KR20070073008A - 조직재생을 위한 히알루론산-기초된 주사형 하이드로겔 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아크릴화된 히알루론산 유도체 또는 이의 염, 이를 사용하여 제조된 하이드로겔, 이들의 제조 방법, 및 상기한 하이드로겔을 포함하는 조직 재생용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 하이드로겔은 생체 내 주사가 가능하여 결손 부위에 최소의 손상을 주면서 조직을 재생시키는데 이용할 수 있다.
히알루론산 유도체, 하이드로겔, 조직 재생
Description
도 1은 합성된 하이드로겔의 사진이다.
도 2는 FR-IR (Fourier transformed infrared) 분광학을 이용하여 아크릴화된 히알루론산을 확인한 것이다.
도 3은 유량계(rheometer)를 이용하여 하이드로겔 생성 속도를 측정한 그래프이다.
도 4는 히알루로니다제에 의한 히알루론산-기초된 하이드로겔의 분해 양상을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 하이드로겔을 사용하여 경조직 재생을 관측한 조직화학염색사진이다.
본 발명은 아크릴화된 히알루론산 유도체 또는 이의 염, 이를 사용하여 제조 된 하이드로겔, 이들의 제조 방법, 및 상기한 하이드로겔을 포함하는 조직 재생용 조성물에 관한 것이다.
하이드로겔은 조직공학 및 약물 전달 분야에서 널리 사용되는 물질로서, 하이드로겔에 약물 및 세포를 함께 포함시켜 조직 재생에 사용되고 있다. 종래에는 하이드로겔을 사용하여 지지체를 제조하여 왔으며, 생체 활성이 좋으며 생체에 적용하기 용이한 주사형 지지체의 개발이 다양하게 시도되어 왔다.
조직 재생용 하이드로겔의 개발은 다양한 물질을 사용하여 다양한 방법으로 수행되어 왔다. 기본적으로 사용되는 물질은 생체 적합성이 좋은 것으로 알려진 고분자로 PEG 등이 사용되어져 왔으나, 생체 외에서 유래한 물질들은 여러 가지 한계점을 가지고 있다.
생체 내 물질을 사용하여 조직공학용 지지체를 만드는 시도들이 행해져 왔으며, 그 중의 하나가 히알루론산 (Hyaluronic acid)을 이용하는 방법이다.
히알루론산은 연골 및 연조직에 넓게 퍼져있는 생체 내 물질로, 생체 적합성이 좋으며 단일 체인으로 구성되어 있는 고분자로서, 면역반응이 없는 비부착성 글리코사민글리칸이다. 세포의 표면물질과 반응을 하여 세포의 생장 및 분화를 조절하는 능력도 가지고 있어, 조직공학 및 약물전달용 물질로 사용되어 왔다.
히알루론산은 일작용성 및 다작용성 하이드라지드를 이용하여 화학적으로 변형이 시키거나 (Prestwich, G.D., et al., Controlled chemical modification of hyaluronic acid : synthesis, applications , and biodegradation of hydrazide derivatives . J Control Release, 1998. 53(1-3): p. 93-103.), 메타크릴레이트 그룹을 이용하여 변형시키거나 (Park, Y.D., N. Tirelli, and J.A. Hubbell, Photopolymerized hyaluronic acid - based hydrogels and interpenetrating networks . Biomaterials, 2003. 24(6): p. 893-900.과 Baier Leach, J., et al., Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels : Natural , biodegradable tissue engineering scaffolds . Biotechnol Bioeng, 2003. 82(5): p. 578-89.), 아미노 또는 알데하이드를 이용하여 변형시킨 바 있다 (Bulpitt, P. and D. Aeschlimann, New strategy for chemical modification of hyaluronic acid : preparation of functionalized derivatives and their use in the formation of novel biocompatible hydrogels. J Biomed Mater Res, 1999. 47(2): p. 152-69.). 이렇게 변형된 히알루론산을 이용하여 많은 연구자들은 새로운 지지체를 만들었으며, Leach 등 (Leach, J.B. and C.E. Schmidt, Characterization of protein release from photocrosslinkable hyaluronic acid - polyethylene glycol hydrogel tissue engineering scaffolds . Biomaterials, 2005. 26(2): p. 125-35.)은 분해속도를 조절하고, BSA(bovine serum albumin)를 분비하는 글리시딜 메타크릴레이트-히알루론산 (GMHA) 하이드로겔을 만들었다. 또한, Kisiday 등 (Kisiday, J., et al., Self - assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division : implications for cartilage tissue repair . Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(15): p. 9996-10001.)은 연골 재생을 위한 펩타이드 수화겔 내에 연골세포를 넣는 기술을 개발하여 자가 조합의 펩타이드 수화겔 지 지체를 만들었다. 그러나, 기존의 수화겔 지지체들은 교차결합 반응속도가 빠르지 못하고, 주사 주입이 가능하지 못했다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자는 히알루론산을 기초한 생체적합성이 높은 생분해성 하이드로겔을 제조하고자 하였다. 본 발명의 신규한 히알루론산 유도체는 생체와 같은 환경에서 가교결합제에 의해 수분 내에 겔을 형성하며, 이를 생체 내 주사함으로써 손상된 부위를 절개하는 등의 조처 없이도 조직이 재생되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 히알루론산을 이용하여 생체적합성이 높은 생분해성 하이드로겔 및 생체 내 환경에서 겔화될 수 있어 손상된 조직에 바로 적용이 가능한 조직 재생용의 주사형 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명자는 생체적합성이 높은 생분해성 하이드로겔을 개발하기 위해 생체 내 고분자인 히알루론산을 사용하였으며, 체내 환경에서 하이드로겔이 만들어지도록 하기 위하여, 히알루론산을 변형하였다.
하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1의 아크릴화된 히알루론산 유도체 또는 이의 염에 관한 것이다:
상기식에서, R은 
이고, n은 4 내지 8이다.
치환기 R에서 n은 바람직하게는 4이다.
본원에 사용된 히알루론산은, 특별히 제한되지는 않으나, 일반적으로 천연 물질, 바람직하게는 척추동물 또는 미생물로부터 유래되는 것을 사용할 수 있다. 히알루론산의 분자량은 통상적으로 400,000 내지 10,000,000, 바람직하게는 600,000 내지 6,000,000 이다. 히알루론산의 카복실 그룹의 형태는 염의 형태를 취할 수 있으며, 이러한 경우 알칼리 금속염, 또는 알칼리 토금속염의 형태일 수 있다. 이러한 염은 나트륨염 또는 칼륨염이 바람직하다.
히알루론산은 조직으로부터 추출하거나 생합성될 수 있으며, 이와 관련한 많은 선행 문헌이 공지되어 있다 (대한민국 특허 출원 10-1987-0014225 (1987.12.12), 10-1989-0009566 (1989.07.06), 10-1985-0003599 (1985.05.24)). 예를 들어, 조직으로부터 추출하는 경우에는 닭의 볏, 관절의 활액, 사람 탯줄 조직, 소 기관지 등으로부터 추출할 수 있으며, 미생물로부터 얻는 경우에는 비용혈성 스트렙토코커스 속에 속하는 미생물을 배양하여 수득할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은
a) 히알루론산을 중합화제의 존재 하에 화학식 2의 디아민과 반응시키는 단계 및
b) 단계 a)에서 얻어진 생성물을 아크릴화제와 반응시키는 단계를 포함하여, 화학식 1의 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 생성하는 방법에 관한 것이다:
화학식 1
상기식에서, R은 
이고, n은 4 내지 8이다.
치환기 R에서 n은 바람직하게는 4이다.
상기한 방법은 히알루론산의 COOH 그룹에 아크릴 그룹을 유도하기 위해 2 단계 공정을 이용하였다. 하나의 구체적 양태로서, 하기 반응식 1을 예로 들어 설명하고자 한다.
먼저, 상온에서 히알루론산(0.25 mmole; 반복 단위 MW에 기초함)을 증류수에 녹여 중합반응제인 EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodimide)의 존재 하에 아디프산 디하이드라지드와 반응시킨다. 이어서, 아민 그룹이 유도된 히알루론산에 포름아마이드에 녹인 N-아크릴옥시숙신이미드 (N-acryloxysuccinimide)와 상온에서 반응시켜 최종적으로 아크릴 그룹이 도입된 히알루론산 유도체를 제조한다. 상기 반응에서 중합반응제로는 커플링제인EDC와 함께 촉매제인 HOBT (0.17g, 1.25 mmole) 등이 사용 가능하다. 상기한 반응에서, N-아크릴옥시숙신이미드는 아크릴화제로 사용된다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 티올 그룹을 갖는 가교결합제로 가교결합시킨 하이드로겔에 관한 것이다.
바람직하게는, 티올 그룹을 갖는 가교결합제는 티올레이티드 폴리(에틸렌 글리콜), 티올 그룹이 있는 펩타이드 등 이다.
보다 바람직하게는, 티올 그룹을 갖는 가교결합제는 화학식 3의 그룹이다:
빛에 의해 겔 제작이 가능한 히알루론산-기초된 하이드로겔을 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트를 가교결합제로 이용하여 제작한 바 있었으나, 본 발명은 광중합 하에서가 아닌 미카엘 타입 부가 반응 (Michael type addition reaction) 반응을 이용하여, 생체 내에서도 하이드로겔을 형성이 가능한 주사형 하이드로겔을 제조하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 티올 그룹을 갖는 가교결합제와 미카엘 부가 반응시켜 하이드로겔을 생성하는 방법에 관한 것이다.
생체 내의 반응 조건에서 겔이 만들어지도록 하기 위해 아크릴 그룹과 특이적으로 반응하는 티올 그룹이 있는 다양한 고분자 물질과 반응시켰다. 바람직하게는, 티올 그룹이 있는 폴리(에틸렌 글리콜), 티올 그룹이 있는 펩타이드를 사용할 수 있다.
상기 방법에서, 티올 그룹을 갖는 가교결합제는 보다 바람직하게는 상기 화학식 3의 그룹이다.
하나의 구체적 양태로서, 하기 반응식 2을 예로 들어 설명하고자 한다.
상기 겔 형성 반응은 아크릴화된 히알루론산을 트리에탄올아민-완충된 용액 (TEA)에 녹여 1% (w/v)용액을 만들고 티올 그룹을 갖는 가교결합제인 티올 그룹이 들어간 다양한 분자를 아크릴 그룹과 티올 그룹의 몰비가 1:1이 되게 넣어주어 37℃ 조건 하에서 반응시킨다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 하이드로겔을 포함하는 조직 재생 또는 재흡착 방지용 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 티올 그룹이 있는 다양한 화합물 중에서 선택된 바이오분자(biomolecule)를 추가로 포함할 수 있으며, 그 예로서 매트릭스 메탈로 프로테아제 에 의해 분해되는 서열을 가진 펩타이드, 플라스민에 의해 분해되는 서열을 가진 펩타이드 등을 포함한다.
또한, 본 발명의 상기한 히알루론산 유도체/히알루론산-기초된 하이드로겔은 본원 발명 이전에 공지된 모든 이용에 적용할 수 있으며, 구체적으로 바이오메디칼 물질, 예를 들어 조직재생용 지지체 (예를 들어, 손상 조직 삽입물, 성형 보조물), 약물 전달체; 항접착제 (예를 들어, 수술 동안 또는 수술 후 재흡착 방지제); 관절액, 초자체액 대용물 등으로 사용할 수 있다.
바람직하게는, 상기 조성물은 조직 재생을 위해 사용할 수 있으며, 그 예로는 세포치료법과 병행하여 신경 재생, 심장 재생. 경조직 재생 등에 사용 가능하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 히알루론산 유도체 또는 이의 염 및 티올 그룹을 갖는 가교결합제를 포함하는, 주사가능한 하이드로겔 생성 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따라 제조된 히알루론산 유도체는 생체 내에 주사하여 히알루론산-기초된 하이드로겔을 생성할 수 있어 뼈, 신경 등 결손된 조직에 최소의 손상을 주고 이들 결손된 조직을 재생하는데 사용할 수 있다.
상기 조성물에는 다양한 바이오분자를 첨가할 수 있어, 이들 물질들의 활성이 유지된 채로 생체 내 전달이 가능하다
이하, 실시예를 들어 본 발명은 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나, 본 발명이 이들 구체적 예로 한정되는 것은 아니며, 이는 단지 설명을 위한 것으로 간주되어야 하며, 첨부된 특허청구범위의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다.
실시예
제조실시예
1: 히알루론산 유도체의 제조
히알루론산 (Lifecore Biomedical Co. (Chaska, MN, USA))을 증류수 40 ml에 녹여 0.25 mmole을 만든 후, EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodimide) (Sigma-Aldrich Inc, (St. Louis. MO. USA) (0.24g, 1.25 mmole)의 존재 하에 아디프산 디하이드라지드 (Fluka Chemical Co. (Buchs, Switzerland) (2.2 g, 12. 5 mmole)와 반응시키고, 아민 그룹이 유도된 히알루론산에 포름아마이드에 녹인 N-아크릴옥시숙신이미드 (Polyscience Inc, (Sarrington, PA, USA) (0.5 g, 3 mmole)와 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이어서, 반응물을 투석 분리하여 동결 건조하고 최종적으로 아크릴 그룹이 도입된 히알루론산 유도체를 제조하였다. 아크릴화된 히알루론산은 FT-IR 분광학 (도 2)과 1H-NMR로 확인하였다.
제조
실시예
2:
하이드로겔의
제조
겔 형성 반응은 아크릴화된 히알루론산을 트리에탄올아민-완충 용액 (TEA; 0.3M, pH 8)에 녹여 1% (w/v)용액을 만들고 티올 그룹을 갖는 가교결합제인 티올레이티드 폴리(에틸렌 글리콜)을 아크릴 그룹과 티올 그룹의 몰비가 1:1이 되게 넣어주어 37℃ 조건 하에서 반응시켜 제조하였다.
실험실시예
1:
하이드로겔의
형성 속도 측정
히알루론산-기초된 하이드로겔은 생체와 같은 환경 (37℃, pH 7.4)에서 수분 내에 겔이 만들어지는 것을 확인하였으며, 완전하게 하이드로겔 반응이 되는 것은 30분 이내임을 확인하였다 (도 3). 하이드로겔 반응 속도는 Rotational Rheometer Gemini (Bohlin Instruments Ltd., Germany)를 사용하여 측정하였다. 1 ml의 아크릴화된 히알루론산과 티올레이티드 폴리(에틸렌 글리콜) 용액을 샌드블라스트 평형 플레이트 (sandblast parallel plate; 직경 15 mm) 위에 올려놓고, 37°C, 500um 갭, 0.1 % 스트레인의 타임 스윕 (time sweep) 측정을 하였고, 0.1 내지 10 rad/s, strain at 0.1% at 20°C에서 frequency sweep 측정을 하였다. 젤이 완전히 형성 된 후, 점성 계수와 탄성 계수를 1 시간 동안 관찰하여 확인한 결과 170 Pa, 2800 Pa로 나타났다.
실험실시예
2:
하이드로겔의
분해 속도 측정
히알루론산-기초된 하이드로겔이 히알루로니다제에 의해 분해되는 양상을 확인하기 위하여 하이드로겔의 조성을 변경하면서 실험한 결과 (아크릴화된 히알루론산과 티올레이티드 폴리(에틸렌 글리콜)의 몰 비율이 (A) 1:1, (B) 1:2, (C) 1:4 즉, (A)의 경우에는 아크릴화된 히알루론산 10mg을 TEA (0.3M, pH 8)에 녹여 1% (w/v)로 만든 용액에 티올레이티드 폴리(에틸렌 글리콜) 30mg을 넣어주었고, (B)의 경우에는 아크릴화된 히알루론산 10mg을 TEA (0.3M, pH 8)에 녹여 1% (w/v)로 만든 용액에 티올레이티드 폴리(에틸렌 글리콜) 60mg을 넣어주었고, (C)의 경우에는 아크릴화된 히알루론산 10mg을 TEA (0.3M, pH 8)에 녹여 1% (w/v)로 만든 용액에 티올레이티드 폴리(에틸렌 글리콜) 120mg을 넣어주었다. 히알루론산의 조성이 높은 샘플 (A)의 분해가 가장 많이 되는 것으로 확인되었으며, 조성비가 가장 낮은 샘플 (B)의 경우 분해가 느린 것을 확인할 수 있었다 (도 4).
실험실시예
3:
하이드로겔의
경조직
재생 효과
하이드로겔을 제작할 때에, 사람의 중간엽줄기세포와 500 ng의 BMP (bone morphogenic protein)-2 (R&D Systems)를 첨가하였으며, 모델 시스템으로는 carvarial 결손 래트 (Male Sprague Dawley albino rats)를 사용하였다. 도 5는 조직 재생에 대한 결과를 보이는 Masson 삼색 염색에 따른 조직화학염색사진이다. 도 5a는 히알루론산 하이드로겔, 도 5b는 히알루론산 하이드로겔 + BMP-2, 도 5c는 히알루론산 하이드로겔 + 줄기 세포, 도 5d는 히알루론산 하이드로겔 + 스템 세포 + BMP-2에 대한 것이다. 줄기 세포와 BMP를 첨가한 샘플에서 골 형성이 가장 우수하였다. 또한, 4주 이내에 하이드로겔이 생체 내에서 분해되는 것을 확인하였으며, 다른 염증 등의 부작용은 관찰되지 않았다.
본 발명에 따라 제조된 히알루론산 유도체는 생체 내에 주사하여 히알루론산-기초된 하이드로겔을 생성할 수 있어 뼈, 신경 등 결손된 조직에 최소의 손상을 주고 이들 결손된 조직을 재생하는데 사용할 수 있다. 또한, 다양한 바이오분자를 첨가할 수 있어, 이들 물질들의 활성이 유지된 채로 생체 내 전달이 가능하다. 또한, 히아루론산-기초된 하이드로겔은 바이오메디칼 물질, 예를 들어 항접착제 (예를 들어 수술 동안 또는 후 재흡착 방지) 등으로 사용할 수 있다.
Claims (15)
- 하기 화학식 1의 아크릴화된 히알루론산 유도체 또는 이의 염.화학식 1
상기식에서, R은이고, n은 4 내지 8이다.
- 제1항에 있어서, n이 4인 히알루론산 유도체 또는 이의 염.
- a) 히알루론산을 중합화제의 존재 하에 화학식 2의 디아민과 반응시키는 단계 및 b) 단계 a)에서 얻어진 생성물을 아크릴화제와 반응시키는 단계를 포함하여, 화학식 1의 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 생성하는 방법.화학식 1
화학식 2
상기식에서, R은이고, n은 4 내지 8이다.
- 제3항에 있어서, 아크릴화제가 N-아크릴옥시숙신이미드인 방법.
- 제1항의 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 티올 그룹을 갖는 가교결합제로 가교결합시킨 하이드로겔.
- 제5항에 있어서, 티올 그룹을 갖는 가교결합제가 티올레이티드 폴리에틸렌 글리콜 또는 티올 그룹이 있는 펩타이드인 하이드로겔.
- 제6항에 있어서, 티올 그룹을 갖는 가교결합제가 화학식 3의 그룹인 하이드로겔.화학식 3
- 제1항의 히알루론산 유도체 또는 이의 염을 티올 그룹을 갖는 가교결합제와 미카엘 부가 반응 (Michael addition reaction)시켜 하이드로겔을 생성하는 방법.
- 제8항에 있어서, 티올 그룹을 갖는 가교결합제가 티올레이티드 폴리에틸렌 글리콜 또는 티올 그룹이 있는 펩타이드인 방법.
- 제9항에 있어서, 티올 그룹을 갖는 가교결합제가 화학식 3의 그룹인 방법.화학식 3
- 제5항의 하이드로겔을 포함하는 조직 재생 또는 재흡착 방지용 조성물.
- 제11항에 있어서, 매트릭스 메탈로 프로테아제 분해 펩타이드, 플라스민 분해 서열을 포함하는 펩타이드 중에서 선택된 바이오분자를 추가로 포함하는 조성물.
- 제1항의 히알루론산 유도체 또는 이의 염 및 티올 그룹을 갖는 가교결합제를 포함하는, 주사가능한 하이드로겔 생성 조성물.
- 제13항에 있어서, 매트릭스 메탈로 프로테아제 분해 펩타이드, 플라스민 분해 서열을 포함하는 펩타이드 중에서 선택된 바이오분자를 추가로 포함하는 조성물.
- 제13항에 있어서, 조직 재생용인 조성물.
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