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KR101773135B1 - 1,4-디아미노부탄의 정제방법 - Google Patents

1,4-디아미노부탄의 정제방법 Download PDF

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KR101773135B1
KR101773135B1 KR1020150064622A KR20150064622A KR101773135B1 KR 101773135 B1 KR101773135 B1 KR 101773135B1 KR 1020150064622 A KR1020150064622 A KR 1020150064622A KR 20150064622 A KR20150064622 A KR 20150064622A KR 101773135 B1 KR101773135 B1 KR 101773135B1
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South Korea
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diaminobutane
carbonates
distillation
fermentation broth
composition
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이효형
나경수
박수진
양영렬
엄혜원
오창엽
이경민
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Abstract

1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제1 조성물로부터 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물을 분리하는 단계; 및 상기 제2 조성물에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류로부터 탄산을 제거하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계;를 포함하는 1,4-디아미노부탄의 정제방법이 제공된다.

Description

1,4-디아미노부탄의 정제방법{Refining method of 1,4-diaminobutane}
1,4-디아미노부탄의 정제방법에 관한 것이다.
1,4-디아미노부탄(일명, 퓨트레신)은 화학적 방법 또는 생물학적 방법으로 생산할 수 있다. 화학적 방법은 시안화수소와 같은 유독성 물질을 사용하거나 고가의 반응 촉매를 사용하여야 한다. 생물학적 방법은 1,4-디아미노부탄을 생산하는 미생물을 배양한 후 발효액으로부터 1,4-디아미노부탄을 정제하여 생산할 수 있다. 따라서, 생물학적 방법이 화학적 방법에 비하여 친환경적이며 고가의 촉매도 사용하지 않는다.
다만, 종래의 1,4-디아미노부탄을 생산하는 생물학적 방법에서 발효액이 1,4-디아미노부탄의 황산염을 포함하므로, 황산염을 정제하기 위하여 알칼리 화합물이 투입되며 다량의 부산물이 발생하고, 당해 부산물의 추가적인 정제도 요구된다.
따라서, 정제시 알칼리 화합물의 첨가도 없으며 부산물의 발생도 감소시킬 수 있는 보다 간단하고 경제적인 방법이 요구된다.
본 발명은 새로운 1,4-디아미노부탄의 정제방법을 제공하는 것이다.
한 측면에 따라,
1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제1 조성물로부터 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물을 분리하는 단계; 및
상기 제2 조성물에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류로부터 탄산을 제거하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계;를 포함하는 1,4-디아미노부탄의 정제방법이 제공된다.
다른 한 측면에 따라,
1,4-디아미노부탄 생산능을 가지는 미생물을 배지에서 질소 공급원을 제공하면서 배양하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 생산하는 단계;
상기 배지로부터 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 발효액 또는 이의 농축물을 준비하는 단계;
상기 발효액 또는 이의 농축물로부터 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물을 분리하는 단계; 및
상기 제3 조성물에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류로부터 탄산을 제거하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계;를 포함하는 1,4-디아미노부탄의 정제방법이 제공된다.
본 발명에서 제공되는 정제 공정에 따르면 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 조성물로부터 간단하게 1,4-디아미노부탄을 높은 수율로 얻을 수 있다. 또한, 정제시 요구되는 알칼리 화합물의 소비도 감소됨과 함께 추가 비용을 발생시켰던 부산물의 양이 급감하기 때문에 이에 소요되던 정제 비용도 함께 낮출 수 있다.
도 1은 개괄적인 1,4-디아미노부탄 정제 방법의 순서도이다.
도 2는 발효 단계부터 탈탄산 단계까지 포함하는 1,4-디아미노부탄 정제 방법의 순서도이다.
이하에서 예시적인 일구현예에 따른 1,4-디아미노부탄의 정제방법에 관하여 더욱 상세히 설명한다.
일구현예에 따른 1,4-디아미노부탄의 정제방법은 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제1 조성물로부터 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물을 분리하는 단계; 및 상기 제2 조성물에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류로부터 탄산을 제거하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계;를 포함한다.
상기 정제방법은 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 조성물로부터 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 분리하고, 상기 분리된 1,4-디아미노부탄 탄산염류로부터 탄산을 제거함에 의하여 간단하게 1,4-디아미노부탄을 정제할 수 있다.
상기 정제방법은 증류 전에 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 조성물에 염기성 물질을 첨가하여 조성물을 알칼리화한 후 증류하는 종래의 정제방법과 달리 별도의 염기성 물질을 첨가하지 않으므로 정제 공정이 간단해지며 부산물도 감소할 수 있다.
상기 정제방법에서 1,4-디아미노부탄 탄산염류(carbonate salts of 1,4-diaminobutane)는 1,4-디아미노부탄이 탄산과 결합하여 형성할 수 있는 모든 형태의 염을 포함하는 의미이다. 구체적으로, 1,4-디아미노부탄 탄산염류는 1,4-디아미노부탄 탄산염(1,4-diaminobutane carbonate, PUT2+CO3 2-, PUT=1,4-diaminobutane(putrescine)) 및 1,4-디아미노부탄 중탄산염(1,4-diaminobitane bicarbonate, PUT2+(HCO3 -)2) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 정제방법에서 제1 조성물은 1,4-다이노부탄 탄산염류를 포함한 조성물이면 어느 것이나 포함되나, 구체적으로 미생물을 배양하여 수득한 1,4-다아미노부탄 탄산염류를 포함하는 발효액 또는 이의 농축물일 수 있다.
상기 정제방법에서 발효액은 발효 과정으로부터 생성될 수 있다. 상기 발효액은 미생물을 이용하여 배양한 발효액이며, 예를 들어 변이된 미생물을 이용하여 배양한 발효액일 수 있다.
예를 들어, 발효액은 코리네박테리움속 미생물을 이용하는 경우 CMA(cornmeal malt extract agar medium) 고체 배지에서 성장시켜 종균 배지로 접종하여 배양 후 본배양 배지로 재접종하여 배양함으로써 준비되는 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 발효액일 수 있다.
상기 발효액의 준비에 사용될 수 있는 미생물들의 종류, 발효 조건 등은 이하의 배양 단계를 포함하는 정제방법 부분에서 보다 구체적으로 설명한다.
상기 정제방법에서 발효액의 농축물은 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 발효액을 농축시킴에 의하여 준비될 수 있다.
발효액을 농축하는 동안 발효액에 포함된 용매의 적어도 일부가 제거될 수 있다. 용매의 적어도 일부가 제거됨에 의하여 발효액에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류의 농도가 증가할 수 있다. 제거되는 용매는 예를 들어 물이다. 1,4-디아미노부탄 탄산염류가 포함된 발효액을 농축하는 단계에서 농축되지 않은 발효액에 포함된 최초 용매의 50% 이상, 구체적으로는 60% 이상, 보다 구체적으로는 70% 이상, 보다 더 구체적으로는 80% 이상이 제거될 수 있다.
발효액의 농축 시에 발효액에 균체가 포함되는 경우 균체의 파괴를 방지하기 위하여 저온 및 감압 환경에서 농축이 수행될 수 있다.
발효액의 농축은 100℃ 이하의 증기온도에서 수행될 수 있다. 즉, 발효액으로부터 기화되는 증기의 온도가 100℃ 이하인 조건에서 농축이 수행될 수 있다. 예를 들어, 발효액을 농축하는 단계는 10℃ 내지 100℃ 의 증기온도, 구체적으로는 30℃ 내지 80℃ 의 증기온도, 보다 구체적으로는 45℃ 내지 67℃ 의 증기온도에서 수행될 수 있다. 상기 조건에서 용매가 더욱 용이하게 제거될 수 있다.
또한, 발효액을 농축하는 단계는 760mmHg 이하의 감소된 압력에서 수행될 수 있다. 즉, 발효액과 평형인 증기의 압력이 760mmHg 이하인 조건에서 농축이 수행될 수 있다. 예를 들어, 발효액을 농축하는 단계는 10 내지 760mmHg의 압력, 구체적으로는 40 내지 500mmHg의 압력, 더욱 구체적으로는 70 내지 200mmHg의 압력에서 수행될 수 있다. 상기 조건에서 용매가 더욱 용이하게 제거될 수 있다.
예를 들어, 발효액의 농축물은 10℃ 내지 100℃의 증기온도 및 10mmHg 내지 760mmHg의 압력에서 농축을 수행하여 준비될 수 있다.
상기 정제방법에서 발효액의 농축물의 pH가 10.0 이상일 수 있다. 발효액 의 농축물의 pH가 10 이상이므로 상기 발효액에 포함된 1,4-디아미노부탄의 염이, 예를 들어 1,4-디아미노부탄 탄산염류일 수 있다.
상기 정제방법에서 증류에 의하여 제1 조성물에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류의 70중량% 이상이 분리 또는 제거될 수 있다. 예를 들어, 상기 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류의 75중량% 이상, 바람직하게는 80중량% 이상, 보다 바람직하게는 85중량% 이상, 보다 더 바람직하게는 90중량% 이상이 분리될 수 있다. 또한, 증류에 의하여 제1 조성물에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류로부터 이산화탄소의 적어도 일부가 분리될 수 있다.
상기 정제방법에서 1,4-디아미노부탄을 포함하는 제1 조성물로부터 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물을 분리할 수 있는 온도는 30℃ 내지 158℃의 증기온도, 구체적으로는 40℃ 내지 120℃의 증기온도에서 수행될 수 있다. 상기 증기온도 조건에서 1,4-디아미노부탄을 포함하는 제2 조성물이 높은 수율로 분리될 수 있다.
상기 정제방법에서 1,4-디아미노부탄을 포함하는 제1 조성물로부터 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 분리하는 압력 범위는 10mmHg 내지 760mmHg의 압력, 구체적으로는 70mmHg 내지 200mmHg의 압력에서 수행될 수 있다. 상기 압력 조건에서 1,4-디아미노부탄을 포함하는 제2 조성물이 높은 수율로 분리될 수 있다.
상기 온도 및 압력 범위에서 분리되는 1,4-디아미노부탄을 포함하는 제2 조성물은 응축에 의하여 액상으로 얻어지거나 응축 없이 기화된 상태로 후속 단계에 사용될 수 있다.
상기 정제방법에서 증류에 의하여 분리되는 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물은 1,4-디아미노부탄 탄산염류와 용매를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 조성물은 1,4-디아미노부탄 탄산염류와 용매만을 포함하고 이온, 아미노산, 유기산, 단백질, 균체와 같은 다른 성분을 포함하지 않을 수 있다.
상기 정제방법에서 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물의 pH가 10.0 이상일 수 있다. 제1 조성물로부터 증류에 의하여 얻어지는 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물의 pH가 10 이상이므로 상기 제2 조성물의 pH를 증가시키기 위한 알칼리 화합물과 같은 추가적인 첨가제가 불필요하다.
증류에 의하여 분리된 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물은 1,4-디아미노부탄 중탄산염 및/또는 1,4-디아미노부탄 탄산염을 포함할 수 있다. 예를 들어, 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물은 1,4-디아미노부탄 중탄산염을 주성분으로 포함하거나 1,4-디아미노부탄 탄산염을 주성분으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물은 용매 외에 1,4-디아미노부탄 중탄산염만을 포함하거나 1,4-디아미노부탄 탄산염만을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "주성분"은 조성물에 포함된 용매 이외의 성분 중에서 가장 함량이 높은 성분을 의미한다.
상기 정제방법에서 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물은 기상, 액상 또는 이들의 혼합상일 수 있다. 즉, 정제방법에서 요구되는 조건에 따라 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물의 상태가 달라질 수 있다.
예를 들어, 분리하는 단계에서 증류에 의하여 얻어지는 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물의 증기 및/또는 응축액을 회수할 수 있다. 증류에 의하여 제2 조성물을 분리하는 단계는 이중 자켓 반응기에서 수행할 수 있다.
상기 제2 조성물에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류로부터 탄산을 제거하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계가 분별증류에 의하여 수행될 수 있다.
1,4-디아미노부탄을 포함하는 제2 조성물에서 분별증류에 의하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류에서 이산화탄소가 분리되고 1,4-디아미노부탄이 회수될 수 있다.
예를 들어, 제1 조성물로부터 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물을 증류에 의하여 분리하여 응축 및 저장한 후, 상기 분리된 조성물이 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계에 사용될 수 있다.
상기 저장은 예를 들어 반응기의 상단과 증류탑의 사이에 배치되는 저장조에 의하여 이루어질 수 있으나, 반드시 이러한 구성으로 한정되지 않으며 당해 기술분야에서 사용될 수 있는 모든 저장 방법이 가능하다.
다르게는, 상기 정제방법에서 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물을 분리하는 단계와 분별증류에 의하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계는 연속적으로 수행될 수 있다. 즉, 상기 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제2 조성물이 제1 조성물에서 증류에 의하여 분리됨과 동시에 다시 분별증류에 의하여 1,4-디아미노부탄과 탄산으로 분리되어 1,4-디아미노부탄이 회수될 수 있다. 상기 분별증류에 의하여 얻어지는 1,4-디아미노부탄은 최종결과물이다.
상기 정제방법에서 분별증류는 100℃ 내지 230℃의 증기온도 및 상압 이상, 즉 1 기압 내지 5기압에서, 구체적으로 분별증류는 100℃ 내지 158℃ 의 증기온도 및 상압에서 작동될 수 있다. 상기 범위의 온도 및 압력에서 1,4-디아미노부탄이 높은 수율로 얻어질 수 있다.
상기 정제방법에서 분별증류에 의하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계는 증류탑에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 제1 조성물을 반응기에서 기화된 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 주성분으로 포함하는 제2 조성물이 준비된 후, 상기 제2 조성물이 증류탑에 투입되어 1,4-디아미노부탄이 선택적으로 회수될 수 있다.
예를 들어, 1,4-디아미노부탄 탄산염류가 1,4-디아미노부탄과 이산화탄소로 분리되어 1,4-디아미노부탄이 선택적으로 회수될 수 있다.
예를 들어, 상기 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 조성물은 증류탑의 중간 위치에 투입될 수 있으나, 투입 위치는 구체적인 반응 조건 및 증류탑의 조건에 따라 변경될 수 있다.
상기 정제방법에서 1,4-디아미노부탄은 증류탑의 하부에서 회수될 수 있으며, 상기 증류탑의 상부에서는 예를 들어, 물과 이온이 회수될 수 있다.
다른 일구현예에 따른 1,4-디아미노부탄의 정제방법은 1,4-디아미노부탄 생산능을 가지는 미생물을 배지에서 질소 공급원을 제공하면서 배양하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 생산하는 단계; 상기 배지로부터 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 발효액 또는 이의 농축물을 준비하는 단계; 상기 발효액 또는 이의 농축물로부터 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물을 분리하는 단계; 및 상기 제3 조성물에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류로부터 탄산을 제거하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계;를 포함한다.
상기 정제방법에서 1,4-디아미노부탄 탄산염류는 1,4-디아미노부탄 생산능을 가지는 미생물을 배지에서 질소 공급원을 제공하면서 배양하여 생산될 수 있다. 즉, 1,4-디아미노부탄 탄산염류는 미생물의 배양 단계에서 생산될 수 있다.
예를 들어, 1,4-디아미노부탄 생산능을 가지는 미생물을 일차적으로 배양한 종균 배양물을 수득한 후, 본 배양에서 종균 배양물을 배지에 접종하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류가 생산될 수 있다.
보다 구체적으로, 배양 단계에서 코리네박테리움속 미생물을 이용하는 경우 CMA(cornmeal malt extract agar medium) 고체 배지에서 성장시켜 종균 배지로 접종하여 배양 후 본배양 배지로 재접종하여 배양함으로써 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 생산할 수 있다.
이러한 배양 단계에서 이용되는 미생물은 1,4-디아미노부탄을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하며, 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 셀레노모나스 속(Selenomanas sp.), 비브리오 속(Vibrio sp.), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 스트렙토마이시스 속 (Streptomyces sp.), 아카노박테리아 속 (Arcanobacterium sp.), 알칼리젠 속(Alcaligenes sp) 등에 속하는 미생물일 수 있다. 구체적으로 코리네박테리움 속에 속하는 미생물 또는 에스케리치아 속에 속하는 미생물이며, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 대장균, 예를 들어 변이된 코리네박테리움속 미생물 또는 변이된 대장균일 수 있다. 구체적인 예로, 1,4-디아미노부탄을 생산할 수 있는 미생물은 글루타메이트에서 오르니틴까지의 생합성 경로가 내재적 활성에 비하여 강화하도록 변이되어 있을 수 있으며, 오르니틴에서 아르기닌 합성에 관여하는 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ornithine carbamoyltransfrase, ArgF), 글루타메이트의 배출에 관여하는 단백질 및/또는 퓨트레신을 분해시키는 단백질(아세틸화에 관여하는 단백질)의 활성을 내재적 활성에 비하여 약화시키도록 변이되고/되거나, 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)의 활성을 도입하거나 내재적 활성에 비하여 강화하도록 변이된 것일 수 있다. 더 구체적으로, 코리네박테리움 KCCM11401P 균주(한국공개출원 제2014-0115244호) 또는 코리네박테리움 XQ37/pKKSpeC 균주(한국공개출원 제2009-0107920호)를 이용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 미생물을 이용하여 배양하는 방법은 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등을 이용할 수 있으나 반드시 이들로 한정되지 않으며 당해 기술분야에서 사용 가능한 방법이라면 모두 가능하다.
배양 조건으로는 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시키고 배양온도는 20 내지 45℃, 예를 들어 25 내지 40℃에서 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있다.
아울러, 본 배양에 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 상기 공급원은 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 배양에 사용되는 pH 조절 및/또는 질소 공급원으로서 암모니아, 유기화합물의 암모늄염, 질소 함유 유기화합물, 탄산계 무기화합물 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이들로 한정되지 않는다.
구체적으로, 암모니아(ammonia), 암모늄아세테이트(ammonium acetate), 암모늄락테이트(ammonium lactate), 요소(urea), 탄산수소암모늄(ammonium bicarbonate), 및 탄산암모늄(ammonium carbonate) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 암모니아는 암모니아 가스이거나 암모니아수일 수 있다. 예를 들어, 상기 무기화합물 중에서는 탄산계 무기화합물만이 상기 질소 공급원으로 사용될 수 있다.
이러한 pH 조절 및/또는 질소 공급원은 배양액 내에 탄산염을 생성하고 황산염 등의 생성을 방지하므로, 정제 과정에서 탄산염에서 탄산이 분리되어 가스로 제거되므로 추가적인 부산물의 생성이 방지되어 전체적인 정제 공정이 간단해지고 정제비용도 감소될 수 있다.
한편, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 등의 황산계 질소 공급원, 염화물계 질소공급원, 질산계 질소공급원은 탄산계 무기화합물이 아니므로 상기 발효액의 질소 공급원에 포함되지 않는다. 예를 들어, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 등의 황산계 질소 공급원, 염화물계 질소공급원, 질산계 질소공급원은 부산물로 생성되므로 이들을 처리하는 공정이 추가적으로 요구되어 공정이 복잡해지고 제조 비용의 증가를 야기할 수 있기 때문이다.
이어서, 배지로부터 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 발효액 또는 이의 농축물을 준비한다.
상기 정제방법에서 발효액은 배양하는 단계로부터 얻어진 결과물을 그대로 사용하여 준비될 수 있다.
한편, 상기 정제방법에서 발효액의 농축물은 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 발효액을 농축시킴에 의하여 준비될 수 있다. 즉, 발효액의 농축물이 발효액을 농축하는 단계에 의하여 준비될 수 있다.
발효액을 농축하는 단계에서 발효액에 포함된 용매의 적어도 일부가 제거될 수 있다. 용매의 적어도 일부가 제거됨에 의하여 발효액에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류의 농도가 증가할 수 있다. 제거되는 용매는 예를 들어 물이다. 중성 발효액을 농축하는 단계에서 농축되지 않은 발효액에 포함된 최초 용매의 50% 이상, 구체적으로는 60% 이상, 보다 구체적으로는 70% 이상, 보다 더 구체적으로는 80% 이상이 제거될 수 있다.
발효액을 농축하는 단계에서 발효액에 균체가 포함되는 경우 균체의 파괴를 방지하기 위하여 저온 및 감압 환경에서 농축이 수행될 수 있다.
발효액을 농축하는 단계는 100℃ 이하의 증기온도에서 수행될 수 있다. 즉, 발효액으로부터 기화되는 증기의 온도가 100℃ 이하인 조건에서 농축이 수행될 수 있다. 예를 들어, 발효액을 농축하는 단계는 10℃ 내지 100℃ 의 증기온도, 구체적으로는 30℃ 내지 80℃ 의 증기온도, 보다 구체적으로는 45℃ 내지 67℃ 의 증기온도에서 수행될 수 있다. 상기 조건에서 용매가 더욱 용이하게 제거될 수 있다.
또한, 발효액을 농축하는 단계는 760mmHg 이하의 감소된 압력에서 수행될 수 있다. 즉, 발효액과 평형인 증기의 압력이 760mmHg 이하인 조건에서 농축이 수행될 수 있다. 예를 들어, 발효액을 농축하는 단계는 10 내지 760mmHg의 압력, 구체적으로는 40 내지 500mmHg의 압력, 더욱 구체적으로는 70 내지 200mmHg의 압력에서 수행될 수 있다. 상기 조건에서 용매가 더욱 용이하게 제거될 수 있다.
예를 들어, 발효액을 농축하는 단계가 10℃ 내지 100℃의 증기온도 및 10mmHg 내지 760mmHg의 압력에서 수행될 수 있다.
상기 정제방법에서 발효액의 농축물의 pH가 10.0 이상일 수 있다. 발효액 의 농축물의 pH가 10 이상이므로 상기 발효액에 포함된 1,4-디아미노부탄의 염이, 예를 들어 1,4-디아미노부탄 탄산염류일 수 있다.
예를 들어, 균체가 제거되거나 제거되지 않은 발효액에서 물을 제거하여 발효액을 농축시킬 수 있다. 농축 단계는 생략될 수 있다.
상기 물의 제거에 사용되는 방법은 감압 농축법 및/또는 증발 농축법 등이다. 이에 사용되는 농축기의 종류는 특별히 이에 제한되지 않고, 원심 농축기, 증발 농축기, 대류순환식 농축기, 저온감압 농축기, 회전식 감압 농축기, 감압증발 농축기, 박막 농축기 및 판형 농축기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 농축기를 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 농축 방법 중에서 저온 감압 농축법을 이용하여 농축할 수 있다.
상기 정제방법에서 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물을 분리하는 단계 전에 발효액 또는 이의 농축물로부터 균체를 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물을 분리하는 단계 전에 발효액 또는 이의 농축물에서 균체를 제거하면 정제 과정에서 얻어지는 1,4-디아미노부탄의 순도가 증가될 수 있다. 상기 분리된 균체는 부산물로 활용될 수 있다. 예를 들어, 분리된 균체는 건조 후 동물용 사료 등으로 사용될 수 있다.
발효액에서 균체를 제거하는 단계는 생략될 수 있다.
발효액에서 균체를 제거하기 위해 사용되는 방법은 특별히 제한되지 않고, 원심 분리기, 필터 프레스, 압착 여과기, 규조토 여과기, 회전식 진공 여과기, 멤브레인 필터(membrane filter), 및 응집과 부유하는 방법 등을 이용할 수 있다. 예를 들어, 균체를 제거하기 위해 사용되는 방법은 멤브레인 필터(membrane filter)를 이용할 수 있다. 상기 중성 발효액은 멤브레인 필터를 이용하여 여과액과 균체 슬러지로 분리될 수 있다. 멤브레인의 공극을 통과할 수 없는 균체 및 기타 불순물이 상기 중성 발효액에서 제거되고 미세 공극을 통과한 액만 여과액으로 얻어질 수 있다. 이 때 멤브레인의 공극을 통과하지 못하여 여과액으로 수득되지 않는 잔류물인 균체 슬러지 또는 균체 슬러지액이 분리 제거될 수 있다. 상기 멤브레인 필터는 상기 중성 발효액에서 균체를 분리 제거할 수 있는 것이면 어느 것이나 이용될 수 있다. 멤브레인 필터의 운전 조건도 당업자가 중성 발효액에서 균체를 분리 제거하기 위하여 용이하게 조건을 설정할 수 있다. 예를 들어, 중성 발효액을 약 50℃로 미리 가열하여 수행할 수 있다. 이는 균체 분리 제거의 효율을 높이기 위한 것으로 낮은 온도보다는 50℃ 정도에서 여과액이 나오는 속도가 더 높아져 여과 시간을 단축시킬 수 있으며, 생산성도 높아지는 효과를 기대할 수 있기 때문이다. 멤브레인간 압력(TMP: Trans membrane pressure)은 약 1.0 내지 1.5 기압의 조건에서 수행될 수 있다. 멤브레인간 압력(TMP)은 수직 방향으로 흐르는 액에 대해 수평 방향으로 가해지는 압력의 크기를 나타내는 값으로, 멤브레인 필터 내의 용액이 막에 가하는 압력을 나타낸다. 사용되는 멤브레인의 공극의 크기도 또한 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 멤브레인의 공극의 크기는 약 0.01㎛ 내지 0.15㎛일 수 있다.
또한, 멤브레인 필터의 가동 후 초기에 겔 층(gel layer) 형성 시간을 1시간 정도 가질 수 있다. 겔 층 형성은 여과 멤브레인 표면에 균체의 얇은 층을 형성시켜 여과액 유속(permeate flux)을 일정한 수준으로 오랜 시간 지속하기 위한 과정이다. 이 과정을 거치는 경우 여과액 유속을 일정하게 유지할 수 있고 멤브레인 필터의 세척 횟수를 줄일 수 있다. 겔 층 형성이 끝난 후에는 본격적으로 멤브레인을 통해 여과액을 수득할 수 있다.
상기 발효액 또는 이의 농축물을 사용하는 정제방법에서 1,4-디아미노부탄 탄산염류(carbonate salts of 1,4-diaminobutane)는 1,4-디아미노부탄 탄산염(1,4-diaminobutane carbonate, PUT2+CO3 2-, PUT=1,4-diaminobutane(putrescine)) 및 1,4-디아미노부탄 중탄산염(1,4-diaminobitane bicarbonate, PUT2+(HCO3 -)2) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 발효액 또는 이의 농축물을 사용하는 정제방법에서 증류에 의하여 발효액 또는 이의 농축물에 포함된 1,4-디아미노부탄 및 이의 염의 70중량% 이상이 분리 또는 제거될 수 있다. 예를 들어, 상기 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류의 75중량% 이상, 구체적으로는 80중량% 이상, 보다 구체적으로는 85중량% 이상, 보다 더 구체적으로는 90중량% 이상이 분리될 수 있다. 또한, 증류에 의하여 발효액 또는 이의 농축물에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류로부터 이산화탄소의 적어도 일부가 분리될 수 있다.
상기 발효액 또는 이의 농축물을 사용하는 정제방법에서 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 발효액 또는 이의 농축물부터 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물을 분리하는 단계는 30℃ 내지 158℃의 증기온도, 구체적으로는 40℃ 내지 120℃의 증기온도에서 수행될 수 있다. 상기 증기온도 조건에서 1,4-디아미노부탄을 포함하는 제3 조성물이 높은 수율로 분리될 수 있다.
상기 발효액 또는 이의 농축물을 사용하는 정제방법에서 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 발효액 또는 이의 농축물로부터 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물을 분리하는 단계는 10mmHg 내지 760mmHg의 압력, 구체적으로는 70mmHg 내지 200mmHg의 압력에서 수행될 수 있다. 상기 압력 조건에서 1,4-디아미노부탄을 포함하는 조성물이 높은 수율로 분리될 수 있다.
상기 온도 및 압력 범위에서 분리되는 1,4-디아미노부탄을 포함하는 제3 조성물은 응축에 의하여 액상으로 얻어지거나 응축 없이 기화된 상태로 후속 단계에 사용될 수 있다.
상기 발효액 또는 이의 농축물을 사용하는 정제방법에서 증류에 의하여 분리되는 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물은 1,4-디아미노부탄 탄산염류와 용매를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제3 조성물은 1,4-디아미노부탄 탄산염류와 용매만을 포함하고 이온, 아미노산, 유기산, 단백질, 균체와 같은 다른 성분을 포함하지 않을 수 있다.
또한, 발효액 또는 이의 농축물로부터 증류에 의하여 제3 조성물을 분리하는 단계에서 알칼리 화합물과 같은 추가적인 첨가제가 요구되지 않으며, 황산염에서 유래하는 부산물도 생성되지 않는다. 따라서, 전체적인 정제 공정이 간단해지고 부산물 처리를 위하여 비용이 감소하므로 경제적으로 매우 유리하다.
증류 단계에서 남은 슬러리는 추가 정제공정을 거쳐 부산물로 활용 가능하다. 균체 분리하지 않은 발효액의 경우 증류수를 추가로 투입하여 슬러리를 완전히 용해하여 균체 분리 후 모액에서 부산물을 회수할 수도 있다.
상기 발효액 또는 이의 농축물을 사용하는 정제방법에서 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물의 pH가 10.0 이상일 수 있다. 발효액 또는 이의 농축물로부터 증류에 의하여 얻어지는 1,4-디아미노부탄을 포함하는 제3 조성물의 pH가 10 이상이므로 상기 제3 조성물의 pH를 증가시키기 위한 알칼리 화합물이 불필요하다.
증류에 의하여 분리된 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물은 1,4-디아미노부탄 중탄산염 및/또는 1,4-디아미노부탄 탄산염을 포함할 수 있다. 예를 들어, 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물은 1,4-디아미노부탄 중탄산염을 주성분으로 포함하거나 1,4-디아미노부탄 탄산염을 주성분으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물은 용매 외에 1,4-디아미노부탄 중탄산염만을 포함하거나 1,4-디아미노부탄 탄산염만을 포함할 수 있다.
상기 발효액 또는 이의 농축물을 사용하는 정제방법에서 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물은 기상, 액상 또는 이들의 혼합상일 수 있다. 즉, 정제방법에서 요구되는 조건에 따라 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물의 상태가 달라질 수 있다.
예를 들어, 분리하는 단계에서 증류에 의하여 얻어지는 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물의 증기 및/또는 응축액을 회수할 수 있다. 증류에 의하여 제3 조성물을 분리하는 단계는 이중 자켓 반응기에서 수행할 수 있다.
상기 제3 조성물에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류로부터 탄산을 제거하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계가 분별증류에 의하여 수행될 수 있다.
1,4-디아미노부탄을 포함하는 제3 조성물에서 분별증류에 의하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류에서 이산화탄소가 분리되고 1,4-디아미노부탄이 회수될 수 있다.
예를 들어, 발효액 또는 이의 농축물로부터 1,4-디아미노부탄을 포함하는 제3 조성물을 증류에 의하여 분리하여 응축 및 저장한 후, 상기 분리된 조성물이 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계에 사용될 수 있다.
상기 저장은 예를 들어 반응기의 상단과 증류탑의 사이에 배치되는 저장조에 의하여 이루어질 수 있으나, 반드시 이러한 구성으로 한정되지 않으며 당해 기술분야에서 사용될 수 있는 모든 저장 방법이 가능하다.
다르게는, 상기 정제방법에서 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물을 분리하는 단계와 분별증류에 의하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계는 연속적으로 수행될 수 있다. 즉, 상기 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물이 발효액 또는 이의 농축물로부터 증류에 의하여 분리됨과 동시에 다시 분별증류에 의하여 1,4-디아미노부탄과 탄산으로 분리되어 1,4-디아미노부탄이 회수될 수 있다. 상기 분별증류에 의하여 얻어지는 1,4-디아미노부탄은 최종결과물이다.
상기 정제방법에서 분별증류는 100℃ 내지 230℃의 증기온도 및 상압 이상, 즉 1기압 내지 5기압, 구체적으로 분별증류는 100℃ 내지 158℃ 의 증기온도 및 상압에서 작동될 수 있다. 상기 범위의 온도 및 압력에서 1,4-디아미노부탄이 높은 수율로 얻어질 수 있다.
상기 정제방법에서 분별증류에 의하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계는 증류탑에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 발효액 또는 농축물을 반응기에서 기화된 1,4-디아미노부탄을 주성분으로 포함하는 제3 조성물이 준비된 후, 상기 제3 조성물이 증류탑에 투입되어 1,4-디아미노부탄이 선택적으로 회수될 수 있다. 예를 들어, 1,4-디아미노부탄 탄산염류가 1,4-디아미노부탄과 이산화탄소로 분리되어 1,4-디아미노부탄이 선택적으로 회수될 수 있다. 예를 들어, 상기 1,4-디아미노부탄을 포함하는 제3 조성물은 증류탑의 중간 위치에 투입될 수 있으나, 투입 위치는 구체적인 반응 조건 및 증류탑의 조건에 따라 변경될 수 있다.
상기 정제방법에서 1,4-디아미노부탄은 증류탑의 하부에서 회수될 수 있으며, 상기 증류탑의 상부에서는 예를 들어, 물과 이온이 회수될 수 있다.
상기 방법으로 정제된 1,4-디아미노부탄은 60중량% 이상의 회수율, 구체적으로는 65중량% 이상의 회수율, 더욱 구체적으로는 75% 이상의 회수율, 더욱 더 구체적으로는 85% 이상의 회수율, 가장 구체적으로는 90.0중량% 이상의 회수율을 가질 수 있다.
또한, 상기 방법으로 정제된 1,4-디아미노부탄은 90.0중량% 이상의 순도 및 90.0중량% 이상의 회수율을 가질 수 있다. 상기 방법으로 정제된 1,4-디아미노부탄은 91.0중량% 이상의 순도 및 91.0중량% 이상의 회수율을 가질 수 있다. 상기 방법으로 정제된 1,4-디아미노부탄은 92.0중량% 이상의 순도 및 92.0중량% 이상의 회수율을 가질 수 있다. 상기 순도는 증류탑 하부에서 얻어지는 물과 1,4-디아미노부탄의 혼합물 중에서 1,4-디아미노부탄의 함량을 의미한다.
이하의 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명이 더욱 상세하게 설명된다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 이들만으로 본 발명의 범위가 한정되는 것이 아니다.
(1,4-디아미노부탄의 정제)
실시예 1: 균체 제거 없는 1,4-디아미노부탄의 정제방법, NH3 사용
(발효단계)
1) 종균배양: 1,4-디아미노부탄 생성 세균의 종균 배양
포도당(glucose) 30.0 g/L, 당밀(molasses) 15 g/L, 인산(phosphoric acid) 1.11 g/L, 황산마그네슘 7수화물(magnesium sulfate 7 hydrate) 5.8 g/L, 옥수수 침출액(corn steep liquor) 10.0 g/L, 알지닌(arginine) 0.5 g/L, 바이오틴(biotin) 1.0 mg/L, 티아민 염산염(thiamine pyrophosphate) 20.0 mg/L, 펜트센산 칼슘염(calcium pathothenate) 20.0 mg/L, 니코틴산(nicotinic acid) 20.0 mg/L, 및 소포제(anti-foaming agent) 0.2 g/L를 함유하는 배지 400 mL를 1L 부피의 유리 발효조에 투입한 후, 120℃에서 20분 동안 가열시켜 살균하였다.
살균된 발효조를 30℃까지 냉각시킨 후, CMA(cornmeal malt extract agar medium) 고체 배지에서 12시간 동안 미리 성장시킨 코리네박테리움 KCCM11401P (대한민국 특허공개 제2014-0115244호) 균체를 상기 배지에 접종하고, 30℃에서 충분한 통기와 교반 하에 배양하여 종균 배양물을 수득하였다. 종균 배양 시에 암모니아 가스를 pH 조절 및 질소원으로 공급하였다.
2) 본 배양
포도당 120.0 g/L, 당밀 7.0 g/L, 인산 0.7 g/L, 황산마그네슘 7수화물 2.0 g/L, Corn steep liquor 5.0 g/L, 알지닌 0.5 g/L, 바이오틴 1.0 mg/L, 티아민 염산염 20.0 mg/L, 펜트센산 칼슘염 20.0 mg/L, 니코틴산 20.0 mg/L, 및 소포제 0.3 g/L를 함유하는 배지 1500 mL를 5L 부피의 유리 발효조에 투입한 후 120℃에서 20분 동안 가열시켜 살균하였다.
살균된 발효조를 30℃까지 냉각시킨 후, 상기에서 준비된 종균 배양물 370 mL를 상기 배지에 접종하고, 30℃에서 충분한 통기와 교반 하에 배양하였다. 배양액의 질소원으로는 암모니아 가스를 사용하고 배양액의 질소원이 고갈되지 않도록 암모니아 가스를 공급하여 pH를 조절하였다.
배양 결과, 발효액에 31.2 g/L의 1,4-디아미노부탄이 축적되었으며, 발효액의 pH는 8.0 이었다.
(농축 단계)
상기 1,4-디아미노부탄 중탄산염을 포함하는 발효액 6,700g을 10L 농축기(Eyela, Tokyo, Japan)에 투입하고, 47℃의 증기온도 및 80mmHg의 압력으로 유지하면서 발효액의 79.5%를 제거하여 농축액을 준비하였다. 이 때, 제거된 응축수는 5,327g이었고, 제거된 응축수 중에 1,4-디아미노부탄은 검출되지 않았다. 하기 표 1은 농축 단계 전, 후의 성분 분석표이다. 하기 표 1의 1,4-디아미노부탄, 아미노산, 유기산, 단백질과 이온은 HPLC로 분석하였고, 수분은 Karl-fisher 수분 측정법을 이용하여 분석하였다.
성분 발효액 (g) 농축 후 응축수 (g) 농축액 (g)
pH 8.0 7.1 10.5
물 6,142.6 5,187.2 960.0
1,4-디아미노부탄 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 중탄산염 489.3 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 0.0 0.0 344.8
이온 7.4 139.8 7.4
아미노산 5.5 0.0 5.5
유기산 6.1 0.0 6.1
단백질 1.5 0.0 1.5
균체 47.7 0.0 47.7
합계 6,700.0 5,327.0 1,373.0
(증류 단계)
준비된 농축액 1.373g을 5L 이중 자켓 반응기에 투입하였다. 이중 자켓 반응기는 상부 응축기, 응축수기와 압력 조절이 가능한 장치가 설치된 장치이다. 이중 자켓 반응기는 50 내지 95℃의 증기온도 및 80mmHg의 압력에서 상기 농축물을 증류시켰다. 상기 이중 자켓 반응기는 초기에 수분 증발로 인해 47℃의 증기온도로 유지되다가 1,4-디아미노부탄이 증발되면서 95℃까지 증기온도가 상승하였다. 증발된 증기는 응축수기를 거쳐 응축수기에 응축되었다. 응축수는 1,286.4g 이었고, 증발 후 잔류물은 86.6g 이었다. 하기 표 2는 증류 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 농축액 (g) 증발 후 잔류물 (g) 응축수 (g)
pH 10.5 - 11.1
물 960.0 0.0 960.0
1,4-디아미노부탄 0.0 18.5 0.0
1,4-디아미노부탄 중탄산염 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 344.8 0.0 326.4
이온 7.4 7.4 0.0
아미노산 5.5 5.5 0.0
유기산 6.1 6.1 0.0
단백질 1.5 1.5 0.0
균체 47.7 47.7 0.0
합계 1,373.0 86.6 1,286.4
(분별증류 단계)
상기 1,4-디아미노부탄을 포함하는 응축수 1,286.4g을 20단의 증류탑(Aceglass Incorporate, USA)에 투입하고 증류탑 상부에서는 물과 탄산 1,086.3g이 회수되고, 증류탑 하부에서는 1,4-디아마노부탄 200.1g (HPLC 함량 92.8%)이 회수되었고, 1,4-디아미노부탄의 회수율은 90.6중량% 이었다.
증류탑은 100 내지 158℃의 증기온도 및 상압에서 1,4-디아미노부탄 탄산염의 탄산을 분리시켜 1,4-디아미노부탄을 회수하였다. 하기 표 3은 탈탄산 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 증발된 응축수 (g) 증류탑 상부 (g) 증류탑 하부 (g)
pH 11.1 7.3 13.5
물 960.0 945.6 14.4
1,4-디아미노부탄 0.0 0.9 185.7
1,4-디아미노부탄 중탄산염 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 326.4 0.0 0.0
이온 0.0 139.8 0.0
아미노산 0.0 0.0 0.0
유기산 0.0 0.0 0.0
단백질 0.0 0.0 0.0
균체 0.0 0.0 0.0
합계 1,286.4 1,086.3 200.1
실시예 2: 균체 제거 후 1,4- 디아미노부탄의 정제방법, NH3 사용
(발효단계)
실시예 1과 동일한 방법으로 종균배양 및 본배양을 실시하여 발효액을 준비하였다.
(균체분리단계)
상기 발효액 13,400g을 15L 바스켓에 넣고, 카트리지 형태의 멤브레인 필터(Milipore사 제조, Pellicon 2, 공극의 크기: 0.1㎛, 멤브레인 면적: 0.5㎡)를 사용하여 발효액을 여과하였다.
상기 발효액을 상기 멤브레인 필터에 넣고 60℃의 온도에서 멤브레인간 압력(TMP: Trans membrane pressure)이 1.2 기압인 조건하에 균체 슬러지 400.0g를 분리 제거하고 여과액을 13,000g수득하였다. 하기 표 4는 균체분리 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 발효액 (g) 균체 슬러지 (g) 여과액 (g)
pH 8.0 8.0 8.0
물 12,285.1 293.6 11,991.6
1,4-디아미노부탄 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 중탄산염 978.6 10.7 967.9
1,4-디아미노부탄 탄산염 0.0 0.0 0.0
이온 14.9 0.2 14.7
아미노산 10.9 0.1 10.8
유기산 12.2 0.1 12.0
단백질 3.0 0.0 3.0
균체 95.3 95.3 0.0
합계 13,400.0 400.0 13,000.0
(농축 단계)
상기 여과액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 농축 단계를 실시하였다. 여과액 6,500g을 투입하고 발효액의 82.5%를 제거하여 농축하였다. 제거된 응축수는 5.365g이었고, 제거된 응축수에서는 1,4-디아미노부탄이 검출되지 않았다. 하기 표 5는 농축 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 여과액 (g) 농축 후 응축수 (g) 농축액 (g)
pH 8.0 7.0 10.7
물 5,995.8 5,226.7 773.7
1,4-디아미노부탄 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 중탄산염 484.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 0.0 0.0 341.1
이온 7.3 138.3 7.3
아미노산 5.4 0.0 5.4
유기산 6.0 0.0 6.0
단백질 1.5 0.0 1.5
균체 0.0 0.0 0.0
합계 6,500 5,365.0 1,135.0
(증류 단계)
상기 농축액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 증류 단계를 실시하였다. 농축액 1.135g을 투입하고 응축수 1,101.8g을 얻었고, 잔류물은 33.2g이었다. 하기 표 6은 증류 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 농축액 (g) 증발 후 잔류물 (g) 증발된 응축수 (g)
pH 10.7 - 11.3
물 773.7 0.0 773.7
1,4-디아미노부탄 0.0 13.0 0.0
1,4-디아미노부탄 중탄산염 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 341.1 0.0 328.1
이온 7.3 7.3 0.0
아미노산 5.4 5.4 0.0
유기산 6.0 6.0 0.0
단백질 1.5 1.5 0.0
균체 0.0 0.0 0.0
합계 1,135.0 33.2 1,101.8
(분별증류 단계)
상기 응축수를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 분별증류 단계를 실시하였다. 응축수 1,101.8g을 투입하고 증류탑 상부로 902.3g 및 증류탑 하부로 199.5g (HPLC 함량 91.8%)이 회수되었고, 1,4-디아미노부탄의 회수율은 91.8중량% 이었다. 하기 표 7은 탈탄산 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 증발된 응축수 (g) 증류탑 상부 (g) 증류탑 하부 (g)
pH 11.3 7.1 13.3
물 773.7 762.5 11.2
1,4-디아미노부탄 0.0 1.5 188.3
1,4-디아미노부탄 중탄산염 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 328.1 0.0 0.0
이온 0.0 138.3 0.0
아미노산 0.0 0.0 0.0
유기산 0.0 0.0 0.0
단백질 0.0 0.0 0.0
균체 0.0 0.0 0.0
합계 1,101.8 902.3 199.5
실시예 3: 균체 제거 후 농축 없는 1,4- 디아미노부탄의 정제방법, NH3 사용
(발효단계)
실시예 1과 동일한 방법으로 종균배양 및 본배양을 실시하여 발효액을 준비하였다.
(균체분리단계)
실시예 2와 동일한 방법으로 균체분리단계를 실시하였다.
(증류 단계)
상기 균체분리된 여과액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 증류 단계를 실시하였다. 여과액 6,500g을 투입하고 응축수 6,465.7g을 얻었고, 잔류물은 34.3g이었다. 하기 표 8은 증류 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 농축액 (g) 증발 후 잔류물 (g) 증발된 응축수 (g)
pH 8.0 - 10.8
물 5,995.8 14.0 6,000.3
1,4-디아미노부탄 0.0 7.3 0.0
1,4-디아미노부탄 중탄산염 484.0 0.0 465.4
1,4-디아미노부탄 탄산염 0.0 0.0 0.0
이온 7.3 0.0 0.0
아미노산 5.4 5.4 0.0
유기산 6.0 6.0 0.0
단백질 1.5 1.5 0.0
균체 0.0 0.0 0.0
합계 6,500 34.3 6,465.7
(분별증류 단계)
상기 응축수를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 분별증류 단계를 실시하였다. 응축수 6,465.7g을 투입하고 증류탑 상부로 6,266.3g 및 증류탑 하부로 199.4g (HPLC 함량 94.1%)이 회수되었고, 1,4-디아미노부탄의 회수율은 91.5중량% 이었다. 하기 표 9는 탈탄산 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 증발된 응축수 (g) 증류탑 상부 (g) 증류탑 하부 (g)
pH 10.8 6.9 13.4
물 6,000.3 5,988.6 11.8
1,4-디아미노부탄 0.0 1.2 187.7
1,4-디아미노부탄 중탄산염 465.4 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 0.0 0.0 0.0
이온 0.0 276.5 0.0
아미노산 0.0 0.0 0.0
유기산 0.0 0.0 0.0
단백질 0.0 0.0 0.0
균체 0.0 0.0 0.0
합계 6,465.7 6,266.3 199.4
실시예 4: 균체 제거 없는 1,4- 디아미노부탄의 정제방법, 암모늄아세테이트 사용
(발효단계)
1) 종균배양: 1,4-디아미노부탄 생성 세균의 종균 배양
실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
2) 본 배양
질소원으로 암모니아 가스 대신에 암모늄아세테이트(ammonium acetate)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 본 배양을 실시하였다.
질소원으로 600g/L의 암모늄아세테이트 100mL를 적가하면서 배양하였다.
배양 결과, 발효액에 30.6 g/L의 1,4-디아미노부탄이 축적되었으며, 발효액의 pH는 8.0 이었다.
(농축 단계)
상기 발효액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 농축 단계를 실시하였다.
발효액 6,700g을 투입하고, 발효액의 81.6%를 제거하여 농축액을 준비하였다. 이 때, 제거된 응축수는 5,187.2g이었고, 제거된 응축수 중에 1,4-디아미노부탄은 검출되지 않았다. 하기 표 1은 농축 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 발효액 (g) 농축 후 응축수 (g) 농축액 (g)
pH 8.0 7.3 10.6
물 6,100.9 5,307.2 798.8
1,4-디아미노부탄 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 중탄산염 514.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 0.0 0.0 355.0
이온 9.5 153.8 9.5
아미노산 6.5 0.0 6.5
유기산 6.0 0.0 6.0
단백질 4.8 0.0 4.8
균체 58.3 0.0 58.3
합계 6,700.0 5,461.0 1,239.0
(증류 단계)
상기 농축액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 증류 단계를 실시하였다.
농축액 1.373g을 투입하고 응축수 1,135.4g을 얻었고, 잔류물은 103.6g이었다. 하기 표 11은 증류 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 농축액 (g) 증발 후 잔류물 (g) 증발된 응축수 (g)
pH 10.6 - 11.4
물 798.8 0.0 798.8
1,4-디아미노부탄 0.0 18.5 0.0
1,4-디아미노부탄 중탄산염 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 355.0 0.0 366.6
이온 9.5 9.5 0.0
아미노산 6.5 6.5 0.0
유기산 6.0 6.0 0.0
단백질 4.8 4.8 0.0
균체 58.3 58.3 0.0
합계 1,239.0 103.6 1,135.4
(분별증류 단계)
상기 응축수를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 분별증류 단계를 실시하였다. 응축수 1,135.4g을 투입하고 증류탑 상부로 943.8g 및 증류탑 하부로 191.5g (HPLC 함량 94.9%)이 회수되었고, 1,4-디아미노부탄의 회수율은 90.3중량% 이었다. 하기 표 12은 탈탄산 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 증발된 응축수 (g) 증류탑 상부 (g) 증류탑 하부 (g)
pH 11.4 7.3 13.5
물 798.8 789.1 9.8
1,4-디아미노부탄 0.0 0.9 181.7
1,4-디아미노부탄 중탄산염 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 366.6 0.0 0.0
이온 0.0 153.8 0.0
아미노산 0.0 0.0 0.0
유기산 0.0 0.0 0.0
단백질 0.0 0.0 0.0
균체 0.0 0.0 0.0
합계 1,135.4 943.8 191.5
실시예 5: 균체 제거 후 1,4-디아미노부탄의 정제방법, 암모늄아세테이트 사용
(발효단계)
실시예 4와 동일한 방법으로 종균배양 및 본배양을 실시하여 발효액을 준비하였다.
(균체분리단계)
실시예 2와 동일한 방법으로 균체 분리 단계를 실시하였다.
상기 발효액 13,400g을 투입하여 균체 슬러지 400.0g를 분리 제거하고 여과액을 13,000g수득하였다. 하기 표 13은 균체 분리 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 발효액 (g) 균체 슬러지 (g) 여과액 (g)
pH 8.0 8.0 8.0
물 12,201.7 271.1 11,930.6
1,4-디아미노부탄 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 중탄산염 1,028.0 11.7 1,016.3
1,4-디아미노부탄 탄산염 0.0 0.0 0.0
이온 19.0 0.2 18.8
아미노산 13.1 0.1 12.9
유기산 12.0 0.1 11.8
단백질 9.6 0.1 9.5
균체 116.6 116.6 0.0
합계 13,400.0 400.0 13,000.0
(농축 단계)
상기 여과액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 농축 단계를 실시하였다. 여과액 6,500g을 투입하고 발효액의 83.4%를 제거하여 농축하였다. 제거된 응축수는 5,421g이었고, 제거된 응축수에서는 1,4-디아미노부탄이 검출되지 않았다. 하기 표 14는 농축 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 여과액 (g) 농축 후 응축수 (g) 농축액 (g)
pH 8.0 7.1 10.8
물 5,965.3 5,268.9 701.5
1,4-디아미노부탄 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 중탄산염 508.1 0.0 351.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 0.0 0.0 0.0
이온 9.4 152.1 9.4
아미노산 6.5 0.0 6.5
유기산 5.9 0.0 5.9
단백질 4.8 0.0 4.8
균체 0.0 0.0 0.0
합계 6,500.0 5,421.0 1,079.0
(증류 단계)
상기 농축액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 증류 단계를 실시하였다. 농축액 1,079g을 투입하고 응축수 1,041.1g을 얻었고, 잔류물은 37.9g이었다. 하기 표 15은 증류 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 농축액 (g) 증발 후 잔류물 (g) 증발된 응축수 (g)
pH 10.8 - 11.3
물 701.5 0.0 701.5
1,4-디아미노부탄 0.0 11.3 0.0
1,4-디아미노부탄 중탄산염 351.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 0.0 0.0 339.6
이온 9.4 9.4 0.0
아미노산 6.5 6.5 0.0
유기산 5.9 5.9 0.0
단백질 4.8 4.8 0.0
균체 0.0 0.0 0.0
합계 1,079.0 37.9 1,041.1
(분별증류 단계)
상기 응축수를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 분별증류 단계를 실시하였다. 응축수 1,041.1g을 투입하고 증류탑 상부로 847.4g 및 증류탑 하부로 193.8g (HPLC 함량 96.2%)이 회수되었고, 1,4-디아미노부탄의 회수율은 92.6중량% 이었다. 하기 표 16은 탈탄산 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 증발된 응축수 (g) 증류탑 상부 (g) 증류탑 하부 (g)
pH 11.3 7.2 13.5
물 701.5 694.1 7.4
1,4-디아미노부탄 0.0 1.2 186.4
1,4-디아미노부탄 중탄산염 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 339.6 0.0 0.0
이온 0.0 152.1 0.0
아미노산 0.0 0.0 0.0
유기산 0.0 0.0 0.0
단백질 0.0 0.0 0.0
균체 0.0 0.0 0.0
합계 1,041.1 847.4 193.8
실시예 6: 균체 제거 후 농축 없는 1,4-디아미노부탄의 정제방법, 암모늄아세테이트 사용
(발효단계)
실시예 4와 동일한 방법으로 종균배양 및 본배양을 실시하여 발효액을 준비하였다.
(균체분리단계)
실시예 5와 동일한 방법으로 균체 분리 단계를 실시하였다.
(증류 단계)
상기 균체 분리된 여과액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 증류 단계를 실시하였다. 여과액 6,500g을 투입하고 응축수 6,459.3g을 얻었고, 잔류물은 40.7g이었다. 하기 표 17은 증류 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 농축액 (g) 증발 후 잔류물 (g) 증발된 응축수 (g)
pH 8.0 - 10.9
물 5,965.3 0.0 5,970.4
1,4-디아미노부탄 0.0 14.1 0.0
1,4-디아미노부탄 중탄산염 508.1 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 0.0 0.0 489.0
이온 9.4 9.4 0.0
아미노산 6.5 6.5 0.0
유기산 5.9 5.9 0.0
단백질 4.8 4.8 0.0
균체 0.0 0.0 0.0
합계 6,500.0 40.7 6,459.3
(분별증류 단계)
상기 응축수를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 분별증류 단계를 실시하였다. 응축수 6,459.3g을 투입하고 증류탑 상부로 6,268.5g 및 증류탑 하부로 190.8g (HPLC 함량 96.5%)이 회수되었고, 1,4-디아미노부탄의 회수율은 91.5중량% 이었다. 하기 표 9는 탈탄산 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 증발된 응축수 (g) 증류탑 상부 (g) 증류탑 하부 (g)
pH 10.9 7.1 13.4
물 5,970.4 5,963.7 6.7
1,4-디아미노부탄 0.0 0.6 184.1
1,4-디아미노부탄 중탄산염 0.0 0.0 0.0
1,4-디아미노부탄 탄산염 489.0 0.0 0.0
이온 0.0 304.2 0.0
아미노산 0.0 0.0 0.0
유기산 0.0 0.0 0.0
단백질 0.0 0.0 0.0
균체 0.0 0.0 0.0
합계 6,459.3 6,268.5 190.8
비교예 1: 균체 제거 후 1,4-디아미노부탄의 정제방법, 황산암모늄 사용
(발효단계)
1) 종균배양: 1,4-디아미노부탄 생성 세균의 종균 배양
pH 조절을 위하여 암모니아를 사용하고, 질소원으로 암모니아 대신에 황산암모늄 5.0g/L를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
2) 본 배양
질소원으로 암모니아 가스 대신에 황산암모늄(ammonium sulfate) 50.0g/L를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 본 배양을 실시하였다.
배양 결과, 발효액에 30.1 g/L의 1,4-디아미노부탄이 축적되었으며, 발효액의 pH는 7.1이었다.
(균체분리단계)
실시예 2와 동일한 방법으로 균체 분리 단계를 실시하였다.
상기 발효액 13,400g을 투입하여 균체 슬러지 400.0g을 분리 제거하고 여과액을 13,000g 수득하였다. 하기 표 19는 균체 분리 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 발효액 (g) 균체 슬러지 (g) 여과액 (g)
pH 7.1 7.1 7.1
물 12,437.3 298.5 12,138.8
1,4-디아미노부탄 396.4 5.1 391.3
이온 450.4 0.2 444.6
아미노산 11.0 0.1 10.8
유기산 11.8 0.2 11.6
단백질 2.9 0.0 2.9
균체 90.3 90.3 0.0
합계 13,400.0 400.0 13,000.0
(농축 단계)
상기 여과액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 농축 단계를 실시하였다.
여과액 6,500g을 투입하고, 발효액의 82.3%를 제거하여 농축액을 준비하였다. 이 때, 제거된 응축수는 5,350g이었고, 제거된 응축수 중에 1,4-디아미노부탄은 검출되지 않았다. 하기 표 20은 농축 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 여과액 (g) 농축 후 응축수 (g) 농축액 (g)
pH 7.1 8.0 6.8
물 6,069.4 5,350.0 719.4
1,4-디아미노부탄 195.7 0.0 195.7
이온 222.3 0.0 222.3
아미노산 5.4 0.0 5.4
유기산 5.8 0.0 5.8
단백질 1.4 0.0 1.4
균체 0.0 0.0 0.0
합계 6,500.0 5,350.0 1,150.0
(증류 단계)
상기 농축액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 증류 단계를 실시하였다.
농축액 1,150g을 투입하고 응축수 719.4g을 얻었고, 잔류물은 430.6g이었다. 1,4-디아미노부탄이 1,4-디아미노부탄의 황산염 결정으로 침전되어 응축수로 회수되지 않았다. 하기 표 21은 증류 단계 전, 후의 성분 분석표이다.
성분 농축액 (g) 증발 후 잔류물 (g) 증발된 응축수 (g)
pH 6.8 - 7.3
물 719.4 0.0 719.4
1,4-디아미노부탄 195.7 195.7 0.0
이온 222.3 222.3 0.0
아미노산 5.4 5.4 0.0
유기산 5.8 5.8 0.0
단백질 1.4 1.4 0.0
균체 0.0 0.0 0.0
합계 1,150.0 430.6 719.4

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  13. 1,4-디아미노부탄 생산능을 가지는 미생물을 배지에서 질소 공급원을 제공하면서 배양하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 생산하는 단계;
    상기 배지로부터 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 발효액 또는 이의 농축물을 준비하는 단계;
    상기 발효액 또는 이의 농축물로부터 증류에 의하여 1,4-디아미노부탄 탄산염류를 포함하는 제3 조성물을 분리하는 단계; 및
    상기 제3 조성물에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류로부터 탄산을 제거하여 1,4-디아미노부탄을 회수하는 단계;를 포함하며,
    상기 질소 공급원이 암모니아, 유기화합물의 암모늄염, 질소 함유 유기화합물, 및 탄산계 무기화합물 중에서 선택된 하나 이상인 1,4-디아미노부탄의 정제방법.
  14. 삭제
  15. 제13 항에 있어서, 상기 농축물이 상기 발효액을 10℃ 내지 100℃의 증기온도 및 10mmHg 내지 760mmHg의 압력에서 농축을 수행하여 준비되는 1,4-디아미노부탄의 정제방법.
  16. 제13 항에 있어서, 상기 농축물의 pH가 10.0 이상인 1,4-디아미노부탄의 정제방법.
  17. 제13 항에 있어서, 상기 제3 조성물을 분리하는 단계 전에 상기 발효액으로부터 균체를 제거하는 단계를 더 포함하는 1,4-디아미노부탄의 정제방법.
  18. 제13 항에 있어서, 상기 1,4-디아미노부탄 탄산염류가 1,4-디아미노부탄 탄산염(1,4-diaminobutane carbonate) 및 1,4-디아미노부탄 중탄산염(1,4-diaminobutane bicarbonate) 중 하나 이상인 1,4-디아미노부탄의 정제방법.
  19. 제13 항에 있어서, 상기 증류에 의하여 제3조성물에 포함된 1,4-디아미노부탄 탄산염류의 70중량% 이상이 분리되는 1,4-디아미노부탄의 정제방법.
  20. 제13 항에 있어서, 상기 증류가 30℃ 내지 158℃의 증기 온도 및 10mmHg 내지 760mmHg의 압력에서 수행되는 1,4-디아미노부탄의 정제방법.
  21. 제13 항에 있어서, 상기 제3 조성물의 pH가 10.0 이상인 1,4-디아미노부탄의 정제방법.
  22. 제13 항에 있어서, 상기 탄산의 제거가 분별증류에 의하여 수행되는 1,4-디아미노부탄의 정제방법.
  23. 제22 항에 있어서, 상기 분별증류가 100℃ 내지 230℃의 증기온도 및 1기압 내지 5기압에서 수행되는 1,4-디아미노부탄의 정제방법.
  24. 제22 항에 있어서, 상기 분별증류가 증류탑에서 수행되는 1,4-디아미노부탄의 정제방법.
  25. 제24 항에 있어서, 상기 증류탑의 하부에서 1,4-디아미노부탄이 회수되는 1,4-디아미노부탄의 정제방법.
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