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KR101877109B1 - 항-il-17a 항체 및 자가면역 및 염증성 장애의 치료에서의 그의 용도 - Google Patents

항-il-17a 항체 및 자가면역 및 염증성 장애의 치료에서의 그의 용도 Download PDF

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KR101877109B1
KR101877109B1 KR1020157023999A KR20157023999A KR101877109B1 KR 101877109 B1 KR101877109 B1 KR 101877109B1 KR 1020157023999 A KR1020157023999 A KR 1020157023999A KR 20157023999 A KR20157023999 A KR 20157023999A KR 101877109 B1 KR101877109 B1 KR 101877109B1
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프란코 이. 디 파도바
토마스 후버
장-미셀 렌 롱도
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노파르티스 아게
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Abstract

본 개시내용은 염증유발 시토카인 IL-17A에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질에 관한 것이다. 본 개시내용은 보다 구체적으로, IL-17A 길항제 (IL-17A 및 IL-17AF의 활성을 억제함)이고, 시험관내 검정에서 IL-17A 유도된 시토카인 생산을 억제할 수 있고, 생체내 항원-유발 관절염 모델에서 억제 효과를 가질 수 있는 특이적 항체 및 단백질에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로, IL-17A 또는 IL17AF 매개 활성을 억제하는 것에 의해 치료될 수 있는 병리학적 장애, 예컨대 류마티스 관절염, 건선, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식 또는 낭성 섬유증 또는 다른 자가면역 및 염증성 장애를 치료하기 위한 상기 항체 및 단백질에 대한 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

항-IL-17A 항체 및 자가면역 및 염증성 장애의 치료에서의 그의 용도 {ANTI-IL-17A ANTIBODIES AND THEIR USE IN TREATING AUTOIMMUNE AND INFLAMMATORY DISORDERS}
관련 출원
본 개시내용은 2013년 2월 8일에 출원된 US 61/762406을 우선권 주장하며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 IL-17A에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질에 관한 것이다. 본 개시내용은 보다 구체적으로, IL-17A의 효과를 억제하고 IL-17A-유도된 활성을 억제할 수 있는 특이적 항체 및 단백질, 뿐만 아니라 예를 들어 IL-17A 신호전달의 억제에 의해 치료될 수 있는 병리학적 장애, 예를 들어 자가면역 및 염증성 장애, 예컨대 류마티스 관절염, 건선, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 다발성 경화증 또는 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식 또는 낭성 섬유증을 치료하기 위한 상기 항체 및 단백질에 대한 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.
인터류킨-17A (IL-17A는 또한 때때로 IL-17로 불림)는 염증성 T 세포의 새롭게 정의된 하위세트, Th17 세포에 의해 생산되는 중요한 림포카인이다. 몇몇 동물 모델에서, 이들 세포는 다양한 자가면역 및 염증 과정을 위해 중추적이다. 증가된 수준의 IL-17A는 포도막염 (Ambadi-Obi, et al. 2007, Nature Med; 13:711-718), 류마티스 관절염 (RA), 건선, 기도 염증, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 염증성 장 질환 (크론병 및 궤양성 결장염), 동종이식편 거부, 암, 복강내 농양 및 유착, 및 다발성 경화증과 연관이 있다 (Weaver, et al. 2007, Annu Rev Immunol; 25:821-852; Witowski et al. 2004, Cell Mol Life Sci; 61:567-579). Th17 세포는 호중구에 의해 지배되는 염증 반응을 신속하게 개시시킬 수 있다 (Miossec, et al. 2009, NEJM; 361:888-98).
IL-17A는 원래 설치류 T-세포 하이브리도마로부터 전사체로서 확인되었다. 이는 IL-17 패밀리로 불리는 시토카인 군의 설립 구성원이다. 설치류에서 CTLA8로 공지되어 있는 IL-17A는 T-림프친화성 라디노바이러스 헤르페스바이러스 사이미리(rhadinovirus herpesvirus saimiri)의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 바이러스 IL-17A에 대해 높은 상동성을 나타낸다 (Rouvier E, et al. 1993, J. Immunol. 150: 5445-56).
IL-17A는 인터페론 감마와 유사하게, 단핵구 및 호중구를 염증 부위로 동원하기 위해 다양한 조직에서 케모카인 생산을 증가시킴으로써, 지연-유형 반응에서 강력한 매개자로서 작용하는 시토카인이다. IL-17 패밀리는 세포외 병원체에 의한 면역계의 침습에 반응하는 염증유발 시토카인의 역할로 기능하고, 병원체의 세포 매트릭스의 파괴를 유발한다. IL-17A는 종양 괴사 인자 및 인터류킨-1과 상승작용적으로 작용한다 (Miossec P, et al. 2009, N. Engl. J. Med. 361:888-98).
그의 기능을 도출하기 위해, IL-17A는 IL-17R로 불리는 제I형 세포 표면 수용체에 결합하며, 상기 수용체는 적어도 2개의 변이체, IL-17RA 및 IL-17RC가 존재한다 (Pappu R, et al. 2012, Trends Immunol.; 33:343-9). IL-17RA는 IL-17A, IL-17AF 및 IL-17F와 결합하고, 다양한 조직: 혈관 내피 세포, 말초 T 세포, B 세포 계통, 섬유모세포, 폐, 골수단핵구성 세포, 및 골수 기질 세포에서 발현된다 (Kolls JK, Linden A 2004, Immunity 21:467-76; Kawaguchi M, et al. 2004, J. Allergy Clin. Immunol. 114:1265-73; Moseley TA, et al. 2003, Cytokine Growth Factor Rev. 14:155-74).
IL-17A에 더하여, IL-17 패밀리의 구성원은 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (또한 IL-25로 불림), 및 IL-17F를 포함한다. IL-17 패밀리의 모든 구성원은 그의 3차원 형상에 중요한 4개의 매우 보존된 시스테인 잔기를 함유하는, 유사한 단백질 구조를 갖는다. 계통발생학적 분석은 IL-17 패밀리 구성원 중에서, IL-17F 이소형 1 및 2 (ML-1)가 IL-17A에 대해 가장 높은 상동성을 갖고 (각각 IL-17A에 대해 55 및 40% 아미노산 동일성을 공유함), 이어서 IL-17B (29%), IL-17D (25%), IL-17C (23%)이며, IL-17E가 IL-17A와 가장 먼 관련성을 가짐 (17%)을 밝혀내었다. 이들 시토카인은 포유동물 내에서 모두 잘 보존되어 있으며, 인간 및 마우스 상동체 사이에 62-88%만큼 많은 아미노산이 보존되어 있다 (Kolls JK, Linden A 2004, Immunity 21:467-76).
IL-17A는 35 kDa의 분자 질량을 갖는, 디술피드-연결된, 동종이량체, 분비된 당단백질인 155-아미노산 단백질이다 (Kolls JK, Linden A 2004, Immunity 21:467-76). IL-17A의 구조는 신호 펩티드에 이어 IL-17 패밀리의 아미노산 영역 특성으로 이루어진다. 단백질에 대한 N-연결된 글리코실화 부위가 단백질의 정제 후에 최초로 확인되었고, 표준 SDS-PAGE 분석에서 하나는 15 kDa에서 그리고 또 다른 것은 20 kDa에서 2개의 밴드가 밝혀졌다. IL-17 패밀리의 상이한 구성원의 비교로 2개의 디술피드 결합을 형성하는 4개의 보존된 시스테인이 밝혀졌다 (Yao Z, et al. 1995, J. Immunol. 155:5483-6). IL-17은 다른 공지된 인터류킨에 대해 어떠한 유사성도 보유하지 않는다는 점에서 독특하다. 또한, IL-17은 임의의 다른 공지된 단백질 또는 구조적 도메인에 대해 어떠한 유사성도 보유하지 않는다 (Kolls JK, Linden A2004, Immunity 21:467-76). 일반적으로, IL-17 패밀리의 다른 구성원, 예컨대 IL-17F는 동종이량체를 형성한다 (IL-17A와 같음).
IL-17A는 또한 특정 상황 하에 IL-17F와 이종이량체를 형성하는 것으로 공지되어 있다. 이종이량체 IL-17AF는 또한 IL-23에 의한 자극에 따라 Th17 세포에 의해 생산된다.
IL-17AF는 IL-17A 및 IL-17F와 마찬가지로 IL-17RA 및 IL-17RC 수용체를 통해 신호를 전달하는 것으로 생각된다. IL-17AF의 생물학적 기능은 IL-17A 및 IL-17F의 그것과 유사하다. IL-17AF에 의한 표적 세포의 자극은 기도 호중구증가증에 더하여 적절한 상황에서 다양한 케모카인의 생산을 유도한다. IL-17AF는 이러한 활성에 있어서 동종이량체 IL-17A보다 덜 강력하지만, 동종이량체 IL-17F보다는 더 강력한 것으로 간주된다. 예를 들어, IL-17A의 효력이 1이면, IL-17AF의 상대적 효력은 IL-17A의 효력의 약 1/10이고, IL-17F의 상대적 효력은 IL-17A의 효력의 약 1/100이다. 인간 및 마우스 IL-17AF는 둘 다 마우스 세포에 대해 활성을 나타낸다. IL-17AF는 총 271개의 아미노산으로 이루어지고, 대략 30.7kDa의 분자량을 갖는다 (셰난도아 바이오테크놀로지(Shenandoah Biotechnology)의 인간 IL-17AF 이종이량체 제품 설명으로부터의 데이터).
다수의 관련 결정 구조가 공개되어 있다. 이는 동종이량체 IL-17F에 대한 결정 구조를 포함한다 (Hymowitz et al. 2001, EMBO J, 19:5332-5341).
수용체 IL-17RA와의 복합체로의 IL-17F의 결정 구조가 또한 공개되어 있다 (Ely et al., 2009 Nature Immunology 10:1245-1251). 또한, 항체의 Fab 단편과의 복합체로의 IL-17A의 적어도 하나의 결정 구조가 공개되어 있다 (Gerhardt et al., 2009 Journal of Molecular Biology, 5:905-921).
건선을 비롯한 여러 염증성 및 자가면역 질환은 과도한 Th1 및/또는 Th17 반응과 관련된다. 이들 중 많은 것은 현재 일반적 면역억제제 또는 모든 환자에서 효과적이지 않은 매우 선택적으로 작용하는 생물제제, 예컨대 항-TNF-α 항체에 의해 치료되고 있다. 이들은 감염 위험을 증가시키고, 반복 치료 후에 효과가 없어지게 되는 것으로 발견되었다. 따라서, 증가된 안전성 프로파일 및 동시에 질환의 장기간 완화 또는 치유를 유도하는 능력을 갖는 치료에 대한 미충족 의료 필요가 존재한다.
다수의 면역 조절 기능이 시토카인의 IL-17 패밀리에 대해 보고되어 있고, 이는 이들이 많은 면역 신호전달 분자를 유도하기 때문인 것으로 추정된다. IL-17A의 가장 주목할 만한 역할은 염증유발 반응을 유도하고 매개하는데 있어서의 그의 관여이다. IL-17A는 또한 알레르기 반응과 연관된다. IL-17은 많은 세포 유형 (섬유모세포, 내피 세포, 상피 세포, 각질세포 및 대식세포)으로부터 많은 다른 시토카인 (예컨대 IL-6, G-CSF, GM-CSF, IL-1β, TGF-β, TNF-α), 케모카인 (IL-8, GRO-α, 및 MCP-1 포함), 및 프로스타글란딘 (예를 들어, PGE2)의 생산을 유도한다. 시토카인의 방출은 IL-17A 반응 특성인 기도 재형성과 같은 많은 기능을 유발한다. 케모카인의 증가된 발현은 호중구를 비롯한 다른 세포를 유인하지만, 호산구는 유인하지 않는다. IL-17 기능은 또한 T 헬퍼 17 (Th17) 세포로 불리는 CD4+ T-세포의 하위세트에 본질적이다. 이들 역할의 결과, IL-17 패밀리는 류마티스 관절염, 천식, 루푸스, 동종이식편 거부 및 항종양 면역을 비롯한 많은 면역/자가면역 관련 질환과 관련된다 (Aggarwal S, Gurney AL 2002, J. Leukoc. Biol. 71:1-8). 또한, 관련성은 추가의 상태, 예컨대 골관절염, 패혈증, 패혈성 또는 내독소성 쇼크, 알레르기 반응, 골 손실, 건선, 허혈, 전신 경화증, 섬유증 및 졸중에 대해서도 도출된다.
따라서, IL-17A의 효과에 대해 길항작용하고 IL-17A 유도된 활성을 억제할 수 있는 특이적 항체, 및 특히 IL-17A 신호전달의 억제에 의해 치료될 수 있는 병리학적 장애를 치료하기 위한 상기 항체에 대한 조성물 및 사용 방법에 대한 필요성이 존재한다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 서열 7, 서열 8 및 서열 3에 의해 코딩된 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 CDR 아미노산 서열, 및 서열 42, 서열 23 및 서열 11에 의해 코딩된 서열에 대해 적어도 64% 동일성을 갖는 CDR 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질을 제공하며, 여기서 상기 항체 또는 분자는 동종이량체 IL-17A 및 이종이량체 IL-17AF에는 특이적으로 결합하지만 동종이량체 IL-17F에는 특이적으로 결합하지 않는다.
한 실시양태에서, IL-17A, IL-17AF 또는 IL-17F는 시노몰구스 원숭이, 레서스 마카크 원숭이, 마모셋 원숭이, 래트, 마우스 또는 인간 중 1종 이상, 예컨대 2 또는 3종 또는 그 초과로부터 선택된다. 한 구체적 실시양태에서, IL-17A, IL-17AF 또는 IL-17F는 인간으로부터의 것이다. 한 구체적 실시양태에서, IL-17A, IL-17AF 또는 IL-17F는 인간 및 마우스로부터의 것이다. 한 구체적 실시양태에서, IL-17A, IL-17AF 또는 IL-17F는 시노몰구스 원숭이, 레서스 마카크 원숭이, 마모셋 원숭이, 래트, 마우스 및 인간으로부터의 것이다.
한 구체적 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 12에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 서열 43에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 항체는 서열 14에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 서열 44에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 a) 제1 가변 아미노산이 Gly (G) 및 Val (V)로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제2 가변 아미노산이 Tyr (Y), Asn (N) 및 Ile (I)로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제3 가변 아미노산이 Trp (W) 및 Ser (S)로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제4 가변 아미노산이 Glu (E) 및 Ala (A)로 이루어진 군으로부터 선택된, 서열 73의 경쇄 CDR1 도메인; b) 가변 아미노산이 Asn (N) 및 Gln (Q)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 서열 74의 경쇄 CDR2 도메인; 및 c) 가변 아미노산이 Asn (N) 및 Asp (D)로 이루어진 군으로부터 선택된, 서열 75의 경쇄 CDR3 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 a) 서열 7, 서열 8 및 서열 3을 순서대로 포함하는 중쇄 CDR, 및 b) 서열 42, 서열 23 및 서열 11, c) 서열 42, 서열 10 및 서열 11, d) 서열 34, 서열 23 및 서열 11, e) 서열 22, 서열 23 및 서열 24, 또는 f) 서열 9, 서열 10 및 서열 11을 순서대로 포함하는 경쇄 CDR을 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 중쇄 CDR, 순서대로, 서열 7, 서열 8 및 서열 3 및 경쇄 CDR, 순서대로, 서열 42, 서열 23 및 서열 11을 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 중쇄 CDR, 순서대로, 서열 7, 서열 8 및 서열 3 및 경쇄 CDR, 순서대로, 서열 42, 서열 10 및 서열 11을 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 중쇄 CDR, 순서대로, 서열 7, 서열 8 및 서열 3 및 경쇄 CDR, 순서대로, 서열 34, 서열 23 및 서열 11을 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 중쇄 CDR, 순서대로, 서열 7, 서열 8 및 서열 3 및 경쇄 CDR, 순서대로, 서열 22, 서열 23 및 서열 24를 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 중쇄 CDR, 순서대로, 서열 7, 서열 8 및 서열 3 및 경쇄 CDR, 순서대로, 서열 9, 서열 10 및 서열 11을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 a) 서열 12를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄, 및 b) 서열 43, c) 서열 53, d) 서열 35, e) 서열 25, 또는 f) 서열 13을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 12에 따른 이뮤노글로불린 중쇄 및 서열 43에 따른 이뮤노글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 12에 따른 이뮤노글로불린 중쇄 및 서열 53에 따른 이뮤노글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 12에 따른 이뮤노글로불린 중쇄 및 서열 35에 따른 이뮤노글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 12에 따른 이뮤노글로불린 중쇄 및 서열 25에 따른 이뮤노글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 12에 따른 이뮤노글로불린 중쇄 및 서열 13에 따른 이뮤노글로불린 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 a) 서열 14를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄, 및 b) 서열 44, c) 서열 54, d) 서열 36, e) 서열 26, 또는 f) 서열 15를 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 14에 따른 이뮤노글로불린 중쇄 및 서열 44에 따른 이뮤노글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 14에 따른 이뮤노글로불린 중쇄 및 서열 54에 따른 이뮤노글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 14에 따른 이뮤노글로불린 중쇄 및 서열 36에 따른 이뮤노글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 14에 따른 이뮤노글로불린 중쇄 및 서열 26에 따른 이뮤노글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 14에 따른 이뮤노글로불린 중쇄 및 서열 15에 따른 이뮤노글로불린 경쇄를 포함한다.
본 개시내용의 한 측면에서, 본 개시내용의 구체적 실시양태에 따른 단리된 항체 또는 분자와 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질이 제공된다.
한 실시양태에서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 Arg78, Glu80, 및 Trp90을 포함하는 IL-17A 에피토프, 예컨대 인간 IL-17A 에피토프에 결합한다.
IL-17A 에피토프는 추가로 Tyr85 또는 Arg124를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, IL-17A 에피토프, 예컨대 인간 IL-17A 에피토프는 추가로 Pro82, Ser87 또는 Val88 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시내용의 한 측면에서, 구체적 실시양태에 따른 항체 또는 분자와 동등한 에피토프 인식 특성을 갖는 항원 인식 표면을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질이 제공된다.
본 개시내용의 한 측면에서, 구체적 실시양태에 따른 적어도 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질에 의해 IL-17A, 예컨대 인간 IL-17A, 또는 IL-17AF, 예컨대 인간 IL-17AF에 대한 결합이 교차-차단되는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질이 제공된다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 a) 인간 IL-17F 동종이량체, IL-17B 동종이량체, IL-17C 동종이량체, IL-17D 동종이량체, IL-17E 동종이량체 중 어느 하나 이상, 및/또는 b) 시노몰구스 원숭이 IL-17F 동종이량체, 마우스 IL-17F 동종이량체 중 어느 하나 이상, 및/또는 c) IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, gIFN, TNF 알파, EGF, GMCSF, TGF 베타 2로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 인간 시토카인 중 어느 하나 이상, 및/또는 d) IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL18, IL23, IFN 또는 TNF로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 마우스 시토카인 중 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하지 않는다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 IL-17A, 예컨대 인간 IL-17A에 결합하여, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 IL-17A와 그의 수용체 사이의 결합을 억제하거나 차단하고, IL-17A 활성을 감소시키거나 중화시킨다.
한 실시양태에서, 인간 IL-17A에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질의 결합 친화도는 비아코어(Biacore)™에 의한 측정 시 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하, 또는 10 pM 이하이다. 구체적 실시양태에서, 인간 IL-17A에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질의 결합 친화도는 비아코어™에 의한 측정 시 200 pM 미만, 또는 100 pM 미만이다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은, 바람직하게는 배양된 연골세포 또는 섬유모세포를 사용하여, 시험관내에서 평가 시 IL-6 분비 또는 GRO-알파 분비를 억제할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 생체내 항원 유발 관절염 실험 모델, 예컨대 래트 AIA-모델에서 무릎 종창을 억제할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 추가의 활성 모이어티에 접합된다.
항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분, 바람직하게는 키메라, 인간화 또는 인간 항체 또는 그의 부분일 수 있다.
본 개시내용의 한 측면에서, 본 개시내용의 실시양태에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질을 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 추가의 활성 성분을 포함한다.
한 구체적 실시양태에서, 상기 제약 조성물은 동결건조물이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 제약 조성물은 바람직하게는 사전-충전 시린지로서 제조된, 치료상 허용되는 양의 본 개시내용의 항체 또는 분자를 포함하는 액체 제제이다.
본 개시내용은 추가로, 보다 바람직하게는 IL-17A에 의해 매개되거나 또는 IL-17A 신호전달, 또는 IL-6 또는 GRO-알파 분비의 억제에 의해 치료될 수 있는 병리학적 장애의 치료를 위한 의약으로서 사용하기 위한, 본 개시내용의 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질, 특히 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 항체의 용도에 관한 것이다.
한 구체적 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 자가면역 및 염증성 장애, 예컨대 관절염, 류마티스 관절염, 건선, 만성 폐쇄성 폐 질환, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 천식, 다발성 경화증 또는 낭성 섬유증의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용의 한 측면에서, IL-17A에 의해 매개되거나 또는 IL-6 또는 GRO-알파 분비를 억제하는 것에 의해 치료될 수 있는 병리학적 장애의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서의 본 개시내용의 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질, 특히 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 항체의 용도가 제공된다.
한 구체적 실시양태에서, IL-17A에 의해 매개되거나 또는 IL-6 또는 GRO-알파 분비를 억제하는 것에 의해 치료될 수 있는 병리학적 장애는 염증성 장애 또는 상태, 예컨대 관절염, 류마티스 관절염, 건선, 만성 폐쇄성 폐 질환, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 천식, 다발성 경화증 또는 낭성 섬유증이다.
본 개시내용의 한 측면에서, 유효량의 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 분자, 특히 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 항체를 투여하여 상태를 완화시키는 것을 포함하는, IL-17A에 의해 매개되거나 또는 IL-6 또는 GRO-알파 분비를 억제하는 것에 의해 치료될 수 있는 병리학적 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 상태는 염증성 장애 또는 상태, 예컨대 관절염, 류마티스 관절염, 건선, 만성 폐쇄성 폐 질환, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 천식, 다발성 경화증 또는 낭성 섬유증이다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질을 생산하는 수단에 관한 것이다. 이러한 수단은 본 개시내용의 항체 또는 단백질의 적어도 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역(들)을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 또는 이러한 핵산을 포함하는, 특히 본 개시내용에 따른 항체 또는 단백질, 예를 들어 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5의 숙주 세포에서의 재조합 생산을 위한 클로닝 발현 벡터를 포함한다. 구체적 실시양태에서, 이러한 클로닝 또는 발현 벡터는 서열 18, 31, 51, 19, 28, 32, 38, 40, 46, 48, 52, 56, 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된, 서열 16, 29, 49, 17, 27, 30, 37, 39, 45, 47, 50, 55, 및 57로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 및 경쇄 서열의 코딩 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
한 실시양태에서, 핵산 분자는 메신저 RNA (mRNA)이다.
본 개시내용은 추가로 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 숙주 세포를 배양하고, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질, 특히 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5를 정제 및 회수하는 것을 포함하는 상기 항체 또는 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.
정의
본 개시내용을 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재되어 있다.
용어 "면역 반응"은 병원체가 침입한 인간 신체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적인 손상, 그의 파괴 또는 그로부터의 제거를 야기하는, 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산되는 가용성 거대분자 (항체, 시토카인 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
"신호 전달 경로" 또는 "신호전달 활성"은 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로의 신호의 전송을 야기하는 단백질-단백질 상호작용, 예컨대 수용체에 대한 성장 인자의 결합에 의해 일반적으로 개시되는 생화학적 인과 관계를 지칭한다. 일반적으로, 전송은 신호 전달을 유발하는 일련의 반응에서 하나 이상의 단백질 상의 하나 이상의 티로신, 세린 또는 트레오닌 잔기의 특이적 인산화를 수반한다. 끝에서 두번째 과정은 유전자 발현에서의 변화를 야기하는 핵 이벤트를 전형적으로 포함한다.
자연 발생 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적인 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 일반적으로, 각 중쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 각 경쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 존재한다.
주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" numbering scheme)]에 기재된 것을 비롯하여 널리 공지된 다수의 스킴 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 전형적인 포맷의 경우에, 카바트 하에, 중쇄 가변 도메인 (VH) 내의 CDR 아미노산 잔기는 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3)로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인 (VL) 내의 CDR 아미노산 잔기는 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), 및 89-97 (LCDR3)로 넘버링된다. 코티아 하에, VH 내의 CDR 아미노산은 26-32 (HCDR1'), 52-56 (HCDR2'), 및 95-102 (HCDR3')로 넘버링되고; VL 내의 아미노산 잔기는 26-32 (LCDR1'), 50-52 (LCDR2'), 및 91-96 (LCDR3')으로 넘버링된다. 카바트 및 코티아 둘 다의 CDR 정의를 조합함으로써, CDR은 인간 VH 내의 아미노산 잔기 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3) 및 인간 VL 내의 아미노산 잔기 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), 및 89-97 (LCDR3)로 이루어진다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 단순히 "항원 부분")은 항원 (예를 들어, IL-17A의 부분)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체, 예컨대 단백질의 전장 또는 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al. 1989, Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 또는 이러한 항원-결합 부분을 포함하는 임의의 융합 단백질을 포함한다.
따라서, 용어 "항원-결합 부분"은 또한 하기 기재되는 바와 같은 대안적 프레임워크 또는 스캐폴드, 예컨대 낙타류 항체 또는 '비-항체' 분자 내에 포함될 수 있는 본 개시내용의 항체에 상응하는 부분을 지칭할 수 있다.
또한, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 형성하여 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어 문헌 [Bird et al. 1988, Science 242:423-426; 및 Huston et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)를 형성하는 단일쇄 단백질로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 통상의 기술자에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, IL-17A, 예컨대 인간 IL-17A에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 IL-17A 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). IL-17A에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는, 그러나, 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 IL-17A 분자, 또는 IL-17A 이종이량체, 예컨대 IL-17AF에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 디스플레이한다.
용어 IL-17A는 달리 기재되지 않는 한 서열 76 또는 서열 78에 정의된 바와 같은 인간 IL-17A를 지칭한다. 용어 IL-17F는 달리 기재되지 않는 한 서열 77에 정의된 바와 같은 인간 IL-17F를 지칭한다. IL-17AF는 통상의 기술자에 의해 인식될 바와 같이, IL-17A 서브유닛 및 IL-17F 서브유닛의 이종이량체이다. 접두어 "r"로 지정되는, 상이한 종으로부터의 재조합 단백질이 하기 기재된 검정에 사용되었다. 예를 들어, 재조합 인간 IL-17A는 rhuIL-17로 지정된다. 통상의 기술자는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 출발 물질 및 표준 프로토콜을 사용하여 이러한 단백질을 발현시키는 방법을 알고 있다. 그러나, 통상의 기술자에게 도움이 되도록, 달리 언급되지 않는 한, 하기 아미노산 서열을 사용할 수 있다: 시노몰구스 원숭이 (시노) IL-17A, 서열 79; 시노IL-17F, 서열 80; 레서스 원숭이 (레서스) IL-17A, 서열 81; 마모셋 원숭이 (마모셋) IL-17A, 서열 82; 마우스 (m) IL-17A, 서열 83; mIL-17F, 서열 84; 래트 IL-17A, 서열 85; 인간 IL-17 수용체 A (huIL-17RA), 서열 86. 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이, 상기 언급된 서열은 상이한 집단 군으로부터 유래됨으로 인해 약간 다를 수 있다. 실시예에서, 예를 들어 스크리닝 목적으로 도구 항체가 또한 사용된다. 이러한 항체는 표준 항체이고, 통상의 기술자에 의해 용이하게 수득될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기로 이루어지고, 통상적으로 특이적 3차원 구조적 특징, 뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 및 비입체형태적 에피토프는, 전자에 대한 결합은 변성 용매의 존재 하에 상실되지만 후자에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 부류 (예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다. 이소형은 또한 Fc 기능을 변경시키는 변형, 예를 들어 이펙터 기능 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 증진시키거나 감소시키는 변형이 이루어진, 이들 부류 중 하나의 변형된 버전을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역이 둘 다 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역 또한 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 배선 서열, 또는 인간 배선 서열의 돌연변이체 버전, 또는 예를 들어 문헌 [Knappik, et al. 2000, J Mol Biol 296:57-86]에 기재된 바와 같은 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다.
"인간화" 항체는 인간에서 덜 면역원성이면서 비-인간 항체의 반응성을 보유하는 항체이다. 이것은, 예를 들어 비-인간 CDR 영역을 보유시키고 항체의 나머지 부분을 그의 인간 대응부 (즉, 불변 영역 뿐만 아니라 가변 영역의 프레임워크 부분)로 대체하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855; Morrison and Oi, 1988, Adv. Immunol., 44:65-92; Verhoeyen et al. 1988, Science, 239:1534-1536; Padlan 1991, Molec. Immun., 28:489-498; 및 Padlan 1994, Molec. Immun., 31:169-217]을 참조한다. 인간 조작 기술의 다른 예는 US 5,766,886에 개시된 조마(Xoma) 기술을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내에서의 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그라프트된 항체를 포함하는 것으로 의도되는 것은 아니다.
용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역이 둘 다 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 디스플레이하는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스), 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 특정 실시양태에서, 그러나, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우에, 생체내 체세포 돌연변이유발)될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에 사용된 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 부류 (예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다.
어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 "IL-17A 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는" 항체 또는 단백질은 100nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하, 100pM 이하, 또는 10pM 이하의 KD로 인간 IL-17A 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 단백질을 지칭하는 것으로 의도된다. "IL-17A 이외의 항원과 교차-반응하는" 항체는 10nM 이하, 1 nM 이하, 또는 100 pM 이하의 KD로 항원에 결합하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. "특정한 항원과 교차-반응하지 않는" 항체는 100 nM 이상의 KD, 또는 1 μM 이상의 KD, 또는 10 μM 이상의 KD로 항원에 결합하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, 항원과 교차-반응하지 않는 이러한 항체는 표준 결합 검정에서 이들 단백질에 대해 본질적으로 검출가능하지 않은 결합을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭하는 것으로 의도되는 반면에, 본원에 사용된 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "KD"는 Ka에 대한 Kd의 비 (즉, Kd/Ka)로부터 수득되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되고, 몰 농도 (M)로 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같이 작동되는 표면 플라즈몬 공명을 사용하거나 또는 비아코어™ 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것에 의한다.
IL-17의 그의 수용체에 대한 결합의 억제는 하기 문맥에 기재되어 있는 검정을 비롯한 다양한 검정에서 편리하게 시험될 수 있다. 용어 "동일한 정도로"는 참조 및 등가의 분자가, 통계적 기준 하에, 본원에 언급된 검정 중 하나에서 본질적으로 동일한 IL-17 억제 활성을 나타낸다는 것을 의미한다 (실시예 참조). 예를 들어, 본 개시내용의 IL-17 결합 분자는 전형적으로, 인간 피부 섬유모세포에서 인간 IL-17에 의해 유도되는 IL-6 생산에 대한 인간 IL-17의 억제에 대해, 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같은 검정 시, 각각의 참조 분자의 반수 최대 억제 농도 (IC50)의 +/-105 이내, 즉 10 nM 미만, 보다 바람직하게는 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2 nM, 바람직하게는 그와 실질적으로 동일한 IC50을 갖는다. 대안적으로, 사용되는 검정은 본 개시내용의 가용성 IL-17 수용체 및 IL-17 결합 분자에 의한 IL-17의 결합의 경쟁적 억제 검정일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서의 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 수많은 부위에서 약한 비-공유 힘을 통해 항원과 상호작용하고; 상호작용이 더 많을수록 친화도가 더 강하다. 본원에 사용된 IgG 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, Fab 단편)에 대한 용어 "높은 친화도"는 표적 항원에 대해 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M, 또는 10-11 M 이하, 또는 10-12 M 이하, 또는 10-13 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, 높은 친화도 결합은 다른 항체 이소형에 대해 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 높은 친화도 결합은 10-7 M 이하, 또는 10-8 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "결합력"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도에 관한 유익한 척도를 지칭한다. 이는 3가지 주요 인자: 항체 에피토프 친화도; 항원 및 항체 둘 다의 원자가; 및 상호작용 부분의 구조적 배열에 의해 제어된다. 궁극적으로, 이들 인자는 항체의 특이성, 즉 특정한 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합할 가능성을 정의한다.
본원에 사용된 IL-17A의 IL-17R에 대한 결합을 억제하는 항체 또는 단백질은 시험관내 경쟁적 결합 검정에서 측정 시 IL-17A의 IL-17R에 대한 결합을 10nM 이하의 IC50, 바람직하게는 1nM 이하의 IC50, 보다 바람직하게는 100pM 이하의 IC50로 억제하는 항체 또는 단백질을 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 검정은 하기 실시예에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "IL-17A 길항제" 또는 "IL-17A 차단 분자"는 IL-17R을 통한 IL-17A 유도된 신호전달 활성을 억제하여 IL-17A 활성을 감소시키거나 중화시키는 항체 또는 단백질을 지칭하는 것으로 의도된다. 이는 인간 세포 검정, 예컨대 인간 세포에서의 IL-17A 의존성 IL-6 또는 GRO-알파 생산 검정에서 밝혀질 수 있다. 이러한 검정은 하기 실시예에 보다 상세하게 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 단백질은 시험관내 인간 세포 검정에서 측정 시 10nM 이하, 1nM 이하, 또는 100pM 이하의 IC50에서 IL-17A 의존성 IL-6 또는 GRO-알파 생산을 억제한다. 이러한 검정은 하기 실시예에 보다 상세하게 기재되어 있다. 일부 실시양태에서 본 개시내용의 항체 또는 단백질은 마우스 및 래트에서의 생체내 검정에서 항원 유발 관절염을 억제한다. 이러한 검정은 하기 실시예에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "ADCC" 또는 "항체 의존성 세포 세포독성" 활성은 세포 고갈 활성을 지칭한다. ADCC 활성은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는, 표준 ADCC 검정에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 본 개시내용의 항체 또는 단백질에 대한 용어 "선택성"은 특정 표적 폴리펩티드에는 결합하지만 밀접하게 관련된 폴리펩티드에는 결합하지 않는 항체 또는 단백질을 지칭한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 및 그의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. (우리딘이 슈도우리딘에 의해 대체된 mRNA 분자, 그를 합성하는 방법, 및 생체내 치료 단백질의 전달 방법을 개시하고 있는 가리코(Kariko) 등의 미국 특허 번호 8,278,036 참조.) 예를 들어 가리코 등의 미국 특허 번호 8,278,036; 및 모데르나(Moderna)의 특허 출원 WO2013/090186A1에 개시되어 있는, mRNA를 포장하는 방법이 사용될 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP 및 상보적 서열 뿐만 아니라 명확하게 명시된 서열을 또한 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "시노" 또는 "시노몰구스"는 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "레서스" 또는 "레서스 마카크"은 레서스 마카크 원숭이 (마카카 물라타(Macaca mulatta))를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "마모셋"은 마모셋 원숭이를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 임의의 질환 또는 장애 (즉, 류마티스 관절염)를 "치료하는" 또는 "치료"는, 한 실시양태에서, 질환 또는 장애를 개선하는 것 (즉, 질환 또는 그의 임상 증상 중 적어도 하나의 발달을 둔화 또는 저지 또는 감소시키는 것)을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 환자에 의해 식별가능하지 않을 수 있는 것을 비롯한 적어도 하나의 물리적 파라미터를 완화 또는 개선하는 것을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애를 물리적으로 (예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화), 생리학적으로 (예를 들어, 물리적 파라미터의 안정화), 또는 둘 다로 조절하는 것을 지칭한다. 질환의 치료 및/또는 예방을 평가하는 방법은, 본원에 구체적으로 기재되어 있지 않으면, 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있다.
본원에 사용된, 환자와 관련하여 "선택하는" 및 "선택된"은 특정한 환자가 미리 결정된 기준을 가짐으로 인해 보다 많은 수의 환자군으로부터 특정한 환자를 구체적으로 선별하는 것을 의미하는 것으로 사용된다. 유사하게, "환자를 선택적으로 치료하는"은 특정한 환자가 미리 결정된 기준을 가짐으로 인해 보다 많은 수의 환자군으로부터 구체적으로 선별된 환자에게 치료를 제공하는 것을 지칭한다. 유사하게, "선택적으로 투여하는"은 특정한 환자가 미리 결정된 기준을 가짐으로 인해 보다 많은 수의 환자군으로부터 구체적으로 선별된 환자에게 약물을 투여하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "최적화된"은 뉴클레오티드 서열이 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어 피키아(Pichia) 세포 또는 트리코더마(Trichoderma) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경된 것을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은, 또한 "모" 서열로도 공지되어 있는 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 코딩된 아미노산 서열을 완전하게 또는 가능한 한 많이 보유하도록 조작된다. 최적화된 서열은 본원에서 CHO 포유동물 세포에 바람직한 코돈을 갖도록 조작되지만, 다른 진핵 세포에서의 이들 서열의 최적화된 발현이 또한 본원에서 고려된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열도 또한 최적화된 것으로 지칭된다.
본원에 사용된 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100). 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 기재된 바와 같은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.
2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 포함된 알고리즘 [E. Meyers and W. Miller 1988, Comput. Appl. Biosci., 4:11-17]을 사용하여 결정할 수 있다. 대안적으로, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 블로섬(Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 입수가능함) 내의 GAP 프로그램에 포함된 알고리즘 [Needleman and Wunsch 1970, J. Mol, Biol. 48:444-453]을 사용하여 결정할 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 또한 디폴트로서 워드 길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M=5, N=4 및 두 가닥의 비교를 사용하여, 예를 들어 핵산 서열에 대한 알고리즘, 예컨대 BLASTN 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다.
용어 "교차-차단", "교차-차단된" 및 "교차-차단하는"은 본원에서, 표준 경쟁적 결합 검정에서 다른 항체 또는 결합제가 IL-17A에 결합하는 것을 방해하는 항체 또는 다른 결합체의 능력을 의미하는 것으로 상호교환적으로 사용된다.
항체 또는 다른 결합체, 예컨대 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질이 IL-17A에 대한 또 다른 항체 또는 결합 분자의 결합을 방해할 수 있는 능력 또는 정도, 및 이로써 그것이 본 개시내용에 따라 교차-차단하는 것으로 언급될 수 있는지 여부는 표준 경쟁 결합 검정을 사용하여 결정할 수 있다. 하나의 적합한 검정은 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 비아코어™ 기술 (예를 들어, 비아코어™ 3000 기기 (비아코어™, 스웨덴 웁살라)를 사용하는 것에 의함)의 사용을 수반한다. 교차-차단을 측정하기 위한 또 다른 검정은 ELISA-기반 접근법을 사용한다. 이들 방법에 대한 추가의 상세한 내용은 실시예에 제공된다.
예를 들어, 여기서 예시된 항체 (즉 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5) 및 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 모두 서로 "교차-차단"할 것이다. 이들 항체는 모두 IL-17A 상의 동일한 에피토프를 표적으로 한다. 다른 교차-차단 항체는 동일하거나 관련된 에피토프에 결합할 것으로 예상된다.
본 개시내용에 따르면, 본 개시내용에 따른 교차-차단 항체 또는 다른 결합체, 예컨대 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 기재된 비아코어™ 교차-차단 검정에서 항체 또는 결합제의 조합물 (혼합물)의 기록된 결합이 조합된 2개의 항체 또는 결합제의 최대 이론적 결합 (상기 정의된 바와 같음)의 80% 내지 0.1% (예를 들어 80% 내지 4%), 구체적으로 최대 이론적 결합의 75% 내지 0.1% (예를 들어 75% 내지 4%), 보다 구체적으로 70% 내지 0.1% (예를 들어 70% 내지 4%), 보다 구체적으로 최대 이론적 결합의 65% 내지 0.1% (예를 들어 65% 내지 4%)이도록 IL-17A에 결합한다.
용액 상 항-IL-17A 항체가 용액 상 항-IL-17A 항체의 부재 하에 (즉, 양성 대조군 웰) 수득된 IL-17A 검출 신호와 비교하여, IL-17A 검출 신호 (즉, 코팅된 항체에 의해 결합된 IL-17A의 양)의 60% 내지 100%, 구체적으로 70% 내지 100%, 보다 구체적으로 80% 내지 100%의 감소를 유발할 수 있는 경우에, 항체는 실시예에 기재된 바와 같은 ELISA 검정에서 교차-차단하는 것으로서 정의된다.
발명의 상세한 설명
본 개시내용은, 부분적으로, 동종이량체 IL-17A 및 이종이량체 IL-17AF에는 특이적으로 결합하지만, 동종이량체 IL-17F에는 특이적으로 결합하지 않는 항체 분자의 발견에 기초한다. 본 개시내용은 이하에서 추가로 기재될 전장 IgG 포맷 항체 뿐만 아니라 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질 둘 다에 관한 것이다.
따라서, 본 개시내용은 예컨대 시노몰구스, 레서스 마카크, 마모셋, 래트, 마우스 또는 인간 중 1종 이상으로부터 선택된 여러 종에 대해 놀랍게도 유사한 결합 능력을 갖는 항체 뿐만 아니라 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질, 뿐만 아니라 제약 조성물, 생산 방법, 및 이러한 항체 및 조성물의 사용 방법을 제공한다.
재조합 항체
본 개시내용의 항체는 인간 재조합 항체 XAB1, 및 유래되고, 단리되고, 하기 표 1에 기재된 바와 같은 그의 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열에 의해 구조적으로 특성화된 항체 유도체 XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5를 포함한다.
<표 1> XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열.
Figure 112015085607095-pct00001
본 개시내용의 이러한 단리된 항체 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 상응하는 가변 영역, VH 및 VL 아미노산 서열이 하기 표 2에 제시되어 있다.
<표 2> XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열.
Figure 112015085607095-pct00002
본 개시내용의 다른 항체는 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이되었지만 상기 기재된 항체에 대해, 특히 상기 기재된 서열에 도시된 CDR 영역에서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산을 갖는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 상기 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 비교하여 CDR 영역에서 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함하는, XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5 중 어느 하나의 돌연변이 변이체이다.
XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 전장 경쇄 및 중쇄 뉴클레오티드 코딩 서열이 하기 표 3에 제시되어 있다.
<표 3> 전장 중쇄 및 경쇄 DNA 코딩 서열.
Figure 112015085607095-pct00003
XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 가변 경쇄 및 중쇄 뉴클레오티드 코딩 서열이 하기 표 4에 제시되어 있다.
<표 4> 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열 DNA 코딩 서열.
Figure 112015085607095-pct00004
본 개시내용의 항체를 코딩하는 다른 핵산은 뉴클레오티드 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이되었지만 상기 기재된 서열 또는 하기 표 5 및 표 6에 도시된 코딩 영역에 상응하는 CDR에 대해 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 100 퍼센트 동일성을 갖는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이는 CDR 코딩 영역에서 뉴클레오티드 결실, 삽입 또는 치환에 의해 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 뉴클레오티드가 상기 기재된 서열 또는 하기 표 5 및 표 6에 도시된 CDR 코딩 영역으로 변화된 변이체 핵산을 포함한다.
동일한 에피토프에 결합하는 항체의 경우에, VH, VL, 전장 경쇄, 및 전장 중쇄 서열 (뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열)은 "혼합 및 매칭"되어 본 개시내용의 다른 항-IL-17A 결합 분자를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 항체의 IL-17A 결합을 상기 기재된 결합 검정 또는 다른 통상의 결합 검정 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 시험할 수 있다. 이들 쇄가 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 전장 중쇄 / 전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 전장 중쇄 / 전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다. 따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 서열 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 13, 25, 35, 43 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 단리된 재조합 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질을 제공하며; 여기서 상기 중쇄 및 경쇄 영역은 항체가 IL-17A에 특이적으로 결합되도록 선택된다.
본 개시내용에 따른 일부 항체 및 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질의 VH CDR1 (또한 사용되는 CDR 정의에 따라 HCDR1 또는 HCDR1'로 불림), VH CDR2 (또한 사용되는 CDR 정의에 따라 HCDR2 또는 HCDR2'로 불림), VH CDR3 (또한 사용되는 CDR 정의에 따라 HCDR1 또는 HCDR1'로 불림), VL CDR1 (또한 사용되는 CDR 정의에 따라 LCDR1 또는 LCDR1'로 불림), VL CDR2 (또한 사용되는 CDR 정의에 따라 LCDR2 또는 LCDR2'로 불림), VL CDR3 (또한 사용되는 CDR 정의에 따라 HCDR3 또는 HCDR3'로 불림)의 아미노산 서열의 예가 표 5 및 표 6에 제시되어 있다.
표 5에서, 본 개시내용의 일부 항체의 CDR 영역은 카바트 시스템을 사용하여 서술된다 (문헌 [Kabat, E. A., et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 또한 문헌 [Zhao&Lu 2009, Molecular Immunology 47:694-700] 참조).
읽기 쉽도록, CDR 영역이 카바트 정의에 따라 서술된 경우에, 이를 이하에서 각각 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3으로 부른다.
<표 5> 카바트 정의에 따른 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 CDR 영역.
Figure 112015085607095-pct00005
컨센서스 서열 서열 73, 서열 74 및 서열 75는 X로 지정된 다수의 가변 아미노산을 포함한다. XAB2 내지 XAB5에 대한 서열의 서열 정렬에 기초하여, 서열 73 내의 4개의 가변 아미노산은 하기에 따라 유리하게 선택될 수 있으며: 제1 가변 아미노산 (X1)은 Gly (G) 및 Val (V)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 제2 가변 아미노산 (X2)은 Tyr (Y), Asn (N) 및 Ile (I)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 제3 가변 아미노산 (X3)은 Trp (W) 및 Ser (S)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 제4 가변 아미노산 (X4)은 Glu (E) 및 Ala (A)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 서열 9는 서열 22와 비교하여 91%의 서열 동일성을 갖고, 서열 34 및 서열 42와 비교하여 73%의 서열 동일성을 갖는다. 서열 22는 서열 34 및 서열 42와 비교하여 64%의 서열 동일성을 갖는다. 서열 34는 서열 42와 비교하여 91%의 서열 동일성을 갖는다.
유사하게, 서열 74에서 1개의 가변 아미노산은 하기에 따라 유리하게 선택될 수 있으며: X1은 Asn (N) 및 Gln (Q)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 서열 10은 서열 23과 비교하여 86%의 서열 동일성을 갖는다.
서열 75에서 1개의 가변 아미노산은 하기에 따라 유리하게 선택될 수 있으며: X1은 Asn (N) 및 Asp (D)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 서열 11은 서열 24와 비교하여 89%의 서열 동일성을 갖는다.
표 6에서, 본 개시내용의 일부 항체의 CDR 영역은 코티아 시스템, [Al-Lazikani et al. 1997, J. Mol. Biol. 273:927-948]을 사용하여 서술된다. 읽기 쉽도록, CDR 영역이 코티아 정의에 따라 서술된 경우에, 이를 이하에서 각각 HCDR1', HCDR2', HCDR3', LCDR1', LCDR2', LCDR3'로 부른다.
<표 6> 코티아 정의에 따른 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5로부터의 CDR 영역.
Figure 112015085607095-pct00006
컨센서스 서열 서열 71 및 서열 72는 X로 지정된 다수의 가변 아미노산을 포함한다. XAB2 내지 XAB5에 대한 서열의 서열 정렬에 기초하여, 서열 71 내의 4개의 가변 아미노산은 하기에 따라 유리하게 선택될 수 있으며: 제1 가변 아미노산 (X1)은 Gly (G) 및 Val (V)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 제2 가변 아미노산 (X2)은 Tyr (Y), Asn (N) 및 Ile (I)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 제3 가변 아미노산 (X3)은 Trp (W) 및 Ser (S)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 제4 가변 아미노산 (X4)은 Glu (E) 및 Ala (A)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 서열 4는 서열 20과 비교하여 86%의 서열 동일성을 갖고, 서열 33 및 서열 41과 비교하여 57%의 서열 동일성을 갖는다. 서열 20은 서열 33 및 서열 41과 비교하여 43%의 서열 동일성을 갖는다. 서열 33은 서열 41과 비교하여 86%의 서열 동일성을 갖는다.
유사하게, 서열 72에서 1개의 가변 아미노산은 하기에 따라 유리하게 선택될 수 있으며: X1은 Asn (N) 및 Asp (D)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 서열 6은 서열 21과 비교하여 86%의 서열 동일성을 갖는다.
각각의 이들 항체가 IL-17A에 결합할 수 있고, 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공됨을 고려하면, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있다 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있고, VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유하는 각각의 항체는 본 개시내용의 다른 항-IL-17A 결합 분자를 생성함). 이러한 "혼합 및 매칭"된 항체의 IL-17A 결합은 상기 및 실시예에 기재된 결합 검정 또는 다른 통상의 검정 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 시험될 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 신규 VH 및 VL 서열은 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역(들) 서열(들)을 본 개시내용의 모노클로날 항체에 대해 본원에 제시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환하는 것에 의해 생성될 수 있다는 것은 통상의 기술자에게 용이하게 인식될 것이다.
한 실시양태에서, 단리된 재조합 항체, 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 7에 따른 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 8에 따른 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 3에 따른 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 9, 22, 34, 42, 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 서열 9, 22, 34, 42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 10, 23, 및 74로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 서열 10 및 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 11, 24, 및 75로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 서열 11 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 가지며; 여기서 상기 CDR 영역은 본 개시내용의 항체 또는 단백질이 IL-17A에 특이적으로 결합하도록 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 단리된 재조합 항체, 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 1에 따른 중쇄 가변 영역 HCDR1'; 서열 2에 따른 중쇄 가변 영역 HCDR2'; 서열 3에 따른 중쇄 가변 영역 HCDR3'; 서열 4, 20, 33, 41, 및 71로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 서열 4, 20, 33, 41로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 LCDR1'; 서열 5에 따른 경쇄 가변 영역 LCDR2'; 및 서열 6, 21, 및 72로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 서열 6 및 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 LCDR3'을 가지며; 여기서 상기 CDR 영역은 본 개시내용의 항체 또는 단백질이 IL-17A에 특이적으로 결합하도록 선택된다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 서열 7, 서열 8 및 서열 3; 서열 12; 또는 서열 14를 포함한다.
본원에 사용된 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득된 경우에 특정한 배선 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화하거나, 또는 파지 상에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 서열상 가장 근접한 (즉, 최대 % 동일성) 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인할 수 있다. 특정한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 배선 서열과 비교 시, 예를 들어 자연 발생 체세포 돌연변이, 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인한 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 전형적으로 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열이 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 뮤린 배선 서열)과 비교하여 인간 항체가 인간의 것임을 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열이 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정한 인간 배선 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 디스플레이할 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 디스플레이할 수 있다.
본 개시내용에서, IL-17A 상의 에피토프는 잠재적인 치료 항체의 결합을 위한 표적으로서 특히 바람직한 것으로 확인되었다. 이러한 에피토프는 XAB1, 및 XAB1의 서열의 변형에 의해 개발된 변이체 항체 XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5에 의해 결합된다. 이러한 에피토프는 IL-17A 서열 상에서, 잔기 Arg 78과 Trp 90 사이에서 발견된다.
에피토프는 IL-17A 내로부터의 하기 가장 바람직한 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 간주될 수 있다: Arg 78, Glu 80, Trp 90. 또한, 하기 아미노산 잔기가 또한 바람직하다: Tyr 85, Arg 124. 다른 중요한 아미노산 잔기는 Pro 82, Ser 87, Val 88이다. 추가로 기여하는 아미노산 잔기는 Val 45*, Leu 49, Asp 81, Glu 83, Pro 86, Pro 130, Phe 133, Lys 137*이며, 여기서 (*)로 표시된 아미노산은 동종이량체 IL-17A의 제2 IL-17A 서브유닛에 의해 기여되는 잔기를 지정한다.
이러한 IL-17A 상의 에피토프를 표적으로 하는 항체는 IL-17A의 그의 수용체에 대한 결합을 차단하여 IL-17A 매개된 시험관내 효과를 억제하고, 항원 유발 관절염의 실험적 생체내 모델의 중증도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이러한 에피토프에 결합하는 항체는 예상외로, IL-17AF 이종이량체에 의해 매개되는 시험관내 효과를 억제하고, 또한 마우스로부터 유래된 IL-17A 및 IL-17AF 및 표적 분자의 다른 종 변형에 대해 예상외의 높은 친화도를 보유하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 이러한 에피토프는 그것이 또한 예상외로 IL-17AF 이종이량체의 구조 내의 접근가능한 포맷 내에 보존되어 있기 때문에 특히 바람직하다. 따라서, 본 개시내용의 바람직한 항체는 또한 IL-17AF 이종이량체에 결합할 것이다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, IL-17AF 이종이량체의 구조가 IL-17A와 충분히 유사하거나 또는 본 개시내용의 항체와의 상호작용이 이를 IL-17A와 충분히 유사하게 만들어, 결합이 여전히 발생할 수 있는 것으로 예상된다.
이는 인 실리코 예측과 조합된 X선 결정학 (관련 기술분야에 공개되어 있고 본 발명자들에 의해 수행됨)에 의해 수득된, IL-17A, IL-17F에 대해 입수가능한 구조 및 이들 분자와 항체 또는 수용체 사이의 상호작용에 기초한 구조적 분석이, 본 개시내용의 항체에 대한 결합 또는 그와 IL-17AF의 교차-반응성이 반드시 일어나지 않을 것임을 시사하였기 때문에 예상치 못한 것이다. 보다 구체적으로, 이종이량체의 IL-17F 단량체 서브유닛의 N-말단 영역은 IL-17AF 이종이량체에 대한 본 개시내용의 항체의 결합을 입체적으로 방해하는 것으로 예측되었다. 따라서 항체가 IL-17AF와 유의하게 교차-반응성이지는 않을 것으로 예상되었다.
그러나, 이러한 예측에도 불구하고, 본 발명자들은 개시된 항체에 의해 IL-17AF에 대한 교차-결합이 일어남을 결정하였다. 이는 실제로 수많은 이유로 유리할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, IL-17AF도 또한 염증유발 시토카인으로서 관련되고, IL-17A에 대해 기재되어 있거나 의심되는 많은 동일한 병리학적 상태 또는 바람직하지 않은 생물학적 사건에 수반될 수 있다. 따라서 본 개시내용의 항체는 IL-17A 및 IL-17AF를 둘 다 표적으로 하거나 또는 방해할 수 있기 때문에 치료상 특히 유익할 수 있다.
더욱이, 본 발명자들은 본 개시내용의 항체와 IL-17AF 사이의 이러한 결합이 또한 시험관내 검정에서 관측 시, IL-17AF의 생물학적 활성의 억제와 관련이 있음을 입증하였다. 따라서, 본 개시내용의 항체는 IL-17A의 활성 뿐만 아니라 IL-17AF의 활성도 효과적으로 표적화하고 길항/중화시킨다.
본 발명자들에 의해 수행된 작업의 추가의 예상외의 결과는 다음과 같다. 원래의 '모' 항체 XAB1의 친화도 성숙은 또한 시노몰구스, 레서스 마카크, 마모셋, 래트 또는 마우스와 같은 다른 종으로부터 유래된 IL-17A 변이체에 대해 높은 친화도 또는 개선된 친화도를 보유하는 항체 세트를 생성한다.
이는 본 개시내용의 항체의 인간 IL-17A에 대한 친화도를 개선하기 위한 노력에서, 생성된 항체의 IL-17A의 종 변이체에 대한 친화도를 또한 개선하리라고는 예상하지 못할 것이었기 때문에 예상치 못한 것이다. 실제로, 정상적으로는 그 반대가 예상될 수 있다. 표적 항원의 특정 종 변이체 (즉 인간)에 대한 항체 친화도를 개선하기 위한 노력은 통상적으로 그러한 항원의 다른 종 변이체에 대한 친화도는 감소시킬 것으로 예상될 것이다. 종 변이체 (또는 상동체/파라로그)의 개념은 주어진 종에 대한 공통 조상을 인식하지만, 진화 역사의 과정에서 분기가 발생함을 받아들인다. 따라서, 상이한 종에서 확인된 특정한 분자의 변이체 사이에 양호한 서열 보존 정도가 존재하더라도, 하나의 종 변이체에 대해 개선된 친화도가 또 다른 종 변이체에 대한 친화도에 대해 개선을 가질 것이라고 예상할 수는 없다. 실제로, 상이한 종에 대한 서열 사이의 분기는 일반적으로 하나의 변이체에 대한 친화도에서의 개선이 또 다른 종 변이체에 대한 결합 친화도를 감소시킬 (또는 심지어 무효화할) 가능성이 더 높을 것이라고 예상하게 한다. 마우스 및 인간 IL-17A 사이의 서열 동일성은 단지 62%이다 (Moseley et al. 2003, Cytokine & Growth Factor Reviews 14:155-174).
그러나, 본 발명의 경우에서 이는 관측되지 않았고, 본 발명자들에 의해 생성된 항체 변이체는 다른 종으로부터의 IL-17A 변이체에 대해 높은 친화도를 보유하였다. 이는 유용한 치료 분자로서 후보 항체 분자를 개발하는데 필요한 작업 동안, 다른 종 (예컨대 시노몰구스, 레서스 마카크, 마모셋, 래트 또는 마우스)에서, 또는 다른 종으로부터 유래되거나 그의 구성요소를 포함하는 세포, 분자 또는 시스템에 대해 수행되어야 할 수많은 시험 및 검정이 요구될 수 있기 때문에 유용하다. 이는 본 개시내용의 항체를 추가 개발에 특히 적합하게 만든다.
따라서, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 IL-17A에 대한 높은 친화도, 마우스, 래트, 시노몰구스 및 마모셋과 같은 다른 종으로부터의 IL-17A와의 교차-반응성, IL-17F와 같은 다른 IL-17 이소형에 대한 교차-반응성의 결여, 다른 시토카인 (예컨대 인간 또는 마우스 시토카인)에 대한 교차-반응성의 결여, 이종이량체 IL-17AF와의 교차-반응성, IL-17A의 그의 수용체, 예컨대 IL-17RA에 대한 결합을 차단하는 능력, IL-17A 유도된 생물학적 효과, 예컨대 IL-6 또는 GRO-알파 분비의 자극을 억제하거나 중화시키는 능력, 및/또는 IL-17A (및/또는 IL-17AF)에 의해 매개되는 생체내 효과, 예컨대 항원 유발 관절염 모델에서 관측되는 종창을 억제하는 능력을 비롯한 바람직한 특성의 범위를 공유할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 항체 및 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 또한 느린 항체-IL17A 복합체의 제거, 느린 리간드 턴오버 및 긴 IL17A 포획 시간을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 이들 항체 및 단백질의 추가의 유리한 특성이 상술된 실시양태에 제공되어 있다.
상동 항체
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열; 전장 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열, 가변 영역 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열, 또는 가변 영역 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열, 또는 상기에서 특히 표 1에 기재된 항체 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 상동성인 모든 6개 CDR 영역 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 코딩 서열을 가지며, 여기서 본 개시내용의 항체 또는 단백질은 원래의 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
원래의 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5 항체의 목적하는 기능적 특성은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
(i) IL-17A에 대한 결합 친화도 (IL-17A에 대한 특이적 결합), 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같이 비아코어™ 검정에서 측정 시 예를 들어 KD가 1nM 이하, 100pM 이하, 또는 10pM 이하;
(ii) IL-17A에 대한 IL-17R 결합의 경쟁적 억제, 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같이 시험관내 경쟁적 결합 검정에서 측정 시 예를 들어 IC50이 10nM 이하, 또는 1nM 이하, 또는 100pM 이하;
(iii) IL-17A 의존성 활성, 예를 들어 IL-6 또는 GRO-알파의 생산의 억제, 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같이 세포 검정에서 측정 시 IC50이 10nM 이하, 또는 1nM 이하, 또는 100pM 이하;
(iv) 실시예에 기재된 바와 같이 생체내 항원 유발 관절염 검정에서 측정 시 관측되는 효과, 예를 들어 무릎 종창의 억제;
(v) 시노몰구스, 레서스 마카크, 래트 또는 마우스 IL-17A 폴리펩티드와의 교차-반응성;
(vi) 인간 또는 마우스 IL-17AF 폴리펩티드와의 교차-반응성;
(vii) IL-17AF에 대한 결합 친화도 (IL-17AF에 대한 특이적 결합), 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같이 비아코어™ 검정에서 측정 시 예를 들어 KD가 1nM 이하, 100pM 이하, 또는 10pM 이하;
(viii) IL-17AF의 억제, 실시예에 기재된 바와 같이 시험관내 경쟁적 결합 검정에서 측정 시 예를 들어 IC50이 200nM 이하, 150 nM 이하, 또는 100 nM 이하;
(ix) 약물 개발을 위한 적합한 특성, 특히 이는 안정하고, 제제 중 높은 농도, 즉 50mg/ml 초과의 농도에서 응집되지 않는다.
예를 들어, 본 개시내용은 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 상동 항체 (또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질)에 관한 것이며, 여기서 CDR 서열, 즉 6개의 CDR 영역; HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 또는 HCDR1', HCDR2', HCDR3', LCDR1', LCDR2', LCDR3'은 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5 중 적어도 하나의 항체의 상응하는 CDR 서열에 대해 적어도 60, 70, 90, 95 또는 100 퍼센트 서열 동일성을 공유하고, 상기 상동 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 IL-17A에 특이적으로 결합하고, 항체 또는 단백질은 하기 기능적 특성 중 적어도 1종을 나타낸다: IL-17A의 그의 수용체에 대한 결합을 억제하거나, 세포 검정에서 IL-17A 의존성 IL-6 또는 GRO-알파 생산을 억제하거나, 생체내 항원 유발 관절염 검정에서 관측되는 효과를 억제함. 관련된 구체적 실시양태에서, 상동 항체 또는 단백질은 IL-17A에 1nM 이하의 KD로 결합하고, 시험관내 경쟁적 결합 검정에서 측정 시 IL-17A의 그의 수용체에 대한 결합을 1nM 이하의 IC50으로 억제한다. XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 CDR은 상기 표 5 및 표 6에 정의되어 있다.
본 개시내용은 추가로 항체 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 어느 하나의 상응하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 80%, 90%, 또는 적어도 95% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 상동 항체 (또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질)에 관한 것이며; 상동 항체 또는 단백질은 IL-17A에 특이적으로 결합하고, 하기 기능적 특성 중 적어도 1종을 나타낸다: IL-17A의 그의 수용체(들)에 대한 결합을 억제하거나, 세포 검정에서 IL-17A 의존성 IL-6 또는 GRO-알파 생산을 억제하거나, 또는 생체내 항원 유발 관절염 검정에서 관측되는 효과를 억제함. 관련된 구체적 실시양태에서, 상동 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예컨대 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 IL-17A에 1nM 이하의 KD로 결합하고, 시험관내 경쟁적 결합 검정에서 측정 시 IL-17A의 그의 수용체(들)에 대한 결합을 1nM 이하의 IC50으로 억제한다. XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 VH 및 VL 아미노산 서열은 상기 표 2에 정의되어 있다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 포함하는 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 상동 항체 (또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질)에 관한 것이며, 여기서: 가변 중쇄는 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 가변 중쇄 및 경쇄의 상응하는 코딩 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 상동 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 IL-17A에 특이적으로 결합하고, 하기 기능적 특성 중 적어도 1종을 나타낸다: IL-17A의 그의 수용체(들)에 대한 결합을 억제하거나, 세포 검정에서 IL-17A 의존성 IL-6 또는 GRO-알파의 생산을 억제하거나, 또는 생체내 항원 유발 관절염 검정에서 관측되는 효과를 억제함. 관련된 구체적 실시양태에서, 상동 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 IL-17A에 1nM 이하의 KD로 결합하고, 시험관내 경쟁적 결합 검정에서 측정 시 IL-17A에 대한 결합을 1nM 이하의 IC50으로 억제한다. XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 가변 영역의 코딩 뉴클레오티드 서열은 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 전장 코딩 뉴클레오티드 서열을 제시하는 표 3 및 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 가변 영역의 아미노산 서열을 제시하는 표 2로부터 유래될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 상기 논의된 목적하는 기능적 특성 중 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 또는 4종 이상을 나타낼 수 있다. 본 개시내용의 항체 또는 단백질은, 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 또는 단백질은 완전 인간 침묵 항체, 예컨대 완전 인간 침묵 IgG1 항체이다.
침묵 이펙터 기능은 항체의 Fc 불변부에서의 돌연변이에 의해 수득될 수 있고, 문헌 [Art: Strohl 2009 (LALA & N297A); Baudino 2008, D265A (Baudino et al. 2008, J. Immunol. 181:6664-69, Strohl, CO 2009, Biotechnology 20:685-91)]에 기재되어 있다. 침묵 IgG1 항체의 예는 IgG1 Fc 아미노산 서열에서 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는 소위 LALA 돌연변이체를 포함한다. 침묵 IgG1 항체의 또 다른 예는 D265A 돌연변이를 포함한다. D265A 돌연변이는 또한 바람직하게는 P329A 돌연변이 (DAPA)와 조합될 수 있다. 또 다른 침묵 IgG1 항체는 비글리코실화 또는 비-글리코실화 항체를 생성하는 N297A 돌연변이를 포함한다.
돌연변이체 아미노산 서열을 갖는 항체는 코딩 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능 (즉, 상기 기재된 기능)에 대해 변경된 코딩 항체를 시험하는 것에 의해 수득할 수 있다.
보존적 변형을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 (또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질)는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열 (또는 HCDR1', HCDR2' 및 HCDR3')을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열 (또는 LCDR1', LCDR2', 및 LCDR3')을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지며, 여기서 3개의 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5에 기초한 명시된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 갖고, 항체 또는 단백질은 본 개시내용의 항-IL-17A 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
본원에 사용된 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체한 아미노산 치환을 지칭하는 것으로 의도된다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 항체는 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능에 대해 시험될 수 있다.
변형은 관련 기술분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본원에 개시된 바와 같은 항체에 도입될 수 있다.
조작 및 변형된 항체
다른 항체 및 항원-결합 단편, 예컨대 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 상기 제시된 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5의 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상을 갖는 항체를 사용하여 제조할 수 있고, 변형된 항체는 출발 항체에서 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 내, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 내 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한가지 유형은 CDR 그라프팅이다. 항체는 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 우세하게 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 개개의 항체 사이에서 CDR 외부의 서열보다 더 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터 유래된 프레임워크 서열 상에 그라프트된 특이적 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al. 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al. 1986, Nature 321:522-525; Queen, C. et al. 1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033]; 윈터(Winter)의 미국 특허 번호 5,225,539, 및 퀸(Queen) 등의 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참조).
따라서, 본 개시내용의 또 다른 실시양태는 표 5 또는 표 6에 정의된 바와 같은 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 어느 하나의 6개의 CDR 영역을 포함하고, 또한 원래의 항체로부터의 상이한 프레임워크 서열을 함유하는 단리된 재조합 CDR-그라프트된 항-IL-17A 항체에 관한 것이다.
이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (인터넷 at www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase 상에서 입수가능함), 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al. 1994, Eur. J Immunol. 24:827-836]에서 찾아볼 수 있다.
프레임워크 서열의 예는 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 어느 하나에 사용된 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 프레임워크 서열이 유래된 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역에 그라프트될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 배선 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역에 그라프트될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 발견되었다 (예를 들어, 퀸 등의 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참조).
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선하는 것으로, "친화도 성숙"으로 공지되어 있다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 다른 관심 기능적 특성은 본원에 기재되고 실시예에 제공되는 것과 같은 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용은 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 항체 중 하나로부터 유래된 친화도 성숙 항체에 관한 것이다. 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 또한, 전형적으로 CDR 영역 내에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체는 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 하나의 6개의 CDR을 포함하며, 여기서 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된 친화도-성숙 항체이다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 조작된 항-IL-17A 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 서열이 원래의 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 함유하는 것을 제외하고, XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 항체 중 적어도 하나의 상응하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 동일한 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 조작된 항체를 제공한다.
대안적 프레임워크 또는 스캐폴드에의 항원-결합 도메인 그라프팅
생성되는 폴리펩티드가 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5의 적어도 하나의 결합 영역을 포함하고 IL-17A에 특이적으로 결합하는 한, 널리 다양한 항체/이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 이뮤노글로불린의 5개의 주요 이디오타입, 또는 그의 단편을 포함하고 (예컨대 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같음), 바람직하게는 인간화 측면을 갖는 다른 동물 종의 이뮤노글로불린을 포함한다. 이와 관련하여, 낙타류에서 확인되는 것과 같은 단일 중쇄 항체가 특히 관심대상이다. 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편이 통상의 기술자에 의해 계속해서 발견되고 개발되고 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 CDR이 그라프트될 수 있는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-이뮤노글로불린 기반 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질을 생성하는 것에 관한 것이다. 서열 76의 표적 단백질에 대해 특이적인 결합 영역을 포함하는 한, 공지된 또는 미래의 비-이뮤노글로불린 프레임워크 및 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이러한 화합물은 본원에서 "표적-특이적 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드"로 지칭된다. 비-이뮤노글로불린 프레임워크의 예는 하기 섹션 (낙타류 항체 및 비-항체 스캐폴드)에서 추가로 기재된다.
낙타류 항체
신세계 구성원, 예컨대 라마 종 (라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 비롯한 낙타 및 단봉낙타 (카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 칼레루스 드로마데리우스(Calelus dromaderius)) 패밀리의 구성원으로부터 수득된 항체 단백질을 인간 대상체에 대해 크기, 구조적 복합성 및 항원성에 대해 특성화하였다. 자연계에서 발견되는 바와 같은 이러한 패밀리의 포유동물로부터의 특정 IgG 항체에는 경쇄가 결여되어 있고, 따라서 다른 동물로부터의 항체의 경우에 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4쇄 4차 구조와 구조적으로 구분된다. PCT 공개 번호 WO 94/04678을 참조한다.
VHH로 확인된 소형 단일 가변 도메인인 낙타류 항체 영역은 "낙타류 나노바디"로 공지된 저분자량 항체-유래 단백질을 생성하는, 표적에 대해 높은 친화도를 갖는 소형 단백질을 생성하기 위한 유전자 조작에 의해 수득될 수 있다. 1998년 6월 2일 허여된 미국 특허 번호 5,759,808을 참조하고; 또한 문헌 [Stijlemans, B. et al. 2004, J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al. 2003, Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003, Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002, Int J Cancer 89: 456-62; 및 Lauwereys, M. et al. 1998, EMBO J 17: 3512-3520]을 참조한다. 낙타류 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는 예를 들어 아블링스(Ablynx) (벨기에 겐트)로부터 상업적으로 입수가능하다. 비-인간 기원의 다른 항체와 마찬가지로, 낙타류 항체의 아미노산 서열은 인간 서열과 보다 밀접하게 유사한 서열을 수득하기 위해 재조합적으로 변경될 수 있고, 즉 나노바디는 "인간화"될 수 있다. 따라서, 인간에 대한 낙타류 항체의 천연적으로 낮은 항원성을 추가로 감소시킬 수 있다.
낙타류 나노바디는 분자량이 인간 IgG 분자의 대략 1/10이고, 상기 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 갖는다. 작은 크기로 인한 한가지 중요성은 보다 큰 항체 단백질에 대해서는 기능적으로 보이지 않는 항원 부위에 결합하는 낙타류 나노바디의 능력으로, 즉 낙타류 나노바디는 전형적인 면역학적 기술을 사용해서는 달리 알 수 없는 항원을 검출하는 시약으로서 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기로 인한 또 다른 중요성은, 낙타류 나노바디는 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈새 내의 특이적 부위에 결합한 결과로서 억제할 수 있기 때문에, 전형적인 항체의 기능보다 전형적인 저분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력을 제공할 수 있다는 것이다.
저분자량 및 조밀한 크기는 추가로, 낙타류 나노바디가 극도로 열안정성이고, 극한 pH 및 단백질분해적 소화에 대해 안정하고, 낮은 항원성이도록 한다. 또 다른 중요성은 낙타류 나노바디가 순환계로부터 조직 내로 용이하게 이동하고, 심지어는 혈액-뇌 장벽을 횡단하며, 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 또한 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 약물 수송을 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일에 공개된 미국 특허 공개 번호 20040161738을 참조한다. 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이들 특징은 높은 치료 잠재력을 나타낸다. 또한, 이들 분자는 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 내에서 완전하게 발현될 수 있고, 박테리오파지와의 융합 단백질로서 발현되며, 기능적이다.
조작된 나노바디는 수용 대상체 내에서의 반감기가 45분 내지 2주가 되도록 유전자 조작함으로써 추가로 적합화될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 94/04678에 기재된 바와 같이 본 개시내용의 인간 항체, XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 하나의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열에 그라프트하는 것에 의해 수득된다.
비-항체 스캐폴드
공지된 비-이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 애드넥틴(Adnectin) (피브로넥틴) (컴파운드 테라퓨틱스, 인크.(Compound Therapeutics, Inc.), 매사추세츠주 월섬), 안키린 (몰레큘라 파트너스 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체 (도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd), 매사추세츠주 캠브리지) 및 아블링스 엔브이 (벨기에 츠뷔나아르드), 리포칼린 (안티칼린) (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이징), 소형 모듈화 면역-제약 (트루비온 파마슈티칼스 인크.(Trubion Pharmaceuticals Inc.), 워싱턴주 시애틀), 맥시바디 (아비디아, 인크.(Avidia, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰), 단백질 A (아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴) 및 아필린 (감마-결정질 또는 유비퀴틴) (실 프로테인즈 게엠베하(Scil Proteins GmbH), 독일 할레), 단백질 에피토프 모방체 (폴리포르 리미티드(Polyphor Ltd), 스위스 알슈빌)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
(a) 피브로넥틴 스캐폴드
피브로넥틴 스캐폴드는 바람직하게는 피브로넥틴 유형 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 유형 III의 10번째 모듈 (10 Fn3 도메인))을 기반으로 한다. 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 그 자체가 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포된 7 또는 8개의 베타 가닥을 갖고, 베타 가닥을 서로 연결하고 용매 노출되는 루프 (CDR과 유사)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각각의 가장자리에 적어도 3개의 이러한 루프가 존재하고, 여기서 가장자리는 베타 가닥의 방향과 수직인 단백질의 경계이다 (미국 특허 번호 6,818,418).
이들 피브로넥틴-기반 스캐폴드는 이뮤노글로불린이 아니지만, 전반적인 폴드는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 중쇄의 가변 영역인 최소의 기능적 항체 단편의 그것과 밀접한 관련이 있다. 이러한 구조로 인해, 비-이뮤노글로불린 항체는 속성 및 친화도가 항체의 그것과 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이들 스캐폴드는 생체내 항체의 친화도 성숙 과정과 유사한 시험관내 루프 무작위화 및 셔플링 전략에 사용될 수 있다. 이들 피브로넥틴-기반 분자는 표준 클로닝 기술을 사용하여 분자의 루프 영역이 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 하나의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
(b) 안키린 - 분자 파트너
본 기술은 상이한 표적에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 보유하기 위해 스캐폴드로서 안키린 유래 반복 모듈을 갖는 단백질을 사용하는 것을 기반으로 한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역평행 α-헬릭스 및 β-턴으로 이루어진 33개 아미노산의 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보솜 디스플레이를 사용함으로써 대부분 최적화된다.
(c) 맥시바디/아비머 - 아비디아
아비머는 천연 A-도메인 함유 단백질, 예컨대 LRP-1로부터 유래된다. 이들 도메인은 원래 단백질-단백질 상호작용을 위해 사용되고, 인간에서는 250종 초과의 단백질이 구조적으로 A-도메인을 기반으로 한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 다수의 상이한 "A-도메인" 단량체 (2-10개)로 이루어진다. 예를 들어 미국 특허 공개 번호 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 기재된 방법론을 사용하여 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머를 생성할 수 있다.
(d) 단백질 A - 아피바디
아피바디® 친화성 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 하나의 스캐폴드를 기반으로 하는 3개-헬릭스 다발로 구성된 소형의 단순 단백질이다. 단백질 A는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질이다. 이 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 이루어지며, 이 중 13개는 무작위화되어 다수의 리간드 변이체를 갖는 아피바디® 라이브러리를 생성한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,831,012 참조). 아피바디® 분자는 항체를 모방하고; 항체의 분자량이 150 kDa인데 비해 이는 6 kDa의 분자량을 갖는다. 아피바디® 분자는 작은 크기에도 불구하고 그의 결합 부위는 항체의 그것과 유사하다.
(e) 안티칼린 - 피에리스
안티칼린®은 피에리스 프로테오랩 아게(Pieris ProteoLab AG) 사에 의해 개발된 제품이다. 이는 화학적으로 감수성 또는 불용성 화합물의 생리학적 수송 또는 저장에 통상적으로 수반되는 소형이고 강건한 단백질의 광범위한 집단인 리포칼린으로부터 유래된다. 몇몇 천연 리포칼린이 인간 조직 또는 체액에서 생성된다.
단백질 아키텍처는 초가변 루프가 경질 프레임워크의 상부에 존재하는 이뮤노글로불린을 연상시킨다. 그러나, 항체 또는 그의 재조합 단편과 대조적으로, 리포칼린은 160 내지 180개 아미노산 잔기를 갖는 단일 폴리펩티드 쇄로 구성되어, 단일 이뮤노글로불린 도메인보다 단지 약간 더 크다.
결합 포켓을 구성하는 4개의 루프 세트는 현저한 구조적 가소성을 나타내고 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서, 상이한 형상의 규정된 표적 분자를 높은 친화도 및 특이성으로 인식하도록 하기 위해 결합 부위를 독점적 방법으로 재성형할 수 있다.
리포칼린 패밀리의 한 단백질인 피에리스 브라시카에(Pieris Brassicae)의 빌린-결합 단백질 (BBP)이, 4개 루프 세트를 돌연변이유발하는 것에 의해 안티칼린을 개발하는데 사용되어 왔다. "안티칼린"을 기재한 특허 출원의 한 예는 PCT 공개 WO 199916873이다.
(f) 아필린 - 실 단백질
아필린™ 분자는 단백질 및 소분자에 대한 특이적 친화도를 위해 설계된 소형의 비-이뮤노글로불린 단백질이다. 신규 아필린™ 분자는 각각 상이한 인간 유래의 스캐폴드 단백질을 기반으로 하는 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선택될 수 있다.
아필린™ 분자는 이뮤노글로불린 단백질과 어떠한 구조적 상동성도 나타내지 않는다. 실 단백질은 2개의 아필린™ 스캐폴드를 사용하며, 그 중 하나는 인간의 구조적 눈 렌즈 단백질인 감마 결정질이고 다른 것은 "유비퀴틴" 슈퍼패밀리 단백질이다. 인간 스캐폴드는 둘 다 매우 소형이고, 고온 안정성을 나타내고, pH 변화 및 변성제에 거의 내성이다. 이러한 높은 안정성은 주로 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 결정질 유래의 단백질의 예는 WO200104144에 기재되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO2004106368에 기재되어 있다.
(g) 단백질 에피토프 모방체 (PEM)
PEM은 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 주요 2차 구조인 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간 크기의 시클릭 펩티드-유사 분자 (MW 1-2 kDa)이다.
프레임워크 또는 Fc 조작
본 개시내용의 조작된 항체 및 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 예를 들어 항체의 특성을 개선하기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형이 이루어진 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한가지 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 항체가 유래된 배선 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배위로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "복귀돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이" 항체도 또한 본 개시내용에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 T 세포-에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해 프레임워크 영역 내 또는 심지어는 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로도 지칭되고, 칼(Carr) 등의 미국 특허 공개 번호 20030153043에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 더하여 또는 대안적으로, 본 개시내용의 항체는 전형적으로 항체의 1종 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경하기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 개시내용의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 다시 항체의 1종 이상의 기능적 특성을 변경하기 위해 그의 글리코실화를 변경하도록 변형될 수 있다. 각각의 이들 실시양태가 하기에 추가로 상세하게 기재된다.
본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 비롯하여 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 IgG 항체의 위치 C226 또는 P230으로부터 카르복실-말단까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 정의된다. Fc 영역에서 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 넘버링이다. Fc 영역의 C-말단 리신 (잔기 K447)은 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안 제거될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, 어떠한 K447 잔기도 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역이 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 보드머(Bodmer) 등의 미국 특허 번호 5,677,425에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 항체의 Fc 힌지 영역이 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입되어, 항체는 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖게 된다. 이러한 접근법은 워드(Ward) 등의 미국 특허 번호 6,165,745에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 그의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 워드의 미국 특허 번호 6,277,375에 기재된 바와 같이, 하기 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 프레스타(Presta) 등의 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질의 이펙터 기능을 변경시키기 위해 Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것에 의해 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 둘 다 윈터 등에 의한 것인 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 제거된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 이러한 접근법은 이두소기(Idusogie) 등의 미국 특허 번호 6,194,551에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경함으로써 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경한다. 이러한 접근법은 보드머(Bodmer) 등의 PCT 공개 WO 94/29351에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질의 능력을 증가시키고/거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 Fc 영역이 변형된다. 이러한 접근법은 프레스타의 PCT 공개 WO 00/42072에 추가로 기재되어 있다. 또한, FcγRl, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 맵핑되어 있고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다 (문헌 [Shields, R.L. et al. 2001, J. Biol. Chem 276:6591-6604] 참조).
특정 실시양태에서, IgG1 이소형의 Fc 도메인이 사용된다. 일부 구체적 실시양태에서, IgG1 Fc 단편의 돌연변이 변이체, 예를 들어 융합 폴리펩티드가 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하고/거나 Fcγ 수용체에 결합하는 능력을 감소시키거나 제거한 침묵 IgG1 Fc가 사용된다. IgG1 이소형 침묵 돌연변이체의 예는 문헌 [Hezareh et al. 2001, J. Virol 75:12161-8]에 기재된 바와 같은, 아미노산 위치 234 및 235에서 류신이 알라닌에 의해 대체된 IgG1이다. IgG1 이소형 침묵 돌연변이체의 또 다른 예는 D265A 돌연변이 (위치 265에서 아스파르테이트가 알라닌에 의해 치환됨)를 갖는 IgG1이다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 위치 297에서 글리코실화를 방지한 침묵 Fc 돌연변이체이다. 예를 들어, Fc 도메인은 위치 297에서 아스파라긴의 아미노산 치환을 함유한다. 이러한 아미노산 치환의 예는 글리신 또는 알라닌에 의한 N297의 대체이다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 그 부위에서 글리코실화가 제거되도록, 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 코(Co) 등의 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
추가로 또는 대안적으로, 변경된 글리코실화 유형을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 항체 또는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본 개시내용의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하기 위한 숙주 세포로 사용될 수 있다. 예를 들어, 행(Hang) 등의 EP 1 176 195는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. 따라서, 한 실시양태에서 본 개시내용의 항체는 저푸코실화 패턴을 나타내는 세포주, 예를 들어 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자의 발현이 결핍된 포유동물 세포주에서의 재조합 발현에 의해 생산된다. 프레스타의 PCT 공개 WO 03/035835는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재하고, 그러한 숙주 세포 내에서 발현된 항체의 저푸코실화가 또한 일어난다 (또한 문헌 [Shields, R.L. et al. 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). 우마나(Umana) 등의 PCT 공개 WO 99/54342는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하고 있으며, 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 증가된 ADCC 활성을 야기한다 (또한 문헌 [Umana et al. 1999, Nat. Biotech. 17:176-180] 참조). 대안적으로, 본 개시내용의 항체 및 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 포유동물-유사 글리코실화 패턴으로 조작되고 글리코실화 패턴으로서 푸코스 결여 항체를 생산할 수 있는 효모 또는 사상 진균에서 생산될 수 있다 (예를 들어 EP 1 297 172 참조).
본 개시내용에 의해 고려되는, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질의 또 다른 변형은 PEG화이다. 이들 분자는 예를 들어 그의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 PEG화될 수 있다. 예를 들어, 항체를 PEG화하기 위해, 항체 또는 그의 단편은 전형적으로 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응된다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용되는 임의의 PEG 형태, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 비글리코실화된 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 개시내용의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, 니시무라(Nishimura) 등의 EP 0 154 316 및 이시까와(Ishikawa) 등의 EP 0 401 384를 참조한다.
본 개시내용에 의해 고려되는 항체 및 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질의 또 다른 변형은 생성되는 분자의 반감기를 증가시키기 위한, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 그의 단편에 대한 본 개시내용의 항체의 적어도 항원-결합 영역의 접합 또는 단백질 융합이다. 이러한 접근법은 예를 들어 발란스(Ballance) 등의 EP 0 322 094에 기재되어 있다.
또 다른 가능성은 생성되는 분자의 반감기를 증가시키기 위한, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 단백질에 대한 본 개시내용의 항체의 적어도 항원-결합 영역의 융합이다. 이러한 접근법은 예를 들어 니그렌(Nygren) 등의 EP 0 486 525에 기재되어 있다.
변경된 항체를 조작하는 방법
상기 논의된 바와 같이, 본원에 제시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항-IL-17A 항체를 사용하여, 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 새로운 항-IL-17A 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 또 다른 측면에서, 본 개시내용의 항-IL-17A 항체의 구조적 특징을 사용하여, 본원에 개시된 항체의 적어도 1종의 기능적 특성, 예컨대 인간 IL-17A에의 결합 및 또한 IL-17A의 1종 이상의 기능적 특성의 억제 (예를 들어, IL-17A 또는 IL-17AF의 그의 수용체(들)에 대한 결합의 억제, IL-17A 또는 IL-17AF 유도된 IL-6, GRO-알파의 생산의 억제 등), 생체내 검정에서의 억제 활성을 보유하는 구조적으로 관련된 항-IL-17A 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질을 생성한다.
IL-17A에 대해 동일한 결합 특성을 실질적으로 보유하는 다른 항체는 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 어느 하나의 동일한 VH 및 VL 영역, 또는 CDR 영역 및 상이한 불변 영역 또는 프레임워크 영역 (예를 들어 상이한 이소형, 예를 들어 IgG4 또는 IgG2로부터 선택된 상이한 Fc 영역)을 보유하는 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 어느 하나의 키메라 항체 또는 CDR 그라프트된 항체를 포함한다.
예를 들어, 상기 논의된 바와 같이 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 어느 하나의 하나 이상의 CDR 영역, 또는 그의 돌연변이는 공지된 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어 추가의, 재조합적으로-조작된, 본 개시내용의 항-IL-17A 항체를 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 이전 섹션에 기재된 것을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 상기 표에 제공된 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5의 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5의 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할 (즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 원래의 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 생성한 다음, "제2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.
제2 세대 서열은 예를 들어 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기의 DNA 코딩 서열을 변경시켜 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 것에 의해 유도된다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 어느 하나의 전장 중쇄 항체 서열, 전장 경쇄 항체 서열로 이루어진, 포유동물 세포에서의 발현이 최적화된 항-IL-17A 항체를 제조하는 방법; 뉴클레오티드 코딩 서열에서 전장 중쇄 항체 서열 및/또는 전장 경쇄 항체 서열 내의 아미노산 잔기를 코딩하는 적어도 하나의 코돈을 변경하여 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하는 방법; 및 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.
변경된 항체 서열은 또한 각각 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 어느 하나의 독특한 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열, 또는 미국 특허 공개 번호 20050255552에 기재된 바와 같은 최소 필수 결합 결정기, 및 CDR1 및 CDR2 서열에 대한 대안적 서열을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 제조될 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터 항체를 스크리닝하는데 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예컨대 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술을 사용하여 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩된 항체는 본원에 기재된 항-IL-17A 항체의 목적하는 기능적 특성 중 1종, 일부 또는 전부를 보유하며, 기능적 특성은 인간 IL-17A에 대한 특이적 결합; 및/또는 IL-17A의 그의 수용체(들)에 대한 결합의 억제; 및/또는 예를 들어 IL-6 또는 GRO-알파의 IL-17A 유도된 생산의 억제 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
변경된 항체는 상기 논의된 기능적 특성 중 1종 이상, 2종 이상 또는 3종 이상을 나타낼 수 있다.
본 개시내용의 항체를 조작하는 방법의 특정 실시양태에서, 돌연변이는 항-IL-17A 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 항-IL-17A 항체는 결합 활성 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 관련 기술분야에 기재되어 있다. 예를 들어, 쇼트(Short)의 PCT 공개 WO 02/092780은 포화 돌연변이유발, 합성 라이게이션 어셈블리, 또는 그의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재하고 있다. 대안적으로, 라자르(Lazar) 등의 PCT 공개 WO 03/074679는 항체의 생리화학적 특성을 최적화하기 위해 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용한 방법을 기재하고 있다.
본 개시내용의 항체를 코딩하는 핵산 분자
본 개시내용의 또 다른 측면은 본 개시내용의 항체 또는 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 가변 경쇄 뉴클레오티드 서열의 예는 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5 중 어느 하나의 가변 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 것으로, 후자의 서열은 표 3 (XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5의 중쇄 및 경쇄의 전체 뉴클레오티드 코딩 서열을 제시함) 및 표 2 (XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5의 가변 영역의 아미노산 서열을 제시함)로부터 유래된다.
본 개시내용은 또한 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포주에서의 단백질 발현을 위해 최적화된, 후자의 서열로부터 유래된 핵산 분자에 관한 것이다.
핵산은 전세포, 세포 용해물에 존재할 수 있거나, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태의 핵산일 수 있다. 핵산은 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 기술을 비롯한 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포성 핵산 또는 단백질로부터 정제된 경우에 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게" 된다. 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조한다. 본 개시내용의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다. 핵산은 벡터, 예컨대 파지 디스플레이 벡터 또는 재조합 플라스미드 벡터에 존재할 수 있다.
본 개시내용의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어 VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편이 수득되면, 이들 DNA 단편은 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자로, Fab 단편 유전자로, 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작될 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 또 다른 DNA 분자에, 또는 또 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 단편에 작동가능하게 연결된다. 이러한 문맥에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편이 기능적 방식으로, 예를 들어 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 인-프레임으로 유지되도록, 또는 단백질이 목적하는 프로모터의 제어 하에 발현되도록 연결된 것을 의미하는 것으로 의도된다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 이소형 중에서 선택된다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우에, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결시켜, VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결되어 VH 및 VL 서열이 연속 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 한다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al. 1988, Science 242:423-426; Huston et at. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al. 1990, Nature 348:552-554] 참조).
본 개시내용의 재조합 항체의 단리
항체 및 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질을 스크리닝하는 수많은 방법이 관련 기술분야에 기재되어 있다. 이러한 방법은 생체내 시스템, 예컨대 항원 면역화 시 완전 인간 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 마우스; 및 항체 DNA 코딩 라이브러리를 생성하고, 항체 생산을 위한 적절한 시스템에서 DNA 라이브러리를 발현시키고, 표적에 친화도 선택 기준으로 결합하는 항체 후보를 발현하는 클론을 선택하고, 선택된 클론의 상응하는 코딩 서열을 회수하는 것으로 이루어진 시험관내 시스템으로 나뉘어질 수 있다. 이들 시험관내 기술은 디스플레이 기술로서 공지되어 있고, 제한 없이 파지 디스플레이, RNA 또는 DNA 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 효모 또는 포유동물 세포 디스플레이를 포함한다. 이들은 관련 기술분야에 널리 기재되어 있다 (검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Nelson et al. 2010, Nature Reviews Drug discovery, "Development trends for human monoclonal antibody therapeutics" (Advance Online Publication) 및 Hoogenboom et al. 2001, Method in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J.] 참조). 한 구체적 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 재조합 항체는 인간 재조합 항체 라이브러리, 예컨대 HuCAL® 라이브러리의 라이브러리를 스크리닝하는 파지 디스플레이 방법을 사용하여 단리된다.
VH 및 VL 유전자 또는 관련 CDR 영역의 레퍼토리는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 개별적으로 클로닝되거나 또는 DNA 합성기에 의해 합성되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합될 수 있으며, 이는 이어서 항원-결합 클론에 대해 스크리닝될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 관련 기술분야에 확립되어 있거나 또는 하기 실시예에 기재되어 있다. 예를 들어 라드너(Ladner) 등의 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698; 다우어(Dower) 등의 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717; 맥카퍼티(McCafferty) 등의 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197; 및 그리피스(Griffiths) 등의 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081을 참조한다.
특정 실시양태에서, IL-17A에 대해 지시된 인간 항체는 마우스 면역계보다 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스를 사용하여 확인될 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하고, 본원에서 "인간 Ig 마우스"로 총칭된다.
HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니유전자좌를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al. 1994, Nature 368:856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 부류 전환 및 체세포 돌연변이를 거쳐 높은 친화도 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 (Lonberg, N. et al. 1994, supra; reviewed in Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N. 1995, Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). HuMAb 마우스의 제조 및 용도, 및 상기 마우스에 의해 보유되는 게놈 변형이 문헌 [Taylor, L. et al. 1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at. 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al. 1993, Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. 1993, EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. 1994, International Immunology 579-591; 및 Fishwild, D. et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851]에 추가로 기재되어 있다. 추가로, 모두 론베르크(Lonberg) 및 카이(Kay)의 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429; 수라니(Surani) 등의 미국 특허 번호 5,545,807; 모두 론베르크 및 카이의 PCT 공개 번호 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962; 및 코르만(Korman) 등의 PCT 공개 번호 WO 01/14424를 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모솜 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되며, 이시다(Ishida) 등의 PCT 공개 WO 02/43478에 상세하게 기재되어 있다.
추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스제닉 동물 시스템이 관련 기술분야에서 입수가능하며, 본 개시내용의 항-IL-17A 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.) 사의 제노마우스(Xenomouse)로 지칭되는 대안적 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 쿠체르라파티(Kucherlapati) 등의 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 및 6,162,963에 기재되어 있다. 통상의 기술자에 의해 인식될 바와 같이, 여러 다른 마우스 모델, 예컨대 트리아니, 인크.(Trianni, Inc.)로부터의 트리아니™ 마우스, 레게네론 파마슈티칼스 인크.(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)로부터의 벨로크이뮨(VelocImmune)™ 마우스, 또는 키맙 리미티드(Kymab Limited)로부터의 키마우스(Kymouse)™ 마우스가 사용될 수 있다.
또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스크로모소믹 동물 시스템이 관련 기술분야에서 입수가능하며, 본 개시내용의 항-IL-17A 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 둘 다를 보유하는 마우스를 사용할 수 있으며; 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다.
본 개시내용의 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화 시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 윌슨(Wilson) 등의 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767에 기재되어 있다.
뮤린 시스템으로부터 본 개시내용의 모노클로날 항체의 생성
모노클로날 항체 (mAb)는 통상의 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein 1975, Nature 256:495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 많은 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환이 사용될 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.
본 개시내용의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열을 기반으로 하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA는 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득하여 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하도록 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 조작할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 CDR 영역을 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다. 예를 들어, 윈터의 미국 특허 번호 5,225,539, 및 퀸 등의 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370을 참조한다.
인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본 개시내용의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하여, 적절한 불멸화 세포주, 예컨대 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 또는 에피토프-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단세포 현탁액을, 50% PEG를 함유하는 P3X63-Ag8.653 비분비성 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580) 수의 1/6과 융합시킬 수 있다. 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트 내에 대략 2 x 145로 플레이팅한 후에, 20% 태아 클론 혈청, 18% "653" 조건화 배지, 5% 오리겐 (이겐(IGEN)), 4mM L-글루타민, 1mM 피루브산나트륨, 5mM HEPES, 0:055mM 2-메르캅토에탄올, 50 유닛/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신, 50mg/ml 겐타마이신 및 1X HAT (시그마(Sigma); HAT는 융합 24시간 후에 첨가됨)를 함유하는 선택 배지 내에서 2주 인큐베이션한다. 대략 2주 후에, HAT를 HT로 대체한 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 개별 웰을 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 배지를 통상적으로 10-14일 후에 관측할 수 있다. 항체 분비성 하이브리도마를 재플레이팅하고, 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 모노클로날 항체를 한계 희석함으로써 1회 또는 2회 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 조직 배양 배지 중에 특성화를 위한 소량의 항체를 생성할 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노크로날 항체 정제를 위해 2-리터의 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 여과하고 농축시킨 후에, 단백질 A-세파로스 (파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이)로 친화성 크로마토그래피할 수 있다. 용리된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 확인하여 순도를 보장할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환하고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고, -80℃에서 저장할 수 있다.
모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
본 개시내용의 항체는 예를 들어 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다 (예를 들어, [Morrison, S. 1985, Science 229:1202]).
예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 또는 생화학 기술 (예를 들어, DNA 화학적 합성, PCR 증폭, 또는 관심 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 cDNA 클로닝)에 의해 수득할 수 있고, DNA를 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이러한 문맥에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 수행하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션된 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선별된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 보다 전형적으로는, 유전자 둘 다가 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, 이들을 목적하는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하는 발현 벡터로 삽입하여 VH 절편이 벡터 내 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되게 하고 VL 절편이 벡터 내 CL 절편에 작동가능하게 연결되게 함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는, 리더 서열로도 불리는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩티드가 인 프레임으로 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다. 이러한 신호 펩티드의 예는 하기 표 7에서 확인되고, 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 예는 하기 표 8에서 확인된다.
<표 7> 중쇄 및 경쇄 펩티드에 대한 신호 펩티드.
Figure 112015085607095-pct00007
<표 8> 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열.
Figure 112015085607095-pct00008
항체 쇄 유전자에 더하여, 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절성 서열은, 예를 들어 문헌 [Goeddel 1990, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA]에 기재되어 있다. 통상의 기술자는 조절 서열의 선택을 비롯하여 발현 벡터의 설계는 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있음을 인식할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 추가로, 조절 요소는 SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복부로부터의 서열을 함유하는, SRa 프로모터 시스템과 같은 상이한 공급원으로부터의 서열로 구성된다 (Takebe, Y. et al. 1988, Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 모두 악셀(Axel) 등의 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 참조). 예를 들어, 전형적으로 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 대해 약물, 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 선택 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위함)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)로 숙주 세포를 형질감염시키는데 표준 기술이 적용되었다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로의 외인성 DNA의 도입을 위해 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것은 이론상 가능하다. 항체의 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포, 효모 또는 사상 진균에서의 발현이 논의되며, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비할 가능성이 원핵 세포보다 더 높기 때문이다.
한 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 클로닝 또는 발현 벡터는 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 표 3으로부터의 코딩 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 클로닝 또는 발현 벡터는 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 표 4로부터의 코딩 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
본 개시내용의 재조합 항체를 발현시키기 위한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (예를 들어, 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp 1982, Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DH FR 선택 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함), CHOK1 dhfr+ 세포주, NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위한 또 다른 발현 시스템은 PCT 공개 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 0 338 841에 제시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 항체를 발현시키기 위한 포유동물 숙주 세포는, 예를 들어 미국 특허 번호 6,946,292에 기재된 바와 같은 FUT8 유전자 발현이 결핍된 포유동물 세포주를 포함한다.
항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입되는 경우에, 항체는 숙주 세포에서의 항체 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로의 항체 분비를 허용하기에 충분한 시간 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법 (예를 들어, 문헌 [Abhinav et al. 2007, Journal of Chromatography 848:28-37] 참조)을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
한 구체적 실시양태에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된, 각각 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5의 발현에 적합한 서열 18, 31, 51, 19, 28, 32, 38, 40, 46, 48, 52, 56, 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 코딩 서열을 갖는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포이다.
이어서 후자의 숙주 세포는 각각 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5로 이루어진 군으로부터 선택된 본 개시내용의 항체의 발현 및 생산에 적합한 조건 하에 추가로 배양될 수 있다.
면역접합체
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 활성 또는 치료 모이어티, 예컨대 세포독소, 약물 (예를 들어, 면역억제제) 또는 방사성독소에 접합된 본 개시내용의 항-IL-17A 항체 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 이러한 접합체는 본원에서 "면역접합체"로 지칭된다. 이는 IL-17A가 Th17 세포의 표면 상에서 발현되는 경우에 특히 바람직할 수 있다 (Brucklacher-Waldert et al. 2009, J Immunol. 183:5494-501).
하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에게 해로운 (예를 들어, 사멸시키는) 임의의 작용제를 포함한다. 예는 탁손, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브로민화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 티. 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신, 및 그의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 치료제는 또한, 예를 들어 항대사물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 절제제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴, 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다.
본 개시내용의 항체에 접합될 수 있는 치료 세포독소의 다른 예는 두오카르마이신, 칼리케아미신, 메이탄신 및 아우리스타틴, 및 그의 유도체를 포함한다. 칼리케아미신 항체 접합체의 예는 상업적으로 입수가능하다 (밀로타르그(Mylotarg)™; 와이어쓰-에이어스트(Wyeth-Ayerst)).
세포독소는 관련 기술분야에서 이용가능한 링커 기술을 사용하여 본 개시내용의 항체에 접합될 수 있다. 세포독소를 항체에 접합시키는데 사용되는 링커 유형의 예는 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드-함유 링커를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 리소솜 구획 내의 낮은 pH에 의한 절단에 감수성이거나 또는 프로테아제, 예컨대 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제, 예컨대 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B, C, D)에 의한 절단에 감수성인 링커가 선택될 수 있다.
세포독소의 유형, 링커, 및 치료제를 항체에 접합시키는 방법에 관한 추가의 논의에 대해서는, 문헌 [Saito, G. et al. 2003, Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. 2003, Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. 2003, Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. 2002, Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. 2002, Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. 2001, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264]을 또한 참조한다.
본 개시내용의 항체는 또한 방사성 동위원소에 접합되어 방사성면역접합체로도 지칭되는 세포독성 방사성제약을 생성할 수 있다. 진단상 또는 치료상 사용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예는 아이오딘131, 인듐111, 이트륨90 및 루테튬177을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 방사성면역접합체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 확립되어 있다. 제발린(Zevalin)™ (DEC 파마슈티칼스(DEC Pharmaceuticals)) 및 벡사르(Bexxar)™ (코릭사 파마슈티칼스(Corixa Pharmaceuticals))를 비롯한 방사성면역접합체의 예가 상업적으로 입수가능하고, 본 개시내용의 항체를 사용하여 방사성면역접합체를 제조하는데 유사한 방법이 사용될 수 있다.
본 개시내용의 항체 접합체를 사용하여 주어진 생물학적 반응을 변형시킬 수 있고, 약물 모이어티는 전형적인 화학적 치료제에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변형제, 예컨대 예를 들어 림포카인, 인터류킨-1 ("IL1"), 인터류킨-2 ("IL2"), 인터류킨-6 ("IL6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자를 포함할 수 있다.
이러한 치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Amon et al.1985, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56; Hellstrom et at. 1987, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 ; Thorpe 1985, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506; Thorpe et al. 1982, Immunol. Rev., 62:119-58]을 참조한다.
이중특이적 분자
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 항-IL-17A/AF 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 개시내용의 항체 또는 단백질은 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성하기 위해 유도체화되거나 또는 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)에 연결될 수 있다. 본 개시내용의 항체 또는 단백질은 실제로 유도체화되거나 또는 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결되어 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중-특이적 분자를 생성할 수 있고; 이러한 다중-특이적 분자도 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 포괄되는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 개시내용의 항체 또는 단백질은 이중특이적 분자가 생성되도록 1종 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결될 수 있다 (예를 들어 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 또는 기타에 의함).
따라서, 본 개시내용은 IL-17A에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성, 예를 들어 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 어느 하나의 하나의 항원-결합 부분 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한 IL-17A의 또 다른 에피토프이다. 또 다른 예는 IL-17A에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성, 예를 들어 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 어느 하나의 하나의 항원-결합 부분 및 IL-17A 내부 또는 또 다른 표적 항원 내부가 아닌 다른 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자이다.
추가로, 이중특이적 분자가 다중-특이적인 본 개시내용의 경우에, 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프에 더하여 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 쇄 Fv를 비롯한 적어도 하나의 항체 또는 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 라드너(Ladner) 등의 미국 특허 번호 4,946,778에 기재된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편, 예컨대 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있다.
본 개시내용의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
본 개시내용의 이중특이적 분자는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 구성성분 결합 특이체를 접합시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합-특이체를 개별적으로 생성한 다음, 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에, 공유 접합을 위해 다양한 커플링제 또는 가교제가 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al. 1984, J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus 1985, Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al. 1985, Science 229:81-83, 및 Glennie et al. 1987, J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다. 접합제는 둘 다 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.) (일리노이주 록포드)에서 입수가능한 SATA 및 술포-SMCC이다.
결합 특이체가 항체인 경우에, 이는 2개 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합에 의해 접합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수의, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 결합 특이체가 둘 다 동일한 벡터 내에 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 개시내용의 이중특이적 분자는 1개의 단일 쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자의 그의 특이적 표적에 대한 결합은, 예를 들어 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (REA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 확인될 수 있다. 각각의 이들 검정은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용하여 특정한 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
다가 항체
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 예를 들어 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5 중 어느 하나의 항원-결합 부분으로부터 선택된, IL-17A에 결합하는 본 개시내용의 항체의 적어도 2개의 동일하거나 상이한 항원-결합 부분을 포함하는 다가 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 다가 항체는 항체의 적어도 2개, 3개 또는 4개의 항원-결합 부분을 제공한다. 항원-결합 부분은 단백질 융합 또는 공유 또는 비-공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 대안적으로, 연결 방법이 이중특이적 분자에 대해 기재되어 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체를 본 개시내용의 항체의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체와 가교시켜 4가 화합물을 수득할 수 있다.
제약 조성물
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질 중 하나 또는 그의 조합, 예를 들어 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 항체를 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본 개시내용의 1종의 항체 또는 (예를 들어 2종 이상의 상이한) 항체의 조합, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 제약 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하거나 또는 상보적 활성을 갖는 항체 또는 단백질의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물은 또한 조합 요법으로써, 즉 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 하나의 다른 항-염증제 또는 또 다른 화학요법제, 예를 들어 면역억제제와 조합된, 본 개시내용의 항-IL-17A 항체 또는 단백질, 예를 들어 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 항체를 포함할 수 있다. 조합 요법에서 사용될 수 있는 치료제의 예는 하기에서 본 개시내용의 항체 또는 단백질의 사용에 대한 섹션에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합하여야 한다 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함). 한 실시양태에서, 담체는 피하 경로에 적합하여야 한다. 투여 경로에 의존하여, 활성 화합물, 즉 항체, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 임의의 바람직하지 않은 독성학적 효과는 부여하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M., et al. 1977, J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 인산 등으로부터 유래된 염, 뿐만 아니라 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 염을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 염, 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 염을 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물은 또한, 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 멸균 절차, 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 함유시키는 것 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 제약 형태의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 함유시키는 것에 의해 유도될 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 용도는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 임의의 통상의 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성이 아닌 한, 본 개시내용의 제약 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 멸균되고 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시키는 것에 의해 유도될 수 있다.
안정한 단백질 (예를 들어, 항체) 제제의 개발에 관한 검토는 문헌 [Cleland et al. 1993, Crit. Reviews. Ther. Drug Carrier Systems 10(4):307-377 및 Wei Wang 1999, Int. J. Pharmaceutcs 185:129-88]에서 찾아볼 수 있다. 항체에 대한 추가의 제제 논의는 예를 들어 문헌 [Daugherty and Mrsny 2006, Advanced Drug Delivery Reviews 58: 686-706]; 미국 특허 번호 6,171,586, 4,618,486, 미국 공개 번호 20060286103, PCT 공개 WO 06/044908, WO 07/095337, WO 04/016286, 문헌 [Colandene et al. 2007, J. Pharm. Sci 96: 1598-1608; Schulman 2001, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164:S6-S11] 및 다른 공지된 참고문헌에서 찾아볼 수 있다.
피내 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 전형적으로 하기 성분 중 하나 이상을 포함한다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매, 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤, 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨, 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산, 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 장성 조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 이러한 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 시린지 또는 다중 용량 바이알 내에 봉입될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 필요량의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에, 멸균 마이크로여과하여 제조될 수 있다. 일반적으로 분산액은, 본 개시내용의 항체 또는 단백질을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시키는 것에 의해 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 활성 성분 플러스 이전에 멸균-여과된 그의 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
한 구체적 실시양태에서, 항체 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5는 바이알 내 액체 제제로서 투여되었다. 바이알당 약물의 양은 150 mg이었다. 액체는 pH 6.0 ± 0.5에서 150 mg/mL 항체, 4.8 mM L-히스티딘, 15.2 mM L-히스티딘-HCl 220 mM 수크로스 및 0.04% 폴리소르베이트 20을 함유하였다. 의도되는 용량의 완전한 제거를 가능하게 하기 위해 20% 과다충전을 첨가하였다.
담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 대상체, 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100 퍼센트 중에서, 이러한 양은 제약상 허용되는 담체와 조합되어 약 0.01 퍼센트 내지 약 99 퍼센트의 활성 성분, 약 0.1 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 또는 약 1 퍼센트 내지 약 30 퍼센트의 활성 성분의 범위일 것이다.
투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급성에 의해 지시되는 바와 같이 용량이 비례적으로 감소되거나 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단위 투여량으로서 적합화된 물리적 이산 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 필요한 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 개시내용의 투여 단위 형태에 관한 상세사항은, 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정한 치료 효과, 및 개체에서의 감수성 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 내재된 제한에 의해 지시되고 이에 직접 의존한다.
항체 또는 단백질의 투여의 경우에, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 150 mg/kg, 예컨대 5, 15, 및 50 mg/kg 피하 투여, 및 보다 통상적으로 0.01 내지 5 mg/kg의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중일 수 있거나, 또는 1-10 mg/kg 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월에 1회, 3개월마다 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 본 개시내용의 항-IL-17A 항체 또는 단백질에 대한 투여 요법은 정맥내 투여에 의한 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg 또는 30 mg/kg을 포함하며, 항체는 하기 투여 스케줄 중 하나를 사용하여 제공된다: 6회 투여량에 대해 4주마다, 이어서 3개월마다; 3주마다; 3 mg/kg 체중 1회에 이어서 1 mg/kg 체중 3주마다.
일부 방법에서, 결합 특이성이 상이한 2종 이상의 항체가 동시에 투여되고, 이러한 경우에 투여되는 각각의 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 속한다. 본 개시내용의 항체 또는 단백질은 통상적으로 다중 시기에 투여된다. 단일 투여량들 사이의 간격은, 예를 들어 매주, 매달, 3개월마다 또는 매년일 수 있다. 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 간격이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서 투여량은 약 1-1000 μg/ml, 일부 방법에서는 약 25-300 μg/ml의 혈장 항체 농도가 달성되도록 조정된다.
대안적으로, 항체 또는 단백질은 지속 방출 제제로서 투여될 수 있고, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 그 다음으로 인간화 항체, 키메라 항체 및 비인간 항체 순이다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서, 비교적 낮은 투여량이 비교적 덜 빈번한 간격으로 장기간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 여생 동안 계속 치료를 받는다. 치료적 적용에서는 질환의 진행이 감소되거나 종료될 때까지 또는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 비교적 짧은 간격으로의 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자에게 예방 요법이 투여될 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이지 않으면서, 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 개시내용의 특정한 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료의 지속기간, 사용된 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 이전 병력, 및 의학 분야에 널리 공지되어 있는 기타 인자를 비롯한 다양한 약동학적 인자에 좌우될 것이다.
본 개시내용의 항-IL-17A 항체 또는 단백질의 "치료 유효 투여량"은 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 장애 또는 불능의 예방을 야기할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 통상의 기술자가 인식할 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 개시내용의 항체의 경우에 투여 경로는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 기타 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로는 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 제한 없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
대안적으로, 본 개시내용의 항체 또는 단백질은 비-비경구 경로에 의해, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어, 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 항체 또는 단백질은 항체를 신속 방출로부터 보호할 담체와 함께, 예컨대 이식물, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제제로 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허를 받았거나 또는 일반적으로 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 관련 기술분야에 공지된 의료 장치로 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 조성물은 무바늘 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 또는 4,596,556에 제시된 장치로 투여될 수 있다. 본 개시내용에 유용한 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예는 하기를 포함한다: 제어된 속도로 의약을 분배하는 이식가능한 미세-주입 펌프를 제시한 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하는 치료 장치를 제시한 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 제시한 미국 특허 번호 4,447,233; 연속적 약물 전달을 위한 가변 유동식 이식가능한 주입 장치를 제시한 미국 특허 번호 4,447,224; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 제시한 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 제시한 미국 특허 번호 4,475,196. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 단백질은 생체내 적절한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시킨다. 본 개시내용의 치료 화합물이 (원하는 경우에) BBB를 횡단하도록 보장하기 위해서는, 이를 예를 들어 리포솜 내에 제제화할 수 있다. 리포솜을 제조하는 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포솜은 특정 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되는 1개 이상의 모이어티를 포함할 수 있고, 따라서 표적화된 약물 전달을 증진시킨다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade 1989, J. Cline Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어, 로우(Low) 등의 미국 특허 5,416,016 참조); 만노시드 (Umezawa et al. 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체 (P.G. Bloeman et al. 1995, FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. 1995, Antimicrob. Agents Chernother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al. 1995, Am. J. Physiol.1233:134); p120 (Schreier et al. 1994, J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함하며; 또한, 문헌 [Keinanen and Laukkanen 1994, FEBS Lett. 346:123; Killion and Fidler 1994, Immunomethods 4:273]을 참조한다.
본 개시내용의 용도 및 방법
본 개시내용의 항체 또는 단백질은 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 배양물 중 세포에, 예를 들어 시험관내 또는 생체내 투여되거나 또는 대상체에 예를 들어 생체내 투여되어, 다양한 장애를 치료, 예방 또는 진단할 수 있다.
본 방법은 IL-17A-관련 장애 및/또는 자가면역 및 염증성 장애, 예를 들어 류마티스 관절염 또는 건선을 치료, 예방 또는 진단하는데 특히 적합하다.
구체적으로, 본 개시내용은 IL-17A-관련 장애 및/또는 자가면역 및 염증성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 방법은 본 개시내용에 따른 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 세포를 치료 유효 용량의 본 개시내용의 항체를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 표적 세포 또는 조직에서 IL-17A 또는 IL-17AF 유도된 신호전달 반응을 감소시키거나 억제하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 세포를 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 예컨대 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 IL6, CXCL1, IL-8, GM-CSF 및/또는 CCL2의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 상세한 설명에서, 어구 "IL-17A/AF 매개 질환" 또는 "IL-17A/AF-관련 장애"는 질환 또는 상태의 원인, 발생, 진행, 지속 또는 병리상태를 비롯하여, 질환 또는 의학적 상태에 있어서 직접적이든 간접적이든 IL-17A 또는 IL-17AF가 역할을 하는 모든 질환 및 의학적 상태를 포괄한다. 따라서 이들 용어는 비정상적 IL-17A/AF 수준과 연관되거나 이를 특징으로 하는 상태 및/또는 표적 세포 또는 조직에서 IL-17A/AF 유도된 활성, 예를 들어 IL-6 또는 GRO-알파의 생산을 감소 또는 억제시키는 것에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 상태를 포함한다. 이는 염증성 상태 및 자가면역 질환, 예컨대 관절염, 류마티스 관절염 또는 건선을 포함한다. 이는 또한 알레르기 및 알레르기성 상태, 과민 반응, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭성 섬유증 및 기관 또는 조직 이식 거부를 포함한다.
예를 들어, 본 개시내용의 항체 또는 단백질은 동종이식편 거부 또는 이종이식편 거부를 비롯하여 심장, 폐, 심장-폐 조합, 간, 신장, 췌장, 피부 또는 각막 이식 수용자의 치료를 위해, 및 예컨대 골수 이식 후 이식편-대-숙주 질환, 및 기관 이식 연관 동맥경화증의 예방을 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용의 항체 또는 단백질은, 이에 제한되지는 않지만, 자가면역 질환 및 염증성 상태, 특히 자가면역 요인을 포함하는 병인을 갖는 염증성 상태, 예컨대 관절염 (예를 들어 류마티스 관절염, 만성 진행성 관절염 및 변형성 관절염) 및 류마티스성 질환, 예컨대 골 손실, 염증성 통증을 수반하는 염증성 상태 및 류마티스성 질환, 척추관절병증, 예컨대 강직성 척추염, 라이터 증후군, 반응성 관절염, 건선성 관절염, 소아 특발성 관절염 및 장병증성 관절염, 골부착부염, 과민증 (기도 과민증 및 피부 과민증을 둘 다 포함) 및 알레르기의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다. 본 개시내용의 항체가 사용될 수 있는 특정 자가면역 질환은 자가면역 혈액 장애 (예를 들어 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 순수 적혈구 빈혈 및 특발성 혈소판감소증 포함), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 염증성 근육 질환 (피부근염), 치주염, 다발연골염, 경피증, 베게너 육아종증, 피부근염, 만성 활성 간염, 중증 근무력증, 건선, 스티븐-존슨 증후군, 특발성 스프루, 자가면역 염증성 장 질환 (예를 들어 궤양성 결장염, 크론병 및 과민성 장 증후군 포함), 내분비 안병증, 그레이브스병, 사르코이드증, 다발성 경화증, 전신 경화증, 섬유화 질환, 원발성 담즙성 간경변증, 소아 당뇨병 (제I형 당뇨병), 포도막염, 건성 각결막염 및 춘계 각결막염, 간질성 폐 섬유증, 보철물주위 골용해, 사구체신염 (예를 들어 특발성 신증후군 또는 미세 변화 신병증을 비롯한 신증후군이 존재 및 부재), 종양의 다른 유형의 다발성 골수종, 피부 및 각막의 염증성 질환, 근염, 골 이식물의 이완, 대사 장애, (예컨대 비만, 아테롬성동맥경화증 및 다른 심혈관 질환, 예컨대 확장성 심근병증, 심근염, 제II형 당뇨병 및 이상지혈증), 및 자가면역 갑상선 질환 (하시모토 갑상선염 포함), 소형 및 중형 혈관 원발성 혈관염, 대형 혈관 혈관염, 예컨대 거대 세포 동맥염, 화농성 한선염, 시신경척수염, 쇼그렌 증후군, 베체트병, 아토피성 및 접촉성 피부염, 세기관지염, 염증성 근육 질환, 자가면역 말초 신경병증, 면역학적 신장, 간 및 갑상선 질환, 염증 및 아테롬성혈전증, 자가염증성 열 증후군, 면역혈액 장애, 및 피부 및 점막의 수포성 질환을 포함한다. 해부학적으로, 포도막염은 전방, 중간, 후방, 또는 범-포도막염일 수 있다. 이는 만성 또는 급성일 수 있다. 포도막염의 병인은 자가면역 또는 비-감염성, 감염성일 수 있거나, 전신 질환과 연관될 수 있거나, 또는 백반 증후군일 수 있다.
본 개시내용의 항체 또는 단백질은 또한 천식, 기관지염, 세기관지염, 특발성 간질성 폐렴, 진폐증, 폐기종 및 기도의 다른 폐쇄성 또는 염증성 질환의 치료, 예방 또는 개선에 유용할 수 있다.
본 개시내용의 항체 또는 단백질은 또한 골 대사 질환, 예컨대 골관절염, 골다공증 및 다른 염증성 관절염, 및 일반적으로 연령-관련 골 손실을 비롯한 골 손실, 및 특히 치주 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
또한, 본 개시내용의 항체 또는 단백질은 또한 만성 칸디다증 및 다른 만성 진균성 질환, 뿐만 아니라 기생충 감염의 합병증, 뿐만 아니라 바이러스 감염 및 바이러스 감염의 합병증을 치료하는데 유용할 수 있고, 흡연 합병증은 치료의 유망한 방안인 것으로 간주된다.
IL-17 및 그의 수용체의 억제는 특히, 만성 염증성 질환의 치료를 위한 가장 유망한 신규 작용 방식 (MOA)으로, 건선은 최근 IL-17 조절제 약물 개발을 위해 연구되고 있는 여러 질환 중에서 가장 진전된 적응증이다 (Miossec P and Kolls JK. 2012, Nat Rev Drug Discov.10:763-76). 여러 연구는 중등도 내지 중증 판상 건선을 갖는 환자에서 IL-17A를 차단하는 것이 단기적으로 안전하고, 매우 주목할만한 개선을 유도한다는 것을 명백하게 입증하였다 (예를 들어, 문헌 [Hueber W, Patel DD, Dryja T, et al. 2010, Sci Transl Med. ;2:52ra72]). 이들 발견은 예상을 넘어선 것으로, IL-17A가 건선의 발병기전에서 주요 신호전달 분자라는 가설을 확인시켜주었다 (Garber K. 2012,Nat Biotechnology 30:475-477).
또한, 가장 흔한 다발성 경화증 (MS) 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염을 비롯한 여러 동물 모델에서, IL-17은 염증 과정에서 중추적이다 (Bettelli E, et al. 2008, Nature; 453:1051-57, Wang HH, et al. 2011, J Clin Neurosci; 18(10):1313-7, Matsushita T, et al. 2013, PLoS One; 8(4):e64835). IL-17 효과는 주로 염증유발이고, 다른 시토카인과 상승작용한다. IL-17 효과, 예컨대 상피 세포에 의한 케모카인 생산의 유도, 대식세포에서의 인터류킨 (IL)-1b, 종양 괴사 인자 알파 (TNFa) 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)-9의 상향조절, 및 IL 6, IL-8 및 프로스타글란딘 E2의 분비의 유도는, MS 병리상태의 많은 측면과 잘 맞는다. 또한, 마우스에서의 트랜스제닉 과다발현 모델을 비롯하여, 신경염증에서 IL-17의 중추적 역할을 입증하는 데이터가 존재한다 (Haak S et al. 2009, JCI; 119:61-69).
천식은 임상적으로 기류 폐쇄 증상에 의해 나타나는 기도의 이질적 염증성 질환으로, 자발적으로 또는 치료에 반응하여 중증도가 달라진다. 천식은 T 헬퍼 세포 유형 2 (Th2) 세포 및 그의 산물에 의해 유발되는 것으로 간주되었지만, 최근 데이터는 Th2-높은 유전자 서명이 천식 대상체의 단지 ~50%의 기도에 존재함을 시사한다 (Woodruff PG et al. 2009, Am J Respir Crit Care Med 180:388-95). 호중구성 염증은 급성 중증 천식에서 지배적이고; 일부 천식 개체는 흡입용 스테로이드에 대해 우세한 객담 호중구증가증 및 불량한 임상 반응을 나타내고; 객담 호중구증가증은 대용량의 흡입용 및/또는 경구 스테로이드를 복용한 천식 개체에서 우세하다 (Wenzel 2012, Nature Med 18:716-25).
천식의 중증도와 관련이 있는 IL-17A의 증가된 수준은 천식 개체의 순환 및 기도에서 건강한 대조군과 비교되어 보고되어 있다. 알레르기성 폐 염증의 마우스 모델에서의 전-임상 연구는 호중구성 기도 염증 및 스테로이드-저항성 기도 과민성에서 IL-17A 및 그의 수용체 (IL-17RA)에 대한 필요성을 관련시켰다. 따라서, 시험관내 IL-17A의 특성, 천식에서 증가된 양으로의 그의 존재, 및 질환의 전-임상 모델은 스테로이드에 대해 불량하게 반응하는 호중구성 및/또는 Th2-낮은 형태의 질환에서 IL-17A의 역할을 지지한다 (Cosmi L et al. 2009, Am J Respir Crit Care Med 180:388-95).
따라서, 하기 상태 목록은 본 개시내용에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질에 의한 치료를 위한 특히 바람직한 표적을 포함한다: 다발성 경화증, 건선, 천식, 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 및 루푸스 신염.
본 개시내용의 항체 또는 단백질은 예를 들어 상기 언급된 질환의 치료 또는 예방을 위해 단독 활성 성분으로서, 또는 다른 약물, 예를 들어 면역억제제 또는 면역조절제 또는 다른 항염증제 또는 다른 세포독성제 또는 항암제에 대한 예를 들어 아주반트로서 함께, 또는 그와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체는 DMARD, 예를 들어 골드 염, 술파살라진, 항말라리아제, 메토트렉세이트, D-페니실라민, 아자티오프린, 미코페놀산, 타크롤리무스, 시롤리무스, 미노시클린, 레플루노미드, 글루코코르티코이드; 칼시뉴린 억제제, 예를 들어 시클로스포린 A 또는 FK 506; 림프구 재순환 조절제, 예를 들어 FTY720 및 FTY720 유사체; mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신, 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, CCI779, ABT578, AP23573 또는 TAFA-93; 면역억제 특성을 갖는 아스코마이신, 예를 들어 ABT-281, ASM981 등; 코르티코스테로이드; 시클로포스파미드; 아자티오프린; 레플루노미드; 미조리빈; 미코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린 또는 그의 면역억제 상동체, 유사체 또는 유도체; 면역억제 모노클로날 항체, 예를 들어 백혈구 수용체, 예를 들어 MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 또는 그의 리간드에 대한 모노클로날 항체; 다른 면역조절 화합물, 예를 들어 CTLA4의 세포외 도메인의 적어도 일부 또는 그의 돌연변이체, 예를 들어 CTLA4의 적어도 세포외 일부 또는 비-CTLA4 단백질 서열에 연결된 그의 돌연변이체, 예를 들어 CTLA4Ig (예를 들어 ATCC 68629로 지정됨) 또는 그의 돌연변이체, 예를 들어 LEA29Y를 갖는 재조합 결합 분자; 부착 분자 억제제, 예를 들어 LFA-1 길항제, ICAM-1 또는 -3 길항제, VCAM-4 길항제 또는 VLA-4 길항제; 또는 화학요법제, 예를 들어 파클리탁셀, 겜시타빈, 시스플라티눔, 독소루비신 또는 5-플루오로우라실; 항 TNF 작용제, 예를 들어 TNF에 대한 모노클로날 항체, 예를 들어 인플릭시맙, 아달리무맙, CDP870, 또는 TNF-RI 또는 TNF-RII에 대한 수용체 구축물, 예를 들어 에타네르셉트, PEG-TNF-RI; 염증유발 시토카인 차단제, IL1 차단제, 예를 들어 아나킨라 또는 IL1 트랩, 카나키누맙, IL13 차단제, IL4 차단제, IL6 차단제, 다른 IL17 차단제 (예컨대 세쿠키누맙, 브로달루맙, 익세키주맙); 케모카인 차단제, 예를 들어 프로테아제, 예를 들어 메탈로프로테아제의 억제제 또는 활성화제, 항-IL15 항체, 항-IL6 항체, 항-IL4 항체, 항-IL13 항체, 항-CD20 항체, NSAID, 예컨대 아스피린 또는 항감염제 (목록은 언급된 작용제로 제한되지 않음)와 조합되어 사용될 수 있다.
상기에 따라, 본 개시내용은 하기 추가 측면을 제공한다:
치료 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 항-IL-17A 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질, 및 적어도 하나의 제2 약물 물질을 예를 들어 병용하여 또는 차례로 공-투여하는 것을 포함하며, 상기 제2 약물 물질은 예를 들어 상기 나타낸 바와 같은 면역억제/면역조절, 항염증 화학요법 또는 항감염 약물인, 상기 정의된 바와 같은 방법.
또는, 치료 유효량의 a) 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 단백질 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질, 및 b) 예를 들어 상기 나타낸 바와 같은 면역억제/면역조절, 항염증 화학요법 또는 항감염 약물로부터 선택된 적어도 하나의 제2 물질을 포함하는 치료 조합물, 예를 들어 키트. 키트는 그의 투여를 위한 지침서를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질이 다른 면역억제/면역조절, 항염증 화학요법 또는 항감염 요법과 함께 투여되는 경우에, 공-투여되는 조합 화합물의 투여량은 물론, 사용되는 공-약물의 유형, 예를 들어 그것이 DMARD, 항-TNF, IL1 차단제 또는 기타인지에 따라, 사용되는 특정 약물에 따라, 치료할 상태 등에 따라 달라질 것이다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 IL-17A의 수준 또는 IL-17A를 함유하는 세포의 수준을 검출하는데 사용될 수 있다. 이는, 예를 들어 샘플 (예컨대 시험관내 샘플) 및 대조군 샘플을 항-IL-17A 항체 (또는 단백질)와, 항체 및 IL-17A 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 접촉시킴으로써 달성할 수 있다. 항체 (또는 단백질) 및 IL-17A 사이에 형성된 임의의 복합체는 샘플 및 대조군에서 검출되고 비교된다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물을 사용하여 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 검출 방법, 예컨대 ELISA 및 유동 세포측정 검정을 수행할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 샘플 및 대조군 샘플을 IL-17A에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 항체 또는 단백질, 또는 그의 항원-결합 부분과, 항체 또는 그의 부분 및 IL-17A 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 내에서 IL-17A (예를 들어, 인간 IL-17A 항원)의 존재를 검출하거나 IL-17A의 양을 측정하는 방법을 추가로 제공한다. 이어서, 복합체의 형성을 검출하며, 여기서 샘플 및 대조군 샘플 사이의 복합체 형성에 있어서의 차이는 샘플 중의 IL-17A의 존재를 나타낸다.
또한, 본 개시내용의 조성물 (예를 들어, 항체, 단백질, 인간 항체 및 이중특이적 분자) 및 사용 지침서로 이루어진 키트가 본 개시내용의 범위 내에 있다. 키트는 적어도 하나의 추가의 시약, 또는 본 개시내용의 하나 이상의 추가의 항체 또는 단백질 (예를 들어, 제1 항체와 구분되는 표적 항원 상의 에피토프에 결합하는 보체 활성을 갖는 항체)을 추가로 함유할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트의 내용물의 의도되는 용도를 지시하는 표지를 포함한다. 용어 표지는 키트 상에 또는 키트와 함께 제공되거나, 또는 달리 키트에 동반되는 임의의 문서 또는 기록물을 포함한다. 키트는 환자가 상기 정의된 바와 같은 항-IL-17A 항체 치료에 반응할 군에 속하는지 여부를 진단하기 위한 도구를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용이 상세하게 기재되긴 하였지만, 이는 하기 실시예 및 특허청구범위에 의해 추가로 예시되며, 이는 예시적인 것이지 추가로 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
도 1은 XAB1 Fab의 3차원 구조를 제공한다. 도 1a는 공간-충전 표현이다. 도 1b는 카툰 표현이다.
도 2는 인간 IL-17A와의 XAB1 Fv 복합체의 3차원 구조를 제공한다. 도 2a는 2개의 XAB1 Fv 단편을 공간-충전 표현으로 제시하고, 도 2b는 2개의 XAB1 Fv 단편을 카툰 표현으로 제시한다.
도 3은 실시예에 따른 ELISA 결과의 그래프를 제시한다. 그래프 넘버링은 다음과 같이 후보 명칭에 상응한다: 1은 MB440; 2는 MB464; 3은 MB468; 4는 MB444; 5는 MB435; 6은 MB463; 7은 XAB1. 도 3a는 정규화된 신호 대 Fab 농도 (M)를 제시하는 그래프이다. 도 3b는 정규화된 잔여 신호 대 세척 인큐베이션 시간 (시)을 제시하는 그래프이다. 도 3c는 정규화된 신호 대 Fab 경쟁자 농도 (M)를 제시하는 그래프이다.
도 4는 인간 IL-17A와의 XAB2 Fv 복합체의 3차원 구조를 제공한다. 도 4a는 2개의 XAB2 Fv 단편을 공간-충전 표현으로 제시하고, 도 4b는 2개의 XAB2 Fv 단편을 카툰 표현으로 제시한다.
도 5는 인간 IL-17A와의 XAB2 Fv 복합체의 3차원 구조를 근접 관찰도로서 제공한다.
도 6은 인간 IL-17A와의 XAB5 Fv 복합체의 3차원 구조를 제공한다. 도 6a는 2개의 XAB5 Fv 단편을 공간-충전 표현으로 제시하고, 도 6b는 2개의 XAB5 Fv 단편을 카툰 표현으로 제시한다.
도 7은 인간 IL-17A와의 XAB5 Fv 복합체의 3차원 구조를, 항체 L-CDR1의 근접 관찰도로서 제공한다.
도 8은 인간 IL-17A와의 XAB4 Fv 복합체의 3차원 구조를 제공한다. 도 8a는 2개의 XAB4 Fv 단편을 공간-충전 표현으로 제시하고, 도 8b는 2개의 XAB4 Fv 단편을 카툰 표현으로 제시한다.
도 9는 인간 IL-17A와의 XAB4 Fv 복합체의 3차원 구조를, 항체 L-CDR1의 근접 관찰도로서 제공한다.
도 10은 인간 IL-17A와의 XAB4 Fv 복합체의 3차원 구조를, 항체 L-CDR2의 근접 관찰도로서 제공한다.
도 11은 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 모델에서 XAB4에 대한 치료 스코어를 제시하는 그래프이다.
도 12는 EAE 모델에서 동물의 치유적 체중 변화 (%)를 제시하는 그래프이다.
도 13은 EAE 모델에서 치유적 누적 스코어를 제시하는 그래프이다.
도 14 및 15는 EAE 모델에서 치료-전 및 치료-후 치유적 스코어의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 16은 EAE 모델에서 XAB4에 대한 예방적 스코어를 제시하는 그래프이다.
도 17은 EAE 모델에서 동물의 예방적 체중 변화 (%)를 제시하는 그래프이다.
도 18은 EAE 모델에서 예방적 누적 스코어를 제시하는 그래프이다.
도 19는 EAE 모델에서 예방적 최대 스코어를 제시하는 그래프이다.
도 20은 EAE 모델에서 EAE 발병을 제시하는 그래프이다.
도 21은 인간 성상세포 모델에서 IL-6 방출에 대한 XAB4의 길항 효과를 제시하는 그래프이다.
도 22는 인간 성상세포 모델에서 CXCL1 방출에 대한 XAB4의 길항 효과를 제시하는 그래프이다.
도 23은 인간 성상세포 모델에서 IL-8 방출에 대한 XAB4의 길항 효과를 제시하는 그래프이다.
도 24는 인간 성상세포 모델에서 GM-CSF 방출에 대한 XAB4의 길항 효과를 제시하는 그래프이다.
도 25는 인간 성상세포 모델에서 CCL2 방출에 대한 XAB4의 길항 효과를 제시하는 그래프이다.
실시예
XAB1은 인간 IgG1/κ 모노클로날 항체이다. 이는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 생성되었다. 간략하게, 메다렉스 시스템을 사용하였다. 마우스를 재조합 인간 IL-17A로 면역화시켰다. 마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사시키고, 비장 세포를 수거하고, PEG 4000을 사용하여 골수종 세포주와 융합시켰다. 융합된 세포를 복막 세포의 피더 층을 갖는 웰에 플레이팅하였다. 배양 세포로부터 상청액을 채취하고, ELISA에 의해 IL-17A 반응성 mAb에 대해 검정하였다. IL-17A mAb 생산에 대해 양성인 클론을 선택하고 플레이팅하였다.
XAB1의 분비의 원인이 되는 하이브리도마를, 초기의 유망한 항체/항원 결합 특성, 예컨대 IL-17A에 대한 결합 친화도, IL-17A의 그의 수용체에 대한 결합을 차단하는 능력, 및 시험관내 검정에서 IL-17A 매개 생물학적 효과를 차단하는 능력을 기반으로 한 추가의 특성화를 위해 확인하였다.
XAB1의 아미노산 서열은 서열 14 (중쇄) 및 서열 15 (경쇄)이다. XAB1은 후속 친화도 성숙을 위해 선택되었다.
구조-유도 친화도 성숙에 대한 첫번째 단계로서, 자유 상태 XAB1 Fab의 결정 구조 뿐만 아니라 상응하는 인간 IL-17A와의 Fv 복합체의 결정 구조를 하기 기재된 바와 같이 결정하였다. 인간 IL-17A와의 XAB1 Fv 복합체의 3차원 구조의 분석은 동시에 수행될 합리적 친화도 성숙 과정, 및 대안으로서, 보다 무작위화된 과정을 가능하게 하였다. 추가의 세부사항을 이하에 제공한다.
또한, X선 결정학을 사용하여, 생성된 친화도 성숙 변이체 항체 중 일부를 특성화하였다. 친화도 성숙 변이체로부터의 결정 데이터의 분석은 변이체 항체의 결합 거동에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 하였고, 하기에 추가로 기재될 바와 같은 일부 예상치 못한 특성이 발견되었다.
실시예 1. 자유 상태 XAB1 Fab의 결정 구조
(i) 물질 및 방법
표준 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 XAB1 Fab 항체 단편을 수득하였다. 간략하게, Fab를 클로닝하고, 중쇄에 대해 C-말단 헥사히스티딘 태그를 갖는 이. 콜라이 W3110에서 발현시켰다. 재조합 단백질을 Ni-킬레이트 크로마토그래피에 이어 10mM 트리스 pH 7.4, 25mM NaCl 중 SPX-75 칼럼 상에서의 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이어서 XAB1 Fab를 한외여과에 의해 10.4mg/ml로 농축시키고, 결정화시켰다.
표준 결정화 프로토콜이 이어졌다. 간략하게, 시팅 드롭 증기 확산 방법을 사용하여 결정을 SD2 96 웰-플레이트에서 19℃에서 성장시켰다. 단백질 원액을 40% PEG 300, 0.1M 인산나트륨-시트르산나트륨 pH 4.2를 함유하는 결정화 완충제와 함께 1:1로 혼합하였다. 전체 드롭 크기는 0.4 μl였다. X선 데이터 수집 전에, 1개의 결정을 나일론 냉동-루프에 마운팅하고, 액체 질소로 직접 급속 냉각시켰다.
표준 프로토콜을 사용하여 X선 데이터 수집 및 프로세싱을 수행하였다. 간략하게, 2.1Å 해상도에 대한 X선 데이터를 스위스 라이트 소스(Swiss Light Source), 빔라인 X10SA에서, MAR225 CCD 검출기로, 1.0000Å X선 방사선을 사용하여 수집하였다. 총, 각각 1.0° 진동의 180개의 영상을 결정에서-검출기까지 거리 190mm에서 기록하고, HKL2000 소프트웨어 패키지로 프로세싱하였다. 결정은 공간군 C2에 속하였고, 셀 파라미터는 a=51.63Å, b=132.09Å, c=77.25Å, α = 90.00°, β = 98.88°, γ = 90.00° 및 비대칭 유닛 내 1개의 XAB1 Fab 분자였다. 2.1Å 해상도에 대한 R-sym은 10.4%였고, 데이터 완전성은 99.0%였다.
구조는 프로그램 PHASER을 사용하여 분자 대체에 의해 결정하였다. VH/VL 및 CH1/CL 도메인 검색 모델은 PDB 엔트리 1HEZ로부터 생성되었다. 모델에 대해 더 이상 추가의 유의한 개선이 이루어질 수 없을 때까지, 프로그램 Coot (크리스탈로그래픽 오브젝트-오리엔티드 툴키트(Crystallographic Object-Oriented Toolkit)) 및 CNX (크리스탈로그래피 & NMR 익스플로러(Crystallography & NMR eXplorer)) 버전 2002를 사용하여 반복적인 모델 구축 및 정밀화를 수행하였다. 모든 데이터에 대한 최종 R- 및 R-자유는 각각 0.188 및 0.231이었다. 최종 정밀화 모델은 각각 0.004Å 및 0.9°의, 이상적인 결합 길이 및 결합각으로부터의 근평균 제곱 편차 (RMSD)를 나타내었다.
(ii) 결과
XAB1 Fab의 X선 정밀화 결과를 표 9에 제공하고, 3차원 구조를 도 1에 제시한다.
<표 9> 프로그램 CNX에 의한 XAB1 Fab의 X선 정밀화.
Figure 112015085607095-pct00009
Figure 112015085607095-pct00010
Figure 112015085607095-pct00011
도 1은 실시예 1에서 수득된 바와 같은 XAB1 Fab의 3차원 구조를 제공한다. 도 1a는 공간-충전 표현이다. 도 1b는 카툰 표현이다. XAB1 Fab의 중쇄 및 경쇄는 각각 암회색 및 연회색으로 보인다.
실시예 2. 인간 IL-17A와의 XAB1 Fv 복합체의 결정 구조: 구조-유도 친화도 성숙을 위한 파라토프의 분석
(i) 물질 및 방법
표준 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 XAB1 Fv 항체 단편을 수득하였다. 간략하게, Fv를 클로닝하고, 중쇄에 대해 C-말단 헥사히스티딘 태그 및 경쇄에 대해 C-말단 Strep-태그를 갖는 이. 콜라이 W3110에서 발현시켰다. 재조합 단백질을 Ni-킬레이트 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
이어서 인간 IL-17A와의 XAB1 Fv 단편 복합체를 표준 방법론을 사용하여 제조하였다. 간략하게, 인간 IL-17A (1.1mg)를 과량의 Fv (2.7mg)와 혼합하고, 복합체를 10mM 트리스 pH 7.4, 25mM NaCl 중에서 S100 크기-배제 크로마토그래피하였다. 이어서 단백질 복합체를 한외여과에 의해 21.2mg/ml로 농축시키고, 결정화시켰다.
표준 결정화 프로토콜이 이어졌다. 간략하게, 시팅 드롭 증기 확산 방법을 사용하여 결정을 SD2 96 웰-플레이트에서 19℃에서 성장시켰다. 단백질 원액을 10% PEG 20,000, 0.1M 비신 pH 9.0, 2.0% (v/v) 디옥산을 함유하는 결정화 완충제와 함께 1:1로 혼합하였다. 전체 드롭 크기는 0.4 μl였다. X선 데이터 수집 전에, 1개의 결정을 간단히 20% PEG 20,000, 30% 글리세롤을 함유하는 결정화 완충제의 1:1 믹스로 옮긴 다음, 액체 질소로 급속 냉각시켰다.
표준 프로토콜을 사용하여 X선 데이터 수집 및 프로세싱을 수행하였다. 간략하게, 3.0Å 해상도에 대한 X선 데이터를 스위스 라이트 소스, 빔라인 X10SA에서, MAR225 CCD 검출기로, 1.0000Å X선 방사선을 사용하여 수집하였다. 총, 각각 1.0° 진동의 110개의 영상을 결정에서-검출기까지 거리 300mm에서 기록하고, HKL2000 소프트웨어 패키지로 프로세싱하였다. 결정은 공간군 P21212에 속하였고, 셀 파라미터는 a=184.31Å, b=55.81Å, c=70.99Å, α = β = γ = 90°였다. 3.0Å 해상도에 대한 R-sym은 11.2%였고, 데이터 완전성은 99.9%였다.
구조는 프로그램 PHASER을 사용하여 분자 대체에 의해 결정하였다. XAB1 Fv 검색 모델은 이전에 결정된 XAB1 Fab의 결정 구조로부터 생성되었다 (실시예 1 참조). IL-17A 검색 모델은 공개된 인간 IL-17F 결정 구조 (PDB 엔트리 1jpy)로부터 생성되었다. 모델에 대해 더 이상 추가의 유의한 개선이 이루어질 수 없을 때까지, Coot (크리스탈로그래픽 오브젝트-오리엔티드 툴키트) 및 CNX (크리스탈로그래피 & NMR 익스플로러) 버전 2002를 사용하여 반복적인 모델 구축 및 정밀화를 수행하였다. 모든 데이터에 대한 최종 R- 및 R-자유는 각각 0.215 및 0.269였다. 최종 정밀화 모델은 각각 0.007Å 및 1.0°의, 이상적인 결합 길이 및 결합각으로부터의 근평균 제곱 편차 (RMSD)를 나타내었다.
(ii) 결과
분자 대체 계산은 2개의 XAB1 Fv 단편이 결합된 1개의 IL-17A 동종이량체를 포함하는 이량체 복합체를 밝혀내었다. 인간 IL-17A와의 XAB1 Fv 복합체의 X선 정밀화 결과를 표 10에 제공하고, 이러한 복합체의 3차원 구조를 도 2에 제시한다. 각각의 XAB1 Fv는 IL-17A 서브유닛 둘 다와 접촉하지만, 대부분의 분자간 접촉 (묻힌 표면의 약 96%)은 단지 1개의 IL-17A 서브유닛만이 기여한다.
<표 10> 프로그램 CNX에 의해 수득된 IL-17A와의 XAB1 Fv 복합체의 X선 정밀화.
Figure 112015085607095-pct00012
Figure 112015085607095-pct00013
Figure 112015085607095-pct00014
도 2는 실시예 2에서 수득된 바와 같은 인간 IL-17A와의 XAB1 Fv 복합체의 3차원 구조를 제공한다. 도 2a는 2개의 XAB1 Fv 단편을 공간-충전 표현으로 제시하고; IL-17A 동종이량체는 카툰 표현으로 제시한다. 도 2b는 2개의 XAB1 Fv 단편을 카툰 표현으로 제시하고; IL-17A 동종이량체는 공간-충전 표현으로 제시한다. XAB1 Fv의 중쇄 및 경쇄는 각각 암회색 및 연회색으로 나타내어진다. IL-17A 동종이량체 중 1개의 쇄는 연회색으로 나타내어지고, 다른 것은 암회색으로 나타내어진다.
복합체의 상세한 분석을 수행하였다. 프로그램 Coot 및 Pymol을 사용하여 결정 구조의 면밀한 육안 검사를 수행하고, 항체-항원 계면에 묻힌 단백질 표면의 양을 CCP4 프로그램 스위트의 프로그램 AREAIMOL로 계산하였다. 분자간 접촉은 항체와 항원 원자 사이에 3.9Å의 컷-오프 거리를 사용하여 정의하였다. 결합 개관은 다음과 같이 요약될 수 있다. XAB1의 결합은 대칭적이고; 각각의 Fv 단편이 IL17A 동종이량체 상의 동등한 에피토프에 결합한다.
각각의 Fv 단편의 결합은 조합된 표면의 평균 1732Å2에 묻혔고, 30개의 항체 및 25개의 IL-17A 아미노산 잔기가 관여되었다. XAB1 경쇄의 묻힌 표면에 대한 기여 (약 560Å2)는 중쇄의 기여 (약 275Å2)보다 더 컸다. 또한, CDRH2는 IL-17A에 대해 어떠한 직접적인 접촉도 하지 않았고, 단백질 항원과 너무 떨어져 친화도 성숙을 위한 기회를 제공하지 못하는 것으로 보였다. CDRH1 기여는 1개의 아미노산 측쇄만 (Tyr32)으로 제한되는 것으로 보였고; 이 CDR도 또한 IL-17A와 너무 떨어져 아미노산 치환을 통한 친화도 성숙의 기회를 제공하지 못하였다. XAB1 CDRH3은 IL-17A와 다중으로 치밀하게 접촉하였다. 그러나, 이러한 영역 내 구조의 면밀한 검사는 점 돌연변이에 의해 이들 접촉을 추가로 증진시킬 임의의 기회를 밝혀내는데 실패하였고; 따라서, CDRH3은 친화도 증진을 위한 표적 영역으로서 부적합한 것으로 간주되었다. 대조적으로, 경쇄 CDR의 검사는 친화도 성숙을 위한 다중의 기회를 나타내었다. 3개의 경쇄 CDR 중에서 CDRL1이 가장 유망한 것으로 간주되었고, 이러한 관측에 기초하여 본 발명자들은 IL-17A 잔기 Arg124, Phe133 및 Tyr85에 대해 접촉을 강화시키기 위해 경쇄의 위치 30 내지 32를 무작위화할 것을 제안하였다.
합리적 설계에 의한 친화도 성숙
상기 결과에 기초하여, 동종이량체 IL-17A와의 XAB1 계면은 비교적 작고, 경쇄로부터의 우세한 기여, CDRH2의 관여 없음, 및 CDRH1에 의한 주로 간접적인 기여 (즉 CDRH3의 안정화를 통해)를 특징으로 하는 것으로 관찰되었다. 따라서, XAB1의 중쇄는 친화도 성숙을 위해 유망한 기회를 제공하는 것으로 보이지 않았다.
대조적으로, XAB1 경쇄는 아미노산 잔기 30 내지 32에서 최대 4개의 아미노산 잔기의 임의적인 삽입에 의한 (CDRL1), 아미노산 51 내지 53 및 56 (CDRL2) 및 아미노산 잔기 92 및 93에서 최대 4개의 아미노산 잔기의 임의적인 삽입에 의한 일부 기회를 제공하였다.
동종이량체 인간 IL-17F에 대한 공개된 결정 구조, 및 인간 수용체 IL-17RA와의 복합체로의 동종이량체 IL-17F의 구조의 이용가능성은 결정화된 IL-17A 및 XAB1 (및 그의 변이체)와의 복합체로의 IL-17A의 관측된 구조에 기초하여 예측이 가능하게 하였다.
IL-17F와 IL-17A 사이에 예측되는 구조적 유사성 (서열 동일성 및 상동성에 기초함)을 조사하였다. IL-17F 및 IL-17A는 구조적으로 비슷하였다. 본 발명자들은 IL-17A가 공개된 IL-17F/IL-17RA 복합체에 대해 밝혀진 것 (Ely LK et al. 2009, Nat Immunol. 10:1245-51)과 동일한 방식으로 그의 수용체의 N-말단 도메인에 결합할 것으로 가설을 세웠다.
인간 IL-17A 및 IL-17F에 대해 관측된 구조, 및 다른 종으로부터 유래된 IL-17A의 서열과 함께 공지된 서열의 비교에 기초하여, 본 발명자들에 의해 수많은 추가의 예측이 이루어졌다:
XAB1 (및 XAB1에 의해 표적화되는 에피토프에 대해 개선된 친화도를 갖는 것으로부터 유래된 항체 변이체)은 인간 IL-17A에 대해 매우 특이적일 것으로 예상되었다. 이러한 항체는 다른 종으로부터의 IL-17A와 일부 교차-반응성을 보유할 것으로 가설을 세웠다 (종 사이에 높은 정도로 보존된 서열 동일성 또는 상동성에 기초함). 그러나, 이용가능한 서열 데이터 및 구조 예측에 기초하여 IL-17A의 종 변이체와 어느 정도까지의 교차-반응성을 예상할 수 있을지 분명하지 않았다. 다른 인터류킨과의 구조적 유사성의 결여를 고려하면, 이러한 분자 (인간 또는 다른 종으로부터의)와의 교차-반응성의 가능성은 거의 없을 것으로 예상되었다.
또한, IL-17A 및 IL-17F (특히 N-말단 영역)의 서열 사이의 차이는 본 개시내용의 항-IL-17A 항체가 IL-17F에 결합하지 않을 것이라고 예측하게 했다. 예를 들어, 2개의 결정 구조의 오버레이는 입체 장애가 이들 항체 및 IL-17F 사이의 결합을 막을 것임을 나타내었다. 추가로, IL-17AF 이종이량체의 구조에 대한 외삽은 또한 특히 N-말단 영역에서의 이러한 간섭이 항체의 IL-17AF 이종이량체에 대한 결합을 방해하여 IL-17AF에 대한 결합의 결여, 즉 IL-17AF 이종이량체에 대한 이들 항체에 의한 교차-반응성의 결여를 야기할 것임을 시사하였다.
실시예 3. 친화도 성숙 항체 변이체의 생성
초기 항체 XAB1의 실제 친화도 성숙은 상기 논의된 이유로 인해 경쇄에 초점이 맞추어졌다. 작업은 3단계: (i) 라이브러리 생성, (ii) 라이브러리 스크리닝, 및 (iii) 후보 특성화로 수행되었다.
단백질 조작 작업 (즉 친화도 성숙)은 취급의 용이성으로 인해 Fab 단편 포맷으로 수행하였다. 조작 후에 후보를 다시 완전한 IgG로 포맷시켰다.
(i) 라이브러리 생성
경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 돌연변이시켜 유전자 변이체 라이브러리를 생성하였다. 라이브러리 생성을 위해 2가지 상이한 접근법 (A 및 B)을 사용하여 2종의 별개의 라이브러리를 제공하였다.
1) 방법 A - 오류 유발 PCR에 의한 무작위 돌연변이:
XAB1의 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 DNA 영역을 오류 유발 PCR을 사용하여 무작위로 돌연변이시켰다. 보다 상세하게, 이 영역을 높은 빈도로 돌연변이를 도입시키는 폴리머라제 뮤타자임 II를 사용하여 증폭시켰다 (보다 상세한 사항에 대해서는, 스트라타진(Stratagene) #200550에 의해 공급되는 진모르프 II(GeneMorph II) 무작위 돌연변이유발 키트에서 공급되는 지침 참조). 그러나, 임의의 적합한 무작위 돌연변이 기술 또는 전략을 사용할 수 있다.
이어서, 잘라내어 XAB1의 발현 벡터로 붙이는 것에 의해 PCR 단편 변이체의 풀을 클로닝하였다. 본질적으로, 모, 비돌연변이 서열을 발현 벡터에서 잘라내고, 무작위로 돌연변이유발된 서열을 그 위치에 붙여 대체하였다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 이를 달성하였다.
이는 다양한 무작위로 돌연변이유발된 가변 도메인 서열을 포함하는 발현 벡터 변이체 라이브러리를 생성하였다.
2) 방법 B - 합리적 설계에 의한 돌연변이:
이러한 접근법 하에, 라이브러리의 생성은 친화도 성숙을 위한 선작업으로서 수행된 구조적 분석에 의해 유도되었다. 상기 기재된 결정 구조로부터 유래된 에피토프 및 파라토프 정보에 기초하여 특정 아미노산 잔기 (특히 XAB1의 경쇄의 CDR1 내)를 표적화 하였다.
결정 구조 정보에 기초하여 선택된 3개의 아미노산 잔기를 완전히 무작위화하였다. 구축을 위해 표준 분자 생물학 접근법을 사용하였다.
첫번째로, 적절한 CDR 및 경쇄 프레임워크의 제1 부분을 코딩하는 가변 영역 단편을 축중성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 즉, CDR을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 정의된 위치 또는 위치들에서 다양한 염기가 제공되게 하는 방식으로 합성하였다. 올리고뉴클레오티드의 설계는 NNK 축중화 코돈 (여기서 N은 모든 4개의 염기, A, T, C 및 G, 및 G 및 T의 경우에 K를 의미함)에 의해 CDR 내 특이적으로 표적화된 아미노산 위치의 무작위화를 가능하게 하였고, 그러한 위치에서 모든 20개의 천연 아미노산을 허용하였다.
이러한 제1 단계에 이어, 첫번째 것에 중첩되고 경쇄의 나머지 부분을 코딩하는 제2 단편을 또한 PCR에 의해 증폭시켰다. 이어서 양 단편을 "어셈블리" PCR에 의해 어셈블리시켜 완전한 가변 경쇄를 생성하였고, '잘라내고 붙이는' 방식으로 발현 벡터로 다시 클로닝하였다. 이로써, 모 서열은 다양한 합리적으로 돌연변이된 서열로 대체되었고, 이에 의해 특정 아미노산 위치에서 모든 20개의 천연 아미노산이 나타내어졌다.
(ii) 라이브러리 스크리닝
일단 XAB1 변이체를 코딩하는 서열을 포함하는 라이브러리가 생성되면, 모 XAB1 서열보다 우월한 특성, 예를 들어 IL-17A에 대한 더 높은 친화도를 갖는 것을 선택하기 위해 이를 스크리닝하는 것이 필요하였다.
2가지 스크리닝 기술을 사용하였다. 첫번째로, 고처리량 스크리닝은 "콜로니 여과 스크리닝" (CFS)에 의해 수행하였다. 이 검정은 많은 수의 클론의 편리한 스크리닝을 가능하게 하였다. 이는 ELISA 스크리닝 이전에 양성 히트에 대한 감소를 허용하였고, 라이브러리 크기가 "방법 B"에서의 라이브러리 크기 (단지 8000)와 비교하여 훨씬 더 크기 때문에 (>105) 무작위 접근법 "방법 A"를 위해 특히 유용하였다. ELISA 스크리닝은 104개 클론 이하에 대해 편리하고, 보다 정량적인 결과를 제공한다.
1) 콜로니 여과 스크리닝 (CFS):
CFS를 위한 프로토콜은 문헌 [Skerra et al. 1991, Anal Biochem 196:151-155]을 기반으로 하였다. 약간의 변형을 가하였다.
Fab 변이체 라이브러리를 발현하는 이. 콜라이 콜로니를 LB 한천 및 글루코스를 함유하는 페트리 디쉬의 상부 필터 상에서 성장시켰다. 병행하여, PVDF 막을 표적 단백질 (IL-17A)로 코팅하였다. 코팅된 막을 한천 플레이트 상에 위치시켰다. Fab 단편을 발현하는 이. 콜라이의 콜로니가 존재하는 필터를 막의 상부에 위치시켰다. 세포에 의해 발현된 Fab 단편이 콜로니로부터 확산되어 표적 IL-17A에 결합하였다. 이와 같이 PVDF 막 상에 포획된 Fab 단편을 이어서 웨스턴 염색을 위해 알칼리성 포스파타제와 접합된 이차 항체를 사용하여 검출하였다. 개선된 결합 특성을 갖는 변이체만을 선택하기 위한 조건은 참조로서 XAB1을 사용하여 이전에 확립되었다.
보다 구체적으로, 라이브러리에 의한 이. 콜라이 세포의 형질전환 후에, 세포를 LB 한천 + 1% 글루코스 + 관심 항생제를 함유하는 페트리 디쉬 상에 위치시킨 듀라포어(Durapore)™ 막 필터 (0.22 μm GV, 밀리포어(Millipore)®, cat #GVWP09050) 상에 스프레딩하였다. 플레이트를 밤새 30℃에서 인큐베이션하였다.
PVDF 막 (이모빌론(Immobilon)-P, 밀리포어®, cat #IPVH08100)을 메탄올 중에 사전-습윤시켜두고, PBS 중에서 세척하고, huIL-17A 용액으로 PBS 중 1 μg/ml로 코팅하였다. 막을 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 코팅 후에, 막을 트리스 완충 염수 (TBS) + 0.05% 트윈 (TBST) 중에서 2회 세척하고, 5% 유액 TBST 중에서 실온에서 2시간 차단시켰다. 이어서, 막을 TBST 중에서 4회 세척하고, 1mM IPTG를 함유하는 2xYT 배지 중에 침지시켰다. 포획 막으로 불리는 이 막을 1mM IPTG + 관심 항생제를 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 위치시키고, 상부에 콜로니를 함유하는 듀라포어 막으로 덮었다. 생성된 샌드위치를 30℃에서 4시간 인큐베이션하였다.
이러한 인큐베이션 후에, 포획 막을 TBST로 4회 세척하고, 5% 유액 TBST 중에서 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 이어서, 막을 TBST로 1회 세척하고, 이차 항체 (항-hu_카파 경쇄 항체, 알칼리성-포스파타제 (AP) 접합됨, 시그마(Sigma) # A3813, 2% 유액 TBST 중에 1:5000으로 희석됨)와 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 그 후에, 막을 TBST 중에서 4회, TBS 중에서 1회 세척하고, 기질 용액 (시그마패스트(SigmaFast) BCIP/NBT 정제, 10ml H2O 중 1개의 정제) 중에서 인큐베이션하였다. 신호가 예상 강도에 이르면, 막을 물로 세척하고 건조되게 하였다.
포획 막에서 신호 발생 후에, 모 XAB1보다 더 강한 신호를 제공하는 콜로니를 골라내어 하기 기재된 이차 ELISA 스크리닝이 진행되게 하였다.
2) ELISA 스크리닝:
CFS 후에, ELISA를 사용하여 CFS에 의해 선택된 후보를 스크리닝하였다. 간략하게, 오류-유발 PCR 돌연변이유발에 의해 확인된 비교적 적은 수의 변이체 (즉 라이브러리 A)의 경우에, ELISA를 수동으로 96 웰 포맷으로 수행하였다. 대조적으로, 합리적 설계에 의해 구축된 라이브러리 (방법 B)의 경우에, IL-17A에 대한 그들의 상이한 결합 친화도 사이를 구별하고 가장 높은 친화도를 갖는 클론을 확인할 수 있도록 ELISA 수준에서 스크리닝될 보다 더 많은 수의 개선된 클론이 필요하였다. 이 목적을 위해 ELISA 로봇을 384 웰 플레이트 포맷으로 사용하였다. 그러나, ELISA 프로토콜은 각 경우에 동일하였고, 유일한 차이는 시약의 부피였다.
a) 세포 배양:
클론을 먼저 2xYT 배지 + 1% 글루코스 + 관심 항생제 중에서 30℃, 900rpm에서 밤새 성장시켰다. 이들 배양물을 함유하는 플레이트를 마스터 플레이트라 불렀다. 다음날, 마스터 플레이트로부터의 배양물 분취액을 2xYT 배지 + 0.1% 글루코스 + 관심 항생제를 함유하는 발현 플레이트로 옮겼다. 이들 플레이트를 약 3시간 동안 30℃, 900rpm에서 인큐베이션하였다. 이어서 이소프로필 β-D-1-티오갈라토피라노시드 (IPTG) 용액을 최종 농도 0.5mM로 첨가하였다. 플레이트를 30℃, 990 rpm에서 밤새 인큐베이션하였다.
다음날, 용해 완충제 (2x) 보레이트 완충 염수 (BBS) 용액 (테크노바(Teknova) #B0205) + 2.5mg/ml 리소자임 + 10u/ml 벤조나제)를 배양물에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션한 다음, 차단을 위해 12.5 % 유액 TBST를 첨가하였다. 30분 인큐베이션 후에, 세포 용해물을 2% 유액 TBST 중에서 1:10으로 희석시키고, ELISA 플레이트로 옮겼다.
b) ELISA:
ELISA 플레이트 (눈크 맥시소르프(Nunc Maxisorp))를 huIL-17A 용액으로 1 μg/ml로 1시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 TBST로 1회 세척하고 5% 유액 TBST로 1시간 차단시켰다. 차단 후에, 플레이트를 TBST로 3회 세척한 다음, 희석된 세포 용해물을 플레이트 상에 로딩하고 1시간 인큐베이션하였다. 그 후에, 플레이트를 TBST로 3회 세척하고, AP 접합된 이차 항체와 1시간 인큐베이션하였다.
마지막으로 플레이트를 TBST로 3회 세척한 다음 기질 용액 (아토포스(AttoPhos) 기질 세트, 로슈(Roche) #11 681 982 001)과 인큐베이션하였다. 전체 과정은 실온에서 수행하였다.
상기 기재된 "전형적인" ELISA에 더하여, 표적 단백질에 대해 매우 높은 친화도 (피코-몰 범위에서)를 갖는 클론 사이의 더 나은 구별을 위해 변형된 ELISA를 또한 수행하였다. 하기 상술되는 바와 같이, "오프-레이트" ELISA 및 "경쟁" ELISA가 이러한 목적을 위해 개발되었다.
c) "오프-레이트" ELISA:
본 검정의 경우에, "전형적인" ELISA 프로토콜과 비교하여 변형은 결합 단계 (ELISA 플레이트에서 세포 용해물의 인큐베이션) 후의 세척 단계로 여겨진다. "전형적인" 프로토콜에서, 플레이트는 TBST로 3회 세척되었다. 세척 용액은 분배되고 어떠한 인큐베이션 시간없이 즉시 흡인되었다. "오프-레이트" ELISA의 경우에, 플레이트는 적어도 3시간 동안 6회 세척되었다. 이러한 긴 세척은 검정의 엄격성을 증가시키고, 느린 오프-레이트를 갖는 클론을 확인가능하게 하였다.
d) "경쟁" ELISA:
이러한 변형된 ELISA 프로토콜은 결합 단계 후에 가외의 단계를 포함하였다. 세포 용해물의 인큐베이션 후에, 플레이트를 TBST로 3회 세척한 다음, 모 XAB1 용액 (2% 유액 TBST 중 200 nM)을 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 과량의 모 Fab와 함께 이러한 긴 인큐베이션은, "오프-레이트" ELISA의 경우에서와 같이, 느린 오프-레이트를 갖는 클론을 확인가능하게 하였고, 이는 피코몰 범위의 친화도를 갖는 클론들 사이의 더 나은 구별을 야기하였다. 나머지 프로토콜은 "전형적인" ELISA 프로토콜과 유사하였다. 라이브러리로부터의 Fab 변이체가 중쇄의 C-말단에 Flag 태그를 갖지만 경쟁을 위해 사용된 모 XAB1 Fab는 그렇지 않기 때문에, 이 경우에 사용된 이차 항체는 AP 접합된 항-Flag 태그 항체였다.
(iii) 후보 특성화
스크리닝 동안 확인된 히트는 추가의 물리화학적 특성화를 위해, 그리고 IL-17A에 대한 높은 친화도 결합, 및/또는 추가의 검정에서의 다른 유리한 특성을 확인하기 위해 더 큰 규모로 생성되었다. 이는 이하에서 보다 상세하게 기재된다.
(iv) 결과: XAB1의 친화도 성숙에 따른 후보의 스크리닝 및 초기 특성화
1) 무작위 돌연변이유발 접근법 (방법 A):
오류-유발 PCR 라이브러리 생성 이후 돌연변이 비율은 유전자당 2 내지 3개의 돌연변이에서 최대인 것으로 발견되었다. 콜로니 여과 스크리닝에 의해 약 3x104개의 클론을 스크리닝하였고, 개선되고 결합에 대해 오프-레이트 및 경쟁 ELISA를 진행시킬 것으로 다수의 94개의 클론이 확인되었다. 서열분석 결과와 함께 ELISA 데이터는 개선을 위한 3개의 잠재적인 핫 스팟, LCDR1에서 위치 28에서 Gly에서 Val (G28V); 프레임워크 3에서 위치 66에서 Gly에서 Val (G66V) 또는 Ser (G66S); LCDR3에서 Asn92에서 Asp (N92D) (데이터는 제시되지 않음, 그러나 위치는 XAB2, VL, 즉 서열 25의 위치와 동일함)를 강조하는 6개의 후보가 확인되게 하였다.
클론 중 하나에서 정지 코돈이 관측되었지만, 사용된 이. 콜라이 균주는 번역-초과를 허용하는 앰버 억제자 균주이기 때문에 관련이 없었다. 수득된 데이터에 기초하여, G28V 및 G66V 돌연변이는 최대의 개선을 유발하는 것으로 보였다. XAB1 변이체는 언급된 2개의 점 돌연변이를 운반하는 표준 분자 생물학 기술에 의해 생성되었다. 잠재적인 번역후 탈아미드화 부위 (N92, S93)의 제거가 유익할지 여부를 시험하기 위해, 추가로 N92D 치환을 갖는 추가의 변이체를 클로닝하였다. 2개의 변이체, 특히 XAB_A2로 지칭되는, 최종적으로 XAB2로 생성될 3중 돌연변이 변이체에 대해 보다 상세한 프로파일링을 수행하였다. XAB2에서, 카바트 정의에 따른 아미노산 번호 1 내지 23은 프레임워크 1을 구성하고, 아미노산 번호 24 내지 34 (카바트)는 LCDR1을 구성하고, 아미노산 번호 35 내지 49 (카바트)는 프레임워크 2를 구성하고, 아미노산 50 내지 56 (카바트)은 LCDR2를 구성하고, 아미노산 57 내지 88 (카바트)은 프레임워크 3을 구성하고, 아미노산 89 내지 97 (카바트)은 LCDR3을 구성하고, 아미노산 98 내지 107 (카바트)은 프레임워크 4를 구성한다. 본 개시내용의 실시양태에 따른 다른 VL 서열의 동일한 세분을 또한 적용하였다.
따라서, 상기 언급된 G66V 치환은 외부 루프로 불리는 프레임워크 영역 내에 존재한다. 이러한 프레임워크 영역은 일부 경우에서 결합에 기여할 수 있다. 이용가능한 구조 정보에 기초하여, 이러한 돌연변이는 실제로 결정 구조로부터 해상될 수 없지만 외부 루프에 근접하여 존재할 수 있는 IL-17A의 영역과 상호작용할 수 있음을 후향적으로 시사하였다.
2) 합리적 돌연변이유발 접근법 (방법 B):
32개의 무작위로 골라낸 구성원을 서열분석함으로써 무작위화된 위치에서의 아미노산 분포의 스냅샷을 생성하였다. 이러한 적은 수의 서열 내에서 통계가 이루어질 수는 없지만, 어떠한 유의한 편향도 존재하지 않았다. 이론적 라이브러리 크기 8000을 초과하여 샘플링된 약 4x104개의 클론을 스크리닝하였다. 높은 수의 히트가 확인되었고, 2630개의 클론을 ELISA 스크리닝 진행되도록 하였다. 결합, 오프-레이트 및 경쟁 ELISA를 수행하고, 최대의 개선을 갖는 60개의 클론을 서열분석하였다. 60개의 클론에서 22개의 독특한 서열이 발견되었고, 결과를 표 11에 요약한다.
<표 11> 모든 선택된 22개의 독특한 후보의 ELISA. 값은 모 Fab XAB1에 대해 정규화되었다. 표현은 특정 서열이 60개의 히트 내에서 얼마나 종종 발견되는지를 나타낸다. 아미노산 서열에서의 차이는 마지막 3개의 칼럼에서 주어진다. XAB1은 이 위치에서 아미노산 I S A를 갖는다. ELISA 신호는 이. 콜라이로부터의 Fab 발현 배양물의 조 추출물로부터 결정하였다.
Figure 112015085607095-pct00015
22개의 독특한 클론 중에서, 6개는 0.5 L 규모 표준 이. 콜라이 발현, 및 IMAC (Ni-NTA) 및 SEC에 의한 2 단계 정제로 선택되었다. 이어서 정제된 Fab를 사용하여 ELISA에 의해 결합에서의 개선을 확인하였다.
선택되고 정제된 Fab 후보의 ELISA 결과를 XAB1과 비교하여 도 3에 제시하며, 여기서 그래프 넘버링은 다음과 같이 후보 명칭에 상응한다: 1은 MB440; 2는 MB464; 3은 MB468; 4는 MB444; 5는 MB435; 6은 MB463; 7은 XAB1.
도 3a는 정규화된 신호 대 Fab 농도 (M)를 제시하는 그래프이다. 모든 선택된 클론이 XAB1보다 더 높은 신호를 생성함을 관찰할 수 있다. 도 3b는 정규화된 잔여 신호 대 세척 인큐베이션 시간 (시)을 제시하는 그래프이다. 모든 선택된 클론은 XAB1보다 더 높은 신호를 생성하였다. 도 3c는 정규화된 신호 대 Fab 경쟁자 농도 (M)를 제시하는 그래프이다. 역시, 모든 선택된 클론이 XAB1보다 더 높은 신호를 생성함을 관찰할 수 있다.
실시예 4. 잠재적인 번역후 탈아미드화 부위의 표적화.
본 발명자들은 아미노산 모티프 아스파라긴에 이어 글리신 (NG), 또는 보다 낮은 정도로 또한 세린이 뒤따르는 경우에 (NS), 번역후 탈아미드화에 감수성일 수 있다는 가설을 세웠다. 이러한 모티프는 항체 XAB1의 L-CDR2 (위치 56/57) 및 L-CDR3 (92/93)에 존재한다. NG 부위가 결합 및 활성 특성에 영향을 미치지 않고 제거될 수 있는지 시험하기 위해 4개의 IgG 변이체를 생성하였다. 이들 4개의 점 돌연변이 변이체를 표준 분자 생물학 절차에 의해 클로닝하고, 100 ml 스케일 중에서 HEK 세포의 표준 일시적 형질감염에 의해 생산하고, 단백질 A 칼럼을 통해 정제하였다.
정제된 IgG 변이체를 시험관내 중화 검정 (예를 들어, 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같음)에서 분석하여 그의 활성을 모 XAB1 IgG와 비교하였다. 결과는 이들 4개의 변이체 중에서 3개가 감소된 활성을 가짐을 나타내었다. 그러나, 후보 XAB_B12 (돌연변이 N56Q)는 모 XAB1에 필적하는 활성을 보유하였다.
<표 12> XAB1에 대한 서열 변형의 개관, 및 시험관내 중화에 대한 상응하는 효과.
Figure 112015085607095-pct00016
이에 따라 가장 적합한 치환이 확인되었고, 이는 친화도 성숙 과정 동안 확인된 가장 유망한 히트로 도입되어 XAB2 (XAB_A2 N56Q), XAB3 (MB468 N56Q), XAB4 (MB435 N56Q)가 생성되었다. 이를, 여전히 NG 부위를 보유하는 XAB5 (MB435)와 함께, HEK 세포의 표준 일시적 형질감염에 의해 생산하고, 단백질 A 칼럼을 통해 정제하였다.
XAB2, XAB3, XAB4에 대해서는 NG 부위가 제거되었지만 (N56Q), XAB5에는 여전히 존재하였다. 무작위 친화도 성숙 접근법 동안 발견된 바와 같이, L-CDR3 내의 NS 모티프가 XAB2에서 제거되었다 (N92D). 따라서, 잠재적 부위의 탈아미드화에 대한 감수성을 시험하기 위해 임의적인 변이체 세트가 이용가능하였다.
4개의 정제된 후보를 완충제 pH 8 중에서 희석하고, 40℃에서 인큐베이션하여 탈아미드화 반응을 강행하였다. 여러 시점에 분취액을 채취하여 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 원리에 따라 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)에 의해 탈아미드화 정도를 결정하였고, 세포 기반 검정에 의해 시험관내 중화 활성을 결정하였다 (예를 들어 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같음).
CEX 결과는 임의의 IgG에 대해 예상되는 바와 같이, 아마도 항체 프레임워크에서의 번역후 변형 부위로 인해, 시간의 경과에 따른 산성 변이체 백분율의 증가를 나타내었지만, 증가의 정도는 다른 후보의 경우보다 XAB5의 경우에 더 높았고, 즉 1주 후 72% vs. 46% 및 4주 후 94% vs. 83%였다. 마지막으로, 시험관내 중화 활성 검정 결과는 XAB5가 강제된 탈아미드화 조건 동안 4주 인큐베이션 후에 활성을 잃는 것으로 나타나, CEX 결과와 서로 관련되었다. 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 크기-배제 크로마토그래피-다중각도 광 산란 방법론 (SEC-MALS)을 사용하여 샘플 내 응집 수준을 모니터링하였다.
데이터를 표 13에 요약한다.
<표 13> SEC-MALS에 의한 분석, 시험관내 중화 활성 및 CEX.
Figure 112015085607095-pct00017
이들 데이터는 잠재적인 번역후 탈아미드화 부위의 성공적인 제거를 나타내었고, 이는 항체 활성에 영향을 미칠 수 있다. 이는, XAB2, XAB3 및 XAB4가 XAB1보다 더 균질한 생성물을 달성할 가능성이 있고, 항체 활성에 영향을 미치는 생산 또는 저장 동안 어떠한 번역후 탈아미드화도 일어날 수 없기 때문에 유리하다.
실시예 5. 친화도 성숙에 의해 유래된 항체 변이체의 X선 분석: XAB2
간략하게, 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 원리에 따라 XAB2 Fv를 클로닝하고, 중쇄에 대해 C-말단 헥사히스티딘 태그 및 경쇄에 대해 C-말단 Strep-태그를 갖는 이. 콜라이 TGf1-에서 발현시켰다. 재조합 단백질을 Ni-킬레이트 크로마토그래피 및 크기-배제 크로마토그래피 (SPX-75)에 의해 정제하였다.
이어서 인간 IL-17A와의 XAB2 Fv 단편 복합체를 표준 방법론을 사용하여 제조하였다. 간략하게, 인간 IL-17A (1.5mg)를 과량의 XAB2 Fv (3.7mg)와 혼합하고, 복합체를 10mM 트리스 pH 7.4, 25mM NaCl 중에서 S100 크기-배제 크로마토그래피하였다. 이어서 단백질 복합체를 한외여과에 의해 26.3mg/ml로 농축시키고, 결정화시켰다.
표준 결정화 프로토콜이 이어졌다. 간략하게, 시팅 드롭 증기 확산 방법을 사용하여 결정을 SD2 96 웰-플레이트에서 19℃에서 성장시켰다. 단백질 원액을 0.2M 아세트산칼슘, 20% PEG 3,350을 함유하는 결정화 완충제와 함께 1:1로 혼합하였다. 전체 드롭 크기는 0.4 μl였다. X선 데이터 수집 전에, 1개의 결정을 간단히 30% PEG 3,350, 30% 글리세롤을 함유하는 결정화 완충제의 1:1 믹스로 옮긴 다음, 액체 질소로 급속 냉각시켰다.
표준 프로토콜을 사용하여 X선 데이터 수집 및 프로세싱을 수행하였다. 간략하게, 2.0Å 해상도에 대한 X선 데이터를 스위스 라이트 소스, 빔라인 X06DA에서, MAR225 CCD 검출기로, 1.0000Å X선 방사선을 사용하여 수집하였다. 총, 각각 0.5° 진동의 360개의 영상을 결정에서-검출기까지 거리 190mm에서 기록하고, XDS 소프트웨어 패키지로 프로세싱하였다. 결정은 공간군 P21212에 속하였고, 셀 파라미터는 a=184.72Å, b=55.56Å, c=71.11Å, α = β = γ = 90°였다. 2.0Å 해상도에 대한 R-sym은 5.2%였고, 데이터 완전성은 100.0%였다.
XAB2 Fv 복합체의 결정이 XAB1 Fv 복합체의 결정 (실시예 2)과 매우 동형이기 때문에, 후자의 구조를 프로그램 CNX에 의한 결정학적 정밀화의 초기 구동을 위한 입력 모델로서 사용하였다. 결정학적 모델에 대해 더 이상 추가의 유의한 개선이 이루어질 수 없을 때까지, Coot (크리스탈로그래픽 오브젝트-오리엔티드 툴키트) 및 CNX (크리스탈로그래피 & NMR 익스플로러) 버전 2002를 사용하여 반복적인 모델 교정 및 정밀화를 수행하였다. 모든 데이터에 대한 최종 R- 및 R-자유는 각각 0.214 및 0.259였다. 최종 정밀화 모델은 각각 0.005Å 및 0.9°의, 이상적인 결합 길이 및 결합각으로부터의 근평균 제곱 편차 (RMSD)를 나타내었다.
결과
인간 IL-17A와의 XAB2 Fv 복합체의 X선 정밀화 결과를 표 14에 제공하고, 이러한 복합체의 3차원 구조를 도 4에 제시한다. X선 결정학 분석은 변이체 항체 XAB2가 표적 특이성을 보유하고, 모 XAB1 항체와 본질적으로 동일한 에피토프에 높은 친화도로 결합함을 확인시켜주었다. 그러나, XAB1 복합체 구조에서, Gly66을 포함하는 경쇄 루프는 이 잔기가 발린으로 돌연변이되었을 때 더 이상 가능하지 않은 입체형태를 취한다. 그 결과, XAB2 복합체에서, Gly66에서 발린으로의 돌연변이 (G66V)는 루프가 새로운 입체형태를 취하게 강제하고, 발린 측쇄는 IL-17A의 Ile51에 대해 소수성 접촉을 만든다 (도 5). 2개 더의 IL-17A 잔기, Pro42 및 Arg43은 이 결정 구조에서 가시화된다 (규칙화됨). 이들 항원 잔기는 XAB2 항체와 추가로 결합 상호작용하게 하고, 특히 Val28과 소수성 접촉하게 한다 (도 5).
<표 14> 프로그램 CNX에 의해 수득된 IL-17A와의 XAB2 Fv 복합체의 X선 정밀화.
Figure 112015085607095-pct00018
Figure 112015085607095-pct00019
Figure 112015085607095-pct00020
도 4는 인간 IL-17A와의 XAB2 Fv 복합체의 3차원 구조를 제공한다. 도 4a는 2개의 XAB2 Fv 단편을 공간-충전 표현으로 제시하고, IL-17A 동종이량체를 카툰 표현으로 제시한다. 도 4b는 2개의 XAB2 Fv 단편을 카툰 표현으로 제시하고, IL-17A 동종이량체를 공간-충전 표현으로 제시한다. XAB2 Fv의 중쇄 및 경쇄는 각각 암회색 및 연회색으로 제시된다. IL-17A 동종이량체 중 하나의 쇄는 연회색으로 제시되고, 다른 것은 암회색으로 제시된다.
도 5는 인간 IL-17A와의 XAB2 Fv 복합체의 3차원 구조를, 글리신에서 발린으로의 돌연변이 (각각 G28V 및 G66V)를 보유하는 항체 L-CDR1 및 외부 루프 영역의 근접 관찰도로서 제공한다. G66V 돌연변이는 외부 루프의 입체형태에서 변화를 야기할 뿐만 아니라, IL-17A 잔기 Pro42, Arg43 및 Ile51에 대한 추가의 항체-항원 접촉을 야기한다. XAB2 Fv는 연회색 카툰으로 나타내어지고, 인간 IL-17A 동종이량체는 보다 짙은 회색 색조로 나타내어진다. Ile51은 Pro42 및 Arg43과 동일한 IL-17A 서브유닛에 속하지 않는다.
실시예 6. 친화도 성숙에 의해 유래된 항체 변이체의 X선 분석: XAB5
XAB5 Fv를 클로닝하고, 중쇄에 대해 C-말단 헥사히스티딘 태그 및 경쇄에 대해 C-말단 Strep-태그를 갖는 이. 콜라이 TGf1-에서 발현시켰다. 재조합 단백질을 Ni-킬레이트 크로마토그래피에 이어 PBS 완충제 중 SPX-75 칼럼 상에서의 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. LC-MS 분석은 중쇄에 대해 예상했던 질량을 나타내었고 (13703.4Da), 2개의 형태의 경쇄의 존재: 전장 (115aa; 12627.3Da; 약 27%) 및 말단절단된 Strep-태그를 갖는 것 (A1에서 Q112; 12222.8Da; 약 73%)을 나타내었다.
이어서 인간 IL-17A와의 XAB5 Fv 단편 복합체를 표준 방법론을 사용하여 제조하였다. 간략하게, 인간 IL-17A (1.4mg)를 과량의 XAB5 Fv (3.4mg)와 혼합하고, 복합체를 10mM 트리스 pH 7.4, 25mM NaCl 중에서 S100 크기-배제 크로마토그래피하였다. 이어서 단백질 복합체를 한외여과에 의해 16.5mg/ml로 농축시키고, 결정화시켰다.
표준 결정화 프로토콜이 이어졌다. 간략하게, 시팅 드롭 증기 확산 방법을 사용하여 결정을 SD2 96 웰-플레이트에서 19℃에서 성장시켰다. 단백질 원액을 15% PEG 5,000 MME, 0.1M MES pH 6.5, 0.2M 황산암모늄을 함유하는 결정화 완충제와 함께 1:1로 혼합하였다. 전체 드롭 크기는 0.4 μl였다. X선 데이터 수집 전에, 1개의 결정을 간단히 20% PEG 5,000 MME, 40% 글리세롤을 함유하는 결정화 완충제의 1:1 믹스로 옮긴 다음, 액체 질소로 급속 냉각시켰다.
표준 프로토콜을 사용하여 X선 데이터 수집 및 프로세싱을 수행하였다. 간략하게, 3.1Å 해상도에 대한 X선 데이터를 스위스 라이트 소스, 빔라인 X10SA에서, 필라투스(Pilatus) 검출기로, 1.00000Å X선 방사선을 사용하여 수집하였다. 총, 각각 0.25° 진동의 720개의 영상을 결정에서-검출기까지 거리 520mm에서 기록하고, XDS 소프트웨어 패키지로 프로세싱하였다. 결정은 공간군 C2221에 속하였고, 셀 파라미터는 a=55.37Å, b=84.08Å, c=156.35Å, α = β = γ = 90°였다. 3.1Å 해상도에 대한 R-sym은 8.9%였고, 데이터 완전성은 99.7%였다.
구조는 이전에-결정된 XAB2 Fv 복합체로부터 유래된 검색 모델을 사용하여 프로그램 Phaser을 사용하여 분자 대체에 의해 결정하였다. 결정학적 모델에 대해 더 이상 추가의 유의한 개선이 이루어질 수 없을 때까지, Coot (크리스탈로그래픽 오브젝트-오리엔티드 툴키트) 및 CNX (크리스탈로그래피 & NMR 익스플로러) 버전 2002를 사용하여 반복적인 모델 교정 및 정밀화를 수행하였다. 모든 데이터에 대한 최종 R- 및 R-자유는 각각 0.222 및 0.305였다. 최종 정밀화 모델은 각각 0.008Å 및 1.2°의, 이상적인 결합 길이 및 결합각으로부터의 근평균 제곱 편차 (RMSD)를 나타내었다.
결과
인간 IL-17A와의 XAB5 Fv 복합체의 X선 정밀화 결과를 표 15에 제공하고, 이러한 복합체의 3차원 구조를 도 6에 제시한다. 이러한 결정 구조에서, XAB5 Fv 복합체는 정확한 결정학적 2-배 대칭을 갖고: 결정의 비대칭 유닛은 전체, 이량체 복합체의 단지 1/2를 함유한다. XAB5 Fv는 IL-17A 서브유닛 둘 다와 접촉하지만, 대부분의 분자간 접촉은 단지 1개의 서브유닛에 대한 것이다 (XAB5 Fv에 의해 묻힌 IL-17A 표면의 약 90%가 1개의 IL-17A 서브유닛에 의해 기여됨). X선 결정학 분석은 변이체 항체 XAB5가 표적 특이성을 보유하고, 모 XAB1 항체와 본질적으로 동일한 에피토프에 높은 친화도로 결합함을 확인시켜주었다. 그러나, XAB5 복합체 구조에서, 경쇄 CDRL1은 인간 IL-17A에 대해 증진된 결합을 제공하는 3개의 점 돌연변이를 보유한다. XAB5 경쇄의 Trp 31은 IL-17A의 Tyr 85와, 그리고 더 낮은 정도로 IL-17A의 Phe 133과의 강한 소수성/방향성 상호작용에 관여한다. XAB5 경쇄의 Asn 30은 H-결합을 IL-17A의 Pro 130의 주쇄 카르보닐에 공여하고, Leu 49 (동일한 IL-17A 서브유닛) 및 Val 45 (다른 IL-17A 서브유닛)과 반 데르 발스 하에 접촉한다. XAB5 경쇄의 Glu 32는 분자내 H-결합 상호작용을 통해 CDRL1 루프를 안정화한다. 또한, Glu 32는 IL-17A의 Arg 124와 유리한 정전기적 상호작용을 일으키지만, "머리-대-머리" 염-가교 상호작용에는 관여하지 않는다 (도 7).
<표 15> 프로그램 CNX에 의해 수득된 IL-17A와의 XAB5 Fv 복합체의 X선 정밀화.
Figure 112015085607095-pct00021
Figure 112015085607095-pct00022
Figure 112015085607095-pct00023
도 6은 인간 IL-17A와의 XAB5 Fv 복합체의 3차원 구조를 제공한다. 정확한 결정학적 2-배 대칭을 갖는 완전한 동종이량체 복합체가 여기서 제시된다. 도 6a는 2개의 XAB5 Fv 단편을 공간-충전 표현으로 제시하고, IL-17A 동종이량체를 카툰 표현으로 제시한다. 도 6b는 2개의 XAB5 Fv 단편을 카툰 표현으로 제시하고, IL-17A 동종이량체를 공간-충전 표현으로 제시한다. XAB5 Fv의 중쇄 및 경쇄는 각각 암회색 및 연회색으로 제시된다. IL-17A 동종이량체 중 하나의 쇄는 연회색으로 제시되고, 다른 것은 암회색으로 제시된다.
도 7은 인간 IL-17A와의 XAB5 Fv 복합체의 3차원 구조를 제공한다. 3개의 돌연변이를 보유하는 항체 L-CDR1의 근접 관찰도가 구조-유도된 편재 라이브러리 접근법에 의해 확인되었다: Asn 30, Trp 31 및 Glu 32. 이들 XAB5 측쇄는 항원 인간 IL-17A, 특히 IL-17A 잔기 Tyr85, Phe133, Arg124, Pro 130, Leu 49 (모두 동일한 IL-17A 서브유닛으로부터의 것) 및 Val 45 (다른 IL-17A 서브유닛으로부터의 것)에 대한 새로운 결합 상호작용에 기여한다.
실시예 7. 친화도 성숙에 의해 유래된 항체 변이체의 X선 분석: XAB4
XAB4 Fv를 클로닝하고, 중쇄에 대해 C-말단 헥사히스티딘 태그 및 경쇄에 대해 C-말단 Strep-태그를 갖는 이. 콜라이 TG1 세포에서 발현시켰다. 재조합 단백질을 Ni-킬레이트 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
이어서 인간 IL-17A와의 XAB4 Fv 단편 복합체를 표준 방법론을 사용하여 제조하였다. 간략하게, 인간 IL-17A (0.5mg)를 과량의 XAB4 Fv (1.2mg)와 혼합하고, 복합체를 10mM 트리스 pH 7.4, 25mM NaCl 중에서 SPX-75 크기-배제 크로마토그래피하였다. 이어서 단백질 복합체를 한외여과에 의해 6.9mg/ml로 농축시키고, 결정화시켰다.
표준 결정화 프로토콜이 이어졌다. 간략하게, 행잉 드롭 증기 확산 방법을 사용하여 결정을 VDX 24 웰-플레이트에서 19℃에서 성장시켰다. 단백질 원액을 15% PEG 5,000 MME, 0.1M MES pH 6.5, 0.2M 황산암모늄을 함유하는 결정화 완충제와 함께 2:1로 혼합하였다. 전체 드롭 크기는 3.0 μl였다. X선 데이터 수집 전에, 1개의 결정을 간단히 25% PEG 5,000 MME, 20% 글리세롤을 함유하는 결정화 완충제의 1:1 믹스로 옮긴 다음, 액체 질소로 급속 냉각시켰다.
표준 프로토콜을 사용하여 X선 데이터 수집 및 프로세싱을 수행하였다. 간략하게, 3.15Å 해상도에 대한 X선 데이터를 스위스 라이트 소스, 빔라인 X10SA에서, 필라투스 검출기로, 0.99984Å X선 방사선을 사용하여 수집하였다. 총, 각각 0.25° 진동의 720개의 영상을 결정에서-검출기까지 거리 500mm에서 기록하고, XDS 소프트웨어 패키지로 프로세싱하였다. 결정은 공간군 C2221에 속하였고, 셀 파라미터는 a=55.76Å, b=87.11Å, c=156.31Å, α = β = γ = 90°였다. 3.15Å 해상도에 대한 R-sym은 5.5%였고, 데이터 완전성은 99.9%였다.
XAB4 Fv 복합체의 결정이 XAB5 Fv 복합체의 결정 (실시예 6)과 거의 동형이기 때문에, 후자의 구조를 프로그램 Phaser을 사용한 분자 대체에 의한 구조 결정을 위한 입력 모델로서 사용하였다. 결정학적 모델에 대해 더 이상 추가의 유의한 개선이 이루어질 수 없을 때까지, Coot (크리스탈로그래픽 오브젝트-오리엔티드 툴키트) 및 오토부스터(Autobuster) 버전 1.11.2 (부스터 버전 2.11.2)를 사용하여 반복적인 모델 교정 및 정밀화를 수행하였다. 모든 데이터에 대한 최종 R- 및 R-자유는 각각 0.197 및 0.253이었다. 최종 정밀화 모델은 각각 0.009Å 및 1.0°의, 이상적인 결합 길이 및 결합각으로부터의 근평균 제곱 편차 (RMSD)를 나타내었다.
(i) 결과
인간 IL-17A와의 XAB4 Fv 복합체의 X선 정밀화 결과를 표 16에 제공하고, 이러한 복합체의 3차원 구조를 도 8에 제시한다. 이러한 결정 구조에서, XAB5 복합체 (실시예 6)에서와 같이, XAB4 Fv 복합체는 정확한 결정학적 2-배 대칭을 갖고: 결정의 비대칭 유닛은 전체, 이량체 복합체의 단지 1/2를 함유한다. XAB4 Fv는 IL-17A 서브유닛 둘 다와 접촉하지만, 대부분의 분자간 접촉은 단지 1개의 서브유닛에 대한 것이다 (1개의 XAB4 Fv에 의해 묻힌 IL-17A 표면의 93%가 1개의 서브유닛에 의해 기여됨). X선 결정학 분석은 변이체 항체 XAB4가 표적 특이성을 보유하고, 모 XAB1 항체와 본질적으로 동일한 에피토프에 높은 친화도로 결합함을 확인시켜주었다. 그러나, XAB4 복합체 구조에서, XAB5 복합체 구조에서와 같이, 경쇄 CDRL1은 인간 IL-17A에 대해 증진된 결합을 제공하는 3개의 점 돌연변이를 보유한다. XAB5 복합체 (실시예 6)에 대해 이미 기재된 바와 같이, XAB4 경쇄의 Trp 31은 IL-17A의 Tyr 85와, 더 낮은 정도로 IL-17A의 Phe 133과의 강한 소수성/방향성 상호작용에 관여한다. XAB4 경쇄의 Asn 30은 H-결합을 IL-17A의 Pro 130의 주쇄 카르보닐에 공여하고, Leu 49 (동일한 IL-17A 서브유닛) 및 Val 45 (다른 IL-17A 서브유닛)과 반 데르 발스 하에 접촉한다. XAB4 경쇄의 Glu 32는 분자내 H-결합 상호작용을 통해 CDRL1 루프를 안정화한다. 또한, Glu 32는 IL-17A의 Arg 124와 유리한 정전기적 상호작용을 일으키지만, "머리-대-머리" 염-가교 상호작용에는 관여하지 않는다 (도 9). XAB4는 또한 경쇄의 위치 56에서 잠재적인 탈아미드화 부위의 제거를 위해 설계된 Asn에서 Gln으로의 돌연변이의 결과로서 XAB1과 상이하다. X선 분석은 XAB4의 Gln 56이 단백질 항원 잔기 Leu 76 및 Trp 90과 접촉하고, Tyr 67 및 Ser 64의 용매-접근가능성을 감소시킴을 보여준다 (도 10).
<표 16> 프로그램 오토부스터에 의해 수득된 IL-17A와의 XAB4 Fv 복합체의 X선 정밀화.
Figure 112015085607095-pct00024
Figure 112015085607095-pct00025
Figure 112015085607095-pct00026
Figure 112015085607095-pct00027
Figure 112015085607095-pct00028
도 8은 인간 IL-17A와의 XAB4 Fv 복합체의 3차원 구조를 제공한다. 도 8a는 2개의 XAB4 Fv 단편을 공간-충전 표현으로 제시하고, IL-17A 동종이량체를 카툰 표현으로 제시한다. 도 8b는 2개의 XAB4 Fv 단편을 카툰 표현으로 제시하고, IL-17A 동종이량체를 공간-충전 표현으로 제시한다. XAB4 Fv의 중쇄 및 경쇄는 각각 암회색 및 연회색으로 제시된다. IL-17A 동종이량체 중 하나의 쇄는 연회색으로 제시되고, 다른 것은 암회색으로 제시된다.
도 9는 인간 IL-17A와의 XAB4 Fv 복합체의 3차원 구조를 구조-유도된 편재 라이브러리 접근법에 의해 확인된 3개의 돌연변이를 보유하는 항체 L-CDR1의 근접 관찰도로서 제공한다: Asn 30, Trp 31 및 Glu 32. 이들 XAB4 측쇄는 항원 인간 IL-17A, 특히 IL-17A 잔기 Tyr85, Phe133, Arg124, Pro 130, Leu 49 (모두 동일한 IL-17A 서브유닛으로부터의 것) 및 Val 45 (다른 IL-17A 서브유닛으로부터의 것)에 대한 새로운 결합 상호작용에 기여한다.
도 10은 인간 IL-17A와의 XAB4 Fv 복합체의 3차원 구조를 Asn 56에서 Gln으로의 돌연변이를 나타내는 항체 L-CDR2의 근접 관찰도로서 제공한다. 이러한 XAB4 측쇄는 IL-17A 잔기 Trp 90 및 Leu 76에 대한 결합 접촉에 기여하고, Tyr 67 및 Ser 64 (모두 동일한 IL-17A 서브유닛으로부터의 것)의 용매-접근가능성을 감소시킨다.
요약하면, X선 결정학 분석은 추가의 분석을 위해 선택된 변이체 항체가 그의 표적 특이성을 보유하고, 모 XAB1 항체와 본질적으로 동일한 에피토프에 높은 친화도로 결합함을 확인시켜주었다. 추가의 또는 개선된 결합 접촉의 결과로, 각각의 변이체 항체와 IL-17A 사이에 보다 치밀한 결합이 관찰되었다 (하기 표 17 참조).
변이체 항체의 추가의 특성화를 하기 기재된 바와 같이 수행하였다.
<표 17> XAB1, XAB2, XAB4 및 XAB5에 의해 결합된 IL-17A 에피토프의 X선 분석: 에피토프 잔기의 요약 및 구조-기반 정성적 분류. (*): 제2 IL-17A 서브유닛에 의해 기여되는 잔기.
Figure 112015085607095-pct00029
실시예 8. 비아코어™에 의해 측정된 친화도 측정 및 교차-반응성
동역학적 결합 파라미터의 결정은 광학 바이오센서 비아코어™ T200 또는 T100 (http://www.biacore.com)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 달성되었다. 이러한 기술은 수용체에 대한 리간드의 결합 (ka) 및 해리 (kd)에 대한 미시적 속도 상수의 무-표지 결정을 가능하게 한다. 따라서, 항체-항원 상호작용을 특성화하기에 특히 적합하다.
비아코어™ 칩 표면에의 항체의 간접 결합은 고정화 완충제 (10mM 아세트산나트륨 pH 5.0) 중의 항-인간 Ig 항체 (지이 헬스케어 바이오-사이언시스 AB(GE Healthcare Bio-Sciences AB); Cat.No. BR-1008-39) 25 μg/ml를 통하거나 또는 고정화 완충제 (10mM 아세트산나트륨 pH 5.0 또는 pH 4.0) 중의 단백질 A (레플리겐(RepliGen): rPA-50) 20 μg/ml를 통해 이루어졌다.
항체를 블랭크 완충제로 최종 농도 1.00 또는 1.25 μg/ml로 희석하였다.
XAB4 또는 XAB1의 해리 상수의 결정을 위한 친화도 측정을 간접 커플링/결합 방법 (상기 참조)을 사용하여 재조합 huIL-17A (서열 78, 예를 들어 0.14에서 8.8 nM로의 2-배 증가 농도), 재조합 huIL-17A/F 이종이량체 (예를 들어 0.13에서 8 nM로의 2-배 증가 농도), 재조합 huIL-17F (서열 77; 예를 들어 7.8에서 500 nM로의 2-배 증가 농도), 시노몰구스 IL-17A (서열 79; 예를 들어 0.63에서 40 nM로의 2-배 증가 농도), 레서스 IL-17A (서열 82; 예를 들어 1.6에서 100 nM로의 2-배 증가 농도), 마모셋 IL-17A (서열 82; 예를 들어 0.63에서 40 nM로의 2-배 증가 농도), 재조합 mIL-17A (서열 83; 예를 들어 0.78에서 50 nM로의 2-배 증가 농도), 재조합 mIL-17A/F (R&D 시스템즈(R&D Systems)® Cat# 5390-IL; 예를 들어 1.25에서 40 nM로의 2-배 증가 농도), 래트 IL-17A (서열 85; 예를 들어 0.78에서 50 nM로의 2-배 증가 농도)에 대해 수행하였고, 표면을 10 mM 글리신 pH 1.75 또는 MgCl2 (3 M)로 재생시켰다. 1개의 칩 표면을 코팅하고, 결합 능력의 유의한 손실없이 재사용하였다. KD 미만에서 출발하여 KD 10배보다 더 높은 농도에서 종료되도록 리간드 농도를 선택하였다.
유사하지만 동일하지는 않은 조건을 사용하여 XAB2 및 XAB3의 친화도를 측정하엿다.
비아코어™ T200 컨트롤 소프트웨어 버전 1.0으로 동역학적 트레이스를 평가하였다. 증가하는 농도의 이들 트레이스의 전체 세트를 종합하여 구동이라 부른다. 2개의 0 농도 샘플 (블랭크 구동)을 각각의 분석물 농도 시리즈에 포함시켜 데이터 평가 동안 이중-참조되게 하였다.
결과
항-IL-17 항체 XAB4, XAB1, XAB2 및 XAB3의 인간, 시노몰구스 원숭이, 마모셋 원숭이, 레서스 원숭이, 마우스 및 래트 IL-17A, 인간 및 마우스 IL-17A/F 이종이량체 및 인간 IL-17F에 대한 결합을 비아코어™ 기술을 사용한 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정하였다.
회합 (ka) 및 해리 (kd), 뿐만 아니라 해리 평형 상수 (KD)에 대한 동역학적 속도 상수를 계산하였다.
XAB4의 친화도 데이터를 표 18에 제시하고, XAB1의 친화도 데이터를 표 19에 제시하고, XAB2의 친화도 데이터를 표 20에 제시하고, XAB3의 친화도 데이터를 표 21에 제시한다. XAB1, XAB2 및 XAB3의 친화도 성숙은 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스 및 래트 IL-17A에 대한 친화도를 증가시켰다.
<표 18> XAB4 결합의 친화도 및 동역학적 속도 상수.
Figure 112015085607095-pct00030
<표 19> XAB1 결합의 친화도 및 동역학적 속도 상수.
Figure 112015085607095-pct00031
<표 20> XAB2 결합의 친화도 및 동역학적 속도 상수.
Figure 112015085607095-pct00032
<표 21> XAB3 결합의 친화도 및 동역학적 속도 상수.
Figure 112015085607095-pct00033
XAB2, XAB3 및 XAB5에 대한 친화도 및 동역학적 속도 상수는 XAB4에 대해 관찰된 것에 필적하였다.
실시예 9. ELISA에서 IL-17A 및 다른 패밀리 구성원에 대한 결합
상이한 항원에 대한 관심 항체의 적정을 수행하였다. 간략하게, ELISA 마이크로타이터 플레이트의 웰 (눈크 이뮤노 플레이츠 맥시소르프(Nunc Immuno plates MaxiSorp): 인비트로젠(Invitrogen), Cat# 4-39454A)을 Ca 및 Mg (10x; 인비트로젠 Cat# 14200-083) 0.02% NaN3 (시그마 Cat# S-8032)이 없는 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중의 1 μg/ml의 재조합 huIL-17A (서열 76; 1.8 mg/ml), 재조합 huIL-17A/F (0.59 mg/ml), 재조합 huIL-17F (서열 77; 1.8 mg/ml)), 재조합 huIL-17B (R&D 시스템즈® Cat# 1248IB/CF), 재조합 huIL-17C (R&D 시스템즈® Cat# 1234IL/CF), 재조합 huIL-17D (R&D 시스템즈® Cat# 1504IL/CF), 재조합 huIL-17E (R&D 시스템즈® Cat# 1258-IL/CF), 재조합 시노IL-17A (서열 79; 0.21 mg/ml), 재조합 시노IL-17F (서열 80; 1.525 mg/ml), 재조합 mIL-17A (서열 83; 2.8 mg/ml), 재조합 mIL-17A/F (R&D 시스템즈® Cat# 5390-IL), 재조합 mIL-17F (서열 84; 0.2 mg/ml) 및 재조합 래트IL-17A (서열 85; 3.8 mg/ml) (100 μl/웰)로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다.
다음날, 마이크로타이터 플레이트를 300 μl의 PBS/2% BSA (분획 V; 로슈 Cat# 10 735 094 001)/0.02% NaN3으로 1시간 동안 37℃에서 차단시켰다. 이어서 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20 (시그마 Cat# P7949) /0.02% NaN3으로 4회 세척하였다. XAB4 또는 XAB1을 3중 웰에 1 μg/ml (100 μl/웰)로 실온에서 3시간 동안 첨가하였다.
플레이트에의 항원 코팅을 확인하기 위해, 대조 항체, 특히 마우스 mAb 항-huIL-17F (노파르티스(Novartis), 5 μg/ml), 염소 항-hu-IL-17B (R&D 시스템즈® Cat# AF1248; 10 μg/ml), 마우스 mAb 항-huIL-17C (R&D 시스템즈® Cat# MAB1234; 10 μg/ml), 염소 항-huIL-17D (R&D 시스템즈® Cat# AF1504; 10 μg/ml), 마우스 mAb 항 hu-IL-17E (R&D 시스템즈® Cat# MAB1258; 10 μg/ml), 마우스 항-mIL-17A 또는 항-mIL-17A/F (노파르티스; 1 μg/ml), 및 래트 항-mIL-17F (R&D 시스템즈® Cat# MAB2057; 1 μg/ml; ) (PBS, 0.02% NaN3 중 100 μl/웰, 3시간, 실온)를 사용하였다.
이어서, 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20/0.02% NaN3으로 4회 세척하였다. 이어서, 알칼리성 포스파타제-접합된 염소 항-인간 IgG 항체 (시그마 Cat# A9544)를, 1/20000의 희석으로 시험 항체가 수용되어 있는 웰에 (100 μl/웰) 실온에서 2시간 30분 동안 첨가하였다. 마우스 mAb가 수용되어 있는 웰에, 알칼리성 포스파타제-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체 (시그마 Cat# A7434)를 1/10000의 희석으로 (100 μl/웰) 실온에서 2시간 30분 동안 첨가하였다. 알칼리성 포스파타제 접합된 마우스 항 염소 IgG 항체 (시그마 Cat# A8062)를 염소 항체에 1/50000의 희석으로 (100 μl/웰) 실온에서 2시간 30분 동안 첨가하였다. 이어서 플레이트를 4회 세척하고, 디에탄올아민 완충제 pH 9.8 중에 1 mg/ml의 최종 농도가 제공되도록 용해시킨 기질 100 μl (p-니트로페닐 포스페이트 정제; 시그마; 5 mg Cat# N9389; 20 mg Cat#. N2765)를 각각의 웰에 첨가하였다.
플레이트를 30분 후에 405 및 490 nm의 필터를 사용하는 스펙트라 맥스(Spectra Max) M5 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))에서 판독하였다. 값은 3중 값의 평균 ± SEM이다.
결과
이들 연구는 XAB4 및 XAB1이 인간 및 마우스 IL-17A, 및 인간 및 마우스 IL-17A/F에 결합할 수 있음을 제시한다. 또한, XAB4가 시노몰구스 및 래트 IL-17A에 결합할 수 있음을 제시한다. 인간, 시노몰구스 및 마우스 IL-17F에의 결합 뿐만 아니라 다른 인간 패밀리 구성원 (IL-17B, IL-17C, IL-17D 및 IL-17E)에의 결합은 이들 실험 조건 하에서 검출되지 않았다..
<표 22> ELISA에 의한, 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스 및 래트 IL-17 패밀리 구성원에 대한 XAB4 및 XAB1의 교차-반응성.
Figure 112015085607095-pct00034
실시예 10. ELISA에 의한 다른 인간, 마우스 및 래트 인터류킨에 대한 교차-반응성
또 다른 실험 세트에서, 선택된 인간, 마우스 또는 래트 시토카인에 대한 본 개시내용의 항체의 교차-반응성을 평가하였다.
3중 웰의 ELISA 마이크로타이터 플레이트 (눈크 이뮤노 플레이츠 맥시소르프: 인비트로젠 Cat# 4-39454A)를 100 μl/웰로, Ca 및 Mg (10x; 인비트로젠 Cat# 14200-083) 0.02% NaN3 (시그마 Cat# S-8032)이 없는 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 1 μg/ml의 하기 시토카인: 재조합 huIL1β (노파르티스), 재조합 huIL-3 (R&D 시스템즈® Cat# 203-IL/CF), 재조합 huIL-4 (R&D 시스템즈® Cat# 204-IL/CF), 재조합 huIL-6 (R&D 시스템즈® Cat# 206-IL-1010/CF), 재조합 huIL-8 (R&D 시스템즈® Cat# 208-IL-010/CF), 재조합 huIL-12 (R&D 시스템즈® Cat# 219-IL-005/CF), 재조합 huIL-13 (노파르티스), 재조합 huIL-17A (서열 76), 재조합 huIL-17A/F, 재조합 huIL-17F (서열 77), 재조합 huIL-18 (MBL Cat# B003-5), 재조합 huIL-20 (노파르티스), 재조합 huIL-23 (R&D 시스템즈® Cat# 1290-IL-010/CF), 재조합 huIFNγ (로슈), 재조합 huTNFα (노파르티스), 재조합 huEGF (시그마 Cat#E9644.), 재조합 huTGFβ2 (노파르티스), 재조합 mIL-1β (R&D 시스템즈® Cat# 401-ML), 재조합 mIL-2 (R&D 시스템즈® 402-ML-020/CF), 재조합 mIL-6 (R&D 시스템즈® Cat# 406-ML-010/CF), 재조합 mIL-12 (R&D 시스템즈® Cat# 419-ML-010/CF), 재조합 mIL-17A (서열 83), 재조합 mIL-17A/F (R&D 시스템즈® Cat# 5390-IL), 재조합 mIL-17F (R&D 시스템즈® Cat# 2057-IL/CF), 재조합 mIL-18 (MBL Cat#B004-5), 재조합 mIL-23 (R&D 시스템즈® Cat# 1887-ML), 재조합 mIFN-γ (R&D 시스템즈® Cat# 485-MT), 재조합 mTNFα (R&D 시스템즈® Cat# 410-MT), 재조합 래트 IL-4 (R&D 시스템즈® Cat# 504-RL/CF), 재조합 래트 IL-6 (R&D 시스템즈® Cat# 506-RL-010), 재조합 래트IL-12 (R&D 시스템즈® Cat# 1760-RL/CF), 재조합 래트IL-17A (서열 85), 재조합 래트IL-23 (R&D 시스템즈® Cat# 3136-RL-010/CF), 재조합 래트TNFα (R&D 시스템즈® Cat# 510-RT/CF)로 코팅하고, 단 재조합 mIL-6, 재조합 mIL-12 및 재조합 mTNFα는 0.5 μg/ml로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다.
다음날, 마이크로타이터 플레이트를 300 μl의 PBS/2% BSA (분획 V; 로슈 Cat# 10 735 094 001)/0.02% NaN3으로 1시간 동안 37℃에서 차단시켰다. 이어서 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20 (시그마 Cat# P7949) /0.02% NaN3으로 4회 세척하였다.
본 개시내용의 항체를 10 μg/ml (100 μl/웰)로 실온에서 3시간 동안 첨가하였다. 플레이트에의 항원 코팅을 확인하기 위해, 100 μl/웰의 하기 대조 항체를 사용하였다: 마우스 항-huIL1β (R&D 시스템즈® Cat# MAB601), 마우스 항-huIL-3 (R&D 시스템즈® Cat# MAB603), 마우스 항-huIL4 (R&D 시스템즈® Cat# MAB604), 마우스 항-huIL-6 (R&D 시스템즈® Cat# MAB206), 마우스 항-hu-IL8 (R&D 시스템즈® Cat# MAB208), 마우스 항-huIL-12 (R&D 시스템즈® Cat# MAB219), 마우스 항-huIL-13 (노파르티스), 마우스 항-huIL-17A (노파르티스), 마우스 항-huIL-17F (노파르티스), 마우스 항-huIL-18 (MBL Cat# D043-3), 마우스 항-huIL-20 (압캠(Abcam) Cat# ab57227), 염소 항-huIL-23 (R&D 시스템즈® Cat# AF1716), 마우스 항-huIFN-γ (R&D 시스템즈® Cat# MAB285), 마우스 항-huTNF-α (R&D 시스템즈® Cat# MAB610), 마우스 항-hu-EGF (R&D 시스템즈® Cat# MAB236), 인간 항-huTGFβ2 (노파르티스), 래트 항-mIL-1β (R&D 시스템즈® Cat# MAB401), 래트 항-mIL-2 (R&D 시스템즈® Cat# MAB402), 래트 항-mIL-6 (R&D 시스템즈® Cat# MAB406), 래트 항-mIL-12 (R&D 시스템즈® Cat# MAB419), 마우스 항-m/래트IL-17A (노파르티스), 래트 항-mIL-17F (R&D 시스템즈® Cat# MAB2057), 래트 항-mIL-18 (MBL Cat# D047-3), 래트 항-mIFN-γ (R&D 시스템즈® Cat# MAB485), 염소 항-mTNFα (R&D 시스템즈® Cat# AF-410-NA), 마우스 항-래트 IL-4 (R&D 시스템즈® Cat# MAB504), 염소 항-래트 IL-6 (R&D 시스템즈® Cat# AF506), 염소 항-래트 IL-12 (R&D 시스템즈® Cat# AF1760), 마우스 항-래트 IL-23 (R&D 시스템즈® Cat# MAB3510), 마우스 항-래트 TNFα (R&D 시스템즈® Cat# MAB510). 이를 PBS, 0.02% NaN3 중 1 또는 5 μg/ml로 실온에서 3시간 동안 첨가하였다.
이어서, 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20/0.02% NaN3으로 4회 세척하였다. 이어서, 알칼리성 포스파타제-접합된 염소 항-인간 IgG 항체 (시그마 Cat# A9544)를 인간 항체가 1/20000의 희석으로 담긴 웰에 첨가하였다 (100 μl/웰). 알칼리성 포스파타제-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체 (시그마 Cat# A1047)를 마우스 항체가 1/10000의 희석으로 담긴 웰에 첨가하였다 (100 μl/웰). 알칼리성 포스파타제-접합된 토끼 항-염소 IgG 항체 (시그마 Cat# A7650)를 염소 항체가 1/1000의 희석으로 담긴 웰에 첨가하고 (100 μl/웰), 알칼리성 포스파타제-접합된 토끼 항 래트-IgG 항체 (시그마 Cat# A6066)를 래트 항체가 1/20000의 희석으로 담긴 웰에 첨가하였다 (100 μl/웰). 이차 항체를 실온에서 2시간 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 4회 세척하고, 디에탄올아민 완충제 pH 9.8 중에 1 mg/ml의 최종 농도가 제공되도록 용해시킨 기질 (p-니트로페닐 포스페이트 정제; 시그마; 5 mg Cat#. N9389 또는 20 mg Cat# N2765) 100 μl를 각각의 웰에 첨가하였다.
플레이트를 실온에서 30분 후에 또는 4℃에서 밤새 후에 405 및 490 nm의 필터를 사용하는 스펙트라 맥스 M5 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스)에서 판독하였다. 값은 3중 값의 평균 ± SEM이다.
결과
수득된 데이터는 XAB4 및 XAB1이 둘 다 인간, 마우스 및 래트 기원의 IL-17A 및 인간 및 마우스 기원의 IL-17A/F에 대해 매우 선택적임을 제시한다. 또한, 시험된 조건 하에, XAB1의 10 μg/ml에서의 인간 IL-17F에 대한 반응성은 (1 μg/ml에서는 관찰되지 않음, 상기 참조) XAB4의 경우에는 관찰되지 않는다. 시험된 다른 시토카인에 대한 반응성은 검출되지 않았다.
<표 23> ELISA에 의한 인간 시토카인에 대한 XAB4 및 XAB1의 교차-반응성.
Figure 112015085607095-pct00035
N.B. 음의 값은 블랭크 (특이적 항체가 없는 웰의 O.D. 값)가 차감됨으로 인함.
<표 24> ELISA에 의한 마우스 시토카인에 대한 XAB4 및 XAB1의 교차-반응성.
Figure 112015085607095-pct00036
N.B. 음의 값은 블랭크 (특이적 항체가 없는 웰의 O.D. 값)가 차감됨으로 인함.
<표 25> ELISA에 의한 래트 시토카인에 대한 XAB4 및 XAB1의 교차-반응성.
Figure 112015085607095-pct00037
N.B. 음의 값은 블랭크 (특이적 항체가 없는 웰의 O.D. 값)가 차감됨으로 인함.
실시예 11. IL-17A - IL-17RA 및 IL-17A/F-IL-17RA 시험관내 경쟁적 결합 억제 검정
인간 IL-17RA를 원액 (BTP22599: 1.68 mg/ml = 46.2 μM)으로부터 사용하였다. ELISA 마이크로타이터 플레이트를 PBS/ 0.02% NaN3 중 인간 IL-17RA (100 μl/웰, 1 μg/ml, ~27.5 nM)로 코팅하고, 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 다음날, 플레이트를 300 μl의 PBS/2% BSA/0.02% NaN3으로 1시간 동안 37℃에서 차단시켰다. 이어서 플레이트를 PBS/0.05% 트윈20/0.02% NaN3으로 4회 세척하였다.
이러한 준비에 이어, 항체 변이체의 적정 (50 μl, IL-17A의 경우에 12 nM 내지 0.12 nM의 농도 및 IL-17A/F의 경우에 1200 nM 내지 40 nM의 농도, 3개의 단계)을 인간 IL-17A 비오틴 (0.94 nM에서 50 μl) 또는 IL-17A/F (31 nM에서 50 μl)와 함께 실온에서 30분 동안 예비-인큐베이션하였다.
100 μl의 혼합물을 웰에 실온에서 3시간 30분 동안 첨가하였다. PBS/0.05% 트윈20/0.02% NaN3으로 세척한 후에, 4배의 알칼리성 포스파타제-접합된 스트렙타비딘을 1/10000의 최종 희석으로 첨가하였다 (100 μl/웰). 실온에서 45분 후에 플레이트를 다시 PBS/0.05% 트윈20/0.02% NaN3으로 4회 세척하고, 디에탄올아민 완충제 pH 9.8 중의 기질 p-니트로페닐포스페이트 (1 mg/ml)를 첨가하였다 (100 μl/웰).
플레이트를 30분 후에 스펙트라 맥스 M5 마이크로플레이트 판독기, 405 및 490nm의 필터에서 판독하였다 (3중). 4개의 파라미터 로지스틱 모델 (엑셀 Xlfit; FIT 모델 205)을 사용하여 상이한 항체 변이체에 대한 억제 백분율 및 IC50의 계산을 수행하였다.
결과
데이터는 XAB4 및 XAB1이 둘 다 huIL-17RA에 대한 huIL-17A 및 huIL-17A/F의 결합을 차단할 수 있음을 제시한다. IL-17A 및 IL-17A/F에 대한 XAB4의 더 높은 친화도는 더 높은 억제 능력을 반영한다. IC50 값을 표에 보고한다. IL-17A/F-IL-17RA 상호작용을 차단하는데 필요한 더 높은 농도는 본 검정에서 약 30배 더 높은 농도의 IL-17A/F가 사용되었다는 사실에 의해 거의 설명된다. 항체는 A/F의 A 서브유닛에 결합하고, 따라서 F 서브유닛이 IL-17RA에 결합하는 것은 막을 수 없다. 그러나, F의 IL-17RA에 대한 결합은 300nM 범위로 상당히 약하다.
<표 26> XAB4 및 XAB1은 huIL-17A 및 huIL-17A/F의 huIL-17RA에 대한 결합을 억제한다.
Figure 112015085607095-pct00038
실시예 12. 본 개시내용의 항체 변이체에 의한 인간 IL-17A 및 IL-17A/F 활성의 시험관내 중화
(i) C20A4Cl6 세포 (인간 연골 세포주)에 대한 검정
C20A4Cl6, 또는 C-20/A4, 클론 6, (Goldring MB, et al. 1994, J Clin Invest; 94:2307-16) 세포를 10% 소 태아 혈청 초-저 IgG (깁코(Gibco) Cat# 16250-078; 로트 1074403), β-메르캅토 에탄올 (5x10-5 M 최종), 및 노르모신(Normocin) (0.1 mg/ml; 인비보젠(InvivoGen) Cat# ant-nr-2)으로 보충된 RPMI (깁코 Cat# 61870-010)에서 배양하였다.
아큐타제(Accutase) 용액 (PAA Cat# L11-007)을 사용하여 세포를 플라스틱으로부터 탈착시켰다. 세포를 96 웰 마이크로타이터 플레이트에, 소 태아 혈청, β-메르캅토에탄올 (5x10-5 M 최종) 및 노르모신 (0.1 mg/ml)이 없는 RPMI 1640 (깁코 Cat# 61870-010) 중의 100μl 웰에 5x103의 밀도로 분포시켰다.
C20A4Cl6 세포가 플레이트에 밤새 부착되게 하였다. 다음날 아침, 상이한 농도의 재조합 huIL-17A (서열 76; MW 32000), 재조합 huIL-17A/F (MW 32800), 재조합 huIL-17F (서열 77; MW 30000), 또는 인간 TNFα (노파르티스; MW 17500)의 존재 하의 대조군 배지를, 50 μl의 상이한 농도의 시험 항체 (XAB4; XAB1), 대조 항체 (시뮬렉트(Simulect)® 1.1% 용액, 배치 C0011; 831179) 또는 대조군 배지의 존재 하의 3중 웰에 50 μl의 부피로, 최종 부피 200 μl/웰 및 최종 농도 0.5% 소 태아 혈청에 이르도록 첨가하였다.
HuIL-17A (30 pM), huIL-17A/F (300 pM) 및 huIL-17F (10 nM)를 huTNFα (6pM)와 함께 첨가하였다. XAB4 (MW 150000)를, huIL-17A를 중화시키기 위해 1 내지 0.003 nM의 농도 범위로, huIL-17A/F를 중화시키기 위해 10 내지 0.03 nM의 농도 범위로, huIL-17F에 대해서는 3 μM 내지 30 nM의 농도 범위로 첨가하였다. XAB1 (MW 150000)를, huIL-17A를 중화시키기 위해 3 내지 0.01 nM의 농도 범위로, huIL-17A/F를 중화시키기 위해 10 내지 0.03 nM의 농도 범위로, huIL-17F에 대해서는 3 μM 내지 30 nM의 농도 범위로 첨가하였다. 시뮬렉트®는 3 μM 내지 100 nM의 농도 범위로 첨가하였다. 24시간 인큐베이션 후에 배양 상청액을 수집하고, ELISA에 의해 huIL-6 생산을 측정하였다.
(ii) BJ 세포 (인간 섬유모세포)에 대한 검정
BJ 세포 (ATCC Cat# CRL 2522로부터의 인간 피부 섬유모세포)를 10% 소 태아 혈청 초-저 IgG (깁코 Cat# 16250-078; 로트 1074403), β-메르캅토에탄올 (5x10-5 M 최종) 및 노르모신 (0.1 mg/ml; 인비보젠 Cat# ant-nr-2)으로 보충된 RPMI (깁코 Cat# 61870-010)에서 배양하였다. 아큐타제 용액 (PAA Cat# L11-007)을 사용하여 세포를 플라스틱으로부터 탈착시켰다.
세포를 96 웰 마이크로타이터 플레이트에, 소 태아 혈청, β-메르캅토에탄올 (5x10-5 M 최종) 및 노르모신 (0.1 mg/ml)이 없는 RPMI 1640 중의 100μl 웰에 5x103의 밀도로 분포시켰다. BJ 세포가 플레이트에 밤새 부착되게 하였다. 다음날 아침, 상이한 농도의 rhuIL-17A (서열 76; MW 32000), rhuIL-17A/F (MW 32800) 및 rhuIL-17F (서열 77; MW 30000), 또는 인간 TNFα (노파르티스; MW 17500)의 존재 하의 대조군 배지를, 50 μl의 상이한 농도의 시험 항체 (XAB4; XAB1), 대조 항체 (시뮬렉트® 1.1% 용액, 배치 # C0011; 831179) 또는 대조군 배지의 존재 하의 3중 웰에 50 μl의 부피로, 최종 부피 200 μl/웰 및 최종 농도 2.5% 소 태아 혈청에 이르도록 첨가하였다.
HuIL-17A (30 pM), huIL-17A/F (300 pM) 및 huIL-17F (10 nM)를 huTNFα (6 pM)와 함께 첨가하였다. XAB4 (MW 150000)를, huIL-17A를 중화시키기 위해 1 내지 0.003 nM의 농도 범위로, huIL-17A/F를 중화시키기 위해 10 내지 0.03 nM의 농도 범위로, huIL-17F에 대해서는 3 μM 내지 30 nM의 농도 범위로 첨가하였다. XAB1 (MW 150000)을, huIL-17A를 중화시키기 위해 3 내지 0.01 nM의 농도 범위로, huIL-17A/F를 중화시키기 위해 10 내지 0.03 nM의 농도 범위로, huIL-17F에 대해서는 3 μM 내지 30 nM의 농도 범위로 첨가하였다. 시뮬렉트®는 3 μM 내지 100 nM의 농도 범위로 첨가하였다. 24시간 인큐베이션 후에 배양 상청액을 수집하고, ELISA에 의해 huIL-6 및 huGROα 생산을 측정하였다.
(iii) 검출 검정
1) 인간 IL-6 생산의 검출을 위한 ELISA
ELISA 마이크로타이터 플레이트를 PBS 0.02%NaN3 중의 항-인간 IL-6 마우스 Mab (R&D 시스템즈® Cat# MAB206; 1μg/ml로 100μl/웰)로 코팅하고, 밤새 +4℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 마이크로타이터 플레이트를 300μl의 PBS/2% BSA/0.02% NaN3으로 실온에서 3시간 동안 차단시켰다. 이어서 플레이트를 PBS/0.05% 트윈20/0.02% NaN3으로 4회 세척하였다. C20A4Cl6의 배양 상청액 (huIL-17A 플러스 huTNFα로 자극된 배양물의 경우에 1:5, 또는 huTNFα 플러스 huIL-17A/F 또는 IL-17F로 자극된 배양물의 경우에 1:2 최종 희석; 100μl/웰) 또는 BJ 세포의 배양 상청액 (huIL-17A 플러스 huTNFα로 자극된 배양물의 경우에 1:10, 또는 huTNFα 플러스 huIL-17A/F 또는 IL-17F로 자극된 배양물의 경우에 1:5 최종 희석; 100 μl/웰)을 첨가하였다.
적정 곡선을 확립하기 위해, rhuIL-6 (노파르티스; 100μl/웰)을 500 pg/ml에서 7.8 pg/ml까지 1:2 희석 단계로 적정하였다. 실온에서 밤새 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20/0.02% NaN3으로 4회 세척하였다. 비오틴-접합된 염소 항-인간 IL-6 항체를 첨가하였다 (R&D 시스템즈® Cat# BAF206; 30 ng/ml; 100 μl/웰). 샘플이 실온에서 4시간 동안 반응하게 두었다. 세척 후에 (4회), 알칼리성 포스파타제-접합된 스트렙타비딘 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch) Cat# 016-050-084)을 1/10000의 최종 희석으로 첨가하였다 (100 μl/웰).
실온에서 40분 후에, 플레이트를 다시 4회 세척하였다. P-니트로페닐 포스페이트 기질 정제 (시그마; 5 mg, Cat# N9389; 20 mg, Cat# N2765)를 1 mg/ml의 최종 농도가 수득되도록 디에탄올아민 완충제 pH 9.8 중에 용해시켰다. 100 μl를 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 후에 405 및 490 nm의 필터를 사용하는 스펙트라 맥스 M5 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스)에서 O.D.를 판독하였다.
2) 인간 GROα 생산의 검출을 위한 ELISA
ELISA 마이크로타이터 플레이트를 PBS/0.02% NaN3 중의 항-인간 GROα 마우스 mAb (R&D 시스템즈® 시스템즈® Cat# MAB275; 1.5 μg/ml로 100 μl/웰)로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 마이크로타이터 플레이트를 300 μl의 PBS/2% BSA/0.02% NaN3으로 실온에서 3시간 동안 차단시켰다. 이어서 플레이트를 PBS/0.05% 트윈20/0.02% NaN3으로 4회 세척하였다. BJ 세포의 배양 상청액 (최종 희석 1:2; 100μl/웰)을 첨가하였다.
적정 곡선을 확립하기 위해, 인간 GROα (R&D 시스템즈® Cat# 275-GR/CF; 100 μl/웰)를 2 ng/ml에서 0.03 ng/ml까지 1:2 희석 단계로 적정하였다. 실온에서 밤새 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20/0.02% NaN3으로 4회 세척하였다.
비오틴-접합된 염소 항-인간 GROα 항체를 첨가하였다 (R&D 시스템즈® Cat# BAF275; 100 ng/ml; 100 μl/웰). 샘플이 실온에서 4시간 동안 반응하게 두었다. 세척 후에 (4회), 알칼리성 포스파타제-접합된 스트렙타비딘 (잭슨 이뮤노리서치 Cat# 016-050-084)을 1/10000의 최종 희석으로 첨가하였다 (100 μl/웰). 실온에서 40분 후에, 플레이트를 다시 4회 세척하였다. P-니트로페닐 포스페이트 기질 정제 (시그마; 5 mg Cat# N9389; 20 mg, Cat# N2765)를 1 mg/ml의 최종 농도가 수득되도록 디에탄올아민 완충제 pH 9.8 중에 용해시켰다. 100 μl를 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 후에 405 및 490 nm의 필터를 사용하는 스펙트라 맥스 M5 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스)에서 O.D.를 판독하였다.
3) 계산
데이터는 평균 +/- SEM으로 보고된다. ELISA 계산을 위해 4개의 파라미터 곡선 피팅을 사용하였다. 항체에 의한 IL-6 및 GRO-α 분비의 억제에 대한 IC50 값을 Xlfit (FIT 모델 205)를 사용하여 계산하였다.
(iv) 결과
1) C20A4Cl6 세포 (인간 연골 세포주)에 대한 검정
XAB4 및 XAB1은 둘 다 rhuTNFα의 존재 하에 rhuIL-17A 및 rhuIL-17A/F로 자극된 C20A4Cl6 세포에 의한 huIL-6 분비의 유도를 중화시킬 수 있다. 대조 항체 (시뮬렉트®)는 100 nM에서 어떠한 영향도 갖지 않는다. XAB4 및 XAB1에 대한 IC50 값 (평균 ± SEM)을 표 27에 보고한다. 심지어 3 μM의 Ab 농도에서도 huIL-17F에 대한 어떠한 억제도 관찰되지 않았다.
<표 27> C20A4Cl6 세포에 의한 huIL-6 분비에 대한 XAB4 및 XAB1의 억제 효과
Figure 112015085607095-pct00039
이들 실험으로부터, 모 XAB1 항체는 그의 유도체와 중화 활성을 공유함이 분명하다. XAB4 변이체는 또한 XAB1보다 더 높은 중화 활성을 갖는 것으로 관찰되었다.
추가의 실험에서, 상기 기재된 실험과 유사하게, 모든 항체 XAB1-XAB5를 표 28에서 관찰되는 바와 같이 비교하였다. 여기서, XAB2, XAB3 및 XAB5에 대한 억제 프로파일은 XAB4 및 XAB1, 특히 XAB4에 대해 관측되는 것에 필적함을 관찰할 수 있다.
<표 28> C20A4Cl6 세포에 의한 huIL-6 분비에 대한 XAB 항체의 억제 효과.
Figure 112015085607095-pct00040
2) BJ 세포 (인간 섬유모세포)에 대한 검정
XAB4 및 XAB1은 둘 다 huTNFα의 존재 하에 rhuIL-17A 및 rhuIL-17A/F로 자극된 BJ 세포에 의한 huIL-6 및 huGROα 분비의 유도를 중화시킨다. 대조 항체 (시뮬렉트®)는 100 nM에서 어떠한 영향도 갖지 않는다. IL-6 및 hu GROα의 억제에 대한 IC50 값을 표 29 및 표 30에 보고한다. 심지어 3 μM의 Ab 농도에서도 huIL-17F에 대한 억제가 관찰되지 않았다. 이들 실험으로부터, 모 XAB1 항체는 그의 유도체와 중화 활성을 공유함이 분명하다.
XAB4 변이체는 또한 XAB1보다 더 높은 중화 활성을 갖는 것으로 관찰된다.
<표 29> BJ 세포에 의한 huIL-6 분비에 대한 XAB4 및 XAB1의 억제 효과.
Figure 112015085607095-pct00041
<표 30> BJ 세포에 의한 hu-GRO-알파 분비에 대한 XAB4 및 XAB1의 억제 효과.
Figure 112015085607095-pct00042
추가의 실험에서, 상기 기재된 실험과 유사하게, 모든 항체 XAB1-XAB5를 표 31 및 표 32에서 관찰되는 바와 같이 비교하였다. 여기서, XAB2, XAB3 및 XAB5에 대한 억제 프로파일은 XAB4 및 XAB1, 특히 XAB4에 대해 관측되는 것에 필적함을 관찰할 수 있다.
<표 31> BJ 세포에 의한 huIL-6 분비에 대한 XAB 항체의 억제 효과.
Figure 112015085607095-pct00043
<표 32> BJ 세포에 의한 huGROα 분비에 대한 XAB 항체의 억제 효과.
Figure 112015085607095-pct00044
실시예 13. 본 개시내용의 항체 변이체에 의한 마우스 IL-17A 및 IL-17A/F 활성의 시험관내 중화
CMT-93 세포 (ATCC CCL-223)를 10% 소 태아 혈청 초-저 IgG (깁코 Cat# 16250-078; 로트 1074403), β-메르캅토에탄올 (5 x 10-5 M 최종) 및 노르모신 (0.1 mg/ml; 인비보젠 Cat# ant-nr-2)으로 보충된 RPMI (깁코 Cat# 61870-010)에서 배양하였다.
아큐타제 용액 (PAA Cat# L11-007)을 사용하여 세포를 플라스틱으로부터 탈착시키고, 96 웰 마이크로타이터 플레이트에, 소 태아 혈청, β-메르캅토에탄올 및 노르모신이 없는 RPMI 1640 중의 100μl 웰에 5x103의 밀도로 분포시켰다.
세포가 플레이트에 밤새 부착되게 하였다. 다음날 아침, 1 nM의 rmIL-17A (서열 83, MW 31000), 3 nM의 rmIL-17A/F (R&D 시스템즈® Cat# 5390-IL; MW 30400), 30 nM의 rmIL-17F (서열 84; MW 30000), 1 nM의 r래트IL-17A (서열 85; MW 31000) 또는 대조군 배지를, 50 μl의 상이한 농도의 시험 항체 (XAB4 또는 XAB1), 대조 항체 (시뮬렉트® 1.1% 용액; C0011, 831179) 또는 대조군 배지의 존재 하의 3중 웰에 50 μl의 부피로, 최종 부피 200 μl/웰 및 최종 농도 1% 소 태아 혈청에 이르도록 첨가하였다.
24시간 인큐베이션 후에 배양 상청액을 수집하고, ELISA에 의해 KC 생산을 측정하였다.
(i) 마우스 KC 생산의 검출을 위한 ELISA
ELISA 마이크로타이터 플레이트를 PBS/0.02% NaN3 중의 래트 항-마우스 KC MAb (R&D 시스템즈® Cat# MAB453; 1 μg/ml로 100 μl/웰)로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음날, 마이크로타이터 플레이트를 300 μl의 PBS/2% BSA/0.02% NaN3으로 실온에서 3시간 동안 차단시켰다. 이어서 플레이트를 PBS/0.05% 트윈20/0.02% NaN3으로 4회 세척하였다. CMT-93 세포의 배양 상청액 (1:5 최종 희석; 100 μl/웰)을 첨가하였다.
적정 곡선을 확립하기 위해, 마우스 KC (R&D 시스템즈® # 453-KC, 100 μl/웰)를 1 ng/ml에서 0.016 ng/ml까지 1:2 희석 단계로 적정하였다. 실온에서 밤새 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20/0.02% NaN3으로 4회 세척하였다. 비오틴-접합된 염소 항-마우스 KC 항체 (R&D 시스템즈® Cat# BAF453; 100 μl/웰)를 0.1 μg/ml로 첨가하였다. 샘플이 실온에서 4시간 동안 반응하게 두었다. 세척 후에 (4회), 알칼리성 포스파타제-접합된 스트렙타비딘 (잭슨 이뮤노리서치 Cat# 016-050-084)를 1/10000의 최종 희석으로 첨가하였다 (100 μl/웰). 실온에서 40분 후에, 플레이트를 다시 4회 세척하였다. P-니트로페닐 포스페이트 기질 정제 (시그마; 5 mg Cat# N9389; 20 mg Cat# N2765)를 1 mg/ml의 최종 농도가 수득되도록 디에탄올아민 완충제 pH 9.8 중에 용해시켰다. 100 μl 배양 상청액을 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 후에 405 및 490 nm의 필터를 사용하는 스펙트라 맥스 M5 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스)에서 O.D.를 판독하였다.
(ii) 계산
데이터는 평균 +/- SEM으로 보고된다. ELISA 계산을 위해 4개의 파라미터 곡선 피팅을 사용하였다. 항체에 의한 KC 분비의 억제에 대한 IC50 값을 Xlfit™ (FIT 모델 205)를 사용하여 계산하였다.
(iii) 결과
XAB4 및 XAB1은 둘 다 마우스 또는 래트 IL-17A 및 마우스 IL-17A/F로 자극된 CMT-93 세포에 의한 마우스 KC 분비의 유도를 중화시킬 수 있다. 대조 항체 (시뮬렉트®)는 어떠한 영향도 갖지 않는다. XAB4 및 XAB1에 대한 IC50 값 (평균 ± SEM)을 표 33에 보고한다. 심지어 10 μM의 Ab 농도에서도 huIL-17F에 대한 억제는 관찰되지 않는다.
<표 33> CMT-93 세포에 의한 마우스 KC 분비에 대한 XAB4 및 XAB1의 억제 효과.
Figure 112015085607095-pct00045
이들 실험으로부터, 모 XAB1 항체, 뿐만 아니라 그의 유도체는 둘 다 중화 활성을 가짐이 분명하다. XAB4 변이체는 또한 XAB1보다 더 높은 중화 활성을 갖는 것으로 관찰된다.
추가의 실험에서, 상기 기재된 실험과 유사하게, 모든 항체 XAB1-XAB5를 표 34에서 관찰되는 바와 같이 비교하였다. 여기서, XAB2, XAB3 및 XAB5에 대한 억제 프로파일은 XAB4 및 XAB1, 특히 XAB4에 대해 관측되는 것에 필적함을 관찰할 수 있다.
<표 34> CMT-93 세포에 의한 KC 분비에 대한 XAB 항체의 억제 효과.
Figure 112015085607095-pct00046
실시예 14. 래트 항원-유발 관절염 검정 (래트 AIA)
암컷 루이스 래트 (120-150 g)를 제-21일 및 제-14일에, 배부 2개의 부위에서 완전 프로인트 아주반트로 1:1 균질화된 메틸화 소 혈청 알부민 (mBSA)에 대해 피내 감작시켰다 (5mg/ml mBSA를 함유하는 0.1 ml). 제0일에, 5% 이소플루란/공기 혼합물을 사용하여 래트를 마취시키고, 관절내 주사를 위해 페이스 마스크를 통해 3.5%의 이소플루란을 사용하여 이를 유지시켰다. 우측 무릎에 5% 글루코스 용액 중 10 mg/ml mBSA 50 μl를 투여하는 한편 (항원 주사된 무릎), 좌측 무릎에는 5% 글루코스 용액만 50 μl 투여하였다 (비히클 주사된 무릎). 이어서 관절내 주사 직후 및 제2일, 제4일 및 제7일에 다시 캘리퍼를 사용하여 좌우 무릎의 직경을 측정하였다.
치료는 제-3일에 단일 피하 주사에 의해 투여되었다. 본 개시내용의 항체를 0.15, 1.5, 15 및 116 mg/kg으로 주사하였다. 우측 무릎 종창을 좌측 무릎 종창의 비로 계산하고, R/L 무릎 종창 비를 시간에 대해 플롯팅하여 대조군 및 치료군에 대한 곡선하 면적 (AUC) 그래프를 수득하였다. 엑셀 스프레드시트를 사용하여 각각의 치료군 AUC에서 개개의 동물의 백분율 억제를 대조군 AUC (0% 억제)에 대해 계산하였다.
결과
결과를 표 35에 제시한다. XAB4의 경우에 계산된 ED50이 1.68 mg/kg s.c로, 우측 무릎 종창의 용량 관련 억제가 입증되었다.
<표 35> 루이스 래트 항원-유발 관절염에서 제0일에서 제7일까지의 무릎 종창에 대한 XAB4 단일 용량 치료의 효과.
Figure 112015085607095-pct00047
데이터 포인트는 n=5 동물의 평균 ± SEM을 나타낸다. * p<0.05 및 ** p<0.01 ANOVA에 이은 던넷 검정 vs 제어 곡선.
유사하게, 위스타 래트를 사용한 모델 (데이터는 제시하지 않음) 및 마우스 항원-유발 관절염 모델을 사용한 모델 (데이터는 제시하지 않음)에서 XAB4에 대한 무릎 종창의 용량 관련 억제가 입증되었다.
실시예 15. 혈관신생 기계론적 모델
인간 IL-17A (150 내지 200 ng)를 함유하는 챔버를 마우스 내에 피하로 위치시켰을 때, 이는 이식물 주위에 새로운 혈관 성장을 유발한다. 혈관신생의 양은 이 영역에서 새롭게 형성된 조직의 중량과 관련이 있다. 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1 및 3 mg/kg의 XAB4에 의한 예방적 치료는 인간 IL-17 유도된 혈관신생을 억제하였다. 5종의 보다 높은 용량은 모두 조직 챔버 중량의 강력하고 유의한 억제를 야기하였다. 4종의 보다 높은 용량은 어떠한 용량 의존성도 나타내지 않았지만, 0.03 mg/kg의 용량은 0.1 mg/kg 이상의 용량보다 덜 효과적이었다.
본 연구는 IL-17A의 강력한 혈관신생 효과가 항-IL-17A 항체에 의해 중화될 수 있음을 입증하고, 생체내에서 인간 IL-17A에 대한 XAB4의 유효성의 실험적 증거를 제공한다.
실시예 16. 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 모델
실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 모델은 다발성 경화증에 대해 공지된 동물 모델이다 (예를 들어, 문헌 [Constantinescu et al., Br J Pharmacol 2011]에서 검토됨). C57Bl/6 마우스에서 IL-17의 억제가 EAE 중증도를 감소시키는 것으로 밝혀져 있다 (Haak S et al. 2009, JCI; 119:61-69).
암컷 C57Bl/6 마우스 (9주령, 독일 하를란)를 재조합 래트 미엘린 핍지교세포 당단백질 펩티드 (MOG1 -125) (사내 생성) 및 완전 프로인트 아주반트 (CFA, 8 mg/ml 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 균주 H37RA (디프코(Difco))를 불완전 프로인트 아주반트 (IFA, 시그마)에 첨가하여 생성)의 50/50 혼합물로 면역화하였다. 면역화는 제0일에 꼬리 저부에 MOG1 -125를 200 μg/동물로 피하 주사하여 수행하였다. 또한, 200 ng/동물 백일해 독소 (PT)를 제0일 및 제2일에 복강내로 주사하였다.
XAB4의 치유적 치료 효과 및 예방적 치료 효과를 둘 다 시험하였다.
치유적 치료
치유적 치료를 위해 16마리의 마우스를 사용하였다 (XAB4를 위해 8마리 및 대조군을 위해 8마리). 동물이 3일 동안 적어도 2.5 (중증 뒷다리 약화)의 임상 스코어를 받으면 치료를 개시하였다. 이후, 15 mg/kg XAB4 또는 이소형 대조 항체를 매주 단일 용량으로 피하 주사하였다.
결과를 도 11 내지 15에 제시한다 (d.p.i는 면역화 후 일수임). 모든 도면에서, XAB4는 원형으로 나타내어지고 이소형 대조군은 사각형으로 나타내어진다. 치유적 스코어 (평균+SEM)는 도11에 제시된다. XAB4로 치료된 동물이 이소형 대조군보다 더 낮은 평균 임상 스코어를 갖는다는 것이 분명하게 관찰된다. 도 12는 2개의 마우스 군에 대한 체중 변화 (%)를 제시하고, 도 13은 누적 치유적 스코어를 제시한다. 도 14 및 15는 치료 전- 및 후-의 치유적 스코어의 비교이다. 모든 그래프에서 XAB4가 이소형 대조군과 비교하여 치료 효과를 갖는다는 것이 분명하게 관찰된다. 따라서, XAB4에 의한 치유적 치료는 EAE의 중증도를 유의하게 감소시켰다.
예방적 치료
예방적 치료를 위해 19마리의 마우스를 사용하였다 (XAB4를 위해 10마리 및 대조군을 위해 9마리). 각각의 동물을 면역화 하루 전에 15 mg/kg XAB4 또는 이소형 대조군으로 단일 피하 주사를 통해 치료하였다. 이후, 15 mg/kg XAB4 또는 이소형 대조 항체를 매주 단일 용량으로 피하 주사하였다.
결과를 도 16 내지 20에 제시한다 (d.p.i는 면역화 후 일수임). 도 16 내지 19에서, XAB4는 채워진 원형으로 나타내어지고, 이소형 대조군은 빈 사각형으로 나타내어진다. 예방적 스코어 (평균+SEM)는 도 16에 제시된다. XAB4로 치료된 동물이 더 낮은 평균 임상 스코어를 갖는다는 것이 분명하게 관찰된다. 도 17은 2개의 마우스 군에 대한 체중 변화 (%)를 제시하고, 도 18은 누적 예방적 스코어를 제시한다. 최대 예방적 스코어는 도 19에서 관찰된다. 모든 그래프에서 XAB4가 이소형 대조군과 비교하여 효과를 갖는다는 것이 분명하게 관찰된다. 또한, XAB4가 실선으로 나타내어지고 이소형 대조군이 점선으로 나타내어진 도 20에서, 이소형 대조군으로 치료된 마우스 군과 비교하여 XAB4로 치료된 마우스 군에서 EAE 발병이 더 늦다는 것이 관찰된다.
따라서, XAB4에 의한 예방적 치료가 EAE 발병을 유의하게 지연시키고 최대 EAE 중증도를 감소시키는 것으로 제시된다.
실시예 17. 인간 성상세포에서 IL6, CXCL1, IL-8, GM-CSF, 및 CCL2의 IL17A-유도된 수준의 감쇠
인간 뇌의 뇌 피질로부터 단리된 성상세포에서 IL-6, CXCL1, IL-8, GM-CSF, 및 CCL2의 수준에 대한 XAB4의 효과를 조사하였다. 성상세포는 세포 통신, 뉴런, 신경교 및 면역 세포의 이동 및 생존을 조절하게 하는 수많은 성장 인자, 시토카인 및 케모카인을 방출한다. 성상세포 종말-발과 내피 세포의 직접 통신은 또한 성상세포가 혈액-뇌-장벽의 기능을 제어하게 한다. 더욱이, 성상세포는 시냅스 전달 및 흥분독성을 조절하게 하는 신경전달물질, 예컨대 글루타메이트를 시냅스 간극에서 방출 및 흡수한다. 성상세포가 CNS 손상 후에 반흔 병리상태를 형성하며, 이는 정상 병리상태 및 병리생리상태와 분명하게 반대되는 역할을 갖는다는 것은 중요하다. 질환에서, 성상세포는 다양한 정신, 신경계 및 신경변성 장애에서 소정의 역할을 하는 것으로 시사되고, 신경염증에서의 그의 역할이 중요할 수 있다.
데이터는 IL-17A 및 TNFα에 의한 공-자극이 인간 성상세포에서 IL-6, CXCL1, IL-8, GM-CSF, 및 CCL2의 방출을 증진시키고, XAB4는 IL-6, CXCL1, IL-8, GM-CSF, 및 CCL2의 수준을 억제함을 제시하였다. 이들 데이터는 성상세포로부터의 시토카인 방출에서 IL-17A의 우세한 역할을 나타내고, 신경염증성 질환에 대한 약물 표적으로서의 그의 용도를 지지한다. XAB4에 의한 인간 성상세포의 사전 치료가 TNFα-유도되는 것에는 영향을 미치지 않으면서, IL-17A-유도되고 IL-17A/TNFα-유도된 IL-6, CXCL1, IL-8, GM-CSF, 및 CCL2의 수준을 억제한다는 것은 주목할 만하다. 아울러, 데이터는 XAB4에 의한 IL-17A 신호전달의 선택적 억제가 인간 성상세포에서 염증유발 시토카인의 수준을 감쇠시킴을 시사하였다. 질환에서, 성상세포는 다양한 정신, 신경계 및 신경변성 장애에서 소정의 역할을 하는 것으로 시사되고, 신경염증에서의 그의 역할이 중요할 수 있다. 성상세포 기능을 변경시키는 신규 약물은 따라서 성상세포 기능의 조절이 치료상 유용한 것으로 판명될 수 있는 경우에 잠재적인 가치가 있다. 따라서, XAB4는 성상세포의 IL-6, CXCL1, IL-8, GM-CSF, 및 CCL2 생산에 대해 효과를 갖는 것으로 밝혀졌으므로, XAB4는 예컨대 다발성 경화증 (MS)의 치료를 위한 유용한 치료제일 수 있다고 결론지을 수 있다.
물질 및 방법
모든 시토카인은 R&D 시스템즈에서 구입하였다. 바실릭시맙 (노파르티스, 스위스 바젤)을 이소형 대조군으로서 사용하였다. 사용된 일차 항체는 다음과 같다: 항-IL17RA 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647 (BG/hIL17AR, 바이오레전드(Biolegend)), 항-IL17RC 알렉사 플루오르 488 (309822, R&D 시스템즈, 영국), 항-p65 (산타 크루즈(Santa Cruz), 미국), 마우스 IgG 알렉사 플루오르 647 (MOPC-21, 바이오레전드, 영국), 마우스 IgG 알렉사 플루오르 488 (133303, R&D 시스템, 영국), 마우스 IgG 비오틴 (G155-178, BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 스위스) 및 래트 IgG PE (A95-1, BD 바이오사이언시스, 스위스). 사용된 이차 항체 및 염료는 다음과 같다: 비오티닐화 염소 항-토끼 IgG (BA1000, 벡터(Vector), 영국), 스트렙타비딘 접합된 알렉사 플루오르 488 및 알렉사 플루오르 633 (S11223 및 S2137, 라이프 테크놀로지(Life Technology), 미국), 염소 항-마우스 알렉사 플루오르 488 및 알렉사 플루오르 633 (A1101 및 A21050, 라이프 테크놀로지, 미국), 스트렙타비딘 BV421 (405226, 바이오레전드, 영국), 훽스트(Hoechst) 34580 (H21486, 라이프 테크놀로지, 미국).
뇌 피질로부터 유래된 인간 성상세포는 사이언셀 리서치 래보러토리(ScienCell Research Laboratory) (미국) (카탈로그 번호 1800)에서 구입하였다. 세포를 공급업체 지침에 따라 성장시켰다. 간략하게, 세포를 1% 성상세포 성장 보충물 (사이언셀 카탈로그 번호 1852), 5% 소 태아 혈청 (사이언셀 카탈로그 번호 0010) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (사이언셀 카탈로그 번호 0503)으로 보충된 인간 성상세포 배지 (사이언셀 카탈로그 번호 1801)에서 성장시켰다. 세포를 T75 배양 플라스크 내에서 5% CO2 및 37℃로 유지시키고, 80% 전면생장률까지 배지를 3일마다 교환하였다. 모든 처리의 경우에, 70,000개의 세포를 24-웰 플레이트에 웰 플레이팅하고, 3일 동안 성장시키고, 2-4시간 동안 혈청 고갈시키고, 그후 성상세포를 XAB4로 2시간 동안 처리하고, 그후 도면 범례에 표시된 바와 같이 재조합 인간 시토카인으로 18-20시간 동안 처리하였다. 세포 펠릿을 사용하여 qPCR에 의해 시토카인의 mRNA 수준을 정량화하고, 상청액을 사용하여 HTRF에 의해 (시스바이오(Cisbio), 프랑스, IL-6, IL-8 & CXCL1의 경우에 사용됨) 또는 알파리사(AlphaLISA)에 의해 (퍼킨엘머(PerkinElmer), 미국, CCL2 & GM-CSF의 경우에 사용됨) 시토카인의 단백질 수준을 정량화하였다.
시토카인 mRNA의 측정은 실시간-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 수행하였다. 간략하게, 성상세포를 5분 동안 실온에서 350 μl 용해 완충제 (1% β-메르캅토에탄올을 함유하는 RLT 완충제) 중에서 서서히 진탕시키는 것에 의해 용해시키고, 알엔이지(RNeasy) 마이크로키트 (74004, 퀴아젠(Qiagen), 스위스)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. cDNA를 슈퍼스크립트(SuperScript) III 역전사효소 (18080-400, 라이프 테크놀로지, 스위스)를 사용하여 합성하였다. 각각의 유전자의 발현 수준을 비아7(Viia7) 실시간 PCR 기계 (라이프 테크놀로지, 스위스)에서 q-PCR에 의해 평가하였다. 택맨 프로브는 라이프 테크놀로지, 스위스에서 구입하였다. 각각의 샘플을 3중으로 분석하고, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT)에 대해 정규화하였다. 인간 성상세포 상청액 (10 μl) 내 인간 IL6, IL8, CXCL1 단백질 (ng/ml)의 수준은 HTRF (IL6: 62IL6PEC; IL8: 62IL8PEC; CXCL1: 6FGROPEG, 시스바이오, 프랑스)에 의해 평가하고, 인간 성상세포 상청액 (5 μl) 내 인간 CCL2 단백질 (ng/ml)의 수준은 알파리사 인간 CCL2/MCP1 (AL244C, 퍼킨엘머, 미국)에 의해 평가하였다. 모든 측정은 제조업체의 지침에 따라 수행하였다.
인간 성상세포의 세포 현탁액은 PBS-5mM EDTA를 사용하여 부착 배양물로부터 수득하였다. 세포외 염색을 위해, 세포를 PBS 2% BSA 중에서 전체 마우스 IgG와 10분 동안 4℃에서 인큐베이션한 다음, PBS 2% BSA 중에서 항체로 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 세포내 염색을 위해, 세포를 시토픽스/시토펌 용액 (554714, BD 바이오사이언시스, 스위스)으로 20분 동안 4℃에서 투과성이 되도록 한 후에, 항체와 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 70 μm 스트레이너를 통한 여과 후에, 세포를 비디포르테사(BDFortessa) (BD 바이오사이언시스, 스위스) 상에서 획득하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (트리 스타 인크.(Tree Star Inc.), 미국)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
화합물 처리 후에, 세포를 PBS (시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 독일) 중에서 세척한 다음, 빙냉 100% 메탄올 중에서 10분 동안 고정시켰다. 세포를 멸균 PBS 중에서 3 x 5분 세척한 다음 PBS 중에서 0.2% 트리톤-X-100 (시그마 알드리치, 독일)과 함께 5분 동안 실온에서 인큐베이션하는 것에 의해 투과성이 되게 하였다. 비-반응성 부위를 PBS 중 10% 정상 염소 혈청 (라이프 테크놀로지, 미국) 및 2% 소 혈청 알부민 (시그마 알드리치, 독일)으로 이루어진 차단 완충제로 +4℃에서 밤새 차단시켰다. 이어서 세포를 일차 항체 중에서 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 일차 항체를 제거하고, 세포를 3 x 5분 PBS로 세척한 후에, 이차 형광 항체를 실온에서 2시간 동안 적용하였다. 이어서 커버슬립을 PBS 중에서 5 x 5분 세척하고, 훽스트 34580 핵 염료로 대조 염색하였다. 마지막으로 커버슬립을 벡타쉴드(Vectashield)R 마운팅 배지 (벡터, 영국) 중의 현미경 슬라이드 상에 마운팅하고, 커버슬립의 가장자리를 네일 바니시로 밀봉하였다. 세포를 악시오베르트(Axiovert) 200M 도립 현미경 (자이스 리미티드(Zeiss Ltd), 독일)을 사용하는 자이스 LSM 510 메타 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 영상화하였다.
결과
XAB4에 의한 TNF-α 또는 IL-17A 자극, 또는 IL-17A/TNF-α 공-자극의 길항작용이 도 21a 내지 25a에서 제시된다. XAB4에 의한 IL-1β 또는 IL-17A/ IL-1β 공-자극의 길항작용은 도 21b 내지 25b에서 제시된다.
도 21은 IL-6 방출에 대한 길항 효과를 제시하고, 도 22는 CXCL1 방출에 대한 길항 효과를 제시하고, 도 23은 IL-8에 대한 길항 효과를 제시하고, 도 24는 GM-CSF에 대한 길항 효과를 제시하고, 도 25는 CCL2에 대한 길항 효과를 제시한다.
일차 인간 성상세포를 IL-17A (50ng/ml), TNF-α (10 ng/ml), IL-1β, IL-17A/TNF-α 및 IL-1β/TNF-α의 존재 또는 부재 하에 XAB4 (0.01nM, 0.1nM 1 nM 및 10nM)의 증가하는 농도로 처리하였다. 사용된 모든 농도를 도면에 나타낸다. 제시된 데이터는 XAB4 0.01nM에 대한 2개의 실험, 및 XAB4 0.1nM, 1nM 및 10nM에 대한 3개의 실험의 대표값이다. 제시된 값은 평균 ± S.E.M이다.
도 21a에서 관찰되는 바와 같이, XAB4 (모든 농도)는 대조군 및 이소형 둘 다와 비교하여 IL-17A, 또는 IL-17A/TNF-α에 의해 자극된 성상세포로부터의 IL-6 방출에 대해 길항 효과를 갖는다. IL-6의 농도 (ng/ml)는 y-축으로 나타내어지고, XAB4의 농도는 각각의 데이터세트에 대해 x-축 상에 (0, 즉 대조군, 0.01nM, 0.1nM, 1 nM 및 10nM), 및 이소형의 경우에 10 nM에 나타내어진다. 좌측 데이터세트는 무자극 세포에 관한 것이고, 그 다음 데이터세트는 TNF-α (10 ng/ml)로 자극된 세포에 관한 것이고, 그 다음 데이터세트는 IL-17A (50ng/ml)로 자극된 세포에 관한 것이고, 마지막 데이터세트는 TNF-α (10 ng/ml) 및 IL-17A (50ng/ml)로 공-자극된 세포에 관한 것이다. 마지막 데이터세트는 약 10배 더 높은 y-축 규모를 갖는다. 도 21b에서 관찰되는 바와 같이, XAB4 (모든 농도)는 IL-1β (0.1 ng/ml)로 자극되거나 또는 IL-1β (0.1 ng/ml) 및 IL-17A (50 ng/ml)로 공-자극된 세포에 대해 이소형과 비교하여 어떠한 길항 효과도 갖지 않는다.
도 22a에서 관찰되는 바와 같이, XAB4 (모든 농도)는 대조군 및 이소형 둘 다와 비교하여 IL-17A, 또는 IL-17A/TNF-α로 자극된 성상세포로부터의 CXCL1의 방출에 대해 길항 효과를 갖는다. CXCL1의 농도 (ng/ml)는 y-축으로 나타내어지고, XAB4의 농도는 각각의 데이터세트에 대해 x-축 상에 (0, 즉 대조군, 0.01nM, 0.1nM, 1 nM 및 10nM), 및 이소형의 경우에 10 nM에 나타내어진다. 좌측 데이터세트는 무자극 세포에 관한 것이고, 그 다음 데이터세트는 TNF-α (10 ng/ml)로 자극된 세포에 관한 것이고, 그 다음 데이터세트는 IL-17A (50ng/ml)로 자극된 세포에 관한 것이고, 마지막 데이터세트는 TNF-α (10 ng/ml) 및 IL-17A (50ng/ml)로 공-자극된 세포에 관한 것이다. 마지막 데이터세트는 약 10배 더 높은 y-축 규모를 갖는다. 도 22b에서 관찰되는 바와 같이, XAB4 (모든 농도)는 IL-1β (0.1 ng/ml)로 자극되거나 또는 IL-1β (0.1 ng/ml) 및 IL-17A (50 ng/ml)로 공-자극된 세포에 대해 이소형과 비교하여 어떠한 길항 효과도 갖지 않는다.
도 23a에서 관찰되는 바와 같이, XAB4 (모든 농도)는 대조군과 비교하여 IL-17A, 또는 IL-17A/TNF-α로 자극된 성상세포로부터의 IL-8의 방출에 대해 길항 효과를 갖는다. 이소형과 비교하여, XAB4 (0.1nM, 1nM 및 10nM)는 IL-8의 방출에 대해 길항 효과를 갖는다. IL-8의 농도 (ng/ml)는 y-축으로 나타내어지고, XAB4의 농도는 각각의 데이터세트에 대해 x-축 상에 (0, 즉 대조군, 0.01nM, 0.1nM, 1 nM 및 10nM), 및 이소형의 경우에 10 nM에 나타내어진다. 좌측 데이터세트는 무자극 세포에 관한 것이고, 그 다음 데이터세트는 TNF-α (10 ng/ml)로 자극된 세포에 관한 것이고, 그 다음 데이터세트는 IL-17A (50ng/ml)로 자극된 세포에 관한 것이고, 마지막 데이터세트는 TNF-α (10 ng/ml) 및 IL-17A (50ng/ml)로 공-자극된 세포에 관한 것이다. 마지막 데이터세트는 약 5배 더 높은 y-축 규모를 갖는다. 도 23b에서 관찰되는 바와 같이, XAB4 (모든 농도)는 IL-1β (0.1 ng/ml)로 자극되거나 또는 IL-1β (0.1 ng/ml) 및 IL-17A (50 ng/ml)로 공-자극된 세포에 대해 이소형과 비교하여 어떠한 길항 효과도 갖지 않는다.
도 24a에서 관찰되는 바와 같이, XAB4 (모든 농도)는 대조군 및 이소형 둘 다와 비교하여 IL-17A/TNF-α로 자극된 성상세포로부터의 GM-CSF의 방출에 대해 길항 효과를 갖는다. XAB4 (0.1nM, 1nM 및 10nM)는 이소형 및 대조군과 비교하여 IL-17A로 자극된 성상세포로부터의 GM-CSF의 방출에 대해 길항 효과를 갖는다. GM-CSF의 농도 (ng/ml)는 y-축으로 나타내어지고, XAB4의 농도는 각각의 데이터세트에 대해 x-축 상에 (0, 즉 대조군, 0.01nM, 0.1nM, 1 nM 및 10nM), 및 이소형의 경우에 10 nM에 나타내어진다. 좌측 데이터세트는 무자극 세포에 관한 것이고, 그 다음 데이터세트는 TNF-α (10 ng/ml)로 자극된 세포에 관한 것이고, 그 다음 데이터세트는 IL-17A (50ng/ml)로 자극된 세포에 관한 것이고, 마지막 데이터세트는 TNF-α (10 ng/ml) 및 IL-17A (50ng/ml)로 공-자극된 세포에 관한 것이다. 도 24b에서 관찰되는 바와 같이, XAB4 (모든 농도)는 IL-1β (0.1 ng/ml)로 자극되거나 또는 IL-1β (0.1 ng/ml) 및 IL-17A (50 ng/ml)로 공-자극된 세포에 대해 이소형과 비교하여 어떠한 길항 효과도 갖지 않거나 낮은 길항 효과를 갖는다.
도 25a에서 관찰되는 바와 같이, XAB4 (모든 농도)는 대조군 및 이소형 둘 다와 비교하여 IL-17A로 자극된 성상세포로부터의 CCL2의 방출에 대해 길항 효과를 갖는다. XAB4 (0.1nM, 1nM 및 10nM)는 이소형 및 대조군과 비교하여 IL-17A/TNF-α로 자극된 성상세포로부터의 CCL2의 방출에 대해 길항 효과를 갖는다. CCL2의 농도 (ng/ml)는 y-축으로 나타내어지고, XAB4의 농도는 각각의 데이터세트에 대해 x-축 상에 (0, 즉 대조군, 0.01nM, 0.1nM, 1 nM 및 10nM), 및 이소형의 경우에 10 nM에 나타내어진다. 좌측 데이터세트는 무자극 세포에 관한 것이고, 그 다음 데이터세트는 TNF-α (10 ng/ml)로 자극된 세포에 관한 것이고, 그 다음 데이터세트는 IL-17A (50ng/ml)로 자극된 세포에 관한 것이고, 마지막 데이터세트는 TNF-α (10 ng/ml) 및 IL-17A (50ng/ml)로 공-자극된 세포에 관한 것이다. 도 25b에서 관찰되는 바와 같이, XAB4 (모든 농도)는 IL-1β (0.1 ng/ml)로 자극되거나 또는 IL-1β (0.1 ng/ml) 및 IL-17A (50 ng/ml)로 공-자극된 세포에 대해 이소형과 비교하여 어떠한 길항 효과도 갖지 않는다.
종합하면, 데이터는 XAB4에 의한 IL-17A 신호전달의 선택적 억제가 인간 성상세포에서 염증유발 시토카인의 수준을 감쇠시킴을 시사하였다. 질환에서, 성상세포는 다양한 정신, 신경계 및 신경변성 장애에서 소정의 역할을 하는 것으로 시사되고, 신경염증에서의 그의 역할이 중요할 수 있다. XAB4는 성상세포의 IL-6, CXCL1, IL-8, GM-CSF, 및 CCL2 생산에 대해 효과를 갖는 것으로 밝혀졌으므로, XAB4는 예컨대 다발성 경화증 (MS)의 치료를 위한 유용한 치료제일 수 있다.
서열 정보
XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5에 관한 서열 데이터를 참조의 용이성을 위해 하기에 요약한다.
표 1은 예 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 전장 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 (서열 번호)을 기재한다.
항체 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5는 통상의 항체 재조합 생산 및 정제 공정을 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 표 3 또는 표 4에 기재된 바와 같은 코딩 서열은 포유동물 생산 세포주에서 재조합 발현을 위한 생산 벡터로 클로닝된다.
표 2는 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5의 가변 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 아미노산 서열을 요약한 것으로, 이는 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 또는 XAB5로부터 키메라 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.
표 5는 대안적 CDR 그라프트된 항체를 생성하기 위한 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 유용한 CDR 서열 (플러스 컨센서스 서열)을 요약한 것이며, 여기서 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5로부터의 CDR 영역은 카바트 정의에 따라 정의된다.
표 6은 대안적 CDR 그라프트된 항체를 생성하기 위한 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5의 유용한 CDR 서열 (플러스 컨센서스 서열)을 요약한 것이며, 여기서 XAB1, XAB2, XAB3, XAB4 및 XAB5로부터의 CDR 영역은 코티아 정의에 따라 정의된다.
본 명세서에서 언급된 모든 서열 (서열 번호)은 표 36에서 확인된다.
서열 목록
본 발명을 실행하는데 유용한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 표 36에서 확인된다.
<표 36> 서열 목록
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SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> ANTI-IL-17A ANTIBODIES AND THEIR USE IN TREATING AUTOIMMUNE AND INFLAMMATORY DISORDERS <130> PAT055329 <140> PCT/IB2014/058854 <141> 2014-02-07 <150> US 61/762406 <151> 2013-02-08 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Gln Asp Gly Ser Glu 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Arg Gly Ser Leu Tyr Tyr 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Gln Gly Ile Ile Ser Ala 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ala Ser 1 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ser Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens 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cagagtgacc 60 atcacctgtc ggcccagcca gggcatctac tgggagctgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccagctccc tggaacaggg cgtgcccagc 180 cggttcagcg gcagcggatc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ttcaacagct accccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642 <210> 39 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 gctattcagc tgactcagtc acctagtagc ctgagcgcta gtgtgggcga tagagtgact 60 atcacctgta gacctagcca gggaatctac tgggagctgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctacgac gctagtagtc tggaacaggg cgtgccctct 180 aggtttagcg gctcaggctc aggcaccgac 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gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642 <210> 49 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgac ctggtgcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctactgga tgtcctgggt gcgacaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggccaac atcaagcagg acggctccga gaagtactac 180 gtggactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggaccgg 300 ggctccctgt actattgggg ccagggcacc ctggtgacag tgtcctcc 348 <210> 50 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 gccatccagc tgacccagtc cccctccagc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc ggccctccca gggcatcaac tgggaactgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccagctccc tggaacaggg cgtgccctcc 180 agattctccg gctctggctc cggcaccgac 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gccagctccc tggaacaggg cgtgccctcc 180 agattctccg gctctggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ttcaactcct accccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttcccccca 360 agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 cccagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642 <210> 53 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Gln Gly Ile Asn Trp Glu 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 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<400> 65 atggcctggg tgtggaccct gcccttcctg atggccgctg ctcagtcagt gcaggcc 57 <210> 66 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Coding sequence for alternative light chain leader sequence <400> 66 atgagcgtgc tgactcaggt gctggccctg ctgctgctgt ggctgaccgg cacccgctgc 60 <210> 67 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Second alternative heavy chain leader sequence <400> 67 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Second alternative light chain leader sequence <400> 68 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys 20 <210> 69 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Coding sequence for second alternative heavy chain leader sequence <400> 69 atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtccgtga ccacaggcgt gcactcc 57 <210> 70 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Coding sequence for second alternative light chain leader sequence <400> 70 atgtccgtgc ccacacaggt gctgggcctg ctgctgctgt ggctgaccga cgccagatgc 60 <210> 71 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Variable <220> <221> Xaa <222> (5)..(7) <223> Variable <400> 71 Ser Gln Xaa Ile Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 72 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Xaa <222> (2)..(2) <223> Variable <400> 72 Phe Xaa Ser Tyr Pro Leu 1 5 <210> 73 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Xaa <222> (5)..(5) <223> Variable <220> <221> Xaa <222> (7)..(9) <223> Variable <400> 73 Arg Pro Ser Gln Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Leu Ala 1 5 10 <210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Variable <400> 74 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Xaa 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Variable <400> 75 Gln Gln Phe Xaa Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 76 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala Glu Phe Arg His 130 135 <210> 77 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Met Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu 1 5 10 15 Ser Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile 20 25 30 Ile Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Arg 35 40 45 Ser Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr 50 55 60 Pro Ser Glu Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly Cys Ile Asn 65 70 75 80 Ala Gln Gly Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln 85 90 95 Glu Thr Leu Val Val Arg Arg Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe 100 105 110 Gln Leu Glu Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro 115 120 125 Val Ile His His Val Gln 130 <210> 78 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Gly Pro Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys 1 5 10 15 Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu 20 25 30 Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp 35 40 45 Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp 50 55 60 Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu 65 70 75 80 Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val 85 90 95 Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys 100 105 110 Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr 115 120 125 Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 130 135 <210> 79 <211> 132 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 79 Gly Ile Ala Ile Pro Arg Asn Ser Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Ser Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Val Lys Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Arg His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala 130 <210> 80 <211> 134 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 80 Met Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu 1 5 10 15 Ser Cys Pro Pro Val Pro Glu Gly Ser Met Lys Leu Asp Thr Gly Ile 20 25 30 Ile Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Arg 35 40 45 Ser Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr 50 55 60 Pro Ser Glu Val Val Gln Ala Gln Cys Lys His Leu Gly Cys Ile Asn 65 70 75 80 Ala Gln Gly Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln 85 90 95 Glu Thr Leu Val Leu Arg Arg Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe 100 105 110 Gln Leu Glu Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro 115 120 125 Val Val His His Val Gln 130 <210> 81 <211> 132 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 81 Gly Ile Ala Ile Pro Arg Asn Ser Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Ser Thr Ser Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Val Lys Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Arg His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala 130 <210> 82 <211> 127 <212> PRT <213> Callithrix jacchus <400> 82 Ser Pro Gln Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ala Glu Asp Lys Asn Phe Pro 1 5 10 15 Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile Arg Asn Arg Asn Thr Asn Ser 20 25 30 Lys Arg Ala Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Ser Ser Pro Trp Asn Leu 35 40 45 His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala 50 55 60 Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Val Asp Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr 65 70 75 80 His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg 85 90 95 Glu Pro Arg His Cys Thr Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Met Leu Val 100 105 110 Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 115 120 125 <210> 83 <211> 134 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 83 Met Ala Ala Ile Ile Pro Gln Ser Ser Ala Cys Pro Asn Thr Glu Ala 1 5 10 15 Lys Asp Phe Leu Gln Asn Val Lys Val Asn Leu Lys Val Phe Asn Ser 20 25 30 Leu Gly Ala Lys Val Ser Ser Arg Arg Pro Ser Asp Tyr Leu Asn Arg 35 40 45 Ser Thr Ser Pro Trp Thr Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Asp Arg Tyr 50 55 60 Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Gln Cys Arg His Gln Arg Cys Val Asn 65 70 75 80 Ala Glu Gly Lys Leu Asp His His Met Asn Ser Val Leu Ile Gln Gln 85 90 95 Glu Ile Leu Val Leu Lys Arg Glu Pro Glu Ser Cys Pro Phe Thr Phe 100 105 110 Arg Val Glu Lys Met Leu Val Gly Val Gly Cys Thr Cys Val Ala Ser 115 120 125 Ile Val Arg Gln Ala Ala 130 <210> 84 <211> 141 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 84 Ala Pro Glu Pro Glu Phe Arg His Arg Lys Asn Pro Lys Ala Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Leu Gln Lys Ala Gly Asn Cys Pro Pro Leu Glu Asp Asn Thr 20 25 30 Val Arg Val Asp Ile Arg Ile Phe Asn Gln Asn Gln Gly Ile Ser Val 35 40 45 Pro Arg Glu Phe Gln Asn Arg Ser Ser Ser Pro Trp Asp Tyr Asn Ile 50 55 60 Thr Arg Asp Pro His Arg Phe Pro Ser Glu Ile Ala Glu Ala Gln Cys 65 70 75 80 Arg His Ser Gly Cys Ile Asn Ala Gln Gly Gln Glu Asp Ser Thr Met 85 90 95 Asn Ser Val Ala Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro 100 105 110 Gln Gly Cys Ser Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Met Leu Leu Lys Val 115 120 125 Gly Cys Thr Cys Val Lys Pro Ile Val His Gln Ala Ala 130 135 140 <210> 85 <211> 134 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 85 Met Ala Val Leu Ile Pro Gln Ser Ser Val Cys Pro Asn Ala Glu Ala 1 5 10 15 Asn Asn Phe Leu Gln Asn Val Lys Val Asn Leu Lys Val Ile Asn Ser 20 25 30 Leu Ser Ser Lys Ala Ser Ser Arg Arg Pro Ser Asp Tyr Leu Asn Arg 35 40 45 Ser Thr Ser Pro Trp Thr Leu Ser Arg Asn Glu Asp Pro Asp Arg Tyr 50 55 60 Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Gln Cys Arg His Gln Arg Cys Val Asn 65 70 75 80 Ala Glu Gly Lys Leu Asp His His Met Asn Ser Val Leu Ile Gln Gln 85 90 95 Glu Ile Leu Val Leu Lys Arg Glu Pro Glu Lys Cys Pro Phe Thr Phe 100 105 110 Arg Val Glu Lys Met Leu Val Gly Val Gly Cys Thr Cys Val Ser Ser 115 120 125 Ile Val Arg His Ala Ser 130 <210> 86 <211> 295 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His 1 5 10 15 Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu 20 25 30 His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile 35 40 45 Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala 50 55 60 Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg 65 70 75 80 Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe 85 90 95 Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Asp Gln Glu Tyr Glu Val Thr 100 105 110 Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln 115 120 125 Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Val 130 135 140 Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr 145 150 155 160 Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp 165 170 175 Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met 180 185 190 Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg 195 200 205 Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn 210 215 220 Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser 225 230 235 240 Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro 245 250 255 Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp 260 265 270 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala 275 280 285 Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 290 295

Claims (36)

  1. a) 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 3으로 표시되는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 순서대로 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및
    b) 서열번호 42, 서열번호 23 및 서열번호 11로 표시되는 3개의 CDR을 순서대로 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질이며, 여기서 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질은 동종이량체 IL-17A 및 이종이량체 IL-17AF에는 특이적으로 결합하지만 동종이량체 IL-17F에는 특이적으로 결합하지 않는 것인, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질.
  2. 제1항에 있어서, IL-17A, IL-17AF 또는 IL-17F가 시노몰구스 원숭이, 레서스 마카크 원숭이, 마모셋 원숭이, 래트, 마우스 또는 인간 중 1종 이상으로부터 선택된 것인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) 서열번호 12의 VH 아미노산 서열, 및
    b) 서열번호 43의 VL 아미노산 서열
    을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) 서열번호 14의 아미노산 서열, 및
    b) 서열번호 44의 아미노산 서열
    을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 IL-17A에 대한 결합 친화도가 비아코어(Biacore)™에 의한 측정 시 200 pM 또는 100 pM 미만인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시험관내에서 평가 시 IL-6 분비 또는 GRO-알파 분비를 억제할 수 있는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생체내 항원 유발 관절염 실험 모델에서 무릎 종창을 억제할 수 있는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가의 활성 모이어티에 접합된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 또는 그의 항원-결합 부분인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질.
  11. 제1항 또는 제2항에 따른 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질을 포함하는, 염증성 장애 또는 상태를 치료하기 위한 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 관절염, 류마티스 관절염, 건선, 만성 폐쇄성 폐 질환, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 신염, 천식, 다발성 경화증 또는 낭성 섬유증을 치료하기 위한 제약 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질 중 어느 하나를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  14. 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질의 재조합 생산에 적합한, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질 중 어느 하나를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터.
  15. 제14항에 따른 하나 이상의 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제13항에 있어서, 핵산 분자가 메신저 RNA (mRNA)인 단리된 핵산 분자.
  17. 제1항 또는 제2항에 따른 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질 중 어느 하나를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하고, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질의 재조합 생산에 적합한 하나 이상의 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고; 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질을 정제 및 회수하는 것을 포함하는, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 단백질을 포함하는 단백질의 생산 방법.
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