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CN112384258A - 用于细胞和组织递送的纳米纤维-水凝胶复合物 - Google Patents

用于细胞和组织递送的纳米纤维-水凝胶复合物 Download PDF

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CN112384258A
CN112384258A CN201980046070.1A CN201980046070A CN112384258A CN 112384258 A CN112384258 A CN 112384258A CN 201980046070 A CN201980046070 A CN 201980046070A CN 112384258 A CN112384258 A CN 112384258A
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microbeads
hydrogel
lipoaspirate
cell
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CN201980046070.1A
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S·雷迪
R·马丁
X·李
C·常
K·科尔伯特
H-Q·毛
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Johns Hopkins University
Original Assignee
Johns Hopkins University
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Abstract

软组织装置可包括包含凝胶和布置在所述凝胶内的至少一种纳米结构的复合材料。软组织装置还可包括生物活性材料诸如细胞、组织。用于愈合软组织缺损同时促进软组织再生的方法可包括将软组织装置施加到软组织缺损，其中所述复合材料包括凝胶和布置在所述凝胶内的纳米结构。用于制造用于愈合软组织缺损的软组织装置的方法可包括提供凝胶，在所述凝胶内布置纳米纤维和生物活性材料。

Description

用于细胞和组织递送的纳米纤维-水凝胶复合物
本申请要求2018年5月9日提交的美国临时申请62/669,287的权益，所述美国临时申请通过引用以其整体并入本文。
政府资助
本发明是在由美国国家卫生研究院颁发的第1R21NS085714号拨款下以及在由国家科学基金颁发的第DMR1410240拨款下借助政府资助进行的。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
本公开涉及在促进软组织再生的同时恢复损失的软组织体积的复合材料和方法。本发明还涉及用于细胞和组织递送以用于美容、重建和细胞疗法的复合材料和方法。
背景技术
创伤、肿瘤切除或先天性畸形导致的软组织缺损很难用常规手段治疗。目前的包括组织重组或组织转移在内的疗法会导致供体部位缺损。其它疗法，诸如假体植入，会导致纤维化和包囊化(encapsulation)。现有的促进组织向内生长的策略也不足以治疗软组织缺损。目前的无细胞基质产生扁平的纤维化组织片，而不是理想重建所需的柔软的三维组织。最后，虽然脂肪移植可以修复软组织缺损，但其广泛应用受阻于可变的移植物存活率和有限的修复体积。进行软组织重建的理想方法是在体内促进软组织诸如脂肪组织的再生，然后植入组织以促进再生。然而，组织再生需要合适的基质来使细胞附着、迁移、增殖、分化和组织成新的组织。许多天然细胞外基质(ECM)在修复部位缺失。因此，当使用基于脂肪组织的重建来修复软组织缺损时，重建不仅立即恢复损失的组织体积，而且修复微环境、支持宿主细胞浸润和促进软组织再生的合成基质成为必要的任务。
水凝胶作为ECM的模拟物受到了极大的关注，因为它们的高含水量和水溶胀网络使得水溶性生物分子易于运输。因此，水凝胶作为软组织重建的填充材料提供了几个有利方面。它们还可充当合适的平台以整合生物活性材料诸如细胞、组织，以进一步促进组织再生，同时充当填充剂材料。例如，细胞在细胞移植过程的每个阶段(注射前、注射、急性注射后和长期存活)都会遇到可导致细胞死亡和损害细胞功能的机械和结构挑战。而且，这些挑战可通过水凝胶来克服，因为水凝胶可以在注射过程中保护细胞免受膜损伤，从而提高移植细胞在宿主组织中的存活率和植入率。
虽然几种水凝胶在软组织重建和干细胞移植中显示出一些益处，但目前还没有能够系列解决所有机械挑战的材料。
为了获得足够的机械性能，通常需要更高的交联密度。然而，在这些条件下，宿主组织细胞(例如，脂肪细胞祖细胞和内皮祖细胞)不能渗透并生长到支架中。在可降解水凝胶的情况下，瘢痕形成和纤维组织形成是典型的，因为宿主组织的向内生长发生得太慢，或者至少比纤维材料的吸收慢。
最近，官能化纳米纤维已被开发用作ECM模拟物，以支持各种细胞活性。符合FDA的合成可生物降解的聚α-酯，诸如聚己内酯(PCL)或聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)可用于通过称为静电纺丝的方法生成纳米纤维。由这些聚合物制备的可生物降解缝线和植入物因其良好的生物相容性跟踪记录而被广泛应用于临床。已经开发了用于干细胞工程应用的不同直径和形貌的各种纳米纤维。然而，这些纳米纤维不能提供宏观结构，使得它们难以用作3D支架。
许多商业化的水凝胶填充剂在患者体内引起中度至重度炎症，同时随着时间的推移不能保持全部原始体积。
鉴于与此类常规方法和系统相关的各种问题，在本领域中仍然需要改进的解决方案来愈合软组织缺损。本公开为这一需求提供了克服了本领域中注意到的各种问题的解决方案。
发明内容
以下公开内容中的组合物和方法被设计成通过使用包含纤维-水凝胶复合物诸如纤维-水凝胶复合物微珠的组合物来解决这一需求，所述组合物具有改善的性质(例如，用于软组织重建的改善的质量，如下文进一步详述的)。
因此，一方面，本文公开了支架复合体(即，软组织装置)，其包含生物活性材料和基本上非球形的微珠群，所述微珠群包含与多个平均长度小于约200微米的聚合物纤维共价连接的水凝胶网络，和以约1mg/mL至约25mg/mL的浓度存在的交联剂，其中生物活性材料被可操作地包裹在非球形的微珠内，或者生物活性材料与非球形的微珠可操作地缔合，或其组合，其中微珠的平均尺寸沿着最长维度在约50微米至约300微米的范围内，其中微珠是经预反应的，其中微珠在室温下基本上稳定至少约6个月，其中生物活性材料能够在受试者中进行以下至少一种：i)募集宿主细胞浸润，ii)促进组织生长，iii)和/或细胞或组织再生，并且其中软组织装置能够被植入或注射到有需要的受试者的靶组织中。
在另一个特定方面，本文公开了软组织装置，其包括生物活性材料和基本上非球形的微珠群，所述基本上非球形的微珠群包含与多个平均长度小于约200微米的聚己内酯纤维共价连接的官能化透明质酸网络，和以约1mg/mL至约25mg/mL的浓度存在的交联剂，其中生物活性材料被可操作地包裹在非球形的微珠内，或者生物活性材料与非球形的微珠可操作地缔合，或其组合，其中所述微珠的平均尺寸沿最长维度在约50微米至约300微米的范围内，其中微珠是经预反应的，其中所述微珠在室温下基本上稳定至少约6个月，其中生物活性材料能够在受试者中进行以下至少一种：i)募集宿主细胞浸润，ii)促进组织生长，iii)和/或细胞或组织再生，并且其中软组织装置能够被植入或注射到有需要的受试者的靶组织中。
在一个实施方案中，微珠是基本上非炎性的。
在一个实施方案中，生物活性材料选自由以下组成的组：生长因子、细胞因子、抗体、细胞、组织、组织载体或组织结合部分、核酸、细胞载体或细胞结合部分或其组合。在特定实施方案中，细胞结合部分或组织结合部分包括肽、抗体、蛋白质、适体、寡糖或生物材料。
在一个实施方案中，生物活性材料包括脂肪细胞、自体脂肪细胞、同种异体细胞、经遗传修饰的同种异体细胞、干细胞、间充质干细胞、经遗传修饰的干细胞、经遗传修饰的同种异体诱导的多能干(iPS)细胞和经遗传修饰的低免疫原性多能干细胞的群体，来自脂肪组织的基质血管部分，其衍生物或其组合。
在另一个实施方案中，生物活性材料包括能够持久地存在于装置内或装置附近的群体。
在某些实施方案中，生物活性材料包括脂肪基质血管部分。
在一个实施方案中，生物活性材料包括脂肪组织。任选地，脂肪组织为脂肪抽吸物。任选地，脂肪组织是自体的。任选地，脂肪组织是同种异体的。在一个实施方案中，包含脂肪组织的软组织装置在37℃下是稳定的。在另一个实施方案中，包含脂肪组织的软组织装置在施用到受试者的靶组织中之前在4℃下保持1小时、2小时、3小时、5小时、7小时或10小时的时间段。
一方面，提供了用于制备施用到受试者的靶组织中的包含脂肪组织的装置的药盒，所述装置所述药盒包括：(i)具有约1cc至约20cc或大于20cc注射器的体积的包含基本上非球形的微珠群的注射器；和(ii)具有约1cc至约20cc或大于20cc注射器的体积的包含脂肪抽吸物的注射器，其中所述两个注射器能够通过鲁尔连接器彼此连接，由此所述脂肪抽吸物被可操作地包裹在所述微珠内或者所述脂肪抽吸物与所述微珠可操作地缔合。
本发明的另一方面提供了用于制备施用到受试者的靶组织中的包含脂肪组织的装置的方法，所述方法包括将脂肪抽吸物和微珠在合适的介质中混合1天、2天、3天、4天、5天或7天。
本发明的另一方面提供了用于制备施用到受试者的靶组织中的包含脂肪组织的装置的药盒，所述药盒包括：(i)包含冻干的微珠的注射器；(ii)包含水、盐水溶液或合适的复溶液的小瓶，其中水、盐水溶液或合适的复溶液能够从小瓶被抽吸到注射器中，由此使冻干的微珠从而再水合；以及(iii)包含所述脂肪抽吸物的注射器，其中所述两个注射器能够通过鲁尔连接器彼此连接，由此所述脂肪抽吸物被可操作地包裹在所述水合微珠中或者所述脂肪抽吸物与所述水合微珠可操作地缔合。
本发明的另一方面提供了用于在人受试者中进行脂肪移植的方法，所述方法包括将软组织装置注射或植入到所述组织或组织缺损中，所述软组织装置包括脂肪组织和基本上非球形的微珠群，所述微珠群包含与多个平均长度小于约200微米的聚己内酯纤维共价连接的官能化透明质酸网络，和以约1mg/mL至约25mg/mL的浓度存在的交联剂，其中生物活性材料被可操作地包裹在所述非球形的微珠内，或者生物活性材料与所述非球形的微珠可操作地缔合，或其组合，其中微珠的平均尺寸沿着最长维度在约50微米至约300微米的范围内，其中微珠是经预反应的，其中微珠在室温下基本上稳定至少约6个月，其中生物活性材料能够在受试者中进行以下至少一种：i)募集宿主细胞浸润，ii)促进组织生长，iii)和/或细胞或组织再生，并且其中所述软组织装置能够被植入或注射到有需要的受试者的靶组织中。
在一个实施方案中，软组织装置包括多个孔。在另一个实施方案中，至少一个亚组的孔可被布置在整个微珠中，使得当被植入或注射到存在于受试者中的靶组织中时，它促进组织生长和细胞浸润。在特定实施方案中，所述多个孔包含不少于50个孔/cm2的面积密度，其中至少约80％的孔的平均尺寸不小于约5微米。
在一个实施方案中，官能化透明质酸包括丙烯酸酯化的透明质酸，交联剂包括巯基化的聚(乙二醇)或其衍生物。
在另一个实施方案中，官能化透明质酸包括巯基化的透明质酸，交联剂包括聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)或其衍生物。任选地，多个聚己内酯纤维包括电纺纤维。
在特定的实施方案中，聚己内酯纤维的直径在约100纳米至约5微米的范围内。
在一个实施方案中，微珠的平均储能模量在约50帕与约2500帕之间。
在另一个实施方案中，所述装置被配制为用于向受试者的靶组织中进行皮肤或皮下施用的可植入或可注射的装置。
本发明的又一方面提供了包括注射器的药盒，所述注射器包括约0.1mL至约20mL的权利要求1的装置，其中所述微珠被配制成i)基本上脱水的珠粒或ii)准备好注射到受试者的靶组织中的水合珠粒。
本发明的另一方面提供了包含软装置的制剂，其中微珠被冻干以形成脱水微珠，并且其中脱水微珠适于用水、盐水溶液或合适的复溶液(reconstitution fluid)复原，以在施用到受试者的靶组织中之前基本上替代损失的水质量(如按重量测量的)，使得当损失的水质量被替代时，复溶液中微珠的浓度与冻干前微珠的浓度相同或基本上相同。
本发明的一方面提供了制剂，其中脱水微珠在施用到有需要的受试者的靶组织中之前，在用水、盐水溶液或合适的复溶液复原时保持或恢复其珠状形式。在特定的实施方案中，所述脱水微珠在室温下基本上稳定至少约12个月。
本发明的一个方面提供了用于制备软装置以用于立即施用到受试者的靶组织中的药盒，所述药盒包括：含有微珠的小瓶，所述微珠已被冻干并形成粉饼，其中冻干的粉饼能够用水、盐水溶液或合适的复溶液复原。
本发明的另一方面提供了用于制备用于立即注射到受试者的靶组织中的本文公开的装置的药盒，所述药盒包括：(i)包含配制为冻干凝胶珠粒的微珠的注射器；和(ii)包含水、盐水溶液或合适的复溶液的小瓶，其中水、盐水溶液或合适的复溶液能够从小瓶中被抽吸到注射器中，由此使冻干的微珠再水合。
在一个实施方案中，软组织装置还包括选自由以下组成的组的化合物：生长因子、刺激血管生成的化合物、免疫调节剂、炎症抑制剂及其组合。
在另一个实施方案中，软组织装置还包括具有治疗作用、血管形成作用、抗血管形成作用、抗炎作用、抗菌作用、抗组胺作用或其组合的化合物。
在一个实施方案中，软组织装置还包括经处理的组织细胞外基质，其中所述经处理的组织细胞外基质可源自脂肪组织。
本发明的另一方面提供了用于进行美容手术或重建手术或者减少或逆转由外伤、外科手术或与年龄相关的疾病、病症或病患引起的组织缺损的方法，其包括将软组织装置注射到组织和/或组织缺损中，所述软组织装置包括被可操作地包裹在基本上非球形的微珠群内的生物活性材料，所述基本上非球形的微珠群包含与多个平均长度小于约200微米的聚己内酯纤维共价连接的官能化透明质酸网络，和以约1mg/mL至约25mg/mL的浓度存在的交联剂，其中微珠的平均尺寸沿着最长维度在约50微米至约300微米的范围内，其中微珠是经预反应的，其中微珠在室温下基本上稳定至少约6个月，其中生物活性材料能够在受试者中进行以下至少一种：i)募集宿主细胞浸润，ii)促进组织生长，iii)和/或细胞或组织再生，并且其中所述软组织装置能够被植入或注射到有需要的受试者的靶组织中。
在适用或未明确否认的情况下，本文描述的任何一个实施例都被认为能够与任何其它一个或多个实施方案组合，即使所述实施方案是在本发明的不同方面下描述的。
这些和其它实施方案从以下详细描述中公开或者根据所述详细描述是显而易见的，以及被所述详细描述所包含。
附图说明
图1是一组显示注射后炎症反应的图像。图1A描绘了含有巯基化的HA(HA-SH)+二丙烯酸酯化的聚乙二醇(PEGDA)(交联剂)(向上指向的箭头)的凝胶与含有丙烯酸酯化的HA(HA-Ac)+巯基化的聚乙二醇(PEGSH，向下指向的箭头)的凝胶在注射后第1天的炎症反应的比较。图1B显示了来自猪大腿内侧模型在术后第(POD)0天(中间图)和POD2(右图)的炎症研究的图像。左图显示了与大腿内侧图像上显示的图案相对应的每次s.c.注射中复合物的身份。图1C显示了植入后48小时猪大腿内侧模型中针对关键组的组织学反应。蓝色染色表示透明质酸，红色染色表示免疫细胞染色。在巯基化的HA组中，注射部位被宿主组织与注射部位之间的确定边界包裹，这可通过注射部位周围的单核细胞活化来显现，这描绘了对该HA组的强烈的急性免疫反应。图1D是显示LS硬复合材料和软复合材料及相关商业对照的剪切储能模量(单位为帕)的图表。图1E是显示复合材料与商业对照相比的体积保持的图。
图2是稀释100倍以对单个珠粒进行成像后的LS珠粒状复合材料的四个光学显微镜图像。图2A显示了被特制化成250μm直径的珠粒后的复合材料；图2B显示了冻干和再水合后的复合材料，说明所述复合材料保持其原始外观；图2C是描绘LS珠粒状制剂的纳米纤维和水凝胶组分的10倍图像；以及图2D是未稀释状态下珠状制剂的光学显微镜图像。图2E显示了珠化和冻干对储能模量没有影响。
图3显示了在150μm和250μm处与珠状颗粒相比的块状复合凝胶的储能模量。
图4是显示复合物LS-1的分析的两个图表。图4A显示了通过MRI定量评估的珠状复合物与商业对照相比的体积保持。图4B显示了HA分子量(MW)对在与4A中使用的相同的HA浓度和纤维负载下制备的复合物的剪切储能模量的影响。图4C显示了HA浓度(mg/ml)对在相同HA MW和纤维负载条件下制备的复合物的剪切储能模量的影响；图4D显示了HA浓度(mg/ml)对在相同HA MW和纤维负载条件下制备的复合物的压缩储能模量的影响；图4E显示了具有不同性质(见表1)的支架的体积保持，证明了复合物的可调性。
图5是一系列MRI图像，其显示与竞争产品相比，新组织浸润LS9珠状复合物注射部位。图5A显示了注射
Figure BDA0002889302300000081
填充剂后第14天、第30天和第50天0％组织向内生长，表明该产品中缺乏宿主细胞组织向内生长。图5B显示了注射LS-9制剂后组织向内生长：第14天18％的新组织、第30天52％的新组织和第50天84％的新组织。图5C描绘了被改变以确定哪个参数对复合物在体内的持久性具有最大影响的五个参数：水凝胶分子量、水凝胶改性度、水凝胶浓度、纳米纤维浓度和交联密度。如图所示，线性回归模型的线性预测能力在14天和30天(R2分别为0.95和0.86)时是可接受的。水凝胶浓度和纳米纤维浓度似乎影响最大。
图6显示了与商购对照品相比，预成型的LS珠粒状复合物的溶胀评估结果。图6A显示了在第0天和第2天预成型复合物(左下注射)与
Figure BDA0002889302300000085
(右下注射)的对比图像，包括图像(上图)和MRI横截面(下图)。图6B显示了
Figure BDA0002889302300000082
VOLUMA
Figure BDA0002889302300000083
(左侧对)、ULTRAPLUS
Figure BDA0002889302300000084
(中间对)和LS珠粒(右侧对)在第0天(左条柱)和第2天(右条柱)的溶胀效果的成对图形比较。图6C是显示通过限制术后溶胀和最大化宿主组织向内生长，LS-9珠状复合物使其区别于市场可比物的图。
图7是显示软组织注射物的刚度(图7A)和tanδ(图7B)(定量能量损失与储存之间的平衡)的两个图。较高的Tanδ表示更像液体的性质，而较低的tanδ表示更像固体的性质，无论模量或粘度如何)。图7C是显示复合物(左上)与天然人脂肪(左下)的比较的三幅图像。这两种材料并排显示于右图中。
图8显示了合成软组织生成的方法。图8A显示了在兔模型中在腹股沟脂肪垫中产生缺损的一般过程。图8B显示了宿主血管在POD 14浸润到不同移植物基质(150帕复合物、150帕水凝胶和80帕水凝胶)中。将内皮细胞用CD31染成红色，将细胞核用DAPI染成蓝色。将纤维用F8BT标记为绿色。比例尺：100μm。
图9是显示使用LS复合物递送脂肪组织的几幅图像。图9A显示了(左)以1:1的比率组合的本发明的复合物基质和脂肪抽吸物，以及(右)单独的脂肪抽吸物。图9B-图9C显示了通过红色和脉管系统标识的肉眼可见的改善的血管生成(图9B)；以及与100％脂肪组相比，在50％脂肪:50％复合物组中通过CD31染色在显微镜下呈现的改善的血管生成(图9C)。内皮细胞用CD31染成红色，细胞核用DAPI染成蓝色。纤维用F8BT标记成绿色。
图10是显示接种了人间充质干细胞(hMSC)的LS复合物和hMSC在整个LS珠粒状制剂中的增殖的多幅图像。图10A显示使用96孔悬浮平板接种hMSC过夜的LS-14的共聚焦显微镜图像。用LS珠粒过夜培养细胞主要得到细胞的表面包被层。LS珠粒用CD31染成红色，细胞核用DAPI染成蓝色。纤维用F8BT标记成绿色。图10B显示了用于LS珠粒生成和细胞接种方案的示意图。将块状水凝胶-纤维复合物挤过250-μm筛网，收集并再次通过该筛，以生成直径为约50–300μm的颗粒。图10B还显示了使用不同孔板如何影响细胞在LS珠粒上的分布。图10C是用于细胞接种的12孔旋转器安装座。图10D显示了使用12孔安装的旋转烧瓶接种hMSC过夜的LS-14的共聚焦显微镜图像。使用12孔安装的旋转烧瓶(图10D)可使细胞分布更均匀，并使细胞能够渗透到微粒的多孔支架中。LS珠粒用CD31染成红色，细胞核用DAPI染成蓝色。纤维用F8BT染成绿色。由图10D可知，hMSC粘附于LS珠粒上，采用沿形状不规则的形态。图10D显示，hMSC的肌动蛋白丝沿水凝胶内的纤维组分轴共定位。
图10E显示hMSC在LS微珠上增殖以形成2D细胞培养物。图10E(a)显示了在200rpm振荡器上的悬浮孔中用hMSC培养一段时间(3天、6天和12天)的LS-14的共聚焦显微镜图像。LS珠粒用CD31染成红色，细胞核用DAPI染成蓝色。纤维用F8BT标记为绿色。在图10E(a)中清楚地观察到hMSC在整个LS复合物微珠中随时间的增殖。图10E(b)是显示附着时(第0天)LS珠粒上的hMSC数量和增殖后(第1天、第3天、第12天)LS珠粒上的hMSC数量的图。通过图像分析进行细胞定量。通过共聚焦显微镜和穿过整个结构的z堆叠对微粒-hMSC(50+颗粒)进行单独成像来确定图像定量的测量结果。通过将颗粒面积乘以z堆叠总厚度的ImageJ分析测定颗粒体积。这产生了细胞/体积测量值，其示于细胞定量图中。由于珠粒的多孔性质而导致的增加的表面积使hMSC能够在微载体表面上生长并进入珠粒核心，如图10E(b)中所看到的。观察到添加了RGD肽改善了hMSC的细胞附着，并允许缩短细胞在颗粒上的倍增时间。图10E(b)是显示附着时(第0天)LS珠粒上的hMSC数量和增殖后(第1天、第3天、第12天)LS珠粒上的hMSC数量。
图10F显示了在POD 28将培养3天的LS-14与AD-hMSC(脂肪来源的hMSC)注射到MI诱导的大鼠心肌中的共聚焦显微镜图像。通过阳性GS4-同工凝集素B4染色，LS-14/hMSC珠粒显示出高的宿主组织细胞浸润和血管浸润。图10G显示在POD 28利用注射的微珠LS-14、LS-14+hMSC和PBS缓冲液的大鼠MI模型(上图：马森氏三色图(Masson’s Trichrome)，下图：苏木精-伊红染色)。在术后和治疗后4周，大鼠心肌表现出减少的瘢痕组织形成和胶原沉积，添加hMSC进一步改善了心肌壁的完整性。图10H显示了在POD 72将LS-14与培养了3天的hMSC(LS-14/hMSC)注射到大鼠皮下间隙的共聚焦显微镜图像。虽然细胞浸润未显示出在POD72完全恢复到注射材料的核心，但宿主组织与移植物之间的界面显示该区域中的阳性RECA-1(内皮细胞)染色和旺盛的细胞生长。
图10I是显示大鼠皮下注射的体积保持的图(注射体积:200μL)。通过MRI测量，通过测量每个切片上的注射材料面积来定量材料的体积保持。图10I显示了下列物质在POD72的体积保持：G1(培养7天，LS-14/hMSC，利用RGD粘附肽)、G2(培养1天，LS-14/hMSC，利用RGD粘附肽)、G3(培养0天，原位LS-14/hMSC，利用RGD粘附肽)、G4(培养7天，LS-14/hMSC无肽)、G5(仅LS-14)。
图10J显示了注射LS-5后POD 13周大鼠模型中的组织学分析(苏木精-伊红染色)。可以清楚地观察到细胞的生长/浸润模式，其概括了潜在的珠粒形态。
图11描绘了珠状复合物的冻干形式的开发。图11A-图11C显示了LS珠状复合物的光学显微镜图像。将HA-Ac、纳米纤维和5k 2-臂PEGSH在PBS中配制并反应过夜。图11A是过夜反应(“预珠化”)之前的复合物的图像；图11B是珠粒形成后的复合物(“珠粒”)的图像；图11C是冻干并再水合后(“冻干后”)的复合物的图像。图11D是显示11A-11C中每一个的剪切储能模量的测量值的图，表明与块状复合物相比，珠状复合物的稳定性增强。
图12是显示改进的冻干工艺的预珠化样品、珠状样品和冻干后样品的剪切弹性模量(图12A)和压缩弹性模量(图12B)的两个图。
图13是显示使用低渗制剂的冻干方法的开发的一系列图。图13A显示了包括珠化前、珠化后、在糖溶液中冻干、在PBS中冻干在内的250μm复合物珠粒样品的储能模量。图13B显示了珠化后的剪切弹性模量。图13C显示了250μm和150μm珠粒珠化后的tanδ。图13D显示了包括本文所述复合物在内的商业制剂的较低tanδ的趋势。
图14提供了LS复合物的珠粒尺寸和纤维长度表征数据。图14A是珠粒直径(平均值＝209.4±62.3μm，中值＝210μm，n＝51)的直方图。在共聚焦显微镜图像下，沿着颗粒的最长轴测量了珠粒的直径。图14B是具有75um筛(左)、150μm筛(中)、250μm筛(右)的珠粒的显微镜图像。图14B展示了通过测量颗粒内的最长轴获得的约75μm、约150μm和约200μm尺寸的珠粒。使用图像分析程序执行进一步表征的珠粒分布，所述程序将使用边缘检测进行更一致的测量。图14C是注射力曲线，其显示了在一定压力下的位移，以根据它们的珠粒尺寸来评估复合物的可注射性。将填充有150μm和75μm珠粒的注射器装载到与MTS标准43机械测试仪相连的注射器夹具(Instron)中。将凝胶通过27号针(1/2”长，BD)以1mm/秒的十字头速度从注射器中注射出来。150μm组和75μm组均产生了可接受的注射曲线。图14D显示了分散在整个水凝胶中的纤维的长度分布(平均值＝110.4±85.5μm，范围＝12-442μm，n＝108)。图14E显示了分散在整个水凝胶中的第一良好生产方案(GMP)(批号0001-0025)运行的纤维长度分布(平均值＝30.1±26.9μm，范围＝2.5-205.0μm，n＝993)。
图15是显示注射LS-14/hMSC(培养3天)后POD 30兔的组织学分析的两幅图像。图15A，注射LS-14/hMSC(培养3天)后POD 30兔脂肪垫中的苏木精-伊红染色(左)和马森氏三色图(右)显示稳健的组织和细胞浸润。图15B，注射LS-14/hMSC(培养3天)后POD 30兔的皮下间隙的苏木精-伊红染色(左)和马森氏三色图(右)显示中度组织和细胞浸润。
图16显示了一系列证明了复合物在体外提高脂肪移植物存活率的能力的图像。图16A(上)显示了在模具中24小时胶凝化后，脂肪抽吸物(F)与复合物(C)或水凝胶(H)的不同比率。100％脂肪抽吸物(100F)、50％复合物对50％脂肪抽吸物(50C)、25％复合物对75％脂肪抽吸物(25C)和100％水凝胶(100H)。百分比比率是根据脂肪抽吸物(F)与复合物(C)或水凝胶(H)的体积比计算得出的。图16A(下)显示了在G2 Ares流变仪上测试的样品。图16B显示了通过流变分析获得的不同的脂肪抽吸物(F)与复合物(C)或水凝胶(H)的比率的机械性能。图16B(左)是每个样品组的代表性应变扫描。图16B(左和右)的样品组被选择为100％脂肪抽吸物(100F)、100％复合物(100C)、50％复合物(50C)、25％复合物(25C)、50％水凝胶(50H)和100％水凝胶(100H)。百分比比率是根据脂肪抽吸物(F)与复合物(C)或水凝胶(H)的体积比计算得出的。图16B(右)显示了每个样品组的平均剪切模量(G’)。
图16C显示了不同脂肪抽吸物、复合物或水凝胶组合的Alamar Blue测定结果。使用Alamar Blue测定对第0天、第1天、第2天、第3天和第7天的细胞存活相对量定量。结果以七天期间脂肪细胞存活百分比显示，将数值针对第1天获得的数值进行标准化。与脂肪抽吸物相比，所有其它组的存活细胞百分比均显著较高(p值<0.05)。
图16D显示了不同的脂肪抽吸物(F)与复合物(C)的比率的免疫组织化学(IHC)分析。用F8BT标记纤维，并将其与脂肪抽吸物组合，以进行IHC。对样品的围脂滴蛋白(perilipin)进行染色以评估形态学(以红色显示的)。脂肪细胞表现出保存的细胞体系结构(cellular architecture)。DAPI染色显示细胞核(以蓝色显示)。比例尺＝100μm。在细胞水平上，当与脂肪抽吸物组合时，LS复合物表现出均匀整合(以绿色显示)。当与100％脂肪抽吸物样品相比时，纤维似乎均匀分散在两个含复合物的组(50C和25C)中，并且不会不利地改变脂肪细胞形态学(基于围脂滴蛋白的染色)。
图17显示了一系列图像，所述图像评估在体内不同比率的脂肪抽吸物(F)和复合物(C)在血管向内生长和脂肪移植物体积保持方面改的能力。图17中的样品组选择为100％脂肪抽吸物(100F)、100％复合物(100C)、50％复合物(50C)、25％复合物(25C)和50％水凝胶(50H)。百分比比率是根据脂肪抽吸物(F)与复合材料(C)或水凝胶(H)的体积比计算得出的。图17A显示了每个样品组的MRI(磁共振成像)体积分析结果。在体积保持方面，25C组在POD 84时间点产生最佳结果(图17A)。所有组都损失了大量最初植入的移植物体积，但25C显示保持的体积最高。100C在POD 84的体积保持最差，表明单独的复合材料并不能充分替代脂肪组织，只能作为脂肪移植的辅助材料。
图17B显示了形状保持分析的结果。在POD 2和POD 84测量最大移植物高度，并计算高度差异百分比。移植物可随着时间的推移变平，但仍然保持相似的总体积。因此，选择最大移植物高度作为形状保持的标志。100F和25C的最大移植物高度变化最小，表明形状保持最佳。与作为参考的100F相比，50C、50H和100C的形状保持明显较差。由盲法研究人员使用ImageJ软件进行体积分析和形状保持分析。形状保持对材料的功能至关重要，因为自体脂肪移植的主要目的是作为软组织缺损的填充剂。
图17C显示了POD7的围脂滴蛋白的IHC分析染色结果。比例尺：100μm。POD 7时的围脂滴蛋白的IHC染色显示，所有组的脂肪细胞形态均得到保持(图17C)。图17D显示了POD28的围脂滴蛋白的IHC分析染色结果。比例尺：100μm。图17D显示，与另外的样品相比，25C样品具有保存最完整的脂肪细胞结构。还可以看出，纤维在体内环境中也均匀分散，并与组织良好整合。
图17E显示了POD7的CD31的IHC分析染色结果。比例尺：100μm。CD31染色的IHC结果清楚地显示了血管分布随时间的变化。在POD 7，所有组中均观察到有限的血管形成(图17E)。然而，与此时间点的另外的组相比，25C组中似乎至少存在略微更大、更强健的血管。图17F显示了POD28的CD31的IHC分析染色结果。比例尺：100μm。在POD28时间点，含有复合物的所有样品组(25C、50C和100C)均有明显的血管生成(图17F)。相比之下，100F和50H组对CD31未表现出强染色，表明血管生成率较低。充足的血液供应对移植物存活是必需的，这可帮助解释为什么含复合物组的体积保持率最高。
图17G由使用MicroFil灌注，然后通过VivoQuant软件分析获得的POD 84移植物的3-D CT(计算机断层扫描)重建图像组成。括号中显示了各移植物的血管供应(vascularity)占移植物总体积的百分比。
图17G所示的3D图像表明，含有复合物的移植物血管化明显好于100F或50H移植物。25C的血管相对于总移植物体积的百分比最高，表明与其它标本相比，其血管供应水平较高。
具体实施方式
结合附图，可以更好地理解以下通过实例给出的详细描述，但无意将本发明仅限制于所描述的特定实施方案。
本发明涉及在软组织重建方法中使用的包含水凝胶和纳米结构的预反应珠状复合材料。本发明还涉及软组织装置，其包括用于细胞和组织递送以进行美容、重建和细胞疗法的珠状复合材料。
本发明还涉及能够募集、捕获、包裹、缔合和/或包埋特定组织成分(包括但不限于脂肪细胞、其它间充质细胞或间充质干细胞)的复合材料。本发明还涉及能够募集、捕获、包裹、缔合和/或包埋特定组织(包括但不限于脂肪组织)的复合材料。本发明还涉及使用包含支架复合物(诸如软组织装置)的组合物修复或重建软组织损伤的方法，所述支架复合物包含与可生物降解的纤维共价连接的生物材料。本发明在其它方面还涉及制造用于软组织重建的组合物的方法，其中所述组合物包含水凝胶和布置在所述水凝胶内的纳米结构。本发明在特定方面还涉及制造用于细胞和组织递送以进行美容、重建和细胞疗法的组合物的方法。
以下是对本发明的详细描述，所述描述被提供来帮助本领域技术人员实施本发明。本领域普通技术人员可在不脱离本发明的精神或范围的情况下对本文所述的实施方案进行修改和变化。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文中在本发明的描述中使用的术语仅用于描述特定的实施方案，并不旨在限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、附图和其它参考文献均通过引用以其整体明确地并入。
尽管在本发明的实践或测试中也可以使用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与所述出版物结合引用的方法和/或材料。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献(其全部公开通过引用并入本文)为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义(除非本文另有定义)：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版1994)；The CambridgeDictionary of Science and Technology(Walker编辑，1988)；The Glossary ofGenetics，第5版，R.Rieger等人(编辑)，Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham,theHarper Collins Dictionary of Biology(1991)。一般来说，本文所述或固有的分子生物学方法的程序等是本领域常用的方法。此类标准技术可见于参考手册例如Sambrook等人，(2000,Molecular Cloning--A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratories)；和Ausubel等人，(1994,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,New-York)。
除非另有说明，否则以下术语可具有以下赋予它们的含义。然而，应当理解，本领域普通技术人员已知或理解的其它含义也是可能的，并且在本发明的范围内。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体并入本文。在存在冲突的情况下，应以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，而无意是限制性的。
定义
术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”是指物品的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一个/种(an)元素”意味着一个/种元素或多于一个/种元素。
如本文中所用，“约”可以表示正或负小于1％或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％或大于30％，这取决于本领域技术人员已知或可知的情况。
如本说明书中所用，“受试者”或“多个受试者”或“多个个体”可包括但不限于哺乳动物，诸如人或非人类哺乳动物，例如家养的、农业的或野生的动物，以及鸟类和水生动物。
如本文中所用，术语“生物活性材料”是指任何具有生物活性的有机剂或无机剂，即其在活组织、器官或生物体中诱导统计学上显著的生物反应。生物活性剂可以是药剂、肽、多糖或多核苷酸，例如DNA和RNA。其可作为可以是在如消化/代谢、血液和凝血、心血管、皮肤病学、泌尿生殖器、激素、免疫学、感染、癌症、肌肉骨骼、神经学、寄生虫、眼科、呼吸和感觉等治疗领域中用于治疗疾病的剂。其还可用于治疗如骨质疏松症、癫痫、帕金森病、疼痛和认知功能障碍等疾病。其可以是用于激素功能障碍疾病的治疗或激素治疗(例如用于避孕、激素替代疗法或利用类固醇激素的治疗)的剂。其还可以是诸如抗生素或抗病毒剂、抗炎剂、神经保护剂、预防性疫苗、记忆增强剂、镇痛药(或镇痛药组合)、免疫抑制剂、抗糖尿病剂或抗病毒剂等的剂。其可以是平喘药、抗惊厥药、抗抑郁药、抗糖尿病药或抗肿瘤药。其可以是抗精神病药、解痉药、抗胆碱能药、拟交感神经药、抗心律失常药、抗高血压药或利尿剂。其可以是用于止痛或镇静的剂。其还可以是镇静剂或用于认知功能障碍的药物。所述剂可呈游离酸或游离碱形式、可为盐或中性化合物。其可以是肽，例如左旋多巴；或抗体片段。其可以是多核苷酸、可溶性离子或盐。
如本文中所用，“支架复合物”包括两种组分聚合纤维和水凝胶材料的任何共价结合。支架复合物在“功能网络”中包含聚合纤维和水凝胶材料，这意味着组分之间的相互作用导致化学、生物化学、生物物理、物理或生理益处。另外，功能网络可包括附加组分，包括细胞、生物材料(例如，多肽、核酸、脂质、碳水化合物)、治疗性化合物、合成分子等。在某些实施方案中，当植入到人受试者中存在的靶组织中时，支架复合物促进组织生长和细胞浸润。
如本文中所用，术语“水凝胶”是一种类型的“凝胶”，是指由通过共价或非共价交联保持在一起的大分子(例如，亲水性聚合物、疏水性聚合物、其共混物)的三维网络组成的水溶胀性聚合物基质，所述大分子的三维网络可以吸收大量的水(例如，每单位非水分子50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)以形成弹性凝胶。聚合物基质可由任何合适的合成或天然存在的聚合物材料形成。如本文中所用，术语“凝胶”是指跨越液体介质体积并通过表面张力作用将其诱捕的固体三维网络。这种内部网络结构可由物理键(物理凝胶)或化学键(化学凝胶)以及微晶或在延伸流体(extending fluid)中保持完整的其它结点产生。事实上，任何流体都可用作包括水(水凝胶)、油和空气(气凝胶)在内的增量剂(extender)。就重量和体积而言，凝胶的组成大部分为流体，因此其密度与其组成液体的密度相似。水凝胶是一种类型的将水用作液体介质的凝胶。
“疏水性”和“亲水性”聚合物的定义基于100％相对湿度下聚合物吸收的水蒸气量。根据这一分类，疏水性聚合物在100％相对湿度(“rh”)下仅吸收高达1％的水，而适度亲水性聚合物吸收1-10％的水，亲水性聚合物能够吸收超过10％的水，吸湿性聚合物吸收超过20％的水。“水溶胀性”聚合物是在浸入水介质中时吸收的水量至少大于其自身重量的50％的聚合物。
术语“交联的”在本文中是指包含分子内和/或分子间交联(无论是通过共价键合还是非共价键合产生的)的组合物，并且可以是直接的或包括交联剂。“非共价”键合包括氢键合和静电(离子)键合。
术语“聚合物”包括直链和支链聚合物结构，并且还涵盖交联的聚合物以及共聚物(其可以交联也可以不交联)，因此包括嵌段共聚物、交替共聚物、无规共聚物等。在本文中称为“寡聚物”的那些化合物是分子量低于约1000Da，优选低于约800Da的聚合物。聚合物和寡聚物可以是天然存在的或从合成来源获得的。
如本文中所用，术语“微珠”意指在最长维度上小于300μm的本发明材料的颗粒。
如本文中所用，术语“经处理的组织细胞外基质”意指取自动物受试者(优选人)并经处理以消毒和去除细胞的细胞外基质(ECM)。
如本文中所用，术语“生物材料”意指被工程化成与生物系统相互作用的有机材料。在本发明的一些实施方案中，生物材料是水凝胶。在一些实施方案中，生物材料是细菌来源的透明质酸。
如本文中所用，术语“可生物降解的”是指可在受试者体内通过生物手段分解的材料。
如本文中所用，术语“储能模量”用于定义动态模量的弹性分量(elasticcomponent)的测量，其举例说明了材料如何响应变形或应力。在实施方案中，“变形”意指由于施加的力而导致的物体形状或尺寸的变化。
如本文中所用，术语“剪切模量”也称为刚性模量，由G表示，定义为剪切应力与剪切应变之比。在实施方案中，“剪切应力”意指与材料横截面共面的应力分量。在实施方案中，“剪切应变”是指垂直于材料横截面的力。
如本文中所用，术语“可植入的”意指能够配制成通过注射器植入受试者体内。
如本文中所用，术语“软组织”是指连接、支撑或包围身体的其它结构和器官的组织。软组织包括肌肉、肌腱、韧带、筋膜、神经、纤维组织、脂肪、血管和滑膜。
如本文中所用，术语“稳定的”是指在室温下不降解的材料。
如本文中所用，术语“脂肪抽吸物”是指通过脂肪抽吸取出的材料。
如本文中所用，术语“自体的”是指来自同一个体的任何材料，所述材料随后将被重新引入该个体。
如本文中所用，术语“同种异体的(allogeneic)”，或者可选地“同种异体的(allogenic)”，是指来源于与引入所述材料的个体相同的物种的不同动物或不同患者的任何材料。
如本文中所用，术语“冻干”是指经过冻干后的材料，所述冻干是通过从材料中除去水分来保存材料的过程，其包括首先冷冻材料，然后在真空下在非常低的温度下对其进行干燥。
如本文中所用，术语“官能化的”是指被均一或非均一修饰以便具有与其关联的功能性化学部分(例如，经化学修饰的)的材料。在一些情况下，功能性化学部分能够反应以允许形成共价键或非共价键。在一些情况下，功能性化学部分可为材料提供改进的性能。
软组织重建
每年有数百万人因肿瘤摘除、创伤、衰老或先天性畸形而遭受毁灭性的软组织损失。包括皮肤、脂肪和肌肉在内的组织损失会导致主要的功能和美学障碍，所述障碍很难用常规手段来治疗。例如，美国每年进行超过300,000例部分乳房切除术，导致因乳房软组织损失而造成的毁容性乳房疤痕。现有的软组织修复方法有明显的缺点。自体组织瓣需要在漫长的手术过程中从身体的另一部分移动软组织，从而留下供体部位的缺陷LoTempio2010.Plastic and Reconstructive Surgery,126(2),393–401；Patel 2012.Annals ofPlastic Surgery,69(2),139–144}。假体植入物容易出现异物反应，导致纤维化和包囊化{Calobrace 2014 Plastic and Reconstructive Surgery,134(增刊1),6S–11；Tsoi2014.Plastic and Reconstructive Surgery,133(2),234–249}。涉及脂肪抽吸过程中收获的脂肪细胞的放置的脂肪移植限于小体积，并受到移植存活率低的阻碍{Kakagia 2014Surgical Innovation,21(3),327–336；Largo 2014 British Journal of PlasticSurgery,67(4),437–448}。
最后，可使用可注射的水凝胶软组织填充剂，但这些仅适用于较小的缺损。然而，由现有填充剂提供的体积恢复是暂时性的{Young 2011.Acta Biomaterialia,7(3),1040–1049；Varma 2014 Acta Biomaterialia,10(12),4996–5004}。本领域需要能够为年龄相关的美容缺陷提供解决方案的长效填充剂。新一代组织工程解决方案已被提出，其重点是使用水凝胶支架作为模板来再生软组织，诸如重建部位处的脂肪组织。
进行软组织重建的当前组织工程方法
脂肪来源的干细胞(ASC)已经在软组织缺损周围的伤口床中鉴定出{Salibian2013 Archives of plastic surgery 40.6：666-675}。当用合适的基质微环境支持时，它们可以分化成软组织诸如脂肪。因此，用功能性材料填充修复部位的策略有可能使得能够使用内源性ASC或使用存在于吸脂抽吸物中的ASC和/或其它间充质细胞再生新组织，所述吸脂抽吸物可通过标准手术实践容易地获得。水凝胶由于其三维(3D)性质和弹性性质与软组织的三维(3D)性质和弹性性质相似，已被作为用于组织缺损再生的支架基质广泛研究。已经使用各种方法来产生水凝胶支架，所述水凝胶支架具有与天然脂肪组织(约2千帕)的模量相似的模量{Alkhouli 2013 American Journal of Physiology.Endocrinology andMetabolism,305(12),E1427–35；Sommer 2013 Acta biomaterialia 9.11(2013)：9036-9048}，同时对抗来自周围组织的物理应力保持其体积和形状。这需要较高的交联密度和较小的平均孔径{Ryu 2011 Biomacromolecules 12.7(2011)：2653-2659；Khetan 2013Nature Materials,12(5),458–465；Li 2014 Journal of Neurotrauma,31(16),1431–1438}，导致细胞浸润低和再生差。水凝胶支架促进细胞浸润的能力是软组织修复成功的关键。缺乏血管浸润是大体积脂肪移植和其它组织工程尝试失败的原因。目前没有可用的材料可以在促进早期血管形成和ASC分化以再生软组织的同时填充软组织缺损中损失的体积。
水凝胶基质
已经使用了各种方法来产生具有与天然脂肪组织的剪切储能模量(150至500帕)相似的剪切储能模量(G’)的水凝胶填充剂，因此它们可以对抗来自周围组织的物理应力保持其独特的体积和形状。迄今为止，这些弹性结构性质是以水凝胶网络中的高交联密度和小平均孔径为代价实现的，这导致有限的细胞浸润并因此导致差的再生。
由于植入物材料的孔隙度(Porosity)和孔径对巨噬细胞浸润和活性的影响，它们可以影响宿主的生物反应。几项研究表明，由支架的孔隙特征和机械特性触发的巨噬细胞的偏极化可以影响纤维化和疤痕形成的程度(M1巨噬细胞主导的反应)对比血管生成和基质重塑(M2巨噬细胞主导的反应)。与无孔植入物相比，植入软组织的多孔材料调节巨噬细胞的促再生极化，促进血管生成以及减少纤维化和疤痕形成。因此，水凝胶支架促进细胞浸润和血管向内生长的能力是调节急性和慢性炎症、促进组织重塑、血管生成和再生以及实现长期软组织修复的关键。
在过去的几年中，Li和Wen开发了用于干细胞移植的具有优化的孔径和模量(10-100帕)的缀合有层粘连蛋白来源的环肽(CCRRIKVAVWLC(SEQ ID NO：1),10μM)的透明质酸(HA)水凝胶。他们已经表明，这种水凝胶支持强健的神经干细胞(NSC)迁移和来自分化细胞的神经突起萌发{Li 2014 Journal of Neurotrauma,31(16),1431–1438}。在创伤性脑损伤的大鼠受控皮质损伤(CCI)模型中，该水凝胶，当在CCI损伤后第3天注射时，在植入后4周至6个月促进显著的脉管系统网络形成，填充损伤部位(>10mm)。这种改善的血管生成归因于这种水凝胶保留和呈现组织分泌的生长因子，特别是血管内皮生长因子(VEGF)的能力。文献报告还显示，3至10个二糖单位的小HA降解片段是内皮细胞增殖、迁移、小管形成和血管生成的强效调节剂{Slevin 2002 Journal of Biological Chemistry,277(43),41046–41059}。在最近的研究中，测试了这种HA水凝胶在CCI损伤后在脑损伤部位递送人胎儿组织来源的NSC球状体的有效性。移植后，这种HA水凝胶在支架基质内递送了强健的血管。再生血管长入病变并穿透植入的基质，并且支持神经元祖细胞的存活和生长。这些结果证实了这种优化的HA水凝胶组合物在促进宿主血管向内生长方面的独特能力。更重要的是，水凝胶基质具有足够的多孔性，以允许在水凝胶基质内进行强健的细胞迁移。然而，将这种HA水凝胶直接用于软组织重建是不可行的，因为其机械性能不足以保持植入部位的完整性––周围脂肪组织的模量高出10倍以上。增加交联密度以提高其模量将使其对细胞浸润和迁移的渗透性差。需要新的策略来增加机械性能，而不显著减小块状水凝胶的平均孔径。在实施方案中，本发明的水凝胶是基本上纯化的透明质酸(HA)，优选由细菌产生。
提供了将水凝胶材料或其它生物材料与聚合物纤维组合的支架基质，所述支架基质被配制成使得密度、凝胶与纤维的比率和其它性质可变，同时保持足够的孔隙度和强度。提供了支架基质，其包含含有经处理的组织细胞外基质(诸如源自和/或可源自脂肪组织的细胞外基质)和/或从所述经处理的组织细胞外基质分离而来的材料。
在一些实施方案中，将水凝胶材料官能化。在特定实施方案中，用包括羟基、氨基、羧基、硫代、丙烯酸酯、磺酸酯、磷酸酯、酰胺以及其修饰形式(诸如活化或保护形式)的基团将水凝胶材料官能化。在优选实施方案中，水凝胶材料包含透明质酸(HA)。在更优选的实施方案中，水凝胶材料包含官能化透明质酸(HA)。在其它优选实施方案中，水凝胶材料包含丙烯酸酯化的透明质酸(HA)。在一些实施方案中，水凝胶材料包含巯基化的透明质酸(HA)。
支架复合物
本文提供了适用于医疗装置的支架复合物，例如通过注射或植入将所述支架复合物掺入施用所述复合物的人受试者的组织中。支架复合物包含通常具有约10nm至约10,000nm诸如约100nm至约8000nm、或约150nm至约5,000nm、或约100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1,000nm、1,500nm、2,000nm、2,500nm、3,000nm、3,500nm、4,000nm、4,500nm、5,000nm、5,500nm、6,000nm、6,500nm、7,000nm、7,500nm或8,000nm的平均直径的聚合物纤维。聚合物纤维通常具有约10μm至约500μm诸如约10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm的平均长度。在实施方案中，使用光学荧光显微镜来确定纤维的长度。在实施方案中，使用电子显微镜来确定纤维的长度。
在一些实施方案中，将纤维官能化。在一些实施方案中，用包括羟基、氨基、羧基、硫代、丙烯酸酯、磺酸酯、磷酸酯、马来酰亚胺、酰胺及其修饰形式诸如活化或保护形式的基团将纤维官能化。
如本文所提供的，聚合物纤维与水凝胶材料的比率可以通过本领域已知的任何方式来确定。例如，基于组分质量，聚合物纤维与水凝胶材料的比率为约1:100至约100:1，诸如约1:50至约50:1，或1:10至约10:1，诸如1:5至约5:1，诸如约1:3至约3:1。聚合物纤维与水凝胶材料的比率还以浓度为基础(例如，给定重量的聚合物纤维每体积水凝胶材料)提供。例如，浓度为约1mg/mL至50mg/mL。通常将水凝胶材料布置在聚合物纤维上，诸如结合至聚合物纤维的外表面(或外表面，取决于组成和形状)。支架复合体通常不是均匀的固体材料。相反，支架复合物包含存在于支架复合物表面上或表面内的多个孔。可在支架复合物的产生过程中调节孔的存在、尺寸、分布、频率和其它参数。孔径可以从低于约1μm至高达100μm(包括1μm、2μm、3μm、45μm、10μm、15μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60 70μm、80μm、90μm或100μm)，并且可以窄范围定制其尺寸，例如使得至少40％，诸如50％、60％、70％、80％、90％、95％或超过95％的孔处于期望的尺寸或期望的尺寸范围内。
本发明的支架复合物适于掺入人受试者的组织中，因此它们通常是“生物相容性的”，意味着能够与生物系统(诸如存在人受试者中的)相互作用，而不会在其中和/或由此诱导病理生理学反应。在一些实施方案中，提供支架复合物是为了持久地保留在组织中。或者，将支架复合物被短暂地保留在人受试者体内，并以基本上可生物降解的形式提供。优选地，聚合物纤维包含生物相容性的可生物降解的聚酯。在优选实施方案中，所述聚合物纤维包含聚己内酯。
如本文所提供的，含聚合物纤维和水凝胶的复合物相互作用的一种优选形式包括交联部分，其通常以有效引入聚合物纤维与水凝胶材料之间的键合(例如，诱导聚己内酯纤维与透明质酸之间的交联)的量存在。
用于软组织修复的支架设计
复合物概念已被广泛用作材料强化机制。例如，向水凝胶中加入羟基磷灰石颗粒可以增加其刚度{Wu 2008 Materials Chemistry and Physics 107.2(2008)：364-369}，而对于细长颗粒，复合物的拉伸模量增加得更多{Yusong 2007 Journal of MaterialsScience,42(13),5129–5134}。电纺纳米纤维网由于其与天然ECM的形貌相似，已被广泛用作组织工程基质。特别有趣的是，脂肪组织的脱细胞ECM本质上是高度纤维状和多孔的(图6G){Young 2011.Acta Biomaterialia,7(3),1040–1049}。最近的几项研究试图通过将片段化的聚(丙交酯)(PLA)或壳聚糖纤维引入聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺或藻酸盐水凝胶来概括纤维组分{Coburn 2011 Smart Structures and Systems,7(3),213；#37；Zhou 2011Colloids and Surfaces B：Biointerfaces,84(1),155–162；Shin 2015 Journal ofMaterials Chemistry}。将片段化的纤维与水凝胶前体溶液混合，并在胶凝化过程中掺入到水凝胶中，以形成3D架构。与相应的水凝胶相比，这些纤维嵌入的水凝胶显示出改进的机械性能。然而，还没有关于体内测试宿主细胞浸润的报告。另外，这些水凝胶是不可降解的，并且需要用于脂肪细胞粘附和分化的粘附配体。
纳米纤维-生物材料复合物的设计
为了实现纤维增强效果同时保持水凝胶相中的高孔隙度，提供了电纺纤维-水凝胶复合物，所述复合物与其它支架相比提供了优异的性能。除了之前报道{Coburn 2011Smart Structures and Systems,7(3),213}的共混纳米纤维和水凝胶基质，此处还介绍了纤维表面与水凝胶交联网络之间的界面键合(图6)。这种复合物设计不仅允许来自固体纤维组分的更强的机械增强，而且还允许水凝胶相的整体机械性能和平均孔径/孔隙度的独立调整，使得能够实现最佳的细胞浸润性能和结构完整性。进一步设想，纤维可被用作ASC和内皮祖细胞的优选细胞粘附基质，因此作为支持细胞迁移和ASC分化的引导者。
为了进一步获得期望的效果，本发明包括聚乙二醇交联剂，以在纳米纤维之间以及纳米纤维与水凝胶之间引入交联。这有助于延长产品的耐久性，并允许调节交联密度，以获得最佳的其它性能。
纤维-水凝胶复合物与脂肪组织的组合(复合物-脂肪)
本文提供了用于医疗装置的纤维-水凝胶复合物与脂肪组织的组合(复合物-脂肪)，所述复合物-脂肪整合到被施用(例如通过注射或植入)所述复合物的人受试者的组织中。复合物-脂肪可通过本领域已知的任何方法制备。可以组合不同比率的脂肪和纤维-水凝胶复合物以获得所需效果的最佳结果。在优选实施方案中，脂肪组织是脂肪抽吸物。
在一些实施方案中，原位组合纤维-水凝胶复合物和脂肪组织，并使其在硅酮模具中或在注射器中或在玻璃容器中胶凝一定的时间段，诸如约1小时、3小时、5小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时，或约1小时至24小时。
在优选实施方案中，原位组合纤维-水凝胶复合物和脂肪抽吸物，并使其在硅酮模具中或在注射器中或在玻璃容器中胶凝一定的时间段，诸如约1小时、3小时、5小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时，或约1小时至24小时。复合物-脂肪抽吸物与单独的脂肪抽吸物相比提供了更优的特性。可将复合物-脂肪抽吸物施用(例如注射)到人受试者体内，以促进脂肪移植物保持和血管形成，充当模拟天然细胞外基质的组织支架。所述方法为更大体积的重建提供了希望，而没有植入物失效和纤维化的风险。与目前临床使用的经处理的脂肪抽吸物相比，复合物-脂肪抽吸物具有增强的机械性能，更类似于体内脂肪。
根据脂肪(例如脂肪抽吸物)与复合材料的比率，可以以协同方式增加组合材料的储能模量(G’)。这一点很重要，因为储能模量是衡量材料可变形程度的量度，理想的组织支架应具有与天然脂肪组织相似的特性/强度。随着储能模量的提高，脂肪/复合材料组合的变形性减小，因而强度更高，受剪切力的影响更小。之前的研究已经证明，这转变为更少的脂解作用和更高的体外脂肪细胞存活率{Luan,Anna等人，Plastic and ReconstructiveSurgery，第140卷，第3期，2017年，第517–524页}。因此，可以合理地推断，具有拥有高储能模量的脂肪复合物组合将转变为提高的体内脂肪细胞和脂肪移植物存活率。这具有很强的临床意义，因为这意味着接受脂肪移植以进行软组织重建的患者发病率更低，并且手术更少。
与脂肪抽吸物相比，复合物-脂肪能够表现出更高的血管生成和血管向内生长速率。充足的血液供应对脂肪移植物的存活是必需的。这就是为什么由复合物-脂肪提供的增加的血管生成和血管向内生长对于脂肪细胞的长期存活是必要的。
另外，复合物-脂肪不会阻止脂肪细胞进入细胞培养基进行存活。复合材料可使脂肪细胞获得长期存活所需的血管生成生长因子。另一方面，单独的脂肪抽吸物在样品周围具有脂质层，从而阻止脂肪细胞进入细胞培养基。
非球形珠状制剂
在本领域已知的其它皮肤填充剂组合物中，复合物/水凝胶形成颗粒制剂，使得能够使用较高浓度的每种组分并提高稳定性。例如，一些商业基于水凝胶的填充剂使用共混方法来形成这些珠粒。这种方法并不理想，因为其几乎不能控制珠粒的尺寸和形状。
在本发明的形式中，使纳米粒子-水凝胶支架基质形成为块状复合凝胶。提供了改进，包括将复合物作为珠状凝胶引入。这使得用户可以改变珠粒性质，以获得理想的结果(表1、图4B、图4C和4D)，并提高复合物的储能模量(图3)。本发明引入了颗粒化系统，其中诸如通过以下方式物理调节预成型的水凝胶-纳米纤维复合物：推动所述预成型的水凝胶-纳米纤维复合物通过一个、两个、三个或超过三个网筛，产生形状和尺寸彼此相对相似的非球形的珠粒群。这种双筛系统允许对珠粒的尺寸进行严格控制，从而允许用户根据需要调节尺寸(表1)。
表1：将预成型的复合物以高和低交联密度(刚度)混合，从而组合两种颗粒类型的有利方面(更硬、降解更慢和更持久；相对更多的孔、更好的细胞浸润和血管形成)。可调整两种类型的复合颗粒的比率以组合本发明的各种期望的性质。根据这些优化参数制作了14种制剂，并对其进行测试。
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预反应复合物
如本文所述，所述发明包含在注射前或储存前反应的复合物。在本发明的前述实施方案中，由最终用户即将在将制剂注射到受试者时混合制剂的组分。这引入了人为因素的复杂性，例如这所需要的用户的准备和处理。改变混合和等待时间可以改变反应时间，从而显著改变复合体的刚度。这可能会导致凝胶太硬而无法通过注射器注射，或者不够硬，从而在注射到受试者体内时产生不良特性。为了解决这一问题，本发明人开发了预反应的组合物，其中反应(例如胶凝化)在储存之前进行。
所述制剂包含7mg/mL HA-Ac、8-10mg/mL具有马来酰亚胺的纤维和6.9mg/mLPEGSH，在37摄氏度以块状方式完全反应。通过在制造过程中对凝胶进行预反应，本发明人消除了对保护不稳定官能团的需要，并消除了最终用户进行大量混合和固化的需要。
冻干
本发明包括在储存复合物之前冻干的步骤。冻干的引入允许产品在室温下长时期储存而不丧失功能。在实施方案中，将珠状产品在蔗糖、海藻糖和氯化钠的等渗溶液中冻干。这些变量在干燥过程中保护微结构，并延长产品的货架期。
在实施方案中，将冻干凝胶珠粒在储存后用水复原，允许它们在几秒钟内准备好注射。
与大多数水凝胶组分相反，纤维-水凝胶复合物的纳米纤维相的机械性能在干燥或冷冻状态下基本不变。因此，在冷冻或冻干过程中，纤维级分能够有助于保持整个复合材料的微结构。利用正确的冻干周期和配方，可冻干复合物，同时在再水合时仍然保持为独特的珠粒。
创新
在某些方面，创新是在纳米纤维表面与水凝胶网络之间具有交联和界面键合的预反应的珠状纳米纤维-水凝胶复合物设计，所述复合物能够被冻干并在再水合后保持其组成。这种工程化的复合物有可能显著改善水凝胶的机械性能，而不会显著减小水凝胶相中的平均孔径。与仅仅两种组分的物理共混相比，界面键合的引入可提供优异的机械强化效果。这项研究将绘制出可用电纺聚己内酯(PCL)纤维-HA水凝胶复合物对比共混物获得的机械性能(密度、孔隙度和剪切模量)的范围。
关键的创新是通过优化这种复合材料的原位形成中的化学作用实现的炎症减少。与先前的工作相比，通过鉴定在受试者中引起炎症的化学性质，并产生具有减少这一问题的新性质的组合物，本发明人已改进了本发明。本发明的先前实施方案使用了巯基化的HA(HA-SH)和丙烯酸酯化的PEG交联剂(PEGDA)。这在受试者中具有阴性反应，包括如图1C所示的急性免疫反应和注射后的炎症(图1A和图1B)。使用包含丙烯酸酯化的HA(HA-Ac)和巯基化的PEG交联剂(PEGSH)的替代组合物。反应基团的这种减少为炎症问题提供了解决方案。图1A和图1B演示了与本发明的先前实施方案相比以及与其它商购可得的填充剂相比的这种改进。
另一项创新是这种纳米纤维-水凝胶复合物修复软组织缺损的演示。初步表征表明，所述复合物与脂肪组织共有结构特征(图6){Christman,2012 US 20120264190 A1；Young 2011.Acta Biomaterialia,7(3),1040–1049}。据推测，这种复合物提供了对软组织再生很重要的结构完整性和机械性能。这项研究还已证明了与水凝胶相比的复合物料的通用性及高效率。
在其它方面，关键创新是将细胞结合或组织结合部分整合到纳米纤维-水凝胶复合材料中。包括肽、适体、抗体、小分子或其它结合试剂在内的这些部分赋予复合物结合来自局部伤口环境的细胞或外源提供的细胞的增强能力。所得的结合的纳米纤维、水凝胶和细胞的整体结构比单独的纳米纤维-水凝胶复合物表现得更像天然组织。包括脂肪细胞、内皮细胞、周细胞(perictye)和其它间充质细胞在内的掺入的细胞组分可以更好地与纳米纤维-水凝胶复合物以及周围组织接触和重塑它们，以实现更加自然和持久的修复。
在其它方面，关键创新是细胞与纳米纤维-水凝胶复合材料的结合。包括脂肪细胞、内皮细胞、周细胞和其它间充质细胞在内的相关的细胞基本组分可以更好地与纳米纤维-水凝胶复合物以及周围组织接触并重塑它们，以实现更加自然和持久的修复，同时提供合适的机械强度来模拟ECM。
在其它方面，关键创新是组织与纳米纤维-水凝胶复合材料的结合。诸如脂肪组织等的相关组织可以更好地与纳米纤维-水凝胶复合物以及周围组织接触并重塑它们，以实现更加自然和持久的修复，同时提供合适的机械强度来模拟ECM。
本发明的关键创新是复合物在室温(15℃(59℉)与18℃(64℉)之间)下的稳定性。许多商购可得的基于水凝胶或透明质酸的填充剂面临的一个问题是必须在冷却条件下储存。这限制了它们可储存的时间，从而缩短了最终用户可向受试者施用产品的窗口。本发明的目的是提高储存稳定性。可被冻干和再水合以用于施用的预反应的珠状制剂的产生解决了这一未满足的需求。
本项目的成功完成将为缺失软组织体积(特别是对于较大的缺损)的修复提供现成的解决方案，在所述较大的缺损中，建立血管网、保持组织修复部位的完整性、促进细胞迁移和组织以及招募宿主细胞对可持续的组织修复至关重要。这种复合设计中使用的材料组分(即HA水凝胶和可生物降解的聚酯纤维)的广泛临床跟踪记录，以及这些关于组织相容性的初步数据，表明了优异的组织相容性和临床转化的直接监管批准途径。
特征：
在一些实施方案中，本发明提供了水凝胶组分中纳米纤维与聚合物网络之间的交联和界面键合。这对形成“真正的”复合物很重要。已经证明，共混此类纤维和水凝胶不提供相同程度的机械增强。以前也有关于纳米纤维-水凝胶共混物的用途的报道。换句话说，交联和界面键合是这项新工作与现有技术的重要区别。此外，界面键合可包括本手稿中所示的共价键和二级键合，诸如氢键和静电荷相互作用。
在一些实施方案中，本发明在纳米纤维-水凝胶复合物中提供了间充质细胞结合元件，其能够增强所得复合物募集、捕获和/或包埋间充质细胞的能力。由细胞和纳米纤维-水凝胶复合物两者组成的所得材料可以表现得更像天然组织，并且可以与单独的纳米纤维-水凝胶复合物相比，实现更加自然和持久的修复。
在一些实施方案中，本发明提供了掺入复合物结构的间充质细胞。任选地，这些细胞可由本领域技术人员在常规临床实践中从吸脂抽吸物获得。可将包括脂肪细胞、间充质干细胞、内皮前体、脂肪细胞前体、内皮细胞和周细胞在内的此类细胞掺入纳米纤维-水凝胶复合物中以产生类似天然软组织的新型材料。
这也是该领域中第一个证明各向同性增强(复合物在所有方向上都更强，这是取代任意几何形状的体积缺损所必需的)的工作。利用纳米纤维垫或少量对齐的纤丝的设计本质上是各向异性的。这种设计能够形成各向同性和各向异性材料。
在本发明中，为了减少患者的炎症，改变了每种组分的化学组成，同时保持了支架的其它重要物理性质，诸如强度和储能模量。[[这方面的细节应在实例中公开。特别重要的是：该制剂中硫醇基团的位置(本发明公开内容中的A2部分)对灵敏度有很大影响。]]
本文所提出的工作定义了被配制成非球形微珠的支架复合物。这种珠化提高了凝胶的储存稳定性，并允许改变其它性质，所述性质可以改善复合物的功能并区分用于不同目的的质量。
本文所提出的工作定义了在注射前发生反应以降低最终用户出错的可能性的支架复合物。复合物的原位成型引入了人为因素的复杂性，包括必要的用户准备和处理。大约几分钟的混合和等待时间会影响制剂的性质，诸如不希望的刚度和弹性(图12A和图12B)。
本发明在本文中引入冻干珠状支架复合物，使其在室温下储存时稳定的步骤(图11)。珠粒可在使用前几秒钟内再水合，同时保持它们的原始性质。现有的HA填充剂不能辐照灭菌，因为水环境使HA链断裂太多。储存前冻干产品不仅允许组合物储存更长的时期，还使得能够进行额外的最终灭菌方式，即通过γ射线或电子束照射。
本文所提出的工作，至少在某些方面，将用于形成复合物的组分定义为具有足够孔径和孔隙度(在珠粒周围和珠粒内)用于细胞迁移和宿主组织向内生长的水凝胶网络，以及松散地包括直径在50nm至10μm的范围内的聚合物纤维的纳米纤维。
凝胶/水凝胶组分
在实施方案中，本发明的支架复合物是包含水凝胶的复合物。水凝胶可包括任何类型的合适的水凝胶组分。本发明设想了纳米结构/凝胶复合物，其包括任何合适的凝胶组分，包括本领域已知的任何合适的水凝胶组分。凝胶和/或水凝胶可以由任何合适的合成或天然存在的材料形成。
例如，凝胶和/或水凝胶的聚合物组分可包括纤维素酯，例如乙酸纤维素、乙酸丙酸纤维素(CAP)、乙酸丁酸纤维素(CAB)、丙酸纤维素(CP)、丁酸纤维素(CB)、丙酸丁酸纤维素(CPB)、二乙酸纤维素(CDA)、三乙酸纤维素(CTA)等。这些纤维素酯描述于美国专利第1,698,049号、第1,683,347号、第1,880,808号、第1,880,560号、第1,984,147号、第2,129,052号和第3,617,201号中，并且可使用本领域已知的技术制备或商购获得。适用于本文的商购可得的纤维素酯包括CA 320、CA 398、CAB 381、CAB 551、CAB 553、CAP 482、CAP 504，全部均可从Eastman Chemical Company,Kingsport,Tenn获得。此类纤维素酯通常具有约10,000至约75,000的数均分子量。
所述纤维素酯包含纤维素和纤维素酯单体单元的混合物；例如，商购可得的乙酸丁酸纤维素包含乙酸纤维素单体单元以及丁酸纤维素单体单元和未酯化的纤维素单元。
本发明的凝胶/水凝胶也可由其它水溶胀性聚合物组成，诸如丙烯酸酯聚合物，其通常由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯和/或其它乙烯基单体形成。合适的丙烯酸酯聚合物是以商品名
Figure BDA0002889302300000311
从RohmPharma(Germany)获得的那些共聚物，如上所指示的。Eudragit系列E、L、S、RL、RS和NE共聚物可用于溶解在有机溶剂、水分散体或干粉末中。优选丙烯酸酯聚合物是甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯的共聚物，诸如Eudragit L和Eudragit S系列聚合物。特别优选的此类共聚物是Eudragit L-30D-55和Eudragit L-100-55(后一种共聚物是可用水复原的EudragitL-30D-55的喷雾干燥形式)。Eudragit L-30D-55和Eudragit L-100-55共聚物的分子量为约135,000Da，其中游离羧基与酯基的比率为约1:1。所述共聚物通常不溶于pH低于5.5的含水流体。另一种特别合适的甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物是Eudragit S-100，其与Eudragit L-30D-55相异在于游离羧基与酯基的比率为约1:2。Eudragit S-100在低于5.5的pH下不溶，但与Eudragit L-30D-55不同，在pH在5.5至7.0的范围内的水性流体中溶解性差。该共聚物在pH 7.0及以上时可溶。还可使用Eudragit L-100，其具有介于Eudragit L-30D-55的pH依赖性溶解度曲线与Eudragit S-100的pH依赖性溶解度曲线之间的pH依赖性溶解度曲线，只要其在低于6.0的pH下不溶即可。本领域技术人员将会理解，Eudragit L-30D-55、L-100-55、L-100和S-100可用具有类似的pH依赖性溶解度特性的其它可接受的聚合物来代替。
透明质酸(HA)
在各种其它实施方案中，本发明的复合材料可基于作为水凝胶材料的透明质酸(HA)。HA是非硫酸化的直链多糖，具有形成水凝胶组分的重复二糖单元。HA也是人组织中细胞外基质的非免疫原性天然组分，在美容和重建手术中广泛用作皮肤填充剂。
在一些实施方案中，将透明质酸官能化。在特定实施方案中，将透明质酸用包含羟基、氨基、羧基、硫代、丙烯酸酯、磺酸酯、磷酸酯、酰胺及其修饰形式(诸如活化或保护的形式)的基团官能化。
在组织损伤和炎症区域的表达增加的天然透明质酸酶促进HA的分解。重要的是，研究表明3-10个二糖单元的小HA降解片段是内皮细胞增殖、迁移、小管形成和血管生成的高效调节因子。HA的这些生物学功能被认为是在涉及Ras和PKC的途径中通过CD44介导的。使用抗CD44抗体阻断CD44/HA相互作用减少了人微血管内皮细胞在体外的增殖和迁移。已将HA水凝胶在各种细胞和组织损伤模型中作为用于细胞递送的潜在基质进行了研究。这些水凝胶可作为细胞的保护和支撑支架，也可以减少瘢痕形成。因此，据信HA在通过促进细胞浸润和促进血管生成来增强组织再生方面具有关键作用。
首先，所述材料具有三维完整性和类似于天然脂肪组织的一致性。这使得其适合于现成的缺失软组织体积的修复。第二，所述材料优选可以沉积有多个柔性纳米纤维，所述纳米纤维可以作为用于脂肪细胞和内皮祖细胞迁移的基质。第三，所述材料具有足够的孔隙度，以允许这些前体细胞快速浸润并整合到支架中，而不是在其周围形成纤维囊。第四，HA水凝胶组分提供了可压缩性和体积膨胀性，同时还提供了重要的血管生成线索(angiogenic cue)。第五，纳米纤维和水凝胶组分是可生物降解的，从而允许它们被再生软组织替代。第六，所有组分材料在许多FDA批准的装置中都有强安全性跟踪记录，这有可能减少临床转化的监管障碍。
透明质酸的分子量影响复合物的整体性能(图4B)。Allergan和其它皮肤填充剂制造商也认识到HA分子量对产品持久性的重要性。Allergan的Juvederm产品是用分子量为2.5MDa的HA制造的。另外，在Juvederm专利US8450475 B2中，Allergan详细说明，“在本发明的典型实施方案中，高分子量与低分子量HA的比率为至少约且优选大于2(w/w≧2)，其中高分子量HA的分子量大于1.0MDa。”
HA的公开内容包括序列号12/393,884的美国专利申请；美国专利第6,921,819号(通过在HA水合过程中使其与多官能接头反应来交联固体透明质酸(HA)的方法)；美国专利第6,685,963号(HA的丙烯酸颗粒)；美国公布200610194758(通过交联高分子量和低分子量HA钠制备水凝胶的方法)；美国公布2009/0036403(用四官能聚乙二醇环氧化物交联HA以提供“可调地”交联HA)；美国公布2009/0143331(具有降解抑制剂诸如硫酸软骨素的HA皮肤填充剂，以提供更持久的填充剂)；美国公布2009/0143348(与类固醇组合的HA)；和美国公布2009/0155314(与肉毒杆菌毒素组合的HA)。另外，美国公布2009/0148527、2009/0093755和2009/0022808分别公开了微球中的、与胶原蛋白交联的和涂覆有蛋白质的HA。HA的进一步公开内容包括：WO 2009/034559(用含有至少一种C-糖苷衍生物的组合物对皮肤进行美容和/或修复处理的方法)；WO 2009/024719(用于填充皮肤中的凹处/凹陷，恢复身体或面部的体积以及减少衰老体征的包含HA和C-糖苷衍生物的化妆品和药物组合物)；WO 2007/128923(制备具有一种或多种活性亲脂性和/或两亲性成分的受控释放的生物相容性凝胶的方法)；美国公布2009/0018102(包含HA和至少一种类视黄醇或其盐/衍生物与寡糖和HA降解抑制剂的组合的组合物，用于治疗皱纹、因成纤维细胞耗竭而导致的线纹和疤痕)；美国专利第3,763,009号(通过使抗坏血酸、麦芽糖和/或寡糖的混合物经受源自曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)或其它属的酶以将混合物酶促转化为抗坏血酸葡糖苷来提高抗坏血酸抗氧化性的方法)；美国专利第5,616,611号(不显示直接还原活性，稳定的并且可用作稳定剂、品质改良剂、抗氧化剂、生理活性剂、制药和化妆品工业中的紫外线吸收剂的α-糖基-L-抗坏血酸)；美国专利第5,843,907号(适用于维生素C富集剂、食品、药物制剂和化妆品的晶体2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸的生产和用途)；和EP 0539196(高纯度2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸的工业规模制备)和美国公布2002/0151711。包含HA和/或维生素C剂的商业产品包括：
Figure BDA0002889302300000341
产口、
Figure BDA0002889302300000342
和
Figure BDA0002889302300000343
135/135HA美塑疗法(Mesotherapy)产品。上述引用的参考文献和印刷出版物中的每一篇都通过引用以其整体单独并入本文。
在实施方案中，本发明的HA是源自细菌发酵的已灭菌的HA。透明质酸可由链球菌属(Streptococcus)细菌的A组和C组菌株产生。由于HA不会引发免疫反应，因此细菌诸如兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)合成HA，作为包裹它们的细胞并表现出分子模拟以逃避宿主免疫系统的检测的手段(Boyce JD,Chung JY,Adler B,J Biotechnol.2000年9月29日；83(1-2):153-60.；Wessels MR,Moses AE,Goldberg JB,DiCesare TJ,ProcNatl Acad Sci U S A.1991年10月1日；88(19):8317-21.)。HA也是由其它病原菌天然产生的，所述病原菌包括化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)(Blank LM,Hugenholtz P,Nielsen LKJ Mol Evol.2008年7月；67(1):13-22.；DeAngelis PL,Jing W,Drake RR,Achyuthan AM,J Biol Chem.1998年4月3日；273(14):8454-8.；Jong A,Wu CH,Chen HM,Luo F,Kwon-Chung KJ,Chang YC,Lamunyon CW,Plaas A,Huang SH Eukaryot Cell.2007年8月；6(8):1486-96.)。
在过去的二十年里，通过细菌发酵生产HA一直在稳步发展。在其发展的早期阶段，将天然产生HA的A组和C组链球菌属在发酵罐中生长，并且纯化了HA。然而，由于这些细菌会产生大量毒素，因此人们开始寻找替代细菌。一旦确定了编码HA生物合成途径的基因，就对许多细菌(芽孢杆菌属(Bacillus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、大肠杆菌(E.coli)和乳球菌属(Lactococcus))进行遗传修饰，以表达这些基因并产生HA。随后的工作主要集中在培养基和培养条件的优化上(Mao Z,Chen RR,Biotechnol Prog.2007年9月至10月；23(5):1038-42.；Wessels MR,Moses AE,Goldberg JB,DiCesare TJ,Proc Natl Acad SciUSA.1991年10月1日；88(19):8317-21.；Widner B,Behr R,Von Dollen S,Tang M,Heu T,Sloma A,Sternberg D,Deangelis PL,Weigel PH,Brown S,Appl EnvironMicrobiol.2005年7月；71(7):3747-52；Sze,Brownlie,Love,3Biotech.2016；6(1):67.doi:10.1007/s13205-016-0379-9.)。
活性剂的递送
可使用本文所述的凝胶/水凝胶组合物中的任一种以便包含活性剂，并由此在以向其传递活性剂的关系施加到身体表面(例如，组织修复部位)时，用作活性剂递送系统。“加载”到本发明的水凝胶组合物中的活性剂的释放通常涉及通过溶胀控制的扩散机制的水的吸收和所述剂的解吸。例如，可在经皮肤的药物递送系统、伤口敷料、局部药物制剂、植入药物递送系统、口服剂型等中使用含活性剂的水凝胶组合物。
可掺入本发明水凝胶组合物并全身性递送(例如，通过经皮肤、口服或其它适于药物的全身性施用的剂型)的合适活性剂包括但不限于：止痛剂；镇痛剂；麻醉剂；抗关节炎剂；呼吸药物，包括平喘剂；抗癌剂，包括抗肿瘤药；抗胆碱能药；抗惊厥药；抗抑郁药；抗糖尿病药；止泻药；抗蠕虫药；抗组胺药；抗高血脂剂；抗高血压剂；抗感染剂，诸如抗生素和抗病毒剂；抗炎剂；抗偏头痛药制剂；止恶心药；抗帕金森症药；止痒药；抗精神病药；解热药；镇痉药；抗结核剂；抗溃疡剂；抗病毒剂；抗焦虑药；食欲抑制剂；注意力缺陷障碍(ADD)和注意缺陷多动障碍(ADHD)药物；心血管制剂，包括钙通道阻滞剂、抗心绞痛剂、中枢神经系统(CNS)剂、β-阻滞剂和抗心律失常剂；中枢神经系统兴奋剂；咳嗽和感冒制剂，包括减充血剂；利尿药；遗传物质；草药；溶激素药；催眠药；降血糖剂；免疫抑制剂；白三烯抑制剂；有丝分裂抑制剂；肌肉松弛剂；麻醉剂拮抗剂；尼古丁；营养剂，诸如维生素、必需氨基酸和脂肪酸；眼科药物，诸如抗青光眼剂；副交感神经阻断药(parasympatholytics)；肽类药物；精神兴奋剂；镇静药；类固醇，包括孕激素、雌激素、皮质类固醇、雄激素和合成代谢剂；戒烟剂；拟交感神经药(sympathomimetics)；镇定剂；和血管扩张剂，包括普通冠状动脉、外周血管和脑血管的扩张剂。可与本发明的粘合组合物一起使用的特定活性剂包括但不限于：毒藜碱、辣椒素、二硝酸异山梨醇酯、氨基柱头素(aminostigmine)、硝化甘油、维拉帕米、普萘洛尔、西拉波林(silabolin)、福尔酮(foridone)、氯压定(clonidine)、金雀花碱、溴氯苯基二氢苯并二氮杂
Figure BDA0002889302300000361
硝苯吡啶、氟西嗪(fluacizin)和舒喘宁。
对于局部药物施用和/或药垫(medicated cushion)(例如含药足垫)，合适的活性剂例如包括以下物质：
抑菌剂和杀菌剂：合适的抑菌剂和杀菌剂包括，例如：卤素化合物诸如碘、聚维酮碘络合物(即，PVP和碘的络合物，也称为“聚维定(povidine)”，并且可在商品倍他定(Betadine)下从Purdue Frederick获得)、碘化物盐、氯胺、氯己定和次氯酸钠；银和含银化合物，诸如磺胺嘧啶、乙酰鞣酸银蛋白、硝酸银、乙酸银、乳酸银、硫酸银和氯化银；有机锡化合物，诸如苯甲酸三正丁基锡；锌和锌盐；氧化剂，诸如过氧化氢和高锰酸钾；芳基汞化合物，诸如硼酸苯基汞或汞溴红(merbromin)；烷基汞化合物，诸如硫柳汞；酚，诸如百里酚、邻苯基酚、2-苄基-4-氯酚、六氯酚和己基间苯二酚；和有机氮化合物，诸如8-羟基喹啉、氯喹那多(chlorquinaldol)、氯碘喹啉(clioquinol)、依沙吖啶、海克替啶、氯己定和安巴腙(ambazone)。
抗生素剂：合适的抗生素剂包括但不限于林可霉素家族的抗生素(指最初从林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis)中回收的一类抗生素剂)、四环素家族的抗生素(指最初从金霉素链霉菌(streptomyces aureofaciens)中回收的一类抗生素剂)和硫基抗生素(sulfur-based antibiotics)，即磺酰胺类。林可霉素家族的示例性抗生素包括林可霉素、克林霉素、如例如美国专利第3,475,407号、第3,509,127号、第3,544,551号和第3,513,155号中描述的相关化合物，及其药理学上可接受的盐和酯。四环素家族的示例性抗生素包括四环素本身、金霉素、土霉素、四环素、地美环素、氢吡四环素、甲烯土霉素和多西环素及其药学上可接受的盐和酯，特别是酸加成盐诸如盐酸盐。示例性硫基抗生素包括但不限于磺胺类磺乙酰胺(sulfacetamide)、苯甲酰磺胺(sulfabenzamide)、磺胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺甲嘧啶(sulfamerazine)、磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine)、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)及其药理学上可接受的盐和酯，例如磺胺乙酰钠。
镇痛剂：合适的镇痛剂是局部麻醉剂，包括但不限于乙酰氨基丁香酚、酯酸阿法多龙、阿法沙龙、阿莫卡因(amucaine)、阿莫拉酮、阿米洛卡因、丁氧普鲁卡因、贝托卡因、苯柳胺酯(biphenamine)、布比卡因(bupivacaine)、burethamine、布他卡因、butaben、布坦卡因(butanilicaine)、丁硫妥(buthalital)、丁托西卡因(butoxycaine)、卡铁卡因(carticaine)、2-氯普鲁卡因(2-chloroprocaine)、辛可卡因、可卡乙碱(cocaethylene)、可卡因、环美卡因(cyclomethycaine)、二丁卡因、二甲异喹、二甲卡因、diperadon、达克罗宁、去水芽子碱(ecgonidine)、芽子碱、氨基苯甲酸乙酯、乙基氯、依替卡因、乙苯噁啶(etoxadrol)、.β.-优卡因、尤普罗辛、非那可明、福莫卡因、海索比妥、海克卡因、羟孕二酮、羟基普鲁卡因、羟基丁卡因、对氨基苯甲酸异丁酯、氯胺酮(kentamine)、甲磺酸亮氨卡因、左沙尔(levoxadrol)、利多卡因、甲哌卡因、美普卡因、美布卡因(metabutoxycaine)、美索比妥(methohexital)、甲基氯、咪哒唑仑、麦替卡因、纳依卡因、辛卡因、奥索卡因(orthocaine)、奥昔卡因(oxethazaine)、对乙氧卡因、非那卡因、苯环利定、苯酚、皮哌吡卡因(piperocaine)、匹多卡因(piridocaine)、聚多卡醇、普莫卡因(pramoxine)、丙胺卡因、普鲁卡因、丙泮尼地、丙泮卡因(propanocaine)、丙对卡因(proparacaine)、丙哌卡因(propipocaine)、丙泊酚(propofol)、丙氧卡因、假可卡因、吡咯卡因、利索卡因(risocaine)、水杨醇、丁卡因、硫烯比妥、硫柳醛(thimylal)、硫代丁比妥(thiobutabarbital)、硫喷妥钠、托利卡因、三甲卡因(trimecaine)、佐拉敏(zolamine)及其组合。丁卡因、利多卡因和丙胺卡因在本文中被称为镇痛剂。
可使用本发明水凝胶组合物作为药物递送系统递送的其它局部剂包括以下物质：抗真菌剂，诸如十一烯酸、托萘酯、咪康唑、灰黄霉素、酮康唑、环吡酮(ciclopirox)、克霉唑和对氯间二甲酚；角质溶解剂，诸如水杨酸、乳酸和尿素；发疱药，诸如斑蝥素；抗痤疮剂，诸如有机过氧化物(例如，过氧化苯甲酰)、类视黄醇(例如，视黄酸、阿达帕林和他扎罗汀)、磺胺类药物(例如，磺胺乙酰钠)、间苯二酚、皮质类固醇(例如，曲安西龙(triamcinolone))、α-羟基酸(例如，乳酸和乙醇酸)、α-酮酸(例如，乙醛酸)和专门用于治疗痤疮的抗菌剂，包括壬二酸、克林霉素、红霉素、甲氯环素、米诺环素、那氟沙星、头孢氨苄、多西环素和氧氟沙星；皮肤增亮剂和漂白剂，诸如氢醌、曲酸、乙醇酸和其它α-羟基酸、阿托卡品(artocarpin)和某些有机过氧化物；治疗疣的剂，包括水杨酸、咪喹莫特、二硝基氯苯、二丁基方酸、鬼臼树脂(podophyllin)、鬼臼毒素、斑蝥素、三氯乙酸、博莱霉素、西多福韦、阿德福韦及其类似物；和抗炎剂，诸如皮质类固醇和非类固醇抗炎药(NSAID)，其中NSAID包括酮洛芬、氟比洛芬、布洛芬、萘普生、非诺洛芬、苯噁洛芬、吲哚洛芬、吡洛芬、卡洛芬、奥沙普秦、普拉洛芬、舒洛芬、阿明洛芬、布替布芬、芬布芬和噻洛芬酸。
对于伤口敷料，合适的活性剂是用于伤口治疗的活性剂，包括但不限于抑菌和杀菌化合物、抗生素剂、镇痛剂、血管扩张剂、组织愈合促进剂、氨基酸、蛋白质、蛋白水解酶、细胞因子和多肽生长因子。
对于一些活性剂的局部和经皮肤施用，以及在伤口敷料中，可能有必要或希望将渗透增强剂掺入水凝胶组合物中，以提高剂进入或穿过皮肤的渗透速率。合适的增强剂包括，例如，下列物质：亚砜，诸如二甲基亚砜(DMSO)和癸基甲基亚砜；醚类，诸如二乙二醇单乙醚(商购可得的Transcutol)和二乙二醇单甲醚；表面活性剂诸如月桂酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、泊洛沙姆(231、182、184)、Tween(20、40、60、80)和卵磷脂(美国专利第4,783,450号)；1-取代的氮杂环庚烷-2-酮，特别是1-正十二烷基环氮杂-环庚烷-2-酮(可在商品名Azone下从Nelson Research&Development Co.,Irvine,Calif.获得；参见美国专利第3,989,816号、第4,316,893号、第4,405,616号和第4,557,934号)；醇类，诸如乙醇、丙醇、辛醇、癸醇、苯甲醇等；脂肪酸，诸如月桂酸、油酸和戊酸；脂肪酸酯，诸如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、丙酸甲酯和油酸乙酯；多元醇及其酯，诸如丙二醇、乙二醇、甘油、丁二醇、聚乙二醇和聚乙二醇单月桂酸酯(PEGML；参见，例如，美国专利第4,568,343号)；酰胺和其它含氮化合物，诸如尿素、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、2-吡咯烷酮、1-甲基-2-吡咯烷酮、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；萜烯类；烷酮类；和有机酸，特别是水杨酸和水杨酸盐类、柠檬酸和琥珀酸。也可使用两种或更多种增强剂的混合物。
在某些其它实施方案中，包含凝胶(例如，水凝胶组分)和纳米结构的本发明复合组合物还可包含另外的任选添加剂组分。此类组分在本领域是已知的，并且可包括例如填料、防腐剂、pH调节剂、软化剂、增稠剂、色素、染料、折射颗粒、稳定剂、增韧剂、防粘剂、药剂(例如，抗生素、血管生成促进剂、抗真菌剂、免疫抑制剂、抗体等)和渗透促进剂。以这样的方式选择这些添加剂及其量，使得它们不会显著干扰水凝胶组合物所需的化学和物理性质。
当粘合剂在皮肤或其它身体表面上时，可以有利地掺入吸收性填料以控制水合度。此类填料可包括微晶纤维素、滑石、乳糖、高岭土、甘露醇、胶态二氧化硅、氧化铝、氧化锌、氧化钛、硅酸镁、硅酸铝镁、疏水淀粉、硫酸钙、硬脂酸钙、磷酸钙、二水合磷酸钙、纺织纸和无纺纸和棉材料。其它合适的填充剂是惰性的，即是基本上非吸附性的，包括例如聚乙烯类、聚丙烯类、聚氨酯聚醚酰胺共聚物类、聚酯类和聚酯共聚物类、尼龙和人造丝。
所述组合物还可包含一种或多种防腐剂。防腐剂包括，例如，对氯间甲酚、苯基乙基醇、苯氧乙醇、氯丁醇、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵、西吡氯铵、二乙酸氯己定或葡糖酸盐、乙醇和丙二醇。
所述组合物还可包括调节pH的化合物。可用作pH调节剂的化合物包括但不限于甘油缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂，或者还可包括柠檬酸-磷酸盐缓冲剂，以确保水凝胶组合物的pH与个体身体表面的pH相容。
所述组合物还可包括合适的软化剂。合适的软化剂包括柠檬酸酯，诸如柠檬酸三乙酯或乙酰基三乙基柠檬酸酯(acetyl triethylcitrate)、酒石酸酯，诸如酒石酸二丁酯、甘油酯，诸如二乙酸甘油酯和三乙酸甘油酯；邻苯二甲酸酯，诸如邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二乙酯；和/或亲水性表面活性剂，优选亲水性非离子表面活性剂，例如糖的部分脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪醇醚和聚乙二醇脱水山梨醇脂肪酸酯。
所述组合物还可包含增稠剂。本文优选的增稠剂是天然存在的化合物或其衍生物，例如包括：胶原蛋白；半乳甘露聚糖；淀粉；淀粉衍生物和水解产物；纤维素衍生物，诸如甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基乙基纤维素和羟基丙基甲基纤维素；胶体硅酸；和糖类，诸如乳糖、蔗糖、果糖和葡萄糖。还可使用合成增稠剂，诸如聚乙烯醇、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙二醇和聚丙二醇。
在某些实施方案中，包含水凝胶和纳米结构的本发明水凝胶复合物还包含促进血管生成的组分。在本发明之前实现临床相关软组织再生的一个挑战是再生的组织优选地应该重新血管化。因此，任何促进软组织再生的材料优选地还应该促进血管生成。实现这一点的一种方法是通过使用含肝素的水凝胶组分，其可以作为生长因子结合部位来富集和保留促进血管生成和组织形成的生长因子。
在实施方案中，所述组合物还包含并递送抗体。术语“抗体”在本文中以其最广泛的含义使用，包括某些类型的免疫球蛋白分子，其包含一个或多个特异性结合抗原或表位的抗原结合结构域。抗体具体地包括完整的抗体(例如，完整的免疫球蛋白)、抗体片段和多特异性抗体。
在一些实施方案中，所述抗体包括抗体。在一些方面，所述抗体是单克隆抗体。在一些方面，所述抗体是嵌合抗体。在一些方面，所述抗体是人源化抗体。在一些方面，所述抗体是人抗体。在一些方面，所述抗体包括抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体包含替代支架。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体(whole antibody)”在本文中可互换使用，指具有与天然抗体结构基本相似的结构并具有包含Fc区的重链的抗体。例如，当用来指IgG分子时，“全长抗体”是包含两条重链和两条轻链的抗体。
术语“Fc区”意指免疫球蛋白重链的C端区，其在天然存在的抗体中与Fc受体和补体系统的某些蛋白质相互作用。各种免疫球蛋白的Fc区的结构和其中包含的糖基化位点在本领域是已知的。参见Schroeder和Cavacini,J.Allergy Clin.Immunol.,2010,125:S41-52(通过引用以其整体并入)。Fc区可以是天然存在的Fc区，或如本领域中或本公开中其它地方所述的经修饰的Fc区。
VH和VL区可进一步细分为散布在更保守的区域之间的高可变性的区域(“高变区(HVR)”；也称为“互补决定区”(CDR))。更保守的区域被称为框架区(FR)。每个VH和VL通常包含按以下顺序排列(从N端到C端)的三个CDR和四个FR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。CDR参与抗原结合，并影响抗体的抗原特异性和结合亲和力。参见Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest第5版(1991)Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(通过引用以其整体并入)。
任何脊椎动物物种的轻链都可以根据其恒定结构域的序列归为两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))之一。
任何脊椎动物物种的重链都可归为五个不同的类别(或同型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM之一。这些类别也分别称为α、δ、ε、γ和μ。根据序列和功能的不同，IgG和IgA类被进一步分为亚类。人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
CDR的氨基酸序列边界可以由本领域技术人员使用许多已知的编号方案中的任一种来确定，所述编号方案包括卡Kabat等人，同上(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人，1997,J.Mol.Biol.,273:927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.262:732-745(“Contact”编号方案)；Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(“IMGT”编号方案)；以及Honegge和Plückthun,J.Mol.Biol.,2001,309:657-70(“AHo”编号方案)；所述文献每一篇通过引用以其整体并入。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，诸如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段包括，例如，Fv片段、Fab片段、F(ab′)2片段、Fab′片段、scFv(sFv)片段和scFv-Fc片段。
“Fv”片段包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接的二聚体。
“Fab”片段除了重链和轻链可变结构域之外，还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段可以例如通过重组方法或通过全长抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。
“F(ab’)2”片段包含在铰链区附近通过二硫键连接的两个Fab’片段。F(ab′)2片段可以例如通过重组方法或通过完整抗体的胃蛋白酶消化来产生。可以例如通过用1-巯基乙醇处理来解离F(ab′)片段。
“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段在单个多肽链中包含VH结构域和VL结构域。VH和VL通常由肽接头连接。参见Plückthun A.(1994)。可使用任何合适的接头。在一些实施方案中，接头是(GGGGS)n(SEQ ID NO：127)。在一些实施方案中，n＝1、2、3、4、5或6。参见Antibodies from Escherichia coli.In Rosenberg M.&Moore G.P.(编辑),ThePharmacology of Monoclonal Antibodies第113卷(第269-315页).Springer-Verlag,NewYork(通过引用以其整体并入)。
“scFv-Fc”片段包含附接至Fc结构域的scFv。例如，Fc结构域可以附接至scFv的C末端。根据scFv中可变结构域的取向(即，VH-VL或VL-VH)，Fc结构域可以跟随VH或VL。可使用本领域已知或本文描述的任何合适的Fc结构域。在一些情况下，Fc结构域包含IgG4 Fc结构域。
术语“单结构域抗体”是指其中抗体的一个可变结构域特异性结合抗原而不存在另一个可变结构域的分子。单结构域抗体及其片段描述于Arabi Ghahroudi等人，FEBSLetters,1998,414:521-526和Muyldermans等人，Trends in Biochem.Sci.,2001,26:230-245中，所述文献的每一篇都通过引用以其整体并入。单结构域抗体也被称为sdAb或纳米抗体。
“多特异性抗体”是包含两个或更多个不同抗原结合结构域的抗体，所述抗原结合结构域共同特异性结合两个或更多个不同的表位。两个或更多个不同的表位可以是同一抗原上的表位(例如，由细胞表达的单个TIGIT分子)或不同抗原上的表位(例如，由相同细胞表达的不同TIGIT分子，或TIGIT分子和非TIGIT分子)。在一些方面，多特异性抗体结合两种不同的表位(即，“双特异性抗体”)。在一些方面，多特异性抗体结合三种不同的表位(即，“三特异性抗体”)。在一些方面，多特异性抗体结合四种不同的表位(即，“四特异性抗体”)。在一些方面，多特异性抗体结合五种不同的表位(即，“五特异性抗体”)。在一些方面，多特异性抗体结合6种、7种、8种或更多种不同的表位。每种结合特异性可以以任何合适的价存在。
“单特异性抗体”是包含一个或多个特异性结合单个表位的结合位点的抗体。单特异性抗体的实例是天然存在的IgG分子，其虽然是二价的(即具有两个抗原结合结构域)，但在两个抗原结合结构域的每一个上识别相同的表位。结合特异性可以以任何合适的价存在。
术语“单克隆抗体”是指来自基本上同质的抗体的群体的抗体。除了在单克隆抗体生产过程中通常可能出现的变体之外，基本上同质的抗体群包含基本上相似并且结合一个或多个相同的表位的抗体。此类变体通常仅少量存在。单克隆抗体通常通过包括从多种抗体中选择单一抗体的方法获得。例如，选择过程可以是从多个克隆(诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆、酵母克隆、细菌克隆或其它重组DNA克隆的池)中选择独特的克隆。可以进一步改变所选抗体，例如，提高对靶标的亲和力(“亲和力成熟”)，使抗体人源化，提高其在细胞培养物中的产量，和/或降低其在受试者中的免疫原性。
术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同来源或物种的抗体。
非人抗体的“人源化”形式是包含源自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体通常是人抗体(受体抗体)，其中来自一个或多个CDR的残基被来自非人抗体(供体抗体)的一个或多个CDR的残基替代。供体抗体可以是任何合适的非人抗体，诸如具有所需特异性、亲和力或生物效应的小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类动物抗体。在一些情况下，受体抗体的选定框架区残基被供体抗体的相应框架区残基替代。人源化抗体还可包含不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。可以进行此类修饰以进一步精炼抗体功能。关于更多细节，参见Jones等人，Nature,1986,321:522-525；Riechmann等人，Nature,1988,332:323-329；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,1992,2:593-596，所述文献中的每一篇均通过引用以其整体并入。
“人抗体”是指具有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列，或来源于利用人抗体库或人抗体编码序列(例如，获自人来源或从头设计的)的非人来源的抗体。人抗体专门排除人源化抗体。
在实施方案中，与本文所述组合物一起提供的抗体或抗原结合蛋白靶向特定的宿主细胞类型。在实施方案中，所述抗体或抗体结合非宿主细胞，诸如细菌或真菌细胞。在实施方案中，抗体或ADP至少是双特异性的，并结合至少两种宿主靶标在实施方案中，抗体或ADC至少是双特异性的，并且结合至少一种宿主靶标和一种非宿主靶标。在实施方案中，抗体或ADP是单特异性或双特异性的。在实施方案中，抗体是三特异性或四特异性的。
在实施方案中，抗体激动受体。在实施方案中，抗体拮抗受体。
在实施方案中，本文提供的组合物还包含用于递送的细胞。在一些实施方案中，细胞源自它们被施用到其中的受试者。在一些方面，细胞源自除它们被用至其中的受试者外的来源。在一些方面，细胞源自细胞系。在一些方面，细胞源自人来源。在一些方面，细胞源自人源化动物来源。
在一些方面，所提供的细胞是干细胞。
在一些方面，所提供的细胞是脂肪细胞(脂肪细胞(adipocyte))。在一些方面，所提供的细胞是肌肉细胞、神经细胞、皮肤细胞或器官细胞。在一些方面，所提供的细胞是肝细胞、胰腺细胞、心脏细胞、肺细胞、食管细胞、内皮细胞或上皮细胞。
在一些方面，所提供的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中提供的免疫细胞是T细胞或B细胞。在一些实施方案中，所提供的细胞是CD-8+T细胞。在一些实施方案中，所提供的细胞是CD-4+T细胞。
在一些方面，所提供的细胞产生有用的物质，诸如胰岛素、胶原蛋白或抗体。在一些实施方案中，这种能力是通过重组DNA引入的。
在一些实施方案中，本文提供的组合物还包含用于递送的小分子，其中小分子是生物活性物质。在一些实施方案中，小分子可在疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防中引起药理学活性或另一种直接效果，或者可以影响身体的结构或功能。
本发明的凝胶/水凝胶/纳米结构复合物还可包括组织修复剂，诸如许多生长因子，包括表皮生长因子(EDF)、PDGF和神经生长因子(NGF)。例如，组合物可包含EGF。表皮生长因子(EGF)是在观察到实验室小鼠的皮肤伤口似乎在允许小鼠舔伤口时愈合更快后发现的。这不仅仅归因于唾液中的一些杀菌剂(诸如溶菌酶)。一种特定的生长因子(现被称为EGF)被证明是促成该现象的原因。EGF与尿抑胃素(urogastrone)相同，并具有血管生成特性。转化生长因子-α(TGFα)非常相似，与同一受体结合，并在刺激上皮细胞再生(上皮形成)方面更有效。
因此，包含EGF/TGF的本发明的水凝胶可有利地用于加速伤口和烧伤愈合、减少瘢痕疙瘩疤痕形成(尤其是烧伤)、皮肤移植敷料和慢性腿部溃疡的治疗。
可用于本发明的组织修复剂包括许多生长因子，包括表皮生长因子(EDF)、PDGF和神经生长因子(NGF)。一般而言，促生长激素会影响1至4个组织。从此类蛋白质开发的许多产品都是靶向一种或另一种类型的创伤修复的，尽管还有其它适应症。下面进一步描述了一些最重要的组织生长因子。
本发明的凝胶/纳米结构组合物还可包含一种或多种生长因子，所述生长因子可用于本发明的组织修复方法和其它应用。
例如，本发明设想在本发明的组合物中包含PDGF。血小板衍生生长因子(PDGF)是几乎所有间充质衍生细胞(即血液、肌肉、骨骼、软骨和结缔组织细胞)的促分裂原。其是一种二聚糖蛋白，以AA或BB同二聚体或AB异二聚体的形式存在。与许多生长因子一样，PDGF现在被认为是更大的因子家族的成员。除了PDGF以外，该家族还包括同二聚因子血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PIGF)、VEGF/PIGF异二聚体和结缔组织生长因子(CTGF)(一种由人血管内皮细胞和成纤维细胞分泌的PDGF样因子)。与NGF、TGFβ和糖蛋白激素诸如人绒毛膜促性腺激素(hCG)一起，PDGF现在被归类为半胱氨酸结生长因子超家族的成员。所有这些因子都可以与本发明的水凝胶结合使用。
PDGF由血小板产生，在血液凝固过程中释放。其只是来源于这些细胞的生长因子之一。PDGF将成纤维细胞和白细胞吸引到损伤部位，并刺激替代结缔组织(主要是成纤维细胞和平滑肌细胞)的生长。其刺激各种细胞(包括产生胶原蛋白的细胞)的细胞分裂，从而促进血管生成。其还刺激有丝分裂发生、血管收缩、趋化作用、酶活性和钙动员。
可将血小板衍生生长因子在使用本发明组合物的某些治疗过程中用于恢复骨和软组织再生，以及用于加速慢性和急性伤口的愈合过程。因此，本发明的水凝胶/纳米结构组合物可以有利地包含血小板衍生生长因子混合物。
例如，可将本发明的水凝胶/纳米结构组合物在基因疗法中用于局部递送PDGF基因。将编码PDGF的质粒DNA掺入水凝胶基质中，并且起源于伤口周围的活组织的肉芽组织成纤维细胞增殖并迁移到基质中，作为质粒基因转移和表达的靶标。
本发明的水凝胶/纳米结构组合物还可包含VEGF以促进血管生成。血管内皮生长因子(VEGF--也称为血管通透性因子(vascular permeability factor))是另一种血管生长因子，其为多功能的血管生成细胞因子。其通过在微血管水平刺激内皮细胞的增殖，导致它们迁移并改变其一般表达，间接和直接促进血管生成(血管生长)。VEGF还使这些内皮细胞通具有高渗透性，导致它们向血管空间外释放血浆蛋白，从而导致该区域的变化，从而促成血管生成。
本发明的组合物还可包含FGF。成纤维细胞生长因子(FGF)实际上是属于肝素结合生长因子家族的至少19 14 18kD肽的家族，并且是培养的成纤维细胞和血管内皮细胞的促有丝分裂因子。它们在体内也是生成血管的，并且这种血管生成性被TNF增强。可以以与EGF相似的方式使用FGF。bFGF，也称为FGF-2，参与控制人巨核细胞生成，已证明FGF能有效刺激内皮细胞的形成，并有助于结缔组织的修复。
水凝胶/纳米结构组合物还可包含角质形成细胞生长因子(KGF)，也称为FGF-7，用于伤口愈合和其它涉及上皮细胞破坏的病症。
转化生长因子(TGF)具有转化各种细胞系的能力，并且可以赋予例如在培养物中生长超过有限代数的能力、在多层而不是单层中生长的能力以及获得异常核型的能力。TGF家族至少有五个成员，其中研究最广泛的是TGF-α和TGF-β。前者对于成纤维细胞和内皮细胞具有促有丝分裂活性，促进血管生成，并促进骨吸收。组合物还可包含TGF。TGF-β是细胞调节的一般介质，是细胞生长的强有力的抑制剂，并抑制许多细胞类型的增殖。TGF-β可拮抗其它肽生长因子的促有丝分裂作用，并且还可抑制许多肿瘤细胞系的生长。TGF-β还具有血管生成作用，并促进成纤维细胞中胶原蛋白的形成。关于本发明的水凝胶类的适应症包括慢性皮肤溃疡，诸如糖尿病患者的神经营养性足部溃疡。其它领域包括伤口愈合、骨修复和免疫抑制性疾病。
例如，本发明的水凝胶/纳米结构组合物可用于携带合适的细胞。可将这些在即将施用于伤口或其它合适的区域时掺入凝胶中，以使功效最大化。合适的细胞包括自体成纤维细胞和角质形成细胞，所述细胞主要负责真皮和表皮的形成。各自包含一种细胞类型的单独的凝胶可以连续或一起施用，或者一种凝胶可包含两种细胞类型，但这通常是不太优选的。
例如，本发明的水凝胶/纳米结构组合物可以有效地包含胶原蛋白。虽然这种形式的胶原蛋白不太可能提供有用的结构功能，但其主要用作其中蛋白水解活性不期望地高的牺牲蛋白，从而例如有助于防止健康组织的浸软。
水凝胶/纳米结构组合物还可包含某些酶。酶用于急性和慢性伤口的清创。清创是从伤口中清除不可存活的组织和异物，是伤口修复过程中自然发生的事件。在炎症阶段，中性粒细胞和巨噬细胞消化“用过的”血小板、细胞碎片和无血管损伤组织并将其从伤口区域清除。然而，随着大量受损组织的累积，这一自然过程变得不堪重负和不足。坏死组织的积聚然后会对伤口产生相当大的吞噬需求，并延缓伤口愈合。因此，坏死组织的清创是局部疗法的一个特殊目标，也是最佳伤口处理的一个重要组成部分。
例如，可将酶掺入本发明的水凝胶中用于局部应用，以提供选择性清创方法。合适的酶可源自各种来源，诸如磷虾、螃蟹、木瓜、牛提取物和细菌。商购可得的合适的酶包括胶原蛋白酶、木瓜蛋白酶/尿素以及纤维蛋白溶酶(fibrinolysin)和脱氧核糖核酸酶的组合。
用于本发明的酶通常以两种方式之一起作用：通过直接消化脱落物的组分(例如，纤维蛋白、细菌、白细胞、细胞碎片、浆液渗出物、DNA)；或者，通过溶解将无血管组织固定到下面的创面床(wound bed)上的胶原蛋白“锚”。
如果需要，本发明的水凝胶可包含达金溶液(Dakin's solution)，通常用于发挥抗微生物作用和气味控制。作为清创剂，达金溶液是非选择性的，因为其具有细胞毒性性质。达金溶液使蛋白质变性，使其更容易从伤口中除去。脱落物的松脱也有利于通过其它方法进行清创。如果目标是清创，则包含达金溶液的水凝胶可以每天更换两次。例如，伤口周围皮肤保护通常应配备软膏、液体皮肤屏障膜敷料或固体皮肤屏障干胶片(wafer)。
本发明的凝胶可通过任何合适的方法递送，所述方法为诸如通过注射器或波纹管组件(bellows pack)(单剂量递送系统)或多剂量系统，诸如加压递送系统或通过“罐中袋”型系统的递送(诸如WO98/32675中所公布的)。波纹管组件的实例示于公布的英国设计第2082665号中。
因此，本发明还扩展到用于治疗伤口的包含根据本发明的凝胶的单剂量递送系统。本发明还扩展到加压递送系统，其包括在气雾剂容器中的根据本发明的凝胶和根据本发明的加压的水凝胶，所述气溶胶容器能够在从其释放压力时形成喷雾。使用此类递送装置可使凝胶被递送至患者身上原本通过直接施加难以到达的区域，诸如当患者躺下时患者背部的区域。
在某些实施方案中，使本发明的水凝胶组合物导电以用于生物医学电极和其它电疗环境(即，将电极或其它导电部件附着至身体表面)可以是有利的。例如，水凝胶组合物可用于将经皮神经刺激电极、电外科返回电极或EKG电极附着到患者的皮肤或粘膜组织。这些应用涉及水凝胶组合物的改性，以便包含导电物质。合适的导电物质是离子导电电解质，特别是通常用于制造用于施加到皮肤或其它身体表面的导电粘合剂的那些，并且包括可电离的无机盐、有机化合物或两者的组合。离子导电电解质的实例包括但不限于硫酸铵、乙酸铵、单乙醇胺乙酸酯、二乙醇胺乙酸酯、乳酸钠、柠檬酸钠、乙酸镁、硫酸镁、乙酸钠、氯化钙、氯化镁、硫酸钙、氯化锂、高氯酸锂、柠檬酸钠和氯化钾，以及氧化还原对，诸如铁盐和亚铁盐(诸如硫酸盐和葡糖酸盐)的混合物。优选的盐是氯化钾、氯化钠、硫酸镁和乙酸镁，对于EKG应用，氯化钾是最优选的。尽管本发明的粘合剂组合物中实际上可以存在任何量的电解质，但优选存在的任何电解质的浓度在约0.1重量％至约15重量％的水凝胶组合物的范围内。属于Nielsen等人的美国专利第5,846,558号中描述的用于制造生物医学电极的程序可适用于本发明的水凝胶组合物，并且关于制造细节，该专利的公开内容通过引用并入。如本领域技术人员所理解的，也可使用其它合适的制造程序。
交联
对于某些应用，特别是当需要高内聚强度时，可共价交联本发明的凝胶/水凝胶的聚合物。本公开设想了凝胶/水凝胶组分的聚合物之间可能需要交联，而且凝胶/水凝胶的聚合物与本发明复合材料的纳米结构组分之间也可能需要交联。本发明设想了用于将聚合物彼此交联以及将凝胶/水凝胶聚合物与本发明的纳米结构组分交联的任何合适的手段。可将凝胶/水凝胶聚合物分子内或分子间或通过共价键共价交联至其它聚合物或纳米结构。在前一种情况下，不存在将聚合物彼此连接或与纳米结构连接的共价键，而在后一种情况下，存在将聚合物彼此连接或与纳米结构连接的共价交联。可使用任何合适的手段，包括使用热、辐射或化学固化(交联)剂来形成交联。交联度应足以消除或至少最小化压缩下的冷流。交联还包括使用第三种分子，即交联过程中使用的“交联剂”。
“交联剂(Cross-linker)”或“交联剂(Cross-linking agent)”可以例如适当地选自由以下组成的组：聚(乙二醇)PEG，例如巯基化的聚(乙二醇)、聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)或其衍生物。
对于热交联，使用自由基聚合引发剂，并且所述引发剂可以是在乙烯基聚合中常规使用的任何已知的产生自由基引发剂。优选引发剂是有机过氧化物和偶氮化合物，通常用量为约0.01重量％至15重量％、优选0.05重量％至10重量％、更优选约0.1重量％至约5％、最优选约0.5重量％至约4重量％的可聚合材料。合适的有机过氧化物包括诸如叔丁基过氧化物和2,2-双(叔丁基过氧)丙烷的二烷基过氧化物、诸如苯甲酰基过氧化物和乙酰基过氧化物的二酰基过氧化物、诸如过苯甲酸叔丁酯和过-2-乙基己酸叔丁酯的过酸酯、诸如过氧化二碳酸联十六烷基酯和过氧化二碳酸二环己基酯的过二碳酸酯、诸如环己酮过氧化物和甲基乙基酮过氧化物的酮过氧化物、诸如枯烯氢过氧化(cumene hydroperoxide)和叔丁基氢过氧化物的氢过氧化物。合适的偶氮化合物包括偶氮双(异丁腈)和偶氮双(2,4-二甲基戊腈)。用于热交联的温度将取决于实际的组分，并且可由本领域普通技术人员容易地推断出，但通常在约80℃至约200℃的范围内。
交联还可通过通常在光引发剂存在的情况下利用辐射来完成。辐射可以是紫外线、α射线、β射线、γ射线、电子束和x射线辐射，尽管紫外线辐射是优选的。有用的光敏剂是“夺氢”类型的三线态敏化剂，包括二苯甲酮和取代的二苯甲酮以及苯乙酮诸如苄基二甲基缩酮、4-丙烯酰氧基二苯甲酮(ABP)、1-羟基-环己基苯基酮、2,2-二乙氧基苯乙酮和2,2-二甲氧基-2-苯基乙酰苯，取代的α-酮醇诸如2-甲基-2-羟基苯丙酮、安息香醚，诸如安息香甲醚和安息香异丙醚，取代的安息香醚诸如茴香醚甲醚、芳族磺酰氯诸如2-萘磺酰氯，光敏肟类诸如1-苯基-1,2-丙二酮-2-(O-乙氧基-羰基)-肟，包括烷基和卤素取代的噻吨酮诸如2-异丙基噻吨酮、2-氯噻吨酮、2,4二甲基噻吨酮、2,4二氯噻吨酮和2,4-二乙基噻吨酮在内的噻吨酮类和酰基膦氧化物。波长为200至800nm，优选200至500nm的辐射优选用于本文，并且在大多数情况下低强度紫外光足以诱导交联。然而，对于夺氢类型的光敏剂，可能需要更高强度的紫外线暴露来实现充分的交联。这种暴露可由汞灯处理器诸如可从PPG,Fusion,Xenon等获得的那些处理器提供。交联也可通过用γ辐射或电子束照射来诱导。合适的照射参数，即用于实现交联的辐射的类型和剂量，对本领域技术人员来说是显而易见的。
合适的化学固化剂，也称为化学交联“促进剂”，包括但不限于聚合物硫醇，诸如2,2-二巯基二乙醚、二季戊四醇六(3-巯基丙酸酯)、乙烯双(3-巯基乙酸酯)、季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)、季戊四醇四巯基乙酸酯、聚乙二醇二巯基乙酸酯、聚乙二醇二(3-巯基丙酸酯)、三羟甲基乙烷三(3-巯基丙酸酯)、三羟甲基乙烷三硫代乙醇酸酯、三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)、三羟甲基丙烷三硫代乙醇酸酯、二硫代乙烷、二或三硫代丙烷和1,6-己烷二硫醇。将交联促进剂加入到未交联的亲水聚合物中以促进其共价交联，或者加入到未交联的亲水聚合物和互补低聚物的共混物中，以提供两种组分之间的交联。
聚合物和/或纳米结构也可在与互补寡聚物混合之前交联。在这种情况下，可以优选通过将单体前体与多官能共聚单体混合并共聚合来合成交联形式的聚合物。单体前体和相应聚合物产物的实例如下：用于聚(N-乙烯基酰胺)产物的N-乙烯基酰胺前体；用于聚(N-烷基丙烯酰胺)产物的N-烷基丙烯酰胺；用于聚丙烯酸产物的丙烯酸；用于聚甲基丙烯酸产物的甲基丙烯酸；用于聚(丙烯腈)产物的丙烯腈；和用于聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)产物的N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)。聚合可以在块状体中、悬浮液中、溶液中或乳液中进行。溶液聚合是优选的，极性有机溶剂诸如乙酸乙酯和低级链烷醇(例如，乙醇、异丙醇等)是特别优选的。对于亲水性乙烯基聚合物的制备，合成通常在如上所述的自由基引发剂存在的情况下通过自由基聚合过程进行。多官能共聚单体包括例如双丙烯酰胺、二醇如丁二醇和己二醇的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯(优选1,6-己二醇二丙烯酸酯)、其它丙烯酸酯诸如季戊四醇四丙烯酸酯和1,2-乙二醇二丙烯酸酯和1,12-十二烷二醇二丙烯酸酯。其它有用的多官能交联单体包括寡聚和聚合的多官能(甲基)丙烯酸酯，例如聚(环氧乙烷)二丙烯酸酯或聚(环氧乙烷)二甲基丙烯酸酯；聚乙烯基交联剂，诸如取代和未取代的二乙烯基苯；和双官能氨基甲酸乙酯丙烯酸酯，诸如EBECRYL 270和EBECRYL 230(分别为1500的重均分子量和5000的重均分子量的丙烯酸酯化的氨基甲酸乙酯，两者均可从UCB of Smyrna,Ga.获得)，及其组合。如果使用化学交联剂，用量优选使得交联剂与亲水性聚合物的重量比在约1:100至1:5的范围内。为了获得更高的交联密度，如果需要，将化学交联与辐射固化组合。
纳米结构
本发明的纳米结构组分可呈任何合适的形式，包括纤维、纤丝、网格区段(meshsection)、分枝纤丝或网络、薄片或成形的颗粒。纳米结构还可包含任何合适的化学官能团，以促进纳米结构与本发明水凝胶的聚合物之间的共价或非共价交联。制造和官能化纳米结构的方法、技术和材料在本领域是公知的。
在某些实施方案中，微细加工方法用于制造本发明的纳米结构。在各种实施方案中，所公开的装置可使用任何合适的微细加工技术来组装和/或制造。此类方法和技术在本领域中是众所周知的。
可用于制造本文公开的纳米结构的微细加工工艺包括光刻；蚀刻技术，诸如激光、等离子体蚀刻、影印石版术或化学蚀刻，诸如湿法化学去除、干法去除和光致抗蚀剂去除；或者通过无固体形式技术(solid free form technique)，包括三维印刷(3DP)、立体光刻(SLA)、选择性激光烧结(SLS)、弹道微粒制造(ballistic particle manufacturing)(BPM)和熔融沉积建模(fusion deposition modeling)(FDM)；通过微机械加工；硅的热氧化；电镀和化学镀(electroless plating)；扩散过程，诸如硼、磷、砷和锑的扩散；离子注入；薄膜沉积，诸如蒸发(灯丝、电子束、闪光、遮蔽和阶梯覆盖)、溅射、化学气相沉积(CVD)、外延(蒸气相、液相和分子束)、电镀、丝网印刷、层压(lamination)或通过其组合。参见Jaeger,Introduction to Microelectronic Fabrication(Addison-Wesley Publishing Co.,Reading Mass.1988)；Runyan等人，Semiconductor Integrated Circuit ProcessingTechnology(Addison-Wesley Publishing Co.,Reading Mass.1990)；Proceedings ofthe IEEE Micro Electro Mechanical Systems Conference 1987-1998；Rai-Choudhury，编辑，Handbook of Microlithography,Micromachining&Microfabrication(SPIEOptical Engineering Press,Bellingham,Wash.1997)。用作模具的材料的选择决定了如何配置表面以形成分支结构。
例如，可使用利用源自半导体工业的光刻工艺和方法制造微机电系统(MEMS)的现有技术工艺。最近开发的方法包括“软影印石版术(soft lithography)”(Whitesides等人，Angew chem.Int ed,37；550-575,(1998))和微流体构造学(美国专利第6,488,872号，Beebe等人，Nature；404:588-59(2000))。聚合物微装置制造的综述和其它论述包括Madou,M.J.Fundamentals of Microfabrication：The Science of Miniaturization；第2版；CRCPress：Boca Raton,1997；Becker,H.和Locascio,L.E.“Polymer microfluidic devices.”Talanta,56(2):267-287,2002；Quake,S.R.和Scherer,A.“Frommicro-tonanofabrication with soft materials.”Science,290(5496):1536-1540,2000；以及Whitesides,G.M.和Stroock,A.D.“Flexible methods for microfluidics.”PhysicsToday,54(6):42-48,2001，所述文献的每一篇均通过引用并入本文。
本发明的纳米结构也可通过静电纺丝(electrostatic spinning)(也称为静电纺丝(electrospinning))来制造。能够形成纤维的液体和/或溶液的静电纺丝技术是公知的，并且已描述于许多专利例如美国专利第4,043,331号和第5,522,879号中。静电纺丝工艺通常包括将液体引入电场，从而使液体产生纤维。通常以有吸引力的电势将这些纤维吸引到导体上以便收集。在液体转化成纤维的过程中，纤维变硬和/或变干。这种硬化和/或干燥可由液体冷却引起，即，其中液体在室温下通常是固体；由溶剂蒸发引起，例如，通过脱水(物理诱导的硬化)；或者由固化机制(化学诱导的硬化)引起。
静电纺丝的工艺通常是涉及使用纤维来制造垫子或其它无纺材料，如例如在美国专利第4,043,331号中公开的。直径从50nm到5微米的纳米纤维可被电纺成无纺纳米纤维网或定向纳米纤维网(aligned nanofiber mesh)。由于纤维直径小，电纺纺织品固有地具有非常高的表面积和小的孔径。这些特性使电纺织物成为许多应用的潜在候选物，所述应用包括：膜、组织支架和其它生物医学应用。
可产生具有非常细的直径的静电纺丝纤维。影响电纺纤维的直径、一致性和均匀性的参数包括聚合物材料和成纤组合中的交联剂浓度(负载)、施加的电压和针收集器距离。根据本发明的一个实施方案，纳米纤维的直径范围为约1nm至约100mm。在其它实施方案中，纳米纤维的直径在约1nm至约1000nm的范围内。另外，纳米纤维的纵横比可在至少约10至至少约100的范围内。应当理解，由于纤维的直径非常小，所以纤维具有高的表面积每单位质量。这种高表面积/质量比允许成纤溶液或液体在几分之一秒内从液体或溶剂化成纤材料转变成固体纳米纤维。
用于形成本发明纳米纤维/纳米结构的聚合物材料可以选自与交联剂相容的任何纤维形成材料。根据预期的应用，成纤聚合物材料可以是亲水性的、疏水性的或两亲性的。另外，成纤聚合物材料可以是热响应性聚合物材料。
合成的或天然的、可生物降解的或非可生物降解的聚合物可形成本发明的纳米纤维/纳米结构。“合成聚合物”是指合成制备的并且包括非天然存在的单体单元的聚合物。例如，合成聚合物可包括非天然单体单元，诸如丙烯酸酯或丙烯酰胺单元。合成聚合物通常通过常规聚合反应诸如加成、缩合或自由基聚合而形成。合成聚合物还可包括具有天然单体单元(诸如天然存在的肽、核苷酸和糖单体单元)与非天然单体单元(例如合成肽、核苷酸和糖衍生物)的组合的聚合物。这些类型的合成聚合物可通过标准合成技术，诸如通过固相合成，或者在允许的情况下通过重组产生。
“天然聚合物”是指天然地、重组地或合成地制备的并且由聚合物主链中天然存在的单体单元组成的聚合物。在一些情况下，可对天然聚合物进行修饰、加工、衍生或以其它方式处理以改变天然聚合物的化学和/或物理性质。在这些情况下，术语“天然聚合物”将被修饰成反映天然聚合物的变化(例如，“衍生的天然聚合物”或“去糖基化的天然聚合物”)。
纳米纤维材料例如可包括加成聚合物和缩合聚合物材料，诸如聚烯烃、聚缩醛、聚酰胺、聚酯、纤维素醚和酯、聚亚烷基硫醚、聚亚芳基氧化物、聚砜、改性聚砜聚合物及其混合物。这些通用类别中的示例性材料包括交联和非交联形式的聚乙烯、聚(ε-己内酯)、聚(乳酸酯)、聚(乙醇酸酯)、聚丙烯、聚(氯乙烯)、聚甲基丙烯酸甲酯(和其它丙烯酸树脂)、聚苯乙烯及其共聚物(包括ABA型嵌段共聚物)、聚(偏二氟乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、不同水解度的聚乙烯醇(87％至99.5％)。示例性加成聚合物往往是玻璃状的(Tg高于室温)。聚氯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯聚合物组合物或合金就是这种情况，或者聚偏二氟乙烯和聚乙烯醇材料的结晶度低。
在本发明的一些实施方案中，纳米纤维/纳米结构材料是聚酰胺缩合聚合物。在更具体的实施方案中，聚酰胺缩合聚合物是尼龙聚合物。术语“尼龙”是所有长链合成聚酰胺的通称。另一种尼龙可通过ε-己内酰胺在少量水存在下的缩聚来制备。该反应形成尼龙-6(由环状内酰胺--也称为ε-氨基己酸制成)，其为线性聚酰胺。另外，也设想了尼龙共聚物。共聚物可通过在反应混合物中组合各种二胺化合物、各种二酸化合物和各种环状内酰胺结构，然后在聚酰胺结构中形成具有随机定位的单体材料的尼龙来制备。例如，尼龙6,6-6,10材料是由六亚甲基二胺以及二酸的C6和C10共混物制成的尼龙。尼龙6-6,6-6,10是通过ε-氨基己酸、六亚甲基二胺以及C6和C10二酸材料的共混物的共聚合来制造的尼龙。
嵌段共聚物还可用作纳米纤维材料。在制备用于制备纳米纤维的组合物时，可以选择溶剂系统，使得两个嵌段都溶于溶剂。一个实例是二氯甲烷溶剂中的ABA(苯乙烯-EP-苯乙烯)或AB(苯乙烯-EP)聚合物。此类嵌段共聚物的实例是Kraton型的AB和ABA嵌段聚合物(包括苯乙烯/丁二烯和苯乙烯/氢化丁二烯(乙烯丙烯))、Pebax型的ε-己内酰胺/环氧乙烷和Sympatex型的聚酯/环氧乙烷以及环氧乙烷和异氰酸酯的聚氨酯。
加成聚合物如聚偏氟乙烯、间规聚苯乙烯、偏二氟乙烯和六氟丙烯的共聚物、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、无定形加成聚合物诸如聚(丙烯腈)及其与丙烯酸和甲基丙烯酸酯的共聚物、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)及其各种共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)及其各种共聚物可以相对容易地进行溶液纺丝，因为它们在低压和低温下是可溶的。高度结晶的聚合物，如聚乙烯和聚丙烯，如果它们要进行溶液纺丝，通常需要更高的温度和高压溶剂。
纳米纤维还可由在聚合物混合物、合金形式中或化学交联键合的结构中包含两种或更多种聚合物材料的聚合物组合物形成。可将两种相关的聚合物材料共混以提供具有有益性质的纳米纤维。例如，可将高分子量聚氯乙烯可以与低分子量聚氯乙烯共混。类似地，可将高分子量尼龙材料与低分子量尼龙材料共混。另外，可将一般聚合物属(generalpolymeric genus)的不同种类共混。例如，可将高分子量苯乙烯材料与低分子量、高抗冲聚苯乙烯共混。可将尼龙-6材料与尼龙共聚物诸如尼龙-6；6,6；6,10共聚物共混。另外，可将具有低水解度的聚乙烯醇，诸如87％水解的聚乙烯醇，与具有98％至99.9％和更高水解度的完全或超水解的聚乙烯醇共混。所有这些混合材料都可以使用适当的交联机制进行交联。尼龙可使用与酰胺键联中的氮原子反应的交联剂进行交联。聚乙烯醇材料可使用羟基反应性材料交联，所述羟基反应性材料为诸如单醛(诸如甲醛、尿素、三聚氰胺-甲醛树脂及其类似物)、硼酸和其它无机化合物、二醛、二酸、氨基甲酸酯、环氧树脂和其它已知的交联剂。交联剂反应并在聚合物链之间形成共价键，以显著提高分子量、耐化学性、整体强度和抗机械降解性。
可生物降解的聚合物也可用于制备本发明的纳米结构。已被作为可生物降解材料研究的合成聚合物的种类的实例包括聚酯、聚酰胺、聚氨酯、聚原酸酯、聚己内酯(PCL)、聚亚氨基碳酸酯、脂肪族碳酸酯、聚磷腈、聚酐及其共聚物。可与例如可植入医疗装置结合使用的可生物降解的材料的具体实例包括聚丙交酯、聚乙交酯、聚二噁烷酮、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物、聚(乙交酯-聚二噁烷酮)共聚物、聚酐、聚(乙交酯-碳酸三亚甲基酯)共聚物和聚(乙交酯-己内酯)共聚物。还可使用这些聚合物与其它可生物降解聚合物的共混物。
在一些实施方案中，纳米纤维是非可生物降解聚合物。非可生物降解的是指通常不能被非酶促、水解或酶促降解的聚合物。例如，非可生物降解的聚合物抵抗可能由蛋白酶引起的降解。非可生物降解的聚合物可包括天然或合成聚合物。
在形成纳米纤维的组合物中包含交联剂，使得纳米纤维与广泛的支撑表面相容。交联剂可以单独使用或与其它材料组合使用，以提供所需的表面特性。
合适的交联剂包括单体(小分子材料)或具有至少两个潜在活性可活化基团的聚合物材料，当受到能量源诸如辐射、电能或热能时，所述基团能够与其它材料形成共价键。一般而言，潜在的反应性可活化基团是对特定施加的外部能量或刺激作出反应，以产生最终与相邻化学结构共价键合的活性物质的化学实体。潜在的活性基团是在储存条件下保持其共价键，但在外部能量源的激活下与其它分子形成共价键的基团。在一些实施方案中，潜在的反应性基团形成活性物质，诸如自由基。这些自由基可包括氮宾、卡宾或酮类的激发态(在吸收外部施加的电能、电化学能或热能时)。美国专利第4,973,493号、第5,258,041号、第5,563,056号、第5,637,460号或第6,278,018号中报道了已知的或商购可得的潜在反应性基团的各种实例。
例如，可使用可从Aldrich Chemicals、Produits Chimiques Auxiliaires et deSyntheses,(Longjumeau,France)、Shin-Nakamara Chemical、Midori Chemicals Co.,Ltd.或Panchim S.A.(France)获得的商购可得的基于三氯甲基三嗪的多功能光交联剂。八种化合物包括2,4,6-三(三氯甲基)-1,3,5三嗪、2-(甲基)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪、2-(4-甲氧基萘基)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪、2-(4-乙氧基萘基)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪、4-(4-羧基苯基)-2,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪、2-(4-甲氧基苯基)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪、2-(1-乙烯-2-2'-呋喃基)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪和2-(4-甲氧基苯乙烯基)-4,6-双(三氯甲基)-1,3,5-三嗪。
使用方法和示例性实施方案
本文公开的凝胶/水凝胶/纳米结构组合物可有利地用于许多组织修复情况，以及其它应用，诸如在导管和其它外科装置和植入物上提供涂层。本发明的凝胶/水凝胶/纳米结构组合物也可用于递送本文所述的活性剂，诸如抗生素、生长因子和免疫抑制剂。
在某些实施方案中，本发明提供了用于愈合软组织缺损的方法，包括将复合材料施加到软组织缺损，其中复合材料包含凝胶和布置在凝胶内的纳米结构。
应当理解，本文描述的水凝胶/纳米结构组合物的有利性质包括以下能力：1)提供容易的表征和质量控制；2)与现有组织基质整合；3)直接掺入新形成的基质中；4)直接包含细胞和生物活性因子；5)保持生物相容性；6)控制生物再吸收；7)由于归于纳米结构的更大结构刚性，容易铸造成复杂的解剖形状；以及8)表现出天然组织诸如关节软骨的机械性能。
在一个应用中，本发明的水凝胶/纳米结构复合物组合物可用于修复软骨组织。目前基于生物学的软骨修复手术程序包括自体软骨细胞植入、钻孔、磨损软骨成形术(abrasion chondroplasty)、微小骨折和镶嵌式关节成形术(mosaic arthroplasty)。所有这些程序只治疗局部关节软骨损伤，而不是诸如在严重的骨关节炎和类风湿性关节炎中看到的软骨裸露的关节表面。此外，他们使用软骨组织塞或从患者获取的扩增的软骨细胞来填充软骨缺损。这些组织或软骨细胞有望通过完全从头合成材料(诸如新合成的透明软骨)来填充缺损，所述从头合成的材料与现有软骨基质整合并具有正常软骨的生物力学性质。然而，此类程序都促进了修复组织(纤维软骨)而非真正的透明软骨的形成，并且对纤维软骨的进一步机械损伤被认为使关节易患骨关节炎。此外，内源性软骨作为修复材料的可用性非常有限，其获得会给患者带来其自身的风险和发病率。从前面的论述中可以明显看出，本文公开的所得水凝胶/纳米结构组合物为患有软骨退行性疾病的患者提供了用于有希望的新疗法的实用材料。
如本文中所述，本发明的水凝胶/纳米结构组合物可以制备成具有广泛变化的性质，适用于任何数量的合成组织植入或增大，以及其它临床应用。如已描述的，本发明的材料可用于修复由损伤或疾病导致的软骨缺损。可被如此修复的损伤造成的缺损可能与运动或事故相关，可能仅涉及表面软骨层，也可能包括底层软骨下骨。可使用本文所述组合物修复的疾病造成的缺损包括由骨关节炎和类风湿性关节炎引起的缺损。无论来自损伤还是疾病，此类缺损可存在于成熟软骨或生长板软骨中。用于合成生长板软骨的水凝胶制剂可能需要包含未取代的支架材料，以允许在生长过程中生物材料的受控生物吸收。
本文所述的水凝胶/纳米结构组合物可用于的另一个领域是修复、重建或增大头颈部的软骨组织以及软组织。用于软组织增大和头颈部重建的生物材料的可用性仍然是整形重建外科领域中的基本挑战。为了开发具有适当生物相容性和寿命的材料，已经进行了大量的研究和投资。这项研究的结果并不乐观。当置于具有免疫能力的动物体内时，目前提出的材料的结构完整性已被证明随着框架被吸收而失效。此外，尽管常规合成材料提供很好的使用寿命，但它们也存在某些不可避免的缺陷。例如，硅酮充满了对安全性和长期免疫相关作用的担忧。合成聚合物PTFE(gortex)和硅橡胶提供较少的组织反应性，但不提供组织整合，并且可代表异物感染和挤出的长期风险。在本申请中描述的材料将用于制备用于头颈部软组织缺损的增大或修复的合成软组织支架材料。特别地，为非炎性的、非免疫原性的并且可被制备成具有适当程度的粘弹性(参见本文的描述)的水凝胶/纳米结构组合物，可用作有效的可植入支架材料。
另外，本发明的水凝胶/纳米结构组合物可以例如用作制备软骨植入物的新型生物相容性和生物适合性(biocompliant)材料，所述软骨植入物经常用于头和颈的重建手术，以修复继发于创伤或先天性畸形的软骨或骨缺损。对耳的特殊应用包括耳成形术和耳廓再造术(auricular reconstruction)，其通常用于修复外伤、肿瘤(即，鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)和先天性缺陷(诸如小耳畸形)引起的软骨缺损。专门针对鼻子的应用包括鼻和鼻中隔的美容和重建手术。背侧隆鼻(Dorsal hump augmentation)、鼻尖、鼻罩和扩张器移植常用于美容鼻整形术。外伤、肿瘤、自身免疫性疾病(诸如韦格纳肉芽肿病)或先天性缺陷后的鼻重建需要软骨用于修复。中隔穿孔很难处理，通常治疗失败。软骨移植将对于这些应用是理想的，因为自体或供体软骨通常是无法获得的。专门针对咽喉的应用包括喉气管重建，这在儿童中通常需要获取肋软骨，这并非没有发病。耳软骨和中隔软骨通常不适合这种应用。基于水凝胶合成的调谐参数，诸如试剂浓度、置换和交联速率，可以合成由本文公开的水凝胶制备的合成软骨材料，以适合前述应用中的每一种。通常对声门下狭窄或气管狭窄引起的气道变窄进行喉气管重建。病因学可以是创伤性的(即，插管创伤或气管切开术)或是特发性的。除了许多颅面应用以外，其它的可能性还包括下巴和脸颊增大，以及用于下眼睑的外翻修复。应当注意的是，这些应用可以不需要具有关节软骨的严格机械性能的软骨。还可能需要包含细胞群或生物活性剂。
本文所述的水凝胶/纳米结构组合物也可用于修复和缩窄鼻腔(通常在过度侵袭性的手术切除后)，以防止流体在鼻腔通道中长期积聚而导致感染和结壳。另一个有前景的应用是儿童和成人的喉气管重建，这是由于例如由在诸如心血管手术之类的手术程序过程中进行的插管引起的喉气管损伤。本文所述的水凝胶/纳米结构组合物也可用于提供环状软骨环替代物，以在癌症颈部切除术后保护颈动脉--可将本发明的组合物置于颈动脉与皮肤之间，作为颈动脉防止皮肤屏障丧失的保护屏障。作为切除神经的神经元再增殖过程中的保护性涂层--纤维组织的形成通常比神经元的再增殖快，从而阻止了其最终形成。将神经末端放置在本发明的水凝胶/纳米结构组合物制管中可以从再增殖部位排除纤维组织的形成。
本发明的水凝胶/纳米结构组合物也可用于修复任何内部或外部器官的软组织缺损。例如，除了许多颅面应用以外，本发明的材料还可用于下巴和脸颊增大，以及用于下眼睑的外翻修复。对于除头颈部外的部位的美容和重建目的，例如用作用于隆乳的乳房植入物，用作伤口密封剂，例如用于填充乳腺或颈部的淋巴结切除(即，由于癌症)后留下的空隙，用于密封淋巴管和减少可导致感染和其它并发症的不受控制的流体至切除部位的引流。
除了上述用途之外，本文所述的水凝胶/纳米结构组合物可用于其它组织工程应用，以使用如上文针对人工软骨形式的合成所描述的类似策略和方法产生合成整形外科组织，包括但不限于骨、腱、韧带、半月板和椎间盘。水凝胶/纳米结构组合物也可用于使用如上文针对人工软骨形式的合成所描述的类似策略和方法制造合成的非整形外科组织，包括但不限于声带、玻璃体、心脏瓣膜、肝脏、胰腺和肾脏。
其中可使用本文公开的水凝胶/纳米结构组合物的另一个领域是胃肠道应用，其中需要治疗或预防腹部或胃肠器官中疤痕组织或狭窄的形成。已经有许多处于临床和FDA批准的不同阶段的产品，其通常被称为“水凝胶”，被设计成或旨在用于治疗和预防瘢痕形成和/或狭窄形成。本发明的材料优于其它已知的水凝胶，因为此处公开的材料可包含纳米结构，所述纳米结构可为水凝胶材料提供支撑、形状和强度。本文公开的水凝胶/纳米结构组合物可用于与使用或打算使用已知水凝胶类似的应用，包括以下应用：用于治疗胃肠道的狭窄或瘢痕形成。治疗包括在预期狭窄的部位注射水凝胶材料以防止瘢痕形成，或者在治疗后在现有狭窄部位注射水凝胶材料以扩大狭窄的GI以防止狭窄复发。
本发明的材料也可用于治疗食管狭窄。食管狭窄是胃食管反流病(GERD)的常见并发症。GERD病是由酸、胆汁和其它有害的胃内容物回流到食管并损伤食管衬细胞引起的。大约7-23％的GERD患者出现食管狭窄或食管的纤维瘢痕形成。食管瘢痕形成也可由用于治疗巴雷特食管的消融疗法引起。此类消融疗法的主要并发症是消融损伤延伸到食管壁太深，并导致食管瘢痕或狭窄。食管狭窄阻碍正常吞咽，是患者发病的主要原因。本文所述的材料可用于治疗或预防由GERD、巴雷特食管和食管消融疗法引起的食管狭窄。
本发明的复合材料也可用于治疗克罗恩病。克罗恩病会导致狭窄或疤痕，阻塞或缩窄肠道内腔，妨碍正常的肠道功能。本发明的材料可用于治疗或预防此类狭窄。
所述复合材料也可用于治疗原发性硬化性胆管炎(PSC)的方法。PSC是一种罕见的肝脏胆管疾病。胆管在肝脏内形成分支网络，并通过两个主要分支离开肝脏，将所述两个分支组合成总胆管，其将肝脏和胆囊中的胆汁排入十二指肠。胆管直径非常窄，通常在其最大最远端部位处只有2mm，但它们通常每天必须将数升胆汁从肝脏排入十二指肠。这些管道的任何堵塞都会导致称为黄疸的严重疾患，这使得许多毒素，特别是血红蛋白分解产物在体内积累。PSC是肝脏内胆管的和上述连接肝脏与小肠的肝外胆管中的瘢痕形成或变窄疾病(structuring disease)。可用本发明的水凝胶/纳米结构组合物治疗或预防PSC的胆管狭窄。
本发明的复合材料也可用于治疗慢性胰腺炎。慢性胰腺炎是胰腺的慢性炎症性疾病，其可因胰腺导管的疤痕或狭窄而变得加重。这些狭窄阻断了胰液的排出，胰液通常必须通过导管或引流导管系统排出胰腺，进入小肠。胰液含有许多消化酶和其它对正常消化和营养吸收重要的成分。慢性胰腺炎引起的胰管阻塞或变窄会导致严重的并发症，其中胰腺会自动消化并形成危及生命的腹部感染和/或脓肿。慢性胰腺炎的胰腺狭窄可用本发明的水凝胶治疗或预防。
目前描述的组合物也可用于治疗胆结石引起的胆管和胰管狭窄。胆结石是非常常见的病症，其主要并发症是胆管和胰管狭窄的形成，这可用用于治疗缺血性肠病的水凝胶来治疗或预防。当肠道的血液供应受到损害时，肠道容易形成疤痕或狭窄。受损血流被称为缺血，可由多种病理引起，所述病理包括心血管疾病、动脉粥样硬化、低血压、血容量不足、肾脏或肝脏疾病引起的低白蛋白血症、血管炎、药物引起的疾病和许多其它疾病。所有这些病因学的最终结果可导致肠道狭窄，阻塞肠道并阻止其正常功能。本发明的水凝胶/纳米结构复合物可用于治疗或预防缺血性肠狭窄。
本发明的组合物也可用于治疗辐射诱发的肠狭窄。癌症的放射疗法与许多病态相关，其中重要的是肠狭窄形成。本发明的水凝胶复合物可用于治疗或预防辐射诱发的肠狭窄。
除了制造合成组织或修复天然组织之外，本文公开的水凝胶/纳米结构复合物还可用于为用于手术或以其它方式用于体内植入的非生物结构或装置(诸如外科器械或者陶瓷或金属假体)提供涂层。这种涂层将在非生物装置材料和活组织之间提供屏障。水凝胶作为非生物装置的屏障的作用包括但不限于：1)防止非生物装置表面上的大分子和/或细胞的吸收，所述吸收可在装置表面上导致蛋白质污垢或血栓形成；2)为由其它非生物相容性材料制成的装置提供无毒、非炎性、非免疫原性、生物相容性表面；3)与装置功能(诸如葡萄糖传感器的葡萄糖扩散、压力传感器的机械力传递或血管移植物或支架的内皮化)的相容性；4)增强装置功能，诸如为基于MEMS的人工肾单位中的现有尺寸屏障提供电荷屏障；5)将截留在水性生理相容性环境中的活细胞群掺入非生物装置中；以及6)包含药物或生物活性因子(诸如生长因子)、抗病毒剂、抗生素或设计成促进装置的血管形成、上皮化或内皮化的粘附分子。
基于前述内容，本发明的水凝胶/纳米结构复合物可用于为各种可植入装置(包括用于糖尿病管理的可植入葡萄糖传感器)提供非过敏性涂层。另外，水凝胶/纳米结构复合物可用于：为基于MEMS的人工肾单位的开发提供电荷屏障；提供水性的、生理上相容的环境，其中可将植入的肾细胞诸如足细胞掺入到基于MEMS的人工肾单位设计中；以及为被设计用于多种目的的可植入MEMS装置提供涂层，所述目的包括但不限于药物递送、机械传感和作为生物检测系统。
还可例如通过酪胺的伯胺与硅表面的第一共价附接将所公开的水凝胶/纳米结构复合物，特别是基于透明质酸的水凝胶，共价附接至硅基装置上，以提供羟基苯基涂覆的表面化学。这可使用用于将已用游离胺修饰的DNA结合到硅表面的相同化学物质。然后通过上述其优选交联模式中使用的相同过氧化物酶驱动的化学将基于HA的水凝胶共价偶联到羟基苯基涂覆的表面。
水凝胶/纳米结构复合物也可用于涂覆非生物心血管装置，诸如导管、支架和血管移植物。这些将包括由由于其生物不相容性而通常不使用的材料制成的装置，但所述装置具有优于目前使用的那些装置的设计特征。可将生物活性因子掺入水凝胶中，以促进水凝胶的内皮化或上皮化，从而促进植入装置的内皮化或上皮化。
尽管本文已经描述了本发明的水凝胶/纳米结构复合物的特定实例和用途，但此类具体用途并不意味着是限制性的。本发明的水凝胶/纳米结构复合物可用于通常用于已知水凝胶的任何应用，特别是用于身体任何部位的软组织的修复和/或再生。
实施例
实施例1.炎症分布减少的原位形成复合物
开发了原位形成复合物，其包含5mg/mL的巯基化的HA(HA-SH)、10mg/mL的聚己内酯(PCL)纤维，并且PEGDA的浓度被设置成使硫醇浓度与丙烯酸酯和马来酰亚胺的组合浓度(5mg/mL)按1:1匹配。手术前约30分钟将各组分混合在一起进行反应，以便开始胶凝化，其中大部分胶凝化原位完成。
虽然在体外和动物(啮齿动物和兔通过皮下(s.c.)注射)中实现了胶凝化的成功，但当在皮下兔模型中注射时，利用巯基化-HA的化学制剂引起短期中度炎症。为了产生具有减少的炎症的复合物制剂，使HA与PEG之间的反应性基团逆转，保持包含纤维-马来酰亚胺组分的早期制剂。
如图1A所示，向上的箭头表示含有HA-SH和PEGDA的凝胶的注射部位；而向下的箭头表示含有HA-Ac和PEGSH的替代组合物的注射部位。
当在猪模型中再次测试化学物质时，观察到类似的炎症分布。将凝胶和复合物以每次注射400μL的体积皮下注射到猪大腿内侧。在随后的48小时内对组织进行成像，然后获取组织。所有组的皮肤炎症在肉眼看来都是良性的(图1B)。
然而，在组织学分析(马森氏三色染色(Masson’s Trichrome staining))下，在巯基化-HA组中显示出强烈的急性(48小时)免疫反应，因为注射部位被宿主组织与注射剂之间的确定边界包裹，如通过注射部位周围的单核细胞活化所显现的(红色)(图1C)。HA丙烯酸酯(HA-Ac)组与HA商业阴性对照组更加相似，在宿主-植入物界面处几乎未显示包裹。
新制剂使用5mg/mL HA-Ac和6mg/mL PEGSH(PEG硫醇；4-臂10k MW PEGSH，其中硫醇的量为丙烯酸酯+马来酰亚胺的两倍，因为该比率提供了最大的机械强度)。HA-Ac的分子量为731k Da，丙烯酸酯化度为10-12.5％。另外，还尝试了200k的HA-Ac，但所得的凝胶要弱得多。
为了进一步减少兔中的炎症分布，以1:1的硫醇与丙烯酸酯+马来酰亚胺的化学计量比使用了2-臂PEGSH交联剂。为了获得所需的储能模量，使用了7mg/mL的稍高初始浓度的HA-Ac。将纤维组分保持在8-10mg/mL，并将2-臂PEGSH设置成具有1:1的化学计量，使5kPEGSH等同于6.9mg/mL。还测试了分子量为3.4kDa和8kDa的PEGSH样品，但它们在相同的化学计量下是较弱的凝胶，选择5kDa MW作为原位胶凝化制剂。
将磁共振成像(MRI)用于评估该制剂的两种变型(基于5.5mg/mL HA-Ac的较软制剂和基于7.5mg/mL的较硬制剂；图1D，表2)。如图所示，与商业
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对照相比，几乎未观察到术后溶胀。在目标刚度范围(stiffness regime)的两端配制所测试的两种复合物(表1)。这些制剂在刚度上与
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的两种经测试的变型：
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和
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相似，证明了本文公开的复合物的可调性。
表2：公开了在大鼠研究中测试的两种复合物的配方细节。
复合物–硬-1 复合物–软-1
HA-Ac 7.50mg/ml 5.50mg/ml
纤维 10.4mg/ml 11.0mg/ml
PEG-SH 4.02mg/ml 3.15mg/ml
所得剪切模量 255帕 100帕
如图1E所示，复合物与商业对照相比的体积保持率(volume retention)也通过MRI定量来评估，显示出与商业对照相比，本发明的复合物的炎症减少。
实施例2.具有新组成的预反应的复合物珠粒
为了提高储存稳定性并使凝胶对最终用户更简单和更一致，将凝胶形成为包含预反应的珠状制剂，其中使制剂(7mg/mL HA-Ac、8至10mg/mL的具有马来酰亚胺的纤维和6.9m/mL的PEGSH)在37℃下于块状形式完全反应。通过在制造过程中对凝胶进行预反应，不需要保护不稳定的官能团，并且不再需要最终用户进行大量的混合和固化。
使块状凝胶形成150μm或250μm的珠粒，然后在蔗糖、海藻糖和氯化钠的等渗溶液中冻干(以在干燥过程中保护微结构并延长产品的货架期)。然后将凝胶珠粒用水复原，并在几秒钟内即可注射，其中储能模量与冻干前相同。珠状复合物的光学显微镜图像如图2所示。图2A显示了被特制化为直径250μm的珠粒后的复合物；图2B显示了被进一步冻干和再水合后的复合物，说明所述复合物保持了其原始外观；图2C是描绘LS珠状制剂的纳米纤维和水凝胶组分的10倍图像；图2D是非稀释状态下珠状制剂的光学显微镜图像。
请注意，将图2中所示的珠粒稀释100倍，以使珠粒可视化成为可能。在非稀释状态下，所得凝胶肉眼看起来与其中单个珠粒是不可辨别的珠化前状态相同(图2D)。这一澄清对于提出的作用机制很重要。来自宿主的浸润细胞以与天然细胞外基质(ECM)相似的方式与复合材料相互作用。冻干的珠粒可在几秒钟内被再水合，并具有一致的凝胶性质，对最终用户来说具有长的工作时间。珠粒尺寸、冻干过程和冻干制剂已被评估为在被破碎成珠粒、冻干、然后再水化后最好地保持与初始性质的一致性。冻干制剂是重要变量，因为在PBS中干燥的制剂的储能模量变化要大得多，这表明在微结构水平上发生了变化。初级干燥阶段需要保持在-30℃或更低的货架温度，以将珠粒保持为单个颗粒—较高的冻干温度会导致无法再被吸入注射器的固体材料塞。图2E描绘了珠化和冻干对上述复合物的储能模量没有影响。
实施例3.不同尺寸的复合物珠粒的流变性质的测定
使用网眼尺寸为1mm、250μm、150μm和90μm的筛制备不同尺寸的珠粒。对颗粒的可注射性(由整形外科医生评估)和流变性质进行了评估。1000μm的珠粒是不可注射的，因为它们的直径比25号针的孔径大得多，而90μm的珠粒在珠化过程中受到严重损坏；因此，两种尺寸都被排除在进一步研究之外。250μm和150μm的珠粒组都通过27号针顺畅注射。这些珠粒尺寸与相关针尺寸的内径大小相似(25号针＝250μm，27号针＝210μm，30号针＝160μm)。250μm和150μm珠粒的流变性质如图3所示。当固体材料塞形成珠粒时，储能模量略有下降，但所得的珠粒在我们的目标刚度范围内，并且可通过改变初始配方使其更硬或更软。250μm和150μm的珠粒显示出相似的流变性质，并且都适合于未来的研究。
实施例4.兔模型中与皮下注射的皮内反应性
接下来，在兔皮下注射模型中，将对珠状制剂针对Juvedérm
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进行了头对头测试。组织学检查后，对组织切片进行盲法评估[需要从CRO引进方法]。表2显示了用于评估三种不同类别(炎症、水肿和纤维化)的切除样品的评定量表。这是ISO10993测试包中要求的一种类似的测试格式，用于对皮内反应性进行分级。如表3所示，与Juvedérm Voluma相比，本文公开的珠状制剂对炎症、水肿和纤维化的总体影响较低。
表2：由(Mass Histology,Worcester,MA)使用的半定量评定量表。
每个类别
无 0
最小 1
轻度 2
中等 3
严重 4
表3：LS珠粒状制剂和Juvéderm Voluma的半定量皮内反应性评估。
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实施例5.LS-1珠状复合物的表征。
最初珠状制剂LS-1(7mg/mL HA-Ac,7.1mg/mL PEGSH,10mg/mL纤维)的MRI结果与实施例1中描述的原位胶凝化制剂的MRI结果相似，所述MRI结果在大鼠模型中的持久性不足(图4A)。为了提高珠状LS-1制剂在体内的持久性，增加了HA-Ac和纤维组分的浓度，并增加了HA-Ac的分子量，以提高持久性，同时保持最佳的生物相容性特征。请注意，这些变化只能用预成型的纳米纤维-HA水凝胶复合物颗粒而不是以前的块状凝胶制剂来实现。为了测试增加HA的MW的效果，产生了使用平均MW为731kDa的HA的复合物。为了提高持久性，使用了来自与原始复合物所用来源相同的GMP来源的具有较高分子量的HA的复合物。如图4B所示，较高MW的复合物凝胶(1.55M Da和2.67M Da)与最初的较低分子量原型(731kDa)相比，具有稍高的储能模量，但仍可通过临床相关号的针完全注射。体内MRI测试证明了较高MW的复合物的持久性增强。
当优化原位形成复合材料配方时，使聚己内酯(PCL)纤维的负载量保持小于1％(溶胀复合物的w/v)，以便更容易通过31-G针注射块状水凝胶复合物。当优化预成型的复合物颗粒时，不太考虑可注射性。因此，研究了PCL纤维与HA水凝胶比率较高时PCL纳米纤维的增强效果。增加的纤维负载也可改善细胞通过基质的迁移，并增强胶原蛋白从浸润细胞的沉积。另外，PCL纤维组分最耐水解或酶降解过程。
为了测试HA浓度对剪切储能模量的影响，使用较高浓度的HA(以及较高浓度的PEG交联剂)以增加交联密度和刚度并延长耐久性。这种方法是第一次利用PEG交联剂。必须优化交联密度，以允许细胞浸润。如果刚度得到优化，那么颗粒化的复合物颗粒之间的空间也可促进细胞浸润和迁移。图4C显示了HA浓度(mg/ml)对在相同HA MW和纤维负载条件下制备的复合物的剪切储能模量的影响；图4D显示了HA浓度(mg/ml)对在相同HA MW和纤维负载条件下制备的复合物的压缩储能模量的影响。
为了组合具有不同交联密度和刚度的复合物颗粒，将具有高交联密度(刚度)和低交联密度(刚度)的预成型的复合物颗粒混合，两种类型颗粒的优点(更硬、降解更慢和更持久；与多孔性、更好的细胞浸润和血管形成)得以组合。两种类型的复合物颗粒的比率是另一个新型可调参数。
基于这些优化参数制备了14种LS制剂的变型，并在MRI体积保留模型中进行了测试(图6A，表4)。通过在啮齿动物研究中优化这些参数，我们恢复了可与现有商业标准相当的耐久性，同时保持了增强的组织向内生长和更加自然的感觉。请注意，许多LS-2至LS-14制剂仅通过转换到珠化前形式作为最终制剂进行实际考虑，并且在初始原位反应化学中是不可能的，因为凝胶刚度与原始LS-1制剂相比得以增加(在某些情况下显著增加)，如储能模量(帕)所示的。这项研究的代表性组如图4E所示。
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Voluma
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用作这项研究的商购对照。
表4：关于LS1制剂的LS-2至LS-14变型的表征
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实施例6.通过MRI和组织学分析对组织向内生长进行评价
通过MRI和组织学分析(图5A-图5B)对组织向内生长进行了表征，并与JuvédermVoluma填充剂进行了比较。由于如通过MRI分析所示的合成组织与宿主组织之间的含水量差异，支架呈现亮白色。随着时间的推移，注射部位周围的宿主组织开始浸润，形成新的组织。这可转化为半永久性注射物，其中支架保持存在足够长的时间以使宿主组织修复缺损部位，但被天然宿主组织重塑。这与常规HA水凝胶(无纤维)形成了直接对比，所述常规HA水凝胶由身体包裹的，并且只在填充剂能够承受降解机制的情况下才存在(图5B)。
如图5A和图5B所示，五个输入参数(水凝胶分子量、水凝胶改性度、水凝胶浓度、纳米纤维浓度和交联密度)已被改变，因为用于改善体内持久性和性能的参数尚待确定。在收集了78天的数据后(到目前为止，研究仍在进行中)，确定了对体积保留影响最大的输入参数。如图5C所示，线性回归模型的线性预测能力在第14天和第30天是可接受的(R2分别为0.95和0.86)。这些线性模型的贡献因子随着时间推移而变化。在14天的时间范围内，水凝胶浓度是最大的输入贡献因子。这可能是因为水凝胶在体内溶胀，因此较高浓度的凝胶比较低浓度的凝胶引起更多的溶胀。最有趣的是，纳米纤维浓度在注射后30天影响最大。纤维可能有助于引导组织向内生长，因此对于最佳性能复合物制剂中观察到的延长的体积保持至关重要。
实施例7.在大鼠模型中通过MRI评估溶胀
当与商业皮下填充剂诸如Juvedérm相比时，上述LS复合物珠粒的完全反应的颗粒化制剂显示出优异的溶胀性能。具体来说，在LS复合物中没有看到在啮齿动物MRI模型中对于Juvedérm注射观察到的显著术后溶胀，这使得临床医生更希望看到“所见即所得”的外观。对当前颗粒化的复合物形式的HA浓度、纤维负载和交联的持续优化正在进行中，预计将恢复与现有商业标准相当的耐久性，同时保持增大的体积、减少的溶胀和更自然的感觉。已在图6A-图6C中表征和绘制了溶胀程度。
Tanδ定量了能量损失和储存之间的平衡。更高的Tanδ表示更像液体的性质，而更低的tanδ表示更像固体的性质，无论模量或粘度如何。
Tan Delta(δ)＝G”/G’
G’：储能模量，测量弹性，即材料储存能量的能力。
G”：损耗模量，测量材料耗散能量的能力
珠粒状复合物的tanδ测量值(图7A)低于商购填充剂，同时保持了类似的刚度分布(图7B)。更像固体的性质反映了体内脂肪的性质，这是目前软组织重建的黄金标准(图7C)。
实施例8.通过珠状复合物设计实现的可注射制剂
利用珠状水凝胶设计实现了四种潜在的可注射制剂。
在一个实施方案中，可注射制剂包括在注射前立即复原的冻干粉饼的小瓶。这是类似于Botox注射中使用的工作流程的工作流程。
在另一个实施方案中，使用双注射器系统来再水合复合物。临床医生将连接两个注射器，再水合，然后立即注射制剂。
在另一个实施方案中，使用与单个注射器一起使用的制剂，其中将珠粒在包装期间于制造设备中再水合，并且在打开包装时准备注射。
在另一个实施方案中，将包含冻干粉的注射器与包含复溶液的小瓶一起提供。液体被从小瓶中吸出并进入注射器与粉末混合。
所有四个实施方案在高级开发测试中都显示出了希望。
实施例9.通过细胞递送的合成软组织
大型动物软组织缺损模型
前述实施例已根据皮下注射模型检查了功效和宿主组织反应，因为这些与其中公开的皮下填充剂产品最相关。为了进一步开发这项技术的用途，探索了用于重建手术的较大软组织缺损的修复。
使用10-mm活检穿孔器在新西兰兔的腹股沟脂肪垫中产生中等大小的缺损(圆柱体：φ-10mm×h-13mm；约1cc)，并且使用盐水置换方法来确保不同动物中去除的脂肪体积的一致性。1cc的体积大于目前用于软组织修复的单个脂肪移植物的推注量(bolus size)，并作为相关概念验证。原位形成和珠状复合物，或呈现缺损形状的对照水凝胶(图8A)。
对POD14(术后第14天)采集的组织样品的初步调查证实，宿主血管浸润到150帕的复合物中的程度比在POD 14浸润到80帕水凝胶中的程度显著更高。相比之下，150帕的水凝胶没有显示明显的血管向内生长到移植物中；并且在150帕的水凝胶与宿主组织之间似乎存在清晰的界限。在这项试点调查中，未将干细胞接种到复合物中，也未将自体脂肪移植物混合到复合物中。结果表明仅在复合物中存在血管向内生长。这也将是用于通过掺入细胞进行更大体积的软组织重建的模型。图8B显示了在POD 14宿主血管浸润到不同移植基质(150帕复合物、150帕水凝胶和80帕水凝胶)中。将内皮细胞用CD31染成红色，将细胞核用DAPI染成蓝色。将纤维用F8BT标记为绿色。比例尺：100μm。
下面强调的研究显示了在大型动物创伤模型中修复更大、更深软组织缺损的进展。
使用复合物珠粒的自体脂肪组织递送
研究了原位成型复合物与自体收获脂肪的组合作为新的合成软组织产品。所述方法为更大体积的重建提供了希望，而没有植入物失效和纤维化的风险。与目前临床使用的经处理的脂肪抽吸物相比，合成软组织具有增强的机械性能，更类似于体内脂肪(图9A)。在一些情况下，可将合成软组织产品与珠状复合物组合而不是原位成型复合物组合。
将合成软组织与脂肪以不同比率组合，以确定在体积保持、组织向内生长和可加工性(workability)方面的优化产品形式。数据表明与100％脂肪组相比在50％脂肪:50％复合物组中血管生成得以改善(通过红色和脉管系统肉眼鉴定的(图9B)；以及在显微镜下通过CD31染色鉴定的(图9C))。
实施例10.使用复合物珠粒的体内干细胞递送
复合物微珠的合成
使用Acr-HA(10mg/mL)、2-臂PEG-SH(15mg/ml)和MAL-PCL纳米纤维片段(30mg/mL)的混合物构建LS-14复合物珠粒。各组分均为脱水形式，在PBS中以相应的终浓度进行再水合，以达到所需的储能模量。在充分混合以确保纤维分散后，将样品装载到注射器中，并在37℃湿度控制室内保存至少4h至过夜，以使交联(胶化凝)完成。使用注射器迫使材料通过250μm网筛两次，以此处理完全胶凝化的复合材料。
然后将块状凝胶通过250μm网筛挤出，收集，并使用注射器使其第二次通过筛，以生成直径为约50–300μm的颗粒(图10B)。
人间充质干细胞(hMSC)在复合物珠粒上的接种
将人间充质干细胞(hMSC)以100万个细胞/mL的微粒接种到200rpm振荡器上的超低粘附96孔板或安装有低粘附12孔的旋转瓶中，以使细胞接种更均匀(图10B)。使用不同的孔板会影响细胞在LS珠粒上的分布(图10B)。例如，使用96孔悬浮板用复合物珠粒过夜培养细胞，主要得到细胞的表面包被层(图10A)。另一方面，使用安装有12孔的旋转瓶(图10C)可使细胞分布更均匀，并可使细胞渗透到珠粒的多孔支架中(图10D)。
溶液相中附着至复合物珠的细胞数量的测定
为了计算有多少细胞与微珠结合，每mL微珠接种100万个hMSC。通过上下抽吸充分混合hMSC和微珠，然后将它们以每孔100uL的分配到圆底非粘附性96孔板中。向每个孔中加入100uL温热的RoosterNourish-MSC-XF(KT-16)，并在培养期间将板在37℃培养箱中于5％CO2下置于转速为200rpm的振荡器板上。振荡30分钟至1小时后，从多个孔中收集细胞微珠上清液，以通过血细胞计数器测量非粘附细胞的数量-记录了非显著数量的细胞。因此，假设所有初始细胞均结合或捕获在微珠混合物中。
通过图像分析法测定附着至复合物珠粒的细胞数
随着时间的推移，hMSC可在微粒上附着和增殖。图10E显示hMSC在LS微珠上增殖以形成2D细胞培养物。如在图10E(a)中所看到的，珠粒的多孔特性导致表面积增加，从而使hMSC可在珠粒表面上生长并生长到珠粒核心中。
通过图像分析进行细胞定量。通过共聚焦显微镜和贯穿整个结构的z堆叠对微粒-hMSC(50+颗粒)进行单独成像，来确定图像定量的测量结果。使用DAPI染色测定细胞的存在，并将每颗粒的细胞数量制成表格(图10E(a))。通过颗粒面积乘以z堆叠总厚度的ImageJ分析确定颗粒体积。这样得到的细胞/体积测量结果示于细胞定量图(图10E(b)和(c))中。RGD肽改善了hMSC的细胞粘附性，并使细胞在颗粒上的倍增时间缩短。
脂肪来源hMSC至大鼠心肌内的递送
将LS-14复合物珠粒与RoosterBio MSC-021脂肪来源的hMSC在圆底、非粘附性96孔板中以100万个细胞/mL珠粒的密度培养3天。在第3天，在15mL试管中收集hMSC-LS珠粒，并以500rpm离心。抽吸上清液，并将hMSC-LS-14珠粒浆收集在1cc注射器中。
使用异氟醚麻醉200g雌性Sprague-Dawley大鼠，并使用缝合线结扎冠状动脉左前降支，导致在心脏的左心室中形成梗塞体积。使用25G针在3个位置将LS-14-hMSC材料注入左心室壁，每个位置20μL。随后缝合大鼠并且大鼠在4周内恢复，在该点处死大鼠，并将外植的心脏组织用于组织学研究。给大鼠心肌注射20uL LS-14珠粒/hMSC，所述LS-14珠粒/hMSC通过阳性GS4-同工凝集素B4染色显示出宿主组织的高细胞浸润和血管浸润(图10F)。
术后和治疗后4周，组织学分析显示，大鼠心肌表现出瘢痕组织形成和胶原沉积减少，添加hMSC进一步改善了心肌壁的完整性(图10G)。此外，与PBS注射组相比，壁变薄减少，这表明了与LS-14联用的hMSC递送可如何减少组织损伤并保持结构完整性。
在替代实施方案中，用hMSC接种具有不同纤维密度的各种复合物珠粒1-7天，然后注射到大鼠心肌中以评价细胞增殖、形态变化、迁移行为。
hMSC至大鼠皮下间隙的递送和新组织形成
如前所述制备了LS-14复合物珠粒。然后，用hMSC以100万个细胞/mL接种珠粒，并在96孔圆底非粘附性板中体外培养7天。通过1cc注射器中的25号针在大鼠腹侧4个部位以每处200μL皮下注射了hMSC-LS-14珠粒。在POD72，通过颈椎脱位处死大鼠，采集并处理样品以进行组织学染色(图10H)。虽然细胞浸润未显示出在POD72完全恢复到注射材料的核心，但宿主组织与移植物之间的界面显示在该区域中RECA-1(内皮细胞)染色呈阳性，并且细胞生长旺盛(图10H)。
在替代实施方案中，用hMSC接种具有不同纤维密度的各种复合物珠粒1-7天，然后在大鼠上皮下注射以评价细胞增殖、形态变化、迁移行为。
在植入部位通过MRI(磁共振成像)进行的体积保持测量
通过MRI测量，可通过测量每个切片上注射材料的面积来定量材料(例如复合物珠粒)的体积保持。第72天时进行MRI，以评估注射的微载体的体积保持。为了定量体积，使用ImageJ测量不透明注射材料占据的面积，并将其乘以每个图像切片的厚度。将面积积分以获得总体积。图10I显示了G1(第7天的LS-14/hMSC)、G2(第1天的LS-14/hMSC)、G3(第0天的原位LS-14/hMSC)、G4(第7天的无肽的LS-14/hMSC)、G5(LS-14)在POD72的体积保持。图10I显示块状体积大部分得到保留。
实施例11.在大鼠模型中皮下植入复合物珠粒
在13周时，从具有来自实施例5中的实验的LS-5复合物珠粒的大鼠体内采集组织样品。将组织样品固定、切片，并用H&E和马森氏三色染色法染色。H&E染色的组织学图像(图10J)显示了细胞的生长/浸润模式，所述模式概括了潜在的珠粒形态学。
在替代实施方案中，植入具有不同纤维密度的各种复合物珠粒，以评估细胞增殖、形态学变化、迁移行为。
实施例12.冻干方法和制剂的开发
上述实施例中描述的复合物结构的主要有利方面是，与本领域已知的大多数水凝胶组分相反，纤维-水凝胶复合物的纳米纤维相的机械性能在干燥或冷冻状态下变化很小。因此，在冷冻或冻干过程中，纤维部分可以有助于保持整个复合物的微结构。利用正确的冻干周期和配方，可冻干复合物，同时在再水合时仍然保持为独特的珠粒。
即使具有复合物结构，理想的冻干制剂和工艺也需要通过实验来确定。在本实施例中，在PBS中配制的7.3mg/mL 700kMW HA-丙烯酸酯、10mg/mL纳米纤维和8.18mg/mLPEGSH(5k 2-臂)在37℃培养箱中于5cc注射器中反应过夜。还将145μL溶液加入到三个直径为8mm的模具中进行流变性测试(图11A，图11D中的“预珠化”)。胶凝化后，通过迫使凝胶通过250μm的筛，将复合物凝胶制成珠粒。将珠粒注射到三个直径为8mm的模具中，并立即测试流变性(图11B，图11D中的“珠粒”组)。将剩余的珠粒体积在液氮中快速冷冻，并在
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烧瓶冻干机(
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6)上冻干48小时。冻干后，冻干饼小于冷冻溶液体积，表明样品没有在整个过程中保持冷冻。将珠粒再水合，以准确地代替损失的水质量(如按重量测量的)。所得复原的凝胶与冻干前有不同的性质—凝胶是两相性的，具有未被凝胶相完全吸收的过量水相。凝胶也不能通过抽吸加载到注射器中，因为微结构的变化使单个珠粒融合在一起。当测试流变性时(图11C，图11D中的“冻干后”组)，凝胶更硬得多，其中储能模量为珠化前凝胶的5.19倍，为珠化凝胶的6.39倍。这是由扩散的水凝胶结构塌陷成更致密的双相结构引起的。可注射性、物理性质和孔隙度都受到冻干过程的影响。
实施例13.改进的冻干方法和制剂的开发
如上所述，再次遵循相同的程序，但对冻干采取更多的控制，使用内置式冻干机(in-shelf lyophilizer)，以便在冻干过程中保持冻干样品更冷(低于冷冻样品的玻璃化转变温度)。在PBS中配制的7.3mg/mL 700kMW HA-丙烯酸酯、10mg/mL纳米纤维和8.18mg/mLPEGSH(5k 2-臂)在37℃培养箱中于5cc注射器中反应过夜。还将145μL的溶液添加到三个直径为8mm的模具中，以进行流变性测试(图12A-图12B中的“预珠化”)。胶凝化后，通过迫使凝胶通过250μm的筛，将复合物凝胶制成珠粒。将珠粒注入三个直径为8mm的模具中，并立即测试其流变性(图12A-图12B中的“珠粒”组)。将剩余的珠粒体积在-80℃的培养箱中冷冻，然后在-10℃的货架温度下放置在预冷的
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冻干机中24小时，然后在20℃下二次干燥24小时。冻干后，冻干的饼在小瓶中占据的体积与冻干前冷冻样品的体积相同，表明冻干过程中饼没有开始融化。将珠粒再水合，以准确地代替损失的水质量(如按重量测量的)。复原的凝胶不能通过抽吸加载到注射器中，但当通过具有鲁尔锁定连接件的注射器之间时，最初彼此牢固粘附的凝胶珠粒能够分散成单独的珠粒。当测试流变性(图12A-图12B中的“冻干后”组)时，珠粒更硬得多，其中储能模量和杨氏模量大大增加。这是由扩散的水凝胶结构塌陷成更致密的双相结构引起的。可注射性、物理性质和孔隙度都受到冻干过程的影响。
实施例14.利用低渗制剂开发冻干方法
7.0mg/mL 700kMW HA-丙烯酸酯、10mg/mL纳米纤维和7.18mg/mL PEGSH(5k 2-臂)在37℃培养箱中的5cc注射器中反应过夜，然后用150μm或250μm筛珠化。在该实施例中，珠粒被配制成低渗的(使用去离子水代替PBS)。
将1cc的珠粒加载到
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冻干小瓶中，向其中加入1cc等渗溶液，再加入1cc去离子水，使小瓶中的总溶液体积为3cc，其中珠粒分散在整个体积中。等渗溶液为A：3％蔗糖、3％海藻糖、0.3％NaCl和2mg/mL游离700k HA，或者B：含有2mg/ml游离700k HA的PBS。将小瓶在液氮中快速冷冻，然后在-30℃的货架温度和10帕的真空压力下冻干48小时，并在Labconco Triad内置式冻干机中采用升至20℃的温度进行24小时的二次干燥。冻干后，将珠粒再水合，以准确地替代损失的水质量(如按重量测量的)。复合物凝胶珠粒可以很容易地被抽吸到注射器中，表明单个珠粒的结构得以保存，这通过光学显微镜得到了证实。在蔗糖-海藻糖溶液中冻干的组与在珠化过程之后、稀释和冻干之前立即冻干的组具有相同的感觉和可操作性。流变性质实际上也是相同的，该组的储能模量为初始预珠化凝胶的90％，比冻干前珠化凝胶的模量高22％(图13A)。在PBS缓冲液中稀释的组也很容易被抽吸到注射器中，其行为类似于蔗糖-海藻糖组，但其储能模量比最初的珠化前模量高87％，比冻干前的珠化凝胶高154％。这表明在PBS组中即使颗粒保持为独特的珠粒，仍然发生一些微结构变化。
珠粒尺寸
通过改变珠化过程中使用的筛的网眼尺寸来改变珠粒尺寸。
开口超过250μm的珠粒筛被排除在外，因为所得珠粒需要至少具有一个尺寸设定为小于注射器针的内径的维度。通常用于皮肤填充剂应用的针的号在25号至30号的范围内，内径为260μm至160μm。较小的珠粒试图通过具有90μm开口的筛，但小的网眼尺寸破坏了复合物凝胶微体系结构(microarchitecture)；90μm的开口尺寸小于许多单根纤维的长度，这导致纤维和凝胶被撕开，而不是被切割成均匀的凝胶-纤维复合物。利用90μm的筛进行处理，没有产生足够的材料来供表征。由250μm和150μm筛产生的珠粒(图13B)产生的凝胶具有与如图13A中形成的珠粒相似的流变性质，特别是储能模量和tanδ，适用于皮肤填充剂。
Tanδ
Tanδ是流变损耗模量除以储能模量，这意味着较低的tanδ值相当于更“像固体”而不是“像液体”的材料。图13C显示了上述工艺的样品(珠化前，250μm的珠粒、150μm的珠粒)的tanδ。如图在13D所示的趋势中所看到的，皮肤填充行业的tanδ值随着时间的推移一直呈下降趋势。这是朝向更像固体的感觉的趋势，所述更像固体的感觉对填充皮肤缺损有更好的提升能力。纤维-水凝胶复合物材料进一步推动该趋势朝向更好地提升能力，并且即使在珠化过程后也能保持该特性。Tanδ数据是在以1Hz从0.1％至10％的振幅进行振幅扫描期间获得的，在Ares G2流变仪上对来自1％至10％的振幅的tanδ值进行平均。合成值(Composite value)来自图13C所示的150μm珠粒组。
实施例15.复合物珠粒的物理化学表征
尺寸分布的确定
在共聚焦显微镜图像下，沿着颗粒的最长轴测量复合物珠粒粒的直径。通过对51个颗粒计数来进行分析。颗粒直方图(图14A)给出的平均珠粒尺寸为209.41±62.27μm。图14B通过测量颗粒内的最长轴，显示了尺寸为约75μm、为约150μm和为约200μm的珠粒的共焦显微镜图像。
使用图像分析程序执行进一步表征的珠粒尺寸分布，所述程序将使用边缘检测进行更一致的测量。
在一些实施方案中，用于处理块状复合物的不同网眼尺寸的筛子可产生不同的珠粒尺寸直方图。
在另一个实施方案中，将SEM(扫描电子显微镜)用于对复合物珠粒成像。成像过程中可能需要对水凝胶或纤维进行染色。
基于复合物珠粒的尺寸评估可注射性
对来自良好生产规范(GMP)批次的过量凝胶进行再处理，以根据珠粒尺寸评估可注射性。简言之，将凝胶填充到10cc注射器中，并通过迫使凝胶通过具有规定的网眼尺寸的不锈钢网筛(来自McMaster Carr的25mm不锈钢网，放置在25mm Sartorius过滤器支架中)来进行颗粒化。迫使凝胶通过250μm的筛，然后通过150μm的筛。然后将该凝胶加载到1cc BD聚碳酸酯注射器中，组成“150μm”组。然后将剩余的批次通过另外的75目筛三次，并加载到1cc BD聚碳酸酯注射器中，形成“75μm”组。然后将加载的注射器装载到与MTS标准43机械测试仪相连的注射器夹具(Instron)中。将凝胶通过27号针(1/2”长，BD)以1mm/秒的十字头速度从注射器中注射出来。代表性位移曲线如图14C所示。150μm组和75μm组均产生了可接受的注射曲线。由于两组产生的凝胶珠粒小于27号针的210μm内径，因此所述曲线相似。
纤维长度分布的测定
分散在整个水凝胶材料中的纤维的长度分布通过使用ImageJ测量相差光学显微镜图像中看到的纤维来确定(图14D、图14E)。作为替代方法，SEM(扫描电子显微镜)可用来测定纤维的长度分布。
纤维和水凝胶上官能团(化学官能团)的定性和定量表征
使用甲苯胺蓝(TBO)测定法对等离子体处理后纤维上的-COOH基团进行表征。微孔板读数器：将BioTeck Synergy 2用于评估测定。下面描述遵循的方案步骤：
·使用直径为0.8cm的穿孔器冲压四片丙烯酸改性纤维片
·将打孔的纤维片放入24孔板中
·用1mL的0.1mM NaOH洗涤纤维片两次
·在0.1mM NaOH中制备0.5mM甲苯胺蓝(TBO)溶液
·向每个孔中加入1mL的0.5mM TBO溶液
·将板放置在转速为200rpm的振荡器上，并在室温下放置12小时
·吸出反应缓冲液
·用0.1mM NaOH洗涤纤维片
·向每个孔中加入1mL的50％(v/v)的乙酸
·将板在室温下放置在转速为200rpm的振荡器上30分钟
·将100μL上清液转移到96孔板中
使用微孔板读数器在633nm处测量，以于50％(v/v)乙酸中的TBO为标准物。对于这些实施例中使用的纤维观察到的典型值为70～100nmol/cm2的COOH密度。
在通过EDC-NHS化学添加马来酰亚胺(MAL)基团进行修饰后，进行Ellman氏测定以测量消耗的硫醇基团。微孔板读数器：将BioTeck Synergy 2用于评估测定。下面描述遵循的方案步骤：
·制备反应缓冲液：0.1M磷酸钠，pH 8.0，含1mM EDTA
·在反应缓冲液中制备4mg/mL的Ellman氏试剂
·在反应缓冲液中制备0.5mM的乙酰半胱氨酸溶液
·冲压四片直径为0.8cm的马来酰亚胺改性纤维片
·将纤维片放入24孔板中
·用1mL升反应缓冲液清洗纤维片
·向每个孔中加入0.5mL的0.5mM乙酰半胱氨酸溶液
·将板在室温下放置在转速为200rpm的振荡器上4小时
·将20μL上清液转移到96孔板中
·通过将其在反应缓冲液中稀释50倍，制备Ellman氏反应溶液
·向96孔板的每个孔中加入200μL Ellman氏反应溶液
最后，将96孔板置于转速为200rpm的振荡器上进行15分钟，并以反应缓冲液中的乙酰半胱氨酸为标准物，使用微孔板读数器在412nm处进行测量。然后，计算消耗的硫醇并获得MAL密度。对于这些实施例中使用的纤维观察到的典型值为70～100nmol/cm2的MAL密度。
丙烯酸酯化的化学鉴定和改性透明质酸的丙烯酸酯化度的定量使用核磁共振(NMR)光谱法来进行。将20mg HA-Ac直接加入到NMR管中的800mg氢氧化氘(D2O)中，在60℃下通过超声处理溶解2小时。然后，通过400MHz下的1H NMR在Varian NMR系统光谱仪上分析所获得的光谱。使用Varian软件、傅立叶变换、基线漂移校正、定相、对1HNMR的积分和基线展平(baseline flattening)处理所得曲线。
对对应于6ppm处的三个峰进行积分，并除以2ppm处的积分值。将2ppm处的积分值设置为3。6ppm处的三个峰对应于与丙烯酸酯基团上的碳关联的三个氢(每个存在的丙烯酸酯基团预期有三个总氢)。2ppm峰对应于存在于透明质酸的每个重复单元上的与乙酰基关联的氢(每个重复单元3个)。因此，取代度是三个6ppm峰的总积分面积除以2ppm峰的积分面积，得到具有丙烯酸酯基团的HA重复单元的分数。丙烯酸酯化度百分比是通过乘以100％转换成百分比的分数。
实施例16.干细胞至兔皮下间隙内的体内递送
在兔研究中，进行了与实施例9中的大鼠研究类似的皮下注射。通过25G针注射200μl培养了3天的LS-14/hMSC微珠。将所测试的组中的一个组注射到背部颈圈区域下方的脂肪垫中。在POD30处死兔以进行组织收获。组织学分析显示，第30天时，兔脂肪垫中有强劲的组织和细胞浸润(图15A)，并且在第30天时，兔皮下间隙中有中度组织和细胞浸润(图15B)。
实施例17.提高脂肪移植物体外存活的纤维-水凝胶复合物
实施例中公开的研究的目的是通过流变性分析表征纤维-水凝胶复合物与人脂肪组织组合时的机械性能。流变学是对流动和变形的研究，用于测量物体在施加的力作用下的塑性流动。储能模量(G’)是材料弹性程度的量度，或者，换而言之，是材料在剪切力作用下可变形的程度。较高的储能模量反映了物体对变形或剪切力的抵抗力增强。当这一概念应用于临床意义时，可推断储能模量越高，组织就越不容易受到继发于机械力的变形或创伤。
比较了在体外细胞培养研究中添加和不添加纳米纤维-水凝胶复合物时的脂肪组织存活率，旨在以后将其植入体内模型中。当组合在一起时，纳米纤维-水凝胶复合物预计会增加脂肪抽吸物的储能模量，在细胞培养研究中与单独使用脂肪抽吸物相比，会导致等同的脂肪组织存活，并且当与脂肪抽吸物结合时会均匀整合。
纤维-水凝胶复合物与脂肪抽吸物的组合(复合物-脂肪抽吸物)的制备
脂肪抽吸物获自18至70岁不吸烟且体重指数低于35的女性。出血病症、HIV、糖尿病和脂肪萎缩病症患者未纳入本研究。在整个研究过程中，使用旋转系统(http://hcp.revolvefatgrafting.com)将获得的脂肪抽吸物处理成颗粒，用乳酸林格氏溶液将其洗涤3次，以去除油和结缔组织。
将不同比率的脂肪抽吸物、水凝胶和复合物组合(表5)，并使其在140μL硅胶模具中胶凝化24小时。在此期间，将样品置于38摄氏度的培养箱中。
表5：将不同比率的脂肪抽吸物、纤维-水凝胶复合物和水凝胶组合，并测试流变性质。
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纤维-水凝胶复合物与脂肪抽吸物的组合(复合物-脂肪抽吸物)的流变研究
使用具有8毫米(mm)锯齿状平行板(间隙大小在0.8-1.2mm的范围内)的G2 Ares流变仪进行动态流变性测试(图16A)。每组至少有4份样品，使用来自两个不同患者的脂肪抽吸物对所有组进行了两次测试。
图16B显示了每个样品组的平均储能模量。75％脂肪抽吸物与25％复合物(25C)的比率导致最高储能模量，G’为395.2帕(SD 112.1)。100％脂肪抽吸物(100F)的储能模量第二高，平均值为361.8帕(sd75.3)。50％复合物和50％脂肪抽吸物(50C)的平均储能模量为208.7(SD45.4)。50％水凝胶和50％脂肪抽吸物(50H)、100％复合物(100C)和100％水凝胶(100H)的储能模量分别为80.3(17.4)帕、94.6(16.3)帕、32.7(12.3)帕。除75％脂肪抽吸物和25％复合物的比率外，所有组的平均储能模量均与100％脂肪抽吸物的储能模量有显著差异(图16B)。
流变性数据表明，75％脂肪抽吸物和25％复合物比率的组合导致所有试验组中的最高储能模量(G’)。该特定组似乎是产生最高G’的最佳比率。100％脂肪抽吸物与75％脂肪抽吸物和25％复合物之间的差异不具有统计学意义，表明该比率模拟了天然脂肪的流变性质。这是可以预期的，因为复合材料的G’比脂肪抽吸物的G’低很多，添加复合材料会导致整体G’下降。然而，该比率似乎允许脂肪组织与纳米纤维-水凝胶复合物之间有理想的交联量，从而提高材料的整体强度。这一点很重要，因为储能模量是材料可抵抗变形的程度的量度，并且理想的组织支架应具有与天然脂肪组织相似的特性/强度。随着储存模量的提高，脂肪抽吸物/复合物组合的可变形性更小，因而强度更大，受剪切力的影响更小。之前的研究已经证明，这转变为更少的脂解作用和更高的体外脂肪细胞存活率{Luan，Anna等人，Plastic and Reconstructive Surgery，第140卷，第3期，2017年，第517–524页}。因此，可以合理地推断，将脂肪复合物与相对较高的储能模量组合可提高脂肪细胞和脂肪移植物的存活率。
细胞存活测定
将不同比率的脂肪抽吸物和复合物组合，并在达尔伯克改良伊格尔培养基(含10％胎牛血清和1:1000青霉素/链霉素的生长培养基)中培养7天(表6)。选择这些比率是因为它们最有可能作为不同的实验组用于未来的体内实验。至少每2天或每当向细胞培养基中添加Alamar Blue试剂时更换生长培养基。使用Alamar Blue测定对第0天、第1天、第2天、第3天和第7天的细胞存活相对量定量。
细胞培养结果(图16C)显示了使用Alamar Blue测试获得的7天内的细胞存活率。与脂肪抽吸物相比，所有其它组的存活细胞百分比均显著较高(p值<0.05)。
表6：细胞存活测定中包括的脂肪抽吸物、纤维-水凝胶复合物和水凝胶的不同比率
组 样品组成
100F 100％脂肪抽吸物
50C 50％脂肪抽吸物+50％复合物
25C 75％脂肪抽吸物+25％复合物
50H 50％脂肪抽吸物+50％复合物
细胞培养的结果表明，添加所公开的纳米纤维-水凝胶复合物是良性的，并且不会损害脂肪细胞的存活。与含有100％脂肪抽吸物的组相比，所有组均具有显著更高的细胞存活率(所有组间p<0.001)。我们的组织支架不能阻止脂肪细胞进入细胞培养基以存活；事实上，其似乎提高细胞的存活率。这可能是由于100％脂肪抽吸物组的样品周围有脂质层，从而阻止脂肪细胞进入细胞培养基。总之，可以推断，如果植入体内模型，我们的复合物不会阻止脂肪细胞获取长期存活所需的血管生成生长因子。
在细胞水平上分析复合物整合的免疫组织化学(IHC)
进行免疫组织化学(IHC)以在细胞水平上分析脂肪细胞形态和复合物整合。首先在4％w/v多聚甲醛中固定IHC样品，然后分别使用10％、20％和30％w/v蔗糖逐步脱水。然后将它们冷冻在最佳切割温度的化合物(optimal cutting temperature compound)中，并以每切片20μm进行切片。对每份样品进行围脂滴蛋白(一种良好建立的脂肪细胞标志物)抗体染色。使用共聚焦显微镜拍摄图像，然后使用ZEN软件进行处理。使用描述性统计以及参数法和非参数法分析数据。使用
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13(StataCorp,College Station,Texas)进行统计分析。图16D显示了使用围脂滴蛋白的IHC染色在细胞水平上观察到的我们的纳米纤维组织支架与人脂肪组织的整合。含有复合物的组以及含有100％脂肪抽吸物的组均被染色。根据我们的IHC分析，复合物内的纳米纤维与脂肪抽吸物组织整合良好(图16D)。
研究表明，我们的复合材料在结构上模拟脂肪组织，与脂肪抽吸物组合时具有高储能模量(从而保护其免受剪切力)，并且在细胞水平上与脂肪抽吸物良好整合。将这些想法组合起来，我们的纳米纤维-水凝胶复合物是增强自体脂肪移植的可行组织支架。为了将这一概念付诸实践，在实施例17中，将我们的复合物和脂肪抽吸物的组合植入鼠模型中，以评估体内的体积保持、组织整合和血管生成。
实施例18.在体内诱导血管向内生长和改善脂肪移植物体积保持的纤维-水凝胶复合物
我们旨在证明，在脂肪移植手术中，我们的新型纳米纤维-水凝胶复合物可作为天然脂肪抽吸物的辅助物。在之前的目标中，我们证明了纳米纤维-水凝胶复合物的机械强度与天然脂肪组织相似且具有生物相容性。我们假设，复合材料可通过促进体积保持和血管生成的增加来改善脂肪移植的结果。
纤维-水凝胶复合物与脂肪抽吸物的组合(复合物-脂肪抽吸物)的制备
脂肪抽吸物获自年龄在18至70岁之间、使用旋转系统接受自体脂肪移植的女性。参与者不吸烟，体重指数低于35。出血病症、HIV、糖尿病和脂肪萎缩病症患者未纳入本研究。将不同比率的脂肪抽吸物、复合物和水凝胶组合，并使其在38摄氏度的培养箱中于1cc注射器中胶凝化3小时(表7)。
表7：将不同比率的脂肪抽吸物、纤维-水凝胶复合物和水凝胶组合，并注射到Foxn1nu小鼠的胁腹
组 样品组成
100F 100％脂肪抽吸物
50C 50％脂肪抽吸物+50％复合物
25C 75％脂肪抽吸物+25％复合物
50H 50％脂肪抽吸物+50％水凝胶
100C 100％复合物
MRI体积分析和形状保持
异氟醚麻醉后，在任一胁腹上将Foxn1nu注射到500μL材料，每只小鼠共注射2次。使用16号钝尖套管进行注射。根据表7将小鼠分为5组，每组共13只小鼠。术后第2天、第28天、第56天和第84天(POD)进行MRI。由盲法研究人员使用ImageJ软件进行体积分析和形状保持分析(图17A)。通过评估POD 2、28、56和84移植物的最大高度并计算高度变化百分比来测量形状保持(图17B)。与POD 2相比，所有组在POD 84表现出显著降低的体积保持(图17A)。虽然100％脂肪抽吸物组最初在POD 28表现出较高的体积保持，但注射25％复合物和75％脂肪抽吸物的组在POD 84表现出最高的体积保持。由于含复合物的两组均表现出最高的保持率，这表明复合物在降低脂肪移植物在吸收率方面发挥了作用。注射100％复合物的组在所有时间点始终表现出最差的体积保持，表明单独的复合物不能作为脂肪组织的充分替代物，只能作为脂肪移植的支持性辅助物。
在形状保持方面，25C和100F组在POD 84的最大高度变化最小(图17B)。以100％脂肪抽吸物组为参考，除25C脂肪抽吸物组外，所有组均显示出显著降低的最大移植物高度百分比。还研究了纳米纤维-水凝胶复合物对形状保持的影响。虽然不同组或甚至不同时间点的总体积保持可以相似，但移植物能够保持其原始预期的形状也很重要。移植物可能会随着时间的推移变平，但仍然保持相似的总体积。因此，我们选择将最大移植物高度作为形状保持的标志。从一个时间点到下一个时间点，除100F和25C组外，所有组均显示出最大移植物高度的显著降低(图17B)。这表明，以25％复合物对比75％脂肪抽吸物的比率将我们的复合材料和脂肪抽吸物组合，不仅促进了增强的体积保持，而且复合材料在该比率下起到了强化脂肪原始总体形状的作用。这对材料的功能至关重要，因为自体脂肪移植的主要目的是作为软组织缺损的填充剂。这在美容敏感区域诸如面部和乳房尤为关键，在这些区域，适当的移植物形状保持对于获得满意的美学结果是必需的。
免疫组织化学(IHC)分析脂肪细胞形态和血管向内生长
在3个不同时间点：POD 7、POD 28和POD 84处死本实施例中的上述小鼠，用于免疫组织化学(IHC)目的。进行了IHC以分析脂肪细胞形态和血管向内生长。在4％w/v多聚甲醛中固定样品，然后分别使用10％w/v、20％w/v和30％w/v蔗糖逐步脱水。然后将它们冷冻在最佳切割温度的化合物中，并以每切片20μm进行切片。对每份样品进行围脂滴蛋白抗体和CD31(分别为良好建立的脂肪细胞和血管的标志物)染色。使用共聚焦显微镜拍摄图像，然后使用ZEN软件进行处理。使用描述性统计以及参数法和非参数法分析数据。使用
Figure BDA0002889302300000851
13(StataCorp,College Station,Texas)进行统计分析。
图17C-图17D显示了我们在术后不同时间点对围脂滴蛋白进行的IHC染色。还进行了CD31染色，见图17E-图17F。在POD7对围脂滴蛋白进行的IHC染色显示，所有组中的脂肪细胞形态均得到保持(图17C)。评估POD28图像(图17D)，可以看出与其它组相比，25C组的脂肪细胞结构保存最完整。我们还可以看到，我们的纤维在体内环境中也均匀分散，并与组织良好整合。
CD31染色的IHC结果清楚地显示了血管供应随时间的变化。在POD 7，所有组中均观察到有限的血管形成(图17E)。然而，与此时间点的另外的组相比，25C组中似乎至少存在略微更大、更强健的血管。当将POD2图像与POD28图像进行比较(图17F)时，我们可以看出各组之间的显著差异。在POD28时间点，含有复合物的所有组(25C、50C和100C)均有明显的血管生成。相比之下，100F和50H组对CD 31未显示出强染色，表明血管生成率较低。充足的血液供应对移植物存活至关重要，这可以帮助解释为什么含复合物组的体积保持率最高。
MicroFil灌注三维重建
对每组一只小鼠进行小鼠脉管系统的MicroFil灌注，以使用计算机断层(CT)扫描评估移植物的微脉管系统。简言之，通过右心房中的切口对小鼠进行放血和肝素化盐水灌注。然后通过小鼠灌注MicroFil硅橡胶注射复合物。然后取出移植样品，并通过CT扫描成像。使用VivoQuant软件对移植物脉管系统进行三维重建，并计算血管与移植组织的比率。图17G显示了重建的脉管系统。使用VivoQuant软件计算移植物脉管系统占移植物总体积的百分比。100F具有最低的血管体积与移植物体积的比率，而25C显示最高的血管体积与移植物体积的比率。通过对每组和每个时间点的一只代表性小鼠进行MicroFil灌注和随后的VivoQuant分析，旨在通过尽可能公正地报告移植物内的血管形成来确认我们的观察结果。图17G所示的3D图像非常醒目，因为我们可以清楚地看到，含有复合物的移植物的血管化明显好于100F或50H移植物。25C的血管相对于总移植物体积的百分比最高，表明与其它样品相比，其血管供应水平较高。
在未来的研究中，对现有体内方案进行小幅修改可能会产生更为显著的结果。例如，在IHC分析中，促再生和促炎抗体染色可用于阐明我们支架的免疫调节能力。另外，Ki-67或溴脱氧尿苷(BrdU)染色可用于评估我们的移植物内的新细胞增殖。最后，使用MicroFil灌注和VivoQuant进行血管的三维可视化和定量可以很容易地对来自裸鼠的大量和各种组织样品进行重复。也可以在兔(lapine)或猪动物模型中探索脂肪移植物增强或再生的替代方法，这可能允许将我们的复合物应用于更大的已有脂肪沉积或脂肪垫内的软组织缺损。
实施例19.复合物珠粒与脂肪抽吸物的组合(复合物珠粒-脂肪抽吸物)的制备
制备了复合物珠粒-脂肪抽吸物样品，以增强脂肪移植方案，诱导血管向内生长，以及改善体内脂肪移植体积保持。
脂肪抽吸物获自年龄在18至70岁之间，使用旋转系统接受自体脂肪移植的女性。参与者不吸烟，体重指数低于35。出血病症、HIV、糖尿病和脂肪萎缩病症患者未纳入本研究。将不同比率的脂肪抽吸物、复合物珠粒和水凝胶组合，以在体外和体内研究中进行试验(表8)。虽然珠状复合物可能不会形成真正的互穿网络进入并包围脂肪抽吸物颗粒，如发生在原位反应的复合物中的情况，但由于珠粒如何强烈地相互粘附，珠粒保持形成内聚凝胶团的能力，如在体内观察到的形状保持中和流变数据中的低tanδ值(珠化后<0.10)中所见。复合物的纤维组分也可起到类似于Velcro的作用，以增加单个珠粒之间的缠结和附着。只要体积比和珠粒/脂肪抽吸物颗粒尺寸允许单个珠粒之间有多个接触点，珠粒之间保持内聚的能力就能维持复合物珠粒-脂肪抽吸物混合物的内聚结构。
复合物珠粒和脂肪抽吸物的组合可用于满足两种不同的临床需求。首先，患者可能没有足够量的供体脂肪可用(尤其是儿科患者)。将复合物珠粒掺入脂肪抽吸物中可用于扩大可用于重建的体积量，而脂肪抽吸物可为血运重建(revascularization)和重塑提供生物学线索。该比率为50:50脂肪-复合物直至具有痕量脂肪抽吸物的几乎完全的复合物珠粒。其次，脂肪移植的临床结果受到移植脂肪存活率低的限制。可以以99:1的脂肪与复合物的比率至50:50的脂肪与复合物的比率掺入复合物珠粒，以提供结构支持、粘附线索、免疫保护和额外的益处，以改善移植脂肪的存活和形状保持。
表8：组合不同比率的脂肪抽吸物、纤维-水凝胶复合物珠粒和水凝胶以进行体外和体内测试。
组 样品组成
100F 100％脂肪抽吸物
50C 50％脂肪抽吸物+50％组合物珠粒
25C 75％脂肪抽吸物+25％组合物珠粒
50H 50％脂肪抽吸物+50％水凝胶珠粒
100C 100％组合物珠粒
脂肪抽吸物与复合物珠粒的混合
可以以几种不同的方式混合/组合复合物珠粒和脂肪抽吸物。这些方案的关键是将脂肪和复合物组合，以便“最低限度地操作”脂肪。一种方法是通过鲁尔-鲁尔连接器将具有复合物珠粒的5cc、10cc或20cc注射器与具有经处理的脂肪的5cc、10cc或20cc注射器连接，然后在注射器之间混合材料。该工作流程是现场工作的外科医生的常规工作。另一种方法是将珠粒放入1cc、5cc或10cc注射器中，并分离基质-血管-部分(通过对抽吸的脂肪进行离心)。在这些情况下，将珠粒与OR中的脂肪混合，在制备后几分钟内使用。
替代方法是将脂肪抽吸物与复合物珠粒在介质中混合，并持续搅拌数天(1天、3天、5天、7天)。如图10E所示，该方案还可使内源性细胞能够生长到珠粒上并重塑珠粒，类似于在珠粒上增殖的干细胞。
复合物珠粒-脂肪抽吸物在增殖时应保持在37℃，然后在冰上保持在4℃达数小时，然后在受试者中使用所述构建体治疗。进行流变性测试、细胞存活测定和免疫组织化学(IHC)以在细胞水平上分析复合物整合的方案与上述实施例18的方案相似。另外，用复合物珠粒-脂肪抽吸物样品重复本实施例19中设计的体内实验，以决定哪种珠粒-脂肪抽吸物的比率产生更好的结果。
实施例20.复合物珠粒的稳定性测定
为了评估所公开的复合物珠粒的稳定性，在不同的时间点对微珠进行流变性研究，以确定机械稳定性。在4℃的水合形式下，微珠被确定为稳定6个月。
在1个月、3个月、6个月、9个月、12个月和24个月时在室温下对珠粒的水合形式和脱水形式进行确定结构完整性的流变性测试(剪切模量)。测试具有不同水凝胶分子量、丙烯酸酯化度、纤维浓度、马来酰亚胺度和交联密度的各种复合物珠粒的稳定性。
关于细胞接种的珠粒，必须将它们与培养基一起保存在37℃下，直到它们准备注射为止。必须使细胞接种的时间安排与注射良好地协调，因为培养时间越长，细胞增殖越多。
如以上实施例中所述，珠状制剂通过临床相关的27号至31号或16号至31号针保持容易注射，并且提供了对原位胶凝原型的若干改进。珠状制剂使得单注射器输送系统更易于使用。由于表面积大得多，因而冻干的珠粒再水合更快，因此不再需要大量的两注射器混合。珠状制剂使得能够在制剂中使用更高浓度的透明质酸、纳米纤维和交联剂。先前，最大浓度由粘度和注射力决定。通过使用特殊的珠粒，成分浓度不再是限速的，研究小组可以进一步改善刚度和提高耐久性。珠状制剂实现了增强的稳定性。与未反应的形式相比，预反应的珠状形式的复合物对温度、湿度和光的变化的耐受性要强得多，并且在多次跨国运输后，其性能没有变化。最后，珠状制剂提供了增强的细胞和组织递送支架。
等同方案
应当理解，本文描述的详细实例和实施方案仅仅是为了说明的目的而通过示例给出的，并且决不被认为是对本发明的限制。本领域技术人员将会想到根据其的各种修改或变化，并且这些修改或变化包括在本申请的精神和范围内，并且被认为在所附权利要求的范围内。例如，可以改变成分的相对量以优化期望的效果，可以添加额外的成分，和/或可以用类似的成分替代所述的一种或多种成分。根据所附权利要求，与本发明的系统、方法和过程相关联的附加有利特征和功能将是显而易见的。此外，本领域技术人员将认识到，或者能够仅使用常规实验来确定，本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。此类等同方案旨在被所附权利要求所涵盖。

Claims (38)

1.一种软组织装置，所述软组织装置包括：
生物活性材料和基本上非球形的微珠群，所述基本上非球形的微珠群包含与多个平均长度小于约200微米的聚己内酯纤维共价连接的官能化透明质酸网络，和以约1mg/mL至约25mg/mL的浓度存在的交联剂，其中所述生物活性材料被可操作地包裹在所述非球形的微珠内，或者所述生物活性材料与所述非球形的微珠可操作地缔合，或其组合，
其中所述微珠的平均尺寸沿着最长维度在约50微米至约300微米的范围内。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述微珠是经预反应的。
3.如权利要求1或2所述的装置，其中所述微珠在室温下基本上稳定至少约6个月。
4.如权利要求1至3中任一项所述的装置，其中所述生物活性材料能够在受试者中进行以下至少一种：i)募集宿主细胞浸润，ii)促进组织生长，iii)和/或细胞或组织再生，并且其中所述软组织装置能够被植入或注射到有需要的受试者的靶组织中。
5.如权利要求1至4中任一项所述的装置，其中所述微珠是基本上非炎性的。
6.如权利要求1至5中任一项所述的装置，其中所述生物活性材料选自由以下组成的组：生长因子、细胞因子、抗体、细胞、组织、组织载体或组织结合部分、核酸、细胞载体或细胞结合部分或其组合。
7.如权利要求6所述的装置，其中所述细胞结合部分或组织结合部分包括肽、抗体、蛋白质、适体、寡糖或生物材料。
8.如权利要求1至7中任一项所述的装置，其中所述生物活性材料包括脂肪细胞、自体脂肪细胞、同种异体细胞、经遗传修饰的同种异体细胞、干细胞、间充质干细胞、经遗传修饰的干细胞、经遗传修饰的同种异体诱导的多能干(iPS)细胞和经遗传修饰的低免疫原性多能干细胞的群体，来自脂肪组织的基质血管部分，其衍生物或其组合。
9.如权利要求1至8中任一项所述的装置，其中所述生物活性材料包括能够持久地存在于所述装置内或所述装置附近的细胞群。
10.如权利要求1至9中任一项所述的装置，其中所述生物活性材料包括脂肪基质血管部分。
11.如权利要求1至10中任一项所述的装置，其中所述生物活性材料包括脂肪组织。
12.如权利要求11所述的装置，其中所述脂肪组织是脂肪抽吸物。
13.如权利要求11所述的装置，其中所述脂肪组织是自体的。
14.如权利要求11所述的装置，其中所述软组织装置在37℃下是稳定的。
15.如权利要求1至14中任一项所述的装置，其中所述软组织装置在施用到受试者的靶组织中之前在40℃下保持1小时、2小时、3小时、5小时、7小时或10小时的时间段。
16.一种用于制备施用到受试者的靶组织中的权利要求1至15中任一项所述的装置的药盒，所述药盒包括：(i)具有约1cc至约20cc或大于20cc注射器的体积的包含基本上非球形的微珠群的注射器；和(ii)具有约1cc至约20cc或大于20cc注射器的体积的包含所述脂肪抽吸物的注射器，其中所述两个注射器能够通过鲁尔连接器彼此连接，由此所述脂肪抽吸物被可操作地包裹在所述微珠内或者所述脂肪抽吸物与所述微珠可操作地缔合。
17.一种用于制备施用到受试者的靶组织中的权利要求1至15中任一项所述的装置的方法，所述方法包括将所述脂肪抽吸物和所述微珠在合适的介质中混合1天、2天、3天、4天、5天或7天。
18.一种用于制备施用到受试者的靶组织中的权利要求1至15中任一项所述的装置的药盒，所述药盒包括：(i)包含冻干的微珠的注射器；(ii)包含水、盐水溶液或合适的复溶液的小瓶，其中水、盐水溶液或合适的复溶液能够被从所述小瓶中抽吸到所述注射器中，由此使所述冻干的微珠从而再水合；和(iii)包含所述脂肪抽吸物的注射器，其中所述两个注射器能够通过鲁尔连接器彼此连接，由此所述脂肪抽吸物被可操作地包裹在所述水合微珠内或者所述脂肪抽吸物与所述水合微珠可操作地缔合。
19.一种用于在人受试者中进行脂肪移植的方法，所述方法包括将软组织装置注射或植入到所述组织或所述组织缺损中，所述软组织装置包括脂肪组织和基本上非球形的微珠群，所述基本上非球形的微珠群包含与多个平均长度小于约200微米的聚己内酯纤维共价连接的官能化透明质酸网络，和以约1mg/mL至约25mg/mL的浓度存在的交联剂，其中所述生物活性材料被可操作地包裹在所述非球形的微珠内，或者所述生物活性材料与所述非球形的微珠可操作地缔合，或其组合，
其中所述微珠的平均尺寸沿着最长维度在约50微米至约300微米的范围内，
其中所述微珠是经预反应的，
其中所述微珠在室温下基本上稳定至少约6个月，
其中所述生物活性材料能够在受试者中进行以下至少一种：i)募集宿主细胞浸润，ii)促进组织生长，iii)和/或细胞或组织再生，并且其中所述软组织装置能够被植入或注射到有需要的受试者的靶组织中。
20.如权利要求1至15中任一项所述的装置，所述装置包括多个孔。
21.如权利要求20所述的装置，其中至少一个亚组的所述孔可被布置在整个所述微珠中，使得当植入或注射到存在于受试者中的靶组织中时，它促进组织生长和细胞浸润。
22.如权利要求20或21所述的装置，其中所述多个孔包含不小于50个孔/cm2的面积密度，其中至少约80％的孔具有不小于约5微米的平均尺寸。
23.如权利要求1至15或20至22中任一项所述的装置，其中所述官能化透明质酸包括丙烯酸酯化的透明质酸，并且所述交联剂包括巯基化的聚(乙二醇)或其衍生物。
24.如权利要求1至15或20或22中任一项所述的装置，其中所述官能化透明质酸包括巯基化的透明质酸，并且所述交联剂包括聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)或其衍生物。
25.如权利要求1至15或20至24中任一项所述的装置，其中所述多个聚己内酯纤维包括电纺纤维。
26.如权利要求1至15或20至24中任一项所述的装置，其中所述聚己内酯纤维的直径在约100纳米至约5微米的范围内。
27.如权利要求1至15或20至26中任一项所述的装置，其中所述微珠的平均储能模量在约50帕与约2500帕之间。
28.如权利要求1至15或20至27中任一项所述的装置，其中所述装置被配制成用于向受试者的靶组织中进行皮肤或皮下施用的可植入或可注射装置。
29.一种包括注射器的药盒，所述注射器包括约0.1mL至约20mL的如权利要求1至15或20至28中任一项所述的装置，其中所述微珠被配制成i)基本上脱水的珠粒或ii)准备好注射到受试者的靶组织中的水合珠粒。
30.一种制剂，所述制剂包含如权利要求1至15或20至28中任一项所述的装置，其中所述微珠被冻干以形成脱水微珠，并且其中所述脱水微珠适于用水、盐水溶液或合适的复溶液复原，以在施用到受试者的靶组织中之前基本上替代损失的水质量(如按重量测量的)，使得当所述损失的水质量被替代时，所述复溶液中的所述微珠的浓度与冻干前微珠的浓度相同或基本上相同。
31.如权利要求30所述的制剂，其中所述脱水微珠在施用到有需要的受试者的靶组织中之前，在用水、盐水溶液或合适的复溶液复原时保持或恢复其珠状形式。
32.如权利要求30所述的制剂，其中所述脱水微珠在室温下基本上稳定至少约12个月。
33.一种用于制备权利要求1至15或20至28中任一项所述的装置的药盒，所述装置用于立即施用到受试者的靶组织中，所述药盒包括：含有所述微珠的小瓶，所述微珠已被冻干并形成粉饼，其中所述冻干的粉饼能够用水、盐水溶液或合适的复溶液复原。
34.一种用于制备权利要求1至15或20至28中任一项所述的装置的药盒，所述装置用于立即注射到受试者的靶组织中，所述药盒包括：(i)包含配制为冻干的凝胶珠粒的所述微珠的注射器；和(ii)包含水、盐水溶液或合适的复溶液的小瓶，其中水、盐水溶液或合适的复溶液能够被从所述小瓶中抽吸到所述注射器中，由此使所述冻干的微珠再水合。
35.如权利要求1至15或20至28中任一项所述的装置，所述装置还包括选自由以下组成的组的化合物：生长因子、刺激血管生成的化合物、免疫调节剂、炎症抑制剂及其组合。
36.如权利要求1至15或20至28中任一项所述的装置，所述装置还包括具有治疗作用、血管形成作用、抗血管形成作用、抗炎作用、抗菌作用、抗组胺作用或其组合的化合物。
37.如权利要求1至15或20至28中任一项所述的装置，所述装置还包括经处理的组织细胞外基质，其中所述经处理的组织细胞外基质可源自脂肪组织。
38.一种用于进行美容手术或重建手术或者减少或逆转由外伤、手术干预或与年龄相关的疾病、病症或疾患引起的组织缺损的方法，所述方法包括将软组织装置注射到所述组织和/或所述组织缺损中，所述软组织装置包括被可操作地包裹在基本上非球形的微珠群内的生物活性材料，所述基本上非球形的微珠群包含与多个平均长度小于约200微米的聚己内酯纤维共价连接的官能化透明质酸网络，和以约1mg/mL至约25mg/mL的浓度存在的交联剂，
其中所述微珠的平均尺寸沿着最长维度在约50微米至约300微米的范围内，
其中所述微珠是经预反应的，
其中所述微珠在室温下基本上稳定至少约6个月，
其中所述生物活性材料能够在受试者中进行以下至少一种：i)募集宿主细胞浸润，ii)促进组织生长，iii)和/或细胞或组织再生，并且其中所述软组织装置能够被植入或注射到有需要的受试者的靶组织中。
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