BR112014017182B1

BR112014017182B1 - Conjunto de polipeptídeos, molécula de ácido nucleico ou um conjunto de moléculas de ácidos nucleicos, composição farmacêutica e kit

Info

Publication number: BR112014017182B1
Application number: BR112014017182-3A
Authority: BR
Inventors: Gernot Stuhler
Original assignee: Julius-Maximilians-Universität Würzburg
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2013-01-14
Publication date: 2023-08-29

Abstract

COMPLEMENTAÇÃO FUNCIONAL BIPARTIDA INDUZIDA POR ANTIGENO DUPLO A presente invenção refere-se ao conjunto de polipetídeos e seus usos. Em particular, a presente invenção refere-se ao conjunto de polipetídeos em que este conjunto compreende dois polipeptídeos em que cada um compreende uma porção "T" alvo de ligação a um antígeno "A" e um fragmento "F" de um domínio funcional, em que os referidos dois polipetídeos não estão associados um ao outro na ausência de um substrato que possui um "A" em (na) sua superfície e em que, mediante a dimerização de "F", o dímero resultante se torna funcional. Além disso, os usos de diagnóstico e médico dos referidos conjuntos são descritos. Mais ainda, a presente invenção refere-se à(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica(m) o referido conjunto de polipetídeos. A presente invenção também refere-se a um vetor que compreende sequência de nucleotídeo da(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica (m) o referido conjunto de polipetídeos. Além disso, a presente invenção refere-se às composições farmacêuticas que compreendem o referido conjunto de polipetídeos. Ainda mais, a presente invenção refere-se ao kit que compreende compreendem o referido conjunto de polipetídeos.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um conjunto de polipeptí- deos e seus usos. Em particular, a presente invenção refere-se a um conjunto de polipeptídeos em que este conjunto é composto por meio de dois polipeptídeos cada um dos quais compreende uma porção- alvo "T" de ligação a um antígeno "A" e um fragmento do "F" de um domínio funcional, em que os referidos dois polipeptídeos não são associados um com o outro na ausência de um substrato que tem "A" em (a) sua superfície e em que, mediante a dimerização de "M", o dímero resultante torna-se funcional. Além disso, usos médicos e de diagnóstico do referido conjunto são descritos. Além disso, a presente invenção refere-se à (s) molécula (s) de ácido nucleico que codifica (m) o referido conjunto de polipeptídeos. A presente invenção também se refere a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos da (s) molécula (s) de ácido nucleico que codifica (m) o referido conjunto de polipeptídeos. Além disso, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que compreende o referido conjunto de polipeptí- deos. Além disso, a presente invenção refere-se a um kit que compreende o referido conjunto de polipeptídeos.

[002] Nos últimos anos têm sido visto um número de artigos que relatam um marco notável de eficácia no que diz respeito aos cons- tructos de anticorpos bi-específicos para a terapia imune de tumores in vitro e em testes clínicos e pré-clínicos iniciais. Hoje em dia, um número substancial de diferentes constructos biespecíficos está disponível, os quais diferem em tamanho, composição, farmacocinética e capacidade de eliminar de maneira direta as células neoplásicas ou para engatar as células efetoras imunológicas para a lise das células do tu mor.

[003] As estratégias imunes de câncer baseadas em anticorpos são opções terapêuticas altamente promissoras devido à sua excelente sensibilidade e especificidade para estruturas-alvo.

[004] A organização estrutural e funcional modular dos anticorpos permite a manipulação extensiva por meio da engenharia genética. Os diferentes domínios do tipo imunoglobulina podem ser separados e/ou unidos sem perder as características funcionais associadas a domínios específicos. Além disso, eles podem ser combinados e ligados com domínios de proteína heterólogos, mas também com porções não- peptídicas. Por conseguinte, é possível desenvolver os constructos de fusão de uma forma racional sem as limitações naturais de anticorpos convencionais.

[005] As proteínas de fusão à base de anticorpo podem ser gera das com novas propriedades biológicas e/ou farmacêuticas. Existem esforços promissores para modificar a capacidade de o domínio Fc para induzir ADCC (anticorpo dependente da citotoxicidade celular mediada) e CDC (citotoxicidade dependente de complemento), por meio da mutagênese, depende da aplicação pretendida, ou para reduzir os efeitos colaterais (mutações) ou inibidores para aumentar a eficácia terapêutica (mutações ativadoras). Novas aplicações que se tornam possível por meio da engenharia genética são ainda mais variadas, quando o domínio de ligação ao antígeno dos anticorpos é considerado.

[006] O antígeno reconhecendo os domínios variáveis da cadeia pesada (VH) e da cadeia leve (VL) de um anticorpo pode ser unido por meio de um ligante peptídico através de engenharia genética, preservando a capacidade de ligação ao antígeno. Tais fragmentos variáveis de cadeia única de ligação ao antígeno (scFvs) podem ser utilizados como substitutos de anticorpos pequenos com capacidade de penetrar o tecido de alta e baixa tempo de retenção de soro para procedimentos de imagens clínicas e radioterapia e outras aplicações. Mais importante, estas porções de scFv podem ser facilmente utilizadas como módulos específicos de antígenos no desenvolvimento de novas terapêuticas recombinantes.

[007] Relatórios recentes indicam um enorme potencial de anti corpos biespecíficos recombinantes em terapia anti-tumoral. Tais anticorpos biespecíficos reconhecem dois antígenos, um dos quais é expresso por meio do tumor, enquanto que o outro é normalmente encontrado em uma célula imune. A maioria dos anticorpos biespecíficos em terapia anti-tumor tem como-alvo um marcador de linhagem associado a um tumor, de um lado e CD3ε, uma molécula invariante do complexo receptor de células T /CD3, por outro lado, recrutando, dessa maneira, as células T para destruir o tumor [Muller e Kontermann, Anticorpos biespecicos para imunoterapia de cancer: perspectivas atuais. Biofármacos 2010, 24 (2): 89 a 98].

[008] Apesar das muitas opções para manipular a estrutura e função dos anticorpos, a eficácia terapêutica de tais reagentes com base em anticorpos é limitada pela natureza do antígeno-alvo, a acessibilidade do antígeno no tumor e tecidos associados a tumores e a aptidão do anticorpo para provocar ou mediar a função de induzir a morte celular desejada.

[009] Por exemplo, quando os pacientes são tratados com os constructos biespecíficos direcionados contra antígenos também expressos em tecidos com funções vitais, efeitos secundários graves são observados. Este é um problema grave, uma vez que, com a excepão de um número desconhecido de moléculas de superfície de células mutadas individualmente e o anticorpo monoclonal do receptor de células T ou B, no caso de linfomas, antígenos específicos de tumor que discriminam uma célula transformada com o seu progenitor saudável não estão disponíveis.

[0010] Uma vez que os conceitos terapêuticos com base na utili zação de anticorpos biespecíficos geralmente dependem do recrutamento de células efetoras, verifica-se que quanto mais eficaz a ferramenta (constructo biespecífico), mais provável que os efeitos secundários ocorram, e até mesmo a expressão de antígeno por minute no tecido não transformado pode causar efeitos fora do alvo incontroláveis.

[0011] Em 2008, a Science publicou o primeiro relatório sobre a eficácia do anticorpo MT103/blinatumomab envolvendo a célula T bio- específica de cadeia única (BiTE); o mesmo induz remissões em cerca de 80% dos pacientes com linfoma recidivados ou refratários para quimioterapia imune padrão a níveis séricos de cerca de 5 ordens de magnitude mais baixas do que os níveis séricos relatados para o anticorpo monoclonal rituximab (Bargou, R. et al, Science 321, 974 a 977, 2008). Esta publicação e relatórios posteriores sobre os ensaios de fase II de confirmação em leucemia linfática aguda (ALL) marcou o início de uma nova era de anticorpos bi-específicos, até então em grave morte por quase duas décadas, devido à toxicidade sistêmica e pouca ou nenhuma atividade terapêutica. Principalmente no que diz respeito ao tal papel da ciência, os anticorpos bi-específicos tornaram-se um campo florescente de novo, em que mais de 35 formatos diferentes foram contados (Reichert, Drugs Discov Today. 17 (2012) 954 a 963). Estes formatos diferem em tamanho e são optimizados para a afinidade para o antígeno, a estabilidade, a capacidade de recrutar as élulas efetoras (principalmente células T) e da farmacocinética. A afinidade ou a avidez dos constructos são manipuladas por meio da maturação de afinidade utilizando as diversas técnicas ou simplesmente juntando- se vários domínios de scFv em linha, a fim de criar um constructo multivalente. Até mesmo os anticorpos triespecíficos são relatados, os quais são projetados para melhorar as capacidades de ligação de exi- bição, abordando duas, em vez de uma molécula-alvo. A estabilidade dos formatos podem ser optimizadas por meio da adição de domínios do tipo imunoglobulina, a fim de imitar os anticorpos que ocorrem naturalmente e que, simultaneamente, melhoram as propriedades farma- cocinéticas tais como semi-vida prolongada no soro, e a proteção contra a digestão proteolítica por meio das proteases. Além disso, a estabilidade dos formatos pode ser melhorada por meio da optimização da produção. Uma vez que sequências de ligação que são utilizadas para juntar de uma forma covalente os domínios scFv muitas vezes levam a agregados, as linhagens de produção têm sido estabelecidas, em que primeiro produzem dois ou três polipeptídeos que podem ser facilmente montados de novo, a fim de gerar um fármaco funcional. Estas técnicas utilizam pontes de dissulfeto dirigidas ou reagentes de ligação cruzada de forma covalente para se juntar aos dois polipeptídeos diferentes. Outras técnicas de fazer uso de domínios-hetero ou homo- dimerização como domínios do tipo leucina-zipper, domínios Fc e outros do tipo saliência em tecnologias de furos (vide, por exemplo, WO 2007/062466). Além disso, as interações de VH e VL, que podem ser estabilizadas por meio da ligação do antígeno, foram utilizadas nos chamados imunoensaios em sanduíche aberto para a detecção do an- tígeno (Ueda, Nature Biotechnology 14 (1996), 1714 a 1718; Ohmuro- Matsuyama (2012) Detection of Proteína Phosphorylation by OpenSandwich Immunoassay, Integrative Proteomics, Dr. Hon-Chiu Leung (Ed.), ISBN: 978-953-51-0070-6; WO 2004/016782/EP-A1 1.536.005.) .

[0012] No entanto, os constructos bi/tri-específico e bi-ou poliva lentes descritos na técnica têm desvantagens. Em primeiro lugar, a ausência de antígenos tumorais verdadeiramente específicos que podem ser abordados como molécula-alvo. De fato, quanto mais potente é o formato de anticorpo biespecífico, mais grave são os danos colaterais, porque os antígenos-alvo abordados até agora são antígenos de diferenciação partilhados por meio dos tumores e células não malignas. Em consequência, os formatos de bi-ou tri-específicos da técnica anterior não podem discriminar células maligna de células não- malignas. A este respeito, os constructos triespecíficos, desenvolvidos para a ligação às células-alvo de avidez elevada, podem vir a conferir um elevado grau de efeitos fora do alvo devido a ligação de uma molécula-alvo em geral ser suficiente para recrutar as células do sistema imunológico para a destruição de uma célula que expressa amolécula- alvo. Dessa maneira, o construto triespecífico aumenta a avidez do custo de especificidade. As análises recentes de vários parâmetros indicam que as células do tumor podem ser distinguidas a partir de seus respectivos tecidos não transformados de origem devido à expressão de assinaturas de antígenos aberrantes. Hoje, estes resultados constituem uma parte integrante do sistema de classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS) de neoplasias hematopoiéticas, e também são verdadeiras para o câncer e células tronco ou células de inicialização do câncer de outra proveniência. Dessa maneira, seria vantajoso alvejar as células que expressam simultaneamente uma combinação de antígenos que em conjunto significam um estado maligno. Nenhum dos anticorpos descritos pela técnica anterior é capaz de discriminar entre as células que expressam uma combinação de antígenos-alvo de células positivas de antígenos individuais. Em segundo lugar, um problema importante de tecnologias de anticorpos bi- específicos utilizando, por exemplo, os módulos de CD3 completos (por exemplo, um anti-CD3 scFv) é a capacidade inerente destas proteínas para estimular ou pré-estimular as células T independentemente de se ligar ao antígeno-alvo nas células-alvo e muitos efeitos secundários observados até agora parecem estar associados com a função da célula T errante.

[0013] Dessa maneira, existe uma necessidade na técnica para as opções de tratamento mais específicos no tratamento de câncer, em particular, há uma necessidade de melhorar as formas de detectar e/ou eliminar as células de carcinoma com uma especificidade mais elevada e reduzir os efeitos colaterais.

[0014] Necessidades semelhantes existem na área do transplante de células tronco hematopoiéticas, isto é, o transplante de células tronco obtidas a partir de uma outra pessoa para um paciente. Um paciente que sofre de leucemia reincidente ou refratária ou outra doença hematológica pode ser tratado por meio da quimioterapia/radiação (para eliminar as células malignas hematopoiéticas) em combinação com um transplante de células hematopoiéticas de um doador saudável. Se a eliminação de células malignas é incompleta, o tumor pode voltar a crescer a partir das células recipientes que sobrevivem malignas, apesar da presença de células saudáveis fornecidas por meio do transplante. Como resultado, as taxas de sobrevivência entre os pacientes submetidos a tratamento de tumores e transplante alogênico são significativamente reduzidas.

[0015] No entanto, é difícil de eliminar (e, de forma semelhante, identificar) os sobreviventes de células malignas, com elevada especificidade e, dessa maneira, apesar de várias tentativas, boas soluções para este problema não foram encontradas. Por conseguinte, existe uma necessidade na técnica para proporcionar melhores maneiras de identificar e/ou eliminar especificamente as tais células receptoras malignas com efeitos secundários mínimos sobre outras células.

[0016] O enxerto (células tronco para transplante alogênico), dado logo após a terapia de condicionamento (radiação/quimioterapia) pode substituir e reconstituir a hematopoiese. O enxerto é colhido a partir de medula óssea ou de células de sangue periférico, estimuladas e contém cerca de um por cento das células tronco hematopoiéticas, que são a fonte das células de sangue recentemente construídas. Além disso, o enxerto contém normalmente um grande número de células do sistema imunológico, em particular linfócitos T, que são parte do sistema imunitário e pode ser muito benéfico em casos em que essas células T montam um ataque imune contra as células leucêmicas. Esta situação é também descrita e conhecida como efeito de enxerto versus leucemia. Por outro lado, uma resposta imune errante que dirige as células T contra o paciente, conhecida como doença de enxerto versus hospedeiro, é também frequentemente observada.

[0017] Para minimizar a doença enxerto versus hospedeiro, os en xertos são normalmente selecionados com base na HLA (antígenos de leucócitos humanos) ou MHC (complexo principal de histocompatibili- dade). Quanto mais próximos os antígenos entre doador e receptor coincidem, menor é a probabilidade de enxerto versus hospedeiro grave. No entanto, para muitos pacientes, um enxerto combinado completo não pode ser encontrado. Nestes casos, a medula óssea ou as células tronco do sangue periférico são utilizadas que diferem em uma ou mesmo mais moléculas HLA. Estes situação clínica exige um rigoroso regime imunossupressor após o transplante para manter o sistema de células T estritamente sob controle.

[0018] Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção forne cer formas melhoradas para a identificação e/ou eliminar especificamente os tipos específicos de células. Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecer formas melhoradas para a identificação e/ou eliminar as células que possuem uma combinação específica de dois antígenos específicos na sua superfície celular especificamente. Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecer formas melhoradas para a identificação e/ou eliminar especificamente as células de carcinoma. Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecer as formas melhoradas para a identificação específica e/ou eliminar as células que (1) são de uma determinada origem (tal como, na situa- ção de um tecido ou de células, as células provenientes do destinatário ou do doador) e que (2) pertencem a um tipo específico de célula ou linhagem de células (tais como as células hematopoiéticas).

[0019] Os objetivos da presente invenção são resolvidos por meio de um conjunto de polipeptídeos que compreende:

[0020] um primeiro polipeptídeo que compreende P1

[0021] uma porção-alvo T1,

[0022] em que a referida porção-alvo T1 se liga especificamente a um antígeno A1, e

[0023] um fragmento F1 de um domínio funcional F,

[0024] em que nem o referido fragmento F1 por si só, nem o refe rido polipeptídeo P1 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F,

[0025] e

[0026] um segundo polipeptídeo que compreende P2

[0027] uma porção-alvo T2,

[0028] em que a referida porção-alvo T2 se liga especificamente a um antígeno A2, e

[0029] um fragmento F2 do referido domínio funcional F,

[0030] em que nem o referido fragmento F2 por si só, nem o refe rido polipeptídeo P2 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F,

[0031] em que o referido antígeno A1 é diferente do referido antí- geno A2,

[0032] em que o referido polipeptídeo P1 e o Referido polipeptídeo P2 não estão associados um com o outro na ausência de um substrato que tem ambos os antígenos de A1 e A2 em ou na sua superfície, mais especificamente uma célula que transporta ambos os antígenos de A1 e A2 para ou sobre a sua superfície celular, e

[0033] em que, mediante a dimerização de o referido fragmento do referido polipeptídeo F1 P1 com o referido fragmento F2 do referido polipeptídeo P2, o dímero resultante é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F.

[0034] Os objetivos da presente invenção também são resolvidos por meio de um conjunto de polipeptídeos que compreende:

[0035] um primeiro polipeptídeo que compreende P1

[0036] uma porção-alvo T1,

[0037] em que a referida porção-alvo T1 se liga especificamente a um antígeno A1, e

[0038] um fragmento F1 de um domínio funcional F,

[0039] em que nem o referido fragmento F1 por si só, nem o refe rido polipeptídeo P1 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F,

[0040] e

[0041] um segundo polipeptídeo que compreende P2

[0042] uma porção-alvo T2,

[0043] em que a referida porção-alvo T2 se liga especificamente a um antígeno A2, e

[0044] um fragmento F2 do referido domínio funcional F,

[0045] em que nem o referido fragmento F2 por si só, nem o refe rido polipeptídeo P2 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F,

[0046] em que o referido antígeno A1 é diferente do referido antí- geno A2,

[0047] em que

[0048] o referido fragmento F1 compreende um domínio VL de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VH do mesmo anticorpo; ou em que o referido fragmento F1 compreende um domínio VH de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VL do mesmo anticorpo; ou

[0049] o referido fragmento F1 compreende um domínio VL de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VH do mesmo anticorpo; ou em que o referido fragmento F1 compreende um domínio VH de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VL do mesmo anticorpo; e

[0050] em que o referido polipeptídeo P1 e o Referido polipeptídeo P2 não estão associados um com o outro na ausência de um substrato que tem ambos os antígenos de A1 e A2 em ou na sua superfície, mais especificamente uma célula que transporta ambos os antígenos de A1 e A2 para ou sobre a sua superfície celular, e

[0051] em que, mediante a dimerização de o referido fragmento do referido polipeptídeo F1 P1 com o referido fragmento F2 do referido polipeptídeo P2, o dímero resultante é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F.

[0052] Os objetivos da presente invenção também são resolvidos por um conjunto de polipeptídeos que compreende:

[0053] um primeiro polipeptídeo que compreende P1

[0054] uma porção-alvo T1,

[0055] em que a referida porção-alvo T1 se liga especificamente a um antígeno A1, e

[0056] um fragmento F1 de um domínio funcional F,

[0057] em que nem o referido fragmento F1 por si só, nem o refe rido polipeptídeo P1 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F,

[0058] e

[0059] um segundo polipeptídeo que compreende P2

[0060] uma porção-alvo T2,

[0061] em que a referida porção-alvo T2 se liga especificamente a um antígeno A2, e

[0062] um fragmento F2 do referido domínio funcional F,

[0063] em que nem o referido fragmento F2 por si só, nem o refe rido polipeptídeo P2 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F,

[0064] em que o referido antígeno A1 é diferente do referido antí- geno A2,

[0065] em que

[0066] (c) o referido fragmento F1 compreende um domínio VL de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VH do mesmo anticorpo; ou em que o referido fragmento F1 compreende um domínio VH de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VL do mesmo anticorpo;

[0067] (d) o referido polipeptídeo P1 e o Referido polipeptídeo P2 não estão associados um com o outro na ausência de um substrato que tem ambos os antígenos de A1 e A2, na sua superfície, mais especificamente uma célula que transporta ambos os antígenos de A1 e A2, na sua superfície celular; ou

[0068] (e) o referido fragmento F1 compreende um domínio VL de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VH do mesmo anticorpo; ou em que o referido fragmento F1 compreende um domínio VH de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VL do mesmo anticorpo; e

[0069] em que o referido polipeptídeo P1 e o Referido polipeptídeo P2 não estão associados um com o outro na ausência de um substrato que tem ambos os antígenos de A1 e A2, na sua superfície, mais especificamente uma célula que transporta ambos os antígenos de A1 e A2, na sua superfície celular, e

[0070] em que, mediante a dimerização do referido fragmento do referido polipeptídeo F1 P1 com o referido fragmento F2 do referido polipeptídeo P2, o dímero resultante é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F, e em que os referidos polipeptídeos P1 e P2, em particular, os referidos fragmentos F1 e F2, têm, na ausência de um substrato ou de células, um com o outro uma dissociação KD constante no intervalo de 10-8 M a 10-2 M.

[0071] A presente invenção refere-se ainda aos seguintes itens:

[0072] 1. O conjunto de polipeptídeos que compreende:

[0073] um primeiro polipeptídeo que compreende P1

[0074] uma porção-alvo T1,

[0075] em que a referida porção-alvo T1 se liga especificamente a um antígeno A1, e

[0076] um fragmento F1 de um domínio funcional F,

[0077] em que nem o referido fragmento F1 por si só, nem o refe rido polipeptídeo P1 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F,

[0078] e

[0079] um segundo polipeptídeo que compreende P2

[0080] uma porção-alvo T2,

[0081] em que a referida porção-alvo T2 se liga especificamente a um antígeno A2, e

[0082] um fragmento F2 do referido domínio funcional F,

[0083] em que nem o referido fragmento F2 por si só, nem o refe rido polipeptídeo P2 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F,

[0084] em que o referido antígeno A1 é diferente do referido antí- geno A2,

[0085] em que o referido polipeptídeo P1 e o Referido polipeptídeo P2 não estão associados um com o outro na ausência de um substrato que tem ambos os antígenos de A1 e A2, na sua superfície, mais especificamente uma célula que transporta ambos os antígenos de A1 e A2, na sua superfície celular, e

[0086] em que, mediante a dimerização de o referido fragmento do referido polipeptídeo F1 P1 com o referido fragmento F2 do referido polipeptídeo P2, o dímero resultante é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F.

[0087] 2. O conjunto de polipeptídeos de acordo com o item 1, em que uma célula possuindo ambos os antígenos A1 e A2, na sua superfície celular induz a dimerização da Fragmento F1 do referido polipep- tídeo P1 com o Fragmento F2 do referido polipeptídeo P2, ao passo que uma célula que não comporta ambos os antígenos de A1 e A2, na sua superfície celular, não induz a dimerização da Fragmento F1 do referido polipeptídeo P1 com o Fragmento F2 do referido polipeptídeo P2.

[0088] 3. O conjunto de polipeptídeos de acordo com o item 1 ou 2, em que a referida porção-alvo T1 compreende um módulo de imu- noglobulina, de preferência, um módulo de I1 imunoglobulina que compreende um domínio VL ligado a um domínio VH, mais de preferência, um módulo de I1 de imunoglobulina que compreende um scFv (fragmento de variante de cadeia única) de um anticorpo, ou um módulo de imunoglobulina que compreende uma região Vhh do domínio variável de um anticorpo de lama, o anticorpo de camelo ou anticorpos de tubarão,

[0089] e/ou a referida porção-alvo T2 compreende um módulo de imunoglobulina, de preferência, um módulo de I2 de imunoglobulina que compreende um domínio VL ligado a um domínio VH, mais de preferência, um módulo de I2 de imunoglobulina que compreende um scFv (fragmento de variante de cadeia única) de um anticorpo, ou um módulo de imunoglobulina que compreende uma região Vhh do domínio variável de um anticorpo de lama, o anticorpo ou anticorpos de camelo de tubarão,

[0090] ou em que a referida porção-alvo T1 e/ou a referida porção- alvo T2 compreende um aptâmero ou um ligante natural do referido antígeno A1 ou Antígeno A2, respectivamente

[0091] 4. O conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer dos itens precedentes, em que o referido antígeno A1 e/ou Referido antí- geno A2 é um antígeno expresso sobre a superfície de células de um tumor ou na superfície de células progenitoras/precursoras de um tumor, de preferência um antígeno expresso sobre a superfície de células de um tumor hematológico ou um antígeno expresso sobre a superfície de células de um tumor não-hematológico.

[0092] 5. O conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer um dos itens precedentes, em que a combinação de antígeno A1 e Antí- geno A2 só é encontrada em células de carcinoma, e não em células que não são cancerígenas, e em que, de preferência, a combinação de antígeno e A1 Antígeno A2 é específica para as células de carcinoma de um certo tipo de câncer.

[0093] 6. O conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer dos itens precedentes, em que o referido antígeno é um antígeno A1 de MHC, de preferência, uma variante alélica de qualquer dos alelos HLA- A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ, HLA-DR, ou HLA-DM, mais de preferência, uma variante alélica de uma molécula MHC de classe I, mais de preferência, uma variante alélica selecionada a partir do grupo que consiste em HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A25, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B35, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, e HLA-Cw7 e/ou o referido antígeno A2 é um antígeno que é específico para um determinado tipo celular ou linhagem de células.

[0094] 7. O conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer dos itens precedentes, em que o referido domínio funcional F é um módulo de imunoglobulina, de preferência um scFv (fragmento de variante de cadeia única) de um anticorpo, ou uma molécula fluorescente, GFP ou de preferência de uma variante da GFP, ou uma molécula capaz de mediar a bioluminescência, preferencialmente Gaussia luci- ferase.

[0095] 8. O conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer dos itens precedentes, em que o referido domínio funcional F é um domínio que se liga especificamente a uma molécula veículo, de preferência, uma molécula veículo, que é um peptídeo ou uma molécula de hidrato de carbono, ou um marcador de afinidade, de preferência, um marcador de afinidade selecionado a partir do grupo que consiste em um marcador FLAG, um marcador myc, um marcador glutationa-S- transferase (GST), um marcador hemaglutinina (HA), um marcador poli-histidina (His) e um marcador da proteína de ligação a maltose (PAM).

[0096] 9. O conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer dos itens precedentes, em que o referido domínio funcional F é um domínio que se liga especificamente a um composto radioativo, um domínio que se liga especificamente a uma molécula de toxina que por si só não é capaz de penetrar através da célula membrana de uma célula humana e que é internalizado em uma célula humana mediante a associação com a membrana celular da referida célula, um domínio que se liga especificamente a uma molécula fluorescente, ou um domínio que se liga especificamente a uma molécula capaz de mediar a biolu- minescência.

[0097] 10. O conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer dos itens precedentes, em que o referido fragmento F1 compreende um domínio VL de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VH do mesmo anticorpo, em que, de preferência, o referido anticorpo é um anticorpo anti-CD3, ou em que o referido fragmento F1 compreende um domínio VH de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VL do mesmo anticorpo, em que, de preferência, o referido anticorpo é um anticorpo anti-CD3.

[0098] 11. O conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer um dos itens precedentes, para uso no tratamento de um paciente que sofre de um tumor ou para uso em diagnóstico em um paciente que sofre de um tumor, de preferência, para uso no tratamento de um paciente que sofre de um tumor e de tecido alogênico ou submetido a transplante de células ou destinado a ser submetido a esse transplante ou para uso em diagnóstico de um paciente que sofre de um tumor submetido ou destinado a tecido alogênico ou transplante de células, em que, de preferência, o referido conjunto de polipeptídeos é administrado ao referido paciente.

[0099] 12. Uma molécula de ácido nucleico ou um conjunto de mo léculas de ácidos nucleicos que codificam o conjunto de polipeptídeos ou de um dos polipeptídeos do conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer dos itens precedentes.

[00100] 13. Vetor que compreende a sequência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico de acordo com o item 12, ou a sequência de uma das moléculas de ácido nucleico de um conjunto de moléculas de ácidos nucleicos de acordo com o item 12.

[00101] 14. Uma composição farmacêutica que compreende quer o conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer itens de 1 a 11 ou a molécula de ácido nucleico/conjunto de moléculas de ácidos nucleicos de acordo com o item 12, ou o vetor de acordo com o item 13, em que, de preferência, a referida composição farmacêutica compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00102] 15. Um kit que compreende o conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer um dos itens 1-11.

[00103] De preferência, o referido antígeno A1 é uma molécula da superfície das células. De preferência, o referido antígeno A2 é uma molécula da superfície das células. De preferência, o referido antígeno A1 é específico para o estado maligno de uma célula. De preferência, o referido antígeno A2 é específico para um determinado tipo celular ou linhagem de células ou para o estado maligno de uma célula. De preferência, o referido antígeno A1 é específico para um tipo de célula maligna. De preferência, o referido antígeno A2 é específico para um tipo de célula maligna.

[00104] Em um aspecto, a presente invenção relaciona-se com o conjunto de polipeptídeos como definido e descrito na presente invenção, em que, no entanto, o antígeno A1 é o mesmo que o antígeno A2. Dessa maneira, em um tal conjunto de polipeptídeos P1 e P2, o fragmento F1 pode ser ligado à porção-alvo e T1 o fragmento F2 pode ser ligado à porção-alvo T2, enquanto que tanto T1 e T2 se ligam especificamente ao mesmo antígeno. Neste contexto, o epitopo no antígeno A1, ao qual a porção-alvo liga-se T1, pode ser o mesmo ou um epitopo diferente como o epitopo no antígeno A2, para a qual a porção-alvo liga-se T2. No caso do epitopo no antígeno A1 é o mesmo que o epí- topo no antígeno A2, Polipeptídeo P1 pode compreender uma porção- alvo, que é idêntica à porção-alvo composta em P2. Além disso, este aspecto da presente invenção baseia-se na vantagem de que o conjunto de polipeptídeos de P1 e P2, com o domínio F interrompido não exibe efeitos fora do alvo (por exemplo, sem pré-ativação das células T Exibindo CD3 e, consequentemente, nas propriedades menos tóxicas e/ou efeitos colaterias, por exemplo, em comparação com os anticorpos biespecíficos convencionais).

[00105] Em uma modalidade, o referido fragmento F1 e o referido fragmento F2 em conjunto são o referido domínio funcional F.

[00106] Em uma modalidade, o referido polipeptídeo P1 e o Referido polipeptídeo P2 não estão de uma forma covalente ligados uns aos outros, na ausência de um substrato que tem ambos os antíge- nos de A1 e A2, na sua superfície, mais especificamente uma célula que transporta ambos os antígenos de A1 e A2, na sua superfície celular.

[00107] Em uma modalidade, o referido polipeptídeo P1 e o Referido polipeptídeo P2 não estão de uma forma covalente ligados uns aos outros.

[00108] O referido polipeptídeo P1 e polipeptídeo P2 e/ou, em particular, o referido fragmento F1 e fragmento F2, como aí compreendido, mais em particular o VH e VL, que pode ser aí compreendido, não são associados uns com os outros, em especial quando administrados a um indivíduo em necessidade de intervenção médica, Isto é, em necessidade de terapia e/ou diagnóstico. Por conseguinte, os meios farmacêuticos ou de diagnóstico proporcionados na presente invenção compreendem dois polipeptídeos de P1 e P2 como incluído no "conjunto de polipeptídeos"definido na presente invenção, de forma não associada. A associação dos dois referidos polipeptídeos têm lugar in vivo, sob a presença do referido substrato ou célula. De acordo com a presença do referido substrato ou celular, a associação dos dois referidos polipeptídeos pode ser (ainda mais) estabilizada por meio de um agente de estabilização (por exemplo, um an- tígeno, como, por exemplo, CD3, HIS ou DIG, como descrito na presente invenção). Preferencialmente, eles não estão associados um com o outro na ausência do referido substrato ou de células e/ou não dimerizam na ausência do referido substrato ou célula. Mais preferencialmente, eles não estão associados uns com os outros na ausência do referido substrato ou de células e/ou não dimerizam na ausência do referido substrato ou celular, mesmo se um agente está presente, que estabiliza a associação e/ou a dimerização do polipep- tídeo P1 e polipeptídeo P2 e/ou, em particular, fragmento F1 e fragmento F2, ou seja, mesmo que o referido polipeptídeo P1 e Polipeptí- deo P2 e/ou, em particular, o referido fragmento F1 e fragmento F2 está presente em um agente de estabilização/complexo trimérico/P1 (F1)/P2 (F2) (por exemplo, em um antígeno/complexo trimérico VH/VL).

[00109] Em uma modalidade específica, o referido polipeptídeo P1 e Polipeptídeo P2 e/ou, em particular, o referido fragmento F1 e fragmento F2, como aí compreendido, mais em particular o VH e VL, que pode ser aí compreendido, são associados uns com os outros e/ou dimerizam em três partes do complexo de formação, de preferência por meio de uma interação mediada por um agente que estabiliza a associação e/ou a dimerização do polipeptídeo P1 e Polipeptídeo P2 e/ou, em particular, Fragmento F1 e Fragmento F2 (por exemplo, um antígeno mediada interação). Mais preferencialmente, no entanto, esta associação e/ou a dimerização ocorre apenas na presença do referido substrato ou célula.

[00110] A força de afinidade com a qual, por exemplo, zíperes de leucina e/ou os domínios constantes de imunoglobulina, tal como CH3 ou fragmentos Fc, hetero e homodimerização é estimada e estar em uma dissociação KD constante no intervalo de 10-8 a 10-11 ~ M (vide, por exemplo, Zhu (1997) Proteína Sci. 6, 781-8,.. Pluckthun (1997) Immunotech 3, 83-105). Este intervalo de KD é claramente inferior à KD com os quais, na ausência do referido substrato ou célula, associação e/ou a dimerização dos referidos polipeptídeos de P1 e P2, em particular tais fragmentos F1 e F2, da presente invenção podem ocorrer. Dessa maneira, em uma modalidade, Polipeptídeo P1 e polipeptí- deo P2 e/ou, em particular, Fragmento F1 e Fragmento F2 como aí compreendido, mais em particular o VH e VL, que pode ser aí compreendido, associado com o outro e/ou na ausência dimeriza do referido substrato ou célula só com um KD que é superior à Kd, por exemplo, hetero- e homodimerização de zíperes de leucina e/ou os domínios constantes de imunoglobulina, tal como CH3 ou fragmentos Fc. Na presença do referido substrato ou célula, prevê-se que polipeptídeo P1 e Polipeptídeo P2 e/ou, em particular, Fragmento F1 e Fragmento F2 como aí compreendido, mais em particular o VH e VL, que pode ser aí compreendido, associado como outro e/ou dimeriza com um KD, que é no intervalo de KD de, por exemplo, hetero- e homodimerização de zíperes de leucina e/ou os domínios constantes, como CH3 de imuno- globulina ou fragmentos Fc, ou mesmo abaixo desto intervalo.

[00111] A força de interação, por exemplo, domínios VH e VL isolados, em geral, é de baixa afinidade. Utilizando espectroscopia de diferença calorimetria, fluorométrica ou ultravioleta e/ou técnicas de dichroisma circulares, as constantes de dissociação KD de 10-9 a 10-6 M foram determinadas (vide, por exemplo, gasta JMB (2001) 305, 989 a 1010; Pluckthun (1992) Comentários imunológicos n° 130). Utilizando técnicas de ressonância de superfície plasmônica (SPR biosensor BIAcore ou BIAcore 2000, a Pharmacia) e um sistema de anticorpos anti HEL (anti-hen lisozima de ovo anticorpo HyHEL-10), Ueda (loc. cit.) E Ohmuro-Matsuyama (loc. cit.) foi verificado que domínios VH e VL isolados não dimerizam em todos (Ka <105/M, abaixo do limite de detecção). No entanto, a associação dos peptídeos de VH e VL foi significativamente aumentada na presença de antígenos cognatos (Ka ~ 109/m), com uma redução notável da taxa de dissociação do antíge- no/Complexo trimérico VH/VL com um Kd calculado ~ 2,73 x 10-5 + 1,43 x 10-6/s a 1,4 uM do antígeno. Por isso, é particularmente previsto no âmbito da presente invenção que o KD com os quais, na ausência do referido substrato ou célula, associação e/ou a dimerização dos referidos polipeptídeos P1 e P2, em particular de tais fragmentos F1 e F2, da presente invenção pode ocorrer apenas em, ou mesmo acima, o KD ou intervalo de KD de domínios VH e VL isolados por exemplo, como foi avaliado no contexto de vestido, Pluckthun (1992 (op. cit.);. loc cit.), Ueda (loc. cit.) e Ohmuro-Matsuyama (loc. cit.), em particular acima de KD ou intervalo de KD do antígeno/complexo trimérico VH/VL como foi estimado no contexto de Worn (loc. cit), Pluckthun (1992; loc cit), Ueda (loc. cit) e Ohmuro-Matsuyama (loc. cit). Na presença do referido substrato ou célula, prevê-se que polipeptídeo P1 e Polipeptídeo P2 e/ou, em particular, Fragmento F1 e fragmento F2 como aí compreendido, mais em particular o VH e VL, que pode ser aí compreendido, associado com o outro e/ou dimeriza com um KD que é (muito) abaixo do intervalo de KD ou de KD domínios VH e VL isolados, por exemplo, como foi avaliado no contexto de Worn(loc. cit.), Pluckthun (1992, loc. cit.), Ueda (loc. cit.) e Ohmuro-Matsuyama (loc. cit.), de preferência a, ou mesmo abaixo, o KD ou intervalo de KD do antígeno/complexo trimérico VH/VL como tem sido estimado no con-texto de Pluckthun (loc. cit.), Ueda (loc. cit.) e Ohmuro-Matsuyama (loc. cit.)

[00112] Em um aspecto, o Polipeptídeo P1 e polipeptídeo P2 e/ou, em particular, o Fragmento F1 e Fragmento F2 como aí compreendido, mais em particular o VH e VL, que pode ser aí compreendido, não estão associados na ausência do referido substrato ou celular e/ou não dimeriza na ausência do referido substrato ou célula. Se de todo, se associam uns com os outros e/ou dimerizam na ausência do referido substrato ou célula só com um KD de 10-8 M de cima, de preferência acima de 10-6 M, mais preferivelmente acima de 10-5 M e mais prefe rencialmente acima de 10 -4M. Em outro aspecto, se de todo, se associam uns com os outros e/ou dimerizam na ausência do referido substrato ou célula só com um KD no intervalo de 10-8 M a 10-2 M, preferencialmente de 10-7 M a 10 3 M, mais preferivelmente de 10-6 M a 10-3 M e ainda mais preferencialmente 10-5 M a 10-3 M. I noutro aspecto, o polipeptídeo P1 e Polipeptídeo P2 e/ou, em particular, Fragmento F1 e Fragmento F2 como aí compreendido, mais em particular o VH e VL, que pode ser aí compreendido, estão associados, na presença do referido substrato ou de células e/ou dimerizam na presença do referido substrato ou célula. Em particular, eles se associam uns com os outros e/ou dimerizam na presença do referido substrato ou célula com uma KD inferior a 10-6 M, de preferência inferior a 10-7 M, mais preferivelmente abaixo de 10-8 M e mais preferencialmente abaixo de 10-9M. Eles também podem associar-se uns aos outros e/ou podem dimeri- zam na presença do referido substrato ou células com um KD no intervalo de 10-11 M a 10-6 M, mais preferivelmente de 10-11 M a 10-7 M e ainda mais de preferência de 10-11 M a 10-8 M.

[00113] Em uma modalidade preferida, o mesmo se aplica no caso de um agente que está presente, que estabiliza a associação e/ou a dimerização do polipeptídeo P1 e Polipeptídeo P2 e/ou, em particular, o fragmento F1 e fragmento F2. Por exemplo, como um agente de estabilização de acordo com a presente invenção pode ser um antígeno, como, por exemplo, CD3, HIS ou DIG, como na descrito presente invenção, capaz de se ligar ao domínio F, que, por exemplo, pode compreender um VH e AVL de um anticorpo (F1 e F2, respectivamente, ou F2 e F3, respectivamente).

[00114] Se "presente", no contexto da presente invenção e, em particular, no âmbito acima (ou seja, em relação ao referido agente e/ou o referido substrato ou células e/ou referidos antígenos A1 e A2), em especial significa estar presente a uma concentração no intervalo de 0,01 uM a 1 mM, em um intervalo de 0,1 a 500 uM, em um intervalo de 0,1 a 300 um, no intervalo de 0,1 a 100 uM, em um intervalo de 1 a 500 um, em um intervalo de 10 a 500 uM. Sendo "ausente", no contexto da presente invenção e, em especial, no contexto acima (isto é, em relação ao referido agente e/ou o referido substrato ou células e/ou o referido antígenos A1 e A2), em especial significa estar presente uma concentração abaixo das intervalos acima ou abaixo de 1 mM, 500 uM, 300 uM, 100 uM, 10 uM, 1 uM, 0,1 uM, 0,01 uM, 0,001 uM ou 1 nM, em que são preferidos os valores mais baixos.

[00115] A pessoa que é versada na técnica está prontamente em posição de medir o KD de dimerização, em particular, de P1 e P2, mais em particular de F1 e F2, como aí compreendido, mais particular da VH e VL, que pode ser aí compreendido. Exemplos dos respectivos métodos de medição são cristalografia de raios-x; ressonância magnética nuclear (RMN); calorimetria isotérmica (ITC); microscopia crio- eletro (CEM); espectrometria de massa (MS); ressonância de superfície plasmônica (SPR). Tais métodos são, por exemplo, descritos em Reconhecimento de superfície da Proteína: Abordagens para a Descoberta de Fármacos: Abordagens para a inibição de interações proteína-proteína para a Descoberta de Fármacos (Eds: Ernest Giralt, Mark Peczuh, Xavier Salvatella John Wiley & Sons, 12 de Novembro de 2010.). Outros exemplos dos respectivos métodos de medição são Análise de Dicroísmo circular; Cromatografia de Filtração de Gel de zona pequena; Retardo de Fluorescência em Gel; Equilíbrio de Sedimentação; Polarização de Fluorescência de Ensaio; Sobreposição de manchamento ou Análise de Far Western; Análise de eletroforese da afinidade capilar; Transferência de Energia de fluorescência de Ressonância (FRET); tais métodos são, por exemplo descritos em Interações de Proteína-proteína: Métodos e Aplicações: 261 (Métodos em Biologia Molecular); Haian Fu (Ereferidor); Humana Press; 1 (23. Marz 2004). Um método preferido para medir o KD, de acordo com a presente invenção é Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS). Este método é, por exemplo, descrito em Douglas Magde (Physical Review Letters 29, 11, 1972, S. 705-708).

[00116] Em um aspecto particular, os KDs referidos na presente invenção (i) aplicam-se a, (ii) estão em ou (iii) são para ser medidos a uma temperatura de 4-38°C, de preferência de 4 a 20°C (por exemplo 10°C) ou 20 e 38°C (por exemplo 30°C), e/ou um pH de 4,5 a 8 (por exemplo, um pH de 7),

[00117] "Não está associado", no contexto da presente invenção, particularmente significa não funcionalmente associado com o respeito à função do domínio F, isto é, não permitindo F1 e F2 para formar um F funcional. Dessa maneira, em um aspecto da presente invenção, P1 e P2 podem ser ligados um ao outro (por exemplo, de forma covalente) na medida em que nenhum domínio funcional F é formado por F1 e F2. É, contudo, preferido que P1 e P2 sejam separadoss.

[00118] Em uma modalidade, o referido antígeno A1 e/ou Referido antígeno A2 é uma molécula.

[00119] Em uma modalidade, o referido antígeno A1 e/ou o referido antígeno A2 é proteico.

[00120] Em uma modalidade, o referido antígeno A1 e/ou o referido antígeno A2 é não proteico.

[00121] Em uma modalidade, a referida porção-alvo liga-se a T1 de forma não covalente ao referido antígeno A1.

[00122] Em uma modalidade, a referida porção-alvo liga-se a T2 não de uma forma covalente ao referido antígeno A2.

[00123] Em uma modalidade, um substrato com ambos os antíge- nos A1 e A2, na sua superfície induz a dimerização do fragmento F1 do referido polipeptídeo P1 com o Fragmento F2 do referido polipeptí- deo P2, enquanto que um substrato, que não têm ambos os antígenos de A1 e A2, na sua superfície celular não induz a dimerização da Fragmento F1 do referido polipeptídeo P1 com o Fragmento F2 do referido polipeptídeo P2.

[00124] Em uma modalidade, uma célula possuindo ambos os antí- genos A1 e A2, na sua superfície celular induz a dimerização da Fragmento F1 do referido polipeptídeo P1 com o Fragmento F2 do referido polipeptídeo P2, ao passo que uma célula que não carrega ambos os antígenos A1 e A2, na sua célula superfície não induz a dimerização da Fragmento F1 do referido polipeptídeo P1 com o Fragmento F2 do referido polipeptídeo P2. Neste contexto, "induz a dimerização" particular- mente significa "permite justaposição e dimerização subsequente".

[00125] Em uma modalidade, a referida porção-alvo T1 compreende um módulo de imunoglobulina e/ou a referida porção-alvo T2 compreende um módulo de imunoglobulina.

[00126] Em uma modalidade, a referida porção-alvo T1 compreende um módulo de imunoglobulina Il, que compreende um domínio VL ligado a um domínio VH, de preferência, um módulo de imunoglobulina Il que compreende um scFv (fragmento de variante de cadeia única) de um anticorpo, um fragmento Fab ou um F (ab ') 2 (por exemplo, com partes adicionais, por exemplo, um domínio Fe) de um anticorpo ou de um anticorpo completo.

[00127] e/ou a referida porção-alvo T2 compreende um módulo de imunoglobulina I2, que compreende um domínio VL ligado a um domínio VH, de preferência, um módulo de imunoglobulina I2 que compreende um scFv (fragmento de variante de cadeia única) de um anticorpo um fragmento Fab ou um F(ab)2 (por exemplo, com partes adicionais, por exemplo, um domínio Fe) de um anticorpo ou de um anticorpo completo.

[00128] Em uma modalidade, a referida porção-alvo T1 e/ou a referida porção-alvo T2 compreende um módulo de imunoglobulina que compreende uma região VhH do domínio variável de um anticorpo de lama, um anticorpo de camelo, ou um anticorpo de tubarão.

[00129] Em uma modalidade, a referida porção-alvo T1 e/ou a referida porção-alvo T2 é um aptâmero ou um ligante natural do referido antígeno A1 ou Antígeno A2, respectivamente.

[00130] Em uma modalidade, a referida porção-alvo T1 e/ou a referida porção-alvo T2 compreende um Fv ou scFv (fragmento de variante (de cadeia única)) de um anticorpo.

[00131] Em uma modalidade, o módulo de imunoglobulina compreendido na porção-alvo T1 e T2 compreende um domínio V selecionado a partir do grupo que consiste em:

[00132] um domínio V de um anticorpo anti-HLA-A2 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 78 e 79 (CDRs 1 e 3) e DAS (CDR 2) e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID NOs: 75-77 (CDRs 1-3);

[00133] um domínio V de um anti-HLA-Cw6 anticorpo que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 83 e 84 (CDRs 1 e 3) e DDS (CDR 2) e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID NOs: 80-82 (CDRs 1-3);

[00134] um domínio V de um anticorpo anti-EpCAM que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 88 e 89 (CDRs 1 e 3) e WAS (CDR 2) e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID NOs: 85-87 (CDRs 1-3);

[00135] um domínio V de um anticorpo anti-Her2 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 93 e 94 (CDRs 1 e 3) e SAS (CDR 2) e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID NOs: 90-92 (CDRs 1-3);

[00136] um domínio V de um anticorpo anti-EGFR1 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 98 e 99 (CDRs 1 e 3) e DAS (CDR 2) e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID NOs: 95-97 (CDRs 1-3);

[00137] um domínio V de um anticorpo anti-CEA que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 103 e 104 (CDRs 1 e 3) e SAS (CDR 2) e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID NOs: 100-102 (CDRs 1-3);

[00138] um domínio V de um anticorpo anti-CD45 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 107 e 108 (CDRs 1 e 3) e LAS (CDR 2) e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID NOs: 105 e 106 (CDRs 1 e 2) e CDR3 ou SEQ ID NOs: 132-134 (CDRs 1-3);

[00139] um domínio V de um anticorpo anti-CD138 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 112 e 113 (CDRs e 1 e 3) e YTS (CDR 2) e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID NOs: 109-111 (CDRs 1-3); e

[00140] um domínio V de um anticorpo anti-CD19 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 158 e 159 (CDRs 1 e 3) e DAS (CDR 2) e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID NOs: 155-157 (CDRs 1-3).

[00141] Em uma modalidade preferida, adicional, o módulo de imu- noglobulina compreendido na porção-alvoT1 e/ou T2 compreende um domínio V selecionado a partir do grupo que consiste em:

[00142] um domínio V de um anticorpo anti-HLA-A2 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 52 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 51;

[00143] um domínio V de um anticorpo anti-HLA-Cw6 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 54 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 53;

[00144] um domínio V de um anticorpo anti-EpCAM que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 56 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 55;

[00145] um domínio V de um anticorpo anti-Her2 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 58 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 57;

[00146] um domínio V de um anticorpo anti-EGFR1 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 60 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 59;

[00147] um domínio V de um anticorpo anti-CEA que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 62 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 61;

[00148] um domínio V de um anticorpo anti-CD45 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 64 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 63; e

[00149] um domínio V de um anticorpo anti-CD138 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 66 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID NOs: 65;

[00150] um domínio V de um anticorpo anti-CD19 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 153 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 152.

[00151] Em uma outra, preferida, modalidade, o módulo de imuno- globulina compreendido na porção-alvo T1 e/ou T2 compreende um domínio V que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 67-74 e 154.

[00152] Em uma modalidade, o polipeptídeo P1 tem a estrutura geral F1-T1 e/ou polipeptídeo P2 tem a estrutura geral F2-T2. O fragmento F e as porções T podem ser separados por meio deum ligante (por exemplo, F1-ligante-T1 e/ou F2-ligante-T2) e/ou flanqueado por meio de (um) alongamento (s) de aminoácido adicional (s) 1 e/ou 2 (alongamento -F1-(ligante)-T1-alongamento2 e/ou Alongamento1-F2- (ligante)-T2-alongamento2). Prefere-se que a estrutura geral anterior seja do terminal N para o terminal C dos polipeptídeos, ou seja, N-F1- T1-C e/ou N-F2-T2-C, N-F1-ligante-T1-C e/ou de N-F2-ligante-T2-C e N-Alongamento1-F1-(ligante)-T1-alongamento2-C e/ou N- Alongamento1-F2-(ligante)-T2-alongamento2-C. No caso da porção- alvo ser ou compreender um módulo de imunoglobulina que, como um Fv ou scFv, o polipeptídeo P1 pode ter a estrutura geral F1-VH1-VL1 e/ou Polipeptídeo P2 pode ter a estrutura geral F2-VH2-VL2 ou poli- peptídeo P1 pode ter a estrutura geral F1-VL1-VH1 e/ou polipeptídeo P2 pode ter a estrutura geral F2-VL2-VH2. Também nestes casos, o fragmento F e as porções T podem ser separados por meio de um li- gante (por exemplo, F1-ligante-VH/VL1-VL/VH1 e/ou F2-ligante- VH/VL2-VL/VH2) e/ou flanqueado por meio de (um) alongamento (s) 1 e/ou 2 (Alongamento1-F1-(ligante) de aminoácidos adicionais - VH/VL1-VL/VH1-alongamento2 e/ou Alongamento1-F2-(ligante) -VH/VL2-VL/VH2 -alongamento2). Também neste caso, é preferível que a estrutura geral anterior seja do terminal N para o terminal C dos polipeptídeos, ou seja, N-F1-VH/VL1-VL/VH1-C e/ou N-F2-VH/VL2 - VL/VH2-C, N-F1-ligante-VH/VL1-VL/VH1-C e/ou N-F2-ligante-VH/VL2- VL/VH2-C e N-Alongamento1-F1-(ligante) -VH/VL1-VL/VH1- alongamento2-C e/ou N-Alongamento1-F2-(ligante) -VH/VL2-VL/VH2- alongamento2-C. Pode também estar presente um agente de ligação entre VH e VL ou VL e VH.

[00153] O ligante acima descrito, em particular o entre os domínios V, pode compreender de 1 a 25 aminoácidos, de preferência de 12 a 20 aminoácidos, de preferência de 12 a 16 ou de 15 a 20 aminoácidos. O ligante acima descrito pode compreender um ou mais motivos (G3S) e/ou (G4S), em particular 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 (G3S) e/ou motivos (G4S), de preferência 3 ou 4 (G3S) e/ou motivos (G4S), mais preferencialmente 3 ou 4 motivos (G4S).

[00154] Em uma modalidade, o referido módulo de imunoglobulina I1 e o referido fragmento F1 são separados por meio de um ligante que compreende de 1 a 12, de preferência 3 a 12, aminoácidos, e/ou a referida imunoglobulina e o referido módulo I2 do fragmento F2 estão separados por meio de um ligante que compreende de 1 a 12, de preferência 3 a 12, aminoácidos.

[00155] Em uma modalidade, o domínio VL de I1 está ligada ao domínio VH de I1 por meio de um ligante que compreende de 12 a 25 aminoácidos, de preferência um agente de ligação com a sequência (G3S) 3 ou (G3S) 4 ou (G4S) 3 ou (G4S) 4 e/ou o domínio VL de I2 é ligado ao domínio VH de I2 por meio de um ligante que compreende 12 a 25 aminoácidos, de preferência um agente de ligação com a se- quência (G3S) 3 ou (G3S) 4 ou (G4S) 3 ou (G4S) 4.

[00156] Como mencionado, o ligante como descrito acima pode compreender o motivo (G3S) e/ou (G4S). Os ligantes alternativos podem consistir totalmente em ou compreenderem o motivo GEG- TSTGSGGSGGSGGAD. A pessoa que é versada na técnica pode, sem mais delongas, encontrar e utilizar ligantes adicionais (peptídeos) conhecidos na técnica.

[00157] Os referidos alongamentos de aminoácido adicionais 1 e/ou 2, podem consituir ou compreenderem de 1 a 200, 1 a 100, 1 a 70, 1 a 65, de 1 a 50, 1 a 25 ou 1 a 20 aminoácidos.

[00158] Em uma modalidade, o referido antígeno A1 e/ou Referido antígeno A2 é um antígeno expresso sobre a superfície de células de um tumor ou na superfície de células progenitoras/precursoras de um tumor, de preferência, um antígeno expresso sobre a superfície de células de um tumor hematológico, mais de preferência, um antígeno expresso sobre a superfície de células selecionadas a partir do grupo que consiste em células de leucemia aguda mielóica, células de leucemia mielóica crônicas, as células de leucemia linfática aguda, células de leucemia linfática crônica, células de linfoma de células, sín- drome mieloproliferativas, células mielodisplásicas, mais preferivelmente as células de mieloma, ou o referido antígeno A1 e/ou Referido antígeno A2 é um antígeno expresso sobre a superfície de células de um tumor não-hematológico, de preferência uma célula selecionada a partir do grupo que consiste em células de carcinoma de células renais, células de câncer de bexiga, células de câncer do pulmão, células de mesotelioma, células de câncer de próstata, células de câncer de cérebro, células de câncer de osso, células de sarcoma, células de câncer de tecidos moles, células de câncer de ovário, células de câncer de colo, células de câncer de mama, células de câncer de endo- métrio, células de carcinoma do útero, as células tumorais de células germinativas, células de carcinoma anais, células de carcinoma retal, células de carcinoma do cólon, células de carcinoma do intestino delgado, células de carcinoma gástrico, células de tumor do estroma gastrointestinal, células de carcinoma de fígado, células de carcinoma do pâncreas, células de carcinoma do duto biliar, células de carcinoma da vesícula biliar, células de carcinoma da cabeça e do pescoço, hipofa- ringe células de carcinoma, células de câncer de laringe, células de câncer de esôfago, células de câncer de pele, de preferência células de melanoma, as células de câncer infantil, as células de um tumor endócrino, as células de um tumor carcinoide, células de timoma, células de câncer de tireoide, células de um tumor de ilhotas de células, as células de um tumor de células adrenais, células de um tumor neuro- endócrino e células de um câncer de origem desconhecida (câncer de origem primária desconhecida). Informações detalhadas sobre esses tipos de câncer podem ser encontradas na literatura relevante, como "Cancer Medicine", JF Holanda, E Frei (editores), McGraw-Hill Professional, 8 a edição (2010) e referências citadas nos mesmos.

[00159] Em uma modalidade, a combinação de antígeno A1 e Antí- geno A2 é apenas encontrada em células sanguíneas ou de células precursoras de células do sangue, preferencialmente apenas em um tipo de células sanguíneas.

[00160] Em uma modalidade, a combinação de antígeno A1 e Antí- geno A2 é apenas encontrada no alvo, em particular, as células de carcinoma, e não (ou apenas de forma insignificante) em células que não são células-alvo, em particular, que não são cancerígenas. Em uma modalidade preferida, a combinação do antígeno A1 e Antígeno A2 é específica para as células de carcinoma de um certo tipo de câncer.

[00161] Em uma modalidade, a combinação de antígeno A1 e Antí- geno A2 distingue um certo tipo de células, de preferência, um certo tipo de células de carcinoma, a partir de quaisquer outras células.

[00162] "Certos tipos de câncer", neste contexto, significa tipo de câncer, caracterizado por meio do mesmo órgão, em que o câncer é formado ou, de preferência, o tipo de câncer, caracterizado por meio do mesmo par de antígenos de A1 e A2 (aberrantes).

[00163] Em uma modalidade, a combinação de antígeno A1 e Antí- geno A2 é encontrada em células progenitoras/precursoras que são células progenitoras/precursoras de um tumor e não em células pro- genitoras/precursoras que não são células progenitoras/precursoras de um tumor.

[00164] Em uma modalidade, o referido antígeno é um antígeno A1 que é específico para o estado maligno de uma célula e o referido an- tígeno A2 é um antígeno que é específico para o tipo de célula ou linhagem de células da referida célula.

[00165] Em uma modalidade,

[00166] antígeno A1 é EpCAM (molécula de adesão celular epiteli- al) e antígeno A2 é CD10 (aglomerado de diferenciação 10), HER2/neu (receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2), (receptor do fator de crescimento endotelial vascular, VEGF-R), EGFR (epidermal receptor do fator de crescimento, também chamado de HER1 (receptor do fator de crescimento epidérmico humano 1) ou ErbB1) ou MDR (proteína de resistência a múltiplos fármacos), ou

[00167] antígeno A1 é MCSP (proteoglicano sulfato de condroitina associado à melanoma) e antígeno A2 é melanoferrin ou EpCAM, ou

[00168] antígeno A1 é CA125 (antígeno do câncer 125/antígeno do carbohidrato 125) e antígeno A2 é CD227 (PEM (mucina epitelial poli- mórfica) ou MUC1 (mucina-1)), ou

[00169] antígeno A1 é o CD56 e o antígeno A2 é CD140b (PDGFRβ (fator de crescimento beta do receptor das plaquetas)) ou gangliosídeo GD3, ou

[00170] o antígeno A1 é o EGFR e o antígeno 2 é HER2, ou

[00171] antígeno A1 é PSMA (antígeno de membrana específico da próstata) e antígeno 2 e HER2, ou

[00172] o antígeno 1 é Sialila Lewis e o antígeno 2 é EGFR, ou

[00173] antígeno 1 é CD44 e o antígeno 2 é ESA (antígeno de su perfície epitelial) (CD326, EpCAM), CD24, CD133, MDR (proteína de multirresistência) ou CD117, ou

[00174] antígeno 1 é CD34 é o antígeno 2 é CD19, CD79a, CD2, CD7, HLA-DR (antígeno leucocitário humano DR), CD13, CD117, CD33 ou CD15, ou

[00175] antígeno 1 é CD33 é o antígeno 2 é CD19, CD79a, CD2, CD7, HLA-DR (antígeno leucocitário humano DR), CD13, CD117 ou CD15, ou

[00176] o antígeno 1 é um antígeno de MUC-1 e o antígeno 2 é CD10, CEA ou CD57, ou

[00177] o antígeno 1 é CD38 e o antígeno 2 é CD138, ou

[00178] o antígeno 1 é um CD 24 e o antígeno 2 é CD29 ou CD49f, ou

[00179] o antígeno 1 é carbônico anidrase IX e o antígeno 2 é aquaporina, preferencialmente aquaporina-2.

[00180] Em uma modalidade, o referido antígeno A1 e/ou Referido antígeno A2 é selecionado a partir do grupo que consiste em HLA-A (HLA-A do complexo principal de histocompatibilidade, classe I, A [Homo sapiens]; Gene ID: 3105 atualizado em 13-Jan-2013; DAQB- 90C11.16-002; Cromossoma: 6; NC_000006.11 (29910247..29913661); para HLA-A2: 1. mRNA = LOCAL NM_001242758 = Versão NM_001242758.1 GI: 337752169 = GenBank: AY191309.1 PRI 13-JAN-2013; 2. Proteína = P79495 [UniParc]. Última vez modificado em Maio 1, 1997. Versão 1.; para HLA-Cw6: mRNA = LOCAL HUMMHCCW6A = GenBank: VERSÃO M28160.1 GI: 531197PRI (18-AUG-1994); Proteína = Q29963 [UniParc]. Última vez modificado em Agosto 22, 2003. Versão 2.); EpCAM (molécula de adesão celular epitelial EPCAM [Homo sapiens ]; também conhecido como ESA; KSA; M4S1; MK-1; DIAR5; EGP-2; EGP40; KS1/4; MIC18; TROP1; EGP314; HNPCC8; TACSTD1.; Gene ID: 4072, atualizado em 6-Jan-2013; mRNA = VERSÃO NM_002354.2 GI: 218505669PRI 06- JAN-2013; Proteína = P16422 [UniParc]. última vez modificado em Novembro 13, 2007. Versão 2.); CD45 (fosfatase tirosina da Proteína PTPRC, tipo do receptor, C [Homo sapiens ]; também conhecido como LCA; LY5; B220; CD45; L-CA; T200; CD45R; GP180; Gene ID: 5788, atualizado em 13-Jan-2013; mRNA = VERSÃO NM_002838.4 GI: 392307006 PRI 13-JAN-2013; Proteína = P08575-1 = Isoforma 1, Última vez modificado em Julho 19, 2003. Versão 2.; Proteína = P085752 = Isoforma 2); Her2 (ERBB2 v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, neuro/glioblastoma derived oncogene homolog (avian) [Homo sapiens]; também conhecido comoNEU; NGL; HER2; TKR1; CD340; HER-2; MLN 19; HER-2/neu; gene ID: 2064, atualizado em 13-Jan-2013; variante de transcrito de mRNA 1 = VERSÃO NM_004448.2 GI: 54792095, PRI 06-JAN-2013; variante de transcrito de mRNA 2 = VERSÃO NM_001005862.1 GI: 54792097, PRI 06-JAN- 2013; Proteína = P04626-1 = Isoforma 1, Última vez modificado em Agosto 13, 1987. Versão 1.; Proteína = P04626-2= Isoforma 2; Proteína = P04626-3= Isoforma 3; Proteína = P04626-4= Isoforma 4); EGFR (receptor do fator de crescimento epidermal EGFR [Homo sapiens ]; também conhecido como ERBB; HER1; mENA; ERBB1; PIG61; Gene ID: 1956, atualizado em 13-Jan-2013; variante de transcrito de mRNA 1 = VERSÃO NM_005228.3 GI: 41327737, PRI 13-JAN-2013; variante de transcrito de mRNA 2 = VERSÃO NM_201282.1 GI: 41327731, PRI 13-JAN-2013; variante de transcrito de mRNA 3 = VERSÃO NM_201283.1 GI: 41327733, PRI 13-JAN-2013; variante de transcrito de mRNA 4 = VERSÃO NM_201284.1 GI: 41327735, PRI 13-JAN- 2013; Proteína = P00533-1 = Isoforma 1, Última vez modificado em Novembro 1, 1997. Versão 2.; Proteína = P00533-2 = Isoforma 2; Proteína = P00533-3 = Isoforma 3; Proteína = P00533-4 = Isoforma 4); CD138 (SDC1 syndecan 1 [ Homo sapiens ]; Gene ID: 6382, atualizado em 6-Jan-2013; variante de transcrito de mRNA 1 = VERSÃO NM_001006946.1 GI: 55749479, PRI 06-JAN-2013; variante de transcrito de mRNA 2 = VERSÃO NM_002997.4 GI: 55925657, PRI 06- JAN-2013; Proteína = P18827 [UniParc]. Última vez modificado em Maio 5, 2009. Versão 3.); CEA (molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembriônico CEACAM5 5 [Homo sapiens]; também conhecido comoCEA; CD66e; Gene ID: 1048, atualizado em 13- Jan-2013; mRNA = VERSÃO NM_004363.2 GI: 98986444, PRI 13- JAN-2013; P06731, Última vez modificado em Janeiro 11, 2011. Versão 3.); e CD19 (CD19 molécula CD19 [Homo sapiens]; também co-nhecido como B4; CVID3; Gene ID: 930, atualizado em 5-Jan-2013; transcrito de mRNA 1 = VERSÃO NM_001178098.1 GI: 296010920, PRI 06-JAN-2013; transcrito de mRNA 2 = VERSÃO NM_001770.5 GI: 296010919, PRI 06-JAN-2013; Proteína = P15391 [UniParc]. Última vez modificado em Novembro 13, 2007. Versão 6).

[00181] Em uma modalidade, o referido antígeno A1 e/ou Referido antígeno A2 é um antígeno do MHC, de preferência, uma variante alé- lica de qualquer dos alelos HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQ, HLA-DR, ou HLA-DM, mais preferencialmente, uma variante alélica de uma molécula MHC de classe I, mais de preferência, uma variante alélica selecionada a partir do grupo que consiste em HLA-A1, HLA-A2, HLA- A3, HLA-A25, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B35, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA- Cw4, HLA-Cw6 e HLA-Cw7.

[00182] Em uma modalidade, o referido antígeno A1 é HLA-A2.

[00183] Em uma modalidade, o referido antígeno A1 e/ou Referido antígeno A2 é selecionado a partir do grupo que consiste emr CD45, aquaporina, preferencialmente aquaporina-2, receptor de eliminador de membro de classe B 1 (SCARB1), CD34, CD33, CD138, CD15, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD20, CD23, CD31, CD43, CD56, CD57, CD68, CD79a, CD146, synaptophysin, CD56, CD57, receptor de acetilcolina nicotínica, quinase músculo-específica (MUSK), canais de cálcio dependentes de voltagem (/ Q-tipo P), canais de potássio dependentes de voltagem (CPVD), receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA), TSH (hormônio estimulante da tiroide) do receptor, amfifisina, HepPar-1, GQ1b gangliosídeo, gangliosídeo GD3, gangliosídeo GM1 e glicoforina-A.

[00184] Em uma modalidade preferida, o referido antígeno A1 é um antígeno do MHC e o referido antígeno A2 é um antígeno que é específico para um determinado tipo celular ou linhagem de células.

[00185] Em uma modalidade, o referido domínio funcional F é um módulo de imunoglobulina, de preferência um scFv (fragmento de variante de cadeia única) de um anticorpo com maior preferência um Fv (fragmento de variante) de um anticorpo, ou uma molécula fluorescente, de preferência uma molécula de fluorescência de complementação bimolecular, mais preferencialmente GFP ou uma variante da GFP, ou uma molécula capaz de mediar a bioluminescência, de preferência uma molécula de luciferase, mais preferencialmente Gaussia luciferase.

[00186] Em uma modalidade, o referido domínio funcional F é um Fv (fragmento de variante) de um anticorpo.

[00187] Em uma modalidade, o referido domínio funcional F especificamente se liga ou é capaz de se ligar especificamente a um antíge- no. Em um aspecto específico, o referido antígeno pode ser um antí- geno que está presente em células do sistema imunitário humano. Em uma modalidade preferida, a referida ligação ativa as referidas células do sistema imunitário humano.

[00188] Em uma modalidade, o referido domínio funcional F é um domínio envolvente de célula T, de preferência um domínio envolvente de célula T se liga especificamente a CD2, CD3, CD5, receptor de células T ou CD28, mais preferivelmente um domínio envolvente de célula T se ligaespecificamente a CD3ε, um domínio envolvente de célula NK (células naturais assassinas), de preferência um domínio envolvente de célula NK de liga especificamente a CD1a, CD16a ou CD56, um domínio envolvendo macrófagos, de preferência um domínio envolvendo os macrófagos se liga especificamente a CD16a, CD32a, CD32b, CD89 ou CD64, um domínio envolvente de monócitos, de pre-ferência, um domínio envolvente de monócitos se liga especificamente a CD32a, CD32b, CD64 ou CD89, um domínio envolvente de granuló- citos, de preferência, um domínio envolvente de granulócitos se liga especificamente a CD16b, CD32a, CD32b, CD64, ou CD89, um domínio envolvente de granulócitos, de preferência um domínio envolvente de neutrófilos, que se liga especificamente a CD89 (FcαRI), ou um domínio envolvente de granulócitos, neutrófilos, monócitos e/ou ma- crófagos ativados, de preferência um domínio envolvente de granulóci- tos, neutrófilos, monócitos e/ou macrófagos ativados, que se liga especificamente a CD64 (FcyRI).

[00189] Em uma modalidade, o referido domínio funcional F é um domínio que se liga especificamente a um antígeno ligado a um composto de diagnóstico ou terapêutico.

[00190] Em uma modalidade, o referido domínio funcional F é um domínio que se liga especificamente a uma molécula veículo, ou um marcador de afinidade. De preferência, a referida molécula veículo está ligada a um composto de diagnóstico ou terapêutico. Preferencialmente, o referido marcador de afinidade está ligado a um composto de diagnóstico ou terapêutico.

[00191] Preferencialmente, o referido marcador de afinidade é selecionado a partir do grupo que consiste em um marcador FLAG, um marcador Myc, um marcador de glutationa-S-transferase (GST), um marcador de hemaglutinina (HA)-tag, um marcador de poli-histidina (His), um marcador de digoxigenina (DIG) e um marcador da proteína de ligação a maltose (MBP).

[00192] De preferência, a referida molécula veículo é um peptídeo ou uma molécula de hidrato de carbono. Em uma modalidade preferida, o referido domínio funcional F é um domínio que se liga especificamente a uma molécula veículo, de preferência, uma molécula veículo ligada a um composto de diagnóstico ou terapêutico, em que a referida molécula veículo é selecionada de entre o grupo que consiste em gelatina, inulina, dextrano e amido de hidroxietila.

[00193] Em uma modalidade, o referido composto terapêutico é um composto radioativo, de preferência, um composto radioativo, que compreende 90Y, 177Lu, 131I, 32P, 10B, ou 213Bi. Em uma modalidade, o referido composto terapêutico é uma toxina. De preferência, a referida toxina é selecionada a partir do grupo que consiste em fator de edema B. anthracis, fator letal B. anthracis, toxina iota C. perfrin- gens, toxina C2 C. botulinum, ADP-ribosiltransferase C. difficile, toxina da difteria do fragmento A C. diphtheriae, toxina shiga Burgholderia sp. (subunidade D), Clostridium perfringens str. 13 toxina PFOA perfringo- lisina O, ricina da cadeia A, planta RIP bouganina, ribonuclease RNASE3 Humana (RNase A família, 3) e endopeptidase de fator letal de antraz. Um outro exemplo não limitativo de uma toxina de acordo com a presente invenção é uma toxina sendo ou que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS 160-168.

[00194] Em uma modalidade, o referido composto de diagnóstico é um composto radioativo, de preferência, um composto radioativo que compreende o 99mTc, 111In, 82Rb e 201Tl. Em uma modalidade, o referido composto de diagnóstico é um composto fluorescente, GFP preferência, uma variante de GFP, ou um composto fluorescente de molécula pequena, tais como FITC (isotiocianato de fluoresceína), PE (ficoeritrina), um corante Alexa Fluor (tais como AlexaFluor488 ou corantes relacionados) ou um corante de cianina (tais como Cy3 (indo- carbocianina) ou Cy5 (Indodicarbocianina) ou corantes relacionados), Em uma modalidade, o referido composto de diagnóstico é uma molécula capaz de mediar a bioluminescência, de preferência uma molécula de luciferase, mais preferencialmente Gaussia luciferase.

[00195] Em uma modalidade, o referido fragmento F1 compreende um domínio VL de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VH do mesmo anticorpo, em que, de preferência, o referido anticorpo é um anticorpo anti-CD3, mais preferivelmente um anticorpo anti-CD3ε, ou um anti-His ou o anticorpo anti-DIG ou o referido fragmento F1 compreende um domínio VH de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VL do mesmo anticorpo, em que, de preferência, o referido anticorpo é um anticorpo anti-CD3, mais de preferência um anti-CD3ε anticorpo, ou um anticorpo anti-His e antiDIG.

[00196] Em uma outra modalidade, os domínios VL e VH como incluídos no fragmento F1 e F2, respectivamente, ou no fragmento F2 e F1, respectivamente, podem também ter dois anticorpos diferentes, específicos para o mesmo antígeno (e para o mesmo ou um diferente epitopo) ou para diferentes Antígenos. Este é, por exemplo, previsto para ser utilizado em que as novas especificações são para ser criadas (por exemplo, em abordagens de exibição em fagos).

[00197] Em uma outra modalidade, o módulo de imunoglobulina compreendido no domínio F compreende um domínio V selecionado a partir do grupo que consiste em:

[00198] um domínio V de um anticorpo anti-CD3, que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 18-20 (CDR 1-3) e/ou um domínio VH que compreende SEQ ID NOs: 15-17 (CDR 1-3) ;

[00199] um domínio V de um anticorpo anti-CD3, que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 24-26 (CDR 1-3) e/ou um domínio VH que compreende SEQ ID NOs: 21-23 (CDR 1-3) ;

[00200] um domínio V de um anticorpo anti-CD3, que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 30-32 (CDR 1-3) e/ou um domínio VH que compreende SEQ ID NOs: 27-29 (CDR 1-3) ;

[00201] um domínio V de um anticorpo anti-CD3, que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOS: 36 e 37 (as CDR 1 e 3) e DTS (CDR 2) e/ou um domínio VH que compreende SEQ ID NOs: 33-35 (CDRs 1-3);

[00202] um domínio V de um anticorpo anti-CD3, que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 41 e 42 (as CDR 1 e 3) e YTN (CDR 2) e/ou um domínio VH que compreende SEQ ID NOs: 38-40 (CDRs1-3); e

[00203] um domínio V de um anticorpo anti-His de anticorpo que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 46 e 47 (as CDR 1 e 3) e KVS (CDR 2) e/ou um domínio VH que compreende SEQ ID NOs: 43-45 (CDRs 1-3);

[00204] um domínio V de um anticorpo anti-DIG, que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID NOs: 50 e 131 (CDRs 1 e 3) e YSS (CDR 2) e/ou um domínio VH que compreende SEQ ID NOs: 48 e 49 (CDR 1 e 2) e A (3 CDR).

[00205] Emu ma outra modalidade preferida, adicional, o módulo de imunoglobulina compreendido no domínio F compreende um domínio V selecionado a partir do grupo que consiste em:

[00206] um domínio V de um anticorpo anti-CD3 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 2 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 1;

[00207] um domínio V de um anticorpo anti-CD3 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 4 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 3;

[00208] um domínio V de um anticorpo anti-CD3 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 6 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 5;

[00209] um domínio V de um anticorpo anti-CD3 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 8 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 7;

[00210] um domínio V de um anticorpo anti-CD3 que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 10 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 9; e

[00211] um domínio V de um anticorpo anti-His que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 12 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 11;

[00212] um domínio V de um anticorpo anti-DIG que compreende um domínio VL que compreende a SEQ ID N°: 14 e/ou um domínio VH que compreende a SEQ ID N°: 30.

[00213] Em uma modalidade, o referido domínio funcional F é um domínio que se liga especificamente a uma molécula de toxina, de preferência, uma molécula de toxina que por si só não é capaz de penetrar através da membrana celular de uma célula humana, e que, de preferência, é internalizada em uma célula humana por meio da associação com a membrana celular da referida célula, em que, preferencialmente, a referida associação com a membrana celular da referida célula é mediada por meio da ligação específica a um heterodimero formado a partir de duas moléculas, de preferência, duas moléculas associadas com a referida membrana celular, em que, preferencialmente, as referidas duas moléculas são os polipeptídeos de P1 e P2, tal como descrito na presente invenção. Em uma modalidade, o referido domínio funcional F é um domínio que se liga especificamente ao componente A (componente ativo) de uma infecção bacteriana de dois componentes da toxina AB. Em uma modalidade, o referido domínio funcional F é um domínio que se liga especificamente a uma toxina selecionada do grupo que consiste em fator de edema B. anthracis, fator letal B. anthracis, toxina iota C. perfringens, toxina C2 C. botulinum, ADP-ribosiltransferase C. difficile, toxina da difteria do fragmento A C. diphtheriae, toxina shiga Burgholderia sp. (subunidade D), Clostridium perfringens str. 13 toxina PFOA perfringolisina O, ricina da cadeia A, planta RIP bouganina, ribonuclease RNASE3 Humana (RNase A família, 3) e endopeptidase de fator letal de antraz. Um outro exem-plo não limitativo de uma toxina de acordo com a presente invenção é uma toxina sendo ou que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs 160-168.

[00214] Em uma modalidade, o referido domínio funcional F é um domínio que se liga especificamente a uma molécula fluorescente, de preferência, uma molécula fluorescente, que por si só não é capaz de penetrar através da membrana celular de uma célula humana. De preferência, a referida molécula fluorescente é GFP ou uma variante da GFP, ou uma molécula que é ou compreende um composto fluorescente de molécula pequena, tais como FITC (isotiocianato de fluores- ceína), PE (ficoeritrina), um corante Alexa Fluor (tais como AlexaFlu- or488 ou corantes relacionadas) ou um corante de cianina (tais como Cy3 (indocarbocianina) ou Cy5 (Indodicarbocianina) ou corantes relacionados).

[00215] Em uma modalidade, o referido domínio funcional F é um domínio que se liga especificamente a uma molécula capaz de mediar a bioluminescência, preferivelmente a uma molécula de luciferase, com maior preferência para Gaussia luciferase.

[00216] Em uma modalidade, o referido domínio funcional F é uma molécula fluorescente, de preferência uma molécula de fluorescência complementação bimolecular, mais preferencialmente GFP ou uma variante da GFP, tal como YFP, PCP, Vénus, ou Cerúlea.

[00217] Exemplos particulares de polipeptídeos de P1 ou P2 compreendidos no conjunto de polipeptídeos de acordo com a presente invenção são polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 114-129 e 197.

[00218] Em geral, a presente invenção relaciona-se com o tratamento ou eliminação de uma população de células indesejáveis e o tratamento ou prevenção de qualquer distúrbio ou doença que vem juntamente com esta população de células não desejadas. Para este efeito, o conjunto de polipeptídeos da presente invenção é para ser utilizado.

[00219] Em uma modalidade, o referido conjunto de polipeptídeos é um conjunto de polipeptídeos para uso no tratamento de um paciente que sofre de um tumor ou câncer ou para uso em diagnóstico de um paciente que sofre de um tumor ou de câncer, de preferência para uso no tratamento de um paciente que sofre de um tumor ou de câncer e submetido ao tecido alogeneico ou transplante de células ou destinado a ser submetido a esse transplante, ou para uso em diagnóstico em um paciente que sofre de um tumor ou câncer e está submetido ou destinado ao tecido alogênico ou ao transplante de células, em que, de preferência, o referido conjunto de polipeptídeos é administrado ao referido paciente.

[00220] Exemplos de tumores a serem tratados ou diagnosticados são aqueles para os quais as células tumorais ou cancerígenas são descritas na presente invenção acima em relação aos antígenos A1 e/ou A2.

[00221] Em uma modalidade, o referido tratamento envolve a eliminação de tecido destinatário/células de um determinado tipo de célula, de preferência, um tipo de célula cancerígena, ou as células precursoras de destinatários dando origem a um certo tipo de células, de preferência de um tipo de célula cancerígena, opcionalmente após ou em paralelo para o transplante para o receptor de tecido destinatá- rio/células dos referidos mesmos tipos de célula ou de dadores de células precursoras que dão origem ao referido mesmo tipo de célula.

[00222] Em uma modalidade, o conjunto de polipeptídeos da presente invenção é para uso em um transplante alogênico de fixação para as neoplasias hematopoiéticas, por exemplo, com antígenos HLA não coincidentes, em particular para uso em exloração terapêuticades- ta situação incompatibilidade. Nesta situação de exemplo, a informação dupla do destinatário haplótipo HLA (HLApaciente) e origem da linhagem hematopoiética (CD45) é apresentada exclusivamente em blastos de leucemia e outras células hematopoiéticas do paciente. Todas as outras células do receptor de origem expressam o haplotipo receptor mas não o antígeno da linhagem hematopoiética CD45 (por exemplo, os receptores de células não-hematopoiéticas são positivos para o HLA-A2 mas negativos para CD45). Da mesma forma, todas as células hematopoiéticas do doador moléculas de haplótipo HLA do doador expresso que significa que eles são CD45 positivos, mas negativos para HLA-A2, na situação de um transplante de incompatibilidade, onde o paciente, mas não o doador é positivo para o HLA-A2. Por conseguinte, a presente invenção refere-se também aos constructos de anticorpo de cadeia única bimoleculares e complementadores direcionados contra o HLA-A2, em casos onde o paciente, mas não é o doador HLA-A2 positivos, e um segundo constructo específico para o marcador de linhagem hematopoiética CD45 para especificamente di-recionar todas as células hematopoiéticas do paciente, incluindo todas as neoplasias hematológicas. Dessa maneira, o primeiro polipeptídeo P1 pode compreender um constructo de cadeia única fragmento de anticorpo direcionado contra a variável de HLA do paciente (porção- alvo T1) fundido com o fragmento VL de F1 antiCD3 (por exemplo, o fragmento F1). O segundo polipeptídeo P2 pode compreender um fragmento variável de cadeia única específica para constructo um marcador de linhagem hematopoiética (por exemplo, CD45; porção-alvo T2), fundido com o VH-dividida fragmento F2 anti-CD3 Fv (fragmento F2).

[00223] Em uma modalidade, a referida eliminação envolve a destruição das referidas células de tecido destinatário/ou as referidas células precursoras de destinatários por meio das células do sistema imunitário, por meio de uma toxina ou de um composto radioativo.

[00224] Em uma modalidade, o referido conjunto de polipeptídeos é um conjunto de polipeptídeos para uso em diagnóstico em um paciente que sofre de tecido alogeneico ou transplante de células, em que, preferencialmente, o referido paciente é um paciente que sofre de um tumor.

[00225] Em uma modalidade, o referido uso de diagnóstico envolve a detecção específica de células receptoras de um determinado tipo celular ou linhagem de células entre as células receptoras de células do tipo diferente ou linhagem de células e células dadoras do mesmo tipo ou do tipo diferente e linhagem de células.

[00226] Em uma modalidade, a referida utilização de diagnóstico envolve a detecção específica de células receptoras que são células malignas entre as células receptoras que não são malignas e entre as células do doador. Em uma modalidade, o referido conjunto de poli- peptídeos é administrado a um paciente.

[00227] De preferência, o referido paciente é um mamífero, mais preferencialmente um ser humano.

[00228] Em uma modalidade, a referida administração ocorre por meio da administração de bolus ou por meio da administração contí- nua.

[00229] Em uma modalidade, os polipeptídeos P1 e P2 do referido conjunto de polipeptídeos são administrados em paralelo. Em uma outra modalidade, os polipeptídeos P1 e P2 do referido conjunto de poli- peptídeos são administrados sequencialmente.

[00230] Em uma modalidade, um dos Polipeptídeos P1 ou P2s de o referido conjunto de polipeptídeos é administrado através de administração em bolus, ao passo que o outro é administrado por meio da administração contínua.

[00231] Em uma modalidade, a quantidade de polipeptídeo é administrada no intervalo de a partir de 0,5 μg/m2 por dia a 500 μg/m2 por dia para o polipeptídeo P1 ou P2 para o polipeptídeo ou para cada um dos polipeptídeos de P1 e P2, de preferência no intervalo de desde 5 μg/m2 por dia para 200 μg/m2 por dia para o Polipeptídeo P1 ou para o polipeptídeo P2 ou para cada um dos polipeptídeos de P1 e P2, mais preferencialmente no intervalo de desde 10 μg/m2 por dia a 80 μg/m2 por dia para o polipeptídeo P1 ou P2 para o polipeptídeo ou para cada um dos polipeptídeos de P1 e P2.

[00232] Em uma modalidade, a quantidade de polipeptídeo administrada está no intervalo de desde 0,05 μg/m2 por dia a 0,5 μg/m2 por dia para o polipeptídeo P1 ou P2 para o polipeptídeo ou para cada um dos polipeptídeos de P1 e P2.

[00233] Em uma modalidade, a quantidade de polipeptídeo P1 administrada é diferente da quantidade de polipeptídeo P2 administrado.

[00234] Em uma modalidade, a quantidade de polipeptídeo é ad ministrada no intervalo de a partir de 0,5 μg/m2 por dia a 50 μg/m2 por dia para o polipeptídeo P1 ou P2 para o polipeptídeo ou para cada um dos polipeptídeos de P1 e P2. Em uma modalidade, a quantidade de polipeptídeo é administrada no intervalo de desde 50 μg/m2 por dia a 100 μg/m2 por dia para o polipeptídeo P1 ou P2 para o polipep- tídeo ou para cada um dos polipeptídeos de P1 e P2. Em uma modalidade, a quantidade de polipeptídeo é administrada no intervalo de desde 100 μg/m2 por dia a 200 μg/m2 por dia para o polipeptídeo P1 ou P2 para o polipeptídeo ou para cada um dos polipeptídeos de P1 e P2. Em uma modalidade, a quantidade de polipeptídeo é administrada no intervalo de desde 200 μg/m2 por dia a 300 μg/m2 por dia para o polipeptídeo P1 ou P2 para o polipeptídeo ou para cada um dos po- lipeptídeos de P1 e P2. Em uma modalidade, a quantidade de poli- peptídeo é administrada no intervalo de desde 300 μg/m2 por dia a 400 μg/m2 por dia para o polipeptídeo P1 ou P2 para o polipeptídeo ou para cada um dos polipeptídeos de P1 e P2. Em uma modalidade, a quantidade de polipeptídeo é administrada no intervalo de desde 400 μg/m2 por dia a 500 μg/m2 por dia para o polipeptídeo P1 ou P2 para o polipeptídeo ou para cada um dos polipeptídeos de P1 e P2. Em uma modalidade, a quantidade de polipeptídeo é administrada no intervalo de desde 500 μg/m2 por dia para um mg/m2 por dia para o polipeptídeo P1 ou P2 para o polipeptídeo ou para cada um dos poli- peptídeos de P1 e P2.

[00235] Os pontos de referência adicionais para derivar as quantidades dos polipeptídeos P1 e P2 a serem administradas podem também ser obtidos por meio de estudos de consultadoria realizadas com constructos de anticorpo bi-específicos (por exemplo, Bargou R et al., Regressão do tumor em pacientes com câncer, com doses muito baixas de uma célula T. anticorpo-envolvente Ciência 2008;. 321 (5891) : 974-7, e Topp MS et al Terapia-alvo com o anticorpo blinatumomab da célula T envolvente de doença residual mínima da quimioterapia refratária em linhagem B em pacientes com leucemia linfoblástica aguda resulta na alta taxa de resposta e sobrevida livre de leucemia prolongada. J Clin Oncol. 2.011, 29: 2493 a 8).

[00236] Em uma modalidade, a referida administração ocorre de forma contínua durante pelo menos 12 horas, durante pelo menos 1 dia ou, pelo menos, 2 dias ou durante pelo menos 3 dias, ou durante pelo menos 4 dias, ou pelo menos 5 dias, ou pelo menos 6 dias, ou durante pelo menos 7 dias, ou pelo menos 8 dias, ou pelo menos 9 dias, ou pelo menos 10 dias, ou pelo menos 11 dias, ou pelo menos 12 dias, ou pelo menos 13 dias, ou pelo menos 14 dias, ou pelo pelo me nos 15 dias, ou por pelo menos 16 dias, ou por pelo menos 17 dias, ou por pelo menos 18 dias, ou por pelo menos 19 dias, ou por pelo menos 20 dias ou, pelo menos, 21 dias ou, pelo menos, 22 dias ou, pelo menos, 23 dias ou durante pelo menos 24 dias, ou pelo menos 25 dias, ou pelo menos 26 dias, ou pelo menos 27 dias, ou pelo menos 28 dias, ou pelo menos 29 dias, ou pelo menos 30 dias, ou pelo menos 5 semanas ou durante pelo menos 6 semanas.

[00237] Em uma modalidade, a referida administração do referido conjunto de polipeptídeos ou de um dos polipeptídeos do referido conjunto de polipeptídeos ocorre por via intravenosa, de preferência por injeção intravenosa.

[00238] Em uma modalidade, a referida administração do referido conjunto de polipeptídeos ou de um dos polipeptídeos do referido conjunto de polipeptídeos ocorre por via subcutânea, de preferência por injeção subcutânea.

[00239] Em uma modalidade, o referido conjunto de polipeptídeos é administrado em combinação com um ou mais medicamentos selecionados a partir do grupo que consiste em um medicamento imunomo- dulador, e/ou um esteroide, preferencialmente prednisolona ou predni- sona.

[00240] Em uma modalidade, o referido conjunto de polipeptídeos é administrado em combinação com um composto radioativo, de preferência, um composto radioativo ligado a um antígeno, uma molécula veículo, ou um marcador de afinidade, em que o referido composto radioativo, o referido antígeno, a referida molécula veículo ou a referido marcador de afinidade é especificamente ligado pelo referido domínio funcional F.

[00241] Em uma modalidade, o referido conjunto de polipeptídeos é administrado em combinação com uma toxina, de preferência, uma toxina ligada a um antígeno, uma molécula veículo, ou um marcador de afinidade, em que a referida toxina, o referido antígeno, a referida molécula veículo ou o referido marcador de afinidade é ligado especificamente por meio do referido domínio funcional F.

[00242] Em uma modalidade, o referido conjunto de polipeptídeos é administrado em combinação com uma molécula fluorescente, de preferência, uma molécula fluorescente ligada a um antígeno, uma molécula veículo, ou um marcador de afinidade, em que o referido fluorforo, o referido antígeno, a referida molécula veículo ou o referido marcador de afinidade é especificamente ligado por meio do referido domínio funcional F.

[00243] Em uma modalidade, o referido domínio funcional F é um domínio que se liga especificamente a um antígeno que não é reconhecido como estranho pelo sistema imunológico do referido paciente para quem o referido conjunto de polipeptídeos é administrado.

[00244] Em uma modalidade de dois conjuntos de polipeptídeos como descritos acima (um primeiro conjunto de polipeptídeos e um segundo conjunto de polipeptídeos) são administrados simultaneamente ou sequencialmente. Em uma modalidade preferida, o referido primeiro conjunto de polipeptídeos tem diferentes fragmentos F1 e F2, que o referido segundo conjunto de polipeptídeos. Em uma modalidade preferida, o referido primeiro conjunto de polipeptídeos tem os mesmos fragmentos F1 e F2, como o referido segundo conjunto de polipeptídeos. Em uma modalidade preferida, as porções de direcionamento T1 e T2 do referido primeiro conjunto de polipeptídeos se li- gam aos mesmos antígenos como a porções de direcionamento T1 e T2, respectivamente, do referido segundo conjunto de polipeptídeos. Em uma modalidade preferida, as porções de direcionamento T1 e T2 do referido primeiro conjunto de polipeptídeos se ligam a antígenos diferentes do que as porções de direcionamento T1 e T2 do referido segundo conjunto de polipeptídeos.

[00245] Em uma modalidade, o referido paciente foi submetido a tratamento contra o câncer, antes do tratamento com o referido conjunto de polipeptídeos, o referido tratamento de câncer, de preferência sendo a quimioterapia, radioterapia ou remoção operativa do tumor, ou é submetido a tratamento contra o câncer em paralelo com o tratamento com o referido conjunto de polipeptídeos, o referido tratamento de câncer de preferência, a quimioterapia, a radioterapia ou a remoção operativa do tumor.

[00246] Em uma modalidade, o referido conjunto de polipeptídeos ou de um dos polipeptídeos do referido conjunto de polipeptídeos foi produzido por meio de um sistema de expressão procariota ou euca- riota ou por meio da síntese de peptídeo novo.

[00247] Em uma modalidade, o referido conjunto de polipeptídeos ou de um dos polipeptídeos do referido conjunto de polipeptídeos é gerado no interior do referido paciente por meio da expressão da proteína a partir de um ácido nucleico introduzido no referido paciente.

[00248] Muitos pacientes sofrem de doenças alérgicas ou auto- imunes. Em muitos destes casos, uma população de células clonais B produz um anticorpo que reage com antígenos errantes expressos por meio dos tecidos dos pacientes ou complexo com um alérgeno, que provoca reacções anafiláticas. Em ambos os casos, é desejável eliminar especificamente o clone de células B errante.

[00249] Para este fim, pode-se modificar o sistema combinatório de forma, de modo que um braço (P1 ou P2, em particular, T1 ou T2), re- conheça um antígeno de célula B associado (por exemplo, CD19, CD20, CD38 ou CD138) e o outro braço (P2 ou P1, em particular, T2 ou T1, respectivamente) é o alergênio ou o substrato ligado por meio do anticorpo que faz com que a doença auto-imune. Quando estes dois constructos se ligam a uma célula B que é o CD19 (CD20, CD38 ou CD138) positivo e simultaneamente exibe o anticorpo clonotípico sobre a superfície, o anticorpo anti-CD3 de VH e VL ligados podem interagir e reconstituir o local de ligação de CD3 exactamente na célula B. Este conjunto de alergênio específico ou específico do antígeno, em última análise resulta na exaustão clonal das células B-alvo.

[00250] Dessa maneira, de acordo com a presente invenção, qualquer um dos referidos antígenos A1 e A2 podem também ser um anticorpo clonotípico na superfície de uma célula B, em particular uma célula B que provoca um distúrbio auto-imune.

[00251] Neste contexto, por exemplo, um dos referidos antígenos A1 e A2 podem ser o CD19 e o outro pode ser um anticorpo clonotípi- co na superfície de uma célula B, em particular uma célula B que provoca um distúrbio auto-imune.

[00252] De acordo com este aspecto da presente invenção, qualquer uma das referidas porção-alvo T1 e T2 podem compreender um alérgeno ou substrato que se liga ao anticorpo clonotípico na superfície da célula B e/ou que é, após a ligação ao anticorpo clonotípico, capaz de causar uma doença auto-imune. Exemplos não-limitativos de um alérgeno que consistam em qualquer um dos referidos-alvo T1 e T2 são porção alérgenos de cabelo, como, por exemplo, cabelo do cão, cabeolo do gato (por exemplo, Fel d 1, Feld D1A, Feld D1B) ou cabelo de cobaias, ou alérgenos de pólen, como, por exemplo, vidoeiro, grama, alérgenos de pólen. Outros exemplos não limitativos são alérgenos de ácaros (por exemplo, Tyr p 2, Der P1, Der f 2), alérgenos do gato (por exemplo, Fel d 1, Feld D1A, Feld D1B), alérgenos de amendoim (por exemplo conglutina-7), alérgenos de fungos (por exemplo Alt a 1), alérgenos de cães (por exemplo, Feld 1), alérgenos sprue trigo (por exemplo, Alpha/beta-gliadina), alérgenos barata alemã (por exemplo, Bla g 1,02 variante alérgeno), bétula ou (principais alergênios do pólen) (por exemplo, Cyn d 1, Pha a 1, Dac g 3, Phl p 2, Phl p 1, profilina, Bet v 1-g, Bet v 1-a), os principais alérgenos maçã (por exemplo, Mal d 1), alérgenos do leite de vaca (por exemplo, alfa- lactalbumina, alfa-S1-caseína), alérgenos de ovos de galinha (por exemplo, lisozima C, ovalbumina) e alérgenos do cavalo (por exemplo latherin, Equ c 1), e semelhantes. Um outro não limitativo e com o exemplo preferido de um composto anti-alérgico em qualquer uma das referidas porção-alvo T1 e T2 é o antígeno para a linhagem de células de mieloma humano do anticorpo U266 IgE-ND. Um outro não limitativo e com o exemplo preferido de um composto anti-alérgico em qualquer uma das referidas porção-alvo T1 e T2 é um alérgeno sendo ou que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS 169-195.

[00253] Neste contexto, a presente invenção também refere-se ao conjunto de polipeptídeos tal como descrito na presente invenção, e, em particular no aspecto acima, para uso no tratamento ou prevenção de um distúrbio selecionado entre o grupo que consiste em

[00254] um distúrbio auto-imune; e

[00255] um distúrbio de hipersensibilidade.

[00256] Exemplos não-limitativos de um distúrbio auto-imune a ser tratado ou evitado de acordo com a presente invenção são selecionados a partir do grupo que consiste em

[00257] doenças alérgicas;

[00258] a esclerose múltipla;

[00259] A psoríase;

[00260] O lúpus eritematoso sistêmico;

[00261] a síndrome de Sjogren;

[00262] a artrite reumatoide;

[00263] púrpura trombocitopênica idiopática;

[00264] Diabetes;

[00265] A vasculite;

[00266] a doença de Crohn; e

[00267] A amilaidose.

[00268] Exemplos não-limitativos de um distúrbio da hipersensibili- dade a ser tratado ou evitado de acordo com a presente invenção são selecionados a partir do grupo que consiste em alergias (reação de hipersensibilidade do tipo I de acordo com Coombs e classificação Gell), um anticorpo de reação citotóxica dependente (tipo II reação de hipersensibilidade), uma doença do complexo imune (reação de hiper- sensibilidade do tipo III), hipersensibilidade do tipo retardado (reação de hipersensibilidade do tipo IV) e um receptor de doença auto-imune mediada (reação de hipersensibilidade do tipo V).

[00269] Em uma modalidade preferida, o referido distúrbio auto- imune ou hipersensibilidade vem juntamente com ou é acionado através de transplante de células tronco alogênicas (ou seja, qualquer distúrbio da hipersensibilidade do tipo I para tipo V de acordo com a classificação de Coombs e Gell).

[00270] Muitas células que estão infectadas por um agente patogênico (por exemplo, um vírus, tal como, por exemplo, HIV, EBV, CMV) proteínas codificadas por meio do patógeno expresso na sua superfície celular. Por conseguinte, em conformidade com a presente invenção, qualquer um dos referidos antígenos A1 e A2 pode também ser tal proteína codificada-patógeno, como, por exemplo, uma proteína de HIV, EBV ou CMV na superfície de uma célula. Neste contexto, a presente invenção também se relaciona com o conjunto de polipeptídeos, tal como descrito na presente invenção para uso no tratamento ou prevenção de uma doença infecciosa, por exemplo, uma doença infecciosa viral. Os exemplos particulares de proteínas codificadas por agentes patogênicos podem ser derivados a partir de http: //www.uniprot.org/uniprot/ e são a gp120 do HIV (Q78706); EBV LMP- 2 (P13285); GB de CMV (P06473); HBV HBS (Q9JG36); E1 do HCV (C4B751); E2 do HCV (Q6TRB1); Humana adenovírus serotipo C 2 HAdV-2 (P03276).

[00271] Os objetivos da presente invenção também são resolvidos por uma molécula de ácido nucleico ou um conjunto de moléculas de ácido nucleico que codificam o conjunto de polipeptídeos ou de um dos polipeptídeos do conjunto de polipeptídeos, tal como definido nas modalidades acima, na qual, de preferência, o referido ácido nucleico molécula ou as moléculas de ácido nucleico do referido conjunto de moléculas de ácidos nucleicos que compreende um sinal de exportação que medeia a secreção do (s) polipeptídeo (s) codificado (s) por uma célula bacteriana ou eucariótica.

[00272] Um exemplo não limitante de molécula de ácido nucleico ou um conjunto de moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção compreende uma ou mais das sequências de nucleotídeos, como descritos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 135-150 e 196.

[00273] Os objetivos da presente invenção também são resolvidos por um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico como definido acima, ou a sequência de uma das moléculas de ácido nucleico de um conjunto de moléculas de ácidos nucleicos, tal como definidos acima.

[00274] Os objetivos da presente invenção também são resolvidos por uma célula, que compreende o referido ácido nucleico/conjunto de ácidos nucleicos ou o referido vetor.

[00275] Os objetivos da presente invenção também são resolvidos por uma composição farmacêutica que compreende quer o conjunto de polipeptídeos, tal como definido acima ou a molécula de ácido nu- cleico/conjunto de moléculas de ácido nucleico como definido acima, ou o vetor, como definido acima, em que, de preferência, a referida composição farmacêutica compreende ainda um veículo farmaceuti- camente aceitável.

[00276] Os objetivos da presente invenção também são resolvidos por um kit que compreende o conjunto de polipeptídeos como definidos acima e/ou a molécula de ácido nucleico ou o conjunto de moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção e/ou o vetor de acordo com a presente invenção.

[00277] Em uma modalidade, os polipeptídeos do referido conjunto de polipeptídeos compostos por meio do referido kit estão contidos em um frasco único.

[00278] Em uma modalidade preferida, os polipeptídeos do referido conjunto de polipeptídeos compostos por meio do referido kit estão contidos em frascos separados.

[00279] Em uma modalidade, um ou mais dos polipeptídeos do referido conjunto de polipeptídeos compostos por meio do referido kit são secos por congelação.

[00280] Em uma modalidade, um ou mais dos polipeptídeos do referido conjunto de polipeptídeos compostos por meio do referido kit estão em solução.

[00281] Os objetivos da presente invenção também são resolvidos por um método para o tratamento de um paciente que sofre de um

[00282] tumor ou câncer e/ou que está passando por transplante de tecidos ou célula alogênica;

[00283] um distúrbio auto-imune; ou

[00284] um distúrbio de hipersensibilidade.

[00285] O referido método pode compreender as etapas de:

[00286] - Obtenção de um conjunto de polipeptídeos, o referido con- junto de polipeptídeos que compreende

[00287] um primeiro polipeptídeo que compreende P1

[00288] uma porção-alvo T1,

[00289] em que a referida porção-alvo T1 se liga especificamente a um antígeno A1, e

[00290] um fragmento F1 de um domínio funcional F,

[00291] em que nem o referido fragmento F1 por si só, nem o referido polipeptídeo P1 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F,

[00292] e

[00293] um segundo polipeptídeo que compreende P2

[00294] uma porção-alvo T2,

[00295] em que a referida porção-alvo T2 se liga especificamente a um antígeno A2, sendo o referido antígeno A2 uma molécula da superfície celular que é específico para um determinado tipo celular ou linhagem de células, e

[00296] um fragmento F2 do referido domínio funcional F,

[00297] em que nem o referido fragmento F2 por si só, nem o referido polipeptídeo P2 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F,

[00298] em que o referido antígeno A1 é diferente do referido antí- geno A2,

[00299] em que o referido polipeptídeo P1 e o Referido polipeptídeo P2 não estão associados um com o outro na ausência de um substrato que tem ambos os antígenos de A1 e A2, na sua superfície, mais especificamente uma célula que transporta ambos os antígenos de A1 e A2, na sua superfície celular, e

[00300] em que, mediante a dimerização do referido fragmento F1 do referido polipeptídeo P1 com o referido fragmento F2 do referido polipeptídeo P2, o dímero resultante é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F,

[00301] - Administrar o referido conjunto de polipeptídeos ao referi do paciente.

[00302] Em tal método de tratamento, o referido conjunto de poli- peptídeos é tal como definido nas modalidades acima.

[00303] Os objetivos da presente invenção também são resolvidos por um método de utilização do conjunto de polipeptídeos como descritos acima para o tratamento de um paciente submetido a célula ou o transplante de tecidos.

[00304] Os objetivos da presente invenção também são resolvidos através da utilização de um conjunto de proteínas, tal como definido nas modalidades acima para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um paciente sofrendo de doenças definido acima e descritos em um distúrbio ou, por exemplo, um paciente que sofre de câncer e/ou é submetido a transplante de células ou tecido.

[00305] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "polipep- tídeo" refere-se a uma cadeia molecular de aminoácidos linear contendo mais de 30 aminoácidos. Opcionalmente, um polipeptídeo pode incluir uma ou mais ligações dissulfureto, ou ser quimicamente modificado. Além disso, opcionalmente, um elemento não proteico (tal como um fluoróforo, de RNA-aptâmero, DNA-aptâmero, ou molécula pequena) pode ser ligado à referida cadeia molecular linear de aminoácidos. Tais polipeptídeos podem ser produzidos por meio de qualquer método conhecido. O polipeptídeo pode, por exemplo, ser gerado por meio da expressão de um ácido nucleico que codifica para o referido poli- peptídeo, ou pode ser sintetizado por meio dos métodos de síntese em fase sólida, ou podem ser produzidos por meio da conjugação ou ligação de moléculas existentes, por exemplo, por meio da ligação química.

[00306] O termo "polipeptídeo P1" é utilizado para referir-se a um polipeptídeo que compreende (i) uma porção-alvo, em que a referida porção-alvo liga-se especificamente a um antígeno, e (ii) um fragmento de um domínio funcional, em que nem o referido fragmento, por si só, nem o referido Polipeptídeo P1 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio funcional. O termo "polipeptídeo P2" é utilizado para referir-se a um polipeptídeo que compreende (i) uma porção-alvo, em que a referida porção-alvo liga-se especificamente a um antígeno, e (ii) um fragmento de um domínio funcional, em que nem o referido fragmento, por si só, nem o referido Polipeptídeo P2 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio funcionais.

[00307] O termo "domínio", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma cadeia molecular linear de aminoácidos que inclui a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo inteiro ou uma porção de um polipeptídeo. Opcionalmente, um domínio pode incluir uma ou mais ligações dissulfureto, ou pode ser quimicamente modificado. Além disso, opcionalmente, um domínio pode compreender um elemento não proteico (tal como um fluoróforo). Em uma modalidade, no entanto, o termo "domínio" não inclui compostos que são quimicamente modificados ou compreendem elemento (s) não proteico.

[00308] Um "domínio funcional", tal como utilizado na presente invenção, é um domínio que é capaz de realizar uma determinada função, tal como a ligação a um determinado antígeno ou parceiro de ligação específico, a ativação específica de um determinado receptor, a mediação de efeitos tóxicos ou de fluorescência após excitação, com luz de um comprimento de onda apropriado.

[00309] O termo "domínio funcional F" é, de preferência, também pretendido incluir os compostos que são não-proteico. Em uma modalidade, no entanto, refere-se a um composto proteico ou uma sua parte funcional.

[00310] O termo "um fragmento de um domínio", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma cadeia molecular linear de ami- noácidos que corresponde a uma parte de um domínio, mas não a totalidade do domínio. Opcionalmente, um fragmento do domínio pode incluir uma ou mais ligações dissulfureto, ou pode ser quimicamente modificado. Além disso, opcionalmente, um domínio pode compreender um elemento não proteico ou parte de um tal elemento não- proteico.

[00311] O termo "fragmento F1" é utilizado para referir-se a um fragmento de um domínio funcional. O termo "fragmento F2" é utilizado para referir-se a um fragmento de um domínio funcional.

[00312] Os pares de abreviaturas P1, P2; T1, T2; F1, F2; A1, A2; e E1, E2, como utilizados na presente invenção, destinam-se a designar diferentes polipeptídeos, porções de direcionamento, fragmentos, antí- genos, e módulos de imunoglobulina, respectivamente. Eles são sinônimo de primeiro polipeptídeo, segundo polipeptídeo; primeira porção- alvo, segundo porção-alvo; primeiro fragmento, segundo fragmento; primeiro antígeno, segundo antígeno; e primeiro módulo de imunoglo- bulina, segundo módulo de imunoglobulina, respectivamente.

[00313] O termo "porção", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma cadeia molecular linear de aminoácidos que inclui a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo inteiro ou uma porção de um polipeptídeo. Opcionalmente, uma porção pode incluir uma ou mais ligações dissulfureto, ou pode ser quimicamente modificada. Além disso, opcionalmente, uma porção pode compreender um elemento não proteico (tal como um oligonucleotídeo). Em uma modalidade, no entanto, o termo "porção" não inclui compostos que são quimicamente modificados ou compreendem elemento (s) não proteico (s).

[00314] O termo "porção-alvo T1" é utilizado para se referir a uma porção que se liga especificamente a um antígeno, por exemplo antí- geno A1. O termo "porção-alvo T2" é utilizado para se referir a uma porção que se liga especificamente a um antígeno, por exemplo antí- geno A2.

[00315] Tal como utilizado na presente invenção, um "ligante" é uma sequência de aminoácidos no interior de um polipeptídeo que liga duas partes do referido polipeptídeo ou dois domínios constituídos por meio do referido polipeptídeo.

[00316] O termo "molécula de ácido nucleico", tal como utilizado na presente invenção, define uma cadeia molecular linear que consiste em mais do que 30 nucleotídeos. O termo inclui DNA, tal como cDNA ou DNA genômico e RNA.

[00317] O termo "constructo", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucleico que compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos recombinantes. O termo também inclui polipeptídeos que são expressos a partir de uma sequência de nucleotídeos recombinante ou que são feitos artificialmente ou moléculas recombinantes que compreendem duas ou mais sequências de aminoácidos que não são naturalmente encontradas no interior da mesma proteína.

[00318] O termo "liga especificamente a" ou "liga especificamente", tal como utilizado na presente invenção no contexto de uma molécula ou o domínio que se liga especificamente a um parceiro de interação ou antígeno, ou que se liga especificamente a um parceiro de interação ou antígeno, significa que uma molécula ou o domínio se liga ao referido parceiro de interação do antígeno ou, de preferência, por meio da ligação não-covalente, ou é capaz de ligar o referido parceiro de interação do antígeno ou, de preferência, por meio da ligação não covalente, e não, ou essencialmente não reagem de forma cruzada com qualquer outro parceiro de interação ou antígeno com uma estrutura semelhante à do parceiro de interação ou antígeno.

[00319] No contexto de uma porção-alvo (tais como porção-alvo T1 ou T2), que se liga especificamente a um antígeno (como antígeno A1 ou A2), o termo "liga-se especificamente à" pretende referir-se a uma situação em que qualquer uma das referidas porção-alvo é capaz de se ligar especificamente ao referido antígeno, ou onde ele realmente se liga ao mesmo.

[00320] No contexto de um domínio envolvente de célula T, uma célula NK de domínio envolvente, células envolventes de macrófagos, um domínio envolvente de monócitos, um domínio envolvente de gra- nulócitos, um domínio envolvente de granulócitos, neutrófilos, ou um domínio envolvente de granulócitos, neutrófilos ativados, monócitos e/ou macrófagos, o termo "liga especificamente a" um antígeno ou uma molécula ou "especificamente se liga a" um antígeno ou uma molécula pretende referir-se a uma situação em que ou o respectivo domínio é capaz de se ligar especificamente ao referido antígeno ou molécula, ou onde ele realmente se liga ao mesmo.

[00321] No contexto de um domínio funcional sendo um domínio que "se liga especificamente a" um antígeno, uma molécula, um composto, uma molécula veículo, ou um marcador de afinidade, o termo "liga-se especificamente a" pretende referir-se a uma situação em que qualquer dos referidos domínios funcionais é capaz de se ligar especificamente ao referido antígeno, molécula, composto, veículo ou molécula marcador de afinidade, ou onde ele realmente se liga ao mesmo.

[00322] No contexto de uma toxina, fluoróforo, o antígeno, veículo ou molécula marcador de afinidade sendo "ligado especificamente por" um domínio funcional, isto pretende referir-se a uma situação na qual tanto o referido domínio funcional é capaz de se ligar especificamente à referida toxina, fluoróforo antígeno, veículo ou molécula marcador de afinidade, ou onde ele realmente se liga ao mesmo.

[00323] Tal como utilizado no presente pedido, uma molécula ou antígeno é "específico para um determinado tipo celular ou linhagem de células" se o mesmo for expresso por meio do referido tipo de célu- las/células da referida linhagem de células, mas não (ou apenas de forma insignificante) para outros tipos de células ou células de outra linhagem de células. Em algumas modalidades, uma molécula ou antí- geno é "específico para um determinado tipo celular ou linhagem de células" se for expresso pelo referido tipo de células/células da referida linhagem de células, e não mais do que alguns outros tipos de células ou células de outra linhagem de células além do referido tipo de célu- las/células da referida linhagem de células que expressa o referido an- tígeno, bem como, enquanto a maioria dos outros tipos de células ou células de outra linhagem de células além do referido tipo de célu- la/células da referida linhagem de células que não expressam o referido antígeno (ou apenas de forma insignificante). O termo "específico para um determinado tipo de célula ou a linhagem de células" pode também significar que a referida molécula ou antígeno é expressa pelo referido tipo de célula/células da referida cepa de células a uma taxa mais elevada, ou a uma proporção maior do que o valor ou por outros tipos de células/células de outras linhagens celulares, no sentido de que pode haver uma pequena mas detectável expressão da referida molécula também em outros tipos de células/células de outras linhagens celulares. O termo "marcador", tal como utilizado na presente invenção no contexto de um marcador para um determinado tipo de célula ou células de linhagem, pode referir-se a uma molécula ou antíge- no que é específico para um tipo de célula ou de células de uma linhagem de células, respectivamente, como acima descrito.

[00324] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "aptâme- ro" refere-se a um pequeno composto, composto por ácido oligonuclei- co (tais como RNA ou DNA) ou molécula peptídica ou não peptídica que se liga a uma molécula-alvo específica, com elevada afinidade.

[00325] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "molécula veículo" refere-se a uma molécula ou parte de uma molécula que não é reconhecida como estranha pelo sistema imunológico de um paciente a quem o conjunto de polipeptídeos de acordo com a presente invenção é administrado, ou que faz com que não só ou uma reação imunitária fraca por um paciente a quem o conjunto de polipeptídeos de acordo com a presente invenção é administrado. De preferência, uma "molécula de veículo" tal está sendo ligado por ou suscetível de ser ligado por uma outra molécula, tal como um anticorpo. Em algumas modalidades, uma "molécula veículo" é uma molécula ou parte de uma molécula que, em certas modalidades, a molécula veículo é ligada de uma forma covalente ou não de uma forma covalente a uma segunda molécula ou parte de uma segunda molécula, por exemplo, um fluoróforo ou toxina.

[00326] O termo "MHC" refere-se ao complexo principal de histo- compatibilidade, que é um conjunto de genes que codifica para um grupo de moléculas que compreende as moléculas da superfície celular, que são necessárias para a apresentação do antígeno a células-T, e que são também responsáveis pela rejeição de enxertos rápidos. Em seres humanos, o MHC inclui os genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA- DP, HLA-HQ e HLA-DR. No presente pedido de patente, o termo é utilizado para se referir aos genes do Complexo Principal de Histocompa- tibilidade, assim como para os produtos de genes codificados por estes genes. O termo "HLA" refere-se a antígenos de humanos. Tal como utilizado na presente invenção, "HLA" é a forma humana de "MHC".

[00327] O termo "variante alélica", tal como utilizado na presente invenção, designa qualquer uma das duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupam o mesmo local cromossômico. Por exemplo, o HLA-A1, HLA-A2, e HLA-A3 são as três variantes alélicas de HLA-A. O termo variante alélica é também utilizado na presente invenção para designar uma proteína codificada por meio de uma variante alélica de um gene.

[00328] O termo "antígeno", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma molécula conhecida por ser especificamente ligada ou capaz de ser ligada especificamente por um anticorpo ou a parte de ligação ao antígeno de um anticorpo. No seu sentido mais amplo, "antígeno A1" refere-se a um antígeno, tal como definido acima. No seu sentido mais amplo "antígeno A2" refere-se a um antíge- no, tal como definido acima. As designações "antígeno A1" e "Antíge- no A2" foram escolhidas a fim de permitir a distinção entre "antígeno A1" e "Antígeno A2". Um "antígeno do MHC" é um antígeno que é também uma molécula pertencente ao complexo de histocompatibili- dade principal. Os antígenos do MHC incluem os antígenos de classe I do CPH (em seres humanos, a expressão do HLA-A, B-, e-C) e MHC de classe II (antígenos em seres humanos, os antígenos HLA-DP,-DQ e-DR). A frase que uma célula "transporta um antígeno" ou "transporta um antígeno na sua superfície celular" pretende referir-se a uma situação em que uma célula expressa um antígeno que está presente na superfície das células da referida célula e acessível para um anticorpo a partir do lado de fora da referida célula. A frase que um substrato "tem um antígeno na sua superfície" pretende referir-se a uma situação em que o referido antígeno está presente na superfície do referido substrato e acessível para um anticorpo aplicado no referido substrato.

[00329] O termo "um antígeno que é específico para o estado ma-ligno de uma célula", tal como utilizado na presente invenção, refere- se a um antígeno que uma célula maligna de um determinado tipo de células (tal como uma célula de tumor maligno de células B) leva, na sua superfície celular, mas que a célula do mesmo tipo de célula que não é maligna (tal como uma célula B não maligna) não transporta (ou apenas de forma insignificante) na sua superfície celular.

[00330] O termo "um antígeno/molécula que é específico para um tipo de célula maligna", como utilizado na presente invenção, refere-se a um antígeno/molécula que uma célula maligna de um determinado tipo de células (tais como células malignas do tumor de células B) leva, na sua célula superfície, mas que a célula do mesmo tipo de célula que não é maligna (tal como uma célula B não maligna) ou células de outros tipos de células (tais como células T ou hepatócitos) não transporta (ou apenas de forma insignificante) na sua superfície celular. Em algumas modalidades, o termo "um antígeno/molécula que é específico para um tipo de célula maligna" refere-se a um antígeno/molécula que uma célula maligna de um determinado tipo de células (tais como células malignas do tumor de células B) leva, na sua superfície celular, mas que a célula do mesmo tipo de célula que não é maligna (tal como uma célula B não maligna) não transporta (ou apenas de forma insignificante) na sua superfície celular, e que apenas as células de alguns outros tipos de células além de que certo tipo de células transportam em sua superfície celular, enquanto as células da maioria dos outros tipos de células não fazem (ou apenas de forma insignificante). O termo "um antíge- no/molécula que é específico para um tipo de célula maligna" pode também significar que o referido antígeno/molécula é expresso por meio da referida célula maligna de um determinado tipo de célula a uma taxa mais elevada, ou a uma proporção maior do que o valor ou por uma célula do mesmo tipo de célula que não é maligno, no sentido de que pode haver uma pequena mas detectável expressão da referida molécula também em uma célula do mesmo tipo de célula que não é maligna. O termo "marcador", tal como utilizado na presente invenção no contexto de um marcador para o estado maligno de uma dada célula ou para um tipo de célula maligna, pode referir-se a uma molécula ou antígeno que é específico para o estado maligno de uma dada célula ou para um tipo de célula maligna, respectivamente, como descrito acima.

[00331] O termo "domínio de imunoglobulina", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a um domínio que é constituído essencialmente por uma região globular de uma cadeia de anticorpo. Os domínios de imunoglobulina são caracterizados em que eles retêm a característica de dobragem da imunoglobulina de moléculas de anticorpo. As imunoglobulinas, tais como IgG, IgE, ou IgM, são compostas por um número variável de cadeias leves e pesadas. Cada cadeia pesada e leve contém uma região constante e uma região variável. Cada região variável de cadeia leve (VL) e cada região variável de cadeia pesada (VH) contém três regiões hipervariáveis, também chamadas "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDR". As CDR são essencialmente responsáveis por meio da ligação da imunoglobu- lina a um antígeno.

[00332] Os termos "VH" ou "domínio VH" são utilizados de forma intercambiável e referem-se a região variável de uma cadeia pesada de imunoglobulina de um anticorpo. Os termos "VL" ou "domínio VL" são utilizados de forma intercambiável e referem-se a região variável de uma cadeia leve de imunoglobulina de um anticorpo.

[00333] O termo "módulo de imunoglobulina", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma molécula, que faz parte de uma molécula ou de montagem molecular que compreende um ou mais, de preferência dois ou mais, os domínios de imunoglobulina e que é capaz de se ligar a um antígeno. De preferência, um "módulo de imuno- globulina" compreende uma cadeia molecular linear de aminoácidos que inclui a sequência de aminoácidos de um ou mais, de preferência dois ou mais domínios de imunoglobulina. Opcionalmente, um "módulo de imunoglobulina" compreende um ou mais, de preferência duas ou mais pontes dissulfeto. Incluídas no termo "módulo de imunoglobulina" estão as moléculas ou partes de uma molécula que compreendem ou consistem em um "fragmento de variante de cadeia única" de um anticorpo. Incluídas no termo "módulo de imunoglobulina" estão também as moléculas ou partes de uma molécula que compreendem ou consistem em um domínio Vhh de uma lama de anticorpo, um anticorpo de camelo, ou um anticorpo de tubarão.

[00334] O termo "imunoglobulina do módulo I1" é utilizado para referir-se a um módulo de imunoglobulina que compreende um domínio VL ligado a um domínio VH. De preferência, o referido domínio VL e o referido domínio VH de o referido módulo de imunoglobulina I1 são derivados do mesmo anticorpo. De preferência, o referido domínio VL e o referido domínio VH do referido módulo de imunoglobulina I1 formam um dímero. Preferencialmente, o referido dímero é capaz de se ligar especificamente a um antígeno. O referido antígeno pode ser, por exemplo, o antígeno A1. Em uma modalidade, o referido "módulo de imunoglobulina I1" compreende um "fragmento de variante de cadeia única" de um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno, por exemplo, o antígeno A1.

[00335] O termo "imunoglobulina do módulo I2" é utilizado para referir-se a um módulo de imunoglobulina que compreende um domínio VL ligado a um domínio VH. De preferência, o referido domínio VL e o referido domínio VH de o referido módulo de imunoglobulina I2 são derivados do mesmo anticorpo. De preferência, o referido domínio VL e o referido domínio VH do referido módulo de imunoglobulina I2 forma um dímero. Preferencialmente, o referido dímero é capaz de se ligar especificamente a um antígeno. O referido antígeno pode ser, por exemplo, o antígeno A2. Em uma modalidade, o referido "módulo de imunoglobulina I2" compreende um "fragmento de variante de cadeia única" de um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno, por exemplo, o antígeno A2.

[00336] Dentro de um constructo de um módulo de imunoglobulina que compreende um domínio VL ligado a um domínio VH, o domínio VL pode ser posicionado no terminal N ou C do domínio VH correspondente. A pessoa que é versada na técnica é capaz de determinar qual o arranjo dos domínios VH e VL que é mais apropriado para um fragmento do domínio de cadeia única variante específica.

[00337] Os termos "Fv" e "fragmento de variante", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a um fragmento de um anticorpo que é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um antígeno completo de reconhecimento e local de ligação. Esta região consiste em um dí- mero de uma região variável pesada e um de cadeia leve em associação estreita, não covalente (VH-VL). Nesta modalidade, o domínio VH e VL juntos definem um local de ligação ao antígeno com especificidade de ligação ao antígeno na superfície do dímero VH-VL.

[00338] Os termos "scFv", "Fv de cadeia única", e "fragmento de variante de cadeia única" são utilizados indiferentemente e servem para designar um anticorpo ou porção de um anticorpo em que a região variável da cadeia pesada (VH) e região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo tradicional de duas cadeias foram unidos para formar uma cadeia. Tipicamente, um ligante é inserido entre as duas cadeias para permitir a dobragem correta e a criação de um local de ligação ativa.

[00339] O termo "anticorpo de lama", como utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo ou uma parte de um anticorpo derivado de lama. O termo "anticorpo de camelo", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo ou uma parte de um anticorpo derivado de camelo. O termo "anticorpo de tubarão", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a um anticorpo ou uma parte de um anticorpo derivado de tubarão. Anticorpos de lama, camelo e tubarão tem uma porção de ligação ao antígeno que é construída por meio de um único domínio, VHH, (ao invés de um VH e uma cadeia VL).

[00340] A expressão "domínio envolvente de célula T", tal como utilizado na presente invenção, pretende referir-se a um domínio que se liga especificamente a um antígeno que está presente na superfície das células de células T. Preferencialmente, a ligação do referido domínio envolvente de célula T ao referido antígeno ativa a referida célula T. Do mesmo modo, a expressão "domínio envolvente de célula NK" refere-se a um domínio que se liga especificamente a um antígeno que está presente na superfície celular das células assassinas naturais. Preferencialmente, a ligação do referido domínio envolvente da célula NK para o referido antígeno ativa as referidas células assassinas naturais. A expressão "domínio envolvente de macrófagos" refere-se a um domínio que se liga especificamente a um antígeno que está presente na superfície da célula de células de macrófagos. De preferência, a ligação do referido domínio envolvente de macrófagos para o referido antígeno ativa as referidas células de macrófagos. A expressão "domínio envolvente de monócitos " refere-se a um domínio que se liga especificamente a um antígeno que está presente na superfície de células de monócitos. De preferência, a ligação do referido domínio envolvente de monócitos para o referido antígeno ativa o referido monóci- tos. A expressão "domínio envolvente de granulócitos " refere-se a um domínio que se liga especificamente a um antígeno que está presente na superfície de células de granulócitos. De preferência, a ligação do referido domínio envolvente de granulócitos para o referido antígeno ativa o referido granulócito. A expressão "domínio envolvente de gra- nulócitos neutrófilos" refere-se a um domínio que se liga especificamente a um antígeno que está presente na superfície de células de granulócitos neutrófilos. De preferência, a ligação do referido domínio envolvente de granulócitos neutrófilos para o referido antígeno ativa os referidos granulócitos neutrófilos. A expressão "domínio envolvente de granulócitos neutrófilos, monócitos e/ou macrófagos ativados" refere- se a um domínio que se liga especificamente a um antígeno que está presente na superfície de células de granulócitos neutrófilos, monóci- tos e/ou macrófagos ativados. De preferência, a ligação do referido domínio envolvente de granulócitos neutrófilos, monócitos e/ou macró- fagos ativados para o referido antígeno ativa o referido monócito e/ou macrófago.

[00341] O termo "molécula capaz de mediar a bioluminescência", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma molécula (ou uma parte funcional de uma molécula) que possui uma atividade enzi- mática que, na presença do (s) substrato (s) apropriado (s) catalisa uma reação que faz a bioluminescência. O termo inclui as luciferases, tais como as luciferases de pirilampo ou Gaussia.

[00342] O termo "variante de GFP", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma molécula que tem uma sequência de ami- noácidos derivada da sequência de aminoácidos da proteína fluorescente verde de Aequorea victoria, introduzindo as alterações que resultam em maior fluorescência ou apresentam fluorescência com cores diferentes. O termo pretende incluir, entre outros, YFP (proteína fluorescente verde), CFP (proteína fluorescente ciano), Vênus (Nagai T et al., Uma variante da proteína fluorescente amarela com a maturação rápida e eficiente para aplicações de células biológicas. Nat. Bio- technol 2002 Jan; 20 (1) : 87 a 90), Cerulean (PCP aprimorada com S72A, Y145A e substituições H148D).

[00343] "GFP melhorada" (e, analogamente, "YFP melhorada", "melhorada PCP") refere-se a um GFP (YFP, PCP), que tem sido "humanizado", como relatado na Kain et al. (1995) Biotechniques 19 (4) : 650-55. "Humanizado" refere-se a alterações feitas para a GFP (YFP, PCP), sequência de ácido nucleico para optimizar os códon para ex- pressão da proteína em células humanas.

[00344] O termo "molécula de complementação de fluorescência bimolecular ", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma molécula fluorescente que pode ser fornecida como dois fragmentos que, por si próprios não são fluorescentes, mas que após a heterodi- merização entre os dois fragmentos formam um dímero que é capaz de fluorescência.

[00345] O termo "composto terapêutico", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a um composto adequado para prevenir, tratar, aliviar ou curar uma doença ou estado de doença. De preferência, um "composto terapêuticao" é um composto que, após a entrada em uma célula, é capaz de causar a morte da célula. Em algumas modalidades, um composto terapêutico pode ser um composto químico ou radioativo que danifica as estruturas celulares vitais ou interrompe os processos celulares vitais.

[00346] O termo "composto de diagnóstico", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a um composto que pode ser detectado por meio dos métodos de detecção comuns, tais como os métodos utilizados na clínica ou em laboratórios de diagnóstico bioquímicos ou médicos, por exemplo, um composto fluorescente, um composto radioativo, ou uma molécula mediadora bioluminescência.

[00347] O termo "células progenitoras/precursoras" pretende referir- se a células imaturas, indiferenciadas ou parcialmente diferenciadas, que são tipicamente encontradas em pós-natais animais/humanos e têm o potencial para se diferenciar em um tipo específico de célula ou em tipos de células específicos. O termo "células progenito- ras/precursoras de um tumor" designa células progenito- ras/precursoras com propriedades alteradas (por exemplo, em relação a seu comportamento proliferação ou gene padrão de expressão) que dão origem a células tumorais. Exemplos de tais células progenito- ras/precursoras de um tumor são por exemplo as células precursoras leucêmica ou progenitoras.

[00348] O termo "câncer", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma célula maligna, um grupo de células, e as neoplasias malignas. O termo destina-se a compreender os carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemias, tumores de células germinais, e blastomas. A "célula cancerígena" é uma célula que faz parte ou é derivada de um câncer. O termo "tumor" é utilizado alternadamente com o termo "câncer".

[00349] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "tumor hematológico" refere-se a um câncer do sangue ou do sistema sanguíneo (tal como células de medula óssea, células sanguíneas, cons- tructo, e as células precursoras de células sanguíneas maduras). Em algumas modalidades, o termo "tumor hematológico" refere-se a uma neoplasia hematológica. Tal como utilizado na presente invenção, o termo "tumor não-hematológico" refere-se a um tumor que não é um tumor hematológico.

[00350] O termo "um paciente que está a sofrer de tecido alogenei- co ou transplante de células", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma situação em que o paciente recebe ou tem recebido as células transplantadas ou tecido transplantado, que foi/foram obtidos a partir de uma outra pessoa. Uma situação como preferida a este aspecto é a situação com antígenos HLA incompatíveis. A unidade "μg/m2", tal como utilizado na presente invenção no contexto de uma quantidade de um polipeptídeo administrado, refere-se a uma certa quantidade de polipeptídeo por metro quadrado de superfície corporal do paciente a quem o referido polipeptídeo é administrado (o peptídeo pode ser administrado por meio de qualquer via adequada de administração, tal como por injeção intravenosa ou subcutânea). Por exemplo, a expressão "A quantidade de polipeptídeo é administrada 50 μg/m2 por dia para o Polipeptídeo P1." pretende referir-se a uma situação em que a quantidade de polipeptídeo P1 administrada por dia é de 50 mg por metro quadrado de superfície corporal do paciente a quem o Poli- peptídeo P1 é administrado. No caso de um paciente que tem uma superfície do corpo de 2 m2, isto significa que 100 ug de polipeptídeo P1 são administrados por dia.

[00351] Os presentes inventores verificaram, surpreendentemente, que, com um conjunto de polipeptídeos de acordo com a presente invenção, os problemas do estado da técnica acima indicados podem ser superados e os objetivos acima descritos podem ser conseguidos. Além disso, os presentes inventores verificaram, surpreendentemente, que, com um conjunto de polipeptídeos de acordo com a presente invenção, as células com uma combinação de dois antígenos específicos podem ser identificadas e/ou eliminadas com elevada especificidade e os efeitos colaterais reduzidos.

[00352] É uma vantagem da estratégia combinatória da presente invenção que nehuma das unidades F pré-formadas (por exemplo, unidades de anti-CD3) sejam utilizadas. A F1 e CD3 de VH e VL) não heterodimeriza por si, nem mesmo na presença de um agente que estabiliza a sua dimerização (por exemplo, um antígeno capaz de se ligar ao domínio F, como por exemplo, CD3, HIS ou DIG), e, portanto, não resultaria em um domínio funcional F (por exemplo, não estimula as células T). Exclusivamente em situações em que ambas os construc- tos complementares P1 e P2 se ligam simultaneamente na superfície de uma determinada célula, os dois componentes de F1 e F2 reconstituem o domínio F (por exemplo, local de ligação de CD3). Dessa ma-neira, a função do domínio F (por exemplo, a ativação de células T) ocorre precisamente quando necessário, mas não sistematicamente. Dessa maneira, pode-se presumir que a estratégia combinatória da presente invenção tem efeitos menos tóxicos, por exemplo, em com- paração com as estratégias de anticorpos biespecíficos normais. Isto é igualmente evidenciado por meio dos exemplos em anexo, em particular por parte do modelo in vivo para o transplante alogênico, onde camundongos HLA-A2 positivos não sofreram quaisquer efeitos clínicos após a infusão de constructos HLA-A2 reativos.

[00353] Em particular, para marcar as células que expressam um antígeno de assinatura predefinida, dois polipeptídeos de cadeia única foram concebidos como partes do constructo bipartido (bi-molecular) final (constructo de anticorpos bi-moleculas/triespecífico), cada um composto por meio de uma ligação ao antígeno de fragmento variável de cadeia única (scFv) e tanto o domínio da cadeia leve variável (VL) ou cadeia pesada variável (VH) de um anticorpo. Quando estes dois fragmentos híbridos ligam seus respectivos antígenos na superfície de uma única célula, os domínios VL e VH interagem uns com os outros para reconstituir o local de ligação ao antígeno original e, dessa maneira, satisfazem os requisitos desejados.

[00354] Conforme mencionado, é uma vantagem do conjunto de polipeptídeos da presente invenção que a ligação de ambos os antí- genos-alvo na superfície celular seja necessária para a heterodimeri- zação funcional. A auto-montagem das duas partes complementares e subsequente estimulação das células T após a ligação de apenas um braço ao seu antígeno pode ser descartada, corroborando os dados publicados que mostram que a ligação de VH ou VL por si só é de baixa afinidade e que heterodímeros VH/VL tendem a dissociar rapidamente na ausência de antígeno (Colman, 1987, Nature 326, 358 a 363; Amit, 1986, Science 233, 747-753; Lei, 2002, Int. Immunol 14, 389 a 400; Ueda, 1996, Nat Biotechnol 14, 1714 a 1718).

[00355] Em contraste com os domínios de homo- ou hetero- dimerização bem conhecidos na técnica (leucina-zipper, Fc-domínios, botão no furo, etc), as interações de VH e HL são de baixa afinidade. No entanto, tem sido demonstrado que a interação VH/VL pode ser estabilizada após a ligação com o antígeno específico. Sem estar limitado pela teoria, a interação VH/VL, de acordo com a presente invenção toma lugar apenas em situações após ambos os fragmentos foram previamente ligados aos seus antígenos-alvo cognato, por exemplo, sobre a superfície de uma célula-alvo. Além disso, sem estar limitado pela teoria, após ligação simultânea no alvo, os constructos são postos em proximidade de modo a que possam formar um complexo trimérico com o antígeno. O assim heterodímero triespecífico complementado no alvo da presente invenção é funcional no que diz respeito à função do domínio F, por exemplo, engata e estimula as células T para a destruição de células tumorais se anti-CD3 é reconstituído.

[00356] Além de uma vantagem dos construtos da presente invenção, P1 e P2, por exemplo, a natureza combinatória da resposta imunitária, foi surpreendentemente verificado, no contexto da presente invenção que o constructo bi-molecular, com o domínio F interrompido, por exemplo, scFv-anti-CD3, não exibe efeitos fora do alvo.

[00357] O conjunto de polipeptídeos de acordo com a presente invenção, em particular os polipeptídeos P1 e P2 aí compreendidos, têm ainda a vantagem de ser mais estável e/ou que tem uma melhoria da vida de prateleira (em particular, a 4°C), em comparação com os cons- tructos convencionais, como constructos BiTE biespecíficos. Estos constructos biespecíficos convencionais tendem a agregar (em particular, a 4°C).

[00358] Prevê-se que os polipeptídeos da presente invenção, P1 e P2, mais em particular de F1 e F2, como aí compreendido, mais particular da VH e VL, que pode ser aí compreendido, devido à sua interface hidrofóbica, são capazes de se ligar a albumina. Isto leva a um tempo de retenção melhorada; ou seja, mais de biodisponibilidade in vivo, mas também in vitro, como, por exemplo, em amostras de soro ou de sangue.

[00359] O conjunto de polipeptídeos de acordo com a presente invenção compreende um primeiro polipeptídeo P1 e P2 de um segundo polipeptídeo. O primeiro polipeptídeo P1 compreende uma primeira porção-alvo T1 (que é capaz de se ligar especificamente a um antíge- no A1) fundida a um primeiro fragmento F1 de um domínio funcional F (vide a figura 1A, em cima). O segundo polipeptídeo P2 compreende uma segunda porção-alvo T2 (que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno A2) ligada a um segundo fragmento F2 do domínio funcional F (vide a figura 1A, parte inferior). Mais importante, os fragmentos F1 resp. F2 do domínio funcional não são tóxicos e por sua própria incapaz de exercer qualquer função biológica, a menos que haja uma parceria entre os dois polipeptídeos P1 e P2. Quando ambos os poli- peptídeos P1 e P2 simultaneamente ligam-se aos seus antígenos na superfície de uma única célula que expresse ambos os antígenos de A1 e A2, os fragmentos F1 e F2 do domínio funcional F são trazidos juntos em estreita proximidade, eles hetero-dimerizam e assim complementam a função biológica desejada (vide a Figura 1B). Por outro lado, uma célula que expressa tanto apenas o antígeno A1 (Figura 1C) ou apenas o antígeno A2 (figura 1D) ou nenhum dos antígenos não causa a complementação da função biológica. Dessa maneira, a função biológica é conseguida com alta especificidade apenas na presença de células que têm ambos os antígenos de A1 e A2 na sua superfície da célula após a ligação simultânea de ambos os polipeptídeos P1 e P2 para uma tal célula. Dependendo da natureza da funcionalidade do domínio F, diferentes objetivos, tais como a identificação de detec- ção/ou eliminação de células que expressam ambos os antígenos de A1 e A2 específico podem ser realizados.

[00360] Em uma modalidade exemplar, este princípio inventivo é aplicado para a eliminação específica de células tumorais:

[00361] Novas análises histopatológicas e citometria de fluxo revelaram que as células tumorais podem ser detectadas e distintas de suas contrapartes não transformadas não por meio dos marcadores de superfície única, mas por meio da expressão de combina- ções/perfis de antígeno aberrantes, como é conhecido por meio das neoplasias hematopoiéticas e câncer e células tronco do câncer de várias outras proveniências. Dessa maneira, enquanto um único antí- geno pode não ser suficiente para identificar especificamente uma determinada célula de tumor, uma combinação específica de dois an- tígenos pode permitir discriminar a célula de tumor a partir de qualquer outro tipo de célula.

[00362] Por exemplo, o conjunto de polipeptídeos de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para eliminar especificamente as células de carcinoma caracterizadas por meio da expressão simultânea dos antígenos CD33 e CD19 na sua superfície celular. Esta combinação de antígenos é encontrada em certos tipos de células de leucemia aguda e distingue dessas células a partir de quaisquer outras células (tais como células não-malignas), o que pode levar, quer CD33 ou CD19 na sua superfície celular, mas não exercem tanto CD33 e CD19 em sua superfície celular (Ossenkoppele et al., Revisão da relevância da expressão do antígeno aberrantes por citometria de fluxo em neoplasias mieloides. Br J Haematol 2011, 153 (4) : 42136).

[00363] Para eliminar especificamente as células leucêmicas que transportam tanto CD33 e CD19 na sua superfície celular, a primeira porção-alvo T1 do primeiro polipeptídeo P1 pode ser um fragmento variável de cadeia única (scFv) específico para CD33. Como fragmento F1 do domínio funcional F, o domínio variável da cadeia leve VL de um anticorpo anti-CD3 pode ser escolhido. A segunda porção T2-alvo do segundo polipeptídeo P2 pode ser de algum scFv para CD19. Co mo o fragmento F2 da funcional do domínio F da cadeia pesada do domínio variável VH do anticorpo anti-CD3, que pode ser escolhido. A VL de domínio variável da cadeia leve e VH do domínio variável da cadeia pesada do anticorpo anti-CD3 são cada um não-tóxico por conta própria. Eles também não são capazes de exercer a sua função biológica (por exemplo, para ligar de maneira eficaz o antígeno CD3), a menos que seja uma parceria entre os polipeptídeos de P1 e P2.

[00364] Na presença de uma célula de leucemia tendo ambos o CD33 e CD19 na sua superfície celular, ambos os polipeptídeos de P1 e P2 se ligam simultaneamente à célula. Como consequência, os fragmentos F1 e F2 do grupo funcional F (ou seja, a cadeia pesada e leve do domínio variável de Fv de anti-CD3 do tal anticorpo anti-CD3) são trazidos juntos em estreita proximidade, eles hetero-dimerizam e, dessa maneira, completam a função biológica desejada, permitindo que o dímero de P1 e P2 venha a se ligar especificamente a CD3.

[00365] CD3 é uma molécula da superfície da célula que está presente na superfície das células T. A molécula é parte da sinalização celular complexa T, e a ligação cruzada de moléculas de CD3 na superfície da célula T após a ligação de um anticorpo específico-CD3 conduz à ativação das células T. Ao envolver os antígenos CD3 sobre a superfície das células T, os heterodímeros de polipeptídeos de P1 e P2 são capazes de recrutar as células T e ativá-las. Como um resultado, os mecanismos efetores típicos de uma resposta das células T ci- totóxicas são extraídos, o que leva à lise das células: libertação de grânulos líticos que contenham as proteínas citotóxicas perforina, granzimas, e granulisina. Perforina forma os poros na membrana da célula-alvo por meio da qual as granzimas podem entrar e induzir a apoptose. Estes efeitos levam à destruição específica de células leu- cêmicas que transportam tanto CD33 quanto o antígeno CD19 na sua superfície celular.

[00366] Outras células além das células leucêmicas não têm tanto o CD33 e o antígeno CD19 na sua superfície celular. Por isso, eles não podem recrutar ambos os polipeptídeos P1 e P2, e não complementam da capacidade de ligação de CD3 e o envolvimento de linfócitos T CD3 positivas é alcançado. Consequentemente, outras células além das células leucêmicas não são afetadas, e a destruição das células malignas, com excelente especificidade é obtida.

[00367] Isto está em contraste gritante com os anticorpos biespeci- ficos convencionais. Um construto biespecífico convencional que envolve células T e tem especificidade para as células expressam o CD33 que é um mediador da destruição de todas as células positivas para CD33. Uma vez que CD33 é o marcador de linhagem mieloide, que é expresso em várias células mieloides e células progenitoras mi- eloides, a destruição destas células resultaria em aplasia de longa duração e, provavelmente, a morte do paciente. Um construto biespecífi- co convencional que envolve as células T e tem especificidade para as células positivas CD19 conduziria à eliminação de todas as células que transportam o antígeno CD19 na sua superfície celular. CD19 é expresso em um subconjunto significativo de linfócitos-B. A destruição dessas células conduziria a um grave defeito do sistema imunológico. Dessa maneira, além de eliminar as células leucêmicas que expressam, simultaneamente, CD33 e CD19 sobre a superfície, a aplicação de anticorpos bi-específicos convencionais, com especificidade para o CD33 e CD19 conduziria à eliminação de células mieloides e um subconjunto significativo de linfócitos-B.

[00368] Dessa maneira, enquanto que os anticorpos bi-específicos convencionais reconhecem apenas um antígeno na célula a ser eliminado, a ativação de efetor de acordo com a presente invenção requer o reconhecimento simultâneo de dois antígenos específicos na superfície da célula a ser identificada/eliminada. Em consequência, a pre sente invenção atinge especificidade significativamente melhoradas e efeitos colaterais reduzidos.

[00369] É claro para uma pessoa com conhecimentos na técnica que, dentro do princípio da presente invenção, diversas variações para a modalidade exemplar acima descrita são possíveis.

[00370] Por exemplo, o método descrito na modalidade exemplar acima pode facilmente ser adaptado para a identificação e/ou eliminação de outros tipos de células tumorais, além das células de leucemia aguda positivas CD33 e CD19 por meio da simples escolha apropriada das porções de direcionamento T1 e T2, que se ligam especificamente a A1 e antígenos A2, respectivamente, que estão presentes ao mesmo tempo em que as células sejam identificadas/eliminadas, mas não apresenta simultaneamente em outros tipos de células. Como citado acima, muitas, se não todas as células de carcinoma (mas também as células progenitoras/precursoras de células de carcinoma) expressar um número de moléculas da superfície celular, que por si só, são amplamente expressos em tecidos normais, mas são indicativas para o fenótipo maligno se expressa de uma forma não -fisiológica combinação. Por exemplo, CD34 é um marcador para as células tronco hema- topoiéticas e CD7 pode ser detectado em um subconjunto de células linfoides. A combinação de CD34 e CD7, no entanto, está fortemente associada à malignidade, e co-expressão aberrante de ambos os antí- genos podem ser detectados em uma proporção substancial de leucemias mieloides agudas (Ossenkoppele et al., Revisão da relevância da expressão do antígeno aberrantes por citometria de fluxo em neoplasias mieloides. Br J Haematol 2011, 153 (4) : 421-36.). Da mesma forma, a co-expressão aberrante de CD44 e CD117 foi descrita para as células tronco do câncer de ovário, CD44 e CD24 para o câncer de pâncreas iniciando as células e a combinação de EpCAM e CD44 em células tronco do cólon e câncer de mama (Natasha Y. Frank, Tobias Schatton, Markus H. Frank,. a promessa terapêutica do conceito de células tronco do câncer J Clin Invest 2010;. 120: 41-50). A expressão de CD24 e CD29, assim como CD24 e CD49f foi encontrada para ser específica para o carcinoma da mama (Vassilapoulos A et al. Identificação e caracterização de células de câncer de iniciação de tumores mamários BRCA1 relacionados com marcadores de células tronco mamários normais. Int. J. Biol Sci 2008; 4: 133-142). Além disso, as combinações com os níveis de antígeno altamente expressos são indicativas de um certo número de doenças malignas, como CD38 e CD138 de mieloma.

[00371] Em adição às combinações de antígenos específicos de câncer listados acima e aquelas conhecidas a partir da literatura científica, combinações adicionais de dois antígenos que são expressos si-multaneamente em células tumorais específicos, mas não em outras células podem ser derivadas de uma forma linear por meiod aqueles que são versados na técnica.

[00372] Em primeiro lugar, a pessoa que é versada pode chegar a uma combinação de antígeno que é específico para um determinado câncer através da combinação de um antígeno que é específico para o estado maligno do respectivo tipo de células com um marcador tipo de célula apropriado ou um marcador de linhagem de células. Por exemplo, a anidrase carbônica IX é um marcador fortemente associado com o carcinoma de células renais e as metástases de carcinoma de células renais e, dessa maneira, representa um marcador para o estado maligno de células renais. Esta membrana localizada marcador, no entanto, também é expressa em células normais do trato intestinal. Ao selecionar como segundo antígeno marcador de linhagem renal como aquaporina, a combinação resultante de dois antígenos é específica para células de carcinoma de células renais e as células que resultam de metástases de carcinoma das células renais, enquanto que nem as células de rim de não-malignos (que não expressam a anidrase carbónica IX), nem as células do trato intestinal (que não expressam aqua- porinas) são caracterizadas por meio do par selecionado de antígenos.

[00373] Informações detalhadas sobre os marcadores para o estado maligno de vários tipos de células e nos marcadores para numerosos tipos de células ou linhagens celulares estão disponíveis a partir da literatura e recursos baseados na web (vide abaixo para mais detalhes) ou pode ser obtido por meio da experimentação direta (vide abaixo).

[00374] Exemplos de marcadores para o estado maligno de uma célula são: E-caderina em células epiteliais e células de carcinoma da mama do tipo ductal; Ca-125 para neoplasias epitelioides e células de carcinoma de ovário, células de adenocarcinoma e células de câncer de mama; Her-2/neu para as células do câncer de mama; cística proteína bruta fluido doença (BRST-2 proteína) para as células do câncer de mama; BCA-225 (carcinoma de mama glicoproteína associada) para as células do pulmão e do câncer de mama; CA 19-9 (antígeno carboidrato 19-9) para pâncreas, vias biliares e células de carcinoma do trato intestinal; CEA para as células do câncer colorretal; CD117 (c-kit) para células GIST (tumor estromal gastrointestinal) (e células mieloi- des e mastócitos); CD30 para células de Reed-Sternberg (e Ki-1 células T ativadas e células-B); Antígeno epitelial (BER-EP4), antígeno de membrana epitelial, e antígeno epitelial relacionado (MOC-31) para as células de carcinoma epiteliais; receptor do Fator de crescimento epidérmico (HER1) para células de vários tipos de câncer; Derivado de plaquetas do receptor do fator de crescimento (PDGFR) alfa para as células de vários tipos de câncer; Melanoma associado ao marca- dor/Mart 1/Melan-A para células de melanoma; CD133 para populações de células tronco do câncer e outros; marcador 72 (tumor associado gp 72) para células de adenocarcinoma.

[00375] Outros exemplos de marcadores para um estado maligno de uma célula/células incluem: EpCAM, CD19, HER-2, HER-3, HER-4, PSMA, MUC-1 (mucina), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, Lewis-Y, CD20, CD33, CD44v6, Wue-1, Antígeno da célula plasmática, (ligada à membrana) IgE, melanoma sulfato de condroitina proteoglicano (MCSP), STEAP, mesotelina, antígeno celular da próstata Stem (PSCA), sTn (sialiladas antígeno Tn), FAP (antígeno de ativação de fibroblastos), EGFRvIII, Igα, Igβ, MT-MMPs, antígeno Cora, EphA2, L6 e CO-29, CCR5, βHCG, gangliosídeo GD3, 9-O-acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosila GM1, Poly SA, GD2, Carboanhidrase IX (MN/CA IX), Sonic Hedgehog (Shh), CCR8, precursor TNF-alfa, A33 Antígeno, Ly-6, desmogleína 4, E-caderina neoepitopo, receptor de acetilcolina Fetal, CD25, Muellerian Substância inibidor (MIS) Receptor tipo II, endossialina, SAS, CD63, TF-antígeno, CD7, CD22, Igα (CD79a), Igβ (CD79b), G250, gp100, F19-antígeno e EphA2.

[00376] Exemplos de antígenos, que são específicos para um determinado tipo de células de linhagem/célula ou para alguns tipos de células (linhagens de células/marcadores de linhagem marcadores do tipo de célula/célula) incluem: CD45 para células hematopoiéticas; CD34 para células endoteliais, células tronco e células do estroma; CD33 para células mieloides; CD138 para as células do plasma e um subconjunto de células epiteliais; CD15 para epitelial, mieloide e células de Reed-Sternberg; CD1a para thymocyctes corticais e células de Langerhans; CD2 para as células do timo, células T e células naturais assassinas (NK); CD3 para células-T, CD4 para as células T auxiliadoras; CD5 de células-T, um subconjunto de células B, e células de car-cinoma do timo; CD8 para células T citotóxicas; CD20 para células B; CD23 para células B ativadas; CD31 para células endoteliais; CD43 para células T, células mieloides, um subconjunto de células B, histió- citos e plasmócitos; CD56 em células NK; CD57 para células neuroen- dócrinas, e células NK; CD68 para macrófagos; CD79a para B e células plasmáticas; CD146 para a linhagem de células endoteliais; proteínas tensoativas para células do pulmão; sinaptofisina, CD56 ou CD57 por células neuroendócrinas; receptor de acetilcolina nicotínico ou qui- nase músculo-específica (MUSK) para as células musculares; canais de cálcio dependentes da voltagem (/ Q-tipo P) ou d canais de potássio dependentes da voltagem (CPVD) ou do receptor de N-metil-D- aspartato (NMDA) para as células do músculo e dos neurônios; TSH (hormônio estimulante da tireoide) receptor para glândula tireoidiana; amfifisina para células musculares; HepPar-1 para hepatócitos; ganglioside GQ1b, GD3 ou GM1 para células neuronais; e glicoforina-A para células da linhagem de células eritropoiética.

[00377] Deve notar-se que existem situações em que pode ser vantajoso contar para os efeitos da presente invenção, em um antígeno com uma especificidade menor que a perfeita para o tipo de célula ou a linhagem de células de interesse. Por exemplo, em situações onde não é conhecido p antígeno que se encontra exclusivamente na linhagem celular/célula de interesse e não em quaisquer outros tipos de células de linhagens/ou em situações em que não é possível confirmar a especificidade exclusiva de um antígeno, também antígenos que estão presentes em um ou mais outros tipos de células linhagens de células T/além da linhagem de célula/célula de interesse pode ser considerado. Consideração semelhante se aplica para os marcadores para o estado maligno de uma célula, ou mesmo para a especificidade da combinação de dois antígenos. Dessa maneira, existem, por exemplo, situações onde para os fins da presente invenção, uma combinação de dois antígenos é selecionada que é específica, não só para as células de interesse, mas também por uma ou mais (alguns) linhagens celulares de outros tipos de células T// tipos de células malignas.

[00378] Em segundo lugar, a pessoa que é versada na técnica pode chegar a uma combinação de antígeno que é específica para um determinado câncer por experimentação direta. Isto pode compreender as etapas de (1) determinar os antígenos de superfície nas células tu- morais a ser eliminado e (2) a identificação de entre estes antígenos de superfície de células de tumor de dois antígenos que não estão presentes simultaneamente em outros tipos celulares (ou, em algumas modalidades, apresentar em apenas alguns outros tipos de células).

[00379] Muitas vezes, a experimentação pode não ser necessária para determinar os antígenos de superfície de células tumorais para ser eliminado, porque essas informações podem já estar disponíveis para o respectivo tipo de câncer a partir da literatura impressa (vide, por exemplo, David J. Dabbs, Imuno-histoquímica de diagnóstico, Churchill Livingstone, 3a edição (2010), ou F e J Lin Prichard, Manual Prático de imunohistoquímica: Frequently Asked Questions, Springer, Nova York, 1a edição (2011)). Mesmo a informação mais extensa está disponível através de recursos baseados na web. Por exemplo, o Cancer Genome Anatomy Project (CGAP), do Instituto Nacional do Câncer dos EUA (NCI) determinou sistematicamente os perfis de várias células pré-câncer, normais e cancerígenas (Strausberg RL expressão gê- nica The Cancer Genome Anatomy Project: Constructo de uma nova informação. e plataforma de tecnologia para pesquisa de câncer: Patologia Molecular do Câncer precoce, 1999 (Srivastava, S., Henson, DE, Gazdar, A., eds IOS Press.), pp 365-370). Os recursos gerados pela iniciativa CGAP estão disponíveis gratuitamente (http: //cgap.nci.nih.gov/) e incluem o acesso a todos os dados CGAP e as ferramentas de análise necessárias. Da mesma forma, a Iniciativa da Caracterização de Genoma do Câncer (CGCI) do Instituto Nacional do Câncer se concentra em ferramentas para caracterizar as alterações genômicas envolvidas em diferentes tumores, por exemplo métodos de caracterização genômica, incluindo exome e análise do transcrito- oma utilizando sequenciamento de segunda geração. Os dados gerados pelo CGCI estão disponíveis através de um banco de dados de acesso público (http: //cgap.nci.nih.gov/cgci.html). Dessa maneira, em muitos casos, a informação sobre a presença ou ausência de várias proteínas da superfície celular conhecidas sobre as células tumorais de interesse pode ser derivada simplesmente verificando estas bases de dados publicamente acessíveis. Se desejado, esta informação pode então ser verificada em uma segunda etapa por meio de análise imu- nocitoquímica/imuno-histoquímico de células de tumor/tecido de acordo com os métodos descritos a seguir.

[00380] Se não há informações disponíveis sobre as proteínas expressas pelas células tumorais/tecido de interesse, a pessoa que é versada na técnica pode realizar uma caracterização dos antígenos nas células tumorais/tecido por meio dos métodos imunocitoquími- cos/imuno-histoquímicos com um painel de anticorpos (vide, por exemplo,, "Manual Prático de imunohistoquímica: Perguntas Frequentes", de Lin F e J Prichard, Springer New York, 1a edição (2011), ou "Utilizando os Anticorpos: Um Manual Laboratorial " e por Harlow e D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Em resumo, uma preparação histológica ou células isoladas a partir de tumor foram incubadas com um primeiro anticorpo direcionado para um antígeno de superfície potencial e, após uma etapa de lavagem, a incubação de um segundo anticorpo direcionado contra o domínio Fe do primeiro anticorpo. Este segundo anticorpo é marcado com um fluoróforo, ou uma enzima tal como HRP (peroxidase de rábano silvestre), de modo a visualizar a expressão do antígeno-alvo. Painéis de anticorpos que podem ser utilizados para fins de antígeno de alto rendimento de perfis de antígenos de superfície de células estão comercialmente disponíveis de vários fabricantes.

[00381] Além disso, as ferramentas especificamente dedicadas à alta taxa de caracterização de células proteômica para identificar e analisar a expressão de proteína da superfície da célula estão comercialmente disponíveis, tais como o FACS (separação de células ativada por fluorescência) com base em alta tecnologia de matriz de transferência BD FACS™ PAC (Combinatória Anticorpo perfil) da Becton, Dickinson & Company.

[00382] A análise imunocitoquímica/proteômica/imunocitoquímica descrita acima pode ser precedida (ou, em alguns casos, substituída) por todo o genoma da expressão do gene de perfis de células de tumor ou por meio da análise por espectrometria de massa das proteínas expressas pelas células tumorais/tecido de interesse. Por exemplo, toda a expressão de genes do genoma de perfis de células tumo- rais pode ser levada a cabo para verificar se a expressão de várias moléculas da superfície celular, e a presença de tais antígenos sobre a superfície celular das células de tumor pode depois ser confirmada através de coloração com anticorpos métodos como descritos acima.

[00383] Outras informações sobre as abordagens para caracterizar os antígenos de superfície de células (câncer) estão disponíveis na literatura científica relevante (por exemplo, Zhou J, L Belov, Huang PY, Shin JS, Salomão MJ, Chapuis PH, Bokey L, C Chan, Clarke C,. Clarke SJ, Christopherson RI. Perfis da Superfície de antígeno de câncer colorretal utilizando microensaios de anticorpos com multiplexação de fluorescência J Métodos Immunol 2010; 355: 40 a 51; ou Carter P, L Smith, Ryan M. Identificação e validação de antígenos de superfície celular para anticorpo visando em oncologia. Endocr Relat Cancer 2004; 11: 659 a 87).

[00384] Em uma próxima etapa, a pessoa que é versada na técnica pode identificar entre os antígenos da superfície celular das células tumorais uma combinação de dois antígenos que não é expressa si- multaneamente em outros tipos de células.

[00385] Muitas vezes, já a literatura ou bancos de dados publicamente disponíveis podefornecer informações detalhadas sobre a presença ou ausência de antígenos de outros tipos de células:

[00386] A expressão de várias moléculas da superfície celular em diversos tipos de células foi estudada sistematicamente por investigadores nas últimas décadas, por meio da imunofenotipagem e perfis de expressão de gene de quase qualquer tipo de célula do corpo. Por exemplo, informações detalhadas sobre a expressão de mais de 360 "agrupamentos de diferenciação" de antígenos (ou antígenos CD) está disponível em versão impressa (por exemplo, " Moléculas celulares de Leucócitos e estromais: os marcadores de CD", de Zola H, Swart B, Nicholson I, Voss e e; John Wiley & Sons, 1 a ed (2007)) e em deposi- tórios on line (por exemplo, www.hcdm.org/MoleculeInformation/tabid/54/Default.aspx), e inclui informação sobre os níveis de distribuição de tecido e expressão de an- tígenos., bem como informações sobre anticorpos reativos de antíge- nos e os epítopos aos quais estes anticorpos se ligam.

[00387] Além disso, há bancos de dados publicamente disponíveis que dão acesso a uma grande quantidade de dados genômicos gerados pela comunidade científica. Por exemplo, o Omnibus (GEO), plataforma de Expressão Gênica do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) dos Estados Unidos (Barrett T et al, NCBI GEO:.. Arquivo para genômica funcional de dados conjuntos de 10 anos. Nucleic Acids Res. 2011; 39 (edição de banco de dados): D1005-10) apresentam arquivos e dá acesso a uma enorme coleção de microen- saio, sequenciamento de próxima geração, e outras formas de dados genômicos funcionais de alto rendimento, e ainda proporciona interfaces e aplicativos baseados na web para fácil acesso a esta informação (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

[00388] Uma vez que um par de dois antígenos foi identificado através destes recursos que parece estar ausente de outros tipos de células para além das células tumorais de interesse, uma pessoa que é versada na técnica pode facilmente validar a adequação da concentração de antígeno para o desenvolvimento de constructos de polipeptí- deo P1 e P2. Tal validação de que a combinação de dois antígenos identificados, de fato não é expressa simultaneamente em outros tipos de células além das células do tumor pode ser realizada por meio de análise imuno-histoquímica/imunocitoquímica de um (optimamente grande) colecção de diversos tipos de células e/ou tecidos, com anticorpos contra os dois antígenos. Células e tecidos de qualquer tipo podem ser obtidos a partir ATCC (American Type Culture Collection), de departamentos de patologia e de bancos de tecidos associados com universidades e instituições de pesquisa. Uma combinação de antígeno adequado é definida como um par de anticorpos que mancha exclusivamente as células tumorais, mas não tecidos saudáveis ou células saudáveis (isto é, ambos os anticorpos do par coram as células tumorais, mas não outros tecidos/células são corados por ambos os anticorpos).

[00389] Deve notar-se que, enquanto que, em muitos casos, o maior grau de especificidade (especificidade de preferência absoluta) é, evidentemente desejável, há situações em que um menor grau de especificidade é aceitável. Por exemplo, se o conjunto de polipeptídeos é utilizado para fins de diagnóstico, um certo grau de reatividade cruzada com outros tipos de células ou tecidos pode ser aceitável (especialmente no caso de tumores sólidos, uma vez que a informação posi- cional adicional ajuda a distinguir as células tumorais a partir de células de reação cruzada). Além disso, se o conjunto de polipeptídeos é utilizado para fins terapêuticos, um certo grau de reatividade cruzada com outros tipos de células ou tecidos pode também ser aceitável, de- pendendo da gravidade da doença no paciente tratado e nos tipos de células/tecidos afetados por meio da reatividade cruzada. Outras situações onde um menor grau de especificidade pode ser aceitável, pode surgir no contexto de um transplante de configuração (vide abaixo).

[00390] Nos casos onde nenhuma sugestão sobre uma combinação de antígeno adequada pode ser derivada a partir da literatura ou a bases de dados públicas, a presença/ausência de antígenos da superfície celular das células de tumor a partir de outros tipos de células pode ser verificada por meio de experimentação simples. Para este fim, uma variedade dos tipos e/ou os tecidos pode ser obtida a partir das fontes acima referidas células podem ser submetidas a caracterização de células proteoma, imunocitoquímicos/imuno-histoquímica e/ou perfil de expressão do gene. (Deve-se notar que tal análise de células/tecidos não-tumorais tem de ser realizada apenas uma vez, em ordem para obter os dados que podem ser utilizados para a criação de vários constructos de acordo com a presente invenção, que pode ser adaptado a diversas diferentes situações terapêuticas ou diagnóstico.) Após a comparação dos resultados obtidos com a informação sobre os antí- genos da superfície celular das células tumorais de interesse, uma combinação de dois antígenos que não está presente em quaisquer outras células além das células tumorais de interesse pode ser facilmente identificada.

[00391] Uma abordagem sistemática semelhante para identificar um par de dois antígenos, que é específico para células tumorais é também descrita em uma publicação recente por Balagurunathan, que se apoia sobre a expressão do gene de todo o genoma criação de perfil seguido por imuno-histoquímica (Yoganand Balagurunathan, Expressão do gene de identificação com base em perfis de-alvos da superfície celular para o desenvolvimento de ligantes multiméricas no câncer de pâncreas Mol Ther 2008; 7 3071-3080). Utilizando microarranjos de DNA, os autores desse manuscrito geraram as bases de dados de perfis de expressão gênica de mRNA para um número significativo de amostras de câncer de pâncreas e amostras de tecidos normais. Os dados de expressão para os genes que codificam as moléculas da superfície das células foram analisados por um método computacional multivariado baseado em regras, a fim de identificar as combinações de genes que são expressos preferencialmente em células tumorais, mas não em tecidos normais. Co-expressão aberrante de antígenos que constituem uma combinação antígeno específico do tumor foi então confirmada através de técnicas de imunohistoquímica padrão no tecido do tumor de pâncreas e microensaios de tecido normal.

[00392] Tendo identificado e validado uma tal combinação de antí- genos que são específicos para as células tumorais de interesse, os constructos de polipeptídeo P1 e Polipeptídeo P2 podem ser manipulados por meio das técnicas de engenharia de proteínas e os métodos padrão de biologia molecular (vide, por exemplo, L e M Howard Kaser, fazendo e utilizando anticorpos: um Manual Prático, CRC Press, 1 a edição (2006); Sambrook et al, Clonagem Molecular:. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)).

[00393] Para muitas moléculas da superfície celular, os anticorpos monoclonais específicos são caracterizados e, portanto, facilmente disponíveis. Dessa maneira, em muitos casos, a pessoa que é versada na técnica pode ter acesso às células de hibridoma de anticorpos mo- noclonais que são específicos para os antígenos da combinação de antígenos identificados. Tendo a opção de escolher a partir de um painel de anticorpos específicos para um dado antígeno, uma pessoa que é versada na técnica pode escolher um anticorpo reativo que se liga a um epitopo próximo da membrana, a fim de minimizar a distância da célula que expressa o antígeno do efetor célula (Bluemel C, Hausmann S, P Fluhr, Sriskandarajah M, Stallcup WB, Baeuerle PA, Kufer p Epitopo distância para o tamanho da membrana de células-alvo e o antígeno determinar a potência de lise T mediada por células por meio de anticorpos específicos para BiTE um grande melanoma antígeno de superfície Cancer Immunol Immunother agosto de 2010; 59 (8) : 1197 a 209). Se não existir tal anticorpo que está disponível contra um ou ambos os antígenos da combinação de antígenos identificados, os anticorpos monoclonais contra os antígenos podem ser gerados através de técnicas padrão (por exemplo, L e M KASER Howard, Fazendo e com Antibodies: A Pratical Handbook, CRC Press, 1a edição (2006)). Além disso, várias empresas oferecem serviços completos para a geração de anticorpos monoclonais feitos sob medida e células de hibri- doma.

[00394] DNA ou mRNA que codifica para os domínios variáveis dos anticorpos monoclonais de interesse podem ser obtidos a partir de hi- bridomas por amplificação por PCR ou clonagem (Orlandi R, Gussow PT, Jones:. Clonagem de domínios variáveis de imunoglobulina para a expressão por meio da reação em cadeia da polimerase, Proc Natl Acad Sci EUA 1989, 86 (10) : 3833-3837, Wang Z, Raifu M, Howard M, Smith L, Hansen D, Goldsby R, Ratner D: Amplificação por PCR Universal de regiões variáveis do gene da imunoglobulina do camundongo: o desenho de iniciadores degenerados e uma avaliação do efeito da polimerase de DNA da atividade 3 5' exonuclease J Immunol Methods 2000, 233 (1-2) : 167-177; Essono S, Frobert Y, Grassi J, CRE- MINO C, Boquet D: Um método geral que permite o desenho de oligo- nucleotídeos para amplificar as regiões variáveis de cDNA imunoglo- bulina J Immunol Methods 2003, 279: 251 a 266; G Howard e M Kaser, fazendo e utilizando anticorpos: Um Manual Prático, CRC Press, 1a edição (2006)) ou de vetores já estabelecidos que compreendem a sequência de DNA do fragmento variável do respectivo anticorpo. Muitas vezes, a sequência pode ser extraída a partir de bases de dados pú- blicas, onde muitas sequências são depositadas, e, em seguida, o constructo pode ainda ser gerados por meio da síntese do gene, uma vez que é oferecido por vários fornecedores de serviços comerciais (por exemplo, criativas Biolabs, Shirley, USA).

[00395] Para formar o constructo de polipeptídeo P1, a sequência de codificação para o fragmento Fv de variável de um anticorpo específico para o antígeno em primeiro lugar do par de antígenos identificados (ou, opcionalmente, a sequência de um fragmento variável de cadeia única derivada da sequência que) é utilizado para a primeira porção-alvo (T1) e ligados através de um ligante adequado (de codificação, por exemplo, para menos de 12 aa), a uma sequência de codificação para o primeiro fragmento F1 de um domínio funcional (por exemplo, o domínio VL de um anticorpo anti-CD3). Da mesma forma, para formar o constructo de polipeptídeo P2 a sequência de codificação para o fragmento Fv de variável de um anticorpo específico para o antígeno do segundo par de antígenos identificados (ou, opcionalmente, a sequência de um fragmento variável de cadeia única derivada da sequência) está sendo utilizado para a segunda porção-alvo (T2) e ligado através de um ligante apropriado para uma sequência que codifica para o segundo fragmento F2 do que domínio funcional (por exemplo, o domínio VH de um anticorpo anti-CD3).

[00396] Para qualquer constructo de um polipeptídeo P1 ou P2 de acordo com a presente invenção, as modificações do constructo ou para as sequências utilizadas para a formação do constructo são consideradas de forma a adaptar-se o constructo com as necessidades específicas. Por exemplo, um constructo pode ser modificado de uma forma que reduz ou suprime a sua imunogenicidade nos seres humanos. No caso de uma sequência é derivada de um anticorpo progenitor não-humano, tal como um anticorpo de murino, modificações na sequência pode ser levada a cabo que resultam em uma imunogenicida- de reduzida nos seres humanos, mantendo ou retendo substancialmente as propriedades de ligação ao antígeno do anticorpo progenitor (conhecido por meio da pessoa que é versada na técnica como "humanizar" um anticorpo/constructo).

[00397] Várias modificações do procedimento acima descrito e adaptações, a fim de acomodar as modalidades e variações descritas neste pedido são evidentes para a pessoa com conhecimentos na técnica.

[00398] Além das variações em relação aos antígenos em que as porções de direcionamento T1 e T2 se ligam especificamente a, várias outras modificações são possíveis. Por exemplo, em vez de fragmentos de variantes de cadeia única (scFv) como porção T1 e/ou T2-alvo outros tipos de anticorpos monovalentes ou estruturas semelhantes a anticorpos podem ser empregues. Por exemplo, uma estrutura de anti- corpos/do tipo anticorpo derivada de um anticorpo de lama, camelo ou tubarão pode ser utilizada. Como anticorpos de lhama, camelo e tubarão têm uma porção de ligação do antígeno que é construído por um único domínio (em vez de um uma cadeia VH e uma cadeia VL), o po- lipeptídeo P1 ou P2 resultante é muito menor e pode, dessa maneira, melhor penetrar nos tecidos tumorais.

[00399] Além disso, uma vez que muitos antígenos tumorais são relevantes para receptores ligados à superfície celular, o Fv de cadeia única de porção-alvo T1 e/ou T2 pode ser substituído pelo ligante natural ou artificial de um tal receptor ligado à superfície celular. Como anticorpos, estes ligantes naturais ou artificiais conferem excelente especificidade para o receptor-alvo. Alternativamente, a porção-alvo T1 e/ou T2 pode ser um aptâmero.

[00400] Além disso, a fim de aumentar a afinidade de ligação de uma porção-alvo para o antígeno, a porção-alvo pode ser multimeriza- da e/ou alterados por glicosilação ou outros tipos de pós-tradução ou modificação química ou ser optimizado por meio de mutagênese dirigida, ou um processo de selecção de exibição em fagos.

[00401] Além disso, os fragmentos F1 e F2 (ou seja, os fragmentos VL e VH de anti-CD3 Fv na modalidade exemplificativa acima descrita) podem ser substituídos por fragmentos de um domínio funcional diferente de F, o que resulta em um efeito biológico diferente mediante a complementação dos dois fragmentos. Utilizando fragmentos de anti CD56, anti CD1a, ou anti CD16a, as células assassinas naturais podem ser recrutadas e ativadas. Utilizando os fragmentos de anti CD16, as células assassinas naturais, leucócitos, neutrófilos polimorfonuclea- res, monócitos e macrófagos podem ser recrutados e ativados. Utilizando os fragmentos de anti CD32a, anti CD32b, anti CD89, anti CD16a, ou anti CD64, os macrófagos podem ser recrutados e ativados. Utilizando os ragmentos de anti CD32a, CD32b anti, anti CD64 ou anti CD89, os monócitos podem ser recrutados e ativados. Utilizando os fragmentos de anti CD16b, anti CD89, anti CD32a, CD32b anti ou anti CD64, granulócitos podem ser recrutados e ativados. Além disso, como alternativa para anti CD3, as células T podem também ser recrutados e ativados utilizando os fragmentos de anti CD2, anti CD5, anti CD28, ou TCR (receptor de células T) anti. Mais informações ou opções adicionais em relação ao recrutamento e ativação de células efe- toras através de anticorpo de ligação estão disponíveis na literatura, por exemplo, " Anticorpos Biespecíficos ", de Roland E. Kontermann (ereferidor), Springer Berlin Heidelberg; 1 a Edição. (2011).

[00402] Uma opção adicional é a utilização de um conjunto de poli- peptídeos de P1 e P2, com os fragmentos F1 e F2 de um domínio funcional F, que se liga a um antígeno em uma célula efetora após a complementação dos dois fragmentos, mas em que a ligação a esse antígeno da célula efetora não faz causa ativação de células efetoras, disse. Este conjunto de polipeptídeos ("primeiro conjunto de polipeptí- deos") é então utilizado (por exemplo, administrado a um paciente) em combinação com um segundo conjunto de polipeptídeos por fragmentos de um domínio funcional F, que mediante a complementação se liga a um segundo antígeno diferente na mesma célula efetora, mas em que novamente se ligar a este antígeno da célula efetora não provoca a ativação da célula efetora. Os antígenos para a qual o primeiro e o segundo conjuntos de polipeptídeos se ligam são escolhidos de uma maneira que, enquanto que a ligação de apenas um dos dois an- tígenos sobre as células efetoras não resulta na ativação da célula efe- tora, a ligação de ambos os antígenos na efetora célula leva simultaneamente a ativação da célula efetora. Isto tem as vantagens de que (1) antígenos de células efetoras podem ser utilizados que não funcionam individualmente, mas requerem a co-estimulação de um segundo antígeno, e (2) o número de antígenos diferentes que determina a especificidade com a qual uma determinada célula (tais como uma célula cancerígena) se distingue das outras células pode ser aumentada de dois (se o primeiro e segundo conjunto de polipeptídeos têm as mesmas porções de direcionamento de T1 e T2, respectivamente) para um máximo de quatro antígenos diferentes (se o primeiro e segundo conjunto de polipeptídeos têm não visando porção em comum).

[00403] Efeitos semelhantes podem ser conseguidos com dois conjuntos de polipeptídeos com diferentes porções de direcionamento, mas o mesmo domínio funcional: Estes conjuntos de polipeptídeos são concebidos para ter um domínio funcional direcionado contra um antí- geno de célula efetora, que normalmente permite que cada conjunto de polipeptídeos, por si só venha a ativar as células efetoras. No entanto, ambos os conjuntos de polipeptídeos são utilizados em uma concentração que é demasiadamente baixa para provocar a ativação de células efetoras eficientes. Se ambos os conjuntos de polipeptídeos estão presentes ao mesmo tempo (por exemplo, na administração si- multânea de um paciente) a cada conjunto de polipeptídeos, por si só não é capaz de ativar a célula efetora (devido à sua baixa concentração), enquanto que a combinação de ambos os grupos de polipeptí- deos é (devido os efeitos dos dois conjuntos de polipeptídeos actuam sinergicamente e, dessa maneira, a soma dos efeitos cautilizados pelos dois conjuntos de polipeptídeos é suficiente para ativar a célula efetora).

[00404] Como outra alternativa ao recrutamento/ativação de células efetoras, uma abordagem de "pré-direcionamento" pode ser perseguida, já que está bem estabelecido para os constructos de anticorpos bi-específicos (Imagem de Câncer e terapia com pré- direcionamento de anticorpos Biespecíficos. Goldenberg DM, Chatal JF, Barbet J, Boerman O, Sharkey RM Atualização Ther Cancer 2007 Mar; 2 (1) : 19-31). Para este fim, F1 e F2 são substituídos por fragmentos de VH e VL de um anticorpo específico para um antígeno, uma molécula de suporte (isto é, uma peça/molécula de uma molécula que não é reconhecido como estranho pelo sistema imunitário do paciente a quem o referido conjunto de polipeptídeos é administrada ou uma molécula que nenhum ou apenas causa uma reação imunitária fraca por um paciente a quem é administrado) ou um marcador de afinidade. Subsequentemente (ou simultaneamente) para administrar os polipeptídeos P1 e P2, um composto terapêutico ou de diagnóstico, acoplado ao referido antígeno, veículo ou molécula marcador de afinidade é administrado. Apenas as células que carregam ambos os antígenos de A1 e A2 na sua superfície são ligados por ambas poli- peptídeo P1 e Polipeptídeo P2. Por conseguinte, apenas a estas células complementação funcional conduz à geração de um local de ligação capaz de recrutar o composto terapêutico ou de diagnóstico através do referido antígeno, molécula veículo ou marca de afinidade. Esta abordagem permite o exclusivo direcionamento de células-alvo no seu conjunto, com a possibilidade de administração e dosagem de compostos terapêuticos, como toxinas ou substâncias radioativas ou compostos de diagnóstico preciso, enquanto que as células que não expressam os antígenos ou que expressam apenas um dos antíge- nos não são afetadas.

[00405] Uma molécula de veículo apropriado pode ser por exemplo um peptídeo ou uma molécula de hidrato de carbono. De preferência, a molécula veículo pode ser gelatina, dextrano, ou o amido de hidroxi- etila, que são comuns expansores de plasma que são metabolicamen- te inertes, permanecem no sangue e são eliminadas por via renal, se eles são suficientemente pequenos. Alternativamente, a molécula veículo pode ser inulina, uma molécula metabolicamente inerte que é utilizado rotineiramente na clínica para determinação de depuração glomerular (e, além disso, existem anticorpos que reconhecem especificamente a inulina).

[00406] Um marcador de afinidade adequado pode ser, por exemplo, um marcador Flag, um marcador myc, um marcador glutationa-S- transferase (GST), um marcador hemaglutinina (HA), um marcador poli-histidina (His), ou um marcador da proteína de ligação a maltose (MBP), um marcador de digoxigenina (DIG).

[00407] O composto terapêutico ligado ao antígeno, veículo ou molécula marcador de afinidade pode, por exemplo, ser um composto radioativo ou uma toxina.

[00408] Compostos radioativos adequados são por exemplo compostos que compreendem 90Y, 177Lu, 131I, 32P, 10B, ou 213Bi. Recrutamento do antígeno, veículo ou molécula marcador de afinidade ligado ao composto radioativo a células que expressam tanto o primeiro como o segundo antígeno conduz à acumulação de radioatividade para o local do tumor, resultando na destruição específica de células tumorais/tecido.

[00409] Em alternativa, o composto terapêutico ligado ao antígeno, veículo ou molécula marcador de afinidade pode ser por exemplo um composto tóxico que não é capaz de atravessar a membrana celular sem prévia de ligação à superfície da célula.

[00410] Este pré-requisito é cumprido pelos componentes A de toxinas clássicas AB derivadas de um número de bactérias patogênicas como Clostridium perfringens, C. botulinum, o C. difficile, B. anthracis e outros. AB-toxinas são complexos de proteínas de dois componentes que interferem com as funções das células internas. O componente A é o componente "ativo" (isto é, matar uma célula sobre a penetração da membrana), mas não é capaz de atravessar a membrana celular por si própria. O componente B é o componente "de ligação", que por si só não é tóxico, mas é essencial para a absorção e a penetração da membrana da componente A.

[00411] Por exemplo, o antígeno protetor Bacillus anthracis (PA) é um componente de toxina B clássica que medeia a captação do fator edema real exotoxins antraz e fator letal (LF). LF sem o componente PA não é tóxico desde que LF por si só não penetre as membranas e, portanto, não pode executar as suas capacidades patogênicas (Pezard C, Berche P, Mock M. "Contribuição dos componentes de toxina individuais para virulência do Bacillus anthracis" 1991 Infect. Immun 59 (10):. 3472). No entanto, quando ligados a moléculas da superfície celular, LF é internalizado e altamente tóxico para a célula.

[00412] Após a dimerização dos polipeptídeos P1 e P2, a função do domínio funcional F é reconstituída. Através da interação do domínio funcional reconstituído com o antígeno, veículo ou molécula marcador de afinidade acoplada com a toxina, a toxina é recrutada para a membrana celular das células-alvo, incorporada nas células e mata as células.

[00413] Este princípio pode ser facilmente adaptado para os fins da presente invenção pela pessoa que é versada na técnica, uma vez que já é amplamente utilizada nos chamados imunotoxinas, em que uma porção-alvo, principalmente um domínio de anticorpo ou do tipo ligante natural, está acoplado ao componente de toxina (vide, por exemplo, Imunotoxinas para terapia de câncer direcionada Kreitman RJ, AAPS J. 2006 Ago 18; 8 (3):. E532-51). Exemplos incluem as imunotoxinas baseadas em toxina da difteria (como Denileucina diftitox (nome co-mercial dos EUA Ontak), que foi aprovado pela FDA para o tratamento de alguns linfomas de células T) ou com base no Fator Letal de B. an- thracis (Pastan I, Hassan R, FitzGerald DJ Kreitman RJ (2007) "Tratamento de câncer de Imunotoxina" Annu Rev. Med 58:. 221-37).

[00414] Os componentes A adequados de AB-toxinas podem ser, por exemplo fator de edema B. anthracis, fator letal B. anthracis, toxina iota C. perfringens, toxina C2C. botulinum, C. difficile ADP- ribosiltransferase, C. diphtheriae toxina da difteria do fragmento A.

[00415] Em alternativa, o composto terapêutico pode ser por exemplo um composto citotóxico que é tóxico após a entrada em uma célula e que é capaz de atravessar a membrana celular por si só, sem prévia de ligação à superfície da célula. Neste caso, o antígeno, veículo ou molécula marcador de afinidade que o composto terapêutico é acoplado a é selecionado de modo a evitar que o conjugado resultante (isto é, o composto terapêutico ligado à molécula de marcação/afinidade antígeno/veículo) a partir do cruzamento de membranas celulares e entrar células sem ligação prévia do conjugado para a superfície celular (uma molécula veículo adequada pode por exemplo ser um veículo de amido de hidroxietila). Dessa maneira, tal conjugado não entra nas células sem prévia obrigatoriedade para sua superfície celular; uma vez que um tal conjugado liga-se à superfície da célula, no entanto, que é internalizado na célula e o composto tóxico mata a célula. O conjugado não se liga a células, a não ser que seja recrutado na pre- sença do conjunto inventivo de polipeptídeos de células que expressam simultaneamente ambos os antígenos de A1 e A2 na sua superfície celular. Tais células se ligam e recrutam ambos os polipeptídeos de P1 e P2, e o domínio funcional reconstituída se liga especificamente e recruta a molécula/marcador de afinidade antígeno/veículo, que, por sua vez, resulta na internalização do composto terapêutico. Em consequência, uma morte específica de células que carregam ambos os antígenos de A1 e A2 na sua superfície celular é realizada. Compostos citotóxicos que podem ser utilizados neste contexto incluem, por exemplo auristatin, a ricina, saponina, briodin 1, bouganin, geloni- na, proteína antiviral pokeweed (PAP), antifolates, alcaloides de ligação, antraciclinas, caliqueamicina, ribonuclease, abrina, modecina ou listeriolisina O.

[00416] O composto de diagnóstico acoplado ao antígeno, veículo ou molécula marcador de afinidade pode, por exemplo, ser um composto radioativo, um fluoróforo, ou um composto capaz de mediar a bioluminescência.

[00417] Os compostos radioativos adequados são por exemplo compostos que compreendem o 99mTc, 111In, 82Rb e 201Tl. Esses compostos são detectados por meio dos procedimentos de imagens médicas conhecidas na clínica.

[00418] Alternativamente, um composto fluorescente pode ser utilizado como composto de diagnóstico, tais como a GFP (proteína fluorescente verde) ou uma variante de GFP (por exemplo, BFP (proteína fluorescente azul), CFP (proteína fluorescente ciano), ou YFP (proteína fluorescente verde)), ou um composto de pequena molécula fluorescente como FITC (isotiocianato de fluoresceína) ou PE (ficoeritrina), corantes alexa fluor (como AlexaFluor488 e corantes relacionados vendidos pela Molecular Probes, por exemplo) ou corantes cianina (como Cy3 (indocarbocianina) ou Cy5 (Indodicarbocianina) ou coran- tes relacionados).

[00419] Alternativamente, um composto capaz de mediar a biolumi- nescência pode ser utilizado como composto de diagnóstico, tais como a luciferase, por exemplo Gaussia luciferase (Chopra A. Gaussia prin- ceps luciferase Em: Imagem Molecular e contraste de banco de dados de agente (MICAD) [banco de dados on-line] Bethesda (. MD): National Library of Medicine (EUA), NCBI; 2004-2012 Disponível em: http: //micad.nih.gov). O emprego de Gaussia luciferase de imagem in vivo está bem estabelecido (vide, por exemplo, Santos EB et al. Imagem Sensitiva in vivo de células T através de uma membrana ligada à Gau- ssia princeps luciferase Nat Med 2009 Mar; 15 (3): 338. 44 Epub 2009 Fev 15; ou Inoue Y et al. Gaussia luciferase para monitoramento do tumor bioluminescência em comparação com a luciferase de vaga- lume Mol Imagem 01 de outubro de 2011; 10 (5) : 377-85 doi: 10.2310/7290.2010.00057. Epub 2011 Abr 26; vide também abaixo para obter detalhes adicionais).

[00420] Além disso, os fragmentos F1 e F2 (ou seja, os fragmentos VL e VH de anti-CD3 Fv na modalidade exemplificativa acima descrita) podem ser substituídos por meio dos fragmentos VL e VH de um anticorpo que é específico para um composto terapêutico ou de diagnóstico (por exemplo, neste caso o domínio funcional F é capaz de se ligar a de maneira direta ao composto terapêutico ou de diagnóstico). Na presente invenção, os mesmos compostos terapêuticos e de diagnóstico, como descrito acima no contexto da abordagem de "pré- direcionamento" podem ser considerados.

[00421] Além disso, os fragmentos F1 e F2 (ou seja, os fragmentos VL e VH de anti-CD3 Fv na modalidade exemplificativa acima descrita) podem ser substituídos por meio dos fragmentos de um composto fluorescente ou bioluminescentes, que são biologicamente inativos em si mesmos, mas recuperam a sua função (ou seja, a sua capacidade pa ra mediar a fluorescência ou bioluminescência) mediante associação dos dois fragmentos e complementação funcional, permitindo assim a identificação específica de células que carregam ambos os antígenos de A1 e A2.

[00422] Um número de moléculas fluorescentes que podem ser utilizados neste contexto são bem conhecidos e caracterizados na técnica, incluindo, mas não se limitando a, GFP (proteína fluorescente verde), derivados de GFP (como YFP (proteína fluorescente verde) e PCP (proteína fluorescente ciano), Venus (Nagai T et al, A variante da proteína fluorescente amarela com maturação rápida e eficiente para aplicações de células biológicas Nat Biotechnol 2002 Jan; 20 (1) : 8790), ou Cerulean (PCP aprimorada com S72A, e substituições Y145A H148D)). Para estas moléculas, os fragmentos divididos são descritos que se auto-montam na situação de proximidade em um processo chamado de complementação bimolecular de fluorescência (BiFC).

[00423] Por exemplo, a GFP, PCP, Venus, com uma substituição M153T, ou Cerúlea pode ser dividido depois do aminoácido 155 (isto é, por exemplo, o fragmento F1 pode compreender os aminoácidos 1 a 155 da GFP, enquanto que o fragmento F2 pode compreender os ami- noácidos 156 a245 da GFP, ou vice-versa). Alternativamente, YFP ou Vênus pode ser dividido após o aminoácido 173. Maiores detalhes sobre a divisão GFP e as variantes de divisão GFP podem ser encontrados em Kerppola TK, visualização de interações moleculares por meio de análise de fluorescência complementação bimolecular:. Características de proteína de complementação do fragmento. Chem Soc Rev. 2009; 38: 2876-86.

[00424] Um exemplo de uma molécula que medeia a biolumines- cência e que pode ser utilizada neste contexto é a luciferase de divisão. Particularmente adequada é a luciferase de Gaussia princeps, que não requer cofatores que sejam ativos e catalisam a oxidação do substrato luciferina celenterado (coelenterazina) em uma reação que emite luz azul, ou derivados de Gaussia luciferase (Remy e Michnick I S, Um ensaio de interação proteína-proteína altamente sensível com base na luciferase Gaussia. Nature Methods -. 3, 977 a 979 (2006)). Por exemplo, o Fragmento F1 pode compreender um fragmento do terminal N de Gaussia luciferase para Gly-93, enquanto que o fragmento F2 pode compreender um fragmento de Glu-94 para o terminal C de Gaussia luciferase, ou vice-versa (vide Remy I e Michnick S, Nature Methods, 2006 para detalhes). Aplicação do Gaussia do sistema de divisão luciferase in vivo tem sido estabelecida (Luker et al, Ima-gens In vivo do receptor de ligante com complementação de Gaussia luciferase. Nature Medicine 2011, doi: 10.1038/nm.2590), que permite uma adaptação simples às finalidades da presente invenção por meio de uma pessoa que é versada na técnica.

[00425] Imagens intravitais de lesões tumorais é de importância eminente em casos onde as células de carcinoma se infiltram nos tecidos e a eliminação completa de todas as células transformadas é pré- requisito para a cura. Um cirurgião a procura de células de carcinoma disseminadas no local da operação pode utilizar GFP dividido ou derivados de GFP divididos fundidos com porções de direcionamento e um sistema de câmara de fluorescência a laser assistido Multiespec- trais para a detecção de células que expressam de modo aberrante um perfil antígeno-alvo, semelhante ao uso intra-operatório de fluorescência ou bioluminescência que já é explorado em algumas situações clínicas (van Dam GM et al, Imagens de fluorescência intraoperatória específicas do tumor no câncer de ovário por receptor-α folato-alvo: resultados pela primeira vez em seres humanos Nat Med 2011 Set 18; 17 (10) : 1315 a 9; Luker et al, Imagens in vivo de de receptor de ligan- te com complementação Gaussia luciferase. Nature Medicine 2011, doi: 10.1038/nm.2590).

[00426] Para a detecção de luciferase de divisão completa, a aplicação de um substrato para a luciferase, o que pode ser luciferina ou coelenterazina, é obrigatória. Coelenterazina é preferida porque coe- lenterazina emite luz independente de ATP e é bem estabelecida para a imagem in vivo e em aplicações in vivo. Um cirurgião será capaz de visualizar as células de câncer depois de ter marcado o tumor com po- lipeptídeo P1 e P2 e injetado em uma quantidade não-tóxica de coe- lenterazina intravenosamente.

[00427] Em uma outra modalidade exemplar, o princípio da presente invenção é aplicado no contexto de um paciente que sofre de um tumor hematopoiético e que recebeu um transplante de células hema- topoiéticas saudáveis de outra pessoa (o doador). Napresente invenção, o conjunto de polipeptídeos de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para a eliminação específica (ou detecção) do restante das células hematopoiéticas malignas do receptor após o transplante de células hematopoiéticas saudáveis do doador.

[00428] Para destruir as células hematopoiéticas malignas em um paciente que sofre de um tumor hematopoiético, o paciente pode ser submetido a quimioterapia e/ou terapia de radiação. Subsequentemente, o paciente recebe um transplante de células hematopoiéticas de um doador saudável.

[00429] Para minimizar o risco de rejeição de transplantes ou doença enxerto versus hospedeiro, a transplantação de tecidos/células (por exemplo, medula óssea) de um doador que tem o mesmo conjunto de moléculas MHC (complexo principal de histocompatibilidade) é geralmente preferido. No entanto, muitas vezes nenhum doador com o mesmo conjunto de moléculas de MHC ("doador HLA idêntico") pode ser identificado. Portanto, o transplante de enxertos com um ou dois desencontros no conjunto de variantes do MHC, cordão umbilical não aparentado com até três desencontros, ou transplantes haploidênticos são cada vez mais utilizados. Por consequência, é comum que exista pelo menos uma diferença distinta entre o conjunto de moléculas de MHC expressas pelas células do receptor e as células do doador.

[00430] No transplante de acordo com esta modalidade exemplar da presente invenção, as células dadoras são utilizadas, de forma que sejam diferentes das células recipientes com respeito a pelo menos uma das suas variantes de HLA. Isto significa que há pelo menos um "antígeno de distinção", que está presente na superfície celular das células receptoras, mas não na superfície celular das células do doador. Por exemplo, o antígeno de distinção pode ser HLA-A2, se o paciente (ou seja, o receptor) é HLA-A2 positivo, enquanto que o doador é HLA-A2 negativo.

[00431] Apesar de quimioterapia/radioterapia, as células hemato- poiéticas malignas individuais do destinatário podem ter escapado de erradicação. Uma vez que as sobreviventes células hematopoiéticas malignas são células receptoras, eles carregam o antígeno distintivo que diferencia as células receptoras de células do doador. Ao mesmo tempo, eles são células de origem da linhagem hematopoiética e, portanto, têm marcadores desta linhagem de células, tais como CD45, na sua superfície celular. Blastos de leucemia e outras células hemato- poiéticas do paciente são as únicas células que exibem simultaneamente o antígeno distintivo (aqui HLA-A2) e os marcadores de linhagem de células hematopoiéticas (aqui CD45). O conjunto de polipeptí- deos de acordo com a presente invenção explora este fato para eliminar especificamente as células.

[00432] Para este fim, a primeira porção-alvo T1 do primeiro poli- peptídeo P1 pode ser um scFv específico para o antígeno próprio que está presente apenas em células do receptor (aqui HLA-A2). Como fragmento F1 do domínio funcional F, a região variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo específico CD3ε-pode ser escolhido. A segunda porção-alvo T2 do segundo polipeptídeo P2 pode ser um único fragmento variável de cadeia (scFv) específico para CD45. Como fragmento F2 do domínio funcional F, a região variável da cadeia pesada (VH) do referido anticorpo específico CD3ε-pode ser escolhida. (Naturalmente, é igualmente possível utilizar a região variável da cadeia pesada (VH) de um anticorpo específico CD3ε-F1 como o fragmento e a região variável da cadeia leve (VL) do referido anticorpo CD3ε específica de um fragmento F2. Como é evidente para uma pessoa com conhecimentos na técnica, este é um princípio geral, e é geralmente possível para mudar os fragmentos utilizados para a Fragmento F1 e Fragmento F2.) Nem VL do anticorpo específico CD3ε-capaz se envolve no CD3ε na ausência de VH, nem VH do anticorpo específico CD3ε é capaz de envolver CD3ε na ausência de VL. Por conseguinte, nem P1 nem P2 é por si só capaz de se ligar a CD3ε.

[00433] No entanto, se tanto o antígeno distintivo (por exemplo, HLA-A2) quanto o antígeno CD45 estão presentes em uma única célula, a ligação aos seus respectivos antígenos traz os dois polipeptídeos P1 e P2 em estreita proximidade. Consequentemente, os domínios VH e VL desemparelhados, resultamem heterodimerização do polipeptí- deos P1 e P2 e na formação de um fragmento de anticorpo funcional variável Fv dos domínios VH e VL que é capaz de se ligar a CD3ε (vide a figura 2).

[00434] Como resultado, as células T são ativadas e recrutadas através CD3ε, e a célula que transporta tanto HLA-A2 quanto CD45 na sua superfície celular é especificamente eliminada por uma resposta de células T citotóxicas.

[00435] Uma pessoa que é versada na técnica entende que, dentro do princípio da presente invenção, diversas variações a esta modalidade exemplificativa são possíveis.

[00436] Por exemplo, no polipeptídeo P2 o fragmento scFv que reconhece o marcador de células hematopoiéticas de linhagem CD45 pode ser substituído por meio de um fragmento scFv que reconhece um marcador de células de linhagem diferente ou tipo de célula, isto é, a porção-alvo T2 pode ser um domínio que se liga especificamente a um antígeno que é específico para uma linhagem de células que não a linhagem de células hematopoiéticas ou para um determinado tipo celular (para uma lista detalhada de vários marcadores de linhagem de células e de marcadores do tipo de células que podem ser utilizadas neste contexto, vide David J. Dabbs, imuno-diagnóstico, Churchill Li-vingstone, 3a edição (2010), ou F e J Lin Prichard, Manual Prático de imunohistoquímica: Perguntas Frequentes, Springer, Nova York, ia edição (2011)). Para adaptar o conjunto de polipeptídeos de um marcador da linhagem de células/marcador do tipo de célula alternativo, é suficiente substituir a porção-alvo do polipeptídeo T2 P2 com uma porção-alvo que tem especificidade de ligação para a um marcador da linhagem de células/marcador do tipo de célula alternativo desejado.

[00437] Por exemplo, na situação de carcinoma de células renais metastático (RCC), uma pessoa que é versada na técnica pode consultar as bases de dados acima mencionadas para informações sobre as proteínas da superfície das células com a expressão restrita a células de rim. Entre muitas outras moléculas, ele vai saber que a expressão de certos membros da família aquaporina está confinada a células renais e eritrócitas. Tendo obtido esta informação, uma pessoa que é versada na técnica vai constructo um polipeptídeo P2 reconhecendo que um membro da família aquaporina está confinado a células de rim de eritrócitos e fundidos com a região variável da cadeia pesada (VH) de um anticorpo específico de CD3ε. No caso em que o paciente que sofre de carcinoma de células renais é A2 HLA positivo e de um transplante de rim de um doador saudável são HLA A2 negativos, o médico que trata o paciente pode utilizar os dois constructos (anti-aquaporina fundido com anti-CD3 (VH) e anti HLA-A2 fundida com a cadeia leve (VL) do referido anticorpo específico de CD3ε). Neste caso, todas as células que expressam simultaneamente o referido aquaporina e HLA A2 será marcadordo para a lise por meio das células T, que são células de carcinoma de células renais e tecidos metastáticos. As células do rim doado pelo doador saudável são HLA A2 negativas e não serão atacadas. Uma vez que os eritrócitos perdem a expressão de HLA ao longo do processo de ontogenia e, portanto, não possuem moléculas HLA em sua superfície, eles serão poupados, apesar de expressar grandes quantidades de aquoporinas. Mais uma vez, um anticorpo bi- específico não complementar endereçando aquaporina convencional iria mediar a morte de todas as células de rim de doador e receptor, bem como os eritrócitos. Um anticorpo biespecífico de endereçamento de HLA A2 em um paciente positivo HLA A2 provavelmente seria fatal, uma vez que cada célula receptora exceto os eritrócitos expressam HLA A2 e pode ser atacada por meio das células T de redirecionamen- to.

[00438] Outro exemplo é o carcinoma hepatocelular (HCC). Os he- patócitos são em grande parte envolvidos em uma série de processos metabólicos, incluindo o tráfico de lipoproteínas. Para este fim, os he- patócitos expressam os receptores para lipoproteínas de alta densidade (HDL) nas suas superfícies (receptores sequestrantes membros da classe B 1, SCARB1). O tratamento de um paciente com HLA A2 HCC positiva sofrendo HCC o qual expressa SCARB1 na superfície de células tumorais e metástases pode ser realizado por um construto de Po- lipeptídeo P2 que compreende um domínio de Fvcs de endereçamento SCARB1 fundido com a região variável da cadeia pesada (VH) do referido anticorpo específico de CD3ε e um polipeptídeo P1 (anti-HLA A2 scFv fundido com a cadeia leve (VL) do referido anticorpo específico de CD3ε) e transplante de células de fígado saudável de um doador HLA A2 negativo. Neste caso, todos os hepatócitos e as células malignas derivadas de hepatócitos que expressam ambos, SCARB1 e HLA A2 serão marcados para a lise por meio dos linfócitos T. Os hepatóci- tos de doador sem HLA A2 será poupado, bem como as células negativas SCARB1 normais de doadores que expressam HLA A2. Uma vez que a expressão SCARB1, também é relatada para células participam na síntese de esteroides nas glândulas supra-renais, as células mais prováveis serão também destruídas por meio das células T redirecionadas, resultando em doença de Addison.

[00439] Diversos marcadores que são específicos para determinados tipos de células ou linhagens celulares ou alguns tipos de célu- las/linhagens são conhecidos (para uma lista de exemplos, vide acima). Mais informação sobre os marcadores de linhagem, antígenos de diferenciação e marcadores de tecidos, bem como a sua distribuição nos tecidos são facilmente acessíveis a partir de fontes publicadas (vide, por exemplo, David J. Dabbs, Imuno-histoquímica de diagnóstico, Churchill Livingstone, 3a edição (2010), ou F e J Lin Prichard, Manual de imunohistoquímica prática: Perguntas Frequentes, Springer, Nova York, 1a edição (2011)) e bases de dados públicas (como o Gene Expression Atlas of European Bioinformatics Institute (EBI), http: //www.ebi.ac. uk/GXA/, ou a expressão gênica Omnibus (GEO) da plataforma, vide acima). Além disso, esses marcadores podem ser identificados e/ou verificados de uma maneira simples por meio de uma pessoa que é versada na técnica utilizando os métodos semelhantes aos descritos acima para a identificação de combinações específicas de antígenos tumorais.

[00440] Em certas modalidades preferidas, um antígeno com menos do que a especificidade perfeita para um determinado tipo celular ou linhagem de células é utilizado (isto é, um antígeno é utilizado, que está presente em mais de uma, mas de preferência apenas alguns, os tipos de células ou linhagens de células). Em algumas modalidades, um antígeno é utilizado, que se expressa por meio da referida linhagem do tipo de célula/célula, a uma taxa mais elevada, ou a uma proporção maior do que o valor ou por outras linhagens do tipo de célu- las/células, no sentido de que pode haver uma expressão pequena mas detectável do referido antígeno também em outros tipos de célu- las/linhagens de células.

[00441] O conceito pode ser adaptado a qualquer outra haplótipo HLA além de HLA-A2 utilizado na modalidade exemplar acima, enquanto as células receptoras são positivas para este antígeno HLA e as células do doador são negativas para o mesmo. Os antígenos HLA possíveis incluem, entre outros, HLA A1, HLA A2, HLA A3, HLA A25, HLA B7, HLA B8, HLA B35, HLA B44 e HLA Cw3, HLA Cw4, HLA Cw6, HLA Cw7. Para adaptar o conjunto de polipeptídeos a um antí- geno HLA alternativo, é suficiente substituir a porção-alvo do polipeptí- deo T1 P1 com uma porção-alvo que tem especificidade de ligação para o antígeno HLA alternativa desejada. Por uma escolha apropriada da porção-alvo T1, é claro que é também possível eliminar especificamente as células do doador.

[00442] Além disso, em vez de um domínio VL e um domínio VH, que, depois da montagem forma um domínio capaz de se ligar a CD3ε (isto é fragmento F1 e fragmento F2 de polipeptídeos de P1 e P2, respectivamente), o domínio VL e VH de domínio pode ser substituído com domínios/fragmentos de que durante a montagem conferem uma função diferente para o dímero resultante. A este respeito, todas as variações acima descritas para a modalidade exemplar, relativas à eliminação e/ou detecção de células tumorais identificadas por meio de uma combinação específica de dois antígenos de superfície celular são igualmente aplicáveis. Por exemplo, quando a montagem do do- mínio funcional complementado pode mediar a ligação/ativação de outras células efetoras do que as células T, a mesma pode ser adaptada a um "pré-direcionamento" da abordagem, pode-se ligar a um composto terapêutico ou de diagnóstico, ou pode formar uma molécula fluo- rescente/molécula capaz de mediar a bioluminescência.

[00443] As diversas opções para a escolha dos fragmentos F1 e F2 e para a escolha de uma das porções de direcionamento T1 ou T2 acima descritas na modalidade exemplar, diz respeito à aplicação do princípio da presente invenção para a eliminação específica de células tumorais que podem, evidentemente, ser consideradas.

[00444] A partir das modalidades e variações exemplares descritas, será claro para uma pessoa com conhecimentos na técnica que o princípio da presente invenção descrito acima, não só pode ser utilizado para a identificação e/ou eliminação altamente específica das células tumorais ou das células receptoras restantes malignas após uma célula transplante, mas também para a identificação e/ou eliminação de qualquer outro tipo de célula possuindo uma combinação específica de dois antígenos que a distingue de outros tipos de células.

[00445] No que se segue, é feita referência às figuras:

[00446] A Figura 1 mostra o princípio da presente invenção. Figura 1A: Antígenos e design de polipeptídeos P1 e P2. Figura 1B: Se uma célula expressa ambos os antígenos 1 e 2 na sua superfície celular, a ligação simultânea do polipeptídeo P1 e Polipeptídeo P2 para a superfície da célula leva P1 e P2, em estreita proximidade, a provocar a associação de fragmentos F1 e F2 e restaurar a função biológica do domínio F por meio da complementação. Nenhuma restauração da função biológica ocorre apenas se o antígeno A1 (Figura 1C) ou antígeno A2 (Figura 1D) estiver presente na superfície da célula.

[00447] A Figura 2 mostra uma modalidade exemplar da presente invenção, em uma configuração de transplante alogênico de neoplasi as hematopoiéticas com antígenos HLA não coincidentes. Nesta situação, a dupla informação de destinatário haplótipo HLA (HLApaciente) e origem da linhagem hematopoiética (CD45) é apresentada exclusivamente em blastos de leucemia e outras células hematopoiéticas do paciente. O primeiro polipeptídeo P1 compreende um constructo do fragmento de anticorpo de cadeia única direcionado contra a variável de HLA do paciente (porção-alvo T1) fundido com o fragmento VL de anti-CD3 (Fragmento F1). O segundo polipeptídeo P2 compreende um fragmento variável de cadeia única específica para constructo o marcador de linhagem hematopoiético CD45 (porção-alvo T2), fundido com o fragmento dividido de VH de anti-CD3 Fv (fragmento F2).

[00448] CD45: antígeno específico para células hematopoiéticas. HLApaciente: antígeno específico de HLA para as células do paciente, isto é, uma variante alélica do MHC humano que está presente na superfície das células do paciente (= células do receptor do transplante de células), mas ausente na superfície das células do doador. αCD45 scFv: scFv com especificidade de ligação para CD45. αHLApaciente scFv: scFV com especificidade de ligação para HLApaciente. CD3 (VH): região variável de uma cadeia pesada de imunoglobulina de um anticorpo com especificidade de ligação para CD3. CD3 (VL): região variável de uma cadeia leve de imunoglobulina de um anticorpo com especificidade de ligação para CD3.

[00449] Após a ligação dos dois constructos através da sua αCD45 scFv e αHLApaciente scFv, respectivamente, para uma célula que transporta tanto o CD45 quanto o antígeno HLApaciente, montagem de CD3 (VH) com CD3 (VL) leva a complementação funcional do anticorpo com a especificidade de ligação para CD3, permitindo, dessa maneira, o recrutamento e ativação de células T através das moléculas CD3 em sua superfície celular específica.

[00450] A Figura 3 mostra os constructos utilizados nas experiên- cias descritas nas figuras 4 a 9. (O constructo 85 difere do construto 71 pelo fato de que o constructo 85 tem um marcador Flag enquanto o constructo 71 tem um marcador myc. constructo 75 difere do construto 82 pelo fato de que o constructo de 75 tem um marcador Flag enquanto que o constructo 82 tem um marcador myc.) VHCD3: região variável da cadeia pesada de um anticorpo anti-CD3; VLCD3: região variável da cadeia leve de um anticorpo anti-CD3; VHA2: região variável da cadeia pesada de um anticorpo anti-HLA-A2; VLA2: região variável da cadeia leve de um anticorpo anti-HLA-A2; VL45: região variável da cadeia pesada de um anticorpo anti-CD45; VH45: região variável da cadeia leve de um anticorpo anti-CD45; L18, L7, L15, L6, L19: ligante de aminoácidos 18, 7, 15, 6, 19, respectivamente.

[00451] A Figura 4 mostra os constructos scFv de cadeia única bi- específicos em tandem convencionais utilizados para controlar o sistema de ensaio. Resumidamente, os constructos de anticorpo biespe- cífico com especificidade para CD3 e HLA A2 foram titulados como indicado para uma co-cultura de U266, umalinhagem de células HLA A2 positiva, CD45 positiv dea mieloma, e Células T HLA A2 negativas (monócitos empobrecidos de células mononucleares do sangue periférico), e a produção de interleucina-2 por meio das células T foi determinada. A capacidade de estimulação das células T substancial foi detectada para os dois constructos FvCD3-HLA-A2 85 e 71, que diferem em seus respectivos marcadores Flag ou Myc (Para estrutura de domínio de constructos vide a Figura 3.). Os constructos Fv em tandem biespecíficos HLA-A2-CD3 foram menos eficientes e os constructos de cadeia única de endereçamento ou de HLA-A2 quanto CD3 não estimularam as células T de todo. O controle positivo é conduzido utilizando inespecífica estimulação de PHA-L (fito-hemaglutinina).

[00452] A Figura 5 mostra a capacidade estimuladora de células T e altamente e exclusivmente específica se um par complementar de constructos de acordo com a presente invenção é utilizado, mas não se apenas um dos dois constructos de um par é utilizado individualmente. Resumidamente, VLCD3-scFvHLA-A2 (constructo 42), VHCD3- scFvCD45 (VL-VH) (constructo 45) e VHCD3-scFvCD45 (VH-VL) (constructo 55) foram titulados separadamente ou em combinações de constructos 42 e 45, ou 42 e 55 para co-culturas de células U266 e T, como descrito. Capacidade estimuladora de células T de alta foi demonstrada para as combinações de 42/45 ou 42/55 com atividade em minuto, se apenas uma destes constructos foi dado separadamente. Estes resultados mostram que os domínios VL e VH de FvCD3 têm de cooperar a fim de reconstituir ou complementar a função das células T envolvente. Mais importante, a porção-alvo scFvCD45 poderia ser comutada a partir de (VL-VH) com a configuração (VH-VL), indicando claramente que o carácter modular dos construtos permite a substituição de uma porção-alvo por outra porção-alvo com especificidade desejada. O sistema de ensaio foi controlado através da utilização de constructos de cadeia única de CD45 (VL-VH), e CD45 (VH-VL), que não estimulam as células T para produzir IL-2.

[00453] A Figura 6 mostra uma primeira de três experiências de bloqueio competitivos. O conjunto biespecífico do constructo FvCD3- HLA-A2 (constructo 71) foi dado a co-culturas de células U266 e T, como descrito e a função de estimulação foi determinado por meio induziu a produção de IL-2 pelos linfócitos T,. A função das células T estimulatória foi bloqueada por meio dos constructos de cadeia única, que ocupam o epitopo-alvo da molécula HLA A2 (constructo 4, a concentração * 100). A estimulação intrínseca das células T pelos cons- tructos de cadeia única específicos HLA A2 ou CD3 (constructo 4 (concentração * 100) ou constructo 36 (concentração * 9)) foi descartada. PHA-L foi utilizado como controle positivo.

[00454] A Figura 7 mostra que "constructos tridomínio" (isto é, os constructos de acordo com a presente invenção) tem primeiro de se ligar à superfície de uma única célula de dimerização e complementam as funções de encaixe de células T do epítopo competitiva as experiências de bloqueio. Resumidamente, os constructos 42 e 45 foram dados a co-culturas de células U266 e linfócitos HLA-A2 T negativas e capacidade estimuladora foi determinada por meio da produção de IL- 2 de células T. Em situações experimentais onde os epítopos de HLA A2 ou moléculas CD45 foram bloqueadas competitivamente por meio dos constructos de 4 ou 46 (ambas as concentrações * 100), a função de estimulação das células T foi revogada. Estes resultados indicam claramente que os dois respectivos "constructos tridomínio" tem de se ligar ao mesmo tempo sobre a superfície de uma célula, a fim de restaurar ou para complementar a função das células T envolvernte. A atividade estimulante intrínseca de qualquer constructo (42, 45, 4, 46 e 36) foi descartada utilizando as diferentes concentrações.

[00455] A Figura 8 mostra a experiência análoga à Figura 7, para a combinação de constructos de 42 e 55. Mais uma vez, a capacidade de células T estimuladoras da combinação dos dois "constructos tri- domínio " foi abolida por meio do bloqueio competitivo dos epitopos antigênicos na HLA A2 ou da molécula CD45. Mais importante, estes resultados mostram de novo que o módulo de segmentação pode ser facilmente substituído por um outro módulo, com especificidade adequada. Mais importante, a configuração VL-VH-VL de constructo 42 e a configuração VH-VH-VL de constructo 55 impedem homo-ou hetero- dimerização ou a auto-montagem dos constructos sem prévia de liga-ção para um substrato que expressa ambos, HLA A2 e antígenos CD45.

[00456] A Figura 9 mostra a lise de células U266 por Células T HLA A2 negativas em uma amostra que compreendem os constructos (VH- VL) ("ambos os constructos") VLCD3-scFvHLA-A2 e VHCD3- scFvCD45. Nenhuma lise significativa foi observada em amostras de controle que compreende apenas um dos dois constructos.

[00457] A Figura 10 mostra a restauração no alvo dos polipeptí- deos. A ligação de dois polipeptídeos separadas (P1 e P2) aos seus respectivos antígenos em uma célula-alvo, consistindo cada uma em um fragmento de anticorpo de cadeia única variável específica (scFv VH-VL) fundido com a luz variável (VL) ou o domínio de cadeia pesada variável (VH) de um anticorpo específico para CD3 (fragmento F1 e F2), permite heterodimerização VH/VL e a formação de um local de ligação de CD3 funcional para exercer as células T.

[00458] A Figura 11 mostra que o CD3 de dimerização VH/VL envolve células T e é dual-antígeno restrito. U266 do mieloma múltiplo, leucemia das células T primárias pró-linfocítica (T-PLL), e células THP- 1 de leucemia mieloide aguda, todos os HLA-A2-positivas e CD45- positivas, foram sondados com doadores de células mononucleares de sangue periférico HLA-A2-negativos (PBMC) e os polipeptídeos, tal como indicado. Envolvimento de células T foi avaliado pela interleuci- na-2 (IL-2) produção reativo (A) e a lise das células-alvo (B). O conjunto biespecífico scFv (CD3 (VH-VL) -. HLA-A2 (VH-VL) do anticorpo foi utilizado como um controle positivo (C), se a ligação dos polipeptídeos em células THP-1 é bloqueado por um excesso competitivo de scFvCD45 (esquerda) e à direita) inibidores ((bloqueando os epítopos de antígenos individuais na célula-alvo), como indicado, e produção IL2 reativa por doador PBMC foi investigada. (D), o antígeno linhagens de células negativas individuais ou duplos RAJI e KMS scFvHLA-A2 - 12-BM foram sondados com os polipeptídeos. PHA-L foi utilizado como um controle de estímulo não específico de PBMC.

[00459] A Figura 12 mostra a terapia direcionada por meio da com- plementação CD3VH/VL condicional in vivo. (A), a sobrevivência de camundongos (n = 6 por grupo) após injeção intraperitoneal de 5 x 106 células THP-1 de leucemia aguda em conjunto com 1,25 x 105, as células HLA-A2-negativos T do doador específicos do CMV e os polipep- tídeos (0,5 ug) como indicado (células tumorais: proporção de células T = 40/1). (B), a ativação de caspase 3 foi avaliada in vitro por citome- tria de fluxo em células HLA-A2/CD45 duplo positivos espectadoras THP-1 e CD45-positivas, mas de HLA-A2-negativos após co-cultura com as células T do doador e os polipeptídeos (3 nM) como indicado. O conjunto biespecífico scFv (CD3 (VH-VL) - HLA-A2 (VH-VL)) do anticorpo foi utilizado como um controle positivo.

[00460] A Figura 13 mostra que os polipeptídeos direcionados por EGFR e EpCAM envolvem as células T para a destruição de células de carcinoma. A linhagem de células de câncer do cólon humano EGFR e EpCAM positiva dupla COLO-206F e a linhagem de células de melanoma de FM-55 (EGFR-positivo mas EpCAM-negativo) foram sondadas com PBMC na presença de polipeptídeos específicos para o EGFR (CD3 (VH)-EGFR (VH-VL)) e EpCAM (CD3 (VL)-EpCAM (VH- VL)), tal como indicado. Envolvimento de células T foi avaliado por reativo interferon-Y produção (IFN-y) (A) e a ativação de caspase-3 em células-alvo (B).

[00461] A Figura 14 mostra que os polipeptídeos direcionados por HLA-A2 e CEA redirecionam as células T para a destruição das células do tumor. A linhagem de célula de câncer do cólon humano COLO- 206F, linhagem de células de melanoma de FM-55 e a linhagem de células de câncer do ovário OVCAR foram sondadas com PBMC na presença de polipeptídeos específicos para HLA-A2 (CD3 (VL)-HLA- A2 (VH-VL)) e CEA (CD3 (VH)-CEA (VH-VL)), tal como indicado. O envolvimento de células T foi avaliado através da produção de IFN-y reativo. As amostras foram ensaiadas e analisadas como duplicados.

[00462] A Figura 15 mostra que os polipeptídeos direcionados HLA- A2 e EGFR redirecionam as células T para a destruição das células do tumor. As linhagens de células humanas de COLO-206F, OVCAR e FM-55 foram sondadas com PBMC na presença de polipeptídeos específicos para HLA-A2 (CD3 (VL)-HLA-A2 (VH-VL)) e EGFR (CD3 (VH)-EGFR (VH-VL)), tal como indicado. O envolvimento de células T foi avaliado através da produção de IFN-y reativo. As amostras foram ensaiadas e analisadas como duplicados.

[00463] A Figura 16 mostra que os polipeptídeos direcionados HLA- A2 e EGFR redirecionam as células T para a destruição das células do tumor. As linhagens de células humanas de COLO-206F, FM-55 e OVCAR foram sondadas com PBMC na presença de polipeptídeos específicos para HLA-A2 (CD3 (VL)-HLA-A2 (VH-VL)) e Her2 (CD3 (VH)-Her2 (VH-VL)), tal como indicado. O envolvimento de células T foi avaliada através da produção de IFN-y reativo. As amostras foram ensaiadas e analisadas como duplicados.

[00464] A Figura 17 mostra que os polipeptídeos direcionados HLA- A2 e EGFR redirecionam as células T para a destruição das células do tumor. Nesta experiência, os fragmentos antiCD3 fendidos (CD3 (VH) e CD3 (VL)) para o anti-CD45 e porções anti-HLA-A2-alvo foram trocados, comparados com os polipeptídeos CD45 e HLA-A2 utilizados na figura 5,7-9, 11,12, 14-16. A linhagem de células de mieloma humano U266 foi sondada com PBMC na presença de polipeptídeos específicos para CD45 (CD3 (VL)-CD45 (VH-VL)) e HLA-A2 (CD3 (VH)- HLA-A2 (VH-VL)) como indicado. O envolvimento de células T foi avaliado através da produção de IFN-y reativo. As amostras foram ensaiadas e analisadas como duplicados.

[00465] A Figura 18 mostra que os polipeptídeos direcionados EGFR e EpCAM redirecionam as células T para a destruição das células tumorais. As linhagens de célula de câncer de cólon humano CO- LO-206F e CX-1 e a linhagem de célula de câncer do ovário OVCAR foram sondadas com PBMC na presença de polipeptídeos específicos para EpCAM (CD3 (VL)-EpCAM (VH-VL)) e EGFR (CD3 (VH) -EGFR (VH-VL)), tal como indicado. O envolvimento de células T foi avaliado através da produção de IFN-y reativo. As amostras foram ensaiadas e analisadas como duplicados.

[00466] A Figura 19 mostra que os polipeptídeos direcionados Her2 e EpCAM redirecionam as células T para a destruição das células do tumor. A linhagem de célula de câncer do ovário humano OVCAR foi sondada com PBMC na presença de polipeptídeos específicos para EpCAM (CD3 (VL)-EpCAM (VH-VL)) e Her2 (CD3 (VH)-Her2 (VH-VL)), tal como indicado. O envolvimento de células T foi avaliado através da produção de IFN-y reativo. As amostras foram ensaiadas e analisadas como duplicados.

[00467] A Figura 20 mostra que os polipeptídeos direcionados CD45 e CD138 redirecionam as células T para a destruição das células do tumor. A linhagem de células de mieloma humano AMO-1 foi sondada com PBMC na presença de polipeptídeos específicos para CD45 (CD3 (VL)-CD45 (VH-VL) do painel superior, CD3 (VH)-CD45 (VH-VL) do painel inferior) e CD138 (CD3 (VH), CD138 (VH-VL) painel superior, CD3 (VL), CD138 (VH-VL) painel inferior), como indicado. O envolvimento de células T foi avaliado através da produção de IFN-y reativo. As amostras foram ensaiadas e analisadas como duplicados.

[00468] A Figura 21 mostra que o direcionamento de um único antí- geno (CD138) com polipeptídeos direcionados CD138 redireciona as células T para a destruição das células tumorais. A linhagem de células de mieloma humano AMO-1 foi sondada com PBMC na presença de polipeptídeos específicos para CD138 (CD3 (VL)-CD138 (VH-VL) e (CD3 (VH)-CD138 (VH-VL)), tal como indicado. O envolvimento de células T foi avaliado pela produção de IFN-y reativo. As amostras foram ensaiadas e analisadas como duplicados.

[00469] A Figura 22 mostra que o direcionamento a um único antí- geno (CD45) com polipeptídeos direcionados CD45 redirecionam as células T para a destruição das células tumorais. As linhagens de células de mieloma humanas AMO-1 e U266 foram sondadas com PBMC na presença de polipeptídeos específicos para CD45 (CD3 (VL)-CD45 (VH-VL) e (CD3 (VH)-CD45 (VH-VL)), tal como indicado. O envolvimento de células T foi avaliado através da produção de IFN-y reativo. As amostras foram ensaiadas e analisadas como duplicados.

[00470] A Figura 23 mostra a restauração no alvo de dois polipeptí- deos direcionados contra um único antígeno na superfície da célula- alvo, dois epitopos diferentes (parte superior) ou o mesmo epitopo (parte inferior) do antígeno. A ligação de dois polipeptídeos separados (P1 e P2) para o seu respectivo epítopo, sobre o mesmo antígeno, em uma célula-alvo. Para direcionamento para dois epitopos diferentes, a porção-alvo de cada polipeptídeo é composta por meio de um fragmento de anticorpo específico variável de cadeia única (scFv). Para direcionamento ao mesmo epitopo, a porção-alvo de cada polipeptídeo é constituída por meio do mesmo fragmento de anticorpo de cadeia única variável (scFv). As partes de direcionamento são fundidas através de ligantes peptidicos para o domínio de cadeia leve variável (VL) ou o domínio de cadeia pesada variável (VH) de um anticorpo específico para CD3 (fragmento F1 e F2), permite heterodimerização VH/VL e a formação de uma região funcional de ligação de CD3 (domínio funcional) para envolver as células T.

[00471] A Figura 24 mostra a possibilidade de utilizar diferentes formas efetoras para matar uma célula-alvo com um kit de partes de polipeptídeos. Para esse efeito, o módulo anti-CD3 (F1 e F2), é substituído por um módulo anti-HIS (hexa-histidina), que, após a ligação simultânea do polipeptídeo 1 e 2, complementa um local de ligação de hexa-histidina e, portanto, liga histidina marcada com cargas úteis (por exemplo uma toxina HIS marcada). A porção-alvo T1 (VH-VL) de poli- peptídeo P1 se liga especificamente a HLA-A2, a porção-alvo T2 (VH- VL) de polipeptídeo P2 liga-se especificamente ao CD45. O fragmento de polipeptídeo F1 P1 compreende um domínio VH de um anticorpo contra uma hexa-histidina-tag e fragmento F2 do polipeptídeo P2 compreende um domínio VL do mesmo anticorpo. A linhagem de célula de leucemia mieloide humana THP-1 foi sondado com um marcador de histidina (His) Clostridium perfringens do componente toxina iota Ia em 0.01μg/mL em combinação com polipeptídeos indicados. Após 48 horas de cultura a viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio de azul alamar®. Os resultados mostram uma diminuição da viabilidade em relação ao fundo do ensaio de células sondadas com a combinação, mas não com polipeptídeos individuais. O controle de células THP-1 foi cultivado simultaneamente em cultura sem toxina. As amostras foram ensaiadas e analisadas como duplicados.

[00472] A Figura 25 mostra que os polipeptídeos direcionados de HLA-A2 e CD45, que compreendem um anticorpo contra uma separação identificador His, matar células tumorais utilizando um marcador de histidina (His) da toxina Shiga de subunidade A a uma concentração de 0.01μg/mL. A mesma configuração experimental foi utilizada como na figura F24.

[00473] A Figura 26 mostra que os polipeptídeos direcionados de HLA-A2 e CD45, que compreende um anticorpo contra uma separação identificador His, matar células tumorais utilizando uma histidina (His) marcadordas toxina Shiga subunidade A a uma concentração de 0.1μg/mL. A mesma configuração experimental foi utilizada como na figura F24/25.

[00474] A Figura 27 mostra que os polipeptídeos direcionados EGFR e EpCAM, que compreendem um domínio funcional F com F1 e F2 são VH e HL de um anticorpo específico para a digoxigenina (ADIG), as células de tumor, utilizando uma digoxigenina marcado com a molécula de peroxidase de rábano silvestre (HRP). A porção-alvo T1 (VH-VL) de polipeptídeo P1 se liga especificamente a EGFR, a porção- alvo T2 (VH-VL) de polipeptídeo P2 liga-se especificamente a EpCAM. O fragmento F1de polipeptídeo P1 compreende um domínio VH de um anticorpo contra a digoxigenina e fragmento F2 do polipeptídeo P2 compreende um domínio VL do mesmo anticorpo. Linhagem de células de câncer de cólon humano Colo-206F foi sondada pela primeira vez com polipeptídeos indicados seguida por sondagem com digoxi- genina HRP. As amostras foram analisadas utilizando o (Invitrogen™, Kit ELISA) e a absorvância foi lida com um leitor de placas BioRadmicro. Para a análise da amostra em branco cromógeno (sem Digoxi- genina-HRP) foi definido como 0. As amostras foram executadas e analisadas como duplicatas.

[00475] A Figura 28 mostra que os polipeptídeos direcionados CD45 e HLA-Cw6 redirecionam as células T para a destruição das células do paciente. Foram utilizadas células de pacientes primários com conhecidos HLA-haplótipos. A51 = células de um paciente com MDS (síndrome mielodisplásica), homozigóticos para o haplótipo HLA-Cw6. A49 = células de um paciente após o transplante de medula óssea alogênica, heterozigótica para o haplótipo HLA-Cw6. As células de pacientes foram incubadas com PBMC saudáveis durante 30 horas, na presença de polipeptídeos específicos para CD45 (CD3 (VL)-CD45 (VH-VL) e HLA-Cw6 (CD3 (VH)-HLA-CW6 (VH-VL)) como indicado. O envolvimento de células T foi avaliado através da produção de IFN-y reativo. As amostras foram ensaiadas e analisadas como duplicados.

[00476] A Figura 29 mostra que os polipeptídeos direcionados EGFR e EpCAM redirecionam as células T para câncer primário a destruição das células do paciente. As células tumorais A44foram retiradas dos ascite maligna de um paciente do sexo masculino de 48 anos com câncer de pâncreas metastático. As células de tumor de pacien- tes foram incubadas com PBMC dos próprios pacientes (recolhidos por flebotomia) durante 30 horas, na presença de polipeptídeos específicos para EpCAM (CD3 (VL)-EpCAM (VH-VL) e EGFR (CD3 (VH)- EGFR (VH VL)), tal como indicado. O envolvimento de células T foi avaliado através da produção de IFN-y reativo. As amostras foram ensaiadas e analisadas como duplicados.

[00477] A Figura 30 mostra que os polipeptídeos direcionados CD45 e HLA-A2 redirecionam CMV restrito de células T CD8 + em destruição das células do tumor. As células tumorais humanas THP-1 e U266 foram incubadas com CMV restringida das células T de um doador saudável HLA-A2 negativa durante 30 horas, na presença de polipeptídeos específicos para HLA-A2 (CD3 (VL)-HLA-A2 (VH VL) e CD45 (CD3 (VH)-CD45 (VH-VL)), tal como indicado. O scFv de anticorpo biespecífico em tandem (CD3 (VH-VL) x HLA-A2 (VH-VL)) foi utilizado como um controle positivo. O envolvimento de células T foi avaliado através da produção de IFN-y reativo. As amostras foram ensaiadas e analisadas como duplicados.

[00478] A Figura 31 mostra a ideia principal para eliminar o distúrbio auto-imune ou a hipersensibilidade causando clones de células B, com um kit de partes de polipeptídeo, que consiste em um polipeptídeo específico do alérgeno e um polipeptídeo específico do tipo de célula. O primeiro polipeptídeo P1 tem no seu grupo-alvo um alérgeno (por exemplo BeTV-1A, Der-f2, conglutina-7, Can-f1, Feld-d1). O segundo polipeptídeo P2 tem em seu grupo-alvo um fragmento de anticorpo de cadeia única variável específica (scFv, VH-VL) visando uma proteína da superfície celular (por exemplo, CD19, CD138, CD38). Ambas as partes de direcionamento são fundidas com qualquer um do domínio variável de cadeia leve (VL) ou o domínio de cadeia pesada variável (VH) de um anticorpo específico para CD3 (fragmento F1 e F2).

[00479] No que se segue, é feita referência a certos genes (huma- nos) ou as proteínas também referidas no relatório descritivo, os exemplos e as figuras em anexo, bem como (parcialmente) nas reivindicações. Na presente invenção abaixo, os correspondentes (exemplares) números do gene de acesso são fornecidos. Outros números de acesso são também fornecidas no relatório descritivo em outras partes deste documento, bem como nos exemplos em anexo.

[00480] CD45: Gene ID: 5788, atualizado em 13-Jan-2013, 3.Protein = P08575-1 = Isoforma 1, Última vez modificado em Julho 19, 2003. Versão 2

[00481] CD34: Proteína: P28906-1/2 Última vez modificado em Julho 15, 1998. Versão 2.

[00482] CD33: Gene ID: 945, atualizado em 30-Dec-2012: Pro teína: P20138 [UniParc]. Última vez modificado em October 17, 2006. Versão 2. Checksum: 1C73E588240FBAD8

[00483] CD138: Gene ID: 6382, atualizado em 6-Jan-2013, 4.Protein = P18827 [UniParc]. Última vez modificado em Maio 5, 2009. Versão 3.

[00484] CD15: Gene ID: 2526, atualizado em 5-Jan-2013

[00485] CD1a: Gene ID: 909, atualizado em 30-Dec-2012, P06126 [UniParc]. Última vez modificado em February 9, 2010. Versão 4. Checksum: C575C3C538F0AA29

[00486] CD2: Gene ID: 914, atualizado em 5-Jan-2013; P06729 [UniParc]. Última vez modificado em October 23, 2007. Versão 2. Checksum: A03D853C3B618917

[00487] CD3e: Gene ID: 916, atualizado em 5-Jan-2013, P07766 [UniParc]. Última vez modificado em February 1, 1996. Versão 2. Checksum: A1603D01CE9957D7

[00488] CD4: Gene ID: 920, atualizado em 13-Jan-2013; P01730 [UniParc]. Última vez modificado em Novembro 1, 1988. Versão 1. Checksum: 20ED893F9E56D236

[00489] CD5: Gene ID: 921, atualizado em 30-Dec-2012; P06127 [UniParc]. Última vez modificado em Novembro 30, 2010. Versão 2. Checksum: 9131AEC9683EE1D3

[00490] CD8a: Gene ID: 925, atualizado em 30-Dec-2012; Iso forma 1/2 (membrane) P01732-1/2 (mCD8alpha) [UniParc]. Última vez modificado em Julho 21, 1986. Versão 1. Checksum: FCCA29BAA73726BB

[00491] CD20: Gene ID: 931, atualizado em 6-Jan-2013; P11836 [UniParc]. Última vez modificado em October 1, 1989. Versão 1. Checksum: AC5420F8B626BDD1

[00492] CD23: Gene ID: 2208, atualizado em 4-Jan-2013; P06734 [UniParc]. Última vez modificado em Janeiro 1, 1988. Versão 1. Checksum: F86708C0E6515B87

[00493] CD31: Gene ID: 5175, atualizado em 13-Jan-2013; Iso forma Long [UniParc].

[00494] Última vez modificado em April 1, 1990. Versão 1. Checksum: C57BBFA200A407A6, P16284-1/2/3/4/5/6 = Isoforms 1-6

[00495] CD43: Gene ID: 6693, atualizado em 30-Dec-2012; P16150 [UniParc]. Última vez modificado em April 1, 1990. Versão 1. Checksum: C9C9AB8435D5E1FE

[00496] CD56: Gene ID: 4684, atualizado em 30-Dec-2012; Iso forma 1 [UniParc]. Última vez modificado em Julho 22, 2008. Versão 3. Checksum: FD3B9DE80D802554, P13591-2/1/3/4/4/6, Isoforms 1-6

[00497] CD57: Gene ID: 27087, atualizado em 5-Jan-2013

[00498] CD68: Gene ID: 968, atualizado em 6-Jan-2013; Iso forma Long (CD68.1) [UniParc].

[00499] Última vez modificado em Maio 15, 2007. Versão 2. Checksum: 69E68D69EDE8EFB0, P34810-1/2, Isoforma 1/2

[00500] CD79a: Gene ID: 973, atualizado em 5-Jan-2013; Iso forma 1 (Long) [UniParc].

[00501] Última vez modificado em Junho 1, 1994. Versão 2., Checksum: 6E5B837409969292, P11912-1/2, Isoforma 1/2

[00502] CD146: Gene ID: 4162, atualizado em 30-Dec-2012; Isoforma 1 [UniParc]. Última vez modificado em Janeiro 10, 2006. Versão 2. Checksum: E46CB8AC7BA0738E, P43121-1/2, Isoforma 1/2.

Proteínas de tensoativo (A e B):

[00503] Gene ID: 6440, atualizado em 30-Dec-2012 e Gene ID: 6439, atualizado em 30-Dec-2012, P07988 [UniParc]. Última vez modificado em Maio 1, 1992. Versão 3. Checksum: 9FD7F66678A35153, e Isoforma 1 [UniParc]. Última vez modificado em April 1, 1990. Versão 2. Checksum: C26A21E33C60AA78, P11686-1/2, Isoforma 1/2

sinaptofisina:

[00504] Gene ID: 6855, atualizado em 30-Dec-2012, P08247 [UniParc]. Última vez modificado em Agosto 1, 1991. Versão 3. Checksum: 592289C43B12EFA7

Receptores de acetilcolina nicotínica:

[00505] Gene ID: 1138, atualizado em 30-Dec-2012, Gene ID: 1136, atualizado em 6-Jan-2013, Gene ID: 1139, atualizado em 13-Jan-2013, Gene ID: 1137, atualizado em 30-Dec-2012, Gene ID: 1141, atualizado em 5-Jan-2013

MUSK quinase específica do múscilo:

[00506] Gene ID: 4593, atualizado em 8-Jan-2013, Isoforma 1 [UniParc]. Última vez modificado em Janeiro 1, 1998. Versão 1. Che cksum: 3DDC20E179FA010C, O15146-1/2, Isoforma 1/2

Canal de cálcio dependente da voltagem (tipo P/Q):

[00507] Gene ID: 773, atualizado em 5-Jan-2013; Isoforma 1 (1A-1) (BI-1-GGCAG) [UniParc]. Última vez modificado em Julho 15, 1999. Versão 2. Checksum: 2F2F378ACE02FD56, O00555- 1/2/3/4/5/6/7, Isoforms 1-7, Gene ID: 25398, atualizado em 11-Jan- 2013, J3KP41 [UniParc]. Última vez modificado em October 3, 2012. Versão 1. Checksum: AEDF4D2A5E49263F

Canal de potássio dependente da voltagem (VGKC):

[00508] Gene ID: 3737, atualizado em 30-Dec-2012, Gene ID: 3736, atualizado em 8-Jan-2013, Gene ID: 3742, atualizado em 8-Jan-2013

receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA):

[00509] Gene ID: 2904, atualizado em 5-Jan-2013, Q13224 [UniParc]. Última vez modificado em Junho 20, 2001. Versão 3. Checksum: 40AEB12BE6E50CEF; Gene ID: 2902, atualizado em 30-Dec- 2012, Isoforma 3 (Long) (NR1-3) [UniParc]. Última vez modificado em Junho 1, 1994. Versão 1. Checksum: CDF5402769E530AB, Q05586- 1/2/3/4/5, Isoforms 1-5

[00510] TSHR: Gene ID: 7253, atualizado em 4-Jan-2013, Iso forma Long [UniParc]. Última vez modificado em March 29, 2005. Versão 2. Checksum: D2EE9CEBFD64A65F, P16473-1/2/3, Isoforms 1-3

[00511] Amfifisina:

[00512] Gene ID: 273, atualizado em 8-Jan-2013, Isoforma 1 (128 kDa) [UniParc].

[00513] Última vez modificado em February 1, 1996. Versão 1., Checksum: 78B4F75AB75BA357, P49418-1/2, Isoforma 1-2

[00514] gangliosídeo GQ1B: Gene ID: 29906, atualizado em 30- Dec-2012

[00515] GD3: Gene ID: 117189, atualizado em 22-Jun-2012

[00516] Ca-125: Gene ID: 94025, atualizado em 30-Dec-2012, Q8WXI7 [UniParc]. Última vez modificado em March 1, 2003. Versão 2. Checksum: B3E7BDF19997A440

[00517] Her-2/neu: Gene ID: 2064, atualizado em 13-Jan-2013, 4. Protein = P04626-1/2/3/4 = Isoforma 1-4, Última vez modifi cado em Agosto 13, 1987. Versão 1.

[00518] gross cystic disease fluid Proteína 15; Gene ID: 5304, atualizado em 30-Dec-2012

[00519] CD117: Gene ID: 3815, atualizado em 6-Jan-2013

[00520] CD30: Gene ID: 943, atualizado em 6-Jan-2013; Iso forma Long [UniParc]. Última vez modificado em Dezembro 1, 1992. Versão 1. Checksum: 7A407CC78A6E0BC8, P28908-1/2, Isoforma 1/2

Fator de crescimento do Receptor PDGFR alfa derivado de plaquetário:

[00521] Gene ID: 5159, atualizado em 13-Jan-2013, Gene ID: 5156, atualizado em 13-Jan-2013, Isoforma 1 [UniParc]. Última vez modificado em April 1, 1990. Versão 1. Checksum: 5E3FB9940ACD1BE8, P16234-1/2/3, Isoformas 1-3; P09619 [UniParc]. Última vez modificado em Julho 1, 1989. Versão 1. Checksum: 038C15E531D6E89D

Marcador associado àMelanoma \/Mart 1:

[00522] Gene ID: 2315, atualizado em 30-Dec-2012; Q16655 [UniParc]. Última vez modificado em Novembro 1, 1996. Versão 1. Checksum: B755BFF39CFCB16E

[00523] CD133: Gene ID: 8842, atualizado em 13-Jan-2013; Isoforma 1 (AC133-1) (S2) [UniParc].

[00524] Última vez modificado em Junho 1, 1998. Versão 1. Checksum: D21CBC05ADB2DEDF, O43490-1/2/3/4/5/6/7, Isoforms 1-7

[00525] No que se segue, é feita referência aos exemplos que são dados para ilustrar, não para limitar a presente invenção.

Exemplos Exemplo 1 Clonagem dos constructos de anticorpos recombinantes

[00526] As sequências de DNA derivadas a partir de células de hi- bridoma e que codificam para os domínios variáveis dos anti-CD3, anti-CD45 e anticorpos anti-HLA A2, respectivamente, foram utilizadas para gerar os constructos de anticorpo descritos na Figura 3 por meio de métodos convencionais de biologia molecular (vide, por exemplo,. Sambrook et al, Clonagem Molecular: Um Manual de laboratório, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nova Iorque (2001)). Os constructos foram projetados para transportar diferentes marcas de afinidade para facilitar a identificação e purificação sobre a expressão de proteínas recombinantes (Myc-, bandeira, His-Tag). Para mais detalhes sobre arranjo de domínio, os marcadores de afinidade e os ligantes dos constructos, vide aFigura 3.

[00527] pelB Líder codifica para uma sequência de aminoácidos que dirige uma proteína expressa em bactérias para o periplasma bac- teriano. A sequência de comando é clivada por meio das enzimas bac- terianas e a proteína pode ser isolada.

Exemplo 2 Expressão e purificação de anticorpos recombinantes

[00528] Expressão de Proteína Periplasmática:

[00529] Os construtos de anticorpos recombinantes foram expressos no periplasma de E. coli, cepa TG1 utilizando um vetor de expressão procariótico adequado. Dois litros de meio 2 x TY, incluindo 0,1% de glucose e 100 ug/mL de ampicilina foi inoculado com 20 mL de uma cultura durante a noite de TG1 transformado e cresceu até à fase exponencial (DO600 0,8-0,9) a 37°C. Uma vez que os fragmentos de anticorpos estão sob o controle do promotor de lactose, a expressão da proteína foi induzida por meio da adição de IPTG a 1 mM, seguido por incubação à temperatura ambiente (temperatura ambiente) com agitação durante mais 3 horas. As células foram colhidas por meio da centrifugação durante 10 min a 2.750 x g e 4°C e foram novamente suspensas em 100 mL ou uma solução tampão apropriada. A lise celular foi realizada por meio da adição de 50 ug/mL de lisozima frescamente dissolvida [Roche Diagnostics] e incubadadurante 25 min em gelo. A seguir, MgSO4 a 10 mM foi adicionado para estabilizar os esferoblas- tos, e as células foram centrifugadas durante 10 min a 6.200 x g e 4°C. Finalmente, o sobrenadante obtido, que contém a proteína periplasmá- tica, foi dialisado contra PBS durante a noite a 4°C e foi centrifugado novamente durante 15 min, como indicado acima. Depois, as proteínas recombinantes foram purificadas por Ni-NTA-IMAC (cromatografia de afinidade de metal imobilizado de ácido nitrila-triacético do níquel).

Cromatografia de Afinidade de Metal imobilizado (IMAC):

[00530] Para a purificação de proteínas recombinantes com um marcador His6, um IMAC foi realizado por meio de ácido nitrilatriacéti- co de níquel imobilizado (NTA) de esferas de agarose [Qiagen]. Em primeiro lugar, uma coluna de 1 mL de Ni-NTA agarose precisava de ser equilibrada com cerca de 10 mL de PBS estéril, ou uma solução tamponada de fosfato de sódio com 20 mM de imidazol. Em seguida, a proteína em bruto, quer precipitada a partir de expressão citoplasmáti- ca, quanto dialisada da expressão periplasmática, foi gradualmente aplicada à coluna. Depois de lavagem com cerca de 20 mL de um tampão de lavagem adequado IMAC (fosfato de sódio em solução tamponada contendo de 20 - 35 mM de imidazole) até não haver mais proteína sendo detectável no fluxo, a proteína ligada foi eluida a partir da coluna em frações de 500 uL com um fosfato de sódio solução tamponada incluindo imidazol a 250 mM.

[00531] Todas as frações de lavagem e eluição recolhidas foram testadas para a presença de proteína por um ensaio de Bradford qualitativa por meio da adição de 10uL de cada amostra de 90uL de 1 x solução de Bradford. A verificação do processo de purificação foi realizada por meio de uma análise de SDS-PAGE. Para este fim, as frações eluídas foram corridas em paralelo com proteína bruta, fluxo, e a fração de lavagem em condições de redução. Finalmente, as frações positivas determinadas pela reação colorimétrica foram reunidas em frações de pico e menores e dialisadas contra PBS durante a noite a 4 ° C. Para uso em ensaios de estimulação, as proteínas purificadas que precsiavam ser estéril filtrada, e a sua concentração foram determinadas. Além disso, após a quantificação de proteínas, 2 ug de outras frações foram utilizadas também analisadas por SDS-PAGE e transferência de Western sob condições redutoras e não redutoras.

[00532] Em alternativa do Exemplo 2, o DNA que codifica para (VH) CD3-EGFR (VH-VL), (VH) CD3-CEA (VH-VL), (VH) CD3-Her2 (VH- VL), (VH) CD3 -HLA-A2 (VH-VL), (VH) CD3-HLA-CW6 (VH-VL) (VH) CD3-CD138 (VH-VL), (VH) antiDig-EGFR (VH-VL), (VH) antiHis-HLA- A2 (VH-VL), (VL) CD3-CEA (VH-VL), (VL) CD3-EpCAM (VH-VL), (VL) antiDig-EpCAM (VH-VL), (VL) antiHis-CD45 (VH-VL), (VL) CD3-CD45 (VH-VL) foram sintetizados e as proteínas foram produzidos e isoladas por GenScript (Piscataway, NJ, EUA). O DNA foi códon optimizado para a expressão de E. coli (vetor E3), a expressão optimizada, cultivada em 2 litros padrão meio LB, a proteína foi obtida a partir de corpos de inclusão ou periplasma (líder pelB) em uma etapa em coluna de Ni-HiTrap. Endotoxinas bacterianas foram removidas por meio da diálise contra 5 litros de 1x tampão fosfato de solução salina (PBS). A concentração foi medida por ensaio de proteína de Bradford, com albumina de soro bovino (BSA) como padrão. A pureza foi estimada por meio da análise densitométrica de um gel de SDS-PAGE corado com azul de Coomassie. As alíquotas foram armazenadas a -80°C ou 4°C. O tampão de armazenamento foi utilizado 1xPBS, 5% de glicerol, 0,5% de sarcosina lauroil de sódio, pH 7,4.

Exemplo 3 Técnicas de cultura celular

[00533] Cultivo Celular:

[00534] As células de mamíferos foram cultivadas em frascos de cultura de tecidos T75, em 20 mL do meio de cultura adequado, a 37°C com 5% de CO2. As células foram divididas a cada 2 - 3 dias. As células aderentes primeiro precisavam ser isoladas com 1 x tripsina- EDTA. As células foram contadas utilizando um corante vital, eosina ou azul tripano. Para o armazenamento, as células de 60 a 80% de confluência foram colhidas por meio da centrifugação durante 5 min a 450 x g, ressuspensas em FCS com DMSO a 10%, aliquotadas em criotubos e congeladas gradualmente, a uma temperatura de -80°C. As células foram descongeladas rapidamente a 37°C em um banho de água e cuidadosamente adicionadas a 5 mL de meio. A fim de remover o DMSO, as células foram de novo centrifugadas, ressuspendidas em meio fresco e transferidas para um frasco de cultura de tecido.

Preparação de células mononucleares de sangue periférico (PBMC):

[00535] PBMC, que compreende os linfócitos e monócitos, foram anteriormente isolados a partir do revestimento de um doador humano saudável por meio da centrifugação de densidade utilizando a solução de separação de linfócito LSM com base em Ficoll 1077 (PAA Laboratories, Pasching, Austria). Uma vez que, durante o uso, no entanto, estes PBMC apareceram como uma população de células não homogêneas, a separação a partir de eritrócitos, granulócitos restantes, e trombócitos foi repetida como se segue. PBMC Descongelados, res- suspensos em 30 mL de meio RPMI 1640 contendo 10% de FCS e Pen-Strep, foram cuidadosamente colocados em camadas sobre 10 mL de LSM 1077 e centrifugados durante 5 min a 800 x g sem travar. Após descartar a fase superior, PBMC concentrado na interfase foi transferido para um tubo fresco, ressuspenso em 30 mL de meio e centrifugado durante 5 min a 450 x g. Os monócitos foram removidos por meio da cultura de PBMC de uma placa de cultura de tecido cm 0 10 durante a noite, permitindo a aderência de monócitos para a placa. Finalmente, PBMC, que permanece na solução, foi colhido.

[00536] Em alternativa do Exemplo 3, as células de carcinoma humanas primárias a partir de um paciente com câncer pancreático me- tastático foram extraídas dos sacos de ascite do paciente (Figura 29). 4 litros com ascites malignos recolhidos frescos foram armazenados em frascos de vidro de 2 litros, a 4°C durante a noite. No dia seguinte o sedimento de células a partir do fundo de vidro foi lavado com 1xPBS e ressuspenso em meio de cultura (DMED suplementado com 200 uM de L-glutamina, 10% de FBS inativado pelo calor, penicilina (200 U/mL), estreptomicina (200 ug/mL) e piruvato de sódio (1 mM) (Gibco®)). Aderente células foram cultivadas em incubadora a 36°C, 5% de CO2, 90% de umidade. No mesmo dia, ascite foi coletado do paciente, 20mL de sangue periférico para extração de PBMC foi coletado. AS células leucêmicas primárias foram obtidas a partir de um pa-ciente do sexo masculino de 71 anos com a T-cell-prolinfocítica leucemia (T-PLL) (Figura 11A) recidivante 32 dias após transplante alo- gênico combinado. As células T-PLL leucêmicas foram extraídos como CMSP a partir do sangue periférico dos pacientes. Na época, a amostra foi retirada onde o paciente teve > 90% de explosão leucêmica em sua contagem de sangue em clínica de diagnóstico de rotina. De todos os pacientes houve um consentimento informado, aprovado pela comissão de ética do hospital da Universidade de Würzburg, o qual foi assinado.

[00537] Em alternativa do Exemplo 3, a geração de células T humanas específicas de citomegalievírus (CMV): Resumidamente, as células dendríticas (DC) foram geradas a partir de monócitos aderentes plásticos a partir de PBMC de HLA-A0201 negativa, doador B0702 +. Após 72h de cultivo em meio GM-CSF/DC contendo IL-4 (Cellgen- ix), DC foram maturados em meio contendo IL4 (100ng/mL), GM-CSF (800IU/mL), LPS (10ng/mL) e IFN-y (100U/mL) com 2.5ug/mL CMV pp65 derivado peptídeo TPRVTGGG. Depois de 16h, DC foram irradiados (30Gy) e co-incubados com-CD45RO, as células T CD57 + CD8- naive na proporção 1: 4 em meio contendo 5% de soro AB e IL21 (10ng/mL). Meio fresco, IL7 e IL15 foi adicionado nos dias 3, 5 e 7 de cultura, antes da avaliação no dia 10 a 12. As células foram cultivadas em meio Cellgenix DC. Soro AB humano foi utilizado a partir de PAA. Um lote único foi utilizado em todas as experiências. IL4, IL7, IL15, ou IL21 foram adquiridos a partir de Peprotech ou Cellgenix (com resultados idênticos). GM-CSF foi comprado de Gentaur. LPS (E. coli O: 15) foi adquirido a partir de Sigma. O HLA-B0702 de restrição do peptídeo TPRVTGGG específico de CMV foi comprado de jpt. Para experimentos in vivo, as células T específicas do CMV foram ainda purificadas utilizando APC rotulados de multímeros MHC (Immudex). A coloração do multímero MHC foi realizada à temperatura ambiente, seguida pelo isolamento de células T de multímero MHC + com esferas anti-APC (Miltenyi).

Exemplo 4 Ensaios funcionais

[00538] Citometria de fluxo:

[00539] A ligação de proteínas de fusão de anticorpo com as células tumorais que apresentam o antígeno e/ou linfócitos T foi testada por meio da citometria de fluxo. Para esta finalidade, as células 2,5-5 x 105 foram incubadas com 10 ug/mL de scFv ou 0,004-4 ug/mL de proteínas de fusão tituladas em 100uL de uma solução tampão adequada (como PBS de albumina + soro de bovino, ou outra solução tampão aceitável) por cavidade de uma placa em forma de V de 96 cavidades, a 4°C durante duas horas. Depois de lavar três vezes com 150uL de uma solução tampão adequada, as células foram incubadas com FITC-conjugado anti-His6 marcador ou anti-Flag marcador ou anticorpo anti-myc marcador, à TA durante 30 min e lavado novamente duas vezes. Para propagação e teste de coloração de fundo, foram preparadas, adicionalmente, duas amostras de cada tipo de célula, uma das células não-coradas e coradas com um anticorpo anti-marcador His6 conjugado com FITC, sem qualquer proteína. Finalmente, as células foram ressuspensas em 500uL de uma solução tampão adequado, transferidas para tubos de FACS e analisadas por meio da citometria de fluxo.

Ensaio de Estimulação PBMC:

[00540] As propriedades estimuladoras de proteínas recombinantes foram testadas em um ensaio de estimulação de base celular. Deste modo, a ativação de células T mediada por anticorpos biespecíficos e "constructos de tridomínio" foi determinada por meio da medição da estimulação de PBMC em termos da libertação de IL-2 induzida.

Medição da atividade estimulante de constructos:

[00541] CD45 pos/HLA A2 da linhagem de células de mieloma U266 foram semeadas em uma placa de 96 cavidades de cultura de células de fundo plano a uma densidade de 105 células por cavidade em 100uL de meio de cultura. As proteínas estimuladoras tituladas foram adicionadas tal como indicado em 100uL de meio por cavidade e foram pré-incubadas durante uma hora a 37°C e 5% de CO2 para assegurar a ligação suficiente. PBMC não estimulado, descongelado e isolado no dia anterior, foi, em seguida, adicionado a uma densidade indicada e foi incubado durante 24 horas a 37°C e 5% de CO2. Finalmente, as placas foram centrifugadas durante 5 min a 450 x g para recolher os sobrenadantes isentos de células para quantificação de IL- 2 por ELISA.

IL-2 ELISA em sanduíche:

[00542] Como indicador para a atividade estimuladora, a ativação de células T induzida por anticorpos biespecíficos foi medida em termos da libertação de IL-2. Após a estimulação de PBMC, a concentração de IL-2 segregada no sobrenadante foi determinada por IL-2 ELISA em sanduíche.

[00543] Em primeiro lugar, uma placa de 96 cavidades de ELISA foi revestida com 400 ng/100uL por cavidade de anticorpo de camundongo anti-humano IL-2 do anticorpo durante a noite a 4°C, seguido por meio da saturação dos locais de ligação não específicos com uma solução tampão de bloqueio apropriada durante duas horas à TA. No entanto, as diluições em série 1: 2 de um padrão de IL-2 foram preparadas em duplicado em diluente de reagente de partida com uma concentração de IL-2 no máximo de 1,000 pg/mL. Em seguida, os sobre- nadantes que contêm IL-2 foram de 1: 3 diluídos em um meio RPMI 1640 contendo 10% de FCS e Pen-Strep (penicilina-estreptomicina). Ambos os sobrenadantes e os padrões diluídos foram transferidos para a placa de ELISA e incubados durante duas horas à RT. A seguir, IL-2 foi detectada através de incubação com 17,5 ng/100uL por cavidade de cabra biotinilado anti-humano de anticorpos IL-2 durante duas horas, à RT. Finalmente, 100uL de estreptavidina conjugada com HRP, 1: 200 diluídos em diluente de reagente, foram adicionados por cavidade e incubados durante 20 min à temperatura ambiente. Cada placa foi desenvolvida utilizando uma solução de substrato TMB. A fim de alcançar um sinal de fundo, pelo menos, duas cavidades em cada placa foram incubadas com o reagente diluente ou meio apenas e do anticorpo de detecção, mais TMB. Entre cada etapa de incubação, a placa foi lavada três vezes com PBS contendo 0,05% de Tween-20 e uma vez com apenas PBS.

[00544] A curva padrão de sete pontos foi criada através da representação gráfica dos sinais de absorbância de cada amostra padrão contra a concentração de IL-2. Dessa maneira, a quantidade de IL-2 de cada sobrenadante pode ser determinada por meio da interpolação na curva padrão equipado com a equação de regressão não linear para uma fase de associação exponencial utilizando GraphPad Prism®.

IFN-Y ELISA (alternativa do Exemplo 4):

[00545] Em cultura de células de 100uL de sobrenadante, a concentração de IFN-Y foi medida utilizando o Kit ELISA de IFN-Y humano (Invitrogen™) após o protocolo do fabricante. Resumidamente 50uL de tampão de incubação foi adicionado a cada cavidade de uma plataforma pré-revestida de 96 cavidades. 50 uL do Tampão de Diluição Padrão a zero cavidades. 50uL dos padrões e as amostras a cada cavidade. 50 mL de solução biotinilada de conjugado de biotina IFN-Y Hu em cada cavidade. Gravado suavemente sobre o lado da placa para misturar. A placa foi coberta com a tampa da placa e incubada durante uma hora e 30 minutos à temperatura ambiente. A solução de cavidade foi cuidadosamente aspirada e descartada a líquido. As cavidades foram lavadas 4 vezes. Adicionou-se 100uL de estreptavidina-HRP solução de trabalho a cada cavidade. A placa foi coberta com a tampa da placa e incubada durante 45 minutos à temperatura ambiente. Solução de cavidades cuidadosamente aspirada e descartada a líquido. Adicionou-se 100 mL de cromogênio estabilizado a cada cavidade. O líquido nas cavidades ficavam azuis. Foi incubado durante 15 a 30 minutos à temperatura ambiente e no escuro. Foi adicionado 100 mL de solução de paragem em cada cavidade. Gravado suavemente sobre o lado da placa para misturar. A solução nas cavidades mudou de azul para amarelo. A absorvância de cada cavidade foi lida com um leitor de placas BioRad a 450 nm.

Ensaio de Citotoxicidade:

[00546] O HLA-A2/CD45 da linhagem de células positiva U266 ou linhagem de células de mieloma U266 foi marcada com 10 uM de CFSE (Kit Traçador de Célula CFDA SE Vibrante Invitrogen) em 350uL de PBS durante 10 min à temperatura ambiente (TA) no escuro. A reação de marcação foi parada por meio da adição de 5 mL de soro de vitela fetal (FCS), seguida por meio de uma incubação de uma hora à TA. Depois de duas lavagens, as células-alvo marcadas com CFSE foram novamente suspensas em meio de ensaio e co-incubadas com células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de um doador saudável HLA-A2 negativa em uma proporção de 1: 10 (5 * 105 e 5 * U266 106 PBMC em 2 mL) e 27 nM de constructos de anticorpos, tal como indicado. Uma amostra tratada com Triton foi utilizado como controle positivo (100% de lise) e uma amostra sem anticorpo cons- tructo como controle negativo (0% de lise). Após 24h, as células apop- tóticas foram visualizadas por mancha 7AAD (Biozol, 10 min à temperatura ambiente) e a % de lise específica de células U266 CFSE mar-cada foi calculada utilizando as técnicas de citometria de fluxo.

Ensaio de caspase-3 (alternativa do Exemplo 4):

[00547] A coloração foi realizada após a co-incubar as células-alvo com células-T (células de tumor: células T proporção 2: 1), com ou sem os polipeptídeos específicos para 4h. A coloração de superfície para HLA-A2 e CD45 foi realizada em primeiro lugar, seguida de fixação e permeabilização (Fix + Perm, BD Biosciences). O anticorpo caspase-3 ativado foi então adicionado durante 30 min. (BD Biosciences). As células foram lavadas com 1xPBS 5% de soro humano (HS, PAA Laboratories) e analisadas em um BD-FACS Canto-II. % da Apoptose específica foi calculada como (% valor experimental - % liberação es- pontânea)/(100% - % liberação espontânea) * 100.

Ensaio Azul Alamar (alternativa do Exemplo 4):

[00548] O ensaio Azul alamar® (Abd Serotec) foi utilizado para medir a proliferação e viabilidade de células, após exposição a toxinas. Resumidamente, as células foram cultivadas em meio de cultura de células de 100uL por cavidade (placa de 96 cavidades). Para a análise, 10uL de Azul alamar foi adicionado por cavidade e incubado na incubadora durante 30 a 120 minutos. A absorvância foi lida com um leitor de placas BioRad a 570 nm e 600 nMApenas os meios em branco foram utilizados. A diferença percentual na redução da proliferação de células entre os diferentes grupos de polipeptídeos foi calculada como indicado pelo fabricante, utilizando as células que crescem em cultura sem toxina como controle.

Ensaio de digoxigenina (alternativa do Exemplo 4):

[00549] Primeiro, a peroxidase a partir de rábano silvestre (HRP, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) foi marcada com digoxigenina NHS- éster (Sigma-Aldrich Chemie GmbH), em uma proporção molar de 1/3. Dig-HRP foi limpo com colunas de cromatografia micro Bio-Spin™ (BioRad) e armazenado a 4°C no escuro. As células Colo-206F foram incubadas primeiro com polipeptídeos indicados em várias concentrações para 90 minutos. As células foram lavadas com PBS e ressus- pensas em meio de cultura de células com Dig-HRP e incubadas durante 30 minutos. Em seguida as células foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em 50uL de PBS. 50 uL de cromogênio es-tabilizado (Invitrogen ™) foi adicionada durante 15-30 minutos à temperatura ambiente no escuro. 50 mL de solução de paragem foi adicionado e a absorvância foi lida com um leitor de placas BioRad a 450 nm.

Camundongos (alternativos do Exemplo 4):

[00550] Os camundongos HLA.A2transgênicos, imunodeficientes (NodScid IL-2rg -/- HLA.A2/B2m tg; Banco de número 14570, Laboratório Jackson, em Bar Harbor, Maine, EUA) para o experimento in vivo (Figura 12A) foram mantidos nas instalações certificadas de animais (ZEMM, Centro de medicina molecular experimental, hospital da Universidade de Würzburg), de acordo com as diretrizes européias. Os camundongos fêmeas, de 6 a 10 semanas de idade, foram divididos em cinco grupos de seis camundongos por grupo (n = 30). 5x106 células THP-1, 1,25 células-T CD8 + específicas x105CMV (células de tumor: proporção de células T 40/1) e a 0,5 ug dos polipeptídeos foram injetados por via intraperitoneal (ip), como indicado. Após a injeção, os camundongos foram monitorizados por inspeção diária. Uma segunda injeção do 1.16x105-specific CD8 + CMV de células T/camundongo foi dada no dia 13 e as injeções de polipeptídeos foram repetidas a cada três dias por semana. Os animais foram sacrificados quando o aumento do peso corporal foi superior a 80% ou se eles pareciam moribundos de acordo com as orientações institucionais.

[00551] A estrutura do domínio, os marcadores de afinidade e os ligantes dos constructos ou polipetídeos utilizados nos Exemplos 5-9 ou Figuras 4-11 são mostrados na Figura 3. Estes constructos e todos os constructos ou polipetídeos utilizados nas Figuras 4-30 foram preparados tal como descrito nos Exemplos 1 e 2. A cultura de células e os ensaios funcionais dos Exemplos 5-9 e de cultura, ensaios funcionais e no trabalho in vivo quanto às Figuras 4-30 foram realizados como descrito nos Exemplos 3 e 4.

Exemplo 5

[00552] A linha de mieloma da célula-alvo positivo CD45 e HLA A2 U266 foi co-incubada com Células T HLA A2 negativas (monócitos esgotados PBMC (células mononucleares do sangue periférico) de um doador saudável e quantidades variáveis de HLA A2 e Constructos CD3 de anticorpos bi-específicos, como indicado (Números. 85, 82, 75 e 71) de PHA-L (fito-hemaglutinina, uma lectina que provoca estimulação não específica de células T, 1 ug/mL de concentração final), foi utilizado como controle positivo e constructos de scFv de cadeia única com especificidade para HLA A2 (Número 4) ou de CD3 (número 36) foram investigados. A produção de IL2 (interleucina-2) por meio da scélulas T foi medida através de técnicas de ELISA. Nenuma produção IL2 foi encontrada em situações experimentais, sem quaisquer cons- tructos. Os dados obtidos são mostrados na Figura 4.

Exemplo 6

[00553] A linhagem de mieloma da célula-alvo positivo CD45 e HLA A2 U266 foi co-incubada com Células T HLA A2 negativas (monócitos esgotados PBMC) de um doador saudável e quantidades variáveis de "constructos" tridomínio adicionado separadamente (Números 42, 45, 55; números referindo-se o constructos, conforme ilustrado na Figura 3) ou em combinações de (42 + 45 ou 42 55). PHA-L e constructos de scFv de cadeia única com especificidade para CD45 (Números 46 e 17) foram dados como controles. A produção de IL2 por meio das células T foi medida através de técnicas de ELISA. Nenhuma produção de IL foi encontrada em situações experimentais, sem quaisquer cons- tructos. Os dados obtidos estão representados na Figura 5.

Exemplo 7

[00554] A linha de mieloma de células-alvo positivas a CD45 e HLA A2 U266 foi co-incubada com HLA A2 células T negativos (PBMC esgotadas de monócitos) de um doador saudável e o anticorpo bi- específico de HLA A2 e constructo CD3 c sozinho (número 71, 27 nM) ou em combinação com constructos de scFv de cadeia única que bloqueiam os epítopos antigênicos de HLA A2 (Número 4, cem vezes superior em comparação com a concentração de constructo 71, ou seja, 2700 nM) ou de CD3 (Número 36, o excesso de nove vezes maior em comparação com a concentração de constructo 71, isto é, 243 nM). A produção de IL2 por meio das células T foi medida através de técnicas de ELISA e PHA-L é dada como controle. Os dados obtidos são mostrados na Figura 6.

Exemplo 8

[00555] A linha de mieloma de células-alvo positivas a CD45 e HLA A2 U266 foi co-incubado com células T HLA A2 negativas (PBMC esgotadas de monócitos) de um doador saudável e a combinação de constructos 42 e 45. A função estimuladora das Células T foi bloqueada por meio dos constructos de cadeia única específicos para HLA A2 (número 4) ou CD45 (número 46). A complementação da função esti- muladora de células T foi ensaiada por meio do ensaio dos constructos 42 e 45 separadamente ou o constructo de scFv de cadeia única direcionados contra CD3 (número 36). A produção de IL2 por meio das células T foi medida através de técnicas de ELISA e PHA-L é dada como controle. A concentração de constructos foi de 27 nM, a menos que indicado de outra forma. ("9 x" indica uma concentração de 243 nM, "100X" uma concentração de 2,700 nM.) Os dados obtidos são mostrados na Figura 7.

Exemplo 9

[00556] A linha de mieloma de células-alvo positivas a CD45 e HLA A2 U266 foi co-incubada com células T HLA A2 negativas (PBMC esgotadas de monócitos) de um doador saudável e a combinação de constructos 42 e 55. A função estimuladora das Células T foi bloqueada por meio dos constructos de cadeia única específicos para HLA A2 (número 4) ou CD45 (número 46). A complementação da função estimuladora de células T foi ensaiada por meio do ensaio dos constructos 42 e 55 separadamente ou constructos de scFv de cadeia única direcionados contra CD3 (número 36). A produção de IL2 por meio das células T foi medida através de técnicas de ELISA e PHA-L é dada como controle. A concentração de constructos foi de 27 nM, a menos que indicado de outra forma. ("9 x" indica uma concentração de 243 nM, "100X" uma concentração de 2,700 nM.) Os dados obtidos são mostrados na Figura 8.

[00557] Os resultados dos exemplos anteriores demonstram claramente que os dois constructos de (42 45) ou (42 55) em primeiro lugar tem de se ligar aos seus ligantes sobre a superfície de uma célula única, a fim de, posteriormente, completar a função de envolvente de células T.

Exemplo 10

[00558] A lise do CD45 e linhagem de células de-alvo mieloma HLA A2 positivas U266 por células T HLA A2 negativas (PBMC esgotadas de monócitos), na presença de VLCD3 scFvHLA-A2 (27 nMol) ou VH- scFvCD45 (27 nMol) ou a combinação de ambos estes constructos (27 nmol cada) foi determinada utilizando as técnicas de citometria de fluxo com base. A percentagem de lise foi calculada por meio das células U266 apoptóticas divididas através de células totais U266 e a apopto- se de fundo foi subtraída. Os dados obtidos são mostrados na Figura 9.

Exemplo 11

[00559] Como partes do constructo de bipartida final, dois polipeptí- deos foram projetados, cada um composto por uma única cadeia de fragmento variável de ligação ao antígeno (scFv) e da cadeia leve variável (VL) ou cadeia pesada variável (VH) de domínio de um anticorpo anti-CD3 ativado pela célulaT (Figura 10). Quando estes dois polipep- tídeos se ligam os respectivos antígenos na superfície de uma única célula, os domínios VL e VH interagem uns com os outros para reconstituir o local de ligação de anti-CD3 original. O assim heterodímero triespecífico no alvo formado engaja e estimula as células T para a destruição das células tumorais.

[00560] Este cenário é totalmente validado in vitro quando os linfóci- tos T são confrontados com as células-alvo que foram incubadas com os dois polipeptídeos diferentes. Como prova de princípio, o principal antígeno de histocompatibilidade HLA-A2 e o marcador de linhagem hematopoiéticas CD45 foram alvejados como primeiro e segundo antí- genos, os quais ambos são expressos em células U266 de mieloma, as células primárias a partir de um paciente com leucemia pró- linfocítica da linhagem de células T (T-PLL), e THP-1 de leucemia mie- loide aguda de blastos (Figura 11). Devido à interação de VL/VH descrita, o heterodímero triespecifico agora potentemente estimula as células T a segregar interleucina-2 (IL-2) (Figura 11a) e para efetuar a lise das células tumorais marcadas em concentração nanomolar (Figura 11b), sendo a eficácia citotóxica bastante semelhante a de uma ativação de células T-anticorpo bi-específico, que foi utilizada como um controle positivo (Figura 11A, painel esquerdo), Mack, 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92, 7021 a 7025. Quando os polipeptídeos foram adicionados separadamente um do outro, eles não induzem os linfócitos T para a lise de células-alvo. Estes resultados estão de acordo com os dados estruturais que indica que ambos os domínios VH e VL são necessários para conferir afinidade suficiente para o antígeno-alvo (Figura 11A, B), Colman, 1987, Nature 326, 358 a 363; Amit, 1986, Ciência 233, 747 a 753. Além disso, os resultados revelam que a possível ho- modimerização de ambos os braços VH ou VL resulta em um efeito biológico mensurável negligenciável.

[00561] Para demonstrar que as duas moléculas devem primeiro ligar os seus antígenos na superfície da célula-alvo para que hetero- dimerização VH/VL venha a ocorrer, os fragmentos variáveis de cadeia única específicos para HLA-A2 e CD45 foram utilizados para bloquear os respectivos epitopos no alvo. Como mostrado na Figura 11c, quando presente em grande excesso, estes inibidores impede os dois poli- peptídeos de desencadear células T de uma forma dependente da dose. Além disso, as células T não foram estimuladas quando as células- alvo foram omitidas (dados não mostrados) ou quando as células-alvo foram sondadas as quais expressam CD45 apenas (células Raji, figura 11D) ou nenhuma molécula-alvo (KMS-12-BM, figura 11D).

Exemplo 12

[00562] Para a prova de conceito in vivo, um modelo de transplante de células tronco de incompatibilidade alogênica foi recorrido em que as células leucêmicas e hematopoiéticas residuais de um paciente, todas HLA-A2 e CD45-positiva, devem ser eliminadas para se obter as células tronco de dadores alogênicos (HLA-A2 -negativas, de CD45- positivo) a oportunidade de enxertar e reconstituir hematopoiese (vide a Figura 2). Para colocar a especificidade do constructo bipartida para o teste, foram utilizados camundongos imunodeficientes expressando o transgene humano HLA-A2 em células nucleadas praticamente todos, a questão sendo se os tecidos murinos HLA-A2-positivas, mas CD45 negativo sofreriam danos colaterais. Células THP-1 foram injetadas por via intraperitoneal com ou sem linfócitos T CD8 de um doador HLA-A2 negativo, que tinha sido selecionado para a especificidade para o citomegalovírus (CMV) para evitar a reatividade imune anti- murino humano. Os tumores intraperitoneais desenvolveram-se rapidamente nos camundongos que não receberam os polipeptídeos, e em camundongos tratados tanto com tipos de moléculas individuais ou com a combinação de ambos os polipeptídeos, mas sem células T. Em todos os casos, a doença disseminada fatal desenvolvida dentro de 3 a 4 semanas (Figura 12A). Em contraste, todos os camundongos portadores de tumor tratados com as células T e as injeções repetidas de ambos os polipeptídeos sobreviveu ao fim da experiência no dia 31, embora com tumores palpáveis no local da injeção. Estes resultados mostram claramente que o constructo bipartida verdadeiramente redireciona as células T independentemente da sua especificidade para células de tumor que expressam simultaneamente ambas as moléculas-alvo (HLA-A2) e CD45 in vivo. Como um aparte, uma célula T re-crutando os anticorpos bi-específicos contra HLA-A2 iria causar estragos, redirecionando as células T contra todos os tecidos murinos HLA- A2positivos. Da mesma forma, um anticorpo bi-específico de ligação ao CD45 teria lise mediada de todas as células hematopoiéticas, incluindo as células THP-1 de leucemia e de blastos de células T do doador. No presente conjunto plano, no entanto, a injeção do polipeptídeo de HLA-A2 específicos nos animais transgênicos HLA-A2 não provocou toxicidade aparente.

[00563] Para examinar uma melhor possível toxicidade para os espectadores, foi empregado um ensaio altamente sensível a apoptose em células THP-1 e monócitos HLA-A2-negativos, mas CD45 positivo, este último representando o compartimento de espectador saudável. Como representado na Figura 12B, observou-se a ativação da caspase-3 em células THP-1, mas não em monócitos tratados da mesma cavidade com a combinação dos polipeptídeos ou o controle positivo biespecífico e células T do doador. THP-1 de células cultivadas com células T e polipeptídeos individuais não foram afetados. Estas observações mostram claramente novamente a iniciação da apoptose ex-clusivamente na população-alvo positiva de antígeno duplo, enquanto as células espectadores HLA-A2-negativos são poupadas. Estes experimentos modelam com bastante precisão a situação clínica urgentemente de pacientes com leucemia com transplante de células tronco HLA-incompatíveis. A abordagem combinatória de usar uma molécula HLA distinta e CD45 tem por objectivo reforçar o enxerto desejado contra os efeitos de leucemia por meio do redirecionamento células T do doador contra blastos leucêmicos de ambas origens mieloide e lin- foide.

Exemplo 13

[00564] Para se aventurar em tumores sólidos, os presentes inventores tiveram como-alvo a abordagem combinatória para molécula de adesão celular epiteliais (EpCAM) e antígenos do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). Ambos os antígenos são sobre- expressos em vários carcinomas e têm sido extensivamente estudados na fase clínica de ensaios II e III. A expressão de EGFR está intimamente associada com a proliferação celular, enquanto EpCAM está presente na superfície basolateral do epitélio virtualmente todos simples e foi recentemente encontrada para agir como uma proteína de sinalização na via Wnt, Maetzel, 2009, Nat celular Biol 11, 162 a 171. Como a Figura 13a ilustra, os dois polipeptídeos desencadeam a libertação de interferona-Y (IFN-y), a partir de linfócitos do doador co- incubado e medeiam a apoptose da linhagem de célula de câncer duplo positivo COLO-206F em concentrações nanomolares (Figura 13a, b), mas apenas quando administrado em combinação, e não apenas com qualquer uma das partes. Como descendente de tecido neuroepi- telial, a linhagem de células de melanoma de FM-55 não tem EpCAM, e, portanto, era totalmente resistente aos polipeptídeos (Figura 13a, b). Embora a expressão de EGFR e EpCAM sobreponha amplamente na proliferação de células de carcinoma, a não-proliferação de células epiteliais, por exemplo, de fígado e pâncreas apenas expressando EGFR ou antígenos EpCAM, respectivamente, devem ser menos suscetíveis a ou protegidas do ataque em duas perfurações. Notavelmente, as toxicidades hepáticas e pancreáticas foram limitantes da dose para os anticorpos monoclonais EpCAM alta afinidade em ensaios clínicos (para revisão vide, Munz, 2010, Cancer Cell Int 10: 44).

Exemplo 14

[00565] Quanto mais a validação da estratégia de complementação funcional bipartida foi realizada por extenso em experiências in vitro, utilizando uma combinação de diferentes polipeptídeos, houve o alvo de vários antígenos de superfície celular de diferentes linhagens de célula humanas.

[00566] As linhagens de célula HLA A2 tumorais humanas positivas FM-55 (mieloma), Colo-206F (câncer do cólon) e OVCAR (câncer do ovário) foram co-incubadas com HLA-A2 PBMC negativos a partir de um doador saudável, polipeptídeo contra o HLA-A2 (CD3 (VL) - HLA- A2 (VH-VL)) e com um segundo polipeptídeo-alvo ou CEA (CD3 (VH) - CEA (VH-VL)), EGFR (CD3 (VH) - EGFR (VH-VL)) ou Her2 (CD3 (VH) - Her2 (VH-VL)). A produção IL2 ou IFN-Y de linfócitos foi medida por meio de técnicas de ELISA. Estes dados demonstram que (i) uma combinação específica de antígenos, de uma assinatura de antígeno, pode ser expressa em carcinomas de origem diversa (pele, neuroepi- telial, intestino e tecido do ovário), (ii) a assinatura do antígeno é acessível com a nossa estratégia complementação funcional bipartida utilizando um conjunto de polipeptídeos específicos para o antígeno de assinatura. Os dados obtidos são apresentados nas Figuras 14, 15 e 16.

Exemplo 15

[00567] Para demonstrar a permutabilidade do domínio funcional, os fragmentos F1 e F2 de um conjunto de polipeptídeos foram trocados uns com os outros, mantendo a sua capacidade de complementa- ção específica para a restauração do seu domínio-alvo do anticorpo original para envolver as células T. Portanto, foi utilizado o conjunto de polipeptídeos contra o antígeno-alvo, CD45 e HLA-A2. O polipeptídeo contra CD45 tinha CD3 (VL) como fragmento F1 e o polipeptídeo contra HLA-A2 tinha CD3 (VH) como fragmento F2. A CD45 e de HLA-A2 A linhagem de células de mieloma U266 positiva foi co-incubada com células T HLA-A2 negativa de um doador saudável e polipeptídeos contra CD45 (CD3 (VL) - CD45 (VH-VL)) e HLA-A2 (CD3 (VH) - HLA- A2 (VH-VL)) em quantidades variadas. O envolvimento de células T foi avaliado através da produção de IFN-y reativo, medido por meio de técnicas de ELISA. Nenhuma produção de IFN-y foi encontrada em situações experimentais, sem quaisquer polipeptídeos. Os dados obtidos estão representados na Figura 17.

Exemplo 16

[00568] A estratégia de complementação funcional bipartida foi ainda testada, visando um conjunto de antígenos, já utilizado como-alvos para terapia de anticorpos do câncer (EGFR, EpCAM e HER2) (Her2 é um-alvo para Trastuzumab no câncer de mama, EGFR é um-alvo para cetuximab em câncer coloeretal e EpCAM é um-alvo para Catumazu- mab para o tratamento da ascite neoplásica). As células positivas para EGFR, EpCAM e Her2 (Colo-206F, CX-1 e OVCAR) foram co- incubadas com PBMC a partir de um doador saudável e a combinação de polipeptídeos contra EGFR (CD3 (VH) - EGFR (VH + VL)), EpCAM (CD3 (VL) - EpCAM (VH + VL)) e Her2 (CD3 (VH) - Her2 (VH + VL)). A complementação da função estimulante de linfócitos foi avaliada por meio da produção de IFN-y reativo, medido por meio de técnicas de ELISA. Nenhuma produção de IFN-y foi encontrada em situações experimentais, sem quaisquer polipeptídeos. Os dados obtidos são apresentados nas Figuras 18 e 19.

Exemplo 17

[00569] Para testar uma combinação antígeno com correlação clínica acurada, a combinação CD45 e CD138 foi utilizada para direcionar as células de mieloma múltiplo humano (MM). A maioria destas células humanas são positivas para CD45 e CD138. Os anticorpos biespecíficos da recrutamento da célula T contra CD45 matariam todas as células hematopoiéticas de um paciente e contra CD138 iriam causar efeitos secundários graves devido à sua expressão em vários tecidos normais (células epiteliais, endotélio, células trofoblásticas e células glandulares do trato GI, a proteína humana Atlas, Versão: 10.0, Atlas atualizado: 2012-09-12). Em contraste, a combinação de CD45 e CD138 é encontrada exclusivamente em células de plasma e células de MM e é, portanto, uma boa assinatura de antígeno para a abordagem terapêutica direcionada. A linhagem positiva humana de células de mieloma múltiplo CD45 e CD138 AMO-1 foi co-incubada com PBMC de um doador saudável ea combinação de polipeptídeos contra CD45 (CD3 (VL) - CD45 (VH + VL)) e CD138 (CD3 (VH) - CD138 (VH + VL)). A complementação da função estimulante de lin- fócitos foi avaliada por meio da produção de IFN-y reativa, medida por meio de técnicas de ELISA. Nenhuma produção de IFN-y foi en- contrada em situações experimentais com polipeptídeos simples ou sem quaisquer polipeptídeos. Os dados obtidos estão representados na Figura 20.

Exemplo 18

[00570] Uma outra aplicação da estratégia de complementação funcional bipartida é os antígenos-alvo individuais na superfície celular e matar as células tumorais positivas de antígenos individuais. Uma grande desvantagem para os anticorpos biespecíficos do recrutamento da célula T com lados de ligação antiCD3 funcionais são graves efeitos colaterais cautilizados por meio da ativação de células T inespecí- ficas e a liberação de citocinas (Linke, R. et al Catumaxomab:.. Desenvolvimento clínico e direções futuras MAbs 2, 129-136 (2010)). A vantagem desta estratégia de complementação funcional bipartida é o fato de, anticorpos em que a ativação de células T antiCD3 domínio funcional é restaurada exclusivamente na célula-alvo, nenhuma ativa-ção de domônio de célula T está presente. As células de mieloma múltiplo humanas positivas para CD45 e CD138 AMO-1 e U266 foram co- incubadas com PBMC a partir de um doador saudável e a combinação de polipeptídeos contra um único antígeno-alvo, ou CD138 (CD3 (VH) - CD138 (VH + VL) + CD3 (VL) - CD138 (VH + VL)) ou CD45 (CD3 (VH) - CD45 (VH + VL) + CD3 (VL) - CD45 (VH + VL)). A complemen- tação da função estimulante de linfócitos foi avaliada por meio da produção de IFN-y reativo, medido por meio de técnicas de ELISA. Nenhuma produção de IFN-y foi encontrada em situações experimentais com polipeptídeos simples ou sem quaisquer polipeptídeos. Os dados obtidos estão apresentados na Figura 21 e 22. Na Figura 23, a abordagem do antígeno único é ilustrada, por meio de um conjunto de poli- peptídeos-alvo dois epítopos diferentes (parte superior) ou o mesmo epitopo (parte inferior) no antígeno A1-alvo.

Exemplo 19

[00571] Este é um exemplo para demonstrar que a estratégia de complementação funcional pode ainda ser elaborada para a entrega direcionada de carga e que as diferentes formas efetoras são possíveis para matar uma célula-alvo. Ao complementar os fragmentos F1 e F2 de um conjunto de polipeptídeos ligadosno-alvo, o local de ligação de anticorpos recém-formado pode ligar qualquer molécula que é específica. A fim de dirigir uma carga marcada com His precisamente para uma célula-alvo, foram utilizados os fragmentos de VH e VL de um anticorpo anti-HIS (hexa-histidina). Após a ligação simultânea de um polipeptídeo (antiHis (VL)-CD45 (VH-VL) e polipeptídeo 2 (antiHis (VH)-HLA-A2 (VH-VL) para o seu-alvo, antígenos específicos de CD45 e HLA-A2, uma hexa-histidina no local de ligação é completada no alvo que se liga a histidina de cargas marcadas com elevada afinidade elevada. A carga sendo uma toxina marcada com His, como dado no exemplo na presente invenção. As células positivas para CD45 e de HLA-A2 de THP-1 foram co-incubadas com perfríngeos de Clostridium marcados com (His)histidina componente da toxina Ia (Figura 24) ou uma toxina Shiga marcada com histidina (His) de subunidade A (figuras 25, 26) em combinação com os polipeptídeos contra CD45 (antiHis (VL)-CD45 (VH-VL)) e HLA-A2 (antiHis (VH)-HLA-A2 (VH-VL)). A complementação de ligação da toxina marcada com His e a subsequente morte celular-alvo foi avaliada medindo a viabilidade celular utilizando um ensaio Azul alamar®. Na maior concentração de polipep- tídeos utilizados (80nm), uma diferença clara na morte de células-alvo, medida como redução na viabilidade das células, foi encontrada em situações experimentais com uma combinação de ambos os polipeptí- deos em relação a polipeptídeos individuais.

Exemplo 20

[00572] Para demonstrar ainda mais a versatilidade, flexibilidade e a permutabilidade da estratégia de complementação funcional biparti- da, os fragmentos VH e VL de um anticorpo anti-digoxigenina foram utilizados para identificar e marcar o antígeno duplo de células positivas com HRP marcado com Digoxigenina (peroxidase de rábano silvestre). EGFR e células Colo-206F positivas EpCAM foram co- incubadas com polipeptídeos contra EGFR (antiDig (VH) - EGFR (VH + VL)) e EpCAM (antiDig (VL) - EpCAM (VH + VL)). Na complementa- ção-alvo do domínio funcional de anti-digoxigenina, indicado por meio da marcação digoxigenina HRP das células Colo-206F, foi avaliada pela medição da atividade da peroxidase, utilizando um kit de ELISA padrão (Invitrogen™). Uma diferença clara nas células-alvo marcadas com Dig - HRP foi encontrada em situação experimental, com uma combinação de ambos os polipeptídeos em relação aos polipeptídeos individuais. Os dados obtidos estão apresentados na Figura 27.

Exemplo 21

[00573] Utilizando os antígenos leucocitários humanos (HLA) como um braço de antígeno duplo restrito a complementação funcional bipartida, esta estratégia de haplótipos foi ainda validada por meio da troca dos domínios funcionais dos polipeptídeos com os fragmentos VH e VL de um anticorpo anti-HLA-Cw6. HLA-Cw6 CMSPs dos pacientes primárias positivos foram co-incubados com o HLA-Cw6 PBMC negativos a partir de um doador saudável, polipeptídeo contra CD45 (CD3 (VL) - CD45 (VH-VL)) e HLA-Cw6 (CD3 (VH) - HLA-Cw6 (VH- VL)). A produção de IFN-y por meio dos linfócitos foi medida por meio de técnicas de ELISA. Estes dados demonstram que as células hema- topoiéticas de pacientes com outros haplótipos que o HLA-A2 podem ser orientadas simplesmente por meio da troca de um domínio-alvo (anti HLA-A2, a Figura 5, 7-9, 11-12) por outro (anti HLA-Cw6). Os dados obtidos são apresentados nas Figuras 28.

Exemplo 22

[00574] A estratégia de complementação funcional bipartida induzi- da por antígeno duplo foi ainda validado em um ensaio com paciente in vitro, utilizando as células de carcinoma primário do paciente recém- isolado e os antígenos-alvo já utilizados para terapia de câncer na clínica ou ensaios clínicos (EGFR, EpCAM, CEA e HER2). As células malignas de um paciente do sexo masculino de 48 anos com câncer de pâncreas metastático foram co-incubadas com os pacientes que possuem linfócitos do sangue periférico e da combinação de polipeptí- deos contra EGFR (CD3 (VH) - EGFR (VH + VL)), EpCAM (CD3 (VL) - EpCAM (VH + VL)), Her2 (CD3 (VH) - Her2 (VH + VL)), CEA (CD3 (VH) - CEA (VH-VL)) e HLA-A2 (CD3 (VL) - HLA -A2 (VH-VL)). A com- plementação da função estimulante de linfócitos foi avaliada por meio da produção de IFN-y reativa, medida por meio de técnicas de ELISA. Nenhuma produção de IFN-y foi encontrada em situações experimentais, sem quaisquer polipeptídeos. Estes dados demonstram o potencial desta estratégia em utilizar as próprias células do sistema imuno- lógico do paciente para atacar e matar suas células transformadas malignas. Os dados obtidos são apresentados nas Figuras 29.

Exemplo 23

[00575] Uma população de células T positivas restrita para CMV CD3/CD8 altamente enriquecida foi utilizada para mostrar que qualquer célula T, independentemente da sua especificidade, pode servir como uma célula efetora em matar as células tumorais positivas de antígenos duplos por meio de esta estratégia de complementação. U266 positiva de CD45 e de HLA-A2 e células THP-1 foram co- incubadas com citomegalievírus de células T específicas (CMV) a partir de um doador saudável HLA-A2 negativa e polipeptídeos contra CD45 (CD3 (VH) - CD45 (VH-VL)) e HLA-A2 (CD3 (VL) - HLA-A2 (VH- VL)) em quantidades variadas. O conjunto biespecífico de anticorpo scFv (CD3 (VH-VL) x HLA-A2 (VH-VL)) foi utilizado como um controle positivo. O envolvimento de células T foi avaliado através da produção de IFN-y reativa, medido por meio de técnicas de ELISA. Nenhuma produção de IFN-y foi encontrada em situações experimentais com polipeptídeos simples ou sem quaisquer polipeptídeos. Os dados obtidos estão apresentados na Figura 30. As células a partir do mesmo lote de alíquota congelada, as células T específicas para CMV e células THP-1, foram utilizadas para o modelo de murino in vivo (Figura 12A).

Exemplo 24

[00576] Esta ilustração representa o potencial para atingir os alér- geno/clones de células B específicas auto-imunes, com a estratégia de complementação funcional bipartida. Ao utilizar um alérgeno sintético como porção-alvo, o alérgeno polipeptídeo ligado irá ligar-se especificamente ao seu receptor de células B clonotípicas expressas na superfície do clone de células B específicas anti-alérgicas. O segundo braço da estratégia bipartida usará um polipeptídeo específico de célu- las-B (CD19, CD20, CD38, CD138), restringindo a complementação seguido do domínio efetor com subsequente morte de células-alvo para o clone de células B específicas anti-alérgicas. O objetivo final desta estratégia é eliminar o clone de célula B que causa e de doença alérgica ou auto-imune (parte superior da Figura 31), enquanto poupando as células B com outras especificidades ou outros do que as células B de células (por exemplo mastócitas ou células basófilas) que ligam o anticorpo responsável pela doença através de Fc-receptores (parte inferior da Figura 31).

[00577] As características da presente invenção descritas no relatório descritivo, as reivindicações e/ou os desenhos anexos podem, tanto separadamente como em qualquer combinação das mesmas, constituir um material para realizar a presente invenção nas suas diversas formas.

Claims

1. Conjunto de polipeptídeos, caracterizado pelo fato que compreende: um primeiro polipeptídeo P1 que compreende (i) uma porção-alvo T1, em que a referida porção-alvo T1 se liga especificamente a um antígeno A1, e (ii) um fragmento F1 de um domínio funcional F, em que nem o referido fragmento F1 por si só, nem o referido polipeptídeo P1 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F, e um segundo polipeptídeo P2que compreende (iii) uma porção-alvo T2, em que a referida porção-alvo T2 se liga especificamente a um antígeno A2, e (iv) um fragmento F2 do referido domínio funcional F, em que nem o referido fragmento F2 por si só, nem o referido polipeptídeo P2 por si só é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F, em que o referido antígeno A1 é diferente do referido antí- geno A2, em que o referido polipeptídeo P1 e o referido polipeptídeo P2 não estão associados um com o outro na ausência de uma célula que contém ambos os antígenos A1 e A2, na sua superfície celular, e em que, mediante a dimerização do referido fragmento F1 do referido polipeptídeo P1 com o referido fragmento F2 do referido polipeptídeo P2, o dímero resultante é funcional no que diz respeito à função do referido domínio F e em que o referido fragmento F1 compreende um domínio VL de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VH do mesmo anticorpo; ou em que o referido fragmento F1 compreende um domínio VH de um anticorpo e o referido fragmento F2 compreende um domínio VL do mesmo anticorpo, e em que o polipeptídeo P1 e P2 é ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 114-129 e 197.

2. Conjunto de polipeptídeos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma célula contendo ambos os antí- genos A1 e A2, na sua superfície celular induz a dimerização do fragmento F1 do referido polipeptídeo P1 com o fragmento F2 do referido polipeptídeo P2, ao passo que uma célula que não contém tanto antí- genos A1 e A2, na sua superfície celular, não induz a dimerização do fragmento F1 do referido polipeptídeo P1 com o fragmento F2 do referido polipeptídeo P2.

3. Conjunto de polipeptídeos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os referidos polipeptídeos P1 e P2 apresentam, na ausência da referida célula, um com o outro uma dissociação KD constante na faixa de 10-8 M a 10-2 M, na faixa de 10-7 M a 10-3 M ou na faixa de 10-6 M a 10-3 M; e/ou os referidos polipeptí- deos P1 e P2 apresentam, na presença da referida célula, um com o outro uma dissociação KD constante inferior a 10-6 M, inferior a 10-7 M inferior a 10-8 M ou inferior a 10-9 M.

4. Conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido an- tígeno de A1 e/ou o referido antígeno de A2 é um antígeno expresso sobre a superfície de células de um tumor ou na superfície de células progenitoras/precursoras de um tumor.

5. Conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a combinação de antígeno A1 e antígeno A2 só é encontrada em células cancerígenas, e não sobre as células que não são cancerígenas.

6. Conjunto de polipeptídeos de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido antígeno A1 e antígeno A2 é específico para as células cancerígenas de um certo tipo de câncer.

7. Conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o referido antígeno A1 é um antígeno MHC sendo uma variante alélica selecionada a partir do grupo que consiste em: HLA-A2, HLA-Cw6, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A25, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B35, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw7; e/ou o referido antígeno A2 é um antígeno que é específico para um determinado tipo celular ou linhagem celular selecionado a partir do grupo que consiste em: CD45; CD34; CD33; CD138; CD15; CD1a; CD2; CD3; CD4; CD5; CD8; CD20; CD23; CD31; CD43; CD56; CD57; CD68; CD79a; CD146; tensoativo pulmonar; sinaptofisina; CD56; CD57; receptor de acetilcolina nicotínico; MUSK quinase específico de músculo; canais de cálcio dependente de voltagem (tipo P/Q); canal de potássio dependente de voltagem (CPVD); Receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA); TSH; amphiphysin; HepPar-1; ganglioside GQ1b, GD3 ou GM1; e glicoforina-A.

8. Conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que qualquer um dos referidos antígenos A1 e A2 é selecionado a partir do grupo que consiste em: HLA-A2; HLA-Cw6; EpCAM; CD45; Her2; EGFR; CD138; CEA; CD19; E-caderina; Ca-125; Her-2/neu; proteína do fluido de doença cística grave; BCA-225; CA 19-9; CD117; CD30; antígeno Epite- lial BER-EP4, antígeno de membrana epitelial e Antígeno MOC-31 epi- telial relacionado ; receptor do fator de Crescimento epidérmico HER1; receptor PDGFR alfa do fator de crescimento Derivado de plaquetas; marcador associado com Melanoma/Mart 1/Melan-A; CD133; TAG 72; e um anticorpo clonotípico na superfície de uma célula B.

9. Conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que (i) um dos referidos antígenos A1 e A2 é EpCAM e o outro é EGFR, HER2/neu, CD10, VEGF-R ou MDR; (ii) um dos referidos antígenos A1 e A2 é MCSP e o outro é melanoferrin ou EpCAM; (iii) um dos referidos antígenos A1 e A2 é CA125 e o outro é CD227 (iv) um dos referidos antígenos A1 e A2 é o CD56 e o outro é CD140b ou gangliosídeo GD3; (v) um dos referidos antígenos A1 e A2 é o EGFR e o outro é HER2; (vi) um dos referidos antígenos A1 e A2 é o PSMA e o outro é HER2; (vii) um dos referidos antígenos A1 e A2 é Sialil Lewis e o outro é EGFR; (viii) um dos referidos antígenos A1 e A2 é CD44 e o outro é ESA, CD24, CD133, CD117 ou MDR; (ix) um dos referidos antígenos A1 e A2 é CD34 e o outro é CD19, CD79a, CD2, CD7, HLA-DR, CD13, CD117, CD33 ou CD15; (x) um dos referidos antígenos A1 e A2 é o CD33 e o outro é CD19, CD79a, CD2, CD7, HLA-DR, CD13, CD117 ou CD15; (xi) um dos referidos antígenos A1 e A2 é MUC1 e o outro é CD10, ou CD57 CEA; (xii) um dos referidos antígenos A1 e A2 é o CD38 e o outro é CD138; (xiii) um dos referidos antígenos A1 e A2 é CD 24 e o outro é CD29 ou CD49f; (xiv) um dos referidos antígenos A1 e A2 é anidrase carbônica IX e o outro é aquaporina-2; (xv) um dos referidos antígenos A1 e A2 é a HLA-A2 e o outro é EpCAM; (xvi) um dos referidos antígenos A1 e A2 é a HLA-A2 e o outro é CD45; (xvii) um dos referidos antígenos A1 e A2 é a HLA-A2 e o outro é EGFR; (xviii) a um dos referidos antígenos A1 e A2 é a HLA-A2 e o outro é Her2; (xix) um dos referidos antígenos A1 e A2 é a HLA-A2 e o outro é CEA; (xx) um dos referidos antígenos A1 e A2 é EpCAM e a outro é CEA; (xxi) um dos referidos antígenos A1 e A2 é a CD45 e o outro é CD138; (xxii) um dos referidos antígenos A1 e A2 é o EGFR e o outro é CEA; (xxiii) um dos referidos antígenos A1 e A2 é o Her2 e a outro é CEA; ou (xxiv) um dos referidos antígenos A1 e A2 é o CD19 e o outro é um anticorpo clonotípico na superfície de uma célula B.

10. Conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a referida porção-alvo T1 e/ou T2 compreende um módulo de imunoglobulina; ou em que a referida porção-alvo T1 e/ou T2 compreende um aptâmero ou um ligante natural do referido antígeno A1 ou antígeno A2, respectivamente.

11. Conjunto de polipeptídeos de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a referida porção-alvo T1 compreende um módulo de imunoglobulina I1 que compreende um domínio VL ligado a um domínio VH ou que compreende um domínio variável de um anticorpo VHH de um anticorpo lhama, um anticorpo de camelo ou um anitcorpo de tubarões; e/ou a referida porção-alvo T2 compreende um módulo de imu- noglobulina I2 que compreende um domínio VL ligado a um domínio VH ou VHH compreende um domínio variável de um anticorpo lhama, um anticorpo de camelo ou um anitcorpo de tubarões.

12. Conjunto de polipeptídeos de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido módulo de imunoglo- bulina I1 compreende um scFv (fragmento de variante de cadeia simples), um fragmento Fab ou um F(ab')2 de um anticorpo ou de um anticorpo completo; e/ou o referido módulo de imunoglobulina I2 compreende um scFv (fragmento de variante de cadeia simples), um fragmento Fab ou um F(ab')2 de um anticorpo ou de um anticorpo completo.

13. Conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 6 a 12, caracterizado pelo fato de que uma da referida porção-alvo T1 e T2 compreende um alérgeno ou substrato o qual se liga a um anticorpo clonotípico na superfície de uma célula B.

14. Conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido fragmento F1 compreende um módulo de imunoglobulina.

15. Conjunto de polipeptídeos de acordo a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido domínio funcional F é um Fv (fragmento variante) de um anticorpo.

16. Conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o referido fragmento F1 compreende um domínio VL de um anticorpo anti-CD3, anti-His e anticorpo anti-DIG e o referido fragmento F2 compreende um domínio VH do mesmo anticorpo, ou em que o referido fragmento F1 compreende um domínio VH de um anticorpo anti-CD3, anti-His e anti-DIG e o referido fragmento F2 compreende um domínio VL do mesmo anticorpo.

17. Conjunto de polipeptídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um paciente que sofre de câncer e/ou de um tumor ou para uso em diagnóstico em um paciente que sofre de câncer e/ou um tumor.

18. Molécula de ácido nucleico ou conjunto de moléculas de ácidos nucleicos, caracterizado pelo fato de que codificam o conjunto de polipeptídeos ou de um dos polipeptídeos do conjunto de polipeptí- deos como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, compreendendo uma sequência de nucleotídeos como descrita em qualquer uma das SEQ ID NOsNOs: 135-150 e 196.

19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o conjunto de polipeptídeos como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou a molécula de ácido nuclei- co/conjunto de moléculas de ácidos nucleicos como definido na reivindicação 18, em que, preferencialmente, a referida composição farmacêutica compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

20. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o conjunto de polipeptídeos como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou a molécula de ácido nucleico ou o conjunto de moléculas de ácidos nucleicos como definido na reivindicação 18.