KR101791568B1

KR101791568B1 - 바실러스 서브틸리스 kacc 17117을 이용한 두유의 이소플라본 비배당체 함량의 증가 방법

Info

Publication number: KR101791568B1
Application number: KR1020140158957A
Authority: KR
Inventors: 송진; 최혜선; 박신영; 최윤희; 이경하
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2017-11-02
Anticipated expiration: 2034-11-14
Also published as: KR20160057840A

Abstract

본 발명은 바실러스 서브틸리스 KACC 17117을 이용한 두유의 이소플라본 비배당체 함량의 증가 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 바실러스 서브틸리스 KACC 17117 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 두유 발효용 조성물, 상기 균주를 이용하여 제조된 두유 발효유 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 유산균이 아닌 고초균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KACC 17117로 두유를 발효함으로서 두유 내 이소플라본 비배당체의 함량을 현저히 증가시키는 바, 건강기능성이 강화된 두유 발효유를 제조할 수 있다.

Description

바실러스 서브틸리스 KACC 17117을 이용한 두유의 이소플라본 비배당체 함량의 증가 방법{METHOD FOR INCREASING CONTENT OF ISOFLAVONE AGLYCONE IN SOYMILK}

본 발명은 바실러스 서브틸리스 KACC 17117을 이용한 두유의 이소플라본 비배당체 함량의 증가 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 바실러스 서브틸리스 KACC 17117 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 두유 발효용 조성물, 상기 균주를 이용하여 제조된 두유 발효유 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

두유는 대두를 갈아서 만드는 콜로이드 상태의 음료로서, 영양학적으로 우수한 성분과 기능적 가치가 높은 성분을 함유하고 있으며, 포화지방산이 적고 다량의 불포화지방산을 함유하고 있다. 콜레스테롤이 없어 식이지방 섭취조절을 통하여 성인질환을 감소시킬 수 있고, 유당불내증을 보이는 사람에게 부작용없이 양질의 영양을 공급할 수 있는 최적의 영양식품이다.

두유의 원료인 대두에는 생리활성물질인 이소플라본, 사포닌, 레시틴, 펩티드, 아미노산 등이 포함되어 있으며, 이중 이소플라본에 대한 관심이 날로 증가하고 있다. 이소플라본(isoflavon)은 여성호르몬의 일종인 에스트로겐과 유사한 구조를 가지며, 피토에스트로겐(phytoestrogen)과 같은 생리적 작용이 있음이 밝혀졌다. 또한 이소플라본은 C6-C3-C6을 기본으로 하는 폐놀계 화합물이고, 총 12종류가 천연의 상태로 존재하는데, 이 중 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein) 및 글리시테인(glycitein)만 비배당체(aglycone)형태이고, 나머지 9가지 이소플라본 유도체는 당이 붙어있는 배당체형태이다. 최근 연구들을 통해서 항암효과(Akiyama et al., J. Biol. Chem ., 262(2):5592, 1987; Molteni et al., J. Nurt ., 125:751s, 1995), 골다공증 예방(Shino et al., Life Sci. , 42(11):1123, 1988), 만성질환 예방(Fotsis et al., Proc. Nat. Acad. Sci . USA., 90:2690,1993), 항산화 효과(Naim et al., J. Agric. Food Chem ., 24(6):1174, 1976) 등의 기능이 계속 밝혀지고 있다.

이소플라본은 자연 상태에서는 대부분이 이소플라본 배당체의 형태로 존재하는데, 배당체 형태의 이소플라본은 위산에 의해 분해되지 않아 체내에서 그대로 흡수되지 않고, 대장 내에 존재하는 미생물에 의해 분비되는 효소에 의해 가수분해된 후에 흡수되기 때문에 흡수율이 낮다(미국특허 제 5,506,211호). 흡수율이 낮은 것을 보완하기 위해 배당체 형태의 이소플라본을 비배당체(아글리콘) 형태로 전환하는 생물전환(bioconversion) 공정 기술 및 가공기술이 절실히 필요한 상태이다. 또한 배당체 형태의 이소플라본은 용해도가 비배당체에 비하여 높으나 이소플라본은 비이온성 수동 분산(nonionic passive diffusion) 기작에 의하여 흡수되므로 비배당체 형태가 이러한 흡수 메커니즘에 유리하다고 보고되었다(Setchell KDR, et.al., J Nutr;131: 1362-1375, 2001).

현재 대두에 존재하는 이소플라본은 대부분이 제니스틴(genistin), 다이드진(daidzin), 글리시틴(glycitin)의 배당체로 존재하기 때문에 체내 흡수율이 낮은 문제가 있으며, 이를 개선하기 위해 미생물을 사용하여 발효하는 방법을 통해 체내 흡수가 용이한 비배당체 형태로 이소플라본을 전환하는 방법에 대한 연구가 진행되고 있는데, 한국공개특허 제2011-0027247호와 같이 대부분의 연구가 유산균을 이용하는 것에 국한되어 있으므로, 다양한 미생물을 개발할 필요가 있다.

한국공개특허 제2011-0027247호

본 발명자들은 유산균이 아닌, 고초균으로 두유를 발효시켰을 때, 두유 내 이소플라본 비배당체 함량이 높아지는 것을 발견하였고, 특히 바실러스 서브틸리스 KACC 17117 균주가 두유 내 이소플라본 비배당체 함량을 높이는데 탁월한 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 두유를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KACC 17117로 발효함으로써 두유 내 이소플라본 비배당체의 함량을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 두유 내 이소플라본 비배당체의 함량을 증가시키기 위한, 바실러스 서브틸리스 KACC 17117 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 두유 발효용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 a) 두유를 제조하는 단계; 및 b) 상기 단계 a)에서 제조된 두유를 바실러스 서브틸리스 KACC 17117 또는 이의 배양액으로 발효하는 단계를 포함하는 이소플라본 비배당체의 함량이 증가된 두유 발효유의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 마지막 목적은 상기 제조방법으로 제조되어 이소플라본 비배당체 함량이 증가된 두유 발효유를 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 두유를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KACC 17117로 발효함으로써 두유 내 이소플라본 비배당체의 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 두유 내 이소플라본 비배당체의 함량을 증가시키기 위한, 바실러스 서브틸리스 KACC 17117 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 두유 발효용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 a) 두유를 제조하는 단계; 및 b) 상기 a)단계에서 제조된 두유를 바실러스 서브틸리스 KACC 17117 또는 이의 배양액으로 발효하는 단계를 포함하는 이소플라본 비배당체의 함량이 증가된 두유 발효유의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 마지막 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된, 이소플라본 비배당체 함량이 증가된 두유 발효유를 제공한다.

본 발명은 유산균이 아닌 고초균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KACC 17117로 두유를 발효함으로서 두유 내 이소플라본 비배당체의 함량을 현저히 증가시키는 바, 건강기능성이 강화된 두유 발효유를 제조할 수 있다.

도 1은 각 균주로 발효한 두유 발효유의 베타-글리코시다제(-glucosidase) 활성을 측정한 결과이다.

본 발명은 두유를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KACC 17117로 발효함으로써 두유 내 이소플라본 비배당체의 함량을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 이소플라본 비배당체는 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein) 및 제니스테인(genistein)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 다이드제인 또는 제니스테인일 수 있으며, 더 바람직하게는 다이드제인일 수 있다.

상기 바실러스 서브틸리스 KACC 17117은 이에 한정되지는 않지만, 10¹ 내지 10¹⁰CFU/mL 농도로 두유의 0.1 내지 5%(v/v)가 되도록 접종될 수 있고, 상기 발효는 이에 한정되지는 않지만, 1 내지 45시간 동안 진행될 수 있다.

또한, 상기 이소플라본 비배당체는 함량이 2 내지 3배 상승할 수 있고, 더 상세하게는 다이드제인 함량 증가율은 300 내지 400%, 제니스테인 함량 증가율은 50 내지 80%일 수 있다. 반면, 글리시테인은 60 내지 90% 감소될 수 있다.

본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KACC 17117 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 두유 발효용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 바실러스 서브틸리스 KACC 15935 또는 KACC 17118, 또는 상기 균주의 배양액을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 액체배지에서 바실러스 서브틸리스 KACC 17117을 배양한 배양액, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액, 상기 배양액을 초음파 처리 또는 용해효소(lysozyme) 처리하여 얻은 세포 파쇄액을 의미할 수 있다.

본 발명은 a) 두유를 제조하는 단계; 및 b) 상기 a)단계에서 제조된 두유를 바실러스 서브틸리스 KACC 17117 또는 이의 배양액으로 발효하는 단계를 포함하는 이소플라본 비배당체의 함량이 증가된 두유 발효유의 제조방법을 제공한다.

a) 두유를 제조하는 단계

본 발명의 두유 발효유를 제조하기 위해서 사용되는 두유는 그 종류가 특별히 한정되지 않는다. 상기 단계 a)처럼 별도의 과정을 통하여 제조될 수 있고, 시판되는 것을 구입할 수 있다. 상기 단계 a)는 당업계에서 통상 사용되는 두유의 제조공정을 거칠 수 있으나, 바람직하게는 i) 대두 중량의 10배(v/w) 양의 물에 대두를 10 내지 30시간 불리는(침지) 단계, ii) 불려진 대두를 마쇄(분쇄)하는 단계 및 iii) 상기 대두 마쇄물을 열처리한 후 여과하는 단계를 포함하는 제조방법을 거쳐 두유를 제조할 수 있다.

b) 상기 a)단계에서 제조된 두유를 바실러스 서브틸리스 KACC 17117 또는 이의 배양액으로 발효하는 단계

상기 b) 단계는 두유에 바실러스 서브틸리스 KACC 17117 또는 이의 배양액 또는 상기 배양액의 농축액을 접종하는 단계이다. 바실러스 서브틸리스 KACC 17117, 바실러스 서브틸리스 KACC 15935, 상기 균주의 배양액 및 상기 배양액의 농축액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 접종될 수 있다. 균주 접종 농도는 이에 한정되지는 않지만, 10¹ 내지 10¹⁰CFU/mL 농도로 두유의 0.1 내지 5%(v/v)일 수 있다.

상기 발효는 1 내지 45시간 동안 진행될 수 있고, 더 상세하게는 30 내지 45시간일 수 있다. 상기 시간을 넘길 경우, 암모니아태 질소 함량이 과도하게 높아지는데, 암모니아태 질소는 과량으로 식품 내에 축적되면 부패취가 나기 때문에 식품의 관능 특성을 해친다.

본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된, 이소플라본 비배당체 함량이 증가된 두유 발효유를 제공한다.

상기 함량이 증가되는 이소플라본 비배당체는 다이드제인 또는 제니스테인 또는 상기 두 물질 모두일 수 있다. 특히 다이드제인의 함량은 매우 현저히 증가될 수 있다.

상기 두유 발효유 1g에 포함된 다이드제인의 함량은 150 내지 800 ug일 수 있고, 더 바람직하게는 160 내지 700 ug일 수 있다. 또한, 제니스테인은 두유 발효유 1g당 200 내지 400 ug일 수 있다.

다이드제인(daidzein)의 분자식은 C₁₅H₁₀O₄이고, 아래 화학식 1로 표시할 수 있다. 또한, 제니스테인(Genistein)의 분자식은 C₁₅H₁₀O₅ 이고, 하기 화학식 2로 표시할 수 있다.

<화학식 1>

<화학식 2>

암을 비롯한 수많은 인간 질환의 예방 및 치료에서 제니스테인의 잠재적 역할은 활발히 연구되어 왔다. 제니스테인에 대한 세포 표적 및 제니스테인에 의해 제어되는 신호전달 경로는 밝혀져 있으며, 암과 관련된 것으로는 세포 성장 및 분열, 아포토시스, 혈관신생, 종양침윤 및 전이에 중요한 표정 및 경로가 있는 것으로 알려져 있다. 제니스테인은 물에 거의 불용성이지만 세포막 투과성은 높다.

또한, 제니스테인 및 다이드제인은 심혈관 위험 인자를 현저히 감소시킬 수 있다[참조:Plant and Mammalian Estrogen Effects on Plasma Lipids of Female Monkeys, Circulation, vol. 90, p.1259 (1994년 10월)]. 또한, 제니스테인 및 다이드제인은 여성에서 내인성 에스트로겐의 수준 감소 및 변경에 의해 야기되는 증상, 예를 들어 폐경기 또는 월경전 증후군의 징후를 감소시키는 것으로 생각된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험예 1. 콩 내 이소플라본 비배당체 함량을 증가시키는 균주 선발

실험예 1-1. 균주 준비

바실러스 서브틸리스(B. subtilis)의 다양한 균주들인 KACC 15935, KACC 17117, KACC 17118, 및 O-2(국립농업과학원 발효식품과에서 분양)를 배양하여 준비하였다. 상기 KACC 17117 및 KACC 17118은 메밀속(Fagopyrum sp.)에서 분리된 균주이다.

실험예 1-2. 균주별 콩 발효물의 이소플라본 함량 측정

실험은 균주 배양액을 첨가하지 않은 대조군(control)과 상기 실시예 1-1에서 나열한 균주 4종을 첨가한 실험군으로 나누어 진행하였다. 장류콩인 대원콩을 세척 후 실온에서 침지(25, 24hr)하고 오토클레이브(autoclave)를 이용하여 증자(121, 30분)하였다. 콩이 40℃ 이하로 냉각되었을 때 증자된 콩 1000g에 각 균주 배양액을 10⁶ CFU/mL 농도로 10mL 접종하여 37℃에서 48시간 동안 발효하였다.

이소플라본 성분 분석을 위해, 상기 발효된 콩을 동결건조 시킨 후 곱게 분쇄하여 40 메시체(mesh sieve)를 통과시켰다. 상기 동결건조 분말 2g에 아세토나이트릴 24mL과 1mol HCl 6mL로 실온에서 1시간 추출하였으며 여과(Whatman No.2) 시킨 후, 3차 증류수로 2배 희석하여 0.2 M 멤브레인 필터로 여과시켜 역상 초고속 액체크로마토그래피법(UPLC / Waters, MA,USA)로 분석하였다. UPL141C는 워터스 엑퀴티 시스템(Waters Acquity system)을 사용하였으며, 컬럼(column)은 Acquity UPLCHSS C18 1.8 um2.175 mm 컬럼, 이동상은 0.1% 아세트산 함유한 10% MeOH(용매 A)와 0.1% 아세트산을 함유한 MeOH(용매 B)을 사용하였다. 용매 구배는 용매 B의 농도를 17분간 26%에서 50%로 증가시켰고, 유속은 0.3 mL/min, 주입 부피(injection volume)는 0.8 L, UV 감지기 파장은 254 nm로 분석하였다.

본 실험에서 얻어진 결과는 SPSS 프로그램(12.0, SPSS Inc. Chicago, IL, USA)으로 분석하여, 각 항목에 대한 평균(mean) 및 표준편차(standard deviation, SD)를 산출하였다. 각 청국장간 차이는 p<0.05 수준에서 원-웨이 아노바(one-way ANOVA)를 실시하였으며, 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)으로 그 유의성을 검증하였다.

하기 표 1에 대조군과 실험군들의 이소플라본 함량 분석 결과를 나타냈다.

단일 균주를 이용한 콩 발효물의 이소플라본 함량(ug/g)

구 분	대조군	KACC 15935	O-2	KACC 17117	KACC 17118
다이드진(daidzin)	493.9^bc	611.7^a	495.4^bc	503.9^bc	425.0^c
글리시틴(glycitin)	231.2^bc	151.9^d	238.0^b	211.5^bc	321.5^a
제니스틴(genistin)	964.4	908.3	938.1	980.8	938.6
M-다이드진	8.9^d	100.5^ab	120.3^a	49.6^c	88.6^b
M-글리시틴	0.0^b	11.7^a	15.7^a	0.0^b	13.3^a
A-다이드진	60.4^bc	50.3^c	54.9^bc	58.0^bc	52.9^bc
M-제니스틴	35.4^e	151.8^b	183.3^a	96.2^d	148.8^b
A-글리시틴	17.6^b	15.3^b	17.6^b	14.8^b	14.8^b
다이드제인(daidzein)	61.2^c	27.0^d	51.5^c	81.0^b	100.6^a
A-제니스틴	78.2^ab	74.4^ab	67.0^b	82.5^ab	62.8^b
글리시테인(glycitein)	8.4^ab	5.5^b	3.7^b	12.0^a	4.5^b
제니스테인(Genistein)	71.9^c	78.8^c	63.4^d	93.9^bc	105.7^b
총 이소플라본	2,031.5^b	2,187.2^ab	2,248.9^ab	2,184.5^ab	2,277.1^ab
총 아글리콘	141.6^c	111.2^d	118.6^d	187.0^b	210.8^a

상기 총 아글리콘은 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein), 제니스테인(genistein)의 합을 나타낸다.

상기 표 1에서 KACC 15935 및 O-2로 발효한 실험군은 균주 처리를 안 한 대조군보다도 유의적으로 낮은 아글리콘 함량을 갖는 것을 확인할 수 있다. 반면, KACC 17117 및 KACC 17118로 발효한 실험군은 대조군, KACC 15935, 및 O-2보다 유의적으로 높은 아글리콘 함량을 보인다. 특히, KACC 17118로 발효한 실험군은 KACC 17117보다 유의적으로 높은 이소플라본 함량을 갖는다.

실험예 2. 두유 내 이소플라본 비배당체 함량을 증가시키는 균주 선발

실험예 2-1. 두유 발효유의 제조

두유는 일반적인 두유 제조방법에 따라 제조하였다. 대두(대원콩) 중량의 10배(v/w) 양의 물에 대두를 18시간 동안 침지한 후, 2분 동안 분쇄하였다. 그 후 18분 동안 가열한 후, 거름망으로 여과시켜 오토클레이브(autoclave)에서 121℃, 15분 조건으로 멸균하였다. 그 후, 제조된 두유에 시료량의 1%(v/v)가 되도록 KACC 17117, KACC 17118 각 균주를 10⁶ CFU/mL 농도로 배양액을 접종하였다. 또한, 상기 두 균주를 동시에 접종했는데, 상기 두 균주 모두 동일하게 시료량의 0.5%(v/v)씩 처리하였다. 대조군은 상기 KACC 15935로 발효한 두유를 사용하였다. 그 후, 37℃에서 48시간 동안 발효시켰다.

실험예 2-2. 균주별 두유 발효유의 이소플라본 함량 측정

상기 실시예 2-1에서 제조한 두유 발효유의 이소플라본 성분 분석을 위해, 상기 발효된 두유를 동결건조 시킨 후 곱게 분쇄하여 40 메시체를 통과시켰다. 상기 동결건조 분말 2g에 포함된 이소플라본 함량 분석 방법은 상기 실시예 1-2와 동일하다.

본 실험에서 얻어진 결과는 SPSS 프로그램(12.0, SPSS Inc. Chicago, IL, USA)으로 분석하여, 각 항목에 대한 평균(mean) 및 표준편차(standard deviation, SD)를 산출하였다. 각 청국장간 차이는 p<0.05 수준에서 원-웨이 아노바(one-way ANOVA)를 실시하였으며, 던컨 다중검정(Duncan's multiple range test)으로 그 유의성을 검증하였다.

상기 이소플라본 성분 분석 결과는 하기 표 2에 기재하였다. 하기 배당체들(다이드진, 글리시틴, 제니스틴)은 아세틸기 또는 말로닐기가 붙은 형태의 배당체도 포함한다.

이소플라본 성분 분석 결과(ug/g)(A- : 아세틸기, M- : 말로닐기)

발효
균주

시간(Hr)

다이드진

글리시틴

제니스틴

M-다이드진

M-글리시틴

A-다이드진

M-제니스틴

A-글리시틴

다이드제인

A-제니스틴

글리시테인

제니스테인

KACC
15935

0

808.3^b

172.3^b

1,363.2^b

325.2

47.0

87.3^a

432.0

25.3^a

150.0^a

117.5^a

27.8^a

186.8^b

36

977.6^a

228.7^a

1,371.8^b

307.5

48.0

36.2^c

426.8

17.0^b

88.3^d

24.6^c

0.0^b

372.1^a

KACC 17117

0

826.8^a

179.5^c

1,407.6^b

319.0

44.6^b

90.4^a

431.7^b

26.7^a

154.1^b

121.2^a

27.9^a

192.4^b

36

19.8^b

552.7^a

1,462.6^ab

316.3

71.7^a

28.5^c

440.1^ab

16.7^b

646.9^a

23.2^c

6.9^b

323.7^a

KACC 17118

0

870.6

184.8^b

1,448.2

339.4

47.9

91.6^a

458.0

27.3^a

162.6^b

123.3^a

29.3^a

203.7^b

36

877.7

223.4^a

1,537.0

330.5

48.8

49.6^b

441.3

18.6^c

224.1^a

21.3^b

2.3^c

287.2^a

KACC 17117 +
KACC 17118

0

857.3^ab

181.7^b

1,436.8^ab

339.1

47.1

91.1^a

453.2

26.9^a

160.6^b

123.2^a

29.5^a

199.8^b

36

740.0^b

242.1^a

1,306.5^b

324.5

52.7

47.3^c

433.0

17.1^c

346.1^a

20.1^b

1.2^b

479.3^a

상기 표 2의 성분들을 정리하여, 아래 표 3에 표시하였다.

두유 발효유 내 이소플라본 형태별 함량(ug/g)

Sample		글루코시드	아세틴-글루코시드	말로닐-그루코시드	아글리콘	총 이소플라본
KACC 15935	0 시간	2,343.7^b	230.1^a	804.1	364.5^b	3,742.5
KACC 15935	36 시간	2,578.1^ab	77.9^c	782.3	460.4 ^a	3,898.6
KACC 17117	0 시간	2,413.9^bc	238.3^a	795.2	374.4^b	3,821.8
KACC 17117	36 시간	2,035.1^c	68.4^b	828.1	977.5 ^a	3,909.0
KACC 17118	0 시간	2,503.7	242.2^a	845.3	395.5^b	3,951.4
KACC 17118	36 시간	2,638.2	89.4^b	820.7	513.6 ^a	4,061.8
KACC 17117 + KACC 17118	0 시간	2,475.8^ab	241.3^a	839.5	389.8^b	3,878.8
KACC 17117 + KACC 17118	36 시간	2,288.7^b	84.6^c	810.3	826.6 ^a	4,010.1

상기 아글리콘은 표 2의 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein), 제니스테인(genistein)의 합을 나타낸다.

상기 표 3의 수치를 이용하여, 각 실험군별 총 이소플라본 함량 대비 총 아글리콘의 함량 비율(편의상 'Ag비율'로 표시)을 하기 표 4에 표시하였다.

Ag 비율(%)	KACC 15935	KACC 17117	KACC 17118	KACC 17117 + KACC 17118
발효 전	9.7	9.7	10.0	10.0
36시간 발효 후	11.8	25.0	12.6	20.6

두유가 아닌 콩을 발효시킨 상기 표 1의 결과를 보면, KACC 17118이 다른 균주들보다 콩의 이소플라본 비배당체 함량을 현저히 증가시키는데 가장 적합하다는 것을 알 수 있다. 그러나 상기 표 4에서 확인할 수 있듯이, 두유를 발효할 시에는 KACC 17118보다는 KACC 17117이 두유 발효유 내 이소플라본 비배당체 함량 비율은 높이는데 가장 적합하다는 것을 알 수 있다. 발효 전과 발효 후의 Ag 비율을 살펴보면, KACC 17117로 인해 2.6배 상승하지만, KACC 17118로 인해서는 1.26배만 상승하였다. 이러한 결과는 콩 및 두유의 아글리콘 함량을 높이는데 적합한 발효 균주가 다르다는 것을 의미한다.

또한, 상기 표 2의 값을 이용하여, 비배당체인 다이드제인, 글리시테인, 제니스테인의 함량이 발효 36시간 후, 얼마나 증가하는 지를 하기 표 5에 정리한 후, 상기 성분들의 증가율을 표시하였다.

		KACC 15935	KACC 17117	KACC 17118	KACC 17117 + KACC 17118
발효 전	다이드제인	150	154.1	162.6	160.6
	글리시테인	27.8	27.9	29.3	29.5
	제니스테인	186.8	192.4	203.7	199.8
발효 후	다이드제인	88.3	646.9	224.1	346.1
	글리시테인	0	6.9	2.3	1.2
	제니스테인	372.1	323.7	287.2	479.3
증가율 (%)	다이드제인	-41.1	319.8	37.8	115.5
	글리시테인	-100	-75.3	-92.2	-95.9
	제니스테인	99.2	68.2	40.1	139.9

상기 표 5에서, KACC 17117로 발효한 두유의 다이드제인 증가율이 다른 균주로 발효한 두유보다 월등히 높음을 확인할 수 있다.

실시예 2-3. 두유 발효유의 베타-글루코시다제(-glucosidase) 활성 측정

두유를 고초균으로 발효시킬 때, 시간 별로 베타-글루코시다제의 활성을 측정하였다. 두유 발효유 시료 20 g에 80 mL의 증류수를 첨가하고 균질화한 후 이를 원심분리(8,000 rpm, 10 min)한 후 상등액을 분석 시료로 사용하였다. 베타-글루코시다제 활성 측정은 다음 방법에 따라 측정하였다. 0.2M 인산 완충액(pH 7.0)에 5mM NPG(4-Nitrophenyl-D-glucopyranoside)가 되도록 기질용액을 제조하였다. 이 기질용액 1.5 mL에 시료추출액 0.5 mL를 넣어 반응(37℃, 20 min) 시킨 후, 2 M Na₂CO₃ 용액 0.5 mL를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 원심분리(8,000 rpm, 5 min)하여 상등액의 흡광도(405 nm)를 측정하였다. 효소 활성은 시료 1 g당 1umol의 NP(p-Nitrophenol)가 생성된 양을 1 유닛(unit)으로 하였다.

베타-글루코시다제 활성(U/g)

균주	0 시간	12 시간	24 시간	36 시간
KACC15935	146.7±29.6^a	234.4±13.9	231.1±44.4	331.1±15.8^b
KACC 17117	156.7±5.8^a	223.3±29.6	234.4±18.4	1,255.6±48.3^a
KACC 17118	121.1±22.2^ab	198.9±9.6	220.0±18.6	323.3±35.3^b
KACC 17117 + KACC 17118	104.4±15.4^b	217.8±13.5	246.7±73.1	293.3±38.4^b

상기 표 6에서 KACC 17117로 발효한 시료의 베타-글루코시다아제 활성은 매우 크게 증가하는 것을 알 수 있다. 상기 표 6의 결과를 도 1에 표시하였는데, 도 1에서 이러한 현상을 더욱 확실하게 확인할 수 있다.

실시예 2-4. 두유 발효유의 이화학적 품질특성 변화

상기 실시예 2-3과 동일한 시료로 아미노태 질소 함량(%), 암모니아태 질소(Nh₄ ⁺-N) 함량(ppm) 및 환원당 값을 측정하였다.

아미노태 질소 함량은 시료추출액 5 mL, 중성 포르말린 용액 10 mL, 증류수 10 mL를 넣은 플라스크에 0.5% 페놀프탈레인 용액 2-3방울을 가한 후, 0.1 N NaOH로 미홍색이 될 때까지의 적정양(V1)과 시료 5 mL, 증류수 20 mL를 넣은 플라스크에 0.5% 페놀프탈레인 용액을 2~3 방울을 가한 후, 0.1 N NaOH로 미홍색이 될 때까지 적정양(V0)을 이용하여 아미노태 질소 함량을 산출하였다(Weatherburn MW, J Anal Chem;39:971-974,1967 참조). 아미노태 질소 함량 계산식은 아래와 같다.

아미노태 질소(%)=(V1-V0)×F×0.0014×D×100/S

V1 : 시료의 적정값(mL)

V0 : 무처리 대조군의 적정값(mL)

F : 0.1 N NaOH의 역가

D : 희석률

S : 시료의 지량(g)

0.0014 :0.1N NaOH(g) 1mL에서의 질소 무게

암모니아태 질소 함량은 시료액 0.1 mL 취한 후 페놀-하이포아염소산염 반응에 의하여 시료 추출액 0.1 mL에 A 용액(phenol 10 g과 sodium nitroprusside dihydrate 0.05g/distilled water 1 L)과 B 용액(Na2HPO4 12H2O 9 g, NaOH 6 g과 NaOCl 10 mL/distilled water 1 L)을 각각 2 mL씩 넣고 37℃에서 20분간 반응시켜 630nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준곡선은 (NH₄)₂SO₄를 사용하여 암모니아태 질소함량을 측정하였다(Uzzan M, Labuza TP et.al., J Food Sci;69:77-86,2004 참조).

환원당 측정은 DNS(dinitrosalicylic acid) 방법에 의하여 측정하였다. 시료 추출액 1 mL에 DNS 3 mL를 혼합한 후 5분 동안 중탕 가열하고 냉각한 후 550 nm에서 흡광도를 측정하며 글루코스 표준 커브를 통해 환원당 값을 구하였다. 환원당 값을 구하는 식은 아래에 기재하였다.

환원당(%)=A×D×1/S×100/1000

A : 시료 용액에 포함된 환원당 함량(mg)

D : 희석비율

S : 시료의 양(g)

상기 결과는 하기 표 7에 표시하였다.

구 분		0hr	12hr	24hr	36hr
아미노태 질소(mg%)	KACC15935	52.3±1.4	78.2±1.4^b	87.4±2.6^c	121.1±1.4^b
	KACC 17117	53.2±1.4	80.7±1.4^b	96.5±2.1^b	140.7±0.7^a
	KACC 17118	56.1±11.3	99.9±3.2^a	109.0±2.5^a	137.8±4.3^a
	KACC 17117 + 17118	52.8±4.5	102.8±2.2^a	109.4±2.6^a	139.4±2.6^a
암모니아태 (mg%)	KACC15935	16.43±1.12^c	17.96±0.60^b	24.67±3.67^bc	50.46±0.47^ab
	KACC 17117	15.90±0.59^c	16.07±0.46^b	19.98±4.67^c	52.04±3.10^ab
	KACC 17118	29.58±0.92^b	24.32±6.37^a	33.18±1.82^a	49.76±2.22^b
	KACC 17117 + 17118	31.60±0.40^a	26.86±0.20^a	28.79±2.69^ab	54.19±1.00^a
환원당(%)	KACC15935	0.2±0.0^c	0.5±0.0^c	0.4±0.0^b	0.4±0.0^c
	KACC 17117	0.1±0.0^d	0.6±0.0^b	0.4±0.0^b	0.4±0.0^d
	KACC 17118	0.3±0.0^b	0.8±0.0^a	0.5±0.0^a	0.7±0.0^a
	KACC 17117 + 17118	0.3±0.0^a	0.8±0.0^a	0.5±0.0^a	0.6±0.0^b

암모니아태 질소는 단백질 분해과정에서 탈아미노화에 의하여 생성되며 식품 내에 과량으로 축적되면 부패취로 작용하므로 일반적으로 장류 제품의 변패 또는 이상발효의 지표로 사용된다. 실제로 48시간 발효한 두유 발효유에서는 부패취가 많이 났다. 따라서 두유 발효유를 제조할 때는 관능적 기호도를 고려하여 48시간을 넘지 않도록 발효하는 것이 바람직하다고 판단된다.

Claims

두유 내 이소플라본 비배당체의 함량을 증가시키는 방법으로서,
상기 방법은, 두유를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KACC 17117로 발효시키는 단계를 포함하고,
상기 발효된 두유는, 상기 바실러스 서브틸리스 KACC 17117를 10⁶CFU/mL 농도로 접종하고, 37℃에서 36시간 발효하였을 때, 두유 1g 당 150~800㎍의 다이드제인 또는 200~400㎍의 제니스테인을 포함하는, 두유 내 이소플라본 비배당체의 함량을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 이소플라본 비배당체가 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein) 및 제니스테인(genistein)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 두유 내 이소플라본 비배당체의 함량을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 바실러스 서브틸리스 KACC 17117이 10¹ 내지 10¹⁰CFU/mL 농도로 두유의 0.1 내지 5%(v/v) 접종되는, 두유 내 비배당체의 함량을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 발효가 1 내지 45시간 동안 진행되는, 두유 내 비배당체의 함량을 증가시키는 방법.
두유 발효용 조성물로서,
상기 조성물은,
두유 내 이소플라본 비배당체의 함량을 증가시키기 위한 것이고,
상기 조성물은, 바실러스 서브틸리스 KACC 17117 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하며,
상기 바실러스 서브틸리스 KACC 17117는, 바실러스 서브틸리스 KACC 17117를 두유에 10⁶CFU/mL 농도로 접종하고, 두유를 37℃에서 36시간 발효하였을 때, 두유 1g 당 150~800㎍의 다이드제인 또는 200~400㎍의 제니스테인 생성능을 포함하는, 두유 발효용 조성물.
a) 두유를 제조하는 단계; 및
b) 상기 a)단계에서 제조된 두유에 제5항의 조성물을 첨가하여 발효하는 단계를 포함하는 이소플라본 비배당체의 함량이 증가된 두유 발효유의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 단계 b)의 발효가 1 내지 45시간 동안 진행되는 이소플라본 비배당체 함량이 증가된 두유 발효유의 제조방법.
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