KR102079275B1 - 재조합 미생물 및 그에 대한 용도 - Google Patents
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Abstract
일산화탄소영양성의, 초산생성 미생물은 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산하지 않는다. 이들은 이들 생성물을 만들기 위한 생합성 경로가 없다. 부가하여, 이들은 중간체 (R,R)-2,3-부탄디올을 생산하고, 반면에 MEK 및 2-부탄올의 생산은 중간체 (R,S)-2,3-부탄디올의 생산을 필요로 한다. 그럼에도 불구하고, MEK 및/또는 2-부탄올의 생산은 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에서 핵심 효소를 발현 또는 과발현하도록 적응된 재조합 미생물을 사용하여 달성될 수 있다. 일산화탄소영양성 아세토겐 클로스트리듐 아우토에타노게넘과 같은 이러한 미생물은 CO를 포함하는 기질을 발효할 수 있다. 전반적인 구도는 (R,S)-2,3-부탄디올로부터 2-부탄올의 생산 및 (S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 포함한다. 이들 단계는 MEK 및 2-부탄올 양자의 생산에 관여한다. 이런 발효 방법은, 그렇지 않으면 대기 중으로 방출되고 환경을 오염시키는 산업적 공정으로부터의 일산화탄소를 이용하는 수단을 제공한다.
Description
본 발명은 CO를 포함하는 기질의 미생물 발효에 의해 MEK 및/또는 2-부탄올의 생산을 위한 재조합 미생물 및 방법에 대한 것이다.
2-부탄올은 주로 산업적 용매인 메틸 에틸 케톤(MEK 또는 부타논)에 대한 전구 물질로서, 대규모로 생산되는 유기 화합물이다. 이것은 전형적으로 황산 촉매를 사용하여 수화함에 의해 석유화학 제품(부텐)으로부터 생산된다.
MEK는 연간 1.9%로 성장하는 US$ 20억의 세계적 시장을 갖는 페인트 및 잉크에서 중요한 성분이다. 그의 합성에 있어 중간체로서, 2-부탄올에 대한 수요는 부타논에 대한 수요와 밀접하게 연관되어 진다. 중요하게는, 2-부탄올은 또한 합성 고무, 수지 및 접착제에 사용되는 1,3-부타디엔으로 전환되어 질 수 있다. 1,3-부타디엔에 대한 세계적인 시장은 US$ 190억을 초과하고, 그리고 이것은 연간 2.7%로 성장하고 있다. 에탄올보다 많은 에너지 밀도인 2-부탄올은 또한 연료뿐만 아니라 부타디엔 생산을 위한 전구체로서 잠재적인 용도를 가진다.
알려진 방법보다 하나 이상의 이점을 제공할 수 있는 미생물 발효에 의한 MEK 및/또는 2-부탄올의 생산을 위한 재조합 미생물 및 방법을 제공하는 것 또는 적어도 공공에게 유용한 선택을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명은, 그 중에서도, 일반적으로 CO 및/또는 CO2를 포함하는 기질의 미생물 발효에 의한 MEK 및/또는 2-부탄올의 생산을 위한 방법 및 이러한 방법에서 재조합 미생물의 사용을 제공한다.
제1 측면에서, 본 발명은 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산할 수 있는 일산화탄소영양 초산생성 재조합 미생물 및 임의로 CO를 포함하는 기질의 발효에 의한 하나 또는 그 이상의 기타 생성물을 제공한다.
하나의 특별한 구현예에 있어서, 본 미생물은 재조합 미생물이 유도되는 모 미생물에는 존재하지 않는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에서 하나 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)를 발현하도록 적응되어 진다.
또 하나의 구현예에 있어서, 본 미생물은 재조합 미생물이 유도되는 모 미생물에는 존재하는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에서 하나 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)를 과-발현하도록 적응되어 진다.
일 구현예에 있어서, 본 미생물은 모 미생물에는 존재하지 않는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에서 하나 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)를 발현하고 그리고 모 미생물에는 존재하는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에서 하나 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)를 과-발현하도록 적응되어 진다.
일 구현예에 있어서, 본 미생물은 다음의 하나 또는 그 이상의 을 발현하도록 적응되어 진다:
(R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 촉매하는 효소;
MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올의 전환을 촉매하는 효소; 및
2-부탄올로 MEK의 전환을 촉매하는 효소.
일 구현예에 있어서, 본 미생물은 모 미생물에 존재하는 하나 또는 그 이상의 효소의 활성을 감소하거나 실질적으로 제거하도록 적응되어 진다. 일 구현예에 있어서, 하나 또는 그 이상의 효소는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로의 일 부분이다.
일 구현예에 있어서, 본 미생물은 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 2-부탄올을 생산할 수 있고, 그리고 다음으로부터 선택된 2-부탄올 생합성 경로에 하나 또는 그 이상의 효소를 발현하거나 과발현하도록 적응되어 진다:
(S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제;
디올/글리세롤 디하이드라타제;
알코올 디하이드로게나제; 및,
이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 및 디올/글리세롤 디하이드라타제 또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 결핍하고, 그리고 본 재조합 미생물은 양자의 이들 효소를 발현하도록 적응되어 진다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체를 포함하고 그리고 본 재조합 미생물은 이 효소의 활성을 감소하거나 또는 실질적으로 제거하도록 적응되어 진다.
일 구현예에 있어서, 본 미생물은 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 MEK를 생산할 수 있고, 그리고 다음으로부터 선택된 MEK 생합성 경로에 하나 또는 그 이상의 효소를 발현하거나 과발현하도록 적응되어 진다:
(S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제;
디올/글리세롤 디하이드라타제; 및,
이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 및 디올/글리세롤 디하이드라타제 또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 결핍하고, 그리고 본 재조합 미생물은 양자의 이들 효소를 발현하도록 적응되어 진다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 알코올 디하이드로게나제 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체를 포함하고 그리고 본 재조합 미생물은 이 효소의 활성을 감소하거나 또는 실질적으로 제거하도록 적응되어 진다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체를 포함하고 그리고 본 재조합 미생물은 이 효소의 활성을 감소하거나 또는 실질적으로 제거하도록 적응되어 진다.
일 구현예에 있어서, 본 미생물은 모 미생물에 존재하는 하나 또는 그 이상의 핵산의 발현을 증가하도록 적응되고 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산이 여기서 이전에 언급된 하나 또는 그 이상의 효소 (또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 일 구현예에 있어서, 발현을 증가하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산은 조절 인자이다. 일 구현예에 있어서, 본 조절 인자는 프로모터이다. 일 구현예에 있어서, 본 프로모터는 항시적 프로모터이다. 일 구현예에 있어서, 본 프로모터는 우드-르정달 유전자 클러스터 또는 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나아제 오페론 프로모터를 포함하는 군에서 선택되어 진다.
일 구현예에 있어서, 본 미생물은 모 미생물에는 존재하지 않는 여기서 이전에 언급된 하나 또는 그 이상의 효소 (또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)을 발현하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 일 구현예에 있어서, 본 미생물은 적어도 2 또는 3의 효소(또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)를 인코딩하고 그리고 이를 발현하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 포함한다.
일 구현예에 있어서, 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산은 핵산 컨스트럭트 또는 벡터이고, 하나의 특별한 구현예에 있어서는 어떠한 조합으로 여기서 이전에 언급된 하나 또는 그 이상의 효소를 인코딩하는 플라스미드이다. 일 구현예에 있어서, 본 외인성 핵산은 발현 플라스미드이다.
일 구현예에 있어서, 본 미생물은 모 미생물에 존재하는 하나 또는 그 이상의 핵산의 발현을 증가하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산 및 모 미생물에 존재하지 않는 하나 또는 그 이상의 효소를 발현하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 또 하나의 구현예에 있어서, 본 미생물은 모 미생물에 존재하는 효소의 활성을 감소하거나 또는 실질적으로 제거하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 핵산을 포함한다.
하나의 특별한 구현예에 있어서, 모 미생물은 클로스트리듐 아우토에타노게넘 , 클로스트리듐 이정달리 , 클로스트리듐 라그스달레이 , 클로스트리듐 카복시디보란스 , 클로스트리듐 드라케이 , 클로스트리듐 스칼톨로게네스 , 클로스트리듐 아세티쿰 , 클로스트리듐 포르미코아세티쿰 , 클로스트리듐 매그넘 , 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 , 아세토박테리움 우디이 , 알칼리박컬럼 바치이 , 블라우티아 프로덕타 , 유박테륨 리모섬 , 무렐라 테모아세티카 , 무렐라 테르마토트로피카 , 스포로무사 오바타 , 스포로무사 실바세티카 , 스포로무사 스파에로이데스 , 옥소박터 프펜니기이 , 및 테모아나에로박터 키우비를 포함하는 일산화탄소영양 초산생성 박테리아의 군으로부터 선택된다.
일 구현예에 있어서 모 미생물은 클로스트리듐 아우토에타노게넘 또는 클로스트리듐 이정달리이다. 하나의 특별한 구현예에 있어서, 본 미생물은 클로스트리듐 아우토에타노게넘 DSM23693이다. 또 하나의 특별한 구현예에 있어서, 본 미생물은 클로스트리듐 이정달리 DSM13528(또는 ATCC55383)이다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 다음의 하나 또는 그 이상의 활성을 결핍한다:
(R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 촉매하는 효소;
MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올의 전환을 촉매하는 효소; 및,
2-부탄올로 MEK의 전환을 촉매하는 효소.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 다음의 하나 또는 그 이상을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자를 결핍한다:
(R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 촉매하는 효소;
MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올의 전환을 촉매하는 효소; 및,
2-부탄올로 MEK의 전환을 촉매하는 효소.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제, 디올/글리세롤 디하이드라타제, 및 알코올 디하이드로게나제, 및/또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자를 결핍한다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제, 알코올 디하이드로게나제, 및/또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제, 알코올 디하이드로게나제, 또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하고 그리고 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제, 디올/글리세롤 디하이드라타제, 및/또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자를 결핍한다.
제2 측면에서, 본 발명은 미생물에서 발현될 때 미생물이 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산하는 것을 가능하게 하는 하나 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 본 핵산은 미생물에서 발현될 때 미생물이 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산하는 것을 가능하게 하는 둘 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)를 인코딩한다.
일 구현예에 있어서, 본 핵산은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 효소를 인코딩한다:
(R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 촉매하는 효소;
MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올의 전환을 촉매하는 효소; 및,
2-부탄올로 MEK의 전환을 촉매하는 효소.
일 구현예에 있어서, 본 효소는 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제, 디올/글리세롤 디하이드라타제, 알코올 디하이드로게나제, 및/또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체로부터 선택된다.
일 구현예에 있어서, 본 핵산은 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제, 디올/글리세롤 디하이드라타제, 및/또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 인코딩하는 핵산 서열, 임의의 순서로 포함한다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산은 더욱이 프로모터를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 프로모터는 그의 제어 하에서 유전자의 항시적 발현을 가능하게 한다. 특정 구현예에 있어서, 우드-르정달 클러스터 프로모터가 사용된다. 또 하나의 특별한 구현예에 있어서, 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나아제 오페론 프로모터가 사용된다. 하나의 특별한 구현예에 있어서, 프로모터는 C. 아우토 에타노게넘으로부터 온다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 모 미생물에서 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제, 알코올 디하이드로게나제, 및/또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체의 발현을 감소하거나 제거하도록 적응된 핵산을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 모 미생물에서 발현될 때, (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제, 디올/글리세롤 디하이드라타제, 알코올 디하이드로게나제 및/또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체의 하나 또는 그 이상의 발현을 증가하도록 적응된 핵산을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 제2 측면의 하나 또는 그 이상의 핵산을 포함하는 핵산 컨스트럭트 또는 벡터를 제공한다.
하나의 특별한 구현예에 있어서, 본 핵산 컨스트럭트 또는 벡터는 발현 컨스트럭트 또는 벡터이다. 하나의 특별한 구현예에 있어서, 본 발현 컨스트럭트 또는 벡터는 플라스미드이다.
제4 측면에서, 본 발명은 제2 측면의 하나 또는 그 이상의 핵산 또는 제3 측면의 벡터나 컨스트럭트를 포함하는 숙주 생물을 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제3 측면에 대해서 언급된 바와 같은 발현 컨스트럭트 또는 벡터 및 메틸화 컨스트럭트 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 조성물은 본 발명의 제1 측면에 따른 재조합 미생물을 생산할 수 있다.
하나의 특별한 구현예에 있어서, 발현 컨스트럭트/벡터 및/또는 메틸화 컨스트럭트/벡터는 플라스미드이다.
제6 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면의 재조합 미생물을 사용하여 CO를 포함하는 기질을 발효하는 것을 포함하는 미생물 발효에 의해, MEK 및/또는 2-부탄올 및 임의로 하나 또는 그 이상의 기타 생성물의 생산을 위한 방법을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 본 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 제1 측면의 하나 또는 그 이상의 미생물의 배양물을 함유하는 생물 반응기에 CO를 포함하는 기질을 제공하는 단계; 및
(b) 적어도 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산하기 위해 생물 반응기 안에 배양물을 혐기적으로 발효하는 단계.
일 구현예에 있어서, 본 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a. 가스가 대기 중으로 방출되기 전에, 산업적인 공정의 결과로서 생산된 CO-함유 가스를 포획하는 단계;
b. 본 발명의 제1 측면의 하나 또는 그 이상의 미생물을 함유하는 배양물에 의해 적어도 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산하기 위해 CO-함유 가스를 혐기적으로 발효하는 단계.
본 방법 측면의 특별한 구현예에 있어서, 미생물은 수성 배양 배지에 유지되어 진다.
본 방법 측면의 특별한 구현예에 있어서, 기질의 발효는 생물 반응기에서 일어난다.
바람직하게는, CO를 포함하는 기질은 CO를 포함하는 가스성 기질이다. 일 구현예에 있어서, 기질은 산업적 폐기 가스를 포함한다. 어떤 구현예에 있어서, 본 가스는 제철소 폐기물 또는 합성가스이다.
일 구현예에 있어서, 기질은 전형적으로 적어도 약 20 내지 약 100 부피% CO, 약 20 내지 약 70 부피% CO, 약 30 내지 약 60 부피% CO, 및 약 40 내지 약 55 부피% CO와 같은, CO의 주요 비율을 함유한다. 특정한 구현예에 있어서, 기질은 약 25 부피%, 또는 약 30 부피%, 또는 약 35 부피%, 또는 약 40 부피%, 또는 약 45 부피%, 또는 약 50 부피%, 또는 약 55 부피%, 또는 약 60 부피% CO를 포함한다.
어떤 구현예에 있어서, 본 방법은 더욱이 발효 액체배지로부터 MEK 및/또는 2-부탄올 및 임의로 하나 또는 그 이상의 기타 생성물을 회수하는 단계를 포함한다.
제7 측면에 있어서, 본 발명은 제6 측면의 방법에 의해 생산될 때 MEK 및/또는 2-부탄올을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 미생물이 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 MEK 및/또는 2-부탄올 및 임의로 하나 또는 그 이상의 기타 생성물을 생산할 수 있도록 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 갖는 모 미생물을 형질전환하는 것을 포함하는 본 발명의 제1 측면의 미생물의 생산을 위한 방법을 제공하고, 여기서 모 미생물은 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산할 수 없다.
하나의 특별한 구현예에 있어서, 모 미생물은 모 미생물에 존재하지 않는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에 하나 또는 그 이상의 효소를 발현하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산으로 형질전환된다. 또 다른 구현예에 있어서, 모 미생물은 모 미생물에 존재하는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에 하나 또는 그 이상의 효소를 과발현하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 핵산으로 형질전환된다. 또 다른 구현예에 있어서, 모 미생물은 모 미생물에 존재하지 않는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에 하나 또는 그 이상의 효소를 발현하고 그리고 모 미생물에 자연적으로 존재하는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에 하나 또는 그 이상의 효소를 과발현하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산으로 형질전환된다. 또 다른 구현예에 있어서, 모 미생물은 2-부타논을 2-부탄올로 전환할 수 있는 하나 또는 그 이상의 효소 및/또는 (R)-아세토인을 (R,R)-2,3-부탄디올로 전환할 수 있는 하나 또는 그 이상의 효소의 활성을 감소하거나 또는 실질적으로 제거하도록 형질전환된다. 일 구현예에 있어서, 모 미생물은 하나 또는 그 이상의 효소를 발현하거나 과발현하도록 형질전환되고 그리고 하나 또는 그 이상의 기타 효소의 활성을 감소하거나 또는 실질적으로 제거하도록 형질전환된다.
어떤 구현예에 있어서, 하나 또는 그 이상의 효소는 여기에 이전에 기재된 것과 같다.
어떤 구현예에 있어서, 모 미생물은 여기에 이전에 기재된 것과 같다.
메소-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 효소를 인코딩하는 외인성 핵산 및 디올/글리세롤 디하이드라타제 효소를 인코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 단리된, 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양성의, 초산생성 박테리아가 제공되어 진다. 상기 박테리아는 이들 핵산으로부터 효소를 발현한다. 두 가지 효소가 동일한 박테리아에서 발현될 수 있거나, 또는 이들은 다른 박테리아에서 별도로 존재할 수 있다. 일반적으로 본 박테리아는 천연에서는 효소를 발현하지 않는다. 일부 경우에서, 본 박테리아는 D-(-)2,3-부탄디올 디하이드로게나제 유전자 중 넉아웃 돌연변이를 갖는다. 다른 경우에 있어서, 본 박테리아는 더욱이 디올/글리세롤 디하이드라타제의 재활성화 단백질을 인코딩하는 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 이들은 그의 기질 및/또는 생성물과 장기간 접촉 후 활성을 상실할 수 있는 디하이드라타제의 활성 생명을 연장한다. 전형적으로 본 박테리아는 혐기성 조건 하에서 효소를 발현할 수 있다.
일부 구현예에 있어서, 본 박테리아는 더욱이 그의 알코올 디하이드로게나제 유전자 안에 넉아웃 돌연변이를 포함할 수 있다. 이것은 인코딩된 알코올 디하이드로게나제 효소의 발현을 감소하거나 방지할 수 있다. 이러한 돌연변이는 2-부탄올의 형성을 감소하거나 또는 예방할 것이어서, MEK의 강화를 야기한다. MEK는 발효의 원하는 생성물일 수 있고, 그래서 이 돌연변이는 아주 바람직할 수 있다. 본 박테리아는 일부 구현예에 있어서서 더욱이 그의 D-(-)2,3-부탄디올 디하이드로게나제에 넉아웃 돌연변이를 포함할 수 있다. 이것은 MEK 또는 2-부탄올의 생산에 바람직하지 않은 부탄디올의 이성질체의 형성을 감소 또는 방지할 것이다. 임의로, 본 박테리아는 더욱이 디올/글리세롤 디하이드라타제의 재활성화 단백질을 인코딩하는 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 이것은 메소-2,3-부탄디올로부터 MEK의 생산을 바람직한 수준으로 유지하는데 도움이 될 것이다.
여기에 기술된 발효 및 전환에 유용한 일산화탄소영양성의, 초산생성 박테리아를 형질전환하기 위해 사용될 수 있는 플라스미드가 또한 제공된다. 본 플라스미드는 일산화탄소영양성의, 초산생성 박테리아에서의 리플리케이트일 수 있고, 즉, 이것은 적당한 리플리케이션의 기점을 가질 수 있다. 일부 경우에 있어서, 본 플라스미드는, 비록 어느 하나가 플라스미드 안에 별도로 존재할 수 있더라도, 메소-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 효소를 인코딩하는 핵산 및 디올/글리세롤 디하이드라타제 효소를 인코딩하는 핵산을 포함할 것이다. 상기 플라스미드가 박테리아로 형질전환될 때, 바람직하게는 상기 박테리아는 효소를 발현한다. 대안적으로 이들은, 만일 유도성 프로모터가 발현을 위해 사용되면, 유도될 때에만 발현될 수 있다.
그러한 박테리아 및 플라스미드는 CO 및/또는 CO2를 2-부탄올로 전환하기 위한 공정을 실행하는데 유용하다. 가스성 CO-함유 및/또는 CO2-함유 기질은 위에서 기술된 일산화탄소영양성의, 초산생성 박테리아의 배양물을 함유하는 생물반응기로 통과되어 진다. 본 박테리아는 본 박테리아가 CO 및/또는 CO2를 2-부탄올로 전환하도록 하는 조건 하에서 배양 배지 안에서 성장되어 진다. 부탄올은 연속적 또는 간헐적 방식으로 생물반응기로부터 회수되어 질 수 있다.
위에서 언급된 몇몇 박테리아는 CO 및/또는 CO2를 메틸 에틸 케톤 (MEK)으로 전환하기 위한 공정에 사용하기 위해 잘 적응되어 진다. 위에서 언급된 바와 같이, 본 박테리아는 바람직하게는 알코올 디하이드로게나제의 활성 또는 생산을 감소하거나 약하게 하는 돌연변이를 가질 것이다. 공정에서, 가스성 CO-함유 및/또는 CO2-함유 기질은 적절한 일산화탄소영양성의, 초산생성 박테리아의 배양물을 함유하는 생물반응기로 통과되어 진다. 본 박테리아는 본 박테리아가 CO 및/또는 CO2를 MEK로 전환하도록 하는 조건 하에서 배양 배지 안에서 성장되어 진다. MEK는 연속적으로 또는 간헐적으로, 어떤 알려진 공정을 사용하여 생물반응기로부터 회수되어 질 수 있다. 일부 경우에 있어서, 사용된 박테리아는 부산물의 생산을 감소하기 위해 D-(-)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 유전자 안에 넉아웃 돌연변이를 가질 것이다. 다른 사례에 있어서, 본 박테리아는 더욱이 디올/글리세롤 디하이드라타제의 재활성화 단백질을 인코딩하는 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 이것은 MEK로 메소-2,3-부탄디올의 전환의 단계를 강력하게 유지할 것이다. 일부 경우에 있어서, 본 박테리아는 D-(-)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 유전자 및 디올/글리세롤 디하이드라타제의 재활성화 단백질을 인코딩하는 외인성 핵산 양자에 넉아웃 돌연변이를 가질 것이다.
선정된 박테리아에서 전환 및 발현을 위해 사용될 수 있는 핵산이 또한 제공된다. 하나의 유용한 핵산은 클로스트리듐 아우토에타노게넘에 대해 코돈-최적화된 메소-2,3-부탄디올 디하이드로게나제를 인코딩한다. 또 하나의 유용한 핵산은 클로 스트리듐 아우토에타노게넘에 대해 코돈-최적화된 디올/글리세롤 디하이드라타제를 인코딩한다. 하나의 특정한 실시예에 있어서, 메소-2,3-부탄디올 디하이드로게나제는 클렙시엘라 뉴모니애 메소-2,3-부탄디올 디하이드로게나제2다. 또 하나의 특정한 실시예에 있어서, 핵산은 클렙시엘라 옥시토카 디올/글리세롤 디하이드라타제를 인코딩한다. 또 하나의 특정한 실시예에 있어서, 핵산은 클렙시엘라 옥시토카 디올/글리세롤 디하이드라타제를 인코딩한다. 이들 다양한 인코딩 서열은 하나 또는 그 이상의 플라스미드와 같은 단일 또는 다중 분자 상에 있을 수 있다. 만일 다중 플라스미드가 사용되어 진다면, 그의 리플리케이션의 기점은 바람직하게는 양립가능하게 될 것이다. 핵산은 또한 적절한 박테리오파아지 상에서 수행되어 질 수 있다.
본 발명은 또한 본 출원의 명세서에서 언급되거나 지시된 부분, 요소 및 특징으로, 상기 부분, 요소 및 특징의 둘 또는 그 이상의 어느 것이나 모든 조합에서 개별적으로나 집합적으로 구성되는 것을 광범위하게 언급될 수 있고, 그리고 여기서 특정한 정수가 언급되는 경우 이것은 본 발명이 관련된 기술 분야에서 알려진 균등값을 가지고, 이러한 알려진 균등값은 개별적으로 제시된 것처럼 여기에 합체되어 지는 것으로 간주되어 진다.
본 발명의 전체에 있어 그의 신규한 측면으로 간주되어져야 하는 이들 및 기타 측면들은, 단지 예시적인 방법으로 제공되는, 다음과 같은 첨부하는 도면을 참고로 하여 다음의 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다:
도 1: 2-부탄올 피크를 나타내는 샘플 크로마토그램. 상단 크로마토그램은 배지에 부가된 메소-2,3-부탄디올을 갖는 pddABC를 함유하는 플라스미드를 품은 C. 아우토에타노게넘으로부터의 샘플이다. 하단 크로마토그램은 배지에 부가된 메소-2,3-부탄디올을 갖는 야생형 C. 아우토에타노게넘으로부터의 샘플이다.
도 2: 형질전환된 E. 콜라이 JW1375에서 부탄디올 생산을 조명한 HPLC 프로파일. 주: Y-축은 그래프들 간에서 균등하게 규격화되지 않음. 볼 수 있는 네 개의 피크는 14.3 min에서 초산, 16.2min에서 메소-2,3-부탄디올, 17.0 min에서 (D,L)-2,3-부탄디올, 및 18.9 min에서 에탄올이다. A. 검출되지 않는 메소-2,3-부탄디올, 및 약간의 (D)-2,3-부탄디올을 갖는 pMTL85145-ALS-ALDC-secAdh593으로 JW1375의 프로파일을 나타냄. B. 약간의 (D)-2,3-부탄디올과 함께 생산된 메소-2,3-부탄디올을 갖는 pMTL85145-ALS-ALDC-secAdh593으로 JW1375의 프로파일을 나타냄.
도 3: 4 클론에서 2,3bdh 유전자 파열의 증폭의 확인. 프라이머 Og42f/Of43r을 갖는 375 bp의 PCR 생성물은 비변형된 야생형 2,3-bdh 유전자 (W)를 나타낸다. 동일한 셋트의 프라이머를 사용한 ~2 kb의 PCR 생성물의 증폭은 표적 유전자 내에 ClosTron 그룹 II 인트론의 삽입을 나타낸다. 2,3-bdh 유전자에 대해 표적화된 모든 4 클론은 ~2 kb PCR 생성물 (1-4)의 증폭에 의해 나타난 바와 같이 유전자 파열에 긍정적이다.
도 4: HPLC에 의한 12-웰 플레이트 내에 메소-2,3-부탄디올 생산의 확인. 크로마토그램은 메소-2,3-부탄디올 및 D-(-)-2,3-부탄디올에 대한 피크를 나타냈다. 5.4:1의 비율이 측정되었다.
도 5: 플라스미드 pMTL83155-KpBDH를 품은 C. 아우토에타노게넘의 반응기 주행에 대한 대사물 프로파일. 선택된 점에서, 메소-2,3-부탄디올이 측정되고 성공적으로 검출되었다.
도 6: HPLC에 의해 연속적인 배양물로부터 3 샘플에서 메소-2,3-부탄디올 생산의 확인.
도 7: C. 아우토에타노게넘에서 메소-2,3부탄디올 디하이드로게나제의 발현을 확인하는 증폭 챠트.
도 8: CO로부터 메소-2,3-BDO, MEK 및 2-부탄올의 생산에 대한 경로.
도 9: 메소-2,3-BDO, MEK 및 2-부탄올의 생산에 대한 경로.
도 1: 2-부탄올 피크를 나타내는 샘플 크로마토그램. 상단 크로마토그램은 배지에 부가된 메소-2,3-부탄디올을 갖는 pddABC를 함유하는 플라스미드를 품은 C. 아우토에타노게넘으로부터의 샘플이다. 하단 크로마토그램은 배지에 부가된 메소-2,3-부탄디올을 갖는 야생형 C. 아우토에타노게넘으로부터의 샘플이다.
도 2: 형질전환된 E. 콜라이 JW1375에서 부탄디올 생산을 조명한 HPLC 프로파일. 주: Y-축은 그래프들 간에서 균등하게 규격화되지 않음. 볼 수 있는 네 개의 피크는 14.3 min에서 초산, 16.2min에서 메소-2,3-부탄디올, 17.0 min에서 (D,L)-2,3-부탄디올, 및 18.9 min에서 에탄올이다. A. 검출되지 않는 메소-2,3-부탄디올, 및 약간의 (D)-2,3-부탄디올을 갖는 pMTL85145-ALS-ALDC-secAdh593으로 JW1375의 프로파일을 나타냄. B. 약간의 (D)-2,3-부탄디올과 함께 생산된 메소-2,3-부탄디올을 갖는 pMTL85145-ALS-ALDC-secAdh593으로 JW1375의 프로파일을 나타냄.
도 3: 4 클론에서 2,3bdh 유전자 파열의 증폭의 확인. 프라이머 Og42f/Of43r을 갖는 375 bp의 PCR 생성물은 비변형된 야생형 2,3-bdh 유전자 (W)를 나타낸다. 동일한 셋트의 프라이머를 사용한 ~2 kb의 PCR 생성물의 증폭은 표적 유전자 내에 ClosTron 그룹 II 인트론의 삽입을 나타낸다. 2,3-bdh 유전자에 대해 표적화된 모든 4 클론은 ~2 kb PCR 생성물 (1-4)의 증폭에 의해 나타난 바와 같이 유전자 파열에 긍정적이다.
도 4: HPLC에 의한 12-웰 플레이트 내에 메소-2,3-부탄디올 생산의 확인. 크로마토그램은 메소-2,3-부탄디올 및 D-(-)-2,3-부탄디올에 대한 피크를 나타냈다. 5.4:1의 비율이 측정되었다.
도 5: 플라스미드 pMTL83155-KpBDH를 품은 C. 아우토에타노게넘의 반응기 주행에 대한 대사물 프로파일. 선택된 점에서, 메소-2,3-부탄디올이 측정되고 성공적으로 검출되었다.
도 6: HPLC에 의해 연속적인 배양물로부터 3 샘플에서 메소-2,3-부탄디올 생산의 확인.
도 7: C. 아우토에타노게넘에서 메소-2,3부탄디올 디하이드로게나제의 발현을 확인하는 증폭 챠트.
도 8: CO로부터 메소-2,3-BDO, MEK 및 2-부탄올의 생산에 대한 경로.
도 9: 메소-2,3-BDO, MEK 및 2-부탄올의 생산에 대한 경로.
하기는 일반적인 용어로 제공된 본 발명의 바람직한 구현예를 포함하여 본 발명의 상세한 설명이다. 본 발명은 더욱이 이하에서, 본 발명을 뒷받침하는 실험적 데이터, 본 발명의 다양한 측면의 특정한 실시예, 및 본 발명을 수행하는 수단을 제공하는 "실시예"로 표제되어 그 아래에 제공된 상세한 설명으로부터 명백하게 밝혀진다.
본 발명자들은 CO를 포함하는 기질 상에서 발효에 의해 (R)-아세토인으로부터 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에서 핵심 효소를 발현하거나 또는 과발현하도록 적응된 재조합 미생물을 사용하여 MEK 및/또는 2-부탄올의 생산을 고찰하였다. 이들은 MEK 및 2-부탄올 양자의 생산에서 중간 단계인, (S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환 및 일산화탄소영양성 아세토겐 클로스트리듐 아우토에타노게넘에서 (R,S)-2,3-부탄디올로부터 2-부탄올의 생산을 입증하였다. 이것은 MEK 및/또는 2-부탄올의 생산에 대한 현재의 방법보다 이점을 가질 수 있는 MEK 및/또는 2-부탄올의 생산을 위한 대안적인 수단을 제공한다. 또한, 이것은 그렇지 않으면 대기 중으로 방출되어 환경을 오염시키는 산업적인 과정에서의 일산화탄소를 사용하는 수단을 제공한다.
일산화탄소영양성 초산생성의 미생물은 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산하는 것으로 알려져 있지 않다. 이들은 이들 생성물을 만들기 위한 생합성 경로를 결한다. 부가하여, 이들은 중간체 (R,R)-2,3-부탄디올을 생산하고 반면 MEK 및 2-부탄올의 생산은 중간체 (R,S)-2,3-부탄디올의 생산을 필요로 한다.
비록 본 발명자들이 클로스트리듐 아우토에타노게넘에서 본 발명의 효능을 입증하였지만, 이들은 본 발명이 상기 및 여기서 더 언급되는 바와 같이, 보다 넓은 군의 일산화탄소영양성 초산생성 미생물들 및 CO를 포함하는 기질 상에서 발효에 적용할 수 있다는 것을 고려하였다.
여기서 언급된 바와 같이, "발효 액체배지"는 적어도 영양소 배지 및 박테리아 세포를 포함하는 배양 배지이다.
여기서 언급된 바와 같이, "셔틀 미생물"은 메틸트랜스퍼라제 효소는 발현되고 목적 미생물과는 구별되는 미생물이다.
여기서 언급된 바와 같이, "목적 미생물"은 발현 컨스트럭트/벡터 상에 포함된 유전자는 발현되고 셔틀 미생물과는 구별되는 미생물이다.
용어 "주요 발효 생성물"은 최고 농도 및/또는 수율로 생산된 일 발효 생성물을 의미하기 위한 것으로 의도된다.
발효 과정에 관계하여 사용될 때, 용어들 "증가하는 효능", "증가한 효능" 등은, 여기에 한정되는 것은 아니지만, 발효를 촉매하는 미생물의 성장의 비율, 상승된 생성물 농도로 성장 및/또는 생성물 생산 비율, 소비된 기질의 부피당 생산된 원하는 생성물의 부피, 원하는 생성물의 생산의 비율 또는 생산 수준 및 발효의 기타 부산물과 비교하여 생산된 원하는 생성물의 상대적인 비율의 어느 하나 또는 그 이상을 증가하는 것을 포함한다.
어구 "일산화탄소를 포함하는 기질" 및 유사한 용어들은 일산화탄소가, 예를 들어 성장 및/또는 발효를 위한 하나 또는 그 이상의 박테리아 균주에 이용가능한 어떤 기질을 포함하는 것으로 이해되어 져야 한다.
어구 "일산화탄소를 포함하는 가스성 기질" 및 유사한 어구들 및 용어들은 어떤 수준의 일산화탄소를 함유하는 어떤 가스를 포함한다. 어떤 구현예에 있어서 기질은 적어도 약 20부피% 내지 약 100부피% CO, 20부피% 내지 70부피% CO, 30부피% 내지 60부피% CO, 및 40부피% 내지 55부피% CO를 함유한다. 특정한 구현예에 있어서, 기질은 약 25부피%, 또는 약 30부피%, 또는 약 35부피%, 또는 약 40부피%, 또는 약 45부피%, 또는 약 50부피% CO, 또는 약 55부피% CO, 또는 약 60부피% CO를 포함한다.
비록 CO를 포함하는 기질이 수소를 포함하는 것을 필요로 하지는 않지만, H2의 존재는 본 발명의 방법에 따른 생성물 형성에 해롭지 않아야 한다. 특정한 구현예에 있어서, 수소의 존재는 알코올 생산의 개선된 전반적인 효율을 초래한다. 예를 들면, 특정한 구현예에 있어서, 기질은 대략 2:1, 또는 1:1, 또는 1:2 비율의 H2:CO를 포함할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 기질은 약 30부피% 이하 H2, 20부피% 이하 H2, 약 15부피% 이하 H2 또는 약 10부피% 이하 H2를 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 기질 스트림은 저농도의 H2, 예를 들면, 5% 미만, 또는 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만, 또는 1% 미만을 포함하거나, 또는 실질적으로 수소가 없다. 기질은 또한, 예를 들면, 약 1부피% 내지 약 80부피% CO, 또는 1부피% 내지 약 30부피% CO2와 같은 약간의 CO2를 함유할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 기질은 약 20부피% 또는 그 미만 CO2를 포함한다. 특정한 구현예에 있어서, 기질은 15부피% 또는 그 미만 CO2, 10부피% 또는 그 미만 CO2, 5부피% 또는 그 미만 CO2를 포함하거나 또는 실질적으로 CO2를 포함하지 않는다.
다음의 상세한 설명에 있어서, 본 발명의 구현예는 "CO를 함유하는 가스성 기질"을 전달하고 발효하는 관점에서 기술되어 진다. 그러나, 가스성 기질은 대안적인 형태로 제공되어 질 수 있다는 것이 인정되어 져야 한다. 예를 들면, CO를 함유하는 가스성 기질은 액체에 용해되어 제공될 수 있다. 본질적으로, 액체는 일산화탄소 함유 가스로 포화되고 그런 다음 그 액체는 생물반응기에 부가된다. 이것은 표준 방법론을 사용하여 달성될 수 있다. 예로써, 마이크로기포 분산 발전기(Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October, 2002)가 사용될 수 있다. 부가적인 예로서, CO를 함유하는 가스성 기질은 고형 지지체 상에 흡착될 수 있다. 이러한 대안적인 방법은 용어 "CO를 함유하는 기질" 등의 사용에 의해 포괄되어 진다.
본 발명의 특정한 구현예에 있어서, CO-함유 가스성 기질은 산업적 방출 또는 폐기 가스이다. "산업적 폐기 또는 방출 가스"는 산업적 과장에 의해 생산된 CO를 포함하는 어떤 가스를 포함하는 것으로 광범위해 취해져야 하고 그리고 철 금속 생성물 제조, 비-제1철 생성물 제조, 석유 정제 공정, 석탄의 가스화, 바이오매스의 가스화, 전력 생산, 카본블랙 생산, 및 코크 제조의 결과로서 생산된 가스를 포함한다. 부가적인 예는 여기의 다른 곳에서 제공될 수 있다.
내용이 달리 요구하지 않는다면, 여기서 사용된 것으로 어구 "발효하는", "발효 공정" 또는 "발효 반응" 등은 공정의 성장 상태 및 생성물 생합성 상태 양자를 포괄하기 위한 것으로 의도된다. 여기에서 부가적으로 기재되는 바와 같이, 일부 구현예에 있어서, 생물반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 발효 반응에 금속 또는 조성물의 부가는 이들 반응기의 어느 하나 또는 양자에 부가를 포함하는 것으로 이해되어 져야 한다.
용어 "생물 반응기"는 연속적 교반 탱크 반응기 (CSTR), 고정 세포 반응기 (ICR), 트리클 층 반응기 (TBR), 버블 컬림, 가스 리프트 발효조, 정적 혼합기를 포함하는 하나 또는 그 이상의 베셀 및/또는 타워 또는 배관 배열, 또는 가스-액체 접촉에 적절한 기타 베셀 또는 기타 장치로 구성된 발효 장치를 포함한다. 일부 구현예에 있어서, 생물반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 생물반응기 또는 발효 반응에 기질의 부가를 언급할 때, 이것은 적절한 경우에 이들 반응기의 하나 또는 양자에 부가를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"외인성 핵산"은 이들이 도입되는 미생물의 외부에 유래하는 핵산이다. 외인성 핵산은, 여기에 한정되는 것은 아니지만, 이들이 도입되어 지는 미생물, 이들이 도입되거나 또는 이들이 인공적으로 또는 재조합으로 창제될 수 있는 유기체와 다른 미생물의 균주 또는 종을 포함하는 어떤 적절한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 외인성 핵산은 이들이 도입되어 지는 미생물 내에 이미 존재하는(단지 예로써, 천연적으로) 핵산 서열을 나타내고, 그리고 이들은 특정한 유전자를 발현하거나 또는 과발현하도록 도입된다(예를 들면, 서열(예를 들면, 유전자)의 복제 수를 증가함에 의해, 또는 발현을 증가하기 위해 강한 또는 항시적 프로모터를 도입함에 의해). 또 하나의 구현예에 있어서, 외인성 핵산은 이들이 도입되어 지는 미생물 내에 정상적으로(단지 예로써, 천연적으로) 존재하지 않는 핵산 서열을 나타내고, 그리고 미생물 내에 존재하지 않는 생성물의 발현 또는 미생물 (예를 들면, 프로모터와 같은 조절 인자의 도입의 경우에) 내에 이미 존재하는(단지 예로써, 원상태 유전자) 유전자의 증가된 발현을 허용한다. 외인성 핵산은 이것이 도입되어 지거나 또는 엑스트라-염색체 상태에 유지되는 미생물의 게놈 안으로 합체되도록 적응되어 질 수 있다.
본 발명은 그의 서열이 여기에 특이적으로 예시된 서열로부터 변하고 이들이 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 핵산을 사용하여 실행되어 질 수 있다고 인정되어 져야 한다. 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 대해, 이것은 인코딩된 단백질 또는 펩티드가 실질적으로 동일한 기능을 가진다는 것을 의미한다. 프로모터 서열을 나타내는 핵산 서열에 대해, 변이체 서열은 아나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 개시하는 능력을 가질 것이다. 이런 핵산은 여기서는 "작용성으로 동등한 변이체"로서 언급되어 질 수 있다. 예로써, 핵산의 작용성으로 동등한 변이체는 대립유전자 변이체, 유전자의 절편, 돌연변이(결실, 삽입, 뉴클레오티드 치환 등) 및/또는 다형성 등을 포함하는 유전자를 포함한다. 다른 미생물로부터의 상동 유전자가 또한 여기에 특이적으로 예시된 서열의 작용성으로 동등한 변이체의 예로서 간주되어 질 수 있다. 이들은, 그의 세부사항을 유전자은행 또는 NCBI와 같은 웹사이트 상에서 공공적으로 이용할 수 있는, 클로스트리듐 sp ., 클로스트리듐 이정달리 , 클로스트리듐 부티리쿰 , 클로스트리듐 diolis , 로세부리아 이눌리니보란스 , 클렙시엘라 옥시토카 , 살모넬라 엔테리카 , 사이토박터 코세리 , 클렙시엘라 뉴모니애 및 에스케리치아 콜리와 같은 종에서 상동 유전자를 포함한다. 어구 "작용성으로 동등한 변이체"는 또한 특정한 유기체에 대해 코돈 최적화의 결과로서 그의 서열이 변하는 핵산을 포함하도록 하여야 한다. 여기서 핵산의 "작용성으로 동등한 변이체"는 바람직하게는 적어도 대략 70%, 바람직하게는 대략 80%, 더 바람직하게는 대략 85%, 바람직하게는 대략 90%, 바람직하게는 대략 95% 또는 그 이상의 동정된 핵산과 핵산 서열 동일성을 가질 것이다.
또한 본 발명은 그의 서열이 여기에 특이적으로 예시된 서열로부터 변하는 폴리펩티드를 사용하여 실행되어 질 수 있다고 인정되어 져야 한다. 이들 변이체는 여기서는 "작용성으로 동등한 변이체"로서 언급되어 질 수 있다. 단백질 또는 펩티드의 작용성으로 동등한 변이체는 동정된 단백질 또는 펩티드와 적어도 40%, 바람직하게는 50%, 바람직하게는 60%, 바람직하게는 70%, 바람직하게는 75%, 바람직하게는 80%, 바람직하게는 85%, 바람직하게는 90%, 바람직하게는 95% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 공유하고 그리고 대상 펩티드 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 가지는 이들 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 이러한 변이체는 절편이, 결실이 1 내지 5, 내지 10, 내지 15, 내지 20, 내지 25 아미노산에 있을 수 있고, 그리고 폴리펩티드의 어느 하나의 말단에서 잔기 1로부터 25로 신장할 수 있고, 그리고 결실이 영역 내에서 어떠한 길이로 될 수 있거나; 또는 내부 위치에 있을 수 있는 폴리펩티드의 끝이 잘린 형태를 포함하는 단백질 또는 펩티드의 그의 범위 절편 내에 포함한다. 여기서 특정된 폴리펩티드의 작용성으로 동등한 변이체는 또한, 예를 들어 이전의 단락에서 예시된 바와 같은, 다른 종의 박테리아 내에 상동 유전자에 의해 발현된 폴리펩티드를 포함하는 것으로 되어야 한다.
여기서 사용된 바와 같은 "실질적으로 동일한 기능"은 핵산 또는 폴리펩티드가 이것이 변이체인 핵산 또는 폴리펩티드의 기능을 수행할 수 있다는 것을 의미하기 위해 의도되어 진다. 예를 들면, 본 발명의 효소의 변이체는 그 효소와 동일한 반응을 촉매할 수 있을 것이다. 그러나, 변이체가 그것이 변이체인 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 수준의 활성을 가지는 것을 의미하는 것으로 되지는 않아야 한다.
어떠한 수의 알려진 방법을 사용하여 작용성으로 동등한 변이체가 그것이 변이체인 핵산 또는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 기능을 가지는 가에 대해 평가할 것이다. 그러나, 예로써, 「Bi℃hem . Biophys . Res . Commun ., 1976, 69: 475-80」, 「Arch . Bi℃hem . Biophys . 1986: 245: 144-52」, 또는 「J. Bacteriol, 1993, 175: 5079-5105」에 개괄된 방법이 각각 알코올 디하이드로게나제, 디올/글리세롤 디하이드라타제, (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제, 및 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제의 활성을 측정하기 위해 사용되어 질 수 있다.
본 발명과 관련하여 사용된 때, "과-발현하다", "과 발현" 및 이와 같은 용어들 및 어구는 동일한 조건 하에서 모 미생물의 단백질(하나 또는 그 이상의 핵산을 포함)의 발현 수준에 비교하여 하나 또는 그 이상 단백질(하나 또는 그 이상의 단백질을 인코딩하는 하나 또는 그 이상 핵산 포함)의 발현에서의 어떠한 증가를 포함하는 것으로 광범위하게 되어야 한다. 이것은 단백질(하나 또는 그 이상의 핵산을 포함)이 어떠한 특정한 수준으로 발현되어 지는 것을 의미하는 것으로 되어서는 않된다.
"모 미생물"은 본 발명의 재조합 미생물을 발생하기 위해 사용된 미생물이다. 모 미생물은 천연적으로 발생한 것(즉, 야생형 미생물) 또는 미리 변형되었지만 본 발명의 하나 또는 그 이상의 대상 효소를 발현 또는 과-발현하지 않는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 미생물은 모 미생물에서 발현되거나 또는 과-발현되지 않는 하나 또는 그 이상의 효소를 발현하거나 또는 과-발현하도록 변형되어 진다.
용어들 핵산 "컨스트럭트" 또는 "벡터" 및 이와 같은 용어는 유전적 물질을 세포 안으로 전이하기 위한 비히클로 사용하기에 적절한 어떠한 핵산(DNA 및 RNA 포함)을 포함하도록 광범위하게 되어야 한다. 용어들은 플라스미드, 바이러스(박테리오파아지 포함), 코스미드 및 인공 염색체를 포함하도록 되어야 한다. 컨스트럭트 또는 벡터는 하나 또는 그 이상의 조절 인자, 리플리케이션의 기점, 다중 클로닝 사이트 및/또는 선별 마커를 포함할 수 있다. 하나의 특별한 구현예에 있어서, 컨스트럭트 또는 벡터는 컨스트럭트 또는 벡터에 의해 인코딩된 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 가능하도록 적응된다. 핵산 컨스트럭트 또는 벡터는 네이키드 핵산뿐만 아니라 세포에 전달을 용이하게 하기 위한 하나 또는 그 이상의 제제로 제형된 핵산(예를 들면, 리포좀-접합된 핵산, 핵산이 그 안에 함유되어 진 유기체)을 포함한다.
"메소-2,3-부탄디올 생합성 경로"는 메소-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 가능하게 하는 효소 경로이다. 예로써, 본 경로는 (R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환의 단계를 포함할 수 있다. 예로써, (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제는 (R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 촉매할 수 있고 그리고 디올/글리세롤 디하이드라타제는 MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올의 전환을 촉매할 수 있다(도 8 및 9).
"MEK 생합성 경로"는 MEK로 (R)-아세토인의 전환을 가능하게 하는 효소 경로이다. 예로써, 본 경로는 (R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인 및 MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올의 전환의 단계를 포함할 수 있다. 예로써, (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제는 (R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 촉매할 수 있고 그리고 디올/글리세롤 디하이드라타제는 MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올의 전환을 촉매할 수 있다(도 8 및 9).
"2-부탄올 생합성 경로"는 2-부탄올로 (R)-아세토인의 전환을 가능하게 하는 효소 경로이다. 예로써, 본 경로는 (R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인, MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올 및 2-부탄올로 MEK의 전환의 단계를 포함할 수 있다. 예로써, (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제는 (R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 촉매할 수 있고, 디올/글리세롤 디하이드라타제는 MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올의 전환을 촉매할 수 있고, 그리고 알코올 디하이드로게나제는 2-부탄올로 MEK를 촉매할 수 있다(도 8 및 9).
문맥상 명확히 달리 요구하지 않는다면, MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에서의 효소에 대한 참조는 임의의 하나 또는 그 이상의 효소의 서브유닛에 대한 참조를 포함하는 것으로 되어야 한다. 단지 예로써, 프로판디올/글리세롤 디하이드라타제는 3 서브유닛을 포함할 수 있다.
"디올/글리세롤 디하이드라타제"에 대한 참조는 디올 디하이드라타제 및 별도로 글리세롤 디하이드라타제에 대한 참조를 포함하는 것으로 되어야 한다. 이것은 단일 효소가 양자 활성을 가지는 것을 의미하는 것으로 되어야 한다. 하나의 특별한 구현예에 있어서, 디올/글리세롤 디하이드라타제는 프로판디올/글리세롤 디하이드라타제이다.
어떤 구현예에 있어서, 본 발명은 어떤 효소의 활성을 감소하거나 또는 실질적으로 제거하는 것을 포함한다. 예를 들면, 일산화탄소영양성 아세토겐은 천연적으로 (R)-아세토인을 (R,R)-2,3-부탄디올로 전환할 수 있고(효소 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제를 사용함), 반면에 MEK 및 2-부탄올의 생산을 위해, (R,S)-2,3-부탄디올의 생산이 필요로 된다. (R,R)-2,3-부탄디올의 생산을 감소하는 것은 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산하기 위한 발효의 효율을 증가하는데 도움이 될 수 있다. 유사하게, 일산화탄소영양 아세토겐은 천연적으로 MEK를 2-부탄올로 전환할 수 있다(예를 들면, 알코올 디하이드로게나제를 사용함). 이것은 2-부탄올의 생산에 도움이 될 수 있지만, 그러나 회수할 수 있는 MEK의 양을 감소할 수 있다. 알코올 디하이드로게나제의 활성을 감소하는 것은 발효로부터 회수될 수 있는 MEK의 양을 증가하는데 도움이 될 수 있다.
효소의 활성을 "감소 또는 실질적으로 제거한다"는 효소의 활성의 수준에서의 어떠한 감소를 포함하는 것으로 광범위하게 되어야 한다. 이것은 효소의 발현 및/또는 활성을 파괴하는 유전적 변형을 포함할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 하나 또는 그 이상의 유전적 변형은 효소를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자를 파괴하거나 또는 넉아웃한다. 일 구현예에 있어서, 하나 또는 그 이상의 유전적 변형은 효소의 발현 또는 활성을 위해 필요한 화합물의 활성을 파괴한다. 일 구현예에 있어서, 하나 또는 그 이상의 유전적 변형은 효소의 발현 또는 활성을 저해하는 하나 또는 그 이상의 화합물의 발현 또는 활성을 증가한다.
본 발명에 따라 유전자, 효소의 발현 또는 활성을 "파괴하는 유전적 변형(그리고 유사한 용어)는 효소가 촉매하는 생성물의 생합성을 적어도 감소하는 어떤 유전적 변형을 포함하는 것으로 광범위하게 되어야 한다. 본 어구는 예를 들면 다음을 포함하는 것으로 되어야 한다: 유전자의 발현에 관계된 유전적 조절 인자에 대한 변형을 포함하는, 효소를 인코딩하는 유전자에 대한 변형; 효소의 활성을 감소하거나 저해하는 단백질을 생산하는 핵산의 도입; 유전자의 발현을 차단하도록 적응된 핵산을 발현하는 핵산의 도입(예를 들면, asRNA (안티센스 RNA), siRNA (소형 개재 RNA), CRISPR (군집형태의 규칙적으로 공간 사이의 짧은 회귀성 반복)); 단백질을 인코딩하는 유전자에 대한 변형을 도입함에 의해 효소의 발현 또는 활성을 위해 필요로 되는 단백질을 감소 또는 저해하는 것. 효소의 발현 또는 활성을 위해 필요로 되는 단백질은 유전자 또는 하나 또는 그 이상의 효소 상에 직접적으로 작용할 수 있거나, 또는 다른 화합물을 통해 간접적으로 작용할 수 있는 것으로 인정되어야 한다. 유사하게, 효소의 활성 또는 발현을 감소 또는 저해하는 단백질은 효소의 유전자 상에 직접적으로 작용할 수 있거나, 또는 다른 화합물을 통해 간접적으로 작용할 수 있다.
"유전적 변형"은, 예를 들면, 미생물에 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 도입하는 것, 유전적 사이트에 돌연변이를 도입하는 것, 게놈으로부터 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 제거 또는 부가하는 것, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 상이한 뉴클레오티드로 치환, 유전자의 치환, 유전자의 제거, 유전자의 부가 등을 포함하는 것으로 광범위하게 되고 의도되어야 한다.
메소-2,3-부탄디올은 (R,S)- 및 (S,R)-2,3-부탄디올을 포함한다. (R,R)-2,3-부탄디올은 D-(-)-2,3-부탄디올이다. (S,S)-2,3-부탄디올은 L-(+)-2,3-부탄디올이다. (R)-아세토인은 D-아세토인이다. (S)-아세토인은 L-아세토인이다.
미생물
여기 이전에 기술된 바와 같이, 본 발명은 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 MEK 및/또는 2-부탄올, 및 임의로 하나 또는 그 이상의 기타 생성물을 생산할 수 있는 재조합 미생물을 제공한다.
하나의 특별한 구현예에 있어서, 미생물은 이것이 유도된 모 미생물에는 존재하지 않는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에 하나 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 드 이상의 서브유닛)를 발현하도록 적응되어 진다. 또 하나의 구현예에 있어서, 미생물은 모 미생물에 존재하는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에 하나 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 드 이상의 서브유닛)를 과-발현하도록 적응되어 진다. 일 구현예에 있어서, 미생물은 모 미생물에는 존재하지 않는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에 하나 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 드 이상의 서브유닛)를 발현하고 그리고 모 미생물에 존재하는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에 하나 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 드 이상의 서브유닛)를 과-발현하도록 적응되어 진다. 일 구현예에 있어서, 미생물은 모 미생물에 존재하는 하나 또는 그 이상의 효소의 활성을 감소하거나 실질적으로 제거하도록 적응되어 진다. 일 구현예에 있어서, 하나 또는 그 이상의 효소는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로의 일부이다. 하나 또는 그 이상의 효소의 활성을 파괴하는 것, 하나 또는 그 이상의 효소를 과발현하는 것 및 하나 또는 그 이상의 효소를 도입하는 것의 조합이 본 발명에서 사용되어 질 수 있다고 인정되어 져야 한다.
일 구현예에 있어서, 미생물은 다음의 하나 또는 그 이상을 발현 또는 과발현하도록 적응되어 진다:
(R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 촉매하는 효소;
MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올의 전환을 촉매하는 효소; 및,
2-부탄올로 MEK의 전환을 촉매하는 효소.
일 구현예에 있어서, (R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 촉매하는 효소는 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 (EC 1.1.1.B20 또는 EC1.1.1.76) 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체이다. 일 구현예에 있어서, MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올의 전환을 촉매하는 효소는 디올/글리세롤 디하이드라타제(EC 4.2.1.28/4.2.1.30) 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체이다. 일 구현예에 있어서, 2-부탄올로 MEK의 전환을 촉매하는 효소는 알코올 디하이드로게나제 (EC 1.1.1.2) 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에 있어서, 미생물은 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 2-부탄올을 생산할 수 있고 그리고 다음으로부터 선택된 2-부탄올 생합성 경로에서 하나 또는 그 이상의 효소를 발현 또는 과발현하도록 적응되어 진다:
(S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제(EC 1.1.1.B20 또는 EC1.1.1.76);
디올/글리세롤 디하이드라타제(EC 4.2.1.28/4.2.1.30);
알코올 디하이드로게나제(EC 1.1.1.2); 및,
이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 (EC 1.1.1.B20 또는 EC1.1.1.76) 및 디올/글리세롤 디하이드라타제 (EC 4.2.1.28/4.2.1.30) 또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 결하고 그리고 재조합 미생물은 이들 효소 양자를 발현하도록 적응되어 진다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 (EC 1.1.1.4) 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체를 포함하고 그리고 재조합 미생물은 이 효소의 활성을 감소 또는 실질적으로 제거하도록 적응되어 진다.
일 구현예에 있어서, 미생물은 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 MEK를 생산할 수 있고 그리고 다음으로부터 선택된 MEK 생합성 경로에서 하나 또는 그 이상의 효소를 발현 또는 과발현하도록 적응되어 진다:
(S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 (EC 1.1.1.B20 또는 EC1.1.1.76);
디올/글리세롤 디하이드라타제 (EC 4.2.1.28/4.2.1.30); 및,
이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 (EC 1.1.1.B20 또는 EC1.1.1.76) 및 디올/글리세롤 디하이드라타제 (EC 4.2.1.28/4.2.1.30) 또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 결하고 그리고 재조합 미생물은 이들 효소 양자를 발현하도록 적응되어 진다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 알코올 디하이드로게나제 (EC 1.1.1.2) 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체를 포함하고 그리고 재조합 미생물은 이 효소의 활성을 감소 또는 실질적으로 제거하도록 적응되어 진다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 (EC 1.1.1.4) 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체를 포함하고 그리고 재조합 미생물은 이 효소의 활성을 감소 또는 실질적으로 제거하도록 적응되어 진다.
미생물은 예를 들면, 미생물 내에 원상태 유전자의 발현을 증가하는 것(예를 들면, 유전자의 발현을 유도하기 위해 보다 강력한 또는 항시적 프로모터를 도입함에 의해), 효소를 발현하도록 적응된 및 인코딩하는 외인성 핵산을 도입함에 의해 특정한 효소를 인코딩하는 유전자의 복제 수를 증가하는 것, 모 미생물 내에 존재하지 않는 효소를 발현하도록 적응된 및 인코딩하는 외인성 핵산을 도입하는 것을 포함하는 재조합 방법의 어떤 수에 의해 하나 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)를 발현 또는 과-발현하도록 적응되어 질 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 모 미생물은 모 미생물에서 원상태인 하나 또는 그 이상의 유전자(자연적으로 존재하는 또는 이전에 형질전환되어 존재되는 것을 포함)의 증가된 또는 과-발현과 모 미생물에 대해 원상태가 아닌 하나 또는 그 이상의 유전자의 도입의 조합을 제공하기 위해 형질전환되어 질 수 있다. 예를 들면, MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에서 하나 또는 그 이상의 효소를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자는 모 미생물에 대해 원상태일 수 있지만, 그러나 경로 중에 하나 또는 그 이상의 다른 효소를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 다른 유전자를 포함하지 않을 수 있다. 미생물은, 예를 들면 원상태 알코올 디하이드로게나제를 과-발현하도록 조작될 수 있고 그리고 (R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환 및 MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올의 전환을 위한 하나 또는 양자 효소를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산을 도입하기 위해 조작되어 질 수 있다. 숙련된 사람은 본 발명에서 다양한 기타 조합의 사용을 인식할 것이다.
추가 구현예에 있어서, 본 발명의 미생물은 알코올 디하이드로게나제 및 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제의 하나 또는 둘 모두의 활성을 감소하고나 또는 실질적으로 제거하는 유전자 맞춤 변형을 도입함에 의해 그의 모 미생물로부터 더욱 변형되어 질 수 있다. MEK의 생산이 바람직한 경우, 양자 효소 활성의 감소가 바람직하다. 2-부탄올의 생산이 바람직한 경우, 단지 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 활성만이 감소되어 진다. (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제의 활성의 감소 또는 실질적으로 제거는 필수적이지는 않지만, 일 구현예에 있어서 그것이 바람직하다.
단지 예로써, (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제에 대한 예시적인 아미노산 및 핵산 서열 정보는 클렙시엘라 뉴모니애로부터 H6VRF2 및 AFB82681.1의 형태로 제공된다.
단지 예로써, 디올/글리세롤 디하이드라타제에 대한 예시적인 아미노산 및 핵산 서열 정보는 아래 표 1 및 2에 제공된다. 어떤 경우에 있어서, 디올/글리세롤 디하이드라타제는 비타민 B12 의존적이고 그리고 기타의 경우에 있어서는 이것은 B12 독립적이다. 몇몇 디올/글리세롤 디하이드라타제는 반응을 촉매한 후 불활성화되어 질 수 있고 그리고 보조인자를 보충함에 의해 효소를 재활성화할 수 있는 활성제 단백질을 필요로 한다. 어떤 구현예에 있어서, 디올/글리세롤 디하이드라타제는 3 서브유닛 (알파, 베타 및 감마)를 포함한다.
| B12 독립적 인돌 디하이드라타제 | ||
| 유기체 | 디하이드라타제 | 활성제 |
| 클로스트리듐 부티리쿰 | ZP_02948838 NZ_ABDT01000049.2:116638.119001 | ZP_02948836 NZ_ABDT01000049.2:115696.116610 |
| 클로스트리듐 sp . | AAY34226 DQ901409.5:2754.3668 |
ACF15539 AY968605.2:2383.3297 |
| 클로스트리듐 디올리스 | ACI39933 FJ214109.1:<1.1920 |
ACI39932 FJ214109.1:1947.>2049 |
| 로세부리아 이눌리니보란스 | ZP_03753304 NZ_ACFY01000062.1:43115.45646 |
ZP_03753303 NZ_ACFY01000062.1:45606.46457 |
| B12 의존적 디올 디하이드라타제 | |||
| 유기체 | 알파 | 베타 | 감마 |
| 클렙시엘라 옥시토카 | 1DIO_A BAA08099.1 GI:868006 | 1DIO_B BAA08100.1 GI:868007 | 1DIO_G BAA08101.1 GI:868008 |
| 살모넬라 엔테리카 | NP_460985 GI:16765370 | NP_460986 GI:16765371 |
NP_460987 GI:16765372 |
| 사이토박터 코세리 | YP_001452384 GI:157145065 | YP_001452383 GI:157145064 | YP_001452382 GI:157145063 |
| 클렙시엘라 뉴모니애 | YP_002236782 GI:206575748 | YP_002236781 GI:206575747 | YP_002236780 GI:206575746 |
| 에스케리치아 콜리 | YP_001463342 GI:157157290 | YP_001463343 GI:157157291 | YP_001463344 GI:157157292 |
단지 예로써, 알코올 디하이드로게나제에 대한 예시적인 아미노산 및 핵산 서열 정보는 P25984.2, 및 P14941 및 AF157307.2, 및 X6484의 형태로 제공된다. 추가적인 예로써, PCT/NZ2012/000022에 기재된 바와 같은 알코올 디하이드로게나제가 사용되어 질 수 있다.
다양한 효소에 대한 서열 정보에 대한 상기 참조는 유전자은행 및/또는 NCBI 데이타베이스 참조이다. 서열 정보는 이들 참조 번호를 사용하여 온-라인으로 쉽게 접근할 수 있다.
본 발명의 미생물에서의 용도의 효소 (및 이들을 인코딩하는 어떤 상응하는 유전자)는 다른 박테리아의 속 및 종 또는 기타 유기체를 포함하는 어떤 적절한 공급원으로부터 유도되어 질 수 있다. 그러나, 일 구현예에 있어서, 클렙시엘라 폐렴, 엔테로박터 에어로게네스 , 또는 패니바실러스 폴리믹사로부터 유래된 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제2다. 일 구현예에 있어서, (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제는 상기에 예시된 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이것은 이들의 작용성으로 동등한 변이체이다. 일 구현예에 있어서, 디올/글리세롤 디하이드라타제는 클 렙시엘라 옥시토카로부터의 디올 디하이드라타제이다. 일 구현예에 있어서, 디올/글리세롤 디하이드라타제는 여기서 이전에 예시된 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이것은 이들의 작용성으로 동등한 변이체이다. 일 구현예에 있어서, 알코올 디하이드로게나제는 클로스트리듐 아우토에타노게넘으로부터 유래한다. 일 구현예에 있어서, 알코올 디하이드로게나제는 여기서 이전에 예시된 아미노산 서열을 가지거나, 또는 이것은 이들의 작용성으로 동등한 변이체이다.
본 발명에 있어서, (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제의 활성은 임의로 감소되거나 또는 실질적으로 제거되어 진다. 이 정도에서, 유전자 및 효소는 모 미생물에 함유되어 진다. 이 효소에 대한 예시적인 서열 정보는 C. 아우토에타노게넘으로부터 AEI90715 및 HQ876009 및 C. 이정달리로부터 YP_003780482.1 및 GI:300855498 및 C. 라그스달레이로부터 AEI90716 및 HQ876010을 포함한다.
일 구현예에 있어서, 미생물은 모 미생물에 존재하는 하나 또는 그 이상의 핵산의 발현을 증가하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 포함하고 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산은 여기서 이전에 언급된 하나 또는 그 이상의 효소 (또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)을 인코딩한다. 일 구현예에 있어서, 발현을 증가하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산은 조절 인자이다. 일 구현예에 있어서, 조절 인자는 프로모터이다. 일 구현예에 있어서, 프로모터는 적절한 발효 조건 하에서 바람직하게는 고활성인 항시적 프로모터이다. 유도성 프로모터가 또한 사용되어 질 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 프로모터는 우드-르정달 유전자 클러스터 또는 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나아제 오페론 프로모터를 포함하는 군에서부터 선택되어 진다. 적절한 발효 조건 하에서 직접적인 발현, 바람직하게는 고수준의 발현을 할 수 있는 기타 프로모터가 예시된 구현예에 대한 대안으로 효과적일 수 있다고 당해 분야의 숙련가에 의해 인정되어 질 것이다.
일 구현예에 있어서, 미생물은 모 미생물에서 존재하지 않는 여기서 이전에 언급된 하나 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)를 발현하도록 적응되고 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 일 구현예에 있어서, 미생물은 적어도 2 또는 3의 효소(또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)를 발현하도록 적응되고 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 포함한다.
하나의 특별한 구현예에 있어서, 미생물은 2-부탄올을 생산할 수 있고 그리고 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 및 디올/글리세롤 디하이드라타제의 하나 또는 바람직하게는 양자, 또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 디올/글리세롤 디하이드라타제는 다른 유전자에 의해 인코딩된 각 서브유닛을 갖는 3 서브유닛으로 구성되어 질 수 있다. 이들 유전자는 전체의 효소를 함께 인코딩하는 단일 핵산 또는 2 이상 핵산으로 조합되어 질 수 있다. 또한, 특정한 모 미생물은 이들 서브유닛의 단지 1, 2 또는 3에 대한 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 단지 1 또는 2의 서브유닛을 발현하는 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 사용하여 미생물을 조작하는 것을 포괄한다. 일 구현예에 있어서, 미생물은 또한 모 미생물에 존재하는 알코올 디하이드로게나제의 발현을 증가하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 핵산을 포함한다.
하나의 특별한 구현예에 있어서, 미생물은 MEK를 생산할 수 있고 그리고 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 및 디올/글리세롤 디하이드라타제의 하나 또는 바람직하게는 양자, 또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 디올/글리세롤 디하이드라타제는 다른 유전자에 의해 인코딩된 각 서브유닛을 갖는 3 서브유닛으로 구성되어 질 수 있다. 이들 유전자는 전체의 효소를 함께 인코딩하는 단일 핵산 또는 2 이상 핵산으로 조합되어 질 수 있다. 또한, 특정한 모 미생물은 이들 서브유닛의 단지 1, 2 또는 3에 대한 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 단지 1 또는 2의 서브유닛을 발현하는 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 사용하여 미생물을 조작하는 것을 포괄한다. 일 구현예에 있어서, 미생물은 또한 모 미생물에서 2-부탄올로 MEK의 전환을 감소 또는 실질적으로 제거하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 핵산 또는 유전적 변형을 포함한다. 일 구현예에 있어서, 미생물은 모 미생물에 존재하는 알코올 디하이드로게나제의 활성을 감소 또는 실질적으로 제거하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 핵산 또는 유전적 변형을 포함한다.
일 구현예에 있어서, (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제는 여기서 이전에 예시된 바와 같은 서열을 포함하는 핵산 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체에 의해 인코딩된다. 일 구현예에 있어서, 디올/글리세롤 디하이드라타제는 여기서 이전에 예시된 바와 같은 서열을 포함하는 핵산 또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체에 의해 인코딩된다. 일 구현예에 있어서, 알코올 디하이드로게나제는 여기서 이전에 예시된 바와 같은 서열을 포함하는 핵산 또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체에 의해 인코딩된다. 대안적으로, 효소는, 예를 들면 여기서 이전에 열거된 바와 같은 공공적으로 이용가능한 데이타베이스에 기술된 바와 같은 핵산 서열에 의해 인코딩되어 질 수 있다.
일 구현예에 있어서, 미생물이 MEK 및 2-부탄올의 어느 하나 또는 양자를 생산할 수 있는 경우, 이것은 모 미생물에서 (R,R)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 감소 또는 실질적으로 제거하도록 임의로 적응되어 진다. 일 구현예에 있어서, 미생물은 모 미생물에서 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제의 활성을 감소 또는 실질적으로 제거하도록 적응된 하나 또는 그 이상의 핵산 또는 유전적 변형을 포함한다.
미생물은 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 모 미생물을 2 이상 유전 인자(예컨대, 유전자 또는 조절 인자(예를 들면, 프로모터))로 형질전화하는 것이 바람직한 경우, 이들은 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산 상에 함유되어 질 수 있다.
일 구현예에 있어서, 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산은 핵산 컨스트럭트 또는 벡터로, 하나의 특별한 구현예에 있어서 어떠한 조합으로 이전에 언급된 하나 또는 그 이상의 효소를 인코딩하는 플라스미드이다.
외인성 핵산은 모 미생물의 전환에 의해 엑스트라-염색체에 존재할 수 있고, 또는 모 미생물의 게놈 안에 합체되어 질 수 있다. 따라서, 이들은 염색체외 컨스트럭트(예를 들면, 리플리케이션 기점, 프로모터 및 기타 조절 인자 또는 서열)의 통합 (예를 들면, 상동 재조합을 가능하게 하는 영역 및 호스트 게놈 안으로 표적화된 통합) 또는 발현 및 복제를 보조하도록 적응된 추가의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일반적인 예로써, 유전자 안으로 유전적 변형을 도입하거나 또는 그렇지 않으면 유전자 또는 단백질을 파열하거나 넉아웃하는 경우, 적절한 핵산 컨스트럭트 또는 벡터가 유전자를 파열하기 위해 모 미생물의 게놈 안으로 합체하도록 설계되어 질 수 있다. 이러한 컨스트럭트는 전형적으로, 상동 재조합이 일어나도록 하는 파열되어 지는 유전자를 플랭킹하거나 그 안의 영역에 유사한 핵산 서열(아암) 및 유전자로부터 핵산의 영역의 적출, 또는 대비 상에 핵산으로 유전자의 영역의 치환으로 발생하는 돌연변이의 도입을 포함한다. 비록 컨스트럭트 상에 아암이 이것이 표적화되어 진 게놈에서의 영역에 100% 상보성을 가지는 것이 바람직하지만, 이것은, 서열이 표적화된 재조합에 대해 대상의 유전적 영역을 허용하기에 충분히 상보적으로 되면, 필요하지 않다. 전형적으로, 아암은 「Sambrook et al 1989」에서 규정된 바와 같이 엄격한 조건 하에서 표적 영역에 대해 하이브리드화가 가능한 수준의 상동성을 가질 것이다.
숙련된 사람은 모 미생물의 게놈 안으로 외인성 핵산의 통합 및 표적화된 상동 재조합에 대해 여기서 언급된 효소, 특히 알코올 디하이드로게나제 및 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제에 대한 이용가능한 서열 정보를 갖는 것을 허용하기에 충분한 핵산 서열을 인식할 것이다.
일 구현예에 있어서, 여기서 이전에 언급된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)을 인코딩하는 외인성 핵산은 더욱이 외인성 핵산에 의해 인코딩된 하나 또는 그 이상의 효소의 발현을 증진하도록 적응된 프로모터를 포함할 것이다. 일 구현예에 있어서, 프로모터는 적절한 발효 조건 하에서 바람직하게는 고활성인 항시적 프로모터이다. 유도성 프로모터가 또한 사용되어 질 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 프로모터는 우드-르정달 유전자 클러스터 및 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나아제 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되어 진다. 적절한 발효 조건 하에서 직접적인 발현, 바람직하게는 고수준의 발현을 할 수 있는 기타 프로모터가 예시된 구현예에 대한 대안으로 효과적일 수 있다고 당해 분야의 숙련가에 의해 인정되어 질 것이다.
일 구현예에 있어서, 외인성 핵산은 발현 플라스미드이다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 일산화탄소영양성 초산생성 박테리아의 군으로부터 선택되어 진다. 어떤 구현예에 있어서, 미생물은 클로스트리듐 아우토에타노게넘 , 클로스트리듐 이정달리 , 클로스트리듐 라그스달레이 , 클로스트리듐 카복시디보란스 , 클로스트리듐 드라케이, 클로스트리듐 스칼톨로게네스 , 클로스트리듐 아세티쿰 , 클로스트리듐 포르미코아세티쿰 , 클로스트리듐 매그넘 , 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 , 아세토박테리움 우디이 , 알칼리박컬럼 바치이 , 블라우티아 프로덕타 , 유박테륨 리모섬 , 무렐라 테모아세티카 , 무렐라 테르마토트로피카 , 스포로무사 오바타 , 스포로무사 실바세티카 , 스포로무사 스파에로이데스 , 옥소박터 프 펜니기이, 및 테모아나에로박터 키우비를 포함하는 군으로부터 선택되어 진다.
하나의 특별한 구현예에 있어서, 모 미생물은 종 C. 아우토에타노게넘, C. 이정달리, 및 C. 라그스달레이를 포함하는 에탄올성 초산생성 클로스트리듐 및 관련된 분리물들의 군집으로부터 선택되어 진다. 이들은 여기에 제한되는 것은 아니지만 균주 C. 아우토에타노게넘 JAI-1T (DSM10061) [Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: 클로스트리듐 아우토에타노게넘, sp. nov., 일산화탄소로부터 에탄올을 생산하는 혐기성 박테리움. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351], C. 아우토에타노게넘 LBS1560 (DSM19630) [Simpson SD, Forster RL, Tran PT, Rowe MJ, Warner IL: 신규한 박데리아 및 이들의 방법. 국제특허 2009, WO/2009/064200], C. 아우토에타노게넘 LBS1561 (DSM23693), C. 이정달리 PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) [Tanner RS, Miller LM, Yang D: 클로스트리듐 이정달리 sp. nov., 클로스트리듐의 rRNA 상동성 그룹 I에서 초산생성 종. Int J SystBacteriol 1993, 43: 232-236], C. 이정달리 ERI-2 (ATCC 55380) [Gaddy JL: 폐기 가스로부터 초산을 생산하는 클로스트리듐 균주. US 특허 1997, 5,593,886], C. 이정달리 C-01 (ATCC 55988) [Gaddy JL, Clausen EC, Ko C-W: 발효 배양액으로부터 그의 추출을 위한 초산뿐만 아니라 용매의 제조를 위한 미생물 공정. US 특허, 2002, 6,368,819], C. 이정달리 O-52 (ATCC 55989) [Gaddy JL, Clausen EC, Ko C-W: 발효 배양액으로부터 그의 추출을 위한 초산뿐만 아니라 용매의 제조를 위한 미생물 공정. US 특허, 2002, 6,368,819], C. 라그스달레이 P11T (ATCC BAA-622) [Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: 신규한 클로스트리듐 종의 단리 및 특성규명, 국제특허 2008, WO 2008/028055], 관련된 분리물들로 예컨대 "C. 코스카티"[Zahn et al - 신규한 에탄올성 종 클로스트리듐 코스카티(US 특허 출원 번호 US20110229947)] 및 "클로스트 리듐 sp ."(Tyurin et al., 2012, J. Biotech Res . 4: 1-12), 또는 돌연변이된 균주, 예컨대 C. 이정달리 OTA-1 (Tirado-Acevedo O. 클로스트리듐 이정달리를 사용하여 합성 가스로부터 바이오에탄올의 생산. PhD 논문, North Carolina State University, 2010)을 포함한다. 클로스트리듐의 rRNA 클러스터 I, 및 그의 16S rRNA 유전자 내의 서브클러스터로부터의 이들 균주들은 약 30%의 유사한 낮은 GC 함량으로 99% 이상 동일하다. 그러나, DNA-DNA 재회합 및 DNA 핑거인쇄 실험은 이들 균주가 명확한 종에 속한다는 것을 보여주었다[Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: 신규한 클로스트리듐 종의 단리 및 특성규명. 국제 특허 2008, WO 2008/028055]
이 클러스터의 모든 종 유사한 형태 및 사이즈(대수 성장하는 세포는 0.5-0.7 x 3-5μm 사이임)를 가지고, 중온성(최적의 성장 온도 30-37℃ 사이)이고 그리고 엄격히 혐기성 미생물[Tanner RS, Miller LM, Yang D: 클로스트리듐 이정달리 sp. nov., 클로스트리듐의 rRNA 상동성 그룹 I에서 초산생성 종. Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232-236; Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: 클로스트리듐 아우토에타노게넘, sp. nov., 일산화탄소로부터 에탄올을 생산하는 혐기성 박테리움. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351; Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: 신규한 클로스트리듐의 종의 단리 및 특성규명. 국제 특허 2008, WO 2008/028055]이다. 게다가, 이들 모두는 동일한 pH 범위 (5.5-6의 최적의 초기 pH를 갖는, pH 4-7.5), 유사한 성장률로 CO 함유 가스 상에서 강한 독립 영양 성장, 및 어떤 조건 하에서 형성된 주요 발효 최종 생성물로서 에탄올 및 아세트산 및 소량의 2,3-부탄디올 및 락산을 갖는 유사한 대사성 프로파일과 같은 동일한 주요 계통발생적 특질을 공유한다. [Tanner RS, Miller LM, Yang D: 클로스트리듐 이정달리 sp. nov., 클로스트리듐의 rRNA 상동성 그룹 I에서 초산생성 종. Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232-236; Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: 클로스트리듐 아우토에타노게넘, sp. nov., 일산화탄소로부터 에탄올을 생산하는 혐기성 박테리움. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351; Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: 신규한 클로스트리듐의 종의 단리 및 특성규명. 국제 특허 2008, WO 2008/028055]. 인돌 생산이 더욱이 3 종 모두에 관찰되었다. 그러나, 이 종들은 다양한 당류(예를 들면, 람노오스, 아라비노오스), 산(예를 들면, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들면, 아르기닌, 히스티딘), 또는 기타 기질(예를 들면, 베타인, 부탄올)의 기질 이용으로 분화한다. 더욱이 이 종들의 몇몇은 어떤 비타민(예를 들면, 티아민, 바이오틴)에 대한 영양 요구체인 것으로 밝혀 졌지만 반면 다른 것들은 그렇지 않다.
일 구현예에 있어서, 모 균주는 CO를 그의 단독 탄소 및 에너지 공급원으로 사용한다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 클로스트리듐 아우토에타노게넘 또는 클로스트리듐 이정달리이다. 하나의 특별한 구현예에 있어서, 미생물은 클로스트리듐 아우토에타노게넘 DSM23693이다. 또 다른 특별한 구현예에 있어서, 미생물은 클로스트리듐 이정달리 DSM13528(또는 ATCC55383)이다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 하나 또는 그 이상의 다음의 활성을 결한다:
(R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 촉매하는 효소;
MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올의 전환을 촉매하는 효소; 및,
2-부탄올로 MEK의 전환을 촉매하는 효소.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 하나 또는 그 이상의 다음을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자를 결한다:
(R,S)-2,3-부탄디올로 (R)-아세토인의 전환을 촉매하는 효소;
MEK로 (R,S)-2,3-부탄디올의 전환을 촉매하는 효소; 및,
2-부탄올로 MEK의 전환을 촉매하는 효소.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제, 디올/글리세롤 디하이드라타제, 및/또는 알코올 디하이드로게나제, 및 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자를 결한다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제, 알코올 디하이드로게나제, 및/또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 모 미생물은 (R)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제, 알코올 디하이드로게나제, 및/또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하고 그리고 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제, 디올/글리세롤 디하이드라타제 및/또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자를 결한다.
핵산
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 미생물을 생성하는데 있어서의 용도의 핵산 및 핵산 컨스트럭트를 제공한다.
일 구현예에 있어서, 핵산은 미생물에서 발현될 때, 미생물이 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산하는 것을 가능하게 하는 MEK 및/또는 2-부탄올 생합성 경로에서 하나 또는 그 이상의 효소(또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 서열을 포함한다. 하나의 특별한 구현예에 있어서, 본 발명은 미생물에서 발현될 때, 미생물이 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산하는 것을 가능하게 하는 2 이상 효소(또는 그의 하나 또는 그 이상의 서브유닛)를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 또 하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 효소의 세 가지를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
하나의 특별한 구현예에 있어서, 효소는 여기서 이전에 기술된 이들 효소들로부터 선택되어 진다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산은 임의의 순서로 (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 및 디올/글리세롤 디하이드라타제 및/또는 이들의 임의의 하나 또는 그 이상의 작용성으로 동등한 변이체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일 구현예에 있어서, 핵산은 더욱이 알코올 디하이드로게나제를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함한다.
각각의 상기 효소를 인코딩하는 예시적인 아미노산 서열 및 핵산 서열이 여기에서 제공되어 지거나 여기서 이전에 언급된 바와 같이 유전자은행으로부터 수득되어 질 수 있다. 그러나, 숙련된 사람은, 유전자은행 및 기타 데이타베이스에서 여기에 함유된 정보에 관해, 효소 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체를 인코딩하는 대안적인 핵산 서열 및 유전자 암호를 쉽게 인식할 것이다.
일 구현예에 있어서, (S)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제를 인코딩하는 핵산은 여기서 이전에 기재된 바와 같은 서열을 가지거나 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에 있어서, 디올/글리세롤 디하이드라타제를 인코딩하는 핵산 서열은 여기서 이전에 기재된 바와 같은 서열을 가지거나 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에 있어서, 알코올 디하이드로게나제를 인코딩하는 핵산 서열은 여기서 이전에 기재된 바와 같은 서열을 가지거나 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체이다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산은 더욱이 프로모터를 포함할 것이다. 일 구현예에 있어서, 프로모터는 그의 조절 하에서 유전자의 항시적 발현을 가능하게 한다. 그러나, 유도성 프로모터가 또한 이용되어 질 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명에 있어서의 용도의 프로모터를 쉽게 인식할 것이다. 바람직하게는, 프로모터는 적절한 발효 조건 하에서 고수준의 발현에 대한 것일 수 있다. 특정 구현예에 있어서 우드-르정달 클러스터 프로모터가 사용된다. 또 하나의 구현예에 있어서, 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 프로모터가 사용된다. 또 하나의 구현예에 있어서, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 프로모터, Rnf 복합체 오페론 프로모터 또는 ATP 합성효소 오페론 프로모터. 하나의 특별한 구현예에 있어서, 프로모터는 C. 아우토에타노게넘으로부터 온다.
본 발명의 핵산은 모 미생물의 전환에 의해 엑스트라-염색체에 잔존할 수 있거나, 또는 미생물의 게놈 안에 합체를 위해 적응되어 질 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산은 염색체외 컨스트럭트(예를 들면, 리플리케이션 기점, 프로모터 및 기타 조절 인자 또는 서열)의 통합 (예를 들면, 상동 재조합을 가능하게 하는 영역 및 호스트 게놈 안으로 표적화된 통합) 또는 발현 및 복제를 보조하도록 적응된 추가의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 핵산은 핵산 컨스트럭트 또는 벡터이다. 하나의 특별한 구현예에 있어서, 핵산 컨스트럭트 또는 벡터는 발현 컨스트럭트 또는 벡터이지만, 그러나 클로닝을 위해 사용된 것과 같은 기타 컨스트럭트 및 벡터도 본 발명에 의해 포괄되어 진다. 하나의 특별한 구현예에 있어서, 발현 컨스트럭트 또는 벡터는 플라스미드이다.
본 발명의 발현 컨스트럭트/벡터는 원한다면 추가적인 단백질의 발현에 적절한 프로모터뿐만 아니라 부가적인 유전자에 부가하여 어떤 수의 조절 인자를 포함할 수 있다는 것이 인식되어 질 것이다. 일 구현예에 있어서, 발현 컨스트럭트/벡터는 하나의 프로모터를 포함한다. 또 하나의 구현예에 있어서, 발현 컨스트럭트/벡터는 2 이상 프로모터를 포함한다. 하나의 특별한 구현예에 있어서, 발현 컨스트럭트/벡터는 발현되어 지는 각 유전자에 대해 하나의 프로모터를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 발현 컨스트럭트/벡터는 하나 또는 그 이상의 리보솜 결합 부위, 바람직하게는 발현되어 지는 각 유전자에 대해 리보솜 결합 부위를 포함한다.
여기에 기술된 핵산 서열 및 컨스트럭트/벡터 서열은 리보솜 결합 부위 및/또는 제한 부위에 대해 필요한 것과 같은 표준 링커 뉴클레오티드를 함유할 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에 의해 인정되어 질 것이다. 이러한 표준 링커 뉴클레오티드는 필요로 되어 지는 것으로 해석되지 않고 규정된 서열 상에 한정을 제공하지 않는다.
본 발명의 발현 컨스트럭트/벡터를 포함하는 핵산 및 핵산 컨스트럭트는 이 기술 분야의 다수의 기술 표준을 사용하여 구성되어 질 수 있다. 예를 들면, 화학적 합성 또는 재조합 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은, 예를 들면 Sambrook 등(Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에 기재되어 졌다. 부가적인 예시적 기술은 여기 이후의 실시예 부분에 기재되어 진다. 본질적으로, 개별적인 유전자 및 조절 인자는 유전자가 원하는 단백질을 형성하도록 발현되어 질 수 있도록 서로에 대해 작동가능하게 연결되어 질 것이다. 본 발명에서 사용하기 위한 적당한 벡터는 이 기술에 있어 당해 분야의 숙련가에 의해 인식되어 질 것이다. 그러나, 예로써, 하기 벡터가 적당할 수 있다: pMTL80000 벡터, pIMP1, pJIR750, 및 여기 이후의 실시예 부분에서 예시된 플라스미드.
본 발명의 핵산은 RNA, DNA, 또는 cDNA를 포함하는 어떤 적절한 형태일 수 있다는 것이 인식되어 져야 한다.
본 발명은 또한 여기에 기술된 임의의 하나 또는 그 이상의 핵산을 포함하는, 바이러스, 박테리아, 및 효모를 포함하는 숙주 유기체, 특히 미생물을 제공한다.
하나 또는 그 이상의 외인성 핵산은 원형 핵산으로 모 미생물에 전달되어 질 수 있거나 또는 형질전환 과정(예를 들면, 리포좀-접합된 핵산, 핵산이 함유된 유기체)을 용이하게 하기 위한 하나 또는 그 이상의 제제와 제형화되어 질 수 있다. 하나 또는 그 이상 핵산은 적절하기로는 DNA, RNA, 또는 이들의 조합일 수 있다. 제한 억제제 어떤 구현예에서 사용되어 질 수 있다; 예를 들면 Murray, N.E. et al. (2000) Microbial . Molec . Biol . Rev . 64, 412 참고.
본 발명의 미생물은 재조합 미생물을 생산하기 위한 기술에서 알려진 어떤 수의 기술을 사용하여 모 미생물 및 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산으로부터 제조되어 질 수 있다. 단지 예로써, 전환(형질도입 또는 형질감염을 포함함)은 전기천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개된 전환, 원형질 전환, 화학적 또는 천연 경쟁도, 프로파아지 유도 또는 컨쥬게이션에 의해 달성되어 질 수 있다. 적절한 전환 기술은 예를 들어, 「Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989」에 기재되어 졌다.
전기천공은 C. 이정달리 (Kopke et al. 2010, P℃ . Nat . Acad . Sci . U.S.A. 107: 13087-92; PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), C. 아우토에타노게넘 (PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), 또는 아세토박테리움 우디이 (Straetz et al., 1994, Appl . Environ . Microbiol . 60:1033-37)와 같은 몇몇의 인산화탄소영양성 아세토겐에 대해 기술되어 졌고 그리고 C. 아세토부틸리컴 (Mermelstein et al., 1992, Biotechnology, 10, 190-195), C. 셀률로리티컴 (Jennert et al., 2000, Microbiology, 146: 3071-3080) 또는 C. 써모셀륨 (Tyurin et al., 2004, Appl. Environ . Microbiol . 70: 883-890)와 같은 많은 클로스트리듐에서 사용된 표준 방법이다. 프로파아지 유도는 일산화탄소영양 아세토겐에서뿐만 아니라 C. 스칼톨로게네스의 경우에서 입증되어 졌고(Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project Western Kentucky University), 반면 컨쥬게이션은 클로스트리듐 디피실레 (Herbert et al., 2003, FEMS Microbiol . Lett . 229: 103-110) 또는 C. 아세토부이리컴 (Williams et al., 1990, J. Gen . Microbiol . 136: 819-826)을 포함하는 많은 클로스트리듐에 대한 선택의 방법으로 기술되어 졌고 그리고 일산화탄소영양성 아세토겐애 대한 유사한 방식으로 사용되어 질 수 있었다. 플라스미드 R702를 갖는 E. 콜라이 HB101과 같은 E. 콜라이 공여체 균주가 사용되어 질 수 있다(Williams et al., 1990, J. Gen . Microbiol . 136: 819-826).
어떤 구현예에 있어서, 형질전환되어 지는 미생물에서 활성인 제한 시스템에 기인하여, 미생물 안으로 도입되어 지는 핵산을 메틸화하는 것이 필요하다. 이것은 아래에 기술된 것을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
예로써, 일 구현예에 있어서, 본 발명의 재조합 미생물은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다:
셔틀 미생물 안으로, (i) 여기서 기술된 바와 같은 발현 컨스트럭트/벡터 및 (ii) 메틸전이효소 유전자를 포함하는 메틸화 컨스트럭트/벡터의 도입;
메틸전이효소 유전자의 발현;
셔틀 미생물로부터 하나 또는 그 이상의 컨스트럭트/벡터의 단리; 및,
목적 미생물 안으로 하나 또는 그 이상의 컨스트럭트/벡터의 도입.
일 구현예에 있어서, 단계 B의 메틸전이효소 유전자는 항시적으로 발현되어 진다. 또 하나의 구현예에 있어서, 단계 B의 메틸전이효소 유전자의 발현은 유도된다.
셔틀 미생물은 발현 컨스트럭트/벡터를 구성하는 핵산 서열의 메틸화를 용이하게 하는 미생물, 바람직하게는 제한 음성 미생물이다. 특정 구현예에 있어서, 셔틀 미생물은 제한 음성 E. 콜라이, 바실러스 섭틸리스 , 또는 락토코커스 락티스이다.
메틸화 컨스트럭트/벡터는 메틸전이효소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일단 발현 컨스트럭트/벡터 및 메틸화 컨스트럭트/벡터가 셔틀 미생물 안으로 도입되면, 메틸화 컨스트럭트/벡터 상에 존재하는 메틸전이효소 유전자가 유도된다. 비록 본 발명의 하나의 특별한 구현예에 있어서는 컨스트럭트/벡터가 유도할 수 있는 lac 프로모터를 포함하고 락토스나 이들의 유사화합물, 보다 바람직하기로는 이소프로필-β-D-티오-갈락토사이드(IPTG)의 부가에 의해 유도되어 지지만, 유도는 어떤 적절한 프로모터 시스템에 의해 될 수 있다. 본 발명의 부가적인 구현예에 있어서, 메틸화 컨스트럭트/벡터 프로모터는 항시적 프로모터이다.
특정한 구현예에 있어서, 메틸화 컨스트럭트/벡터는 셔틀 미생물의 동일성에 특정한 리플리케이션의 기점을 가지고 그래서 메틸화 컨스트럭트/벡터 상에 존재하는 어떤 유전자가 셔틀 미생물에서 발현되어 진다. 바람직하기로는, 발현 컨스트럭트/벡터는 목적 미생물의 동일성에 특정한 리플리케이션의 기점을 가지고 그래서 발현 컨스트럭트/벡터 상에 존재하는 어떤 유전자가 목적 미생물에서 발현되어 진다.
메틸전이효소의 발현은 발현 컨스트럭트/벡터 상에 존재하는 유전자의 메틸화를 초래한다. 발현 컨스트럭트/벡터는 그런 다음 다수의 알려진 방법의 어느 하나에 따라 셔틀 미생물로부터 단리되어 질 수 있다.
하나의 특별한 구현예에 있어서, 양자 컨스트럭트/벡터는 동시에 단리된다.
발현 컨스트럭트/벡터는 어떤 수의 알려진 방법을 사용하여 목적 미생물 안으로 도입되어 질 수 있다. 그러나, 예로써, 이후의 실시예 부분에서 기술된 방법론이 사용될 수 있다. 발현 컨스트럭트/벡터가 메틸화되어 지기 때문에, 발현 컨스트럭트/벡터 상에 존재하는 핵산 서열은 목적 미생물 안으로 합체되어 질 수 있고 그리고 성공적으로 발현되어 질 수 있다.
메틸전이효소 유전자가 셔틀 미생물 안으로 도입되어 질 수 있고 그리고 과-발현될 수 있다는 것이 구상된다. 따라서, 일 구현예에 있어서, 수득한 메틸전이효소는 알려진 방법을 사용하여 수집되어 질 수 있고 발현 플라스미드를 메틸화하기 위해 시험관 내에서 사용될 수 있다. 발현 컨스트럭트/벡터는 그런 다음 발현을 위해 목적 미생물 안으로 도입되어 질 수 있다. 또 하나의 구현예에 있어서, 메틸전이효소 유전자는 셔틀 미생물의 게놈안으로 도입되고 그 다음 셔틀 미생물 안으로 발현 컨스트럭트/벡터의 도입, 셔틀 미생물로부터 하나 또는 그 이상의 컨스트럭트/벡터의 단리 그리고 그런 다음 목적 미생물 안으로 발현 컨스트럭트/벡터의 도입이 따른다.
상기에 정의된 바와 같은 발현 컨스트럭트/벡터 및 메틸화 컨스트럭트/벡터가 물질의 조성물을 제공하기 위해 조합되어 질 수 있다. 이러한 조성물은 본 발명의 재조합 미생물을 생산하기 위한 제한 장막 메카니즘을 회피하는데 특별한 유용성을 가진다.
하나의 특별한 구현예에 있어서, 발현 컨스트럭트/벡터 및/또는 메틸화 컨스트럭트/벡터는 플라스미드이다.
당해 분야의 숙련가는 본 발명의 미생물을 생산함에 있어 수많은 적당한 메틸전이효소의 사용을 인식할 것이다. 그러나, 예로써 바실러스 서브틸리스 파아지 ΦT1 메틸전이효소 및 이후에 실시예에서 기술된 메틸전이효소가 사용될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 메틸전이효소는 PCT/NZ2011/000203 (WO2012/053905)에 기재된 메틸전이효소의 아미노산 서열을 가지거나 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체이다. 적당한 메틸전이효소를 인코딩하는 핵산은 원하는 메틸전이효소의 서열 및 유전자 코드를 가지는 것이 쉽게 인정될 것이다. 일 구현예에 있어서, 메틸전이효소를 인코딩하는 핵산은 PCT/NZ2011/000203 (WO2012/053905)에 기재된 메틸전이효소의 서열을 포함하거나 또는 이들의 작용성으로 동등한 변이체이다.
메틸전이효소 유전자의 발현을 가능하게 하도록 적용된 어떤 수의 컨스트럭트/벡터는 메틸화 컨스트럭트/벡터를 생성하기 위해 사용되어 질 수 있다.
생산 방법
본 발명은 본 발명의 재조합 미생물을 사용하여 CO를 포함하는 기질을 발효하는 것을 포함하는 미생물 발효에 의해 MEK 및/또는 2-부탄올의 생산 및 임의로 하나 또는 그 이상의 기타 생성물의 생산에 대한 방법을 제공한다. 바람직하게는, MEK 및/또는 2-부탄올은 주요한 발효 생성물이다. 본 발명의 방법은 산업적 공정으로부터 전체 대기중 탄소 방출을 감소하기 위해 사용되어 질 수 있다.
바람직하기로는, 발효는 본 발명의 재조합 미생물을 사용하여 적어도 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산하기 위해 생물 반응기 안에서 기질을 혐기적으로 발효하는 단계를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 본 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 하나 또는 그 이상의 미생물의 배양물을 함유하는 생물 반응기에 CO를 포함하는 기질을 공급하는 단계; 및
(b) 적어도 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산하기 위해 생물 반응기 안에서 배양물을 혐기적으로 발효하는 단계.
일 구현예에 있어서, 본 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 가스가 대기 중으로 방출되기 전에, 산업적 공정의 결과로서 생산된 CO를 포함하는 가스를 포획하는 단계;
(b) 본 발명의 하나 또는 그 이상의 미생물을 함유하는 배양물에 의해 적어도 MEK 및/또는 2-부탄올을 생산하기 위해 CO-함유 가스의 혐기적 발효 단계.
본 발명의 하나의 특별한 구현예에서, 미생물에 의해 발효된 가스성 기질은 CO를 함유하는 가스성 기질이다. 가스성 기질은 산업적 공정의 부산물로서, 또는 자동차 배기 가스와 같은 일부 다른 근원으로부터 얻어진 CO-함유 폐기물일 수 있다. 어떤 구현예에서, 산업적 공정은 제련과 같은 철 금속 생성물 제조, 비-제1철 생성물 제조, 석유 정제 공정, 석탄의 가스화, 전력 생산, 카본블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크 제조로 구성된 그룹으로부터 선택되어 진다. 이들 구현예에서, CO-함유 가스는 어떠한 편리한 방법을 사용하여 가스가 대기 중으로 방출되기 전에 산업적 공정으로부터 포획되어 질 수 있다. CO는 합성가스(일산화탄소 및 수소를 포함하는 가스)의 구성분일 수 있다. 산업적 공정으로부터 생산된 CO는 정상적으로는 확 타올라 CO2를 생산하고 그리고 따라서 본 발명은 CO2 온실 가스 방출을 감소하고 그리고 바이오 연료로 사용을 위한 부탄올을 생산하는데 특별한 유용성을 가진다. 가스성 CO-함유 기질의 조성물에 의존하여, 가스를 발효에 도입하기 전에 먼지 입자와 같은 어떠한 원하지 않는 불순물을 제거하기 위해 이것을 처리하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 예를 들면, 가스성 기질은 여과되어 질 수 있거나 또는 알려진 방법을 사용하여 세정되어 질 수 있다.
CO-함유 기질 가스에 부가하여, 발생하는 가스-대-적어도 MEK 및/또는 2-부탄올 및 박테리아의 성장을 위해, 적당한 액체 영양 배지가 생물반응기에 공급되어 지는 것이 필요할 것이라는 것이 인식되어 질 것이다. 기질 및 배지는 생물반응기에 연속적으로, 배치 또는 배치 공급 방식으로 공급되어 질 수 있다. 영양 배지는 사용된 마이크로-유기체의 성장을 허용하기에 충분한 비타민 및 미네랄을 함유할 것이다. CO를 사용하여 하나 또는 그 이상 생성물을 생산하기 위한 발효에 적절한 혐기성 배지는 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들면, 적절한 배지는 Biebel (2001)에 기재되어 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 배지는 이후의 실시예 부분에서 기재된 바와 같다.
발효는 바람직하게는 가스-대-적어도 MEK 및/또는 2-부탄올 발효가 일어나기에 적절한 조건 하에서 수행되어 져야 한다. 고려되어 져야 하는 반응 조건은, 액체상 내의 CO가 제한되지 않고, 그리고 생성 억제를 회피하기 위한 최대 생성물 농도를 공고하게 하기 위해, 압력, 온도, 가스 유속, 액체 유속, 배지 pH, 배지 산화환원 포텐셜, 교반율(연속적 교반 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종 수준, 최대 가스 기질 농도를 포함한다.
부가하여, 기질 흐름의 CO 농도(또는 가스성 기질 내에서 CO 분압)를 증가하고 그리고 따라서 CO가 기질인 발효 반응의 효율을 증가하는 것이 때로는 바람직하다. 증가된 압력에서의 작동은, 여기서 이것은 적어도 MEK 및/또는 2-부탄올의 생산을 위한 탄소 공급원으로서 마이크로-유기체에 의해 취하여 질 수 있는, 가스 상에서 액체 상으로 CO 전이의 비율에서 유의성 있는 증가를 가능하게 한다. 이것은 결국 생물반응기가 대기압보다 고압에서 유지될 때, 체류 시간(유입 가스 유속으로 나누어진 생물반응기 내의 액체 용적으로 정의됨)이 감소되어 질 수 있다는 것을 의미한다. 최적의 반응 조건은 사용된 본 발명의 특정한 마이크로-유기체에 부분적으로 의존할 것이다. 그러나, 일반적으로, 대기 압력보다 높은 압력에서 발효가 수행되어 지는 것이 바람직하게 된다. 또한, 주어진 CO-대-적어도 MEK 및/또는 2-부탄올 전환율은 부분적으로 기질 체류 시간의 작용이고, 그리고 원하는 체류 시간을 달성하는 것은 결국 생물반응기의 필요한 용적에 따르기 때문에, 가압된 시스템의 사용은 필요한 생물반응기의 용적과 결과적으로 발효 장비의 자본 비용을 크게 줄일 수 있다. US 특허 번호 5,593,886에서 제공된 실시예에 따르면, 반응기 용적은 반응기 작동 압력의 증가에 대해 직선 비율로 감소, 즉 10 대기압에서 작동된 생물반응기는 1 대기압에서 작동된 것의 십분의 일의 용적만이 필요되어 질 수 있다.
예로써, 상승된 압력에서 가스-대-에탄올 발효를 수행하는 이점이 기술되어 져 있다. 예를 들면, WO 02/08438은 각각 150g/l/일 및 369g/l/일의 에탄올 생산성을 제공하는, 30 psig 및 75 psig의 압력 하에서 수행된 가스-대-에탄올 발효를 기술하고 있다. 그러나, 대기압에서 유사한 배지 및 유입 가스 조성물을 사용하여 수행된 발효 예는 일당 리터 당 10 내지 20배 이하 에탄올을 생산하는 것이 밝혀졌다.
CO-함유 가스성 기질의 도입 비율은 액체 상에 있는 CO의 농도가 제한되지 않도록 확실하게 하는 것이 또한 바람직하다. 이것은 CO-제한 조건의 결과는 하나 또는 그 이상 생성물이 배양물에 의해 소비되어 질 수 있기 때문이다.
발효 반응에 공급하기 위해 사용된 가스 스트림의 조성물은 그 반응의 효율성 및/또는 비용에 유의성 있는 영향을 가질 수 있다. 예를 들면, O2는 혐기성 발효 공정의 효율성을 감소할 수 있다. 발효 전후에 발효 공정의 단계에서 원치않는 또는 불필요한 가스의 처리는 이러한 단계에 부하를 가중할 수 있다(예를 들면, 가스 스트림이 생물반응기에 도입 전에 압축되는 경우, 발효에서 필요하지 않은 가스를 압축하기 위해 불필요한 에너지가 사용되어 질 수 있음). 따라서, 원치않는 성분을 제거하고 그리고 바람직한 성분의 농도를 증가하기 위해, 기질 흐름, 특히 산업적 공급원으로부터 유도된 기질 흐름을 처리하는 것이 바람직할 수 있다.
어떤 구현예에 있어서, 본 발명의 미생물의 배양물은 수성 배양 배지에 유지된다. 바람직하게는 수성 배양 배지는 최소 혐기성 미생물 성장 배지이다. 적당한 배지는 당해 기술에 공지되어 있고, 그리고 예를 들면 US 특허 번호 5,173,429 및 5,593,886 및 WO 02/08438에 기재되어 있고 그리고 여기서 이후의 실시예 부분에서 기재된 바와 같다.
MEK 및/또는 2-부탄올, 또는 MEK 및/또는 2-부탄올 및/또는 하나 또는 그 이상의 기타 생성물을 함유하는 혼합된 스트림은 분별 증류 또는 증발, 투석증발, 가스 스트립핑 및, 예를 들면 액체-액체 추출을 포함하는 추출성 발효와 같은 당해 분야에서 알려진 방법에 의해 발효 배양액으로부터 회수되어 질 수 있다. 부가적인 예로써, 부탄올의 추출에 대한 방법은 「Kopke & Durre, 2011, Biohemical production of biobutanol」, 「Handbook of biofuels production: prcesses and technologies (Eds.: Luque, Campelo & Clark), Woodhead Publishing Ltd, Camebridge, UK: 221-257」에 기술되어 져 있다.
본 발명의 어떤 바람직한 구현예에 있어서, MEK 및/또는 2-부탄올 및 하나 또는 그 이상의 생성물이 생물반응기로부터 배양액 부분을 연속적으로 제거하고, 배양액으로부터 미생물 세포를 분리(편리하게는 여과에 의함)하고 그리고 배양액으로부터 하나 또는 그 이상 생성물을 회수함에 의해 발효 배양액으로부터 회수되어 진다. 알코올은 예를 들면 증류에 의해 편리하게 회수되어 질 수 있다. 아세톤은 예를 들면 증류에 의해 회수되어 질 수 있다. 생산된 어떤 산은 예를 들면 활성탄 상에 흡착함에 의해 회수되어 질 수 있다. 분리된 미생물 세포는 바람직하게는 발효 생물 반응기로 회귀 된다. 알코올(들) 및 산(들)이 제거되어 진 후 잔존하는 세포 없는 투과액도 또한 바람직하게는 발효 생물 반응기로 회귀 된다. 부가적인 영양소(예컨대 B 비타민)가 세포 없는 투과액이 발효 생물 반응기로 회귀 되기 전에 영양 배지를 다시 보충하기 위해 세포 없는 투과액에 부가되어 질 수 있다.
또한, 만일 배양액의 pH가 활성탄에 아세트산의 흡착을 증진하기 위해 상기에서 기재된 바와 같이 조정되어 지면, pH는 생물반응기로 회귀 되기 전에 발효 생물반응기 내의 배양액의 것과 유사한 pH로 재-조정되어 져야 한다.
실시예
이하 본 발명은 다음의 비-제한적인 예를 참조로 더 상세히 기술되어 질 것이다.
미생물
C. 아우토에타노게넘 DSM10061 및 DSM23693(DSM10061의 유도체) 뿐만 아니라 C. 이정달리 DSM13528이 DSMZ(The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany)으로부터 수득되어 졌다. 성장은 엄격히 혐기성 조건 및 기술(Hungate, 1969, Methods in Microbiology, vol. 3B. Academic Press, New York: 117-132; Wolfe, 1971, Adv. Microb. Physiol., 6: 107-146)을 사용하여 37℃에서 수행되어 졌다. 효모 추출물이 없이 화학적으로 규정된 PETC 배지(표 1) 및 단독 탄소 및 에너지 공급원으로서 30 psi 일산화탄소 함유 제련 폐기물(Glenbrook, NZ에 있는 뉴질랜드 스틸 사이트로부터 수집됨; 조성물: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2)이 사용되어 졌다.
대사산물의
분석
단백질 및 세포 잔사를 제거하기 위해, 400μl 샘플이 100μl의 2%(w/v) 5-설포살리실산과 혼합되고 그리고 3분 동안 14,000 x g에서 원심분리되어 침전된 잔사를 분리한다. 그런 다음 10μl의 상등액은 분석을 위해 HPLC 안에 주입된다. 2,3-부탄디올, 2-부탄올 및 기타 대사물의 HPLC 분석은 35℃에서 작동된 RID (굴절률 검출기) 및 35℃로 유지된 Aminex HPX-87H 칼럼 (300 x 7.8 mm, 입자 크기 9㎛)를 장착한 Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 약간 산성화된 물이 0.6 ml/min의 유속으로 하여 이동상으로 사용되었다(0.005 M H2SO4). 2,3-부탄디올 입체이성체의 구분을 위해, 35℃에서 작동된 RID (굴절률 검출기) 및 60℃로 유지된 Alltech IOA-2000 유기산 칼럼 (150 x 6.5 mm, 입자 크기 8㎛)를 장착한 Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 약간 산성화된 물이 0.25 ml/min의 유속으로 하여 이동상으로 사용되었다(0.005 M H2SO4).
알코올
디하이드로게나제에
의한
C.
아우토에타노게넘
에서
2-
부탄올로
MEK
의 전환
알코올 디하이드로게나제(Adh; EC 1.1.1.2)가 2-부탄올로 MEK를 전환할 수 있는 일산화탄소영양성 C. 아우토에타노게넘 (PCT/NZ2012/000022에 기재됨)의 게놈에서 확인되었다. 이 효소는 2-부탄올로 MEK를 전환하기 위해 기재된 C. 베이제린 키이로부터의 알코올 디하이드로게나제에 상동성을 가진다(Ismail et al., J. Bacteriol, 1993, 175: 5079-5105).
이 활성을 확인하기 위해, 일산화탄소영양성 아세토겐 C. 아우토에타노게넘, C. 이정달리 및 C. 라그스달레이로 성장 실험이 PETC 배지(표 1) 및 단독 탄소 및 에너지 공급원으로서 제련 폐기 가스(Glenbrook, NZ에 있는 뉴질랜드 스틸 사이트로부터 수집됨; 조성물: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2)를 갖는 50mL 혈청 보틀에서 수행되어 졌다. 대수 증식기 동안, 5g/L MEK가 배양물에 부가되었다. 증식의 말단에, MEK는 남이 있지 않았지만, 동등량의 2-부탄올이 검출되었다(표 4). 효소 검정은 C. 아우토에타노게넘의 조 추출물로 Ismail 등(J. Bacteriol, 1993, 175: 5079-5105)에 따라 수행되었고 그리고 활성은 기질로 MEK와 보조인자로서 NADPH로 성공적으로 검출될 수 있었다.
| 부가된 MEK | 증식의 말단에서 MEK | 증식의 말단에서 2-부탄올 | |
| C. 아우토에타노게넘 | 5.0g/L | 0.1g/L | 5.0g/L |
| C. 이정달리 | 5.1g/L | 0.1g/L | 4.8g/L |
| C. 라그스달레이 | 5.3g/L | 0.3g/L | 4.4g/L |
활성의 부가적인 증거를 위해, 알코올 디하이드로게나제 유전자가 발현 벡터 안에 클로닝되고, E. 콜라이에서 과잉 생산되고 그리고 2-부탄올로 MEK를 전환하는 활성에 대해 측정되었다.
유전자는 게놈 DNA로부터 증폭되고 그리고 하기 과정으로 KpnI 및 HindIII를 통해 pBAD 벡터 안으로 클로닝되었다. 증폭된 ADH 유전자는 KpnI-HF 및 HindIII로 유사하게 잘리고 그리고 전기천공에 의해 E. 콜라이 MC1061 세포 안으로 형질전환되었다. ADH 유전자의 서열은 DNA 서열분석함에 의해 확인되었다. 형질전환된 세포는 0.8의 OD600이 도달될 때까지 37℃에서 암피실린으로 100mL LB 안에서 성장되었다. 이 시점에서, 1mL의 20% 아라비노오스가 부가되고 그리고 배양물은 나머지의 발현을 위해 28℃에서 배양되어 진다. 세포는 펠렛화 되고, 상등액은 가만히 따르어 진다. 그런 다음 펠렛은 HEPES 버퍼 (50 mM Na-HEPES 및 0.2 mM DTT, pH 8.0)에 재현탁되고 그리고 각각 0.2μL의 벤조나제(Merck, 25units/μL) 및 r리소자임(Merck, 30 kU/μL)이 부가된다. 알코올 디하이드로게나제가 그런 다음 고정된 금속 어피니티 크로마토그래피를 사용하여 융합된 N-말단 His6 태그를 통해 정제된다. 얼음 상에서 30분 배양 후, 세포는 초음파처리에 의해 용리되고, 불용성 잔해는 펠렛화되고, 상등액은 0.2 마이크론 필터를 사용하여 정화된다. 정화된 상등액은 세포용리 버퍼로 철저히 세정된 Talon 수지(Clontech)에 부가된다. 500μL의 층 부피가 정제를 위해 사용되고 그리고 단백질은 4℃에서 1 시간 동안 Talon 수지에 결합되고 그리고 그런 다음 세포용리 버퍼로 몇 번 세정된다. 단백질은 150mM 이미다졸이 보충된 세포용리 버퍼를 사용하여 칼럼으로부터 용출되고 그리고 용출물은 500μL 분획으로 수집된다. 정제 공정을 통한 다양한 단계에서 취해진 분취량뿐만 아니라 모든 용출 분획은 단백질의 존재를 확인하고 정제의 성공을 결정하기 위해 SDS PAGE 겔에 걸어 졌다. 단백질은 Amicon 울트라-4 원심 필터 유니트(Millipore)를 사용하여 저장 버퍼 (50 mM 칼륨 포스페이트, 150 mM NaCl, 10% v/v 글리세롤, pH 7.0) 안으로 교환되어 졌다. 단백질은 E. 콜라이에서 발현될 때 고용해성이고 그리고 쉽게 정제될 수 있다. 활성 검정은 기질로 0.2 mM 및 3mM MEK의 농도로 보조인자로 NADPH를 사용하여 석영 큐벳을 갖는 UV/비스분광측정기에서 수행되어 졌다. 검정 혼합물은 1mM DTT를 갖는 50 mM 트리스-HCl 버퍼(pH 7.5)를 함유했다. 알코올 디하이드로게나제는 기질로서 MEK로 44±2 sec-1의 K cat , 1.2±0.1 mM의 KM을 가지고 결과로 3.8x104 sec-1 mM-1의 Kcat/KM을 갖는 활성을 보였다.
클렙시엘라
옥시토카
로부터
디올
디하이드라타제
유전자 (
pddABC
)를 갖는
클로스트리듐
발현 플라스미드의 구성
표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술이 사용되었다[Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989; Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K: Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, 1987].
포스포트랜스아세틸라제-아세테이트 키나아제 오페론(Ppta-ack) (서열번호: 1)의 프로모터 영역은 프라이머 Ppta-ack-NotI-F(서열번호: 2: GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC) 및 Ppta-ack-NdeI-R(서열번호: 3: TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC)를 사용하여 C. 아우토에타노게넘 DSM10061의 게놈 DNA로부터 증폭되고 그리고 NotI 및 NdeI 제한 부위를 사용하여 E. 콜라이 -클로스트리듐 셔틀 벡터 pMTL83151 (FJ797647.1; Nigel Minton, University of Nottingham, UK)[Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78: 79-85] 안에 클로닝되어, 플라스미드 pMTL83155를 얻었다.
클로스트리듐 아우토에타노게넘 DSM 10061로부터 게놈 DNA가 Bertram과 Durre (1989)에 의한 변형된 방법을 사용하여 단리되었다. 100-ml의 밤샘 배양물이 수확되고(6,000 x g, 15 min, 4℃), 칼륨 인산염 완충액 (10 mM, pH 7.5)으로 세정되고 그리고 1.9 ml STE 버퍼 (50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM 수크로오스; pH 8.0)에 현탁된다. 300 μl 리소자임 (~100,000 U)이 부가되고 그리고 이 혼합물은 30분 동안 37℃에서 인큐베이션되고, 그런 다음 280μl의 10% (w/v) SDS 용액이 부가되고 그리고 10분 동안 또 인큐베이션된다. RNA는 240μl의 EDTA 용액(0.5M, pH 8), 20μl 트리스-HCl(1M, pH 7.5), 및 10μl RNase A(Fermentas)의 부가에 의해 실온에서 단리된다. 그런 다음, 100μl 프로테이나제 K(0.5U)가 부가되고 그리고 단백질 분해가 37℃에서 1-3시간 동안 일어난다. 마지막으로, 600μl의 나트륨 퍼클로레이트(5M)가 부가되고, 그 다음 펜올-클로로포름 추출 및 이소프로판올 침전이 따른다. DNA 정량 및 정성은 분광광도법적으로 검사되었다.
클렙시엘라 옥시토카로부터 디올 디하이드라타제 (EC 4.2.1.28, Accession D45071)를 인코딩하는 유전자, pddABC가 부가적인 서브-클로닝 동안 NdeI 및 EcoRI 제한 부위에 의해 플랭킹된 클로스트리듐 아우토에타노게넘 (서열번호: 4)에 대해 최적화된 코돈으로 단일 오페론에서 합성된다. pddABC 오페론은 그런 다음 제한 효소 NdeI 및 EcoRI을 사용하여 pMTL83155 안으로 pUC57 벡터로부터 서브-클로닝된다.
C.
아우토에타노게넘
안으로
pddABC
발현 플라스미드의 도입
플라스미드, pMTL83155-pddABC가 위에서 기재된 방법을 사용하여 C. 아우토에 타노게넘을 형질전환하기 위해 사용된다. 과성장이 15㎍ mL-1 티암페니콜을 함유하는 YTF-아가(8g/L 트립톤, 5g/L 효모 추출물, 2g/L NaCl, 2.5g/L 플럭토스, 및 7.5 g/L 한천, pH 5.8) 상에서 수행되고 그리고 30psi 실 제련 가스에서 37℃에서 배양된다. 단일 콜로니는 15㎍ mL-1 티암페니콜을 함유하는 PETC-MES-아가(표 1, 카보네이트 버퍼 대신 MES를 가지고 플럭토스 없음) 상에서 백금니로 재접종되고 그런 다음 15㎍ mL-1 티암페니콜 및 0.5% 플럭토스를 함유하는 PETC-MES-아가 상에 백금니로 재접종된다. 다중 콜로니가 플럭토스를 갖는 플레이트로부터 취해지고 그리고 30psi 실 제련 가스로 발치(Balch) 튜브 안에서 0.5% 플럭토스를 갖는 3mL의 PETC-MES 안에서 성장된다. 플라스미드의 존재는 PCR에 의해 확인된다.
아우토에타노게넘
에서
디올
디하이드라타제
생체내
활성 시험
pMTL83155-pddABC을 장착한 C. 아우토에타노게넘의 균주가 메소- 2,3-부탄디올의 존재에서 성장되고 그리고 대조군으로서 야생형에 비교되었다. 성장 배지가 5 g L-1 메소-2,3-부탄디올로 보강될 때, 92시간의 성장 후, 12mg L-1 2-부탄올이 형질전환된 균주의 배양물에서 검출되었고 반면 야생형에서는 검출되지 않았다(표 5). 이론에 구속됨이 없이, 본 저자들은 디올 디하이드라타제가 메소-23BDO를 MEK로 전환하고, 반면 상기에서 기재된 바와 같이 C. 아우토에타노게넘에 존재하는 알코올 디하이드로게나제 활성이 그런 다음 2-부탄올로 MEK를 전환한다고 믿는다.
| 샘플 |
아세트산
(g L -1 ) |
에탄올
(g L -1 ) |
2-
부탄올
( mg L -1 ) |
| pddABC 장착한 C. 아우토에타노게넘 + 메소-2,3-부탄디올 | 2.97 ± 0.15 | 1.33 ± 0.06 | 12.33 ± 1.53 |
| pddABC 장착한 C. 아우토에타노게넘 | 3.00 ± 0.00 | 1.47 ± 0.06 | ND |
| C. 아우토에타노게넘 야생형 + 메소-2,3-부탄디올 | 2.67 ± 0.06 | 0.97 ± 0.06 | ND |
| C. 아우토에타노게넘 야생형 | 3.07 ± 0.72 | 1.17 ± 0.06 | ND |
ddrAB
의
리액티베이터
단백질의 공-발현에 의한
MEK
전환에 대한 메소-
BDO
의
개선
2,3-부탄디올과 디올 디하이드라타제 PddABC 효소 복합체의 반응은 생성물 형성을 이끌면서, 또한 효소 복합체의 불활성화를 이끌 수 있다(Bachovin et. al. 1977). K. 옥시토카와 같은 원상태 유기체에서 손상된 효소 복합체를 재활성화할 수 있는 부가적 효소가 존재한다(Mori K. et al, 1997). MEK로 메소-2,3-부탄디올의 전환의 효율성을 개선하기 위해, 적절한 리액티베이터 단백질(YP_005016278 및)이 디올 디하이드라타제 유전자와 동동 발현된다. K. 옥시토카로부터 리액티베이터 단백질 유전자(GeneID:11660428 및)인, ddrAB가 제한 부위 SacI 및 KpnI에 의해 플랭킹된 C. 아우토에타노게넘(서열번호: 6)에 대해 최적화된 코돈으로 합성된다. ddrAB 오페론은 제한 효소 SacI 및 KpnI을 갖는 pMTL83155-pddABC 안에 클로닝된다. 발생된 벡터인, pMTL83155-pddABC-ddrAB는 상기에서 기재된 바와 같이 C. 아우토에타노 게넘을 형질전환하기 위해 사용되어 MEK 및 2-부탄올로 메소-2,3-부탄디올의 전환을 개선한다.
메소-
2,3-
부탄디올의
생산을 위한 유전자를 갖는 발현 플라스미드의 구성 및
E.
콜라이
내에서
생체내
시험
C. 아우토에타노게넘에서 메소-2,3-부탄디올을 생산하는 흥미에서, 본 발명자들은 C. 아우토에타노게넘에서 중간체로서 존재되는 (R)-아세토인의 메소-2,3-부탄디올로 전환할 수 있는 것으로 클렙시엘라 뉴모니애로부터 budC (EC 1.1.1.303, Accession YP_001335719)를 동정하였다. 이 유전자는 (서열번호: 5)에 의해 클로스트리듐 아우토에타노게넘에 대해 최적화된 코돈으로 합성되고 그리고 추가적인 서브-클로닝을 위해 SalI 및 XhoI 제한 부위에 의해 플랭킹된 클로닝 벡터 pBSK에 수용된다. 피루베이트로부터 아세토인의 합성은 아세토락테이트 합성효소(ALS) 및 아세토락테이트 탈탄산효소(ALDC)의 연속적인 작용을 요하고, 그래서 이들 두 유전자를 구성하는 플라스미드가 제작되어 졌다. 먼저, 포스포트랜스아세틸라제-아세테이트 키나아제 오페론 (Ppta-ack) (서열번호: 1)의 프로모터 영역이 프라이머 Ppta-ack-NotI-F (서열번호: 2: GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC) 및 Ppta-ack-NdeI-R (서열번호: 3: TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC)을 사용하여 C. 아우토에타노게넘 DSM10061의 게놈 DNA로부터 증폭되고 그리고 NotI 및 NdeI 제한 부위를 사용하여 E. 콜라이 -클로스트리듐 셔틀 벡터 pMTL85141 (FJ797651.1; Nigel Minton, University of Nottingham, UK) [Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78: 79-85] 안에 클로닝되어, 플라스미드 pMTL85145를 생성한다. 다음으로, C. 아 우토에타노게넘으로부터 유전자 als는 프라이머 als-NdeI-F (서열번호: 7: GGAAGTTTCATATGAATAGAGATAT) 및 als-EcoR1-R (서열번호: 8: GGTATAGAATTCTGGTTTAATAGATAATGC)을 사용하여 증폭되고, 그리고 수득한 앰플리콘은 NdeI 및 EcoR1 제한 부위를 사용하여 pMTL85145 안으로 클로닝된다. ALDC는 그런 다음 프라이머 ALDC-EcoR1-F (서열번호:9: GCGAATTCGACATAGAGGTGAATGTAATATGG) 및 ALDC-SacI-R (서열번호: 10: GCGAGCTCTTATTTTTCAACACTTGTTATCTCA)을 사용하여 증폭에 의해 이 플라스미드 안으로 부가되고, 그런 다음 제한 부위 EcoR1 및 SacI을 사용하여 클로닝하여, 플라스미드 pMTL85145-ALS-ALDC를 생성한다. budC 유전자는 pMTL85145-ALS-ALDC 안에 클로닝된다. 이 컨스트럭트는 「Genetic Coli Stock Centre(GCSC)」로부터 수득된 E. 콜라이 JW1375 -1 (ldhA744(del)::kan)을 형질전환하기 위해 사용되어 진다. 수득한 균주는 대조군으로서 pMTL85145-ALS-ALDC-secAdh593을 장착한 균주와, 2% 글루코스를 갖는 M9 배지에서 혐기적으로 증식된다. 대조군 균주는 (D)-(-)-2,3-부탄디올을 생산하였고 그리고 검출가능한 메소--2,3-부탄디올은 없었다(도 2). budC를 갖는 컨스트럭트를 장착한 균주는 310 mg L-1 메소-(R,S)-2,3-부탄디올 및 소량의 (D)-(R,R)-2,3-부탄디올을 생산했다(도 2).
일산화탄소로부터 메소-
BDO
의 생산
C.
아우토에타노게넘
DSM23693
의 D-(-)-2,3-
부탄디올
디하이드로게나제의
불활성화:
C. 아우토에타노게넘 DSM23693에서 D-(-)-2,3-BDO 생산에 연루된 2,3-부탄디올 디하이드로게나제(2,3-bdh) 유전자가 ClosTron 그룹 II 인트론 매개 유전자 파괴 툴(Heap et al., 2010)을 사용하여 불활성화되었다. ClosTron.com에 있는 Perutka 알고리즘이 합성되어 pMTL007C-E5 벡터로 전달된 2,3-bdh 유전자의 센스 가닥 상의 염기 468과 469 사이에 그룹 II 인트론 표적 부위를 동정하기 위해 사용되어 졌다. 최종 벡터 pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s(서열번호: 11)는 표적 부위 안으로 삽입에 의해 항생제 클라리트로마이신에 대한 내성을 부여하는 레트로-트랜스포지션-활성화 ermB 마커 (RAM)를 함유한다.
pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s 플라스미드가 상기에서 기재된 바와 같이 C. 아우토에타노게넘 DSM23693 안으로 도입된다. 단일 콜로니의 백금니로 접종이 15㎍/ml 티암페니콜을 함유하는 PETC-MES 배지 상에 먼저 순차적으로 되고 그 다음 15㎍/ml 클라리트로마이신을 함유하는 PETC-MES 배지를 갖는 아가 플레이트 상에 된다. 플라스미드 당 4 콜로니가 2,3- bdh 유전자 내 그룹 II 인트론 삽입 사이트를 플랭킹하는 프라이머 Og42f (서열번호: 12) 및 Og43r (서열번호: 13)을 사용하여 PCR에 의해 그룹 II 인트론 삽입에 대해 무작위로 스크리닝 되었다. Maxime PCR PreMix Kit가 PCR을 위해 사용되었다. 16s rDNA가 또한 프라이머 fD1 (서열번호: 14) 및 rP2 (서열번호: 15) 및 Maxime PCR PreMix Kit를 사용하여 PCR 증폭되었다.
2,3
bdh
유전자 파열의 확인:
프라이머 Og42f / Of43r로 375 bp의 PCR 생성물의 증폭은 비변형된 야생형 2,3-bdh 유전자를 나타낸다. 동일한 셋트의 프라이머를 사용한 ~2 kb의 PCR 생성물의 증폭은 표적 유전자 안에 ClosTron 그룹 II 인트론의 삽입을 나타낸다. 2,3- bdh 유전자에 대해 표적화된 모든 4 클론은 ~2 kb PCR 생성물의 증폭에 의해 나타난 바와 같이 유전자 파괴에 대해 긍정적이다(도 3). 이들 결과는 C. 아우토에타노게넘 DSM23693에서 2,3- bdh 유전자의 파열을 확인한다
메소-2,3-
부탄디올
생성
디하이드로게나제의
발현
발현 벡터의 제작:
C. 아우토에타노게넘에서 메소-2,3-부탄디올을 생산하는 흥미에서, 발명자들은 C. 아우토에타노게넘에서 중간체로서 존재되는 (R)-아세토인의 메소-2,3-부탄디올로 전환할 수 있는 것으로 K. 뉴모니애로부터 budC (EC 1.1.1.303, Accession YP_001335719)를 동정하였다. 이 유전자는 추가적인 서브-클로닝을 위해 NdeI 및 EcoRI 제한 부위에 의해 플랭킹된 클로스트리듐 아우토에타노게넘 (서열번호: 5)에 대해 최적화된 코돈으로 합성된다. 먼저, 포스포트랜스아세틸라제-아세테이트 키나아제 오페론 (Ppta-ack)의 프로모터 영역이 pMTL85145 NotI 및 NdeI 제한 부위로부터 잘리고 그리고 NotI 및 NdeI로 절단된 pMTL83151 (FJ797651.1; Nigel Minton, University of Nottingham, UK) [Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78: 79-85] 안으로 클로닝되어, pMTL83155를 생산한다. 제한 부위 NdeI 및 EcoRI을 사용하여, K. 뉴모니애로부터 budC 유전자가 pMTL83155 안으로 클로닝되어 pMTL83155-KpBDH를 생산한다.
C. 아우토에타노게넘의 전환:
CO로부터 메소-2,3-부탄디올을 생산하기 위해, 발현 플라스미드인 pMTL83155-KpBDH가 사용되어 C. 아우토에타노게넘 DSM23693 및 티암페니콜 (15 mg L-1 ) 셀렉션으로 상기된 방법을 사용하여 파열된 2,3-bdh 유전자로 발생된 돌연변이체를 형질전환한다.
형질전환된 C. 아우토에타노게넘 내에서 메소-2,3- 부탄디올 생산:
메소-2,3-부탄디올의 생산을 시험하기 위해, 형질전환된 균주가 2-mL 배양물 안에 2 bar(g)로 실 제련 가스 상에서 증식되었다. 방해된 원상태 2,3-bdh 유전자를 갖는 돌연변이체의 배경에서 메소-2,3-부탄디올이, D-(-)-2,3부탄디올에 대한 메소-2,3-부탄디올의 5.4:1의 비율로 370 ± 70 mg L-1 (아홉 샘플의 평균 ± 하나의 표준 편차)가 생산되었다(도 4). 이 성장 실험의 샘플은 메소-부탄디올 디하이드로게나제 유전자의 발현에 대해 qRT-PCR에 의해 분석되었다(하기 참고).
연속적-
교반
탱크 반응기 (
CSTR
) 내에서 형질전환된 C.
아우토에타노게넘에
서 메소-2,3-
부탄디올
생산:
대략 1500mL의 용액 A(표 6)가 1.5L 발효조 안에 사입되고 그리고 질소로 충진된다. 레사쥬린(1.5mL의 2g/L 용액) 및 H3PO4(85% 용액, 2.25mL)이 부가되고 그리고 농축된 NH4OH(aq)를 사용하여 pH가 5.0으로 조정되었다. 니트리로트리아세트산 (0.3ml의 0.15M 용액)이 1.5ml의 용액 C(표 6)에 앞서 부가된다. 이것은 그 다음 NiCl2 (0.75ml의 0.1M 용액) 및 Na2WO3 (1.5mL의 0.01M 용액)이 부가된다. 15ml의 용액 B(표 6)가 부가되고 그리고 용액은 50mL/min로 CO 함유 가스(50% CO; 28% N2, 2% H2, 20% CO2)로 바꾸기 전에 N2로 충진된다. 발효조는 그런 다음 플라스미드 pMTL83155-KpBDH 및 파열된 D-(-)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 유전자를 갖는 200ml의 클로스트리듐 아우토에타노게넘 배양물로 접종되어 진다. 발효조는 37℃로 유지되고 그리고 200rpm로 교반된다. 이 실험 동안, Na2S 용액(0.2M 용액)이 대략적으로 0.1 ml/hour의 비율로 부가된다. 기질 공급은 미생물 배양물의 요구에 응하여 증가되어 진다.
발효 프로파일은 도 5에 도시되어 졌다. 메소-BDO의 생산이 다중 샘플링 포인트에 걸친 연속적 발효에서 0.2 g/L의 농도와 D-(-)-형으로 1:1의 비율로 확인되었다(도 5+6). 이 반응기의 샘플은 메소-부탄디올 디하이드로게나제 유전자의 발현에 대해 qRT-PCR에 의해 분석되어 졌다(하기 참고).
| 용액 A | |||
| NH4Ac | 3.083g | KCl | 0.15g |
| MgCl2.6H2O | 0.4g | NaCl (선택) | 0.12g |
| CaCl2.2H2O | 0.294g | 증류수 | 최대 1L |
| 용액 B | |||
| 바이오틴 | 20.0 mg | 칼슘 D-(*)-판토테네이트 | 50.0 mg |
| 엽산 | 20.0 mg | 비타민 B12 | 50.0 mg |
| 피리독신. HCl | 10.0 mg | p-아미노벤조산 | 50.0 mg |
| 티아민. HCl | 50.0 mg | 티옥산 | 50.0 mg |
| 리보플라빈 | 50.0 mg | 증류수 | 1 리터까지 |
| 니코틴산 | 50.0 mg | ||
| 용액 C | |||
| 성분 | mmol /L H 2 O | 성분 | mmol /L H 2 O |
| FeCl3 | 0.1 | Na2SeO3 | 0.01 |
| CoCl2 | 0.05 | Na2MoO4 | 0.01 |
| NiCl2 | 0.05 | ZnCl2 | 0.01 |
| H3BO3 | 0.01 | MnCl2 Na2WO3 |
0.01 0.01 |
샘플링 및 분석적 절차
배지 샘플이 각 발효의 경로에 걸쳐 일정 간격으로 CSTR 반응기로부터 취해졌다. 배지가 샘플링되어 지는 매번, 반응기 안으로 유입하는 또는 반응기로부터 유출하는 가스가 없는 것을 확실하게 하는 주의가 기울어졌다.
HPLC
:
HPLC 시스템 Agilent 1100 시리즈. 이동상: 0.0025N 황산. 유동 및 압력: 0.800mL/min. 칼럼: Alltech IOA; Catalog # 9648, 150 x 6.5 mm, 입자 크기 5㎛. 칼럼의 온도: 60℃. 검출기: 굴절 지수. 검출기의 온도: 45℃.
샘플 제조를 위한 방법:
400μL의 샘플 및 50μL의 0.15M ZnSO4 및 50μL의 0.15M Ba(OH)2가 에펜도르프 튜브 안으로 적하되어 졌다. 튜브는 10분 동안, 12,000rpm, 4℃에서 원심분리되어 졌다. 200μL의 상등액이 HPLC 바이알로 이동되고 그리고 5μL가 HPLC 기기 안으로 주입되었다.
상부공간 분석:
측정은 두 개의 설치 채널을 갖는 Varian CP-4900 micro GC 상에서 수행되어 졌다. 채널 1은 70℃에서 200kPa 아르곤 및 4.2s의 백플러쉬 시간으로 흐르는 10m Mol-시브 칼럼이고, 반면 채널 2는 90℃에서, 150kPa 헬륨 및 백플러쉬 없이 흐르는 10m PPQ 칼럼이다. 양 채널에 대한 인젝터 온도는 70℃이다. 주행시간은 120s로 설정되지만, 그러나 모든 대상 피크는 보통 100s 전에 용리하였다.
세포 밀도:
세포 밀도는 규정된 분취량의 발효 배양액에서 박테리아 세포를 계수함에 의해 결정되어 졌다. 대안적으로, 샘플의 흡광도가 600nm에서 측정되었고(분광측정기) 그리고 건조 질량이 공개된 절차에 따른 계산을 통해 결정되었다.
메소-2,3- 부탄디올 디하이드로게나제 budC 유전자 발현의 발현:
qRT-PCR 실험이 상기한 12-웰 플레이트 및 연속적 발효에서 증식 연구에서 C. 아우토에타노게넘 내에 메소-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 budC 유전자의 도입의 성공적인 발현을 확인하기 위해 수행되어 졌다. 비록 올리고뉴클레오티드 쌍 KpBDH-F 및 R을 사용한 야생-표준 균주로 관찰된 증폭은 없지만, 유사한 수준에서 양 성장 연구에 대해 플라스미드 pMTL83155-KpBDH를 담지하는 균주에 대해서는 신호가 측정되어, 메소-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 budC 유전자 성공적인 발현을 확인하였다(도 7).
12-웰-플레이트에서 성장 실험의 1mL 샘플(실험 1) 및 연속적 반응기로부터 4,5mL 샘플(실험 2)이 취해졌다. 샘플은 수집 바로 추출되어 졌다. 배양물은 원심분리되었다(5,000 x RPM, 10분, 4℃). 총 RNA는 프로토콜에 따라 RiboPureTM (Ambion)을 사용하여 단리되어 졌다. 세포의 파열은 1분 쉐이크와 1분 얼음으로 하는 삼 회 주기로 BeadBeater (Biospec)를 사용하여 수행되어 지고, 용출은 50μL의 RNase/DNase-없는 물에서 수행되어 졌다. TURBOTM DNase (Ambion)를 사용하여 DNase I 처리 후, 그런 다음 SuperScript III 역전사효소 Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 역전사 단계가 수행되어 졌다. RNA가 NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)을 사용하여 체크되어 졌다. non-RT 대조가 모든 올리고뉴클레오티드 쌍에 대해 수행되어 졌다. 모든 qRT-PCR 반응은 2ng/μL의 cDNA 템플레이트, 67nM의 각 올리고뉴클레오티드(표 7), 및 1x iQ™ SYBR® 그린 슈퍼믹스(Bio-Rad Labratories, Carlsbad, CA, USA)를 갖는 25μL의 총 반응 부피에서 MyiQ™ 단일 칼라 검출 시스템 (Bio-Rad Labratories, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 삼중으로 수행되어 졌다. 반응 조건은 95℃에서 10분이고, 그 다음 15s 동안 95℃와 1분 동안 72℃의 40회 주기가 따랐다. 증폭의 올리고뉴클레오티드 이량체화 및 기타 인공물의 검출을 위해 용융-곡선 분석이 qPCR의 성취 후(0.5℃/s로 40℃ 내지 95℃의 111 주기) 바로 수행되어 졌다.
| 표적 | 올리고뉴클레 오타이드 명 | DNA 서열 (5' 내지 3') | 서 열번 호: |
| 구아닐레이트 키나아제 (gnk) | GnK-F | TCAGGACCTTCTGGAACTGG | 35 |
| GnK-R | ACCTCCCCTTTTCTTGGAGA | 36 | |
| 포르메이트 테트라하이드로폴레이트 리가제 (FoT4L) | FoT4L-F | CAGGTTTCGGTGCTGACCTA | 37 |
| FoT4L-F | AACTCCGCCGTTGTATTTCA | 38 | |
| 메소-2,3- 부탄디올 디하이드로게나제 budC | KpBDH -F | AAGTTTCTGAGGCTGCAGGT | 39 |
| 메소-2,3- 부탄디올 디하이드로게나제 budC | KpBDH -R | GCTGCAACATCTTCAGGTTCA | 40 |
일산화탄소로부터
MEK
및 2-
부탄올의
생산
CO로부터 2-부탄올 생산을 위해, 클렙시엘라 뉴모니아로부터 메소-23-부탄디올 디하이드로게나제 유전자 budC 및 클렙시엘라 옥시토카로부터 디올 디하이드라타제 유전자 pddABC가 클로스트리듐 아우토에타노게넘과 같은 일산화탄소영양성 아세토겐 안으로 동시에 도입되어 진다. 2-부탄올 대신에 MEK의 생산을 위해, 알코올 디하이드로게나제가 넉-아웃되어 졌다.
발현 벡터의 제작
CO로부터 MEK 또는 2-부탄올의 생산은 메소-2,3-부탄디올 생산하는 부탄디올 디하이드로게나제 및 MEK로 2,3-부탄디올을 전환할 수 있는 디올 디하이드라타제를 필요로 한다. 이러한 목적을 위해, 발현 벡터가 양 유전자를 발현하기 위해 제작되어 진다. K. 뉴모니애로부터 코돈 최적화된 budC 유전자가 SalI 및 XhoI로 pBSK-KpBDH로부터 절단되어 지고 pMTL83155-pddABC의 SalI 사이트 안에 클로닝된다.
C. 아우토에타노게넘 및 유도체 균주의 형질전환
이 벡터는 상기에서 기재된 바와 같이 불활성화된 원상태 디하이드로게나제로 C. 아우토에타노게넘 및 유도체 균주를 형질전환하기 위해 사용되어 졌다. 다양한 생성된 균주는 그런 다음 제련 가스 상에서 증식되고 그리고 원하는 대사물의 생산에 대해 시험된다.
D-(-)-2,3-
부탄디올
디하이드로게나제
및 알코올
디하이드로게나제
양자의 넉아웃
D-(-)-2,3-부탄디올의 생산 및 2-부탄올로 MEK의 전환, 양자를 제거하기 위해, 원상태 D-(-)-부탄디올 디하이드로게나제 및 알코올 디하이드로게나제 양자가 제거되어 진다.
이것은 실시예 1 및 실시예 3에서 기술된 바와 같은 ClosTron 툴을 사용하여 두 가지 방법 (a) 상동 재조합 및 (b) 마커 리스 유전자 파열에 의해 달성되어 질 수 있다.
(a) 상동 재조합에 의한 Δ2,3
bdh
Δ
SecAdh
이중 녹아웃 C.
아우토에타노게
넘
DSM23693
균주:
2,3bdh 유전자의 ~1 kb 5'(서열번호: 16) 및 3'(서열번호: 17) 상동성 아암이 C. 아우토에타노게넘 DSM23693 게놈 DNA를 사용하여 PCR 증폭되었다. 프라이머 Og13f (서열번호: 18)/Og14r (서열번호: 19) 및 Og15f (서열번호: 20)/Og16r (서열번호: 21)이 각각 5' 및 3' 상동성 아암을 증폭하기 위해 사용되었다. 두 PCR 생성물이 pMTL85151-2,3bdh-KO를 얻기 위해 Sbf1/Not1 및 Nhe1/Asc1 사이트 사이 pMTL85151 플라스미드 안에 클로닝되었다. 이 플라스미드는 상기 실시예에 기술된 바와 같이 어느 하나의 컨쥬게이션 또는 전기천공에 의해 C. 아우토에타노게넘 DSM23693 안으로 도입된다. 티암페니콜 플레이트 상에서 셀렉션에 따라 형질전환체가 이 PCR 생성물의 서열분석과 PCR에 대한 2,3bdh의 상동성 아암을 플랭킹하는 프라이머 Og33f (서열번호: 22) 및 Og34r (서열번호: 23)을 사용하여 2,3bdh 녹아웃을 위해 스크리닝된다.
SecAdh 유전자 녹아웃을 위한 플라스미드는 유사하게 제작될 수 있다. 2,3bdh 유전자의 ~1 kb 5'(서열번호: 24) 및 3'(서열번호: 25) 상동성 아암이 C. 아우토에타노게넘 DSM23693 게놈 DNA를 사용하여 PCR 증폭되었다. 프라이머 Sec5f (서열번호: 26)/Sec5r (서열번호: 27) 및 Sec3f (서열번호: 28)/Sec3r (서열번호: 29)이 각각 5' 및 3' 상동성 아암을 증폭하기 위해 사용되었다. 두 PCR 생성물이 pMTL85151-SecAdh-KO를 얻기 위해 Sbf1/Not1 및 Nhe1/Asc1 사이트 사이 pMTL85151 플라스미드 안에 클로닝되었다. 티암페니콜 플레이트 상에서 셀렉션에 따라 형질전환체가 PCR에 대한 SecAdh 유전자의 상동성 아암을 플랭킹하는 프라이머 SecO5f (서열번호: 30) 및 SecO5r (서열번호: 31)을 사용하여 SecAdh 녹아웃을 위해 스크리닝될 수 있다.
C. 아우토에타노게넘 DSM23693 안의 2,3bdh 또는 the SecAdh 유전자 중 어느 하나의 녹아웃이 일단 달성되면, 이들 단일 돌연변이체 내의 제2 유전자가 pMTL85151-2,3bdh-KO 또는 pMTL85151-SecAdh-KO 플라스미드 중 어느 하나를 사용하여 표적화되어 진다. 플라스미드는 상기에 기술된 바와 같이 어느 하나의 전기천공에 의해 단일 유전자 녹아웃 돌연변이체 안으로 도입된다. 형질전환체는 상응하는 유전자의 상동성 아암을 플랭킹하는 프라이머를 사용하여 제2 유전자의 녹아웃을 위해 스크리닝될 수 있다.
(b)
ClosTron
을 사용하여 Δ2,3
bdh
Δ
SecAdh
이중 유전자 파열:
ClosTron 그룹 II 인트론 컨스트럭트 내 RAM ermB 카세트가 플립파제 재조합 사이트(Frt)에 의해 플랭킹된다. 컨쥬게이션 또는 전기천공의 어느 하나에 의해 Δ2,3bdh ClosTron 돌연변이체 안에 플립파제 재조합효소를 도입함에 의해, ~1.3 kb의 RAM ermB 마커가 돌연변이체의 게놈으로부터 제거되어 질 수 있고 그리고 따라서 ermB 마커가 재순환되어 질 수 있다. ~0.8 kb 단편의 그룹 II 인트론은 게놈 상에 남을 것이다. 이것은 (i) 클라리트로마이신에 대한 그의 민감성을 시험함에 의해, 그리고 (ii) 프라이머 Og42f (서열번호: 12) 및 Og43r (서열번호: 13)로 그룹 II 인트론 삽입 사이트를 플랭킹하는 프라이머로 PCR 및 PCR 생성물의 서열분석함에 의해 확인되어 질 수 있다. RAM ermB 마커(Δ2,3bdh-ermB ClosTron) 없이 Δ2,3bdh ClosTron 돌연변이체가 일단 얻어지면, 돌연변이체 내 SecAdh 유전자가 ClosTron 그룹 II 인트론 삽입의 불활성화 툴을 사용하여 유사한 방법으로 표적화된다. 염기 399 및 400 사이 인트론 삽입 사이트가 ClosTron.com에 있는 Perutka 알고리즘을 사용하여 SecAdh 유전자에서 확인되어 졌고 그리고 인트론 표적화 카세트가 설계되어 졌다(서열번호: 22). 인트론 표적화 카세트는 DNA2.0에 의해 상업적으로 합성되고 그리고 컨쥬게이션 또는 전기천공 중 어느 하나에 의해 Δ2,3bdh-ermB ClosTron 돌연변이체 안으로 도입되어 질 수 있는 pMTL007C-E5-SecAdh-399!400s로서 pMTL007C-E2 벡터 안에 전달된다. 형질전환체는 티암페니콜 및 클라리트로마이신 아가 플레이트 상에서 순차적으로 선정될 수 있고 그리고 상기에서 설명된 바와 같이 프라이머 SecCTf (서열번호: 33) 및 SecCTr (서열번호: 34)로 PCR에 의해 스크리닝된다.
본 발명은 독자가 과도한 실험 없이 본 발명을 실시할 수 있도록 어떤 바람직한 구현예를 참고로 하여 여기에 기술되어 졌다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 성분 및 변수의 많은 부분이 본 발명의 범위에서 벗어남이 없이 어느 정도로 변화 또는 변형되어 질 수 있거나 또는 알려진 등가물로 치환될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 이러한 변형 및 등가물은 개별적으로 제시되어 진 것처럼 여기에 편입되어 진다고 인정되어 져야 한다. 명칭, 제목, 등은 본 문헌의 독자의 이해를 높이기 위해 제공되어 지는 것이고, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것으로 해석되어서는 안된다.
위에서 그리고 아래에서 인용된 모든 출원, 특허 및 공보의 전체 개시내용은, 만일 있다면 이로써 참고로 여기에 편입된다. 그러나, 본 명세서에서 어떤 출원, 특허 및 공보에 대한 참조는 이들이 유효한 선행기술을 구성한다거나 세계의 어떤 국가에서 공통된 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 인지 또는 어떤 형태의 암시도 아니고, 그리고 이러한 것으로 취해져서도 아니 된다.
본 명세서 및 이하의 청구항 전체를 통하여, 문맥상 달리 요하지 않는 한, 단어 "포함한다", "포함하는" 등은 배타적인 의미에 반하는 것으로 포괄적인 의미, 즉 "함유하지만, 여기에 한정되지는 않는"의 의미인 것으로 해석되어 지는 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> LanzaTech New Zealand Limited
<120> Recombinant microorganisms and uses therefor
<130> LT81
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 479
<212> DNA
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 1
aatatgatat ttatgtccat tgtgaaaggg attatattca actattattc cagttacgtt 60
catagaaatt ttcctttcta aaatatttta ttccatgtca agaactctgt ttatttcatt 120
aaagaactat aagtacaaag tataaggcat ttgaaaaaat aggctagtat attgattgat 180
tatttatttt aaaatgccta agtgaaatat atacatatta taacaataaa ataagtatta 240
gtgtaggatt tttaaataga gtatctattt tcagattaaa tttttgatta tttgatttac 300
attatataat attgagtaaa gtattgacta gcaaaatttt ttgatacttt aatttgtgaa 360
atttcttatc aaaagttata tttttgaata atttttattg aaaaatacaa ctaaaaagga 420
ttatagtata agtgtgtgta attttgtgtt aaatttaaag ggaggaaatg aacatgaaa 479
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide Ppta-ack-NotI-F
<400> 2
gagcggccgc aatatgatat ttatgtcc 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide Ppta-ack-NdeI-R
<400> 3
ttccatatgt ttcatgttca tttcctcc 28
<210> 4
<211> 2951
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon optimised pddABC operon
<400> 4
catatgagaa gtaaaagatt tgaggcatta gcaaaaagac cagttaatca agatggattt 60
gtaaaagaat ggattgaaga aggtttcata gcaatggaat ctccaaatga tccaaaacca 120
agtattaaaa ttgtaaatgg tgctgtaaca gaacttgatg gaaaacctgt atctgatttt 180
gacttaatag atcattttat agcaagatat ggaataaact taaatagagc tgaagaagtt 240
atggctatgg atagtgttaa acttgctaat atgctttgtg atcctaatgt aaaaagatct 300
gagattgtac ctttaactac agcaatgact cctgctaaga tagtagaagt tgtatcacac 360
atgaatgtag tagagatgat gatggcaatg cagaaaatga gagctagaag aactccatca 420
caacaagcac atgtaactaa cgttaaagat aacccagtac aaatagcagc agatgctgca 480
gaaggtgctt ggagaggttt tgacgaacaa gaaactacag ttgcagttgc aagatatgct 540
ccttttaatg ctattgctct tttagttgga tcacaggttg gtagaccagg tgtacttaca 600
caatgtagtt tagaagaagc tactgagctt aaattaggaa tgcttggaca tacatgttat 660
gcagaaacta taagtgttta cggaacagaa cctgttttta cagatggtga tgatactcca 720
tggtctaagg gatttcttgc atcatcatac gcatcaagag gtttaaagat gagatttact 780
tctggatctg gatctgaagt tcagatggga tatgctgaag gtaagagtat gttatatctt 840
gaagctagat gtatatatat aacaaaagct gcaggtgttc aaggattaca aaacggatca 900
gtatcatgca taggtgtacc aagtgcagtt ccatcaggaa ttagagctgt tcttgctgaa 960
aacttaatat gtagttcatt agatttagag tgcgcaagtt ctaatgatca gacatttact 1020
cattcagata tgagaagaac agctagatta cttatgcagt ttcttcctgg aactgatttc 1080
ataagttctg gatattcagc tgtacctaat tacgataata tgtttgctgg aagtaatgaa 1140
gatgctgaag actttgatga ttataatgta atacaaagag acttaaaggt agacggtggt 1200
ttaagaccag taagagaaga agatgtaata gcaataagaa ataaggctgc tagagcactt 1260
caggcagtat tcgcaggtat gggtttacct cctataacag atgaagaagt tgaagcagct 1320
acttatgctc atggttctaa ggatatgcct gaaagaaata ttgttgaaga tataaagttc 1380
gctcaggaaa ttataaataa gaatagaaat ggacttgaag tagttaaagc attagcacag 1440
ggtggtttta ctgatgttgc acaagatatg cttaatattc agaaagctaa attaactggt 1500
gattatttac acacatcagc aataattgtt ggtgacggac aagtattatc agcagtaaac 1560
gatgtaaatg actatgctgg accagctaca ggatatagac ttcaaggtga aagatgggaa 1620
gagataaaga atataccagg tgcacttgat ccaaatgaaa tagattaatt gaacacacaa 1680
aaaaaataat taataaggag gcaaacaaat ggaaataaat gaaaaacttt taagacagat 1740
aattgaagat gtactttcag aaatgaaagg aagtgataaa cctgtatcat ttaatgcacc 1800
tgctgctagt gcagctcctc aagcaactcc tcctgctggt gacggattct taactgaagt 1860
tggtgaagct agacaaggaa cacaacaaga tgaagtaata atagctgttg gaccagcatt 1920
tggattagct cagactgtaa atatagtagg tattccacac aaatcaatac ttagagaagt 1980
tatagctgga atagaagaag aaggtataaa ggcaagagtt attagatgtt ttaagtcttc 2040
tgatgtagca tttgttgctg ttgaaggtaa tagactttct ggatcaggaa taagtattgg 2100
aatacaatca aaaggaacaa cagttattca tcagcaagga ttaccaccac ttagtaacct 2160
tgaacttttt cctcaagcac cattattaac attagagact tatagacaaa taggtaagaa 2220
tgctgctaga tacgcaaaaa gagagtcacc acagccagta ccaactttaa acgatcaaat 2280
ggcaagacct aaatatcagg caaaatctgc aattttacat ataaaagaga ctaaatatgt 2340
agtaacagga aagaatccac aggaacttag agtagcatta taaaaataaa tagtagatat 2400
ataaagtaaa aggaggtaag ataatgaata cagacgcaat agaatcaatg gtaagagatg 2460
tactttcaag aatgaactct ttacaaggag aagctccagc agcagctcca gcagcaggtg 2520
gtgcaagtag aagtgctaga gtttcagatt atccattagc taataagcat cctgaatggg 2580
ttaaaactgc aacaaacaaa actttagatg attttactct tgaaaatgtt ctttcaaata 2640
aagtaactgc tcaggatatg agaattactc cagaaacact tagattacag gctagtatag 2700
ctaaggatgc tggaagagac agattagcta tgaattttga aagagcagct gagttaactg 2760
ctgttcctga tgatagaata ttagaaatat acaatgctct tagaccttat agatctacaa 2820
aagaagaact tttagcaata gcagatgatc ttgagtctag atatcaagca aaaatttgtg 2880
cagcattcgt aagagaagca gctacacttt atgtagagag aaagaaatta aaaggagatg 2940
attaagaatt c 2951
<210> 5
<211> 780
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon optimised budC gene
<400> 5
catatgaaaa aggttgcatt agttacagga gcaggacaag gtataggaaa ggctatagca 60
cttagacttg taaaagatgg atttgcagtt gctattgcag attataacga tactacagct 120
aaagcagttg cttcagaaat taatcaagca ggtggtagag caatggctgt aaaagttgat 180
gttagtgata gagaccaggt ttttgctgct gttgaacaag ctagaaagac attaggtggt 240
tttgatgtaa tagttaataa tgctggtgta gctccatcaa ctccaattga atctataact 300
ccagaaatag tagacaaagt atataatata aacgtaaaag gtgtaatatg gggtatacaa 360
gcagcagtag aagcattcaa gaaagaagga cacggtggta aaataataaa tgcttgttct 420
caggctggtc atgtaggtaa tccagaatta gcagtatact catcatcaaa gtttgcagta 480
agaggtctta cacaaacagc agctagagat cttgctccat taggaattac agtaaatgga 540
tattgccctg gaattgttaa gactcctatg tgggcagaga ttgatagaca agtttctgag 600
gctgcaggta aacctttagg atatggaact gcagagtttg caaagagaat tactcttggt 660
agacttagtg aacctgaaga tgttgcagct tgtgtaagtt atttagcttc acctgatagt 720
gattatatga caggacagtc tcttttaatt gacggtggta tggtatttaa ttaagaattc 780
<210> 6
<211> 2254
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon optimised ddrAB operon
<400> 6
gagctcagga ggtttactca tgagatatat agctggaata gatataggaa atagtagtac 60
tgaagtagca ttagcaactt tagatgaagc tggagcatta actataactc atagtgcatt 120
agcagaaact actggaataa aaggaacttt aagaaatgta tttggaatac aagaagcatt 180
agcattagta gcaagaggag ctggaatagc agtaagtgat ataagtttaa taagaataaa 240
tgaagcaact cctgtaatag gagatgtagc aatggaaact ataactgaaa ctataataac 300
tgaaagtact atgataggac ataatcctaa aacacctgga ggagcaggat taggaactgg 360
aataactata acacctcaag aattattaac tagacctgca gatgcacctt atatattagt 420
agtaagtagt gcatttgatt ttgcagatat agcaagtgta ataaatgcaa gtttaagagc 480
aggatatcaa ataactggag taatattaca aagagatgat ggagtattag taagtaatag 540
attagaaaaa cctttaccta tagtagatga agttttatat atagatagaa tacctttagg 600
aatgttagca gcaatagaag tagcagtacc tggaaaagta atagaaactt taagtaatcc 660
ttatggaata gcaactgtat ttaatttaag tcctgaagaa actaaaaata tagtacctat 720
ggcaagagca ttaataggaa atagatctgc agtagtagta aaaactccta gtggagatgt 780
aaaagcaaga gcaatacctg ctggaaattt agaattatta gcacaaggaa gatctgtaag 840
agtagatgta gctgctggag ctgaagcaat aatgaaagca gtagatggat gtggaagatt 900
agataatgta actggagaaa gtggaacaaa tataggagga atgttagaac atgtaagaca 960
aactatggca gaattaacta ataaacctag tagtgaaata tttatacaag atttattagc 1020
agtagatact agtgtacctg taagtgtaac tggaggatta gctggagaat ttagtttaga 1080
acaagcagta ggaatagcaa gtatggtaaa aagtgataga ttacaaatgg caatgatagc 1140
aagagaaata gaacaaaaat taaatataga tgtacaaata ggaggagcag aagcagaagc 1200
agcaatatta ggagcattaa caacacctgg aactactaga cctttagcaa tattagattt 1260
aggagcagga tctactgatg caagtataat aaatcctaaa ggagatataa tagcaactca 1320
tttagctgga gctggagata tggtaactat gataatagct agagaattag gattagaaga 1380
tagatattta gcagaagaaa taaaaaaata tcctttagca aaagtagaaa gtttatttca 1440
tttaagacat gaagatggaa gtgtacaatt ttttagtact cctttacctc ctgcagtatt 1500
tgcaagagta tgtgtagtaa aagcagatga attagtacct ttacctggag atttagcatt 1560
agaaaaagta agagctataa gaagatctgc aaaagaaaga gtatttgtaa ctaatgcatt 1620
aagagcttta agacaagtaa gtcctactgg aaatataaga gatatacctt ttgtagtatt 1680
agttggagga agtagtttag attttgaagt acctcaatta gtaactgatg cattagcaca 1740
ttatagatta gtagctggaa gaggaaatat aagaggatct gaaggaccta gaaatgcagt 1800
agcaacagga ttaatattaa gttggcataa agaatttgca catgaaagat aacaatgtag 1860
gaggttaact atgaatggaa atcatagtgc accagcaata gcaatagcag taatagatgg 1920
atgtgatgga ttatggagag aagtattatt aggaatagaa gaagaaggaa taccttttag 1980
attacaacat catcctgctg gagaagtagt agatagtgca tggcaagcag caagaagtag 2040
tcctttatta gtaggaatag catgtgatag acatatgtta gtagtacatt ataaaaattt 2100
acctgcaagt gcacctttat ttactttaat gcatcatcaa gatagtcaag cacatagaaa 2160
tactggaaat aatgcagcaa gattagtaaa aggaatacca tttagagatt taaatagtga 2220
agcaactgga gaacaacaag atgaataagg tacc 2254
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide als-NdeI-F
<400> 7
ggaagtttca tatgaataga gatat 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide als-EcoR1-R
<400> 8
ggaagtttca tatgaataga gatat 25
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide als-NdeI-F
<400> 9
gcgaattcga catagaggtg aatgtaatat gg 32
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide als-EcoR1-R
<400> 10
gcgagctctt atttttcaac acttgttatc tca 33
<210> 11
<211> 9052
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> plasmid pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s
<400> 11
cctgcagggt gtagtagcct gtgaaataag taaggaaaaa aaagaagtaa gtgttatata 60
tgatgattat tttgtagatg tagataggat aatagaatcc atagaaaata taggttatac 120
agttatataa aaattacttt aaaaattaat aaaaacatgg taaaatataa atcgtataaa 180
gttgtgtaat ttttaagcta aaaaagctta taattatcct tagcactcgt tgaggtgcgc 240
ccagataggg tgttaagtca agtagtttaa ggtactactc tgtaagataa cacagaaaac 300
agccaaccta accgaaaagc gaaagctgat acgggaacag agcacggttg gaaagcgatg 360
agttacctaa agacaatcgg gtacgactga gtcgcaatgt taatcagata taaggtataa 420
gttgtgttta ctgaacgcaa gtttctaatt tcgattagtg ctcgatagag gaaagtgtct 480
gaaacctcta gtacaaagaa aggtaagtta ggctcaacga cttatctgtt atcaccacat 540
ttgtacaatc tggtacaatc tgtaggagaa cctatgggaa cgaaacgaaa gcgatgccga 600
gaatctgaat ttaccaagac ttaacactaa ctggggatac cctaaacaag aatgcctaat 660
agaaaggagg aaaaaggcta tagcactaga gcttgaaaat cttgcaaggg tacggagtac 720
tcgtagtagt ctgagaaggg taacgccctt tacatggcaa aggggtacag ttattgtgta 780
ctaaaattaa aaattgatta gggaggaaaa cctcaaaatg aaaccaacaa tggcaatttt 840
agaaagaatc agtaaaaatt cacaagaaaa tatagacgaa gtttttacaa gactttatcg 900
ttatctttta cgtccagata tttattacgt ggcgacgcgt gaagttccta tactttctag 960
agaataggaa cttcgcgact catagaatta tttcctcccg ttaaataata gataactatt 1020
aaaaatagac aatacttgct cataagtaac ggtacttaaa ttgtttactt tggcgtgttt 1080
cattgcttga tgaaactgat ttttagtaaa cagttgacga tattctcgat tgacccattt 1140
tgaaacaaag tacgtatata gcttccaata tttatctgga acatctgtgg tatggcgggt 1200
aagttttatt aagacactgt ttacttttgg tttaggatga aagcattccg ctggcagctt 1260
aagcaattgc tgaatcgaga cttgagtgtg caagagcaac cctagtgttc ggtgaatatc 1320
caaggtacgc ttgtagaatc cttcttcaac aatcagatag atgtcagacg catggctttc 1380
aaaaaccact tttttaataa tttgtgtgct taaatggtaa ggaatactcc caacaatttt 1440
atacctctgt ttgttaggga attgaaactg tagaatatct tggtgaatta aagtgacacg 1500
agtattcagt tttaattttt ctgacgataa gttgaataga tgactgtcta attcaataga 1560
cgttacctgt ttacttattt tagccagttt cgtcgttaaa tgccctttac ctgttccaat 1620
ttcgtaaacg gtatcggttt cttttaaatt caattgtttt attatttggt tgagtacttt 1680
ttcactcgtt aaaaagtttt gagaatattt tatatttttg ttcataccag caccagaagc 1740
accagcatct cttgggttaa ttgaggcctg agtataaggt gacttatact tgtaatctat 1800
ctaaacgggg aacctctcta gtagacaatc ccgtgctaaa ttgtaggact gccctttaat 1860
aaatacttct atatttaaag aggtatttat gaaaagcgga atttatcaga ttaaaaatac 1920
tttctctaga gaaaatttcg tctggattag ttacttatcg tgtaaaatct gataaatgga 1980
attggttcta cataaatgcc taacgactat ccctttgggg agtagggtca agtgactcga 2040
aacgatagac aacttgcttt aacaagttgg agatatagtc tgctctgcat ggtgacatgc 2100
agctggatat aattccgggg taagattaac gaccttatct gaacataatg ccatatgaat 2160
ccctcctaat ttatacgttt tctctaacaa cttaattata cccactatta ttatttttat 2220
caatatagaa gttcctatac tttctagaga ataggaactt cacgcgttgg gaaatggcaa 2280
tgatagcgaa acaacgtaaa actcttgttg tatgctttca ttgtcatcgt cacgtgattc 2340
ataaacacaa gtgaatgtcg acagtgaatt tttacgaacg aacaataaca gagccgtata 2400
ctccgagagg ggtacgtacg gttcccgaag agggtggtgc aaaccagtca cagtaatgtg 2460
aacaaggcgg tacctcccta cttcaccata tcattttctg cagcccccta gaaataattt 2520
tgtttaactt taagaaggag atatacatat atggctagat cgtccattcc gacagcatcg 2580
ccagtcacta tggcgtgctg ctagcgctat atgcgttgat gcaatttcta tgcactcgta 2640
gtagtctgag aagggtaacg ccctttacat ggcaaagggg tacagttatt gtgtactaaa 2700
attaaaaatt gattagggag gaaaacctca aaatgaaacc aacaatggca attttagaaa 2760
gaatcagtaa aaattcacaa gaaaatatag acgaagtttt tacaagactt tatcgttatc 2820
ttttacgtcc agatatttat tacgtggcgt atcaaaattt atattccaat aaaggagctt 2880
ccacaaaagg aatattagat gatacagcgg atggctttag tgaagaaaaa ataaaaaaga 2940
ttattcaatc tttaaaagac ggaacttact atcctcaacc tgtacgaaga atgtatattg 3000
caaaaaagaa ttctaaaaag atgagacctt taggaattcc aactttcaca gataaattga 3060
tccaagaagc tgtgagaata attcttgaat ctatctatga accggtattc gaagatgtgt 3120
ctcacggttt tagacctcaa cgaagctgtc acacagcttt gaaaacaatc aaaagagagt 3180
ttggcggcgc aagatggttt gtggagggag atataaaagg ctgcttcgat aatatagacc 3240
acgttacact cattggactc atcaatctta aaatcaaaga tatgaaaatg agccaattga 3300
tttataaatt tctaaaagca ggttatctgg aaaactggca gtatcacaaa acttacagcg 3360
gaacacctca aggtggaatt ctatctcctc ttttggccaa catctatctt catgaattgg 3420
ataagtttgt tttacaactc aaaatgaagt ttgaccgaga aagtccagaa agaataacac 3480
ctgaatatcg ggagctccac aatgagataa aaagaatttc tcaccgtctc aagaagttgg 3540
agggtgaaga aaaagctaaa gttcttttag aatatcaaga aaaacgtaaa agattaccca 3600
cactcccctg tacctcacag acaaataaag tattgaaata cgtccggtat gcggacgact 3660
tcattatctc tgttaaagga agcaaagagg actgtcaatg gataaaagaa caattaaaac 3720
tttttattca taacaagcta aaaatggaat tgagtgaaga aaaaacactc atcacacata 3780
gcagtcaacc cgctcgtttt ctgggatatg atatacgagt aaggagatct ggaacgataa 3840
aacgatctgg taaagtcaaa aagagaacac tcaatgggag tgtagaactc cttattcctc 3900
ttcaagacaa aattcgtcaa tttatttttg acaagaaaat agctatccaa aagaaagata 3960
gctcatggtt tccagttcac aggaaatatc ttattcgttc aacagactta gaaatcatca 4020
caatttataa ttctgaactc cgcgggattt gtaattacta cggtctagca agtaatttta 4080
accagctcaa ttattttgct tatcttatgg aatacagctg tctaaaaacg atagcctcca 4140
aacataaggg aacactttca aaaaccattt ccatgtttaa agatggaagt ggttcgtggg 4200
ggatcccgta tgagataaag caaggtaagc agcgccgtta ttttgcaaat tttagtgaat 4260
gtaaatcccc ttatcaattt acggatgaga taagtcaagc tcctgtattg tatggctatg 4320
cccggaatac tcttgaaaac aggttaaaag ctaaatgttg tgaattatgt gggacgtctg 4380
atgaaaatac ttcctatgaa attcaccatg tcaataaggt caaaaatctt aaaggcaaag 4440
aaaaatggga aatggcaatg atagcgaaac aacgtaaaac tcttgttgta tgctttcatt 4500
gtcatcgtca cgtgattcat aaacacaagt gaatgtcgag cacccgttct cggagcactg 4560
tccgaccgct ttggccgccg cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgac 4620
tacgcgatca tggcgaccac acccgtcctg tggatcgcca agccgccgat ggtagtgtgg 4680
ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg 4740
aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 4800
aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc ccggagggtg gcgggcagga 4860
cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg ccatcctgac ggatggcctt 4920
tttgcgtttc tacaaactct tcctgtcgtc atatctacaa gccatccccc cacagatacg 4980
ggcgcgccgc cattattttt ttgaacaatt gacaattcat ttcttatttt ttattaagtg 5040
atagtcaaaa ggcataacag tgctgaatag aaagaaattt acagaaaaga aaattataga 5100
atttagtatg attaattata ctcatttatg aatgtttaat tgaatacaaa aaaaaatact 5160
tgttatgtat tcaattacgg gttaaaatat agacaagttg aaaaatttaa taaaaaaata 5220
agtcctcagc tcttatatat taagctacca acttagtata taagccaaaa cttaaatgtg 5280
ctaccaacac atcaagccgt tagagaactc tatctatagc aatatttcaa atgtaccgac 5340
atacaagaga aacattaact atatatattc aatttatgag attatcttaa cagatataaa 5400
tgtaaattgc aataagtaag atttagaagt ttatagcctt tgtgtattgg aagcagtacg 5460
caaaggcttt tttatttgat aaaaattaga agtatattta ttttttcata attaatttat 5520
gaaaatgaaa gggggtgagc aaagtgacag aggaaagcag tatcttatca aataacaagg 5580
tattagcaat atcattattg actttagcag taaacattat gacttttata gtgcttgtag 5640
ctaagtagta cgaaaggggg agctttaaaa agctccttgg aatacataga attcataaat 5700
taatttatga aaagaagggc gtatatgaaa acttgtaaaa attgcaaaga gtttattaaa 5760
gatactgaaa tatgcaaaat acattcgttg atgattcatg ataaaacagt agcaacctat 5820
tgcagtaaat acaatgagtc aagatgttta cataaaggga aagtccaatg tattaattgt 5880
tcaaagatga accgatatgg atggtgtgcc ataaaaatga gatgttttac agaggaagaa 5940
cagaaaaaag aacgtacatg cattaaatat tatgcaagga gctttaaaaa agctcatgta 6000
aagaagagta aaaagaaaaa ataatttatt tattaattta atattgagag tgccgacaca 6060
gtatgcacta aaaaatatat ctgtggtgta gtgagccgat acaaaaggat agtcactcgc 6120
attttcataa tacatcttat gttatgatta tgtgtcggtg ggacttcacg acgaaaaccc 6180
acaataaaaa aagagttcgg ggtagggtta agcatagttg aggcaactaa acaatcaagc 6240
taggatatgc agtagcagac cgtaaggtcg ttgtttaggt gtgttgtaat acatacgcta 6300
ttaagatgta aaaatacgga taccaatgaa gggaaaagta taatttttgg atgtagtttg 6360
tttgttcatc tatgggcaaa ctacgtccaa agccgtttcc aaatctgcta aaaagtatat 6420
cctttctaaa atcaaagtca agtatgaaat cataaataaa gtttaatttt gaagttatta 6480
tgatattatg tttttctatt aaaataaatt aagtatatag aatagtttaa taatagtata 6540
tacttaatgt gataagtgtc tgacagtgtc acagaaagga tgattgttat ggattataag 6600
cggccggcca gtgggcaagt tgaaaaattc acaaaaatgt ggtataatat ctttgttcat 6660
tagagcgata aacttgaatt tgagagggaa cttagatggt atttgaaaaa attgataaaa 6720
atagttggaa cagaaaagag tattttgacc actactttgc aagtgtacct tgtacctaca 6780
gcatgaccgt taaagtggat atcacacaaa taaaggaaaa gggaatgaaa ctatatcctg 6840
caatgcttta ttatattgca atgattgtaa accgccattc agagtttagg acggcaatca 6900
atcaagatgg tgaattgggg atatatgatg agatgatacc aagctataca atatttcaca 6960
atgatactga aacattttcc agcctttgga ctgagtgtaa gtctgacttt aaatcatttt 7020
tagcagatta tgaaagtgat acgcaacggt atggaaacaa tcatagaatg gaaggaaagc 7080
caaatgctcc ggaaaacatt tttaatgtat ctatgatacc gtggtcaacc ttcgatggct 7140
ttaatctgaa tttgcagaaa ggatatgatt atttgattcc tatttttact atggggaaat 7200
attataaaga agataacaaa attatacttc ctttggcaat tcaagttcat cacgcagtat 7260
gtgacggatt tcacatttgc cgttttgtaa acgaattgca ggaattgata aatagttaac 7320
ttcaggtttg tctgtaacta aaaacaagta tttaagcaaa aacatcgtag aaatacggtg 7380
ttttttgtta ccctaagttt aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 7440
gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 7500
atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 7560
tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 7620
gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 7680
actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 7740
gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 7800
agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 7860
ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 7920
aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 7980
cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 8040
gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 8100
cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 8160
cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 8220
gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca 8280
gggccccctg cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc tttttcgcac 8340
gatatacagg attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc caacggcgtc 8400
agccgggcag gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc ttcactgtcc 8460
cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg ccggctaccg 8520
ccggcgtaac agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc aggaagggca 8580
gcccacctat caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag gaaaaggcgg 8640
cggcggccgg catgagcctg tcggcctacc tgctggccgt cggccagggc tacaaaatca 8700
cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg agctggcccg catcaatggc gacctgggcc 8760
gcctgggcgg cctgctgaaa ctctggctca ccgacgaccc gcgcacggcg cggttcggtg 8820
atgccacgat cctcgccctg ctggcgaaga tcgaagagaa gcaggacgag cttggcaagg 8880
tcatgatggg cgtggtccgc ccgagggcag agccatgact tttttagccg ctaaaacggc 8940
cggggggtgc gcgtgattgc caagcacgtc cccatgcgct ccatcaagaa gagcgacttc 9000
gcggagctgg tgaagtacat caccgacgag caaggcaaga ccgatcgggc cc 9052
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide Og42f
<400> 12
ctgcacctaa aaccaaagca gtatt 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide Og43r
<400> 13
atcctttaag caagagtact gcacc 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide fD1
<400> 14
ctgcacctaa aaccaaagca gtatt 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide rP2
<400> 15
atcctttaag caagagtact gcacc 25
<210> 16
<211> 1160
<212> DNA
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 16
agtggcactg gaaaagaact cttagctcaa tctattcaca attatagtga aagatgtgaa 60
ggcccttttg tagctataaa ttgtagttct atacctagag aacttgtaga aagtgagctt 120
tttggttatg aaaaaggagc ttttacggga gctttaaagc aaggaaagcc tggaaagttt 180
gaattagcag atggaggaac tatttttttg gatgaagtag gagagcttcc tcttgatata 240
cagtcaaagc ttttaagggt tcttgataat aataaaatta caagagttgg aggaacttat 300
gaaaaacagc taaatgtaag gataatagga gctacaaaca gggtgctcaa ggatgaaatt 360
aaaaagaaaa atttcagaag tgacctttat tatagattga gtgtgatgaa tataaaaact 420
gtcccactta gggaaagaaa agaagatata gagcttttaa ttaaatattt tatggaagaa 480
ttgaattcta aaagtttgtg taagaagaaa gtagtggaaa aagcatacat agaaaagatt 540
aaagcttatg attggcctgg aaatgttaga gaacttagaa atgtaataga gagggattac 600
tatttaagtg aggataagat ggcccctttg gattatttag aaaaagaagt ttatgaaaaa 660
aatgtctcct ctgatccagt aaatattagt gtgcttccaa tggatgtttt agaaaaagaa 720
aacattgaaa atgcacttaa aaagtgtaag ggaaatatat taaaagctgc aaaatcttta 780
aatatcagta gatctaccat gtatagaaaa atgaaaaagt atggaataaa aagtgtgtca 840
aaatgaccag aaaagagtaa gattctcaaa ataggacact aagtatgtgt cataatggca 900
catagtgatt ttaaatgtct ttttaacagg tttcttgttt ttggtatggc ttttgcttat 960
aaaatatagt gaatatatta acaggtatat gtaaatttta atattgccat actattataa 1020
aaaaggagag ataattatga aagctgtatt gtggtatgat aaaaaagatg taagagtaga 1080
ggaaattgag gaacctaagg taaaagaaaa tgctgtaaaa attaaagtga aatggtgtgg 1140
tatatgtggt tctgacttgc 1160
<210> 17
<211> 834
<212> DNA
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 17
tattgaggag gccaaaaatg agctttaaga aaaatgtata cgatacaatg agggaactaa 60
tatctgtgcc aagcatatct ggtacaaaag aagagtgtgc ggcagcagaa aaaatatatg 120
aaaaaatttt ggaaatacct tattttaagg acaatcctga aaatctagga atagagcaaa 180
ttgaagatga tcctttagga agaagctttg tatgggcagt agtaaatgga aatgaaaatt 240
caccaaattc gtttatactt tcaggtcatt tggatgtagt tggagtagaa gaatttggac 300
atttaaaatc tatggctttt gatgtagatg aatgtactaa aagaatctca gaattgaatt 360
tagatgaaga tgctatggag gattttaaat caggagattg gatatttgga aggggaactg 420
cagacatgaa gtttggagtg gccctcaata tggaactttt aagagaattc agtaaagaga 480
gaaactttaa gggaaactta ttacttttag tagttcctgg tgaagagagt aattccgaag 540
gaatgattgc tgcagctcca tttcttctta aattaaagga agagaggaag tacaattact 600
gtggtatgat aatatcagag ccaagtatac ctgaaagagg agaaaaagaa ggcaagagat 660
tatatatagg tagtgtaggt aaaattatgc ctttattttt ttgtgtggga aaagaaactc 720
atgtagggga atctttaaga ggattgaatc caaatttgct agtttcagag ataaacaaat 780
taatggaatg taatccagat ctctcagata gcgtttatga tactgtgact ccac 834
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide Og13f
<400> 18
attcatcctg caggagtggc actggaaaag aactcttag 39
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide Og14r
<400> 19
gactgcggcc gcgcaagtca gaaccacata taccaca 37
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide Og15f
<400> 20
atatgctagc tattgaggag gccaaaaatg agctt 35
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide Og16r
<400> 21
gactggcgcg ccgtggagtc acagtatcat aaacgct 37
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide Og33f
<400> 22
aatggcaggg cagataattg taatg 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide Og34r
<400> 23
aaggcattct gagccagttc tttta 25
<210> 24
<211> 1062
<212> DNA
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 24
acagttaaaa agcatatcta acagtccttc cactgtacta attcaaggcg aaagcggtac 60
aggtaaagaa cttattgcgc agtccatcca caatgacagc agcagaaaaa ataacagctt 120
tatagcaata aattgcggtg ccatacccaa aaatttaata gaaagtgaat tattcggata 180
tgaagatgga tcattcacag gtgcaaaaca tggagggcgt gcaggaaaat ttgaacttgc 240
aaatggtggt actttatttt tagatgaaat tggggaaatg cctttagata tgcaagtaaa 300
tcttttaaga gttctccaag aaaactgtat tacaagaata ggcgggaaca gatgtgtaaa 360
aatagatata agaatcattg cagctactaa taaaaatttg agggaagaaa tacataaagg 420
aacttttcgc gaagatttat actatagact aaatgtaata cctatatatg taccaccact 480
gcgggaaaga gatatggata ttaaaatact gataaactat tttttaaaga taaaagcttt 540
taaacttaaa aaacctattc caatagtaag acctgatata tatcaaaagc tcttaaatta 600
taattggccc ggaaatgtaa gagaattgga aaattgtatt gaaaatatcg taaatatgaa 660
tggaaataca tctttcaact tcgaaaatag tatttcagta aatacgcaaa ctagtccttg 720
tactacaaaa tttaaatatg atatgtattc attaaaagag ttggaaaaag aagcaataac 780
aaattgtatg agtaattgca atggtaacat tgcaaaagct tctaaaattc tgggaataaa 840
tagaagtact ttgtatacaa aaataaaaaa atatcaaatt aatttttctt aaagtgtatg 900
taaacacaac tttgttgtaa aaagcaacat tattttctta aaaaatgttg ctttttacag 960
catttttcaa ttatatatat taaccttata aagtcctacc cccctaaatt caaccttttc 1020
atgataaaaa acatactggc acaacatttg cttatatatt ta 1062
<210> 25
<211> 823
<212> DNA
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 25
cgtattttta attgcgaact taagatttaa ttaatatcta ctatgagtaa gtcaacatat 60
atacctaaat tatgataaaa ttatatatta taatttcaaa ataaacataa ctataataat 120
acactaagat aaagctattt atctgatggc tacctactgt aacactccct cttctatcaa 180
agtgagagat aacagtagct acgcccctag ataattcatc taaacttagt gggagaaaca 240
aaactctaaa gagaaagcga ttcactttaa atcaaagatt tgagatatct gcttctccca 300
ctaagtaaga ttcattgata taaaaaggaa ggtaatctaa taatgtttaa accatttact 360
catagtgaaa tagtcagtag gtctcttaat agatgcatta aataccatat agaaaaaggt 420
ataccaaaac ctaaacgaac acttagtcgc aaagaattgg acaacttaat aaaagaaaac 480
aacgatatta taaaaatagc aaaaccattt atggaaatac tttatgattt tttaagtgga 540
tcaggtttct cattatatct cacagacaaa aatggaattg tattaactat cataggtgac 600
aaagatattg taatggagca ggcaaaggct ggaatagcag aaggtattga tctgagtgaa 660
caaagtgcag gtacaaatgc agcaggaact gctatttttg aaaatttgtc agttcaactt 720
tcaggcaaag aacattttat aaatactttt cagatttata cctgctctgc atctgtcata 780
cataacgaac aaggaaatat aatcggatgt ctaactttaa ctg 823
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<223> intron target region against alcohol dehydrogenase
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aagcttataa ttatccttag atatcaatct tgtgcgccca gatagggtgt taagtcaagt 60
agtttaaggt actactctgt aagataacac agaaaacagc caacctaacc gaaaagcgaa 120
agctgatacg ggaacagagc acggttggaa agcgatgagt tacctaaaga caatcgggta 180
cgactgagtc gcaatgttaa tcagatataa ggtataagtt gtgtttactg aacgcaagtt 240
tctaatttcg attatatctc gatagaggaa agtgtctgaa acctctagta caaagaaagg 300
taagttagca agattgactt atctgttatc accacatttg taca 344
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<223> Oligonucleotide of SecCTf
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catgatttgt tcaactatat cacc 24
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<223> Oligonucleotide KpBDH -R
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aagtttctga ggctgcaggt 20
Claims (20)
- 메소-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 효소를 인코딩하는 외인성 핵산 및 디올/글리세롤 디하이드라타제 효소를 인코딩하는 외인성 핵산을 포함하는, 단리된, 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양성의, 초산생성 박테리아로서, 이에 의해 상기 박테리아는 혐기성 조건 하에서 상기 효소를 발현시키고, 상기 핵산의 부재에서, 상기 박테리아는 상기 효소를 발현시키지 않는, 박테리아.
- 청구항 1에 있어서, 상기 박테리아는 D-(-)2,3-부탄디올 디하이드로게나제 유전자 내 넉아웃(knock-out) 돌연변이를 갖는, 단리된, 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양성의, 초산생성 박테리아.
- 청구항 1에 있어서, 디올/글리세롤 디하이드라타제의 재활성화 단백질을 인코딩하는 외인성 핵산을 추가적으로 포함하는, 단리된, 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양성의, 초산생성 박테리아.
- 삭제
- 삭제
- CO 및/또는 CO2을 2-부탄올로 전환시키는 방법으로서,
박테리아가 CO 및/또는 CO2를 2-부탄올로 전환시키도록 배양 배지 내에 청구항 1의 일산화탄소영양성의, 초산생성 박테리아의 배양물을 함유하는 생물반응기에 가스성 CO-함유 및/또는 CO2-함유 기질을 전달하는 단계, 및
상기 부탄올을 상기 생물반응기로부터 회수하는 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 1에 있어서, 알코올 디하이드로게나제 유전자(EC 1.1.1.2) 내 넉아웃 돌연변이를 추가적으로 포함하는, 박테리아.
- 청구항 7에 있어서,
(a) 그의 D-(-)2,3-부탄디올 디하이드로게나제 내 넉아웃 돌연변이; 또는
(b)디올/글리세롤 디하이드라타제의 재활성화 단백질을 인코딩하는 외인성 핵산
을 추가적으로 포함하는, 박테리아. - CO 및/또는 CO2를 메틸 에틸 케톤(MEK)으로 전환시키는 방법으로서,
박테리아가 CO 및/또는 CO2를 MEK로 전환시키도록 배양 배지 내에 청구항 8의 일산화탄소영양성의, 초산생성 박테리아의 배양물을 함유하는 생물반응기에 가스성 CO-함유 및/또는 CO2-함유 기질을 전달하는 단계, 및
상기 MEK를 상기 생물반응기로부터 회수하는 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 6 또는 9에 있어서, 상기 박테리아는
(a) D-(-)-2,3-부탄디올 디하이드로게나제 유전자 내 넉아웃 돌연변이를 갖고/갖거나;
(b) 디올/글리세롤 디하이드라타제의 재활성화 단백질을 인코딩하는 외인성 핵산을 추가적으로 포함하는, 방법. - 청구항 1에 있어서, 메소-2,3-부탄디올 디하이드로게나제를 인코딩하는 외인성 핵산은 클로스트리듐 아우토에타노게넘에 대해 코돈-최적화된 것인, 박테리아.
- 청구항 1에 있어서, 디올/글리세롤 디하이드라타제를 인코딩하는 외인성 핵산은 클로스트리듐 아우토에타노게넘에 대해 코돈-최적화된 것인, 박테리아.
- 청구항 1에 있어서, 상기 메소-2,3-부탄디올 디하이드로게나제는 클렙시엘라 뉴모니애 메소-2,3-부탄디올 디하이드로게나제인, 박테리아.
- 청구항 1에 있어서, 상기 디올/글리세롤 디하이드라타제는 클렙시엘라 옥시토카 디올/글리세롤 디하이드라타제인, 박테리아.
- 삭제
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