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KR101896567B1 - 암 치료를 위한 디베이트 분자와 parp 억제제의 병용 용도 - Google Patents

암 치료를 위한 디베이트 분자와 parp 억제제의 병용 용도 Download PDF

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KR101896567B1
KR101896567B1 KR1020187005307A KR20187005307A KR101896567B1 KR 101896567 B1 KR101896567 B1 KR 101896567B1 KR 1020187005307 A KR1020187005307 A KR 1020187005307A KR 20187005307 A KR20187005307 A KR 20187005307A KR 101896567 B1 KR101896567 B1 KR 101896567B1
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마리 듀트레익스
웨일 제이
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인스티튜트 큐리
상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄
옹쎄오
인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
유니베르시떼 파리스-쉬드
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Abstract

본 발명은 암을 치료하기 위한 PARP 억제제와 디베이트 분자의 병용에 관한 것이다.

Description

암 치료를 위한 디베이트 분자와 PARP 억제제의 병용 용도
본 발명은 의학 분야, 특히 종양학에 관한 것이다.
폴리(ADP 리보스)폴리머라제 PARP1 (및 PARP2)는 DNA 손상에 결합하여 수리 효소를 끌어들이는 ADP-리보스 고분자를 형성함으로써 DNA 수리를 촉진하는 효소이다. PARP는 염기 절단 수리 경로에 의한 단일 가닥 절단의 주요 효소이다. 수리되지 않은 채로 남아있는 경우, 단일 가닥 절단은 복제 중에 상동성 재조합에 의해 필수적으로 수리되는 이중 가닥 절단으로 전환된다. 따라서, PARP를 억제하는 것은 상동성 재조합이 결핍된 세포에서 치명적이다. 이러한 관찰은 이미 상동성 재조합 용량을 사용할 수 없는 돌연변이를 가진 암을 치료하기 위한 PARP 억제제의 개발을 유도하였다.
두 가지 주요 효소가 PARP 억제제에 의해 표적화된다: PARP1 및 PAPR2. 정상 조건 하에서, PARP1 및 PARP2는 수리 과정이 진행되면 DNA로부터 방출된다. 그러나, 이들이 일부 PARP 억제제에 결합되어 있는 경우, PARP1 및 PARP2는 DNA 상에 포획되게 된다. 포획된 PARP-DNA 복합체는 수리되지 않은 단일 가닥 DNA 절단보다 세포에 더 독성이 있다. 두 가지 부류의 PARP 억제제가 있다: (i) 주로 PARP 효소 활성을 억제하는 작용을 하고 DNA 상에 PARP 단백질을 포획하지 않는 촉매적 억제제 및 (ii) PARP 효소 활성을 차단하고 손상 부위로부터 이의 방출을 막는 결합된 억제제. 다수의 PARP 억제제가 개발되었지만, 유형 (i) 또는 유형 (ii)의 분류가 명확하지 않다. 벨리파립은 유형 (i)일 수 있으며, 올라파립, 니라파립, BM673은 유형 (ii)에 속할 수 있는 것으로 제안되었다. 또한, PARP가 다수의 세포 과정에 관여하므로, 종양 세포 내에서 PARP 억제제의 작용 기전은 완전히 밝혀지지 않았다. 환자는 현재 특정 종양 유형 (예컨대, 고등급 장액성 난소암 또는 삼중 음성 뇌암)을 가지거나 이들의 암이 관련 분자의 아형 (예컨대, BRCA1/2-돌연변이된 유방암, 난소암, 췌장암, 또는 전립선 암)에 속할 수 있는 경우에만 PARP 억제제 시험으로 간주된다.
PARP억제제 (PARPi) 단일 요법은 임상에서 유망한 효능 및 안전성 프로파일을 나타냈지만, 이들의 주요 한계는 HR 결핍의 필요성과 신속한 내성의 출현이다. 초기에 PARPi 치료에 반응하는 많은 종양들은 HR 활성을 회복시키거나 대안적인 수리 경로의 활성을 자극하는 보상적 돌연변이를 통해 결국 재발된다.
따라서, PARP 억제제의 사용은 특정 종양 유형에 제한되며 임의의 암 치료에서 사용될 수 없다.
본 발명은 임의의 종류의 암 치료에 PARP 억제제를 사용할 수 있는 병용 치료를 제공하며, 특히 상동성 재조합 결핍과 관련된 것에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자와 PARP 억제제의 병용을 제공하여 종양에 대한 상승 효과를 유도한다.
따라서, 본 발명은 특히 암 치료에 사용하기 위한, PARP 억제제 및 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자와 병용하여 암 치료에 사용하기 위한 PARP 억제제 또는 PARP 억제제와 병용하여 암 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 암 치료에서 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 병용된 제제로서 PARP 억제제 및 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 키트에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 핵산 분자는 적어도 하나의 유리 말단 및 인간 게놈의 임의의 유전자에 대해 60% 미만의 서열 동일성을 갖는 6 내지 200 bp의 DNA 이중 가닥 부분을 갖는다.
보다 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 다음의 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure 112018018789208-pct00001
상기 식에서, N은 데옥시뉴클레오티드이고, n은 1 내지 195의 정수이고, 밑줄친 N은 변형된 포스포다이에스터 백본가 있거나 없는 뉴클레오티드를 나타내고, L'는 링커이고, C는 바람직하게는 친유성 분자 및 세포 수용체가 수용체 매개된 엔도시토시스를 가능하게 하도록 표적화하는 리간드로부터 선택되는 엔도시토시스를 촉진하는 분자이고, L은 링커이고, m 및 p는 독립적으로 0 또는 1의 정수이다.
보다 구체적으로, 상기 핵산 분자는 다음의 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure 112018018789208-pct00002
Figure 112018018789208-pct00003
Figure 112018018789208-pct00004
Figure 112018018789208-pct00005
Figure 112018018789208-pct00006
Figure 112018018789208-pct00007
Figure 112018018789208-pct00008
Figure 112018018789208-pct00009
Figure 112018018789208-pct00010
Figure 112018018789208-pct00011
Figure 112018018789208-pct00012
Figure 112018018789208-pct00013
Figure 112018018789208-pct00014
Figure 112018018789208-pct00015
및
Figure 112018018789208-pct00016
상기 식에서, 밑줄친 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 백본을 갖는 뉴클레오티드를 나타내고, 연결된 L'는 헥사에틸렌글리콜, 테트라데옥시티미딜레이트 (T4), 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸 및 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸으로 이루어진 군으로부터 선택되고; m은 1이고, L은 카복사미도 올리고에틸렌 글리콜이고, C는 단일 또는 이중 쇄 지방산 예컨대 옥타데실 및 디올레오일, 콜레스테롤, 토코페롤, 폴산, 당 예컨대 갈락토스 및 만노스 및 이의 올리고사카라이드, 펩티드 예컨대 RGD 및 봄베신 및 단백질 예컨대 인테그린으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 콜레스테롤 또는 토코페롤이다.
바람직한 구현예에서, 상기 핵산 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112018018789208-pct00017
Figure 112018018789208-pct00018
, 및
Figure 112018018789208-pct00019
.
보다 바람직하게는, 엔도시토시스를 촉진하는 분자는 콜레스테롤 또는 토코페롤이다.
매우 특정한 구현예에서, 상기 핵산 분자는 다음의 화학식을 갖는다:
Figure 112018018789208-pct00020
서열번호 21
또 다른 매우 특정한 구현예에서, 상기 핵산 분자는 다음의 화학식을 갖는다:
Figure 112018018789208-pct00021
상기 식에서, C는 콜레스테릴이고, Lm은 테트라에틸렌 글리콜이고, p는 1이고 L'는 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸이다.
바람직하게는, PARP 억제제는 루카파립 (AG014699, PF-01367338), 올라파립 (AZD2281), 벨리파립 (ABT888), 이니파립 (BSI 201), 니라파립 (MK 4827), 탈라조파립 (BMN673), AZD 2461, CEP 9722, E7016, INO-1001, LT-673, MP-124, NMS-P118, XAV939, 이의 유사체, 유도체 또는 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, PARP 억제제는 AZD2281 (올라파립), ABT888 (벨리파립), BMN673, BSI-21 (이니파립), AZD 2461, MK-4827 (니라파립), 및 AG 014699 (루카파립)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, PARP 억제제는 치료량 이하로 사용된다.
모든 암 유형이 치료될 수 있다. 보다 바람직하게는 암은 백혈병, 림프종, 육종, 흑색종, 및 두경부암, 신장암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 폐암, 특히 소세포 폐암, 및 비소세포 폐암, 식도암, 유방암, 방광암, 대장암, 간암, 자궁경부암, 및 자궁내막암 및 복막암으로부터 선택된다. 특히, 암은 고형암이다. 특정 양태에서, 암은 전이암 또는 고등급 또는 진행암이다. 특정 구현예에서, 암은 백혈병, 림프종, 흑색종, 육종, 두경부암, 유방암, 뇌암, 대장암, 및 자궁경부암으로부터 선택된다.
도 1: 몇몇 투여량의 올라파립 (OLA), 벨리파립 (VELI) 및 DT01에서 살아있는 세포의 백분율 의해 측정된 올라파립 및 벨리파립과 DT01의 병용의 초-부가도의 예시
도 2. DT01과 올라파립의 초-부가 효과는 세포주와 DNA-PK 또는 BRCA 돌연변이에 의존하지 않는다. 상이한 종양 세포 (자궁경부암, 교모세포종, 혈액암, 유방암 유래) 및 2개의 비종양 유방 세포에서 모니터링된, 0.1 μM 올라파립 (흑색), 100 μg/ml DT01 (회색) 또는 0.1 μM 올라파립+ 100 μg/ml DT01 둘 모두의 처리 (빗금)에 노출된 세포의 생존.
도 3. DT01과 올라파립의 생체 내 상승효과
도 4: 세포 사멸에 대한 DNA 수리 억제제 AsiDNA 또는 올라파립의 효과. 4.8μM AsiDNA (A) 또는 0.1μM Ola (B)로 처리한 BC 세포주 (MDAMB436, HCC1937, BC227, HCC38, BC173, MDAMB468, HCC1143, BT20, MDAMB231, HCC1187, 및 HCC70), 자궁경부 아데노암종 세포주 (HeLa CTL SX, HeLa BRCA1 SX 및 HeLa BRCA2 SX) 및 비-종양 유방 세포주 (184B5, MCF10 및 MCF12A)에서의 세포 사멸 분석. 점선은 각각의 처리에 대해 민감한 세포주를 나타낸다 (2배 이상의 사멸 세포 %의 평균 차이로 정의됨).
도 5: 세포 생존에 대한 DNA 수리 억제제 AsiDNA 또는 올라파립의 영향. 4.8μM AsiDNA 또는 0.1μM Ola로 처리한 BC 세포주 (MDAMB436, HCC1937, BC227, HCC38, BC173, MDAMB468, HCC1143, BT20, MDAMB231, HCC1187, HCC70), 자궁경부 아데노암종 세포주 (HeLa CTL SX, HeLa BRCA1 SX 및 HeLa BRCA2 SX) 및 비-종양 유방 세포주 (184B5, MCF10 및 MCF12A)에서의 세포 생존 분석. 생존을 살아있는 비-처리된 세포의 %로 나타냈다.
도 6: 병용 치료가 초-부가 효능을 나타낸다. AsiDNA (4.8μM), 올라파립 (0, 0.1 및 1μM) 또는 둘 모두로 처리 후 6일차에 트립판 블루 표지 후에 세포 계수에 의해 모니터링 하였다. (A) 비-처리된 조건(NT)에 대비 살아있는 세포의 비율. (B) 사멸 세포의 백분율. 데이터를 적어도 2개의 독립된 실험의 평균 + Sc.D.로 나타냈다. 점선은 AsiDNA와 올라파립 사이의 부가도가 있는 경우의 계산된 세포 생존을 나타낸다.
도 7: AsiDNA와 올라파립 병용 치료의 효과. 0.1μM Ola로 처리했거나(흑색) 처리하지 않은(회색) 배양에서 종양 (패널 A) 및 비종양 세포주 (패널 B)에서의 세포 생존 (위쪽 패널) 및 세포 사멸 (아래쪽 패널) 분석. 불연속 선은 AsiDNA와 Ola 사이의 부가도가 있는 경우 계산된 세포 생존을 나타낸다 (AsiDNA에 대한 생존 x 올라파립에 대한 생존). 생존과 세포 사멸을 트립판 블루 염색 및 수동 계수로 모니터링 하였다 (치료 후 6일). 생존을 살아있는 비처리된 세포의 %로 나타냈고 사멸 세포를 사멸 세포의 빈도로서 나타냈다.
도 8: 올라파립이 AsiDNA와는 독립적으로 손상 부위에 대한 XRCC1 모집을 억제한다. (A) 레이저 손상 후 40초 후 XRCC1-eYFP 모집의 대표적인 이미지 및 (B) Ola (1μM) 및/또는 AsiDNA (16μM)로 처리한 후 24시간 후 MDAMB231 세포에서의 XRCC1-eYFP 모집 동력학. ns: 유의하지 않음; ****: p<0.0001. 이러한 실험은 제어된 환경 (37℃, 5% CO2) 하에서 63/1.4 대물 렌즈를 사용하여 DMI6000 스탠드에 부착된 Leica SP5 공초점 시스템으로 수행하였다. 모든 기록을 적절한 샘플링 주파수 (512_512 이미지, 선 평균 4 및 줌 설정 8) 및 관심 형광 단백질에 적응된 아르곤 레이저 선 (YFP의 경우 514nm)을 사용하여 만들었다. 첫 번째 단계에서, 광역학적 손상을 유발하지 않을 정도로 충분히 낮은 레이저 에너지로 2 내지 3초의 기간 내에 2개의 이미지를 수득하였다. 이어서, 405-nm 레이저 라인 (다이오드)을 100 ms 동안 최대 출력으로 설정하고 재현가능한 에너지 양으로 광 손상 지점을 야기하기 위해 핵 내에 일정한 크기 (176 nm)의 단일 지점에 초점을 맞췄다. 이어서 관심 단백질의 모집을 사전 손상 서열과 동일한 설정을 사용하여 형광에 의해 모니터링하였다. AsiDNA (16μM), 올라파립 (1μM) 또는 둘 모두로 처리한 후 24시간 후에 레이저 손상을 유도하였다. 이미지를 후속의 52초 동안 2초 간격으로 캡쳐하였다.
도 9: DNA 수복에 대한 AsiDNA 및 올라파립 병용 치료의 효과. Ola 및/또는 AsiDNA로 24시간 동안 처리한 MDAMB231 (A) 또는 MCF10 (C) Ola 및/또는 AsiDNA 처리 24시간 후 세포(B, D) 에서의 γH2AX (붉은색) 및 Rad51 또는 53BP1 (녹색) 병소의 대표적인 이미지. Ola 및/또는 AsiDNA 처리 24시간 후 세포 100개의 MDAMB231 세포 (B) 또는 MCF10A 세포 (D)에서의 53BP1 및 Rad51 병소의 넘버링. 붉은색 막대는 평균 값을 나타낸다 (E, F). MDAMB231 (E) 또는 MCF10A (F) 세포에서 Ola 및/또는 AsiDNA 처리 후 24시간 후 알칼라인 코멧 분석에 의해 DNA 손상을 모니터링 하였다. ns: 유의하지 않음; *: p<0.05; ****: p<0.0001.
도 10: AsiDNA가 조사-유도된 53BP1 병소를 억제한다. AsiDNA 및/또는 Ola로 처리 전 22시간 후, 10Gy 조사 후 2시간 후 100개의 MDAMB231 세포에서의 53BP1 병소의 번호. 붉은색 막대는 평균 값을 나타낸다. *: p<0.05; **: p<0.01; ****: p<0.0001.
도 11: AsiDNA 및 PARP 결함의 상승 효과. (A) 다양한 동질유전자 DT40 세포주에 대한 AsiDNA의 세포독성. (B) DT40 세포 야생형 (WT; 흑색) 또는 PARP KO (붉은색) 단독 (연속된 선) 또는 벨리파립 1μM과의 병용(푸른색 불연속 선)에서의 AsiDNA에 대한 세포 생존 비교. (36)에 기술된 바와 같이 다양한 돌연변이체 DT40 세포에서 ATPlite 1-단계 키트로 (처리 후 72시간) 생존을 모니터링 하였다. 생존을 비처리된 세포의 %로서 나타냈다. 결과는 3개의 독립된 실험에 대해 평균 생존 ± SEM으로서 나타냈다.
도 12: 벨리파립과 결합된 AsiDNA가 초-부가 효능을 나타낸다. AsiDNA (4.8μM), 벨리파립 (0, 10 및 50μM) 또는 둘 모두로 처리한 효능을 트립판 블루로 처리한 후 6일 후에 모니터링 하였다. (A) 비처리된 조건(NT) 대비 상대적인 살아있는 세포의 백분율. (B) 사멸된 세포의 백분율. 범선은 AsDNA와 벨리파립 사이의 부가도가 존재하는 경우 계산된 세포 생존을 나타낸다.
도 13: MDAMB231에 대한 AsiDNA와 다양한 PARPi의 병용 치료 효과. 4.8μM AsiDNA (흑색), 16μM AsiDNA (어두운 회색)로 처리했거나 처리하지 않은 (연회색) 배양에서 MDAMB231 세포주의 세포 생존 (A) 및 세포 사멸(B) 분석. 불연속 선은 AsiDNA와 PARPi 사이의 부가도가 존재하는 경우 계산된 세포 생존을 나타낸다 (AsiDNA에 대한 생존 x PARPi에 대한 생존). 처리 후 6일 후 살아있는 세포와 사멸된 세포를 모니터링 하였다. 생존을 살아있는 비처리된 세포의 %로 나타내고 사멸된 세포를 사멸된 세포의 빈도로 나타냈다. PARPi 투여량은 80% 및 50% 생존으로 선택되었다 (표 2).
따라서, 본 발명은 다음에 관한 것이다:
- 특히 암 치료에 사용하기 위한, PARP 억제제 및 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물;
- 특히 암 치료에서, 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 병용된 제제로서 PARP 억제제 및 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 함유하는 제품 또는 키트;
- 특히 암 치료에서, 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 PARP 억제제 및 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 병용된 제제;
- 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자로의 치료와 병용하는 암 치료에서 사용하기 위한 PARP 억제제를 포함하는 약학 조성물;
- PARP 억제제로의 치료와 병용하는 암 치료에서 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물;
- 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자로의 치료와 병용하는 암 치료를 위한 약제의 제조를 위한 PARP 억제제를 포함하는 약학 조성물의 용도;
- PARP 억제제로의 치료와 병용하는 암 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물의 용도;
- 암 치료를 위한 약제의 제조를 위한 PARP 억제제 및 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물의 용도;
- 치료를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하는 방법으로서, (a) 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자, (b) PARP 억제제, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법;
- 치료를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하는 방법으로서, PARP 억제제를 포함하는 유효량의 약학 조성물, 및 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 유효량의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법;
- 치료를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하는 방법으로서, PARP 억제제 및 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 유효량의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
본원에 사용된 용어 "키트", "제품" 또는 "병용된 제제"는 상기 정의된 병용 파트너가 독립적으로 또는 고유한 양의 병용 파트너와 상이한 고정된 병용을 사용하여, 즉, 동시에 또는 상이한 시점에 투여될 수 있다는 점에서 특히 "부품 키트"를 정의한다. 부품 키트의 부품은 이어서, 예컨대 동시에 또는 시간순으로 엇갈려서, 즉, 상이한 시점 및 부품 키트의 임의의 부품에 대해 동일하거나 상이한 시간 간격으로 투여될 수 있다. 병용된 제제에서 투여되는 병용 파트너의 총 양의 비율은 다양할 수 있다. 병용 파트너는 동일한 경로 또는 상이한 경로로 투여될 수 있다.
본 발명에서, 용어 치료는 치유적, 증상적, 및 예방적 치료를 의미한다. 본 발명의 약학 조성물, 키트, 제품 및 병용된 제제는, 암 진행의 초기 또는 후기 단계를 포함하여 암 또는 종양이 존재하는 인간에서 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물, 키트, 제품 및 병용된 제제는 암을 가진 환자를 반드시 치료할 필요는 없지만, 진행을 지연 또는 늦추거나 질병의 추가 진행을 예방하여 환자의 상태를 개선할 것이다. 특히, 본 발명의 약학 조성물, 키트, 제품 및 병용된 제제는 종양 발달을 감소시키고, 종양 부담을 감소시키고, 포유류 숙주에서 종양 퇴행을 일으키고/일으키거나 전이 발생 및 암 재발을 예방한다. 암 치료에서, 본 발명의 약학 조성물은 치료학적 유효량으로 투여된다.
"치료학적 유효량"은, 인간을 포함하는 포유류에서, 단독으로 또는 약학 조성물의 다른 활성 성분, 키트, 제품 또는 병용된 제제와 병용하여 암의 유해한 효과를 예방, 제거 또는 감소시키는 본 발명의 약학 조성물의 양을 의미한다. 투여된 투여량은 단독으로 또는 본원에 기술된 병용 외의 다른 치료와 병용하여 사용되는 각각의 화합물에 대해 정의된 "치료 유효량"에 대한 조성물 중 각각의 화합물에 대해 더 낮을 수 있음이 이해될 것이다. 조성물의 "치료 유효량"은 환자, 병리학, 투여 방식 등에 따라 당업자에 의해 채택될 것이다.
본원 전체의 명세서에서 "암 치료" 등이 본 발명의 약학 조성물과 관련하여 언급될 때, 이는 다음을 의미한다: (a) 암 치료 방법으로서, 상기 방법은 본 발명의 약학 조성물을 이러한 치료를 필요로하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법; (b) 암 치료를 위한 본 발명의 약학 조성물의 용도; (c) 암 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 약학 조성물의 용도; 및/또는 (d) 암 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 약학 조성물.
본원에서 고려되는 약학 조성물은 활성 성분 외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분의 생물학적 활성의 효능을 저해하지 않고 투여되는 숙주에 대해 독성이 없는 임의의 담체 (예컨대 지지체, 물질, 용매 등)를 포함하는 것을 의미한다. 예컨대, 비경구 투여를 위해, 활성 화합물은 비히클 예컨대 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민 및 링거 용액으로 주사하기 위한 단위 투여량으로 제형화될 수 있다.
약학 조성물은 약학적으로 호환되는 용매 중의 용액으로서 또는 적절한 약학적 용매 또는 비히클 중의 비히클 중의 에멀젼, 현탁액 또는 분산액으로서, 또는 환제, 정제 또는 당업계에 공지된 방법으로 고체 비히클을 함유하는 캡슐제로서 제형화될 수 있다. 경구 투여에 적절한 본 발명의 제형은 각각 소정량의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 사쉐, 정제 또는 로젠지로서 분리된 단위의 형태; 분말 또는 과립 형태; 수성 액체 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액 형태; 또는 수중유 에멀전 또는 유중수 에멀전 형태일 수 있다. 비경구 투여에 적절한 제형은 편리하게는 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장성인 활성 성분의 멸균 유성 또는 수성 제제를 포함한다. 모든 이러한 제형은 또한 다른 약학적으로 호환되고 비독성인 보조제, 예컨대 안정화제, 항산화제, 결합제, 염료, 유화제 또는 향료 물질을 함유할 수 있다. 본 발명의 제형은 약학적으로 허용되는 담체와 결합된 활성 성분 및 따라서 선택적으로 다른 치료적 성분을 포함한다. 담체는 제형의 다른 성분과 호환될 수 있고 이의 수용자에게 해롭지 않다는 점에서 "허용가능"해야 한다. 약학 조성물은 적절한 멸균 용액의 주사 또는 정맥 내 주입에 의해 또는 소화관에 의한 경구 투여로서 유리하게 적용된다. 대부분의 이러한 화학요법제의 안전하고 효과적인 투여 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 이의 투여가 표준 문헌에 기술되어 있다.
PARP 억제제
본원에 사용된 용어 "PARP"는 폴리 (ADP-리보스) 폴리머라제를 지칭한다. PARP는 β-니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 (NAD+)가 니코틴아미드 및 폴리-ADP-리보스 (PAR)로 변환되는 것을 촉매한다. PARP는 DNA 단일 가닥 절단 (SSB)의 수리에서 중요한 분자이다. 본원에 사용된 용어 "PARP" (EC 2.4.2.30)는 "PARS" (폴리(ADP-리보스) 신타제의 경우), "ADPRT" ( NADr단백질 (ADP-리보실) 트랜스퍼라제 (중합화)의 경우), 또는 "pADPRT" (폴리(ADP-리보스) 트랜스퍼라제의 경우)와 동일하다.
본원에 사용된 용어 "PARP 억제제"는 폴리 (ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)의 활성을 감소시키는 능력을 가진 임의의 화합물을 지칭한다. PARP 억제는 주로 2개의 상이한 기작에 의존한다: (i) PARP 효소 활성을 억제함으로써 주로 작용하는 촉매적 억제 및 (ii) PARP 효소 활성을 차단하고 손상된 부위로부터 이의 방출을 막는 결합 억제. 결합 억제제는 촉매적 억제제보다 더 독성이다. 본 발명에 따른 PARP 억제제는 바람직하게는 촉맥적 및/또는 결합 억제제이다.
바람직한 구현예에서, PARP 억제제는 PARP 패밀리의 임의의 효소의 억제제이고, 바람직하게는 PARP1 및/또는 PARP2이다.
PARP 활성은 당업자에게 널리 공지된 다양한 기법에 의해 결정될 수 있다. 통상적으로, 이러한 기법은 히스톤 단백질 상에 표지된 폴리(ADP-리보스)의 혼입을 측정하는 단계를 포함한다. 이러한 기법에 대한 상업적인 키트를 이용할 수 있다 (예컨대, 비오티닐화된 폴리(ADP-리보스)가 포함된 Tervigen의 키트 참조). Putt KS et al (Anal Biochem, 326(1):78-86, 2004)에 의해 개발된 것과 같은 다른 방법이 또한 사용될 수 있으며, 상기 개시는 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다. 이러한 방법은 공지된 또는 추정상의 PARP 억제제의 IC50 값의 결정에 이상적이다.
다수의 PARP 억제제가 공지되어 있고, 따라서 공지된 출발 물질로부터 공지된 방법에 의해 합성될 수 있거나, 상업적으로 이용할 수 있거나, 문헌에서 상응하는 화합물을 제조하는데 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 적절한 PARP 억제제의 예시는 비제한적으로 올라파립 (AZD-2281, 4-[(3-[(4-사이클로프로필카보닐)피페라진-4-일]카보닐)-4-플루오로페닐]메틸(2H)-프탈라진-l-온), 벨리파립 (ABT-888, CAS 912444-00-9, 2-((fi)-2-메틸피롤리딘-2-일)-lW-벤즈이미다졸-4-카복사미드), CEP-8983 (ll-메톡시-4,5,6,7-테트라히드로-lH-사이클로펜타[a]피롤로[3,4-c]카바졸-l,3(2H)-다이온) 또는 이의 전구약물 (예컨대 CEP- 9722), 루카파립 (AG014699, PF-01367338, 8-플루오로-2-{4-[(메틸아미노)메틸]페닐}-l,3,4,5-테트라히드로-6H-아제피노[5,4,3-cd]인돌-6-온), E7016 (GPI-21016, 10-((4-히드록시피페리딘-l-일)메틸)크로메노-[4,3,2-데]프탈라진-3(2H)-온), 탈라조파립 (BMN-673, (8S,9R)-5-플루오로-8-(4-플루오로페닐)-9-(l-메틸-lH-l,2,4-트리아졸-5-일)-8,9-다이히드로-2H-피리도[4,3,2데]프탈라진-3(7H)-온), INO-1001 (4-페녹시-3-피롤리딘-l-일-5-설파모일-벤조산), KU0058684 (CAS 623578-11-0), 니라파립 (MK 4827, Merck & Co Inc), 이니파립 (BSI 201), 이니파립-메트 (이니파립의 C-니트로소 대사산물), CEP 9722 (Cephalon Inc), LT-673, MP-124, NMS-P118, XAV939, AZD 2461, 니코틴아미드, 5-메틸 니코틴아미드, 4-아미노-l,8-나프탈이미드, 피콜린아미드, 벤즈아미드, 3-치환된 벤즈아미드, 3-메톡시벤즈아미드, 3-히드록시벤즈아미드, 3-아미노벤즈아미드, 3-클로로프로카인아미드, 3-니트로소벤즈아미드, 4-아미노벤즈아미드, 2-아미노벤즈아미드, 메틸 3,5-다이요도-4-(4'-메톡시페녹시) 벤조에이트, 메틸-3,5-다이요도-4-(4'-메톡시-3',5'-다이요도-페녹시) 벤조에이트, 환형 벤즈아미드, 1,5-다이[(3-카바모일페닐)아미노카보닐옥시] 펜탄, 인돌, 벤즈이미다졸, 벤족사졸-4-카복사미드, 벤즈이미다졸-4-카복사미드, 2-치환된 벤족사졸 4-카복사미드, 2-치환된 벤즈이미다졸 4-카복사미드, 2-아릴 벤즈이미다졸 4-카복사미드, 2-사이클로알킬벤즈이미다졸-4-카복사미드, 2-(4-히드록스페닐) 벤즈이미다졸 A-카복사미드, 퀴녹살린카복사미드, 이미다조피리딘카복사미드, 2-페닐인돌, 2-치환된 벤족사졸, 2-페닐 벤족사졸, 2-(3-메톡시페닐) 벤족사졸, 2-치환된 벤즈이미다졸, 2-페닐 벤즈이미다졸, 2-(3-메톡시페닐) 벤즈이미다졸, 1,3,4,5-테트라히드로-아제피노[5,4,3-cd]인돌-6-온, 아제피노인돌, 아제피노인돌온, 1,5-다이히드로-아제피노[4,5,6-cd]인돌린-6-온, 다이히드로다이아자피노인돌린온, 3-치환된 다이히드로다이아자피노인돌린온, 3-(4-트리플루오로메틸페닐)-다이히드로다이아자피노인돌린온, 테트라히드로다이아자피노인돌린온, 5,6-다이히드로이미다조[4,5, 1-j, k][l,4]벤조다이아조핀-7(4H)-온, 2-페닐-5,6-다이히드로-이미다조[4,5,l-jk][l,4]벤조다이아제핀-7(4H)-온, 2,3-다이히드로-이소인돌-1-온, 벤즈이미다졸-2-피페라진, 벤즈이미다졸-2-피페라진 이종환형 유도체, 4-요오도-3-니트로벤즈아미드, 벤조피론, 1,2-벤조피론 6-니트로소벤조피론, 6-니트로소 1,2-벤조피론, 5-요오도-6-아미노벤조피론, 벤조일우레아, 퀴놀론, 이소퀴놀론, 이소퀴놀리논, 다이히드로이소퀴놀리논, 2H-이소퀴놀린-l-온, 3H-퀴나졸린-4-온, 5-치환된 다이히드로이소퀴놀리논, 5-히드록시 다이히드로이소퀴놀리논, 5-메틸 다이히드로이소퀴놀리논, 5-히드록시 이소퀴놀리논, 5-아미노 이소퀴놀린-1-온, 5-다이히드록시이소퀴놀리논, 1,5-다이히드록시이소퀴놀린, 1,5-이소퀴놀린디올, 4-히드록시퀴나졸린, 치환된 티아졸릴-이소퀴놀리논, 치환된 옥사조일-이소퀴놀리논, 테트라히드로-2H-이소퀴놀린-1-온, 3,4-다이히드로이소퀴놀린-l(2H)-온, 3,4-다이히드로-5-메톡시-이소퀴놀린-l(2H)-온, 3,4-다이히드로-5-메틸-l(2H)이소퀴놀리논, 3H-퀴나졸린-4-온, 이소퀴놀린-l(2H)-온, 3,4 다이히드로이소퀴놀린-l(2H)-온, 4-카복사미도-벤즈이미다졸, 치환된 6-사이클로헥실알킬 치환된 2-퀴놀리논, 치환된 6-사이클로헥실알킬 치환된 2-퀴녹살리논, 7-페닐알킬 치환된 2-퀴놀리논, 7-페닐알킬 치환된 2-퀴녹살리논, 6-치환된 2-퀴놀리논, 6-치환된 2-퀴녹살리논, 1-(아릴메틸)퀴나졸린-2,4(1H,3H)-다이온, 4,5-다이히드로-이미다조[4,5,l-ij]퀴놀린-6-온, l,6-나프티리딘-5(6H)-온, 1,8-나프탈이미드, 4-아미노-l,8-나프탈이미드, 3,4-다이히드로-5-[4-l(l-피페리디닐)부톡시]-l(2H)-이소퀴놀리논, 2,3-다이히드로벤조[데]이소퀴놀린-l-온, 1-1 lb-다이히드로-[2H]벤조피라노[4,3,2-데]이소퀴놀린-3-온, 테트라환형 락탐, 벤즈피라노이소퀴놀리논, 벤조피라노[4,3,2-데]이소퀴놀리논, 퀴나졸린, 퀴나졸린온, 퀴나졸린다이온, A-히드록시퀴나졸린, 2-치환된 퀴나졸린, 8-히드록시-2-메틸퀴나졸린-4-(3H)온, 프탈라진, 프탈라진온, 프탈라진-l(2H)-온, 5-메톡시-4-메틸-l(2) 프탈라진온, 4-치환된 프탈라진온, 4-(l-피페라지닐)-l(2H)-프탈라진온, 테트라환형 벤조피라노[4,3,2-데]프탈라진온 및 테트라환형 인데노 [l,2,3-데]프탈라진온, 트리환형 프탈라진온, 2-아미노프탈히드라지드, 프탈라진온 케톤, 다이히드로피리도프탈라진온, 6-치환된 5-아릴아미노-1h-피리딘-2-온, 피리다지논, 테트라히드로피리도피리다지논, 테트라아자 페날렌-3-온, 티에노[2,3-c]이소퀴놀린-5-온 (TIQ-A), 2,5-다이아자바이사이클로[2.2.1]헵탄, 피리미도이미다졸, 이소인돌린온, 페난트리딘, 페난트리디논, 5[H]페난트리딘-6-온, 치환된 5[H] 페난트리딘-6-온, 2,3-치환된 5[H]페난트리딘-6-온, 6(5H)페난트리디논의 설폰아미드/카바미드 유도체, 티에노[2, 3-c]이소퀴놀론, 9-아미노 티에노[2,3-c]이소퀴놀론, 9- 히드록시티에노[2,3-c]이소퀴놀론, 9-메톡시티에노[2,3-c]이소퀴놀론, N-(6-옥소-5,6-다이히드로페난트리딘-2-일]-2-(N,N-다이메틸아미노}아세트아미드, 치환된 4,9- 다이히드로사이클로펜타[imn]페난트리딘-5-온, 불포화된 히드록시민산 유도체, O-(3-피페리디노-2-히드록시-l-프로필)니코틴 아미독심, O-(2-히드록시-3-피페리디노-프로필)-3-카복실산 아미독심, 피리다진, 피라진아미드, BGB-290, PF-1367338 (Pfizer Inc), AG014699 (Pfizer, Inc.), KU-59436 (KuDOS/AstraZeneca PJ34, 4-아미노-l,8-나프탈리니드 (Trevigen), 6(5H)-페난트리디논 (Trevigen), NU1025, 4-HQN, BGP -15, A-966492, GPI21016, 6(5H)-페난트리디논 (펜), 테오프로민, 테오필린, 카페인, 메틸잔틴, 티미딘, 3-아미노프탈히드라지드, 이의 유사체, 유도체 또는 혼합물을 포함한다.
추가의 PARP 억제제가 예컨대 WO14201972, WO14201972, WO12141990, WO10091140, WO9524379, WO09155402, WO09046205, WO08146035, WO08015429, WO0191796, WO0042040, US2006004028, EP2604610, EP1802578, CN104140426, CN104003979, US060229351, US7041675, WO07041357, WO2003057699, US06444676, US20060229289, US20060063926, WO2006033006, WO2006033007, WO03051879, WO2004108723, WO2006066172, WO2006078503, US20070032489, WO2005023246, WO2005097750, WO2005123687, WO2005097750, US7087637, US6903101, WO20070011962, US20070015814, WO2006135873, UA20070072912, WO2006065392, WO2005012305, WO2005012305, EP412848, EP453210, EP454831, EP879820, EP879820, WO030805, WO03007959, US6989388, US20060094746, EP1212328, WO2006078711, US06426415, US06514983, EP1212328, US20040254372, US20050148575, US20060003987, US06635642, WO200116137, WO2004105700, WO03057145A2, WO2006078711, WO2002044157, US20056924284, WO2005112935, US20046828319, WO2005054201, WO2005054209, WO2005054210, WO2005058843, WO2006003146, WO2006003147, WO2006003148, WO2006003150, WO2006003146, WO2006003147, UA20070072842, US05587384, US20060094743, WO2002094790, WO2004048339, EP1582520, US20060004028, WO2005108400, US6964960, WO20050080096, WO2006137510, UA20070072841, WO2004087713, WO2006046035, WO2006008119, WO06008118, WO2006042638, US20060229289, US20060229351, WO2005023800, WO1991007404, WO2000042025, WO2004096779, US06426415, WO02068407, US06476048, WO2001090077, WO2001085687, WO2001085686, WO2001079184, WO2001057038, WO2001023390, WO01021615A1, WO2001016136, WO2001012199, WO95024379, WO200236576, WO2004080976, WO2007149451, WO2006110816, WO2007113596, WO2007138351, WO2007144652, WO2007144639, WO2007138351, WO2007144637, Banasik et al. (J. Biol. Chem., 267:3, 1569-75, 1992), Banasik et al. (Molec. Cell. Biochem, 138:185-97, 1994), Cosi et al. (Expert Opin. Ther. Patents 12 (7), 2002), Southan 및 Szabo (Curr Med Chem, 10 321-340, 2003), Underhill C. et al. (Annals of Oncology, doi:10.1093/annonc/mdq322, pp 1-12, 2010), Murai J. et al. (J. Pharmacol. Exp. Ther., 349:408-416, 2014)에 기술되어 있으며, 모든 이러한 특허 및 공개문헌은 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다.
바람직한 구현예에서, PARP 억제제 화합물은 루카파립 (AG014699, PF-01367338), 올라파립 (AZD2281), 벨리파립 (ABT888), 이니파립 (BSI 201), 니라파립 (MK 4827), 탈라조파립 (BMN673), AZD 2461, CEP 9722, E7016, INO-1001, LT-673, MP-124, NMS-P118, XAV939, 이의 유사체, 유도체 또는 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 더 바람직한 구현예에서, PARP 억제제는 루카파립 (AG014699, PF-01367338), 올라파립 (AZD2281), 벨리파립 (ABT888), 이니파립 (BSI 201), 니라파립 (MK 4827), 탈라조파립 (BMN673), AZD 2461, 이의 유사체, 유도체 또는 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
핵산 분자
본 발명에서 사용하기 위한 접합되거나 접합되지 않은 핵산 분자가 다음의 화학식에 의해 기술될 수 있다:
Figure 112018018789208-pct00022
상기 식에서,
N은 뉴클레오티드이고, n은 적어도 1의 정수이고, 밑줄친 N은 변형된 포스포다이에스터 백본을 갖거나 갖지 않는 뉴클레오티드이고, L'는 링커이고, C는 엔도시토시스를 촉진하는 분자이고, L은 링커이고, m 및 p는 독립적으로 0 또는 1의 정수이다. 화학식 (II) 및 (III)에서, C-Lm은 뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 각각 연결된다. 화학식 (I-III)에서, C-Lm은 바람직하게는 다이설파이드 결합 (S-S)을 통해 L'에 연결된다. 분자가 접합되는 경우, p는 1이다. 바람직하게는, 밑줄친 N은 변형된 포스포다이에스터 백본을 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다.
바람직한 구현예에서, 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 분자는 하나 또는 몇몇의 다음의 특징을 갖는다:
- N은, 바람직하게는 A (아데닌), C (시토신), T (티민) 및 G (구아닌)로 이루어진 군으로부터 선택되고 CpG 다이뉴클레오티드의 발생을 회피하도록 선택되고 인간 게놈의 임의의 유전자와 80% 또는 70% 미만, 심지어는 60% 또는 50% 미만의 서열 동일성을 갖는, 데옥시뉴클레오티드이고/이거나,
- n은 1 내지 195, 바람직하게는 3 내지 195, 23 내지 195, 또는 25 내지 195, 선택적으로 1 내지 95, 2 내지 95, 3 내지 95, 5 내지 95, 15 내지 195, 19 내지 95, 21 내지 95, 23 내지 95, 25 내지 95, 27 내지 95, 1 내지 45, 2 내지 35, 3 내지 35, 5 내지 35, 15 내지 45, 19 내지 45, 21 내지 45, 또는 27 내지 45의 정수이다. 특히 바람직한 구현예에서, n은 27이고 이거나;
- 밑줄친 N은 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 백본, 보다 바람직하게는 포스포로티오에이트 백본을 갖거나 갖지 않는 뉴클레오티드를 지칭하고; 바람직하게는, 밑줄친 N은 변형된 포스포다이에스터 백본을 갖는 뉴클레오티드를 지칭하고/하거나;
- 연결된 L'는 헥사에틸렌글리콜, 테트라데옥시티미딜레이트 (T4), 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸 및 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
- m은 1이고 L은 카복사미도 폴리에틸렌 글리콜, 보다 바람직하게는 카복사미도 트리에틸렌 글리콜 또는 카복사미도 테트라에틸렌 글리콜이고/이거나;
- C는 콜레스테롤, 단일 또는 이중 쇄 지방산 예컨대 옥타데실, 올레산, 디올레오일 또는 스테아르산, 또는 세포 수용체 예컨대 폴산, 토코페롤, 당 예컨대 갈락토스 및 만노스 및 이의 올리고사카라이드, 펩티드 예컨대 RGD 및 봄베신, 및 단백질 예컨대 트랜스퍼링 및 인테그린을 표적으로 하는 리간드 (펩티드, 단백질, 앱타머를 포함함)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 콜레스테롤 또는 토코페롤이고, 보다 더 바람직하게는 콜레스테롤이다.
바람직하게는, C-Lm은 트리에틸렌글리콜 링커 (10-O-[1-프로필-3-N-카바모일콜레스테릴]-트리에틸렌글리콜 라디칼이다. 대안적으로, C-Lm은 테트라에틸렌글리콜 링커 (10-O-[1-프로필-3-N-카바모일콜레스테릴]-테트라에틸렌글리콜 라디칼이다.
바람직한 구현예에서, 접합된 디베이트(Dbait) 분자 또는 헤어핀 핵산 분자는 다음의 화학식을 갖는다:
Figure 112018018789208-pct00023
상기 식에서, N, N, n, L, L', C 및 m에 대해 화학식 (I), (II), (II') 및 (III)과 동일한 정의를 갖는다.
특정 구현예에서, 핵산 분자는 PCT 특허 출원 WO2005/040378, WO2008/034866 및 WO2008/084087에 광범위하게 기술되어 있는 것과 같은 디베이트 분자일 수 있으며, 상기 공개문헌은 참조로써 본원에 포함되어 있다.
디베이트 분자는 이의 치료 활성에 필요한 다수의 특성, 예컨대 이의 최소 길이, 적어도 하나의 유리 말단의 존재, 및 이중 가닥 부분의 존재, 바람직하게는 DNA 이중 가닥 부분에 의해 정의될 수 있다. 하기 논의되는 바와 같이, 디베이트 분자의 정확한 뉴클레오티드 서열은 이의 활성에 영향을 미치지 않는 다는 것을 유의하는 것이 중요하다. 또한, 디베이트 분자는 변형된 및/또는 비천연 백본을 함유할 수 있다.
바람직하게는, 디베이트 분자는 비인간 유래이고(즉, 이의 뉴클레오티드 서열 및/또는 형태 (예컨대, 헤어핀)는 인간 세포에서와 같이 존재하지 않음), 가장 바람직하게는 합성 유래이다. 디베이트 분자의 서열이 거의 역할을 하지 않기 때문에, 역할이 있다면, 디베이트 분자는 바람직하게는 공지된 유전자, 프로모터, 인핸서, 5'- 또는 3'- 상류 서열, 엑손, 인트론 등과 유의한 정도의 서열 상동성 또는 동일성을 갖지 않는다. 즉, 디베이트 분자는 인간 게놈의 임의의 유전자와 80% 또는 70% 미만, 심지어는 60% 또는 50% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 서열 동일성을 결정하는 방법이 당업계에 널리 공지되어 있으며 예컨대 Blast를 포함한다. 디베이트 분자는 인간 게놈 DNA와는 엄격한 조건 하에서 혼성화되지 않는다. 전형적인 엄격한 조건은 이들이 부분적으로 상보적인 핵산으로부터 완전히 상보적인 핵산을 구별할 수 있는 조건이다.
또한, 디베이트 분자의 서열은 바람직하게는 널리 공지된 톨-유사 수용체 매개된 면역학적 반응을 회피하기 위해 CpG가 없다.
디베이트 분자의 길이는 이것이 Ku 및 DNA-PKcs 단백질을 포함하는 Ku 단백질 복합체의 적절한 결합을 가능케 하기에 충분한 한 가변적일 수 있다. 이와 같은 Ku 복합체에 결합하는 것을 보장하고 DNA-PKcs 활성화를 가능케 하기 위해 디베이트 분자의 길이가 20 bp 초과, 바람직하게는 약 32 bp이어야 한다는 것이 밝혀졌다. 바람직하게는, 디베이트 분자는 20 내지 200 bp, 보다 바람직하게는 24 내지 100 bp, 보다 더 바람직하게는 26 내지 100, 및 가장 바람직하게는 24 내지 200, 25 내지 200, 26 내지 200, 27 내지 200, 28 내지 200, 30 내지 200, 32 내지 200, 24 내지 100, 25 내지 100, 26 내지 100, 27 내지 100, 28 내지 100, 30 내지 100, 32 내지 200 또는 32 내지 100 bp를 포함한다. 예컨대, 디베이트 분자는 24 내지 160, 26 내지 150, 28 내지 140, 28 내지 200, 30 내지 120, 32 내지 200 또는 32-100 bp를 포함한다. "bp"는 분자가 명시된 길이의 이중 가닥 부분을 포함하는 것으로 의도된다.
특정 구현예에서, 적어도 32 bp, 또는 약 32 bp의 이중 가닥 부분을 갖는 디베이트 분자는 디베이트32 (서열번호 1), 디베이트32Ha (서열번호 2), 디베이트32Hb (서열번호 3), 디베이트32Hc (서열번호 4) 또는 디베이트32Hd (서열번호 5)와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 선택적으로, 디베이트 분자는 디베이트32, 디베이트32Ha, 디베이트32Hb, 디베이트32Hc or 디베이트32Hd와 동일한 뉴클레오티드 조성을 포함하지만 이의 뉴클레오티드 서열은 상이하다. 이어서, 디베이트 분자는 3 A, 6 C, 12 G 및 11 T를 갖는 이중 가닥 부분의 하나의 가닥을 포함한다. 바람직하게는, 디베이트 분자의 서열은 임의의 CpG 다이뉴클레오티드를 함유하지 않는다.
대안적으로, 이중 가닥 부분은 디베이트32 (서열번호 1), 디베이트32Ha (서열번호 2), 디베이트32Hb (서열번호 3), 디베이트32Hc (서열번호 4) 또는 디베이트32Hd (서열번호 5)의 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 32개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 보다 특정한 구현예에서, 이중 가닥 부분은 디베이트32 (서열번호 1), 디베이트32Ha (서열번호 2), 디베이트32Hb (서열번호 3), 디베이트32Hc (서열번호 4) 또는 디베이트32Hd (서열번호 5)의 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 32개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어져 있다.
본원에 개시된 핵산은 DSB 모방체로서 적어도 하나의 유리 말단을 가져야 한다. 상기 유리 말단은 유리 무딘(blunt) 말단 또는 5'-/3'- 돌출 말단일 수 있다. "유리 말단"은 본원에서 5' 말단 및 3' 말단 모두를 갖거나 3' 말단 또는 5' 말단 중 하나를 갖는 핵산 분자, 특히 이중 가닥 핵산 부분을 지칭한다. 선택적으로, 5' 및 3' 말단 중 하나는 핵산 분자를 접합하기 위해 사용될 수 있거나 차단 기 예컨대 3'-3'뉴클레오티드 결합에 연결될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 핵산 분자는 2개의 유리 말단을 함유하고, 선형일 수 있다. 따라서, 디베이트 분자는 또한 2개의 유리 말단을 갖고 디베이트32 (서열번호 1), 디베이트32Ha (서열번호 2), 디베이트32Hb (서열번호 3), 디베이트32Hc (서열번호 4) 또는 디베이트32Hd (서열번호 5)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 이중 가닥 분자일 수 있다.
또 다른 특정한 구현예에서, 이는 오직 하나의 유리 말단을 함유한다. 바람직하게는, 디베이트 분자는 이중 가닥 DNA 줄기 및 루프를 갖는 헤어핀 핵산으로 제조된다. 상기 루프는 핵산 또는 당업자에게 공지된 다른 화학 기 또는 이의 혼합물일 수 있다. 뉴클레오티드 링커는 2 내지 10개의 뉴클레오티드, 바람직하게는, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비-뉴클레오티드 링커는 비제한적으로 무기 뉴클레오티드, 폴리에터, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질, 폴리히드로카본, 또는 다른 중합체성 화합물 (예컨대 올리고에틸렌 글리콜 예컨대 2 내지 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 바람직하게는 4, 5, 6, 7 또는 8 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 것들)을 포함한다. 바람직한 링커는 헥사에틸렌글리콜, 테트라데옥시티미딜레이트 (T4), 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸 및 다른 링커 예컨대 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 특정 구현예에서, 디베이트 분자는 디베이트32 (서열번호 1), 디베이트32Ha (서열번호 2), 디베이트32Hb (서열번호 3), 디베이트32Hc (서열번호 4) 또는 디베이트32Hd (서열번호 5)의 적어도 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 32개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 이중 가닥 부분 또는 줄기를 갖는 헤어핀 분자, 및 헥사에틸렌글리콜 링커, 테트라데옥시티미딜레이트 링커 (T4), 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸 또는 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸인 루프일 수 있다. 보다 특정한 구현예에서, 이러한 디베이트 분자는 디베이트32 (서열번호 1), 디베이트32Ha (서열번호 2), 디베이트32Hb (서열번호 3), 디베이트32Hc (서열번호 4) 또는 디베이트32Hd (서열번호 5)의 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 32개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 이중 가닥 부분을 가질 수 있다.
디베이트 분자는 바람직하게는 2'-데옥시뉴클레오티드 백본을 포함하고, 선택적으로 하나 또는 몇몇의 (2, 3, 4, 5 또는 6) 변형된 뉴클레오티드 및/또는 아데닌, 시토신, 구아닌 및 티민 외의 뉴클레오염기를 포함한다. 따라서, 디베이트 분자는 본질적으로 DNA 구조물이다. 특히, 디베이트 분자의 이중 가닥 부분 또는 줄기는 데옥시리보뉴클레오티드로 이루어져 있다.
바람직한 디베이트 분자는, 특히 이들을 분해로부터 보호하기 위해 가닥의 하나 또는 각각의 말단에서 하나 또는 몇몇의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 또는 기를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 디베이트 분자의 유리 말단은 가닥의 하나 또는 각각의 말단에서 1, 2, 또는 3개의 변형된 포스포다이에스터 백본에 의해 보호된다. 바람직한 화학 기, 특히 변형된 포스포다이에스터 백본은 포스포로티오에이트를 포함한다. 대안적으로, 바람직한 디베이트는 3'- 3' 뉴클레오티드 연결, 또는 메틸포스포네이트 백본을 갖는 뉴클레오티드를 갖는다. 다른 변형된 백본이 당업계에 널리 공지되어 있고 포스포라미데이트, 모폴리노 핵산, 2'-0,4'-C 메틸렌/에틸렌 가교된 잠긴 핵산, 펩티드 핵산 (PNA), 및 단쇄 알킬, 또는 다양한 길이의 사이클로알킬 당 내(intersugar) 연결 또는 단쇄 이종원자 또는 이종환형 당 간(intrasugar) 연결, 또는 당업자에게 공지된 임의의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 제1의 바람직한 구현예에서, 디베이트 분자는 가닥의 하나 또는 각각의 말단에서 1, 2, 또는 3개의 변형된 포스포다이에스터 백본에 의해, 보다 바람직하게는 적어도 3' 말단에서 그러나 보다 더 바람직하게는 5' 및 3' 말단 모두에서 3개의 변형된 포스포다이에스터 백본 (특히 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트)에 의해 보호된 유리 말단을 갖는다.
가장 바람직한 구현예에서, 디베이트 분자는 32 bp의(예컨대, 서열번호 1 내지 5, 특히 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 가짐) DNA 이중 가닥 부분 또는 줄기를 포함하는 헤어핀 핵산 분자 및 헥사에틸렌글리콜, 테트라데옥시티미딜레이트 (T4), 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸 및 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 포함하거나 이로 이루어진 DNA 이중 가닥 부분의 2개의 가닥 또는 줄기를 연결하는 루프, 3개의 변형된 포스포다이에스터 백본(특히 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연결)을 갖는 DNA 이중 가닥 부분의 유리 말단 또는 줄기 (즉 루프의 반대편에서)이다.
상기 핵산 분자는 화학적 합성, 반-생합성 또는 생합성, 임의의 증폭 방법에 의해 제조되며 임의의 추출 및 제조 방법 및 임의의 화학적 변형이 뒤따른다. 링커는 표준 핵산 화학 합성에 의해 혼입될 수 있도록 제공된다. 보다 바람직하게는, 핵산 분자는 특이적으로 설계된 변형 합성에 의해 제조된다: 2개의 상보적인 가닥이 적절한 링커 전구체의 혼입과 함께 표준 핵산 화학 합성에 의해 제조되고, 이의 정제 후에, 이들은 서로 공유적으로 결합된다.
선택적으로, 핵산 분자는 엔도시토시스 또는 세포 흡수를 촉진하는 분자에 접합될 수 있다.
특히, 엔도시토시스 또는 세포 흡수를 촉진하는 분자는 친유성 분자 예컨대 콜레스테롤, 단일 또는 이중 쇄 지방산, 또는 세포 수용체가 수용체 매개된 엔도시토시스를 가능케 하도록 표적화 하는 리간드, 예컨대 폴산 및 폴레이트 유도체 또는 또는 트랜스페린 (Goldstein et al. Ann. Rev. Cell Biol. 1985 1:1-39; Leamon & Lowe, Proc Natl Acad Sci USA. 1991, 88: 5572-5576.)일 수 있다. 분자는 또한 토코페롤, 당 예컨대 갈락토스 및 만노스 및 이의 올리고사카라이드, 펩티드 예컨대 RGD 및 봄베신 및 단백질 예컨대 인테그린일 수 있다. 지방산은 포화되거나 불포화될 수 있고 올레산 또는 스테아르산과 같이 C4 내지 C28, 바람직하게는 C14 내지 C22, 보다 더 바람직하게는 C18일 수 있다. 특히, 지방산은 옥타데실 또는 디올레오일 수 있다. 지방산은 적절한 링커 예컨대 글리세롤, 포스파티딜콜린 또는 에탄올아민 등과 연결되거나 디베이트 분자 상에 부착되기 위해 사용된 링커에 의해 함께 연결된 이중쇄 형태로서 발견될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴레이트"는 프테로산 유도체 및 유사체를 포함하여 폴레이트 및 폴레이트 유도체를 지칭하기 위해 의도된다. 본 발명에 사용하기에 적절한 폴산 유사체 및 유도체는 비제한적으로 안티폴레이트, 다이히드로폴레이트, 테트라히드로폴레이트, 폴린산, 프테로폴리글루탐산, 1-데자, 3-데아자, 5-데아자, 8-데아자, 10-데아자, 1,5-데아자, 5,10 다이데아자, 8,10-다이데아자, 및 5,8-다이데아자 폴레이트, 안티폴레이트, 및 프테로산 유도체를 포함한다. 추가의 폴레이트 유사체가 US2004/242582에 기술되어 있다. 따라서, 엔도시토시스를 촉진하는 분자는 단일 또는 이중 쇄 지방산, 폴레이트 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는, 엔도시토시스를 촉진하는 분자는 디올레오일, 옥타데실, 폴산, 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 구현예에서, 핵산 분자는 콜레스테롤에 접합된다.
엔도시토시스를 촉진하는 분자는 바람직하게는 링커를 통해 디베이트 분자에 접합된다. 당업계에 공지된 임의의 링커가 엔도시토시스를 촉진하는 분자를 디베이트 분자에 공유적으로 부착시키기 위해 사용될 수 있다. 예컨대 WO09/126933은 38 내지 45 페이지에서 편리한 링커에 대한 광범위한 검토를 제공한다. 링커는 비제한적으로 지방족 쇄, 폴리에터, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질, 폴리히드로카본, 또는 다른 중합체성 화합물 (예컨대 올리고에틸렌 글리콜 예컨대 2 내지 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 바람직하게는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 에틸렌 글리콜 단위, 보다 더 바람직하게는 6개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 것들)일 수 있고, 화학적 또는 효소적 방법에 의해 분해될 수 있는 임의의 결합, 예컨대 다이설파이드 결합, 보호된 다이설파이드 결합, 산 불안정한 결합 (예컨대 히드라존 결합), 에스터 결합, 오르토 에스터 결합, 포스폰아미드 결합, 생물분해가능한 펩티드 결합, 아조 결합 또는 알데히드 결합을 포함한다. 이러한 분해가능한 링커가 WO2007/040469의 12 내지 14 페이지, WO2008/022309의 22 내지 28 페이지에 상세하게 있다.
특정 구현예에서, 핵산 분자는 엔도시토시스를 촉진하는 하나의 분자에 연결될 수 있다. 대안적으로, 엔도시토시스를 촉진하는 몇몇 분자 (예컨대 2, 3, 또는 4개)는 하나의 핵산 분자에 부착될 수 있다.
특정 구현예에서, 엔도시토시스를 촉진하는 분자 사이의 링커, 특히 콜레스테롤, 및 핵산 분자는 CO-NH-(CH2-CH2-O)n이고, 상기 식에서 n은 1 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 n은 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 매우 특정한 구현예에서, 링커는 CO-NH-(CH2-CH2-O)4 (카복사미도 테트라에틸렌 글리콜)이다. 또 다른 매우 특정한 구현예에서, 링커는 CO-NH-(CH2-CH2-O)3 (카복사미도 트리에틸렌 글리콜)이다. 링커는 핵산 분자의 활성을 변형시키지 않는 임의의 편리한 위치에서 핵산 분자에 연결될 수 있다. 특히, 링커는 5' 말단, 3' 말단 또는 핵산 분자가 헤어핀인 경우 루프에서 연결될 수 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 고려되는 접합된 디베이트 분자는 헤어핀 구조를 갖는 디베이트 분자이고 이의 5' 말단에서 바람직하게는 링커를 통해 엔도시토시스를 촉진하는 분자에 접합된다.
또 다른 특정한 구현예에서, 엔도시토시스를 촉진하는 분자 사이의 링커, 특히 콜레스테롤, 및 핵산 분자는 다이알킬-다이설파이드 {예컨대, (CH2)r-S-S-(CH2)s r 및 s는 1 내지 10, 바람직하게는 3 내지 8의 정수 예컨대 6임}이다.
가장 바람직한 구현예에서, 접합된 디베이트 분자는 32 bp(예컨대, 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 특히 서열번호 4를 가짐)의 DNA 이중 가닥 부분 또는 줄기를 포함하는 헤어핀 핵산 분자 및 헥사에틸렌글리콜, 테트라데옥시티미딜레이트 (T4), 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸 및 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 포함하거나 이로 이루어진 DNA 이중 가닥 부분의 2개의 가닥 또는 줄기를 연결하는 루프, 3개의 변형된 포스포다이에스터 백본 (특히 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연결)을 갖는 DNA 이중 가닥 부분의 유리 말단 또는 줄기 (즉 루프의 반대편에서)이며, 상기 디베이트 분자는, 바람직하게는 링커 (예컨대 카복사미도 올리고에틸렌 글리콜, 바람직하게는 카복사미도 트리에틸렌 글리콜 또는 카복사미도 테트라에틸렌 글리콜)를 통해 이의 5' 말단에서 콜레스테롤에 접합된다.
바람직한 구현예에서, NNNN-(N)n-N은 디베이트32 (서열번호 1), 디베이트32Ha (서열번호 2), 디베이트32Hb (서열번호 3), 디베이트32Hc (서열번호 4) 또는 디베이트32Hd (서열번호 5)의 적어도 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 32개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나 디베이트32 (서열번호 1), 디베이트32Ha (서열번호 2), 디베이트32Hb (서열번호 3), 디베이트32Hc (서열번호 4) 또는 디베이트32Hd (서열번호 5)의 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 32개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진다. 특정 구현예에서, NNNN-(N)n-N은 디베이트32 (서열번호 1), 디베이트32Ha (서열번호 2), 디베이트32Hb (서열번호 3), 디베이트32Hc (서열번호 4) 또는 디베이트32Hd (서열번호 5), 보다 바람직하게는 디베이트32Hc (서열번호 4)를 포함하거나 이로 이루어져 있다.
따라서, 접합된 디베이트 분자 또는 헤어핀 핵산 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
서열번호 1인 NNNN-(N)n-N을 갖는
Figure 112018018789208-pct00024
Figure 112018018789208-pct00025
Figure 112018018789208-pct00026
서열번호 2인 NNNN-(N)n-N을 갖는
Figure 112018018789208-pct00027
Figure 112018018789208-pct00028
Figure 112018018789208-pct00029
서열번호 3인 NNNN-(N)n-N을 갖는
Figure 112018018789208-pct00030
Figure 112018018789208-pct00031
Figure 112018018789208-pct00032
서열번호 4인 NNNN-(N)n-N을 갖는
Figure 112018018789208-pct00033
Figure 112018018789208-pct00034
Figure 112018018789208-pct00035
서열번호 5인 NNNN-(N)n-N을 갖는
Figure 112018018789208-pct00036
Figure 112018018789208-pct00037
및,
Figure 112018018789208-pct00038
상기 식에서, L, L', C, p 및 m에 대해 화학식 (I), (II) 및 (III)과 동일한 정의를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 화학식 (Ia), (IIa), (IIIa), (Ib), (IIb), (IIIb), (Ic), (IIc), (IIIc), (Id), (IId), (IIId), (Ie), (IIe) 및 (IIIe)의 분자, 바람직하게는 화학식 (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) 및 (IIe)의 분자는 하나 또는 몇몇의 다음의 특징을 갖는다:
- 밑줄친 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 백본, 보다 바람직하게는 포스포로티오에이트 백본을 갖거나 갖지 않는 뉴클레오티드를 나타내고, 바람직하게는, 밑줄친 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 백본, 보다 바람직하게는 포스포로티오에이트 백본을 갖거나 갖지 않는 뉴클레오티드를 나타내고/내거나,
- 연결된 L'는 헥사에틸렌글리콜, 테트라데옥시티미딜레이트 (T4), 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸 및 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나,
- m은 1이고 L은 카복사미도 폴리에틸렌 글리콜이고, 보다 바람직하게는 카복사미도 트리에틸렌 글리콜 또는 카복사미도 테트라에틸렌 글리콜이고/이거나,
- p는 1이고/이거나,
- C는 콜레스테롤, 단일 또는 이중 쇄 지방산 예컨대 옥타데실, 올레산, 디올레오일 또는 스테아르산, 또는 세포 수용체 예컨대 폴산, 토코페롤, 당 예컨대 갈락토스 및 만노스 및 이의 올리고사카라이드, 펩티드 예컨대 RGD 및 봄베신, 및 단백질 예컨대 트랜스퍼링 및 인테그린를 표적화하는 리간드 (펩티드, 단백질, 앱타머를 포함함)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 콜레스테롤이다.
바람직하게는, C-Lm은 트리에틸렌글리콜 링커 (10-O-[1-프로필-3-N-카바모일콜레스테릴]-트리에틸렌글리콜 라디칼이다. 대안적으로, C-Lm은 테트라에틸렌글리콜 링커 (10-O-[1-프로필-3-N-카바모일콜레스테릴]-테트라에틸렌글리콜 라디칼이다.
화학식 (I), (II), (II'), (III), (Ia), (IIa), (IIIa), (Ib), (IIb), (IIIb), (Ic), (IIc), (IIIc), (Id), (IId), (IIId), (Ie), (IIe) 및 (IIIe), 바람직하게는 화학식 (II), (II'), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) 및 (IIe)의 디베이트 분자 또는 헤어핀 핵산 분자의 특정한 구현예에서, L'는 바람직하게는 헥사에틸렌글리콜, 테트라데옥시티미딜레이트 (T4), 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸 및 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
화학식 (I), (II), (II'), (III), (Ia), (IIa), (IIIa), (Ib), (IIb), (IIIb), (Ic), (IIc), (IIIc), (Id), (IId), (IIId), (Ie), (IIe) 및 (IIIe), 바람직하게는 화학식 (II), (II'), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) 및 (IIe)의 디베이트 분자 또는 헤어핀 핵산 분자의 특정한 구현예에서, C는 콜레스테롤이고, C-Lm은 라디칼
Figure 112018018789208-pct00039
이다.
바람직한 구현예에서, 접합된 디베이트 분자 또는 헤어핀 핵산 분자는 (II), (II'), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), 및 (IIe)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 식에서, C-Lm은 라디칼
Figure 112018018789208-pct00040
이고,
상기 식에서 L'은 바람직하게는 헥사에틸렌글리콜, 테트라데옥시티미딜레이트 (T4), 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸 및 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸, 보다 바람직하게는 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
매우 특정한 구현예에서, 디베이트 분자 또는 헤어핀 핵산 분자는 다음의 화학식을 갖는다:
Figure 112018018789208-pct00041
상기 식에서, C-Lm은 라디칼
Figure 112018018789208-pct00042
이다.
상기 식에서 L'은 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸이고, 상기 식에서 밑줄친 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 백본을 갖는다. 따라서, 상기 분자는 다음의 구조를 가지며 이는 실시예 부분에서 "코디베이트"로 지칭된다.
Figure 112018018789208-pct00043
서열번호 21.
화학식 (I), (II), (II'), (III), (Ia), (IIa), (IIIa), (Ib), (IIb), (IIIb), (Ic), (IIc), (IIIc), (Id), (IId), (IIId), (Ie), (IIe) 및 (IIIe), 바람직하게는 화학식 (II), (II'), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) 및 (IIe)의 디베이트 분자 또는 헤어핀 핵산 분자의 특정한 구현예에서, C는 콜레스테롤이고, C-Lm은 테트라에틸렌글리콜 링커 (10-O-[1-프로필-3-N-카바모일콜레스테릴]-테트라에틸렌글리콜 라디칼이다.
바람직한 구현예에서, 접합된 디베이트 분자 또는 헤어핀 핵산 분자는 (II), (II'), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), 및 (IIe)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 식에서 C-Lm은 테트라에틸렌글리콜 링커 (10-O-[1-프로필-3-N-카바모일콜레스테릴]-테트라에틸렌글리콜 라디칼이고, 상기 식에서 L'는 바람직하게는 헥사에틸렌글리콜, 테트라데옥시티미딜레이트 (T4), 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸 및 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸이다.
매우 특정한 구현예에서, 디베이트 분자 또는 헤어핀 핵산 분자 (AsiDNA 또는 DT01)는 다음의 화학식을 갖는다:
Figure 112018018789208-pct00044
상기 식에서, C-Lm은 테트라에틸렌글리콜 링커 (10-O-[1-프로필-3-N-카바모일콜레스테릴]-테트라에틸렌글리콜 라디칼이고, L'는 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸이다.
Figure 112018018789208-pct00045
또 다른 바람직한 구현예에서, 핵산 분자는 다음의 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure 112018018789208-pct00046
상기 식에서, N은 데옥시뉴클레오티드이고, n은 1 내지 15의 정수이고, 밑줄친 N은 변형된 포스포다이에스터 백본을 갖거나 갖지 않는 뉴클레오티드를 나타내고, L'는 링커이고, C는 콜레스테롤이고, L은 링커이고, m은 0 또는 1의 정수이고, p는 1이다. 바람직하게는, 밑줄친 N은 변형된 포스포다이에스터 백본을 갖는 뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 핵산 분자는 화학식 (II)이다.
따라서, 본 발명은 또한 전술된 바와 같은 디베이트 분자 또는 핵산 분자의 용도, 이것 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물로서 하기 상세한 사항과 같이, PARP 억제제와 병용하고, 방사선 요법 및/또는 방사선 동위원소 요법 및/또는 항종양 요법을 포함하거나 포함하지 않고, 바람직하게는 DNA 손상 항종양제를 포함하는 암 치료에 사용하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
추가의 병용
선택적으로, 본원에 개시된 핵산 분자 및 PARP 억제제를 사용하는 치료는 방사선 요법, 방사선 동위원소 요법 및/또는 또 다른 항종양 화학 요법, 면역 요법, 또는 호르몬 요법과 병용하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항종양 화학 요법은 직접 또는 간접적으로 DNA 손상 항종양제에 의한 치료이다.
본원에 사용된 용어 "항종양 화학 요법" 또는 "화학 요법"은 화학적 또는 생물화학적 물질을 사용하는, 특히 하나 또는 몇몇의 항신생물제를 사용하는 암 치료적 처치를 지칭한다. 특히, 이는 또한 호르몬 요법 및 면역 요법을 포함한다. 용어 "호르몬 요법"은 호르몬을 차단, 추가 또는 제거하기 위한 목적을 갖는 암 치료를 지칭한다. 예컨대, 유방암에서, 여성 호르몬인 에스트로겐 및 프로게스테론은 일부 유방암 세포의 성장을 촉진시킬 수 있다. 따라서 이러한 환자에서, 호르몬 요법은 에스트로겐 차단을 위해 주어지며, 통상적으로 사용되는 약물의 비제한적인 목록은 다음을 포함한다: 타목시펜, 파레스톤, 아리미덱스, 아로마신, 페마라, 졸라덱스/루프론, 메가세, 및 할로스테인. 용어 "면역 요법"은 암을 거부하기 위한 면역 체계를 사용하는 암 치료적 처치를 지칭한다. 상기 치료적 처치는 환자의 면역 체계를 자극하여 악성 종양 세포를 공격한다.
특정 양태에서, 본원에 기술된 핵산 분자 및 PARP 억제제는 DNA 손상 치료와 병용하여 사용된다. DNA 손상 치료는 방사선 요법, 또는 DNA 손상 항종양제와 함께인 화학 요법, 또는 이들의 조합일 수 있다. DNA 손상 치료는 바람직하게는 상대적으로 특이적으로 암 세포에서의 DNA 가닥 분해를 유도하는 치료를 지칭한다.
DNA 가닥 분해는 이온화된 방사선 (방사선 요법)에 의해 달성될 수 있다. 방사선 요법은 비제한적으로 γ-선, X-선, 및/또는 방사선 동위원소의 종양 세포로의 직접적인 전달을 포함한다. 다른 방사선 요법은 마이크로파 및 UV 조사를 포함한다. 방사선 요법에 대한 다른 접근법이 또한 본 발명에서 고려된다.
DNA 가닥 분해는 방사선 동위원소 요법에 의해, 특히 방사선 동위원소의 투여에 의해, 바람직하게는 표적화된 방사선 동위원소에 의해 달성될 수 있다. 표적화는 방사성 요오드와 같은 동위원소의 화학적 성질에 의한 것일 수 있으며 이는 다른 장기보다 천배나 더 갑상선 샘에 의해 특이적으로 흡수된다. 대안적으로, 표적화는 방사선 동위원소에 합텐 또는 항체와 같은 표적 특성을 갖는 또 다른 분자를 부착시킴으로써 달성될 수 있다. 임의의 다수의 적절한 방사성 동위원소가 사용될 수 있으며, 비제한적으로 인듐-111, 루테튬-171, 비스무스-212, 비스무스-213, 아스타틴-211, 구리-62, 구리-64, 구리-67, 이트리움-90, 요오딘-125, 요오딘-131, 인-32, 인-33, 스칸듐-47, 은-111, 갈륨-67, 프라세오디뮴-142, 사마륨-153, 터븀-161, 디스프로슘-166, 홀뮴-166, 레늄-186, 레늄-188, 레늄-189, 납-212, 라듐-223, 악티늄-225, 철-59, 셀레늄-75, 아르세닉-77, 스트론튬-89, 몰리브데눔-99, 로듐-105, 팔라듐-109, 프라세오디뮴-143, 프로메튬-149, 에르븀-169, 이리듐-194, 금-198, 금-199, 및 납-211을 포함한다.
손상된 DNA 항종양제는 바람직하게는 토포이소머라제 I 또는 II, DNA 가교결합제, DNA 알킬화제, 항-대사제 및 유사분열 스핀들 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
토포이소머라제 억제제 I 및/또는 II는 비제한적으로 에토포시드, 토포테칸, 캄프토테신, 이리노테칸, 암사크린, 인토플리신, 안트라사이클린 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 이단루비신 및 미톡산트론을 포함한다. 토포이소머라제 억제제 I 및 II는 비제한적으로 인토플레신을 포함한다.
DNA 가교결합제는 비제한적으로 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴을 포함한다.
항-대사제는 핵산 합성을 담당하는 효소를 차단하거나 DNA에 통합되어 부정확한 유전자 암호를 생성하고 세포 사멸을 유도한다. 이의 비제한적인 예는, 제한 없이 폴산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 디아미나제 억제제, 및 보다 특히 메토트렉세이트, 플록스우리딘, 시타라빈, 6-머캅토퓨린, 6- 티오구아닌, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴, 5-플루오로우라실, 겜티타빈 및 카페시타빈을 포함한다.
DNA 손상 항종양제는 비제한적으로 니트로겐 머스터드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아, 금속 염 및 트리아젠을 포함하여 알킬화제일 수 있다. 이의 비제한적인 예는 우라실 머스터드, 클로메틴, 사이클로포스파미드 (CYTOXAN(R)), 이포스포아미드, 멜팔란, 클로람부실, 피포브로만, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오프스포르아민, 부설판, 카머스틴, 로머스틴, 포테머스틴, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 티오테파, 스트렙토조신, 다카르바진, 및 테모졸로미드를 포함한다.
유사분열 스핀들 억제제는 비제한적으로 파클리탁셀, 도세탁셀, 비노렐빈, 라로탁셀 (XRP9881로도 지칭됨; Sanofi-Aventis), XRP6258 (Sanofi-Aventis), BMS-184476 (Bristol-Meyer-Squibb), BMS-188797 (Bristol-Meyer-Squibb), BMS-275183 (Bristol-Meyer-Squibb), 오르타탁셀 (IDN 5109, BAY 59-8862 또는 SB-T-101131로도 지칭됨 ; Bristol-Meyer-Squibb), RPR 109881A (Bristol-Meyer-Squibb), RPR 116258 (Bristol-Meyer-Squibb), NBT-287 (TAPESTRY), PG-파클리탁셀 (CT-2103, PPX, 파클리탁셀 폴리글루멕스, 파클리탁셀 폴리글루타메이트 또는 XyotaxTM로도 지칭됨), ABRAXANE® (Nab-파클리탁셀로도 지칭됨 ; ABRAXIS BIOSCIENCE), 테세탁셀 (DJ-927로도 지칭됨), IDN 5390 (INDENA), 탁소프렉신 (도코사헥사논산-파클리탁셀로도 지칭됨; PROTARGA), DHA-파클리탁셀 (탁소프렉신®으로도 지칭됨), 및 MAC-321 (WYETH)을 포함한다. 또한 Hennenfent & Govindan (2006, Annals of Oncology, 17, 735-749)의 검토를 참조한다.
치료되는 암 또는 종양
용어 "암", "암성", 또는 "악성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로하는 포유류의 생리학적 상태를 지칭하거나 설명한다. 예시적인 암은 예컨대 백혈병, 림프종, 아세포종, 암종 및 육종을 포함한다.
보다 특정한 이러한 암의 예는 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 필라델피아 염색체 양성 급성 림프아구성 백혈병 (Ph+ ALL), 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경교종, 위장암, 망막암, 난소암, 간암, 대장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 신경아세포종, 췌장암, 교모세포종 다형성, 자궁경부암, 위암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 및 두경부 암, 위암, 생식 세포 종양, 소아 육종, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병, 비만세포증 및 비만세포증과 관련된 임의의 증상을 포함한다.
"백혈병"은 혈액 형성 기관의 진행성이고 악성인 질환을 지칭하며, 혈액 및 골수에서 백혈구 및 이의 전구체의 왜곡된 증식 및 발생을 일반적으로 특징으로 한다. 일반적으로 백혈병은 다음 (1) 내지 (3)에 따라 임상적으로 분류된다: (1) 급성 또는 만성 질병의 지속기간 및 특징; (2) 관여하는 세포의 유형; 골수성 (골수기원의), 림프성 (림프성의), 또는 단핵구; 및 (3) 백혈병성 또는 비백혈병 (아백혈병성) 혈액에서 비정상 세포의 수의 증가 또는 비증가. 백혈병은 예컨대, 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 성체 T-세포 백혈병, 무백혈병성 백혈병, 백혈구병성 백혈병, 호염기성 백혈병, 아세포성 백혈병, 소 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 피부 백혈병, 배아 백혈병, 호산구성 백혈병, 그로스 백혈병, 모양-세포성 백혈병, 조혈세포성 백혈병, 혈구아세포성 백혈병, 조직구성 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 급성 단구성 백혈병, 백혈구 감소성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프아구성 백혈병, 림프모구 백혈병, 림프성의 백혈병, 림프성 백혈병, 림프구육종 세포 백혈병, 비만 세포 백혈병, 거대핵세포 백혈병, 미세골수아구성 백혈병, 단핵구 백혈병, 골수단구성 백혈병, 골수구성 백혈병, 골수성 과립구성 백혈병, 골수단핵구 백혈병, 네겔리 백혈병, 혈장 세포 백혈병, 형질구성 백혈병, 전골수성 백혈병, 리이더 세포 백혈병, 실링 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 아백혈병성 백혈병, 및 미분화 세포 백혈병을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명은 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 및/또는 필라델피아 염색체 양성 급성 림프아구성 백혈병 (Ph+ ALL)의 치료를 제공한다.
다양한 암이 또한 본 발명의 범주에 포함되며, 비제한적으로 다음의 암을 포함한다: 방광암 (가속화된 및 전이성 방광암 포함), 유방암, 결장암 (결장직장암 포함), 신장암, 간암, 폐암 (소세포 폐암 및 비소세포 폐암 및 폐 아데노암종 포함), 난소암, 전립선암, 고환암, 비뇨생식관암, 림프계암, 직장암, 후두암, 췌장암 (외분비성 췌장 암종 포함), 식도암, 위암, 담낭암, 자궁경부암, 갑상선암, 및 피부암 (편평 세포 암종 포함)을 포함하는 암종; 림프계의 조혈 종양 예컨대 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모양 세포 림프종, 조직구성 림프종, 및 버킷 림프종; 골수계의 조혈성 종양 예컨대 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병, 및 전골수성 백혈병; 중주신경계 및 말초신경계 종양 예컨대 성상세포종, 신경아세포종, 신경교종, 및 신경초종; 간엽 기원 종양 예컨대 섬유육종, 횡문근육종, 및 골육종; 기타 종양 예컨대 흑색종, 색소피부건조증, 각질극세포종, 정상피종, 갑상선 소포암, 및 기형암종; 흑색종, 절제불가능 단계 III 또는 IV 악성 흑색종, 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경교종, 위장암, 망막암, 난소암, 간암, 대장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 신경아세포종, 췌장암, 교모세포종 다형성, 자궁경부암, 위암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 및 두경부 암, 망막아세포종, 위암, 생식 세포 종양, 골암, 골 종양, 골의 성인 악성 섬유성 조직구종; 골의 소아 악성 섬유성 조직구종, 육종, 소아 육종; 골수형성이상 증후군; 신경아세포종; 고환 생식 세포 종양, 안구내 흑색종, 골수형성이상 증후군; 골수형성이상/골수증식성 질환, 활액 육종.
본 발명의 바람직한 구현예에, 암은 고형 종양이다. 예컨대, 암은 육종 및 골육종 예컨대 카포시 육종, AIDS-관련 카포시 육종, 흑색종, 특히 맥락막 흑색종, 및 두경부암, 신장암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 폐암, 식도암, 유방암, 방광암, 대장암, 간 및 쓸개관암, 자궁암, 충수암, 및 자궁경부암, 고환암, 위장암 및 자궁내막암 및 복막암일 수 있고 바람직하게는, 암은 육종, 흑색종, 특히 맥락막 흑색종, 및 두경부암, 신장암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 폐암, 식도암, 유방암, 방광암, 대장암, 간암, 자궁경부암, 및 자궁내막암 및 복막암일 수 있다.
본 발명에 기술된 약학 조성물 및 제품, 키트 또는 병용된 제제는 고형 종양의 성장 억제, 종양 부피 감소, 종양의 전이성 전이 예방 및 미소전이의 성장 또는 발달 예방에 유용할 수 있다. 본 발명에 기술된 약학 조성물 및 제품, 키트 또는 병용된 제제는 특히 예후가 불량한 환자 또는 방사선 또는 화학 요법 내성 종양의 치료에 적절하다.
특정 구현예에서, 암은 고등급 암 또는 진행암이거나 전이암이다.
또 다른 특정한 구현예에서, 암은 상동성 재조합 수선에 대해 결핍되거나 손상되지 않는다 (예컨대 BRCA 돌연변이되거나 BRCAness가 아님).
처방, 투여량 및 투여 경로
본 발명의 병용된 제제에 사용된 각각의 병용 파트너의 유효 투여량은 사용된 특정 화합물 또는 약학 조성물, 투여 방식, 치료되는 질환, 치료되는 질환의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 발명의 병용된 제제의 투여량 처방은 투여 경로 및 환자의 상태를 포함하여 다양한 인자에 따라 선택된다. 통상의 숙련된 의사, 임상의 또는 수의사는 질환의 진행을 예방, 대항 또는 막기 위해 필요한 단일 활성 성분의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 독성 없이 효능을 나타내는 범위 이내의 활성 성분의 농도를 달성하는데 있어 최적의 정밀도는 표적 부위에 대한 활성 성분의 능력의 동력학에 기초한 처방을 필요로 한다.
본 발명은 보다 특히, PARP 억제제의 양 또는 투여량이 단독으로 사용될 때의 양 또는 투여량에 비해 감소될 수 있는 약학 조성물, 키트, 제품 또는 병용된 제제에 관한 것이다. 실제로, 디베이트 분자와 PARP 억제제의 병용은 적어도 부가 효과를 야기하지만, 두 활성 성분의 명확한 상승 효과를 유도한다. 이러한 증강 효과는 일반적으로 정상 세포에 대한 독성을 나타내므로 부작용과 관련될 수 있는 PARP 억제제의 양을 감소시킬 수 있다. 디베이트 분자는 유리하게는 최소한의 독성을 나타내며 심지어는 독성을 나타내지 않는다. 이이서, 본 발명의 병용 치료에 의해, 부작용, 특히 PARP 억제제의 부작용을 감소시키면서 치료 효능을 보존하거나 심지어는 개선할 수 있다.
대안적으로, PARP 억제제의 양 또는 투여량을 낮추는 대신에, PARP 억제제의 투여 빈도 또는 이의 기간 또는 치료 기간을 단축시킬 수 있다.
구현예에 따르면, 본 발명은 전술된 암 치료 방법, 약학 조성물, 제품, 키트 또는 병용된 제제에 관한 것이며, 여기서, 병용된 제제 중의 본원에 개시된 핵산 분자 및 PARP 억제제의 양은 2개의 활성 성분의 병용된 치료 효과가 부가적으로 또는 바람직하게는 상승적이도록 한다.
용어 "상승적" 치료 효과는 병용의 수득된 치료 효과가 각각의 파트너 단독의 치료 효과의 부가보다 많은 것을 의미한다 (즉, 본원에 개시된 핵산 분자의 효과와 PARP 억제제 단독의 효과를 더한 것을 초과함).
용어 "부가적인" 치료 효과는 병용의 수득된 치료 효과가 각각의 파트너 단독의 치료 효과의 부가인 것을 의미한다 (즉, 본원에 개시된 핵산 분자의 효과와 PARP 억제제 단독의 효과를 더한 것과 동일함).
본 발명은 전술된 암의 치료 방법, 약학 조성물, 제품, 키트 또는 병용된 제제에 관한 것이며, 여기서 PARP 억제제는 단독 사용시 동일한 적응증 및 동일한 투여 경로에 대해 화학 요법에서 사용되는 통상적인 투여량보다 더 낮은 투여량으로 사용되며 (즉, 통상적인 화학 요법에서 사용된 것과 동일하거나 또는 바람직하게는 보다 낮은 양), 또한 본원에서 치료량 이하로 지칭된다. 보다 특히, 상기 양은 예컨대 통상적인 치료적 투여량의 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 %일 수 있다 (특히 동일한 적응증 및 동일한 투여 경로의 경우). 통상적인 치료적 투여량은 약물 승인 기관 (예컨대, FDA 또는 EMEA)이 인정한 양이다. 이러한 관점에서, 본 발명은 전술된 암 치료 방법, 약학 조성물, 제품, 키트 또는 병용된 제제에 관한 것이며, 여기서, PARP 억제제의 양은 치료적 투여량 이하로 사용되고 본원에 개시된 핵산 분자의 양은 2개의 활성 성분의 병용된 치료 효과가 부가적인 또는 보다 바람직하게는 상승적인 양이다.
본 발명은 (a) 본원에 개시된 핵산 분자와 (b) PARP 억제제의 병용된 제제의 상승적 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 암 치료에서, 동시, 분리 또는 순차적 사용을 위한 상승적 비율의 (a) 본원에 개시된 핵산 분자와 (b) PARP 억제제를 포함하는 상승적 병용에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 분자는 앞서 정의된 바와 같은 DT01이고, PARP 억제제는 AZD2281 (올라파립), ABT888 (벨리파립), BMN673, BSI-21 (이니파립), AZD 2461, MK-4827 (니라파립), 및 AG 014699 (루카파립)으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 보다 바람직하게는 AZD2281 (올라파립) 또는 BT888 (벨리파립이다.)
용어 "상승적 치료학적 유효량" 또는 "상승적 비율"은 병용의 치료 효과가 각각의 파트너 단독의 치료 효과의 부가를 초과하는 것을 의미한다 (즉, 본원에 개시된 핵산 분자 단독의 치료 효과와 PARP 억제제 단독의 치료 효과를 더한 것보다 큼).
본 발명은 또한 본 발명의 병용의 암 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체에 대해 공동으로 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상승적 병용은 PARP 억제제가 치료량 이하의 양으로 사용되거나 투여되도록 한다. 특히, PARP 억제제의 치료량 이하는 암을 단일 약물로서 치료하기 위해 사용되는 통상적인 투여량보다 적다 (즉, 다른 약물과 병용하지 않음). 보다 특히, 치료량 이하는 예컨대 동일한 적응증 및 동일한 투여 경로에 대해 통상적인 치료적 투여량의 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 %일 수 있다. 통상적인 치료적 투여량은 약물 승인 기관 (예컨대, FDA 또는 EMEA)이 인정한 양이며, 참조 문헌에서 확인할 수 있다.
하나 이상의 성분들 사이의 부가적 또는 상승적 상호작용을 결정할 때, 효과에 대한 최적의 범위 및 효과에 대한 각각의 성분의 절대 투여량은 상이한 w/w 비율 범위에 대한 성분의 투여 및 치료를 필요로 하는 환자에 대한 투여량에 의해 명확하게 측정될 수 있다. 인간의 경우, 환자에 대한 임상 연구를 수행하는 복잡성과 비용은 상승작용을 위한 1차 모델로서 이러한 형태의 시험의 사용을 비실용적으로 할 수 있다. 그러나, 하나의 종에서 상승작용의 관찰은 다른 종에서의 효과를 예측할 수 있고, 상승적 효과를 측정하기 위한 동물 모델이 존재하며, 이러한 연구 결과는 또한 유효 투여량 및 혈장 농도 비율 범위, 및 약물동력학적/약물동태학적 방법의 적용에 의해 다른 종에서 요구되는 절대 투여량 및 혈장 농도를 예측하는데 사용될 수 있다. 암 모델과 인간에서 나타나는 효과의 상관 관계는 동물 모델에서 관찰된 상승작용이 인간에 대한 상승작용을 또한 예측할 수 있음을 시사한다.
본 발명의 병용의 약리학적 활성은, 예컨대 임상 연구에서 또는 바람직하게는 시험 절차에서 입증될 수 있다. 적절한 임성 연구는, 예컨대 진행성 종양이 있는 환자의 공개 라벨 비-무작위, 용량 확대 연구이다. 이러한 연구는 본 발명의 병용의 활성 성분의 부가적 또는 상승작용을 입증할 수 있다. 증식성 질환에 대한 유익한 효과는 이러한 연구의 결과를 통해 직접적으로 또는 당업자에게 공지된 바와 같은 연구 설계의 변화에 의해 결정될 수 있다. 이러한 연구는, 특히 활성 성분 및 본 발명의 병용을 사용하는 단일 요법의 효과를 비교하는데 적절하다. 바람직하게는, 병용 파트너의 투여량은 (a) 고정된 투여량으로 투여되고 병용 파트너는 (b) 최대 관용 투여량에 도달할 때까지 단계적으로 확대된다. 대안적으로, 병용 파트너는 (b) 고정된 투여량으로 투여되고 병용 파트너는 (a) 최대 관용 투여량에 도달할 때까지 단계적으로 확대된다.
본원에 개시된 핵산 분자에 대한 투여 경로는 경구, 비경구, 정맥 내, 종양 내, 피하, 두개 내, 동맥 내, 국소, 직장, 경피, 피 내, 비강, 근육 내, 복강 내, 골수 내 등일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 디베이트 분자는 치료되는 종양 부위 근처에 투여되거나 주사되어야 한다. 추가의 특정 구현예에서, 치료되는 암이 흑색종인 경우, 본원에 개시된 핵산 분자는 피하 및 정맥 내 주사에 의해 전달될 수 있다. 또 다른 바람직한 투여 경로는 종양 내 주입이다.
DNA 손상 항종양제가 본원에 개시된 핵산 분자 및 PARP 억제제와 병용하여 사용되는 경우, DNA 손상 항종양제, 본원에 개시된 핵산 분자 및 PARP 억제제는 동일한 경로 또는 별도의 경로에 의해 투여될 수 있다. DNA 손상 항종양제에 대한 투여 경로는 경구, 비경구, 정맥 내, 종양 내, 피하, 두개 내, 동맥 내, 국소, 직장, 경피, 피내, 비강, 근육 내, 골수 내 등일 수 있다.
본원에 개시된 핵산 분자는 조사 및/또는 DNA 손상 항종양제의 투여 전, 및/또는 이와 동시에 및/또는 이후에, 보다 바람직하게는 조사 및/또는 DNA 손상 항종양제의 투여 전 및/또는 이와 동시에 투여되어야 한다. 조사 및/또는 DNA 손상 항종양제의 투여는, 조사가 적용될 때 또는 DNA 손상 항종양제가 종양 세포에 도달할 때 본원에 개시된 핵산 분자가 종양 세포 내에 존재하도록 수행된다. 통상의 숙련된 의사, 임상의 또는 수의사는 활성 성분, 혈장에서 표적 부위에 대한 이용가능성에 대한 이의 동력학, 또는 이의 약물동력학적 프로파일에 기초하여 처방을 결정할 수 있다. 예비 결과는 디베이트 분자가 하루 동안 활성 성태를 유지함을 나타낸다.
방사선 요법 또는 DNA 손상 항종양제에 의한 치료가 시작되면, 본원에 개시된 핵산 분자로의 치료는 방사선 요법 또는 DNA 손상 항종양제에 의한 치료가 적용되거나 투여되어야 하는 한 계속될 수 있다. 대안적으로, 본원에 개시된 핵산 분자로의 치료는 또한 종료될 수 있다.
PARP 억제제와 병용되어 사용된 본원에 개시된 핵산 분자의 유효 투여량은 투여 방식, 치료되는 질환, 치료되는 질환의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 핵산 분자의 투여 요법은 투여 경로 및 환자의 상태를 포함하여 다양한 인자에 따라 선택된다. 통상의 숙련된 의사, 임상의 또는 수의사는 암을 예방, 대항 또는 막기 위해 필요한 본원에 개시된 핵산 분자의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
예컨대, 국소 투여에서 (예컨대, 종양 내 또는 피하 투여가 사용되는 경우), 디베이트 분자의 유효량은 종양 1 cm3 당 적어도 0.01 mg, 바람직하게는 종양 1 cm3 당 0.1 내지 40 mg, 가장 바람직하게는 종양 1 cm3 당 1 내지 20 mg이다. 유효량은 일일 치료 프로토콜로 투여될 수 있다 (예컨대, 3 내지 6주 연속 동안 주 당 5일, 또는 3 내지 6주 연속 동안 일주일에 3회). 대안적으로, 예컨대, 1 cm3의 종양 당 적어도 0.1 mg, 바람직하게는 1 cm3의 종양 당 0.1 내지 40 mg, 가장 바람직하게는 1 cm3의 종양 당 1 내지 20 mg의 유효량이 3 내지 6주 연속 동안 매주 치료 프로토콜로 투여될 수 있다. 다른 투여 경로가 사용되는 경우, 당업자는 1 cm3의 종양 당 적어도 0.01 mg, 바람직하게는 1 cm3의 종양 당 0.1 내지 40 mg, 가장 바람직하게는 1 cm3의 종양 당 1 내지 20 mg의 종양 중의 디베이트 분자의 유효량을, 특히 일일 치료 프로토콜로 또는 매주 치료 프로토콜로 수득하기 위한 양을 채택할 수 있다. 예컨대, 전신 투여의 경우, 디베이트 분자의 유효량 또는 단위 투여량은 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 4 내지 40 mg일 수 있다. 따라서, 전신 경로의 경우, 디베이트 분자의 유효량 또는 단위 투여량은 환자의 0.06 내지 0.6 mg/kg일 수 있다. 물론, 상기 투여량 및 처방은 화학 요법 및/또는 방사선 요법 처방을 고려하여 당업자에 의해 채택될 수 있다.
방사선 요법의 경우, 당업계에 공지된 임의의 방사선 요법 처방이 사용될 수 있으며, 특히 정위 조사 (예컨대 15 Gy) 또는 부분 방사선 조사가 사용될 수 있다. 부분 조사의 사용은, 예컨대 조사가 특히 효율적일 수 있으며, 매일 또는 매 2 내지 5일마다, 바람직하게는 매 3 내지 4일마다, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주의 기간 동안 적용될 수 있다. 조사는 1 내지 10 Gy, 바람직하게는 2 내지 5 Gy, 특히 2, 3, 4 또는 5 Gy일 수 있다. 예컨대, 6주 동안 15x2Gy의 부분 조사, 또는 2주 동안 4 내지 6x5Gy의 부분 조사가 고려될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 고려된 방사선 요법은 2주 동안 5 Gy의 4회 조사를 갖는 프로토콜이다. 조사 및 디베이트 분자를 사용하는 암의 병용 치료의 상이한 처방 또는 조건은 디베이트 분자에 의한 방사선 민감화가 조사 선량이 아니라 디베이트 분자의 투여량에 의존함을 시험하고 입증하도록 한다.
화학 요법에서, 본 발명의 병용된 제제, 키트 또는 제품에서 사용되거나 본 발명의 조성물과 조합된 DNA 손상 항종양제의 유효 투여량은 사용된 특정 DNA 항 종양제, 투여 방식, 치료되는 질환, 치료되는 질환의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 따라서, DNA 손상 항종양제의 투여 요법은 투여 경로 및 환자의 상태를 포함하여 다양한 인자에 따라 선택된다. 통상의 숙련된 의사, 임상의 또는 수의사는 암의 진행을 예방, 대항 또는 막기 위해 필요한 DNA 항종양제의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
상기 치료는 하나 또는 다수의 사이클, 예컨대 2 내지 10개 사이클, 특히 2, 3, 4, 또는 5개 사이클을 포함할 수 있다. 상기 사이클은 연속되거나 분리될 수 있다. 예컨대, 각각의 사이클은 1 내지 8주, 바람직하게는 3 내지 4주의 기간으로 분리된다.
본 발명의 추가의 양태 및 이점이 다음의 실시예에 기술될 것이며, 이는 제한이 아닌 설명으로서 간주되어야 한다.
실시예
실시예 1
세포 생존에 대한 시험관 내 시험
본 발명자들은 DT01과 올라파립 또는 벨리파립과의 병용이 세포 생존에 미치는 영향을 시험하였다. 보다 특히, 그 결과를 도 1에 나타냈다.
유방암 세포주 MDAMB231을 100 μg/ml (흑색, 네모) 또는 333 μg/ml (회색, 십자형)의 DT01을 사용하거나 DT01을 사용하지 않고(흑색, 다이아몬드형) 처리하고 0, 0.1 및 1 μM의 올라파립 (위쪽 패널) 또는 1, 10 및 50 μM의 벨리파립 (아래 패널)에 노출시켰다. 살아있는 세포를 검출하기 위해 트립판 블루를 사용하여 처리 후 6일 째에 생존을 측정하였다. 데이터를 비-처리한 대조군의 %로 표시하였다. DT01은 100 및 333 μg/ml에 노출된 후 88% 및 49% 생존을 나타내는 독립적 효과를 가졌다. PARP 억제제인 올라파립 또는 벨리파립을 첨가하면 세포 사멸이 현저하게 증가하였다 (실선). 병용 치료에 대한 생존은 단일 치료 둘 모두의 예상되는 부가 효과보다 떨어졌으며 (점선), 이는 DT01 및 PARP 억제제의 모든 시험된 투여량에서 상승 효과를 나타냈다.
이어서, PARP 억제제와 디베이트 분자의 병용은 단일 치료의 예상되는 부가 효과보다 더 높은 항종양 효과를 나타냈다. 이러한 초-부가도 (supra-additivity)는 각 약물의 모든 투여량에서 관찰되었다. 상기 초-부가도는 디베이트 패밀리와 모든 PARP 억제제의 병용을 사용하여 관찰되었다. 실제로, 올라파립은 PARP 억제제 유형 (ii)에 속하는 반면, 벨리파립은 유형 (ii)에 속한다. 이어서, 관찰된 상승적 효과는 억제 기작에 의존하지 않았다.
본 발명자들은 여러가지 상이한 세포주에 대한 병용 효과를 시험하였다. 그 결과를 도 2에 나타냈다.
0.1 μM 올라파립 (흑색), 100 μg/ml DT01 (회색) 또는 0.1 μM 올라파립+ 100 μg/ml DT01 (해치) 둘 모두의 치료에 노출된 세포의 생존을 상이한 종양 세포 (자궁경부암, 교모세포종, 혈액암, 유방암 유래) 및 2개의 비종양성 유방 세포에서 모니터링하였다. DNA 수리의 주요 돌연변이는 도면의 아래쪽 패널에 나타냈다.
수리 상 결함이 있는 경우 (BRCA-/-, 상동성 재조합 결함; DNA-PKcs-/-, 비상동성 말단 결합 결함) 모든 세포주에서 병용의 초-부가 효과가 관찰되었다. PARP 활성이 결핍된 세포(HelaPARP1KO)만이 PARP 억제제에 둔감하여 병용에 반응하지 않았다. Hela, MO59K, MO59J, Hut7, IM9, MD231, 및 BC173과 같은 올라파립에 내성이 있는 것으로 공지된 암세포주는 병용 치료의 초-부가 효과를 나타냈다. 비종양성 세포는 단일 및 병용 치료 둘 모두에 둔감했다.
재료 및 방법
인간 세포주를 10% 우태 혈청 (ATGC, 올리언스, 프랑스), 1% 소듐 피루베이트, 스트렙토마이신 (100　mg.mL-1) 및 페니실린 (100 mg.mL-1) (Invitrogen, 칼스배드, 캘리포니아, 미국)이 보충된 완전 RPMI (Gibco, 세르지 퐁투아즈, 프랑스)에서 성장시켰다. 세포를 100% 습도에서 5% CO2 대기 하에 37℃에서 유지시켰다. 혈청이 없는 배지에서 시간 0에서 뉴클레오티드 (DT01 및 다른 것들) 또는/및 PARP 억제제를 첨가하여 처리를 수행하였다. 처리 시작 후 24시간 후에 상기 배지를 우태 혈청을 포함한 신선한 배지로 교체하였다. 세포를 추가로 4일 동안 (처리 후 5일) 성장시키고, 트립신으로 처리하고 총 세포 수를 계수하였다. 집단 중 살아있는 세포(무색)를 계수하기 위해 트립판 블루 (0.4%)를 첨가하였다.
종양 성장에 대한 생체 내 시험
지방 패드에 이식된 이종 이종이식 MD227 인간 유방암 세포주를 가진 누드 마우스에 DT01 (5 mg/일) 및 올라파립 (200mg/kg/일)을 종양 내로 투여하여 처리하였다. 종양 성장을 모니터링 하였다 (시간 0: 처리 시작). 군 당 8 내지 10마리의 동물을 처리하였다 (제1군: 비히클 주입 (회색선); 제2군: DT01 (흑색 점선); 제3군: 올라파립 (회색 점선); 제4군; DT01+ 올라파립 (흑색선)). 처리를 투여 후속의 5일에 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타냈으며, 이는 올라파립 단독 또는 DT01 단독으로 처리한 동물에 비해 종양 크기의 감소를 나타냈다.
재료 및 방법
4.106 종양 세포를 성체 암컷 누드 마우스 (Janvier, 르 제네스트 생 이슬, 프랑스)에 주사하여 인간 유방암 이종이식 종양을 수득하였다. 상기 동물을 실험 시작 전 적어도 1주일 동안 실험실에서 수용하였다. 광 및 암주기 (12 시간 : 12시간), 상대 습도 (55%), 및 온도 (21℃)의 제어된 조건 하에 케이지 당 6마리의 동물이 있었다. 음식과 수돗물을 자유롭게 사용하게 하였다. 피하 종양이 약 125　mm3에 도달했을 때, 마우스를 일정한 군으로 분리하여 상이한 치료 프로토콜을 주었다: 치료하지 않음(NT), 1주일 동안 DT01 단독 (5일 동안 매일 2.5 mg 종양 내 및 2.5 mg 피하 처리), 1주일 동안 올라파립 단독 (200mg/kg/일) (os 당 5일 세션), 및 DT01+올라파립 병용 치료 1주일 (5일 세션). 모든 실험에서, 매 2 내지 3일마다 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양을 측정하였다. 국소 피부 독성 또는 전신 독성이 관찰되지 않았다. 다음의 공식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다: 길이 x 폭 x 폭/2. 마우스를 매주 칭량하고 280일 동안 추적 조사하였다. 윤리적 이유로, 종양이 1500 mm3에 도달하면 동물을 희생시켰다. 동물 실험 윤리 위원회가 모든 실험을 승인하였다.
실시예 2
본 발명자들은 DNA 수리 억제제의 2가지 부류의 병용 효과를 분석하고 이들의 결합이 모든 세포에서 합성 치사를 모방함을 입증하였다. 이들을 12개의 유방암 세포주에서 디베이트 (AsiDNA) 및 PARP 억제제 (올라파립)의 효능을 비교하였다. 신호전달 네트워크 맵과 관련하여 해석되는 이러한 세포주의 다단계 오믹스 데이터에 대한 분석은 디베이트 또는 올라파립에 대한 민감도와 관련된 상이한 DNA 수리 분자 프로파일을 강조하였으며, 이는 병용된 치료를 합리화하였다. 디베이트와 올라파립이 병용된 치료의 초-부가 효과가 비 종양 세포에 대한 유의한 세포독성이 없는 20개의 종양 세포주에서 확인되었다. 분자 분석은 올라파립과 디베이트가 각각 손상 부위에서 XRCC1 및 RAD51/53BP1 수리 효소가 모집되는 것을 방지하고 병용 시 누적 효과를 갖는다는 것을 입증하였다. 디베이트와 다른 PARP 억제제와의 병용 시 치료 상승효과가 또한 관찰되었다. 이러한 결과는 디베이트와 PARP 억제제를 병용하여 모든 종양에서 합성 치사를 되풀이하는 치료적 관심을 강조한다.
본 발명자들은 최초로 유방암 (BC) 세포주의 패널에서 올라파립 (Ola) 및 디베이트에 대한 민감도를 분석하였다. BC는 가장 흔한 여성 악성 종양으로, 매년 전 세계적으로 170만 건의 새로운 사례로 진단된다. 기저형/삼중 음성 아군에서 30%의 유병률을 갖는 산발성 BC 종양의 8.8%에서 CRCA의 불활성화 돌연변이가 관찰되었다. 이들을 상이한 BRCAness 상태의 BC 세포주의 패널에서 사용하였으며, PARPi, 올라파립 (Ola) 및 디베이트에 대한 이들의 민감도를 독립적으로 최초로 분석하였다. BC 세포주를 디베이트 또는 Ola에 대한 이들의 민감도에 따라 분류하였다. 포괄적인 신호전달 네트워크 맵의 관점에서 이러한 세포주의 다단계 오믹스 데이터 분석에서 특히 DNA 수리 기작에서, 디베이트 또는 Ola의 민감성과 관련된 다양한 분자 프로파일을 확인하였고, 이는 이러한 두 약물의 병용에 대한 관심을 강조한다. 본 발명자들은 BRCAness 상태와 상관 없이 BC 세포주에서 Ola 및 디베이트의 상승적 효과를 관찰하였고 이러한 병용이 많은 암세포 유형에서 상이한 PARP 억제제와 함께 효과적임을 입증하였다.
결과
BC 세포주가 AsiDNA 및 올라파립에 대한 상이한 민감도를 나타냄
Ola 및 AsiDNA의 효능을 4BRCA-돌연변이된 세포주를 포함하여 12BC 세포주에서 세포 사멸 및 증식을 측정하여 평가하였다 (도 4a 및 4b 및 도 5). 또한, BRCA1 또는 BRCA2 유전자에 대해 침묵된 HeLa 세포를 BRCA 돌연변이 인자의 대조군으로서 사용하고 3개의 불멸화된 유방 세포주 (MCF10A, MCF12A 및 184B5)를 비-종양 대조군으로서 사용하였다. BC227 BRCA2 -/- 돌연변이체의 75 내지 80% 생존률에 근거하여 약물 농도 (Ola의 경우 0.1 μM 및 Asi DNA의 경우 4.8μM)를 선택하였다. 모든 BC 세포주에서, 세포의 상대적인 수의 감소는 세포 사멸의 증가와 관려이 있었으며 (도 4a, 도 5), 이는 살아있는 세포의 수가 세포독성을 나타내고 세포증식 억제 효과를 나타내지 않음을 반영한다. Ola 및 AsiDNA 처리는 세가지 대조군 비-종양 세포주에 영향을 미치지 않았다. 이와 대조적으로, 종양 세포주는 Ola의 경우 100% 내지 5% 그리고 AsiDNA의 경우 100% 내지 60%로 다양한 생존률을 나타냈다. 모든 BRCA -/- 세포주가 두 처리 모두에 대해 민감하였다. BRCA 유능(proficient) 종양 세포주 중에서, MDAMB468이 두 처리에 대해 민감하였고, BC173 및 HCC1143은 AsiDNA에 대해서만 민감하였고, HCC1187은 Ola에 대해서만 민감하였다. BT20, MDAMB231, MCF7 및 HCC70은 이러한 투여량에서 두 처리 모두에 대해 내성이 있었다 (도 4a, 4b 및 도 5). AsiDNA에 대한 반응과 Ola에 대한 반응 사이의 상관관계 분석은 유의한 상관관계를 나타내지 않았다 (스피어맨 계수 r: 0.33 및 P 값: 0.17). 이러한 결과는 BRCA 결핍이 AsiDNA 또는 Ola 효능에 충분하지만 필요하지 않음을 나타내며, 상이한 수리 결함이 이러한 약물에 대한 민감도를 결정함을 시사한다.
AsiDNA와 올라파립의 병용 치료가 BC 세포주에서 초-부가 효능을 나타냄
본 발명자들은 Ola 및 AsiDNA 단독에 대해 상이한 민감도를 갖는 3개의 BC 및 2개의 비-종양 세포주의 병용 처리에 대한 세포 생존을 모니터링 하였다 (도 6; 표 1). Ola 및 AsiDNA 단일 처리의 효능은 용량 의존적이었다 (도 7). 그러나, 이러한 병용은 시험된 모든 투여량에서 예상되는 부가 효과보다 더 효율적이거나 적어도 동등하게 유지되었다. 흥미롭게도, 병용 치료에 대한 생존은 단일 치료에 대한 민감도의 정도와 관계 없이 3개의 암 모델에서 초-부가적이었다. AsiDNA의 투여량을 16 μM로 증가시키면 AsiDNA의 단일 치료 효과가 유의하게 증가하였지만 병용된 치료의 효능에는 유의한 효과를 미치지 않았다. 이와 반대로, 정상 세포는 AsiDNA 및 Ola 모두 병용 치료 및 단일 치료 모두에 대해 둔감하였다 (도 6; 표 1).
[표 1]
다양한 암 유형에서 단일 치료 및 병용된 치료의 효능
사용한 농도는 AsiDNA의 경우 4.8μM이고 Ola의 경우 0.1μM이었다. 계산된 부가도 = AsiDNA에 대한 생존 x Ola에 대한 생존
Figure 112018018789208-pct00047
AsiDNA 및 올라파립의 병용에서의 분자 기작
이러한 세포독성 상승효과를 분석하기 위해, 본 발명자들은 AsiDNA, Ola 또는 둘 모두가 DNA 수리 활성에 대해 미치는 영향을 조사하였다. 이들은 처음에 각 분자가 표적 수리 효소의 모집을 억제하는 다른 분자의 능력에 영향을 미치지 않는지를 점검하였다. 예측한 바와 같이, Ola는 XRCC1 병소(foci) 모집을 현저하게 지연시킨 반면 AsiDNA는 그렇지 않았다. XRCC1의 모집은 AsiDNA의 존재 및 부재 하에 Ola로 처리된 세포에서 유사하게 지연되었다 (도 8). AsiDNA에 의한 DNA-PK 키나아제 활성의 활성화는 히스톤 H2AX의 범-핵산 인산화에 의해 쉽게 밝혀질 수 있다. 이러한 인산화는 Ola의 부재 시와 같이 존재 하에서 관찰되었다 (도 9a, 9c). H2AX의 범-핵산 인산화는 AsiDNA에 의한 HR 및 NHEJ 수리 효소 모집의 억제에 연관되어 있을 것으로 생각된다. 조사(irradiation) 후에, 우리는 Ola를 사용하거나 사용하지 않은 AsiDNA 처리된 세포에서 53BP1 병소의 감소를 관찰하였다 (도 10). DNA 손상 처리의 부재 시, Ola는 53BP1 및 Rad51 병소와 함께 위치하는 γH2AX 병소 형성에 의해 밝혀진 DSB의 축적을 유도한다 (도 9a, 9B). AsiDNA의 첨가는 Ola에 의해 유도된 53BP1 또는 Rad51 병소의 형성을 유의하게 감소시켰다 (도 9a, 9B). AsiDNA 후 Rad51 및 53BP1 병소의 감소가 DNA 손상 수의 감소를 통해서가 아니라 손상 부위에서 이들의 모집을 억제함으로써 유도됨을 입증하기 위해, 본 발명자들은 상이한 처리 후에 MDAMB231 종양 세포의 손상을 모니터링하기 위해 단일 세포 알칼리성 혜성 (comet) 분석을 사용하였다. γH2AX 병소에 의해 시사되는 바와 같이, Ola 처리는 24시간에 걸쳐 손상의 축적을 유도한 반면 AsiDNA는 그렇지 않았다 (도 9e). AsiDNA를 Ola와 병용하는 것은 Ola에 의해 유도되는 DNA 손상을 2배 증가시켰다. 이러한 증가는 MDAMB231 세포에서 병용의 효과적인 세포독성을 설명할 수 있었다. 이와 반대로, MCF10A 비-종양 세포에서, Ola 처리 후에 DNA 손상의 약간의 증가가 관찰되었을지라도, AsiDNA와 Ola의 병용은 손상 축적을 증가시키지 않았다 (도 9c, 9d 및 9f).
다른 암세포주에서 AsiDNA가 올라파립 효능을 증가시켰음
AsiDNA와 Ola의 병용 효능이 BC에 한정되지 않는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 교모세포종, 자궁경부암, 대장암, 혈액암 및 흑색종을 포함하는 상이한 암세포주의 민감도를 분석하였다. 모든 종양 모델이 약물 병용의 초-부가 효능을 나타냈다 (표 1). 또한, 단일 및 병용 치료에 대한 DNA 수리 돌연변이체와 동질유전자 쌍의 분석은 AsiDNA가 하나의 수리 결함을 갖는 모든 돌연변이체 (PARP1, BRCA1, BRCA2, Ku70, DNA-PKcs)에 대해 매우 세포독성인 반면 Ola 민감도가 BRCA 돌연변이체에 대해 본질적으로 제한됨을 나타낸다 (표 1). AsiDNA에 대한 PARP1, BRCA 및 Ku70 돌연변이체의 민감도는 DT40 닭 림프종 수리 돌연변이체의 동질유전자 세트에서 확인되었다 (도 11a). 본 발명자들은 또한 MDAMB231, BC173 및 BC227에 비해 단일 치료에 대한 상이한 반응 프로파일을 갖는 3종의 다른 BC 세포주 (MDAMB468, HCC1187 및 HCC38)에서 병용 치료의 효과를 조사하였다 (표 1). AsiDNA와 Ola 사이의 상승적 효과가 이러한 3개의 BC 세포주에서도 관찰되었다. 고형 종양으로부터 유도된 세포주 중에서, 오직 Hela-PARP1 침묵된 세포만이 Ola 치료 후에 AsiDNA에 대한 민감도의 증가가 관찰되지 않았기 때문에 병용으로부터의 이익을 얻지 못했다. 놀랍게도, Hut78 및 Jurkat 혈액 종양 T 세포는 두 단일 치료의 계산된 부가 효과에 가까운 병용 치료에서 생존하였다 (표 1). 두 세포주 모두 단일 치료에 대해 민감했기 때문에, 부가도의 부족은 특정 DNA 수리 결함과 상관관계가 없는 것으로 나타났다. 종합하면, 이러한 결과는 병용 치료 AsiDNA/Ola의 효능이 BC에 제한되지 않으며, AsiDNA가 BRCA 상태와 독립적으로 Ola에 대한 모든 세포주를 민감화시킨다는 것을 나타낸다.
AsiDNA가 모든 PARP 억제제와 함께 초-부가 효능을 유도함
PARP 억제제는 적어도 2개의 부류에 속한다: PARP 효소 활성을 억제하는 촉매적 억제제, 및 DNA 손상 부위에서 PARP 효소 활성 및 포획 PARP 단백질 둘 모두를 차단하는 이중 억제제. Ola는 두 번째 군에 속하는 반면 벨리파립 (Veli)은 단지 효소적 억제제이다. 따라서, 본 발명자들은 Ola 대신 Veli를 사용하여 BC 주의 패널에서 효능 분석을 반복하였다 (도 12). 병용 치료의 상승적 효과가 3개의 BC 주에서 Veli를 사용하여 관찰되었지만, 이러한 효과는 비-종양 세포에서는 없었다. 이는 DNA 상에 PARP를 포획하는 것이 효율적인 병용에 필수적이지 않음을 나타낸다. 유사한 결과가 DT40 림프종 세포에서도 관찰되었다 (도 11b).
본 발명자들은 임상 적용을 위해 개발된 5개의 다른 PARPi (루카파립, 이니파립, 니라파립, AZD2461 및 BMN673)를 사용한 MDAMB231 세포에서의 병용 치료 효능을 모니터링 하였다 (도 13). 적용된 PARPi의 투여량은 준 치사 효과 및 50% 생존을 나타내는 투여량을 제공하는 것으로 선택되었다 (표 2). PARPi와 AsiDNA의 병용의 초-부가 효능을 이의 작용 기전과 독립적으로 모든 억제제로 확인하였다 (도 13). 이러한 결과는 관찰된 상승적 효과가 단지 올라파립에 제한되지 않고 일반적임을 입증한다.
[표 2]
Figure 112018018789208-pct00048
재료 및 방법
세포 배양, 화학약품 및 AsiDNA 분자
4개의 BRCA1 결핍 BC 세포주 (Institut Curie로부터의 BC227, ATCC로부터의 HCC1937, HCC38 및 MDAMB436), 8개의 BRCA1 유능 BC 세포주 (Institut Curie로부터의 BC173, ATCC로부터의 BT20, HCC1143, HCC1187, HCC70, MCF7, MDAMB231 및 MDAMB468), 3개의 비-종양 유방 세포주 (ATCC로부터의 184B5, MCF10A 및 MCF12A), 5개의 인간 자궁경부암 HeLa 세포주인 BRCA1에 대해 침묵된 것 (HelaBRCA1SX, Tebu-Bio 00301-00041로 지칭됨), BRCA2에 대해 침묵된 것 (HelaBRCA2SX, Tebu-Bio 00301-00028로 지칭됨), PARP1에 대해 침묵된 (HeLaPARP1KD, Vincent Pennanaech의 기부, Institut Curie, 프랑스)것 및 대조군 (HeLaCTLSX, Tebu-Bio01-00001, 및 HeLaCTLKD Vincent Pennanaech 기부, Institut Curie, 프랑스), 인간 교모세포종 세포주 MO59K 및 MO59J (DNA-PKcs 결핍), 인간 흑색종 세포주 SK28LshCTL 및 SK28 LshDNA-PKcs, 인간 대장암 세포주 HCT116 WT 및 HCT116 KU70+/- (KU70 유전자에 대해 이형접합체), 인간 두경부 암 세포주 Hep2, 종양 혈액 세포 Hut78, IM9 및 Jurkat을 사용하여 세포를 배양하였다. 공급업체의 지시에 따라 세포를 성장시켰다. 세포주를 5% CO2에서 가습된 대기에서 37℃에서 유지시켰다.
DT40 버킷-림프종 세포는 Murai et al (2012, Cancer Res, 72, 5588-99)에서 이전에 기술된 것과 같이 상이한 유전자에 대해 넉아웃된 닭 세포이다. 본 연구를 위해, 본 발명자들은 DT40 야생형 세포를 대조군으로서 사용하였고 (DT40WT), 4개의 세포주를 각각 BRCA1, KU70, TDP1 및 PARP1 유전자에 대해 넉아웃하였다 (DT40BRCA1KO, DT40KU70KO, DT40TDP1KO 및 DT40PARP1KO). DT40 세포를 1% 닭 혈청 (Life Technologies, 칼스배드, 캘리포니아, 미국), 10-5 M β-머캅토에탄올, 페니실린, 스트렙토마이신 및 10% 우태 혈청 (FBS)으로 보충된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) 배지 중에서 5% CO2가 있는 37℃에서 배양하였다. 세포 배양을 위한 시약을 Gibco Invitrogen으로부터 입수하였다.
모든 PARP 억제제인 AZD-2281 (올라파립), AZD-2461, ABT888 (벨리파립), MK-4827 (니라파립), BSI-201 (이니파립), BMN673 (탈라조파립) 및 AG-014699 (루카파립)을 Medchem express (프린세톤, 미국)로부터 구입하고 10mM의 저장 농도로 DMSO 중에 희석하였다.
디베이트 분자 (AsiDNA)는 자동 고상 올리고뉴클레오티드 합성 방법 (Agilent, 미국)에 의해 제조된 이중 가닥의 32개 염기쌍 올리고 뉴클레오티드이다. 상기 서열은 다음과 같다: 5'XGCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA-L'-TCTAGGCTTGTTTGCTGGGTTGTGGGCACAGC-3' 여기서 L'는 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸이고 밑줄친 글자는 포스포로디아미데이트 뉴클레오시드이다. 콜레스테릴 테트라에틸렌글리콜 (X)이 5'말단에 연결되어 있다.
약물에 대한 세포 민감도 측정
AsiDNA 또는 PARPi 세포독성을 상대 생존 및 세포 사멸량에 의해 측정하였다. 부착 세포를 24웰 배양 플레이트에 적절한 밀도로 씨딩하고 AsiDNA 및/또는 PARPi를 첨가하기 전에 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 처리 후 6일차에 세포를 수확하고, 0.4% 트립판 블루 (Sigma Aldrich, 세인트-루이스, 미국)로 염색하고, 버커(Burker) 챔버로 계수하였다. 세포 생존을 살아있는 모의-처리된 세포에 대한 살아있는 처리된 세포의 비율로서 계산하였다. 세포 사멸을 계수된 세포의 총 수에 대한 사멸 세포의 수로서 계산하였다. 독성의 부가를 AsiDNA에 대한 세포 생존 및 PARPi에 대한 세포 생존의 곱에 의해 계산하였다.
DT40 닭 림프종 수리 돌연변이체(Murai et al, 2012, Cancer Res, 72, 5588-99)의 세포독성을 측정하기 위해, 750개의 세포를 37℃에서 지시된 농도의 약물(AsiDNA 및/또는 벨리파립)을 포함하거나 포함하지 않은 배지에서 Perkin Elmer Life Sciences (월섬, 마이애미, 미국)의 96웰 백색 플레이트에 (최종 농도 150 μl/웰) 씨딩하였다. 72시간 후에, ATPlite 1-스텝 키트 (PerkinElmer, 월섬, 마이애미, 미국)를 사용하여 3회 중복으로 세포를 분석하였다. 요약하면, ATPlite 용액을 각각의 웰에 첨가하였다 (DT40 세포의 경우 150 μl). 처리 5분 후에, 발광 강도를 Perkin Elmer Life Sciences (월섬, 마이애미, 미국)의 Envision 2104 다중표지 판독기로 측정하였다. 비처리된 세포의 신호 강도를 100%로 설정하였다.
항체 및 면역학 연구
면역염색을 위해, MDAMB231 세포를 5x105 세포의 농도로 커버 슬립 (Menzel, 브라운슈바이크, 독일) 상에 씨딩하고 37℃에서 1일 동안 인큐베이션 하였다. 이어서 세포를 16μM AsiDNA +/- 1μM 올라파립으로 처리하였다. 처리 후 24h 후에, 세포를 4% 파라포름알데히드/포스페이트-완충된 식염수 (PBS 1x) 중에 20분 동안 고정시키고, 0.5% 트리톤 X-100 중에서 10분 동안 투과시키고, 2% 우 혈청 알부민/PBS 1x로 블록킹하고 1차 항체로 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 모든 2차 항체를 1/200으로 희석하여 실온(RT)에서 45분 동안 사용하고, DNA를 4', 6-다이아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 염색하였다. 다음의 항체를 사용하였다: 1차 단클론 마우스 항-포스포-H2AX (Millipore, 기앙쿠르, 프랑스), 항-53BP1 토끼 항체 (Cell signaling technology, 덴버스, 미국), 항-Rad51 토끼 항체 (Merk Millipore, 다름슈타트, 독일), Alexa-633이 접합된 2차 염소 항-마우스 IgG (Molecular Probes, 유진, 오리건, 미국) 및 Alexa-488이 접합된 2차 염소 항-토끼 IgG (Molecular Probes, 유진, 오리건, 미국).
알칼리 단일-세포 전기영동 "코멧 분석"
AsiDNA (16μM), 올라파립 (1μM) 또는 둘 모두를 처리한 세포를 DMEM 중의 0.5% 저융점 아가로스 중에 현탁하고 0.5% 정상 융점 아가로스 층으로 미리 코팅된 유색 유리 현미경 슬라이드 상으로 옮겼다. 슬라이드를 4℃에서 1시간 동안 용해(lysis) 용액 [2.5 mol/L NaCl, 100 mmol/L EDTA,10 mmol/L 트리스, 1% 소듐 라우릴 사코시네이트, 10% DMSO, 1% 트리톤 X-100 (pH 10)] 중에 침지시키고, 0.3 mol/L NaOH (pH 13) 및 1 mmol/L EDTA로 조건화된 전기영동 탱크에 40분 동안 놓아두고, 25 V (300 mA)에서 25분 동안 전기영동하고, 중성 완충액 [400 mmol/L 트리스-HCl (pH 7.5)]으로 세척하고, 20 Ag/mL 에티듐 브로마이드로 염색하였다. "코멧"의 변수를 소프트웨어 Comet Assay 2 (Perceptive Instrument)를 사용하여 정량화하였다. 각 실험 지점에 대해 3회 중복으로 슬라이드를 처리하였다. 꼬리 모멘트는 꼬리의 DNA 비율과 혜성의 머리와 꼬리 사이의 변위의 곱하기로 정의된다.
통계 분석
모든 통계 분석을 양측 스튜던트 t-검정으로 수행하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Institut Curie et al <120> Use of a combination of Dbait molecule and PARP inhibitors to treat Cancer <130> B2068EP <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Dbait32 <400> 1 acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct 32 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Dbait32Ha <400> 2 cgtaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Dbait32Hb <400> 3 gctaggcttg tttgctgggt tgtaggcaca gc 32 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Dbait32Hc <400> 4 gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Dbait32Hd <400> 5 gctaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule Ia <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane + Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or proteins <400> 6 acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct 32 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule Ib <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane + Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or pr <400> 7 cgtaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule Ic <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane + Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or pr <400> 8 gctaggcttg tttgctgggt tgtaggcaca gc 32 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule Id <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane + Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or pr <400> 9 gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule Ie <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane + Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or pr <400> 10 gctaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule IIa <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> at the 5' end, Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or proteins <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane <400> 11 acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct 32 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule IIb <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> at the 5' end, Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or proteins <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane <400> 12 cgtaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule IIc <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> at the 5' end, Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or proteins <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane <400> 13 gctaggcttg tttgctgggt tgtaggcaca gc 32 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule IId <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> at the 5' end, Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or proteins <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane <400> 14 gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule IIe <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> at the 5' end, Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or proteins <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane <400> 15 gctaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule IIIa <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> misc_feature <223> note= "the last nucleotide at the 3'end of the complementary strand is linked to Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or proteins <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane <400> 16 acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct 32 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule IIIb <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> misc_feature <223> note= "the last nucleotide at the 3'end of the complementary strand is linked to Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or proteins <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane <400> 17 cgtaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule IIIc <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> misc_feature <223> note= "the last nucleotide at the 3'end of the complementary strand is linked to Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or proteins <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane <400> 18 gctaggcttg tttgctgggt tgtaggcaca gc 32 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule IIId <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> misc_feature <223> note= "the last nucleotide at the 3'end of the complementary strand is linked to Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or proteins <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane <400> 19 gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule IIIe <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate or methylphosphonate backbone" <220> <221> misc_feature <223> note= "the last nucleotide at the 3'end of the complementary strand is linked to Lm = carboxamido oligoethylene glycol + C = single or double chain fatty acids, cholesterol, sugars, peptides or proteins <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate or methylphosphonate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' =hexaethyleneglycol, tetradeoxythymidylate or 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane <400> 20 gctaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleic acid molecule DT01 <220> <221> misc_feature <223> note="at the 3' end of the complementary strand the three last nucleotides with phosphorothioate backbone" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> at the 5' end, 10-O-[1-propyl-3-N-carbamoylcholesteryl]-triethyleneglycol radical <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> mod_base= phosphorothioate backbone <220> <221> stem_loop <222> (1)..(32) <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> loop L' = 2,19-bis(phosphor)-8-hydraza-1-hydroxy-4-oxa-9-oxo-nonadecane <400> 21 gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32

Claims (28)

  1. 디베이트(Dbait) 핵산 분자 및 PARP 억제제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물로서, 상기 디베이트(Dbait) 핵산분자는 이중-가닥 DNA 줄기(stem) 및 루프(loop)를 갖는 헤어핀(hairpin) 핵산이며, 다음 화학식 중 하나를 갖는 약학 조성물:
    Figure 112018021520418-pct00087

    상기 화학식에서, N은 데옥시뉴클레오티드이고, n은 23 내지 195의 정수이고, 밑줄 친 N은 변형된 포스포다이에스터 백본을 갖거나 갖지 않는 뉴클레오티드를 나타내고, L'는 링커이고, C는 수용체 매개된 엔도시토시스를 가능케 하는 세포 수용체가 표적인 친유성 분자 또는 리간드로부터 선택된 엔도시토시스를 촉진하는 분자이고, L은 링커이고, m 및 p는 독립적으로 0 또는 1인 정수이며, 상기 디베이트 핵산 분자는 인간 게놈의 임의의 유전자와 70% 미만의 서열 동일성을 가진다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 가지는 것인 암 치료용 약학 조성물:
    - n은 27 내지 95의 정수;
    - N 은 A (아데닌), C (시토신), T (티민) 및 G (구아닌)로 이루어진 군으로부터 선택되고 CpG 다이뉴클레오티드의 발생을 회피하도록 선택되고 인간 게놈의 임의의 유전자와 80% 미만의 서열 동일성을 갖는 데옥시뉴클레오티드;
    - 링커 L'은 헥사에틸렌글리콜 , 테트라데옥시티미딜레이트 (T4), 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2 -히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸 및 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸으로 이루어진 군으로부터 선택;
    - m은 1이고, L은 카복사미도 폴리에틸렌 글리콜; 및
    - C는 콜레스테롤, 단일 또는 이중 쇄 지방산 및 세포 수용체를 표적으로 하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택.
  3. 제2항에 있어서, 상기 카복사미도 폴리에틸렌 글리콜은 카복사미도 트리에틸렌 글리콜 또는 카복사미도 테트라에틸렌 글리콜인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 단일 또는 이중 쇄 지방산은 옥타데실, 올레산, 디올레오일 및 스테아르산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 리간드는 폴산, 토코페롤, 당, 펩티드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 당은 갈락토스, 만노스 및 이의 올리고사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 펩티드는 RGD 또는 봄베신인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 단백질은 트랜스퍼링 또는 인테그린인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 상기 C는 콜레스테롤 또는 토코페롤인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  10. 제2항에 있어서, 상기 C는 콜레스테롤인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 디베이트 핵산 분자는 다음의 화학식 중 하나를 갖는 것인, 암 치료용 약학 조성물:

    Figure 112018073510368-pct00088

    Figure 112018073510368-pct00089

    Figure 112018073510368-pct00090

    Figure 112018073510368-pct00091

    Figure 112018073510368-pct00092

    Figure 112018073510368-pct00093

    Figure 112018073510368-pct00094

    Figure 112018073510368-pct00095

    Figure 112018073510368-pct00096

    Figure 112018073510368-pct00097

    Figure 112018073510368-pct00098

    Figure 112018073510368-pct00099

    Figure 112018073510368-pct00100

    Figure 112018073510368-pct00101

    및
    Figure 112018073510368-pct00102

    상기 화학식에서, 밑줄 친 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 메틸 포스포네이트 백본을 갖는 뉴클레오티드를 나타내고, 링커 L'은 헥사에틸렌글리콜, 테트라데옥시티미딜레이트 (T4), 1,19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸 및 2,19-비스(포스포르)-8-히드라자-1-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸으로 이루어진 군으로부터 선택되고, m 은 1이고 L은 카복사미도 올리고에틸렌 글리콜이고, C는 단일 또는 이중 쇄 지방산, 콜레스테롤, 토코페롤, 폴산, 당, 펩티드 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단일 또는 이중 쇄 지방산은 옥타데실 또는 디올레오일인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 당은 갈락토스, 만노스 및 이의 올리고사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 펩티드는 RGD 또는 봄베신인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 상기 단백질은 인테그린인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  16. 제11항에 있어서, 상기 C는 콜레스테롤인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 디베이트 핵산 분자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암 치료용 약학 조성물:
    Figure 112018021520418-pct00103

    Figure 112018021520418-pct00104
    , 및
    Figure 112018021520418-pct00105
    .
  18. 제1항에 있어서, 상기 디베이트 핵산 분자는 다음의 화학식인 암 치료용 약학 조성물:
    Figure 112018021520418-pct00106
    .
  19. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 다음의 화학식인 약학 조성물:
    Figure 112018021520418-pct00107

    상기 화학식에서, C는 콜레스테릴이고, Lm은 테트라에틸렌 글리콜이고, p는 1이고 L'는 1, 19-비스(포스포)-8-히드라자-2-히드록시-4-옥사-9-옥소-노나데칸이다 .
  20. 제1항에 있어서, 상기 PARP 억제제는 루카파립 (AG014699, PF-01367338), 올 라파립 (AZD2281), 벨리파립 (ABT888), 이니파립 (BSI 201), 니라파립 (MK 4827), 탈라조파립 (BMN673), AZD 2461, CEP 9722, E7016, INO-1001, LT-673, MP-124, NMS-P118, XAV939, 이의 유사체, 유도체 또는 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암 치료용 약학 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 PARP 억제제는 AZD2281 (올라파립), ABT888 (벨리파립), BMN673, BSI-21 (이니파립), AZD 2461, MK-4827 (니라파립), 및 AG 014699 (루카파립)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암 치료용 약학 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 상기 암은 백혈병, 림프종, 육종, 흑색종, 및 두경부암, 신장암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암, 폐암, 식도암, 유방암, 방광암, 뇌암, 대장암, 간암, 및 자궁 경부암으로부터 선택되는, 암 치료용 약학 조성물.
  23. 제1항에 있어서, 상기 암은 백혈병, 림프종, 흑색종, 육종, 두경부암, 유방암, 뇌암, 대장암, 및 자궁경부암으로부터 선택되는, 암 치료용 약학 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 상기 PARP 억제제는 치료량 이하로 투여되는 것인 암 치료 용 약학 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 상기 PARP 억제제 및 상기 디베이트 핵산 분자는 방사선 요법 및 DNA 손상제를 이용하는 항종양 화학 요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것과 병용되어 사용되는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 암 치료용 약학 조성물을 포함하는 키트로서, 상기 디베이트 핵산 분자는 동시, 분리 또는 순차적 투여를 위한 병용 제제로 포함되는 것인, 암 치료용 약학 조성물을 포함하는 키트.
  27. 암 치료용 PARP 억제제로서, 상기 PARP 억제제는 디베이트(Dbait) 핵산분자와의 병용투여용인 것을 특징으로 하고, 상기 디베이트(Dbait) 핵산분자는 이중-가닥 DNA 줄기(stem) 및 루프(loop)를 갖는 헤어핀(hairpin) 핵산이며, 다음 화학식 중 하나를 갖는 PARP 억제제:
    Figure 112018073510368-pct00108

    상기 화학식에서, N은 데옥시뉴클레오티드이고, n은 23 내지 195의 정수이고, 밑줄 친 N은 변형된 포스포다이에스터 백본을 갖거나 갖지 않는 뉴클레오티드를 나타내고, L'은 링커이고, C는 수용체 매개된 엔도시토시스를 가능케 하는 세포 수용체가 표적인 친유성 분자 또는 리간드로부터 선택된 엔도시토시스를 촉진하는 분자이고, L은 링커이고, m 및 p는 독립적으로 0 또는 1인 정수이며, 상기 디베이트 핵산 분자는 인간 게놈의 임의의 유전자와 70% 미만의 서열 동일성을 가진다.
  28. 암 치료용 디베이트(Dbait) 핵산분자로서, 상기 디베이트(Dbait) 핵산분자는 PARP 억제제와의 병용투여용인 것을 특징으로 하고, 이중-가닥 DNA 줄기(stem) 및 루프(loop)를 갖는 헤어핀(hairpin) 핵산이며, 다음 화학식 중 하나를 갖는 디베이트(Dbait) 핵산분자:
    Figure 112018073510368-pct00109

    상기 화학식에서, N은 데옥시뉴클레오티드이고, n은 23 내지 195의 정수이고, 밑줄 친 N은 변형된 포스포다이에스터 백본을 갖거나 갖지 않는 뉴클레오티드를 나타내고, L'은 링커이고, C는 수용체 매개된 엔도시토시스를 가능케 하는 세포 수용체가 표적인 친유성 분자 또는 리간드로부터 선택된 엔도시토시스를 촉진하는 분자이고, L은 링커이고, m 및 p는 독립적으로 0 또는 1인 정수이며, 상기 디베이트 핵산 분자는 인간 게놈의 임의의 유전자와 70% 미만의 서열 동일성을 가진다.
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