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KR102095339B1 - 신규한 락토바실러스 류테리 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

신규한 락토바실러스 류테리 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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KR102095339B1
KR102095339B1 KR1020170068416A KR20170068416A KR102095339B1 KR 102095339 B1 KR102095339 B1 KR 102095339B1 KR 1020170068416 A KR1020170068416 A KR 1020170068416A KR 20170068416 A KR20170068416 A KR 20170068416A KR 102095339 B1 KR102095339 B1 KR 102095339B1
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reuteri
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periodontal disease
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Abstract

본 발명은 락토바실러스 류테리 AN417 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 락토바실러스 류테리 AN417 균주는 종래 치주질환균을 억제하는 것으로 알려진 해외 균주에 비해 공시균, 충치 원인균 및 치주질환 원인균에 대하여 우수한 항생활성 및 생육 저해 활성을 나타낸다. 또한, 유전체 서열 결정 결과, 상기 균주는 표준균주와 16S rRNA 유전자 서열 상동성이 99.67%로서 신규한 균주로 사료된다. 따라서, 락토바실러스 류테리 AN417 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 조성물은 치주질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

신규한 락토바실러스 류테리 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물{NOVEL LACTOBACILLUS REUTERI AND COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING PERIODONTAL DISEASES COMPRISING THE SAME}
본 발명은 신규한 락토바실러스 류테리 균주의 동정 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 잘못된 식습관 및 고령화로 인해 면역력이 감소하고 영양 및 대사 장애가 증가하여 치주질환이 발생하는 환자의 수가 증가하고 있다. 치주질환의 직접적인 원인은 치아에 지속적으로 형성되는 플라그(plaque)라는 세균막과 이것이 제거되지 않고 단단해져 생긴 치석이다. 플라그와 치석이 쌓이면 잇몸이 치아로부터 떨어지게 되고, 이로 인해 치아와 잇몸 사이에 염증이 발생하게 된다.
치주질환은 염증의 정도에 따라 치은염과 치주염으로 구분된다. 치은염은 잇몸이 빨갛게 붓고 출혈의 증세가 나타날 수 있지만, 칫솔질을 꼼꼼히 하면 어느 정도 회복이 가능하다. 치은염에서 염증이 더 진행된 것이 치주염인데, 치주염의 경우 구취가 나며 치아와 잇몸 사이에서 고름이 나오고, 저작 시 불편감을 느끼게 된다. 또한, 치아가 흔들리는 증세가 나타날 수 있다.
양치질과 스케일링을 통해 구강 내 세균성 플라그와 치석을 제거하여 세균의 번식에 유리한 환경을 만들지 않는 것이 가장 기본적인 치주질환의 예방 및 치료 방법이다. 또한, 먹는 잇몸 치료약, 양치액, 잇몸과 치아 사이에 넣는 특수 약제, 항생제 등의 약물 치료 방법도 있다.
한편, 치주질환을 예방하거나 치료할 수 있는 효과를 가지는 건강기능식품 및 치료제가 개발되고 있다. 특히, 최근에는 유산균이 구강 내 치주질환 원인균을 억제하여 치주질환 예방에 유효한 것이 보고된 바 있으며(KR 10-1690090 B1), 치주질환균에 대해 보다 우수한 항생활성을 보이는 균주들이 개발되고 있다.
대한민국 등록특허 10-1690090
이에, 본 발명자들은 기존에 치주질환 치료용으로 사용되고 있는 균주 대비 우수한 항생활성을 나타내는 신규한 균주를 연구하던 중, 돼지 소장에서 신규한 락토바실러스 균을 동정하였다. 신규한 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) 균주가 종래 치주질환균을 억제하는 것으로 알려진 KCTC 3594 및 KCTC 3678에 비해 치주질환 원인균에 대하여 더 우수한 항균활성을 가지는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규한 L. reuteri 균주 및 이를 이용한 치주질환 치료제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 제 KCTC13231BP 호로 기탁된 L. reuteri AN417 균주를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 L. reuteri AN417 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 L. reuteri AN417 균주는 종래 치주질환균을 억제하는 것으로 알려진 해외 균주에 비해 공시균, 충치 원인균 및 치주질환 원인균에 대하여 더 우수한 항생활성 및 생육 저해 활성을 나타낸다. 또한, 16S rRNA 서열은 표준균주와 99.67%의 상동성을 나타내는 신규한 균주로 판단되었다. 따라서, L. reuteri AN417 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 조성물은 치주질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a는 평판배지에 배양된 Escherichia coli(E. coli) 균에 대한 L. reuteri 표준 균주 및 L. reuteri AN417 균주의 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 1b는 평판배지에 배양된 Pseudomonas aeruginasa(P. aeruginasa) 균에 대한 L. reuteri 표준 균주 및 L. reuteri AN417 균주의 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 1c는 평판배지에 배양된 Streptococcus mutans(S. mutans) 균에 대한 L. reuteri 표준 균주 및 L. reuteri AN417 균주의 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 2a는 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 치주질환원인균인 포르피로모너스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 대한 L. reuteri 표준 균주 및 L. reuteri AN417 균주의 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 2b는 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 치주질환원인균인 타네렐라 포시덴시스(Tannerella forsythensis)에 대한 L. reuteri 표준 균주 및 L. reuteri AN417 균주의 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 산성 배지(pH 2 및 3)와 0.5% 담즙산(bile acid) 배지에서 L. reuteri 표준 균주 및 L. reuteri AN417 균주의 생존력을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 측면으로, 기탁번호 제 KCTC13231BP 호로 기탁된 L. reuteri AN417 균주를 제공한다.
L. reuteri는 동물의 위장관 및 소장에서 주로 발견되는 락토바실러스속 균이다. 인간을 비롯한 건강한 동물의 출산 채널, 모유, 입에서도 종종 발견된다. L. reuteri는 항생 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 돼지 유래 신규 균주 L. reuteri AN417를 제공한다. 상기 L. reuteri AN417의 기탁번호는 KCTC13231BP 이다.
또한, 본 발명의 일 측면은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, “배양액”이란 L. reuteri AN417 균주를 배양한 후 수득한 배지일 수 있다. 배양액의 수거시기는 미생물 성장곡선 중 지수적 성장기 또는 정체기일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 배양액은 필터링 되어 이용될 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물은 E. coli, P. aeruginasa, S. mutans, P. gingivalis, Tannerella forsythensis 등의 다양한 미생물에 대한 항균 효과를 지니는 조성물일 수 있으며 특히, P. gingivalis, Tannerella forsythensis 등의 치주질환을 일으키는 미생물에 대한 항균 효과를 지니는 조성물일 수 있다.
본 명세서에서, “유효성분”이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또한, 본 발명의 일 측면은 기탁번호 제 KCTC13231BP 호로 기탁된 L. reuteri AN417 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, “치주질환”이란 풍치라고도 불리우며, 치은염과 치주염 등의 치아 주위 치은(잇몸), 치주인대, 골조직을 포함하는 치주조직에 발생한 질환일 수 있다.
본 발명의 "약학적 조성물"은 그 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 국소형 제형 예컨대 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로로에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS)(예컨대 패치제, 붕대 등), 스프레이, 가글 등으로 제조될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산 등을 들 수 있으며 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 “치주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물”은 그 유효성분인 락토바실러스 류테리 AN417 균주 또는 이의 배양액을 치주질환 예방 또는 치료 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 99.900 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 “유효량”이란 증상의 예방, 개선, 치료, 또는 이러한 증상의 발현 지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 특별히 정의되지 아니한 용어는 국어사전적 의미나 당업계에서 일반적으로 통용되는 의미를 따른다.
본 발명의 “항균용 조성물” 및 “치주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물”(이하 “본 발명의 조성물”)은 구체적인 양태에 있어서, 그 제형은 치약, 액상의 구강세정제(mouthwash), 식이성 필름, 마우스 스프레이 또는 츄잉껌 등의 여러 제형을 모두 포함하며, 각각의 조성물은 통상적인 방법으로 제조 가능하다.
본 발명의 치주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 치약으로 제형화 되는 경우, 본 발명의 치약은 L. reuteri AN417 균주 또는 이의 배양액을 포함할 수 있다. 이외에 습윤제, 점증제, 기포제, 보존제, 감미제, 향료 및 기타 성분을 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 L. reuteri AN417 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 “치주질환 예방 또는 개선용 식품 조성물”(이하 “본 발명의 조성물”)은 구체적인 양태에 있어서, 그 제형은 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 건강 보조식품, 식품 첨가제 또는 기능성 음료 등의 여러 제형을 모두 포함하며, 각각의 조성물은 통상적인 방법으로 제조 가능하다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 파악될 경우, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 산제, 정제, 캡슐제 등 형태의 식품 제제류가 될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 시료 채취
정읍 인근 도축장에서 돼지로부터 소장을 채취하여 혐기성 균배양기(anaerobic jar)에 넣고 특정한 혐기 상태를 유지하였다.
실시예 2. L. reuteri 균주의 분리
상기 실시예 1의 돼지 소장으로부터 L. reuteri 균주를 분리하기 위해, 절대 혐기적 MRS 배지를 제조하여 사용하였다. 이때, 혐기적 MRS 배지는 N2를 이용하여 MRS 배지 내에 존재하는 산소를 제거한 후 멸균하여 제조하였다.
실시예 1에서 채취하여 혐기 상태를 유지시킨 돼지 소장 1 g을 100 ㎖의 MRS 배지에 현탁한 후, 37℃에서 1시간동안 진탕 배양(shake culture)하였다. 이후, 단계희석(serial dilution)하였다. 상기 희석액을 MRS 평판배지에 50 μl씩 도말하여 37℃에서 2일동안 혐기 배양한 후, 배지로부터 200개의 L. reuteri 균주를 순수 분리하였다. 상기 분리된 균주를 20%(v/v)의 탈지유(skim milk)에 현탁한 후, -70℃에 보관하여 하기 실험에 사용하였다.
실시예 3. 분리된 L. reuteri 균주의 동정
상기 실시예 2에서 분리된 L. reuteri 균주의 분자생물학적 동정을 위하여, 16S rRNA 유전자를 타겟으로 하는 유니버셜 프라이머인 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC A-3': 서열번호 1)와 1492R (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3': 서열번호 2)을 사용하였다. 직접적인 콜로니 PCR 기법을 사용하여 산물을 얻은 후, 마크로젠에 의뢰하여 L. reuteri 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다. 이때, L. reuteri AN417 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 서열번호 1과 같다.
EZbiocloud(http://www.ezbiocloud.net/)를 통해 상기 분석하여 얻은 염기서열들을 검색하였다. 이후, 확보된 L. reuteri 균주의 유전체 서열 분석을 ㈜천랩에 의뢰하였고, L. reuteri 균주의 확보된 서열을 기존에 보고된 L. reuteri 균주의 서열과 비교하였다. 분석 결과, L. reuteri AN417(Lre417)이 신규한 균주임을 확인하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
ANIb
　 SD2112 I5007 DSM20016 ATCC53608 Lre401 Lre417 ZLR003
SD2112 - 95.33 95.34 95.21 99.98 95.3 95.47
I5007 95.25 - 96.15 99.18 95.27 99.09 99.29
DSM20016 95.43 96.38 - 95.68 95.43 96.35 95.71
ATCC53608 95.4 99.25 95.65 - 95.4 99.38 99.53
Lre401 99.99 95.43 95.39 95.22 - 95.4 95.56
Lre417 95.15 99.14 96.07 99.26 95.16 - 99.19
ZLR003 95.31 99.28 95.71 99.35 95.39 99.03 -
표 1에 나타난 바와 같이, 분리된 L. reuteri AN417 균주(Lre417)는 기존에 보고된 L. reuteri 표준 균주와의 ANI(average nucleotide identity) 값이 95.15 내지 99.26으로 상당한 차이를 보이는 신규한 균주로 확인되었다.
실험예 1. 다양한 병원균에 대한 L. reuteri AN417 균주의 항균활성 분석
상기 실시예 3에서 확보된 신규 L. reuteri AN417 균주의 항균활성을 분석하기 위해, 치주질환균에 대한 우수한 항생활성이 보고된 L. reuteri KCTC 3594와 L. reuteri KCTC 3678을 포함한 L. reuteri 표준 균주를 대조군으로 하여 다양한 병원균에 대한 항균활성을 수행하였다.
공시균으로 널리 사용되는 E. coli, P. aeruginasa 및 충치 원인균인 S. mutans를 각각 105개씩 Nutrient agar 평판배지 (Difico)에 도말하였다. 이후, L. reuteri 표준 균주 및 자체 분리한 L. reuteri 균주의 배양액을 흡수시킨 디스크를 상기 병원균이 도말된 평판 배지 위에 올려놓고, 균주 배양액의 생육저지환의 크기를 비교하였다. 그 결과를 도 1a 내지 도 1c에 나타내었다.
도 1a 내지 도 1c에 나타난 바와 같이, 다른 L. reuteri 균주에 비해 L. reuteri AN417 균주가 E. coli, P. aeruginasa 및 S. mutans 균에 대하여 가장 우수한 항균력을 나타냄을 확인하였다.
실험예 2. 치주질환 원인균에 대한 L. reuteri AN417 균주의 항균활성 분석
L. reuteri AN417 균주의 항균활성을 분석하기 위해, L. reuteri 표준 균주인 L. reuteri KCTC 3594 및 L. reuteri KCTC 3678을 대조군으로 하여 치주질환 원인균에 대한 항균활성을 수행하였다.
L. reuteri 표준 균주 및 L. reuteri AN417 균주의 균체를 0.25um 공극을 가지는 필터로 제거한 배양액에 치주질환 원인균인 Porphyromonas gingivalis KCTC 5352와 Tannerella forsythensis KCTC 5666을 105cells/ml 농도로 접종하였다. 이후, 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 상기 치주질환 원인균에 접종된 L. reuteri 표준 균주와 L. reuteri AN417 균주에 의한 치주질환 원인균의 생육저해효과를 측정하였다. 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.
도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, L. reuteri AN417 균주가 L. reuteri 표준 균주에 비해 치주질환 원인균인 Porphyromonas gingivalis와 Tannerella forsythensis의 생장을 억제하는 항균력이 우수함을 확인하였다.
실험예 3. L. reuteri AN417 균주의 산성 조건 및 담즙산에 대한 안정성 평가
L. reuteri AN417 균주의 활생균(probiotics)으로서의 안정성을 확인하기 위해, 산성 배지 및 0.5% 담즙산 배지에서 L. reuteri AN417 균주의 생존력을 평가하였다.
배양 배지를 pH 2 및 3의 산성 조건으로 하였으며, 첨가하는 담즙산은 최종 농도가 0.5% 가 되도록 하였다. 이후, L. reuteri 표준 균주(KCTC 3594 및 KCTC 3678) 및 L. reuteri AN417 균주를 상기 산성 배지 및 0.5% 담즙산이 첨가된 배지에 각각 접종하였다. 12시간 후, 상기 각 균주들의 생존력을 평가하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, L. reuteri 표준 균주 및 L. reuteri AN417 균주 모두 산성 조건 및 0.5% 담즙산 배지에서 생존함을 확인하였다.
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Claims (9)

  1. 기탁번호 제 KCTC13231BP 호로 기탁된 Lactobacillus reuteri AN417 균주.
  2. 제1항에 따른 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물로서,
    상기 항균용 조성물은 E. coli, P. aeruginasa, S. mutans, P. gingivalis, 또는 Tannerella forsythensis 균주에 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항균용 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 따른 Lactobacillus reuteri AN417 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 치주질환이 치은염 및 치주염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 조성물의 제형이 치약, 구강세정제, 식이성 필름, 마우스 스프레이 및 츄잉껌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제1항에 따른 Lactobacillus reuteri AN417 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 치주질환이 치은염 및 치주염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 조성물의 제형이 기능성 식품, 영양 보조제, 건강식품, 식품 첨가제, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
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