KR101761092B1

KR101761092B1 - 췌도 세포 이식용 조성물

Info

Publication number: KR101761092B1
Application number: KR1020160038084A
Authority: KR
Inventors: 이동윤; 김태헌; 강동훈
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2016-03-30
Filing date: 2016-03-30
Publication date: 2017-07-26
Anticipated expiration: 2036-03-30

Abstract

본 발명은 글리시리진(glycyrrhizin)이 결합된 생체적합성 고분자 백본을 포함하는 췌도세포 이식용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 췌도 세포 이식용 조성물 또는 이식용 췌도 세포 제조 방법을 이용하는 경우, 이식할 췌도세포에 대하여 면역 거부 반응을 효과적으로 감소시키기 위해 표면 개질시킬 수 있고, 본 발명의 이식용 췌도 세포 조성물 또는 췌도세포-결함(islet cell-deficiency) 질환 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 이용하는 경우, 췌도 세포를 면역 거부 반응 없이 효과적으로 이식할 수 있으며, 췌도 세포의 결함에 의해 발생하는 다양한 질병들을 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

췌도 세포 이식용 조성물{Composition for Transplanting of Islet Cells}

본 발명은 글리시리진(glycyrrhizin)이 결합된 생체적합성 고분자 백본을 포함하는 췌도세포 이식용 조성물에 관한 것이다.

췌장 소도세포 이식(pancreatic islet transplantation)에 있어서 주안점은 이식된 췌장 소도세포에 대한 면역반응 및 이식 장소에서 일어나는 염증 반응의 조절이다. 이식 초기의 면역반응 및 염증 반응으로 인해 이식된 췌장 소도세포의 60% 이상이 제 기능을 하지 못하고 리젝션(rejection)된다. 이에 주된 원인은 세포 내에 있는 전사 인자 단백질(transcription factor protein)인 HMGB1 단백질이다. HMGB1 단백질은 세포 내에 유전자 전사 단백질로써 존재하지만 이식을 하면서 생기는 수술적인 손상과 면역반응으로 인해 세포 밖으로 분비되면서 주위 면역세포들의 TLR2, TLR4 및 RAGE등의 세포막 수용체에 결합하면서 면역반응 및 염증 반응을 유발하게 되며, 끝내 이러한 과정을 거치며 이식된 췌장 소도세포가 리젝션된다. 특히, 다른 장기들에 비해 췌장에 HMGB1 단백질이 많이 존재하기 때문에 성공적인 췌장 소도세포 이식에 있어서 HMGB1 단백질의 방출을 조절하는 기술 개발은 매우 중요한 이슈이다.

췌도 세포의 이식 시 초기에 발생하는 HMGB1의 작용을 막기 위해 HMGB1의 항체를 이식 동물에 대해 정맥주사를 통해(Intravenous) 주입하여 면역반응을 줄여주고자 하는 시도가 있었다(Matsuoka N, et al., High-mobility group box 1 is involved in the initial events of early loss oftransplanted islets in mice. Journal of Clinical Investigation 120:735-743(2010).

또한, 세포 전사 요소중 하나인 NF-κB를 막아주는 DHMEQ나, 췌도 세포를 간에서 이식할 때 항응고 물질인 항트롬빈(antithromin) III을 동종 이식 후에 동물에 투여 해주면 HMGB1의 발현을 줄일 수 있다는 보고가 있었다(Kuraya D, et al., Efficacy ofDHMEQ, a NF-kappaB inhibitor, in islet transplantation: I. HMGB1 suppression byDHMEQ prevents early islet graft damage. Transplantation 96:445-453(2013); Kojima D, et al., Prevention of high-mobility group box 1-mediated early loss of transplanted mouse islets in the liver by antithrombin III. Transplantation 93:983-988(2012)).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 췌도 세포 이식시의 면역 거부 반응을 줄이기 위한 췌도 세포 이식용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 글리시리진이 결합된 생체적합성 고분자 백본을 이용하는 경우, 췌도 세포 이식시의 면역 거부 반응을 유의하게 감소시킬 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 췌도 세포 이식용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 이식용 췌도 세포 제조 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 이식용 췌도 세포 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 췌도세포-결함(islet cell-deficiency) 질환 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 생체적합성 고분자 백본 및 (b) 상기 생체적합성 고분자 백본에 결합된 글리시리진을 포함하는 췌도 세포 이식용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 췌도 세포 이식시의 면역 거부 반응을 줄이기 위한 췌도 세포 이식용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 글리시리진이 결합된 생체적합성 고분자 백본을 이용하는 경우, 췌도 세포 이식시의 면역 거부 반응을 유의하게 감소시킬 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 "글리시리진(glycyrrhizin)"은 감초 추출 성분으로서, HMGB1 단백질과 직접 결합하여 그 활동성을 억제한다는 점에 대해서는 알려져 왔다. 그러나, 글리시리진을 이용하여 췌도 세포의 표면 개질에 이용하는 기술에 대해서는 알려진 바 없으며, 본 발명자들은 생체적합성 고분자 백본에 글리시리진을 결합시키고, 글리시리진이 결합된 생체적합성 고분자 백본을 이식을 위한 췌도 세포 표면 개질에 이용하는 경우, 췌도 세포의 이식 성공률을 유의하게 향상시킬 수 있음을 밝혔다. 하기 실시예에서 보인 바와 같이 본 발명의 글리시리진이 결합된 생체적합성 고분자 백본을 이용하는 경우, 췌도 세포의 생존률이 최대 3배까지 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 글리시리진은 산화된(oxidized) 형태의 글리시리진이다. 상기 산화된 형태의 글리시리진은 도 1의 1에 나타낸 바와 같이, 말단의 글루쿠론산 고리의 2번 탄소 및 3번 탄소 사이의 결합이 산화에 의해 열려(opened) 알데하이드 치환기를 형성하게 된다. 이렇게 형성된 알데하이드 그룹에 의해 글리시리진은 생체 적합성 고분자 백본과 결합을 형성할 수 있다.

본 명세서 상의 용어 "생체 적합성 고분자 백본"은 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 파괴시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 항응혈성(blood compatibility)을 갖는 고분자를 의미하고, 다수의 글리시리진과 결합을 형성할 수 있는 백본의 역할을 하는 고분자를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 고분자 백본은 알데하이드 그룹과 화학 결합을 형성할 수 있는 기능기를 포함한다. 상술한 바와 같이 산화된 형태의 글리시리진은 알데하이드 그룹을 포함하며, 글리시리진의 알데하이드 그룹과 화학 결합을 형성할 수 있는 치환기를 포함하는 생체 적합성 고분자라면 제한없이 이용가능하다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 고분자 백본에 포함된 기능기는 아민 그룹, 카복실 그룹, 티올 그룹 또는 히드록사이드 그룹이다. 바람직하게는 아민 그룹이 포함된 생체 적합성 고분자 백본을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 고분자 백본은 글리콜 키토산, 폴리-L-리신, 폴리(4-비닐피리딘/디비닐벤젠), 키틴, 폴리(부타디엔/아크릴로니트릴) 아민 말단, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐린, 폴리(에틸렌글리콜)비스(2-아미노에틸), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드, 폴리(2-비닐피리딘), 폴리(2-비닐피리딘 N-옥사이드), 폴리-ε-Cbz-L-리신, 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트), 폴리(알릴 아민), 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 폴리(N-메틸비닐아민), 폴리(디알릴디메틸암모늄클로라이드), 폴리(N-비닐피롤리돈), 키토산, 또는 폴리(4-아미노스티렌)으로부터 선택된다.

췌도세포의 이식은 당업계에 공지된 적절한 이식부위(예를 들면, 신장 피막 하 및 간문맥 등)를 선정하고, 이식 부위에 공지된 방식, 예를 들면 복강 절개없이 초음파 투시 하에서 경피적으로 간문맥을 통해 간 내로 준비한 췌도를 주입하는 방법 등을 통해 수행된다. 이식에 적합한 도세포의 조건은 ABO 일치형으로서 췌도 (islet)수가 5,000/kg(객체 체중) 이상, 췌도 순도(islet purity)가 30% 이상, 최종 부피가 10 ml 이하이며 그램 염색상 음성이고, 엔도톡신 음성인 경우 이식 조건이 된다(Shapiro J et al., International trial of the edmonton protocol for islet transplantation, N Engl J Med 355:1318-1330(2006)).

본 발명의 조성물은 (a) 이식 전의 세포 전처리 및 (b) 세포가 이식된 객체(subject)에 대한 이식 부위 국소 투여 중 적어도 하나에 사용된다. 본 발명에 있어서, 이식용 세포 전처리는 객체에 이식하기 위한 세포를 준비하여, 객체에 이식하기 전의 이식용 세포에 본 발명의 조성물을 처리하는 것을 의미하며, 구체적인 처리 방법은 분리된 이식용 세포의 표면에 본 발명의 조성물이 결합될 수 있는 조건 하에서 이식용 세포와 본 발명의 조성물을 접촉시켜, 상호 결합을 형성하도록 하는 것이다. 상술한 "결합될 수 있는 조건"을 형성할 수 있는 방법의 구체적인 예로서, 췌도 세포 표면의 아민기와 화학 결합을 형성할 수 있는 치환기를 갖도록 고분자 백본을 개질시키는 방법 및 췌도 세포와 고분자 백본의 결합을 매개할 수 있는 링커를 이용하는 방법이 있다. 상기 링커의 구체적인 일례로서 PEG를 들 수 있으며, 특히 다양한 이중 기능성(bifunctional) PEG를 이용하여 췌도 세포를 페길레이션 시키고, 페길레이션된 표면에 글리시리진이 결합된 고분자 백본을 추가적으로 결합시킬 수 있다. 세포가 이식된 객체에 대한 이식 부위 국소 투여는, 세포 이식과 동시에 또는 세포 이식 직후 언제라도 가능하며, 이때 상술한 바와 같이, 췌도 세포 표면의 아민기와 화학 결합을 형성할 수 있는 치환기를 갖도록 개질시킨 고분자 백본을 이용하거나, 상술한 링커가 미리 결합된, 구체적으로 예를 들면 이중 기능성 PEG를 이용하여 페길레이션된 췌도 세포를 이식 한 뒤, 본 발명의 조성물을 이식 부위에 국소 주입함으로서, 이식된 췌도 세포의 표면에 글리시리진이 결합된 생체 적합성 고분자 백본이 결합될 수 있도록 할 수 있다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 이식 전의 세포 전처리에 사용된다. 이식 전의 세포를 전처리 함으로서 이식 거부 반응을 예방할 수 있다는 점에서 이식 후 전신적 투여 또는 이식 부위 국소 투여만이 가능한 기존 약물들에 비하여 효율성이나 안정성 면에서 크게 유리하며, 이식 거부 반응 억제를 위한 기존의 약물들과 차별화된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 공여자(donor)로부터 분리된 상태의 췌도 세포에, 상술한 췌도 세포 이식용 조성물을 처리하여, 글리시리진이 결합된 생체 적합성 고분자 백본을 상기 췌도 세포 표면에 결합시키는 단계를 포함하는 이식용 췌도 세포 제조 방법을 제공한다.

본 발명인 이식용 췌도 세포 제조 방법은 상술한 본 발명의 일 양태인 췌도 세포 이식용 조성물을 이용하는 방법에 관한 것인바, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.

본 발명의 방법에 있어서 췌도 세포에 대한 췌도 세포 이식용 조성물의 "처리"는 상술한 이식전의 세포 전처리와 동일하며, 요컨대 분리된 이식용 세포의 표면에 본 발명의 조성물이 결합될 수 있는 조건 하에서 이식용 세포와 본 발명의 조성물을 접촉시켜, 상호 결합을 형성하도록 하는 것이다. 상기 "결합될 수 있는 조건"에 대해서도 상술한 바와 동일하다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 췌도 세포는 페길레이션 된(PEGylated) 것이다. 췌도 세포의 표면의 아민 그룹과 결합을 형성할 수 있는 치환기를 도입한 고분자 백본을 이용할 수도 있으나, 페길레이션에 의해 췌도 세포와 고분자 백본 사이의 결합의 효율성을 높일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 페길레이션은 헤테로 이중 기능성(heterobifunctional) PEG를 이용하여 수행된 것이다. 페길레이션의 첫 단계는 PEG 폴리머의 일 말단 또는 양 말단을 적절한 기능기로 치환시키는 것이며, 본 발명의 경우 췌도 세포와 고분자 백본의 화학결합을 매개하기 위하여 페길레이션을 이용하는 것이므로, PEG의 양 말단이 적절한 기능기로 치환된 것을 이용할 수 있다. 본 명세서 상의 용어 "헤테로 이중 기능성(heterobifunctional) PEG"는 상술한 바와 같이 PEG의 양 말단이 각각 서로 다른 적절한 기능기로 치환되어 있는 PEG를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 헤테로 이중 기능성 PEG는 일 말단에 말레이미드 치환기를 포함하고, 다른 일 말단에 NHS 에스테르 또는 카복실산 치환기를 포함하는 것이다. 본 발명의 "말레이미드(maleimide)" 치환기는 설프히드릴(-SH) 그룹과 반응하여 화학 결합을 형성할 수 있는 치환기이고, "NHS 에스테르" 또는 "카복실산" 치환기는 아민 그룹과 반응하여 화학 결합을 형성할 수 있는 치환기이다.

따라서, 본 발명의 헤테로 이중 기능성 PEG를 이용함으로써, 1차적으로 상기 PEG의 일 말단의 NHS 에스테르 또는 카복실산 치환기와 췌도 세포 표면의 아민 그룹 간의 결합을 형성시킬 수 있다. 한편 2차적으로 페길레이션된 췌도 세포와 글리시리진을 결합시킨 생체 적합성 고분자 백본 간의 결합을 형성시켜야 하는데, PEG의 반응하지 않은 다른 일 말단이 말레이미드 치환기를 포함하는 경우, 고분자 백본의 잔여 아민기를 설프히드릴 그룹으로 치환시킬 필요가 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명의 실시예에서는 트라웃 시약(Traut's reagent)을 이용하여 잔여 아민기를 설프히드릴 그룹으로 치환시켰다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 이식용 췌도 세포 조성물을 제공한다:

(a) 공여자(donor)로부터 분리된 췌도 세포;

(b) 링커로서의 이중 기능성 PEG; 및

(c) (i) 생체적합성 고분자 백본 및 (ii) 상기 생체적합성 고분자 백본에 결합된 글리시리진; 상기 생체적합성 고분자 백본은 상기 링커를 매개로 상기 췌도 세포에 결합된다.

본 발명의 췌도 세포 조성물은 공여자로부터 분리된 췌도 세포를 객체(subject)에 이식하기 위해, 상기 췌도 세포를 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 췌도 세포 이식용 조성물로 처리하여, 고분자 백본을 췌도 세포에 결합시킨 상태의 세포 조성물에 관한 것인 바, 중복되는 내용에 관하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 글리시리진은 산화된(oxidized) 형태의 글리시리진이다. 상기 산화된 형태의 글리시리진에 대하여는 본 발명의 다른 일 양태에 관한 설명을 통해 이미 설명한 바 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 고분자 백본은 상술한 바와 같이 글리콜 키토산, 폴리-L-리신, 폴리(4-비닐피리딘/디비닐벤젠), 키틴, 폴리(부타디엔/아크릴로니트릴) 아민 말단, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐린, 폴리(에틸렌글리콜)비스(2-아미노에틸), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드, 폴리(2-비닐피리딘), 폴리(2-비닐피리딘 N-옥사이드), 폴리-ε-Cbz-L-리신, 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트), 폴리(알릴 아민), 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 폴리(N-메틸비닐아민), 폴리(디알릴디메틸암모늄클로라이드), 폴리(N-비닐피롤리돈), 키토산, 또는 폴리(4-아미노스티렌)으로부터 선택된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 이중 기능성 PEG는 헤테로 이중 기능성(heterobifunctional) PEG이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 헤테로 이중 기능성 PEG는 일 말단에 말레이미드 치환기를 포함하고, 다른 일 말단에 NHS 에스테르 또는 카복실산 치환기를 포함하는 것이다. 상기 헤테로 이중 기능성 PEG에 대하여는 본 발명의 다른 일 양태에 관한 설명을 통해 이미 설명한 바 있다.

본 발명의 췌도 세포 조성물은 상술한 췌도 세포 이식용 조성물과 마찬가지로, 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 이식용 췌도 세포 조성물은 특별히 제한되지 않지만, 췌도 세포 300개 당 약 1-300 μg/ml 농도의 글리시리진을 포함할 수 있다. 보다 더 구체적으로 췌도 세포 300개 당 약 5-200 μg/ml, 보다 더 구체적으로 약 10-150 μg/ml, 보다 더 구체적으로 약 20-120 μg/ml 농도의 글리시리진을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 이식용 췌도 세포 조성물을 포함하는 췌도세포-결함(islet cell-deficiency) 질환 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 췌도 세포의 이식을 위하여 표면 개질된 췌도 세포 조성물에 관한 것이므로, 췌도세포-결함에 의해 발생할 수 있는 모든 질환에 대하여 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 췌도세포-결함 질환은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 및 당뇨병성 만성 신질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환이다. 상기 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 당뇨병성 만성 신질환은 모두 췌도세포 이식으로 치료가 가능한 질병이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 췌도세포-결함 질환은 제1형 당뇨병이다. 제1형 당뇨병의 경우에는, 인슐린을 분비하는 췌도의 베타세포가 파괴됨으로 인하여 인슐린 분비기능이 소실되어 발생하고, 췌도세포 이식이 제1형 당뇨병에 대한 좋은 치료방법이 될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 이식 부위에 대한 국소 투여가 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 췌도 세포 이식용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 이식용 췌도 세포 제조 방법을 제공한다.

(c) 본 발명은 이식용 췌도 세포 조성물을 제공한다.

(d) 본 발명은 췌도세포-결함(islet cell-deficiency) 질환 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(e) 본 발명의 췌도 세포 이식용 조성물 또는 이식용 췌도 세포 제조 방법을 이용하는 경우, 이식할 췌도세포에 대하여 면역 거부 반응을 효과적으로 감소시키기 위해 표면 개질시킬 수 있다.

(f) 본 발명의 이식용 췌도 세포 조성물 또는 췌도세포-결함(islet cell-deficiency) 질환 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 이용하는 경우, 췌도 세포를 면역 거부 반응 없이 효과적으로 이식할 수 있으며, 췌도 세포의 결함에 의해 발생하는 다양한 질병들을 효과적으로 치료할 수 있다.

도 1은 페길레이션 된 췌장소도 세포와 글리콜 키토산과 글리시리진의 컨쥬게이션 과정에 대한 모식도를 나타낸다.
도 2는 글리시리진과 글리콜 키토산의 결합 여부를 FT-IR로 확인한 결과를 나타낸다. 글리시리진, 글리콜 키토산, 산화된 글리시리진, 및 글리시리진이 결합된 글리콜 키토산, 4 그룹에 대하여 FT-IR을 확인하였다.
도 3a 내지 3d는 글리시리진과 글리콜 키토산의 결합상태에서 PEG 결합을 확인한 NMR 결과를 나타낸다. 글리콜 키토산(도 3a), 글리시리진(도 3b), PEG(MAL-PEG-NHS)(도 3c), PEG-글리콜 키토산-글리시리진(도 3d), 4 그룹에 대하여 각각 NMR을 통해 확인하였다.
도 4는 폴리-L-리신 고분자에 대한 글리시리진의 결합 반응 과정의 모식도를 나타낸다.
도 5는 폴리-L-리신에 결합된 글리시리진에 대하여, FT-IR을 통해 결합 생성을 확인한 결과를 나타낸다. 도 5의 (A)는 FT-IR 결과를 나타내고, 도 5의 (B)는 결합 구조식을 나타낸다.
도 6은 글리콜 키토산-oGL의 처리 농도에 따른 세포 생존능을 나타낸다.
도 7은 글리콜 키토산-oGL 처리 농도에 따른 세포 표면 관찰 결과를 나타낸다.
도 8은 PEG를 매개로 췌장소도 세포 표면에 글리콜 키토산-oGL이 결합하였는지 여부를 공초점 이미징에 의해 관찰한 결과를 나타낸다.
도 9는 GSIS를 통한 췌장소도의 인슐린 분비량(좌측 패널)과 인슐린 단백질 분비량에 따른 SI 값 비교(우측 패널) 결과를 나타낸다.
도 10은 SPR(surface plasmon resonance)을 통한 HMGB1에 대한 결합 친화도 확인 결과를 나타낸다. 글리시리진, 글리콜 키토산, HMGB1 Ab, 클리콜 키토산-oGL 그룹으로 나누어 HMGB1에 대한 결합 친화도를 측정하였다.
도 11은 마우스에 대한 췌장소도 이식에 따른 혈당 변화 실험 결과를 나타낸다.
도 12는 글리시리진을 처리한 췌도세포를 당뇨병 질환 동물 모델에 이식 후 혈당 변화를 관찰한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 글리시리진( glycyrrhizin )과 글리콜 키토산(glycol chitosan )의 결합

(1) 4℃에서 카보네이트 버퍼 용액(pH 9.5) 1 ml에 글리시리진 0.41 mg(0.5 mM)(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 녹였다. (2) 같은 부피의 과요오드산 나트륨 용액(sodium periodate solution)(50 mM)을 넣고 4℃에 빛을 차단한 상태에서 90분간 반응시켜 산화된 글리시리진(glycyrrhizin)을 얻었다. (3) 글리콜 키토산(glycol chitosan)(80,000~120,000 Da; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan)을 카보네이트 버퍼 용액(pH 9.5)에 1 mg/ml로 녹여서 상기 (2)의 용액에 1 ml를 방울방울 떨어뜨렸다. (4) 24시간 동안 4℃에 빛을 차단한 상태로 반응시켰다. (5) 시아노보로하이드라이드(cyanoborohydride)(5 M)를 (4)의 용액에 ml당 0.5 μl씩 넣어주었다. (6) 24시간동안 4℃에 빛을 차단한 상태로 반응시켰다. (7) 카보네이트 버퍼 용액(pH 9.5)에 48시간 동안 투석(dialysis)(MWCO 3500-5000)하였다. (8) 2차 증류수에 72시간동안 투석(MWCO 3500-5000)하였다. (9) 동결건조를 통해 가루형태로 보관하였다. (10) 인산 버퍼(phosphate buffer)(pH 8.0, EDTA 5 mM)에 (9)에서 얻어진 글리시리진과 글리콜 키토산의 결합형태의 파우더를 1 mg/ml로 녹였다. (11) 인산 버퍼에 2 mg/ml로 녹인 트라웃 시약(Traut's reagent)(14 mM)을 (10)의 용액 10 ml당 69 μl씩 넣어주었다. (12) 상온에서 4시간 반응시켰다.

실시예 2: 췌장소도 표면 개질

(1) 글리콜 키토산과 글리시리진을 컨쥬게이션 시키기 위해 글리시리진 산화 과정을 거쳐 글루쿠론산 부분에 알데하이드기를 형성시켰다(참조: 도 1의 1). (2) 산화된 글리시리진을 글리콜 키토산의 아민기와 결합시킨 뒤에, 트라웃 시약(Traut's reagent)을 통해 남은 아민기를 SH기로 치환시켰다(참조: 도 1의 2). (3) 췌장소도 세포 표면의 아민기와 PEG(MAL-PEG-NHS)의 NHS를 결합시켜 페길레이션(PEGylation) 시켰다(참조: 도 1의 3). (4) 페길레이션된 췌장소도의 말레이미드(maleimide)와 글리시리진과 결합된 글리콜 키토산의 SH기를 결합시켜 표면을 개질시켰다(참조: 도 1의 4).

실시예 3: 글리시리진과 글리콜 키토산(glycol chitosan)의 결합 여부 확인

3-1. FT-IR 측정

(1) 글리시리진, 글리콜 키토산, 산화된 글리시리진, 및 글리콜 키토산에 결합된 글리시리진을 각각 준비하였다. (2) 산화된 글리시리진과 글리콜 키토산에 결합된 글리시리진은 동결건조를 통해 분말형태로 건조시켰다. (3) NaCl(100 mg)에 4가지 그룹 각각(1 mg)을 막자사발로 곱게 간 후, FT-IR을 이용해 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 글리콜 키토산의 사카린 구조(saccarin structure)를 1065 cm^-1에서 확인하였고, 1651 cm^-1과 3425 cm^-1에서 아민기의 피크를 확인하였다. 글리시리진의 카복실기를 1442 cm^-1에서 확인하였고, 산화 과정을 거친 글리시리진의 경우 새로운 피크가 1632 cm^-1에서 관찰되었으며, 1632 cm^-1에서의 피크가 알데하이드기를 나타내는 피크인 바, 산화된 것을 확인하였다.

글리시리진과 글리콜 키토산의 합성된 형태의 데이터로 1628 cm^-1에서 결합하고 남은 알데하이드기와 1320 cm^-1에서 산화된 글리시리진의 알데하이드기와 글리콜 키토산의 아민기가 결합하여 아마이드 결합이 형성된 것을 확인하였고 940 cm^-1에서 글리콜 키토산의 사카린 구조가 합성을 거치면서 피크의 시프팅(shifting)이 일어난 것을 확인하였다.

결합시킨 그룹의 FT-IR 데이터를 통해 글리시리진이 산화되어 글리콜 키토산과 결합할 알데하이드 기가 형성됨을 확인하였다. 또한 형성된 글리시리진의 알데하이드기와 글리콜 키토산의 아민기가 결합하여 아마이드 결합이 형성됨을 확인하였다.

3-2. NMR 측정

(1) 글리시리진, 글리콜 키토산, PEG(MAL-PEG-NHS), PEG-글리콜 키토산-글리시리진(1 mg)을 각각 D₂O(600 ml)에 녹였다. (2) 4가지 그룹을 각각 NMR을 이용해 측정하였고 그 결과를 도 3a 내지 3d에 나타내었다.

PEG(MAL-PEG-NHS)의 말레이미드(maleimide)를 6.89 ppm, PEG를 3.72 ppm, NHS를 2.51 ppm과 2.73 ppm에서 각각 확인하였다. 글리콜 키토산과 글리시리진을 결합한 뒤에 PEG를 결합한 뒤 확인 한 데이터에서 0.81 ppm, 1.42 ppm과 5.70 ppm에서 각각 글리시리진을 나타내는 피크를 확인하였고, 동시에 PEG 한쪽에 붙어있는 NHS를 나타내는 2.51 ppm, 2.73 ppm에서 확인하였다.

글리콜 키토산의 -CH-와 글리시리진의 히드록사이드 라디칼, 그리고 PEG의 에틸렌옥사이드 백본(backbone)를 나타나는 3.4 ppm에서 3.7 ppm에서 피크가 매우 강하게 나타나는 것을 확인 하였으며, 피크가 나타나는 지점이 겹치기 때문에 각각의 피크를 모두 확인 할 수는 없지만 PEG의 NHS와 글리시리진이 나타내는 피크를 동시에 확인한 것과, 피크가 겹치는 구간에서 피크가 강하게 나타난 것으로 PEG와 결합이 되었다는 것을 확인하였다.

실시예 4: 키토산 이외에 PLL(Poly-L-Lysine)을 이용하여 글리시리진과 결합 확인

키토산 이외의 고분자에 글리시리진의 결합을 확인하기 위해서 아민기(amine group)를 가장 많이 갖고 있는 PLL(Poly-L-Lysine)(30,000~70,000 Da; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 글리시리진을 결합시켰다(참조: 도 4). 결합 조건은 키토산과 동일한 방법으로 수행하였고, FT-IR을 이용해 결과를 확인하였다(참조: 도 5).

FT-IR 결과 3055 cm^-1 및 1320 cm^-1에서 결합된 피크를 확인하였다. 상기 결과로부터 글리시리진을 결합할 수 있는 고분자는 키토산에 국한되지 않고, PLL 및 그 이외의 아민기를 갖는 다양한 고분자 등으로 활용이 가능함을 확인하였다.

실시예 5: 췌장소도 세포 분리

(1) 7주령의 수컷 SD-래트(rat)를 마취제를 이용하여 마취한 후 복부 절개하였다. (2) 췌장 장기를 노출 시킨 후 총담관(Common bile duct)을 통해서 콜라게나아제(Collagenase) P 용액을 이용하여 췌장 장기를 부풀린 후 췌장 장기를 적출하였다. (3) 15분 동안 효소 반응 후 차가운 M199 배지를 넣어 효소 반응을 정지 시킨 후 2회 세척하였다. (4) 피콜-히스토페이크(Ficoll-histopaque) 및 M199 배지의 더블-레이어(double-layer)를 이용한 농도 구배-원심분리(density gradient-centrifugation)를 24분간 실시하였다. (5) 분리된 층 사이의 췌장소도를 모아 2회 세척 후 입체경(stereoscope)를 이용하여 수작업 선별(handpicking)하였다. (6) 10% FBS 및 1% 항생제가 들어 있는 RPMI-1640 배양액에서 1일 동안 배양하였다. (7) 다음날 배양액을 한번 교체하였다.

실시예 6: 췌장소도에서의 글리콜 키토산-oGL(oxidazed glycyrrhizin) 처리 농도의 확립

췌장소도 세포 표면 개질을 진행 할 때, 세포의 생존능에 영향을 주지 않는 최적의 글리시리진의 농도를 설정하기 위한 실험으로 CCK-8을 사용하였다. 대조군(control) 그룹은 글리콜 키토산-oGL과 페길레이션(PEGylation)을 시키지 않았고, 비교군은 모두 0.25%의 PEG와 반응을 시켰으며, 글리콜 키토산-oGL을 0%, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%로 나누어 실험을 진행하였다. n수는 5이며, DNA 분석(assay)을 통해 값을 보정하였다. 대조군(control)을 100%로 설정하였을 때, 글리콜 키토산-oGL의 농도 0%부터 0.25% 까지는 약 93% 정도의 세포 생존능을 보이며 통계적인 차이를 보이지 않았고, 0.5%를 처리 하였을 때, 약 63%의 값을 나타내 통계적인 차이를 보였다(참조: 도 6).

췌장소도 세포의 생존능 측정과 동시에 세포의 상태와 표면을 관찰하기 위한 실험으로 글리콜 키토산-oGL을 농도별로 처리 한 뒤, CCK-8 실험을 하기 직전에 현미경을 통해 각 그룹의 췌장소도 세포를 현미경을 통해 관찰하였다. 대조군 그룹과 0%, 0.05%, 0.1%는 세포의 수와 표면에 차이가 없는 것으로 관찰되었다. 0.25% 그룹의 경우 다른 그룹에 비해 췌장소도 세포가 약간 깨져있는 것이 관찰되지만 전체적인 세포의 수나 표면의 모습은 대조군 그룹과 차이를 보이지 않음을 확인하였다. 이는 CCK-8 결과와 비교해 보았을 때 표면적인 모습은 약간의 차이를 보이지만 실제로 췌장소도 세포의 셍존능에는 문제가 없는 것으로 확인하였다. 0.5% 그룹은 최장소도 세포의 개수도 적고 세포 표면도 다른 그룹에 비해 거친 것으로 관찰되어지며, 세포가 상당히 많이 깨져있는 모습을 보였고 이는 CCK-8 결과와 동일한 결과로 확인되었다(참조: 도 7).

실시예 7: 글리콜 키토산-oGL의 췌장소도 세포 표면 결합

글리콜 키토산-oGL에 형광물질인 FITC를 붙인 뒤, 페길레이션(PEGlylation)시킨 췌장소도 세포에 결합시키고, 공초점 이미징(confocal imaging) 실험으로 글리콜 키토산-oGL이 PEG를 매개로 하여 세포 표면에 결합하는지를 확인하였다.

페길레이션 시키지 않은 췌장소도 세포 그룹과 글리콜 키토산-oGL 처리한 그룹을 비교하여 PEG를 매개로 하여 결합하는지를 확인하고, 표면에 결합하는 글리시리진의 양을 처리 횟수에 따라 증가 시킬 수 있는지 여부를 확인하였다.

페길레이션 시키지 않은 췌장소도 세포에 글리콜 키토산-oGL을 처리한 그룹과 실험을 통해 정한 농도인 0.25%의 글리콜 키토산-oGL을 1번, 2번, 3번 처리한 그룹으로 각각 나누어 실험하였다. non-PEG 그룹은 형광이 세포 안부터 전부 발현 되는 것으로 보아 표면에 글리콜 키토산-oGL이 붙지 않고 흡수(uptake) 되었음을 확인하였다. 모든 세포에서 균등하게 발현 되지 않고 일부 세포에서만 발현되는 것으로 보아 글리콜 키토산-oGL이 무작위적으로 세포에 흡수(uptake) 되었다는 것을 확인하였다. PEG를 0.25% 처리한 그룹은 몇몇 손상된 세포에서 안쪽까지 형광이 발현되는 것을 제외하고 세포 표면에서 형광이 발현되는 것을 알 수 있었다. 이를 통해 PEG를 매개로 하여 글리콜 키토산-oGL이 표면에 결합함을 확인하였다. 1번, 2번, 3번 처리한 그룹은 각각 형광의 세기나 분포정도가 비슷한 것으로 보아 췌장소도 세포 표면에 처리하는 조건은 1번으로 확립하였다(참조: 도 8).

실시예 8: 포도당 자극에 의한 인슐린 분비(glucose sitimulated insulin secretion: GSIS) 측정

글리콜 키토산-oGL의 처리 농도인 0.25%에서의 췌장소도 세포의 정상적인 인슐린 분비를 확인하기 위해 GSIS 실험을 진행하였다. 실험 그룹은 글리콜 키토산-oGL을 처리 하지 않은 그룹과 0.25%로 처리한 그룹으로 나누었으며, 비교 실험을 위해 n=5로 n당 50개의 췌장 소도를 이용해 저농도 조건(glucose solution: 2.8 mM)과 고농도 조건(glucose solution: 20.2 mM)에서 각각 한 시간씩 반응을 시킨 후, ELISA 키트를 이용해 인슐린의 양을 측정하였고, 도 9에 결과를 나타내었다.

대조군 그룹의 경우 저(low) 글루코오스 조건에서 인슐린 함량이 약 0.3 ng, 고 글 루코오스 조건에서 약 1.2 ng이 나왔고, 글리시리진 컨쥬게이션된 그룹의 경우 저 글루코오스 조건에서 약 0.4 ng, 고 글루코오스 조건에서 약 1.3 ng으로 나왔으며 대조군 그룹과 조건에 따른 차이가 비슷하게 나타났다. 이를 통해 글리시리진을 췌장소도세포에 0.25%로 반응 시켰을 때 생존능 뿐만 아니라 인슐린 분비가 조건에 따라 정상적으로 조절되어짐을 확인하였고, 또한 SI 인덱스(index) 또한 2이상으로 관찰됨을 통해 합성 후에도 인슐린 분비 기능이 정상적으로 이루어짐을 확인하였다.

실시예 9: SPR(surface plasmon resonance)을 통한 HMGB1에 대한 결합 친화도(binding affinity)확인

Reichert SR7500DC system, scrubber2 software를 이용하여 측정하였으며 골드 칩(gold chip)으로는 CMDH를 사용하였다. 리간드(Ligand)로 HMGB1 단백질을 이용하였으며, 10 μl/ml 플로우(flow)로 칩(chip)에 코팅시킨 후, 각 그룹별 분석 물질(analyte)의 다양한 농도를 이용하여 실험을 진행하였다.

글리시리진, 글리콜 키토산, HMGB1 Ab, 글리콜 키토산-oGL 그룹으로 나누어 HMGB1에 대한 결합 친화도를 측정하였다(참조: 도 10).

SPR분석 결과, HMGB1 단백질은 글리시리진, 그리고 글리콜 키토산-oGL과 각각 결합을 하는 것을 확인할 수 있었으며, 글리콜 키토산의 경우 결합 친화도는 HMGB1 Ab를 제외한 다른 그룹보다 큰 결합력을 나타내는 결과를 보이지만, 분자량이 약 120 kDa으로서 SPR 실험에서는 매우 큰 분자량이고 10 근방의 RU 값으로 미루어보아, KD값은 의미가 없으며 사실상 HMGB1과 결합하지 않음을 확인하였다. 글리콜 키토산-oGL의 경우 글리시리진보다 약 260배 정도의 결합 친화도를 나타내었으며, 이는 글리콜 키토산에 글리시리진을 결합시킴으로써 타겟으로 하는 HMGB1의 결합 부위(binding site)가 늘어났기 때문이고, 비록 HMGB1 Ab에 비하여 결합력이 매우 작지만 결합을 한다는 것 자체에 의미가 있었다. 글리콜 키토산과 합성된 글리시리진이 HMGB1 억제에 대한 활성이 있으며, 글리콜 키토산이 글리시리진을 최대한 많이 도입하기 위한 고분자 백본(polymeric backbone)의 역할을 함을 확인할 수 있었다.

실시예 10: 제1 형 당뇨를 유도한 Balb/c 마우스에서의 췌도 세포 이식

10-1. 당뇨병 모델

(1) 인위적으로 당뇨병을 유도하기 위해 시트르산 버퍼(citrate buffer) 200μl에 스트렙토조토신(streptozotocin)을 Balb/C 마우스의 체중 kg당 200 mg의 비율로 녹였다. (2) 이를 신속히 복강에 주사하고 1주일 후 혈당을 측정하여 혈당 수치가 이틀 연속 >350 mg/dl 이상인 실험동물을 당뇨병 모델로 사용하였다.

10-2. 글리콜 키토산-oGl을 처리한 췌장소도의 신장 이종이식

(1) 당뇨병이 유발된 실험동물을 마취제를 이용하여 마취시켰다. (2) 마우스의 왼쪽 신장 위치 부근을 알코올 솜으로 충분히 닦아 준 후, 절개하였다. (3) 신장을 조심스럽게 꺼낸 후, 아무 처리도 하지 않은 일반 췌장소도와 글리콜 키토산-oGL을 처리한 췌장소도 300개를 헤밀턴 시린지를 이용하여 왼쪽신장 내피 막 사이에 이식하였다. (4) 실험동물의 피부를 이식 후 봉합하였다. (5) 실험동물이 마취에서 깨어날 때까지 적절한 온도 하에서 관찰하였다. (6) 매일 오후 1시-3시 사이에 췌장소도를 이식 받은 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액을 얻어 원터치 울트라 혈당 측정 시험지를 사용하여 혈당을 측정하였다(참조: 도 11).

혈당 측정 결과, 무처리 췌도를 이식한 그룹의 경우 생존율이 약 6.8일인 반면, 글리콜 키토산-oGL이 결합된 췌도를 이식한 그룹의 경우 생존율이 약 12일로 관찰되었다. 이는 글리콜 키토산-oGL에 의해서 이식된 췌도의 생존율이 최대 약 3배까지 늘어난 이유가 이식 후 손상에 의해 분비되는 HMGB1 단백질을 포획하여 면역/염증반응을 억제하여 나타난 결과이다.

실시예 11: 글리콜 키토산-oGL의 결합에 의해 이식된 췌도의 생존율 증강 확인

(1) 췌장세포 표면에 결합된 동량의 글리시리진을 처리하기 위해서 D-글루코사민 분석(Glucosamine assay) 방법(이는 알파 아밀라제 및 글루코아밀라제 효소를 이용하여 글리콜 키토산 분해정도를 확인하는 것으로, 만일 클리콜 키토산에 글리시리진에 화학결합되어 있으면 분해정도가 감소하게 되며 이를 정량적 분석하여 화학결합된 글리시리진 양을 계산하는 방법임)을 이용하여 글리콜 키토산-oGL에 결합된 글리시리진 양을 측정하였다. 그 결과 300개의 췌도 당 약 56 μg/ml 농도의 글리시리진의 존재를 확인하였다. (2) 그 후 췌장세포를 새로 분리하여 56 μg/ml의 농도로 글리시리진을 처리한 후, 당뇨병 질환 동물모델에 이식하여 혈당을 측정하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

이 결과로부터, 단순히 글리시리진을 췌장세포에 처리 후 이식하였을 경우 이식된 췌장소도의 생존율을 증강시키지 못함을 확인하였다(생존율: 약 4일).

이는 단순히 물리적으로 처리된 글리시리진이 이식 후에 빠르게 세척(wash-out) 되어 이식된 췌장세포로부터 방출된 HMGB1를 포획할 수 있는 능력을 발휘할 수 없기 때문이다. 그 결과 면역/염증 반응을 억제할 수 있는 효과가 없으므로, 이식된 췌장세포의 생존율이 무처리 췌도 이식 그룹과 유사하게 나타난 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

(a) 생체적합성 고분자 백본 및 (b) 상기 생체적합성 고분자 백본에 결합된 글리시리진을 포함하는 췌도 세포 이식용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 글리시리진은 산화된(oxidized) 형태의 글리시리진인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자 백본은 알데하이드 그룹과 화학 결합을 형성할 수 있는 기능기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 기능기는 아민 그룹, 카복실 그룹, 티올 그룹, 또는 히드록사이드 그룹인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 기능기는 아민 그룹인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자 백본은 글리콜 키토산, 폴리-L-리신, 폴리(4-비닐피리딘/디비닐벤젠), 키틴, 폴리(부타디엔/아크릴로니트릴) 아민 말단, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐린, 폴리(에틸렌글리콜)비스(2-아미노에틸), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드, 폴리(2-비닐피리딘), 폴리(2-비닐피리딘 N-옥사이드), 폴리-ε-Cbz-L-리신, 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트), 폴리(알릴 아민), 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 폴리(N-메틸비닐아민), 폴리(디알릴디메틸암모늄클로라이드), 폴리(N-비닐피롤리돈), 키토산, 또는 폴리(4-아미노스티렌)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
공여자(donor)로부터 분리된 상태의 췌도 세포에, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 췌도 세포 이식용 조성물을 처리하여, 글리시리진이 결합된 생체 적합성 고분자 백본을 상기 췌도 세포 표면에 결합시키는 단계를 포함하는 이식용 췌도 세포 제조 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 췌도 세포는 페길레이션 된(PEGylated) 것인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 페길레이션은 헤테로 이중 기능성(heterobifunctional) PEG를 이용하여 수행된 것인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 헤테로 이중 기능성 PEG는 일 말단에 말레이미드 치환기를 포함하고, 다른 일 말단에 NHS 에스테르 또는 카복실산 치환기를 포함하는 것인 것을 특징으로 하는 방법.
다음을 포함하는 이식용 췌도 세포 조성물:
(a) 공여자(donor)로부터 분리된 췌도 세포;
(b) 링커로서의 이중 기능성 PEG; 및
(c) (i) 생체적합성 고분자 백본 및 (ii) 상기 생체적합성 고분자 백본에 결합된 글리시리진; 상기 생체적합성 고분자 백본은 상기 링커를 매개로 상기 췌도 세포에 결합된다.
제 11 항에 있어서, 상기 글리시리진은 산화된(oxidized) 형태의 글리시리진인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자 백본은 글리콜 키토산, 폴리-L-리신, 폴리(4-비닐피리딘/디비닐벤젠), 키틴, 폴리(부타디엔/아크릴로니트릴) 아민 말단, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐린, 폴리(에틸렌글리콜)비스(2-아미노에틸), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드, 폴리(2-비닐피리딘), 폴리(2-비닐피리딘 N-옥사이드), 폴리-ε-Cbz-L-리신, 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트), 폴리(알릴 아민), 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 폴리(N-메틸비닐아민), 폴리(디알릴디메틸암모늄클로라이드), 폴리(N-비닐피롤리돈), 키토산, 또는 폴리(4-아미노스티렌)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 이중 기능성 PEG는 헤테로 이중 기능성(heterobifunctional) PEG 인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 헤테로 이중 기능성 PEG는 일 말단에 말레이미드 치환기를 포함하고, 다른 일 말단에 NHS 에스테르 또는 카복실산 치환기를 포함하는 것인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 췌도세포-결함(islet cell-deficiency) 질환 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 췌도세포-결함 질환은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 및 당뇨병성 만성 신질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 17 항에 있어서, 상기 췌도세포-결함 질환은 제1형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 조성물.