CN116754336B - 一种染色试剂以及获得具节纤小丝状大型海藻显微结构的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种染色试剂以及获得具节纤小丝状大型海藻显微结构的方法。涉及生物体样品制片方法领域。上述染色试剂，包括以下组分：对氯间二甲苯酚；酸性试剂；洋红试剂；溶剂；其中，对氯间二甲苯酚、酸性试剂和溶剂的体积比为5：(45‑80)：(55‑80)；所述酸性试剂包括冰醋酸。本发明的染色试剂，可染色出凸显结构中某些重要特征，如纹孔连接的节点、胞间连丝等，这些特征有利于更清晰的展示皮层发育和四分孢子囊的发育。
Description
技术领域
本发明涉及生物体样品制片方法领域，尤其是一种染色试剂以及获得具节纤小丝状大型海藻显微结构的方法。
背景技术
显微结构研究，是揭示生命现象和过程的必须手段，从荷兰科学家虎克发明显微镜以来已经有300多年，取得了许多进步，但该领域的研究往往受到样品处理过程中制片技术的好坏所影响。
具节纤小丝状大型海藻，是海洋中的大型低等植物，主要为仙菜目CERAMIALES中的物种，其包括仙菜属Ceramiun、纵胞藻属Centroceras、多管藻属Polysiphonia、新管藻属Neosiphonia、爬管藻属Herposiphonia等属物种。藻体横切面观、四分孢子囊的起源、假根的起源、皮层的发育等显微结构特征是对这些属种进行准确物种鉴定、分类和生命活动等研究的重要特征。然而，这些属种藻体过于纤细，其宽度多在几十个微米至几毫米之间，要获得其清晰的各种显微结构特征难度很大。过去该领域的学者主要是用石蜡切片来获得其显微结构特征。但是这存在明显的不足：1)石蜡切片需要通过固定—洗涤—脱水—透明—浸蜡—包埋—切片—展片—烤片多道程序，其操作复杂，费时费力；2)石蜡切片需要脱水机、包埋机、切片机等仪器，而且在以上的操作程序中需要各种试剂，投入成本高；3)有些藻体其宽度仅有四十几微米，非常细，纵使石蜡切片也很难切出理想的显微结构；4)石蜡切片所获得的显微结构为一个个独立的横切面，不具备完整性，不能直观体现一段藻体显微结构特征的连续变化；5)石蜡切片不能获得皮层结构特征。也有学者采用染色制片的方法，但往往只能获得皮层结构，由于配方的缺陷，无法进一步获得更加清晰完整的关键显微结构，且无法通过染色来凸显结构中重要特征，如现有技术中，海藻结构中的纹孔连接的节点和胞间连丝都无法通过染色方法观察到。
如何能快速获得具节纤小丝状大型海藻显微结构，显然是一个科学难题。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是：
提供一种染色试剂。
本发明所要解决的第二个技术问题是：
提供一种所述染色试剂的制备方法。
为了解决所述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种染色试剂，包括以下组分：
对氯间二甲苯酚；
酸性试剂；
洋红试剂；
溶剂；
其中，对氯间二甲苯酚、酸性试剂和溶剂的体积比为5：(45-80)：(55-80)；
所述酸性试剂包括冰醋酸。
根据本发明的实施方式，所述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：
1.本发明的染色试剂，一方面通过染色试剂中的洋红试剂对样品进行染色，凸显结构中某些重要特征，如纹孔连接的节点等，另一方面也因具节纤小丝状大型海藻其皮层细胞与围轴细胞之间、围轴细胞相互之间、围轴细胞与轴细胞之间存在胞间粘质及胞间连丝，纹孔连接等各种连接，存在致密性，所以需要先利用对氯间二甲苯酚及醋酸的腐蚀性来解离皮层细胞与围轴细胞之间、围轴细胞相互之间、围轴细胞与轴细胞之间粘质及其连接，然后通过把握混合试剂中对氯间二甲苯酚、酸性试剂和溶剂的体积比，保留皮层内部细胞之间的连接。
2.本发明的染色试剂，通过冰醋酸与洋红试剂的组合，可染色出凸显结构中某些重要特征，如纹孔连接的节点、胞间连丝等，这些特征有利于更清晰的展示皮层发育和四分孢子囊的发育。此外，对氯间二甲苯酚的使用，相对于现有染色试剂中的苯酚，氯间二甲苯酚更适用于具节纤小丝状大型海藻，经过氯间二甲苯酚处理后，可以进一步获得具节纤小丝状大型海藻的假根发育方式、四分孢子囊发育方式、围轴细胞数目及其连续变化过程、皮层发育过程等各种清晰完整的关键显微结构。
3.本发明的染色试剂，能够促进细胞质壁分离，并且能够进一步使得胞间连丝变得很清晰。
根据本发明的一种实施方式，所述酸性试剂还包括乳酸。通过在酸性试剂中，再加入包括乳酸在内的酸性试剂，能够促进酸性试剂的腐蚀效果。
根据本发明的一种实施方式，对氯间二甲苯酚、酸性试剂和溶剂的体积比为5：(45-50)：(55-60)。
根据本发明的一种实施方式，所述洋红试剂的添加量为过量。
为了解决所述第二个技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种获得具节纤小丝状大型海藻显微结构的方法，包括以下步骤：
S1配置所述的染色试剂；
S2混合海藻样品与染色试剂，得到染色后的样品；
S3将海藻样品以节为单位进行分离，每一节即为一个样品的横切面；
S4挑断步骤S3中分离后海藻的环节，将断节平展开来，通过显微镜观察显微结构。
根据本发明的实施方式，所述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：
1.本发明的方法，制片速度快，花费极少，经济适用，有利于工业化生产。
2.本发明的方法，染色效果好，能获得各种完整清晰的显微结构，且不易褪色。染色后得到的样品，由于染色试剂组分含有对氯间二甲苯酚和酸性试剂，使得样品自身也具有杀菌防腐作用，能较长时间保存。
3.通过本发明的方法，不仅可获得具节纤小丝状大型海藻的各种清晰特征的显微结构，而且还能直观体现一段藻体显微结构特征的连续变化，在海藻的形态学、解剖学、发育学及进化研究方面有重要的应用价值。
根据本发明的一种实施方式，步骤S1中，配置所述染色试剂，包括以下步骤：混合酸性试剂于溶剂中，得到混合液，将所述混合液煮沸至沸点，加入过量的洋红试剂，经冷却、过滤，向滤液中加入对氯间二甲苯酚，得到所述染色试剂。
根据本发明的一种实施方式，步骤S2中，于密闭槽中混合样品与染色试剂，混合的时间为5-6h。混合的时间，以腐蚀后的样品是否能被针灸针轻松挑开为准。在本发明中，通过把握染色试剂中用于腐蚀的成分含量及腐蚀所用的时间，来保留皮层内部细胞之间的连接，以利于后续操作，如挑开藻体、整块皮层或者获得横切面等。
根据本发明的一种实施方式，步骤S2中，还包括以下步骤：用毛刷清洁海藻样品。
根据本发明的一种实施方式，步骤S3中，将海藻样品以节为单位进行分离，所使用的分离工具包括针灸针。
根据本发明的一种实施方式，步骤S3中，还包括以下步骤：先以溶剂洗净海藻样品中多余的染色试剂，再加溶剂使海藻样品悬浮。
根据本发明的一种实施方式，步骤S3中得到的横切面，无需盖片，可直接在4X和10X物镜下选取特征拍照。
根据本发明的一种实施方式，步骤S4中，将断节平展开来，包括以下步骤：将断节平铺于载玻片上，盖上盖玻片。
根据本发明的实施方式，步骤S4中，将断节平展开来，得到皮层结构。
根据本发明的一种实施方式，将断节平铺于载玻片上，盖上盖玻片之后，还包括添加保湿防腐剂和封片的步骤。
本发明的另一个方面，还涉及所述染色试剂在形态学或解剖学或发育学或进化学中的应用。包括如上述第1方面实施例所述的染色试剂。由于该应用采用了上述染色试剂的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为实施例1中具节纤小丝状大型海藻样品在处理前的400μm显微结构图；
图2为实施例1中具节纤小丝状大型海藻样品在处理前的20μm显微结构图；
图3为实施例1中具节纤小丝状大型海藻样品在处理前的400μm下簇生假根的显微结构图；
图4为实施例1中具节纤小丝状大型海藻样品在处理前的20μm下四分孢子囊(T)环的显微结构图；
图5为实施例2中具节纤小丝状大型海藻样品在处理前的100μm显微结构图；
图6为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理中和处理后得到的显微结构图；
图7为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理后得到的节横切面显微结构图；
图8为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理后得到的四分孢子囊(T)环显微结构图；
图9为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理后得到的四分孢子囊(T)的节横切面显微结构图；
图10为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例2处理后得到的藻体上部的显微结构图；
图11为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例2处理后得到的藻体下部的显微结构图；
图12是具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理后的显微结构图；
图13是具节纤小丝状大型海藻样品在经对比例处理后的显微结构图；
图14为芋根江篱的囊果被细胞在经过实施例3处理前的显微结构图；
图15为芋根江篱的囊果被细胞在经过实施例3处理后的显微结构图；
图16为异枝江篱的囊果被细胞样品在经过实施例4处理前的显微结构图；
图17为异枝江篱的囊果被细胞样品在经过实施例4处理后的显微结构图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的范围。
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
实施例1选取的具节纤小丝状大型海藻样品为仙菜属物种Ceramium gardneriKylin。
一种染色试剂，包括以下组分：
对氯间二甲苯酚5ml；
冰醋酸45ml；
洋红试剂；
蒸馏水55ml；
其中，洋红试剂的添加量为过量。
一种获得具节纤小丝状大型海藻显微结构的方法，包括以下步骤：
S1配置所述的染色试剂：冰醋酸45ml，蒸馏水55ml，将上述的混合液煮沸至沸点，在其中加入过量洋红粉末直至不能溶解，等其冷却后滤过，再向滤液中加入5ml对氯间二甲苯酚后混匀，得到染色试剂；
S2选取目标样品，用毛刷清洁藻体表面2-3次，去除藻体表面的杂质和杂藻，切取所要观察的藻段；将所选的样品段放入染色槽中，加入染色试剂，密闭染色腐蚀约5小时；
S3用针管挑取腐蚀好的样品放置培养皿中，滴清水洗净多余染液，再加清水使样品轻悬浮，在解剖镜下用针灸针将样品一节节挑开，每一节即是一个样品横切面，该横切面不需盖片可直接在4X和10X物镜下选取特征拍照；
S4将环节切面用针灸针挑断，将断节小心平铺于载玻片上，盖上盖玻片使得断节平展开来，平展开的断节即是皮层结构。
S5加保湿防腐剂封片。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：选取的物种不同。
实施例2选取的具节纤小丝状大型海藻样品为爬管藻属物种。
一种染色试剂，包括以下组分：
对氯间二甲苯酚5ml；
冰醋酸45ml；
洋红试剂；
蒸馏水55ml；
其中，洋红试剂的添加量为过量。
一种获得具节纤小丝状大型海藻显微结构的方法，包括以下步骤：
S1取所要观察的样品，用毛刷清洁藻体表面2-3次，去除藻体表面的杂质和杂藻，切样品成带有3-4根有限枝的藻段；
S2将藻段转入染色槽中，加入染色试剂，染色并腐蚀约5小时；
S3染色及解离后的样品转入小烧杯中，用蒸馏水清洗样品3-4次，清洗藻段表面染液，后将藻段平整放置干净载玻片上，滴水盖片，吸净多余水液。
S4不断透过盖玻片轻压藻段，同时，将样品放置显微镜下观察看是否压散开，使藻段细胞单层铺平于载玻片上。滴加1-2滴封片液，封片。
S5在成像显微镜下拍照记录显微特征。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：样品不同。其中，实施例1为选取的具节纤小丝状大型海藻样品，实施例3选取的是芋根江篱的囊果被细胞样品。
实施例4
实施例4与实施例1的区别在于：样品不同。其中，实施例1为选取的具节纤小丝状大型海藻样品，实施例4选取的是异枝江篱的囊果被细胞样品。
对比例
对比例与实施例1的区别在于：染色试剂组分不同。其中，对比例的染色试剂组分为对氯间二甲苯酚、乳酸、苯胺蓝和蒸馏水。实施例1的染色试剂组分为对氯间二甲苯酚、冰醋酸、洋红试剂和蒸馏水。
经测试，对比例染色后的具节纤小丝状大型海藻样品，无法清晰观察四分孢子囊的发育。
性能测试：
对实施例1选取的具节纤小丝状大型海藻样品：仙菜属物种Ceramium gardneriKylin进行显微结构拍照。
其中，图1为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理前的400μm显微结构图。从图1中，无法看出具节纤小丝状大型海藻样品的皮层结构(C)及形成过程。
其中，图2为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理前的20μm显微结构图。
其中，图3为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理前的400μm下簇生假根的显微结构图。
其中，图4为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理前的20μm下四分孢子囊(T)环的显微结构图。
其中，图5为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例2处理前的100μm显微结构图。
其中，图6为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理中和处理后得到的显微结构图。图6中的A至I可基于皮层细胞间的胞间连丝清晰展示由一个围轴细胞(P)逐步形成成熟皮层组织的全过程。其中，图6中的A为一个围轴细胞；图6中的B为围轴细胞的左上角首先分裂出1级皮层细胞；图6中的C为随后在右上角分裂出1级皮层细胞；图6中的D为一级皮层细胞再进一步分裂出二级皮层细胞；图6中的E为在围轴细胞上端出现二级皮层细胞后，围轴细胞的左下角开始分裂出一级皮层细胞；图6中的F为围轴细胞上端开始出现3级皮层细胞，同时，围轴细胞的下端右边也开始分裂出二级皮层细胞；图6中的G为紧接着围轴细胞左下端也开始分裂出二级皮层细胞；图6中的H为上端出现围轴细胞上端开始出现4级皮层细胞，同时，围轴细胞正下方开始分裂出1个1级皮层细胞；图6中的I为一个成熟完成的皮层组织，包括围轴细胞向上两侧发育出4级皮层细胞，而向下两侧发育出3级皮层细胞，同时，在正下方发育出2级皮层细胞。即图6中的A-I为一个完整的皮层发育过程。由此可见，通过本发明的染色剂和方法，可以观察到样品皮层发育的过程。
其中，图7为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理后得到的节横切面显微结构图。从图7可以看出，经实施例1处理后获得的节横切面可清晰展示其围轴细胞(P)个数。而对应的图2中，无法展示围轴细胞(P)个数。
其中，图8为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理后得到的四分孢子囊(T)环显微结构图。从图8中，可清晰展示假根是由围轴细胞(P)和一级皮层细胞(C)生出。而相对应的图3中可见簇生假根，但无法知道假根是由围轴细胞(P)生出还是皮层细胞(C)生出。
其中，图9为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理后得到的四分孢子囊(T)的节横切面显微结构图。从图9中，基于四分孢子囊与围轴细胞的纹孔连接的节点可以清晰看出每个围轴细胞(P)可生出两个四分孢子囊(T)。而对应的图4，可见四分孢子囊(T)环生于节处，但无法知道四分孢子囊(T)是由哪个哪种细胞发育而来。
其中，图10为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例2处理后得到的藻体上部的显微结构图。
其中，图11为具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例2处理后得到的藻体下部的显微结构图。
从图10和图11中，可以清楚看出围轴细胞数及其变化规律。而相对应的图5中，无法看出围轴细胞个数。
图12是具节纤小丝状大型海藻样品在经实施例1处理后的显微结构图，在该图中，清晰显示了四分孢子囊发育的过程，其中，图12中的A为二分孢子囊；图12中的B为三分孢子囊；图12中的C为四分孢子囊。
图13是具节纤小丝状大型海藻样品在经对比例处理后的显微结构图，经测试，对比例染色后的具节纤小丝状大型海藻样品，无法清晰观察四分孢子囊的发育。基于对比例与实施例1的区别在于：染色试剂组分不同。其中，对比例的染色试剂组分为对氯间二甲苯酚、乳酸、苯胺蓝和蒸馏水。实施例1的染色试剂组分为对氯间二甲苯酚、冰醋酸、洋红试剂和蒸馏水，可以知晓，使用本发明实施例的染色试剂，能够清晰展示四分孢子囊发育的过程。
对实施例3芋根江篱的囊果被细胞样品进行测试，其中，图14为芋根江篱的囊果被细胞在经过实施例3处理前的显微结构图。图15为芋根江篱的囊果被细胞在经过实施例3处理后的显微结构图。从图14-15中，可以看出，在经过处理后的显微结构图中，可以清楚看清胞间连丝，从而佐证了本发明的染色试剂，能够促进细胞质壁分离，并且能够进一步使得胞间连丝变得很清晰。
对实施例4异枝江篱的囊果被细胞样品进行测试，其中，图16为异枝江篱的囊果被细胞样品在经过实施例4处理前的显微结构图。图17为异枝江篱的囊果被细胞样品在经过实施例4处理后的显微结构图。从图16-17中可以知晓，在经过实施例4处理后的显微结构图中，可以清楚看清胞间连丝，从而佐证了本发明的染色试剂，能够促进细胞质壁分离，并且能够进一步使得胞间连丝变得很清晰。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.使用染色试剂获得具节纤小丝状大型海藻显微结构的方法，其特征在于：
所述染色试剂，包括以下组分：
对氯间二甲苯酚；
酸性试剂；
洋红试剂；
溶剂；
所述溶剂为蒸馏水；
其中，所述对氯间二甲苯酚、酸性试剂和溶剂的体积比为5：45-80：55-80；
所述酸性试剂包括冰醋酸；
所述染色试剂的制备方法，包括以下步骤：
混合酸性试剂于溶剂中，得到混合液，将所述混合液煮沸至沸点，加入过量的洋红试剂，经冷却、过滤，向滤液中加入对氯间二甲苯酚，得到染色试剂；
使用所述染色试剂获得具节纤小丝状大型海藻显微结构的方法，包括以下步骤：
S1 混合海藻样品与所述染色试剂，得到染色后的样品；
S2 将海藻样品以节为单位进行分离，每一节即为一个样品的横切面；
S3 挑断步骤S2中分离后海藻的环节，将断节平展开来，通过显微镜观察显微结构。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酸性试剂还包括乳酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述对氯间二甲苯酚、酸性试剂和溶剂的体积比为5：45-50：55-60。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中，于密闭槽中混合样品与染色试剂，混合的时间为5-6h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中，还包括以下步骤：用毛刷清洁海藻样品。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S2中，将海藻样品以节为单位进行分离，所使用的分离工具包括针灸针。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S2中，还包括以下步骤：先以溶剂洗净海藻样品中多余的染色试剂，再加溶剂使海藻样品悬浮。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S3中，将断节平展开来，包括以下步骤：将断节平铺于载玻片上，盖上盖玻片。
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