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CN101130751B - 植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置 - Google Patents

植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置 Download PDF

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Abstract

本发明涉及的是一种细胞工程技术领域的植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置。本发明包括依次串行连接的一级沉降装置、二级沉降装置、三级沉降装置，储液瓶、取样装置、在线监测系统、供气装置、沉降装置分别与反应罐连接，反应罐置于磁力搅拌器上，废液瓶与沉降装置连接。本发明为一套包括三个重力沉降截留细胞装置的内外筒式生物反应器，为大规模植物细胞连续灌注培养提供了借鉴和参考。与现有技术相比，本发明既能有效提高反应器中细胞与培养液的分离效率，又可以降低污染的概率。

Description

植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置
技术领域
本发明涉及的是一种细胞工程技术领域的装置，具体是一种植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置。
背景技术
植物天然产物的开发一直是人们研究的热点，利用生物反应器进行植物细胞悬浮培养不仅可以生产许多具有重要价值的次级代谢产物，而且可以缓解野生资源的过度采挖。然而，植物细胞在培养过程中产生的酚类物质不利于细胞增殖，严重时造成细胞褐化、死亡；另外，次生代谢产物在培养液中积累会抑制产物的进一步合成。植物细胞连续灌注培养可以将细胞释放到培养基里面的物质不断带到反应器外面，有效解决了细胞褐变和产物反馈抑制的问题，但连续灌注培养过程中细胞与培养液的分离效率偏低，限制了连续灌注培养的大规模应用。常用的细胞截留方法有膜过滤、离心沉降和重力沉降等。膜过滤容易发生堵塞，离心沉降会对敏感的植物细胞造成损伤。重力沉降是依靠细胞与培养液的密度差，使细胞与培养液发生相对运动，从而达到分离的目的。重力沉降的优点是不会损伤细胞，所以目前的报道的关于植物细胞连续灌注培养的文献中主要是通过重力沉降来截留细胞。由于植物细胞培养体系的粘度较大，根据斯托克斯定律 v T = 2 9 ρ - ρ ′ η g r 2 , 沉降的效果会比较差，所以需要一些特殊的装置来提高沉降效率。
经对现有技术文献的检索发现，C.De Dobbeleer等人在《Biotechnology andBioengineering》(生物技术和生物工程)2006，95(6)：1127-1137上发表的“AHigh-Rate Perfusion Bioreactor for Plant Cells”(一个用于植物细胞培养的高效连续灌注培养生物反应器)中将四个玻璃沉降柱置于反应器的正上方，但为了避免通气影响沉降效果，将气喷头置于液面下6cm的地方，使得气液不能充分混合。Wei Wen Su等在《Journal of Biotechnology and Bioengineering》(生物技术和生物工程杂志)2003，95(1)：13-20上发表的“Continuous PlantCell Perfusion Culture：Bioreactor Characterization and Secreted EnzymeProduction”(植物细胞连续灌注培养：生物反应器特征和次生代谢酶的生产)中使用一个内外筒的反应器装置来实现植物细胞重力沉降。但其缺陷和不足是：实验室在重复该实验时发现细胞沉降效果并不好，当细胞浓度较高时有大量的细胞流失在废液中。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置。本发明为一套包括三个重力沉降截留细胞装置的内外筒式生物反应器。通过重力沉降使植物细胞和培养液高效分离的生物反应器培养装置，可以实现植物细胞的连续灌注培养。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括：反应罐、储液瓶、取样装置、在线监测系统、供气装置、磁力搅拌器、沉降装置、废液瓶。所述的沉降装置还包括依次串行连接的一级沉降装置、二级沉降装置、三级沉降装置。储液瓶、取样装置、在线监测系统、供气装置、沉降装置分别与反应罐连接，反应罐置于磁力搅拌器上，废液瓶与沉降装置连接。储液瓶中的培养液在液泵的作用下流入反应罐中，溢出来的液体依次在一级沉降装置、二级沉降装置、三级沉降装置中进行培养液与细胞的分离。分离出来的细胞通过液泵返回反应罐中，废液流入废液瓶。
所述的反应罐为内外筒式结构，包括：内筒、外筒、搅拌轴、罐盖、搅拌浆、气喷头，内筒、外筒在底部相连通，内筒中部与外筒顶部相连。搅拌轴通过螺丝、硅胶垫圈与罐盖固定密封。搅拌轴底端设有实心管、搅拌浆，实心管与搅拌浆相连。所述的搅拌轴呈中空管状，其末端连有气喷头。
所述的气喷头内设有孔径为180μm玻璃滤蕊。
所述搅拌浆的长度为内筒直径的1/3，搅拌浆的最低点高于内筒的下沿。
所述的反应罐设有取样口，反应罐通过取样口与取样装置连接。
所述的反应罐，外表侧设有液体培养基入口，反应罐通过液体培养基入口与储液瓶连接。
所述的反应罐，其外侧设有培养液出口、细胞回流口，反应罐通过培养液出口、细胞回流口分别与储液瓶连接。
所述的反应罐，底部设有细胞连续收获口。
反应罐中：搅拌浆转动以后加速内筒中的物质传递，但外筒是一个相对静止的沉降区域，细胞在外筒中发生沉降后返回内筒，上清液从培养溶液出口处溢出，流入二级沉降装置、三级沉降装置。中空的搅拌轴同时又是进气口，管的末端连有一个装有孔径为180μm玻璃滤蕊的气喷头。搅拌轴与罐盖用螺丝、硅胶垫圈固定和密封。搅拌轴可以上下抽动，从而调整搅拌浆的高度。
所述沉降装置包括：一级沉降装置、二级沉降装置、三级沉降装置，还包括液泵。一级沉降装置设于反应罐内。液泵、一级沉降装置、二级沉降装置、三级沉降装置通过硅胶管串连依次连接。
所述的二级沉降装置为由圆柱体与圆锥体拼合相连而得的沉降瓶(圆柱部分的直径为6cm，沉降瓶的总高为8cm)。沉降瓶的上端左边为进液管，其右边为出液管。出液管与废液瓶连接。
所述的三级沉降装置与二级沉降装置的形状完全相同。
沉降装置中：反应罐中的培养液在一级沉降装置中进行细胞与培养基的初步分离后，上清液进入二级沉降瓶进行第二次沉降分离。从二级沉降瓶流出的液体流入三级沉降瓶进一步沉降分离，上清流入废液瓶，二级沉降装置、三级沉降装置分离出来的细胞通过细胞回流管返回反应罐中。
所述取样装置为双联瓶。取样时先打开第一夹子，然后再打开第二夹子，细胞液就在重力的作用下自动流入取样瓶，当样品的量达到目的体积后马上把第一夹子夹紧，样品转移到其它容器后再把第二夹子夹紧。取样口处于相对无菌取样瓶中，减少了因取样造成污染的机会。另外，双联取样瓶的两个瓶口可以插入各种探头，取样的同时得到一些不需要在线监测的数据。
与现有技术中的的反应器比较，本发明在反应器外增加两个扁平式的沉降装置(沉降瓶)，增加了沉降区的横截面积，提高了沉降效率。
与现有技术中的的反应器比较，本发明反应器的搅拌轴是中空的，该搅拌轴的顶端同时又是通气进口，反应器不需要再设计专门的进气口，减小了污染的机会。
本发明为一套包括三个重力沉降截留细胞装置的内外筒式生物反应器。通过重力沉降使植物细胞和培养液高效分离的生物反应器培养装置，可以实现植物细胞的连续灌注培养。气喷头用孔径为180μm的玻璃滤蕊，避免了使用金属喷头时容易被腐蚀的问题。将通气管与中空搅拌轴相连，取样口与双联取样瓶相连，降低了通气与取样造成培养基污染的概率；同时添加了两个新的沉降装置，在进气速率为200-500vvm，搅拌子转速为90-150rpm的条件下，沉降效率达到100％，KLa达到6.5h-1，为大规模植物细胞连续灌注培养提供了借鉴和参考。与现有技术相比，本发明既能有效提高反应器中细胞与培养液的分离效率，又可以降低污染的概率。
附图说明
图1为本发明的系统结构示意图
图2反应罐结构示意图
图3二级沉降装置、三级沉降装置结构示意图
图4双联瓶结构示意图
其中：1-储液瓶，2-空气滤头，3-液泵，4-气泵，5-反应罐，6-气体流量计，7-双联瓶，8-在线监测器，9-磁力搅拌器，10-二级沉降装置，11-三级沉降装置，12-废液瓶，13-氧探头，14-pH探头，15-反应器外筒(一级沉降装置)，16-内筒，17-取样口，18-液体培养基入口，19-培养液出口，20-细胞回流口，21-细胞连续收获口，22-螺丝，23-垫圈，24-进气口/或搅拌轴，25-罐盖，26-搅拌浆，27-气喷头，28-实心管，-29细胞回流管，30-出液管，31-三级沉降瓶，32-进液管，33-二级沉降瓶-34第二夹子，35-瓶塞，36-第一夹子。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
如图1所示，本实施例包括：反应罐5、储液瓶1、取样装置、在线监测系统、供气装置、磁力搅拌器9、沉降装置、废液瓶12，沉降装置还包括依次串行连接的一级沉降装置15、二级沉降装置10、三级沉降装置11。储液瓶1、取样装置、在线监测系统、供气装置、沉降装置分别与反应罐5连接，反应罐5置于磁力搅拌器9上，废液瓶12与沉降装置连接。
在线监测系统包括：电脑37、在线监测器8、氧探头13、pH探头14，氧探头13、pH探头14通过在线监测器8与电脑相连。
供气装置包括：空气滤头2、气体流量计6、气泵4、通气管和气喷头27。空气滤头2、气体流量计6、气泵4、通气管和气喷头27顺序相连。
储液瓶1中的培养液在液泵3的作用下流入反应罐5中，溢出来的液体依次在一级、二级、三级沉降装置11中进行培养液与细胞的分离。分离出来的细胞通过液泵3返回反应罐5中，废液流入废液瓶12。
如图2所示，反应罐5为内外筒式结构，(外筒15的直径为10cm，内筒16的直径为8cm。)反应罐5包括：内筒16、外筒15、搅拌轴24、罐盖25、搅拌浆26、气喷头27，内筒16、外筒15在底部是相连通，内筒16中部与外筒15顶部相连。搅拌轴24通过螺丝22、硅胶垫圈23与罐盖25固定密封。搅拌轴24底端设有实心管28、搅拌浆26，实心管28与搅拌浆26相连。搅拌轴24呈中空管状，其末端连有气喷头27。气喷头27内设有孔径为180μm玻璃滤蕊。
搅拌浆26的长度为内筒16直径的1/3，搅拌浆26的最低点高于内筒16的下沿。反应罐5设有取样口17，反应罐5通过取样口17与取样装置连接。反应罐5的外表侧设有液体培养基入口18，反应罐5通过液体培养基入口18与储液瓶1连接。反应罐5的一侧设有培养液出口19、细胞回流口20，反应罐5通过培养液出口19、细胞回流口20分别与储液瓶1连接。反应罐5的底部设有细胞连续收获口21。
搅拌浆26转动以后加速内筒16中的物质传递，但外筒是一个相对静止的沉降区域，细胞在外筒中发生沉降后返回内筒16，上清液从培养溶液出口处溢出，流入二级沉降装置10、三级沉降装置11。中空的搅拌轴24同时又是进气口24，管的末端连有一个装有孔径为180μm玻璃滤蕊的气喷头27。搅拌轴24与罐盖25用螺丝22、硅胶垫圈23固定和密封。搅拌轴24可以上下抽动，从而调整搅拌浆26的高度。
如图3所示，沉降装置包括：一级沉降装置15、二级沉降装置10(即二级沉降瓶33)、三级沉降装置11(即三级沉降瓶31)，还包括液泵3。一级沉降装置15设于反应罐5内。液泵3、一级沉降装置15、二级沉降装置10(即二级沉降瓶33)、三级沉降装置11(即三级沉降瓶31)通过硅胶管串连依次连接。
如图3所示，二级沉降瓶33为由圆柱体与圆锥体拼合相连而得的沉降瓶(圆柱部分的直径为6cm，沉降瓶的总高为8cm)。沉降瓶的上端左边为进液管32，其右边为出液管30。出液管30与废液瓶12连接。
三级沉降装置11与二级沉降装置10的形状完全相同。
反应罐5中的培养液在一级沉降装置15中进行细胞与培养基的初步分离后，上清液进入二级沉降瓶进行第二次沉降分离。从二级沉降瓶流出的液体流入三级沉降瓶进一步沉降分离，上清流入废液瓶12，二级沉降装置10、三级沉降装置11分离出来的细胞通过细胞回流管29返回反应罐5中。
如图4所示，取样装置为双联瓶7，双联瓶各设有瓶塞35。取样时先打开第一夹子36，然后再打开第二夹子34，细胞液就在重力的作用下自动流入取样瓶7，当样品的量达到目的体积后马上把第一夹子36夹紧，样品转移到其它容器后再把第二夹子34夹紧。取样口17处于相对无菌取样瓶7中，减少了因取样造成污染的机会。另外，双联取样瓶的两个瓶口可以插入各种探头，取样的同时得到一些不需要在线监测的数据。
通过本实施例对培养甘草细胞进行了连续培养，起始接种密度为5g(干重)/L-1，培养液为添加NAA和IAA的MS培养基，通气速率为300vvm，搅拌速率为120rpm，培养温度为25℃。同时以甘草细胞为材料对该反应器的截效率和kLa进行了测定。结果表明，在适合于植物细胞生长的条件下(搅拌速率为120rpm，通气速率为0.3vvm，灌注速率为10％)，细胞截留效率达到100％，kLa为6.0，30天后细胞最大生物量达16.5gL-1，而分批培养时最大生物量仅为12gL-1左右。
本发明植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置非常适合于植物细胞的生长，可推广于工业规模应用。

Claims (9)

1.一种植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置，包括：反应罐、储液瓶、取样装置、在线监测系统、供气装置、磁力搅拌器、沉降装置、废液瓶；
所述的沉降装置包括：依次串行连接的一级沉降装置、二级沉降装置、三级沉降装置，储液瓶、取样装置、在线监测系统、供气装置、沉降装置分别与反应罐连接，反应罐置于磁力搅拌器上，废液瓶与沉降装置连接；
其特征在于：
所述的反应罐为内外筒式结构，包括：内筒、作为一级沉降装置的外筒、搅拌轴、罐盖、搅拌浆、气喷头，内筒、外筒在底部相连通，内筒中部与外筒顶部相连，搅拌轴通过螺丝、硅胶垫圈与罐盖固定密封，搅拌轴底端设有实心管、搅拌浆，实心管与搅拌浆相连；
所述的外筒是一个相对静止的沉降区域，细胞在外筒中发生沉降后返回内筒，上清液从培养溶液出口处溢出，流入二级沉降装置、三级沉降装置。
2.如权利要求1所述的植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置，其特征是，所述的搅拌轴呈中空管状。
3.如权利要求2所述的植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置，其特征是，所述的搅拌轴，其末端连接有气喷头。
4.如权利要求3所述的植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置，其特征是，所述的气喷头内设有玻璃滤蕊。
5.如权利要求1所述的植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置，其特征是，所述搅拌浆的长度为内筒直径的1/3，搅拌浆的最低点高于内筒的下沿。
6.如权利要求1所述的植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置，其特征是，所述沉降装置还包括液泵，其中：一级沉降装置设于反应罐内，液泵、一级沉降装置、二级沉降装置、三级沉降装置通过硅胶管串连依次连接。
7.如权利要求1或6所述的植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置，其特征是，所述的二级沉降装置为由圆柱体与圆锥体拼合相连而得的沉降瓶。
8.如权利要求1或6所述的植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置，其特征是，所述的三级沉降装置与二级沉降装置的形状完全相同。
9.如权利要求1所述的植物细胞搅拌式生物反应器连续灌注培养装置，其特征是，所述取样装置为双联瓶。
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