[go: up one dir, main page]

KR101631719B1 - 유효한 숙시네이트 및 말레이트 제조를 위한 물질 및 방법 - Google Patents

유효한 숙시네이트 및 말레이트 제조를 위한 물질 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101631719B1
KR101631719B1 KR1020097021920A KR20097021920A KR101631719B1 KR 101631719 B1 KR101631719 B1 KR 101631719B1 KR 1020097021920 A KR1020097021920 A KR 1020097021920A KR 20097021920 A KR20097021920 A KR 20097021920A KR 101631719 B1 KR101631719 B1 KR 101631719B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
brevibacterium
succinate
delete delete
streptomyces
poxb
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
KR1020097021920A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100015743A (ko
Inventor
켐위치 잔타마
마크 존 하웁트
쑤리 장
조나탄 씨. 무어
킬나탐 티. 샨무감
로니 오닐 인그램
Original Assignee
유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39766740&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR101631719(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인크. filed Critical 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인크.
Publication of KR20100015743A publication Critical patent/KR20100015743A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101631719B1 publication Critical patent/KR101631719B1/ko
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01054—Formate C-acetyltransferase (2.3.1.54), i.e. pyruvate formate-lyase or PFL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02001—Acetate kinase (2.7.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01032—Phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) (4.1.1.32)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03003—Methylglyoxal synthase (4.2.3.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

유전적으로 조작된 미생물은, 플라스미드 또는 외래 유전자의 첨가 없이 pH-조절된 회분식 발효에서 미네랄 염 배지에서 숙시네이트 및 말레이트를 생성하도록 제조되었다. 본 발명은 또한 유전적으로 변형된 미생물의 배양을 포함하는, 숙시네이트 및 말레이트를 제조하는 방법을 제공한다.
Figure R1020097021920
숙시네이트, 말레이트, 효소, 유전자, 변형.

Description

유효한 숙시네이트 및 말레이트 제조를 위한 물질 및 방법{MATERIALS AND METHODS FOR EFFICIENT SUCCINATE AND MALATE PRODUCTION}
본 출원은 본원에서 참고로 인용된 전체 개시물인 미국 가출원 제60/895,806호(2007.03.20.자 출원)의 이익을 주장하고, 상기 개시물의 모든 도면, 표 및 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 허가 번호 USDOE-DE FG02-96ER20222 하에서 에너지부 및 허가 번호 USDA & DOE Biomass RDI DE FG36-04-GO14019 하에서 미국 농무부와 관련된 에너지부로부터 수여된 정부 지지로 만들어졌다. 상기 정부는 본 발명의 특정 권리를 갖는다.
재생가능한 공급원료에서 나온 숙시네이트(succinate)의 발효 생성물은 원유 가격이 상승함에 따라 점점 더 경쟁력이 있을 것이다. 숙시네이트는 현재 원유로부터 만들어지는 플라스틱, 용매 및 다른 화학물질로의 변형을 위한 기질로서 역할을 할 수 있다(문헌[Lee 등, 2004; Lee 등, 2005; McKinlay 등, 2007; Wendisch 등, 2006; Zeikus 등, 1999]). 많은 박테리아는 대부분의 발효 생성물으로서 숙시네이트를 생성하는 자연적인 능력을 갖고 있다고 설명되어 왔다(미국 특허 제5,723,322호; 표 1). 그러나, 복합 과정, 복합 배지 및 긴 배양 시간이 종종 요구 된다.
성공의 정도는 달랐지만 숙시네이트 생성을 위해 대장균 균주(Escherichia coli strain)를 조작하는 데에 다양한 유전적 접근법이 이전에 사용되었다(표 1). 대부분의 연구에서, 달성된 역가(titer)는 낮았고, 복합 배지 재료(예를 들어, 효모 추출물 또는 옥수수 침출액)가 요구되었다. 균주 NZN111은 대사된 글루코스의 몰 당 0.98 몰의 숙시네이트의 몰 수율(molar yield)을 갖는 108 mM 숙시네이트를 생성하였다(문헌[Chatterjee 등, 2001; Millard 등, 1996; Stols 및 Donnelly, 1997]). 이러한 균주는, 다복제(multicopy) 플라스미드로부터 2개의 유전자(피루베이트-포르메이트리아제(pyruvate-formatelyase)를 인코딩(encoding)하는 pflB 및 락테이트 탈수소화효소(lactate dehydrogenase)를 인코딩하는 ldhA)를 비활성화 시키고, 2개의 대장균 유전자인 말레이트 탈수소화효소(malate dehydrogenase(mdh)) 및 포스포에놀피루베이트 카복실화효소(phosphoenolpyruvate carboxylase(ppc))를 과발현시킴으로써 조작되었다. 균주 HL27659k는 숙시네이트 탈수소화효소(sdhAB), 포스페이트 아세틸전이효소(phosphate acetyltransferase(pta)), 아세테이트 키나아제(acetate kinase(ackA)), 피루베이트 옥시다제(pyruvate oxidase(poxB)), 글루코스 수송체(glucose transporter(ptsG)) 및 이소시트레이트 리아제 억제자(isocitrate lyase repressor(iclR))를 변형시킴으로써 조작되었다. 이러한 균주는 100 mM 미만의 숙시네이트를 생성하였고, 산소-제한 발효 조건을 요구하였다(문헌[Cox 등, 2006; Lin 등, 2005a, 2005b, 2005c; Yun 등, 2005]). 대사 인실리코(in silico)의 분석은, 만헤이미아 숙시니시프로두센스(Mannheimia succiniciproducens)에서 천연의 숙시네이트 경로와 유사한 대장균에서의 경로를 발생시키기 위해 유전자 녹아웃(gene knockout)을 설계하는 데에 사용되어 왔다(문헌[Lee 등, 2005 및 2006]). 그러나, 상기 결과로 생성된 균주는 숙시네이트를 거의 생성하지 못하였다. Anderson 등(2007)은 천연의(native) 유전자만을 함유하는 조작된 대장균(339 mM)에 의해 높은 수준의 숙시네이트 생성을 보고하였다.
다른 연구자는 대장균에서 이종 유전자를 발현시키는 다른 접근법을 수행하였다. 리조비움 에텔로티(Rhizobium eteloti) 피루베이트 카복실화효소(pyc)는 탄소 흐름을 숙시네이트로 돌리기 위해 다복제 플라스미드로부터 과발현되었다(문헌[Gokarn 등, 2000; Vemuri 등, 2002a, 2002b]). 균주 SBS550MG는 이소시트레이트 리아제 억제자(iclR), adhE , ldhA 및 ackA를 비활성화시키고, 다복제 플라스미드로부터 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 시트레이트 합성효소(citZ) 및 R.etli pyc를 과발현시킴으로써 제조되었다(문헌[Sanchez 등., 2005a]). 이러한 균주를 이용하여, 글루코스로부터 160 mM의 숙시네이트가 1.6의 몰 수율로 생성되었다.
더 복합된 과정이 숙시네이트 생성을 위해 연구되어 왔다(표 1). 이러한 많은 과정은 호기성 성장 단계 후 혐기성 생성 단계를 포함한다. 혐기성 단계에는 이산화탄소, 수소 또는 둘 모두가 종종 제공된다(문헌[Andersson 등, 2007; Sanchez 등, 2005a 및 2005b; Sanchez 등, 2006]; 미국 특허 제5,869,301호; 문헌[Vemuri 등, 2002a 및 2002b]). 천연의 숙시네이트 생산자에 대한 최근의 연구 에서, A. 숙시니시프로두센, 전기투석, CO2 분사법, 셀 재순환(cell recycle) 및 회분식 유가 반응(batch feeding)이 조합되었다(문헌[Meynial-Salles 등., 2007]).
본 발명은, 이종의 유전자 또는 플라스미드를 필요로 하지 않으면서 간단하고, pH-조절되고, 회분식 발효 동안에 미네랄 염 배지에서 높은 역가 및 수율로 숙시네이트를 생성하는, 대장균의 균주와 같은 다양한 형태의 미생물을 제공한다. 발현되는 동안에, 중간체 균주는 주된 생성물로서 말레이트(malate)를 생성하는 것으로 특징지워졌다.
본 발명은 락테이트의 생성에 유용한 신규의 미생물, 예를 들어 대장균을 제공한다. 따라서, 본 발명의 물질 및 방법은 다양한 적용에 사용하기 위한 숙시네이트 및 말레이트를 생성하는 데에 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 대장균의 유도체는 숙시네이트, 말레이트 및 알라닌(alanine)을 생성하는 균주를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 실시예에서, 대장균 C(예를 들어, ATCC 8739)는 다양한 보관소 또는 상업적인 소스(source)로부터 수득할 수 있는 임의의 다른 대장균 균주로 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 조작된 미생물은 또한 천연의(native) 유전자만을 함유한다(즉, 다른 미생물에서 나온 유전자 물질을 함유하지 않음). 본 발명의 추가적인 장점은 하기의 설명으로부터 쉽게 명백해질 것이다.
도 1a 내지 도 1b는 글루코스가 숙시네이트로 발효되는 것을 나타낸다. 도 1a는 대장균에 의한 글루코스의 발효에 대한 표준 경로를 나타낸다. 이러한 경로는 운덴(Unden) 및 클리펠드(Kleefeld)(2004)에 의해 재규명되었다. 굵은 화살표는 주요한 발효 경로를 나타낸다. 십자형 기호는 KJ012(ldhA , adhE , ackA)를 조작(engineer)하기 위해 본 연구에서 수행된 유전자 결실을 나타낸다. 유전자 및 효소: ldhA, 락테이트 탈수소화효소(lactate dehydrogenase); pflB, 피루베이트-포르메이트리아제(pyruvate-formate lyase); focA, 포르메이트 수송체(formate transporter); pta, 포스페이트 아세틸전이효소(phosphate acetytransferase); ackA, 아세테이트 키나아제(acetate kinase); adhE, 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase); ppc, 포스포에놀피루베이트 카복실화효소(phosphoenolpyruvate carboxylase); pdh, 피루베이트 탈수소화효소 복합체(pyruvate dehydrogenase complex); gltA, 시트레이트 합성효소(citrate synthase); mdh, 말레이트 탈수소화효소(malate dehydrogenase); fumA , fumB 및 fumC, 퓨마라제 이소자임(fumarase isozymes) ; frdABCD, 퓨마레이트 환원효소(fumarate reductase); fdh, 포르메이트 탈수소화효소(formate dehydrogenase); icd, 이소시트레이트 탈수소화효소(isocitrate dehydrogenase); acs, 아세틸~CoA 합성효소(acetyl~CoA synthetase); mgsA, 메틸글리옥살 합성효소(methylglyoxal synthase); poxB, 피루베이트 옥시다제(pyruvate oxidase); aldA, 알데히드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase); 및 aldB, 알데히드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase). 도 1b는 대장균의 조작된 균주에서 숙시네이트 및 말레이트를 제조하기 위한 ATP 생성 및 성장의 연결을 나타낸다. 진한 화살표는 NADH 풀(pool)을 연결한다. 점선의 화살표는 NAD+ 풀을 연결한다. 혐기성 조건 하의 해당과정 동안에, 성장은 ATP의 생성 및 NADH의 산화와 부득이하게 연결된다.
도 2a 내지 2d는 대장균에 의해 숙시네이트를 생성하는 가능한 카복실화 경로를 나타낸다. 주요 카복실화 효소를 인코딩하는 유전자는 굵은 글씨체로 나타내었다. 도 2a는 PEP 카복실라제를 나타낸다. 포스포에놀피루베이트(PEP)로부터 ATP는 생성되지 않는다. 이는 글루코스 발효 동안에 대장균에 의해 숙시네이트를 생성하기 위한 주된 경로로 간주된다.
도 2b는 말릭(malic) 효소(NADH)를 나타낸다. 피루베이트 키나아제(pykA 또는 pykF)에 의해 ADP 및 PEP에서 ATP를 생성하는 동안에 에너지는 보존된다. 말릭 효소(sfcA)는 말레이트를 생성하기 위해 NADH-연계되고, 환원적인 카복실화를 촉진한다. 도 2c는 말릭 효소(NADPH)를 나타낸다. 피루베이트 키나아제(pykA 또는 pykF)에 의해 ADP 및 PEP에서 ATP를 생성하는 동안에 에너지는 보존된다. 말릭 효소(maeB)는 말레이트를 제조하기 위해 NADPH-연계되고, 환원적인 카복실화를 촉진한다. 도 2d는 PEP 카복시키나아제를 나타낸다. 옥살아세트산(oxaloacetic acid)을 생성하기 위한 PEP의 카복실화 동안에 ATP가 생성되어 에너지는 보존된다.
도 3a 내지 3c는 KJ017, KJ032 및 KJ060을 제조하기 위해 KJ012가 대사적으로 진화되는 동안에 성장하는 것을 나타낸다. 균주 KJ012는 KJ017을 제조하기 위해, 5%(w/v)의 글루코스(도 3a) 및 10%(w/v)의 글루코스(도 3b)를 각각 함유하는 NBS 배지에 연속적으로 전이되었다. focA 및 pflB의 결실 후에, 상기 결과로 생성된 균주(KJ032)는 아세테이트가 추가된 배지에서 초기에 2차 배양되었다(도 3c). KJ060을 제조하기 위한 추가적인 전이 동안에 아세테이트 수준(level)은 감소되고 이후에 제거되었다. 비교를 위해 첨가된 파선은 아세테이트 없이 KJ017에 의한 발효를 나타낸다. 기호: OD550nm에서의 광학 밀도, ●.
도 4a 내지 4f는 숙시네이트 및 말레이트 제조를 위한 균주가 대사적으로 진화되는 동안에 발효 생성물의 개요를 나타낸다. 나타낸 바와 같이 아세트산 나트륨을 추가하여 배양하였다. 검은색 화살표는 문자로 나타낸 바와 같이 발효 조건 사이에서의 전이를 나타낸다. KJ032가 대사적으로 진화되는 동안에 포르메이트 및 작은 양의 락테이트도 검출되지 않았다. KJ070 및 KJ072가 대사적으로 진화되는 동안에 포르메이트 및 락테이트는 검출되지 않았다. 도 4a(5% w/v 글루코스) 및 도 4b(10% w/v 글루코스), KJ012에서 KJ017; 도 4c(5% w/v 글루코스) 및 도 4d(10% w/v 글루코스), KJ032에서 KJ060; 도 4e 10% 글루코스, KJ070에서 KJ071; 도 4f 10% 글루코스, KJ072에서 KJ073. 기호 : ■, 숙시네이트; □, 포르메이트; △, 아세테이트; ▲, 말레이트; ◆, 락테이트; 및 ▼, 피루베이트.
도 5는 숙시네이트 및 말레이트 제조를 위한 생촉매(biocatalyst)로서 대장균 C의 유전자 조작 및 대사적인 진화에서의 단계를 요약한 다이어그램(diagram)을 나타낸다. 이러한 과정은 성장-기반의 선택 중 2000여 종을 제공하는 261 연속적인 전이를 나타낸다. 표 3의 괄호에서 나타낸 바와 같이, 클론은 각각의 레지 먼(regimen)의 최종적인 배양으로부터 분리되고, 균주 지정(strain designation)으로 할당되었다.
도 6은 글루코스의 발효 및 이와 관련된 경로를 나타낸다. 제조에서 결실된 유전자를 나타내는 주요한 대사는 숙시네이트 제조를 위해 조작되었다. 진한 화살표는 주요한 발효 경로를 나타낸다. 굵은 점선(dashed) 화살표는 아세테이트(poxB)로의 피루베이트 산화에 대한 미세호기성(microaerophilic) 경로를 나타낸다. 점선 화살표는 호기성 대사 동안에 피루베이트 탈수소화효소(pdh) 및 글리옥실레이트 바이패스(glyoxylate bypass)(aceAB)를 정상적으로 기능하게 하는 경로를 나타낸다. 박스된 십자형은 KJ012 및 KJ017을 제조하는 데에 사용되는 3개의 초기 유전자 결실(ldhA , adhE , ackA)을 나타낸다. 단순한 십자형은 KJ017 유도체를 제조하는 동안에 결실된 추가 유전자를 나타낸다: KJ032(ldhA , adhE , ackA , focA , pflB), KJ070(ldhA , adhE , ackA, focA , pflB , mgsA) 및 KJ072(ldhA , adhE , ackA , focA , pflB , mgsA , poxB). 유전자 및 효소: ldhA, 락테이트 탈수소화효소(lactate dehydrogenase); focA, 포르메이트 수송체(formate transporter); pflB, 피루베이트-포르메이트리아제(pyruvate-formate lyase); pta, 포스페이트 아세틸전이효소(phosphate acetytransferase); ackA, 아세테이트 키나아제(acetate kinase); adhE, 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase); ppc, 포스포에놀피루베이트 카복실화효소(phosphoenolpyruvate carboxylase); pdh, 피루베이트 탈수소화효소 복합체(pyruvate dehydrogenase complex); gltA, 시트레이트 합성효소(citrate synthase); mdh, 말레이트 탈수소화효소(malate dehydrogenase); fumA , fumB 및 fumC, 퓨마라제 이소자임(fumarase isozymes); frdABCD, 퓨마레이트 환원효소(fumarate reductase); fdh, 포르메이트 탈수소화효소(formate dehydrogenase); mgsA, 메틸글리옥살 합성효소(methylglyoxal synthase); gloAB, 글리옥실라제(glyoxylase) Ⅰ 및 Ⅱ; poxB, 피루베이트 옥시다제(pyruvate oxidase); aceA, 이소시트레이트 리아제(isocitrate lyase); aceB, 말레이트 합성효소(malate synthase); acnAB, 아코니타제(aconitase); 및 acs, 아세틸~CoA 합성효소(acetyl~CoA synthetase).
도 7a 내지 7c는 대장균 C의 유도체에 의해 미네랄 염 배지(10% 글루코스)에서 숙시네이트 및 말레이트를 제조하는 것을 나타낸다. 도 7a는 AM1 배지에서 KJ060에 의한 숙시네이트 제조를 나타낸다. 도 7b는 AM1 배지에서 KJ073에 의한 숙시네이트 제조를 나타낸다. 도 7c는 NBS 배지에서 KJ071에 의한 말레이트 제조를 나타낸다. 발효는 33mg DCW l-1의 수준에서 접종하였다. 기호 : ○, 글루코스; ●, 숙시네이트; ■, 말레이트; △, 세포 질량(cell mass).
도 8은 pL0I4162의 제조를 나타낸다. pEL04 및 pLOI4152와 관련된 짧은 진한 화살표는 DNA 증폭에 사용되는 프라이머(primer)를 나타낸다.
도 9는 KJ073에서 숙시네이트 생성 경로를 나타낸다. 본 연구에서 숙시네이트 제조에 수반되는 주요 카복실화 효소인, 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제를 인코딩하는 pck 유전자는 반대의 유형으로 나타내어진다. 진한 화살표는 글루코스의 혐기성 발효 동안에 기능화되도록 예상되는 반응을 나타낸다. 진한 십자형 은 결실된 유전자를 나타낸다. 박스된 십자형은 숙시네이트 생성을 위한 초기 균주인, KJ017(ldhA , adhE, ackA)을 제조하는 데에 사용되는 주된 결실을 나타낸다. 굵은 점선은, 미세호기성 조건 하에서만 일반적으로 기능화되는 과정인, PoxB에 의한 아세테이트로의 피루베이트의 산화를 나타낸다. 점선은 호기성 미생물과 주로 관련된 반응을 나타낸다. 유전자 및 효소 : ldhA, 락테이트 탈수소화효소(lactate dehydrogenase); pflB, 피루베이트-포르메이트리아제(pyruvate-formate lyase); focA, 포르메이트 수송체(formate transporter); pta, 포스페이트 아세틸전이효소(phosphate acetytransferase); ackA, 아세테이트 키나아제(acetate kinase); adhE, 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase); ppc, 포스포에놀피루베이트 카복실화효소(phosphoenolpyruvate carboxylase); pdh, 피루베이트 탈수소화효소 복합체(pyruvate dehydrogenase complex); gltA, 시트레이트 합성효소(citrate synthase); mdh, 말레이트 탈수소화효소(malate dehydrogenase); fumA , fumB 및 fumC, 퓨마라제 이소자임(fumarase isozymes); frdABCD, 퓨마레이트 환원효소(fumarate reductase); fdh, 포르메이트 탈수소화효소(formate dehydrogenase); icd, 이소시트레이트 탈수소화효소(isocitrate dehydrogenase); acs, 아세틸~CoA 합성효소(acetyl~CoA synthetase); mgsA, 메틸글리옥살 합성효소(methylglyoxal synthase); poxB, 피루베이트 옥시다제(pyruvate oxidase); aldA, 알데히드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase); 및 aldB, 알데히드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase). tdcE 유전자(pflB와 상동성이 있는(homologous), 피루베이트 포르메이트리아제) 및 tcdD 유전자(ackA와 상동성이 있는(homologous), 프로피오네이 트(propionate) 키나아제)는 괄호로 나타내고, 트레오닌 감성 반응(threonine degradation) 동안에 일반적으로 발현된다.
도 10은 결실된(진한 십자형) 추가적인 유전자의 경로를 예시하는 대사의 연장된 부분을 나타낸다. 숙시네이트 및 아세테이트는 KJ073 발효에서 나온 주된 생성물(박스됨)이다. 유전자 및 효소 : citDEF, 시트레이트 리아제(citrate lyase); gltA, 시트레이트 합성효소(citrate synthase); aspC, 아스파르테이트 아미노기전이효소(aspartate aminotransferase); pck, 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제; sfcA, NAD+-연결된 말릭 효소; fumA & fumB, 퓨마라제; frdABCD, 퓨마레이트 환원효소(fumarate reductase); pykA & pykF, 피루베이트 키나아제; tdcE , 피루베이트 포르메이트리아제(pflB와 상동성이 있음); pta, 포스페이트 아세틸전이효소(phosphate transacetylase); tcdD, 아세테이트 키나아제(ackA와 상동성이 있음).
본 발명은 물질 및 방법을 제공하는데, 특유하고 유리한 조합의 유전자 돌연변이는 탄소 흐름을 원하는 생성물(예를 들어, 숙시네이트 및 말레이트)로 돌리는 데에 사용된다. 본 발명의 기술은 천연의 경로 뿐만 아니라 재조합 경로로부터 생성물을 수득하는 데에 사용될 수 있다. 유리하게도, 본 발명은 영양분으로서 미네랄 염 및 당만으로 이러한 생성물을 제조하기 위한 다용도의 플랫폼(platform)을 제공한다.
본 발명의 미생물은, 대장균에 속하는 것과 같은 박테리아에서 하나 이상의 목표 유전자를 변형시킴으로써 수득될 수 있다. 일 실시예에서, 변형된 박테리아는 대장균 또는 그의 특정 균주(예를 들어, 대장균 B, 대장균 C, 대장균 W 또는 기타)일 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명에 따라 변형될 수 있는 박테리아는, 글루코노박터 옥시단(Gluconobacter oxydans), 글루코노박터 아사이(Gluconobacter asaii), 아크로모박터 델마베(Achromobacter delmarvae), 아크로모박터 비스코서스(Achromobacter viscosus), 아크로모박터 락티쿰(Achromobacter lacticum), 아그로박테리움 튜메파시엔(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 알칼리진 패칼리스(Alcaligenes faecalis), 아스로박터 시트레우스(Arthrobacter citreus), 아스로박터 투메센(Arthrobacter tumescens), 아스로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus), 아스로박터 하이드록시카보글루타미쿠스(Arthrobacter hydrocarboglulamicus), 아스로박터 옥시단(Arthrobacter oxydans), 오레오박테리움 사페르데(Aureobacterium saperdae), 아조토박터 인디쿠스(Azotobacter indicus), 브레비박테리움 암모니아진(Brevibacterium ammoniagenes), 디바리카툼(divaricatum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 글로보숨(Brevibacterium globosum), 브레비박테리움 푸스쿰(Brevibacterium fuscum), 브레비박테리움 케토글구타미쿰(Brevibacterium ketoglutamicum), 브레비박테리움 헬코룸(Brevibacterium helcolum), 브레비박테리움 푸실룸(Brevibacterium pusillum), 브레비박테리움 테스타세움(Brevibacterium testaceum), 브레비박테리 움 로세움(Brevibacterium roseum), 브레비박테리움 이마리오필리움(Brevibacterium immariophilium), 브레비박테리움 리넨(Brevibacterium linens), 브레비박테리움 프로토파르미에(Brevibacterium protopharmiae), 코리네박테리움 아세토필룸(Corynebacterium acetophilum), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 칼루네(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 아세토애시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 엔테로박터 애로진(Enterobacter aerogenes), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora), 에르위니아 허비콜라(Erwinia herbicola), 에르위니아 크리샌세미(Erwinia chrysanthemi), 플라보박테리움 페레그리눔(Flavobacterium peregrinum), 플라보박테리움 푸카툼(Flavobacterium fucatum), 플라보박테리움 아우란티눔(Flavobacterium aurantinum), 플라보박테리움 레나눔(Flavobacterium rhenanum), 플라보박테리움 세와넨스(Flavobacterium sewanense), 플라보박테리움 브레브(Flavobacterium breve), 플라보박테리움 메닝고셉티쿰(Flavobacterium meningosepticum), 마이크로코쿠스(Micrococcus ) 종. CCM825, 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii), 노카디아 오파카(Nocardia opaca), 노카디아 루고사(Nocardia rugosa), 플라노코쿠스 에우시나투스(Planococcus eucinatus), 프로테우스 레트게리(Proteus rettgeri), 프로피오니박테리움 스헤르만니이(Propionibacterium shermanii), 슈도모나스 신산타(Pseudomonas synxantha), 슈도모나스 아조토포만(Pseudomonas azotoformans), 슈도모나스 플루오레센(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis), 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 애시도보란(Pseudomonas acidovolans), 슈도모나스 무시돌렌(Pseudomonas mucidolens), 슈도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 로도코쿠스 에리스로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 로도코쿠스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous), 로도코쿠스(Rhodococcus) 종. ATCC 15592, 로도코쿠스(Rhodococcus) 종. ATCC 19070, 스포로사시나 우레아(Sporosarcina ureae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii), 비브리오 티로진(Vibrio tyrogenes), 액티노마두라 마두레(Actinomadura madurae), 액티노마이스 비올라세오크로모진(Actinomyces violaceochromogenes), 기타사토스포리아 파루로사(Kitasatosporia parulosa), 스트렙토마이스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이스 플라벨루스(Streptomyces flavelus), 스트렙토마이스 그리세올루스(Streptomyces griseolus), 스트렙토마이스 리비단(Streptomyces lividans), 스트렙토마이스 올리바세우스(Streptomyces olivaceus), 스트렙토마이스 타나시엔시스(Streptomyces tanashiensis), 스트렙토마이스 버지니아(Streptomyces virginiae), 스트렙토마이스 안티바이오티쿠스(Streptomyces antibioticus), 스트렙토마이스 카카오이(Streptomyces cacaoi), 스트렙토마이스 라벤둘레(Streptomyces lavendulae), 스트렙토마이스 비리도크로모진(Streptomyces viridochromogenes), 애로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 바실루스 푸 밀루스(Bacillus pumilus), 바실루스 서큘란(Bacillus circulans), 바실루스 티아미노리티쿠스(Bacillus thiaminolyticus), 에스케리키아 푸룬디(Escherichia freundii), 마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum), 세라티아 마르세스센(Serratia marcescens), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 스코트물레리(Salmonella schottmulleri), 크산토모나스 시트리(Xanlhomonas citri) 및 기타 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시예에서, 본 발명은 숙시네이트 또는 말레이트의 제조에 적당한 다른 유기체로부터 플라스미드, 항생물질에 대한 내성 유전자 및/또는 물질이 없는 박테리아 균주(예를 들어, 대장균)를 제공한다. 다른 미생물 시스템과 달리, 본 발명의 미생물은 기질로서 당을 사용하는 단일 단계 제조 과정에 사용될 수 있는데, 이는 높은 비율의 생성물 생성, 높은 수율, 간단한 영양 요구(예를 들어, 미네랄 염 배지), 그리고 6탄당, 5탄당 및 많은 이당류의 생물 변환을 허용하는 강력한 대사를 갖는다.
따라서, 본 명세서에 따라 제조되는 미생물은 당해 기술 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 비활성화된 하나 이상의 목표 유전자를 가질 수 있다. 예를 들어, 목표 유전자는 목표 유전자에 삽입, 결실 또는 임의의 돌연변이를 도입함으로써 비활성화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 양태는 목표 유전자에 하나 이상의 정지 코돈(예를 들어, 1개 내지 10개 이상의 정지 코돈)을 삽입한다. 본 발명의 일부 양태는, 목표 유전자에서 프레임시프트(frameshift) 돌연변이를 도입하기 위해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 이상의 염기를 삽입 또는 결실한다. 본 발명의 다른 양태는 목표 유전자에서 프레임시프트 돌연변이를 도입하기 위해 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29 또는 이상의 염기를 삽입 또는 결실한다. 본 출원의 다른 실시예는 목표 유전자 내에 하나 이상의 점돌연변이(point mutation)(예를 들어 1개 내지 30개 이상)를 도입하고, 본 발명의 다른 양태는 본 발명의 미생물로부터 목표 유전자를 부분적, 전체적 또는 완전히 결실한다. 본 발명의 이러한 각각의 양태에서, 대사 경로는 목표 유전자(들)에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시킴으로써 비활성화된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "목표 유전자(들)"은 아세테이트 키나아제, 알콜 탈수소화효소, 아스파르테이트 아미노기전이효소, 시트레이트 리아제, 포르메이트 수송체, 락테이트 탈수소화효소, 메틸글리옥살 합성효소, 피루베이트-포르메이트리아제, 피루베이트 옥시다제, 포스페이트 아세틸전이효소, 말릭 효소 및/또는 프로피오네이트 키나아제/α-케토부티레이트 포르메이트리아제를 코딩하는 유전자를 말한다. 바람직한 실시예에서, 상기 유전자는 ackA(아세테이트 키나아제), adhE(알콜 탈수소화효소), aspC(아스파르테이트 아미노기전이효소), citCDEF(시트레이트 리아제), focA(포르메이트 수송체), ldhA(락테이트 탈수소화효소), mgsA(메틸글리옥살 합성효소), pflB(피루베이트-포르메이트리아제), poxB(피루베이트 옥시다제), pta(포스페이트 아세틸전이효소), sfcA(말릭 효소) 및/또는 tdcDE(프로피오네이트 키나아제/α-케토부티레이트 포르메이트리아제)이다. 따라서, 본 발명의 특정 양 태에서, 이러한 유전자 중 하나 이상은 미생물(예를 들어, 대장균을 포함하는 임의의 박테리아 균주)에서 비활성화된다. 개선된 성장 및 숙시네이트 또는 말레이트 제조를 갖는 균주를 위한 선택 과정은 "대사적으로 진화"라고 불리운다(이들의 예는 개시된 예 내에서 제공된다). "천연의 대장균 유전자(들)"은, 대장균에 도입되고 대장균 이외의 임의의 미생물로부터 수득되는 "이종 유전자(heterologous gene)"와 대조적으로, 대장균 미생물에서 자연적으로 발견되는 유전자(들)로 이해된다.
본 발명의 다양한 제한이 없는 실시예는 하기를 포함한다:
1. a) 아세테이트 키나아제, b) 락테이트 탈수소화효소, c) 알콜 탈수소화효소, d) 피루베이트 포르메이트리아제, e) 메틸글리옥살 합성효소, f) 피루베이트 옥시다제 및/또는 g) 시트레이트 리아제인 목표 유전자 중 하나 이상으로의 유전자 변형을 포함하고, 상기 유전자 변형은 상기 목표 유전자에 의해 제조되는 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
2. 실시예 1에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는, 대장균(Escherichia coli), 글루코노박터 옥시단, 글루코노박터 아사이, 아크로모박터 델마베, 아크로모박터 비스코서스, 아크로모박터 락테이트, 아그로박테리움 튜메파시엔, 아그로박테리움 라디오박터, 알칼리진 패칼리스, 아스로박터 시트레우스, 아스로박터 투메센, 아스로박터 파라피네우스, 아스로박터 하이드록시카보글루타미쿠스, 아스로박터 옥시단, 오레오박테리움 사페르데, 아조토박터 인디쿠스, 브레비박 테리움 암모니아진, 디바리카툼, 브레비박테리움 락토퍼멘툼, 브레비박테리움 플라붐, 브레비박테리움 글로보숨, 브레비박테리움 푸스쿰, 브레비박테리움 케토글구타미쿰, 브레비박테리움 헬코룸, 브레비박테리움 푸실룸, 브레비박테리움 테스타세움, 브레비박테리움 로세움, 브레비박테리움 이마리오필리움, 브레비박테리움 리넨, 브레비박테리움 프로토파르미에, 코리네박테리움 아세토필룸, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 칼루네, 코리네박테리움 아세토애시도필룸, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 엔테로박터 애로진, 에르위니아 아밀로보라, 에르위니아 카로토보라, 에르위니아 허비콜라, 에르위니아 크리샌세미, 플라보박테리움 페레그리눔, 플라보박테리움 푸카툼, 플라보박테리움 아우란티눔, 플라보박테리움 레나눔, 플라보박테리움 세와넨스, 플라보박테리움 브레브, 플라보박테리움 메닝고셉티쿰, 마이크로코쿠스 종. CCM825, 모르가넬라 모르가니, 노카디아 오파카, 노카디아 루고사, 플라노코쿠스 에우시나투스, 프로테우스 레트게리, 프로피오니박테리움 스헤르만니이, 슈도모나스 신산타, 슈도모나스 아조토포만, 슈도모나스 플루오레센, 슈도모나스 오발리스, 슈도모나스 스투체리, 슈도모나스 애시도보란, 슈도모나스 무시돌렌, 슈도모나스 테스토스테로니, 슈도모나스 에루지노사, 로도코쿠스 에리스로폴리스, 로도코쿠스 로도크로스, 로도코쿠스 종. ATCC 15592, 로도코쿠스 종. ATCC 19070, 스포로사시나 우레아, 스타필로코쿠스 아우레우스, 비브리오 메치니코비, 비브리오 티로진, 액티노마두라 마두레, 액티노마이스 비올라세오크로모진, 기타사토스포리아 파루로사, 스트렙토마이스 코엘리컬러, 스트렙토마이스 플라벨루스, 스트렙토마이스 그리세올루스, 스트렙토마이스 리비단, 스트렙토마이스 올리바 세우스, 스트렙토마이스 타나시엔시스, 스트렙토마이스 버지니아, 스트렙토마이스 안티바이오티쿠스, 스트렙토마이스 카카오이, 스트렙토마이스 라벤둘레, 스트렙토마이스 비리도크로모진, 애로모나스 살모니시다, 바실루스 푸밀루스, 바실루스 서큘란, 바실루스 티아미노리티쿠스, 에스케리키아 푸룬디, 마이크로박테리움 암모니아필룸, 세라티아 마르세스센, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 스코트물레리 또는 크산토모나스 시트리인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
3. 실시예 1 또는 실시예 2에 있어서, 상기 변형된 박테리아 균주는 대장균 B인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
4. 실시예 1, 2 또는 3에 있어서, 상기 목표 유전자 중 a) 아세테이트 키나아제, b) 락테이트 탈수소화효소, c) 알콜 탈수소화효소, d) 피루베이트 포르메이트리아제 및 e) 피루베이트 옥시다제는 비활성화되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
5. 실시예 4에 있어서, 상기 박테리아 균주는 비활성화된 메틸글리옥살 합성효소 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
6. 실시예 4 또는 실시예 5에 있어서, 상기 박테리아 균주는 비활성화된 시트레이트 리아제 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
7. 실시예 1, 2, 3, 4 또는 5에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 대사적으로 진화된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
8. 실시예 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 있어서, 상기 유전자 또는 그의 일부 분은 결실되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
9. 실시예 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 있어서, 상기 유전자는 프레임시프트 돌연변이, 점돌연변이, 정지 코돈의 삽입 또는 그의 조합으로 비활성화되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
10. 실시예 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 대장균 균주이고, 외래 유전자 또는 그의 단편을 포함하지 않는(또는 천연의 대장균 유전자만을 포함함) 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
11. 실시예 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 있어서, 1) 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 비활성화된 하기의 유전자 중 하나 이상을 갖지 않는다: a) 퓨마레이트 환원효소; b) ATP 합성효소(synthase); c) 2-케토글루타르산 탈수소화효소(sucAB); d) 숙시네이트 탈수소화효소(예를 들어, sdhAB), 포스페이트 아세틸전이효소(예를 들어, pta); e) 글루코스 수송체(예를 들어, ptsG); f) 이소시트레이트 리아제 억제자(예를 들어, iclR); 및/또는 2) 상기 유전적으로 변형된 균주는 유전자(예를 들어, 말레이트 탈수소화효소(mdh) 및 포스포에놀피루베이트 카복실라제(ppc), 피루베이트 카복실라제(pyc) 및/또는 시트레이트 합성효소(예를 들어, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) citZ)를 인코딩하거나 그리고/또는 과발현하는 플라스미드 또는 다복제 플라스미드를 포함하지 않는다는 조건을 갖는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
12. 실시예 1 내지 실시예 11에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 KJ012, KJ017, KJ032, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072 또는 KJ073인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
13. 실시예 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 배지에 접종하는 단계, 및 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 배양 또는 성장시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 배양 또는 성장시키는 방법;
14. 숙시네이트 또는 말레이트의 제조를 가능하게 하는 조건 하에서, 실시예 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙시네이트 또는 말레이트를 제조하는 방법;
15. 실시예 14에 있어서, 상기 하나 이상의 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 KJ012, KJ034, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072 또는 KJ073인 것을 특징으로 하는 방법;
16. 실시예 13, 14 또는 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 미네랄 염 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법;
17. 실시예 16에 있어서, 상기 미네랄 염 배지는 2% 내지 20% (w/v) 탄수화물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법;
18. 실시예 17에 있어서, 상기 미네랄 염 배지는 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 10.5%, 11%, 11.5%, 12%, 12.5%, 13%, 13.5%, 14%, 14.5%, 15%, 15.5%, 16%, 16.5%, 17%, 17.5%, 18%, 18.5%, 19%, 19.5% 또는 20% (w/v)의 당을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법;
19. 청구항 17 또는 18에 있어서, 상기 탄수화물은 글루코스, 프럭토스, 자일로스(xylose), 아라비노스(arabinose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 람노스(rhamnose), 수크로스(sucrose), 셀로비오스(cellobiose), 헤미셀룰로스(hemicellulose) 또는 그의 다양한 조합인 것을 특징으로 하는 방법;
20. 실시예 14, 15, 16, 17, 18 또는 19에 있어서, 상기 숙시네이트 또는 말레이트는 적어도 0.20M, 0.25M, 0.30M, 0.35M, 0.40M, 0.45M, 0.50M, 0.55M, 0.60M, 0.65M 또는 0.70M의 농도로 제조되는 것을 특징으로 하는 방법;
21. 실시예 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20에 있어서, 상기 배지는 NBS 미네랄 염 배지 또는 AM1 배지(표 4를 참고함)인 것을 특징으로 하는 방법;
22. 실시예 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21에 있어서, 상기 숙시네이트 또는 말레이트의 수율은 90% 이상(동등하거나 또는 초과임)인 것을 특징으로 하는 방법;
23. 실시예 22에 있어서, 상기 수율은 적어도 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% 또는 99%인 것을 특징으로 하는 방법;
24. 청구항 13 내지 16 또는 청구항 20 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성장 배지는 숙시네이트, 말레이트 또는 퓨마레이트의 제조를 위한 기질로서 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법;
25. 청구항 17 내지 19에 있어서, 상기 배지는 숙시네이트, 말레이트 또는 퓨마레이트의 제조를 위한 기질로서 글리세롤을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법; 또는
26. 실시예 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전적으로 변형된 박테리아 균주 및 배지를 포함하는 조성물.
하기의 추가적인 실시예가 또한 본 발명에 의해 제공된다:
1. a) 아세테이트 키나아제, b) 락테이트 탈수소화효소, c) 알콜 탈수소화효소, d) 피루베이트 포르메이트리아제, e) 메틸글리옥살 합성효소, f) 피루베이트 옥시다제, g) 시트레이트 리아제, h) 아스파르테이트 아미노기전이효소, i) 포르메이트 수송체, j) 포스페이트 아세틸전이효소, k) 말릭 효소 및 l) 프로피오네이트키나아제/α-케토부티레이트 포르메이트리아제를 인코딩할 목표 유전자로의 유전자 변형를 포함하고, 상기 유전자 변형은 상기 목표 유전자에 의해 제조되는 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
2. 실시예 1에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는, 대장균, 글루코노박터 옥시단, 글루코노박터 아사이, 아크로모박터 델마베, 아크로모박터 비스코서스, 아크로모박터 락티쿰, 아그로박테리움 튜메파시엔, 아그로박테리움 라디오박터, 알칼리진 패칼리스, 아스로박터 시트레우스, 아스로박터 투메센, 아스로박터 파라피네우스, 아스로박터 하이드록시카보글루타미쿠스, 아스로박터 옥시단, 오레오박테리움 사페르데, 아조토박터 인디쿠스, 브레비박테리움 암모니아진, 디바 리카툼, 브레비박테리움 락토퍼멘툼, 브레비박테리움 플라붐, 브레비박테리움 글로보숨, 브레비박테리움 푸스쿰, 브레비박테리움 케토글구타미쿰, 브레비박테리움 헬코룸, 브레비박테리움 푸실룸, 브레비박테리움 테스타세움, 브레비박테리움 로세움, 브레비박테리움 이마리오필리움, 브레비박테리움 리넨, 브레비박테리움 프로토파르미에, 코리네박테리움 아세토필룸, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 칼루네, 코리네박테리움 아세토애시도필룸, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 엔테로박터 애로진, 에르위니아 아밀로보라, 에르위니아 카로토보라, 에르위니아 허비콜라, 에르위니아 크리샌세미, 플라보박테리움 페레그리눔, 플라보박테리움 푸카툼, 플라보박테리움 아우란티눔, 플라보박테리움 레나눔, 플라보박테리움 세와넨스, 플라보박테리움 브레브, 플라보박테리움 메닝고셉티쿰, 마이크로코쿠스 종. CCM825, 모르가넬라 모르가니, 노카디아 오파카, 노카디아 루고사, 플라노코쿠스 에우시나투스, 프로테우스 레트게리, 프로피오니박테리움 스헤르만니이, 슈도모나스 신산타, 슈도모나스 아조토포만, 슈도모나스 플루오레센, 슈도모나스 오발리스, 슈도모나스 스투체리, 슈도모나스 애시도보란, 슈도모나스 무시돌렌, 슈도모나스 테스토스테로니, 슈도모나스 에루지노사, 로도코쿠스 에리스로폴리스, 로도코쿠스 로도크로스, 로도코쿠스 종. ATCC 15592, 로도코쿠스 종. ATCC 19070, 스포로사시나 우레아, 스타필로코쿠스 아우레우스, 비브리오 메치니코비, 비브리오 티로진, 액티노마두라 마두레, 액티노마이스 비올라세오크로모진, 기타사토스포리아 파루로사, 스트렙토마이스 코엘리컬러, 스트렙토마이스 플라벨루스, 스트렙토마이스 그리세올루스, 스트렙토마이스 리비단, 스트렙토마이스 올리바세우스, 스트렙토마이스 타나시엔시스, 스트렙토마이스 버지니아, 스트렙토마이스 안티바이오티쿠스, 스트렙토마이스 카카오이, 스트렙토마이스 라벤둘레, 스트렙토마이스 비리도크로모진, 애로모나스 살모니시다, 바실루스 푸밀루스, 바실루스 서큘란, 바실루스 티아미노리티쿠스, 에스케리키아 푸룬디, 마이크로박테리움 암모니아필룸, 세라티아 마르세스센, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 스코트물레리 또는 크산토모나스 시트리인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
3. 실시예 2에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 대장균인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
4. (a) 시트레이트 리아제 유전자, 그리고 a) 아세테이트 키나아제, b) 락테이트 탈수소화효소, c) 알콜 탈수소화효소, d) 피루베이트 포르메이트리아제, e) 메틸글리옥살 합성효소, f) 피루베이트 옥시다제, g) 아스파르테이트 아미노기전이효소, h) 포르메이트 수송체, i) 포스페이트 아세틸전이효소, j) 말릭 효소 및 k) 프로피오네이트 키나아제/α-케토부티레이트 포르메이트리아제를 인코딩할 목표 유전자 인코딩 중 하나 이상으로의 유전자 변형; 또는
(b) 시트레이트 리아제 유전자, 락테이트 탈수소화효소 유전자, 알콜 탈수소화효소 유전자, 아세테이트 키나아제 유전자, 포르메이트 수송체 유전자, 피루베이트 포르메이트리아제 유전자, 메틸글리옥살 합성효소 유전자, 피루베이트 옥시다제 유전자, 그리고 a) 아스파르테이트 아미노기전이효소, b) 포스페이트 아세틸전이효소, c) 말릭 효소 및/또는 d) 프로피오네이트 키나아제/α-케토부티레이트 포르메이트리아제를 인코딩할 목표 유전자 중 하나 이상으로의 유전자 변형을 포함하고, 상기 유전자 변형은 상기 목표 유전자에 의해 제조되는 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
5. 실시예 4에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 대장균, 글루코노박터 옥시단, 글루코노박터 아사이, 아크로모박터 델마베, 아크로모박터 비스코서스, 아크로모박터 락티쿰, 아그로박테리움 튜메파시엔, 아그로박테리움 라디오박터, 알칼리진 패칼리스, 아스로박터 시트레우스, 아스로박터 투메센, 아스로박터 파라피네우스, 아스로박터 하이드록시카보글루타미쿠스, 아스로박터 옥시단, 오레오박테리움 사페르데, 아조토박터 인디쿠스, 브레비박테리움 암모니아진, 디바리카툼, 브레비박테리움 락토퍼멘툼, 브레비박테리움 플라붐, 브레비박테리움 글로보숨, 브레비박테리움 푸스쿰, 브레비박테리움 케토글구타미쿰, 브레비박테리움 헬코룸, 브레비박테리움 푸실룸, 브레비박테리움 테스타세움, 브레비박테리움 로세움, 브레비박테리움 이마리오필리움, 브레비박테리움 리넨, 브레비박테리움 프로토파르미에, 코리네박테리움 아세토필룸, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 칼루네, 코리네박테리움 아세토애시도필룸, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 엔테로박터 애로진, 에르위니아 아밀로보라, 에르위니아 카로토보라, 에르위니아 허비콜라, 에르위니아 크리샌세미, 플라보박테리움 페레그리눔, 플라보박테리움 푸카툼, 플라보박테리움 아우란티눔, 플라보박테리움 레나눔, 플라보박테리움 세와넨스, 플라보박테리움 브레브, 플라보박테리움 메닝고셉티쿰, 마이크로코쿠스 종. CCM825, 모르가넬라 모르가니, 노카디아 오파카, 노카디아 루고사, 플라노코쿠스 에우시나투스, 프로테우스 레트게리, 프로피오니박테리움 스헤르만니이, 슈도모나 스 신산타, 슈도모나스 아조토포만, 슈도모나스 플루오레센, 슈도모나스 오발리스, 슈도모나스 스투체리, 슈도모나스 애시도보란, 슈도모나스 무시돌렌, 슈도모나스 테스토스테로니, 슈도모나스 에루지노사, 로도코쿠스 에리스로폴리스, 로도코쿠스 로도크로스, 로도코쿠스 종. ATCC 15592, 로도코쿠스 종. ATCC 19070, 스포로사시나 우레아, 스타필로코쿠스 아우레우스, 비브리오 메치니코비, 비브리오 티로진, 액티노마두라 마두레, 액티노마이스 비올라세오크로모진, 기타사토스포리아 파루로사, 스트렙토마이스 코엘리컬러, 스트렙토마이스 플라벨루스, 스트렙토마이스 그리세올루스, 스트렙토마이스 리비단, 스트렙토마이스 올리바세우스, 스트렙토마이스 타나시엔시스, 스트렙토마이스 버지니아, 스트렙토마이스 안티바이오티쿠스, 스트렙토마이스 카카오이, 스트렙토마이스 라벤둘레, 스트렙토마이스 비리도크로모진, 애로모나스 살모니시다, 바실루스 푸밀루스, 바실루스 서큘란, 바실루스 티아미노리티쿠스, 에스케리키아 푸룬디, 마이크로박테리움 암모니아필룸, 세라티아 마르세스센, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 스코트물레리 또는 크산토모나스 시트리인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
6. 실시예 5에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 대장균인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
7. 실시예 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 대사적으로 진화된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
8. 실시예 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 있어서, 상기 목표 유전자 또는 그의 부 분, 또는 목표 유전자들 또는 그의 부분들은 결실, 프레임시프트 돌연변이, 점돌연변이, 정지 코돈의 삽입 또는 그의 조합에 의해 비활성화되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
9. 실시예 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 외래 유전자 또는 그의 단편을 포함하지 않거나, 또는 천연의 유전자만을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
10. 실시예 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 있어서, 1) 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 비활성화된 하기의 효소 중 하나 이상을 갖지 않으며: a) 퓨마레이트 환원효소; b) ATP 합성효소(synthase); c) 2-케토글루타르산 탈수소화효소(sucAB); d) 숙시네이트 탈수소화효소; e) 글루코스 수송체; f) 이소시트레이트 리아제 억제자; 및/또는 2) 상기 유전적으로 변형된 균주는 말레이트 탈수소화효소, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 피루베이트 카복실라제 및/또는 시트레이트 합성효소를 인코딩하거나 그리고/또는 과발현하는 플라스미드 또는 다복제 플라스미드를 포함하지 않는다는 조건을 갖는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
11. 실시예 7, 8, 9, 10 또는 11에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 대사적으로 진화된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
12. 실시예 1 내지 실시예 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는,
a) 적어도 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM 또는 700 mM 농도의 숙시네이트,
b) 적어도 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM 또는 700 mM 농도의 퓨마레이트, 또는
c) 적어도 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM 또는 500 mM 농도의 말레이트를 생성하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
13. 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 KJ012, KJO17, KJ032, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072, KJ073, KJ076, KJ079, KJ091, KJ098, KJ104, KJ1lO, KJl19, KJ122 또는 KJl34인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주;
14. 실시예 1 내지 실시예 13 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 배지에 접종하는 단계, 및 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 배양 또는 성장시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 배양 또는 성장시키는 방법;
15. 숙시네이트, 말레이트 또는 퓨마레이트의 제조를 가능하게 하는 조건 하에서, 실시예 1 내지 실시예 13 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙시네이트, 퓨마레이트 또는 말레이트를 제조하는 방법;
16. 실시예 15에 있어서, 상기 하나 이상의 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 KJ012, KJO17, KJ032, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072, KJ073, KJ076, KJ079, KJ091, KJ098, KJ104, KJ1lO, KJl19, KJ122 또는 KJl34인 것을 특징으로 하는 방법;
17. 실시예 14 내지 실시예 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 미네랄 염 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법;
18. 실시예 17에 있어서, 상기 미네랄 염 배지는 2% 내지 20% (w/v) 탄수화물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법;
19. 실시예 18에 있어서, 상기 미네랄 염 배지는 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 10.5%, 11%, 11.5%, 12%, 12.5%, 13%, 13.5%, 14%, 14.5%, 15%, 15.5%, 16%, 16.5%, 17%, 17.5%, 18%, 18.5%, 19%, 19.5% 또는 20% (w/v)의 당을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법;
20. 실시예 18 또는 실시예 19에 있어서, 상기 탄수화물은 글루코스, 프럭토스, 자일로스(xylose), 아라비노스(arabinose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 람노스(rhamnose), 수크로스(sucrose), 셀로비오스(cellobiose), 헤미셀룰로스(hemicellulose) 또는 그의 조합인 것을 특징으로 하는 방법;
21. 실시예 15 내지 실시예 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 숙시네이트 또는 말레이트의 수율은 90% 이상인 것을 특징으로 하는 방법;
22. 실시예 21에 있어서, 상기 수율은 적어도 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% 또는 99%인 것을 특징으로 하는 방법;
23. 실시예 15 내지 실시예 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 적어도 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM 또는 700 mM 농도의 숙시네이트를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법;
24. 실시예 15 내지 실시예 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 적어도 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM 또는 500 mM 농도의 말레이트를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법;
25. 실시예 15 내지 실시예 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주는 적어도 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM 또는 700 mM 농도의 퓨마레이트를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법;
26. 실시예 14 내지 17 또는 실시예 21 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 숙시네이트, 말레이트 또는 퓨마레이트의 제조를 위한 기질로서 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법;
27. 실시예 18 내지 20에 있어서, 상기 배지는 숙시네이트, 말레이트 또는 퓨마레이트의 제조를 위한 기질로서 글리세롤을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법; 또는
28. 실시예 1 내지 13에 따른 하나 이상의 유전적으로 변형된 박테리아 균주 및 배지를 포함하는 조성물.
미생물은 예에서 나타낸 바와 같이, 미국, 일리노이주 61604, 피오리아, 유 니버시티 스트리트 1815 N에 있는 농업 연구소 배양균 보관기관에 기탁되었다. 이러한 배양균은, 37 CFR 1.14 및 35 USC 122 하에서 권리를 부여한 특허상표청에 의해 결정되는 것에 대한 특허 출원 중에, 이러한 배양균에 접근 가능할 것을 보장하는 조건 하에서 기탁되었다. 상기 기탁은 본 출원의 대응물 또는 결과물이 출원되는 나라의 특허법에 의해 요구되는 바와 같이 이용가능하다. 그러나, 정부에 의해 수여된 특허권을 훼손하면서까지 본 발명을 실시하는 데에 상기 기탁을 해야하는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.
나아가, 본 배양균 기탁은 미생물의 기탁에 관한 부타페스트 조약의 조항에 따라 저장될 것이고 공중에게 이용가능하게 될 것인데, 상기 배양균은 기탁용 샘플을 공급하기 위한 가장 최근의 요청 후에 적어도 5년의 기간 동안, 임의의 경우에는 기탁일 후 적어도 30년의 기간 동안 또는 개시된 상기 배양균을 발행할 수 있는 임의의 특허를 실행할 수 있는 기간 동안 상기 배양균이 생존가능하고 오염되지 않도록 필요한 모든 관리를 하여 저장될 것이다. 샘플이 요청된 경우에 기탁의 상태 때문에 수탁자가 샘플을 공급할 수 없는 경우에는, 기탁자는 상기 기탁을 대체할 의무가 있음을 인정한다. 공중의 본 배양균 기탁에 대한 이용가능성에 대한 모든 제약은 상기 배양균 기탁을 개시하는 특허에 부여된 것에 대해 결정적으로 제거될 것이다.
이하에서는 본 발명을 실시하는 방법에 대한 예를 예시한다. 이러한 예는 제한적으로 해석되어서는 안된다. 달리 지적하지 않는 한, 모든 백분율은 중량%이고, 모든 용매 혼합 비율은 부피 비율이다.
예 1
미생물은 하기와 같이 농업연구소 배양균 보관기관(ARS Culture Collection)에 기탁되었다:
배양균 균주 지정 기탁일
KJ012 B-50022 2007년 3월 15일
KJ017 B-50023 2007년 3월 15일
KJ032 B-50024 2007년 3월 15일
KJ060 B-50025 2007년 3월 15일
KJ070 B-50026 2007년 3월 15일
KJ071 B-50027 2007년 3월 15일
KJ072 B-50028 2007년 3월 15일
KJ073 B-50029 2007년 3월 15일
물질 및 방법
균주, 배지 및 성장 조건
본 연구에 사용된 균주를 표 2에 요약한다. 대장균 C(ATCC 8739)의 유도체는 생산성 증가를 위한 유전자 결실 및 선택의 독특한 조합에 의해 숙시네이트를 제조하기 위해 발현되었다. 균주 제조 동안에, 배양균은 변형된 루리아 베르타니(LB) 배양액(리터 당: 10g의 배지(Difco) 트립톤, 5g의 배지 효모 추출물, 5g의 염화나트륨)(문헌[밀러, 1992])에서 37℃에서 성장되었다. 항생제는 적당히 포함되었다.
100 mM KHCO3, 1 mM 베타인 HCl 및 당(2% 내지 10%)이 추가된 NBS 미네랄 염 배지(문헌[Causey 등., 2004])를 대부분의 연구에서 및 균주의 보존을 위해 발효 배양액으로서 사용하였다. 새로운 낮은 염 배지인 AM1(4.2g l-1 총 염; Martinez 등., 2007)이 본 연구의 이후 단계 동안에 발현되었고, KJ060 및 KJ073으로 발효되 는 데에 사용되었다. 이 배지는, 초기 당 농도가 5% 이상인 경우에, 나타낸 바와 같이 100 mM KHCO3 및 당이 추가되었고, 1 mM 베타인을 포함한다. 항생물질에 대한 내성, 플라스미드 또는 다른 외래 유전자를 인코딩하는 유전자는, 제조되는 동안의 중간체를 제외하고 숙시네이트 제조를 위해 발현되는 균주에는 존재하지 않는다.
유전자 방법
본 연구에서 사용된 플라스미드 및 프라이머를 표 2에 요약한다. 염색체 결실, 통합 및 항생물질에 대한 내성 유전자의 제거를 위한 방법은 이전에 설명되었다(문헌[Datsenko 및 Wanner, 2000; Grabar 등. 2006; Posfai 등., 1997; Zhou 등. 2006]). 센스 프라이머(sense primer)는 각각의 목표 유전자(굵은 글씨 유형)의 N-말단에 대응한 서열 이후에 FRT-kan-FRT 카세트(cassette)에 대응한 20 bp(밑줄)를 포함한다. 안티-센스(anti-sense) 프라이머는 각각의 목표 유전자(굵은 글씨 유형)의 C-말단에 대응한 서열 이후에 카세트에 대응한 20 bp(밑줄)를 포함한다. 증폭된 DNA 단편은 Red 재조합효소(pKD46)를 품은 대장균 균주로 전기천공되었다. 상기 결과로 생성된 재조합에서, FRT-kan-FRT 카세트는 목표 유전자의 결실된 영역을 상동성이 있는 재조합에 의해 대체하였다(이중 교차의 경우). 내성 유전자(FRT-kan-FRT)는 이후에 플라스미드 pFT-A를 사용하여 FLP 재조합효소를 갖는 염색체로부터 절개되었고, 하나의 FRT 부위를 함유하는 흉터 영역을 남겼다. 염색체 결실 및 통합은 항생물질 표시에 대한 테스트, PCR 분석 및 발효 생성물의 분석에 의해 증명되었다. 일반화된 P1 파지 도입(문헌[Miller, 1992])은 KJ032를 제조하 기 위해 균주 SZ204로부터 균주 KJ017로 ΔfocA - pflB ::FRT-kan-FRT 돌연변이를 전이시키는 데에 사용되었다.
mgsA 및 poxB 유전자의 결실
변형된 방법이 2단계의 상동성이 있는 재조합 과정을 사용하여 대장균 염색체 유전자를 결실시키기 위해 발현되었다(문헌[Thomason 등., 2005]). 이 방법으로, 항생물질 유전자 또는 흉터 서열은 유전자 결실 후에 염색체 상에 남아있지 않다. 제 1의 재조합에서, 목표 유전자의 부분은 클로람페니콜(chloramphenicol) 내성 유전자(cat) 및 레반슈크라제(levansucrase) 유전자(sacB)를 포함하는 DNA 카세트에 의해 대체되었다. 제 2의 재조합에서, cat - sacB 카세트는 결실된 영역을 생략하고 천연의 서열로 대체되었다. sacB 유전자를 포함하는 세포는 수크로스로 배양되는 동안에 레반(levan)을 축적하고 사멸된다. 재조합체는 cat - sacB 카세트의 손실을 위해 매우 풍부하게 생존하였다.
카세트는 유전자 결실을 촉진하도록 제조되었다. cat - sacB 영역은, pLOI4151을 제조하기 위해 JMcatsacB 프라이머 세트(표 2)를 사용한 PCR에 의해 pEL04(문헌[Lee 등., 2001; Thomason 등., 2005])로부터 증폭되고, NheI로 침지되고, pLOI3421의 대응 부위로 결찰(ligate)되었다. cat - sacB 카세트는 pLOI4151(헥산의 주형) 및 cat-업2/ sacB -다운2(cat-up2/sacB-down2) 프라이머 세트(각각의 프라이머에 포함된 EcoRV 부위)를 사용한 PCR에 의해 증폭되었고, EcoRV로 침지되었고, 이후의 결찰에 사용되었다.
mgsA 유전자 및 주위의 500 bp 영역(yccT' - mgsA - helD', 1435 bp)은, 플라스 미드 pLOI4228을 제조하기 위해, 프라이머 세트 mgsA-업/다운을 사용하여 증폭되었고, pCR2.1-TOPO 벡터(인비트로젠)로 클론화되었다. 이 플라스미드 DNA의 1000-배 희석된 표본은 mgsA-l/2 프라이머 세트(mgsA 유전자 내부 및 외부로 향하는 프라이머 둘 모두)를 사용하여 인사이드-아웃(inside-out) 증폭을 위한 헥산의 주형으로서 역할을 하였다. 레플리콘(replicon)을 포함하는 상기 결과로 생성된 4958 bp 단편은, pLOI4229를 제조하기 위해 pLOI4151로부터 증폭되고, EcoRV-침지된 cat - sacB 카세트에 결찰되었다. 이 4958 bp 단편은 또한 제 2의 플라스미드인 pLOI4230(인산화 및 자가-결찰)를 제조하는 데에 사용되었다. pLOI4230에서, mgsA의 중심 영역은 비어있다(yccT' - mgsA' - mgsA "- helD').
XmnI로 pLOI4229 및 pLOI4230을 침지시킨 후에(백터 내에서), 각각은 통합 단계 Ⅰ(yccT' - mgsA' - cat - sacB - mgsA "- helD') 및 단계 Ⅱ(yccT' - mgsA' - mgsA "- helD') 각각을 위한 선형 DNA 단편을 제조하기 위해, mgsA-업/다운 프라이머 세트를 사용하여 증폭하는 헥산의 주형으로서 역할을 한다. pKD46(Red 재조합효소)을 포함하는 KJ060으로 단계 Ⅰ 단편의 전기천공 그리고 발현 및 분리를 허용하기 위한 30℃에서 2시간의 배양 후에, 재조합체는 플레이트(plate) 상에 클로람페니콜(40 mg l-1) 및 암피실린(ampicillin)(20 mg l-1) 내성으로 선택된다(30℃, 18시간). 3개의 클론이 선택되고, 암피실린 및 5% w/v 아라비노스를 갖는 루리아 배양액에서 성장되고, 전기천공을 위해 준비되었다. 단계 Ⅱ 단편으로 전기천공을 한 후에, 세포는 37℃에서 4시간 동안 배양되었고, 10%의 수크로스를 함유하는 100 ml의 변형된 LB(100 mM MOPS 완충액이 첨가되고 NaCl은 생략됨)를 포함하는 250 ml 플라스크로 옮겨졌다. 밤새도록 배양한 후에(37℃에서), 클론은 6%의 수크로스를 함유하는 변형된 LB 플레이트(NaCl 없음; 100 mM MOPS가 첨가됨) 상에서 선택되었다(39℃, 16시간). 생성된 클론을 암피실린 및 클로람페니콜 내성의 손실에 대해 테스트하였다. 제조(construction)는 PCR 분석에 의해 더 확증되었다. mgsA 유전자가 없는 클론이 선택되고 KJ070으로 지정되었다.
poxB 유전자는, mgsA 유전자를 결실하는 데에 사용되는 방법과 유사한 방법에서 KJ071로부터 결실되었다. poxB 결실을 제조하는 데에 사용되는 추가적인 프라이머 세트(poxB-업/다운 및 poxB-1/2)는 대응하는 플라스미드(pLOI4274, pLOI4275 및 pLOI4276)와 함께 표 2에 포함된다. 상기 결과로 생성된 균주는 KJ072로 지정되었다.
효소 분석
세포를 5% 또는 10% 글루코스를 갖는 NBS 배지에서 성장시켰고, 원심분리에 의해 미드-로그(mid-log) 성장하는 동안에 수득하였고(4℃에서 5분 동안 8,000 g),차가운 100 mM 트리스-HCl(pH 7.0) 완충액으로 세척하였고, 동일한 완충액(5 ml)에서 재현탁시켰다. 세포를 유리 비드(bead)로 비드-조작(MP Biomedicals; 오하이오주, 솔론)함으로써 분쇄하고, 천연 그대로의 추출물을 수득하기 위해 15분 동안 13,000g에서 원심분리하였다. 표준(Pierce BCA 단백질 분석 키트)으로서 소의 혈청 알부민을 갖는 BCA 방법에 의해 단백질을 측정하였다.
PEP 카복실라제 활성을 전에 설명한 바와 같이 측정하였다(문헌[Canovas 및 Kornberg, 1969]). 반응 혼합물은 100 mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM NaHCO3, 0.2 mM NADH, 20 U 말레이트 탈수소화효소 및 10 mM PEP를 함유하고, 반응은 천연 그대로의 추출물을 첨가함으로써 시작되었다. PEP 카복시키나아제 활성을 전에 설명된 바와 같이 측정하였다(문헌[Van der Werf 등., 1997]). 반응 혼합물은 100 mM MES 완충액(pH 6.6), 10 mM MgCl2, 75 mM NaHCO3, 5 mM MnCl2, 50 mM ADP, 1 mM DTT, 0.2 mM NADH, 20 U 말레이트 탈수소화효소 및 10 mM PEP를 함유한다. 반응은 천연 그대로의 추출물을 첨가함으로써 시작되었다.
NAD+ 의존형 말릭 효소 활성을 이전에 설명된 바와 같이 양쪽 방향에서 측정하였다(문헌[Stols 및 Donnelly. 1997]). 카복실화 방향에서, 반응 혼합물은 100 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5), 25 mM NaHCO3, 1 mM MnCl2, 1 mM DTT, 0.2 mM NADH 및 25 mM 피루베이트를 함유한다. 반응은 천연 그대로의 추출물을 첨가시킴으로써 시작되었다. 그러나, 이러한 분석 방법은 락테이트 탈수소화효소의 존재 때문에 야생형(wild type) 대장균 C에서 말릭 효소 활성을 측정할 수 없다. 탈카복시화 방향에서, 반응 혼합물은 100 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5), 2.5 mM NAD+, 1 mM DTT, 10 mM MgCl2, 20 mM KCl 및 20 mM L-말레이트를 함유한다. 반응은 천연 그대로의 추출물을 첨가함으로써 시작되었다.
NAD(H)+가 NADP(H)+로 대체된 것을 제외하고, 의존 NADP+ 의존형 말릭 효소 활성을 NADP+ 의존형 말릭 효소에 대해 동일한 방법으로 측정하였다. 활성의 단위는 분(min) 당 1 나노몰(nmol)의 기질을 산화 또는 환원시키는 효소의 양으로 정의되었다.
실시간 RT - PCR 분석
실시간 RT-PCR을 이전에 설명된 바와 같이 메세지 RNA 수준(message RNA level)을 측정하는 데에 사용하였다(문헌[Jarboe 등., 2008]). 세포를 5% 또는 10% 글루코스를 갖는 NBS 배지에서 성장시켰고, 드라이아이스/에탄올 조에서 빙빙돌림으로써 미드-로그 성장 동안에 수득한 후, 원심분리하고 정제할 때까지 알엔에이레이터(RNALater)(캐나다, 발렌시아, 퀴아젠(Qiagen))에서 -80℃에서 저장하였다. RNA 정제는 알엔이지 미니 컬럼(RNeasy Mini columns)(퀴아젠)으로 수행한 후 DNaseI(인비트로젠)로 침지하였다. Superscript Ⅱ(캐나다 칼스배드, 인비트로젠)로의 역전사는 핵산의 주형으로서 50 ng의 총 RNA를 사용하였다. 실시간 PCR은 SYBR Green RT-PCR mix를 갖는 Bio-Rad iCycler(캐나다 헤르클레스, Bio-Rad)에서 수행되었다. 역전사가 없는 RT-PCR을 작동함으로써 게놈의 DNA 오염에 대해 RNA를 조사하였다. 전사가 많다는 것은, 표준 및 발현 수준이 전사 억제자인 birA 유전자에 의해 정상화되는 경우에 게놈의 DNA를 사용하여 추정되었다(Jarboe 등., 2008). pck 및 birA에 사용되는 RT-PCR 프라이머를 표 2에 열거한다.
pck 영역의 염기 서열
KJ073의 pck 유전자에서 발생된 임의의 돌연변이가 있는지를 알기 위해, KJ012 및 KJ073 둘 모두에서 pck 유전자의 코딩 영역 및 프로모터(promotor) 영역(코딩 영역 앞에 약 800bp)은 PfuUltra High Fidelity DNA 중합효소(Stratagene; Wilmington, DE)에 의해 증폭되었다. 프라이머 세트 pck-F/R은 전사 종결 구조를 통해 코딩 영역을 증폭하는 데에 사용되었다. 프라이머 세트 pck-2는 프로모터 영역을 증폭하는 데에 사용되었다. DNA 염기 서열은 생명공학 연구를 위한 플로리다 대학의 학제학적 연구 센터에 의해 제공되었다(적용된 생물계의 자동 염기 서열 분석 장치에 의함).
발효
종균(seed) 미생물 및 발효를 글루코스, 100 mM KHCO3 및 1 mM 베타인 HCl을 함유하는 NBS 또는 AM1 미네랄 염 배지에서 37℃, 100 rpm에서 성장시켰다. 초기 실험과정 동안에 KOH를 자동적으로 첨가함으로써 pH 7.0에서 유지하였다. 이후에, 3 M K2CO3와 6N KOH의 1:1 혼합물을 첨가함으로써 pH를 유지하였다. 발효는 350 ml의 작동 부피를 갖는 작은 발효 용기에서 수행하였다. 발효는 나타낸 바와 같이 0.01(3.3 mg CDW l-1) 또는 0.1(33.3 mg CDW l-1)의 초기 OD550 중 하나에서 접종되었다. 항생물질에 대한 내성 유전자는 테스트된 균주에는 존재하지 않았다. 발효 용기는 샘플 제거를 위한 배출구로서 역할을 하는 16 게이지 바늘을 제외하고는 봉인되었다. 무산소생활은 대기의 CO2를 확보하기 위해 제공되는 첨가된 중탄산염으 로 성장하는 동안에 빠르게 달성되었다.
분석
세포 질량을 Bausch & Lomb Spectronic 70 분광광도계로 550 nm(OD 1.0 = 333 mg의 세포 건조 중량 l-1)에서 광학 밀도로부터 추정하였다. 유기 산 및 당은 고성능 액체 크로마토그래피를 사용함으로써 측정되었다(문헌[Grabar 등., 2006]).
결과 및 논의
숙시네이트 생성을 위한 KJ012 의 제조 : ldhA , adhE 및 ackA 의 결실
대장균에 관한 가장 대부분의 과학적 지식은 복합 배지(예를 들어, 본원에서 보고된 연구에서 사용되는 5% (w/v) 글루코스(278 mM) 및 10% (w/v)(555 mM) 글루코스 보다는 낮은 농도의 당 기질(일반적으로 0.2% w/v; 11 mM)을 사용하는 미네랄 염 배지 보다는 루리아 배양액임)에서의 연구로부터 유래된다. 상업적으로 상당한 수준의 생성물을 제조하는 데에 많은 양의 당이 요구된다. 이전의 연구는 복합 배지에서 숙시네이트 생성을 위한 많은 대장균 유도체의 제조를 설명하였다(표 1). 복합 배지에서, 주요 경로에 기초한 합리적인 디자인은 대사 공학의 학술 시연에서 상당히 성공적이었다. 그러나, 박테리아 발효 생성물의 제조를 위해 복합 영양소를 사용하는 것은 물질 비용, 정제 비용 및 폐기물 처리에 관련된 비용을 증가시킨다. 복합 배지 성분 없이 미네랄 염 배지를 사용하는 것은 훨씬 더 비용-효율적이어야 한다.
대장균 C는 글루코스를 함유하는 NBS 미네랄 염 배지에서 잘 성장하고 발효 생성물로서 락테이트, 아세테이트, 에탄올 및 숙시네이트의 혼합물을 생성한다(도 1a; 표 3). 대장균으로 한 다른 연구와 대조적으로(표 1), 본원에서 보고되는 연구는 물질, 숙시네이트 정제 및 폐기물 처리 비용을 최소화하기 위해 미네랄 염 배지를 사용하여 높은 수준의 당을 숙시네이트로 변환시킬 수 있는 균주의 발현에 초점이 맞춰져 있었다. 대장균에 대해 일반적으로 받아들여지는 표준 발효 경로를 예시하는 도 1을 참조하면, 숙시네이트-제조 균주의 대사 공학을 위한 합리적인 디자인은, 모든 다른 생성물에 대해 최종 단계를 인코딩하는 유전자에서 결실이 발생하도록 고안되었다: 락테이트(ldhA), 에탄올(adhE) 및 아세테이트(ackA). 합리적인 디자인에 의해 이러한 대사 공학에서 나온 결과는 완전히 예상치 못한 것이었다. 상기 결과로 생성된 균주(KJ012)는 5% 글루코스(278 mM)를 함유하는 미네랄 염 배지에서 혐기성 조건 하에서 매우 불완전하게 성장하였고, 주된 발효 생성물로서 숙시네이트 대신에 아세테이트를 생성하였다. 합리적인 디자인에서 나온 예상과는 반대로, 숙시네이트는 생성물 중에 작은 부분으로 남아있었다. 대사된 글루코스에 근거한 숙시네이트의 몰 수율은 이러한 돌연변이의 결과로서 변화하지 않았고, 5%의 글루코스를 함유하는 NBS 미네랄 염 배지에서 발효되는 동안에 모체 및 KJ012에 대해 글루코스의 몰 당 0.2 몰 숙시네이트가 수득되었다. 우리는 NBS 미네랄 염 배지가 호기성 조건(호기성 흔들어진 플라스크; 5% 글루코스) 하에서 배양되는 KJ012의 성장에 필요한 모든 미네랄 영양소를 함유한다는 것을 확인하였다. 호기성 흔들어진 플라스크에서, KJ012에 대한 세포 수율은 혐기성 성장 동안 보다 5-배 높았고, 혐기성 성장 동안에 대장균 C(모체)의 75% 이었다. 또한, 이러한 결 과로 모든 중심부 생합성 경로는 KJ012에서 기능적으로 남아 있다는 것이 확인되었다.
복합 영양소가 존재하는 경우에(루리아 배양액), KJ012에 의한 발효성 숙시네이트 제조는 최소한의 염 배지에 있는 KJ012와 비교할 때 20-배 증가하였고, 숙시네이트에 대한 몰 수율은 3.5-배 증가하였다. 명백하게는, 주된 경로에 기초한 합리적인 디자인은 학술 시연에 더 적합하거나, 복합 영양소로 사용하기 위해 의도된 과정을 디자인하는 데에 더 적합하다.
미네랄 염 배지에서 혐기성 대사 동안에 불완전한 성장, 불완전한 숙시네이트 생성 및 KJ012(Δ ldhA :: FRT Δ adhE :: FRT Δ ackA :: FRT)에 의한 아세테이트 제조에서의 증가에 대한 근거는 알려지지 않았다. 이는 표준 경로 차트에 기초한 합리적인 디자인을 사용하여 대사 공학에서 나온 예상치 못한 결과이다. 최소한의 배지에서, 대사 공학에 대한 합리적인 디자인은 명백히 예상되지 않는다. 상기 결과로 생성된 균주인 KJ012는 성장에서 모체보다 하위에 있고 숙시네이트 제조에 대해 모체보다 더 우수하지 않다.
KJ012 의 성장-기반의 선택에 의한 숙시네이트 제조를 위한 KJ017 의 발현
KJ012(Δ ldhA :: FRT Δ adhE :: FRT Δ ackA :: FRT)는 모체인 대장균 C와 비교하여 불완전하게 성장하였으며, 더 낮은 비율로 숙시네이트를 생성하고, 더 우수하지 않은 몰 수율을 제공한다(표 3). 이러한 결과에도 불구하고, 이 균주의 연속적인 전이는 하기의 이론적 근거에 기초하여 개선된 성장 및 숙시네이트 제조를 공동-선택하는 방법으로 시도되었다. 숙시네이트로의 글루코스 발효에 대한 주된 경로(도 1a 및 도 2a)는 카복실화 단계에 대해 포스포에놀피루베이트 카복실라제(ppc)를 사용하도록 일반적으로 여겨진다(문헌[Unden 및 Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Keseler 등., 2005; Millard 등., 1996; Gottschalk, 1985; Karp 등., 2007]). 이러한 카복실화 효소는 포스포에놀피루베이트에서 높은 에너지의 포스페이트를 보존하지 못하고, 성장을 위해 이용가능한 순(net) ATP를 감소시킨다. 숙시네이트 제조를 위한 다른 경로는, ATP 수율을 증가시키고 이에 의하여 성장을 증가시킬 수 있는 공지된 대장균 유전자의 레퍼토리를 사용하도록 계획될 수 있다(도 1a; 도 2b, 2c 및 2d). 그러나, 이러한 다른 경로 중 어느 것도 천연의 균주인 대장균으로 발효하는 동안에 숙시네이트 제조를 위해 작용하도록 나타나지 않았다. 이러한 다른 경로에서 주요 효소는 글루코스에 의해 억제되며, 글루코스 신생합성(gluconeogenesis) 동안에 정상적으로 활성적이다. 일반적으로, 이러한 글루코스 신생합성 효소의 수준은 글루코스 및 다른 대사 산물의 이용가능성과 반비례하여 변하고(문헌[Goldie 및 Sanwal, 1980a; Wright 및 Sanwal, 1969; Sanwal 및 Smando, 1969a]), 반대 방향인 탈카복실화에서 작용한다(문헌[Keseler 등., 2005; Oh 등., 2002; Kao 등., 2005; Stols 및 Donnelly, 1997; Samuelov 등., 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere 등., 2004; Goldie 및 Sanwal, 1980b; Sanwal 및 Smando, 1969b; Sanwal 1970b]).
이러한 것 중 하나에 대한 주요 효소인 NADH-연계된 말릭 효소(sfcA)(도 2b)는 대장균에서 숙시네이트 제조를 증가시킬 수 있다는 것을 증명해 왔지만, 그렇게 하기 위해 플라스미드로부터 과발현을 요구하였다(문헌[Stols 및 Donnelly, 1997]). 그러나, 이러한 다른 경로 중 어느 것도, 높은 수준의 글루코스로 혐기성 성장하는 동안에, 천연의 균주인 대장균 또는 KJ012에서 작용하도록 기대되지 않을 것이다. 개선된 성장을 위해 선택되는 KJ012의 연속적인 전이는, 산화환원 균형을 유지하고 ATP 수율을 증가시키는 숙시네이트 제조를 위한 다른 경로(도 1b)의 돌연변이 활성화를 선택하는 기회를 제공한다.
KJ012는 성장이 허용되는 것만큼 빠르게 발효 조건 하에서 NBS 글루코스 배지에서 연속적으로 전이되었다(도 3a; 도 4a; 도5). 성장은 제 1의 9 전이 사이에서 요구된 배양의 4일 내지 5일로 천천히 존속하였고, 그런 다음 24시간-간격에서 만들어진 전이를 허용하여 극적으로 증가하였다. 이 경우는 숙시네이트 제조에서 개선이 거의 없는 아세테이트(도 4a)에서의 증가를 수반하였다. 27 전이(60일) 후에, KOH는 추가적인 이산화탄소를 제공하기 위해 3M K2CO3와 6N KOH의 1:1 혼합물로 대체되었다(모든 NBS 미네랄 염 배지에 초기에 첨가된 100 mM). 계속적인 전이로 숙시네이트의 제조가 개선되었다. 총 40 전이는 5% 글루코스(227 mM)에서 만들어진 후, 또 다른 40 전이가 10% 글루코스(555 mM)에서 만들어졌다. 10% 글루코스에서 전이되는 동안에, 숙시네이트 수율은 글루코스의 몰 당 약 0.7 몰로 남아있었고, 상기 글루코스는 부산물(co-product)로서 락테이트, 아세테이트 및 포르메이트로 대사되었다(표 3). 이 수율은 대장균 C 및 KJ012보다 3-배 더 높았다. 클론은 분리되고 KJ017로 지정되었다. KJ017을 제조하기 위해 KJ012의 성장에서의 개선을 선택하는 것은 숙시네이트 제조(비율, 역가 및 몰 수율)에서의 개선을 공동 선택하 였다.
KJ017 에 의해 숙시네이트 제조를 증가시키는 생리적 근거
천연의 발효 경로(포스포에놀피루베이트 카복실라제; ppc)로 일반적으로 간주되는 경로를 사용하여 대장균에 의해 제조되는 숙시네이트는 무기 포스페이트를 생성함으로써 포스포에놀피루베이트의 에너지를 소비한다. 이러한 경로에 의해 생성되는 숙시네이트 당 1 ATP가 손실된다(도 1; 도 6). 다른 효소 시스템을 사용함으로써 이러한 에너지를 ATP로서 보존하는 것은 숙시네이트 제조를 증가시키기 위해 세포 성장 및 공동-선택을 증가시키는 기회를 나타낸다. 대장균에서 공지된 유전자에 기초하여, 숙시네이트 제조를 위한 3개의 다른 효소 경로가 ATP를 보존하고 이에 의하여 성장을 증가시킬 수 있도록 계획되었다(도 1; 도 6). 그러나, 이러한 다른 경로에서 모든 카복실화 단계는 유기 산과 같은 기질 상에서 성장하는 동안에 주로 글루코스 신생합성을 위해 반대 방향(탈카복실화)에서 작용하도록 여겨진다(문헌[Keseler 등., 2005; Oh 등., 2002; Kao 등., 2005; Stols 및 Donnelly, 1997; Samuelov 등., 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere 등., 2004; Goldie 및 Sanwal, 1980b; Sanwal 및 Smando, 1969b; Sanwal 1970b]). KJ017을 발현하기 위한 성장-기반의 선택은 이러한 다른 경로 중 하나 이상을 실제로 활성화하였다는 가정을 테스트하기 위해, 주요 카복실화 단계의 특정 활성을 비교하였다(표 4). 이들 중 3개는 대장균 C, KJ012 및 KJ017과 유사하거나 낮았다. 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제(pck)를 보존하는 에너지는 KJ012와 비교하여 KJ017에서 4-배 증가하였고, 이는 개선된 성장을 위한 선택이 ATP 수율을 증가시키는 것을 통해 숙 시네이트의 제조를 증가시키는 것을 공동-선택할 것이라는 가정, 숙시네이트 제조를 위해 에너지-보존 경로의 발현을 증가시키는 결과와 일치한다.
나아가, 성장-기반의 선택 및 추가적인 유전자 결실은, 성장 및 숙시네이트 제조에서 더 나은 개선을 갖는 많은 추가적인 균주를 제조하는 데에 사용되었다(도 3 및 도 4). 이들 중 하나인 KJ073에서의 효소 수준이 또한 시험되었다. 이 균주에서, 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제의 시험관 활성은 KJ017의 활성보다 8-배 더 증가되었고, 다른 카복실화 효소는 본질적으로 변하지 않았다(표 4).
pck 및 주위 영역은 KJ012 및 KJ073으로부터 클론화되었고 서열화되었다. 코딩 영역에서 변화가 발견되지 않았다. 번역 후 변형이 없다면, 효소의 촉매 성질은 변하지 않았어야 한다. 단일 돌연변이가 번역 시작 부위에 비해 pck 프로모터 영역인 -64 bp 부위에 있는 G 내지 A에서 검출되었다. 이 돌연변이는 번역 시작 부위에 비해 -139 bp 부위인 전사 시작 부위 뒤에 있었다. 대장균 C의 서열에 대해 KJ073에서 이러한 서열(A 내지 G)을 회복하는 것은 세포 성장, 발효 또는 숙시네이트 제조에 영향을 주지 않고, 이러한 돌연변이가 본질적이지 않다는 것을 나타낸다(데이터는 미도시함). RT-PCR으로 메세지 수준이 KJ073에서 증가되었다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 pck의 발현을 증가시키기 위한 근거로서 조절 돌연변이와 일치한다.
이전의 연구자들은 포스포에놀피루베이트 카복실라제(ppc) 및 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제(pck)의 동적 파라미터(kinetic parameter)가 카복실화 및 숙시네이트 제조에 중요한 영향을 줄 수 있다는 것에 주목하였다(문헌[Millard 등 ., 1996; Kim 등., 2004]). 대장균 포스포에놀피루베이트 카복실라제(ppc)를 위한 중탄산염에 대한 Km은 0.15 mM이고(문헌[Morikawa., 등 1980]), 이는 대장균 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제(pck)보다 9-배(13 mM) 더 낮다(문헌[Krebs 및 Bridger 1980]). 다복제 플라스미드에서 대장균으로부터 과발현된 pck는 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제 활성을 50-배 증가시켰다 하더라도, 숙시네이트 제조에는 영향이 없다는 것이 보고되었다(문헌[Millard 등., 1996]). 언에어로바이오스피리륨 숙시니시프로두센(Anaerobiospirillum sycciniciproducens)이 대장균 K12에서 과발현되는 경우에도 숙시네이트 제조는 증가되지 않았다(문헌[Kim 등., 2004]). 이 효소는 또한 중탄산염에 대해 높은 Km을 갖는다(30 mM; 문헌[Laivenieks 등., 1997]). 그러나, 언에어로바이오스피리륨 숙시니시프로두센 pck가 대장균 K12의 ppc 돌연변이에서 과발현되는 경우에, 숙시네이트 제조는 6.5-배 증가되었다(문헌[Kim 등., 2004]). KJ017 및 이후의 유도체에서, 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제는 기능적인 천연의 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 존재에서도 주된 카복실화 활성을 명확하게 나타낸다.
대장균 C의 효소 측정에서 나온 결과는 꽤 놀랍다. 성장하는 동안에 천연의 대장균에 의한 숙시네이트 제조에 대해 주로 카복실화 활성으로 일반적으로 간주되는 효소(포스포에놀피루베이트 카복실라제; ppc)(문헌[Unden 및 Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Keseler 등., 2005; Millard 등, 1996; Gottschalk 1985; Karp 등, 2007])는 대장균 C에 대한 시험관에서 대부분의 활성 효소는 아니다. 따라서, 대사 공학의 합리적인 디자인 및 대사 흐름의 추정을 일반적으로 기초로 한 대장균에 대해 일반적으로 받아들여지는 대사 경로는 모든 균주에서 대사를 정확히 반영할 수는 없다. 시험관의 기질-포화(substrate-saturating) 조건 하에서, 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제 활성은 대부분 활성이었다. 대장균 K12에서, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 및 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제 둘 모두에 대한 활성은 숙시네이트에 대해 주된 경로로서 역할을 하는 이전의 것과 시험관에서 동일하다고 보고되었다(140 nm min-1 mg-1 세포 단백질; 문헌[Van der Werf 등., 1997])
이전의 연구는, TCA 회로 중간체를 보충하기 위해 PEP를 더 카복실화시키기 때문에, 대장균에서 천연의 ppc 유전자의 과발현은 높은 특정의 숙시네이트 생성(문헌[Millard 등., 2000]), 높은 특정의 성장 비율 및 낮은 특정의 아세테이트 생성를 가져온다는 것을 나타내었다(문헌[Farmer 및 Liao, 1997]). 그러나, PEP가 글루코스 수송 시스템에 요구되기 때문에, 과발현된 ppc는 또한 동질 유전자형의 대조군과 비교하여 숙시네이트 수율(글루코스 당)을 상당히 증가시키기 않으면서 글루코스 섭취율을 15% 내지 40% 까지 감소시킨다(문헌[Chao 및Liao, 1993; Gokarn 등., 2000]). 숙시네이트 수율을 증가시키기 위한 천연의 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 실패로 인해, 대장균 유전자의 천연의 레퍼토리로 더 연구를 추구하기 보다는 카복실화 단계로서 락토바실루스 락티스(Lactobacillus lactis) 또는 리조비움 에틀리(Rhizobium etli)로부터 PYC(피루베이트 카복실라제)의 발현에 대한 새로운 대사 디자인(문헌[Vemuri 등., 2002ab; Gokarn 등., 2000; Lin 등., 2005abc])으로 대부분의 연구 관심이 돌려졌다.
액티노바실루스 숙시노진(Actinobacillus succinogenes)과 같은 루멘(rumen) 박테리아는, 카복실화를 위해 에너지를 보존하는 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제를 사용하여 글루코스 발효 동안에 주된 생성물로서 숙시네이트를 생성한다(문헌[Kim 등., 2004; McKinlay 등., 2005; McKinlay 및 Vieille, 2008]). 이러한 유기체에 대해 보고된 활성은 KJ017 활성의 5-배이고, KJ073의 계속되는 성장-기반의 선택(대사적으로 진화)에 의해 수득되는 활성의 절반이다. 따라서, 대사 공학(ldhA adhE ackA) 및 대사적인 진화(ATP 생성의 효율을 증가시키기 위한 성장-기반의 선택)의 조합을 사용함으로써, 본원에서 보고되는 연구는, 대장균 유전자의 천연의 레퍼토리만을 사용함으로써 액티노바실루스 숙시노진과 같은 루멘 유기체와 유사한 대장균의 숙시네이트-제조 균주의 발현을 설명한다. 대장균 포스포에놀피루베이트 카복실라제(ppc)의 과발현이 포스포에놀피루베이트 합성효소(synthase)에서 돌연변이가 없는 경우에 숙시네이트 제조에 도움이 되지 않는다는 이전의 보고(문헌[Chao 및 Liao, 1993; Kim 등., 2004; Gokarn 등, 2000; Millard 등., 1996])에도 불구하고, KJ017 및 유도체는 숙시네이트 및 말레이트 제조를 위한 주요 경로로서 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제를 사용하도록 조작되었다.
KJ032 및 KJ060 의 제조
10% (w/v) 글루코스로 성장하는 동안에, 주로 락테이트 탈수소화효소(ldhA) 및 아세테이트 키나아제(ackA) 활성을 인코딩하는 유전자의 결실에도 불구하고, 원하지 않은 부산물(아세테이트, 포르메이트 및 락테이트)이 KJ017(△ ldhA :: FRT △ adhE :: FRT △ackA::FRT)로의 발효에서 풍부하였다(표 3). 락테이트 및 아세테이트의 제조는 또한 성장-기반의 선택을 위한 기초인, 더 높은 ATP 수율을 가져올 수 있다(도 1a).
피루베이트 포르메이트리아제(pflB)를 인코딩하는 유전자는, 포르메이트 및 아세테이트의 잠재적 소스인 잉여 아세틸~CoA로서 환원제의 손실을 제거하기 위해 KJ017로부터 결실되었다. 오페론(operon)에서 상류에 있는 포르메이트 수송체(focA)가 또한 결실되었다. 예상된 바와 같이, 결실된 균주(KJ032)는 아세테이트 없이 성장하지 않았고, 이는 KJ017에서 아세틸~CoA 제조를 위한 주요 경로임이 확인되었다(도 3c). pflB의 결실은 혐기성 조건 하에서 아세테이트 영양요구성을 초래한다고 잘 공지되어 있다(문헌[Sawers 및 Bock, 1988]). KJ032에 의한 성장 및 숙시네이트 제조는 20 mM의 아세테이트를 첨가함으로써 회복되었다(도 3c, 도 4c 및 도 5). 포르메이트 및 아세테이트의 제조는 pflB(및 focA) 결실의 결과로서 실질적으로 감소되었다. 이러한 균주가 성장을 위해 아세테이트를 요구한다 하더라도, 추가적인 아세테이트가 또한 발효 동안에 생성되었다. 동일한 현상이 피루베이트 제조를 위한 대장균 K-12 생촉매의 제조 동안에 pflB-결실된 균주에 대해 이전에 보고되었다(문헌[Causey 등., 2004]). 락테이트 수준은 또한 KJ032에서 감소되었다(표 3; 도 4c). 이후의 전이로 성장 및 숙시네이트 제조가 개선되었다. 첨가된 아세테이트는 감소되었고, 접종물(inoculum) 크기는 감소되었고, 글루코스 농도는 이후의 전이 동안에 2배(10% w/v)가 되었다(도 4d). 아세테이트의 양이 5 mM으로 감소된 후에, 불안정한 집단이 나타났는데, 이는 숙시네이트를 손실시키고 말레이트의 수준을 증가시키도록 제조되었다. 추가적인 전이 후에, 아마도 또 다른 유전자의 발현이 증가되었기 때문에, 아세테이트는 생략되었고, 균주는 아세테이트에 대해 더 이상 영양요구성이 아니도록 발현되었다. 그러나, 숙시네이트 수율은 첨가된 아세테이트의 제거에 따라 감소하였고, 반면에 말레이트 및 아세테이트 수준은 증가하였다. 아세테이트의 소스 및 말레이트에서의 증가에 대한 근거는 공지되지 않았다. 적은 양의 피루베이트가 또한 제조되었다. 클론은 마지막의 전이로부터 분리되었고, KJ060(ΔldhA::FRT ΔadhE::FRT ΔackA::FRT ΔfocA-pflB::FRT)으로 지정되었다. 이 균주는 10% 글루코스를 갖는 NBS 미네랄 염 배지에서 대사된 글루코스의 몰 당 1 몰의 숙시네이트를 생성하였다.
메틸글리옥살 합성효소( mgsA )의 결실에 의한 KJ070 및 KJ071 의 제조
다양한 균주의 발효 배양액에 존재하는 적은 양의 락테이트는 메틸글리옥살 합성효소 경로에서 유래되는 것으로 추정된다(도 6; 문헌[Grabar 등. 2006]). 이는 수율의 적은 손실을 나타낸다 할지라도, 이러한 경로에 의한 락테이트의 제조는 성장 및 해당작용 둘 모두의 억제제인 메틸글리옥살의 축적을 나타낸다(문헌[Egyud 및 Szent- Gyorgyi, 1966; Grabar 등., 2006; Hopper 및 Cooper, 1971]). 메틸글리옥살 및 락테이트의 제조는 KJ070(ΔldhA::FRT ΔadhE::FRT ΔackA::FRT ΔfocA-pflB::FRT ΔmgsA)을 제조하기 위해 KJ060에서 mgsA 유전자(메틸글리옥살 합성효소)를 결실함으로써 제거되었다. 균주 KJ070은 5% (w/v) 글루코스에서 초기에 2차 배양되었다(도 4e 및 도 5). mgsA의 결실은 배지에서 피루베이트의 축적에 의해 증명되는 바와 같이 해당과정 흐름을 증가시켰다고 추정된다(표 3). 퓨마레이트 환원효소의 알로스테릭 억제제인 옥살로아세테이트의 제조를 증가시키기 때문에, 해당과정 흐름에서 이러한 증가는 또한 숙시네이트/말레이트 비율을 추가적으로 감소시킬 수 있다(문헌[Iverson 등., 2002; Sanwal, 1970c]).
전이 21에서, 글루코스는 10% (w/v)로 2배 증가되었고, 전이는 계속되었다. 이러한 높은 수준의 글루코스 및 이후의 전이는 말레이트의 생성을 더 증가시켰고, 나중의 전이에서는 숙시네이트를 초과하였다(도 4e). 10% w/v 글루코스에서 말레이트 대 숙시네이트의 증가된 생성은 또한 증가된 해당과정 흐름 및 옥살로아세테이트에 의한 퓨마레이트 환원효소의 억제와 일치한다. 전이 50에서, 대사된 글루코스의 몰 당 1.3 몰의 말레이트 및 0.71 몰의 숙시네이트가 생성되었다(표 3). 상당한 양의 아세테이트가 또한 생성되었다. 새로운 균주는 최종의 2차 배양으로부터 분리되었고, KJ071(ΔldhA::FRT Δ adhE :: FRT Δ ackA :: FRT Δ focA - pflB :: FRT Δ mgsA)로 지정되었다. 이 균주는 말레이트 생성에 유용할 수 있다.
poxB 의 결실에 의한 KJ072 및 KJ073 의 제조
아세테이트로의 글루코스의 변환이 산화환원 중간이더라도, 아세테이트에 대해 탄소의 분할된 부분은 숙시네이트 및 말레이트의 수율을 감소시킨다. 피루베이트 옥시다제(poxB)는 미세호기성 조건 하의 배양 동안에 아세테이트 및 CO2의 잠재적인 소스로 나타난다(문헌[Causey 등., 2004]). poxB가 혐기성 조건 하에서 피루베이트를 산화시키도록 작용하지 않는다 하더라도, poxB는 유전자 결실을 목표로 하였다(도 6). 예상된 바와 같이, KJ072(Δ ldhA :: FRT Δ adhE :: FRT Δ ackA :: FRT Δ focA - pflB :: FRT Δm g sA Δ poxB)를 제조하기 위한 poxB의 결실은 아세테이트 생성을 감소시키지 않았고, 이는 다른 경로가 아세테이트 생성에 수반된다는 것을 나타낸다. 그러나, poxB를 제거하는 것은 발효 생성물에서 예상치 못한 변화인 숙시네이트에서의 증가 및 말레이트에서의 감소를 가져왔다(표 3; 도 4f). 숙시네이트 제조에서의 이러한 개선에 대한 메커니즘은 공지되지 않았으나, 피루베이트 옥시다제의 다른 활성(예를 들어, 아세토인(acetoin) 생성, 탈카복실화 및 탄소결찰(carboligation))과 관련될 수 있다(문헌[Ajl 및 Werkman, 1948; Chang 및 Cronan, 2000]).
균주 KJ072는 10% (w/v) 글루코스를 갖는 더 낮은 염 배지인 AM1 배지에서 대사적인 진화의 40회 추가적인 순환의 영향을 받는다(표 3; 도 4f 및 도 5). 성장, 세포 수율 및 숙시네이트 제조에서의 개선이 이러한 전이 동안에 관찰되었다. 말레이트, 피루베이트 및 아세테이트 수준이 또한 증가하였다. 클론이 최종의 전이로부터 분리되고 KJ073(ΔldhA::FRT ΔadhE::FRT ΔackA::FRT ΔpflB::FRT ΔmgsA ΔpoxB)으로 지정되었다. 이 균주는 카복실화를 위한 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제 경로를 유지하였다(표 4). 이 균주의 시험관내 활성은 KJ012의 활성보다 45-배 높았고, KJ017보다 10-배 높았고, 이는 숙시네이트 제조 및 성장에 대한 에너지 보존의 단단한 결합에 대한 추가적인 증거를 제공하고 선택에 사용되는 기초를 더 확립하게 한다.
10% (w/v) 글루코스를 함유하는 AM1 배지에서 KJ060 및 KJ073 의 발효
도 7은 숙시네이트 제조를 위한 2개의 최상의 생촉매인 KJ060 및KJ073으로의 회분식 발효를 나타낸다. 성장이 배양의 초기 48시간 내에 완료되었다 하더라도, 숙시네이트 제조는 96시간 동안 계속되었다. 숙시네이트 제조의 1/3이 세포 성장이 없는 경우에 발생하였다. 이러한 균주는 대사된 글루코스에 근거하여 1.2 내지 1.6의 몰 수율로, 668 mM 내지 733mM의 숙시네이트 역가를 생성하였다. AM1배지에서의 수율이 NBS 미네랄 염 배지에서의 수율 보다 일반적으로 더 높다. 아세테이트, 말레이트 및 피루베이트는 원하지 않은 부산물로서 축적되었고, 숙시네이트의 잠재적인 수율을 떨어뜨렸다(표 3). 글루코스 및 CO2(잉여)로부터 숙시네이트의 이론적인 최대 수율은 하기의 식을 근거로 하여 글루코스의 몰 당 1.71 몰이다:
7 C 6 H 12 O 6 + 6 CO 2 → 12 C 4 H 6 O 4 + 6 H 2 O
그러나, 이러한 수율을 달성하는 대장균에서 직접적인 숙시네이트 경로는 없다(도 6).
숙시네이트로의 다른 기질의 변환
본 연구가 숙시네이트로의 글루코스의 변환에 주로 초점을 맞추고 있다 하더라도, 대장균은 식물 세포벽의 성분인 모든 6탄당 및 5탄당을 대사시키는 천연의 능력을 갖는다고 잘 공지되어 있다(문헌[Asghari 등., 1996; Underwood 등., 2004]). 대장균의 일부 균주는 또한 수크로스를 대사시킬 수 있다(문헌[Moniruzzaman 등., 1997]). 균주 KJ073은 혈청 튜브에서 2%의 6탄당 및 5탄당의 이용을 위해 테스트되었다. 모든 경우에서, 이러한 당은 주로 숙시네이트로 변환되었다. 균주 KJ073은 또한 글리세롤을 숙시네이트로 대사시켰다. 2% 글리세롤 로 배양하는 동안에, 143 mM 글리세롤이 이론적으로 최대량의 89%인 0.89 몰 수율을 갖는 127 mM 숙시네이트를 생성하기 위해 대사되었다.
1 mM 베타인 및 10% 글루코스를 함유하는 NBS 배지에서 말레이트 의 제조
성장-기반의 선택 동안에, 배양균은 잠재적으로 유용한 다른 생성물인 말레이트의 생성으로 변하는 것이 관찰되었다(표 3). 말레이트는 10% 글루코스를 갖는 KJ071에서 나온 가장 풍부한 생성물이었고(표 3; 도 4e), 숙시네이트의 거의 2배이었다. 이 균주는 대사된 글루코스를 근거로 하여 1.44 몰 수율을 갖는 516 mM 말레이트를 생성하였다(표 3).
결론
대장균의 발효 대사는 주목할만하게 적응될 수 있다는 것을 나타내었다. 유도체는, 천연의 발효 경로와 관련된 유전자의 많은 결실을 회피하고, 산화환원 균형을 유지하는 남아있는 효소를 통해 흐름을 증가시키고, ATP 생성의 효율을 증가시키고 성장을 증가시키도록 조작되고 진화되었다. 훨씬 더 많은 시도가 있었지만, 모든 생합성의 요구를 충족시키도록 탄소 부분의 균형을 잡는 동안에 세포는 미네랄 염 배지에서 적응할 만한 변화를 만들 수 있다. NADH 산화(락테이트 탈수소화효소, 알콜 탈수소화효소)에 대한 주된 경로 및 아세테이트 생성(아세테이트 키나아제)을 제거한 후에, 성장 및 ATP 생성은 산화환원 균형을 위해 NADH 산화 그리고 말레이트 또는 숙시네이트의 생성에 연계된 채로 남아있다(도 1b). 혐기성 성장-기반의 선택은 산화환원 균형을 보장하고, 증가된 성장의 근거인 ATP의 증가된 효율 및 증가된 비율을 선택한다. 둘 모두의 전구체가 전자 수용체로서 역할을 하기 때문에, 산화환원 균형 및 ATP 생성에 대한 이러한 선택은 최종 생성물로서 말레이트와 숙시네이트를 쉽게 구별할 수 없다. 이러한 연구 동안에, 하나의 균주가 숙시네이트 보다 말레이트를 더 생성하는 (KJ071)에서 발현되었다. 이러한 균주 및 다른 유도체는 말레이트 생성에 유용할 수 있다. 다른 균주(예를 들어, KJ073 및 KJ060)는 글루코스의 몰 당 1.2 내지 1.6 몰의 수율에서 주요 생성물로서 숙시네이트를 생성한다.
혐기성 성장 동안에 아세틸~CoA의 주요 소스인 pflB의 결실은 아세테이트에 대한 영양요구성을 요구하였다(문헌[Sawers 및 Bock, 1988]). 아마 피루베이트 탈수소화효소와 같은 다른 경로에 의해 아세틸~CoA의 생성을 증가시켰기 때문에, 이러한 요구는 대사적인 진화를 통해 제거되었다(문헌[de Graef 등., 1999]). 이러한 영양요구성을 대체하였던 아세테이트 또는 아세틸~CoA의 대사 소스는 공지되지 않았다. 대사 생성물에서의 많은 변화는 예상되지 못했다. mgsA의 결실 후에 선택 동안에 말레이트에서의 증가는 설명되지 않는다. 메틸글리옥살은 대사에서의 불균형에 대응하여 생성되는 대사 억제제이다(문헌[Grabar 등., 2006]). 메틸글리옥살 생성의 제거는 성장-관련된 장점(예를 들어, 증가된 성장율, 접종 후에 더 짧아진 지연 등)을 제공할 수 있었다. poxB 결실 후에 말레이트에서의 감소 및 더 높은 숙시네이트의 생성으로의 변화는 또한 놀라웠다. 아세테이트 수준에서의 변화는 거의 관찰되지 않았고, 이는 이러한 효소가 아세테이트의 작은 소스이거나 아세테이트 생성을 위한 다른 경로에 의해 기능적으로 대체되었다는 것을 나타낸다. poxB의 결실 후에, 숙시네이트는 주된 디카복실산으로서 다시 생성되었다. 숙시네 이트 생성을 위한 최상의 균주인 KJ060 및 KJ073으로, 말레이트 및 아세테이트는 풍부한 부산물로서 남아 있었다(표 3; 도 4d 및 4f). 이들의 제거는 수율을 증가시키는 추가적인 기회를 나타낸다.
숙시네이트 생성을 위해 발현된 모든 이전에 조작된 대장균은 보존을 위해 항생제와 함께 복합 배지 및 플라스미드를 사용하였다. 대부분은 샘플인 회분식 발효에서 숙시네이트의 낮은 역가를 달성하였고, 높은 역가를 달성하기 위해서는 더 복합적인 과정을 요구하였다(표 1). 복합 배지에서 재조합 대장균에 의해 글루코스로부터 숙시네이트 생성을 증가시키기 위해, 다양한 유전자 접근법이 보고되었다. 우리의 초기 제조에서, 성장 및 당 대사는 미네랄 염 배지에서는 매우 불완전하였으나 복합 배지(루리아 배양액)에서는 매우 강력하였다. 비타민, 아미노산 및 다른 거대분자의 전구체를 함유하는 복합 배지는 대사 공학에 의해 발생되는 대사 및 생합성에서 잠재적인 규제 문제를 감출 수 있다.
많은 다른 연구자들은 또한 이종 유전자를 사용하였고, 가스(CO2, H2, O2 또는 공기)로 분사하는 단계 및 호기와 혐기 과정의 이중 단계를 포함하는 복잡한 과정을 사용하였다. 이러한 복잡한 과정 및 영양소는 제조, 물질, 정제 및 폐기물 처리 비용을 증가시킨다고 예상될 것이다. 대조적으로, 균주 KJ060 및 KJ073은, 임의의 복합 영양소 또는 외래 유전자 없이 미네랄 염 배지를 사용하여 샘플인 회분식 발효(10% 당)에서 높은 역가의 숙시네이트(600 mM 내지 700 mM)을 생성하였다.
예 2
미생물은 하기와 같이 농업연구소 배양균 보관기관(ARS Culture Collection)에 기탁되었다:
배양균 균주 지정 기탁일
KJ073 B-50029 2007년 3월 15일
KJ091 B-50110 2008년 2월 20일
KJ098 B-50111 2008년 2월 20일
KJ104 B-50112 2008년 2월 20일
KJ110 B-50113 2008년 2월 20일
KJ119 B-50114 2008년 2월 20일
KJ122 B-50115 2008년 2월 20일
KJ134 B-50116 2008년 2월 20일
물질 및 방법
균주, 배지 및 성장 조건
대장균 C(ATCC 8739)의 새로운 유도체는 성장-기반의 선택과 결합된 유전자 결실의 독특한 조합을 사용하여 숙시네이트 제조를 위해 발현되었다. 본 연구에 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머를 표 1에서 요약한다. 균주 제조 동안에, 배양균은 변형된 루리아 베르타니(LB) 배양액(리터 당: 10g의 배지(Difco) 트립톤, 5g의 배지 효모 추출물, 5g이 염화나트륨)(밀러, 1992)에서 37℃에서 성장되었고, 항생제로 적당히 포함되었다(문헌[Jantama 등., 2008; Zhang 등., 2007]). 항생물질에 대한 내성, 플라스미드 또는 다른 외래 유전자를 인코딩하는 유전자는 숙시네이트 제조를 위해 발현되는 최종 균주에는 존재하지 않는다. 제조 후에, 균주는 성장되었고 AM1 배지에서 보존되었다(문헌[Martinez 등., 2007]). 이 배지에는 100 mM KHCO3 및 글루코스(나타낸 바와 같음)가 추가되었다. 초기 글루코스 농도가 5% (w/v) 이상인 경우에, 베타인(1 mM)이 또한 첨가되었다.
adhE , ldhA 및 focA - pflB 영역에서 FRT 표지( marker )의 결실
순차적인 유전자 결실을 만들고 adhE , ldhA 및 focA - pflB 유전자 위치로부터 FRT 표지를 제거하는 데에 사용된 방법은 이전에 설명되어 왔다(문헌[Datsenko 및 Wanner, 2000; Grabar 등., 2006; Jantama 등., 2008; Zhang 등., 2007]). 플라스미드 pLOI4151은 cat - sacB 카세트의 소스로서 사용되었고, Red 재조합효소(pKD46)는 이중-교차의 상동성이 있는 재조합 경우를 촉진하는 데에 사용되었다. 클로람페니콜 내성은 통합을 선택하는 데에 사용되었다. 수크로스로의 성장은 sacB의 손실을 선택하는 데에 사용되었다. 이러한 접근법으로, 연속적인 결실은 모든 FRT 부위를 제거하였던 KJ079의 유도체를 생성하도록 만들어졌다. 프라이머 및 플라스미드를 표 1에서 열거한다.
△ adhE 영역에서 FRT 부위를 제거하기 위해, △ adhE ::FRT 목표 영역에 대한 하이브리드 프라이머(WMadhEA/C)가 △ adhE ::FRT의 5' 및 3' 영역에 대해 약 50 bp의 상동성이 있고, 그리고 pLOI4151에서 나온 cat - sacB 유전자에 대응한 20 bp를 함유하도록 디자인되었다. 이러한 프라이머는 헥산의 주형으로서 pLOI4151을 사용하여 cat-sacB 카세트의 PCR 증폭을 위해 사용되었다. 상기 결과로 생성된 PCR 생성물은, TG200을 생성하기 위해 클로람페니콜에 대한 내성을 선택하는 이중-교차의 상동성이 있는 재조합 경우에 의해, △ adhE 영역에 있는 FRT 부위를 cat - sacB 카세트로 대체하는 데에 사용되었다.
adhE 유전자 및 주위 서열은 업/다운adhE 프라이머를 사용하여 대장균 C로부 터 증폭되었다. ychE' - adhE - ychG'를 함유하는 PCR 생성물(3.44kb)은 pCR2.1-TOPO로 클론화되고, pLOI4413을 수득하였다. 제 2 세트의 프라이머(IO-adhE업/다운)는 헥산의 주형으로서 pLOI4413으로 인사이드-아웃 생성물을 증폭하는 데에 사용되었고, 블런트-엔드(blunt-ended) 생성물을 수득하기 위해 Pfu 중합효소를 증폭하는 데에 사용되었으며, adhE 서열의 2.6 kb 내부 분절이 결실되었다. 이러한 인사이드-아웃 PCR 생성물은 키나아제-처리되었고 자가-결찰되었으며, 이는 pLOI4419를 생성하였다. pLOI4419(업/다운adhE 프라이머)로부터 증폭된 PCR 생성물은 sacB의 손실을 위한 수크로스 선택과 함께 또 다른 이중의 상동성이 있는 재조합 경우에 의해, TG200에 있는 cat - sacB 카세트를 원하는 염색체 서열로 대체하는 데에 사용되었다. 상기 결과로 생성된 균주는 TG201(△ adhE 영역으로부터 제거된 FRT를 갖는 KJ079)로 지정되었다.
△ ldhA 영역 및 △( focA - pflB ) 영역에서 FRT 부위는 adhE ::FRT 부위를 결실하는 데에 사용된 방법과 유사한 방법으로 제거되었다. △ ldHA에 있는 FRT 부위를 제거하는 데에 사용되는 추가적인 프라이머 세트(ldhAA/C 및 IO-ldhA업/다운)는 대응하는 플라스미드(pLOI4430 및 pLOI4432)와 함께 표 1에 포함되었다. 균주 TG202는 TG201에 있는 영역을 pLOI4151(WMldhAA/C 프라이머)에서 나온 PCR 생성물로 대체함으로써 생성되었다. TG202에 있는 cat - sacB 카세트는 TG203을 생성하기 위해, sacB의 손실을 위한 수크로스 선택과 함께 pLOI4432(ldhAA/C 프라이머)에서 나온 PCR 생성물로 대체되었다.
△( focA - pflB )에서 FRT 부위를 제거하는 데에 사용되는 프라이머 세트(업 focA/중간pflA 및 IO-ycaO업/IO-중간pflA다운) 및 대응하는 플라스미드(pLOI4415 및 pLOI4421)는 표 1에 포함되었다. 균주 TG204는 TG203에 있는 영역을 pLOI4151(WMldhAA/C 프라이머)에서 나온 PCR 생성물로 대체함으로써 생성되었다. TG204에 있는 cat - sacB 카세트는 KJ091을 생성하기 위해, sacB의 손실을 위한 수크로스 선택과 함께 pLOI4421(업focA/중간pflA 프라이머)에서 나온 PCR 생성물로 대체되었다. KJ091은 KJ073의 유도체이고, 모든 FRT 부위는 염색체의 △ adhE , △ldhA 및 △ focA - pflB로부터 제거되었다.
표지 없는 유전자 결실을 위해 cat - sacB 카세트를 함유하는 pLOI4162 의 제조
염색체 DNA의 순차적인 결실을 촉진하기 위해, 플라스미드 pLOI4162(도 1)는 제거가능한 cat - sacB 카세트 및 모든 해독 프레임에서 정지 코돈을 갖는 합성 DNA의 18-bp 단편을 포함하는 선택으로 제조되었다. 이러한 플라스미드는 플라스미드 pLOI2228(문헌[Martinez-Morales 등., 1999]), pLOI2511(문헌[Underwood 등., 2002]) 및 pEL04(문헌[Lee 등., 2001; Thomason 등., 2005])의 합성 서열 및 부분으로 구성된다. 헥산의 주형으로 pEL04를 사용함으로써, 인사이드-아웃 PCR은, cat 및 sacB 유전자 사이에서 원하지 않는 SmaI 및 BamHI를 제거하기 위해 JMpEL04F1/R1 프라이머로 수행된다. 증폭된 생성물은 pLOI4152를 생성하기 위해 BglⅡ(양쪽 프라이머 내임)로 침지되었고, 자가-결찰되었다. 플라스미드 pLOI4131는 pLOI2511(Klenow-처리된 NheI , ClaI)의 양립가능한 부위로 pLOI2228로부터 FRT-cat-FRT 단편(Klenow-처리된 BanI , ClaI)의 결찰에 의해 제조되었다. 플라스미드 pLOI4131는 이후에 pLOI4145를 생성하기 위해 FRT-cat-FRT 단편을 제거하는 EcoRI 로 침지되고 자가-결찰되었으며, 단일의 KasI 및 XmaI 부위를 보유하였다. 폴리링커(polylinker) 분절(SfPBXPS)은 상보적인 올리고뉴클레오티드(SfPBXPS센스 및 SfPBXPScomp)를 어닐링함으로써 준비되었다. KasI 및 XmaI로 침지한 후에, 이러한 분절은 pLOI4153을 생성하기 위해 pLOI4145의 대응 부위로 결찰되었다. pLOI4152 변형된 cat - sacB 카세트는 JMcatsacB업3/다운3 프라이머 세트를 사용한 PCR에 의해증폭되었다. BamHI 및 XhoI로 침지한 후에, 이러한 카세트는 pLOI4146을 생성하기 위해 pLOI4153의 대응 부위로 결찰되었다. 모두 6개의 해독 프레임에서 정지 코돈으로 18-bp 영역(5'GCCTAATTAATTAATCCC3') (서열번호: 1)을 발생시키기 위해, pLOI4146은 pLOI4154(미도시)를 생성하기 위해 PacI로 침지되고 자가-결찰되었으며, cat - sacB 카세트를 제거하였다. 2개의 추가적인 염기(T 및 A)는 pLOI4161을 생성하기 위해 돌연변이유발 프라이머(JM4161센스/comp) 및 선형 플라스미드 증폭을 사용하여 pLOI4154의 SfoI 및 PacI 부위 사이에 삽입되었다. 최종적으로, cat -sacB 카세트를 함유하는 pLOI4146에서 나온 PacI 침지된 단편은 pLOI4162(GenBank 등록번호 EU531506)를 생성하기 위해 pLOI4161의 PacI-침지된 부위로 결찰되었다.
tdcDE 및 aspC 에서 유전자 결실의 제조
tdcDE 유전자 및 주위 1000 bp 영역(tdcG' - tdcFED - tdcC', 5325 bp)은 플라스미드 pLOI4515를 생성하기 위해 tdcDE업/다운 프라이머를 사용하여 증폭되었고 pCR2.1-TOPO 벡터로 클론화되었다. 이러한 플라스미드 DNA의 1000-배 희석된 표본은 tdcDEF7/R7 프라이머(tdcDE 유전자 내부 및 외부로 향하는 프라이머 둘 모두)를 사용하여 인사이드-아웃 증폭을 위한 헥산의 주형으로서 역할을 한다. 레플리콘을 함유하는 상기 결과로 생성된 6861 bp 단편은 pLOI4516을 생성하기 위해 pLOI4162(JMcatsacB업3/다운3 프라이머)로부터 증폭된, SmaI / SfoI-침지된 cat - sacB 카세트에 결찰되었다. 이 6861 bp 단편은 또한 tcdD 및 tdcE의 결실을 함유하는 제 2의 플라스미드 pLOI4517(키나아제 처리됨, 자가-결찰)을 제조하는 데에 사용되었다. pLOI4516 및 pLOI4517(tdcDE업/다운 프라이머)로부터 증폭된 PCR 단편은 KJ091에서 tdcDE 영역을 대체하는 데에 사용되었다. 상기 결과로 생성된 클론은 암피실린 및 클로람페니콜 내성의 손실에 대해 테스트되었고 KJ098로 지정되었다.
aspC 유전자는 tdcDE 유전자를 결실하는 데에 사용된 방법과 유사한 방법으로 KJ104로부터 결실되었다. aspC 결실을 제조하는 데에 사용된 추가적인 프라이머 세트(aspC업/다운 및 aspC1/2)는 대응되는 플라스미드(pLOI4280, pLOI4281 및 pLOI4282)와 함께 표 1에 포함된다. 상기 결과로 생성된 균주는 KJ110으로 지정되었다. KJ098 또는 KJ110 둘 모두는 각각의 결실된 영역(tdcDE 및 aspC) 내에 임의의 간섭 서열을 함유하지 않는다.
ackA 영역에서 FRT 부위의 제거 및 citF , sfcA 및 pta - ackA 유전자 결실의 제조
KJ073의 ackA 영역에서 FRT 부위를 제거하기 위해, 원하는 돌연변이의 서열을 함유하는 플라스미드는, 대장균 C 게놈의 DNA가 ackA 유전자의 약 200 bp 상류 및 하류를 묶는 JMackAF1/R1 프라이머와 함께 ackA의 PCR 증폭을 위한 헥산의 주형으로서 사용되는 것과 같이 제조되었다. 선형의 생성물은 pLOI4158을 생성하기 위해 pCR2.1-TOPO(캐나다, 칼스배드, 인비트로젠)로 클론화되었다. 이때, 플라스미 드 pLOI4158은, ackA의 808-bp 내부 분절이 결여된 블런트-엔드 생성물을 수득하기 위해 JMackA업1/다운1 프라이머 및 pfu 중합효소와 함께 인사이드-아웃 PCR을 위한 헥산의 주형으로서 사용되었다. PacI-측면의 cat - sacB 카세트(pLOI4162로부터 SmaI/SfoI 단편)는 pLOI4159를 생성하기 위해 블런트 PCR 생성물로 결찰되었다. 플라스미드 pLOI4159는 PCR 증폭을 위한 헥산의 주형(JMackAF1/R1 프라이머)으로서 역할을 하였다. 이러한 PCR 생성물은, 클로람페니콜 내성을 위한 선택과 함께 이중-교차의 상동성이 있는 재조합에 의해 KJ073의 ackA 영역에서 FRT 부위를 대체하는 데에 사용되었다. 상기 결과로 생성된 클론은 KJ076으로 지정되었다.
플라스미드 pLOI4159는 또한 pLOI4160을 생성하기 위해 cat - sacB 카세트를 제거하는 PacI로 침지되고 자가-결찰되었으며, 18-bp 번역 정지 서열을 보유하였다. 플라스미드 pLOI4160은 PCR 헥산의 주형(JMackAF1/R1 프라이머)으로서 역할을 한다. 이러한 증폭된 단편은 sacB의 손실을 위한 선택과 함께 이중-교차의 상동성이 있는 재조합에 의해 KJ076에 있는 cat - sacB 카세트를 대체하는 데에 사용되었다. 증가된 온도에서의 성장에 의한 pKD46의 제거 후에, 상기 결과로 생성된 균주는 KJ079로 지정되었다. 이 균주에서, 결실된 영역은 18-bp 번역 정지 서열에 의해 대체되었다.
ackA 영역으로부터 FRT 부위를 제거하는 데에 사용된 방법은, citF , sfcA 및 pta-ackA의 순차적인 결실을 만들고, 결실된 영역을 18-bp 번역 정지 서열로 대체하는 데에 사용되었다. citF 결실을 제조하는 데에 사용된 추가적인 프라이머 세트(citF업/다운 및 citF2/3)는 대응하는 플라스미드(pLOI4629, pLOI4630 및 pLOI4631)와 함께 표 1에 포함된다. 상기 결과로 생성된 균주는 KJ104로 지정되었다.
sifA 유전자는 각각 KJ119 및 KJ122로 지정된 균주를 생성하는 균주 KJ104 및 KJ110으로부터 결실되었다. sfcA 결실을 제조하는 데에 사용된 추가적인 프라이머 세트(sfcA업/다운 및 sfcA1/2)는 대응하는 플라스미드(pLOI4283, pLOI4284 및 pLOI4285)와 함께 표 1에 포함된다.
ackA - pta 오페론(합성 번역 정지 서열을 포함함)은 균주 KJ134를 생성하기 위해 KJ122로부터 결실되었다. 이러한 결실을 제조하는 데에 사용된 추가적인 프라이머 세트(ackA업/pta다운 및 ackA2/pta2)는 대응하는 플라스미드(pLOI4710, pLOI4711 및 pLOI4712)와 함께 표 1에 포함된다. 균주 KJ134는 임의의 FRT 부위 또는 외래 유전자를 함유하지 않는다.
발효
종균(seed) 미생물 및 발효는 10% (w/v) 글루코스(555 mM), 100 mM KHCO3 및 1 mM 베타인 HCl을 함유하는 AM1 미네랄 염 배지(문헌[Martinez 등., 2007)에서 37℃(100 rpm)에서 배양되었다. pH를 유지하고 CO2를 공급하기 위해, 3 M K2CO3와 6N KOH의 혼합물을 첨가하였다. 염기 조성(1:1, 4:1, 6:1의 혼합물)에서의 차이는 발효에 거의 영향이 없었다. 발효는 350 ml의 작동 부피를 갖는 작은 용기에서 수행되었다. 발효는 달리 지적하지 않는 한 0.01(3.3 mg CDW l-1)의 초기 OD550에서 접종되었다. 발효 용기는 샘플 제거를 위한 배출구 및 배기구로서 제공되는 16-게이 지 바늘을 제외하고는 봉인되었다. 무산소생활은 성장하는 동안에 빠르게 달성되었다. 첨가된 중탄산염은 대기의 CO2를 확보하도록 제공되었다.
분석
세포 질량을 Bausch & Lomb Spectronic 70 분광광도계를 사용하여 550 nm(OD 1.0 = 333 mg의 세포 건조 중량 l-1)에서 광학 밀도로부터 추정하였다. 유기 산 및 당은 고성능 액체 크로마토그래피를 사용함으로써 측정되었다(문헌[Grabar 등., 2006]).
결과 및 논의
대장균 C 야생형에서 중심부 혐기성 발효 유전자는 PCR 생성물 및 제거가능한 항생물질 표지로 Datsenko & Wanner(2000)의 방법(FRT 인식 부위 및 FLP 재조합효소를 사용함)에 의해 순차적으로 결실되었다. 대사적인 진화(ATP 생성의 효율을 증가시키기 위한 성장-기반의 선택)와 조합한 이러한 제조는, 성장 및 숙시네이트 생성을 증가시키는 에너지-보존형 포스포에닐피루베이트 카복시키나아제(pck)를 보충한 돌연변이 균주를 선택하는 데에 사용되었다(도 9). 상기 결과로 생성된 균주인 KJ073은 대사된 글루코스의 몰 당 1.2 몰의 숙시네이트를 생성하였고(문헌[Jantama 등., 2008]), 루멘 박테리움, 액티노바실루스 숙시노진(문헌[van der Werf 등., 1997]) 및 만헤이미아 숙시니시프로두센스(문헌[Song 등., 2007])와 아주 유사한 숙시네이트 경로를 사용한다. 그러나, 이러한 유전자 결실을 제조하는 데에 사용되는 방법은 각각의 결실된 유전자(ackA , ldhA , adhE , ackA , focA - pflB) 의 영역에서 단일의 82- 내지 85-nt 유전자 흉터를 남겼다. 이러한 FRT 부위는 항생물질 유전자의 제거 동안에 FLP 재조합효소(문헌[Storici 등., 1999])를 위한 인식 부위로서 역할을 하였다. 이러한 모든 외래의 서열은 KJ073으로부터 순차적으로 제거되었고, 이전에 설명된 방법(문헌[Grabar 등., 2006; Zhang 등., 2007; Jantama 등., 2008])을 사용하여 원하는 유전자 결실만을 갖는 천연의 DNA로 대체되었다. 상기 결과로 생성된 균주인 KJ091은 ackA , ldhA , adhE , focA - pflB , ackA , mgsA 및 poxB에서 특정의 결실을 함유하고, 모든 FRT 부위가 없다. 이 균주에는 ackA 내에 있는 18-bp 번역 정지 서열을 제외하고 모든 외래 DNA 및 합성 DNA가 없다. 균주 KJ091에 의한 숙시네이트 생성은 KJ073에 의한 생성과 동일하다(표 7). 이 균주는 숙시네이트 생성에서 추가적인 개선을 위해 모체로서 사용되었다.
숙시네이트 생성 동안에 tdcD 및 tdcE 의 결실에 의한 아세테이트의 감소
대장균에 의한 글루코스의 혐기성 발효 동안에, 피루베이트 포르메이트리아제(pflB)는 아세틸~P의 전구체인, 아세틸~CoA의 주된 소스로서 역할을 하고, 아세테이트 키나아제(ackA)는 아세틸~P로부터 아세테이트 생성을 위한 주된 경로로서 역할을 한다(문헌[Karp 등., 2007; Kessler & Knappe, 1996]). 이들 균주가 ackA 및 pflB 둘 모두에서 결실을 함유하고 있기 때문에, 균주 KJ073 및 KJ091에서 발효 생성물로서 아세테이트의 풍부함은 놀랄만하였다(도 9). 발효의 마지막에 남아있는 아세테이트는 개선된 숙시네이트 수율을 위해 대사를 추가적으로 새로운 방향으로 돌리기 위한 잠재적인 기회를 나타낸다.
아세테이트 키나아제(및 프로피오네이트 키나아제) 활성과 관련된 효소는 tdcD에 의해 인코딩되지만, 일반적으로 트레오닌의 감성(degradation)만을 위해 생성된다(문헌[Hesslinger 등., 1998; Reed 등., 2003]). 선택 동안에 발생하는 돌연변이가 도 10에 도시된 바와 같이 tdcD의 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 10% (w/v) 글루코스로 혐기성 성장 동안에, tdcD의 발현은 ackA를 기능적으로 대체할 수 있고, 이는 아세틸~P로부터 아세테이트의 생성을 증가시킨다. 동일한 오페론에서 인접한 tdcE 유전자는 pflB와 유사하고, 트레오닌 감성 동안에 공동-발현되는 피루베이트(및 α-케토부티레이트) 포르메이트리아제 활성을 인코딩한다(문헌[Hesslinger 등., 1998]). 10% (w/v) 글루코스로 혐기성 성장 동안에 이러한 유전자의 증가된 발현은 아세틸~P의 직접적인 전구체인, 아세틸~CoA의 생성을 증가시키고, 포르메이트로서 환원제를 소비할 수 있다는 것이 가능하다(도 10). tdcD 및 tdcE(인접함) 둘 모두는 KJ098을 생성하기 위해 KJ091로부터 동시에 결실되었다. 이러한 2개의 유전자의 결실은 아세테이트 생성을 절반으로 감소시켰고, KJ091과 비교하여 KJ098에서 10% 만큼 숙시네이트 수율을 증가시켰으며, 이는 숙시네이트로부터 탄소 흐름을 전환하는 데에서 이러한 예상치 못한 경로의 중요성을 확립하였다. 놀랍게도, KJ091에 의한 말레이트의 생성은 KJ098에서 새로운 결실의 결과로서 제거되었다. KJ098에 의해 생성되는 피루베이트의 수준은, 또한 피루베이트 대사, 피루베이트 포르메이트리아제 활성(tdcD) 및 아세테이트 키나아제 활성(tdcE)을 위한 2개의 다른 경로의 제거에 대해 증가하도록 예상되는 중간체에서 40% 만큼 감소하였다. 말레이트의 제거에 관련되는 메커니즘(숙시네이트 정제 동안에 문제가 되는 오염물질), 피루베이트에서의 감소 그리고 tdcD 및 tdcE의 동시에 발생하 는 결실로 인한 숙시네이트에서의 증가는 공지되지 않았다.
숙시네이트 생성 동안에 아세테이트 수율에 대한 시트레이트 리아제 ( citDEF ) 결실의 영향
KJ098이 KJ091을 넘어 상당한 개선을 나타낸다 할지라도, 아세테이트 수준에서의 추가적인 감소 및 숙시네이트 수율에서의 추가적인 증가는 가능할 수 있다. 혐기성 조건 하에서, 옥살로아세테이트는 환원된 생성물(말레이트) 및 산화된 중간체(시트레이트)로 분할된다(도 9). 시트레이트는, 다른 대사 기능을 위한 세포내 OAA 풀(pool)을 재순환시키기 위해 시트레이트 리아제(citDEF)에 의해 옥살로아세테이트 및 아세테이트로 다시 변환될 수 있다(문헌[Nilekani 등., 1983]). 상당한 양의 시트레이트 리아제의 발현은 시트레이트 상에서의 성장과 관련된다(문헌[Lutgens 및 Gottschalk, 1980; Kulla 및 Gottschalk, 1977]). 시트레이트 리아제는 3개의 다른 폴리펩티드 사슬로 구성되는 다중-효소 복합체이다. α 또는 큰 소단위체는 제 1의 단계를 촉진하는 시트레이트-ACP 전이효소이다. β 또는 중간의 소단위체는 제 2의 단계를 촉진하는 시트릴-ACP 리아제이다. γ 또는 작은 소단위체는 아크릴-운반체로서 작용하고, 또한 보결분자단(prosthetic group) 성분을 운반한다. 3개의 모든 소단위체는 반응이 발생하기 위해 요구된다(문헌[Quentmeier 등., 1987]). 하나 이상의 이러한 소단위체를 코딩하는 유전자의 결실은, 숙시네이트의 생성 동안에 시트레이트 리아제의 활성을 제거할 것이고 아세테이트의 수준을 더 감소시킬 수 있다. citF 유전자는 KJ104를 생성하기 위해 KJ098로부터 결실되었다. 그러나, 이 결실은 아세테이트 생성 또는 다른 숙시네이 트 수율에 영향을 주지 않았다(표 7). citF의 결실이 아세테이트에서의 감소를 초래하지 않았기 때문에, 이 중간체는 다른 경로로부터 발생한다고 추정된다. 알려지지 않은 이유 때문에, citF의 결실은 KJ104의 성장에 불리한 영향을 주었고(세포 수율이 22% 만큼 감소함), 발효의 마지막에서 KJ098과 비교하여 거의 50% 만큼 피루베이트의 수준을 증가시켰다. 그러나, KJ104의 숙시네이트 수율, 역가, 평균 생산성 및 아세테이트 수준은 KJ098과 비교할 만하다(표 7).
숙시네이트 수율에서 aspC 및 sfcA 결실의 영향
아스파르테이트 아미노기전이효소(aspC)는 아미노기전이반응(transamination)에 의해 아스파르테이트, 페닐알라닌(phenylalanine) 및 다른 화합물의 합성을 촉진하는 다중기능성 효소이다. 반응에서, L-아스파르테이트는, L-글루타메이트와 함께 아미노기전이반응에 의해, PEP 카복실화에서 나온 중간체인 옥살로아세테이트로부터 합성된다. 아스파르테이트는 단백질로 구성되고, 몇몇 다른 생합성 경로에 관여한다. 약 27%의 세포 질소가 아스파르테이트를 통해 흐른다고 추정되었다(문헌[Reitzer, 2004]). 아스파르테이트 생합성 및 숙시네이트 생성은 옥살로아세테이트의 일반적인 세포내 풀을 공유한다. aspC의 결실은 숙시네이트 생성을 증가시킬 수 있으나, 또한 AM1과 같은 최소한의 염 배지에서 혐기성 성장을 방지하는 영양요구성을 발생시킬 수 있다.
이 아스파르테이트 아미노기전이효소(aspC)는 KJ110을 생성하기 위해 KJ104로부터 결실되었다. 예상외로, aspC의 결실은 KJ104와 비교할 때 KJ110에서 숙시네이트 수율 또는 세포 수율에 영향을 주지 않았다(표 7). 따라서, 아스파타 제(aspartase)는 본 균주에서 숙시네이트 생성으로부터 상당한 수준의 옥살로아세테이트를 전환하지 못한다. 다른 효소가, 이전에 아스파르테이트 아미노기전이효소에 의해 촉진되었던 생합성 필요를 대체하도록 이용될 수 있다.
KJ104 및 숙시네이트 생성을 위해 조작된 대장균의 다른 균주에서 발효의 마지막에 상당한 양의 피루베이트가 존재한다(표 7). 이러한 피루베이트는 원하지 않은 생성물 및 숙시네이트 수율을 증가시키는 추가적인 기회를 나타낸다. 발효 배양액에서 이러한 높은 수준의 피루베이트는, 도 10에 도시된 바와 같이 말릭 효소(sfcA)에 의해 피루베이트에 대한 말레이트의 탈카복실화를 초래할 수 있다. 이 효소는 글루코스의 혐기성 분해대사 동안에 보다는 글루코스 신생합성(문헌[Unden 및 Kleefeld, 2004; Stols 및 Donnelly, 1997; Oh 등., 2002]) 동안에 주로 작용한다고 여겨진다. 말레이트를 형성하는 피루베이트의 환원성 카복실화가 열역학적으로 선호된다 하더라도, 이러한 효소의 동적 파라미터는 생리적인 조건 하에서 탈수소화 및 탈카복실화를 선호한다(문헌[Stols 및 Donnelly, 1997]). 피루베이트를 카복실화하는 이러한 효소의 과발현은, 대장균의 숙시네이트 생성을 위한 균주를 제조하는 근거로서 이전에 사용되었다(문헌[Stols 및 Donnelly, 1997]).
말릭 효소(sfcA)가 KJ104(및 관련된 균주)에서 카복실화하고 숙시네이트 생성에 기여한다면, 이 유전자의 결실은 숙시네이트 수율을 감소시키고 피루베이트와 같은 다른 생성물의 수준을 증가시키도록 기대될 것이다. 다르게는, 말릭 효소(sfcA)가 KJ104에서 탈카복실화하고 피루베이트에 대해 말레이트를 전환시킨다면, 이러한 효소를 코딩하는 유전자의 결실은 숙시네이트 수율을 증가시키고 피루 베이트의 수준을 감소시키도록 기대될 것이다. 예상외로, KJ119를 생성하기 위한 KJ104로부터 sfcA 유전자의 결실은 KJ104와 비교하여 숙시네이트 생성, 성장, 피루베이트 수준 등(표 7)에 측정할 수 있을 정도의 영향을 주지 못하였다. 이러한 결과는, 말릭 효소(sfcA)가 KJ104 및 관련된 균주에서 숙시네이트 생성에 중요하지 않다는 것을 명백히 증명하였다. 이 결과는, 말릭 효소의 증가된 생성이 숙시네이트 생성을 위한 주된 경로로서 사용되었던 Stols 등(1997)에 의해 발현된 숙시네이트-생성 균주와 확실히 대조된다.
KJ104에서 sfcA 결실 또는 aspC 결실 중 하나로부터 어떠한 상당한 이익도 관찰되지 않는다 하더라도, 연구는 조합된 둘 모두의 유전자를 결실시킨 경우의 영향을 테스트하기 위해 수행되었다. 이는 KJ122를 생성하기 위해 KJ110에서 sfcA 유전자를 결실시킴으로써 수행되고, 어떠한 이익도 없다고 예상되었다. 그러나, sfcA 및 aspC 둘 모두(균주 KJ122)의 조합된 결실은, 모체 균주인 KJ110 및 관련된 균주(KJ104 및 KJ119)와 비교하여, 아세테이트에서의 적은 감소와 함께 숙시네이트 수율 및 역가에서의 예상치 못한 증가(표 7)를 초래하였다. KJ122에서 조합된 결실(sfcA 및 aspC)은, KJ104와 비교할 때, 숙시네이트 수율, 숙시네이트 역가 및 평균 생산성이 각각 18%, 24% 및 24% 정도의 상당한 증가를 초래하였다. 메커니즘이 공지되지 않았다 하더라도, 단일 돌연변이는 효과적이지 못했는데, 이는 단일 돌연변이가 임의의 잠재적인 이익을 줄이기는 했지만 남아있는 활성, 말릭 효소 또는 아스파르테이트 아미노기전이효소(도 10)를 통해 흐름을 증가시킴으로써 부분적으로 상보되었기 때문이다. 숙시네이트 수율 및 역가에서의 증가는, 더 많은 부분이 숙시네이트로 진행되도록 허용하는 옥살로아세테이트의 이용가능성에서 증가로 인한 것으로 추정된다. 말레이트 수준은 또한 극히 낮게 유지되었다.
균주 KJ122(표 7)는 이론적인 최대 수율(글루코스의 몰 당 1.71 몰)의 88%인 글루코스의 몰 당 1.5 몰의 숙시네이트를 생성하였다. 이렇게 높은 수준의 숙시네이트를 생성하고 말레이트를 완전히 감소시키기 위해, 추가적인 환원제가 필요하였다. 추가적인 환원제의 소스가 공지되지 않았다 하더라도, 이러한 결과는 피루베이트 탈수소화효소를 통한 피루베이트 흐름에서의 증가와 일치한다. 이 효소는 주로 호기성 대사 동안에 작용하도록 여겨지나(문헌[Guest 등., 1989]), 발효 동안에 낮은 수준에서 작용한다고 보고되었다(문헌[de Graef 등., 1999]).
pta 의 결실에 의한 피루베이트 및 아세테이트에서의 감소
KJ122는 우수한 숙시네이트 수율(글루코스의 몰 당 1.5 몰)에 더하여 적은 양의 아세테이트 및 피루베이트를 생성하였다. 숙시네이트에 대한 이론적인 최대 수율은 글루코스의 몰 당 1.71 몰이고, 이러한 3-탄소 중간체는 수율을 더 증가시키는 기회를 나타낸다. 피루베이트는 대사 과잉으로서 해당과정으로부터 축적된다고 추정되고, 아세테이트 축적과 관련될 수도 있다. 아세틸~CoA는 많은 효소의 알로스테릭 조절물질이다. 아세테이트 및 아세테이트 키나아제 활성의 소스는 공지되지 않았는데, 이는 아세테이트 키나아제(tdcD 및 ackA)에 대한 2개의 주요 활성을 인코딩하는 유전자가 결실되었기 때문이다(도 9 및 도 10). 아세테이트가 포스포아세틸기전이효소(phosphotransacetylase)의 생성물인 아세틸~P로부터 제조된다고 가정하면, pta 유전자를 비활성화시키기 위해 추가적인 결실이 KJ122에서 만들 어졌다. 상기 결과로 생성된 균주인 KJ134는 거의 이론적인 수준의 숙시네이트를 생성하였다(표 7). 이 균주에서, 피루베이트 및 아세테이트 수준은 실질적으로 감소되었다. 부피 생산성은 또한 17% 만큼 감소되었다. 균주 KJ134로 숙시네이트의 수율은, 복합의 발효 과정, 배지 또는 성장 조건에 상관없이 모든 다른 균주와 동일하거나 더 우수하였다.
미생물 생촉매a에 의한 숙시네이트 생성의 비교

유기체
배지/조건		 숙시네이트 역가
(mM)b 		숙시네이트 수율
(몰/몰)
참고
대장균
KJ060(ldhA adhE ackA focA pflB)		 10 g/l NaHCO3를 갖는 100 g/l 글루코스 AM1, 간단한 회분식 발효, 120 시간 배양, 6M KOH+3M K2CO3의 1:1 혼합물로 pH를 유지함 733
[0.90]		 1.41 본
명세서
대장균
KJ073(ldhA adhE ackA focA pflB mgsA poxB)		 10 g/l NaHCO3를 갖는 100 g/l 글루코스 AM1, 간단한 회분식 발효, 96 시간 배양, 6M KOH+3M K2CO3의 1:1 혼합물로 pH를 유지함 668
[0.82]		 1.20 본
명세서
대장균
KJ060(ldhA adhE ackA focA pflB) 높은 접종량
(200 mg CDW 1-1) 		10 g/l NaHCO3를 갖는 100 g/l 글루코스 AM1, 간단한 회분식 발효, 120 시간 배양, 6M KOH+3M K2CO3의 1:1 혼합물로 pH를 유지함 622
[0.61]		 1.61 본
명세서
액티노바실루스
숙시노진 FZ53		 15 g/l CSL 및 5 g/l YE로 보충된 130 g/l 글루코스, 80 g/l MgCO3, 혐기성 회분식 발효, 78 시간 배양 898
[1.36]		 1.25 Guettler 등., 1996a
대장균
AFP111(pflAB, ldhA, ptsG)
리조비움 에틀리 pyc 과발현됨		 20 g/l 트립톤, 10 g/l YE 및 40 g/l MgCO3로 보충된 배지에 있는 40 g/l 글루코스(총 90g의 글루코스), 이중 상-유가(dual phase-fed) 회분식 발효, 76 시간 배양 841
[1.31]		 1.68 Vemuri 등., 2002ab
언에어로바이오스피리륨
숙시니시프로두센스 ATCC 53488		 펩톤/YE에 근거한 배지에 있는 120 g/l 글루코스, CO2를 분사하는 통합된 멤브레인-생물반응기-전기투석, 150 시간 배양 703
[0.55]		 1.35 Meynial-Salles 등., 2007
액티노바실루스
숙시노진 13OZ		 15 g/l CSL 및 YE로 보충된 100 g/l 글루코스, 80 g/l MgCO3, 혐기성 회분식 발효, CO2를 분사함, 39 시간 배양 678
[2.05]		 1.37 Guettler 등., 1996b
대장균
HL27659k/pKK313
(iclR sdhAB ackA-pta poxB, pstG) 수수 블가레 pepc(Sorghum vulgare pepc) 과발현됨 		20 g/l 트립톤, 32 g/l YE 및 2 g/l NaHCO3로 보충된 배지에 있는 106 g/l 글루코스, 완전한 호기성 조건 하에서 유가 회분식 발효, 59 시간 배양 499
[1.00]		 0.85 Lin 등., 2005d
언에어로바이오스피리륨
숙시니시프로두센스 ATCC 53488		 50 g/l 글루코스 및 10 g/l CSL, CO2를 분사함 및 300 mM Na2CO3, 회분식 발효, 24 시간 배양 426
[2.09]		 1.37 Glassner 및 Datta, 1992
만헤이미아
숙시니시프로두센스(ldhA pflB pta-ackA)		 MMH3에 있는 63 g/L 글루코스(효모 추출에 근거한 배지), 유가 회분식 발효, 0.25 vol/vol/분 CO2를 분사함, 30 시간 배양 444
[1.75]		 1.16 Lee 등.,
2006
박테리아 분리주
13OZ
ATCC 55618		 1% CSL, 0.6% YE 및 10 N NaOH로 중화된 2 g/l MgCO3로 보충된 50 g/l 글루코스, 0.3 기압의 CO2, 29.5 시간 배양 388
[1.55]		 1.40 Guettler 등., 1998
대장균 SBS550MG
(ldhA adhE iclR ackA-pta), L 락티스 pyc 바실루스 서브틸리스 citZ		 1 g/l NaHCO3로 보충된 20 g/l 글루코스(총 100 g 글루코스) LB, 200 mg/l 암피실린 및 1 mM IPTG. 1L/분 STP 공간부분(headspace)에서 100% CO2, 반복된 유가 회분식 발효, 95 시간 배양 339
[0.42]		 1.61c Sanchez 등., 2005a; Cox 등., 2006
대장균 AFP184
(pflB ldhA pts)		 15 g/l CSL로 보충된 102 g/l 글루코스, 이중 상 호기성 성장 및 혐기성 생성, 공기 분사 후 CO2 분사함, 32 시간 배양 339
[1.27]		 0.72c Anderson 등., 2007
액티노바실루스
숙시노진
ATCC 55618		 밀가루의 가수분해물 및 5 g/l YE를 갖는 70 g/l 글루코스, 4% 접종물과 함께 혐기성 회분식 발효, 65 시간 배양 302
[0.55]		 1.18 Du 등., 2007
언에어로바이오스피리륨
숙시니시프로두센스 ATCC 53488		 50 g/l 글루코스, 2% CSL 및 25 ppm 트립토판, 5.5 M NaCO3로 중화됨, 0.3 기압인 부분 압력의 CO2로 포화된 배지, 29.5 시간 배양 289
[1.16]		 1.04 Guettler 등., 1998
숙시니비브리오
덱스트리노솔벤스
ATCC 19716		 각각 15 g/l인 CSL 및 YE, 100 g/l 글루코스 및 80 g/l MgCO3, 회분식 발효, 36 시간 226
[0.74]		 NR Guettler 등., 1998
코리네박테리움
글루타니쿰(glutanicum) R		 400 mM NaHCO3를 갖는 정의된 미네랄 염 배지에 있는 40 g/l 글루코스(총 121 g 글루코스), 유가 회분식 발효, 6시간 배양 195
[3.83]		 0.29 Okino 등., 2005
프레보텔라
루미노콜라(Prevotella ruminocola)
ATCC 19188		 각각 15 g/l인 CSL 및 YE, 100 g/l 글루코스 및 80 g/l MgCO3, 회분식 발효, 36 시간 160
[0.52]		 NR Guettler 등., 1998
대장균 SBS550MG
(ldhA adhE iclR ackA-pta), L 락티스 pyc 바실루스 서브틸리스 citZ		 1 g/l NaHCO3로 보충된 20 g/l 글루코스 LB, 200 mg/l 암피실린 및 1 mM IPTG. 1L/분 STP 공간부분에서 100% CO2, 회분식 발효, 24 시간 배양 162.6
[0.80]		 1.61c Sanchez 등., 2005a; Cox 등., 2006
만헤이미아
숙시니시프로두센스
MBEL55E
KCTC 0769BP		 119 mM NaHCO3로 보충된 MH4(YE에 근거한 배지)에 있는 18 g/L 글루코스, 101.3 kPa 기체인 CO2 부분 압력(100% CO2)를 갖는 연속적인-셀-재순환 멤브레인 반응기, 6시간 배양 144
[2.83]		 1.44 Song 등., 2007
대장균 SBS110MG
(ldhA adhE),
락토코커스 락티스 pyc		 1.5 g/l NaHCO3 및 0.5g MgCO3로 보충된 20 g/l 글루코스 LB, 200 mg/l 암피실린 및 1 mM IPTG. 1L/분 STP 공간부분에서 100% CO2를 갖는 이중 상, 168 시간 배양 130
[0.09]		 1.24c Sanchez 등., 2005a; Sanchez 등., 2006
대장균 NZN111
(W1458 pflB ldhA),
대장균 sfcA
과발현됨		 0.5g MgCO3로 보충된 20 g/l 글루코스 LB, 1.5 g/l NaOAc, 0.1 g/l 암피실린 및 10 μM IPTG. 44 시간 배양, 봉인된 혈청 튜브 108
[0.22]		 0.98c Stols 등., 1997
대장균 JCL1208,
대장균 ppc
과발현됨		 0.15 g MgCO3로 보충된 11 g/l 글루코스 LB, 0.1 g/l 카베니실린 및 0.1 mM IPTG, 44시간 배양, 1기압 공간부분에서 무산소 CO2를 충전함, 18 시간 배양 91
[0.60]		 0.44c Millard 등., 1996
대장균 GJT -
Sorghum pepC		 27.78 g/l MgCO3로 보충된 40 g/l 글루코스 LB, 봉인된 밀폐형 플라스크에서 간단한 회분식 발효 80
[데이터 없음]		 0.42c Lin 등., 2005c
대장균 HL51276k
(iclR icd sdhAB ackA-pta poxB, pstG), Sorghum 종.
pepC S8D 돌연변이		 2 g/l NaHCO3로 보충된 10.8 g/l 글루코스 LB, 50 mg/l 카나마이신, 1 mM IPTG, 혐기성 회분식 반응기, 50 시간 배양 68
[0.16]		 1.09c Lin 등., 2005b
대장균 SBS880MG
(ldhA adhE △fdhF),
L 락티스 pyc		 1.5 g/l NaHCO3 및 0.5g MgCO3로 보충된 20 g/l 글루코스 LB, 200 mg/l 암피실린 및 1 mM IPTG. 100% CO2 공간부분을 갖는 이중 상, 168 시간 배양 60
[0.04]		 0.94c Sanchez 등., 2005b
a 첨자 : CSL, 옥수수 침출액; YE, 효모 추출액; NR, 보고되지 않음.
b 평균 부피 생산성은 숙시네이트의 역가 아래에서 괄호[g l-1 h-1]로 나타난다.
c 몰 수율은 호기성 및 혐기성 조건 둘 모두에 대해 대사된 당에서 나온 숙시네이트의 생성에 근거하여 계산되었다. 생물자원(biomass)은 호기성 성장 동안에 주로 발생되었다. 숙시네이트는 CO2, H2 또는 둘 모두의 혼합물로 혐기성 배양 동안에 주로 생성되었다.
본 연구에 사용된 대장균 균주, 플라스미드 및 프라이머
대장균 균주
관련 특성 소스
균주 C 야생형(ATCC 8739) ATCC
KJ012 균주 C, △ldhA::FRT △adhE::FRT △ackA::FRT 본 연구
KJ017 KJ012, 10% 글루코스로부터 선택되는 개선된 균주, NBS 본 연구
KJ032 KJ017, △ldhA::FRT △adhE::FRT △ackA::FRT △(focA-pflB)::FRT 본 연구
KJ060 KJ032, 초기 아세테이트 없이 10% 글루코스로부터 선택되는 개선된 균주, NBS 본 연구
KJ070 KJ060, △mgsA 본 연구
KJ071 KJ070, 10% 글루코스로부터 선택되는 개선된 균주, NBS 본 연구
KJ072 KJ071, △poxB 본 연구
KJ073 KJ072, 10% 글루코스로부터 선택되는 개선된 균주, AM1 본 연구
SZ204 △(focA-pflB)::FRT-kan-FRT Zhou, 2003
플라스미드
pKD4 bla FRT-kan-FRT Datsenko, 2000
pKD46 bla γβexo(Red 재조합효소), 온도-조건의 레플리콘 Datsenko, 2000
pFT-A bla flp 온도-조건부 레플리콘 및 FLP 재조합효소 Posfai, 1997
pEL04 cat-sacB 목표 카세트 Lee. 2001
Thomson, 2005
pLOI3421 1.8 kbp SmaI 단편 함유 aac Wood, 2005
pLOI4151 bla cat; cat-sacB 카세트 본 연구
pCR2.1-TOPO bla kan; TOPO TA 클로닝 벡터 인비트로젠
pLOI4228 bla kan; pCR2.1-TOPO 벡터로 클론화된 대장균 C로부터 yccT'-mgsA-helD'(PCR) 본 연구
pLOI4229 pLOI4228에서 mgsA로 클론화된 pLOI4151(EcoRV 침지됨)로부터 PCR 증폭된 cat-sacB 카세트 본 연구
pLOI4230 키나아제 처리된 후 자가-결찰된 pLOI4228(mgsA-1/2 프라이머를 사용함)로부터 증폭된 PCR 단편 본 연구
pLOI4274 bla kan; pCR2.1-TOPO 벡터로 클론화된 대장균 C로부터 poxB(PCR) 본 연구
pLOI4275 pLOI4274의 poxB로 클론화된 pLOI4151(EcoRV 침지됨)로부터 PCR 증폭된 cat-sacB 카세트 본 연구
pLOI4276 키나아제 처리된 후 자가-결찰된 pLOI4274(poxB-1/2 프라이머를 사용함)로부터 증폭된 PCR 단편 본 연구
프라이머 세트
ldhA 5’ATGAACTCGCCGTTTTATAGCACAAAACAGTACGACAAGAAGTACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC3’ (서열번호: 2)
5’TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTCGCCTTTTTCCAGATTGCTCATATGAATATCCTCCTTAG3’ (서열번호: 3)		 본 연구
adhE 5’ATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAACGCACTCGTAGAGCGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC3’ (서열번호: 4)
5’TTAAGCGGATTTTTTCGCTTTTTTCTCAGCTTTAGCCGGAGCAGCCATATGAATATCCTCCTTAG3’ (서열번호: 5)		 Zhou, 2003
ackA 5’ATGTCGAGTAAGTTAGTACTGGTTCTGAACTGCGGTAGTTCTTCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC3’ (서열번호: 6)
5’TCAGGCAGTCAGGCGGCTCGCGTCTTGCGCGATAACCAGTTCTTCCATATGAATATCCTCCTTAG3’ (서열번호: 7)		 Zhou, 2003
focA-pflB 5’TTACTCCGTATTTGCATAAAAACCATGCGAGTTACGGGCCTATAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC3’ (서열번호: 8)
5’ATAGATTGAGTGAAGGTACGAGTAATAACGTCCTGCTGCTGTTCTCATATGAATATCCTCCTTAG3’ (서열번호: 9)		 본 연구
JMcatsacB 5’TTAGCTAGCATGTGACGGAAGATCACTTCG3’ (서열번호: 10)
5’CCGCTAGCATCAAAGGGAAAACTGTCCATAT3’ (서열번호: 11)		 본 연구
cat-업2/sacB-다운2 5’AGAGAGGATATCTGTGACGGAAGATCACTTCG3’ (서열번호: 12)
5’AGAGAGGATATCGAATTGATCCGGTGGATGAC3’ (서열번호: 13)		 본 연구
mgsA-업/다운 5’CAGCTCATCAACCAGGTCAA3’ (서열번호: 14)
5’AAAAGCCGTCACGTTATTGG3’ (서열번호: 15)		 본 연구
mgsA-1/2 5’AGCGTTATCTCGCGGACCGT3’ (서열번호: 16)
5’AAGTGCGAGTCGTCAGTTCC3’ (서열번호: 17)		 본 연구
poxB-업/다운 5’AAGCAATAACGTTCCGGTTG3’ (서열번호: 18)
5’CCACTTTATCCAGCGGTAGC3’ (서열번호: 19)		 본 연구
poxB-1/2 5’GACGCGGTGATGAAGTGAT3’ (서열번호: 20)
5’TTTGGCGATATAAGCTGCAA3’ (서열번호: 21)		 본 연구
pck-F/R 5’TTGGCTAAGG AGCAGTGAAA TGCGCGTTA3’ (서열번호: 22)
5’CACGACAAAA GAAGGGTAAA TAAAC3’ (서열번호: 23)		 본 연구
pck-2/3 5’TTGTTAACGCGCATTTCACT3’ (서열번호: 24)
5’GCGATAGCGGCTACTGTCAT3’ (서열번호: 25)		 본 연구
pck(RT-PCR) 5’GACGATACCACTCGCGAT3’ (서열번호: 26)
5’GTCGACAACGAACAGACGT3’ (서열번호: 27)		 본 연구
pck(RT-PCR) 5’ATCGTGATGGCGGAAGT3’ (서열번호: 28)
5’CTTGCGATCCTGCAGATAG3’ (서열번호: 29)		 본 연구
대장균의 돌연변이 균주에 의한 미네랄 염 배지에서 글루코스의 발효


균주a


미생물 조건
 배지, 글루코스
(w/v)
 세포 수율b (g/L)
숙시네이트
수율		 평균. 부피. 생산성
(g/L/h)
발효 생성물(mM)c
몰/몰 g/g Suc Mal Pyr Ace Lac For
대장균 C 야생형f 0.1 OD550, 0.1 mM 0.2 베타인 5%,
NBS		 2.0±0.2 0.19±0.02 0.12 0.12±
0.01		 49±3 -g 33± 10 152± 30 98
±
24		 262
±
19
KJ012f 0.1 OD550, 0.1 mM 베타인 5%,
NBS		 0.3±0.1 0.20±0.01 0.13 0.04±
0.01		 6± 0.4 - - 26±1 - -
KJ012 0.1 OD550, 0.1 mM 베타인 흔들어진 플라스크h 5%,
NBS+
MOPS		 1.5 0.10 0.06 0.02 10 - - 226 - 16
KJ012 0.1 OD550 루리아 배양액 5%,
LB		 1.5 0.70 0.50 0.09 108 - - 61 <2 14
KJ012
(ldhA, ackA, adhE)













(KJ017)		 제 1의 TF: 베타인 없음, 0.1 OD550, 120시간 전이 5%,
NBS		 0.3 0.13 0.09 0.072 6 - - 26 <2 -
제 3의 TF: 2 mM 베타인, 0.1 OD550, 96시간 전이 5%,
NBS		 0.7 0.28 0.18 0.128 26 - - 71 <2 -
제 40의 TF: 1 mM 베타인, 0.1 OD550, 24시간 전이, 3M K2CO3+ 6N KOH 5%,
NBS		 2.3 0.73 0.48 0.251 204 - - 179 <2 151
제 40의 TF: 1 mM 베타인, 0.1 OD550, 24시간 전이, 3M K2CO3+ 6N KOH 10%,
NBS		 1.7 0.74 0.49 0.354 288 - - 181 38 199
KJ032
(ldhA, ackA, adhE, focA, pflB)
 제 2의 TF: 1 mM 베타인, 0.1 OD550, 48시간 전이, 20 mM NaOAc, 3M K2CO3+ 6N KOH 5%,
NBS		 1.0 1.47 0.97 0.260 212 - - 44 - -
제 15의 TF: 1 mM 베타인, 0.01 OD550, 24시간 전이, 5 mM NaOAc, 3M K2CO3+ 6N KOH 10%,
NBS		 1.4 1.07 0.71 0.736 596 331 9 170 <2 -



(KJ060)		 제 5의 TF: 1 mM 베타인, 0.01 OD550, 24시간 전이, NaOAc 없음, 3M K2CO3+ 6N KOH 10%,
NBS		 1.4 1.04 0.69 0.711 579 318 9 161 <2 -
KJ070
(ldhA, ackA, adhE, focA, pflB, mgsA)




(KJ071)		 제 1의 TF: 1 mM 베타인, 0.01 OD550, 24시간 TF, 3M K2CO3+ 6N KOH 5%,
NBS		 1.0 1.06 0.70 0.361 294 219 25 102 - -
제 50의 TF: 1 mM 베타인, 0.01 OD550, 24시간 전이, 3M K2CO3+ 6N KOH 10%,
NBS		 1.1 0.71 0.47 0.419 341 626 <2 76 - -
KJ072
(ldhA, ackA, adhE, focA, pflB, mgsA, poxB)









(KJ073)		 제 2의 TF: 1 mM 베타인, 0.01 OD550, 24시간 전이, 3M K2CO3+ 6N KOH 10%,
NBS		 1.3 0.97 0.64 0.663 539 186 <2 95 - -
제 6의 TF: 1 mM 베타인, 0.01 OD550, 24시간 전이, 3M K2CO3+ 6N KOH 10%,
AM1		 1.2 1.34 0.88 0.733 596 38 4 112 - -
제 45의 TF: 1 mM 베타인, 0.01 OD550, 24시간 전이, 3M K2CO3+ 6N KOH 10%,
AM1		 1.5 1.26 0.83 0.858 699 313 103 172 - -
KJ073f 1 mM 베타인, 3M K2CO3+ 6N KOH 0.01 OD550 접종물 10%,
AM1		 2.3
±0.1		 1.20±0.09 0.77±
0.03		 0.82
±0.01		 668
±8		 118
±
13		 55
±
22		 183
±
27		 - -
KJ060f 1 mM 베타인, 3M K2CO3+ 6N KOH 0.01 OD550 접종물 10%,
AM1		 2.2
±0.1		 1.41±0.07 0.92±
0.05		 0.90
±0.04		 733
±
39		 39
±
17		 - 250
±
36		 2±1 -
KJ060f 1 mM 베타인, 3M K2CO3+ 6N KOH 0.01 OD550 접종물 10%,
AM1		 2.2
±0.1		 1.61±0.12 1.05±
0.09		 0.77
±0.04		 622
±8		 17
±5		 1.5
±1		 180
±
13		 2±1 -
KJ071f 1 mM 베타인, 3M K2CO3+ 6N KOH 0.01 OD550 접종물 10%, NBS 1.5
±0.0		 0.78±0.02 0.53±
0.01		 0.33
±0.04		 280±7 516
±
14		 58
±
15		 64
±
9		 - -
a 클론은 다양한 지점에서 발효 배양액으로부터 분리되고 균주 번호에 할당되고, 괄호에서의 숫자에 의해 나타내졌다.
b 세포 수율은 광학 밀도(3 OD550nm = 1 g/l-1 CDW)로부터 측정되었다.
c 숙시네이트 수율은 대사된 글루코스에 근거하여 계산되었다.
d 평균 부피 생산성은 총 배양 시간에 대해 계산되었다.
e 첨자: suc, 숙시네이트; mal, 말레이트; pyr, 피루베이트; ace, 아세테이트; lac, 락테이트; for, 포르메이트.
f 표준 편차를 고려하여 평균 3배 이상의 발효.
g -는 생성물이 없음을 나타낸다.
h 혐기성 흔들어진 플라스크(100 rpm; 100 ml NBS, 250-ml 플라스크).
다른 균주에서 카복실화 효소 활성의 비교


효소
 특정 활성 [나노몰 분-1 (mg 단백질)-1]
대장균 C 대장균 KJ012 대장균 KJ017 대장균 KJ073 대장균 K12a 액티노바실루스
숙시노진a
PEP
카복실라제		 20±2 25±2 17±1 27±2 140 10
PEP
카복시키나아제		 295±23 162±11 700±68 7341±462 140 4,700
말릭 효소
(NADH, 카복실화)		 NDb 5±2 12±4 12±3 공지되지 않음 공지되지 않음
말릭 효소
(NADPH 카복실화)		 <1 <1 <1 <1 공지되지 않음 공지되지 않음
a 데이터는 문헌[van der Werf 등., 1997]으로부터 구함.
b 락테이트 탈수소화효소의 존재 때문에 야생형 대장균 C에서 측정할 수 없음.
배지의 조성(탄소 소스를 제외함)

성분
 농도(밀리몰 L-1)
aNBS +
1 mM 베타인		 AM1
1 mM 베타인
KH2PO4 25.72 0
K2HPO4 28.71 0
(NH4)2HPO4 26.50 19.92
NH4H2PO4 0 7.56
총 PO4 80.93 27.48
총 N 53.01 47.39
b총 K 84.13 1.00
MgSO47H2O 1.00 1.50
CaCl22H2O 0.10 0
티아민 HCl 0.015 0
베타인-KCl 1.00 1.00
(μmol L-1)c
FeCl36H2O 5.92 8.88
CoCl26H2O 0.84 1.26
CuCl22H2O 0.59 0.88
ZnCl2 1.47 2.20
Na2MoO42H2O 0.83 1.24
H3BO3 0.81 1.21
MnCl24H2O2 0 2.50

총 염
12.5 g L-1
4.1 g L-1
a NBS + 1 mM 베타인: 베타인(1 mM)으로 변형된 NBS 배지.
b 베타인-HCl 스탁(stock)을 중성화하는 데에 사용된 KOH를 포함하여 계산됨.
c 추적 금속 스탁(trace metal stock)(1000X)은 120 mM HCl에서 준비되었다.
대장균 균주
관련 특성 소스
균주 B
KJ073 △ldhA::FRT △adhE::FRT △(focA-pflB)::FRT △ ackA::FRT △mgsA △poxB Jatama 등., 2008
KJ076 KJ073, △ackA::cat-sacB, 번역 정지 서열 본원에서 공개됨
KJ079 KJ073, △ackA::번역 정지 서열 본원에서 공개됨
TG200 KJ079, △adhE::cat-sacB 본원에서 공개됨
TG201 TG200, △adhE 본원에서 공개됨
TG202 TG201, △ldhA::cat-sacb 본원에서 공개됨
TG203 TG202, △ldhA 본원에서 공개됨
TG204 TG203, △(focA-pflB)::cat-sacB 본원에서 공개됨
KJ091 TG204, △(focA-pflB) 본원에서 공개됨
KJ098 KJ091, △tdcDE 본원에서 공개됨
KJ104 KJ098, △citF 본원에서 공개됨
KJ110 KJ104, △aspC 본원에서 공개됨
KJ119 KJ104, △sfcA 본원에서 공개됨
KJ122 KJ110, △sfcA 본원에서 공개됨
KJ134 KJ122, △ackA-pta 본원에서 공개됨
플라스미드
pKD46 bla γβexo(red 재조합효소), 온도-조건의 레플리콘 Datsenko, 2000
pEL04 cat-sacB 카세트 Lee, 2001,
Thomason, 2005
pLOI2228 cat; FRT-cat-FRT 카세트 Martinez-Morales 등., 1999
pLOI2511 bla kan; FRT-kan-FRT 카세트 Underwood 등., 2002
pLOI4131 bla; pLOI2228(BanI 침지되고, Klenow 처리되고, ClaI 침지된, FRT-cat-FRT 카세트) 및 pLOI2511(NheI 침지되고, Klenow 처리되고, ClaI 침지됨)의 결찰
본원에서 공개됨
pLOI4145 bla; EcoRI 침지된 pLOI4131, 자가-결찰 본원에서 공개됨
pLOI4146 bla cat; pLOI4152, BamHI/XhoI 침지되고 BamHI/XhoI 침지된 pLOI4153으로부터 PCR 증폭된(JMcatsacB업3/다운3 프라이머를 사용함) cat-sacB 카세트의 결찰 본원에서 공개됨
pLOI4151 bla cat; cat-sacB 카세트 Jantama 등., 2008
pLOI4152 cat-sacB 카세트; pEL04(JMpEL04F1/R1 프라이머를 사용함)로부터 PCR 증폭된 카세트, BglII 침지 및 자가-결찰 본원에서 공개됨
pLOI4153 bla; pLOI4145(KasI/XmaI 침지됨) 및 KasI/XmaI 침지된 SfPBXPS 폴리링커(상보성의 올리고뉴클레오티드 SfPBXPS 센스/SfPBXPScomp의 어닐링)의 결찰
본원에서 공개됨
pLOI4154 PacI 침지된 pLOI4146, 자가 결찰 본원에서 공개됨
pLOI4161 bla cat;cat-sacB 카세트 본원에서 공개됨
pLOI4162 bla cat; pLOI4146 및 PacI 침지된 pLOI4161의 cat-sacB 카세트(PacI 침지됨)의 결찰 본원에서 공개됨
pCR2.1-TOPO
bla kan; TOPO TA 클로닝 벡터
인비트로젠
pLOI4158 bla kan; pCR2.1-TOPO 벡터로 클론화된 대장균 C(JMackA-F1/R1 프라이머)로부터의 ackA(PCR)
본원에서 공개됨
pLOI4159 pLOI4158(JMackA업1/다운1을 사용함)로부터 PCR 증폭된 인사이드-아웃 생성물로 클론화된 pLOI4162로부터의 SmaI/SfoI 침지된 cat-sacB 카세트
본원에서 공개됨
pLOI4160 pLOI4159의 PacI 침지 후 자가-결찰됨 본원에서 공개됨
pLOI4515 bla kan; pCR2.1-TOPO 벡터로 클론화된 대장균 C(tdcDE-업/다운 프라이머를 사용함)로부터의 tdcG'-tdcFED-tdcC' 본원에서 공개됨
pLOI4516 pLOI4515(tdcDE-F7/R7 프라이머를 사용함)로부터 PCR 증폭된 인사이드-아웃 생성물로 클론화된 pLOI4162로부터의 SmaI/SfoI 침지된 cat-sacB 카세트 본원에서 공개됨
pLOI4517 키나아제 처리된 후 자가-결찰된 pLOI415(tdcDE-F7/R7 프라이머를 사용함)로부터 인사이드-아웃 생성물을 증폭한 PCR 단편 본원에서 공개됨
pLOI4629 bla kan; pCR2.1-TOPO 벡터로 클론화된 대장균 C(citF-어업2/다운2 프라이머를 사용함)로부터의 citF(PCR) 본원에서 공개됨
pLOI4630 pLOI4629(citF-2/3 프라이머를 사용함)로부터 PCR 증폭된 인사이드-아웃 생성물로 클론화된 pLOI4162로부터의 SmaI/SfoI 침지된 cat-sacB 카세트 본원에서 공개됨
pLOI4631 pLOI4630의 PacI 침지 후 자가-결찰됨 본원에서 공개됨
pLOI4280 bla kan; pCR2.1-TOPO 벡터로 클론화된 대장균 C(aspC-1/2 프라이머를 사용함)로부터의 aspC(PCR) 본원에서 공개됨
pLOI4281 pLOI4280(aspC-1/2 프라이머를 사용함)으로부터 PCR 증폭된 인사이드-아웃 생성물로 클론화된 pLOI4162로부터의 SmaI/SfoI 침지된 cat-sacB 카세트 본원에서 공개됨
pLOI4282 키나아제 처리된 후 자가-결찰된 pLOI4280(aspC-1/2 프라이머를 사용함)으로부터 인사이드-아웃 생성물을 증폭한 PCR 단편 본원에서 공개됨
pLOI4283 bla kan; pCR2.1-TOPO 벡터로 클론화된 대장균 C(sfcA-업/다운 프라이머를 사용함)로부터의 sfcA(PCR) 본원에서 공개됨
pLOI4284 pLOI4283(sfcA-1/2 프라이머를 사용함)으로부터 PCR 증폭된 인사이드-아웃 생성물로 클론화된 pLOI4162로부터의 SmaI/SfoI 침지된 cat-sacB 카세트 본원에서 공개됨
pLOI4285 pLOI4284의 PacI 침지 후 자가-결찰됨 본원에서 공개됨
pLOI4710 bla kan; pCR2.1-TOPO 벡터로 클론화된 대장균 C(ackA-업/pta-다운 프라이머를 사용함)로부터의 ackA-pta(PCR) 본원에서 공개됨
pLOI4711 pLOI4710(ackA-2/pta-2 프라이머를 사용함)으로부터 PCR 증폭된 인사이드-아웃 생성물로 클론화된 pLOI4162로부터의 SmaI/SfoI 침지된 cat-sacB 카세트 본원에서 공개됨
pLOI4712 pLOI4711의 PacI 침지 후 자가-결찰됨 본원에서 공개됨
pLOI4413 bla kan; pCR2.1-TOPO 벡터로 클론화된 대장균 C(업/다운-adhE 프라이머를 사용함)로부터의 ychE'-adhE-ychG'(PCR) 본원에서 공개됨
pLOI4419 키나아제 처리된 후 자가-결찰된 pLOI4413(IO-adhE-업/다운 프라이머를 사용함)으로부터 인사이드-아웃 생성물을 증폭한 PCR 단편 본원에서 공개됨
pLOI4415 bla kan; pCR2.1-TOPO 벡터로 클론화된 대장균 C(업-focA/중간-pflA 프라이머를 사용함)로부터의 ycaO'-focA-pflB-pflA'(PCR) 본원에서 공개됨
pLOI4421 키나아제 처리된 후 자가-결찰된 pLOI4415(IO-ycaO-업/IO-중간pflB-다운 프라이머를 사용함)으로부터 인사이드-아웃 생성물을 증폭한 PCR 단편 본원에서 공개됨
pLOI4430 bla kan; pCR2.1-TOPO 벡터로 클론화된 대장균 C(ldhA-A/C 프라이머를 사용함)로부터의 hslJ'-ldhA-ydbH'(PCR) 본원에서 공개됨
pLOI4432 키나아제 처리된 후 자가-결찰된 pLOI4424(IO-ldhA-업/다운 프라이머를 사용함)으로부터 인사이드-아웃 생성물을 증폭한 PCR 단편 본원에서 공개됨
프라이머 세트
JM4161 센스/comp 5’ACCGCATCAGGCGCCTAATTAATTAATCCCGG3’ (서열번호: 30)
5’CCGGGATTAATTAATTAGGCGCCTGATGCGGT3’ (서열번호: 31)		 본원에서 공개됨
JMpEL04F1/R1 5’CAGCAGATCTAAGTAAATCGCGCGGGTTTG3’ (서열번호: 32)
5’CAGCAGATCTAGCGGCTATTTAACGACCCT3’ (서열번호: 33)		 본원에서 공개됨
JMackA-F1/R1 5’GCCTGAAGGCCTAAGTAGTA3’ (서열번호: 34)
5’GCACGATAGTCGTAGTCTGA3’ (서열번호: 35)		 본원에서 공개됨
JmackA 업
1/다운1		 5’GTTGAGCGCTTCGCTGTGAG3’ (서열번호: 36)
5’GCCGCAATGGTTCGTGAACT3’ (서열번호: 37)		 본원에서 공개됨
JmcatsacB
업3/다운3		 5’CTCACCTCGAGTGTGACGGAAGATCACTTCG3’ (서열번호: 38)
5’GTGCAGGATCCATCAAAGGGAAAACTGTCCATAT3’ (서열번호: 39)		 본원에서 공개됨
SfPBXPS 센
스/comp		 5’ATGTAGGCGCCATTAATTAATGGATCCACTATCTCGAGATTAATTAATCCCGGGACTAT3’ (서열번호: 40)
5’ATAGTCCCGGGATTAATTAATCTCGAGATAGTGGATCCATTAATTAATGGCGCCTACAT3’ (서열번호: 41)		 본원에서 공개됨
WMadhE
A/C		 5’ATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAACGCACTCGTAGAGCGTCGGCACGTAAGAGGTTCCAA3’ (서열번호: 42)
5’TTAAGCGGATTTTTTCGCTTTTTTCTCAGCTTTAGCCGGAGCAGCACACTGCTTCCGGTAGTCAA3’ (서열번호: 43)		 본원에서 공개됨
WMldhA
A/C		 5’ATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTACGACAAGAAGTACGGCACGTAAGAGGTTCCAA3’ (서열번호: 44)
5’TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTCGCCTTTTTCCAGATTGCTACACTGCTTCCGGTAGTCAA3’ (서열번호: 45)		 본원에서 공개됨
WMpflB
A/C		 5’TTACTCCGTATTTGCATAAAAACCATGCGAGTTACGGGCCTATAACGGCACGTAAGAGGTTCCAA3’ (서열번호: 46)
5’TTACATAGATTGAGTGAAGGTACGAGTAATAACGTCCTGCTGCTGTTCTACACTGCTTCCGGTAGTCAA3’ (서열번호: 47)		 본원에서 공개됨
tdcDE-업/
다운		 5’CGCCGACAGAGTAATAGGTT3’ (서열번호: 48)
5’TGATGAGCTACCTGGTATGG3’ (서열번호: 49)		 본원에서 공개됨
tdcDE-
F7/R7		 5’CGATGCGGTGGCCAATTAAG3’ (서열번호: 50)
5’GACGACGTGCTGGATTACGA3’ (서열번호: 51)		 본원에서 공개됨
citF-
업2/다운2		 5’GGGTATTCAGGCGTTCGATA3’ (서열번호: 52)
5’GCCCGAGAGGATGACTATGT3’ (서열번호: 53)		 본원에서 공개됨
citF-2/3 5’GGTGATCGATGTTGTGCATC3’ (서열번호: 54)
5’CCCGTTCTTGTCGTTGAGAT3’ (서열번호: 55)		 본원에서 공개됨
IO-adhE-
업/다운		 5’GCTGCTCCGGCTAAAGCTGA3’ (서열번호: 56)
5’ACGCTCTACGAGTGCGTTAA3’ (서열번호: 57)		 본원에서 공개됨
업-focA/중
간-pflB		 5’AGATCGCCAGCCGCTGCAAT3’ (서열번호: 58)
5’AACCGTTGGTGTCCAGACAG3’ (서열번호: 59)		 본원에서 공개됨
IO-ycaO-업
/IO-중간pf
lB-다운		 5’GCCTACATTGCGTAGGCTAT3’ (서열번호: 60)
5’GCAGCAGGACGTTATTACTC3’ (서열번호: 61)
본원에서 공개됨
ldhA-A/C 5’ATGAAACTCGCCGTTTATAG3’ (서열번호: 62)
5’TTAAACCAGTTCGTTGCCC3’ (서열번호: 63)		 본원에서 공개됨
IO-ldhA-업
/다운		 5’CGTTCGATCCGTATCCAAGT3’ (서열번호: 64)
5’AGGCTGGAACTCGGACTACT3’ (서열번호: 65)		 본원에서 공개됨
aspC-업/다
운		 5’TCCATCGCTTACACCAAATC3’ (서열번호: 66)
5’TGGGGGATGACGTGATATTT3’ (서열번호: 67)		 본원에서 공개됨
aspC-1/2 5’AGATAACATGGCTCCGCTGT3’ (서열번호: 68)
5’AGGAGCGGCGGTAATGTTC3’ (서열번호: 69)		 본원에서 공개됨
sfcA-
업/다운		 5’CTATGCTTGATCGGCAACCT3’ (서열번호: 70)
5’ACGATCGCCTGGTTTTAATG3’ (서열번호: 71)		 본원에서 공개됨
sfcA-1/2 5’TACCGCCGTACCTCCATCTA3’ (서열번호: 72)
5’CGTAAGGGATATAAAGCGAACG3’ (서열번호: 73)		 본원에서 공개됨
ackA-업/pt
a-다운		 5’CGGGACAACGTTCAAAACAT3’ (서열번호: 74)
5’ATTGCCCATCTTCTTGTTGG3’ (서열번호: 75)		 본원에서 공개됨
ackA-
2/pta-2		 5’AACTACCGCAGTTCAGAACCA3’ (서열번호: 76)
5’TCTGAACACCGGTAACACCA3’ (서열번호: 77)		 본원에서 공개됨
대장균의 돌연변이 균주에 의한 미네랄 염 배지에서 글루코스의 발효


균주

미생물 조건
 배지,
글루코스
(w/v)
 세포
수율a
(g/L)
숙시네이트
수율b 		평균.
부피.
생산성c
(g/L/h)
발효 생성물(mM)d,e,f
몰/몰 g/g Suc Mal Pyr Ace Lac For
KJ073 1mM 베타인,
3M K2CO3+6N KOH (1:1)
0.01 OD550nm 접종물		 10%,
AM1		 2.3±0.1 1.20±
0.09		 0.77
±
0.03		 0.82
±0.01		 668
±8		 118
±
13		 55
±
22		 183
±
27		 - -
KJ091 1mM 베타인,
3M K2CO3+6N KOH (1:1)
0.01 OD550nm 접종물		 10%. AM1 2.2±0.1 1.19
±
0.02		 0.78
±
0.01		 0.84
±0.01		 687
±3		 109
±3		 72
±5		 155
±6		 -
KJ098 1mM 베타인,
3M K2CO3+6N KOH (1:1)
0.01 OD550nm 접종물		 10%,
AM1		 2.3±0.1 1.30
±
0.04		 0.85
±
0.02		 0.79
±0.01		 644
±9		 - 42
±8		 88
±1		 - -
KJ104 1mM 베타인,
3M K2CO3+6N KOH (4:1)
0.01 OD550nm 접종물		 10%,
AM1		 1.8±0.1 1.31
±
0.01		 0.86
±
0.01		 0.78
±0.03		 634
±
25		 5
±1		 78
±5		 90
±
10		 - -
KJ104 1mM 베타인,
3M K2CO3+6N KOH (6:1)
0.01 OD550nm 접종물		 10%,
AM1		 1.9±0.1 1.30
±
0.01		 0.85
±
0.01		 0.77
±0.01		 625
±4		 3
±2		 94
±5		 81
±2		 - -
KJ110 1mM 베타인,
3M K2CO3+6N KOH (4:1)
0.01 OD550nm 접종물		 10%,
AM1		 2.0±0.1 1.28±
0.02		 0.84
±
0.01		 0.79
±0.01		 640
±
10		 4
±1		 76
±6		 106
±
11		 - -
KJ119 1mM 베타인,
3M K2CO3+6N KOH (4:1)
0.01 OD550nm 접종물		 10%,
AM1		 2.0±0.1 1.33
±
0.07		 0.87±
0.01		 0.82
±0.01		 672
±
10		 4
±0		 64
±
18		 95
±
14		 - -
KJ122 1mM 베타인,
3M K2CO3+6N KOH (4:1)
0.01 OD550nm 접종물		 10%,
AM1		 2.3±0.1 1.50
±
0.02		 0.98
±
0.01		 0.92±0.01 750
±1		 0
±0		 122
±
21		 94
±
13		 - -
KJ122 1mM 베타인,
3M K2CO3+6N KOH (6:1)
0.01 OD550nm 접종물		 10%,
AM1		 2.0±0.2 1.54
±
0.02		 1.01
±
0.01		 0.97
±0.04		 787±
35		 6
±3		 59
±6		 110
±
7		 - -
KJ122 1mM 베타인,
3M K2CO3+6N KOH (6:1)
0.15 OD550nm 접종물		 10%,
AM1		 2.1±0.1 1.57
±
0.09		 1.03
±
0.06		 0.93
±0.06		 756±
49		 0
±0		 124
±
13		 122
±
9		 - -
KJ134 1mM 베타인,
3M K2CO3+6N KOH (6:1)
0.01 OD550nm 접종물		 10%,
AM1		 2.3±0.1 1.70g
±
0.03		 1.11
±
0.02		 0.83
±0.02		 674±
15		 13
±2		 22
±9		 37
±5		 -
a 세포 수율은 광학 밀도(3 OD550nm = 1 g l-1 CDW)로부터 측정되었다.
클론dl 다양한 지점에서 발효 배양액으로부터 분리되고 균주 번호에 할당되고, 괄호에서의 숫자에 의해 나타내졌다.
b 숙시네이트 수율은 대사된 글루코스에 근거하여 계산되었다.
c 평균 부피 생산성은 총 배양 시간에 대해 계산되었다.
d 첨자: suc, 숙시네이트; mal, 말레이트; pyr, 피루베이트; ace, 아세테이트; lac, 락테이트; for, 포르메이트.
e 에탄올(153±39 mM)은 대장균 C에서 나온 배양액에만 존재하였다.
f 모든 데이터는 표준 편차를 고려하여 평균 3배 이상의 발효를 나타낸다.
g 숙시네이트의 이론적 수율에 근접하였음에도 불구하고 추가적인 생성물이 발견되었다. 총 생성물에 근거하여, 부산물은 11%를 나타내었다.
참고문헌,
미국 특허 제5,723,322호
미국 특허 제5,869,301호
미국 특허 제5,143,834호(Glassner 등., 1992)
미국 특허 제5,723,322호(Guettler 등., 1998)
미국 특허 제5,573,931호(Guettler 등., 1996a)
미국 특허 제5,505,004호(Guettler 등., 1996b)
Ajl, S. J., Werkman, C. H. (1948) "Enzymatic fixation of carbon dioxide in α-ketoglutaric acid" Proc . Natl . Acad . Sci . USA 34:491-498.
Andersson, C., Hodge, D., Berglund, K.A., Rova, U. (2007) "Effect of different carbon sources on the production of succinic acid using metabolically engineered Escherichia coli." Biotechnol Prog 23(2):381-388.
Asghari, A., Bothast, R. J., Doran, J. B., Ingram, L. O. (1996) "Ethanol production from hemicellulose hydrolysates of agricultural residues using genetically engineered Escherichia coli strain KO11" J. Industrial Microbiol. 16:42-47.
Causey, T.B., Shanmugam, K.T., Yomano, L.P, Ingram, L.O. (2004) "Engineering Escherichia coli for efficient conversion of glucose to pyruvate" Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101:2235-2240.
Chao, Y and Liao, J.C. (1993) "Alteration of growth yield by overexpression of phosphoenol pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase in Escherichia coli" Appl Environ Microbiol . 59:4261-4265.
Chang, Y.Y., Cronan, J. E., Jr. (2000) "Conversion of Escherichia coli pyruvate decarboxylase to an 'alpha-ketobutyrate oxidase'" Biochem . J. 352:717-724.
Chatterjee, R., Cynthia, S.M., Kathleen, C., David, P.C., Donnelly, M.I. (2001) "Mutation of the ptsG gene results in increased production of succinate in fermentation of glucose by Escherichia coli." Appl . Environ . Microbiol. 67:148-154.
Cox, S.J., Levanon, S.S., Sanchez, A.M., Lin, H., Peercy, B., Bennett, G.N., San, K.Y. (2006) "Development of a metabolic network design and optimization framework incorporating implement constraints: A succinate production case study" Metab . Engin . 8:46-57.
Datsenko, K.A., Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products" Proc . Natl . Acad. Sci . USA 97:6640-6645.
de Graef, M.R., Alexeeva, S., Snoep, J.L., de Mattos, M.J.T. (1999) "The steady-state internal redox state (NADH/NAD) reflects the external redox state and is correlated wit catabolic adaptation in Escherichia coli." J. Bacteriol. 181:2351-235.
Delbaere, L.T.J., Sudom, A.M., Prasad, L., Leduc, Y., Goldie, H. (2004) "Structure/function studies of phosphoryl transfer by phosphoenolpyruvate carboxykinase" Biochimica et Biophysica Acta . 1679:271-278.
Du, C., Lin, S.K., Koutinas, A., Wang, R., Webb, C. (2007) "Succinic acid production from wheat using a biorefining strategy" Appl Microbiol Biotechnol. 76(6):1263-1270.
Egyud, L.G., Szent-Gyorgyi, A. (1966) "On the regulation of cell division" Proc . Natl . Acad . Sci . USA 56:203-207.
Farmer, W. 및 Liao, J.C. (1997) "Reduction of aerobic acetate production by Escherichia coli" Appl . Environ . Microbiol . 63:3205-3210.
Fraenkel, D.G. (1996) Chapter 14, Glycolysis. In A. Bock, R. Curtiss III, J. B. Kaper, F. C. Neidhardt, T. Nystrom, K. E. Rudd, and C. L. Squires (ed.), EcoSal-Escherichia coli 및 Salmonella: cellular and molecular biology. [Online.] http://www.ecosal.org. ASM Press, Washington, D.C.
Gokarn, R.R., Eiteman, M.A., Altman, E. (2000) "Metabolic analysis of Escherichia coli in the presence and absence of carboxylating enzymes phosphoenolpyruvate carboxylase and pyruvate carboxylase" Appl . Environ . Microbiol. 66:1844-1850.
Goldie, A.H. 및 Sanwal, B.D. (1980a) "Genetic and physiological characterization of Escherichia coli mutants deficient in phosphoenolpyruvate carboxykinase activity" J Bacteriol . 141(3):1115-1121.
Goldie, A.H. 및 Sanwal, B.D. (1980b) "Allosteric control by calcium and mechanism of desensitization of phosphoenolpyruvate carboxykinase of Escherichia coli ." J Biol Chem . 255(4):1399-1405.
Gottschalk, G. (1985) Bacterial metabolism. 2nd ed. Springer-Verlag, New York.
Grabar, T.B., Zhou, S., Shanmugam, K.T., Yomano, L.P., Ingram, L.O. (2006) "Methylglyoxal bypass identified as source of chiral contamination in L(+) and D(-) lactate fermentations by recombinant Escherichia coli ." Biotechnol. Lett . 28:1527-1535.
Guest, J.R., Angier, S.J., Russell (1989) "Structure, expression, and protein engineering in the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli." Ann . N. Y. Acad . Sci . 573:76-99.
Hesslinger, C., Fairhurst, S.A., Sawers, G. (1998) "Novel keto acid formate-lyase and propionate kinase enzymes are components of an anaerobic pathway in Escherichia coli that degrades L threonine to propionate" Mol Microbiol 27(2):477-492.
Hopper, D.J., Cooper, R.A. (1971) "The regulation of Escherichia coli methylglyoxal synthase: a new control site in glycolysis" FEBS Lett 13:213-216.
Iverson, T. M., Luna-Chavez, C., Croal, L. R., Cecchini, G., Rees, D. C. (2002) "Crystallographic studies of the Escherichia coli quinol-fumarate reductase with inhibitors bound to the quinol-binding site. 2002" J. Biol . Chem. 277:16124-16130.
Jantama, K., Haupt, M.J., Svoronos, S.A., Zhang, X., Moore, J.C., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (2008) "Combining metabolic engineering and metabolic evolution to develop nonrecombinant strains of E. coli C that produce succinate and malate" Biotech . Bioeng . 99(5):1140-1153.
Jarboe, L.R., Hyduke, D.R., Tran, L.M., Chou, K.J., Liao, J.C. (2008) "Determination of the Escherichia coli S-nitrosoglutathione response network using integrated biochemical and systems analysis" J Biol Chem . 283: 5148-5157.
Kao, K.C., Tran, L.M., Liao, J.C. (2005) "A global regulatory role of gluconeogenic genes in Escherichia coli revealed by transcriptome network analysis" J Biol Chem 280:36079-36087.
Karp, P.D., Keseler, I.M., Shearer, A., Latendresse, M., Krummenacker, M., Paley, S.M., Paulsen, I.T., Collado-Vides, J., Gamma-Castro, S., Peralta-Gil, M., Santos-Zavaleta, A., Penaloza-Spinola, M., Bonavides-Martinez, C., Ingraham, J. (2007) "Multidimensional annotation of Escherichia coli K-12 genome" Nucl Acids Res . 35(22):7577-7590.
Keseler, I.M., Collado-Vides, J., Gamma-Castro, S., Ingraham, J., Paley, S., Paulsen, I.T., Peralta-Gil, M., Karp, P.D. (2005) "Ecocyc: A comprehensive database resource for Escherichia coli" Nucl Acids Res 33:D334-D337.
Kessler, D., and Knappe, J. (1996) Anaerobic dissimilation of pyruvate. In Neidhardt FC, Curtiss III R, Ingraham JL, Lin ECC, Low KB, Magasanik B, Reznikoff WS, Riley M, Schaechter M, Umbarger HE, editors. Escherichia coli 및 Salmonella: cellular and molecular biology. ASM Press, Washington, D.C. p. 199-205.
Kim, P., Laivebieks, M., Vieille, C., Zeikus, J.G. (2004) "Effect of overexpression of Actinobacillus succinogenes phosphoenolpyruvate carboxykinase on succinate production in Escherichia coli" Appl Environ Microbiol. 70(2): 1238-41.
Krebs, A., Bridger, W.A. (1980) "The kinetic properties of phosphoenolpyruvate carboxykinase of Escherichia coli" Can J Biochem 58(4): 309-318.
Kulla, H., and Gottschalk, G. (1977) "Energy-dependent inactivation of citrate lyase in Enterobacter aerogenes" J. Bacteriol . 132(3): 764-770.
Laivenieks, M., Vieille, C., Zeikus, J.G. (1997) "Cloning, sequencing, and overexpression of the Anaerobiospirillum succiniciproducens phosphoenolpyruvate carboxykinase (pckA) gene" Appl Environ Microbiol 63(6): 2273-2280.
Lee, E-C., Yu, K., Martinez de Velasco, J., Tessarollo, L., Swing, D.A., Court, D.L., Jenkins, N.A., and Copeland, N.G. (2001) "A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA" Genomics 73: 56-65.
Lee, S.Y., Hong, S.H., Lee, S.H., Park, S.J. (2004) "Fermentative production of chemicals that can be used for polymer synthesis" Macromol . Biosci. 4:157-164.
Lee, S.J, Lee ,D.Y., Kim, T.Y., Kim, B.H., Lee, J., Lee, S.Y. (2005) "Metabolic engineering of Escherichia coli for enhanced production of succinic acid, based on genome comparison and in silico gene knockout simulation" Appl Environ Microbiol 71:7880-7887.
Lee, S.J., Song, H., Lee, S.Y. (2006) "Genome-based metabolic engineering of Mannheimia succiniciproducens for succic acid production" Appl Environ Microbiol 72(3):1939 1948.
Lin, H., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005a) "Chemostat culture characterization of Escherichia coli mutant strains metabolically engineered for aerobic succinate production: A study of the modified metabolic network based on metabolite profile, enzyme activity, and gene expression profile" Metab. Engin . 7:337-352.
Lin, H., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005b) "Metabolic engineering of aerobic succinate production systems in Escherichia coli to improve process productivity and achieve the maximum theoretical succinate yield" Metab . Engin. 7:116-127.
Lin, H., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005c) "Effect of carbon sources differing in oxidation state and transport route on succinate production in metabolically engineered Escherichia coli" J. Ind . Microbiol . Biotechnol . 32:87-93.
Lin, H., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005d) "Fed-batch culture of a metabolically engineered Escherichia coli strain designed for high-level succinate production and yield under aerobic conditions" Biotechnol Bioeng 90:775-779.
Lutgens, M., 및 Gottschalk, G. (1980) "Why a co-substrate is required for the anaerobic growth of Escherichia coli on citrate" J. Gen Microbiol . 119: 63-70.
Martinez, A., Grabar, T.B., Shanmugam, K.T., Yomano, L.P., York, S.W., Ingram, L.O. (2007) "Low salt medium for lactate and ethanol production by recombinant Escherichia coli" Biotechnol . Lett . 29:397-404.
Martinez-Morales, F., Borges, A.C., Martinez, A., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (1999) "Chromosomal integration of heterologous DNA in Escherichia coli with precise removal of markers and replicons used during construction" J Bacteriol . 181:7143?7148.
McKinlay, J.B., Zeikus, J.G., Vieille, C. (2005) "Insights into Actinobacillus succinogenes fermentative metabolism in a chemically defined growth medium" Appl Environ Microbiol . 71(11):6651-6656.
McKinlay, J.B., Vieille, C. (2008) "13C-metabolic flux analysis of Actinobacillus succinogenes fermentative metabolism at different NaHCO3 and H2 concentrations" Metab . Eng . 10:55-68.
McKinlay, J.B., Vieille, C., Zeikus, J.G. (2007) "Prospects for a bio-based succinate industry" Appl Microbiol Biotechnol . 76(4):727-740.
Meynial-Salles, I., Dorotyn, S., Soucaille, P. (2007) "A new process for the continuous production of succinic acid from glucose at high yield, titer and productivity" Biotechnol Bioeng . 99(1):129-135.
Miller, J.H. (1992) A short course in bacterial genetics: A laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria, Cold Spring Harbor Press.
Millard, C.S., Chao, Y.P., Liao, J.C., Donnelly, M.I. (1996) "Enhanced production of succinic acid by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli" Appl . Environ . Microbiol . 62:1808-1810.
Morikawa, M., K. Izui, 등. (1980) "Regulation of Escherichia coli phosphoenolpyruvate carboxylase by multiple effectors in vivo. Estimation of the activities in the cells grown on various compounds" J Biochem ( Tokyo ) 87(2): 441-449.
Moniruzzaman, M. 등. (1997) "Isolation and molecular characterization of high-performance cellobiose-fermenting spontaneous mutants of ethanologenic Escherichia coli K011 containing the Klebsiella oxytoca casAB operon" Appl . Environ . Microbiol . 63:4633-4637.
Nilekani, S., Sivaraman, C. (1983) "Purification and properties of citrate lyase from Escherichia coli" Biochemistry 22(20);4657-63.
Oh, M.K., Rohlin, L., Kao, K.C., Liao, J.C. (2002) "Global expression profiling of acetate-grown Escherichia coli" J Biol Chem 277: 13175-13183.
Okino, S., Inui, M., Yukawa, H. (2005) "Production of organic acids by Corynebacterium glutanicum under oxygen deprivation" Appl Microbiol Biotechnol 68:475-480.
Posfai, G., Koob, M.D., Kirkpatrick, H.A., Blattner, F.C. (1997) "Versatile insertion plasmids for targeted genome manipulations in bacteria: Isolation, deletion, and rescue of the pathogenicity island LEE of the Escherichia coli O157:H7 genome" J. Bacteriol . 179:4426-4428.
Quentmeier, A., Holzenburg, A., Mayer, F., Antranikian, G. (1987) "Reevaluation of citrate lyase from Escherichia coli" Biochim Biophys Acta 913(1): 60-5.
Reed, J.L., Vo, T.D., Schilling, C.H., Palsson, B.O. (2003) "An expanded genome-scale model of Escherichia coli K-12 (iJR904 GSM/GPR)" Genome Biol. 4(9):R54.
Reitzer, L. 2004. 6 July 2004, posting date. Chapter 3.6.1.3, Biosynthesis of Glutamate, Aspartate, Asparagine, L-Alanine, and D-Alanine. In A. Bock, R. Curtiss III, J. B. Kaper, F. C. Neidhardt, T. Nystrom, K. E. Rudd, and C. L. Squires (ed.), EcoSal-Escherichia coli 및 Salmonella: cellular and molecular biology. [Online.] http://www.ecosal.org. ASM Press, Washington, D.C.
Samuelov, N.S., Lamed, R., Lowe, S., Zeikus, J.G. (1991) “Influence of CO2-HCO3 levels and pH on growth, succinate production, and enzyme-activities of Anaerobiospirillum succiniproducens" Appl . Environ . Microbiol . 57: 3013-3019.
Sanchez, A.M., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005a) "Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity" Metabolic Engineering 7:229-239.
Sanchez, A.M., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005b) "Efficient succinic acid production from glucose through overexpression of pyruvate carboxylase in an Escherichia coli alcohol dehydrogenase and lactate dehydrogenase mutant" Biotechnol . Prog . 21: 358-365.
Sanchez, A.M., Bennett, G.N., San, K.Y. (2006) "Batch culture characterization and metabolic flux analysis of succinate-producing Escherichia coli strains" Metabolic Engineering 8: 209-226.
Sanwal, B.D. and Smando, R. (1969a) "Malic enzyme of Escherichia coli: Possible mechanism for allosteric effects" J Biol Chem . 244(7):1824-1830.
Sanwal, B.D. and Smando, R. (1969b) "Malic enzyme of Escherichia coli: Diversity of the effectors controlling enzyme activity" J Biol Chem . 244(7):1817-1823.
Sanwal, B.D. (1970a) "Allosteric controls of amphibolic pathways in bacteria" Bacteriol . Rev . 34:20-39.
Sanwal, B.D. (1970b) "Regulatory characteristics of the diphosphopyridine nucleotide-specific malic enzyme of Escherichia coli" J Biol Chem . 245(5):1212-1216.
Sanwal, B.D. (1970c) "Regulatory mechanisms involving nicotinamide adenine nucleotide as allosteric effectors: A control of glucose 6-phosphate dehydrogenase" J Biol Chem 245(7):1625-1631.
Sawers, G., Bock, A. (1988) "Anaerobic regulation of pyruvate formate-lyase from Escherichia coli K-12" J. Bacteriology . 170:5330-5336.
Song, H., Lee, J.W., Choi, S., You, J.K., Hong, W.H., Lee, S.Y. (2007) "Effects of dissolved CO2 levels on the growth of Mannheimia succiniciproducens and succinic acid production" Biotechnol Bioeng . 98(6):1296-1304.
Storici, F., Coglievina, M., Bruschi, C.V. (1999) "A 2-μm DNA-based maker recycling system for multiple gene disruption in the yeast Saccharomyces cerevisiae" Yeast 15:271-283.
Stols, L., Donnelly, M.I. (1997) "Production of succinic acid through overexpression of NAD dependent malic enzyme in an Escherichia coli mutant" Appl. Environ . Microbiol . 63:2695-2701.
Thomason, L., Court, D.L., Bubunenko, M., Constantino, N., Wilson, H., Datta, S., Oppenheim, A. (2005) "Recombineering: Genetic Engineering in Bacteria Using Homologous Recombination", sections 1.16.1-1.16.21. In F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Klingston, D. D. Moore, J. G. Deidman, J. A. Smith, and K. Struhl (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons Inc., New York.
Underwood, S.A., Buszko, M.L., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (2004) "Lack of protective osmolytes limits final cell density and volumetric productivity of ethanologenic Escherichia coli KO11 during xylose fermentation" Appl . Environ . Microbiol . 70(5): 2734-40.
Underwood, S.A., Buszko, M.L., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (2002) "Genetic changes to optimize carbon partitioning between ethanol and biosynthesis in ethanologenic Escherichia coli" Appl Environ Microbiol . 68(12): 6263-6272.
Unden, G. and Kleefeld, A.(2004년 6월 30일), posting date. Chapter 3.4.5, C4-Dicarboxylate Degradation in Aerobic and Anaerobic Growth. In A. Bock, R. Curtiss III, J. B. Kaper, F. C. Neidhardt, T. Nystrom, K. E. Rudd, and C. L. Squires (ed.), EcoSal-Escherichia coli 및 Salmonella: cellular and molecular biology. [Online.] http://www.ecosal.org. ASM Press, Washington, D.C.
van der Werf, M. J., M. V. Guettler, M. K. Jain, 및 J. G. Zeikus (1997) "Environmental and physiological factors affecting the succinate product ratio during carbohydrate fermentation by Actinobacillus sp . 130Z" Arch . Microbiol. 167:332-342.
Vemuri, G.N., Eiteman, M.A., Altman, E. (2002a) "Effects of growth mode and pyruvate carboxylase on succinic acid production by metabolically engineered strains of Escherichia coli ." Appl . Environ . Microbiol . 68:1715-1727.
Vemuri, G.N., Eiteman, M.A., Altman, E. (2002b) "Succinate production in dual-phase Escherichia coli fermentations depends on the time of transition from aerobic to anaerobic conditions" J. Ind . Microbiol . Biotechnol. 28, 325-332.
Wang, Q., Chen, X., Yang, Y., Zhao, X. (2006) "Genome-scale in silico aided metabolic analysis and flux comparisons of Escherichia coli to improve succinate production" Appl Microbiol Biotechnol 73:887-894.
Wendisch, V.F., Bott, M., Eikmanns, B.J. (2006) "Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic acids and amino acids" Curr Opin Microbiol 9:1-7.
Wood, B.E., Yomano, L.P., York, S.W., Ingram, L.O. (2005) "Development of industrial medium required elimination of the 2,3-butanediol fermentation pathway to maintain ethanol yield in an ethanologenic strain of Klebsiella oxytoca" Biotechnol . Prog . 21:1366-1372.
Wright, J.A. 및 Sanwal, B.D. (1969) "Regulatory mechanisms involving nicotinamide adenine nucleotide as allosteric effectors: Control of phosphoenolpyruvate carboxykinase" J Biol Chem . 244(7):1838-1845.
Yun, N.R., San, K.Y., Bennett, G.N. (2005) "Enhancement of lactate and succinate formation in adhE or pta - ackA mutants of NADH dehydrogenase-deficient Escherichia coli" J. Appl . Microbiol . 99:1404-1412.
Zhang, X., Jantama, K., Moore, J.C., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (2007) "Production of L-alanine by metabolically engineered Escherichia coli" Appl. Microbiol . Biotechnol . 77: 355-366.
Zhou, S., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (2003) "Functional replacement of the Escherichia coli D-(-)-lactate dehydrogenase gene (ldhA) with the L-(+)-lactate dehydrogenase gene (ldhL) from Pediococcus acidilactici" Appl . Environ. Microbiol . 69:2237-2244.
Zhou, S., Grabar, T.B., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (2006) "Betaine tripled the volumetric productivity of D-(-)-lactate by Escherichia coli strain SZ132 in mineral salts medium" Biotechnol . Lett . 28:671-676.
SEQUENCE LISTING <110> University of Florida Research Foundation, Inc. Jantama, Kaemwich Haupt, Mark John Zhang, Xueli Moore, Jonathan C. Shanmugam, Keelnatham T. Ingram, Lonnie O'Neal <120> Materials and Methods for Efficient Succinate and Malate Production <130> UF-550XC1 PCT <150> US 60/895,806 <151> 2007-03-20 <160> 77 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> translational stop sequence <400> 1 gcctaattaa ttaatccc 18 <210> 2 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ldhA <400> 2 atgaactcgc cgttttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacgtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 3 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ldhA <400> 3 ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgctcatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 4 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for adhE <400> 4 atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for adhE <400> 5 ttaagcggat tttttcgctt ttttctcagc tttagccgga gcagccatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 6 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ackA <400> 6 atgtcgagta agttagtact ggttctgaac tgcggtagtt cttcagtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 7 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ackA <400> 7 tcaggcagtc aggcggctcg cgtcttgcgc gataaccagt tcttccatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 8 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for focA-plfB <400> 8 ttactccgta tttgcataaa aaccatgcga gttacgggcc tataagtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 9 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for focA-plfB <400> 9 atagattgag tgaaggtacg agtaataacg tcctgctgct gttctcatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for JMcatsacB <400> 10 ttagctagca tgtgacggaa gatcacttcg 30 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for JMcatsacB <400> 11 ccgctagcat caaagggaaa actgtccata t 31 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for cat-up2/sacB-down2 <400> 12 agagaggata tctgtgacgg aagatcactt cg 32 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for cat-up2/sacB-down2 <400> 13 agagaggata tcgaattgat ccggtggatg ac 32 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for mgsA-up/down <400> 14 cagctcatca accaggtcaa 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for mgsA-up/down <400> 15 aaaagccgtc acgttattgg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for mgsA-1/2 <400> 16 agcgttatct cgcggaccgt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for mgsA-1/2 <400> 17 aagtgcgagt cgtcagttcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for poxB-up/down <400> 18 aagcaataac gttccggttg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for poxB-up/down <400> 19 ccactttatc cagcggtagc 20 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for poxB-1/2 <400> 20 gacgcggtga tgaagtgat 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for poxB-1/2 <400> 21 tttggcgata taagctgcaa 20 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for pck-F/R <400> 22 ttggctaagg agcagtgaaa tgcgcgtta 29 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for pck-F/R <400> 23 cacgacaaaa gaagggtaaa taaac 25 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for pck-2/3 <400> 24 ttgttaacgc gcatttcact 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for pck-2/3 <400> 25 gcgatagcgg ctactgtcat 20 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for pck (RT-PCR) <400> 26 gacgatacca ctcgcgat 18 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for pck (RT-PCR) <400> 27 gtcgacaacg aacagacgt 19 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for birA (RT-PCR) <400> 28 atcgtgatgg cggaagt 17 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for birA (RT-PCR) <400> 29 cttgcgatcc tgcagatag 19 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for JM4161 sense/comp <400> 30 accgcatcag gcgcctaatt aattaatccc gg 32 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for JM4161 sense/comp <400> 31 ccgggattaa ttaattaggc gcctgatgcg gt 32 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for JMpEL04F1/R1 <400> 32 cagcagatct aagtaaatcg cgcgggtttg 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for JMpEL04F1/R1 <400> 33 cagcagatct agcggctatt taacgaccct 30 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for JMackA-F1/R1 <400> 34 gcctgaaggc ctaagtagta 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for JMackA-F1/R1 <400> 35 gcacgatagt cgtagtctga 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Primer set for JMackA up1/down1 <400> 36 gttgagcgct tcgctgtgag 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for JMackA up1/down1 <400> 37 gccgcaatgg ttcgtgaact 20 <210> 38 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for JMcatsacB up3/down3 <400> 38 ctcacctcga gtgtgacgga agatcacttc g 31 <210> 39 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for JmcatsacB up3/down3 <400> 39 gtgcaggatc catcaaaggg aaaactgtcc atat 34 <210> 40 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for SfPBXPS sense/comp <400> 40 atgtaggcgc cattaattaa tggatccact atctcgagat taattaatcc cgggactat 59 <210> 41 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for SfPBXPS sense/comp <400> 41 atagtcccgg gattaattaa tctcgagata gtggatccat taattaatgg cgcctacat 59 <210> 42 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for WMadhE A/C <400> 42 atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtcggca cgtaagaggt 60 tccaa 65 <210> 43 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for WMadhE A/C <400> 43 ttaagcggat tttttcgctt ttttctcagc tttagccgga gcagcacact gcttccggta 60 gtcaa 65 <210> 44 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for WMldhA A/C <400> 44 atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacggcac gtaagaggtt 60 ccaa 64 <210> 45 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for WMldhA A/C <400> 45 ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgctacact gcttccggta 60 gtcaa 65 <210> 46 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for WMpflB A/C <400> 46 ttactccgta tttgcataaa aaccatgcga gttacgggcc tataacggca cgtaagaggt 60 tccaa 65 <210> 47 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for WMpflB A/C <400> 47 ttacatagat tgagtgaagg tacgagtaat aacgtcctgc tgctgttcta cactgcttcc 60 ggtagtcaa 69 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for tdcDE-up/down <400> 48 cgccgacaga gtaataggtt 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for tdcDE-up/down <400> 49 tgatgagcta cctggtatgg 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for tdcDE-F7/R7 <400> 50 cgatgcggtg gccaattaag 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for tdcDE-F7/R7 <400> 51 gacgacgtgc tggattacga 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for citF-up2/down2 <400> 52 gggtattcag gcgttcgata 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for citF-up2/down2 <400> 53 gcccgagagg atgactatgt 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for citF-2/3 <400> 54 ggtgatcgat gttgtgcatc 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for citF-2/3 <400> 55 cccgttcttg tcgttgagat 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for IO-adhE-up/down <400> 56 gctgctccgg ctaaagctga 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for IO-adhE-up/down <400> 57 acgctctacg agtgcgttaa 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for up-focA/Mid-pflB <400> 58 agatcgccag ccgctgcaat 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for up-focA/Mid-pflB <400> 59 aaccgttggt gtccagacag 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for IO-ycaO-up/IO-midpflB-down <400> 60 gcctacattg cgtaggctat 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for IO-ycaO-up/IO-midpflB-down <400> 61 gcagcaggac gttattactc 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ldhA-A/C <400> 62 atgaaactcg ccgtttatag 20 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ldhA-A/C <400> 63 ttaaaccagt tcgttgccc 19 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for IO/ldhA-up/down <400> 64 cgttcgatcc gtatccaagt 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for IO-ldhA-up/down <400> 65 aggctggaac tcggactact 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for aspC-up/down <400> 66 tccatcgctt acaccaaatc 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for aspC-up/down <400> 67 tgggggatga cgtgatattt 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for aspC-1/2 <400> 68 agataacatg gctccgctgt 20 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for aspC-1/2 <400> 69 aggagcggcg gtaatgttc 19 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for sfcA-up/down <400> 70 ctatgcttga tcggcaacct 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for sfcA-up/down <400> 71 acgatcgcct ggttttaatg 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for sfcA-1/2 <400> 72 taccgccgta cctccatcta 20 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for sfcA-1/2 <400> 73 cgtaagggat ataaagcgaa cg 22 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ackA-up/pta-down <400> 74 cgggacaacg ttcaaaacat 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ackA-up/pta-down <400> 75 attgcccatc ttcttgttgg 20 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ackA-2/pta-2 <400> 76 aactaccgca gttcagaacc a 21 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer set for ackA-2/pta-2 <400> 77 tctgaacacc ggtaacacca 20

Claims (55)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 유전적으로 변형된 박테리아 세포에 있어서, 상기 박테리아 세포는 200 mM 이상의 숙신산을 제조하고, 포스포에놀피루베이트 카복시키나아제(pck)를 과발현하고, (a) ldhA; (b) ack; (c) adhE; 및 (d) focA-pflB 목표 유전자의 유전자 변형을 포함하며, 이때 상기 유전자 변형은 상기 목표 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 poxB, pta, tdcD, tdcE, mdh, sdh, iclR, icl, pdh, sfcA, aspC, aceAB, 및 citDEF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 유전자 변형을 더 포함하며, 이때 하나 이상의 유전자 변형은 상기 하나 이상의 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  31. 제 29 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 poxB의 유전자 변형을 더 포함하고, 상기 유전자 변형은 poxB에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  32. 제 29 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 (a) poxB; (b) tdcD; 및 (c) tdcE의 유전자 변형을 더 포함하며, 이때 상기 유전자 변형은 poxB, tdcD, 및 tdcE에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  33. 제 29 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 (a) poxB; 및 (b) sfcA의 유전자 변형을 더 포함하고, 이때 상기 유전자 변형은 poxB, 및 sfcA에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  34. 제 29 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 (a) poxB; (b) sfcA; (c) tdcD; 및 (d) tdcE의 유전자 변형을 더 포함하고, 이때 상기 유전자 변형은 poxB, sfcA, tdcD, 및 tdcE에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  35. 제 29 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 (a) tdcD; (b) tdcE; (c) aspC; (d) sfcA; (e) poxB; (f) citF; 및 (g) pta의 유전자 변형을 더 포함하고, 이때 상기 유전자 변형은 tdcD, tdcE, aspC, sfcA, poxB, citF, 및 pta에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  36. 제 29 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 대장균, 글루코노박터 옥시단, 글루코노박터 아사이, 아크로모박터 델마베, 아크로모박터 비스코서스, 아크로모박터 락티쿰, 아그로박테리움 튜메파시엔, 아그로박테리움 라디오박터, 알칼리진 패칼리스, 아스로박터 시트레우스, 아스로박터 투메센, 아스로박터 파라피네우스, 아스로박터 하이드록시카보글루타미쿠스, 아스로박터 옥시단, 오레오박테리움 사페르데, 아조토박터 인디쿠스, 브레비박테리움 암모니아진, 브레비박테리움 디바리카툼, 브레비박테리움 락토퍼멘툼, 브레비박테리움 플라붐, 브레비박테리움 글로보숨, 브레비박테리움 푸스쿰, 브레비박테리움 케토글구타미쿰, 브레비박테리움 헬코룸, 브레비박테리움 푸실룸, 브레비박테리움 테스타세움, 브레비박테리움 로세움, 브레비박테리움 이마리오필리움, 브레비박테리움 리넨, 브레비박테리움 프로토파르미에, 코리네박테리움 아세토필룸, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 칼루네, 코리네박테리움 아세토애시도필룸, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 엔테로박터 애로진, 에르위니아 아밀로보라, 에르위니아 카로토보라, 에르위니아 허비콜라, 에르위니아 크리샌세미, 플라보박테리움 페레그리눔, 플라보박테리움 푸카툼, 플라보박테리움 아우란티눔, 플라보박테리움 레나눔, 플라보박테리움 세와넨스, 플라보박테리움 브레브, 플라보박테리움 메닝고셉티쿰, 마이크로코쿠스 종. CCM825, 모르가넬라 모르가니, 노카디아 오파카, 노카디아 루고사, 플라노코쿠스 에우시나투스, 프로테우스 레트게리, 프로피오니박테리움 스헤르만니이, 슈도모나스 신산타, 슈도모나스 아조토포만, 슈도모나스 플루오레센, 슈도모나스 오발리스, 슈도모나스 스투체리, 슈도모나스 애시도보란, 슈도모나스 무시돌렌, 슈도모나스 테스토스테로니, 슈도모나스 에루지노사, 로도코쿠스 에리스로폴리스, 로도코쿠스 로도크로스, 로도코쿠스 종. ATCC 15592, 로도코쿠스 종. ATCC 19070, 스포로사시나 우레아, 스타필로코쿠스 아우레우스, 비브리오 메치니코비, 비브리오 티로진, 액티노마두라 마두레, 액티노마이스 비올라세오크로모진, 기타사토스포리아 파루로사, 스트렙토마이스 코엘리컬러, 스트렙토마이스 플라벨루스, 스트렙토마이스 그리세올루스, 스트렙토마이스 리비단, 스트렙토마이스 올리바세우스, 스트렙토마이스 타나시엔시스, 스트렙토마이스 버지니아, 스트렙토마이스 안티바이오티쿠스, 스트렙토마이스 카카오이, 스트렙토마이스 라벤둘레, 스트렙토마이스 비리도크로모진, 애로모나스 살모니시다, 바실루스 푸밀루스, 바실루스 서큘란, 바실루스 티아미노리티쿠스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 아밀로리퀴파시엔, 바실루스 코아굴란스 에스케리키아 푸룬디, 마이크로박테리움 암모니아필룸, 세라티아 마르세스센, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 스코트물레리 또는 크산토모나스 시트리인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  37. 제 29 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  38. 제 29 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 임의의 외래 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  39. 제 29 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 250 mM 이상의 숙신산을 제조하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  40. 제 29 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 mgsA의 유전자 변형을 더 포함하고, 상기 유전자 변형은 상기 목표 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  41. 제 40 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 poxB, pta, tdcD, tdcE, mdh, sdh, iclR, icl, pdh, sfcA, aspC, aceAB, 및 citDEF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 유전자 변형을 더 포함하며, 이때 하나 이상의 유전자 변형은 상기 하나 이상의 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  42. 제 40 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 poxB의 유전자 변형을 더 포함하고, 상기 유전자 변형은 poxB에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  43. 제 40 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 (a) poxB; (b) tdcD; 및 (c) tdcE의 유전자 변형을 더 포함하며, 이때 상기 유전자 변형은 poxB, tdcD, 및 tdcE에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  44. 제 40 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 (a) poxB; 및 (b) sfcA의 유전자 변형을 더 포함하고, 이때 상기 유전자 변형은 poxB, 및 sfcA에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  45. 제 40 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 (a) poxB; (b) sfcA; (c) tdcD; 및 (d) tdcE의 유전자 변형을 더 포함하고, 이때 상기 유전자 변형은 poxB, sfcA, tdcD, 및 tdcE에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  46. 제 40 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 (a) tdcD; (b) tdcE; (c) aspC; (d) sfcA; (e) poxB; (f) citF; 및 (g) pta의 유전자 변형을 더 포함하고, 이때 상기 유전자 변형은 tdcD, tdcE, aspC, sfcA, poxB, citF, 및 pta에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 효소 활성을 비활성화시키는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  47. 제 40 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 대장균, 글루코노박터 옥시단, 글루코노박터 아사이, 아크로모박터 델마베, 아크로모박터 비스코서스, 아크로모박터 락티쿰, 아그로박테리움 튜메파시엔, 아그로박테리움 라디오박터, 알칼리진 패칼리스, 아스로박터 시트레우스, 아스로박터 투메센, 아스로박터 파라피네우스, 아스로박터 하이드록시카보글루타미쿠스, 아스로박터 옥시단, 오레오박테리움 사페르데, 아조토박터 인디쿠스, 브레비박테리움 암모니아진, 브레비박테리움 디바리카툼, 브레비박테리움 락토퍼멘툼, 브레비박테리움 플라붐, 브레비박테리움 글로보숨, 브레비박테리움 푸스쿰, 브레비박테리움 케토글구타미쿰, 브레비박테리움 헬코룸, 브레비박테리움 푸실룸, 브레비박테리움 테스타세움, 브레비박테리움 로세움, 브레비박테리움 이마리오필리움, 브레비박테리움 리넨, 브레비박테리움 프로토파르미에, 코리네박테리움 아세토필룸, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 칼루네, 코리네박테리움 아세토애시도필룸, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 엔테로박터 애로진, 에르위니아 아밀로보라, 에르위니아 카로토보라, 에르위니아 허비콜라, 에르위니아 크리샌세미, 플라보박테리움 페레그리눔, 플라보박테리움 푸카툼, 플라보박테리움 아우란티눔, 플라보박테리움 레나눔, 플라보박테리움 세와넨스, 플라보박테리움 브레브, 플라보박테리움 메닝고셉티쿰, 마이크로코쿠스 종. CCM825, 모르가넬라 모르가니, 노카디아 오파카, 노카디아 루고사, 플라노코쿠스 에우시나투스, 프로테우스 레트게리, 프로피오니박테리움 스헤르만니이, 슈도모나스 신산타, 슈도모나스 아조토포만, 슈도모나스 플루오레센, 슈도모나스 오발리스, 슈도모나스 스투체리, 슈도모나스 애시도보란, 슈도모나스 무시돌렌, 슈도모나스 테스토스테로니, 슈도모나스 에루지노사, 로도코쿠스 에리스로폴리스, 로도코쿠스 로도크로스, 로도코쿠스 종. ATCC 15592, 로도코쿠스 종. ATCC 19070, 스포로사시나 우레아, 스타필로코쿠스 아우레우스, 비브리오 메치니코비, 비브리오 티로진, 액티노마두라 마두레, 액티노마이스 비올라세오크로모진, 기타사토스포리아 파루로사, 스트렙토마이스 코엘리컬러, 스트렙토마이스 플라벨루스, 스트렙토마이스 그리세올루스, 스트렙토마이스 리비단, 스트렙토마이스 올리바세우스, 스트렙토마이스 타나시엔시스, 스트렙토마이스 버지니아, 스트렙토마이스 안티바이오티쿠스, 스트렙토마이스 카카오이, 스트렙토마이스 라벤둘레, 스트렙토마이스 비리도크로모진, 애로모나스 살모니시다, 바실루스 푸밀루스, 바실루스 서큘란, 바실루스 티아미노리티쿠스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 아밀로리퀴파시엔, 바실루스 코아굴란스, 에스케리키아 푸룬디, 마이크로박테리움 암모니아필룸, 세라티아 마르세스센, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 스코트물레리 또는 크산토모나스 시트리인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  48. 제 40 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  49. 제 40 항에 있어서,
    상기 박테리아 세포는 임의의 외인성 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 세포.
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 배양 또는 성장시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 제29항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 배양 배지에 접종하는 단계, 및 상기 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 배양 또는 성장시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 배양 또는 성장시키는 방법.
  54. 숙시네이트 또는 말레이트의 제조를 가능케하는 조건 하에서 제29항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 배양 배지 중에 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙시네이트 또는 말레이트를 제조하는 방법.
  55. 제29항 내지 제49 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 유전적으로 변형된 박테리아 균주 및 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020097021920A 2007-03-20 2008-03-19 유효한 숙시네이트 및 말레이트 제조를 위한 물질 및 방법 Expired - Fee Related KR101631719B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89580607P 2007-03-20 2007-03-20
US60/895,806 2007-03-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100015743A KR20100015743A (ko) 2010-02-12
KR101631719B1 true KR101631719B1 (ko) 2016-06-24

Family

ID=39766740

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097021920A Expired - Fee Related KR101631719B1 (ko) 2007-03-20 2008-03-19 유효한 숙시네이트 및 말레이트 제조를 위한 물질 및 방법

Country Status (12)

Country Link
US (1) US8691539B2 (ko)
EP (2) EP2570481B1 (ko)
JP (2) JP5546871B2 (ko)
KR (1) KR101631719B1 (ko)
CN (2) CN101688196B (ko)
AU (1) AU2008228948B2 (ko)
BR (1) BRPI0809400B1 (ko)
CA (1) CA2688938C (ko)
ES (2) ES2527402T3 (ko)
MX (1) MX2009010154A (ko)
MY (1) MY160694A (ko)
WO (1) WO2008115958A2 (ko)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004044210A2 (en) 2002-11-06 2004-05-27 University Of Florida Materials and methods for the efficient production of acetate and other products
EP2137315B1 (en) 2007-03-16 2014-09-03 Genomatica, Inc. Compositions and methods for the biosynthesis of 1,4-butanediol and its precursors
WO2010115067A2 (en) * 2009-04-02 2010-10-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. Engineering the pathway for succinate production
US7947483B2 (en) * 2007-08-10 2011-05-24 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol
EP3514242A3 (en) 2008-09-10 2019-08-28 Genomatica, Inc. Microrganisms for the production of 1,4-butanediol
US8691552B2 (en) * 2008-10-28 2014-04-08 William Marsh Rice University Microaerobic cultures for converting glycerol to chemicals
WO2010059616A2 (en) 2008-11-18 2010-05-27 University Of Florida Research Foundation, Inc. Biocatalysts and methods for conversion of hemicellulose hydrolsates to biobased products
EP3345997A1 (en) 2009-02-16 2018-07-11 Basf Se Novel microbial succinic acid producers and purification of succinic acid
CA2764368C (en) * 2009-06-04 2017-08-01 Genomatica, Inc. Process of separating components of a fermentation broth
US8129169B2 (en) 2009-06-04 2012-03-06 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol and related methods
US8377666B2 (en) * 2009-10-13 2013-02-19 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol, 4-hydroxybutanal, 4-hydroxybutyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto
US8778656B2 (en) 2009-11-18 2014-07-15 Myriant Corporation Organic acid production in microorganisms by combined reductive and oxidative tricaboxylic acid cylce pathways
KR20120099258A (ko) * 2009-11-18 2012-09-07 미리안트 코포레이션 화합물들의 효과적인 생산을 위한 미생물 엔지니어링
US10017793B2 (en) 2009-11-18 2018-07-10 Myriant Corporation Metabolic evolution of Escherichia coli strains that produce organic acids
JP5939986B2 (ja) 2009-11-18 2016-06-29 ミリアント・コーポレイションＭｙｒｉａｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 有機酸を生産する大腸菌株の代謝的進化
WO2011066076A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the coproduction of 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
CN102781900A (zh) 2009-12-31 2012-11-14 麦兰特公司 从含有琥珀酸铵的发酵液纯化琥珀酸
US8048661B2 (en) 2010-02-23 2011-11-01 Genomatica, Inc. Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes
US8445244B2 (en) 2010-02-23 2013-05-21 Genomatica, Inc. Methods for increasing product yields
US9187772B2 (en) * 2010-09-01 2015-11-17 University Of Florida Research Foundation, Inc. L-malate production by metabolically engineered escherichia coli
US9845513B2 (en) 2010-12-13 2017-12-19 Myriant Corporation Method of producing succinic acid and other chemicals using sucrose-containing feedstock
EP2668281A4 (en) 2011-01-25 2015-08-26 Cargill Inc COMPOSITIONS AND METHODS OF SUCCINATE MANUFACTURE
WO2012103263A2 (en) * 2011-01-25 2012-08-02 Finley Kenneth R Compositions and methods for malate and fumarate production
US9169486B2 (en) 2011-06-22 2015-10-27 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing butadiene and methods related thereto
WO2013009679A2 (en) 2011-07-08 2013-01-17 University Of Florida Research Foundation, Inc. Over-expression of a putative oxidoreductase (ucpa) for increasing furfural or 5-hydroxymethylfurfural tolerance
AU2011373671B2 (en) 2011-07-22 2016-04-28 Ptt Global Chemical Public Company Limited Fermentation of glycerol to organic acids
CN102311943A (zh) * 2011-09-07 2012-01-11 天津工业生物技术研究所 苹果酸酶突变体及其应用
CN111705028A (zh) 2012-06-04 2020-09-25 基因组股份公司 制造4-羟基丁酸酯、1，4-丁二醇和相关化合物的微生物和方法
BR112015001601A2 (pt) 2012-07-25 2017-11-07 Bioamber Sas células de levedura tendo curso de tca redutor de piruvato em succinato e superexpressão de uma enzima transidrogenase nad(p)+ exógena
JP6649551B2 (ja) 2013-07-23 2020-02-19 ピーティーティー グローバル ケミカル パブリック カンパニー リミテッド 糖の取り込みのための促進拡散を用いるコハク酸および他の化合物の生産方法
CN105658807A (zh) * 2013-08-05 2016-06-08 绿光生物科技股份有限公司 具有蛋白酶切割位点的工程化蛋白
CN105705647B (zh) 2013-09-03 2020-03-27 Ptt全球化学公众有限公司 从1，3-丙二醇制造丙烯酸、丙烯腈和1，4-丁二醇的方法
TW201538477A (zh) 2013-12-06 2015-10-16 Myriant Corp 製備丁二酸酯之方法
KR101828551B1 (ko) * 2016-01-11 2018-02-13 한국과학기술원 말론산 생성능을 가지는 재조합 변이미생물 및 이를 이용한 말론산의 제조방법
WO2019006312A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Myriant Corporation MICROORGANISM HAVING A NUMBER OF STABILIZED COPIES OF A FUNCTIONAL DNA SEQUENCE AND ASSOCIATED METHODS
CN108795956B (zh) * 2018-05-04 2021-04-23 华南农业大学 GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用
CN111073864B (zh) * 2018-10-19 2022-06-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 提高苹果酸产量的新突变蛋白
CN110951660B (zh) 2019-12-19 2021-12-03 江南大学 一株固定co2产苹果酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用
CN111876360B (zh) * 2020-08-10 2022-02-25 青岛农业大学 一株氧化葡糖酸醋杆菌及其应用
CN112280725B (zh) * 2020-10-29 2022-08-30 江南大学 一种高效生产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法
CN112940964B (zh) * 2021-01-29 2023-05-09 西南大学 一种喀斯特槽谷区石漠化土壤改良微生物菌剂及其制备与应用
JP2024543418A (ja) * 2021-11-24 2024-11-21 ティエンジン インスティテュート オブ インダストリアル バイオテクノロジー， チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシーズ コハク酸の効率的な生産のための耐酸性酵母株、その構築方法およびその使用
CN115851511B (zh) * 2022-10-17 2023-10-03 杭州欧合生物科技有限公司 一种产琥珀酸的大肠杆菌及其构建方法和应用
CN116103213A (zh) * 2023-01-31 2023-05-12 江南大学 一种代谢工程改造大肠杆菌生产富马酸的方法
CN118546852B (zh) * 2024-07-30 2024-10-18 北京化工大学 一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004043881A2 (en) * 2001-03-30 2004-05-27 Ut-Battelle, Llc A method to produce succinic acid from raw hydrolysates
US7145058B2 (en) 2002-03-27 2006-12-05 Council Of Scientific And Industrial Research Efficient method of preventing growth of microbial genetic transformant after transformation
US20070037265A1 (en) * 2005-08-10 2007-02-15 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for efficient lactic acid production

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US585278A (en) * 1897-06-29 Hub-securing device
US5143834A (en) 1986-06-11 1992-09-01 Glassner David A Process for the production and purification of succinic acid
WO1993018144A1 (en) * 1992-03-05 1993-09-16 The Trustees Of Columbia University Of The City Of New York Recombination activating gene deficient animal
SE9302119L (sv) 1993-06-18 1994-05-09 Johansson Ab C E Maskinstativ innefattande en portal jämte sätt att bestämma geometrin hos portalen vid maskinstativets deformation
US5504004A (en) 1994-12-20 1996-04-02 Michigan Biotechnology Institute Process for making succinic acid, microorganisms for use in the process and methods of obtaining the microorganisms
US5573931A (en) 1995-08-28 1996-11-12 Michigan Biotechnology Institute Method for making succinic acid, bacterial variants for use in the process, and methods for obtaining variants
US5869301A (en) 1995-11-02 1999-02-09 Lockhead Martin Energy Research Corporation Method for the production of dicarboxylic acids
US6159738A (en) 1998-04-28 2000-12-12 University Of Chicago Method for construction of bacterial strains with increased succinic acid production
US6607885B1 (en) 1999-10-15 2003-08-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for high-density microarray medicated gene expression profiling
US6911329B2 (en) * 2000-09-23 2005-06-28 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using coryneform bacteria
WO2004044210A2 (en) 2002-11-06 2004-05-27 University Of Florida Materials and methods for the efficient production of acetate and other products
US7244610B2 (en) 2003-11-14 2007-07-17 Rice University Aerobic succinate production in bacteria
FR2864967B1 (fr) 2004-01-12 2006-05-19 Metabolic Explorer Sa Microorganisme evolue pour la production de 1,2-propanediol
US7098009B2 (en) 2004-03-04 2006-08-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Production of chemicals from lignocellulose, biomass or sugars
JP4771437B2 (ja) 2004-08-27 2011-09-14 ライス ユニバーシティー 増加したコハク酸産生を有する変異Ｅ．ｃｏｌｉ株
US20070072280A1 (en) 2005-09-19 2007-03-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for the efficient production of xylitol
WO2008119009A2 (en) 2007-03-27 2008-10-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for efficient alanine production
KR101103839B1 (ko) 2007-07-12 2012-01-06 한국과학기술원 순수 숙신산 생성 변이균주 및 이를 이용한 숙신산제조방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004043881A2 (en) * 2001-03-30 2004-05-27 Ut-Battelle, Llc A method to produce succinic acid from raw hydrolysates
US7145058B2 (en) 2002-03-27 2006-12-05 Council Of Scientific And Industrial Research Efficient method of preventing growth of microbial genetic transformant after transformation
US20070037265A1 (en) * 2005-08-10 2007-02-15 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for efficient lactic acid production

Also Published As

Publication number Publication date
ES2389582T3 (es) 2012-10-29
JP2014050387A (ja) 2014-03-20
ES2527402T3 (es) 2015-01-23
WO2008115958A3 (en) 2009-02-19
CN104694449A (zh) 2015-06-10
EP2121915A2 (en) 2009-11-25
WO2008115958A2 (en) 2008-09-25
US8691539B2 (en) 2014-04-08
US20100184171A1 (en) 2010-07-22
EP2121915A4 (en) 2010-05-05
MX2009010154A (es) 2009-10-12
HK1137485A1 (en) 2010-07-30
KR20100015743A (ko) 2010-02-12
HK1211318A1 (en) 2016-05-20
AU2008228948A1 (en) 2008-09-25
CN104694449B (zh) 2018-05-22
AU2008228948B2 (en) 2014-04-24
WO2008115958A4 (en) 2009-04-09
MY160694A (en) 2017-03-15
CA2688938A1 (en) 2008-09-25
EP2121915B1 (en) 2012-08-08
CA2688938C (en) 2018-01-16
CN101688196B (zh) 2015-01-07
JP2010531635A (ja) 2010-09-30
JP5836342B2 (ja) 2015-12-24
EP2570481A1 (en) 2013-03-20
JP5546871B2 (ja) 2014-07-09
BRPI0809400A2 (pt) 2014-09-09
CN101688196A (zh) 2010-03-31
BRPI0809400B1 (pt) 2018-12-04
EP2570481B1 (en) 2014-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101631719B1 (ko) 유효한 숙시네이트 및 말레이트 제조를 위한 물질 및 방법
US10287611B2 (en) Engineering the pathway for succinate production
Jantama et al. Combining metabolic engineering and metabolic evolution to develop nonrecombinant strains of Escherichia coli C that produce succinate and malate
US8778656B2 (en) Organic acid production in microorganisms by combined reductive and oxidative tricaboxylic acid cylce pathways
HK1211318B (en) Materials and methods for efficient succinate and malate production
HK1137485B (en) Materials and methods for efficient succinate and malate production

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20091020

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20130308

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20140926

Patent event code: PE09021S01D

E90F Notification of reason for final refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Final Notice of Reason for Refusal

Patent event date: 20150622

Patent event code: PE09021S02D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20160324

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20160613

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20160613

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190515

Year of fee payment: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20190515

Start annual number: 4

End annual number: 4

PC1903 Unpaid annual fee

Termination category: Default of registration fee

Termination date: 20210324