KR101903275B1

KR101903275B1 - 신규미생물 락토바실러스 플란타룸 cjl-159 또는 이를 포함하는 어류용 사료첨가제

Info

Publication number: KR101903275B1
Application number: KR1020170025193A
Authority: KR
Inventors: 정철연; 강성종; 진영석
Original assignee: (주)창조바이오텍
Priority date: 2017-02-27
Filing date: 2017-02-27
Publication date: 2018-10-01
Anticipated expiration: 2037-02-27
Also published as: KR20180098729A

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CJL-159 균주 또는 이를 포함하고 있는 어류용 사료첨가제에 관한 것이다.
상기 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주의 균체 또는 이의 배양액은 내염성, 내산성, 내담즙성을 가져 스트렙토코커스 파라우베리스에 대해 우수한 방제효과를 갖는다. 특히 상기 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주 배양용 배지에 백수오가 첨가될 경우 스트렙토코커스 파라우베리스에 대한 항균성이 더욱 증가된 것이 확인되어, 어류 질병 방제용 조성물이나 사료 조성물로서 용이하게 이용될 수 있다.

Description

신규미생물 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 또는 이를 포함하는 어류용 사료첨가제 {NOVEL MICROORGANISM LACTOBACILLUS PLANTARUM CJL-159 OR ADDITIVES FOR FISH FEEDS CONTAINING IT}

본 발명은 신규미생물 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 또는 이를 포함하는 어류용 사료첨가제에 관한 것이다.

현재 어류 양식장에서는 밀집양식으로 인한 질병 증가, 영양상태 불균형 등과 같은 요인들로 인하여 어류의 성장저하 및 폐사가 발생되는 문제가 심각하게 대두되고 있다.

이에 사료에 첨가제를 첨가하여 상기 문제를 해결토록 하는데, 통상적으로 사용되는 사료첨가제로는 항생제, 비타민제, 아미노산 공급제, 광물질 공급제, 효소제, 호르몬제 등이 있다.

그러나, 상기의 사료첨가제들은 과다 급이시 양식어류의 약품에 대한 내성이 증가하여 약제 남용을 야기시킬 수 있으며, 이로 인하여 양식된 어류에는 상기 유해물질들이 축적되어 어류 섭취시 인체에 유해할 수 있는 유해물질을 간접적으로 섭취할 수 있다는 점이 수산물의 안전성 면에서 문제점을 갖게 된다.

이에, 이를 해소하기 위해 한국등록특허 제10-057771호 및 한국등록특허 제10-860111호 등의 관련 연구가 진행된 바 있으나, 현재까지 어병을 일으키는 세균에 대한 방제효과를 나타내는 천연항생제 또는 이를 포함하는 사료 첨가제 조성물에 대한 연구는 아직 초기 단계에 머무르고 있다.

백수오(Cynanchi Wilfordii Radix)는 은조롱 또는 큰조롱(Cynanchum wilfordii)의 덩이뿌리이다. 백하수오라고도 한다. 근래에 독성으로 인해 문제가 된 이엽우피소와는 다른 생약이다. 자양, 강장, 보혈, 정력 증진 등의 효능이 있고 종기를 가라앉히는 작용도 한다. 적용질환은 빈혈증, 병후의 허약증세, 양기부족, 신경통, 만성풍비(뇌와 척수에 이상이 생겨 몸과 팔다리가 마비되고 감각과 동작에 장애가 있는 병), 허리와 무릎이 쑤시고 아픈 증세, 선질병(체질박약, 임파선종양, 습진, 수포성결막염 등이 생겨나는 전신질환) 등이다. 기타 일찍 머리카락이 하얗게 되는 증세와 궤양이 오래도록 아물지 않을 때에도 쓰인다.

본 발명자들은 어병을 일으키는 세균에 대한 방제효과를 나타내는 유용균 또는 이러한 균주의 배양에 적용가능한 생약의 약리학적 활성에 대한 연구를 수행하던 중, 락토바실러스 플란타룸 신규 균주와 이 균주의 백수오 첨가 배양액이 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)에 대한 항균활성이 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

한국등록특허 제10-057771호 (바실러스 폴리퍼멘티루스, 바실러스 리케니포르미스 및 사카로마이세스 세로비지에를 포함하는 어류사료첨가용 조성물) 한국등록특허 제10-860111호 (신규 미생물 트라우스토카이트리움 에스피.케이제이에스-1, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-2 및 이들과 바실러스 리케니포르미스를 포함하고 있는 사료첨가제 및 사료)

본 발명에서는 상기의 문제점을 해결하기 위해 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)에 대한 항균활성을 나타내는 신규미생물 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CJL-159 균주 또는 상기 신규미생물을 포함하고 있는 어류용 사료첨가제를 제공하는 데에 있다.

본 발명은 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)에 대한 항균활성을 나타내는 신규미생물 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CJL-159(수탁번호 KCTC18550P) 균주에 관한 것이다.

상기 균주는 내담즙성, 내염성 또는 내산성을 갖는 것이 특징이다.

본 발명은 또한 상기 균주의 균체 또는 이의 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)가 원인이 되는 어류 질병 방제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 상기 균주의 균체 또는 이의 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 어류용 사료 첨가제를 제공할 수 있다.

상기 배양액은 유산균 배양용 미생물 배지에서 배양된 것일 수 있으며, 또한 백수오가 첨가된 유산균 배양용 미생물 배지에서 배양된 것일 수 있다.

본　발명은　또한　탄소원 5~50 중량부, 펩톤(peptone) 5~50 중량부, 아세트산 나트륨(Sodium acetate) 3~11 중량부, 구연산 암모늄(Ammonium citrate) 2~5 중량부, 2인산칼륨(dipotassium phosphate) 0.5~4 중량부, 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80) 0.5~4 중량부, 황산 마그네슘(Magnesium sulfate) 0.1~0.2 중량부　및 황산 망간(Manganese sulfate) 0.05~0.1 중량부가 포함된　유산균　배양　배지용　혼합분말을　제공할　수　있다．상기　혼합분말에는　백수오 10~50 중량부가　포함될　수　있다．상기　혼합분말은　물　1000　중량부에　혼합되어　유산균　배양에　사용될　수　있다．　　　　

이하 본 발명을 자세하게 설명한다.

본 발명은 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주에 관한 것이며, 상기 균주는 서열번호 1로 이루어진 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용되는 유산균 배양용 배지는 탄소원으로 미생물 배양에 사용되는 어떤 것이라도 사용가능하나 바람직하게는 당밀, 포도당, 설탕 또는 덱스트란 중에 선택된 1종 이상이 포함된 것을 특징으로 한다. 또한 기존의 유산균 배양용 배지에는 포도당이 주로 포함되는데, 당밀이 포함될 경우 균주의 성장을 보다 더 증진시킬 수 있다.

상기 유산균 배양용 배지는 탄소원, 펩톤(peptone), 아세트산 나트륨(Sodium acetate), 구연산 암모늄(Ammonium citrate), 2인산칼륨(dipotassium phosphate), 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80), 황산 마그네슘(Magnesium sulfate) 및 황산 망간(Manganese sulfate)이 포함된 것일 수 있다. 바람직하게는 배지 1L 당, 탄소원 5~50 g, 펩톤(peptone) 5~50 g, 아세트산 나트륨(Sodium acetate) 3~11 g, 구연산 암모늄(Ammonium citrate) 2~5 g, 2인산칼륨(dipotassium phosphate) 0.5~4 g, 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80) 0.5~4 g, 황산 마그네슘(Magnesium sulfate) 0.1~0.2 g 및 황산 망간(Manganese sulfate) 0.05~0.1 g가 포함된 것일 수 있다. 이들 각 성분을 정제수, 바람직하게는, 증류수에 혼합한 후 멸균하여 유산균 배양용 배지로 제조할 수 있다.

상기 유산균 배양용 배지는 pH가 6.8-7.2로 조정된 것일 수 있다.

상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CJL-159 균주 배양액 제조를 위한 유산균 배양용 배지에 항균성을 증가시키기 위해 백수오가 첨가될 수 있다. 바람직하게는 배지 1L당 백수오가 10~50 g 첨가될 수 있다. 따라서 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주 배양액은, 다른 표현으로서, 백수오의 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주 발효액이라 할 수 있다.

본 발명 균주의 배양 시간은 12~48시간 동안이 바람직하며, 더 바람직하게는 24~30시간이 좋다.

본 발명에서 어류 방제용 조성물이나 어류용 사료 첨가제에 사용되는 균주의 균체 또는 이의 배양액은, 수득된 균체나 배양액을 그대로 사용할 수도 있지만 이를 농축하거나 건조하여 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서의 용어 '배양액'은 미생물 생장에 적절한 배지에 일정 농도의 포자를 접종하여 배양기에서 일정 기간 동안 미생물이 생장하도록 유도한 후 수득된, 균체, 균체가 생장하면서 분비한 물질, 및 생장에 필요한 영양성분이 혼합된 액으로서, 불순물을 걸러내는 과정을 거쳐 제조할 수 있다.

본 발명의 용어 '방제'는 일반적으로 병원체 감염을 예방, 감소 또는 근절시키는 것을 포함하며, 감염에 있어서의 예방 또는 감소는 비처리된 개체(본 발명에서는 어류)에 대하여 통계적으로 현저한 차이가 있음을 의미한다.

본 발명의 균주 배양액은 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 방제용 미생물 제제로 사용될 수 있는데, 상기 미생물 제제는 미생물의 안정적인 제제화를 목적으로 수화제, 입제 또는 캡슐화의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에서 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)가 질병원인균이 되어 발생하는 어류의 질병은 '어류 연쇄구균증'이며, 상기 질병은 해수어와 담수어에 모두 발생한다. 이 균에 감염된 개체는 어체가 쇠약해지고 안구가 돌출되며 출혈이 생기고 지느러미, 체표 및 근육에 출혈을 일으키며, 복수가 차고 근육에 결절이 있으며 장 팽만, 간의 퇴색이 관찰된다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주의 방제대상 어류는 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)가 질병을 일으키는 대상 어류라면 모두 가능하며, 특히, 넙치, 터봇, 방어，돌돔, 무지개송어, 은어　또는 감성돔의 방제에 효과적이다.

본 발명의 어류 질병 방제용 조성물은 약학 조성물로 이용가능하다. 상기 약학 조성물은 통상의 어류 질병 방제용 약학 조성물에 약제학적으로 허용되는 각종 담체, 희석제 또는 부형제가 포함될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제제화 함으로 써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 동물용 주사제, 산제, 액제, 과립제 또는 정제일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 동물용 주사제 및 경구용 액제로 제조되는 경우에는 증류수, 에틸올레이트, 에탄올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등을 사용하여 제제화될 수 있고 항산화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, 토코페롤 등을 더 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 동물용 산제 및 과립제로 제조되는 경우에는 비타민류, 글루코스, 락토스, 전분, 효소 등을 사용하여 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 상세하게는, 경구 투여일 경우에는 직접 경구 또는 음용수에 혼합하여 투여하거나 사료에 혼합하여 투여할 수 있고, 비경구 투여일 경우에는 통상 주사법으로 투여될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 제제의 투여량은 투여 대상 동물의 종류, 체중, 연령 등에 따라 조절될 수 있으며, 적합한 투여량은 당업계에서 적합한 지식을 가진 자에 의해 조절될 수 있다. 상기 약학 조성물에는 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주의 균체 또는 배양액, 이들의 농축물, 건조물 등이 0.1~30 중량%로 첨가될 수 있다.

또한 어류용 사료 첨가제 조성물에도 통상의 사료 첨가제 어류 또는 사료에 이용되는 각종 부형제가 포함될 수 있다. 본 발명의 사료 첨가제가 포함된 어류용 사료에는 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주의 균체 또는 배양액, 이들의 농축물, 건조물 등이 0.1~30 중량%로 첨가될 수 있다.

본　발명은　탄소원 5~50 중량부, 펩톤(peptone) 5~50 중량부, 아세트산 나트륨(Sodium acetate) 3~11 중량부, 구연산 암모늄(Ammonium citrate) 2~5 중량부, 2인산칼륨(dipotassium phosphate) 0.5~4 중량부, 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80) 0.5~4 중량부, 황산 마그네슘(Magnesium sulfate) 0.1~0.2 중량부　및 황산 망간(Manganese sulfate) 0.05~0.1 중량부가 포함된　유산균　배양　배지용　혼합분말을　제공할　수　있다．상기　혼합분말에는　백수오 10~50 중량부가　포함될　수　있다．상기　혼합분말은　물　1000　중량부에　혼합되어　유산균　배양에　사용될　수　있다．　

본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CJL-159 균주 또는 이를 포함하고 있는 어류용 질병 방제제와 사료첨가제에 관한 것이다.

본 발명의 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)에 대한 항균활성을 나타내며, 서열번호 1의 염기서열을 포함한다. 상기 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주의 균체 또는 이의 배양액은 내염성, 내산성, 내담즙성을 가져 스트렙토코커스 파라우베리스에 대해 우수한 방제효과를 갖는다. 특히 상기 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주 배양용 배지에 백수오가 첨가될 경우 스트렙토코커스 파라우베리스에 대한 항균성이 더욱 증가된 것이 확인되어, 어류 질병 방제용 조성물이나 사료 조성물로서 용이하게 이용될 수 있다.

도 1은 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주의 phylogenic tree 결과를 나타낸 계통수 그림이다.
도 2는 유산균 배양용 배지 내의 백수오 첨가량에 따른 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주 배양액의 생균수를 나타내는 그래프이다.
도 3은 유산균 배양용 배지 내의 탄소원 종류에 따른 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주 배양액의 생균수를 나타내는 그래프이다.
도 4는 500L 용량의 유산균 배양용 배지에서 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주가 배양되는 과정에서, 배양액 내에서의 생균수/pH/당도(Brix) 변화를 나타낸다.
도 5는 스트렙토코커스 파라우베리스에 감염된 넙치의 생존률을 나타내는 그래프이다. Negative Control은 '균주 배양액이 무처리된 사료 첨가군'을 말하며, Positive Control은 '백수오 미첨가 배지에 배양된 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주 배양액이 첨가된 사료 첨가군'을 말하고, 나머지 그룹은 '백수오 첨가 배지에 배양된 락토바실러스 플란타룸 CJL-159 균주 배양액이 첨가된 사료 첨가군'으로서 각 숫자는 배양액에 포함된 ml당 생균수(cfu)를 뜻한다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 균주의 분리 및 생육>

실시예 1-1. 유산균 균주 분리

2 L의 MRS agar(glucose 20g, peptone #3 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, sodium citrate 5g, ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 2 g, Tween 80 1g, Bromophenol blue 0.002g, Bacto agar 17g/2L)를 2L의 비이커에 첨가 후 증류수를 첨가하여 2L 배지를 제조하였다. 이를 교반하여 pH를 7.0-7.2로 3mol의 가성소다용액을 첨가하여 조절하였고, 그 후 가열하여 95 ℃까지 가열 후 모든 내용물이 녹은 것을 확인하고 이를 autoclave를 실시하였다. *Tween 80 :폴리소르베이트 80의 상품명.

유산균주를 분리하기위한 분리원으로는 시중에서 구입한 열무김치, 새우젓, 갈치속젓, 비비고 썰은 배추김치(CJ), 제주옹기 맛김치, 종가집 맛김치, 자리돔 젓, 꽃 멸치젓, 한라참치액, 종가집 열무김치, 종가집 나박김치, 종가집 동치미, 토굴숙성 광천새우젓, 낙지젓갈, 오징어 젓갈, 창란 젓갈 등 총 39가지의 재료를 구매하여 실험에 사용하였다.

실시예 1-2. 분리 절차 및 균주분석

10 g의 sample에 90ml의 멸균 증류수를 첨가한 후 믹서기로 1분간 분쇄한 후, 10배 단위로 serial dilution을 실시하였다. serial dilution 후 0.05 ml의 액을 MRS agar에 유리 spreader를 이용하여 균을 도말하였고 37 ℃에서 24-48 시간동안 배양하였다. 여기서 자란 콜로니(colony)의 모양과 형태 등을 관찰 후 단일 콜로니를 백금이를 이용하여 순수분리 하였다. 이렇게 328개의 콜로니를 수득한 후, MRS agar에 단일 콜로니 별로 순수 분리 후 MRS agar plate에 2차 배양을 실시하였다. 2차 배양 후 콜로니를 MRS broth에 접종 후 37 ℃에서 24-48 시간동안 배양 후 glycerol 80% 0.25ml와 배양액 0.75ml를 혼합하여 glycerol stock을 제조하였으며 제조 후 이를 냉동 보관하여 추후 실험에 사용하였다. 순수 분리된 유산균을 MRS agar에 streaking 후 48 시간동안 2차 순수 배양 후 균주 분석을 위해 solgent사에 의뢰하였다. 실험 결과, 이들 균주는 Lactobacillus sp., Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Leuconostoc pseudomesenteroides, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus 등의 유산균임이 확인되었다.

<실시예 2. 항균력 보유 유산균 선발>

실시예 1에서 분리된 유산균이 어류의 질병을 일으키는 균주에 대해 항균성이 있는지를 확인하였다. 이를 위해 제주대에서 공급된 어류 질병균인 Streptococcus parauberis 균주를 이용하여 BHI broth, 37℃ 에서 24시간 배양 후 50 ℃로 준비한 0.75% BHI soft agar에 배양액을 1%로 맞추어 첨가하였다. 이와는 별도로 분리된 유산균을 MRS both가 채워진 10ml 시험관에 접종하여 37℃, 48 시간 배양 후 멸균된 이쑤시개를 사용하여 MRS agar에 콕 찍어 접종한 후 건조하였다. 그 후 유산균주가 확산되는 것을 방지하기 위해 0.75% soft MRS agar를 건조된 유산균 배양액 위에서 점적하여 코팅하였다. 15분간 공냉하여 agar가 굳은 후 준비된 Streptococcus parauberis 균주가 접종된 50 ℃ 0.75% BHI soft agar를 그 위에 10ml를 부어 중중으로 굳힌 후 37℃ incubator에서 48 시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 항균력을 가진 유산균 주위로 형성된 hollow zone의 지름을 측정하여 항균력의 지표로 사용하였다. 총 281개 유산균주를 가지고 test한 결과 항균력이 뛰어난 328개의 유산균 중 항균환 지름이 평균 2cm인 CJL-153, CJL-159, CJL-173의 3가지 균주를 후보 균주로 선정하였다. 하기 표 1에는 이들 3가지 균주의 실험결과를 나타내었다(항균환 지름이 2cm 미만인 다른 균주 결과는 표시하지 않음).

균주명	항균환 지름(cm) 1회	항균환 지름(cm) 2회	항균환 지름 평균(cm)
CJL-153 (Lactobacillus sp.)	2.0	2.2	2.1
CJL-159 (Lactobacillus plantarum)	3.0	2.4	2.7
CJL-173 (Leuconostoc mesenteroides)	2.0	2.0	2.0

<실시예 3. 인공위액 저항성 및 인공 담즙산 내성, 내염성 TEST>

생균이 포함된 균주 발효물이 어류의 사료 조성물로서 효능을 나타내기 위해서는 어류가 이를 섭취했을 때 위액과 담즙에서의 생존율, 바닷물에 대한 내염성 등이 우수해야 하기 때문에, 이들 항균 균주에 대한 인공위액 저항성 및 인공 담즙산 내성, 내염성 등을 확인하였다.

실시예 3-1. 인공위액 저항성 확인

이를 위해 인공위액은 1N HCl을 사용하여 pH를 2.5로 조정한 MRS broth에 pepsin(sigma, USA) 1000 unit/ml가 되도록 첨가하여 사용하였다. 균주 처리 전, 균주 처리 2시간 배양 후의 각 배양액에서의 균수를 측정하기 위해, serial dilution 후 MRS agar 배지에 100㎕씩 도포하고 37 ℃에서 24시간 방치 후 균수를 counting 하였다. 이에 대한 결과는 표 2에 나타내었는데, CJL-159 균주가 인공위액에 대한 저항성이 뛰어난 것으로 확인된다.

조건	균주	처리전	처리 후	증감
pH 2.5 인공위액	CJL-159	1.2×10⁵ cfu/ml	1.9×10⁵ cfu/ml	166%

실시예 3-2. 인공 담즙산 내성 확인

인공 답즙산은 Lactobacillus MRS broth(Difco, USA)에 0.45μm 필터로 여과한 Bile bovine 1%, 2%, 3%를 각각 첨가하여 제조하였다. 배양한 유산균을 적정량에 인공담즙액을 투여하였다. 이 후 2시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 이 때 2시간 배양 전/후 배양액을 serial dilution으로 MRS agar에 100㎕씩 도포하고 도말하여 37 ℃에서 배양하여 colony수를 측정하였다.

표 3을 참고하면, 3종 균주 모두 내담즙성이 확인되며, 특히 Bile 3% 조건에서 CJL-159번 균주가 207% 성장하여 내담즙성이 가장 뛰어난 결과를 보였다.

실시예 3-3. 내염성 확인

MRS 액체 배지에 1%, 3%, 5%의 NaCl을 첨가한 후, 전 배양한 균주 배양액을 1% 접종하여 30℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이 2시간 배양 전/후 배양액을 serial dilution으로 MRS agar에 100㎕씩 도포하고 도말하여 37 ℃에서 배양한 후 colony수를 측정하였고, 각 생균수를 비교하여 생존율을 계산하였다.

표 4를 참고하면 해수와 염도가 유사한 NaCl 3% 조건에서 CJL-159 균주 배양액에서 117%로 균주 수가 증식되는 것이 확인되어 내염성이 가장 뛰어난 것을 알 수 있다.

조건	균주	처리전(cfu/ml)	처리후(cfu/ml)	비고
NaCl 1%	CJL-153	8.0×10⁵	1.3×10⁶	160%
	CJL-159	4.6×10⁴	1.1×10⁵	230%
	CJL-173	1.5×10⁶	2.1×10⁶	141%
NaCl 2%	CJL-153	1.7×10⁶	1.7×10⁶	100%
	CJL-159	1.8×10⁵	1.8×10⁵	98%
	CJL-173	2.4×10⁶	2.0×10⁶	82%
NaCl 3%	CJL-153	1.2×10⁶	8.0×10⁵	69%
	CJL-159	1.2×10⁵	1.4×10⁵	117%
	CJL-173	2.0×10⁶	1.7×10⁶	86%

< 실시예 4. 항생제 내성 확인>

유산균을 24시간 전배양 후 균 농도를 Mcfarland 0.5에 맞도록 희석한 후 면봉을 이용하여 유산균 희석액을 MRS agar에 골고루 도말하였다. 그 후 배지 위에 판매되고 있는 항생제 디스크를 핀셋을 이용하여 배지 위에 눌러 고정시켰다. 다음으로는 24시간 동안 37 ℃에서 배양 후 형성된 hollow zone의 지름(cm)을 측정하여 항생제 내성을 판단하였다.

표 5를 참고하면 CJL-153 균주보다는 CJL-159, CJL-173 균주가 항생제 내성이 더 우수한 것으로 확인된다.

조건	CJL-153 (cm)	CJL-159 (cm)	CJL-173 (cm)
Ampicillin	1.7	1.3	2.5
Oxytetracycline	1.7	2.0	2.1
Florfenicol	1.8	2.0	2.1
Cephalexin	1.4	1.2	1.3
Clindamycin	1.7	2.0	2.3
Erythrpmycin	2.0	2.3	2.3
Amoxycillin	1.7	1.5	1.7

<실시예 5. 항균 균주의 선정 및 유전정보 확인>

이와 같은 여러 실험 data와 항균력을 비교하여 CJL-159 균주를 본 발명의 사료 첨가제 조성물 제조용 균주로 최종 선정하였다.

CJL-159번 균주는 실시예 1에서 Lactobacillus plantarum 균주로 확인된 것이며, 이 균주에 대한 phylogenic tree 결과는 도 1과 같다.

상기 균주는 실시예 1-2에 기재한 바와 같이 solgent사에 의뢰하여 하기 표 6의 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16s rRNA의 특징을 갖는 Lactobacillus plantarum 균주인 것으로 확인된다.

< 실시예 6. 균주 배양용 배지 최적화 조건 설정>

실시예 6-1. 백수오 첨가량 확인

본 발명의 유산균 배양용 배지에 첨가될 백수오 첨가 조건을 최적화하기 위해, 분말 백수오를 MRS broth(glucose 20g, peptone #3 10g, beef extract 10g, sodium acetate 5g, ammonium citrate 2g, K₂HPO₄ 2g, tween 80 1g, magnesium sulfate 0.1g, Manganese sulfate 0.05g)에 1.0×10⁶ cfu/ml의 생균수를 가지는 유산균을 1% MRS broth에 첨가하여 24시간 배양하여 비교하였다(생균수 초기 접종 농도는 이후 동일함). 실험결과는 도 2와 같다.

도 2를 참고하면, 전체 배양조건에서 백수오 첨가량이 1~3%(w/v)일 때, 유산균의 성장 또한 제한되지 않음을 확인할 수 있다. 또한 이 그래프에는 나타내지 않았지만 5%(w/v)까지는 첨가해도 균주 배양이 잘 되는 것이 확인되었다. 이후의 실험에서는 백수오 첨가량을 1%(w/v)로 설정하여 사용하였다.

실시예 6-2. 탄소원 첨가량 최적화

유산균 배양용 배지 최적화를 위해 당밀, 흑설탕, dextran을 대상으로 실험을 실시하였고 기준 농도는 20g/L를 기준으로 하여 실험을 진행하였으며 배지 조성은 백수오 10g, 탄소원 20g, peptone #3 10g, beef extract 10g, sodium acetate 5g, ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 2g, tween 80 1g, magnesium sulfate 0.1 g, Manganese sulfate 0.05g을 넣고 1 L로 증류수를 채워 배지를 만들고 pH를 7.0 ±0.2로 맞추었다. 37 ℃, 100 rpm, 24시간 배양 후 serial dilution 후 MRS agar에 도말하여 균수를 counting하였다. 실험결과 당밀이 가장 좋았기에, 당밀의 첨가량을 5~50 g/L로 각각 달리한 배지 조성물을 제조하여 당밀 농도를 확인한 바, 각 농도에서 균주가 잘 자라는 것으로 확인되며, 특히 15g/L 일때 가장 높았고 이 때의 생균수는 3.82×10¹¹ cfu/ml이었다.

실시예 6-3. 질소원 첨가량 최적화

질소원의 최적화를 위해서 yeast extract, peptone, soybean meal, ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate의 6가지 질소원에 대하여 실험을 진행하였다. 백수오 10g, 당밀 15g, 질소원 10g, sodium acetate 5g, ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 2g, tween 80 1g, magnesium sulfate 0.1 g, Manganese sulfate 0.05g을 넣고 1 L로 증류수를 채워 배지를 만들고 pH를 7.0 ±0.2로 맞추었다. 37 ℃, 100 rpm, 24시간 배양 후 serial dilution 후 MRS agar에 도말하여 균수를 counting하였다. 실험결과 beef peptone(meat peptone)이 가장 좋았다. 이에, beef peptone의 첨가량에 대한 최적화를 수행한 바 5~50 g/L 내에서 균주의 성장이 좋았고(1×10⁹ cfu/ml 이상), 특히 첨가량 15g 일 때 생균수는 1.72×10¹⁰ cfu/ml으로 확인된다.

실시예 6-4. 미네랄 첨가량 최적화- Sodium acetate

Sodium acetate의 첨가량 최적화를 위해서 Sodium acetate의 첨가량을 0g, 1 g, 3g, 5g, 7g, 9g, 11g 까지 농도를 바꾸어가며 실험을 진행하였다. 백수오 10g, 당밀 15g, beef peptone 15g, ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 2g, tween 80 1g, magnesium sulfate 0.1 g, Manganese sulfate 0.05g을 넣고 1 L로 증류수를 채워 배지를 만들고 pH를 7.0 ±0.2로 맞추었다. 37 ℃, 100 rpm, 24시간 배양 후 serial dilution 후 MRS agar에 도말하여 균수를 counting하였다. 실험결과 Sodium acetate 첨가량 3~11 g/L에서 균주의 내에서 균주의 성장이 좋았고(1×10⁹ cfu/ml 이상), 특히 첨가량 3g 일때 1.16×10¹⁰ cfu/ml으로 확인된다.

실시예 6-5. 미네랄 첨가량 최적화 - Ammonium citrate

Ammonium citrate의 첨가량 최적화를 위해서 Ammonium citrate의 첨가량을 0g, 1 g, 2g, 3g, 4g, 5g, 6g, 7g 까지 농도를 바꾸어가며 실험을 진행하였다. 백수오 10g, 당밀 15g, beef peptone 15g, sodium acetate 3g, K₂HPO₄ 2g, tween 80 1g, magnesium sulfate 0.1 g, Manganese sulfate 0.05g을 넣고 1 L로 증류수를 채워 배지를 만들고 pH를 7.0 ±0.2로 맞추었다. 37 ℃, 100 rpm, 24시간 배양 후 serial dilution 후 MRS agar에 도말하여 균수를 counting하였다. 실험결과 Ammonium citrate 첨가량 2~5 g/L에서 균주의 내에서 균주의 성장이 좋았고(1×10⁹ cfu/ml 이상), 특히 첨가량 2g 일때 3.5×10⁹ cfu/ml으로 확인된다.

실시예 6-6. 미네랄 첨가량 최적화 - dipotassium phosphate

dipotassium phosphate의 첨가량 최적화를 위해서 dipotassium phosphate의 첨가량을 0g, 0.5 g, 1g, 1.5g, 2.0g, 2.5g, 3.0g, 3.5g 까지 농도를 바꾸어가며 실험을 진행하였다. 백수오 10g, 당밀 15g, beef peptone 15g, sodium acetate 3g, Ammonium citrate 2g, tween 80 1g, magnesium sulfate 0.1 g, Manganese sulfate 0.05g을 넣고 1 L로 증류수를 채워 배지를 만들고 pH를 7.0 ±0.2로 맞추었다. 37 ℃, 100 rpm, 24시간 배양 후 serial dilution 후 MRS agar에 도말하여 균수를 counting하였다. 실험결과 dipotassium phosphate 첨가량 0.5~4 g/L에서 균주의 성장이 좋았고(1×10⁹ cfu/ml 이상), 특히 첨가량 3g 일때 3.5×10⁹ cfu/ml으로 확인된다.

실시예 6-7. 미네랄 첨가량 최적화 - Tween 80

Tween 80의 첨가량 최적화를 위해서 Tween 80의 첨가량을 0g, 0.5 g, 1g, 1.5g, 2.0g, 2.5g, 3.0g, 3.5g, 4.0g 까지 농도를 바꾸어가며 실험을 진행하였다. 백수오 10g, 당밀 15g, beef peptone 15g, sodium acetate 3g, Ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 3.0g, magnesium sulfate 0.1 g, Manganese sulfate 0.05g을 넣고 1 L로 증류수를 채워 배지를 만들고 pH를 7.0 ±0.2로 맞추었다. 37 ℃, 100 rpm, 24시간 배양 후 serial dilution 후 MRS agar에 도말하여 균수를 counting하였다. 실험결과 Tween 80 첨가량 0.5~4 g/L 에서 균주의 내에서 균주의 성장이 좋았고(1×10⁹ cfu/ml 이상), 특히 첨가량 3.5g 일때 1.9×10⁹ cfu/ml으로 확인된다.

실시예 6-8. 미량 물질 배양 조건 확인

또한 위 실험들과 동일한 방법으로 Magnesium sulfate와 Manganese sulfate에 대해서도 배양 조건을 확인하였고, Magnesium sulfate 0.1~0.2 g/L, Manganese sulfate 0.05~0.1 g/L의 범위에서 균주의 성장이 좋았다(1×10⁹ cfu/ml 이상).

실시예 6-9. 유산균 배양 배지 조건 확립

상기 배양 조건 실험들을 통해 백수오를 첨가하여 본 발명의 균주를 배양하기에 가장 좋은 배양 배지 조건을 하기와 같이 설정하였다.

미생물 배양용 배지 조성물의 구성 성분	첨가량
백수오	10~50 g/L
당밀	5~50 g/L
peptone	5~50 g/L
Sodium acetate	3~11 g/L
Ammonium citrate	2~5 g/L
dipotassium phosphate	0.5~4 g/L
Tween 80(폴리소르베이트 80)	0.5~4 g/L
Magnesium sulfate	0.1~0.2 g/L
Manganese sulfate	0.05~0.1 g/L

<실시예 7. 대량 발효 조건 확인>

실시예 7-1. 배양 조건 i

플라스크에 배양된 종균 배양액을 5L jar 퍼멘터에서 3 L의 규모로 배양하였다. 이 때 플라스크와 퍼멘터 배양은 모두 [백수오 10g/L, 당밀 15 g/L, Peptone 15 g/L, Sodium acetate 3 g/L, Ammonium citrate 2.0 g, dipotassium phosphate 3g/L, Tween 80 2g/L, Magnesium sulfate 0.1g/L, Manganese sulfate 0.05g/L] 조건의 배지를 사용하였다. 종균 배양액은 3L 배지에 1%(v:v)로 접종하였다. 그 밖의 배양 조건으로 초기 pH 7.0, 배양온도 37℃, 공기공급 1 vvm, rpm은 100 으로 24시간 배양하였다. 배양 정도는 생균수를 기준으로 분석하였다. 실험결과 24시간에 확인된 생균수는 1.61×10⁹ cfu/ml였다. 이 결과를 바탕으로 다음실험에서는 배양시간을 늘려 30시간으로 책정하였다.

실시예 7-2. 배양 조건 ii

상기 배양 조건 I과 동일한 공정을 사용하되, 배양 조건 ii에서는 30시간 배양하였고, 배지는 1.5배 농축배지(백수오 15g/L, 당밀 22.5 g/L, Peptone 22.5 g/L, Sodium acetate 4.5 g/L, Ammonium citrate 3.0 g, K₂HPO₄ 4.5 g, Tween 80 3.0 g, Magnesium sulfate 0.15 g, Manganese sulfate 0.075g)를 사용하였다.

실시예 7-3. 배양 조건 iii

배양 조건 iii에서도 배양 조건 I과 동일한 공정을 사용하되, 배양시간은 30시간, 2배 농축배지(백수오 20g/L, 당밀 30g/L, Peptone 30g/L, Sodium acetate 6g/L, Ammonium citrate 4g/L, K₂HPO₄ 4g/L, Tween 80 4g/L, Magnesium sulfate 0.2g/L, Manganese sulfate 0.1g/L)를 사용하였다.

실시예 7-4. 배양 조건 iv

배양조건 iv에서는 배양 조건 I과 동일한 공정을 사용하되, 총 발효량은 500 L, 배지(백수오 20g/L, 당밀 30g/L, Peptone 30g/L, Sodium acetate 6g/L, Ammonium citrate 4g/L, K₂HPO₄ 4g/L, Tween 80 4g/L, Magnesium sulfate 0.2g/L, Manganese sulfate 0.1g/L)를 사용하였고, 30시간 배양하였다.

상기 각 배양 조건에서 유산균이 적정 농도인 10^8~9 cfu/ml 이상으로 증가하는 것이 확인되어 본 발명에서 사용한 배지 조성물이 본 발명의 균주 배양에 유용함이 확인된다. 이 때, 실시예 7-4의 배양상태를 대표로 하여 도 4에 나타내었다.

< 실시예 8. 어류 실험 >

실시예 8-1. 유산균의 어류 장내 정착 실험 결과

대조구 사료(Negative control), Positive Control 사료(백수오를 함유하지 않은 배지에서 배양된 Lactobacillus plantarum CJL-159 균주 배양액을 사료내　생균수 Lactobacillus plantarum 1.0 x 10⁶ cfu/g의 농도가 되도록 희석하여 사료에 분무함), 실험구 사료(백수오를 함유한 배지에서 배양된 Lactobacillus plantarum CJL-159 균주 배양액을 사료내　생균수 Lactobacillus plantarum 1.0 x 10^6~8 cfu/g의 농도가 되도록 희석하여 사료에 분무하여 공급)를 제조하고, 제조된 각 사료 조성물을　군당　10마리씩의 넙치에 공급하였다（2반복 실험）.

각 상기 사료 공급 후, 유산균이 어류 장내에 정착되는지 확인하였는데, 표 8을 참고하면, Negative control 사료 처리구에서는 8주 실험기간 동안 유산균이 검출되지 않은 것을 알 수 있다. 그러나 Positive Control 사료 처리구(백수오 미첨가 배지를 이용해 배양된 균주 배양액이 분사된 사료로 생균수 Lactobacillus plantarum 1.0 x 10⁶ cfu/g사료)와 백수오 첨가 배지를 이용해 배양된 배양액이 분사된 사료 처리구(생균수 Lactobacillus plantarum 1.0 x 10⁶ cfu/g사료)에서는 사료 급이 후 유산균이 장에서 관찰되는 것을 알 수 있다. 또한 백수오 첨가 배지를 이용해 배양된 배양액이 분사된 사료 실험군의 장 내 유산균 수가 특히 급증한 것이 확인된다.

실시예 8-2. 어류 Challenge test

실시예 8-1에서 각 사료 조성물 투여를 마친 8주차에, 어류 공격성 실험을 수행하였다. 각 사료 처리구에서 넙치를 10마리씩 선정하여 10⁶ CFU/g사료의 농도로 조정된 스트렙토코커스 파라우베리스(Strptococcus parauberis)를 접종하여 3주간 누적폐사율을 확인하였다.

도 5를 참고하면, 대조구(Control 사료) 넙치는 감염 후 21일째 90%로 가장 높은 폐사율을 보였지만, 미생물 배양액 첨가 사료가 공급된 넙치는 40~50% 가량 폐사율이 감소되는 것을 보이는 것이 확인된다. 또한 이는 유산균 배양 배지에 백수오가 포함되지 않은 채로 본 발명의 균주를 배양한 것을 처리한 Positive Control보다 백수오 첨가된 배지에서 배양된 배양액이 첨가된 사료가 공급된 넙치에서 10~20% 가량 더 효과적인 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 균주 배양 시 유산균 배지에 백수오가 첨가된 것이 사료 첨가제로 투여되었을 때, 어류의 폐사율이 현저하게 감소하였음을 확인할 수 있다.

한국생명공학연구원

KCTC18550P

20170210

<110> Repiatec Co. Ltd. <120> NOVEL MICROORGANISM LACTOBACILLUS PLANTARUM CJL-159 OR ADDITIVES FOR FISH FEEDS CONTAINING IT <130> 2017-0066 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1442 <212> DNA <213> LACTOBACILLUS PLANTARUM <400> 1 tgcaagtcga acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat catgatttac atttgagtga 60 gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga agcgggggat aacacctgga 120 aacagatgct aataccgcat aacaacttgg accgcatggt ccgagtttga aagatggctt 180 cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag atggtggggt aacggctcac 240 catggcaatg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc cacattggga ctgagacacg 300 gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga aagtctgatg 360 gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga 420 acatatctga gagtaactgt tcaggtattg acggtattta accagaaagc cacggctaac 480 tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt 540 aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cttcggctca accgaagaag 600 tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg 660 tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact 720 gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccatacc 780 gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat 840 taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900 ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc ttaccaggtc 960 ttgacatact atgcaaatct aagagattag acgttccctt cggggacatg gatacaggtg 1020 gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080 acccttatta tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa 1140 ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200 tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc 1260 cattctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat 1320 cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380 catgagagtt tgtaacaccc aaagtcggtg gggtaacctt ttaggaacca gccgcctaag 1440 gt 1442

Claims

스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)에 대한 항균활성을 나타내고, 내산성, 내담즙성 및 내염성을 갖는 것을 특징으로 하는 신규미생물 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) CJL-159(수탁번호 KCTC18550P) 균주.
삭제
제1항의 균주의 균체 또는 이의 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)가 원인이 되는 어류 질병 방제용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 배양액은 유산균 배양용 배지 또는 백수오가 첨가된 유산균 배양용 배지에서 배양된 것을 특징으로 하는 어류 질병 방제용 조성물.
제1항의 균주의 균체 또는 이의 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)가 원인이 되는 질병 방제 효능이 있는 어류용 사료 첨가제.
제5항에 있어서,
상기 배양액은 유산균 배양용 배지 또는 백수오가 첨가된 유산균 배양용 배지에서 배양된 것을 특징으로 하는 어류용 사료 첨가제.
총부피 1ℓ 기준, 백수오 10~50g, 당밀 5~50g, 펩톤(peptone) 5~50g, 아세트산 나트륨(Sodium acetate) 3~11g, 구연산 암모늄(Ammonium citrate) 2~5g, 2인산칼륨(dipotassium phosphate) 0.5~4g, 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80) 0.5~4g, 황산 마그네슘(Magnesium sulfate) 0.1~0.2g 및　황산 망간(Manganese sulfate) 0.05~0.1g이 포함되고, pH가 6.8 내지 7.2로 조정되며, 물이 잔량으로 포함된 유산균　배양용　배지 조성물에 제1항의 균주가 배양된 배양액이 포함된 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis)가 원인이 되는 어류 질병 방제용 조성물.