KR102360232B1

KR102360232B1 - 구강질환 예방 또는 개선 효과를 가지는 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102360232B1
Application number: KR1020210039916A
Authority: KR
Inventors: 김석진; 정의천; 임혜지; 이종서
Original assignee: (주)바이오일레븐
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2022-02-09
Anticipated expiration: 2041-03-26

Abstract

본 발명은 구강질환 예방 또는 개선 효과가 우수한 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 상기 락토바실러스 플란타룸 균주는 Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55 균주로서 기탁번호가 KCTC 14454BP인 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

구강질환 예방 또는 개선 효과를 가지는 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이의 용도{Lactobacillus plantarum having effects of preventing or improving oral disease and the use thereof}

본 발명은 구강염증, 치아우식증 및 구취를 포함하는 구강질환 예방, 개선 또는 치료 효과를 가지는 락토바실러스 플란타룸 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

치주질환은 세균에 의해 야기되는 치아지지 조직의 염증상태로서, 출혈, 치주낭의 형성 및 치조골의 파괴 등으로 인하여 치아의 상실을 가져오는 질환이다. 세균의 집락형성, 세균의 치주조직 침투 및 치주조직이 파괴되는 과정으로 진행된다. 특히 red complex 에 속하는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 및 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)와, orange complex 에 속하는 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum) 이 치주질환의 가장 중요한 원인균주이다.

치주조직 파괴와 염증은 그람 음성 혐기성 세균의 대사 산물인 황화수소, 암모니아 및 유독한 아민과 같은 세포 독소와 그람 음성 혐기성 세균의 세포벽 구성분인 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide)와 같은 내독소에 의해 직접 조직이 파괴되거나 또는 생체 면역계를 자극하여 자극된 체액성 및 세포성 면역계의 작용으로인해 세포 외부로 분비된 활성산소, 프로스타글란딘(prostaglandin), 루코트리엔(leukotrien), 히스타민(histamine), 인터루킨(interleukin)등의 다양한 사이토카인에 의해 염증이 유발된다.

염증 반응이 시작되면 염증성 사이토카인인 IL-12는 Th0 세포로부터 Th1 세포로 분화시키고, 대식세포를 활성화시켜 염증반응을 증진시킨다. 이러한 염증은 골을 생성하는 기능은 저하시키고, 골을 흡수하는 기능은 증가시켜 치조골이 점점 소실되고 파괴되어 결국 치아를 상실하게 된다. 반면에 IL-10과 같은 항염증성 사이토카인 생성이 증가되면 조절 T세포(Tregs)를 증가시켜 활성화된 대식세포를 제어해 염증반응을 저하시키고, 건강한 치주 상태를 유지하게 된다.

치아우식증은 입 안에서 서식하는 박테리아에 의해 설탕, 전분 등이 분해되면서 생성된 산에 의해 치아의 법랑질이 손상되어 발생하는 증상을 말한다. 이는 치아의 손상뿐만 아니라 심한 통증, 잇몸 부종, 구취 등을 유발하고 다른 구강질환으로 진행될 수 있으며, 우식으로 인해 벌어진 잇몸 틈사이로 세균이 침입해 2차 감염이 일어날 수도 있다. 치아우식증의 대표적인 원인균으로는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus)가 있으며 치아우식증을 예방하기 위해 상기 언급한 유발균의 생장을 억제, 사멸하는 제품들이 개발되고 있다.

구취는 구강 또는 비강을 통하여 나오는 불쾌한 냄새로 정의되며, 구취의 원인으로는 구강 세균에 의한 음식물 부패와 그 대사산물인 휘발성 황 화합물 때문인 것으로 알려져 있다. 휘발성 황 화합물은 황을 함유하는 시스테인과 메티오닌과 같은 아미노산, 펩타이드 및 단백질 기질 존재 시 혐기성 세균에 의해 생성된다. 시스테인에서 황화수소가 만들어지고 메티오닌에 의해서 메틸머캅탄, 디메틸설파이드가 생성되며 이중 황화수소와 메틸머캅탄이 구취의 주된 원인인자로 90%를 차지한다. 그람 음성 혐기성 세균이 휘발성 황 화합물 생성 능력을 가지며 특히 치주질환 원인 균주로 알려진 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 박테로이데스 폴시튜스(Bacteroides forsythus)가 많은 양의 황화수소와 메틸머캅탄을 생성한다고 보고되고 있다.

구강 세균을 제어하기 위해 항생제, 항균제, 항염제가 사용되고 있다. 그러나, 항생제는 분리된 치주질환 균주에서 내성을 나타낸 사례가 보고되어 심각한 문제가 되고 있다. 항균제는 치아 염색 또는 구강점막의 작열감 등의 부작용을 초래한다. 또한, 불소 화합물이 함유된 구강청결제, 치약 및 가글액 등은 일부 성분에 대한 안전성 이슈와 논란이 보고되고 있다. 구강 내 사각지대에 있는 치주질환 원인균은 억제가 어렵고 유해균의 지속적인 성장으로 인해 이러한 치료제는 일시적인 제어일 뿐이라는 문제가 있다.

따라서 구강염증, 치아우식증 및 구취제거와 같은 구강 질환에 안전하고 효과적인 균주에 대한 연구가 필요한 실정이다.

한국 등록특허 제 10-1681810 호

상기와 같은 배경하에서, 본 발명자들은 하기와 같은 신규 미생물 및 이의 용도를 제공하고자 한다.

본 발명의 일측면은 락토바실러스 속의 균주로 항균 활성이 우수한 신규한 균주 및 이의 제제를 제공하고자 한다. .

본 발명의 목적은 수탁번호 KCTC 14454BP로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 BCC-LPL-55 (Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55) 균주를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 플란타룸 BCC-LPL-55 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 플란타룸 BCC-LPL-55 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 치아우식증의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 플란타룸 BCC-LPL-55 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 구취제거 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 하나의 다른 목적은 상기 락토바실러스 플란타룸 BCC-LPL-55 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 치주질환, 치아우식증 또는 구취 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 해결 수단을 제공한다.

본 발명의 일측면은 구강 유해 미생물에 항균력을 갖는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum ) 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 IL-12의 생성을 감소시키며, IL-10의 생성을 증가시키는 항염 효과가 있는, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 치주질환 예방, 개선 또는 치료 효과가 있는, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 치주질환 유발 미생물인 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia) 및 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)에 항균력이 있는 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 치아우식증 예방, 개선 또는 치료 효과가 있는, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 치아우식증 유발 미생물인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 상귀니스(Streptococcus sanguinis), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 라티(Streptococcus ratti), 스트렙토코커스 크리세티(Streptococcus criceti), 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus) 및 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii) 에 항균력이 있는, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 구취제거 또는 예방 효과가 있는, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 구취 발생 미생물은 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) 및 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)에 항균력이 있는 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16S rRNA를 갖는, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 동일속 동일종의 락토바실러스 플란타룸 KCTC 3108과는 다른 염기서열을 갖는 락토바실러스 플란타룸 BCC-LPL-55인, 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KCTC 14454BP인, 균주를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 치주 질환의 예방, 개선 또는 치료가 필요한 대상에게 치주 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 치아우식증의 예방, 개선 또는 치료가 필요한 대상에게 치아우식증을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는 구취 예방 또는 제거가 필요한 대상에게 구취를 예방 또는 제거하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 하나의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 치주 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 아연을 더 포함하는, 치주 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 건강기능식품 또는 의약품 조성물인, 치주 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 하나의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 치아우식증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 아연을 더 포함하는, 치아우식증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 건강기능식품 또는 의약품 조성물인, 치아우식증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 하나의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 구취 제거 또는 예방용 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 아연을 더 포함하는, 구취 제거 또는 예방용 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 건강기능식품 또는 의약품 조성물인, 구취 제거 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 항염 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 IL-12의 생성을 감소시키며, IL-10의 생성을 증가시키는 항염 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 치주 질환 원인균에 대한 항균 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 치아우식증 원인균에 대한 항균 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 구취 발생 미생물에 대항 항균 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 잇몸 질환 개선 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 치주질환, 치아 우식증 또는 구취제거 개선 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 대한 항균 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)에 대한 항균 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)에 대한 항균 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia)에 대한 항균 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 박테로이데스 폴시튜스(Bacteroides forsythus)에 대한 항균 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)에 대한 항균 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항균 효과가 우수하다.

본 발명의 일측면에 따른 균주 및 이를 포함하는 조성물은 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus)에 대한 항균 효과가 우수하다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.

도 1은 신규 Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55 균주(KCTC 14454BP)의 당 이용성 확인 결과이다.
도 2은 신규 Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55 균주(KCTC 14454BP)의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3는 신규 Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55와 Lactobacillus plantarum KCTC 3108의 서열 간 차이를 나타낸 것이다.
도 4a는 분리된 32균주 중 항염 효과를 가지는 11균주를 도식화한 그래프이고 도 4b는 균주의 IL-12 생성량을, 도 4c는 균주의 IL-10 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 분리된 균주의 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항균효과를, 5b는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 대한 항균효과를, 5c는 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)에 대한 항균효과를 나타낸 그래프이다.

이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 BCC-LPL-55(Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55)균주는 항염 효과를 가지면서, 치주질환 및 치아우식증 유발균에 대한 항균활성을 가지는 바, 치주질환, 치아우식증 또는 구취 예방, 개선, 또는 치료 효과를 제공한다

이하, 본 발명의 다양한 측면에 대하여 설명한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 치주질환 유발 미생물인 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia) 및 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 에 항균력이 있는 균주를 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 균주는 락토바실러스 플란타룸 BCC-LPL-55인, 균주를 제공한다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물인, 치주 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물, 건강기능식품 또는 의약품 조성물일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물인, 치아우식증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물인, 구취 제거 또는 예방용 조성물을 제공한다.

예시적인 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약학 조성물인 것일 수 있다.

상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/ 또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 개선적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 투여제 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다. 상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있으며, 이들 제형은 유효성분 이외에 계면 활성제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

예시적인 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 식품 조성물인 것일 수 있다. 상기 식품 조성물은 액상 또는 고체 상태의 제형일 수 있고, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다. 본 명세서에 개시된 유효성분 외에 함유할 수 있는 액체 성분에는 특별한 제한점이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올 등이 있다. 상기의 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성향미제(예를 들어 사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 명세서에 개시된 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 일 측면에서 약 5 내지 12 g일 수 있다. 상기 식품 조성물은 일 측면에서 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그 염, 알긴산 및 그 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 치약 또는 가글액의 형태로 제공될 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 인간을 대상으로 사용될 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 인간 이외의 동물, 바람직하게 반려동물, 더 바람직하게 개 및 고양이의 구취제거를 위해 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 락토바실러스 플란타룸 BCC-LPL-55 균주의 분리

한국인에게 맞는 신규 균주를 선발하기 위해 건강한 한국인 아기 및 성인의 분변, 모유 등을 시료로 사용하였다. 시료 1g을 멸균 식염수에 10배 연속 희석한 후 희석액 0.1mL를 MRS 고체배지에 도말하여 혐기조건에서 3일간 배양하였다. 생성된 단일 콜로니를 MRS 액체배지에 37℃, 18시간 동안 순수 배양하였다.

실시예 2. 락토바실러스 플란타룸 BCC-LPL-55 균주의 당 이용성

선별된 균주의 당 이용성을 분석하기 위해 API 50 CH kit(BioMerieux, Lyon, France)를 사용하여 49개의 탄소원에 대한 이용성을 확인하였다. MRS 고체배지에서 배양된 균주의 콜로니를 2 MacFarland의 탁도로 조절하여 현탁액을 제조하였다. 탁도를 맞춘 API 50 CHL medium을 API 50CH 스트립 튜브에 120 ㎕씩 분주하고 큐플에 미네랄 오일(mineral oil)을 2 방울씩 첨가하여 37℃에서 24 시간 및 48 시간 동안 배양하여 당 이용 패턴을 확인하였다. 동정 결과는 API web 프로그램(https://apiweb.biomerieux.com) 을 사용하여 확인하였다. 동정결과, 도 1에 표시된 바와 같이 락토바실러스 플란타룸과 99.9% 로 동일함을 나타내었다.

실시예 3. 플란타룸 균주의 동정

1) 16S rRNA 서열 분석

균주의 동정을 위해 Solgent (Daejeon, Korea)에 16S rRNA 서열분석을 의뢰하였다. 균주의 순수배양액 1mL에서 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, 추출된 DNA를 주형으로 16S rRNA 영역을 27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG), 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACTT) primer로 PCR을 수행하여 DNA sequencing (Solgent)을 진행하였다. 염기서열 분석 결과를 토대로 NCBI의 BLAST 상의 Genebank 데이터베이스에 등록된 다른 표준균주와 상동성을 비교하였다.

염기서열 분석 결과 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 신규 균주는 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum JCM 1149와 99.93% 의 상동성을 나타내었다. Mega 7 program을 이용하여 상동성을 분석하고 계통도를 얻었다 (도 2).

2) PCR profiles

균주에서 분리한 DNA를 주형으로 특정 부분의 specific 한 Lactobacillus plantarum primer Forward (CAGATCCATCCGCTCAAACT), Reverse (ACCAACGACTTGACCAGCTT) 를 이용하여 PCR을 수행하였다. 본 발명에 해당되는 균주와 비교분석을 위해 한국생명공학연구원에서 분양받은 Lactobacillus plantarum KCTC 3108을 대조군으로 사용하였고 서열 간 차이를 도 3에 나타내었다.

분석결과, Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55는 Lactobacillus plantarum KCTC 3108의 서열과 차이를 보였으며 기존의 Lactobacillus plantarum과는 다른 신규한 균주임을 확인하였다.

이에 본 발명자는 상기 균주를 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주로 동정하였고, Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55로 명명하여 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2021년 1월 19일자로 기탁하였다 (기탁번호 KCTC 14454BP).

실험예 1. 항염 효과 확인

구강 내 염증의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 균주의 항염 효과를 세포 내 IL-12 및 IL-10 조절 능력을 평가하여 선발하였다.

분리된 균의 항염 효과를 측정하기 위해 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit를 이용하여 실험을 수행하였다. Raw 264.7세포는 10% 우태아혈청(FBS), penicillin(100 IU/mL), streptomycin(100 mg/mL)이 첨가된 DMEM 배지에 배양하였다. 24 well plate에 5 x 10⁵ cells/mL 농도로 Raw 264.7 세포를 분주하였으며, 분주하고 4시간 후 non-serum 및 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지 0.5 mL로 교체해 주었다.

각 균주를 1 x 10⁸CFU/mL 의 농도가 되도록 Raw 264.7 세포 위에 다시 접종하고 lipopolysaccharide(LPS) (1 mg/mL) 1ul 처리한 뒤, 5% CO₂ 존재 하에 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 well에서 조심스럽게 배지를 수거, 원심분리 한 후 상등액을 취한 다음 상등액에 포함된 IL-12 및 IL-10양을 ELISA Kit (Cusabio, USA)를 사용하여 측정하였다.

음성 대조군으로는 균주 미처리군, 양성 대조군으로는 LPS (Lipopolysaccharide, Sigma)를 각각 1 mg /mL의 농도로 처리한 샘플을 사용하였다.

분리균주와 비교분석을 위해 한국생명공학연구원에서 분양받은 Lactobacillus rhamnosus GG KCTC 5033 (LGG로 표기)을 대조군으로 사용하였다. 모든 실험은 3회 반복하였고 평균값을 표준편차(SD)와 함께 도 4에 나타냈다. 또한, 도 4a 내지 도 4c 에 그래프로 제시했다.

항염능을 보이는 32개의 균주 중에서 IL-12를 유의하게 감소시키며, 동시에 IL-10을 유의하게 증가시키는 11개 균주를 선별하였다. 결과는 도 4a에 방사형 그래프로 나타내었다.

염증 반응 시 초기 Th1면역계의 cytokine stimulator인 IL-12 사이토카인은 상기 도 4b에서 확인되듯이, 선발된 11개의 균주 처리 시 LPS를 처리하여 대식세포에서 IL-12 분비를 유도한 군과 비교하였을 때, 최소 75% 내지 100% 정도의 매우 유의한 수준으로 IL-12 분비를 억제시키는 결과가 확인되었다.

이 중 10균주 (BCC-LPL-55, BCC-LF-02, BCC-LCL-02, BCC-STT-02, BCC-LR-08, BCC-LR-12, BCC-LG-12, BCC-LG-18, BCC-LG-19, BCC-LPG-14)는 항염 분야에서 효과가 공지된 LGG (LPS 처리군 대비 80% 감소)보다 더 우수한 수준이었다.

또한, IL-10(Interleukin-10)은 대표적인 항염증성 사이토카인으로 Th2 세포에서 분비된다.

상기 도 4c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 11균주 (BCC-LPL-55, BCC-LF-02, BCC-LCL-02, BCC-STT-02, BCC-LR-08, BCC-LR-12, BCC-LG-01, BCC-LG-12, BCC-LG-18, BCC-LG-19, BCC-LPG-14)는 LPS를 처리하여 대식세포에서 IL-10 분비를 유도한 군보다도 20% 내지 높게는 300% 수준으로 IL-10의 분비를 증가시켰다. 이는 대조군으로 사용된 LGG와 비교하였을 때, 매우 유의한 (p<0.001) 수준이었다.

이러한 사실을 종합하여 볼 때, 본 발명에서 항염능으로 선발된 11균주는 대식세포내에서 염증반응에 영향을 미치는 IL-12및 IL-10을 유의미하게 조절할 수 있는 결과를 보였고, 이는 항염능에 있어 LGG보다 훨씬 우수한 유산균 재료임을 분명하게 입증한다.

실험예 2. 구강 유해 미생물에 대한 항균 효과 확인

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 BCC-LPL-55(Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55)의 균체에 있어, 구강 세균에 대한 항균 활성을 Spot assay 방법을 이용하여 평가하였다.

1)유산균 배양

기존에 구강 세균 억제 효능이 알려진 균주 Weissella cibaria (WC)와 치주질환 항염증 효과가 알려진 Lactobacillus brevis (LB)는 각각 제품으로부터 분리하여 대조군으로 사용하였다. 항염 상위 11균주와 대조군 2균주는 MRS 액체배지에 접종 후 37℃, 18시간 배양하였다.

2) 병원성균 배양

본 실험에서 사용된 균주는 치아우식증과 관련된 균주 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans KCTC 3065)는 한국생명공학연구원에서 분양받아 Brain heart infusion 배지에서 37℃ 48시간 호기 배양하여 사용하였다.

본 실험에서 사용된 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis KCTC 5352)는 한국생명공학연구원에서, 푸조박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum KCOM 1205)은 한국구강미생물자원은행에서 분양 받아 modified Brain heart infusion (5㎍/mL hemin, 1㎍/mL menadione, 0.05% cysteine) 배지에서 37℃ 48시간 혐기 배양하여 사용하였다.

3) 항균 활성

유산균 배양한 후 원심분리하여 상등액을 제거한 뒤, 1X PBS로 1번 균체를 세척한 다음 0.85% saline 용액에 1 x 10⁹CFU/mL수준으로 희석하고, 병원성균은 0.85% saline 용액에 1 x 10⁷CFU/mL수준으로 희석하였다.

20mL씩 분주하여 건조된 MRS 고체배지에 균수가 조정된 병원성 균을 100㎕ 분주하여 스프레더로 도말한 다음 병원성균이 도말된 배지 위에 유산균체 희석액 10㎕를 떨어트려 말린 뒤, 37℃, 48시간 혐기 배양하여 유산균체 주변에 생성된 억제환을 측정하였다.

병원성균에 대한 억제환은 Scan 500 Automatic colony counter(Interscience, France)를 이용하여 촬영 및 측정하여 평가하였다. 항균활성 결과는 도 5에 나타냈다.

Pre-test로서 항염 상위 11균주를 스트렙토코커스 뮤탄스에 대해 항균효과가 있는지 확인하였다. 그 결과, BCC-LR-12, BCC-LR-08, BCC-LPL-55, BCC-LF-02 총 4균주가 항균 활성이 있는 것으로 확인되었다. 선별된 4균주로 포르피로모나스 진지발리스와 푸조박테리움 뉴클레아툼에 대한 항균활성 실험을 진행하였다.

도 5a에서 나타난 바와 같이, BCC-LPL-55 균주가 스트렙토코커스 뮤탄스에 대해 30.1mm의 가장 큰 억제환을 형성하였다. 이는 26.5mm의 억제환을 보인 Lactobacillus plantarum KCTC 3108보다 높은 항균력을 보였다.

도 5b에 나타난 바와 같이, BCC-LPL-55는 포르피로모나스 진지발리스에 대해 18mm의 억제환을 형성하였으며 이는 15.7mm의 억제환을 보인 Lactobacillus plantarum KCTC 3108보다 높은 항균력을 보였다. 또한 BCC-LPL-55는 Weissella cibaria 보다 더 높은 항균활성을 나타내었다. 반면에 Lactobacillus brevis 는 항균활성을 나타내지 않았다.

도 5c에 나타난 바와 같이, 분리 균주들은 푸조박테리움 뉴클레아툼에 대해 Weissella cibaria 보다 더 높은 항균활성을 나타내었다(23mm이상). 특히 BCC-LPL-55는 28.2mm의 가장 큰 억제환을 형성하였다. 이는 24.3mm의 억제환을 보인 Lactobacillus plantarum KCTC 3108보다 높은 항균력을 보였다. 반면에 Lactobacillus brevis 는 항균활성을 나타내지 않았다.

도 5에 나타난 바와 같이, 항균활성 결과, 신규 Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55는 분리된 균주 중에서 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 푸조박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum)에 대해 항균 활성이 가장 우수하였다. 또한 동일속 동일종의 Lactobacillus plantarum KCTC 3108의 항균 결과와 비교했을 때, BCC-LPL-55 균주가 탁월한 항균활성을 보였다.

특히, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대해 60% 이상 항균 활성이 보고된 Weissella cibaria 보다 Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55의 항균력이 더 높았으며 포르피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 푸조박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum)에 대해서도 Weissella cibaria보다 높은 항균 활성이 확인되었다.

분리 균주 중에서 Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55 균주가 구강질환 원인균의 성장을 우수하게 억제하였다.

IL-12 및 IL-10 분비능, 구강 유해균주에 대한 항균활성 실험 결과를 토대로 다기능 구강 유산균으로써 Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55 균주를 최종적으로 선별하였다.

이에, 본원발명의 발명자들은 신규로 분리 및 동정된 Lactobacillus plantarum BCC-LPL-55 균주가 치주질환, 치아우식증 및 구취 원인균을 효과적으로 억제함으로써 치주질환, 치아우식증 및 구취 예방 또는 개선에 유용함을 확인하였다.

한국생명공학연구원

KCTC14454BP

20210119

<110> Bioeleven co., Ltd. <120> Lactobacillus plantarum having effects of preventing or improving oral disease and the use thereof <130> DP-2020-0728 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1448 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 16S rRNA of BCC-LPL-55 <400> 1 aggacgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga acgaactctg gtattgattg 60 gtgcttgcat catgatttac atttgagtga gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggaaa 120 cctgcccaga agcgggggat aacacctgga aacagatgct aataccgcat aacaacttgg 180 accgcatggt ccgagcttga aagatggctt cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg 240 tattagctag atggtggggt aacggctcac catggcaatg atacgtagcc gacctgagag 300 ggtaatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttcca caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt 420 cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga acatatctga gagtaactgt tcaggtattg 480 acggtattta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540 tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg 600 atgtgaaagc cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag 660 aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca 720 gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa 780 acaggattag ataccctggt agtccatacc gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt 840 ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacggccgca 900 aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960 tcgaagctac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatact atgcaaatct aagagattag 1020 acgttccctt cggggacatg gatacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080 gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatta tcagttgcca gcattaagtt 1140 gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1200 tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga 1260 actcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggattgta ggctgcaact 1320 cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt 1380 cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc aaagtcggtg 1440 gggtaacc 1448

Claims

스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 및 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)을 포함하는 구강 유해 미생물에 항균력을 갖고,
IL-12의 생성을 감소시키며, IL-10의 생성을 증가시키는 항염 효과가 있는,
기탁번호가 KCTC 14454BP인 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum ) BCC-LPL-55 균주.
삭제
제1항에 있어서,
상기 균주는 치주질환 예방, 개선 또는 치료 효과가 있는, 균주.
삭제
제1항에 있어서,
상기 균주는 치아우식증 예방, 개선 또는 치료 효과가 있는, 균주.
삭제
제1항에 있어서,
상기 균주는 구취 제거 또는 예방 효과가 있는, 균주.
삭제
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16S rRNA를 갖는, 균주.
제1항, 제3항, 제5항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양물 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 치주 질환의 예방 또는 개선용 조성물.
제10항에 있어서,
상기 조성물은 아연을 더 포함하는, 치주 질환의 예방 또는 개선용 조성물.
제10항에 있어서,
상기 조성물은 건강기능식품인, 치주 질환의 예방 또는 개선용 조성물.
삭제
제1항, 제3항, 제5항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양물 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 치아우식증의 예방 또는 개선용 조성물.
제14항에 있어서,
상기 조성물은 아연을 더 포함하는, 치아우식증의 예방 또는 개선용 조성물.
제14항에 있어서,
상기 조성물은 건강기능식품인, 치아우식증의 예방 또는 개선용 조성물.
삭제
제1항, 제3항, 제5항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양물 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 구취 제거 또는 예방용 조성물.
제18항에 있어서,
상기 조성물은 아연을 더 포함하는, 구취 제거 또는 예방용 조성물.
제18항에 있어서,
상기 조성물은 건강기능식품인, 구취 제거 또는 예방용 조성물.
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