KR101750148B1

KR101750148B1 - 세포 배양 시스템 및 세포 배양 방법

Info

Publication number: KR101750148B1
Application number: KR1020147029902A
Authority: KR
Inventors: 우시오 이와모토; 미치 사토; 가나코 고니시; 가츠히사 마츠우라; 다츠야 시미즈; 데루오 오카노
Original assignee: 아사히 가세이 가부시키가이샤; 각코우 호우진 도쿄 죠시 이카다이가꾸
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-04-24
Publication date: 2017-06-22
Anticipated expiration: 2033-04-24
Also published as: EP2843036A4; CN104321419B; US10717961B2; TW201400613A; TWI576433B; CN104321419A; EP2843036A1; WO2013161885A1; US20150118745A1; JP6408910B2; JPWO2013161885A1; KR20150013469A

Abstract

세포 배양조와, 성분 조정액 저류조와, 세포 배양액의 입구와 출구를 갖는 배양액 성분 조정 수단과, 세포 배양조로부터 배양액 성분 조정 수단의 입구에 접속된 입구 접속 송액 회로와, 세포 배양조로부터 배양액 성분 조정 수단의 출구에 접속된 출구 접속 송액 회로와, 입구 접속 송액 회로로부터 배양액 성분 조정 수단을 거쳐 출구 접속 송액 회로에 세포 배양액을 관류하는 수단과, 세포 배양조의 액량을 조정하는 수단을 구비하는 세포 배양 시스템으로서, 배양액 성분 조정 수단을 통해 세포 배양조 내의 세포 배양액의 성분과 성분 조정액 저류조 내의 성분 조정액의 성분을 연속적으로 조정 가능함과 동시에, 세포 배양조 내의 세포 배양액의 양을 실질적으로 일정하게 조정 가능한, 세포 배양 시스템.

Description

세포 배양 시스템 및 세포 배양 방법{CELL CULTURE SYSTEM AND CELL CULTURE METHOD}

본 발명은 세포 배양 시스템 및 세포 배양 방법에 관한 것이다.

최근, 종래의 합성 화학 물질을 주성분으로 한 의약품에 더하여 생명 공학 기술을 이용하여 생산된 생물 재료를 기원으로 하는 의약품인 생물 제제의 이용이 확대되고 있다. 생물 제제 중에서도 특히 놀라운 것이 항체 등의 세포 생산물이다. 이들 생물 제제는 그 효과가 매우 높지만, 고가인 것이 과제로 되어 있다. 또한 생물로부터의 생산물이기 때문에 제조 공정 중에 품질의 변동 등이 종래의 의약품에 비해서 커질 가능성도 있다. 따라서, 한번에 보다 대량으로 세포를 배양하여, 생산물을 저렴하게 제조하는 시스템의 개발이나, 배양 환경을 안정적으로 유지할 수 있으며 세포의 품질을 유지함으로써 생산물의 품질을 향상시키는 것이 가능한 배양 시스템이 요구되고 있다.

또한, 최근에는 세포를 치료에 이용하는 재생 의료가 실용화되기 시작하고 있다. 현재 일본에서도 피부나 연골 조직에서는, 약사 승인을 받아 시판되고 있는 제품이 있다. 현재에는 환자의 세포를 일부 채취하여, 이것을 증식시킨 후 조직을 만들어 이식한다고 하는 치료 방법으로 되어 있지만, 장래적으로는 체성 줄기 세포나 다능성 줄기 세포로부터 원하는 세포를 유도하여 치료에 이용하는 것이 실용화될 것으로 예상된다. 이러한 치료가 실현되는 경우, 환자에게 이식 가능한 크기의 조직을 제작하기 위해서는, 매우 다량의 세포가 필요로 된다. 심장의 좌심실을 예로 들면 10^9개 오더의 세포수가 필요하다고 추산된다. 이러한 대량의 배양 세포를 준비하기 위해서는, 현재의 기술 수단에서는 상당한 수고와 비용이 필요하다.

또한 현재 상태의 세포 배양 공정의 대부분은 사람이 수동 조작으로 실시하고 있기 때문에, 조작 미스나 배양계에의 균등의 혼입의 리스크도 완전하게는 부정할 수 없다.

이상으로부터 세포를 보다 고밀도로 배양할 수 있고, 게다가 저비용이며, 자동으로 실시 가능한 유효한 배양 시스템의 실현이 요구되고 있다. 이러한 요구 사항을 만족시키는 배양 시스템으로서 반투막을 이용한 투석의 원리를 이용하여 배양액을 연속적으로 정화하면서 배양하는 각종 시스템이 제안되어 있다(예컨대, 특허문헌 1, 2 참조).

그러나, 이들 시스템으로 세포 배양을 행하면, 배양액을 관류함으로써 생기는 반투막의 외측과 내측의 압력차나 성분의 농도 구배에 의해 막을 통한 배양액 용매의 이동이 생겨, 장시간의 배양을 실시하면 조 내의 액량이 감소 또는 증가하여 배양조 내의 액량을 컨트롤하는 것이 어렵기 때문에 안정된 배양이 어렵다고 하는 과제가 있다. 또한, 통상 이들 시스템에 의한 배양에서는 배양액의 조성 변화를 적게 하기 위해 관류의 속도를 될 수 있는 한 높게 하는 요구가 있지만, 관류 속도를 올릴수록 상기 컨트롤도 곤란해진다고 하는 과제도 있다. 또한, 배양 스케일을 크게 하는 것도 관류 속도를 크게 하는 것이 되어, 역시 동일한 과제가 발생한다.

또한 그 외의 방법으로서 비특허문헌 1에는 로터형의 세포 배양조에 투석 수단을 접속하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 배양조는 일반적으로 널리 사용되고 있는 세포 배양 장치와는 상이한 특수한 세포 배양조가 필요하며, 또한 스케일 업이 곤란하다고 하는 과제가 있다.

특허문헌 1: 일본 특허 공개 소화63-226279호 공보 특허문헌 2: 일본 특허 공개 평성7-40928호 공보

비특허문헌1 : Biotechnology and Bioengineering, 2005; 92(7): 920

본 발명은 이상에서 서술한 과제를 해결하기 위한 세포 배양 시스템을 제공한다. 즉, 여러가지 세포의 배양 형태에 대응 가능하며, 저비용, 생력화, 고밀도 배양을 동시에 달성할 수 있는 시스템을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 행한 결과, 배양액 성분 조정 수단을 통해 세포 배양조 내의 세포 배양액과 성분 조정액 저류조 내의 성분 조정액이 연속적으로 성분을 조정 가능함과 동시에, 세포 배양조 내의 배양액량을 실질적으로 일정하게 조정 가능한 것을 특징으로 하는 세포 배양 시스템에 의해, 여러가지 세포의 배양 형태에 대응 가능하며, 저비용, 생력화, 고밀도 배양을 동시에 달성할 수 있고 또한 스케일 업을 용이하게 달성할 수 있는 시스템을 제공할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 양태는, 세포를 배양하기 위한 세포 배양조와, 성분 조정액 저류조와, 세포 배양액 및/또는 성분 조정액의 입구와 출구를 가지며, 반투막을 구비하는 배양액 성분 조정 수단과, 세포 배양조 및/또는 성분 조정액 저류조로부터 배양액 성분 조정 수단의 입구에 접속된 입구 접속 송액 회로와, 세포 배양조 및/또는 성분 조정액 저류조로부터 배양액 성분 조정 수단의 출구에 접속된 출구 접속 송액 회로와, 입구 접속 송액 회로로부터 배양액 성분 조정 수단을 거쳐 출구 접속 송액 회로에 세포 배양액 및/또는 성분 조정액을 관류하는 수단과, 세포 배양조의 액량을 조정하는 수단을 구비하는 세포 배양 시스템으로서, 배양액 성분 조정 수단을 통해 세포 배양조 내의 세포 배양액의 성분과 성분 조정액 저류조 내의 성분 조정액의 성분을 연속적으로 조정 가능함과 동시에, 세포 배양조 내의 세포 배양액의 양을 실질적으로 일정히 조정 가능한, 세포 배양 시스템이다.

예컨대, 세포 배양 시스템은, 배양액 성분 조정 수단이 성분 조정액 저류조 내에 배치되어 있으며, 배양액 성분 조정 수단이 세포 배양액의 입구와 출구를 가지고, 입구 접속 송액 회로가 세포 배양조로부터 배양액 성분 조정 수단의 입구에 접속되어 있으며, 출구 접속 송액 회로가 세포 배양조로부터 배양액 성분 조정 수단의 출구에 접속되어 있고, 관류하는 수단이, 입구 접속 송액 회로로부터 배양액 성분 조정 수단을 거쳐 출구 접속 송액 회로에 세포 배양액을 관류하여도 좋다.

혹은, 세포 배양 시스템은, 배양액 성분 조정 수단이 세포 배양조 내에 배치되어 있으며, 배양액 성분 조정 수단이 성분 조정액의 입구와 출구를 가지고, 입구 접속 송액 회로가 성분 조정액 저류조로부터 배양액 성분 조정 수단의 입구에 접속되어 있으며, 출구 접속 송액 회로가 성분 조정액 저류조로부터 배양액 성분 조정 수단의 출구에 접속되어 있고, 관류하는 수단이 입구 접속 송액 회로로부터 배양액 성분 조정 수단을 거쳐 출구 접속 송액 회로에 성분 조정액을 관류하여도 좋다.

혹은, 세포 배양 시스템은, 배양액 성분 조정 수단이 성분 조정액 저류조 및 세포 배양조의 외부에 설치되어 있으며, 입구 접속 송액 회로가, 세포 배양조로부터 배양액 성분 조정 수단의 제1 입구에 접속된 제1 입구 접속 송액 회로와, 성분 조정액 저류조로부터 배양액 성분 조정 수단의 제2 입구에 접속된 제2 입구 접속 송액 회로를 포함하고, 출구 접속 송액 회로가, 세포 배양조로부터 배양액 성분 조정 수단의 제1 출구에 접속된 제1 출구 접속 송액 회로와, 성분 조정액 저류조로부터 배양액 성분 조정 수단의 제2 출구에 접속된 제2 출구 접속 송액 회로를 포함하며, 제1 입구와 제1 출구를 연결하는 공간과, 제2 입구와 제2 출구를 연결하는 공간을, 반투막이 구성하고, 관류하는 수단이, 제1 입구 접속 송액 회로로부터 배양액 성분 조정 수단을 거쳐 제1 출구 접속 송액 회로에 세포 배양액을 관류하는 수단과, 제2 입구 접속 송액 회로로부터 배양액 성분 조정 수단을 거쳐 제2 출구 접속 송액 회로에 성분 조정액을 관류하는 수단을 포함하고 있어도 좋다.

관류하는 수단은, 세포 배양조의 세포 배양액 및/또는 성분 조정액 저류조의 성분 조정액을 배양액 성분 조정 수단에 송액하는 송액 수단과, 배양액 성분 조정 수단에 송액되며, 세포 배양액 중의 불필요 물질과 성분 조정액 중의 유용 물질을 접촉시킨 세포 배양액 및/또는 성분 조정액을 반송하는 액 반송 수단를 구비하고, 송액 수단의 1시간당의 송액량(V1)과, 액 반송 수단의 1시간당의 반송량(V2)이, 0.9×V1≤V2≤1.1×V1이며, 세포를 포함한 세포 배양액의 총량의 변동이 10％ 이내여도 좋다.

세포 배양 시스템은, 입구 접속 송액 회로 혹은 제1 입구 접속 송액 회로에 설치된, 세포 배양조 내측 단부에 세포 또는 세포 응집 덩어리를 통과시키지 않고, 세포 배양액을 실질적으로 통과시키는 필터를 더 구비하고 있어도 좋다.

또한, 본 발명의 양태는, a) 상기 세포 배양 시스템을 설치하는 것과, b) 세포 배양조에, 세포 및 세포 배양액을 공급하여, 성분 조정액 저류조에 배양액 성분 조정액을 공급하는 것과, c) 세포 배양액 및/또는 성분 조정액을 연속적으로 관류하는 것을 포함하고, 송액 수단의 1시간당의 송액량(V1)과, 액 반송 수단의 1시간당의 반송량(V2)을, 0.9×V1≤V2≤1.1×V1이 되도록 제어하며, 또한 세포를 포함한 세포 배양액의 총량의 변동이 10％ 이내가 되도록 제어하는, 세포 배양 방법이다.

또한, 본 발명의 별도의 양태는, 적어도, 세포 및 세포 배양액이 넣어지며, 세포를 배양하는 세포 배양조와, 유용 물질을 함유하는 성분 조정액이 넣어지는 성분 조정액 저류조와, 세포 배양액과 성분 조정액을 접촉시켜 물질 교환을 행하는 배양액 성분 조정 수단과, 세포 배양조의 세포 배양액 및/또는 성분 조정액 저류조의 성분 조정액을 배양액 성분 조정 수단에 송액하는 송액 수단과, 접촉시킨 세포 배양액 및/또는 성분 조정액을 반송하는 액 반송 수단을 구비하고, 송액 수단의 1시간당의 송액량(V1)과, 액 반송 수단의 1시간당의 반송량(V2)이, 0.9×V1≤V2≤1.1×V1이며, 세포 배양액의 세포를 포함한 세포 배양액의 총량의 변동이 10％ 이내인, 세포 배양 시스템이다.

또한 혹은, 본 발명의 양태는, 적어도, 세포 및 세포 배양액을 세포 배양조에 넣어, 세포를 배양하는 공정과, 세포 배양조의 세포 배양액 및/또는 성분 조정액 저류조의 성분 조정액을 송액하는 공정과, 세포 배양액과 성분 조정액을, 막을 통해 접촉시키는 공정과, 막을 통해 접촉한 세포 배양액 및/또는 성분 조정액을 반송하는 공정을 포함하고, 송액하는 공정에서의 1시간당의 송액량(V1)과, 반송하는 공정의 1시간당의 반송량(V2)이, 0.9×V1≤V2≤1.1×V1이며, 세포 배양액의 세포를 포함한 세포 배양액의 총량의 변동이, 10％ 이내인, 세포 배양 방법이다.

상기 세포 배양 시스템 및 세포 배양 방법에 있어서, 예컨대, 세포는 포유 동물 세포이며, 포유 동물 세포는, 배아 줄기 세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 간엽계 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 및/또는 이들로부터 분화 유도된 세포이다.

또한, 상기한 세포 배양 시스템 및 세포 배양 방법에 있어서, 예컨대, 세포는, 부유 배양 가능한 세포, 접착 세포, 세포 응집체를 형성하는 세포, 및/또는 입자형 담체에 접착 가능한 세포이며, 입자형 담체에 접착 가능한 세포는, 세포 배양조에 세포 및 입자형 담체를 넣어 배양된다.

본 발명에 따른 세포 배양 시스템은, 여러가지 세포의 배양 형태에 대응 가능하며, 저비용, 생력화, 고밀도 배양을 동시에 달성할 수 있는 시스템을 제공할 수 있다.

도 1은 세포 배양 시스템의 일례를 나타내는 모식도이며, 배양액 성분 조정 수단을 성분 조정액조 내에 설치한 예를 나타내는 모식도이다.
도 2는 세포 배양 시스템의 일례를 나타내는 모식도이며, 배양액 성분 조정 수단을 성분 조정액조 내에 설치하고, 또한 세포 배양조 내에 세포가 통과하지 않는 필터를 설치한 예를 나타내는 모식도이다.
도 3은 세포 배양 시스템의 일례를 나타내는 모식도이며, 배양액 성분 조정 수단을 세포 배양조 내에 설치한 예를 나타내는 모식도이다.
도 4는 세포 배양 시스템의 일례를 나타내는 모식도이며, 배양액 성분 조정 수단을 세포 배양조, 및 성분 조정액 저류조의 외부에 독립적으로 설치한 예를 나타내는 모식도이다.
도 5는 세포 배양 시스템의 일례를 나타내는 모식도이며, 배양액 성분 조정 수단을 세포 배양조, 및 성분 조정액 저류조의 외부에 독립적으로 설치하고, 또한 세포 배양조 내에 세포가 통과하지 않는 필터를 설치한 예를 나타내는 모식도이다.
도 6은 세포 배양조 내세포 배양액의 pH 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 세포 배양조 내세포 배양액의 젖산 농도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 배양체(배양 10일째)의 원상당 직경 분포를 나타내는 그래프이다.
도 9는 배양체(배양 10일째) 내 아포토시스 세포의 염색도를 나타내는 그래프이다.

이하에 본 발명의 실시형태를 설명한다. 이하의 도면의 기재에 있어서, 동일 또는 유사한 부분에는 동일 또는 유사한 부호로 표시하고 있다. 단, 도면은 모식적인 것이다. 따라서, 구체적인 치수 등은 이하의 설명을 대조하여 판단하여야 하는 것이다. 또한, 도면 상호간에 있어서도 서로의 치수 관계나 비율이 상이한 부분이 포함되어 있는 것은 물론이다.

본 실시형태에 따른 세포 배양 시스템은, 도 1에 나타내는 바와 같이, 세포를 배양하기 위한 세포 배양조(1)와, 성분 조정액 저류조(2)와, 세포 배양액(9) 및/또는 성분 조정액(10)의 입구와 출구를 가지고, 반투막을 구비하는 배양액 성분 조정 수단(3)과, 세포 배양조(1) 및/또는 성분 조정액 저류조(2)로부터 배양액 성분 조정 수단(3)의 입구에 접속된 입구 접속 송액 회로(5)와, 세포 배양조(1) 및/또는 성분 조정액 저류조(2)로부터 배양액 성분 조정 수단(3)의 출구에 접속된 출구 접속 송액 회로(4)와, 입구 접속 송액 회로(5)로부터 배양액 성분 조정 수단(3)을 거쳐 출구 접속 송액 회로(4)에 세포 배양액(9) 및/또는 성분 조정액(10)을 관류하는 수단(7, 6)과, 세포 배양조(1)의 액량을 조정하는 수단을 구비하는 세포 배양 시스템으로서, 배양액 성분 조정 수단(3)을 통해 세포 배양조(1) 내의 세포 배양액(9)의 성분과 성분 조정액 저류조(2) 내의 성분 조정액(10)의 성분을 연속적으로 조정 가능함과 동시에, 세포 배양조(1) 내의 세포 배양액(9)의 양을 실질적으로 일정하게 조정 가능한, 세포 배양 시스템이다.

도 2에 나타내는 바와 같이, 세포 배양조(1) 내에는, 세포 또는 세포 응집 덩어리가 세포 배양액(9)과 함께 세포 배양조(1)의 외측으로 나와 버리는 것을 방지하기 위한 수단으로서, 필터(8)를 입구 접속 송액 회로(5)의 단부에 마련하여도 좋다. 필터(8)로서는, 세포 또는 세포 응집 덩어리가 필터 표면에 눈 막힘되기 어려운 구조이면 좋고, 소재나 형태는 한정되지 않지만, 예컨대 세포를 대상으로 한다면 평균 공경 5 ㎛∼10 ㎛의 스테인레스나 나일론제의 메쉬, 부직포 등, 또한 세포 응집 덩어리를 대상으로 한다면 폴리에틸렌의 소결체, 부직포로 이루어지는 평균 공경 30 ㎛의 평판형막 등이 사용 가능하다. 재질이 그것들을 흡착하기 쉬운 성질을 가지고 있는 경우에는, 그것들을 별도의 재료로 코트하거나, 표면 개질제를 이용하거나 함으로써 흡착을 억제하는 것도 가능하다.

본 실시형태에 따른 세포 배양액이란, 각종 세포와 그 세포의 생육 가능한 용액 성분과 환경을 적어도 갖는 용액을 말한다. 그 성분 및 농도는 세포의 성질에 따라 설계된다. 또한 생리적인 pH를 유지하기 쉽도록 완충능을 갖도록 설계되는 것이나, pH의 변화를 색으로 판별하기 쉽도록 pH 지시 색소를 혼합할 수도 있다. 일반적으로 시판되고 있는 각종 세포 배양액을 그대로 사용하는 것이나 이것들에 목적 세포의 성질에 따라 추가 성분을 첨가하여 이용하는 것도 가능하다.

본 실시형태에 따른 세포의 배양 시스템으로 배양되는 세포는, 포유 동물 세포 등의 세포이다. 배양의 결과, 세포의 생산물을 이용하는 것이면, 그 물질을 생산하기 쉬운 세포나 원하는 물질을 생산하기 쉽도록, 특정 유전자를 도입한 세포도 선택할 수 있다. 또한, 세포 배양의 결과, 특정 세포를 이용하는 것이면, 그 세포를 증식하기 쉬워지도록 유전자 개변한 세포 등도 이용할 수 있다.

또한, 세포의 성숙도에 관해서도 어떠한 제약도 없고, 성숙 세포, 미분화 세포 함께 이용하는 것이 가능하다. 따라서, 생체 조직으로부터 효소 처리를 하여 채취한 세포, 혈액에 유래하는 세포, 간엽계 줄기 세포, ES 세포, iPS 세포 등이 예시된다. 또한, 접착 세포, 부유 세포인 것에도 한정되지 않는다. 또한, 세포는 단일 종류의 세포에 한정도 되지 않는다. 원하는 세포가 생육하기 쉬운 물질을 생산하는 다른 세포를 혼합시켜 공(共)배양한다고 하는 것에도 이용될 수 있다.

본 실시형태에 따른 배양액 성분 조정 수단이란, 배양액 성분의 막 투과성이 그 분자량에 의존하는 반투성의 막을 말한다. 성분 조정액은 배양액 성분 조정 수단을 통해 세포 배양액과 접한다. 배양액 성분 조정 수단의 공경은 세포 배양조에 유지하고자 하는 성분의 분자량에 따라 설계된다. 즉, 세포 배양조 내에 유지하고자 하는 성분 중 최소 분자량 물질이 막을 투과하지 않도록 선택된다. 배양액 성분 조정 수단의 형상은, 평막 형상, 중공사(中空絲) 형상이 이용될 수 있지만, 배양액이나 성분 조정액을 관류하는 목적에서는 중공사 형상이 바람직하다.

배양액 성분 조정 수단의 재질은 특별히 한정되지 않지만, 세포 배양조 내에 유지하고자 하는 성분이 흡착, 분해 등이 되지 않는 재질이 바람직하게 이용된다. 또한, 재질이 이들을 흡착하기 쉬운 성질을 가지고 있는 경우에는, 이들을 별도의 재료로 코트하거나, 표면 개질제를 이용하거나 함으로써 흡착을 억제하는 것도 가능하다. 배양액 성분 조정 수단(3)은, 도 3에 나타내는 바와 같이 세포 배양조(1) 내에 설치, 또는 도 1 및 도 2에 나타내는 바와 같이 성분 조정액 저류조(2)에 설치, 또는, 도 4에 나타내는 바와 같이 세포 배양조(1)나 성분 조정액 저류조(2)의 외부에 독립적으로 설치될 수 있다.

이와 같이, 본 실시형태에 따른 세포 배양 시스템은, 1) 배양액 성분 조정 수단을 성분 조정액조 내에 설치하는 것, 2) 배양액 성분 조정 수단을 세포 배양조 내에 설치하는 것, 3) 배양액 성분 조정 수단을 세포 배양조, 및 성분 조정액 저류조의 외부에 독립적으로 설치하는 것의 적어도 3종류를 들 수 있지만, 이 형태는 세포의 성질에 따라서도 선택된다. 예컨대, 배양하는 세포가 접착 세포이면, 세포 배양조 내에 설치한 배양액 성분 조정 수단의 반투막에 세포가 부착하는 것을 막기 위해 1)이나 3)의 형태가 바람직하게 이용된다. 또한, 배양 세포가 부유 세포이며 단일 세포인 채로 증식하는 세포이면 2)의 형태가 바람직하게 이용된다.

도 4에 나타내는 구성에 있어서는, 송액 수단(7)에 의해 세포 배양조(1)로부터 흡인된 세포 배양액(9)은, 제1 입구 접속 송액 회로(5)를 거쳐, 중공사 모듈의 제1 입구로부터 중공사 모듈의 내부에 들어가, 중공사(3)의 내측을 통과하고, 더욱 중공사 모듈의 제1 출구로부터 제1 출구 접속 송액 회로(4)를 거쳐 세포 배양조(1)로 되돌아간다. 또한, 송액 수단(15)에 의해 성분 조정액 저류조(2)로부터 흡인된 성분 조정액(10)은, 제2 입구 접속 송액 회로(17)를 거쳐, 중공사 모듈의 제2 입구로부터 중공사 모듈의 내부에 들어가, 중공사(3)의 외측을 통과하고, 더욱 중공사 모듈의 제2 출구로부터 제2 출구 접속 송액 회로(16)를 거쳐 성분 조정액 저류조(2)로 되돌아간다.

본 실시형태에 따른 성분 조정액이란, 세포 배양액의 성분의 배양액 성분 조정 수단을 실질적으로 투과 가능한 성분 중 적어도 하나의 성분을 갖는 용액을 말한다. 배양액과 성분 조정액에 각각 함유하는 성분은, 그 분자량과 양 액 사이의 농도차에 의해 막을 통해 조정된다.

분자량이 막의 공경보다 커서 실질적으로 막을 투과할 수 없는 성분은 양 액 사이를 이동하지 않는다. 그에 비하여, 분자량이 막의 공경보다 작아 실질적으로 막을 투과할 수 있는 성분은 그 농도차가 적어지도록 양 액 사이에서 농도 조정된다. 세포에 의해 생산되어 세포 배양액 중에 축적된 대사물은 성분 조정액측으로 이동함으로써 배양액 중의 농도를 저하시킨다. 동시에, 세포 생육에 필요하며 배양 기간 중에 농도가 저하한 성분에 대해서는 성분 조정액으로부터 배양액으로 이동하여 보충된다. 이상의 원리로부터, 성분 조정액의 내용과 농도를 적절하게 설정함으로써, 배양액 중의 환경이 유지되어 세포의 양호한 생육 환경이 유지된다. 물론 세포 배양액을 그대로 사용할 수도 있다. 따라서, 성분 조정액은 세포 배양 기간 중에 배양액 중으로부터 상실되어 가는 성분을 전부 갖는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 이들의 성분의 농도가 배양 기간 중에 고갈되지 않도록 농도 설정된다.

또한, 성분 조정액의 양은 세포 대사물의 축적 방지라고 하는 관점에서 되도록 많게 설정하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 배양액의 5배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상으로 설정된다. 그러나, 성분 조정액의 양은 배양 비용에 영향을 끼치기 때문에, 배양 기간과 필요 세포수에 의해 결정되어도 좋다. 또한, 성분 조정액은 세포 배양액과 마찬가지로 생리적인 pH를 유지하기 쉽도록 완충능을 갖도록 설계되는 것이나, pH의 변화를 색으로 판별하기 쉽게 pH 지시 색소를 혼합하는 것 등도 가능하다.

본 실시형태에 따른 세포 배양조란, 각종 세포와 그 세포의 생육 가능한 용액 성분을 갖는 배양액을 유지한 채로 무균적으로 배양이 가능하도록 설계된 것이면 좋고, 그 형태, 크기, 재질은 따지지 않는다. 일반적으로 이들의 파라미터는 세포의 특성과 필요한 세포수에 따라 설계된다. 세포가 접착 세포이면, 세포가 중력에 의해 침강하여 표면에 접착하기 쉬운 넓은 평면 구조를 갖는 조가 설계되고, 부유 세포이면 깊이가 있어, 도 1 내지 도 4에 나타내는 바와 같은 회전 날개(교반 날개)(12)에 의한 교반에 의해 배양액의 성분이나 산소 농도가 균일화되기 쉬운 구조가 설계된다.

또한, 접착 세포라도 부유 세포용으로 설계된 세포 배양조에 접착 세포와 입자 담체를 혼합하여 배양함으로써, 입자 담체에 접착 세포를 접착시켜 이것을 부유시키면서 배양하는 것도 가능하다. 또한 부유 배양에 의해 세포끼리가 회합하기 쉽게 세포 덩어리를 형성하는 것 같은 접착 세포도 부유 세포용으로 설계된 조에 의해 배양 가능하다.

도 1 내지 도 4에 나타내는 바와 같이, 세포 배양조(1)에는, 통기 필터(11)가 마련되어 있어도 좋다.

세포 배양조에는 세포 배양액 및/또는 성분 조정액을 조로부터 취출하는 입구와, 성분 조정된 후 조 내로 되돌아가기 위한 입구가 각각 설치된다.

본 실시형태에 따른 성분 조정액 저류조란, 성분 조정액을 배양 기간 중에 무균적으로 유지할 수 있도록 설계되는 것이면 좋고, 그 형태, 크기, 재질은 따지지 않는다. 일반적으로 이들의 파라미터는 성분 조정액의 양이나 조 내에 배양액 성분 조정 수단을 설치할지의 여부에 따라 적절하게 설계된다. 성분 조정액 저류조에는 세포 배양액 및/또는 성분 조정액을 조로부터 취출하는 입구와, 성분 조정된 후 조 내로 되돌아가기 위한 입구가 각각 설치된다.

또한, 도 1 내지 도 4에 나타내는 바와 같이, 교반 회전자(13)를 성분 조정액 저류조(2)의 바닥면에 두어도 좋다. 또한, 성분 조정액 저류조(2)에는, 통기 필터(14)를 마련하여도 좋다.

본 실시형태에 따른 송액 회로란, 세포 배양조, 성분 조정액 저류조, 배양액 성분 조정 수단 사이에 설치되어 배양액 또는 성분 조정액을 무균적으로 관류하는 것이 가능한 관강 구조를 갖는 튜브를 말한다. 재질로서는, 실리콘, 우레탄, 불소 수지, 폴리염화비닐 등이 이용된다.

본 실시형태에 따른 세포 배양액 및/또는 성분 조정액을 관류하는 수단이란, 상기 송액 회로에 접하도록 설치되고, 동력을 이용하여 연속적으로 회로 내의 액을 송액 가능한 수단을 말한다. 일반적인 펌프이면 사용 가능하고, 연동 펌프, 다이어프램 펌프 등을 예시할 수 있다.

본 실시형태에 따른 세포 배양조의 액량을 조정하는 수단은, 배양 중에 세포 배양조의 액 용량을 실질적으로 일정하게 조정하는 수단을 말한다. 이러한 기능을 도 1 내지 도 4에 나타내는 송액 수단(7, 6)에 더불어 갖게 하는 것도 가능하다. 배양 장치에 중공사형의 반투막이 설치되고, 이것을 통해 배양액과 성분 조정액 사이에서 성분의 교환이 행해지거나, 막에 여과압이 가해지거나 하면, 결과로서 양 액 사이의 이동이 발생한다. 그 때문에, 특단의 조치를 취하지 않으면, 최초에 설정한 배양액과 성분 조정액의 각각의 액량이 변화하는 경우가 있다. 그러나, 배양액의 액량이 변화하면, 배양액 중의 성분 농도나, 세포 밀도가 변화하기 때문에 안정된 배양이 달성되지 않는 경향이 있다. 그래서 예컨대 반투막의 입구 및 출구에 각각 독립적으로 펌프 등의 송액 수단(7, 6)을 설치하고, 이들을 독립적으로 제어함으로써 액 용량을 일정하게 유지하는 것을 달성할 수 있다. 이러한 수단에는 배양조나 성분 조정액 저류조 내의 공기층의 압력을 제어하는 방법 등의 방법도 있지만, 상기한 바와 같이 독립된 적어도 2대의 펌프에 의해 제어하는 방법을 가장 간편하게 효과적으로 실시할 수 있다.

도 1 및 도 2에 나타내는 본 실시형태에 있어서, 예컨대, 송액 수단(7)은, 세포 배양조(1)의 세포 배양액(9)을 배양액 성분 조정 수단(3)에 송액한다. 송액 수단(6)은, 배양액 성분 조정 수단(3)에 송액되고, 세포 배양액(9) 중의 불필요 물질과 성분 조정액(10) 중의 유용 물질의 농도를 막을 통해 조정한 후 세포 배양액(9)을 반송하는 액 반송 수단으로서 기능한다.

도 3에 나타내는 본 실시형태에 있어서, 예컨대, 송액 수단(6)은, 성분 조정액 저류조(2)의 성분 조정액(10)을 배양액 성분 조정 수단(3)에 송액한다. 송액 수단(7)은, 배양액 성분 조정 수단(3)에 송액되어, 세포 배양액(9) 중의 불필요 물질과 성분 조정액(10) 중의 유용 물질을 접촉시킨 성분 조정액을 반송하는 액 반송 수단으로서 기능한다.

여기서, 송액 수단의 1시간당의 송액량(V1)과, 액 반송 수단의 1시간당의 반송량(V2)은 이상적으로는 V1=V2가 바람직하지만, 완전히 동일한 송액량을 실현하는 것은 곤란한 경우가 많다. 또한, V1과 V2의 차를 매우 작게 하는 것은 가능하지만, 매우 고가의 정밀도가 높은 펌프가 필요로 되는 경우도 있다. 그러나, 송액량(V1과 V2)을, 0.9×V1≤V2≤1.1×V1의 범위 내로 하면, 급격한 액량 변화를 초래하는 일없이, V1과 V2를 개별로 조정함으로써 상기 세포 배양액의 총량의 변동을 10％ 이내로 컨트롤하는 것이 용이해지기 때문에 적합하다. 또한, 송액량(V1과 V2)을 상기 범위 내로 하는 것은, 저렴한 펌프에 의해 용이하게 실현 가능하다.

상기한 바와 같이 적어도 2대의 독립된 펌프를 사용한 경우, 도 5에 나타내는 바와 같이, 더욱 세포 배양조(1)의 액량을 검지하는 수단(18)을 이용하여 액면이 원하는 높이보다 위 또는 아래에 있는 정보를 정보 전달 회로(19)를 통해 수시 취득하고, 그 정보로부터, 컴퓨터 등의 송액 수단 조정기(20)에 의해, 입구 접속 송액 회로(5)와 출구 접속 송액 회로(4)에 접속된 각 펌프(7, 6)의 유속에 차를 갖게 함으로써 액면을 제어하는 시스템으로 할 수도 있다. 예컨대 각 펌프의 실유속이 설정값과 약간 오차를 발생한 경우라도, 이러한 조정 시스템으로 함으로써 장시간의 배양 중에 오차가 축적되어 세포 배양조의 액면에 큰 변화가 생겨 버리는 것을 방지할 수 있다.

실시예 1

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것이 아니다.

(세포 배양 시스템)

배양 장치로서는, 8연동 동물 배양 장치 Bio Jr. 8(BJR-25NA1S-8C, 에이블 가부시키가이샤)을 사용하였다. 본 장치는, 1대의 컨트롤러로 8대의 100 mL 용량의 세포 배양조를 제어 가능하며, 측정·제어 항목은 교반 속도, 온도, pH, 및 용존 산소 농도(DO)로 각 배양조는 독립적으로 제어할 수 있다.

(ES 세포의 준비)

배양 세포로서는 마우스 ES 세포(EMG 7주)를 선택하였다.

(배양체 배양)

(배양 0일째부터 배양 3일째)

세포 배양조로서 유리제의 전용조(에이블 가부시키가이샤)를 사용하여, 배양액을 100 mL로 하였다.

마우스 ES 세포를 밀도 1×10^5 cells/mL로 하여, 배양을 개시하였다. 이 시점을 배양 0일째로 하였다.

배양액으로서는, Glasgow 최소 필수 배지(GMEM, 인비트로젠사)에 이하의 성분을 첨가하여 사용하였다.

즉, 10％ 소 태아 혈청(FBS, 가부시키가이샤 니치레이), 0.1 mM 비필수 아미노산(NEAA, 인비트로젠사), 1 mM 피루브산나트륨(Na-pyruvate, 시그마사), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올(2-ME, 인비트로젠사)이 되도록 배양액을 조제하였다.

3일째까지 이대로 배양하여, ES 세포의 회합체인 배양체(EB: Embryoid body)를 형성시켰다.

세포 배양조에는 교반 회전 날개를 설치하고, 회전수는 85 rpm으로 하였다.

세포 배양조에는, 온도, pH, 용존 산소 농도를 각각 계측 가능한 센서를 설치하였다.

또한, 용존 산소 농도는 40％로 제어되는 설정으로 하고, 그 때문에 산소, 질소, 공기의 혼합 가스가 세포 배양조 내의 배양액에 대하여 상면 통기가 되도록 가스 도입 라인을 설치하였다. 또한 가스를 조로부터 배출하는 도출 라인을 설치하였다.

(배양 3일째부터 10일째)

배양 3일째에 얻어진 전체 세포수를 산출하고, 이하와 같이 실시예 1과 비교예의 배양 방법으로 분할하여 배양을 재개하였다. 하나의 배양조당의 세포 밀도는 1.8×10^5 cells/mL로 하였다.

실시예 1에 있어서는, 도 2에 나타낸 바와 같은 세포 배양 시스템을 제작하였다. 즉, 세포 배양조는 상기 배양조의 덮개 부분에 배양액의 취출과 반환이 가능한 입구를 설치하였다.

또한, 세포 배양조 내에는 세포 덩어리가 배양액과 함께 배양조의 외측으로 나와 버리는 것을 방지하기 위한 수단으로서 폴리에틸렌의 소결체로 이루어지는 직경 15 ㎜, 평균 공경 30 ㎛의 평판형막을 설치하였다.

성분 조정액조는 용량 1 L의 유리제 멸균병을 사용하였다.

조의 덮개의 부분에 통기 라인, 배양액의 입구, 출구 라인을 설치하였다.

배양액 성분 조정 수단은, 아사히 폴리술폰 다이얼라이저 APS(아사히카세이 쿠라레 메디컬 가부시키가이샤)의 중공사를 400개 묶어 유효 길이 20 ㎝가 되도록 중공사 양 단부의 관강 구조가 해방되도록 우레탄 접착제로 고정한 것을 사용하였다.

배양액 성분 조정 수단은, 성분 조정액 저류 수단의 내부에 설치하고, 중공사 다발의 양 단부와 배양액의 입구, 출구 라인을 회로로 접속하였다.

성분 조정액으로서는, 세포 배양액에 FBS를 첨가하지 않는 배양액을 1 L 사용하였다.

송액 회로로서는, 실리콘제 튜브(내직경 1 ㎜φ, 외직경 4 ㎜φ)를 이용하였다.

배양액의 송액 수단으로서는, 연동 펌프 IPC-N4(ISMATEC사)를 2대 사용하였다. 2대의 펌프는 각각 세포 배양조와 성분 조정액 저류조를 접속하는 송액 회로에 접하여 송액 가능한 상태로 설치하였다.

이상 설명한 방법에 따라, 도 2에 나타낸 바와 같은 세포 배양 시스템을 제작하였다.

펌프의 작동 속도는, 3일째부터 4일째는 100 mL/일, 4일째부터 5일째까지는 400 mL/일, 5일째부터 10일째까지는 1,000 mL/일로 하였다.

세포 배양조의 액 용량이 실질적으로 같은 레벨을 유지할 수 있도록 하면서 2대의 펌프 유속을 미조정하여, 10일째까지 연속적으로 배양액을 관류하면서 배양을 실시하였다.

10일째에 세포 배양을 종료하고, 세포수의 측정을 행하였다.

(세포수의 측정)

배양 10일째에 배양체를 세포 배양조로부터 회수하고, 0.25％ 트립신/EDTA(인비트로젠사)로 처리하여 단세포의 상태로 한 후, 트리판 블루 색소로 사세포를 염색하여, 생세포만을 계산반을 이용하여 카운트하였다.

(젖산 농도의 측정)

배양액 중의 젖산 농도의 변화는, 세포 배양조로부터 소량의 배양액을 채취한 후, 다기능 바이오센서 BF-7(오지 케이소쿠키키 가부시키가이샤)을 이용하여 측정하였다.

(EB의 원상당 직경 측정)

EB의 원상당 직경은, 광학 현미경 ECLIPSE Ti-U(가부시키가이샤 니콘)를 이용하여 EB의 화상을 촬영한 후, 화상 해석 소프트(Nikon Elements D, 가부시키가이샤 니콘)를 이용하여 EB의 외주 길이를 측정하고, 그 값으로부터 완전한 원의 경우의 원상당 직경을 산출하였다. 각 샘플로부터 100개의 EB의 원상당 직경을 측정하여, 원상당 직경의 빈도 분포를 작성하였다.

(EB 내부 세포의 TUNEL 염색)

EB 내부의 세포가 어느 정도 아포토시스를 발생하고 있는가에 대해서 판정하기 위해 TUNEL 염색을 행하였다.

각 샘플로부터, EB의 동결 절편을 제작하고, 아포토시스 검출 키트(다카라 바이오 가부시키가이샤)를 이용하여 사세포를 염색하였다.

(비교예 1)

배양 3일째까지의 장치를 이용하여, 10일째까지 배양을 계속하였다.

4일 및 5일째에 1회, 6일에서 9일째에 2회의 배양액의 교환을 실시하였다.

배양액의 교환은, 세포 배양조의 교반을 멈추어 배양체를 침강시킨 후, 장치로부터 세포 배양조를 분리하여, 클린 벤치 내에서 배양액 상청을 빼낸 후, 신선한 배양액을 첨가하는 방법으로 하였다.

배양액 교환은 합계 10회 실시하며, 합계 1 L의 배양액을 사용하였다.

(비교예 2)

실시예 1에서 이용한 장치로부터, 성분 조정액 저류조로부터 세포 배양조를 향하여 이어지는 송액 회로에 설치된 펌프를 제거한 장치를 이용하여 배양을 계속하였다. 배양 계속과 동시에 세포 배양조 내의 배양액량이 감소하기 시작하여, 배양 계속이 곤란해져 배양을 중지하였다.

(결과)

배양 10일째의 실시예 1 및 비교예 1의 배양에 의해 얻어진 총세포수를 이하에 나타낸다.

실시예 1의 총세포수 4.6×10^8개

비교예 1의 총세포수 3.4×10^8개

배양 10일간의 실시예 1 및 비교예 1의 배양 중의 각각의 세포 배양조의 pH 변화를 도 6에 나타내었다.

배양 10일간의 실시예 1 및 비교예 1의 세포 배양조 내 세포 배양액의 젖산 농도 변화를 도 7에 나타내었다.

배양 10일째의 실시예 1 및 비교예 1의 배양 결과, 얻어진 EB의 각각의 원상당 직경을 도 8에 나타내었다.

배양 10일째의 실시예 1 및 비교예 1의 배양의 결과, 얻어진 EB의 동결 절편의 염색 결과를 도 9에 나타내었다. 아포토시스 세포가 갈색으로 염색되었다.

이상의 결과로부터, 실시예에 따른 세포 배양 시스템에서는, 배양액 교환이 불필요하며, 고가의 혈청의 사용량을 1/10까지 저감할 수 있음과 동시에, 최종적으로 회수되는 세포수는 약 1.4배로 현저한 차가 보여졌기 때문에 유효한 배양 방법인 것이 제시되었다. 또한, 실시예의 배양 방법에서는 비교예에 비해서 젖산의 축적이 적은 것, 이에 대응하여 pH의 저하가 없는 것을 알 수 있었다. 또한, 배양 종료 시의 EB의 직경은 비교예에 비해서 소직경으로 내부의 아포토시스 세포가 적은 경향이 확인되었다. 따라서, 실시예에 따른 세포 배양 시스템에서는 양호한 배양 환경의 유지가 가능하고, EB 내 세포의 아포토시스 발현 억제가 달성된 것으로 생각된다.

실시예 2

(ES 세포의 준비)

배양 세포로서는 실시예 1와 같이 마우스 ES 세포(EMG 7주)를 선택하였다.

(배양체 배양)

(배양 0일째부터 배양 3일째)

실시예 1의 배양 0일째부터 배양 3일째와 동일한 방법으로 세포 배양조 4개를 사용하여 ES 세포를 배양하였다.

(배양 3일째부터 10일째)

실시예 2에 있어서는, 도 5에 나타낸 바와 같은 세포 배양 시스템을 제작하였다. 즉, 배양 3일째에 상기 4개의 세포 배양조로부터 얻어진 전체 세포수를 산출하고, 하나의 유리제의 대형 배양조(에이블 가부시키가이샤)에 세포 밀도 1.7×10^5 cells/mL로 하여 모았다. 배양액 용량을 1 L로 하였다. 상기 배양조를 동물 세포 배양 장치 BCP(BCP-03NP3S, 에이블 가부시키가이샤)에 설치하여 배양을 개시하였다.

배양액으로서는, 실시예 1과 같은 것을 이용하였다.

세포 배양조에는 교반 회전 날개를 설치하고, 회전수는 60 rpm으로 하였다.

세포 배양조에는 상기 배양조의 덮개 부분에 배양액의 취출과 반환이 가능한 입구를 설치하였다.

또한, 세포 배양조 내에는 세포 덩어리가 배양액과 함께 배양조의 외측으로 나와 버리는 것을 방지하기 위한 수단으로서 폴리에틸렌의 소결체로 이루어지는 직경 47 ㎜, 평균 공경 30 ㎛의 평판형막을 액 상면에 설치하였다.

성분 조정액조에는 용량 10 L의 폴리프로필렌제 탱크를 사용하였다.

배양액 성분 조정 수단은, 지속 완서식 혈액 여과기 엑셀 플로우 AEF-03(아사히카세이 쿠라레 메디컬 가부시키가이샤)을 사용하였다.

배양액 성분 조정 수단은, 세포 배양조, 성분 조정액 저류조의 외부에 독립적으로 설치하였다.

세포 배양조로부터 상기 평판형막을 통과하여 취출된 배양액이 중공사 내측을 흐르도록 배양액의 입구 라인을 회로로 접속하였다. 다음에 중공사 내측을 통과해 온 배양액이 배양조로 되돌아가도록 출구 라인을 회로로 접속하였다.

계속해서, 성분 조정액이 성분 조정액 저류조로부터 취출되어 배양액 성분 조정 수단의 중공사 외측을 통과하여, 성분 조정액 저류조로 되돌아가도록 입구 라인, 출구 라인을 접속하였다.

성분 조정액으로서는, 혈청을 부가하고 있지 않은 세포 배양액을 10 L 사용하였다.

송액 회로로서는, 플론 튜브(내직경 2 ㎜φ, 외직경 4 ㎜φ)를 이용하였다.

배양액의 송액 수단으로서는, 연동 펌프 IPC-N4(ISMATEC사)를 3대 사용하였다. 3대의 펌프는 각각 세포 배양조와 배양액 성분 조정 수단, 배양액 성분 조정 수단과 성분 조정액 저류조를 접속하는 송액 회로에 접하여 송액 가능한 상태로 설치하였다.

또한, 세포 배양조에는 액면 검지 수단으로서 레이저식 검지기(가부시키가이샤 키엔스)를 부착하여, 액면의 상승이 일어났을 때에는, 연동 펌프의 유속을 멈추도록 프로그램한 조정기를 출구 라인(1)의 송액 펌프와의 사이에 설치하였다.

이상 설명한 방법에 따라, 도 5에 나타낸 바와 같은 세포 배양 시스템을 제작하였다.

펌프의 작동 속도는, 3일째부터 4일째는 입구 라인(1)의 펌프는 1 L/일, 출구 라인 펌프(1)의 펌프는 1.1 L/일, 4일째부터 5일째까지는 입구 라인(1)의 펌프는 4 L/일, 출구 라인 펌프(1)는 4.4 L/일, 5일째부터 10일째까지는 입구 라인(1)의 펌프는 10 L/일, 출구 라인(1)의 펌프는 11 L/일로 하였다. 성분 조정액을 송액하는 펌프의 작동 속도는, 입구 라인(1)의 펌프의 속도의 4배로 하였다.

본 시스템에 의해 세포 배양조의 액 용량이 실질적으로 같은 레벨을 유지할 수 있도록 펌프 유속을 미조정하여, 10일째까지 연속적으로 배양액을 관류하면서 배양을 실시하였다.

10일째에 세포 배양을 종료하고, 세포수의 측정하였다.

(결과)

배양 10일째의 실시예 및 비교예의 배양에 의해 얻어진 총세포수를 이하에 나타낸다.

실시예 2의 총세포수 5.7×10^9개

이상의 결과로부터 실시예에 따른 세포 배양 시스템에 따르면 스케일 업이 용이한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3

(세포의 준비)

배양 세포로서는 시판의 부유 세포인 CHO 세포(차이니즈 햄스터 난소 유래, 라이프 테크놀로지즈사)를 선택하였다.

(배양 0일째부터 배양7일째)

실시예 3에 있어서는, 도 3에 나타낸 바와 같은 세포 배양 시스템을 제작하였다. 즉, 세포 배양조로서 칼스타 플라스크(더블 아암형, 교반 셋트를 가짐, 시바타카가쿠)를 사용하여, 배양액을 300 mL로 하였다.

CHO 세포를 파종 밀도 2×10^5 cells/mL로 하여, 배양을 개시하였다. 이 시점을 배양 0일째로 하였다.

배양액으로서는, CD-CHO 배지(라이프 테크놀로지즈사)를 사용하였다.

세포 배양조에는 교반 회전 날개를 설치하고, 회전수는 80 rpm으로 하였다.

세포 배양조는 상기 배양조의 덮개 부분에 배양액의 취출과 반환이 가능한 입구를 설치하였다.

성분 조정액조는 용량 500 mL의 유리제 멸균병을 사용하였다.

세포 배양조의 덮개의 부분에 통기 라인, 성분 조정액의 입구, 출구 라인을 설치하였다.

배양액 성분 조정 수단은, 아사히 폴리술폰 다이얼라이저 APS(아사히카세이 쿠라레 메디컬 가부시키가이샤)의 중공사를 100개 묶어 유효 길이 25 ㎝가 되도록 중공사 양 단부의 관강 구조가 해방되도록 우레탄 접착제로 고정한 것을 사용하였다.

배양액 성분 조정 수단은, 세포 배양조의 내부에 설치하고, 중공사 다발의 양 단부와 성분 조정액의 입구, 출구 라인을 회로로 접속하였다.

성분 조정액으로서는, CD-CHO 배지를 300 mL 사용하였다.

상기 2조를 37℃, 5％ CO2 분위기 하의 인큐베이터(IP400, 야마토 카가쿠) 내에 설치하였다.

성분 조정액의 송액 수단으로서는, 연동 펌프(SJ-121H, ATTO사)를 2대 사용하였다. 2대의 펌프는 각각 세포 배양조와 성분 조정액 저류조를 접속하는 송액 회로에 접하여 송액 가능한 상태로 설치하였다.

이상 설명한 방법에 따라, 도 3에 나타낸 바와 같은 세포 배양 시스템을 제작하였다.

펌프의 초기 작동 속도는, 0일째부터 4일째는 0.22 mL/분, 4일째부터 7일째까지는 0.62 mL/분으로 하였다.

세포 배양조의 액 용량이 실질적으로 동일한 레벨을 유지할 수 있도록 하면서 2대의 펌프 유속을 미조정하여, 7일째까지 연속적으로 배양액을 관류하면서 배양을 실시하였다.

(비교예 3)

실시예의 세포 배양조만으로 한 장치(배양액 성분 조정 수단도 없음)를 이용하여, 실시예와 동일하게 7일째까지 배양을 계속하였다.

(결과)

배양 7일째의 실시예 3 및 비교예 3의 배양에 의해 얻어진 생세포의 밀도를 이하에 나타낸다.

실시예 3의 세포 밀도 66.8×10^5 cells/mL

비교예 3의 세포 밀도 28.9×10^5 cells/mL

이상과 같이 단일 세포의 형태로 증식하는 부유 세포에 있어서도 실시예에 따른 세포 배양 시스템이 유효한 것을 확인할 수 있었다.

본 실시형태에 따른 세포 배양 시스템 및 세포 배양 방법은, 여러가지 포유 동물 세포의 배양 형태에 대응 가능하며, 저비용, 생력화, 고밀도 배양을 동시에 달성할 수 있는 시스템을 제공할 수 있기 때문에, 세포에 단백질 등의 생산물을 대량으로 생산시키는 분야나, 세포 그 자체를 대량 배양하여 이용하는 분야에 이용 가능하다.

1 세포 배양조
2 성분 조정액 저류조
3 배양액 성분 조정 수단
4 송액 회로
5 송액 회로
6 송액 수단
7 송액 수단
8 필터
9 세포 배양액
10 성분 조정액
11 통기필터
12 교반 날개
13 교반 회전자
14 통기 필터
15 송액 수단
16 송액 회로
17 송액 회로
18 액면 검지 수단
19 정보 전달 회로
20 송액 수단 조정기

Claims

세포를 배양하기 위한 세포 배양조와,
성분 조정액 저류조와,
세포 배양액 또는 성분 조정액 또는 둘다의 입구와 출구를 가지며, 반투막을 구비하는 배양액 성분 조정 수단과,
상기 세포 배양조 또는 상기 성분 조정액 저류조 또는 둘다로부터 상기 배양액 성분 조정 수단의 입구에 접속된 입구 접속 송액 회로와,
상기 세포 배양조 또는 상기 성분 조정액 저류조 또는 둘다로부터 상기 배양액 성분 조정 수단의 출구에 접속된 출구 접속 송액 회로와,
상기 입구 접속 송액 회로로부터 상기 배양액 성분 조정 수단을 거쳐 상기 출구 접속 송액 회로에 상기 세포 배양액 또는 상기 성분 조정액 또는 둘다를 관류하는 수단
을 구비하는 세포 배양 시스템으로서,
상기 관류하는 수단이 상기 입구 접속 송액 회로에 설치된 송액 수단과 상기 출구 접속 송액 회로에 설치된 송액 수단을 구비하고,
상기 입구 접속 송액 회로에 설치된 송액 수단과 상기 출구 접속 송액 회로에 설치된 송액 수단을 제어함으로써,
상기 배양액 성분 조정 수단을 통해 상기 세포 배양조 내의 상기 세포 배양액의 성분과 상기 성분 조정액 저류조 내의 상기 성분 조정액의 성분을 연속적으로 조정 가능함과 동시에,
상기 세포 배양조 내의 상기 세포 배양액의 양을 실질적으로 일정하게 조정 가능한 세포 배양 시스템.
제1항에 있어서, 배양액 성분 조정 수단이, 중공사(中空絲)형인 세포 배양 시스템.
제1항에 있어서,
상기 배양액 성분 조정 수단이 상기 성분 조정액 저류조 내에 배치되어 있고,
상기 배양액 성분 조정 수단이 상기 세포 배양액의 입구와 출구를 가지며,
상기 입구 접속 송액 회로가 상기 세포 배양조로부터 상기 배양액 성분 조정 수단의 입구에 접속되어 있고,
상기 출구 접속 송액 회로가 상기 세포 배양조로부터 상기 배양액 성분 조정 수단의 출구에 접속되어 있으며,
상기 관류하는 수단이, 상기 입구 접속 송액 회로로부터 상기 배양액 성분 조정 수단을 거쳐 상기 출구 접속 송액 회로에 상기 세포 배양액을 관류하는 세포 배양 시스템.
제1항에 있어서,
상기 배양액 성분 조정 수단이 상기 세포 배양조 내에 배치되어 있으며,
상기 배양액 성분 조정 수단이 상기 성분 조정액의 입구와 출구를 가지고,
상기 입구 접속 송액 회로가 상기 성분 조정액 저류조로부터 상기 배양액 성분 조정 수단의 입구에 접속되어 있으며,
상기 출구 접속 송액 회로가 상기 성분 조정액 저류조로부터 상기 배양액 성분 조정 수단의 출구에 접속되어 있고,
상기 관류하는 수단이 상기 입구 접속 송액 회로로부터 상기 배양액 성분 조정 수단을 거쳐 상기 출구 접속 송액 회로에 상기 성분 조정액을 관류하는 세포 배양 시스템.
제1항에 있어서,
상기 배양액 성분 조정 수단이 상기 성분 조정액 저류조 및 상기 세포 배양조의 외부에 설치되어 있으며,
상기 입구 접속 송액 회로가, 상기 세포 배양조로부터 상기 배양액 성분 조정 수단의 제1 입구에 접속된 제1 입구 접속 송액 회로와, 상기 성분 조정액 저류조로부터 상기 배양액 성분 조정 수단의 제2 입구에 접속된 제2 입구 접속 송액 회로를 포함하고,
상기 출구 접속 송액 회로가, 상기 세포 배양조로부터 상기 배양액 성분 조정 수단의 제1 출구에 접속된 제1 출구 접속 송액 회로와, 상기 성분 조정액 저류조로부터 상기 배양액 성분 조정 수단의 제2 출구에 접속된 제2 출구 접속 송액 회로를 포함하며,
상기 제1 입구와 상기 제1 출구를 연결하는 공간과, 상기 제2 입구와 상기 제2 출구를 연결하는 공간을, 상기 반투막이 구성하고,
상기 관류하는 수단이, 상기 제1 입구 접속 송액 회로로부터 상기 배양액 성분 조정 수단을 거쳐 상기 제1 출구 접속 송액 회로에 상기 세포 배양액을 관류하고, 또한, 상기 제2 입구 접속 송액 회로로부터 상기 배양액 성분 조정 수단을 거쳐 상기 제2 출구 접속 송액 회로에 상기 성분 조정액을 관류하는 세포 배양 시스템.
제1항에 있어서,
상기 입구 접속 송액 회로에 설치된 송액 수단의 1시간당의 송액량(V1)과, 상기 출구 접속 송액 회로에 설치된 송액 수단의 1시간당의 반송량(V2)이, 0.9×V1≤V2≤1.1×V1이며, 상기 세포를 포함한 상기 세포 배양액의 총량의 변동이 부피 기준으로 10％ 이내인 세포 배양 시스템.
제3항에 있어서, 상기 입구 접속 송액 회로에 설치된, 상기 세포 배양조 내측 단부에 세포 또는 세포 응집 덩어리를 통과시키지 않고, 상기 세포 배양액을 실질적으로 통과시키는 필터를 더 구비하는 세포 배양 시스템.
제5항에 있어서, 상기 제1 입구 접속 송액 회로에 설치된, 상기 세포 배양조 내측 단부에 세포 또는 세포 응집 덩어리를 통과시키지 않고, 상기 세포 배양액을 실질적으로 통과시키는 필터를 더 구비하는 세포 배양 시스템.
a) 제6항에 기재된 세포 배양 시스템을 설치하는 것과,
b) 상기 세포 배양조에, 세포 및 상기 세포 배양액을 공급하며, 상기 성분 조정액 저류조에 상기 배양액 성분 조정액을 공급하는 것과,
c) 상기 세포 배양액 또는 상기 성분 조정액 또는 둘다를 연속적으로 관류하는 것
을 포함하고,
상기 입구 접속 송액 회로에 설치된 송액 수단의 1시간당의 송액량(V1)과, 상기 입구 접속 송액 회로에 설치된 송액 수단의 1시간당의 반송량(V2)을, 0.9×V1≤V2≤1.1×V1이 되도록 제어하며, 또한 상기 세포를 포함한 상기 세포 배양액의 총량의 변동이 부피 기준으로 10％ 이내가 되도록 제어하는 세포 배양 방법.
적어도, 세포 및 세포 배양액이 넣어져, 상기 세포를 배양하는 세포 배양조와,
유용 물질을 함유하는 성분 조정액이 넣어지는 성분 조정액 저류조와,
상기 세포 배양액과 상기 성분 조정액을 접촉시켜 물질 교환을 행하는 배양액 성분 조정 수단과,
적어도 상기 세포 배양조의 상기 세포 배양액을 상기 배양액 성분 조정 수단에 송액하는 송액 수단과,
접촉시킨 상기 세포 배양액을 상기 배양액 성분 조정 수단으로부터 상기 세포 배양조에 반송하는 액 반송 수단
을 구비하고,
상기 송액 수단과, 상기 액 반송 수단을 제어함으로써, 상기 송액 수단의 1시간당의 송액량(V1)과, 상기 액 반송 수단의 1시간당의 반송량(V2)을, 0.9×V1≤V2≤1.1×V1으로 하고, 세포 배양액의 상기 세포를 포함한 상기 세포 배양액의 총량의 변동을 부피 기준으로 10％ 이내로 하는 것인 세포 배양 시스템.
적어도, 세포 및 세포 배양액을 세포 배양조에 넣어, 상기 세포를 배양하는 공정과,
적어도 상기 세포 배양조의 상기 세포 배양액을 송액 수단에 의해 막에 송액하는 공정과,
상기 세포 배양액과 성분 조정액을, 상기 막을 통해 접촉시키는 공정과,
상기 막을 통해 상기 성분 조정액에 접촉한 세포 배양액을 액 반송 수단에 의해 상기 세포 배양조에 반송하는 공정과,
상기 송액 수단과, 상기 액 반송 수단을 제어하는 공정
을 포함하고,
상기 송액하는 공정에서의 1시간당의 송액량(V1)과, 상기 반송하는 공정의 1시간당의 반송량(V2)이, 0.9×V1≤V2≤1.1×V1이며,
세포 배양액의 세포를 포함한 세포 배양액의 총량의 변동이 부피 기준으로 10％ 이내인 세포 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포가 포유 동물 세포인 세포 배양 시스템.
제12항에 있어서, 상기 포유 동물 세포가, 배아 줄기 세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 간엽계 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 및 이들로부터 분화 유도된 세포 중 하나 이상인 세포 배양 시스템.
제1항에 있어서, 상기 세포가 부유 배양 가능한 세포, 접착 세포, 세포 응집체를 형성하는 세포, 및 입자형 담체에 접착 가능한 세포 중 하나 이상인 세포 배양 시스템.
제14항에 있어서, 상기 입자형 담체에 접착 가능한 세포는, 세포 배양조에 세포 및 입자형 담체를 넣어 배양되는 세포 배양 시스템.
제10항에 있어서, 상기 세포가 포유 동물 세포인 세포 배양 시스템.
제16항에 있어서, 상기 포유 동물 세포가, 배아 줄기 세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 간엽계 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 및 이들로부터 분화 유도된 세포 중 하나 이상인 세포 배양 시스템.
제10항에 있어서, 상기 세포가 부유 배양 가능한 세포, 접착 세포, 세포 응집체를 형성하는 세포, 및 입자형 담체에 접착 가능한 세포 중 하나 이상인 세포 배양 시스템.
제18항에 있어서, 상기 입자형 담체에 접착 가능한 세포는, 세포 배양조에 세포 및 입자형 담체를 넣어 배양되는 세포 배양 시스템.