티는 항원에 특이적으로 결합하고, 및 (ii) 기능성 도메인의 단편, 상기 단편 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P2 단독으로는 상기 기능성 도메인의 기능에 관하여 작용하지 않는 것을 포함하는 폴리펩타이드를 말한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "도메인(domain)"은 전체 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 부분의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산의 직선 분자 사슬을 말한다. 선택적으로, 도메인은 하나 또는 그 이상의 이황화 결합을 포함하거나 또는 화학적으로 변형되어 있을 수 있다. 게다가, 선택적으로 도메인은 비-단백질성 요소 (예를 들어, 형광단)를 포함할지도 모른다. 일 실시예에서, 그러나, 용어 "도메인"은 화학적으로 변형된 화합물을 포함하지 않거나 또는 비-단백질성 요소(들)을 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용된, "기능성 도메인(functional domain)"은 특정 결합 파트너 또는 항원에 특이적으로 결합, 특정 수용체의 특이적 활성, 유독성 효과의 중재, 또는 적절한 파장의 빛의 자극 하에 형광발광과 같은 특정 기능을 수행할 수 있는 도메인이다.
용어 "기능성 도메인 F"는 바람직하게는 비-단백질성의 화합물을 포함하는 것으로 되어 있다. 일 실시예에서, 그러나, 이것은 단백질성 화합물 또는 이의 기능성 부분을 말한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "도메인의 단편"은 도메인의 일부에 해당하는 아미노산의 직선 분자 사슬을 말하며, 전체 도메인을 말하는 것은 아니다. 선택적으로, 도메인의 단편은 하나 또는 그 이상의 이황화 결합을 포함하거나 또는 화학적으로 변형되어 있을 수 있다. 게다가, 선택적으로 도메인은 비-단백질성 요소 또는 이러한 비-단백질성 요소의 일부를 포함할지도 모른다.
용어 "단편 F1"은 기능성 도메인의 단편을 말한다. 용어 "단편 F2"는 기능성 도메인의 단편을 말한다.
본 명세서에서 사용된, 쌍으로 된 축약형 P1, P2; T1, T2; F1, F2; A1, A2; 및 I1, I2는 다른 폴리펩타이드, 표적 모이어티, 단편, 항원, 및 면역글로불린 모듈 각각을 지정하는 것으로 여겨진다. 이것은 제 1 폴리펩타이드, 제 2 폴리펩타이드; 제 1 표적 모이어티, 제 2 표적 모이어티; 제 1 단편, 제 2 단편; 제 1 항원, 제 2 항원; 및 제 1 면역글로불린, 제 2 면역글로불린과 각각 동의어이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "모이어티(moiety)"는 전체 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 일부의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산의 직선 분자 사슬을 말한다. 선택적으로, 모이어티는 하나 또는 그 이상의 이황화 결합을 포함하거나 또는 화학적으로 변형되어 있을 수 있다. 게다가, 선택적으로 모이어티는 비-단백질성 요소 (예를 들어, 올리고핵산염(oligonucleotide))를 포함할지도 모른다. 일 실시예에서, 그러나, 용어 "모이어티"는 화학적으로 변형된 화합물을 포함하지 않거나 또는 비-단백질성 요소(들)을 포함하지 않는다.
용어 "표적 모이어티 T1"은 항원, 예를 들어 항원 A1에 특이적으로 결합하는 모이어티를 말한다. 용어 "표적 모이어티 T2"는 항원, 예를 들어 항원 A2에 특이적으로 결합하는 모이어티를 말한다.
본 명세서에서 사용된, "링커(linker)"는 상기 폴리펩타이드의 두 부분 또는 상기 폴리펩타이드에 의해 구성되는 두 도메인을 연결하는 폴리펩타이드 내의 아미노산 서열이다.
본 발명에서 사용된, 용어 "핵산 분자(nucleic acid molecule)"는 30개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 직선 분자 사슬로 정의한다. 이 용어는 cDNA 또는 유전체 DNA(genomic DNA)와 같은 DNA 및 RNA를 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "구조체(consturct)"는 하나 또는 그 이상의 재조합 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산 분자를 말한다. 또한 이 용어는 재조합 뉴클레오티드 서열로부터 발현되는 폴리펩타이드 또는, 같은 단백질 내에서는 자연적으로 찾을 수 없는 둘 또는 그 이상의 아미노산 서열로 구성되는 인공적으로 만들어지거나 재조합 분자인 폴리펩타이드를 포함한다.
상호작용 파트너 또는 항원에 특이적으로 결합하거나 또는 상호작용 파트너 또는 항원과 특이적으로 결합하는 분자 또는 도메인이라는 맥락에서 본 발명에서 사용된, 용어 "~에 특이적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합한다"는 분자 또는 도메인이 상기 상호작용 파트너 또는 항원에 결합, 바람직하게는 비-공유 결합에 의해 결합하는 것, 또는 상기 상호작용 파트너 또는 항원에 결합, 바람직하게는 비-공유 결합에 의해 결합할 수 있는 것을 의미하나, 상호작용 파트너 또는 항원의 구조와 유사한 구조를 가지는 다른 어떤 상호작용 파트너 또는 항원과 교차반응하지 않거나 필수적으로 교차반응하지 않는 것을 의미한다.
항원 (예를 들어, 항원 A1 또는 A2)에 특이적으로 결합하는 표적 모이어티 (예를 들어, 표적 모이어티 T1 또는 T2)의 맥락에서, 용어 "~에 특이적으로 결합한다"는 상기 표적 모이어티가 상기 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 실제로 결합하는 상황을 말한다.
T 세포 인게이징(engaging) 도메인, NK 세포 인게이징(engaging) 도메인, 도메인 인게이징(engaging) 대식세포, 단핵구 인게이징(engaging) 도메인, 과립구 인게이징(engaging) 도메인, 도메인 인게이징(engaging) 호중성 과립구, 또는 도메인 인게이징(engaging) 활성된 호중성 과립구, 단핵구 및/또는 대식세포의 맥락에서, 용어 항원 또는 분자"에 특이적으로 결합하는" 또는 항원 또는 분자"에 특이적으로 결합한다"는 각각의 도메인이 상기 항원 또는 분자에 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 실제로 결합하는 상황을 나타내는 것으로 여겨진다.
항원, 분자, 화합물, 운반체 또는 친화성 태그"에 특이적으로 결합하는" 도메인이 되는 기능성 도메인의 맥락에서, 용어 "~에 특이적으로 결합하는"은 상기 기능성 도메인이 상기 항원, 분자, 화합물, 운반체 또는 친화성 태그에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 실제로 결합하는 상황을 나타내는 것으로 여겨진다.
기능성 도메인"에 의해 특이적으로 결합된" 독소, 형광단, 항원, 운반체 또는 친화성 태그의 맥락에서, 이것은 상기 기능성 도메인이 상기 독소, 형광단, 항원, 운반체 또는 친화성 태그에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 실제로 결합하는 상황을 나타내는 것으로 여겨진다.
본 명세서에서 사용된, 분자 또는 항원은 만약 이것이 하기 특정 세포 타입/하기 특정 세포 계통의 세포에 의해 발현되는 것이라면 "특정 세포 타입 또는 세포 계통에 특이적"이나, 다른 세포 타입 또는 다른 세포 계통의 세포에 의해 발현되는 것이라면 특이적이지 않다 (또는 무시할 수 있을 정도이다). 일부 실시예에서, 분자 또는 항원은 만약 그것이 하기 특정 세포 타입/하기 특정 세포 계통의 세포에 의해 발현되는 것이라면 "특정 세포 타입 또는 세포 계통에 특이적"이고, 및 상기 세포 타입/상기 세포 계통의 세포 외의 대부분의 다른 세포 타입 또는 다른 세포 계통의 세포는 상기 항원을 발현하지 않는 (또는 무시해도 될 정도만 발현하는) 반면, 상기 세포 타입/상기 세포 계통의 세포 외의 적지 않은 다른 세포 타입 또는 다른 세포 계통의 세포는 상기 항원을 발현하지 않는다. 용어 "특정 세포 타입 또는 세포 계통에 특이적"은 또한 상기 분자 또는 항원이 상기 세포 타입/상기 세포 계통의 세포에 의해, 다른 세포 타입/다른 세포 계통의 세포에서 또한 상기 분자의 적지만 탐지할 수 있는 발현이 있을지도 모른다는 의미에서, 다른 세포 타입/다른 세포 계통의 세포에 의할 때보다 더 높은 속도로 또는 더 높은 비율 또는 양으로 발현됨을 의미할 수 있다. 특정 세포 타입 또는 세포 계통에 대한 마커라는 맥락에서 본 명세서에서 사용된, 용어 "마커(marker)"는 상기에서 언급된 세포 타입 또는 세포 계통의 세포에 각각 특이적인 분자 또는 항원이라고 말할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "앱타머(aptamer)는 높은 친화도로 특이적인 표적 분자에 결합하는 올리고핵산 (예를 들어, RNA 또는 DNA), 또는 펩타이드성 또는 비-펩타이드성 분자를 포함하는 저분자 화합물(small compound)을 말한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "운반체(carrier molecule)"는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 세트를 투여하는 환자의 면역 체계에 의해 이물질로 인식거나, 또는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 세트가 투여되는 환자에 의해 면역 반응을 일으키지 않거나 또는 약하게 일으키는 분자 또는 분자의 일부를 말한다. 바람직하게는, 이러한 "운반체"는 또 다른 분자, 예를 들어 항체에 의해 결합되거나 또는 결합되어질 수 있다. 일부 실시예에서, "운반체"는 분자 또는 분자의 일부이고, 특정 실시예에서 운반체는 공유적으로 또는 비-공유적으로 제 2 분자 또는 제 2 분자의 일부, 예를 들어, 형광단 또는 독소(toxin)에 결합한다.
용어 "MHC"는 주조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex)를 말하며, 이는 항원이 T-세포에 제시하도록 요구되는 그리고 또한 급성 이식편거부반응에 원인이 되는 세포-표면 분자로 구성되는 분자의 그룹을 암호화하는 유전자 세트이다. 인간에서, MHC는 유전자 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-HQ,및 HLA-DR를 포함한다. 본 명세서에서, 이 용어는 주조직적합성 복합체의 유전자뿐만 아니라 이 유전자에 의해 암호화된 유전자 산물을 나타내기 위해 사용된다. 용어 "HLA"는 사람 백혈구 항원(Human Leukocyte Antigen)을 말한다. 본 명세서에서 사용된, "HLA"는 "MHC"의 인간형이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "대립유전자 변이체(allelic variant)"는 같은 염색체 위치(locus)를 차지하는 유전자의 둘 또는 그 이상의 여러 가지 형태의 어떤 것이라도 나타낸다. 예를 들어, HLA-A1, HLA-A2, 및 HLA-A3은 HLA-A의 세 개의 대립유전자 변이체이다. 용어 대립유전자 변이체는 또한 유전자의 대립유전자 변이체에 의해 암호화된 단백질을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "항원(antigen)"은 항체 또는 항체의 항원-결합 부분에 의해 특이적으로 결합 되거나 또는 결합 될 수 있는 것으로 알려진 분자를 말한다. 가장 넓은 의미에서, "항원 A1"은 상기에서 정의된 항원을 말한다. 가장 넓은 의미에서, "항원 A2"는 상기에서 정의된 항원을 의미한다. 명칭 "항원 A1" 및 "항원 A2"는 "항원 A1" 및 "항원 A2"의 구분을 허용하기 위해서 선택되었다. "MHC 항원"은 또한 주조직적합성 복합체에 달려 있는 분자인 항원이다. MHC 항원은 MHC 클래스 Ⅰ 항원 (인간에서, 항원 HLA-A, -B, 및 -C) 및 MHC 클래스 Ⅱ 항원 (인간에서, 항원 HLA-DP, -DQ, 및 -DR)을 포함한다. 세포는 "항원을 가진다" 또는 "세포 표면에서 항원을 가진다"는 구절은 세포가 상기 세포의 세포 표면에 나타나며 상기 세포의 외부로부터 온 항체에 접근가능한 항원을 발현하는 상황을 나타내는 것으로 여겨진다. 기질은 "표면에 항원을 가진다"는 구절은 상기 항원이 상기 기질의 표면에 나타나며 상기 기질에 적용되는 항체에 접근 가능한 상황을 나타내는 것으로 여겨진다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "악성 상태의 세포에 특이적인 항원"은 특정 세포 타입 (예를 들어, 악성 B-세포 종양 세포)의 악성 세포가 세포 표면에 가지나, 그러나 같은 세포 타입의 악성이 아닌 세포 (예를 들어, 비 악성 B-세포)는 세포 표면에 가지지 않는 (또는 무시해도 될 정도만 가지는) 항원을 말한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "악성 세포 타입에 특이적인 항원/분자"는 특정 세포 타입의 악성 세포 (예를 들어, 악성 B-세포 종양 세포)가 표면에 가지나, 그러나 같은 세포 타입의 악성이 아닌 세포 (예를 들어, 비 악성 B-세포) 또는 다른 세포 타입의 세포 (예를 들어, T-세포 또는 간세포(hepatocytes))는 세포 표면에 가지지 않는 (또는 무시해도 될 정도만 가지는) 항원/분자를 말한다. 일부 실시예에서, 용어 "악성 세포 타입에 특이적인 항원/분자"는 특정 세포 타입의 악성 세포 (예를 들어, 악성 B-세포 종양 세포)가 세포 표면에 가지나, 그러나 같은 세포 타입의 악성이 아닌 세포 (예를 들어, 비 악성 B-세포)는 세포 표면에 가지지 않으며 (또는 무시해도 될 정도만 가지며), 및 대부분의 다른 세포 타입의 세포는 가지지 않는 (또는 무시해도 될 정도만 가지는) 반면, 그 특정 세포 타입 외의 많지 않은 다른 세포 타입의 세포의 세포 표면에 가지는 항원/분자를 말한다. 용어 "악성 세포 타입에 특이적인 항원/분자"는 또한 상기 항원/분자가 특정 세포 타입의 상기 악성 세포에 의해, 악성이 아닌 같은 세포 타입의 세포에서도 상기 분자의 적지만 탐지할 수 있는 발현이 있을지도 모른다는 의미에서, 악성이 아닌 같은 세포 타입의 세포에 의할 때보다 더 높은 속도로 또는 더 높은 비율 또는 양으로 발현되는 것을 의미할지도 모른다. 특정 세포의 악성 상태 또는 악성 세포 타입에 대한 마커라는 맥락에서 본 명세서에서 사용된, 용어 "마커(marker)"는 상기에서 설명된 특정 세포의 악성 상태 또는 악성 세포 타입에 각각 특이적인 분자 또는 항원이라고 말할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "면역글로불린 도메인(immunoglobulin domain)"은 항체 사슬의 구형의 지역(region)으로 필수적으로 구성되는 도메인을 말한다. 면역글로불린 도메인은 그것이 항체 분자의 면역글로불린 폴드(fold) 특징을 보유한다는 점에서 특징지어진다. IgG, IgE, 또는 IgM과 같은 면역글로불린은 다양한 수의 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변부와 가변부를 포함한다. 각각의 경쇄 가변부(VL) 및 각각의 중쇄 가변부(VH)는 3 개의 초가변영역을 포함하며, "상보성 결정 영역(complementarity-determining regions)" 또는 "CDRs"로 불려진다. CDRs는 면역글로불린의 항원에의 결합에 주로 책임이 있다.
용어 "VH" 또는 "VH 도메인"은 교체 사용이 가능하며, 항체의 면역글로불린 중쇄의 가변부를 말한다. 용어 "VL" 또는 "VL 도메인"은 교체 사용이 가능하며, 항체의 면역글로불린 경쇄의 가변부를 말한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "면역글로불린 모듈(immunoglobulin module)"은 분자, 분자의 일부, 또는 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 둘 또는 그 이상의 면역글로불린 도메인으로 구성되는 분자 조립을 말하며, 항원에 결합할 수 있다. 바람직하게는, "면역글로불린 모듈"은 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 둘 또는 그 이상의 면역글로불린 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산의 직선 분자 사슬을 포함한다. 선택적으로, "면역글로불린 모듈"은 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 둘 또는 그 이상의 이황화 결합을 포함한다. 용어 "면역글로불린 모듈"에 포함되는 것은 항체의 "단일-사슬 가변 단편(scFv)"으로 구성되거나 또는 포함하는 분자 또는 분자의 일부이다. 용어 "면역글로불린 모듈"에 포함되는 것은 또한, 라마(llama) 항체, 낙타(camel) 항체, 또는 상어(shark) 항체의 VHH 도메인으로 구성되거나 또는 포함하는 분자 또는 분자의 일부이다.
용어 "면역글로불린 모듈 I1"은 VH 도메인에 연결된 VL 도메인을 포함하는 면역글로불린 모듈을 나타내기 위해 사용된다. 바람직하게는 상기 면역글로불린 모듈 I1의 상기 VL 도메인 및 상기 VH 도메인은 같은 항체로부터 유래된다. 바람직하게는, 상기 면역글로불린 모듈 I1의 상기 VL 도메인 및 상기 VH 도메인은 이합체를 형성한다. 바람직하게는, 상기 이합체는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 항원은, 예를 들어, 항원 A1일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 "면역글로불린 모듈 I1"은 항원, 예를 들어 항원 A1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 "단일-사슬 가변 단편(scFv)"을 포함한다.
용어 "면역글로불린 모듈 I2"는 VH 도메인에 연결된 VL 도메인을 포함하는 면역글로불린 모듈을 나타내기 위해 사용된다. 바람직하게는 상기 면역글로불린 모듈 I2의 상기 VL 도메인 및 상기 VH 도메인은 같은 항체로부터 유래된 것이다. 바람직하게는, 상기 면역글로불린 모듈 I2의 상기 VL 도메인 및 상기 VH 도메인은 이합체를 형성한다. 바람직하게는, 상기 이합체는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 항원은, 예를 들어, 항원 A2일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 "면역글로불린 모듈 I2"는 항원, 예를 들어 항원 A2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 "단일-사슬 가변 단편(scFv)"을 포함한다.
VH 도메인에 연결된 VL 도메인을 포함하는 면역글로불린 모듈의 구조 내에, VL 도메인은 상응하는 VH 도메인의 N- 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 통상의 기술자는 VH 및 VL 도메인의 어떤 배열이 특이적 단일-사슬 가변 단편(scFv) 도메인에 더욱 적합한지를 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "Fv" 및 "가변 단편"은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편인 항체의 단편을 말한다. 이 영역은 긴밀한, 비-공유적 결합에 의한 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변부의 이합체(VH-VL 이합체)로 구성된다. 이 배열에서, VH 및 VL 도메인은 함께 VH-VL 이합체의 표면에 항원 결합 특이성을 가지고 항원 결합 부위로 정의된다.
용어 "scFv", "단일 사슬 Fv", 및 "단일-사슬 가변 단편"은 교체 사용이 가능하며, 전통적인 두 사슬 항체의 중쇄(VH)의 가변부 및 경쇄(VL)의 가변부가 하나의 사슬을 형성하기 위해 결합되는 항체 또는 항체의 부분을 지정하는 것으로 여겨진다. 일반적으로, 링커는 두 사슬 사이에 삽입되어 활성 결합 부위의 적절한 폴딩(folding) 및 창조를 이끈다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "라마 항체(llama antibody)"는 라마(llama)로부터 유래된 항체 또는 항체의 일부를 말한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "낙타 항체(camel antibody)"는 낙타(camel)로부터 유래된 항체 또는 항체의 일부를 말한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "상어 항체(shark antibody)"는 상어(shark)로부터 유래된 항체 또는 항체의 일부를 말한다. 라마, 낙타 및 상어 항체는 (VH 및 VL 사슬보다도) 하나의 단일 도메인, VHH 에 의해 구축된 항원 결합 모이어티를 가진다.
본 명세서에서 사용된, 표현 "T 세포 인게이징(engaging) 도메인"은 T 세포의 세포 표면에 나타나는 항원에 특이적으로 결합하는 도메인을 말한다. 바람직하게는, 상기 T 세포 인게이징 도메인을 상기 항원에 결합하는 것은 상기 T 세포를 활성화시킨다. 유사하게, 표현 "NK 세포 인게이징(engaging) 도메인"은 자연 살해 세포(Natural Killer cells)의 세포 표면에 나타나는 항원에 특이적으로 결합하는 도메인을 말한다. 바람직하게는, 상기 NK 세포 인게이징 도메인의 상기 항원에의 결합은 상기 자연 살해 세포를 활성화시킨다. 표현 "도메인 인게이징 대식 세포( domain engaging macrophage cells)"는 대식 세포의 세포 표면에 나타나는 항원에 특이적으로 결합하는 도메인을 말한다. 바람직하게는, 상기 도메인 인게이징 대식 세포의 상기 항원에의 결합은 상기 대식 세포를 활성화시킨다. 표현 "단핵구 인게이징 도메인(monocyte engaging domain)"은 단핵구의 세포 표면에 나타나는 항원에 특이적으로 결합하는 도메인을 말한다. 바람직하게는, 상기 단핵구 인게이징 도메인의 상기 항원에의 결합은 상기 단핵구를 활성화시킨다. 표현 "과립구 인게이징 도메인(granulocyte engaging domain)"은 과립구의 세포 표면에 나타나는 항원에 특이적으로 결합하는 도메인을 말한다. 바람직하게는, 상기 과립구 인게이징 도메인의 상기 항원에의 결합은 상기 과립구를 활성화시킨다. 표현 "도메인 인게이징 호중성 과립구(domain engaging neutrophil granulocytes)"는 호중성 과립구의 세포 표면에 나타나는 항원에 특이적으로 결합하는 도메인을 말한다. 바람직하게는, 상기 도메인 인게이징 호중성 과립구의 상기 항원에의 결합은 상기 호중성 과립구를 활성화시킨다. 표현 "도메인 인게이징(engaging) 활성된(activated) 호중성 과립구, 단핵구 및/또는 대식세포"는 활성된 호중성 과립구, 단핵구 및/또는 대식세포의 세포 표면에 나타나는 항원에 특이적으로 결합하는 도메인을 말한다. 바람직하게는, 상기 도메인 인게이징 활성된 호중성 과립구, 단핵구 및/또는 대식세포의 상기 항원에의 결합은 상기 단핵구 및/또는 대식세포를 활성화시킨다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "생체발광을 조정할 수 있는 분자"는 적절한 기질(들)이 존재하는 경우 생체 발광을 일으키는 반응의 촉매 작용을 하는 효소적 활성을 갖는 분자 (또는 분자의 기능성 부분)를 말한다. 이 용어는 반딧불(firefly) 또는 가우시아(Gaussia)의 루시퍼라제와 같은 루시퍼라제(luciferases)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "GFP 변이체(GFP variant)"는 Aequorea victoria로부터의 녹색 형광 단백질의 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 가지며, 변화를 도입함에 의하여 형광이 더 세지거나 다른 색의 형광을 가져오는 분자를 말한다. 이 용어는 특히 YFP (노랑 형광 단백질), CFP (청록 형광 단백질), 비너스(Venus)(Nagai T et al., A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 2002 Jan;20(1):87-90), 세루리안(Cerulean)(S72A, Y145A 및 H148D의 치환을 한 강화된 CFP)를 포함하는 것으로 여겨진다.
"강화된 GFP(Enhanced GFP)" (및, 비슷하게, "강화된 YFP", "강화된 CFP")는 카인 등(Kain et al.)의 'Biotechniques 19(4):650-55 (1995)'에서 보고된 "인간화된(humanized)" GFP (YFP, CFP)를 말한다. "인간화된(Humanized)"이란 인간 세포에 단백질의 발현을 위한 코돈을 적합하게 만드는 GFP (YFP, CFP) 핵산서열에서 만들어지는 변화를 말한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "2분자 형광 보완 분자"는 그것들 단독으로는 형광이 아니나, 두 단편 사이에 헤테로이합화 반응에 의해 형성된 이합체는 형광을 낼 수 있는 두 단편으로서 제공될 수 있는 형광 분자를 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료 화합물(therapeutic compound)"은 질병 또는 질병 상태를 예방, 치료, 완화 또는 억제하기 위해 적합한 화합물을 말한다. 바람직하게는, "치료 화합물"은 세포에 들어갈 때 즉시 그 세포의 사멸을 일으킬 수 있는 화합물이다. 일부 실시예에서, 치료 화합물은 생명 유지에 필수적인 세포 구조체를 손상하거나 생명 유지에 필수적인 세포의 프로세스를 방해하는 화학적 또는 방사성 화합물일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "진단 화합물(diagnostic compound)"은 일반적인 감지 방법, 예를 들어 임상적으로 또는 생화학적이나 의학적 진단 실험실에서 사용되는 방법에 의해 감지될 수 있는 화합물, 예를 들어 형광 화합물, 방사성 화합물, 또는 생체발광을 조정하는 분자일 수 있다.
용어 "전구/선구 세포(progenitor/precursor cells)"는 출생 후 동물/인간에서 전형적으로 찾을 수 있는, 그리고 특정 세포 타입 또는 특정 세포 타입들로 분화하는 잠재력을 가지는 미숙한, 분화되지 않은 또는 부분적으로 분화된 세포를 나타내는 것으로 여겨진다. 용어 "종양의 전구/선구 세포"는 종양 세포를 일으키는 바뀐 성질(예를 들어, 그들의 증식 행위 또는 유전자 발현 패턴에 관한 것)을 가지는 전구/선구 세포를 나타낸다. 이러한 종양의 전구/선구 세포의 예는 예를 들면 백혈병 전구 또는 선구 세포이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "암(cancer)"은 악성 세포, 세포의 그룹, 또는 악성 종양 형성을 말한다. 이 용어는 암종(carcinomas), 육종(sarcomas), 림프종(lymphomas), 백혈병(leukemias), 생식 세포 종양(germ cell tumours), 및 아세포종(blastomas)을 포함하는 것으로 여겨진다. "암 세포(cancerous cell)"는 암으로부터 유래되거나 암의 일부인 세포를 말한다. 용어 "종양(tumour)"은 용어 "암"과 교환 사용이 가능하다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "혈액학적 종양(haematologic tumour)"은 혈액 또는 혈액 생성 체계 (예를 들어, 골수 세포, 혈액-생성 세포, 및 성숙 혈액 세포의 전구세포)의 암을 말한다. 일부 실시예에서, 용어 "혈액학적 종양"은 혈액학적 종양 형성(neoplasia)을 말한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "비혈액학적 종양(non-haematologic tumour)"은 혈액학적 종양이 아닌 종양을 말한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "동종 조직 또는 세포 이식을 받는 환자"는 환자가 다른 사람으로부터 얻은 이식 세포 또는 이식 조직을 받거나 받았던 상황을 말한다. 이 측면에 바람직한 상황은 불일치된 HLA 항원을 가지는 상황이다. 상당한 양의 투여된 폴리펩타이드의 맥락에서 본 명세서에서 사용된, 단위 "㎍/m2"는 상기 폴리펩타이드가 투여되는 환자의 체(body) 표면의 제곱 미터 당 폴리펩타이드의 특정량을 말한다 (펩타이드는 투여의 어떤 적절한 경로에 의해서든, 예를 들어 정맥 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다). 예를 들어, "투여된 폴리펩타이드의 양은 폴리펩타이드 P1에 대하여 하루에 50 ㎍/m2이다"라는 표현은 하루에 투여되는 폴리펩타이드 P1의 양이 폴리펩타이드 P1이 투여되는 환자의 체 표면의 제곱 미터 당 50 ㎍인 상황을 나타내는 것으로 여겨진다. 2 m2의 체 표면을 가지는 환자의 경우에, 이것은 폴리펩타이드 P1의 100 ㎍이 하루에 투여됨을 의미하는 것이다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 세트를 가지고 종래 기술의 상기에서 언급한 문제점들이 극복될 수 있고 상기에서 언급한 목적이 달성될 수 있다는 놀라운 발견을 하였다. 게다가, 본 발명자들은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 세트를 가지고, 두 항원의 특이적 조합을 가지는 세포를 높은 특이성을 가지고 확인할 수 있고 및/또는 제거할 수 있으며, 부작용을 줄일 수 있다는 놀라운 발견을 하였다.
본 발명의 조합 전략의 한 가지 이점은 미리 형성된 F 유닛(예를 들어 항-CD3 유닛)이 사용되지 않는다는 점이다. F1 및 CD3 (VH 및 VL)은 그 자체로는 이합체화하지 않는데, 그들의 이합체화를 안정화시키는 에이전트(agent)가 존재하는 경우에도 그러하고 (예를 들어, 도메인 F에 결합할 수 있는 항원, 예를 들어, CD3, HIS 또는 DIG), 및 그러므로 기능성 F 도메인을 초래하지 않는다 (예를 들어 T 세포를 자극시키지 않는다). 상보성 구조체 P1 및 P2가 주어진 세포의 표면에 동시에 결합하는 상황에서 독점적으로, 두 구성요소 F1 및 F2가 F 도메인을 재구성한다 (예를 들어, CD3 결합 부위). 그러므로, F 도메인의 기능 (예를 들어 T 세포 활성)은 정확하게 필요한 곳에서 일어나고 전신에서 일어나지 않는다. 이러한 이유로, 본 발명의 조합 전략이, 예를 들어 일반 2중특이성 항체 전략과 비교하여, 더 적은 독성 효과를 가진다는 것을 추정될 수 있다. 또한 이것은 덧붙인 예들에 의하여 입증이 되는데, 특히 HLA-A2 양성 마우스가 HLA-A2 활성 구조체들의 주입 후에 어떤 임상 효능도 겪지 않는, 동종 이식을 위한 in vivo 모델에 의하여 입증된다.
특히, 미리 정의된 항원 특징을 발현하는 세포를 태그하기 위하여, 두 단일-사슬 폴리펩타이드가 최종 이분 (2중-분자의) 구조체 (2중-분자/3중특이적 항체 구조체)의 일부로 디자인되었는데, 각각은 항원-결합 단일-사슬 가변 단편 (scFv) 및 항체의 가변 경쇄 (VL) 또는 가변 중쇄 (VH) 도메인을 포함한다. 이러한 두 하이브리드(hybrid) 단편들이 단일 세포의 표면에 그들 각각의 항원에 결합할 때, VL 및 VH 도메인은 원래의 항원 결합 부위를 재구성하기 위해 서로 상호작용하고, 그러므로 희망한 요구를 충족시킨다.
언급한 것처럼, 세포 표면에 두 개의 표적 항원의 결합이 기능적 헤테로이합체화를 위해 필수적이라는 점이 본 발명의 폴리펩타이드 세트의 하나의 이점이다. 두 상보성 파트의 자기-조립 및 항원에 오직 하나의 팔의 결합 후의 뒤따른 T 세포 자극은 제외될 수 있고, 그러므로 보강 논문 데이터는 스스로 VH 또는 VL 결합은 낮은 친화도를 가지고, VH/VL 헤테로이합체는 항원의 부재하에 급격히 분리되는 경향이 있음을 보여준다(Colman, 1987, Nature 326, 358-363; Amit, 1986, Science 233, 747-753; Law, 2002, Int Immunol 14, 389-400; Ueda, 1996, Nat Biotechnol 14, 1714-1718).
본 발명의 기술분야에서 잘 알려진 호모- 또는 헤테로-이합체화 도메인 (류신(leucine)-지퍼(zipper), Fc-도메인, 구멍에 손잡이(knob in the hole) 등등)과 대조하여, VH 및 HL 상호작용은 낮은 친화도계이다. 그러나, VH/VL 상호작용이 특이적 항원에 결합 후에 안정화될 수 있음이 나타났다. 이론에 의해 결합됨 없이, 본 발명에 따른 VH/VL 상호작용은 오직 두 단편이 동계의 표적 항원, 예를 들어 표적 세포의 표면에 미리 결합된 후에만 일어난다. 또한 이론에 의해 결합됨 없이, 정확한 동시 결합 후에, 구조체들은 항원과 3량체의 복합체를 형성할 수 있도록 하기 위하여 매우 밀접하게 가져가진다. 그러므로, 본 발명의 정확한 상보성 3중특이적 헤테로이합체는 도메인 F의 기능에 관하여 작용하며, 예를 들어, 항 CD3이 재구성된다면 종양 세포 파괴를 위해 T 세포를 모으고 자극시킨다.
발명 P1 및 P2의 구조체의 하나의 이점, 즉. 면역 반응을 유발하는 조합적 성격 외에, 본 발명의 맥락에서 분열된 F 도메인을 가지는 2중-분자 구조체, 예를 들어 scFv-항 CD3은 부정확한 효과를 나타내지 않는다는 놀라운 발견을 했다.
구체적으로 그 안에 폴리펩타이드 P1 및 P2로 구성된 본 발명에 따른 폴리펩타이드 세트는 더욱 안정적이고 및/또는 BiTE 구조체와 같은 종래의 2중특이적 구조체와 비교하여 향상된 저장 수명(shelf life) (특히 4℃에서)을 가진다는 추가적 이점을 가진다. 이러한 종래 2중특이적 구조체는 집합되는 경향이 있다 (특히 4℃에서).
본 발명 P1 및 P2의 폴리펩타이드, 더욱 구체적으로 그 안에 구성된 것으로서 F1 및 F2, 더욱 구체적으로 그 안에 구성될 수 있는 VH 및 VL는, 그들의 소수성 인터페이스(interface) 때문에, 알부민(albumin)과 결합할 수 있음이 예상된다. 이것은 향상된 보유 시간(retention time), 즉. 예를 들어 혈청 또는 혈액 샘플 같은 in vivo 뿐만 아니라 in vitro에서 더 긴 생체이용률을 이끈다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드 세트는 제 1 폴리펩타이드 P1 및 제 2 폴리펩타이드 P2로 구성된다. 제 1 폴리펩타이드 P1은 기능성 도메인 F의 제 1 단편 F1과 결합된 제 1 표적 모이어티 T1 (이것은 항원 A1에 특이적으로 결합 할 수 있다)으로 구성된다 (도 1A, 위 참고). 제 2 폴리펩타이드 P2는 기능성 도메인 F의 제 2 단편 F2에 결합된 제 2 표적 모이어티 T2 (이것은 항원 A2에 특이적으로 결합할 수 있다)로 구성된다(도 1A, 아래 참고). 중요하게도, 기능성 도메인의 단편 F1 및 F2 각각은 그들 자체로는 비-유독성이며, 두 폴리펩타이드 P1 및 P2 사이에 파트너링이 없다면 어떤 생물학적 기능도 행사할 수 없다. 폴리펩타이드 P1 및 P2가 동시에 항원 A1 및 A2를 발현하는 단일 세포 표면에 그들의 항원과 결합한 때, 기능성 도메인 F의 단편 F1 및 F2는 아주 가깝게 서로 가져와지고, 그들은 헤테로-이합체화하고, 그러므로 요구된 생물학적 기능을 상보한다 (도 1B 참고). 반면, 오직 항원 A1 (도 1C) 또는 오직 항원 A2 (도 1D)만을 발현하거나 항원 중 어느 것도 발현하지 않는 세포는 생물학적 기능의 상보를 일으킬 수 없다. 그러므로, 생물학적 기능은 폴리펩타이드 P1 및 P2 모두 세포의 동시 결합 하에 항원 A1 및 A2를 세포 표면에 모두 가지는 세포가 존재하는 경우에만 높은 특이성을 가지고 성취된다. 기능성 도메인 F의 본성에 의존하여, 항원 A1 및 A2를 모두 발현하는 세포의 특이적 확인/감지 또는 제거와 같은, 다른 목적이 성취될 수 있다.
대표적인 일 구체예에서, 이 독창적 원리는 종양 세포의 특이적 제거를 위해 적용된다:
새로운 조직병리학적 및 유동세포 분석법들은 단일 표면 마커에 의해서가 아닌, 이상 항원 조합/프로파일(profile)의 발현에 의해서 조혈 종양형성(haematopoietic neoplasias)과 암 및 다양한 다른 기원의 암 줄기 세포로 유명한 종양 세포가 감지될 수 있고 그들의 비-변형된 대응물로부터 구별할 수 있음을 나타내왔다. 그러므로, 단일 항원은 특정 종양 세포를 특이적으로 확인하기 위해 충분하지 않을 수 있는 반면, 두 항원의 특이적 조합은 어떤 다른 종류의 세포로부터 종양 세포를 구별하도록 허용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 세트는 세포 표면에 항원 CD33 및 CD19를 동시 발현함에 의하여 특징지어지는 암 세포를 특이적으로 제거하기 위하여 사용될 수 있다. 이 항원의 조합은 특정 타입의 급성 백혈병 세포에서 찾아지고, 이러한 세포를, 세포 표면에 CD33 또는 CD19을 가질지도 모르나 CD33 및 CD19를 동시에 가지지는 않는 어떤 다른 세포 (예를 들어, 비-악성 세포)로부터 구별한다(Ossenkoppele et al., Review of the relevance of aberrant antigen expression by flow cytometry in myeloid neoplasms. Br J Haematol 2011, 153(4):421-36).
세포 표면에 CD33 및 CD19를 모두 가지는 이러한 백혈병 세포를 특이적으로 제거하기 위하여, 제 1 폴리펩타이드 P1의 제 1 표적 모이어티 T1은 CD33에 특이적인 단일 사슬 가변 단편 (scFv)일 수 있다. 기능성 도메인 F의 단편 F1으로서, 항 CD3 항체의 경쇄 가변 도메인 VL이 선택될 수 있다. 제 2 폴리펩타이드 P2의 제 2 표적 모이어티 T2는 CD19에 특이적인 scFv일 수 있다. 기능성 도메인 F의 단편 F2로서, 항 CD3 항체의 중쇄 가변 도메인 VH이 선택될 수 있다. 항 CD3 항체의 경쇄 가변 도메인 VL 및 중쇄 가변 도메인 VH는 그들 자신 혼자에 의해서는 각각 비-유독성이다. 그들은 또한 폴리펩타이드 P1 및 P2 사이의 파트너링이 없다면 그들의 생물학적 기능 (즉, CD3 항원에 효과적으로 결합)을 행사할 수 없다.
세포 표면에 CD33 및 CD19를 모두 가지는 백혈병 세포의 존재하에, 폴리펩타이드 P1 및 P2는 그 세포에 동시에 결합한다. 결과로서, 기능성 그룹 F의 단편 F1 및 F2 (즉, 항-CD3 항체의 Fv 항 CD3 가변 도메인의 중쇄 및 경쇄)은 서로 매우 가깝게 가져와지고, 그들은 헤테로-이합체화되고, 그러므로 P1 및 P2의 이합체가 CD3에 특이적으로 결합할 수 있게 하는 요구된 생물학적 기능을 상보한다.
CD3은 T 세포의 표면에 나타나는 세포 표면 분자이다. 분자는 T 세포 신호 복합체의 일부이고, CD3-특이적 항체의 결합 후에 T 세포 표면에 CD3 분자의 결합은 T 세포의 활성을 이끈다. T 세포 표면에 CD3 항원을 이끄는 것에 의하여, 폴리펩타이드 P1 및 P2의 헤테로이합체는 T 세포를 모으고 활성화시킬 수 있다. 그 결과, 세포독성 T 세포 반응의 전형적인 주효 메카니즘이 유발되고, 이는 세포 용해를 이끈다: 세포독성 단백질 퍼포린(perforin), 그랜자임(granzyme), 및 그래누리신(granulysin)을 포함하는 용해 미립(lytic granule)의 방출. 퍼포린은 표적 세포의 세포막을 통해 그랜자임이 들어갈 수 있고 세포사멸을 유도할 수 있는 구멍(pore)을 형성한다. 이러한 효과는 세포 표면에 CD33 및 CD19 항원 모두를 가지는 백혈병 세포의 특이적 파괴를 이끈다.
백혈병 세포보다 다른 세포들은 세포 표면에 CD33 및 CD19 항원을 모두 가지지 않는다. 그러므로, 그들은 폴리펩타이드 P1 및 P2를 모을 수 없고, CD3 결합 능력의 상보 및 CD3 양성 T 림프구의 개입(engagement)이 이루어지지 않는다. 결과적으로, 백혈병 세포 외의 다른 세포들은 영향을 받지 않고, 정교한 특이성을 가지는 악성 세포의 파괴가 성취된다.
이것이 종래의 2중특이적 항체와 완전히 대조되는 점이다. T 세포를 모으고 CD33을 발현하는 세포에 특이성을 가지는 종래의 2중특이적 구조체은 모든 CD33 양성 세포의 파괴를 조정할 것이다. CD33은 많은 골수 세포 및 골수 간세포에 발현되는 세포골수계 마커이기 때문에, 이러한 세포의 파괴는 오래 지속되는 결여증(aplasia) 및 아마도 환자의 죽음을 초래할 것이다. T 세포를 모으고 CD19 양성 세포의 특이성을 가지는 종래의 2중특이성 구조체는 세포 표면에 CD19 항원을 가지는 모든 세포의 제거를 이끌 것이다. CD19는 B-림프구의 중요한 서브세트에 발현된다. 이러한 세포의 파괴는 면역 체계의 심각한 결함을 이끌 것이다. 그러므로, 표면에 CD33 및 CD19를 동시에 발현하는 백혈병 세포를 제거하는 것 외에, CD33 및 CD19에 특이성을 가지는 종래의 2중특이성 항체의 적용은 골수 세포 및 B-림프구의 상당한 서브세트의 제거를 이끌 것이다.
그러므로, 종래의 2중특이성 항체가 제거되어야 할 세포에 오직 하나의 항원을 인식하는 반면에, 본 발명에 따른 주효 활성은 확인/제거되어야 할 세포의 표면에 두 개의 특이적인 항원의 동시 인식을 요구한다. 결과적으로, 본 발명은 상당히 향상된 특이성을 달성하였고, 부작용을 줄였다.
본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 원리 안에서, 상기에서 설명한 대표적인 예의 다양한 변화가 가능함은 자명할 것이다.
예를 들어, 상기 대표 예에서 설명한 접근은 CD33 및 CD19 양성 급성 백혈병 세포 외의 다른 타입의 종양 세포의 확인/제거를 위해, 확인/제거 되어야 할 세포에 동시에 나타나나 다른 세포 타입에는 동시에 나타나지 않는 항원 A1 및 A2 각각에 특이적으로 결합하는 적절한 표적 모이어티 T1 및 T2를 간단히 선택함에 의하여 쉽게 적용될 수 있다.
상기에서 제시된 것처럼, 모든 암 세포 (뿐만 아니라 암 세포의 전구/선구 세포)가 다 그런 건 아니지만 많은 경우 그 자체가 정상 조직에 넓게 발현되는 많은 세포 표면 분자를 가지나, 그러나 비-생리적 조합에서 발현된다면 악성 표현형을 위해 나타내어진다. 예를 들어, CD34는 조혈 줄기 세포에 대한 마커이고, CD7은 임파상 세포의 서브세트에서 감지될 수 있다. 그러나, CD34 및 CD7의 조합은 악성 종양과 강하게 관련되어 있고, 두 항원의 이상 동시-발현은 급성 골수성 백혈병의 상당한 부분에서 감지될 수 있다 (Ossenkoppele et al., Review of the relevance of aberrant antigen expression by flow cytometry in myeloid neoplasms. Br J Haematol 2011, 153(4):421-36.). 유사하게, CD44 및 CD117의 이상 동시-발현은 난소 암 줄기 세포를 위해 설명되고, CD44 및 CD24는 췌장암 개시 세포를 위해, 그리고 EpCAM 및 CD44의 조합은 대장 및 유방 암 줄기 세포에서 설명된다 (Natasha Y. Frank, Tobias Schatton, Markus H. Frank; The therapeutic promise of the cancer stem cell concept. J Clin Invest. 2010; 120:41- 50). CD24 및 CD49f 뿐만 아니라 CD24 및 CD29의 발현은 유방 암종에 특이적인 것으로 밝혀졌다 (Vassilopoulos A et al. Identification and characterization of cancer initiating cells from BRCA1 related mammary tumours using markers for normal mammary stem cells. Int J Biol Sci 2008; 4:133-142). 게다가, 골수종에 대한 CD38 및 CD138과 같이, 높은 발현 항원 수준을 가지는 조합은 많은 악성종양을 위해 나타내진다.
상기에서 나타난 암-특이적 항원 조합 및 논문 데이터베이스의 자료에 덧붙여, 특이적 종양 세포에 동시에 발현되나 다른 세포에서는 발현되지 않는 두 항원의 추가적인 조합이 본 발명의 기술분야에 속하는 통상의 기술자에 의해 간단한 방법으로 이끌어내 질 수 있다.
첫 번째로, 통상의 기술자는 적절한 세포 타입 마커 또는 세포 계통 마커를 가지고 각각의 세포 타입의 악성 상태에 특이적인 항원을 결합함에 의해 특정 암에 특이적인 항원 조합에 도달할 수 있다. 예를 들어, 카보닉 안하이드라아제 IX (carbonic anhydrase IX)는 신장 세포 암종 및 신장 세포 암종의 전이와 강하게 관련이 있는 마커이고, 그러므로 신장 세포의 악성 상태에 대한 마커를 대표한다. 그러나, 이러한 세포막 위치 마커는 또한 위장관의 정상 세포에 발현한다. 아쿠아포린(aquaporin) 같은 신장 계통 마커를 제 2 항원으로 선택함에 의하여, 두 항원의 조합의 결과는 신장 세포 암종 세포 및 신장 세포 암종의 전이로부터 초래된 세포에 특이적이며, 반면 비-악성 신장 세포 (카보닉 안하이드라아제 IX가 발현하지 않음) 또는 위장관의 세포 (아쿠아포린이 발현하지 않음)는 선택된 항원의 쌍에 의해 특징지어지지 않는다.
다양한 세포 타입의 악성 상태에 대한 마커 및 많은 세포 타입 또는 세포 계통에 대한 마커에 대한 구체적인 정보는 데이터베이스 및 웹-기반 자료 (구체적으로 아래 참조)로부터 이용가능하거나 간단한 실험에 의해 얻어질 수 있다 (아래 참조).
세포의 악성 상태에 대한 마커의 예는 하기를 포함한다: 상피 세포 및 관형 유방 암종 세포에 대한 E-카데린(E-cadherin); 유상피 악성종양 및 난소 암 세포, 선암 세포 및 유방 암 세포에 대한 Ca-125; 유방 암 세포에 대한 Her-2/neu; 유방 암 세포에 대한 GCDFP(gross cystic disease fluid protein) (BRST-2 단백질); 폐 및 유방 암 세포에 대한 BCA-225 (글리코단백질에 관련된 유방 암종); 췌장, 담관 및 장관 암 세포에 대한 CA 19-9 (카보하이드레이트 항원 19-9); 직장 암 세포에 대한 CEA; gist (위장관 간질성 종양) 세포 ( 및 골수 및 비만 세포)에 대한 CD117 (c-kit); 리드-스텐버그(Reed-Sternberg) 세포 (및 Ki-1 활성된 T-세포 및 B-세포)를 위한 CD30; 상피 암 세포에 대한 상피 항원 (BER-EP4), 상피 세포막 항원, 및 상피 관련 항원 (MOC-31); 다양한 암의 세포에 대한 표피생장인자 수용체 (HER1); 다양한 암의 세포에 대한 혈소판유래 생장인자수용체 (PDGFR) 알파; 흑색종 세포에 대한 흑생종 연관 마커/Mart 1/Melan-A; 암 줄기 세포 개체군 및 다른 것들에 대한 CD133; 선암 세포에 대한 TAG 72 (종양 관련 gp 72).
세포/세포들의 악성 상태에 대한 마커에 대한 추가적인 예는 하기를 포함한다: EpCAM, CD19, HER-2, HER-3, HER-4, PSMA, MUC-1 (mucin), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, Lewis-Y, CD20, CD33, CD44v6, Wue-1, 플라즈마 세포 항원(Plasma Cell Antigen), (세포막-결합(membrane-bound)) IgE, MCSP (Melanoma Chondroitin Sulfate Proteoglycan), STEAP, 메조텔린(mesothelin), PSCA (Prostate Stem Cell Antigen), sTn (sialylated Tn antigen), FAP (fibroblast activation antigen), EGFRvIII, Igα, Igβ, MT-MMPs, 코라(Cora) 항원, EphA2, L6 및 CO-29, CCR5, βHCG, 강글리오사이드(ganglioside) GD3, 9-O-아세틸-GD3, GM2, 글로보(Globo) H, 푸코실(fucosyl) GM1, 폴리(Poly) SA, GD2, 카보안하이드라아제(Carboanhydrase) IX (MN/CA IX), 소닉 헤드게호그(Sonic Hedgehog) (Shh), CCR8, TNF-알파 전구체, A33 항원, Ly-6, 데스모글레인(desmoglein) 4, E-카데린(cadherin) 네오에피토프, 태아 아세틸콜린 수용체(Fetal Acetylcholine Receptor), CD25, MIS (Muellerian inhibitor Substance) 수용체 타입 II, 엔도시알린(endosialin), SAS, CD63, TF-항원, CD7, CD22, Igα(CD79a), Igβ(CD79b), G250, gp100, F19-항원 및 EphA2.
특정 세포 타입/세포 계통 또는 적은 세포 타입/세포 계통에 특이적인 항원에 대한 예는 하기를 포함한다 (세포 타입 마커/세포 계통 마커): 조혈 세포에 대한 CD45; 내피 세포, 줄기 세포, 및 간질 세포에 대한 CD34; 골수 세포에 대한 CD33; 플라스마 세포 및 상피 세포의 서브세트에 대한 CD138; 상피, 골수 및 리드-스텐버그(Reed-Sternberg) 세포에 대한 CD15; 외피 흉선 세포 및 랑게르한스(Langerhans) 세포에 대한; 흉선 세포, T-세포, 및 자연살생(NK) 세포에 대한 CD2; T-세포에 대한 CD3; 헬퍼 T-세포에 대한 CD4; T-세포, B-세포의 서브세트, 및 흉선 암종 세포에 대한 CD5; 세포독성 T-세포에 대한 CD8; B-세포에 대한 CD20; 활성된 B-세포에 대한 CD23; 내피 세포에 대한 CD31; T-세포, 골수 세포, B-세포의 서브세트, 대식세포(histiocytes), 및 플라즈마 세포에 대한 CD43; NK 세포에 대한 CD56; 신경 내분비 세포, 및 NK 세포에 대한 CD57; 대식 세포(macrophages)에 대한 CD68; B-세포 및 플라즈마 세포에 대한 CD79a; 내피 세포 계에 대한 CD146; 폐 세포에 대한 계면활성제 단백질(surfactant proteins); 신경 내분비 세포에 대한 시냅토파이신(synaptophysin), CD56 또는 CD57; 근육 세포에 대한 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nicotinic acetylcholine receptor) 또는 근육-특이적 키나아제 (MUSK); 근육 세포 및 신경 세포에 대한 전압-의존성 칼슘 채널 (P/Q-type) 또는 전압-의존성 칼륨 채널 (VGKC) 또는 N-메틸-D-아스파르트산(aspartate) 수용체 (NMDA); 갑상선에 대한 TSH (갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone)) 수용체; 근육 세포에 대한 암피파이신(amphiphysin); 간세포(hepatocytes)에 대한 HepPar-1; 뉴런 세포에 대한 강글리오사이드(ganglioside) GQ1B, GD3 또는 GM1; 조혈 세포 계의 세포에 대한 글라이코포린(glycophorin)-A.
본 발명의 목적을 위해 관심 있는 세포 타입 또는 세포 계통에 완벽한 특이성보다 적은 특이성을 가지는 항원에 의존하는 것이 이점이 될지도 모르는 상황이 있음을 주의하여야 한다. 예를 들어, 어느 다른 세포 타입/계통에서는 찾을 수 없으나 관심 있는 세포 타입/세포 계통에 독점적으로 찾을 수 있는 항원이 알려지지 않은 상황 또는 항원의 독점적 특이성을 확인하는 것이 가능하지 않은 상황에서, 관심 있는 세포 타입/세포 계통 외에 하나 또는 그 이상의 다른 세포 타입/세포 계통에 나타나는 항원 또한 고려될 수 있다. 유사한 고려는 세포의 악성 상태에 대한, 또는 두 항원의 조합의 특이성에 대한 마커를 위해 적용된다. 그러므로, 예를 들어 본 발명의 목적을 위해 관심 있는 세포뿐만 아니라 하나 또는 그 이상 (적은 수의) 다른 세포 타입/세포 계통/종류의 악성 세포에 특이적인 두 항원의 조합이 선택되는 상황이 있다.
두 번째로, 통상의 기술자는 간단한 실험에 의해 특정 암에 특이적인 항원 조합에 도달할 수 있다. 이것은 (1) 제거되어야 할 종양 세포에 표면 항원을 결정하는 단계, 및 (2) 이러한 종양 세포 표면 항원 사이에서 다른 세포 타입에 동시에 나타나지 않는 (또는, 일부 실시예에서, 아주 적은 다른 세포 타입에 나타나는) 두 항원을 확인하는 단계를 포함할지도 모른다.
종종, 실험은 제거되어야 할 종양 세포에 표면 항원을 결정하기 위해 필요하지 않을 수 있는데, 왜냐하면 그러한 정보는 이미 논문 데이터베이스로부터 각각의 타입의 암을 위해 이용이 가능하기 때문이다 (예를 들어, David J. Dabbs, Diagnostic immunohistochemistry, Churchill Livingstone, 3rd edition (2010); 또는 F Lin and J Prichard, Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently Asked Questions, Springer, New York, 1st edition (2011) 참조). 더욱 방대한 정보는 웹-기반 자료를 통해 이용이 가능하다. 예를 들어, 미국 국립 암 연구소 (NCI)의 암 게놈 아나토미 프로젝트 (Cancer Genome Anatomy Project( CGAP))는 다양한 정상의, 전암의, 그리고 암 세포의 유전자 발현 프로파일(profile)을 체계적으로 결정했다 (Strausberg RL. The Cancer Genome Anatomy Project: building a new information and technology platform for cancer research. In: Molecular Pathology of Early Cancer, 1999, (Srivastava, S., Henson, D.E., Gazdar, A., eds. IOS Press), pp. 365-370). CGAP 계획에 의해 생성된 자료는 무료로 이용가능하고(http://cgap.nci.nih.gov/), 모든 CGAP 자료 및 필요한 분석 도구에 대한 접근을 포함한다. 유사하게, 국립 암 연구소 (NCI)의 암 게놈 특징 계획 (Cancer Genome Characterization Initiative(CGCI))은 서로 다른 종양에 수반하는 유전적 변화를 특징 짓기 위한 도구에 집중했으며, 예를 들어 2세 시퀀싱을 이용한 진유전체(exome) 및 전사체(transcriptome) 분석을 포함하는 유전적 특징을 밝히는 방법이 있다. CGCI에 의해 생성된 데이터는 공개적으로 접근가능한 데이터베이스를 통해 이용가능하다(http://cgap.nci.nih.gov/cgci.html). 그러므로, 많은 경우에 관심 있는 종양 세포에 다양하게 알려진 세포 표면 단백질의 존재 또는 부재에 대한 정보는 이러한 공개적으로 접근가능한 데이터베이스를 확인함에 의해 간단히 얻을 수 있다. 필요하다면, 이 정보는 하기에 설명된 방법에 따라 종양 세포/종양의 면역세포화학적/면역조직화학적 분석에 의하여 두 번째 스텝에서 증명될 수 있다.
관심 있는 종양 세포/조직에 의해 발현되는 단백질에 대해 이용가능한 정보가 없다면, 통상의 기술자는 많은 항체로 면역세포화학적/면역조직화학적 방법에 의하여 종양 세포/조직에 항원을 특징 짓는 것을 수행할 수 있다(예를 들어, "Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently Asked Questions" by F Lin and J Prichard, Springer New York, 1st edition (2011); 또는 "Using Antibodies: A Laboratory Manual" by E Harlow and D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998) 참조). 요약하면, 종양으로부터 분리된 조직학적 준비 또는 세포는 잠재적인 표면 항원으로 향하는 제 1 항체와 배양하고, 세척 단계 후에, 제 1 항체의 Fc 도메인으로 향하는 제 2 항체를 배양한다. 이러한 제 2 항체는 표적 항원의 발현을 관찰하기 위하여 형광단(fluorophore) 또는 HRP (서양고추냉이 퍼옥시다아제)와 같은 효소로 표지된다. 세포 표면 항원의 높은 스루풋(throughput) 항원 프로파일링 목적을 위해 이용될 수 있는 많은 항체는 많은 제조업자로부터 상업적으로 이용가능하다.
게다가, 세포 표면 단백질 발현을 확인하고 분석하기 위한 높은 스루풋(throughput) 단백체 세포 특징에 특이적으로 전념하는 도구가 상업적으로 이용가능하며, 예를 들어 Becton의 FACS (Fluorescence-activated cell sorting)-기반 고 처리량 분석 기술 BD FACS™ CAP (Combinational Antibody Prifile), Dickinson & Company가 있다.
상기에서 설명한 면역세포화학적/면역조직화학적/단백체 분석 전에 (또는, 일부 상황에서, 대체되어) 종양 세포의 전체 유전체 유전자 발현 프로파일링 또는 관심 있는 종양 세포/조직에 의해 발현되는 단백질의 질량 분광계 분석이 이루어져야 될지도 모른다. 예를 들어, 종양 세포의 전체 유전체 유전자 발현 프로파일링은 다양한 세포 표면 분자의 발현을 확인하기 위하여 수행될 수 있고, 종양 세포의 세포 표면에 이러한 항원의 존재는 상기에서 설명된 항체-기반 염색 방법을 통해 확인될 수 있다.
(암) 세포의 표면 항원을 특징 짓기 위한 접근에 대한 추가적인 정보는 관련된 논문 데이터베이스에서 이용가능하다 (예를 들어, Zhou J, Belov L, Huang PY, Shin JS, Solomon MJ, Chapuis PH, Bokey L, Chan C, Clarke C, Clarke SJ, Christopherson RI. Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing. J Immunol Methods. 2010;355:40-51; 또는 Carter P, Smith L, Ryan M. Identification and validation of cell surface antigens for antibody targeting in oncology. Endocr Relat Cancer. 2004;11:659-87).
다음 단계에서, 통상의 기술자는 종양 세포의 세포 표면 항원 사이에서 다른 세포 타입에서는 동시에 발현되지 않는 두 항원의 조합을 확인할 것이다.
종종, 이미 논문 또는 공개적으로 이용가능한 데이터베이스는 다른 세포 타입의 항원의 존재 또는 부재에 대한 구체적인 정보를 제공할지도 모른다:
다양한 세포 타입에 있는 다양한 세포 표면 분자의 발현은 신체의 거의 모든 세포 타입의 면역표현형 및 유전자 발현 프로파일링에 의하여 수십 년 동안 연구자들에 의해 체계적으로 연구되어 왔다. 예를 들어, 360 이상의 "cluster of differentiation" 항원 (또는 CD 항원)의 발현에 대한 구체적인 정보는 논문 (예를 들어, "Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers" by Zola H, Swart B, Nicholson I, and Voss E; John Wiley & Sons, 1st ed. (2007)) 및 온라인 보관소(예를 들어, www.hcdm.org/MoleculeInformation/tabid/54/Default.aspx)에서 이용가능하며, 항원의 조직 분포 및 발현 수준에 대한 정보뿐만 아니라, 항원 활성 항체 및 이러한 항체가 결합하는 에피토프에 대한 정보를 포함한다.
게다가, 과학계에서 생산된 많은 양의 유전적 데이터에 접근을 제공하는 공개적으로 이용가능한 데이터베이스가 있다. 예를 들어, 미국의 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GEO (Gene Expression Omnibus) 플랫폼 (Barrett T et al., NCBI GEO: archive for functional genomics data sets--10 years on. Nucleic Acids Res. 2011;39(Database issue):D1005-10) 기록 보관소에 보관하고 마이크로어레이(microarray), 다음 세대 시퀀싱, 및 고-처리량 기능성 유전적 데이터의 다른 형태의 거대한 수집에 대한 접근을 주며, 웹-기반 인퍼페이스 및 이 정보에 쉬운 접근을 위한 적용을 추가적으로 제공한다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).
일단 관심 있는 종양 세포 외의 다른 세포 타입으로부터 부재되는 것으로 나타나는 두 항체의 쌍이 확인되면, 본 발명의 기술분야의 통상의 기술자는 쉽게 P1 및 P2-폴리펩타이드 구조체의 추가적 개발을 위한 항원 조합의 적합성을 입증할 수 있다. 두 항원의 확인된 조합이 정말로 종양 세포 외의 다른 세포 타입에 동시에 발현되지 않는다는 이러한 입증은 두 항원에 대한 항체로 여러 가지 세포 타입 및/또는 조직의 (최적으로 큰) 모음의 면역조직화학적/면역세포화학적 분석에 의하여 수행될 수 있다. 어떤 종류의 세포 및 조직이라도 ATCC (American Type Culture Collection)로부터, 병리과로부터, 그리고 대학과 연구기관에 관련된 조직 은행으로부터 얻어질 수 있다. 적절한 항원 조합은 종양 세포를 독점적으로 얼룩지게 하나, 건강한 조직 또는 건강한 세포에는 그렇지 않은 항체의 쌍으로 규정된다(즉, 세트의 두 항체 모두 종양 세포를 얼룩지게하나, 다른 조직/세포는 두 항체에 의해 얼룩지지 않는다).
많은 경우에 가장 높은 정도의 특이성 (바람직하게는 완벽한 특이성)은 물론 요구되는 반면, 낮은 정도의 특이성이 허용되어지는 상황이 있음을 주의하여야 한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 세트가 진단적 목적으로 사용되면, 다른 세포 타입 또는 조직과 어느 정도의 교차반응성이 허용가능할지도 모른다 (특히 고형 종양의 경우에, 추가적인 위치 정보는 종양 세포를 교차반응하는 세포로부터 구별하는 것을 도와주기 때문이다). 게다가, 폴리펩타이드 세트가 치료적 목적으로 사용되면, 다른 세포 타입 또는 조직과 어느 정도의 교차반응성이 허용가능할지도 모르는데, 이는 치료된 환자에서 병의 심각성 및 교차반응에 의해 영향 받는 세포 타입/조직에 달려 있다. 낮은 정도의 특이성이 허용가능한 다른 상황이 이식 환경의 맥락에서 일어날지도 모른다(하기 참고).
논문 또는 공개된 데이터베이스로부터 얻을 수 잇는 적절한 항원 조합에 대한 힌트가 없는 상황에서, 다른 세포 타입으로부터 종양 세포의 세포 표면 항원의 존재/부재는 간단한 실험에 의해 확인될 수 있다. 이것을 위하여, 상기에서 언급된 자료로부터 얻을 수 있는 다양한 세포 타입 및/또는 조직은 단백체 세포 특징화, 면역세포화학적/면역조직화학적 분석 및/또는 유전자 발현 프로파일링의 대상일 수 있다. (비-종양 세포/조직의 이러한 분석은 다양한 다른 치료적 또는 진단적 상황에 적용될 수 있는 본 발명에 따른 다양한 구조체의 디자인을 위해 사용될 수 있는 데이터를 얻기 위하여 오직 한번 수행되어야 한다는 것을 주의하여야 한다.) 관심 있는 종양 세포의 세포 표면 항원에 대한 정보와 얻어진 결과의 비교 하에, 관심 있는 종양 세포 외의 다른 어떤 세포에서도 나타나지 않는 두 항원의 조합은 쉽게 확인될 수 있다.
종양 세포에 특이적인 두 항원의 쌍을 확인하기 위한 유사한 체계적 접근이 또한 Balagurunathan의 최근 논문에서 설명되며, 이것은 전체 유전체 유전자 발현 프로파일링에 이어 면역조직화학이 뒤따름이 필요하다 (Yoganand Balagurunathan, Gene expression profiling-based identification of cell-surface targets for developing multimeric ligands in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther 2008;7. 3071-3080). DNA 마이크로어레이를 이용하여, 그 논문의 저자는 상당한 수의 췌장암 샘플 및 정상 조직 샘플을 위한 mRNA 유전자 발현 프로파일의 데이터베이스를 생성하였다. 세포-표면 분자를 암호화하는 유전자를 위한 발현 데이터는, 정상 세포에서는 아니나 종양 세포에서는 우선적으로 발현하는 유전자 조합을 확인하기 위하여 다변량 규칙-기반 계산적 접근에 의해 분석되었다. 종양-특이적 항원 조합을 구성하는 항원의 이상 공동-발현은 그 후 췌장 종양 조직에서 표준 면역조직화학적 기술 및 정상 조직 마이크로어레이를 이용하여 확인된다.
관심 있는 종양 세포에 특이적인 항원의 조합을 확인 및 입증하여, 폴리펩타이드 P1 및 폴리펩타이드 P2의 구조는 표준 단백질 공학 기술 및 분자생물학의 방법을 이용하여 제작될 수 있다 (예를 들어,G Howard and M Kaser, Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, CRC Press, 1st edition (2006); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001) 참고).
많은 세포 표면 분자를 위해, 특이적 단일클론 항체는 특징지어지고, 그러므로 쉽게 이용가능하다. 그러므로, 많은 경우에 통상의 기술자는 항원의 확인된 조합의 항원에 특이적인 단일클론 항체의 하이브리도마 세포(hybridoma cell)에 접근할 수 있다. 주어진 항원에 특이적인 많은 항체로부터 선택된 옵션을 가지고, 본 발명의 기술 분야의 통상의 기술자는 주효 세포로부터 항원 발현 세포의 거리를 최소화하기 위하여 세포막에 가까운 에피토프와 결합하는 활성 항체를 선택할지도 모른다(Bluemel C, Hausmann S, Fluhr P, Sriskandarajah M, Stallcup WB, Baeuerle PA, Kufer P. Epitope distance to the target cell membrane and antigen size determine the potency of T cell-mediated lysis by BiTE antibodies specific for a large melanoma surface antigen. Cancer Immunol Immunother. 2010 Aug;59(8):1197-209). 만약 그러한 항체가 항원의 확인된 조합의 하나 또는 두 항원에 대해 이용가능하지 않다면, 항원에 대한 단일클론 항체가 표준 기술에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, G Howard and M Kaser, Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, CRC Press, 1st edition (2006)). 게다가, 다양한 회사들은 주문 제작한 단일클론 항체 및 하이브리도마 세포의 생성을 위한 풀 서비스를 제공한다.
관심 있는 단일클론 항체의 다양한 도메인을 암호화하는 DNA 또는 mRNA는 PCR 증폭 또는 클로닝에 의해 하이브리도마(hybridoma)로부터 (Orlandi R, Gussow PT, Jones: Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A 1989, 86(10):3833-3837; Wang Z, Raifu M, Howard M, Smith L, Hansen D, Goldsby R, Ratner D: Universal PCR amplification of mouse immunoglobulin gene variable regions: the design of degenerate primers and an assessment of the effect of DNA polymerase 3' to 5'exonuclease activity. J Immunol Methods 2000, 233(1-2):167-177; Essono S, Frobert Y, Grassi J, Cremino C, Boquet D: A general method allowing the design of oligonucleotide primers to amplify the variable regions from immunoglobulin cDNA. J Immunol Methods 2003, 279:251-266; G Howard and M Kaser, Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, CRC Press, 1st edition (2006)) 또는 각각의 항체의 가변 단편의 DNA 서열을 포함하는 이미 설정된 벡터로부터 얻어질 수 있다. 종종, 서열은 많은 서열이 저장되어 있는 공개된 데이터베이스로부터 추출될 수 있고, 그 후 구조체는 다양한 상업적 서비스 제공자에 의해 제공된 것으로서 유전자 합성에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, Creative Biolabs, Shirley, USA).
폴리펩타이드 P1의 구조체를 형성하기 위하여, 확인된 항원 쌍의 제 1 항원에 특이적인 항체의 가변 단편 Fv를 암호화하는 서열 (또는, 선택적으로, 이 서열로부터 얻어진 단일 사슬 가변 단편의 서열)이 제 1 표적 모이어티 (T1)을 위해 이용되었고, 적절한 링커 (예를 들어, 12개 이하의 aa를 암호화함)를 통해 기능성 도메인의 제 1 단편 F1을 암호화하는 서열에 연결되었다(예를 들어, 항 CD3 항체의 VL 도메인). 이와 같이, 폴리펩타이드 P2의 구조체를 형성하기 위하여, 확인된 항원 쌍의 제 2 항원에 특이적인 항체의 가변 단편 Fv를 암호화하는 서열 (또는, 선택적으로, 그 서열로부터 얻어진 단일 사슬 가변 단편의 서열)은 제 2 표적 모이어티 (T2)를 위해 사용되었고, 적절한 링커를 통하여 기능성 도메인의 제 2 단편 F2를 암호화하는 서열과 연결되었다 (예를 들어, 항 CD3 항체의 VH 도메인).
본 발명에 따른 폴리펩타이드 P1 또는 P2의 어떤 구조체을 위해서라도, 구체적 필요에 구조체를 적응하게 하기 위하여 구조체를 형성하기 위해 사용되는 구조체 또는 서열의 변형이 고려되어진다. 예를 들어, 구조체는 인간에서 면역원성을 줄이거나 업애는 방법으로 변형될 수 있다. 서열이 쥣과의 항체 같은 비-인간 모체 항체로부터 얻은 경우, 서열의 변형이 수행될 수 있고, 이는 모체 항체의 항원-결합 성질을 보유하거나 또는 상당히 보유하는 동안에 인간에서 감소된 면역원성을 초래한다(통상의 기술자에게 "인간화(humanizing)" 항체/구조체로 알려져 있다).
본 명세서에서 설명된 실시예 및 입증에 부응하기 위하여 상기에서 설명된 절차 및 적용의 다양한 변형은 본 발명의 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에게 명백하다.
표적 모이어티 T1 및 T2가 특이적으로 결합하는 항원에 관한 입증에 더하여, 다양한 다른 변형이 가능하다. 예를 들어, 표적 모이어티 T1 및/또는 T2로서 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 대신에, 다른 타입의 1가 항체 또는 항체-유사 구조체가 이용될 수 있다. 예를 들어, 라마(llama), 낙타(camel) 또는 상어(shark) 항체로부터 유래된 항체/항체-유사 구조체가 이용될 수 있다. 라마, 낙타 및 상어 항체는 하나의 단일 도메인에 의해 만들어지는 항체 결합 모이어티를 가지기 때문에 (VH 및 VL 도메인 보다), 결과적인 폴리펩타이드 P1 또는 P2는 더욱 작고, 그러므로 종양 조직을 더욱 잘 관통할지도 모른다.
게다가, 많은 종양-관련 항원이 세포 표면-결합 수용체이기 때문에, 표적 모이어티 T1 및/또는 T2의 단일 사슬 Fv는 그러한 세포 표면-결합 수용체의 생체 또는 인공 리간드로 대체될 수 있다. 항체와 같이, 이러한 생체 또는 인공 리간드는 표적 수용체를 향한 훌륭한 특이성을 부여한다. 대안으로, 표적 모이어티 T1 및/또는 T2는 앱타머(aptamer)일 수 있다.
게다가, 항원에 대한 표적 모이어티의 결합 친화도를 강화시키기 위하여, 표적 모이어티는 다량체화될 수 있고 및/또는 글리코실레이션 또는 다른 타입의 번역 후 또는 화학적 변형에 의하여 바뀌거나, 또는 사이트 직접적 돌연변이 생성 또는 파지 디스플레이 선별 과정을 통해 적합하게 만들어질 수 있다.
게다가, 단편 F1 및 F2는 (즉, 상기-언급된 대표적 예에서 항 CD3 Fv의 VL 및 VH 단편) 다른 기능성 도메인 F의 단편으로 대체될 수 있고, 두 단편의 상보 하에 서로 다른 생물학적 효과를 초래한다. 항 CD56, 항 CD1a, 또는 항 CD16a의 단편을 이용함에 의하여, 자연살세포(natural killer cell)는 모집되고 활성 될 수 있다. 항 CD16의 단편을 이용함에 의하여, 자연살세포(natural killer cell), 호중성 다형핵 백혈구, 단핵구 및 대식세포는 모집되고 활성 될 수 있다. 항 CD32a, 항 CD32b, 항 CD89, 항 CD16a, 또는 항 CD64의 단편을 이용함에 의하여, 대식세포는 모집되고 활성 될 수 있다. 항 CD32a, 항 CD32b, 항CD64, 또는 항 CD89의 단편을 이용함에 의하여, 단핵구는 모집되고 활성 될 수 있다. 항 CD16b, 항 CD89, 항 CD32a, 항 CD32b, 또는 항 CD64의 단편을 이용함에 의하여, 과립구는 모집되고 활성 될 수 있다. 게다가, 항 CD3의 대안으로, T 세포는 또한 항 CD2, 항 CD5, 항 CD28, 또는 항 TCR (T 세포 수용체)의 단편을 이용함에 의하여 모집되고 활성 될 수 있다. 항체 결합을 통한 주효 세포의 모집 및 활성에 관한 추가적인 정보 또는 추가적인 옵션은 논문 데이터베이스로부터 이용가능하며, 예를 들면, "Bispecific Antibodies" by Roland E. Kontermann (editor), Springer Berlin Heidelberg; 1st Edition. (2011)가 있다.
추가적인 옵션은 두 단편의 상보 하에 주효 세포의 항원에 결합하는 기능성 도메인 F의 단편 F1 및 F2를 가지는 폴리펩타이드 P1 및 P2의 세트를 사용하는 것이며, 그러나 주효 세포의 이 항원에 상기 결합은 상기 주효 세포의 활성을 일으키지 않는다. 이러한 폴리펩타이드 세트 ("제 1 폴리펩타이드 세트")는 그 후 상보 하에 같은 주효 세포에 두 번째 서로 다른 항원에 결합하는 기능성 도메인 F의 단편을 가지는 제 2 폴리펩타이드 세트와 조합하여 사용되며(예를 들어, 환자에게 주입됨), 그러나 주효 세포의 이 항원에의 또 한번 상기 결합은 주효 세포의 활성을 일으키지 않는다. 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 세트가 결합하는 항원은 ,주효 세포에 두 항원 중 오직 하나의 결합은 주효 세포의 활성을 일으키지 않는 반면, 주효 세포에 두 항원에 동시 결합은 주효 세포의 활성을 이끈다는 방법으로 선택된다. 이것은 (1) 각각으로는 기능하지 않으나 제 2 항원의 상호 자극을 요구하는 주효 세포에의 항원이 이용될 수 있고, 및 (2) 특정 세포 (예를 들어, 암 세포)가 다른 세포로부터 분화되는 특이성에 영향을 미치는 서로 다른 항원의 수가 둘 (만약 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 세트가 각각 같은 표적 모이어티 T1 및 T2를 갖는 경우)로부터 4개의 서로 다른 항원 (만약 제 1 및 제 2 폴리펩타이드 세트가 공동으로 표적 모이어티를 가지지 않는 경우)까지 증가될 수 있다는 이점을 갖는다.
유사한 효과들이 서로 다른 표적 모이어티를 가지나 같은 기능성 도메인을 가지는 두 폴리펩타이드 세트로 달성될 수 있다: 이러한 폴리펩타이드 세트는 일반적으로 각각의 폴리펩타이드 세트 그 자체로 주효 세포를 활성화시키게 하는 주효 세포 항원에 직접적인 기능성 도메인을 가지기 위해 디자인된다. 그러나, 폴리펩타이드 세트는, 농도가 너무 낮아서 효과적인 주효 세포 활성을 일으킬 수 없는 농도에서 이용된다. 만약 두 폴리펩타이드 세트가 동시에 나타나면 (예를 들어, 환자에 동시에 투여함), 폴리펩타이드 세트 각각은 혼자서 주효 세포의 활성을 할 수 없고 (낮은 농도 때문이다), 반면 두 폴리펩타이드 세트 모두의 조합은 (두 폴리펩타이드 세트의 효과는 상승적으로 작동되기 때문에 그러므로 두 폴리펩타이드 세트에 의해 초래된 효과의 합계는 주효 세포를 활성화시키기에 충분하다) .
주효 세포의 모집/활성의 또 다른 대안으로서, "프리타겟팅(pretargeting)" 접근이 추구될 수 있는데, 이것은 2중특이성 항체 구조체를 위해 잘 설정되어 있다(Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Goldenberg DM, Chatal JF, Barbet J, Boerman O, Sharkey RM. Update Cancer Ther. 2007 Mar;2(1):19-31). 이것을 위하여, F1 및 F2는 항원, 운반체 (즉, 상기 폴리펩타이드가 투여되는 환자의 면역 체계에 의해 이물질로 인식되지 않는 분자/분자의 부분 또는 투여되는 환자에 의해 면역 반응이 없거나 아주 약하게 일으키는 분자) 또는 친화성 태그에 특이적인 항체의 VH 및 VL 단편에 의해 대체된다. 폴리펩타이드 P1 및 P2의 투여 후에 (또는 동시에), 상기 항원, 운반체 또는 친화성 태그와 연결된 치료적 또는 진단 화합물이 투여된다. 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 세포만이 폴리펩타이 P1 및 폴리펩타이드 P2에 의해 결합된다. 결과적으로, 오직 이러한 세포에서 기능 상보성이 상기 항원, 운반체 또는 친화성 태그를 통해 치료적 또는 진단 화합물을 모을 수 있는 결합 부위의 생성을 이끈다. 이러한 접근은 정확한 투여의 가능성과 결합한 표적 세포의 독점적인 어드레싱(addressing) 및 독소 또는 방사성 기질과 같은 치료 화합물 또는 진단 화합물의 적량을 허용하며, 반면 항원에 발현되지 않거나 오직 하나의 항원만 발현하는 세포는 영향을 받지 않는다.
적절한 운반체(carrier molecule)는 예를 들면 펩타이드 또는 카보하이드레이트(carbohydrate) 분자일 수 있다. 바람직하게는, 운반체는 젤라틴(gelatine), 덱스트란(dextrane), 또는 하이드록시에틸 녹말(hydroxyethyl starch)일 수 있고, 이것은 대사 작용으로 비활성인 흔한 혈장 증량제(plasma expander)이고, 혈액에 남아있고, 충분히 작다면 신장에서(renally) 제거된다. 그 대신에, 운반체는 인슐린, 사구체 정리(clearance)의 측정을 위한 클리닉에서 일상적으로 이용되는 대사 작용으로 비활성인 분자 (및, 이에 덧붙여, 이눌린(inulin)을 특이적으로 인식하는 항체가 존재함)일 수 있다.
적절한 친화성 태그는 예를 들어 Flag-태그, myc-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST)-태그, 헤마글루티닌(HA)-태그, 폴리히스티딘(His)-태그, 또는 말토오스 결합 단백질(MBP)-태그, 다이옥시제닌(DIG)-태그일 수 있다.
항원, 운반체 또는 친화성 태그와 연결된 치료 화합물은 예를 들어 방사성 화합물 또는 독소일 수 있다.
적절한 방사성 화합물은 예를 들면 90Y, 177Lu, 131I, 32P, 10B, 또는 213Bi를 포함하는 화합물이다. 방사성 화합물에 연결된 항원, 운반체 또는 친화성 태그의 제 1 및 제 2 항원을 모두 발현하는 세포로의 모집은 종양 부위에 방사능의 축적을 이끌고, 이는 종양 세포/조직의 특이적 파괴를 초래한다.
대안으로, 항원, 운반체 또는 친화성 태그에 연결된 치료 화합물은 예를 들어 세포 표면에 미리 결합함 없이 세포막을 통과할 수 없는 독소 화합물일 수 있다.
이러한 전제조건은 Clostridium perfringens, C. botulinum, C. difficile, B. anthracis 등의 많은 병원성 박테리아로부터 유래된 고전적인 AB-독소의 A 구성요소에 의해 만족된다. AB-독소는 내부의 세포 기능을 방해하는 두-구성요소 단백질 복합체이다. A 구성요소는 "활성" 구성요소 (즉, 이것은 세포막 통과 하에 세포를 죽인다)이고, 그러나 그 자체로는 세포막을 통과할 수 없다. B 구성요소는 그 자체로는 비-유독성의 "결합" 구성요소이고, 그러나 구성요소 A의 세포질 통과 및 흡수를 위해 필수적이다.
예를 들어, Bacillus anthracis 양성 항원 (positive antigen(PA))은 고전적인 유독성 B 구성요소이고, 실제 안트락스 엑소톡신 이디마 인자(anthrax exotoxins edema factor) 및 치사 인자(LF)의 흡수를 매개한다. PA-구성요소가 없는 LF는 LF 스스로는 세포막을 통과할 수 없고 그러므로 자신의 병원성을 수행할 수 없기 때문에 비-유독성이다(Pezard C, Berche P, Mock M. "Contribution of individual toxin components to virulence of Bacillus anthracis" 1991 Infect. Immun. 59 (10): 3472). 그러나, 세포 표면 분자와 결합되면, LF는 안으로 들어갈 수 있고 세포에 매우 유독성이다.
폴리펩타이드 P1 및 P2의 이합체화 하에, 기능성 도메인 F의 기능이 재구성된다. 재구성된 기능성 도메인과 독소가 연결된 항원, 운반체 또는 친화성 태그와의 상호작용을 통하여, 독소는 표적 세포의 세포막에 모집되고, 세포 안으로 포함되고, 세포를 죽인다.
이 원리는 통상의 기술자에 의해 본 발명의 목적에 쉽게 적용되는데, 왜냐하면 이것은 이미 주로 항체-유사 도메인 또는 생체 리간드인 표적 모이어티가 유독성 구성요소에 결합되는 곳인 면역독소(immunotoxin)로 불리는 것으로 널리 이용되기 때문이다(예를 들어, Immunotoxins for targeted cancer therapy. Kreitman RJ, AAPS J. 2006 Aug 18;8(3):E532-51 참고). 그 예로 디프테리아(diphtheria) 독소를 기반으로 한 면역독소 (예를 들어, 몇몇 T 세포 림프종의 치료를 위해 FDA의 승인을 받은 데니류킨 디프티톡스(Denileukin diftitox (U.S 상표명 Ontak)) 또는 B. anthracis 치사 인자를 기반으로 한 면역독소(Pastan I, Hassan R, FitzGerald DJ, Kreitman RJ (2007). "Immunotoxin treatment of cancer". Annu. Rev. Med. 58: 221- 37)를 포함한다.
AB-독소의 적절한 A 구성요소는 예를 들어 B. anthracis 이디마(edema) 인자, B. anthracis 치사 인자, C. perfringens 이오타(iota) 독소, C. botulinum C2 독소, C. difficile ADP-리보실트랜스퍼라아제(ribosyltransferase) C. diphtheriae 디프테리아 독성 단편 A일 수 있다.
그렇지 않으면, 치료 화합물은 예를 들어 세포 안으로 들어가면 유독성이며 세포 표면에 미리 결합함 없이 스스로 세포막을 통과할 수 있는 세포독성 화합물일 수 있다. 이 경우에, 치료 화합물이 연결되는 항원, 운반체 또는 친화성 태그는 그것이 세포막을 통과하고 세포 표면에 컨주게이트(conjugate)의 우선적인 결합 없이 세포로 들어가는 것으로부터 결과적인 컨주게이트 (즉, 항원/운반체/친화성 태그와 연결된 치료 화합물)를 막는 것으로 선택된다(적절한 운반체는 예를 들어 하이드록시에틸(hydroxyethyl) 녹말(starch) 운반체이다). 그러므로, 이러한 컨주게이트는 세포 표면에 우선적 결합 없이는 세포로 들어가지 않는다; 일단 이러한 컨주게이트가 세포 표면에 결합하면, 그러나, 이것은 세포 안으로 내포되고 유독성 화합물은 세포를 죽인다. 컨주게이트는, 본 발명의 폴리펩타이드 세트의 존재 하에 항원 A1 및 A2를 세포 표면에 동시에 모두 발현하는 세포에 모집되지 않는다면 세포에 결합하지 않는다. 이러한 세포는 폴리펩타이드 P1 및 P2 모두를 결합하고 모집하며, 그리고 재구성된 기능성 도메인은 항원/운반체/친화성 태그에 특이적으로 결합하고 모집하고, 이것은 결국 치료 화합물의 내포를 초래한다. 결과적으로, 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 세포의 특이적 사멸이 성취된다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 세포독성 화합물들은 예를 들어, 아우리스태틴(auristatin), 리신(ricin), 사포닌(saponin), 브리오딘(bryodin) 1, 보우가닌(bouganin), 겔로닌(gelonin), 포크위드 항바이러스단백질(pokeweed antiviral protein (PAP)), 항엽산제(antifolates), 일일초알칼로이드(vinca alkaloides), 안트라사이클린(anthracyclines), 칼리케아미신(calicheamicin), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 아브린(abrin), 모덱신(modeccin), 또는 리스테리오리신(Listeriolysin) O를 포함한다.
항원, 운반체 또는 친화성 태그와 연결된 진단 화합물은 예를 들어 방사성 화합물, 형광단(fluorophore), 또는 생체발광(bioluminescence)을 조정할 수 있는 화합물일 수 있다.
적절한 방사성 화합물은 예를 들어 99 mTc, 111In, 82Rb 또는 201Tl를 포함하는 화합물이다. 이러한 화합물들은 클리닉에서 잘 알려진 의학 이미징 절차에 의해 감지된다.
대안적으로, 형광 화합물은 진단 화합물로서 이용될지도 모르며, 예를 들어 GFP (녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)) 또는 GFP 변이체 (예를 들어, BFP (파랑 형광 단백질(blue fluorescent protein)), CFP (시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein)), 또는 YFP (노랑 형광 단백질(yellow fluorescent protein))), 또는 FITC (fluorescein isothiocyanate)와 같은 형광 저분자 화합물 또는 PE (피코에리트린(phycoerythrin)), 알렉사 플루오르 염료 (alexa fluor dyes (예를 들어, Molecular Probes사가 판매하는 알렉사플루오르488(AlexaFluor488) 및 관련 염료)) 또는 시아닌 염료(cyanine dyes (예를 들어, Cy3 (인도카보시아닌(Indocarbocyanine)) 또는 Cy5 (인도다이카보시아닌(Indodicarbocyanine)) 또는 관련 염료)가 있다.
대안적으로, 생체발광을 조정할 수 있는 화합물은 진단 화합물로서 이용될지도 모르며, 예를 들어 루시퍼라아제(luciferase), 그 예로 Gaussia 루시퍼라아제 (Chopra A. Gaussia princeps luciferase. In: Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD) [database online]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), NCBI; 2004-2012. Available from: http://micad.nih.gov.)가 있다. in vivo 이미징을 위한 이용이 잘 설립되어있다 (예를 들어, Santos EB et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nat Med. 2009 Mar;15(3):338-44. Epub 2009 Feb 15; 또는 Inoue Y et al. Gaussia luciferase for bioluminescence tumor monitoring in comparison with firefly luciferase. Mol Imaging. 2011 Oct 1;10(5):377-85. doi: 10.2310/7290.2010.00057. Epub 2011 Apr 26;를 참고하고, 자세한 정보는 아래를 참고하라).
게다가, 단편 F1 및 F2는 (즉, 상기 설명한 대표 예에서 항 CD3 Fv의 VL 및 VH 단편) 치료적 또는 진단 화합물에 특이적인 항체의 VL 및 VH 단편들로 대체될 수 있다(즉, 이 경우에 기능성 도메인 F는 치료적 또는 진단 화합물에 직접적으로 결합을 할 수 있다). 여기에서, "프리타겟팅(pretargeting)" 접근의 의미로 상기에서 설명한 동일한 치료적 및 진단 화합물들이 고려될 수 있다.
게다가, 단편 F1 및 F2는 (즉, 상기에서 설명한 대표적 예에서 항 CD3 Fv의 VL 및 VH 단편) 형광 또는 생체발광 화합물의 단편에 의해 대체될 수 있는데, 이것은 그 자체로는 생물학적 불활성이나, 두 단편의 연관 및 기능 상보성 하에 그들의 기능을 다시 얻으며 (즉, 형광 또는 생체발광을 조정하는 능력), 그러므로 항원 A1 및 A2 모두를 가지는 세포의 특이적 확인을 가능하게 한다.
관련하여 사용될 수 있는 많은 형광 분자들이 해당 기술분야에서 잘 알려져 있고 특징지어져 있으며, 이는 GFP (green fluorescent protein), GFP 유도체 (예를 들어, YFP (yellow fluorescent protein) 및 CFP (cyan fluorescent protein), 비너스(Venus) (Nagai T et al., A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 2002 Jan;20(1):87-90), 또는 세루리안(Cerulean) (S72A, Y145A 및 H148D 치환과 함께 강화된 CFP))를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 이러한 분자들을 위해, 분리된(split) 단편들이 2중분자 형광 상보성(bimolecular fluorescence complementation (BiFC))으로 불리는 과정 안에서 아주 가까운 상황에서 자기-조립하는 것으로 설명된다.
예를 들어, GFP, CFP, 비너스(Venus), M153T 치환된 비너스(Venus), 또는 세루리안(Cerulean)은 아미노산 155 이후로 분리될 수 있다 (즉, 예를 들어, 단편 F1은 GFP의 아미노산 1-155로 구성될 수 있고, 반면 단편 F2는 GFP의 아미노산 156-245로 구성될 수 있다, 또는 반대일 수도 있다). 대안적으로, YFP 또는 비너스(Venus)는 아미노산 173 이후로 분리될 수 있다. 분리된 GFP 및 분리된 GFP 변이체들에 대한 추가적인 자세한 정보는 Kerppola TK., Visualization of molecular interactions using bimolecular fluorescence complementation analysis: characteristics of protein fragment complementation. Chem Soc Rev. 2009;38:2876-86. 에서 찾을 수 있다.
생체발광을 조정하고 이와 관련해서 사용될 수 있는 분자의 예는 분열된 루시퍼라아제(luciferase)이다. 특히 적합한 것은 Gaussia princeps의 루시퍼라아제, 이것은 파랑 빛을 방출하는 반응에서 활성화되고 기질 강장동물 루시페린(luciferin) (코엘렌터라진(coelenterazine))의 산화를 촉매하기 위하여 공동인자(cofactor)를 필요로 하지 않는 것이고, 또는 Gaussia 루시퍼라아제의 유도체이다(Remy I and Michnick S, A highly sensitive protein-protein interaction assay based on Gaussia luciferase. Nature Methods - 3, 977 - 979 (2006)). 예를 들어, 단편 F1은 Gaussia 루시퍼라아제의 N-말단부터 Gly-93까지의 단편으로 구성되고, 반면 단편 F2는 Glu-94부터 Gaussia 루시퍼라아제의 C-말단까지의 단편으로 구성될 수 있으며, 또는 반대일 수도 있다 (Remy I and Michnick S, Nature Methods, 2006에서 자세한 정보 참고). in vivo 에서 Gaussia의 분리된 루시퍼라아제 시스템의 적용이 설립되어 왔으며(Luker et al., In vivo imaging of ligand receptor binding with Gaussia luciferase complementation. Nature Medicine 2011, doi:10.1038/nm.2590), 통상의 기술자에 의해 본 발명의 목적에 간단히 적용하기 위해 이용할 수 있다.
종양 병변(lesion)의 생체 내 이미징은 암 세포가 조직에 침투하는 경우, 및 치료를 위해 모든 변형된 세포의 완전한 제거가 전제조건인 경우에 탁월하게 중요한 것이다. 치료 부위에서 전이된 암 세포를 찾는 외과의는 표적 모이어티와 결합된 분리된 GFP 또는 분리된 GFP 유도체 및 다뤄지는 항원 프로파일(profile)을 비정상적으로 발현하는 세포의 감지를 위한 다중스펙트럼 형광 카메라 시스템을 돕는 레이저를 이용할지도 모르고, 이는 이미 일부 임상 셋팅에서 이용된 형광 또는 생체발광의 수술 중의 이용과 유사하다(van Dam GM et al., Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat Med. 2011 Sep 18;17(10):1315-9; Luker et al., In vivo imaging of ligand receptor binding with Gaussia luciferase complementation. Nature Medicine 2011, doi:10.1038/nm.2590).
상보적 분리된 루시퍼라아제의 감지를 위해, 루시페린(luciferin) 또는 코엘렌터라진(coelenterazine)일 수 있는 루시퍼라아제의 기질 응용은 필수적이다. 코엘렌터라진이 선호되는데, 왜냐하면 코엘렌터라진은 ATP와 독립적으로 빛을 방출하고, in vivo 이미징 및 in vivo 적용을 위해 잘 설립되어 있기 때문이다. 외과의는 암에 폴리펩타이드 P1 및 P2로 태그를 하고 코엘렌터라진을 비-독성인 양으로 정맥주사하여 암 세포를 시각화할 수 있을 것이다.
또 다른 대표적인 실시예에서, 본 발명의 원리는 조혈 종양을 앓고 있는 환자 및 다른 사람(제공자)로부터 건강한 조혈 세포의 이식을 받는 환자와 관련하여 적용된다. 여기에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 세트는 이식제공자로부터 건강한 조혈 세포의 이식 후에 이식받은 자의 남아있는 악성 조혈 세포의 특이적 제거 (또는 감지)를 위해 이용될 수 있다.
조혈 종양을 앓는 환자의 악성 조혈 세포를 파괴하기 위하여, 환자는 화학요법 및/또는 방사선 치료를 받을지도 모른다. 그 후에, 환자는 제공자로부터 건강한 조혈 세포의 이식을 받는다.
이식 거부 또는 대숙주성이식편병(graft versus host disease)의 위험을 최소화하기 위하여, 같은 MHC(주조직 적합성 복합체) 분자 세트를 가지고 있는 이식제공자로부터 조직/세포 (예를 들어, 골수)의 이식이 대개 바람직하다. 그러나, 종종 같은 MHC 분자 세트를 가진 제공자("HLA-동일 제공자")가 확인될 수 없다. 그러므로, MHC 변이체의 세트에서 하나 또는 둘의 미스매치가 있는 이식편, 세 개의 미스매치까지 가지는 비관련 제대혈, 또는 동일단배체의 이식의 이용이 증가하고 있다. 따라서, 수여자의 세포에 의해 발현되는 MHC 분자와 제공자의 세포에서 발현되는 MHC 분자의 세트 사이의 구별되는 최소한 하나의 차이점이 있는 것은 흔한 일이다.
본 발명의 대표적인 예에 따른 이식에서, 이식제공자의 세포들은 최소한 하나의 HLA 변이체와 관련하여 이식수여자의 세포와 구별되는 것을 이용한다. 이것은 이식받는자 세포의 세포표면에는 나타나나, 이식제공자 세포의 세포 표면에는 나타나지 않는 최소한 하나의 "구별되는 항원(distinguishing antigen)"이 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 만약 환자 (즉, 이식수여자)가 HLA-A2 양성이고, 반면 이식제공자는 HLA-A2 음성이라면, 구별되는 항원은 HLA-A2일 수 있다.
화학치료/방사선 치료에도 불구하고, 이식수여자(recipient)의 각각의 악성 조혈 세포들은 박멸을 피할지도 모른다. 살아있는 악성 조혈 세포는 이식수여자의 세포이기 때문에, 그들은 이식제공자 세포로부터 이식수여자 세포를 구분하는 구별되는 항원을 가진다. 동시에, 그들은 조혈 계통 기원의 세포이고, 그러므로 세포 표면에 그 세포 계통의 마커, 예를 들어 CD45를 가진다. 환자의 백혈병성 블라스트(blast) 및 다른 조혈 세포들은 구별되는 항원 (여기에서는 HLA-A2) 및 조혈 세포 계통의 마커 (여기에서는 CD45)를 동시에 나타내는 유일한 세포이다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드 세트는 특이적으로 이러한 세포들을 제거하기 위하여 이 사실을 이용한다.
이러한 목적 달성을 위하여, 제 1 폴리펩타이드 P1의 제 1 표적 모이어티 T1은 이식수여자 세포에만 오직 나타나는 구별되는 항원 (여기에서 HLA-A2)에 특이적인 scFv일 수 있다. 기능성 도메인 F의 단편 F1으로서, CD3ε-특이적 항체의 경쇄(VL)의 가변 부위가 선택될 수 있다. 제 2 폴리펩타이드 P2의 제 2 표적 모이어티 T2는 CD45에 특이적인 단일 사슬 가변 단편 (scFv)일 수 있다. 기능성 도메인 F의 단편 F2로서, 상기 CD3ε-특이적 항체의 중쇄 (VH)의 가변 부위가 선택될 수 있다. (물론, 단편 F1으로서 CD3ε-특이적 항체의 중쇄 (VH)의 가변 부위 및 단편 F2로서 상기 CD3ε-특이적 항체의 경쇄(VL)의 가변부위를 사용하는 것이 동일하게 가능하다. 본 발명의 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 명백한 것으로서, 이것은 일반적인 원리이고, 단편 F1 및 F2를 위해 사용되는 단편을 바꾸는 것은 일반적으로 가능하다.) VH의 부존재 하에 CD3ε를 모을 수 있는 CD3ε-특이적 항체의 VL도 아니고, 또는 VL의 부존재 하에 CD3ε를 모을 수 있는 CD3ε-특이적 항체도 아니다. 따라서, P1 또는 P2 둘다 그 자체로는 CD3ε의 결합이 가능하지 않다.
그러나, 만약 구별되는 항원 (예를 들어, HLA-A2) 및 CD45 항원이 하나의 단일 세포에 모두 존재한다면, 그들 각각의 항원에 결합은 두 폴리펩타이드 P1 및 P2가 매우 근접하도록 가져간다. 그 결과로서, 쌍이 아닌 VH 및 VL 도메인이 모아지고, 이는 폴리펩타이드 P1 및 P2의 헤테로이합체화를 초래하며, CD3ε에 결합할 수 있는 VH 및 VL 도메인으로부터 기능성 가변 항체 단편 Fv의 형성을 초래한다(도 2 참고).
그 결과, T 세포는 모집되고 CDε를 통하여 활성화되며, 세포 표면에 HLA-A2 및 CD45를 모두 가지는 세포는 세포독성 T 세포 반응에 의해 특이적으로 제거된다.
해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 원리 안에서, 이 대표적 예의 다양한 변형이 가능하다는 것을 이해한다.
예를 들어, 폴리펩타이드 P2 안에서, 조혈 세포 계통 마커 CD45를 인식하는 scFv 단편은 다른 세포 계통 또는 세포 타입의 마커를 인식하는 scFv 단편에 의해 대체될 수 있는데, 즉, 표적 모이어티 T2는 조혈 세포 계통과는 다른 세포 계통 또는 특정 세포 타입에 특이적인 항원과 특이적으로 결합하는 도메인일 수 있다(이와 관련하여 사용될 수 있는 다양한 세포 계통 마커 및 세포 타입 마커의 구체적인 리스트는 David J. Dabbs, Diagnostic immunohistochemistry, Churchill Livingstone, 3rd edition (2010); 또는 F Lin and J Prichard, Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently Asked Questions, Springer, New York, 1st edition (2011)를 참고하라). 대체가능한 세포 계통 마커/세포 타입 마커에 폴리펩타이드 세트를 적응시키기 위하여, 폴리펩타이드 P2의 표적 모이어티 T2를 요구되는 대체 세포 계통 마커/세포 타입 마커에 결합 특이성을 가지는 표적 모이어티로 대체하는 것으로 충분하다.
예를 들어, 전이성 신장 세포 암종(RCC)의 상황에서, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 신장 세포에 제한된 발현을 가지는 세포 표면 단백질에 대한 정보를 얻기 위해 위에서 인용한 데이터베이스를 찾아볼 수 있다. 많은 다른 분자들 중에, 통상의 기술자는 특정 멤버의 아쿠아포린 패밀리의 발현이 신장 세포 및 적혈구에 국한됨을 알 것이다. 이러한 정보를 얻고나서, 본 발명의 기술분야의 통상의 기술자는 CDε-특이적 항체의 중쇄 (VH)의 가변 부위와 결합되고 신장 세포 및 적혈구에 국한된 아쿠아포린 패밀리 멤버를 인식하는 폴리펩타이드 P2를 구성할 것이다. 신장 세포 암종을 겪는 환자가 HLA A2 양성이고 건강한 이식제공자의 신장 이식편은 HLA A2 음성인 경우에, 환자를 치료하는 임상의(clinician)는 두 구조체 (항-CD3(VH)에 결합된 항-아쿠아포린 및 상기 CDε-특이적 항체의 경쇄(VL)에 결합된 항-HLA A2)을 이용할 수 있다. 이러한 경우에, 상기 아쿠아포린 및 HLA A2를 동시에 발현하는 모든 세포는 T 세포에 의한 용해를 위해 태그될 것이고, 이것은 신장 세포 암종 및 전이성 조직이다. 건강한 이식제공자에 의해 제공된 신장 세포는 HLA A2 음성이고 공격받지 않을 것이다. 적혈구는 개체 발생 과정에 따라 HLA 발현이 느슨하고, 그러므로 표면에 HLA 분자를 가지지 않기 때문에, 그것은 많은 양의 아쿠아포린 발현에도 불구하고 남아있게 된다. 다시,말하면, 종래의, 아쿠아포린을 향하는 비-상보적 2중특이성 항체는 이식제공자 및 이식수여자의 모든 신장 세포뿐만 아니라 적혈구의 죽음을 매개할 것이다. HLA A2 양성 환자에서 HLA A2를 향하는 2중특이성 항체는 아마도 태아 상태(fetal)일 것인데, 왜냐하면 모든 이식수여자 세포는 HLA A2를 발현하는 적혈구를 제외하고 재표적된 T 세포에 의해 공격될 것이기 때문이다.
또 다른 예는 간세포 암종 (HCC)이다. 간세포(Hepatocyte)는 지질단백질의 트래피킹(trafficking)을 포함하는 많은 대사 과정에 크게 관련되어 있다. 이것 때문에, 간세포는 표면에 고 밀도 지질단백질 (HDL)을 위한 수용체를 발현한다 (스캐빈처 수용체 클래스 B 멤버 1, SCARB1). 종양 세포 표면에 SCARB1을 발현하고 전이되는 HCC를 앓는 HLA A2 양성 환자의 치료는 상기 CD3ε-특이적 항체의 중쇄 (VH)의 가변 부위에 결합된 SCARB1을 향하는 scFv 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 P2 구조체 및 폴리펩타이드 P1 (상기 CD3ε-특이적 항체의 경쇄 (VL)에 결합된 항-HLA A2 scFv) 및 건강한, HLA A2 음성 이식제공자의 간 세포의 이식에 의해 성취될 수 있다. 이러한 경우에, SCARB1 및 HLA A2를 모두 발현하는 모든 간세포 및 간세포-유도 악성 세포는 T 림프구에 의해 용해되기 위하여 태그될 것이다. HLA A2가 부족한 이식제공자의 간세포는 남아있을 것이며, 이는 HLA A2를 발현하는 정상적인 SCARB1 음성 이식제공자 세포도 마찬가지일 것이다. SCARB1 발현은 또한 부신에 스테로이드(steroid) 합성에 참여하는 세포로 보고되었기 때문에, 이러한 세포는 아마도 또한 다시 보내진 T 세포에 의해 파괴될 것이고, 이는 애디슨병(Addison's disease)를 초래한다.
특정 세포 타입 또는 세포 계통 또는 적은 세포 타입/계통에 특이적인 다양한 마커가 알려졌다 (예시 리스트는, 상기를 참고하라). 계통 마커, 분화 항원 및 조직 마커뿐만 아니라 그들의 조직 분포에 대한 더 많은 정보는 공개된 자료 (예를 들어, David J. Dabbs, Diagnostic immunohistochemistry, Churchill Livingstone, 3rd edition (2010); 또는 F Lin and J Prichard, Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently Asked Questions, Springer, New York, 1st edition (2011) 참고) 및 공개 데이터베이스 (예를 들어, the Gene Expression Atlas of the European Bioinformatics Institute (EBI), http://www.ebi.ac.uk/gxa/; 또는 the Gene Expression Omnibus (GEO) platform, 상기를 참고)로부터 쉽게 얻을 수 있다. 게다가, 이러한 마커들은 항원의 종양-특이적 조합의 확인을 위해 상기에서 설명한 방법과 유사한 방법을 이용하여 통상의 기술자에게 간단한 방법으로 확인되고 및/또는 입증될 수 있다.
어떠한 바람직한 실시예에서, 특정 세포 타입 또는 세포 계통에 완벽한 특이성보다 더 적은 특이성을 가지는 항원이 이용된다 (즉, 하나 이상, 그러나 바람직하게는 매우 적은 세포 타입 또는 세포 계통에 나타나는 항원이 이용된다). 일부 실시예에서, 다른 세포 타입/세포 계통에 의할 때보다 더 높은 속도 또는 더 높은 비율 또는 양으로 발현되는 상기 세포 타입/세포 계통에 의해 발현되는 항원이 이용되며, 같은 의미에서 다른 세포 타입/세포 계통에서 또한 상기 세포의 적지만 탐지가능한 발현이 있을 수 있다.
이식수여자 세포가 HLA 항원에 양성이고 이식제공자 세포가 이것에 대해 음성인 한, 이 개념은 상기 대표 예에서 이용된 HLA-A2 외에도 어떤 다른 HLA 단상형(haplotype)에도 적용될 수 있다. 가능한 HLA 항원은, 그 중에서도 HLA A1, HLA A2, HLA A3, HLA A25, HLA B7, HLA B8, HLA B35, HLA B44 및 HLA Cw3, HLA Cw4, HLA Cw6, HLA Cw7 을 포함한다. 대체적 HLA 항원에 폴리펩타이드 세트를 적응시키기 위하여, 폴리펩타이드 P1의 표적 모이어티 T1을 요구된 대체가능한 HLA 항원에 결합 특이성을 가지는 표적 모이어티로 대체하는 것으로 충분하다. 표적 모이어티 T1의 적절한 선택에 의하여, 이식제공자 세포를 특이적으로 제거하는 것도 물론 가능하다.
게다가, 조립 하에 CD3ε에 결합할 수 있는 도메인을 형성하는 VL 도메인 및 VH 도메인 (즉, 폴리펩타이드 P1 및 P2의 단편 F1 및 단편 F2 각각) 대신에, VL 도메인 및 VH 도메인이 조립 하에 결과적인 이합체에 다른 기능을 수여하는 도메인/단편과 대체될 수 있다. 이러한 측면에서, 두 세포 표면 항원의 특이적 조합에 의해 확인된 종양 세포의 제거/감지와 관련된 대표적 예를 위하여 상기에서 설명된 모든 변형이 동등하게 적용된다. 예를 들어, 조립 하에 상보된 기능성 도메인은 T 세포보다 다른 주효 세포의 결합/활성을 조정할지도 모르고, "프리타겟팅(pretargeting)" 접근에 적응될지도 모르며, 치료적 또는 진단 화합물을 결합할지도 모르고, 또는 생체발광을 조정할 수 있는 형광 분자/분자를 형성할지도 모른다.
종양 세포의 특이적 제거를 위한 본 발명의 원리의 적용과 관련하여 상기 대표적 예에서 설명된 단편 F1 및 F2의 선택을 위한 다양한 옵션 및 표적 모이어티 T1 또는 T2의 선택을 위한 다양한 옵션이 물론 같이 고려될 수 있다.
설명된 대표적 예 및 변형으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 상기에서 설명된 본 발명의 원리가 종양 세포 또는 이식 후에 남아있는 악성 이식수여자 세포의 매우 특이적인 확인/제거를 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 다른 타입의 세포로부터 구별되는 두 항원의 특이적 조합을 가지는 어떤 다른 타입의 세포의 확인/제거를 위해서라도 사용할 수 있음이 분명할 것이다.
이하, 도면을 설명한다:
도 1은 본 발명의 원리를 나타낸 도이다. 도 1A: 폴리펩타이드 P1 및 P2의 디자인 및 항원. 도 1B: 세포가 세포 표면에 항원 1 및 2를 발현하면, 폴리펩타이드 P1 및 폴리펩타이드 P2의 세포 표면의 동시 결합은 P1 및 P2를 가깝게 하고, 단편 F1 및 F2가 연관되고 상보성에 의해 도메인 F의 생물학적 기능의 회복을 일으킨다. 항원 A1 (도 1C) 또는 항원 A2(도 1D) 단독으로 세포 표면에 존재한다면, 생물학적 기능의 회복은 일어나지 않는다.
도 2는 미스매치된 HLA 항원과 함께하는 조혈 종양 형성을 위한 동종 이식에 있어서 본 발명의 대표적인 실시예를 나타낸 도이다. 이 상황에서, 이식대상자 HLA 일배체형(haplotype) (HLApatient) 및 조혈 계통 기원(CD45)의 이중 정보는 환자의 백혈병 아세포 및 다른 조혈세포에서 독점적으로 나타난다. 제 1 폴리펩타이드 P1은 환자의 HLA (표적 모이어티 T1) 에 대해 직접적인 항 CD3의 단일-사슬 가변 단편 항체(single-chain variable fragment antibody) 구조를 포함하며, 이는 VL 단편 (단편 F1)과 융합되어 있다. 제 2 폴리펩타이드 P2는 조혈 계통 마커 CD45 (표적 모이어티 T2)에 특이적인 단일-사슬 가변 단편 구조를 포함하며, 이는 항 CD3 Fv의 VH 스플릿-단편 (단편 F2)와 융합되어 있다.
CD45: 조혈 세포에 특이적인 항원. HLApatient: 환자 세포에 특이적인 HLA-항원, 즉, 환자 세포(= 세포 이식의 이식수여자의 세포) 표면에 존재하나, 기증자 세포 표면에는 존재하지 않는 인간 MHC의 대립유전자 변이체. αCD45 scFv: CD45에 특이적으로 결합하는 scFv. αHLApatient scFv: HLApatient에 특이적으로 결합하는 scFV. CD3(VH): CD3에 특이적으로 결합하는 항체의 면역글로불린 중쇄의 가변 부위. CD3(VL): CD3에 특이적으로 결합하는 항체의 면역글로불린 경쇄의 가변 부위.
αCD45 scFV 및 αHLApatient scFv 각각을 통한 두 구조의 CD45 및 HLApatient 항원을 가지는 세포와의 결합 하에, CD3(VH)과 CD3(VL)의 조립은 CD3에 특이적으로 결합하는 항체의 기능 상보성을 이끌고, 그러므로 세포 표면의 CD3 분자를 통해 T 세포의 특이적 모집 및 활성을 이끈다.
도 3은 도 4-9에 묘사된 실험에 사용된 구조를 나타낸 도이다. (구조 71은 myc 태그를 가지는 반면, 구조 85는 플래그 태그(Flag tag)를 가지고 있다는 사실에 의해 구조 85는 구조 71과 다르다.) VHCD3: 항-CD3 항체의 중쇄의 가변 부위; VLCD3: 항-CD3 항체의 경쇄의 가변 부위; VHA2: 항-HLA-A2 항체의 중쇄의 가변 부위; VLA2: 항-HLA-A2 항체의 경쇄의 가변 부위; VL45: 항-CD45 항체의 중쇄의 가변 부위; VH45: 항-CD45 항체의 경쇄의 가변 부위; L18, L7, L15, L6, L19: 18, 7, 15, 6, 19 아미노산 각각의 링커(linker).
도 4는 검정(assay) 시스템을 통제하기 위해 사용되는 대표적인 탠덤(tandem) 2중특이성 단일 사슬 scFv 구조를 나타낸다. 요약하면, CD3 및 HLA A2에 특이성을 가지는 2중특이성항체 구조는 U266, HLA A2 양성, CD45 양성 골수 세포계, 및 HLA A2 음성 T 세포 (말초혈액 단핵세포를 감소시키는 단핵구)의 공동배양에 바람직하게 적정되어지고, 및 T 세포에 의한 인터류킨 2의 생산이 결정된다. 상당한 T 세포 자극성 용량은 각각의 플래그(Flag) 또는 Myc-태그에 의해 구별되는 두 FvCD3-HLA-A2 구조 85 및 71을 위해 검출된다 (구조체의 도메인 구조는 도 3에서 볼 수 있다). HLA-A2-CD3 배열에서 2중특이성 탠덤(tandem) Fv 구조체는 덜 효과적이고, HLA-A2 또는 CD3을 지시하는 단일 사슬 구조체는 T 세포를 전혀 자극하지 않는다. 양성 대조군은 비특이적 PHA-L(phytohemagglutinin) 자극을 이용하여 수행하였다.
도 5는 본 발명에 따른 상보성 구조체 쌍이 이용되는 경우, 두 구조체 쌍 중 오직 하나가 독립적으로 이용되는 경우가 아닐 때, 정교하고 매우 특이적인 T 세포 자극 용량을 나타낸 도이다. 요약하면, VLCD3-scFvHLA-A2 (구조 42), VHCD3-scFvCD45(VL-VH) (구조 45) 및 VHCD3-scFvCD45(VH-VL) (구조 55)는 분리되어 적정되어지거나 또는 설명된 U266 및 T 세포의 공동배양에 구조체 42 및 45, 또는 42 및 55의 조합으로 적정되어진다. 높은 T 세포 자극 용량은 42/45 또는 42/55 조합이, 만약 이 구조체의 오직 하나만 분리되어 주어진다면, 미비한 활성을 가지는 것에서 증명된다. 이 결과는 FvCD3의 VL 및 VH 도메인이 T 세포를 모으는 기능을 재구성하거나 상보하기 위하여 협력해야 함을 보여준다. 중요하게도, scFvCD45 표적 모이어티는 (VL-VH)에서 (VH-VL) 배열로 바뀔 수 있는데, 이는 분명히 구조체의 모듈식 특성이 요구되는 특이성을 가지는 또 다른 표적 모이어티에 의해 표적 모이어티의 대체를 허용한다. 이 검정 시스템은 T 세포가 IL2를 생성하도록 자극하지 않는 단일 사실 구조체 CD45(VL-VH) 및 CD45(VH-VL)의 사용에 의해 통제된다.
도 6은 세 번의 경쟁 방해 실험의 첫 번째를 나타낸 도이다. 설명한 U266 및 T 세포를 공동배양하기 위해 2중특이성 탠덤(tandem) 구조 FvCD3-HLA-A2 (구조 71)이 주어졌고, 자극 기능은 T 림프구에 의한 유도된 IL2 생산을 통해 측정됐다. T 세포 자극 기능은 HLA A2 분자의 표적화 에피토프를 점유하는 단일 사슬 구조체에 의해 방해된다(구조 4, 농도 *100). HLA A2 또는 CD3 특이적 단일 사슬 구조체(구조 4 (농도 *100) 또는 구조 36 (농도 *9))에 의한 T 세포 고유의 자극 효과는 제외했다. PHA-L는 양성 대조군으로 이용했다.
도 7은 "트리도메인 구조체(tridomain constructs)"(즉, 본 발명에 따른 구조체)가 이합체화되기 위하여 그리고 T 세포를 모으는 기능을 상보하기 위하여 먼저 단일 세포 표면에 결합해야 한다는 경쟁 에피토프 방해 실험을 나타낸 도이다. 요약하면, 구조 42 및 45는 U266 세포 및 HLA-A2 음성 T 림프구의 공동 배양을 위해 주어지며, 자극 용량은 T 세포의 IL2 생산에 의해 측정되었다. 실험적 상황에서, HLA A2 또는 CD45 분자에 에피토프가 있는 곳이 구조 4 또는 46(두 구조 모두 농도 *100)에 의해 경쟁적으로 방해됐고, T 세포 자극 기능은 없어졌다. 이 결과는 두 각각의 "트리도메인 구조체"가 T 세포를 모으는 기능을 회복하거나 상보하기 위하여 세포 표면에 동시에 결합해야함을 분명하게 나타낸다. 각각의 구조(42, 45, 4, 46 및 36)의 고유의 자극 활성은 다른 농도를 사용함으로써 제외했다.
도 8은 구조체 42 및 55의 조합에 대한 도 7과 유사한 실험을 나타낸 도이다. 다시, 두 "트리도메인 구조체"의 조합의 T 세포 자극 용량은 HLA A2 또는 CD45 분자에 대한 항원 에피토프의 경쟁적 억제에 의해 제거되었다. 중요하게도, 이 결과는 표적화 모듈이 적절한 특이성을 가지는 또 다른 모듈에 의해 쉽게 대체될 수 있음을 다시 보여준다. 더욱 중요하게도, 구조체 42의 VL-VH-VL 배열 및 구조체 55의 VH-VH-VL 배열은 HLA A2 및 CD45 항원 모두를 발현하는 기질에 사전 결합 없이 호모- 또는 헤테로-이합체화 또는 구조체의 자기조립을 방해하였다.
도 9는 VLCD3-scFvHLA-A2 및 VHCD3-scFvCD45(VH-VL) 구조체("두 구조체")를 포함하는 샘플에서 HLA A2 음성 T 세포에 의한 U266 세포의 용해를 나타낸 도이다. 두 구조체 중 오직 하나만을 포함하는 대조군 샘플에서는 의미 있는 용해는 관찰되지 않았다.
도 10은 폴리펩타이드의 정확한 복원을 나타낸 도이다. 특이적 단일-사슬 가변 항체 단편 (scFv, VH-VL)이 CD3-특이적 항체의 가변 경쇄 (VL) 또는 가변 중쇄(VH) 도메인과 결합되어 이루어지는 각각의 두 분리된 폴리펩타이드 (P1 및 P2)의 표적 세포에 있는 그들 각각의 항원과의 결합은 VH/VL 헤테로이합체화 및 기능성 CD3 결합 부위의 형성으로 T 세포를 이끌 수 있도록 한다.
도 11은 CD3 VH/VL 이합체화가 T 세포를 모으고 이중-항원-제한되어 지는 것을 나타낸 도이다. 모두 HLA-A2-양성 및 CD45-양성인 U266 골수종(myeloma), 1차 T 세포 전-림프성 백혈병 (T-PLL), 및 THP-1 급성 골수성 백혈병 세포는 HLA-A2-음성 이식제공자 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 및 지시된 폴리펩타이드로 조사됐다. T-세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 인터류킨-2 (IL-2) 생산 (A) 및 표적 세포 용해 (B) 에 의해 측정되었다. 2중특이성 탠덤(tandem) scFv (CD3(VH-VL) - HLA-A2(VH-VL)) 항체가 양성 대조군으로 이용되었다. (C), 나타난 대로, THP-1 세포에서 폴리펩타이드의 결합은 scFvCD45 (왼쪽) 및 scFvHLA-A2 (오른쪽) 억제제 (표적 세포에서 각각의 항원 에피토프를 방해함)의 과잉에 의해 경쟁적으로 방해되었고, 및 이식제공자 PBMCs에 의한 활성 IL2 생산이 조사되었다. (D), 단일 또는 이중 항원 음성 세포주 RAJI 및 KMS-12-BM는 폴리펩타이드로 조사되었다. PHA-L은 PBMCs에 비특이성 자극 대조군으로 사용되었다.
도 12는 in vivo에서 조건부의 CD3VH/VL 상보성에 의한 표적화된 치료를 나타낸 도이다. (A), 5×106 THP-1 급성 백혈병 세포를 1.25×105 CMV-특이적, HLA-A2-음성 이식제공자 T 세포 및 지시된 폴리펩타이드 (0.5㎍)와 함께 복강 내 주사한 후의 마우스 (그룹 당 n = 6)의 생존 (종양 세포: T-세포 비율 = 40/1). (B), 이식제공자 T 세포 및 지시된 폴리펩타이드 (3 nM)와 함께 공동배양 한 후, HLA-A2/CD45 이중-양성 THP-1 및 CD45-양성이나 HLA-A2-음성인 바이스탠더 세포(bystander cells)에서 카스파제(Caspase) 3 활성은 in vitro에서 유동세포 계측법(flow cytometry)에 의해 측정되었다. 2중특이성 탠덤(tandem) scFv (CD3(VH-VL) - HLA-A2(VH-VL)) 항체는 양성 대조군으로 사용되었다.
도 13은 EGFR- 및 EpCAM-지시된 폴리펩타이드가 암종 세포 파괴를 위해 T 세포를 모으는 것을 나타낸 도이다. EGFR 및 EpCAM 이중-양성 인간 대장암 세포주 COLO-206F 및 흑색종(melanoma) 세포주 FM-55 (EGFR-양성이나 EpCAM-음성)는 지시된 EGFR (CD3(VH)-EGFR(VH-VL)) 및 EpCAM (CD3(VL)-EpCAM(VH-VL))에 특이적인 폴리펩타이드들의 존재 하에서 PBMCs로 조사되었다. T 세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 인터페론-γ(IFNγ) 생산 (A) 및 표적 세포에서 카스파제(caspase) 3의 활성 (B)에 의해 측정되었다.
도 14는 HLA-A2 및 CEA 지시된 폴리펩타이드들이 종양 세포 파괴를 위해 T 세포의 방향을 다시 바꾸는 것을 나타낸 도이다. 인간 대장암 세포주 COLO-206F, 흑색종 세포주 FM-55 및 난소암 세포주 OVCAR는 지시된 HLA-A2 (CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL)) 및 CEA (CD3(VH)-CEA(VH-VL))에 특이적인 폴리펩타이드들의 존재 하에 PBMCs로 조사된다. T 세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 IFNγ 생산에 의해 측정되었다. 샘플들이 run되고 두 번씩 분석되었다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 15는 HLA-A2 및 EGFR 지시된 폴리펩타이드들이 종양 세포 파괴를 위해 T 세포의 방향을 다시 바꾸는 것을 나타낸 도이다. 인간 대장암 세포주 COLO-206F, FM-55 및 OVCAR은 지시된 HLA-A2 (CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL)) 및 EGFR (CD3(VH)-EGFR(VH-VL))에 특이적인 폴리펩타이드들의 존재 하에 PBMCs로 조사되었다. T 세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 IFNγ 생산에 의해 측정되었다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 16은 HLA-A2 및 Her2 지시된 폴리펩타이드들이 종양 세포 파괴를 위해 T 세포의 방향을 다시 바꾸는 것을 나타낸 도이다. 인간 세포주 COLO-206F, FM-55 및 OVCAR은 지시된 HLA-A2 (CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL)) 및 Her2 (CD3(VH)-Her2(VH-VL))에 특이적인 폴리펩타이드들의 존재 하에 PBMCs로 조사되었다. T 세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 IFNγ 생산에 의해 측정되었다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 17은 CD45 및 HLA-A2 지시된 폴리펩타이드들이 종양 세포 파괴를 위해 T 세포의 방향을 다시 바꾸는 것을 나타낸 도이다. 이 실험에서 도 5, 7-9, 11, 12, 14-16에서 사용된 CD45 및 HLA-A2 폴리펩타이드들과 비교하여, 항-CD45 및 항-HLA-A2 표적 모이어티를 위한 분리된 항CD3 단편 (CD3(VH) 및 CD3(VL))은 교환된다. 인간 흑색종 세푸조 U266은 지시된 CD45 (CD3(VL)-CD45(VH-VL)) 및 HLA-A2 (CD3(VH)-HLA-A2(VH-VL))에 특이적인 폴리펩타이드들의 존재 하에 PBMCs로 조사되었다. T 세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 IFNγ 생산에 의해 측정되었다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 18은 EGFR 및 EpCAM 지시된 폴리펩타이드들이 종양 세포 파괴를 위해 T 세포의 방향을 다시 바꾸는 것을 나타낸 도이다. 인간 대장암 세포주 COLO-206F 및 CX-1 및 난소암 세포주 OVCAR은 지시된 EpCAM (CD3(VL)-EpCAM(VH-VL)) 및 EGFR (CD3(VH)-EGFR(VH-VL))에 특이적인 폴리펩타이드들의 존재 하에 PBMCs로 조사되었다. T 세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 IFNγ 생산에 의해 측정되었다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 19는 Her2 및 EpCAM 지시된 폴리펩타이드들이 종양 세포 파괴를 위해 T 세포의 방향을 다시 바꾸는 것을 나타낸 도이다. 인간 난소암 세포주 OVCAR은 지시된 EpCAM (CD3(VL)-EpCAM(VH-VL)) 및 Her2 (CD3(VH)-Her2(VH-VL))에 특이적인 폴리펩타이드들의 존재 하에 PBMCs로 조사되었다. T 세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 IFNγ 생산에 의해 측정되었다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 20은 CD45 및 CD138 지시된 폴리펩타이드들이 종양 세포 파괴를 위해 T 세포의 방향을 다시 바꾸는 것을 나타낸 도이다. 인간 골수종 세포주 AMO-1은 지시된 CD45 (CD3(VL)-CD45(VH-VL) 상부 패널, CD3(VH)-CD45(VH-VL) 하부 패널) 및 CD138 (CD3(VH)-CD138(VH-VL) 상부 패널, CD3(VL)-CD138(VH-VL) 하부 패널)에 특이적인 폴리펩타이드들의 존재 하에 PBMCs로 조사되었다. T 세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 IFNγ 생산에 의해 측정되었다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 21은 CD138과 함께 표적 단일 항원 (CD138) 지시된 폴리펩타이드들이 종양 세포 파괴를 위해 T 세포의 방향을 다시 바꾸는 것을 나타낸 도이다. 인간 골수종 세포주 AMO-1는 지시된 CD138 (CD3(VL)-CD138(VH-VL) 및 (CD3(VH)-CD138(VH-VL))에 특이적인 폴리펩타이드들의 존재 하에 PBMCs로 조사되었다. T 세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 IFNγ 생산에 의해 측정되었다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 22는 CD45와 함께 표적 단일 항원 (CD45) 지시된 폴리펩타이드들이 종양 세포 파괴를 위해 T 세포의 방향을 다시 바꾸는 것을 나타낸 도이다. 인간 골수종 세포주 AMO-1 및 U266는 지시된 CD45 (CD3(VL)-CD45(VH-VL) 및 (CD3(VH)-CD45(VH-VL))에 특이적인 폴리펩타이드들의 존재 하에 PBMCs로 조사되었다. T 세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 IFNγ 생산에 의해 측정되었다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 23은 세포 표면에 단일 항원을 향하고, 항원에 두 다른 에피토프 (상부) 또는 같은 에피토프 (하부)를 표적하는 두 폴리펩타이드의 정확한 복원을 나타낸 도이다. 두 개의 분리된 폴리펩타이드들 (P1 및 P2)의 그들 각각의 에피토프와의 결합은, 같은 항원에서, 표적 세포에서 나타난다. 두 개의 다른 에피토프를 표적하기 위하여, 각 폴리펩타이드의 표적 모이어티는 특이적 단일-사슬 가변 항체 단편 (scFv)로 구성된다. 같은 에피토프를 표적하기 위하여, 각 폴리펩타이드의 표적 모이어티는 같은 단일-사슬 가변 항체 단편 (scFv)로 구성된다. 표적 모이어티들은 펩타이드 링커를 통하여 CD3-특이적 항체의 가변 경쇄 (VL) 또는 가변 중쇄 도메인 (VH)과 연결되고, VH/VL 이합체화 및 기능성 CD3 결합 부위의 형성 (기능성 도메인)이 T 세포를 모으는 것을 가능하게 한다.
도 24는 폴리펩타이드 파트의 키트로 표적 세포를 죽이기 위한 다른 주효 방법들을 이용하기 위한 가능성을 나타낸 도이다. 이것을 위하여, 항-CD3 모듈 (F1 및 F2)는 항-HIS (헥사-히스티딘)에 의해 대체되고 그것은, 폴리펩타이드 1 및 2의 동시 결합 후에, 헥사-히스티딘 결합 부위를 상보하고, 그러므로 히스티딘 표지된 페이로드(payload)를 결합한다 (예를 들어, HIS-태그된 독소). 폴리펩타이드 P1의 표적 모이어티 T1 (VH-VL)는 HLA-A2에 특이적으로 결합하고, 폴리펩타이드 P2의 표적 모이어티 T2 (VH-VL)는 CD45에 특이적으로 결합한다. 폴리펩타이드 P1의 단편 F1은 헥사히스티딘-태그에 대한 항체의 VH 도메인을 포함하고, 폴리펩타이드 P2의 단편 F2는 같은 항체의 VL 도메인을 포함한다. 인간 골수성 백혈병 세포주 THP-1은 히스티딘(His) 태그된 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 이오타(Iota) 독소 구성요소 Ia 0.01㎍/ml로 지시된 폴리펩타이드들과 조합하여조사되었다. 배양 58시간 후에 세포 생존능력이 alamarBlue® 시험을 이용하여 측정되었다. 그 결과는 조합으로 조사되었을 때 시험의 백그라운드(background)에 비해 생존능력의 감소를 나타내었으나, 각각의 폴리펩타이드를 이용하였을 때는 그렇지 않았다. 대조군 THP-1 세포는 배양에서 독소 없이 동시에 키워졌다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 25는 His-태그에 대한 분리된 항체를 포함하는 HLA-A2 및 CD45 지시된 폴리펩타이드들이, 히스티딘(His) 태그된 Shiga 독소 서브유닛 A를 0.01㎍/ml의 농도에서 이용하여 종양 세포를 죽이는 것을 나타낸 도이다. 같은 실험적 설정이 도 F24에서처럼 이용되었다.
도 26은 His-태그에 대한 분리된 항체를 포함하는 HLA-A2 및 CD45 지시된 폴리펩타이드들이, 히스티딘(His) 태그된 Shiga 독소 서브유닛 A를 0.1㎍/ml의 농도에서 이용하여 종양 세포를 죽이는 것을 나타낸 도이다. 같은 실험적 설정이 도 F24/25에서처럼 이용되었다.
도 27은 F1 및 F2가 다이옥시제닌 (aDig)에 특이적인 항체의 VH 및 HL인 것인 기능성 도메인 F를 포함하는 EGFR 및 EpCAM 지시된 폴리펩타이드들이, 다이옥시제닌(digoxigenin) 표지된 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 분자를 이용하여 종양 세포를 표시하는 것을 나타낸 도이다. 폴리펩타이드 P1의 표적 모이어티 T1 (VH-VL)은 EGFR에 특이적으로 결합하고, 폴리펩타이드 P2의 표적 모이어티 T2 (VH-VL)는 EpCAM에 특이적으로 결합한다. 폴리펩타이드 P1의 단편 F1은 다이옥시제닌(digoxigein)에 대한 항체의 VH 도메인을 포함하고, 폴리펩타이드 P2의 단편 F2는 같은 항체의 VL 도메인을 포함한다. 인간 대장암 세포주 Colo-206F는 지시된 폴리펩타이드들로 먼저 조사되고 그 다음에 다이옥시제닌 표지된 HRP로 조사되었다. 샘플들은 (Invitrogen™, ELISA Kit)를 이용하여 분석되었고, 흡광도는 BioRAD-마이크로 플레이트 리더로 관찰했다. 분석을 위하여 크로모겐(chromogen) 블랭크(blank) 샘플 (다이옥시제닌-HRP가 없음)을 0으로 설정했다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 28은 CD45 및 HLA-CW6 지시된 폴리펩타이드들이 환자 세포 파괴를 위해 T 세포의 방향을 다시 바꾸는 것을 나타낸 도이다. 알려진 HLA-단상형(haplotype)과 함께 1차 환자 세포가 이용되었다. A51 = MDS (골수이형성 증후군) 환자의 세포, HLA-Cw6 단상형에 대해 동형. A49 = 동종 골수 이식 후 환자의 세포, HLA-Cw6 단상형에 대해 이형. 환자 세포는 건강한 PBMCs와 30분 동안 배양되었는데, 지시된 CD45 (CD3(VL)-CD45(VH-VL) 및 HLA-Cw6 (CD3(VH)-HLA-CW6(VH-VL))에 특이적인 폴리펩타이드의 존재 하에 배양되었다. T 세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 IFNγ 생산에 의해 측정되었다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 29는 EGFR 및 EpCAM 지시된 폴리펩타이드들이 1차 암 환자 세포 파괴를 위하여 T 세포의 방향을 다시 바꾸는 것을 나타낸 도이다. A44 종양 세포는 전이성 췌장암 48세 남성 환자의 악성 복수(ascite)로부터 수집되었다. 환자 종양 세포는 환자 자신의 PBMCs (정맥 절개술에 의해 수집)와 30분 동안 배양되었고, 지시된 EpCAM (CD3(VL)-EpCAM(VH-VL) 및 EGFR (CD3(VH)-EGFR(VH-VL))에 특이적인 폴리펩타이드들의 존재 하에 배양되었다. T 세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 IFNγ 생산에 의해 측정되었다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 30은 CD45 및 HLA-A2 지시된 폴리펩타이드들이 종양 세포 파괴를 위해 CMV 제한된 CD8+ T 세포의 방향을 다시 바꾸는 것을 나타낸 도이다. 인간 종양 세포 THP-1 및 U266은 HLA-A2 음성의 건강한 이식제공자의 CMV 제한된 T-세포와 함께 30분 동안 배양되었는데, 지시된 HLA-A2 (CD3(VL)-HLA-A2(VH-VL) 및 CD45 (CD3(VH)-CD45(VH-VL))에 특이적인 폴리펩타이드들의 존재 하에 배양되었다. 2중특이성 탠덤(tandem) scFv (CD3(VH-VL) x HLA-A2(VH-VL))-항체는 양성 대조군으로 사용되었다. T 세포 인게이지먼트(engagement)는 활성 IFNγ 생산에 의해 측정되었다. 샘플들이 실험되었고 사본으로 분석되었다.
도 31은 알레르겐(allergen) 특이적 폴리펩타이드 및 세포 타입 특이적 폴리펩타이드로 이루어지는 폴리펩타이드 파트의 키트로 B-세포 클론을 일으키는 자가면역 또는 과민증 질환을 제거하기 위한 원리 아이디어를 나타낸 도이다. 제 1 폴리펩타이드 P1은 표적 모이어티에 알레르겐 (예를 들어, Betv-1A, Der-f2, Conglutin-7, Can-f1, Feld-d1)를 가진다. 제 2 폴리펩타이드 P2는 표적 모이어티에 세포 표면 단백질 (예를 들어, CD19, CD138, CD38)을 표적하는 특이적 단일-사슬 가변 항체 단편 (scFv, VH-VL)을 가진다. 두 표적 모이어티 모두는 CD3-특이적 항체의 가변 경쇄 (VL) 또는 가변 중쇄 도메인 (VH)과 결합되었다 (단편 F1 및 F2).
이하, (특히) 청구항에서뿐만 아니라 본 명세서, 첨부된 실시예 및 도면에서 언급된 특정 (인간) 유전자 또는 단백질에 관하여 개시한다. 하기에서, 해당하는(대표적인) 유전자의 번호(accession number)를 제공한다. 추가적인 유전자 번호(accession number)는 첨부된 예들뿐만 아니라 본 명세서의 다른 부분에서도 제공된다.
CD45 : 유전자 ID: 5788, updated on 13-Jan-2013, 3. 단백질 = P08575-1 = 아이소폼(Isoform) 1, Last modified July 19, 2003. Version 2
CD34 : 단백질: P28906-1/2 Last modified July 15, 1998. Version 2.
CD33 : 유전자 ID: 945, updated on 30-Dec-2012: 단백질: P20138 [UniParc]. Last modified October 17, 2006. Version 2. Checksum: 1C73E588240FBAD8
CD138 : 유전자 ID: 6382, updated on 6-Jan-2013, 4. 단백질 = P18827 [UniParc]. Last modified May 5, 2009. Version 3.
CD15 : 유전자 ID: 2526, updated on 5-Jan-2013
CD1a : 유전자 ID: 909, updated on 30-Dec-2012, P06126 [UniParc]. Last modified February 9, 2010. Version 4. Checksum: C575C3C538F0AA29
CD2 : 유전자 ID: 914, updated on 5-Jan-2013; P06729 [UniParc]. Last modified October 23, 2007. Version 2. Checksum: A03D853C3B618917
CD3e : 유전자 ID: 916, updated on 5-Jan-2013, P07766 [UniParc]. Last modified February 1, 1996. Version 2. Checksum: A1603D01CE9957D7
CD4 : 유전자 ID: 920, updated on 13-Jan-2013; P01730 [UniParc]. Last modified November 1, 1988. Version 1. Checksum: 20ED893F9E56D236
CD5 : 유전자 ID: 921, updated on 30-Dec-2012; P06127 [UniParc]. Last modified November 30, 2010. Version 2. Checksum: 9131AEC9683EE1D3
CD8a : 유전자 ID: 925, updated on 30-Dec-2012; 아이소폼(Isoform) 1/2 (membrane) P01732-1/2 (mCD8alpha) [UniParc]. Last modified July 21, 1986. Version 1. Checksum: FCCA29BAA73726BB
CD20 : 유전자 ID: 931, updated on 6-Jan-2013; P11836 [UniParc]. Last modified October 1, 1989. Version 1. Checksum: AC5420F8B626BDD1
CD23 : 유전자 ID: 2208, updated on 4-Jan-2013; P06734 [UniParc]. Last modified January 1, 1988. Version 1. Checksum: F86708C0E6515B87
CD31 : 유전자 ID: 5175, updated on 13-Jan-2013; 아이소폼(Isoform) Long [UniParc].
Last modified April 1, 1990. Version 1. Checksum: C57BBFA200A407A6, P16284-1/2/3/4/5/6 = 아이소폼(Isoform) 1-6
CD43 : 유전자 ID: 6693, updated on 30-Dec-2012; P16150 [UniParc]. Last modified April 1, 1990. Version 1. Checksum: C9C9AB8435D5E1FE
CD56 : 유전자 ID: 4684, updated on 30-Dec-2012; 아이소폼(Isoform) 1 [UniParc]. Last modified July 22, 2008. Version 3. Checksum: FD3B9DE80D802554, P13591-2/1/3/4/4/6, 아이소폼(Isoforms) 1-6
CD57 : 유전자 ID: 27087, updated on 5-Jan-2013
CD68 : 유전자 ID: 968, updated on 6-Jan-2013; 아이소폼(Isoform) Long (CD68.1) [UniParc].
Last modified May 15, 2007. Version 2. Checksum: 69E68D69EDE8EFB0, P34810-1/2, 아이소폼(Isoform) 1/2
CD79a : 유전자 ID: 973, updated on 5-Jan-2013; 아이소폼(Isoform) 1 (Long) [UniParc].
Last modified June 1, 1994. Version 2. , Checksum: 6E5B837409969292, P11912-1/2, 아이소폼(Isoform) 1/2
CD146 : 유전자 ID: 4162, updated on 30-Dec-2012; 아이소폼(Isoform) 1 [UniParc]. Last modified January 10, 2006. Version 2. Checksum: E46CB8AC7BA0738E, P43121-1/2, 아이소폼(Isoform) 1/2.
계면활성제 단백질( surfactant proteins ) (A 및 B):
유전자 ID: 6440, updated on 30-Dec-2012 및 유전자 ID: 6439, updated on 30-Dec-2012, P07988 [UniParc]. Last modified May 1, 1992. Version 3. Checksum: 9FD7F66678A35153, 및 아이소폼(Isoform) 1 [UniParc]. Last modified April 1, 1990. Version 2. Checksum: C26A21E33C60AA78, P11686-1/2, 아이소폼(Isoform) 1/2
시냅토파이신 ( synaptophysin ):
유전자 ID: 6855, updated on 30-Dec-2012, P08247 [UniParc]. Last modified August 1, 1991. Version 3. Checksum: 592289C43B12EFA7
니코틴성 아세틸콜린 수용체( nicotinic acetylcholine receptors ):
유전자 ID: 1138, updated on 30-Dec-2012, 유전자 ID: 1136, updated on 6-Jan-2013, 유전자 ID: 1139, updated on 13-Jan-2013, 유전자 ID: 1137, updated on 30-Dec-2012, 유전자 ID: 1141, updated on 5-Jan-2013
근육 특이적 키나아제 ( muscle - specific kinase ) MUSK :
유전자 ID: 4593, updated on 8-Jan-2013, 아이소폼(Isoform) 1 [UniParc]. Last modified January 1, 1998. Version 1. Checksum: 3DDC20E179FA010C, O15146-1/2, 아이소폼(Isoform) 1/2
전압 의존성 칼슘 채널( voltage - gated calcium channel ) (P/Q- type ):
유전자 ID: 773, updated on 5-Jan-2013; 아이소폼(Isoform) 1 (1A-1) (BI-1-GGCAG) [UniParc]. Last modified July 15, 1999. Version 2. Checksum: 2F2F378ACE02FD56, O00555-1/2/3/4/5/6/7, 아이소폼(Isoforms) 1-7, 유전자 ID: 25398, updated on 11-Jan-2013, J3KP41 [UniParc]. Last modified October 3, 2012. Version 1. Checksum: AEDF4D2A5E49263F
전압 의존성 칼륨 채널( voltage - gated potassium channel ) ( VGKC ):
유전자 ID: 3737, updated on 30-Dec-2012, 유전자 ID: 3736, updated on 8-Jan-2013, 유전자 ID: 3742, updated on 8-Jan-2013
N- 메틸 -D-아스파르트산( aspartate ) 수용체 ( NMDA ):
유전자 ID: 2904, updated on 5-Jan-2013, Q13224 [UniParc]. Last modified June 20, 2001. Version 3. Checksum: 40AEB12BE6E50CEF; 유전자 ID: 2902, updated on 30-Dec-2012, 아이소폼(Isoform) 3 (Long) (NR1-3) [UniParc]. Last modified June 1, 1994. Version 1. Checksum: CDF5402769E530AB, Q05586-1/2/3/4/5, 아이소폼(Isoforms) 1-5
TSHR : 유전자 ID: 7253, updated on 4-Jan-2013, 아이소폼(Isoform) Long [UniParc]. Last modified March 29, 2005. Version 2. Checksum: D2EE9CEBFD64A65F, P16473-1/2/3, 아이소폼(Isoforms) 1-3
암피파이신 ( Amphiphysin ):
유전자 ID: 273, updated on 8-Jan-2013, 아이소폼(Isoform) 1 (128 kDa) [UniParc].
Last modified February 1, 1996. Version 1., Checksum: 78B4F75AB75BA357, P49418-1/2, 아이소폼(Isoform) 1-2
강글리오사이드 ( ganglioside ) GQ1B : 유전자 ID: 29906, updated on 30-Dec-2012
GD3 : 유전자 ID: 117189, updated on 22-Jun-2012
Ca -125: 유전자 ID: 94025, updated on 30-Dec-2012, Q8WXI7 [UniParc]. Last modified March 1, 2003. Version 2. Checksum: B3E7BDF19997A440
Her -2/ neu : 유전자 ID: 2064, updated on 13-Jan-2013, 4. 단백질 = P04626-1/2/3/4 = 아이소폼(Isoform) 1-4 , Last modified August 13, 1987. Version 1.
육안적 낭포증 유체 단백질(gross cystic disease fluid protein) 15; 유전자 ID: 5304, updated on 30-Dec-2012
CD117 : 유전자 ID: 3815, updated on 6-Jan-2013
CD30 : 유전자 ID: 943, updated on 6-Jan-2013; 아이소폼(Isoform) Long [UniParc]. Last modified December 1, 1992. Version 1. Checksum: 7A407CC78A6E0BC8, P28908-1/2, 아이소폼(Isoform) 1/2
혈소판유래 생장인자수용체 ( Platelet derived growth factor receptor ) PDGFR 알파( alpha ):
유전자 ID: 5159, updated on 13-Jan-2013, 유전자 ID: 5156, updated on 13-Jan-2013, 아이소폼(Isoform) 1 [UniParc]. Last modified April 1, 1990. Version 1. Checksum: 5E3FB9940ACD1BE8, P16234-1/2/3, 아이소폼(Isoforms) 1-3; P09619 [UniParc]. Last modified July 1, 1989. Version 1. Checksum: 038C15E531D6E89D
흑색종 연관 마커 ( Melanoma associated marker )/ Mart 1:
유전자 ID: 2315, updated on 30-Dec-2012; Q16655 [UniParc]. Last modified November 1, 1996. Version 1. Checksum: B755BFF39CFCB16E
CD133 : 유전자 ID: 8842, updated on 13-Jan-2013; 아이소폼(Isoform) 1 (AC133-1) (S2) [UniParc].
Last modified June 1, 1998. Version 1. Checksum: D21CBC05ADB2DEDF, O43490-1/2/3/4/5/6/7, 아이소폼(Isoforms) 1-7
이하, 본 발명을 실시예에 의해 자세히 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 재조합 항체 구조체의 클로닝( Cloning )
융합 세포로부터 유래된 및 항-CD3, 항-CD45 및 항-HLA L2 항체 각각의 가변 도메인을 위해 암호화하는 DNA 서열은 분자생물학의 일반적 방법에 의하여 도 3에 나타난 항체 구조체를 생성하기 위해 사용되었다(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001) 참조). 이 구조체는 재조합 단백질의 발현에 동정 및 정제를 용이하게 하는 다른 친화성 태그를 운반하기 위해 디자인되었다(Myc-, Flag, His-태그). 도메인 배열, 친화성 태그 및 구조체의 링커의 구체적인 것은 도 3에 나타냈다.
pelB Leader는 박테리아 내에서 발현되는 단백질을 박테리아 주변 세포질로 보내는 아미노산 서열을 암호화한다 . 대표 서열은 박테리아 효소에 의해 자르고, 단백질은 분리될 수 있다.
실시예 2 : 재조합 항체의 발현 및 정제
주변 세포질 단백질 발현:
재조합 항체 구조체는 적절한 원핵 발현 벡터를 이용하여 E. coli 균주 TG1의 주변 세포질에서 발현되었다. 0.1 % 글루코오스 및 100 ㎍/ml 앰피실린(ampicillin)을 포함하는 2 리터의 2 × TY 배지에 하룻밤 배양한 형질전환된 TG1 20 ml로 접종시키고, 37℃에서 대수 증식기 (OD600 0.8 - 0.9)까지 배양하였다. 항체 단편들은 락토오스(lactose) 프로모터를 제어하기 때문에, 단백질 발현은 1 mM IPTG의 첨가에 의해 유도되었고, RT(실온)에서 흔들며 추가적으로 3 h 동안 배양했다. 세포는 10분 동안 2,750 ×g, 4℃에서 원심분리에 의해 채취하였고, 100 ml 또는 적절한 완충용액에 재현탁되었다. 세포 용해는 50 ㎍/ml의 새롭게 용해된 리소자임 [Roche Diagnostics]을 첨가하여 수행하였고, 얼음통 안에서 차게 25 분 동안 배양하였다. 그 다음, 10 mM MgSO4을 스페로플라스트(spheroplasts)를 안정화하기 위해 첨가하고, 그리고 세포를 10분 동안 6200×g, 4℃에서 원심분리하였다. 마지막으로, 주변 세포질 단백질을 포함하는 입수한 상층액을 PBS로 밤새 4℃에서 투석하고, 그 상태로 15분 동안 다시 원심분리하였다. 그 후에, 재조합 단백질은 Ni-NTA-IMAC (Nickel Nitrilo-triacetic acid Immobilised Metal Affinity Chromatography)에 의해 정제되었다.
고정된 금속 친화도 색층 분석(Immobilised-Metal Affinity Chromatography (IMAC)):
His6 태그를 가지고 재조합 단백질을 정제하기 위해, 고정된 니켈(nickel)-나이트릴로트리아세트산(nitrilotriacetic acid; NTA) 아가로스 비드(beads) [Qiagen]를 이용하여 IMAC가 수행되었다. 먼저, 1　ml Ni-NTA 아가로스의 칼럼은 약 10 ml의 살균 PBS 또는 20 mM 이미다졸(imidazole)을 넣은 소듐 포스페이트(sodium phosphate) 완충 용액으로 평형이 유지될 필요가 있다. 그 후, 세포질 발현으로부터 침전되거나 주변세포질 발현으로부터 투석된 조단백질(crude protein)은 서서히 컬럼에 적용된다. 단백질이 플로우(flow)에서 더 이상 검출되지 않을 때까지 약 20 ml의 적절한 IMAC 세척 버퍼 (20 - 35 mM 이미다졸을 포함하는 소듐 포스페이트 완충용액)로 세척한 후에, 결합된 단백질은 250 mM 이미다졸을 포함하는 소듐 포스페이트-완충용액이 녹은 500 ㎕ 분획(fraction)에서 컬럼으로부터 용출된다.
모든 수집된 세척 및 용리 분획은 10 ㎕의 각 샘플을 90 ㎕의 1 ×Bradford 용액에 첨가함으로써 정량 Bradford assay에 의해 단백질의 존재를 테스트한다. 정제 과정의 확인은 SDS-PAGE 분석에 의해 수행되었다. 이러한 목적을 위해, 용리된 분획은 감소시키는 조건 하에 조단백질, 플로우(flow), 및 세척된 분획과 병행하여 수행하였다. 마지막으로, 비색반응(colorimetric reaction)에 의해 결정된 양성 분획(positive fraction)은 피크(peak) 및 마이너 분획(minor fraction)으로 모아지고, 밤새 4℃에서 PBS로 투석되었다. 자극 시험(stimulation assay)에 사용하기 위해, 정제된 단백질은 살균 여과되어야하고, 그것의 농도가 결정되었다. 게다가, 단백질 정량 후에, 2 ㎍의 추가로 사용된 분획은 또한 감소하는 및 감소하지 않는 조건 하에 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의해 분석되었다.
실시예 2의 대안으로, (VH)CD3-EGFR(VH-VL), (VH)CD3-CEA(VH-VL), (VH)CD3-Her2(VH-VL), (VH)CD3-HLA-A2(VH-VL), (VH)CD3-HLA-CW6(VH-VL) (VH)CD3-CD138(VH-VL), (VH)항Dig-EGFR(VH-VL), (VH)항His-HLA-A2(VH-VL), (VL)CD3-CEA(VH-VL), (VL)CD3-EpCAM(VH-VL), (VL)항Dig-EpCAM(VH-VL), (VL)항His-CD45(VH-VL), (VL)CD3-CD45(VH-VL)을 암호화하는 DNA가 합성되었고, 단백질이 생산되었고, GenScript(Piscataway, NJ, USA)에 의해 분리되었다. DNA는 E.coli 발현 (벡터 E3)에 최적화된 코돈이고, 발현이 최적화되고, 2 리터의 표준 LB-배지에서 자랐고, 단백질은 봉입체들(inclusion bodies) 또는 주변세포질로부터 (pelB leader) Ni-HiTrap 컬럼에 의해 한 단계로 얻어졌다. 세균 내독소는 5 리터의 1x 포스페이트 완충용액 (PBS)로 투석함으로써 제거되었다. 농도는 표준 소 혈청 알부민 (BSA)과 함께 단백질 정량 분석(Bradford protein assay)에 의해 측정되었다. 순도는 쿠마씨 블루(Coomassie Blue)-염색된 SDS-PAGE 겔의 농도계 분석에 의해 추정되었다. 부분 표본(Aliquot)들은 -80℃ 또는 +4℃에서 저장되었다. 저장 버퍼는 1xPBS, 5% 글리세롤, 0.5% 소듐 라우로일 사르코신(sodium lauroyl sarcosine), pH 7.4를 이용했다.
실시예 3 : 세포 배양 기술
세포 배양:
포유류 세포는 T75 조직 배양 플라스크에서 20 ml의 적절한 배양 배지에서 37℃ 5% CO2와 함께 배양되었다. 세포들은 매 2-3일마다 나뉘어졌다. 부착 세포는 먼저 1 × 트립신-EDTA로 떼어내는 것이 필요했다. 세포들은 생체 염색, 에오신(eosin) 또는 트립판 블루를 이용하여 카운트되었다. 저장을 위해, 60 - 80 % 융합의 세포들은 5분 동안 450 ×g에서 원심분리함으로써 채취하였고, 10 % DMSO가 녹아있는 FCS에서 재현탁하였고, 저온 유리병에 나누고, 그리고 -80℃의 온도에서 서서히 얼렸다. 세포들은 워터 배스(water bath)에서 37℃에서 빠르게 녹이고, 5 ml 배지에 조심스럽게 첨가하였다. DMSO를 제거하기 위하여, 세포들은 다시 원심분리되었고, 신선한 배지에 재현탁되었고, 조직 배양 플라스크에 옮겨졌다.
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)의 준비:
림프구와 단핵구로 구성된 PBMC는 피콜(Ficoll) 기반의 림프구 분리 용액 LSM 1077 (PAA Laboratories, Pasching, Austria)을 이용하여 밀도 원심분리에 의하여 건강한 인간 이식제공자의 백혈구 연층(buffy coat)으로부터 미리 분리되었다. 이용하는 동안, 이 PBMC는 비균질 세포군으로 나타나기 때문에, 남아있는 적혈구, 과립구 및 혈소판으로부터의 분리가 하기와 같이 반복되었다. 10 % FCS 및 Pen-Strep을 포함하는 30 ml RPMI 1640 배지에서 재현탁한 녹은 PBMC는 10 ml의 LSM 1077에 조심스럽게 겹겹이 쌓고, 5분 동안 800 ×g에서 멈춤없이 원심분리하였다. 가장 위에 있는 층을 버린 후에, PBMC는 중간층에 집중된 PBMC는 신선한 튜브에 옮겼고, 30 ml의 배지에서 재현탁하고, 그리고 5분 동안 450 ×g에서 원심분리하였다. Ø 10 cm 조직 배양 플레이트에서 밤새 PBMC를 배양함에 의해 단핵구가 플레이트에 부착되게 하여 단핵구들은 제거되었다. 마지막으로, 용액에 남아있는 PBMC는 채취하였다.
실시예 3의 대안으로, 전이성 최장암 환자의 원발성 인간 암 세포를 환자의 복수 백(ascites bag)으로부터 추출하였다 (도 29). 신선한 수집된 악성 복수 4 리터는 4 ℃에서 밤새 2 리터 유리병에 저장되었다. 다음날 유리병의 세포 펠릿(pellet)은 1xPBS로 세척하였고, 배양 배지(200 μM 1-글루타민이 추가된 DMED, 10% 열 비활성화된 FBS, 페니실린(200 U/mL), 스트렙토마이신 (200 ㎍/mL) 및 소듐 피루베이트(sodium pyruvate) (1mM) (Glibco®))에서 재현탁하였다. 부착 세포들은 인큐베이터 36℃, 5% CO2, 90% 습도에서 배양되었다. 같은 날 복수(ascites)는 환자로부터 모아졌고, PBMC 추출을 위한 20ml 말초혈액이 수집되었다. 제1기 백혈암 세포들은 잘 맞는 동종 줄기 세포 이식 32일 후 재발한 T-세포-전림프성 백혈병 (T-PLL)을 가지는 71 세 남자 환자로부터 얻어졌다 (도 11A). 백혈병의 T-PLL 세포들은 환자의 말초혈액으로부터 PBMCs 로서 추출되었다. 샘플이 모아졌을 때 환자는 정기적인 클리닉 진단에서 그의 혈구수에 >90% 백혈병의 블라스트(blast)를 가졌다. 모든 환자로부터 에 Wurzburg ethical committee의 대학 병원에 의해 공인된 고지된 동의서가 사인되었다.
실시예 3의 대안으로, 거대세포바이러스(CMV)-특이성 인간 T-세포의 생성: 요약하면, 수지상 세포 (DC)는 HLA-A0201 음성의 PBMC, B0702+ 제공자로부터의 플라스틱 부착 단핵구로부터 생성되었다. GM-CSF/IL4-포함 DC 배지 (Cellgenix)에서 72h 배양 후에, DC는 IL4(100ng/ml), GM-CSF(800IU/ml), LPS (10ng/ml) 및 IFNγ(100U/ml)을 포함하는 배지에서 2.5ug/ml CMV pp65 유래된 펩타이드 TPRVTGGG을 더하여 성숙되었다. 16h 후에, DC는 방사능처리되었고 (30Gy), 5% AB 혈청 및 IL21 (10ng/ml)을 포함하는 배지에서 1:4 비율로 CD45RO-, CD57- 나이브(naive) CD8+ T-세포와 함께 공동-배양되었다. 10-12일에 평가 전에, 신선한 배지, IL7 및 IL15가 배양 3, 5 및 7일에 첨가되었다. 세포들은 Cellgenix DC 배지에서 배양되었다. 인간 AB 혈청이 PAA로부터 사용되었다. 모든 실험에 걸쳐 하나의 싱글 배치(batch)가 사용되었다. IL4, IL7, IL15, IL21는 Peprotech 또는 Cellgenix에서 (동일한 결과를 가지고) 구입되었다. GM-CSF는 Gentaur로부터 구입되었다. LPS (E.coli O:15)는 Sigma로부터 구입되었다. HLA-B0702-제한된 CMV-특이성 펩타이드 TPRVTGGG는 jpt로부터 구입되었다. in vivo 실험을 위해, CMV-특이성 T-세포는 APC-표지된 MHC-멀티머 (Immudex)를 이용하여 더욱 정제되었다. MHC 멀티머 염색은 실온에서 수행되었고, 그 후에 항-APC-비드 (Miltenyi)로 MHC-멀티머+ T-세포의 분리를 하였다.
실시예 4 : 기능성 검정( Functional Assays )
유동 세포 분석법(Flow Cytometry):
항체 융합 단백질의 항체-존재 종양 세포 및/또는 T 림프구와의 결합은 유동 세포 분석법에 의해 시험되었다. 이러한 목적을 위해, 2.5 - 5 ×105 세포가 웰(well) 당 100 ㎕의 적절한 완충 용액 (예를 들어, PBS + 소 혈청 알부민, 또는 다른 허용가능한 완충용액) 안에서 4 ℃에서 2 h 동안 96-웰 V-형태 플레이트에서 10　㎍/ml의 scFv 또는 0.004 - 4 ㎍/ml의 적정된 융합 단백질과 함께 배양되었다. 150 ㎕의 적절한 완충 용액으로 세 번 세척한 후에, 세포들은 FITC-결합된 항-His6 태그 또는 항-Flag 태그 또는 항-myc 태그 항체와 함께 RT에서 30 분 동안 배양되었고, 두 번 다시 세척되었다. 백그라운드 염색을 위한 시험 및 게이팅(gating)을 위해, 각 세포 타입의 추가적인 두 개의 샘플을 준비했고, 이 중 하나는 염색되지 않은 세포 그리고 나머지 하나는 어떤 단백질도 없이 FITC-결합된 항-His6 태그 항체로 염색된 것이다. 마지막으로, 세포는 500 ㎕의 적절한 완충용액에서 재현탁되었고, FACS 튜브로 옮겨졌고, 유동 세포 분석법에 의해 분석되었다.
PBMC 자극 시험(Stimulation Assay):
재조합 단백질의 자극 특성은 세포-기반의 자극 시험에서 시험되었다. 그렇게 함으로써, 2중특이성 항체 및 "트리도메인 구조체"에 의해 조정된 T-세포 활성은 유도된 IL-2 방출에 관한 PBMC의 자극을 측정함에 의하여 결정된다.
구조체의 자극 활성의 측정:
CD45 pos/HLA A2 골수종 세포주 U266은 바닥이 평평한 96-웰 세포 배양 플레이트에서 웰 당 105 세포의 밀도로 100 ㎕의 배양 배지에 넣어졌다. 적정된 자극 단백질이 웰 당 100 ㎕ 배지에서 나타난 바와 같이 첨가되었고, 충분한 결합을 위해 1 h 동안 37℃ 및 5 % CO2에서 전배양되었다. 그 전날 녹이고 분리한 비활성화 PBMC가 그 후 지시된 밀도로 첨가되었고, 24 h 동안 37℃ 및 5　% CO2에서 배양되었다. 마지막으로, ELISA에서 IL-2 정량을 위해 세포-프리 상층액을 채취하기 위하여 플레이트는 5 분 동안 450 ×g에서 원심분리되었다.
IL-2 샌드위치(Sandwich) ELISA:
자극 활성을 위한 지표로서, 2중특이성 항체에 의해 유도된 T-세포 활성은 IL-2 방출면에서 측정되었다. PBMC 자극 하에, 상층액 내의 분비된 IL-2의 농도는 IL-2 샌드위치 ELISA에 의해 결정되었다.
먼저, 96-웰 ELISA 플레이트는 웰 당 400 ng/100 ㎕의 마우스 항-인간 IL-2 항체로 밤새 4℃에서 코팅되었고, 그 후 적절한 저해 버퍼로 비특이성 결합 부위를 2 h 동안 RT에서 포화시켰다. 그 동안에, 1,000 pg/ml의 최대 IL-2 농도에서 시작하여 IL-2 기준의 단계적인 1 : 2 희석이 희석용 시약에서 2 통으로 준비되었다. 그 후, IL-2를 포함하는 상층액은 10 % FCS 및 Pen-Strep (페니시린-스트렙토마이신)을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 1:3으로 희석되었다. 희석된 상층액 및 기준은 ELISA 플레이트에 옮겨졌고, 2 h 동안 RT에서 배양되었다. 그 다음, IL-2는 웰 당 17.5 ng/100 ㎕의 비오틴 부착 염소 항-인간 IL-2항체와 2 h 동안 RT에서 배양함에 의해 탐지되었다. 마지막으로, 희석 시약에 의해 1 : 200으로 희석된 100 ㎕의 HRP-결합된 스트렙트아비딘(streptavidin)이 웰 당 첨가되었고, 20분 동안 RT에서 배양되었다. 각각의 플레이트는 TMB 기질 용액을 이용하여 성장되었다. 백그라운드 신호를 이루기 위하여, 각 플레이트에 최소 2 웰이 희석시약 또는 배지만으로 배양되었고, 감지 항체에 TMB까지 함께 배양되었다. 각 배양 단계 사이에서, 플레이트는 0.05 % Tween-20을 포함하는 PBS로 세 번 세척되었고, PBS만으로 한 번 세척되었다.
세븐 포인트 표준 곡선(seven point standard curve)은 IL-2 농도에 대한 각 표준 샘플의 흡수 신호를 플로팅(plotting)함에 의해 만들어졌다. 그러므로, 각 상층액의 IL-2의 양은 GraphPad Prism®을 이용하여 한 단계 지수적 연상을 위해 비선형 회귀방정식에 맞는 표준 곡선의 보간법(interpolation)에 의해 결정될 수 있다.
IFN-γ ELISA (실시예 4의 대안):
100㎕의 세포 배양 상층액에서 IFN-γ 농도는 인간 IFN-γ ELISA 키트 (Invitrogen™)를 이용하여 제조사의 프로토콜 후에 측정된다. 요약하면 50 ㎕의 인큐베이션 버퍼가 미리 코팅된 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가된다. 50 ㎕의 표준 희석 버퍼가 제로 웰에(zero well) 첨가된다. 50 ㎕의 표준 및 샘플이 각 웰에 첨가된다. 50 ㎕의 비오틴부착된 Hu IFN-γ 비오틴 결합 용액이 각 웰에 첨가된다. 플레이트의 가장자리를 테이핑하여 섞는다. 플레이트 커버로 플레이트를 덮고, 1 시간 30 분 동안 실온에서 배양한다. 용액을 웰로부터 완전히 흡입하고, 액체를 제거했다. 웰을 4 번 세척하였다. 100 ㎕ 스트렙트아미딘-HRP 작용(working) 용액을 각 웰에 첨가했다. 플레이트 커버로 플레이트를 덮고, 45분 동안 실온에서 배양하였다. 용액을 웰로부터 완전히 흡입하고, 액체를 제거했다. 100 ㎕의 안정화 색원체(Chromogen)을 각 웰에 첨가했다. 웰의 용액은 파란색으로 바뀌었다. 우리는 15-30분 동안 실온 그리고 암실에서 배양하였다. 100 ㎕의 중지(stop) 용액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트의 가장자리를 단단히 테이핑하고 섞었다. 웰의 용액은 파란색 또는 노란색으로 변했다. 각 웰의 흡광도는 BioRad 플레이트 리더로 450 nm에서 관찰됐다.
세포독성 분석(Cytotoxicity Assay):
HLA-A2/CD45 양성 세포주 U266 또는 골수종 세포주 U266은 10 μM CFSE (Invitrogen Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit) 로 350 ㎕ PBS 에서 10분 동안 RT에서 암실에서 표지되었다. 표지 반응은 5 ml 태아 송아지 혈청 (FCS)를 첨가함에 의해 중단되었고, 그 후 실온에서 1-분 배양하였다. 2 번의 세척 후에, CFSE-표지된 표적 세포들은 분석 배지에 재현탁되었고, 지시한 27 nM의 항체 구조체 및 1:10 (2 ml 내에 5*105 U266 및 5*106 PBMCs)의 양으로 HLA-A2 음성의 건강한 제공자의 PBMC와 공동배양하였다. 트리톤(Triton)으로 처리된 샘플은 양성 대조군 (100% 용해)으로 사용되었고, 항체 구조체가 없는 샘플을 음성 대조군 (0% 용해)으로 사용하였다. 24h 후에, 사멸 세포는 7AAD 염색(Biozol, RT에서 10분)에 의해 보여지고, CFSE 표지된 U266 세포의 특이적 용해 %는 유동 세포 분석 기술을 이용하여 계산되었다.
카스파제(Caspase)-3 분석 (실시예 4의 대안):
특정한 폴리펩타이드의 존재 또는 부재 하에 4h 동안 표적 세포의 T-세포와의 공동배양(종양 세포 : T-세포 비율 2:1) 후에 염색이 수행되었다. HLA-A2 및 CD45를 위한 표면 염색이 먼저 수행되었고, 그 후 고정 및 투과(Fix+Perm, BD Biosciences)했다. 활성된 카스파제-3 항체가 그 후 30분 동안 첨가되었다(BD Biosciences). 세포들은 1xPBS +5% 인간 혈청 (HS, PAA Laboratories)으로 세척되었고, BD-FACS Canto-II에서 분석되었다. 특이적 세포사멸 %는 (실험값% - 자발적 방출%)/(100% - 자발적 방출%)*100 으로 계산되었다.
알라마 블루 분석(Alamar blue assay) (실시예 4의 대안):
alamarBlue® 분석 (Abd Serotec)은 독소에 노출된 후에 세포의 증식 및 생존 능력을 측정하기 위하여 사용된다. 요약하면, 세포는 웰 (96 웰 플레이트) 당 100㎕의 세포 배양 배지에서 키워졌다. 분석을 위해 웰 당 10㎕ alamarBlue가 첨가되었고, 30-120분 동안 인큐베이터에서 배양되었다. 흡광도는 BioRad 플레이트 리더로 570nM 및 600nM에서 관찰됐다. 블랭크(blank)를 위해 배지만을 사용하였다. 다른 폴리펩타이드 그룹 사이에 세포 증식의 감소의 차이 %는 독소가 없는 배양에서 자란 세포를 대조군으로 사용하여 제조사에 의해 지시된 대로 계산되었다.
다이옥시제닌(Digoxigenin) 분석 (실시예 4의 대안):
먼저 서양고추냉이(horseradish) (HRP, Sigma-Aldrich Chemie gmbH)의 퍼옥시다아제는 1/3 분자비로 다이옥시제닌 NHS-에스터 (Sigma-Aldrich Chemie gmbH)로 표지되었다. Dig-HRP는 마이크로 Bio-Spin™ 크로마토그래피 컬럼 (BioRad)으로 깨끗하게 되고, 4℃ 암실에서 저장되었다. Colo-206F 세포들은 먼저 다양한 농도의 지정된 폴리펩타이드와 90분 동안 배양되었다. 세포들은 PBS로 세척되었고, Dig-HRP로 세포 배양 배지에서 재현탁되었고, 30분 동안 배양되었다. 그 후 세포들은 PBS로 두 번 세척되고, 50㎕ PBS에서 재현탁되었다. 50㎕의 안정화된 크로모겐 (Invitrogen™)이 15-30분 동안 실온 암실에서 첨가되었다. 50㎕의 중지(stop) 용액이 첨가되고, 흡광도는 BioRad 플레이트 리더로 450 nm에서 관찰됐다.
마우스(Mice) (실시예 4의 대안):
in vivo 실험(도 12A)을 위한 HLA.A2 형질전환, 면역결핍 마우스는 우리의 증명된 동물 시설(ZEMM, Center for experimental molecular medicine, University hospital Wurzburg)에서 유럽연합 가이드라인에 따라 유지되었다. 6-10주령 암컷 마우스들은 그룹 당 5 마리로 6개의 그룹으로 나뉘어졌다(n=30). 5x106 THP-1 세포, 1,25x105CMV 특이적 CD8+ T-세포 (종양 세포: T-세포 비율 40/1) 및 0.5㎍의 폴리펩타이드가 지시된 대로 복강내(i.p.) 주입되었다. 주입 후에, 마우스들은 매일 관찰되었다. 1.16x105 CMV-특이적 CD8+ T-세포/마우스의 두 번째 주입이 13일 째에 이루어졌고, 폴리펩타이드의 주입은 매주 3일 반복되었다. 동물들은 무게의 증가가 80%보다 많거나 기관의 가이드라인에 따라 빈사상태(moribund)가 나타나는 경우 안락사시켰다.
실시예 5-9 또는 도 4-11에서 사용된 도메인 구조, 친화성 태그, 및 구조체 또는 폴리펩타이드의 링커는 도 3에 나타냈다. 도 4-30에서 사용된 이러한 구조체 및 모든 구조체 또는 폴리펩타이드는 실시예 1 및 2에서 설명한 바에 의해 준비되었다. 실시예 5-9의 세포 배양 및 기능성 시험, 및 도 4-30의 배양, 기능성 시험 및 in vivo 실험은 실시예 3 및 4에 설명된 바에 의해 수행되었다.
실시예 5
CD45 및 HLA A2 양성 골수종 표적 세포주 U266은 건강한 제공자의 HLA A2 음성 T 세포 (단핵구 감소된 PBMCs (peripheral blood mononuclear cells)) 및 다양한 양의 지정된 HLA A2 및 CD3 2중특이성 항체 구조체(번호 85, 82, 75 및 71)와 공동배양되었다. PHA-L (T 세포의 비특이적 촉진을 일으키는 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin), 렉틴(lectin); 1 ㎍/ml 최종 농도)이 양성 대조군으로 사용되었고, HLA A2 (번호 4) 또는 CD3 (번호 36)에 특이성을 갖는 단일 사슬 scFv 구조체가 조사되었다. T 세포에 의한 IL2 (Interleukin-2) 생산은 ELISA 기술에 의해 측정되었다. 어떤 구조체 없이는 실험적 상황에서 IL2 생산을 발견하지 못했다. 얻은 데이터는 도 4에 나타내었다.
실시예 6
CD45 및 HLA A2 양성 골수종 표적 세포주 U266은 건강한 제공자의 HLA A2 음성 T 세포 (단핵구 감소된 PBMCs)과 공동배양되었고, 다양한 양의 "트리도메인 구조체"는 각각 분리되어 첨가(번호 42, 45, 55; 번호는 도 3에 나타난 구조체를 말함)되거나 조합(42 + 45 또는 42 + 55)되어 첨가되었다. PHA-L 및 CD45에 특이성을 가지는 단일 사슬 scFv 구조체들 (번호 46 및 17)은 대조군으로 주어졌다. T 세포에 의한 IL2 생산은 ELISA 기술에 의해 측정되었다. 어떤 구조체 없이는 실험적 상황에서 IL 생산을 발견하지 못했다. 얻은 데이터는 도 5에 나타내었다.
실시예 7
CD45 및 HLA A2 양성 골수종 표적 세포주 U266는 건강한 제공자의 HLA A2 음성 T 세포 (단핵구 감소된 PBMCs), 및 HLA A2 및 CD3 2중특이성 항체 구조체 혼자 (번호 71, 27 nM) 또는 HLA A2 (번호 4, 구조체 71의 농도와 비교하여 100배를 초과하는, 즉. 2700nM) 또는 CD3 (번호 36, 구조체 71의 농도와 비교하여 9배를 초과하는, 즉. 243nM)에 항원성 에피토프를 막는 단일 사슬 scFv 구조체와 조합하여 공동배양하였다. T 세포에 의한 IL2 생산은 ELISA 기술에 의해 측정되었고, PHA-L은 대조군으로 주어졌다. 얻은 데이터는 도 6에 나타내었다.
실시예 8
CD45 및 HLA A2 양성 골수종 표적 세포주 U266는 건강한 제공자의 HLA A2 음성 T 세포 (단핵구 감소된 PBMCs) 및 구조체 42 및 45의 조합과 공동배양하였다. T 세포 자극 기능은 HLA A2 (번호 4) 또는 CD45 (번호 46)에 특이적인 단일 사슬 구조체에 의해 저해되었다. T 세포 자극 기능의 상보성은 구조체 42 및 45 각각 또는 CD3 (번호 36)에 직접적인 단일 사슬 scFv 구조체를 검정함에 의해 시험되었다. T 세포에 의한 IL2 생산은 ELISA 기술에 의해 측정되었고, PHA-L은 대조군으로 주어졌다. 구조체의 농도는, 별도의 표시가 없다면, 27 nM이었다. ("9x"는 243 nM의 농도를 가리키고, "100x"는 2700 nM의 농도를 가리킨다.) 얻은 데이터는 도 7에 나타내었다.
실시예 9
CD45 및 HLA A2 양성 골수종 표적 세포주 U266는 건강한 제공자의 HLA A2 음성 T 세포 (단핵구 감소된 PBMCs) 및 구조체 42 및 55의 조합과 공동배양하였다. T 세포 자극 기능은 HLA A2 (번호 4) 또는 CD45 (번호 46)에 특이적인 단일 사슬 구조체에 의해 저해되었다. T 세포 자극 기능의 상보성은 구조체 42 및 55 각각 또는 CD3 (번호 36)에 직접적인 단일 사슬 scFv 구조체를 검정함에 의해 시험되었다. T 세포에 의한 IL2 생산은 ELISA 기술에 의해 측정되었고, PHA-L은 대조군으로 주어졌다. 구조체의 농도는, 별도의 표시가 없다면, 27 nM이었다. ("9x"는 243 nM의 농도를 가리키고, "100x"는 2700 nM의 농도를 가리킨다.) 얻은 데이터는 도 8에 나타내었다.
이전의 실시예의 결과들은 T 세포 인게이징(engaging) 기능을 그 후에 상보하기 위하여는 두 구조체 (42+45) 또는 (42+55)가 먼저 단일 세포의 표면에 있는 그들의 리간드에 결합하여야 함을 분명하게 증명한다.
실시예 10
VLCD3-scFvHLA A2 (27 nMol) 또는 VH-scFvCD45 (27 nMol) 또는 이 두 구조체들의 조합 (각각 27　nMol)의 존재 하에 HLA A2 음성 T 세포 (단핵구 감소된 PBMCs)에 의한 CD45 및 HLA A2 양성 골수종 표적 세포주 U266의 용해가 유동 세포 분석법 기반 기술에 의해 측정되었다. 용해 %는 전체 U266 세포에서 나뉘어진 사멸된 U266 세포에 의해 계산되었고, 백그라운드 세포사멸은 제외했다. 얻은 데이터는 도 9에 나타내었다.
실시예 11
최종 두 개로 구성된 구조체의 일부로서, 두 폴리펩타이드가 디자인되었고, 각각은 항원-결합 단일-사슬 가변 단편 (scFv) 및 T 세포-활성 항-CD3 항체의 가변 경쇄 (VL)) 또는 가변 중쇄 (VH)를 포함한다 (도 10). 이러한 두 폴리펩타이드가 단일 세포의 표면에 있는 그들 각각의 항원에 결합할 때, VL 및 VH 도메인은 서로 상호작용하여 원래의 항-CD3 결합 부위를 재구성한다. 그러므로 정확한 형태의 3중특이성 헤테로이합체는 종양 세포 파괴를 위해 T 세포를 이끌고 자극시킨다.
이 시나리오는 T 림프구가 두 개의 다른 폴리펩타이드와 배양된 표적 세포에 마주칠 때 in vitro에서 완벽히 입증된다. 이론의 증거로서, 주조직적합성 항원 HLA-A2 및 조혈 계통 마커 CD45가 먼저 표적화되었고, 항원이 두 번째였으며, 둘은 모두 골수종 세포, T 세포 계통의 전-림프성 백혈병(T-PLL)을 가지는 환자의 1차적 세포, 및 THP-1 급성 골수성 백혈성 블라스트에 발현된다(도 11). 설명한 VL/VH 상호작용 때문에, 지금 3중특이성 헤테로이합체는 강하게 T 세포가 인터류킨-2 (IL-2)를 분비하도록 자극하고 (도 11a) 및 나노몰의 농도에서 표지된 종양 세포를 용해하도록 자극하며 (도 11b), 세포독성 효과는 2중특이성 T 세포-활성 항체의 그것과 꽤 유사하고, 이것은 양성 대조군으로 이용되었다 (도 11A, 왼쪽 패널), Mack, 1995, Proc Natl Acad Sci 92, 7021-7025. 폴리펩타이드들이 각각 분리되어 첨가될 때, 그들은 T 림프구가 표적 세포를 용해하도록 유도하지 않는다. 이러한 결과들은 표적 항원에 충분한 친화성을 부여하기 위해 VH 및 VL 도메인 모두가 필요함을 나타내는 구조적 데이터와 일치한다 (도 11A, B), Colman, 1987, Nature 326, 358-363; Amit, 1986, Science 233, 747-753. 게다가, 이 결과들은 VH 또는 VL 팔의 가능한 호모이합체화는 무시해도 될 정도의 측정가능한 생물학적 효과를 초래함을 나타낸다.
두 분자는 VH/VL 헤테로이합체화가 일어나게 하기 위해 먼저 표적 세포의 표면에 있는 그들의 항원에 결합해야 함을 증명하기 위하여, HLA-A2 및 CD45에 특이적인 단일-사슬 가변 단편을 표적의 각각의 에피토프를 저해하기 위해 사용하였다. 도 11c에 나타난 것처럼, 큰 초과가 나타날 때, 이러한 억제제들은 투여량-의존적 방법으로 두 폴리펩타이드가 T 세포를 작동시키는 것으로부터 예방한다. 게다가, T 세포들은 표적 세포가 누락되었을 때 또는 표적 세포가 CD45만 발현된 (RAJI 세포, 도 11D) 또는 표적 분자 어느 것도 발현되지 않은 (KMS-12-BM, 도 11D) 것으로 조사되었을 때는 자극되지 않는다.
실시예 12
in vivo 에서 개념을 증명하기 위해, 동종의 미스매치된 줄기 세포 이식 모델은 리조트(resort)되고, 그 안에서 환자의 남은 백혈병성 및 조혈 세포는, 모두 HLA-A2 및 CD45-양성인데, 동종의 이식제공자 줄기 세포 (HLA-A2-음성, CD45-양성)에게 접목할 기회 및 혈액생성을 재구성할 기회를 주기 위하여 제거되어야 한다 (도 2 참고). 이분 구조체의 특이성을 테스트하기 위하여, 거의 모든 세포에 인간 HLA-A2 이식 유전자를 발현하는 면역결핍 마우스가 이용되었고, 문제는 HLA-A2-양성이나 CD45-음성인 쥣과 조직이 부수적 피해를 겪는지에 있었다. THP-1 세포들은 HLA-A2-음성 제공자의 CD8 T 림프구와 함께 또는 제외하고 복강내로 주사되었고, 이것은 인간 항-쥣과(murine) 면역 반응을 피하기 위하여 거대세포바이러스(cytomegalovirus (CMV))에 특이성을 위해 선택된 것이었다. 복강 내의 종양은 폴리펩타이드를 받지 않은 마우스, 및 단일 분자 타입으로 치료 또는 T 세포가 없는 두 폴리펩타이드의 조합으로 치료된 마우스 안에서 급격히 성장했다. 모든 경우에, 치명적인 다발성 질병이 3 내지 4주 내에 발생했다 (도 12A). 이와는 아주 대조적으로, T 세포 및 반복적인 두 폴리펩타이드의 주사로 치료된 모든 종양을 가지고 있는 마우스들은, 비록 감지할 수 있는 종양이 주사 부위에 있었지만, 실험이 종료된 31일 날까지 살아있었다. 이러한 결과들은 in vivo에서 이분 구조체는 표적 분자 (HLA-A2 및 CD45) 모두를 동시에 발현하는 종양 세포에서 그들의 특이성과 관계없이 T 세포를 실제로 다시 보낸다(redirect)는 것을 분명하게 보여준다. 코멘트로서, 모든 HLA-A2 양성 쥣과 조직에 대한 T 세포의 재전송에 의해 HLA-A2에 대한 T 세포 리크루팅(recruiting) 2중특이성 항체는 파괴될 수 있다. 이와 같이, CD45-결합 2중특이성 항체는 THP-1 백혈병 블라스트 및 제공자의 T 세포를 포함하여 모든 조혈 세포의 용해를 조정할 것이다. 그러나, 우리의 구성에서, HLA-A2-특이적 폴리펩타이드의 HLA-A2 형질전환 동물로의 주입은 명백한 독성을 일으키지 않았다.
바이스탠더(bystander)에 대한 가능한 독성을 추가적으로 실험하기 위하여, 우리는 THP-1 세포 및 HLA-A2-음성이나 CD45-양성인 단핵구(monocyte)에 대하여 고감도 세포사멸 시험을 이용하였고, 후자는 건강한 바이스탠더 컴파트먼트(compartment)를 나타낸다. 도 12B에 나타난 바와 같이, 우리는 THP-1 세포에서 카스파제(caspase)-3 활성을 관찰했으나, 폴리펩타이드 또는 2중특이성 양성 대조군 및 이식제공자 T 세포의 조합으로 같은 웰에서 처리된 단핵구에서는 관찰되지 않았다. T 세포 및 각각의 폴리펩타이드와 함께 배양된 THP-1 세포는 영향을 받지 않았다. 이러한 관찰은 2중 항원 양성 표적 개체군에서 독점적인 세포사멸의 개시를 다시 분명하게 보여주며, 반면 HLA-A2-음성 바이스탠더 세포들은 남아있음을 보여준다. 이러한 실험은 HLA-미스매치된 줄기 세포 이식을 한 백혈병 환자의 심각한 임상적 상황을 매우 정확하게 만든다. 구별되는 HLA 분자 및 CD45를 이용하는 조합적 접근은 골수 및 림프 기원의 백혈병 블라스트에 반대하여 이식제공자의 T 세포를 재표적함에 의해 요구된 이식편 대 백혈병 반응을 확대시키는 것을 겨냥한다.
실시예 13
고형 종양으로 수행하기 위하여, 우리는 상피 세포 접착 분자 (EpCAM) 및 상피세포 성장인자 수용체 (EGFR) 항원에 조합적 접근을 표적했다. 두 항원들은 다양한 암종에서 과발현하고 임상 단계 II 및 III 시험에서 광범위하게 연구되어왔다. EGFR의 발현은 세포 증식과 밀접하게 연관되어 있고, 반면 EpCAM은 거의 모든 단층 상피의 기저 측 표면에 나타나고 최근에는 Wnt 경로에서 신호 단백질과 같이 활동하는 것이 발견되었다, Maetzel, 2009, Nat Cell Biol 11, 162-171. 도 13a에 나타난 바와 같이, 두 폴리펩타이드는 공동 배양된 이식제공자 림프구로부터 인터페론-γ (IFNγ)의 방출을 촉발시키고, 이중-양성 암 세포주 COLO-206F의 사멸을 나노몰 농도에서 조정하나(도 13a, b), 그러나 조합으로 주여졌을 때만 그러하고 각각의 부분이 따로 주어졌을 때는 그렇지 않다. 신경상피 세포의 자손(descendant)으로서, 흑색종(melanoma) 세포주 FM-55는 EpCAM이 없고, 그러므로 폴리펩타이드에 대해 완전히 저항력이 있다(도 13a, b). EGFR 및 EpCAM의 발현이 증식하는 암종 세포에서 넓게 겹쳐져(overlap) 있지만, 단독으로 EGFR 또는 EpCAM 항원을 각각 발현하는, 예를 들어, 간 및 웨장의 비-증식 상피 세포는 양면적 공격으로부터 덜 민감하거나 덜 보호될 수 있다. 특히, 간 및 췌장 독성은 임상 시험에서 고-친화성 단일클론 EpCAM 항체의 투여량 제한적이었다(검토를 위해, Munz, 2010, Cancer Cell Int 10:44 를 참고하라).
실시예 14
이분 기능 상보성 이론의 추가적 확인이 광범위한 in vitro 실험에 의해 수행되었는데, 다른 폴리펩타이드의 조합을 이용하였고, 서로 다른 인간 세포주에 다양한 세포 표면 항원을 표적으로 하였다.
HLA A2 양성 인간 종양 세포주 FM-55 (골수종), Colo-206F (대장암) 및 OVCAR (난소암)이 건강한 제공자의 HLA-A2 음성 PBMCs, HLA-A2 (CD3(VL) - HLA-A2(VH-VL))에 대한 폴리펩타이드 및 CEA (CD3(VH) - CEA(VH-VL)), EGFR (CD3(VH) - EGFR(VH-VL)) 또는 Her2 (CD3(VH) - Her2(VH-VL))를 표적하는 제 2 폴리펩타이드와 함께 공동배양하였다. 림프구에 의한 IL2 또는 IFN-γ 생산은 ELISA 기술에 의해 측정되었다. 이러한 데이터는 (i) 항원의 특이적 조합인 항원 특징은 다양한 기원(피부, 신경상피, 내장 및 난소 조직)의 암종에 발현될 수 있고, (ii) 항원 특징은 항원 특징에 특이적인 폴리펩타이드 세트를 이용하여 우리의 이분 기능 상보성 전략으로 접근이 가능함을 증명한다. 얻은 데이터는 도 14, 15 및 16에 나타내었다.
실시예 15
기능성 도메인의 교환가능성을 증명하기 위하여, 폴리펩타이드 세트의 단편 F1 및 F2를 서로 교환하였으며, 그들의 T 세포를 이끄는 그들 고유의 항체 도메인의 정확한 복원을 위하여 특이적 상보 능력은 보유한 채로 수행하였다. 그러므로 CD45 및 HLA-A2 표적 항원에 대한 폴리펩타이드 세트가 사용되었다. CD45에 대한 폴리펩타이드는 CD3(VL)를 단편 F1으로서 가졌고, HLA-A2에 대한 폴리펩타이드는 CD3(VH)을 단편 F2로서 가졌다. CD45 및 HLA-A2 양성 골수종 세포주 U266은 건강한 제공자의 HLA-A2 음성 T 세포, 및 CD45 (CD3(VL) - CD45(VH-VL)) 및 HLA-A2 (CD3(VH) - HLA-A2(VH-VL))에 대한 폴리펩타이드와 다양한 양으로 공동배양되었다. T 세포 이끔(engagement)은 ELISA 기술에 의해 측정된 반응성 IFNγ 생산에 의해 평가되었다. IFNγ 생산은 어떤 폴리펩타이드도 없는 실험적 상황에서 발견되지 않았다. 얻은 데이터는 도 17에 나타내었다.
실시예 16
이분 기능 상보성 전략은 암의 항체 치료를 위한 표적으로서 이미 사용된 (EGFR, EpCAM 및 Her2) (Her2은 유방암에서 Trastuzumab의 표적이고, EGFR은 직장암에서 Cetuximab의 표적이고, 및 EpCAM은 종양성 복수(ascites) 치료를 위한 Catumazumab의 표적이다) 항원의 세트를 표적화함에 의해 더 시험되었다. EGFR, EpCAM 및 Her2 양성 세포 (Colo-206F, CX-1 및 OVCAR)는 건강한 제공자의 PBMCs 및 EGFR (CD3(VH) - EGFR(VH+VL)), EpCAM (CD3(VL) - EpCAM(VH+VL)) 및 Her2 (CD3(VH) - Her2(VH+VL))에 대한 폴리펩타이드의 조합과 공동배양하였다. 림프구 자극 기능의 상보는 재활성 IFNγ 생산에 의해 평가되었고, ELISA 기술에 의해 측정되었다. IFNγ 생산은 어떤 폴리펩타이트도 없는 실험적 상황에서 발견되지 않았다. 얻은 데이터는 도 18 및 19에 나타냈다.
실시예 17
가까운 임상적 상관관계로 항원 조합을 테스트하기 위하여, 조합 CD45 및 CD138이 인간 다발성 골수종 (MM) 세포를 표적하기 위해 이용되었다. 인간 MM 세포의 대다수는 CD45 및 CD138에 양성이다. CD45에 대한 T 세포 리크루팅(recruiting) 2중특이성 항체는 환자의 모든 조혈 세포를 죽일지도 모르며, CD138에 대한 T 세포 리크루팅(recruiting) 2중특이성 항체는 다양한 정상 조직 (위장기관의 상피 세포, 내피, 영양막 세포 및 샘세포, The Human Protein Atlas, Version: 10.0, Atlas updated: 2012-09-12)에 나타하기 때문에 심각한 부작용을 일으킬지도 모른다. 그에 반해서 CD45 및 CD138의 조합은 형질세포 및 MM 세포에서 독점적으로 발견되며, 그러므로 표적화 치료적 접근을 위한 좋은 항원 특징이다. CD45 및 CD138 양성 인간 다발성 골수종 세포주 AMO-1는 건강한 제공자의 PBMCs, 및 CD45 (CD3(VL) - CD45(VH+VL)) 및 CD138 (CD3(VH) - CD138(VH+VL))에 대한 폴리펩타이드 조합과 공동배양되었다. 림프구 자극 기능의 상보는 ELISA 기술에 의해 측정된 IFNγ 생산에 의해 평가되었다. IFNγ 생산은 하나의 폴리펩타이드가 있거나 어떤 폴리펩타이드도 없는 실험적 상황에서 발견되지 않았다. 얻은 데이터는 도 20에 나타내었다.
실시예 18
이분 기능 상보성 전략의 추가적 적용은 세포 표면에 단일 항원을 표적하는 것 및 단일 항원 양성 종양 세포를 죽이는 것이다. 기능적 항CD3 결합 사이드(side)로 T 세포 리크루팅(recruiting) 2중특이성 항체를 위한 하나의 주요한 결점은 비특이적 T-세포 활성 및 사이토카인(cytokine) 방출에 의해 초래된 심각한 부작용이다(Linke, R. et al. Catumaxomab: clinical development and future directions. MAbs 2, 129-136 (2010)). 이분 기능 상보성 전략의 이점은 사실, T-세포 활성 항-CD3 기능성 도메인이 표적 세포에 독점적으로 복원되는 항체이다. 표적 세포가 없다면, T-세포 활성 도메인은 나타나지 않는다. CD45 및 CD138 양성 인간 다발성 골수종 세포 AMO-1 및 U266은 건강한 제공자의 PBMCs, 및 CD138 (CD3(VH) - CD138(VH+VL) + CD3(VL) - CD138(VH+VL)) 또는 CD45 (CD3(VH) - CD45(VH+VL) + CD3(VL) - CD45(VH+VL))의 단일 표적 항원에 대한 폴리펩타이드의 조합과 공동배양하였다. 림프구 자극 기능의 상보는 ELISA 기술에 의해 측정된 IFNγ 생산에 의해 평가되었다. IFNγ 생산은 하나의 폴리펩타이드가 있거나 어떤 폴리펩타이드도 없는 실험적 상황에서 발견되지 않았다. 얻은 데이터는 도 21 및 22에 나타내었다. 도 23에서 표적 항원 A1에 두 다른 에피토프 (윗 부분) 또는 같은 에피토프 (아랫 부분)을 표적하는 폴리펩타이드 세트를 이용함에 의하여 단일 항원 접근을 나타냈다.
실시예 19
이것은 기능 상보성 전략이 표적된 페이로드(payload) 전달을 위해 더욱 정교하게 만들어질 수 있고, 다른 유효한 방법이 표적 세포를 죽이기 위해 가능함을 증명하기 위한 예이다. 표적에서 결합된 폴리펩타이드의 세트의 F1 및 F2 단편을 상보함에 의하여, 새롭게 형성된 항체 결합 부위는 그것이 특이적인 어떤 분자라도 결합할 수 있다. HIS-태그된 페이로드(payload)를 정확히 표적 세포로 향하게 하기 위하여, 항-HIS(헥사-히스티딘)-항체의 VH 및 VL 단편이 이용되었다. 폴리펩타이드 1 (항His(VL)-CD45(VH-VL)) 및 폴리펩타이드 2 (antiHis(VH)-HLA-A2(VH-VL))의 특이적 표적 항원 CD45 및 HLA-A2에의 동시 결합 후에, 헥사-히스티딘 결합 부위는 히스티딘 표지된 페이로드(payload)를 높은 친화도로 결합하는 표적에 상보된다. 페이로드(payload)는 이 실시예에서 주어진 HIS-태그된 독소이다. CD45 및 HLA-A2 양성 세포 THP-1은 히스티딘(His)-태그된 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens) 이오타(Iota) 독소 구성요소 Ia (도 24) 또는 히스티딘(His)-태그된 시가(Shiga) 독소 서브유닛 A (도 25, 26)을, CD45 (항His(VL)-CD45(VH-VL)) 및 HLA-A2 (항His(VH)-HLA-A2(VH-VL))에 대한 폴리펩타이드와 조합하여 함께 공동배양하였다. his-태그된 독소 결합 및 그 후의 표적 세포 사멸의 상보성은 알라마블루(alamarBlue®) 분석을 이용하여 세포 생존능력을 측정함에 의해 평가되었다. 가장 높은 사용 폴리펩타이드의 농도 (80nM)에서, 세포 생존능력의 감소로 측정된 표적 세포 사멸의 분명한 차이점이 단일 폴리펩타이드와 비교하여 두 개의 폴리펩타이드를 조합한 실험적 상황에서 발견되었다.
실시예 20
이분 기능 상보성 전략의 다재다능, 융통성 및 교환가능성을 더욱 증명하기 위하여, 다이옥시제닌-표지된 HRP (서양고추냉이 퍼옥시다아제)로 이중 항원 양성 세포를 확인하고 표시하기 위해 항-다이옥시제닌 항체의 VH 및 VL 단편이 이용되었다. EGFR 및 EpCAM 양성 Colo-206F 세포는 EGFR (항Dig(VH) - EGFR(VH+VL)) 및 EpCAM (항Dig(VL) - EpCAM(VH+VL))에 대한 폴리펩타이드와 공동배양되었다. Colo-206F 세포의 다이옥시제닌-HRP 표지에 의해 지정되는, 표적에서 기능성 도메인 항-다이옥시제닌의 상보성은 표준 ELISA 키트(Invitrogen™)를 이용하여 퍼옥시다아제 활성을 측정함에 의해 평가되었다. Dig-HRP 표지된 표적 세포에서 분명한 차이점이 하나의 폴리펩타이드와 비교한 두 개의 폴리펩타이드의 조합을 가지는 실험적 상황에서 발견되었다. 얻은 데이터는 도 27에 나타내었다.
실시예 21
인간 백혈구의 항원 (HLA)을 이분 기능 상보성을 제한하는 두 부분으로 된 항원을 위한 하나의 팔로 사용하여, 이 단상형(haplotype) 전략은 폴리펩타이드의 기능성 도메인을 항-HLA-Cw6 항체의 VH 및 VL 단편으로 교환함으로써 더욱 입증되어진다. HLA-Cw6 양성 초기 환자 PBMCs는 건강한 제공자의 HLA-Cw6 음성 PBMCs, CD45 (CD3(VL) - CD45(VH-VL))에 대한 폴리펩타이드 및 HLA-Cw6 (CD3(VH) - HLA-Cw6(VH-VL))와 함께 공동배양되었다. 림프구에 의한 IFNγ 생산은 ELISA 기술에 의해 측정되었다. 이러한 데이터는 HLA-A2보다 다른 단상형(haplotype)을 가지고 있는 환자의 조혈성 세포는 하나의 표적 도메인(항 HLA-A2, 도 5, 7-9, 11-12)을 간단하게 또 다른 것(항 HLA-Cw6)에 의해 교환함에 의해 표적화될 수 있음을 증명한다. 얻은 데이터는 도 28에 나타내었다.
실시예 22
2중 항원-유도된 이분 기능 상보성 전략은 in vitro 환자 실험에서 더욱 증명되며, 새롭게 분리된 초기 환자 암 세포 및 임상 또는 임상적 시험에서 암 치료를 위해 이미 사용된 항원 표적을 이용한다(EGFR, EpCAM, CEA 및 Her2). 전이성 췌장암을 가지고 있는 48세 남성 환자의 악성 세포를 환자 자신의 말초 혈액 임파구, 및 EGFR (CD3(VH) - EGFR(VH+VL)), EpCAM (CD3(VL) - EpCAM(VH+VL)), Her2 (CD3(VH) - Her2(VH+VL)), CEA (CD3(VH) - CEA(VH-VL)) 및 HLA-A2 (CD3(VL) - HLA-A2(VH-VL))에 대한 폴리펩타이드의 조합과 공동배양하였다. 림프구 자극 기능의 상보성은 반응성 ELISA 기술에 의해 측정된 IFNγ 생산에 의해 평가되었다. IFNγ 생산은 어떤 폴리펩타이드도 없는 실험적 상황에서 발견되지 않았다. 이러한 데이터는 이 전략을 그의 악성 변형된 세포를 표적하고 죽이기 위하여 환자 자신의 면역 세포에 이용하기 위한 잠재력을 증명한다. 얻은 데이터는 도 29에 나타내었다.
실시예 23
T-세포 개체군을 제한하는 매우 강화된 CD3/CD8 양성 CMV는, 특이성과 관계 없이, 상보성 전략을 이용함에 의해 어떤 T 세포가 주효 세포로 제공될 수 있고, 이중 항원 양성 종양 세포를 죽일 수 있음을 나타내기 위하여 사용되었다. CD45 및 HLA-A2 양성 U266 및 THP-1 세포는 HLA-A2 음성의 건강한 제공자의 시토메갈로바이러스 (CMV) 특이적 T-세포 및 CD45 (CD3(VH) - CD45(VH-VL)) 및 HLA-A2 (CD3(VL) HLA-A2(VH-VL))에 대한 폴리펩타이드와 다양한 양으로 공동배양되었다. 2중특이성 탠덤(tandem) scFv (CD3(VH-VL) x HLA-A2(VH-VL))-항체는 양성 대조군으로 사용되었다. T 세포 고용(engagement)은 ELISA 기술에 의해 측정된 반응성 IFNγ 생산에 의해 평가되었다. IFNγ 생산은 하나의 폴리펩타이드를 가지거나 어떤 폴리펩타이드도 가지지 않는 실험적 상황에서 발견되지 않았다. 얻은 데이터는 도 30에 나타내었다. 같은 얼려진 분액(aliquot) 배치(batch)의 세포, CMV 특이적 T-세포 및 THP-1 세포는 in vivo 쥐 모델을 위해 사용되었다 (도 12A).
실시예 24
이 설명은 이분 기능 상보성 전략을 가지고 알레르겐(allergen)/ 자가면역 특이적 B-세포 클론(clone)을 표적하기 위한 잠재력을 나타낸다. 표적 모이어티로서 합성된 알레르겐을 이용함에 의하여, 알레르겐 결합된 폴리펩타이드는 알레르겐 특이적 B-세포 클론의 표면에 발현되는 클로노타입의 B-세포 수용체에 특이적으로 결합할 것이다. 이분 구조체 전략의 두 번째 팔은 B-세포 특이적 폴리펩타이드 (CD19, CD20, CD38, CD138)를 이용할 것이며, 알레르겐 특이적 B-세포 클론을 죽이는 다음 표적 세포로 주효 도메인의 뒤따르는 상보성을 억제할 것이다. 이 전략의 궁극적인 목표는 알레르기성 또는 자가면역 질병(도 31의 윗 부분)을 일으키는 B 세포 클론을 제거하는 것이며, 반면 Fc-수용체를 통하여 질병에 원인이 되는 항체와 결합하는 B 세포와 다른 세포 (예를 들어, 비만 세포 또는 호염기세포) 또는 다른 특이성을 가지는 B 세포를 남게 한다(도 31의 아랫 부분).
본 명세서, 청구항, 및/또는 첨부 도면에 나타난 본 발명의 특징은 분리되어서 그리고 이의 어떤 조합에서라도 다양한 형태로 발명을 실현하기 위한 자료가 될 수 있다.
<110> Julius Maximilians Universitat Wurzburg <120> Dual antigen-induced bipartite functional complementation <130> W1010 PCT S3 <150> EP 12 15 1125.7 <151> 2012-01-13 <160> 198 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH anti-CD3 <400> 1 Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL anti-CD3 <400> 2 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Ala Ala Ala 100 105 110 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH anti-CD3 <400> 3 Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL anti-CD3 <400> 4 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> huMAb anti-CD variant 9 VH <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> huMAb anti-CD variant 1 VL <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Ile Lys Arg 100 105 110 Thr <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VH (L2K) <400> 7 Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VL (L2K) <400> 8 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VH (145.2C11) <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Lys 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Ser Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Thr Ser Ser Ser Ile Asn Ile Lys Tyr Ala Asp Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Leu Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ile Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Asp Trp Asp Lys Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr 115 <210> 10 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VL (145.2C11) <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Asn Lys Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Ser Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp 100 105 110 <210> 11 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HIS VH <400> 11 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Asp Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Glu Ser Gln Ser Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 100 105 110 Ser Ala <210> 12 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HIS VL <400> 12 Asp Tyr Lys Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Pro Val 1 5 10 15 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 20 25 30 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 35 40 45 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 80 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 100 105 110 Glu Ile Lys Arg 115 <210> 13 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-DIG VH <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Asn Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr 115 120 125 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-DIG VL <400> 14 Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Arg 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe 115 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VH CDR1 (WT) <400> 15 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His 1 5 10 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VH CDR2 (VH5) <400> 16 Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VH CDR3 (WT) <400> 17 Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VK CDR1 (WT) <400> 18 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VK CDR2 (WT) <400> 19 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VK CDR3 (WT) <400> 20 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VH CDR1 (WT) <400> 21 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His 1 5 10 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VH CDR2 (WT) <400> 22 Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VH CDR3 (WT) <400> 23 Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VK CDR1 (WT) <400> 24 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VK CDR2 (WT) <400> 25 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VK CDR3 (WT) <400> 26 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VH CDR1 (UCHT-1) <400> 27 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn 1 5 10 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VH CDR2 (UCHT-1) <400> 28 Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val 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Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VL CDR 1 (L2K) <400> 36 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VL CDR 3 (L2K) <400> 37 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VH CDR 1 (145-2C11) <400> 38 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VH CDR 2 (145-2C11) <400> 39 Ile Thr Ser Ser Ser Ile Asn Ile 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VH CDR 3 (145-2C11) <400> 40 Ala Arg Phe Asp Trp Asp Lys Asn Tyr 1 5 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VL CDR 1 (145-2C11) <400> 41 Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 VL CDR 3 (145-2C11) <400> 42 Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr 1 5 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Asp Ile Lys Asn Tyr 1 5 <210> 51 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HLA-A2 VH <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Ser 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu 100 105 110 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-HLA-A2 VL <400> 52 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr 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CCGE1002 Shiga toxin subunit A (a.a.24-285) 6x histidine tag two protease cleavage sites <400> 161 Met Ala Ser Thr Thr His His His His His His Asp Thr Asp Ile Pro 1 5 10 15 Thr Thr Gly Gly Gly Ser Arg Pro Asp Asp Asp Asp Lys Glu Asn Leu 20 25 30 Tyr Phe Gln Gly His Met Glu Phe Ser Val Asp Phe Thr Ser Pro Gln 35 40 45 Lys Tyr Val Gln Ser Leu Gly Ala Ile Arg Ala Ala Met Gly Asp Ala 50 55 60 Met Ser Leu Thr Asn Ile Pro Gly Asn Lys Ile Leu Tyr Gln Leu Arg 65 70 75 80 Pro Asp Ala Ser Asn Ile Val Glu Gly Val Thr Ile Glu Ile Ile Gly 85 90 95 Val Gly Arg Asn Asn Ser Pro Ser Asn Arg Asp Val Arg Phe Val Ile 100 105 110 Asn Pro Ser Asp Leu Tyr Leu Thr Gly Phe Ile Val Gly Arg Ile Phe 115 120 125 Tyr Arg Phe Ser Asp Phe Ser Asp Thr Ala Ser Gly Arg Val Gln Val 130 135 140 Asn Ala Pro Arg His Leu Val Asp Phe Thr Ile Asp Met Thr Val Asp 145 150 155 160 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Ala Arg Ser Ala Gly Val Ser Ala Asp Arg 165 170 175 Thr Asp Leu Ser Ile Asp Arg Tyr Ser Leu Met Lys Gly Tyr Arg Asp 180 185 190 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<223> Human RNASE3 ribonuclease (RNase A family, 3) protein without N-terminale signal peptide but with a N-terminal nuclear localisation sequence 6x histidine tag <400> 168 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Arg Pro Pro Gln Phe Thr 1 5 10 15 Arg Ala Gln Trp Phe Ala Ile Gln His Ile Ser Leu Asn Pro Pro Arg 20 25 30 Cys Thr Ile Ala Met Arg Ala Ile Asn Asn Tyr Arg Trp Arg Cys Lys 35 40 45 Asn Gln Asn Thr Phe Leu Arg Thr Thr Phe Ala Asn Val Val Asn Val 50 55 60 Cys Gly Asn Gln Ser Ile Arg Cys Pro His Asn Arg Thr Leu Asn Asn 65 70 75 80 Cys His Arg Ser Arg Phe Arg Val Pro Leu Leu His Cys Asp Leu Ile 85 90 95 Asn Pro Gly Ala Gln Asn Ile Ser Asn Cys Thr Tyr Ala Asp Arg Pro 100 105 110 Gly Arg Arg Phe Tyr Val Val Ala Cys Asp Asn Arg Asp Pro Arg Asp 115 120 125 Ser Pro Arg Tyr Pro Val Val Pro Val His Leu Asp Thr Thr Ile His 130 135 140 His His His His His 145 <210> 169 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen for human myeloma cell line U266 antibody IgE-ND <400> 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<400> 183 Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Glu His Leu Met Cys Asp Ile Asp 1 5 10 15 Gly Gln Ala Ser Asn Ser Leu Ala Ser Ala Ile Val Gly His Asp Gly 20 25 30 Ser Val Trp Ala Gln Ser Ser Ser Phe Pro Gln Phe Lys Pro Gln Glu 35 40 45 Ile Thr Gly Ile Met Lys Asp Phe Glu Glu Pro Gly His Leu Ala Pro 50 55 60 Thr Gly Leu His Leu Gly Gly Ile Lys Tyr Met Val Ile Gln Gly Glu 65 70 75 80 Ala Gly Ala Val Ile Arg Gly Lys Lys Gly Ser Gly Gly Ile Thr Ile 85 90 95 Lys Lys Thr Gly Gln Ala Leu Val Phe Gly Ile Tyr Glu Glu Pro Val 100 105 110 Thr Pro Gly Gln Cys Asn Met Val Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu 115 120 125 Ile Asp Gln Gly Leu 130 <210> 184 <211> 263 <212> PRT <213> Phleum pratense <400> 184 Met Ala Ser Ser Ser Ser Val Leu Leu Val Val Val Leu Phe Ala Val 1 5 10 15 Phe Leu Gly Ser Ala Tyr Gly Ile Pro Lys Val Pro Pro Gly Pro Asn 20 25 30 Ile Thr Ala Thr Tyr Gly Asp Lys Trp Leu Asp Ala Lys Ser Thr Trp 35 40 45 Tyr Gly Lys Pro Thr Gly Ala Gly Pro Lys Asp Asn Gly Gly Ala Cys 50 55 60 Gly Tyr Lys Asp Val Asp Lys Pro Pro Phe Ser Gly Met Thr Gly Cys 65 70 75 80 Gly Asn Thr Pro Ile Phe Lys Ser Gly Arg Gly Cys Gly Ser Cys Phe 85 90 95 Glu Ile Lys Cys Thr Lys Pro Glu Ala Cys Ser Gly Glu Pro Val Val 100 105 110 Val His Ile Thr Asp Asp Asn Glu Glu Pro Ile Ala Pro Tyr His Phe 115 120 125 Asp Leu Ser Gly His Ala Phe Gly Ala Met Ala Lys Lys Gly Asp Glu 130 135 140 Gln Lys Leu Arg Ser Ala Gly Glu Leu Glu Leu Gln Phe Arg Arg Val 145 150 155 160 Lys Cys Lys Tyr Pro Glu Gly Thr Lys Val Thr Phe His Val Glu Lys 165 170 175 Gly Ser Asn Pro Asn Tyr Leu Ala Leu Leu Val Lys Tyr Val Asn Gly 180 185 190 Asp Gly Asp Val Val Ala Val Asp Ile Lys Glu Lys Gly Lys Asp Lys 195 200 205 Trp Ile Glu Leu Lys Glu Ser Trp Gly Ala Ile Trp Arg Ile Asp Thr 210 215 220 Pro Asp Lys Leu Thr Gly Pro Phe Thr Val Arg Tyr Thr Thr Glu Gly 225 230 235 240 Gly Thr Lys Thr Glu Ala Glu Asp Val Ile Pro Glu Gly Trp Lys Ala 245 250 255 Asp Thr Ser Tyr Glu Ser Lys 260 <210> 185 <211> 122 <212> PRT <213> Phleum pratense <400> 185 Met Ser Met Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Leu Ala Met Ala Val 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Phe Ala Gly Ala Trp Cys Val Pro Lys Val Thr Phe 20 25 30 Thr Val Glu Lys Gly Ser Asn Glu Lys His Leu Ala Val Leu Val Lys 35 40 45 Tyr Glu Gly Asp Thr Met Ala Glu Val Glu Leu Arg Glu His Gly Ser 50 55 60 Asp Glu Trp Val Ala Met Thr Lys Gly Glu Gly Gly Val Trp Thr Phe 65 70 75 80 Asp Ser Glu Glu Pro Leu Gln Gly Pro Phe Asn Phe Arg Phe Leu Thr 85 90 95 Glu Lys Gly Met Lys Asn Val Phe Asp Asp Val Val Pro Glu Lys Tyr 100 105 110 Thr Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Pro Glu Glu 115 120 <210> 186 <211> 159 <212> PRT <213> Malus x domestica <400> 186 Met Gly Val Tyr Thr Phe Glu Asn Glu Phe Thr Ser Glu Ile Pro Pro 1 5 10 15 Ser Arg Leu Phe Lys Ala Phe Val Leu Asp Ala Asp Asn Leu Ile Pro 20 25 30 Lys Ile Ala Pro Gln Ala Ile Lys Gln Ala Glu Ile Leu Glu Gly Asn 35 40 45 Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Thr Phe Gly Glu Gly Ser Gln 50 55 60 Tyr Gly Tyr Val Lys His Arg Ile Asp Ser Ile Asp Glu Ala Ser Tyr 65 70 75 80 Ser Tyr Ser Tyr Thr Leu Ile Glu Gly Asp Ala Leu Thr Asp Thr Ile 85 90 95 Glu Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Lys Leu Val Ala Cys Gly Ser Gly Ser 100 105 110 Thr Ile Lys Ser Ile Ser His Tyr His Thr Lys Gly Asn Ile Glu Ile 115 120 125 Lys Glu Glu His Val Lys Val Gly Lys Glu Lys Ala His Gly Leu Phe 130 135 140 Lys Leu Ile Glu Ser Tyr Leu Lys Asp His Pro Asp Ala Tyr Asn 145 150 155 <210> 187 <211> 96 <212> PRT <213> Dactylis glomerata <400> 187 Val Lys Val Thr Phe Lys Val Glu Lys Gly Ser Asp Pro Lys Lys Leu 1 5 10 15 Val Leu Asp Ile Lys Tyr Thr Arg Pro Gly Asp Thr Leu Ala Glu Val 20 25 30 Glu Leu Arg Gln His Gly Ser Glu Glu Trp Glu Pro Leu Thr Lys Lys 35 40 45 Gly Asn Leu Trp Glu Val Lys Ser Ser Lys Pro Leu Thr Gly Pro Phe 50 55 60 Asn Phe Arg Phe Met Ser Lys Gly Gly Met Arg Asn Val Phe Asp Glu 65 70 75 80 Val Ile Pro Thr Ala Phe Lys Ile Gly Thr Thr Tyr Thr Pro Glu Glu 85 90 95 <210> 188 <211> 269 <212> PRT <213> Phalaris aquatica <400> 188 Met Met Lys Met Val Cys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Leu Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Leu Ala Val Phe Val Gly Ser Ala Gln Gly Ile Ala Lys 20 25 30 Val Pro Pro Gly Pro Asn Ile Thr Ala Glu Tyr Gly Asp Lys Trp Leu 35 40 45 Asp Ala Lys Ser Thr Trp Tyr Gly Lys Pro Thr Gly Ala Gly Pro Lys 50 55 60 Asp Asn Gly Gly Ala Cys Gly Tyr Lys Asp Val Asp Lys Ala Pro Phe 65 70 75 80 Asn Gly Met Thr Gly Cys Gly Asn Thr Pro Ile Phe Lys Asp Gly Arg 85 90 95 Gly Cys Gly Ser Cys Phe Glu Leu Lys Cys Ser Lys Pro Glu Ser Cys 100 105 110 Ser Gly Glu Pro Ile Thr Val His Ile Thr Asp Asp Asn Glu Glu Pro 115 120 125 Ile Ala Pro Tyr His Phe Asp Leu Ser Gly His Ala Phe Gly Ser Met 130 135 140 Ala Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Val Arg Gly Ala Gly Glu Leu Glu 145 150 155 160 Leu Gln Phe Arg Arg Val Lys Cys Lys Tyr Pro Asp Gly Thr Lys Pro 165 170 175 Thr Phe His Val Glu Lys Gly Ser Asn Pro Asn Tyr Leu Ala Leu Leu 180 185 190 Val Lys Tyr Val Asp Gly Asp Gly Asp Val Val Ala Val Asp Ile Lys 195 200 205 Glu Lys Gly Lys Asp Lys Trp Ile Glu Leu Lys Glu Ser Trp Gly Ala 210 215 220 Ile Trp Arg Ile Asp Thr Pro Asp Lys Leu Thr Gly Pro Phe Thr Val 225 230 235 240 Arg Tyr Thr Thr Glu Gly Gly Thr Lys Ala Glu Phe Glu Asp Val Ile 245 250 255 Pro Glu Gly Trp Lys Ala Asp Thr His Asp Ala Ser Lys 260 265 <210> 189 <211> 246 <212> PRT <213> Cynodon dactylon <400> 189 Ala Ile Gly Asp Lys Pro Gly Pro Asn Ile Thr Ala Thr Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Lys Trp Leu Glu Ala Arg Ala Thr Phe Tyr Gly Ser Asn Pro Arg Gly 20 25 30 Ala Ala Pro Asp Asp His Gly Gly Ala Cys Gly Tyr Lys Asp Val Asp 35 40 45 Lys Pro Pro Phe Asp Gly Met Thr Ala Cys Gly Asn Glu Pro Ile Phe 50 55 60 Lys Asp Gly Leu Gly Cys Arg Ala Cys Tyr Glu Ile Lys Cys Lys Glu 65 70 75 80 Pro Val Glu Cys Ser Gly Glu Pro Val Leu Val Lys Ile Thr Asp Lys 85 90 95 Asn Tyr Glu His Ile Ala Ala Tyr His Phe Asp Leu Ser Gly Lys Ala 100 105 110 Phe Gly Ala Met Ala Lys Lys Gly Gln Glu Asp Lys Leu Arg Lys Ala 115 120 125 Gly Glu Leu Thr Leu Gln Phe Arg Arg Val Lys Cys Lys Tyr Pro Ser 130 135 140 Gly Thr Lys Ile Thr Phe His Ile Glu Lys Gly Ser Asn Asp His Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Leu Leu Val Lys Tyr Ala Ala Gly Asp Gly Asn Ile Val Ala 165 170 175 Val Asp Ile Lys Pro Arg Asp Ser Asp Glu Phe Ile Pro Met Lys Ser 180 185 190 Ser Trp Gly Ala Ile Trp Arg Ile Asp Pro Lys Lys Pro Leu Lys Gly 195 200 205 Pro Phe Ser Ile Arg Leu Thr Ser Glu Gly Gly Ala His Leu Val Gln 210 215 220 Asp Asp Val Ile Pro Ala Asn Trp Lys Pro Asp Thr Val Tyr Thr Ser 225 230 235 240 Lys Leu Gln Phe Gly Ala 245 <210> 190 <211> 214 <212> PRT <213> Bos primigenius <400> 190 Met Lys Leu Leu Ile Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg 1 5 10 15 Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn 20 25 30 Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly 35 40 45 Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr 50 55 60 Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys Gln Met Glu Ala Glu Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Glu Gln Lys His Ile 85 90 95 Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln 100 105 110 Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile Val Pro 115 120 125 Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly Ile His Ala 130 135 140 Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu Ala Tyr Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gln Phe Tyr Gln Leu Asp Ala Tyr Pro Ser 165 170 175 Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gln Tyr Thr Asp Ala Pro 180 185 190 Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys 195 200 205 Thr Thr Met Pro Leu Trp 210 <210> 191 <211> 142 <212> PRT <213> Bos primigenius <400> 191 Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala 1 5 10 15 Thr Gln Ala Glu Gln Leu Thr Lys Cys Glu Val Phe Arg Glu Leu Lys 20 25 30 Asp Leu Lys Gly Tyr Gly Gly Val Ser Leu Pro Glu Trp Val Cys Thr 35 40 45 Thr Phe His Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gln Ala Ile Val Gln Asn Asn 50 55 60 Asp Ser Thr Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Asn Asn Lys Ile Trp Cys 65 70 75 80 Lys Asp Asp Gln Asn Pro His Ser Ser Asn Ile Cys Asn Ile Ser Cys 85 90 95 Asp Lys Phe Leu Asp Asp Asp Leu Thr Asp Asp Ile Met Cys Val Lys 100 105 110 Lys Ile Leu Asp Lys Val Gly Ile Asn Tyr Trp Leu Ala His Lys Ala 115 120 125 Leu Cys Ser Glu Lys Leu Asp Gln Trp Leu Cys Glu Lys Leu 130 135 140 <210> 192 <211> 386 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 192 Met Gly Ser Ile Gly Ala Ala Ser Met Glu Phe Cys Phe Asp Val Phe 1 5 10 15 Lys Glu Leu Lys Val His His Ala Asn Glu Asn Ile Phe Tyr Cys Pro 20 25 30 Ile Ala Ile Met Ser Ala Leu Ala Met Val Tyr Leu Gly Ala Lys Asp 35 40 45 Ser Thr Arg Thr Gln Ile Asn Lys Val Val Arg Phe Asp Lys Leu Pro 50 55 60 Gly Phe Gly Asp Ser Ile Glu Ala Gln Cys Gly Thr Ser Val Asn Val 65 70 75 80 His Ser Ser Leu Arg Asp Ile Leu Asn Gln Ile Thr Lys Pro Asn Asp 85 90 95 Val Tyr Ser Phe Ser Leu Ala Ser Arg Leu Tyr Ala Glu Glu Arg Tyr 100 105 110 Pro Ile Leu Pro Glu Tyr Leu Gln Cys Val Lys Glu Leu Tyr Arg Gly 115 120 125 Gly Leu Glu Pro Ile Asn Phe Gln Thr Ala Ala Asp Gln Ala Arg Glu 130 135 140 Leu Ile Asn Ser Trp Val Glu Ser Gln Thr Asn Gly Ile Ile Arg Asn 145 150 155 160 Val Leu Gln Pro Ser Ser Val Asp Ser Gln Thr Ala Met Val Leu Val 165 170 175 Asn Ala Ile Val Phe Lys Gly Leu Trp Glu Lys Ala Phe Lys Asp Glu 180 185 190 Asp Thr Gln Ala Met Pro Phe Arg Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Pro 195 200 205 Val Gln Met Met Tyr Gln Ile Gly Leu Phe Arg Val Ala Ser Met Ala 210 215 220 Ser Glu Lys Met Lys Ile Leu Glu Leu Pro Phe Ala Ser Gly Thr Met 225 230 235 240 Ser Met Leu Val Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu 245 250 255 Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn 260 265 270 Val Met Glu Glu Arg Lys Ile Lys Val Tyr Leu Pro Arg Met Lys Met 275 280 285 Glu Glu Lys Tyr Asn Leu Thr Ser Val Leu Met Ala Met Gly Ile Thr 290 295 300 Asp Val Phe Ser Ser Ser Ala Asn Leu Ser Gly Ile Ser Ser Ala Glu 305 310 315 320 Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn 325 330 335 Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val Asp Ala 340 345 350 Ala Ser Val Ser Glu Glu Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Cys 355 360 365 Ile Lys His Ile Ala Thr Asn Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg Cys Val 370 375 380 Ser Pro 385 <210> 193 <211> 147 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 193 Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Gly Lys Val Phe Gly Arg Cys Glu Leu Ala Ala Ala Met Lys Arg 20 25 30 His Gly Leu Asp Asn Tyr Arg Gly Tyr Ser Leu Gly Asn Trp Val Cys 35 40 45 Ala Ala Lys Phe Glu Ser Asn Phe Asn Thr Gln Ala Thr Asn Arg Asn 50 55 60 Thr Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Leu Gln Ile Asn Ser Arg Trp 65 70 75 80 Trp Cys Asn Asp Gly Arg Thr Pro Gly Ser Arg Asn Leu Cys Asn Ile 85 90 95 Pro Cys Ser Ala Leu Leu Ser Ser Asp Ile Thr Ala Ser Val Asn Cys 100 105 110 Ala Lys Lys Ile Val Ser Asp Gly Asn Gly Met Asn Ala Trp Val Ala 115 120 125 Trp Arg Asn Arg Cys Lys Gly Thr Asp Val Gln Ala Trp Ile Arg Gly 130 135 140 Cys Arg Leu 145 <210> 194 <211> 187 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 194 Met Lys Leu Leu Leu Leu Cys Leu Gly Leu Ile Leu Val Cys Ala Gln 1 5 10 15 Gln Glu Glu Asn Ser Asp Val Ala Ile Arg Asn Phe Asp Ile Ser Lys 20 25 30 Ile Ser Gly Glu Trp Tyr Ser Ile Phe Leu Ala Ser Asp Val Lys Glu 35 40 45 Lys Ile Glu Glu Asn Gly Ser Met Arg Val Phe Val Asp Val Ile Arg 50 55 60 Ala Leu Asp Asn Ser Ser Leu Tyr Ala Glu Tyr Gln Thr Lys Val Asn 65 70 75 80 Gly Glu Cys Thr Glu Phe Pro Met Val Phe Asp Lys Thr Glu Glu Asp 85 90 95 Gly Val Tyr Ser Leu Asn Tyr Asp Gly Tyr Asn Val Phe Arg Ile Ser 100 105 110 Glu Phe Glu Asn Asp Glu His Ile Ile Leu Tyr Leu Val Asn Phe Asp 115 120 125 Lys Asp Arg Pro Phe Gln Leu Phe Glu Phe Tyr Ala Arg Glu Pro Asp 130 135 140 Val Ser Pro Glu Ile Lys Glu Glu Phe Val Lys Ile Val Gln Lys Arg 145 150 155 160 Gly Ile Val Lys Glu Asn Ile Ile Asp Leu Thr Lys Ile Asp Arg Cys 165 170 175 Phe Gln Leu Arg Gly Asn Gly Val Ala Gln Ala 180 185 <210> 195 <211> 228 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 195 Met Leu Lys Val Ser Cys Leu Phe Val Leu Leu Cys Gly Leu Leu Val 1 5 10 15 Pro Ser Ser Ala Gln Gln Ile Pro Pro Glu Val Ser Ser Gln Ile Thr 20 25 30 Asp Ala Leu Thr Gln Gly Leu Leu Asp Gly Asn Phe Leu Ser Leu Leu 35 40 45 Asn Ala Ile Asn Leu Glu Gly Leu Leu Asn Thr Ile Leu Asp Gln Val 50 55 60 Thr Gly Leu Leu Asn Ile Leu Val Gly Pro Leu Leu Gly Pro Ser Asp 65 70 75 80 Ala Glu Ile Lys Leu Gln Asp Thr Arg Leu Leu Gln Leu Ser Leu Glu 85 90 95 Phe Ser Pro Asp Ser Lys Gly Ile Asp Ile Trp Ile Pro Leu Glu Leu 100 105 110 Ser Val Tyr Leu Lys Leu Leu Ile Leu Glu Pro Leu Thr Leu Tyr Val 115 120 125 Arg Thr Asp Ile Arg Val Gln Leu Arg Leu Glu Ser Asp Glu Asp Gly 130 135 140 Lys Tyr Arg Leu Ala Phe Gly His Cys Ser Leu Leu Pro Arg Ala Ile 145 150 155 160 Glu Leu Gln Ser Gly Asn Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ala Val Leu 165 170 175 Gly Thr Ile Glu Asn Ala Leu Gly Asn Phe Ile Thr Glu Asp Leu Gly 180 185 190 Ala Gly Leu Cys Pro Thr Leu Asn Ser Leu Val Ser Asn Leu Asp Leu 195 200 205 Gln Leu Val Asn Asn Leu Ile Asn Leu Ile Leu Asp Arg Ala Asn Val 210 215 220 Asp Leu Ser Val 225 <210> 196 <211> 558 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding pelB-CD3(VL) -FLAG-BirA-U266Ant-6His <220> <221> source <222> (1)..(558) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Nucleotide sequence encoding pelB-CD3(VL) - FLAG-BirA-U266Ant-6His" /organism="Artificial Sequence" <400> 196 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60 atggccgaca ttcagctgac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 120 gtcaccatga cctgcagagc cagttcaagt gtaagttaca tgaactggta ccagcagaag 180 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aagtggcttc tggagtccct 240 tatcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcatactctc tcacaatcag cagcatggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccaa cagtggagta gtaacccgct cacgttcggt 360 gctgggacca agctggagct gaaatccgga ggtggtggat ccgactacaa ggatgacgat 420 gacaaaggcg gcggcctgaa cgatattttt gaagcgcaga aaattgaatg gcatctgagc 480 ccgcatctgc tgtgggatct gtttcgcgtg ggcctgccgg gcgcggcggg cggcggccat 540 catcaccatc atcattag 558 <210> 197 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pelB-CD3(VL) - FLAG-BirA-U266Ant-6His <400> 197 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser 50 55 60 Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly 130 135 140 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Leu Ser 145 150 155 160 Pro His Leu Leu Trp Asp Leu Phe Arg Val Gly Leu Pro Gly Ala Ala 165 170 175 Gly Gly Gly His His His His His His 180 185 <210> 198 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alternative linker <400> 198 Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Asp

Claims (46)

  1. 하기 제 1 폴리펩타이드 P1 및 제 2 폴리펩타이드 P2를 포함하는 폴리펩타이드 세트로,
    상기 제 1 폴리펩타이드 P1은
    (i) 항원 A1에 특이적으로 결합하는 표적 모이어티 T1, 및
    (ii) 기능성 도메인 F의 단편 F1, 상기 단편 F1 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P1 단독으로는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하지 않는 것
    을 포함하고,
    상기 제 2 폴리펩타이드 P2는
    (i) 항원 A2에 특이적으로 결합하는 표적 모이어티 T2, 및
    (ii) 상기 기능성 도메인 F의 단편 F2, 상기 단편 F2 단독으로 또는 상기 폴리펩타이드 P2 단독으로는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하지 않는 것
    을 포함하며,
    상기 항원 A1은 상기 항원 A2와 상이하고,
    상기 폴리펩타이드 P1 및 상기 폴리펩타이드 P2는 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 모두 가지는 세포가 존재하지 않는 경우 서로 결합되지 않고,
    상기 폴리펩타이드 P1의 상기 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 상기 단편 F2의 이합체화 될 때, 상기 이합체는 상기 도메인 F의 기능에 관하여 작용하며,
    상기 단편 F1은 항체의 VL 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 상기 동일 항체의 VH 도메인을 포함하거나; 상기 단편 F1은 VH 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 상기 동일 항체의 VL 도메인을 포함하고,
    상기 표적 모이어티 T1은 scFv(단쇄가변분절, single-chain variant fragment)이고, 상기 표적 모이어티 T2는 scFv(단쇄가변분절, single-chain variant fragment)인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 가지는 세포는 상기 폴리펩타이드 P1의 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 단편 F2의 이합체화를 유도하는 반면, 세포 표면에 항원 A1 및 A2를 가지지 않는 세포는 상기 폴리펩타이드 P1의 단편 F1과 상기 폴리펩타이드 P2의 단편 F2의 이합체화를 유도하지 않는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드 P1 및 P2는, 상기 기질 또는 세포가 존재하지 않는 경우, 10-8 M 내지 10-2 M 범위, 10-7 M 내지 10-3 M 범위, 또는 10-6 M 내지 10-3 M 범위의 해리 상수 KD를 서로 가지고; 및/또는 상기 폴리펩타이드 P1 및 P2는, 상기 기질 또는 세포가 존재하는 경우, 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 10-8 M이하, 또는 10-9 M이하의 해리 상수 KD를 서로 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항원 A1 및/또는 상기 항원 A2는 종양 세포의 표면 또는 종양 전구/선구 세포(progenitor/precursor cell)의 표면에 발현된 항원인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항원 A1 및 항원 A2의 조합은 암세포에서만 발견되며, 암세포가 아닌 경우에는 발견되지 않는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항원 A1 및 항원 A2의 조합은 특정 타입 암의 암세포에 특이적인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항원 A1은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 대립유전자 변이체인 MHC 항원이고:
    HLA-A2, HLA-Cw6, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A25, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B35, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, 및 HLA-Cw7; 및/또는
    상기 항원 A2는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 특정 세포 종류 또는 세포 계통에 특이적인 항원인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트:
    CD45; CD34; CD33; CD138; CD15; CD1a; CD2; CD3; CD4; CD5; CD8; CD20; CD23; CD31; CD43; CD56; CD57; CD68; CD79a; CD146; 계면활성제 단백질; 신경접합단백질 (synaptophysin); 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nicotinic acetylcholine receptor); 근육 특이적 키나아제 MUSK; 전압 의존성 칼슘 채널 (P/Q-type); 전압 의존성 칼륨 채널 (VGKC); N-메틸-D-아스파르트산수용체 (NMDA); TSH 수용체; 암피파이신 (amphiphysin); HepPar-1; 강글리오사이드 (ganglioside) GQ1B, GD3 또는 GM1; 및 글라이코포린-A (glycophorin-A).
  9. 제1항에 있어서,
    상기 항원 A1 및 A2는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트:
    HLA-A2; HLA-Cw6; EpCAM; CD20; CD33; CD38; CD45; Her2; EGFR; CD138; CEA; CD19; PSMA; E-cadherin; Ca-125; Her-2/neu; GCDFP(gross cystic disease fluid protein); BCA-225; CA 19-9; CD117; CD30; 상피 항원(Epithelial antigen) BER-EP4, 상피막 항원(Epithelial membrane antigen) 및 상피 관련 항원(Epithelial Related Antigen) MOC-31; 상피세포생장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor) HER1; 혈소판유래 생장인자수용체 알파(Platelet derived growth factor receptor PDGFR alpha); 흑색종 연관 마커(Melanoma associated marker)/Mart 1/Melan-A; CD133; TAG 72; 아쿠아포린-2 및 B 세포 표면의 클론형 항체.
  10. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 항원 A1 및 A2중 하나는 EpCAM이고 다른 하나는 EGFR, HER2/neu, CD10, VEGF-R 또는 MDR;
    (ii) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 MCSP이고 다른 하나는 멜라노페린(melanoferrin) 또는 EpCAM;
    (iii) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 CA125 이고 다른 하나는 CD227;
    (iv) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 CD56이고 다른 하나는 CD140b 또는 GD3 강글리오사이드(ganglioside);
    (v) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 EGFR이고 다른 하나는 HER2;
    (vi) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 PSMA이고 다른 하나는 HER2;
    (vii) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 Sialyl Lewis이고 다른 하나는 EGFR;
    (viii) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 CD44이고 다른 하나는 ESA, CD24, CD133, MDR 또는 CD117;
    (ix) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 CD34이고 다른 하나는 CD19, CD79a, CD2, CD7, HLA-DR, CD13, CD117, CD33 또는 CD15;
    (x) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 CD33이고 다른 하나는 CD19, CD79a, CD2, CD7, HLA-DR, CD13, CD117 또는 CD15;
    (xi) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 MUC1이고 다른 하나는 CD10, CEA 또는 CD57;
    (xii) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 CD38이고 다른 하나는 CD138;
    (xiii) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 CD 24이고 다른 하나는 CD29 또는 CD49f;
    (xiv) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 탄산무수화효소(carbonic anhydrase) IX이고 다른 하나는 아쿠아포린-2(aquaporin-2);
    (xv) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 HLA-A2이고 다른 하나는 EpCAM;
    (xvi) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 HLA-A2이고 다른 하나는 CD45;
    (xvii) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 HLA-A2이고 다른 하나는 EGFR;
    (xviii) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 HLA-A2이고 다른 하나는 Her2;
    (xix) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 HLA-A2이고 다른 하나는 CEA;
    (xx) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 EpCAM이고 다른 하나는 CEA;
    (xxi) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 CD45이고 다른 하나는 CD138;
    (xxii) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 EGFR이고 다른 하나는 CEA;
    (xxiii) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 Her2이고 다른 하나는 CEA; 또는
    (xxiv) 상기 항원 A1 및 A2 중 하나는 CD19이고 다른 하나는 B 세포 표면의 클론형 항체인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 도메인 F는 면역글로불린 모듈, 형광 모듈, 또는 생체발광을 조정할 수 있는 모듈이거나, 면역글로불린 모듈, 형광 모듈, 또는 생체발광을 조정할 수 있는 모듈을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 기능성 도메인 F는 항체의 Fv (variant fragment) 인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
  17. 삭제
  18. 제1항에 있어서,
    상기 단편 F1은 항-CD3, 항-His 또는 항-DIG 항체의 VL 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 상기 동일 항체의 VH 도메인을 포함하거나, 또는 상기 단편 F1은 항-CD3, 항-His 또는 항-DIG 항체의 VH 도메인을 포함하고 상기 단편 F2는 상기 동일 항체의 VL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 면역글로불린 모듈은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 V 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트:
    (i) 서열번호 2를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 1을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인;
    (ii) 서열번호 4를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 3을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인;
    (iii) 서열번호 6을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 5를 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인;
    (iv) 서열번호 8을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 7을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인;
    (v) 서열번호 10을 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 9를 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-CD3 항체의 V 도메인;
    (vi) 서열번호 12를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 11을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-His 항체의 V 도메인; 및
    (vii) 서열번호 14를 포함하는 VL 도메인 및/또는 서열번호 30을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항-DIG 항체의 V 도메인.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드 P1 및 P2중 어느 하나는 서열번호 114-129 및 197로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 세트.
  21. 제1항, 제3항 내지 제10항, 제15항 내지 제16항 및 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드 세트는 암 및/또는 종양에 걸린 환자의 치료에 이용하거나, 또는 암 및/또는 종양에 걸린 환자의 진단에 이용하기 위한 것인 폴리펩타이드 세트.
  22. 제1항, 제3항 내지 제10항, 제15항 내지 제16항 및 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 세트 또는 폴리펩타이드 세트의 폴리펩타이드 중 하나를 암호화하는 핵산분자 또는 핵산분자 세트.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 핵산분자 또는 핵산분자 세트는 서열번호 135-150 및 196 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산분자 또는 핵산분자 세트.
  24. 제1항, 제3항 내지 제10항, 제15항 내지 제16항 및 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 세트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  25. 제1항, 제3항 내지 제10항, 제15항 내지 제16항 및 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 세트를 포함하는 키트.
  26. 제22항에 따른 핵산분자/핵산분자 세트를 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  27. 제22항에 따른 핵산분자 또는 핵산분자 세트를 포함하는 키트.
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