CN104694449B - 用于有效生产琥珀酸和苹果酸的材料和方法 - Google Patents

Abstract

为了在pH受控的分批发酵中在矿物盐培养基中生产琥珀酸和苹果酸，构建了经遗传改造的微生物，但不添加质粒或外源基因。本发明还提供了生产琥珀酸和苹果酸的方法，包括培养经遗传修饰的微生物。

Description

用于有效生产琥珀酸和苹果酸的材料和方法

本申请为2008年3月19日提交的，发明名称为“用于有效生产琥珀酸和苹果酸的材料和方法”的PCT申请PCT/US2008/057439的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2009年9月18日，申请号为200880008975.1。

与相关申请交叉参考

本申请主张2007年3月20日提交的美国临时申请系列号No.60/895,806的权益，其公开内容通过整体引用作为参考，包括所有的图、表格和氨基酸或核酸序列。

政府支持

根据授权号USDOE-DE FG02-96ER20222下由能源部(Department of Energy)授权的，和授权号USDA&DOE Biomass RDI DE FG36-04GO14019下由能源部与美国农业部(United States Department of Agriculture)联合授权的政府支持，完成了本发明。政府对本发明具有某些权利。

发明背景

随着石油价格的提高，从可更新的原料发酵生产琥珀酸会越来越有竞争力。琥珀酸可作为底物用于转化成塑料、溶剂和目前由石油制成的其他化学品(Lee等，2004；Lee等，2005；McKinlay等，2007；Wendisch等，2006；Zeikus等，1999)。许多细菌被描述为具有生产琥珀酸作为主要发酵产物的天然能力(美国专利号No.5,723,322；表1)。然而，通常需要复杂的工艺、复杂的培养基和长久的孵育时间。

先前已使用多种遗传手段改造大肠杆菌菌株(Escherichia coli)用于生产琥珀酸，并取得了不同程度的成功(表1)。在大部分研究中，达到的滴度较低，并且需要复杂的培养基成分例如酵母提取物或玉米浆。菌株NZN111以每摩尔被代谢的葡萄糖0.98摩尔琥珀酸的摩尔产率生产108mM琥珀酸(Chatterjee等，2001；Millard等，1996；Stols和Donnelly，1997)。该菌株如下改造得到：使两个基因失活(编码丙酮酸-甲酸裂解酶的pflB和编码乳酸脱氢酶的ldhA)并过表达来自多拷贝质粒的两个大肠杆菌基因：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)和苹果酸脱氢酶(mdh)。菌株HL27659k如下改造得到：突变琥珀酸脱氢酶(sdhAB)、磷酸乙酰转移酶(pta)、乙酸激酶(ackA)、丙酮酸氧化酶(poxB)、葡萄糖转运蛋白(ptsG)和异柠檬酸裂合酶阻抑物(iclR)。该菌株生产少于100mM的琥珀酸并需要氧受限制的发酵条件(Cox等，2006；Lin等，2005a，2005b，2005c；Yun等，2005)。使用在计算机芯片上的代谢分析设计基因敲除，从而在大肠杆菌中创建与Mannheimia succiniciproducens中的天然琥珀酸途径相似的途径(Lee等，2005和2006)。然而得到的菌株生产非常少的琥珀酸。Andersson等，(2007)报道了仅含有天然基因的经改造的大肠杆菌琥珀酸生产的最高水平(339mM)。

其他研究人员从事的是在大肠杆菌中表达异源基因的备选途径。从多拷贝质粒中过表达Rhizobium eteloti丙酮酸羧化酶(pyc)，从而指导碳流向琥珀酸(Gokarn等，2000；Vemuri等，2002a，2002b)。如下构建菌株SBS550MG：使异柠檬酸裂合酶阻抑物(iclR)、adhE、ldhA和ackA失活，并从多拷贝质粒中过表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的citZ(柠檬酸合酶)和R.etli pyc(Sanchez等，2005a)。使用该菌株，以1.6的摩尔产率从葡萄糖生产160mM琥珀酸。

也研究了用于琥珀酸生产的更复杂的工艺(表1)。许多这些工艺包括需氧生长期，之后是厌氧生产期。厌氧期通常用二氧化碳、氢或二者提供(Andersson等，2007；Sanchez等，2005a和2005b；Sanchez等，2006；美国专利号5,869,301；Vemuri等，2002a和2002b)。在使用天然琥珀酸生产者产琥珀酸厌氧螺菌(A.succiniciproducens)的近期研究中，组合了电渗析、CO₂的喷射、细胞再循环和分批补料(Meynial-Salles等，2007)。

本发明提供了在矿物盐培养基中，在简单的、pH-受控的、分批发酵期间，以高滴度和产率生产琥珀酸而不需要异源基因或质粒的多种形式的微生物，例如大肠杆菌菌株。在开发期间，中间体菌株的特征是生产苹果酸作为优势产物。

发明概述

本发明提供了适用于生产乳酸的新微生物，例如大肠杆菌。因此，本发明的材料和方法可被用于生产适用于多种应用的琥珀酸和苹果酸。

在某些实施方案中，大肠杆菌的衍生物(在本文中也称作大肠杆菌)可被用于构建生产琥珀酸、苹果酸和丙氨酸的菌株。在多种实施方案中，大肠杆菌C(例如ATCC 8739)可同大肠杆菌的任何其他菌株一样被使用，所述任何其他大肠杆菌菌株可得自多种保藏单位或商业来源。在一些实施方案中，本发明的经改造的微生物也仅含有天然基因(即不含有来自其他生物的遗传材料)。根据下文的描述会容易地明了本发明的其他优点。

附图概述

图1A-1B.葡萄糖成为琥珀酸的发酵。图1A显示通过大肠杆菌发酵葡萄糖的标准途径。该途径已由Unden和Kleefeld(2004)重新画出。粗体箭头表示中枢发酵途径。十字代表为了改造KJ012在该研究中进行的基因缺失(ldhA，adhE，ackA)。基因和酶：ldhA，乳酸脱氢酶；pflB，丙酮酸-甲酸裂解酶；focA，甲酸转运蛋白；pta，磷酸乙酰基转移酶；ackA，乙酸激酶；adhE，醇脱氢酶；ppc，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；pdh，丙酮酸脱氢酶复合物；gltA，柠檬酸合酶；mdh，苹果酸脱氢酶；fumA，fumB和fumC，延胡索酸酶异构酶；frdABCD，延胡索酸还原酶；fdh，甲酸脱氢酶；icd，异柠檬酸脱氢酶；acs，乙酰基～CoA合成酶；mgsA，甲基乙二醛合酶；poxB，丙酮酸氧化酶；aldA，醛脱氢酶；和aldB，醛脱氢酶。图1B显示经改造的大肠杆菌菌株中，ATP生产和生长与琥珀酸和苹果酸生产的偶合。实线箭头连接NADH池。虚线箭头连接NAD⁺池。在厌氧条件下的糖酵解期间，生长与ATP的生产和NADH的氧化专性偶合。

图2A-2D.大肠杆菌对琥珀酸生产的可能的羧化途径。编码关键性羧化酶的基因以粗体显示。图2A显示PEP羧化酶。磷酸烯醇丙酮酸(PEP)不生产ATP。这被认为是葡萄糖发酵期间大肠杆菌生产琥珀酸的主要途径。

图2B显示苹果酸酶(NADH)。在丙酮酸激酶(pykA或pykF)从ADP和PEP生产ATP期间，能量被保存。苹果酸酶(sfcA)催化NADH-相关的还原性羧化，从而生产苹果酸。图2C显示苹果酸酶(NADPH)。在丙酮酸激酶(pykA或pykF)从ADP和PEP生产ATP期间，能量被保存。苹果酸酶(maeB)催化NADPH-相关的还原性羧化，从而生产苹果酸。图2D显示PEP羧激酶(carboxykinase)。在PEP的羧化期间通过生产ATP保存能量，从而生产草酰乙酸。

图3A-3C.KJ012代谢演化期间产生KJ017、KJ032和KJ060的生长。将菌株KJ012连续地转移进含5％(w/v)(图3A)和10％(w/v)(图3B)葡萄糖的NBS培养基中，分别产生KJ017。缺失focA和pflB后，将得到的菌株(KJ032)最初在补充有乙酸的培养基中继代培养(图3C)。乙酸水平被降低并随后在进一步传递中被消除，以生产KJ060。折线代表无乙酸时KJ017的发酵，添加作为比较。符号：OD_550nm处的光密度●。

图4A-4F.用于生产琥珀酸和苹果酸的菌株的代谢演化期间，发酵产物的概述。如所示用乙酸钠补充培养物。黑色的箭头代表在文本所示发酵条件之间的转换。在KJ032的代谢演化期间未检测到甲酸和仅检测到小量乳酸。在KJ070和KJ072的代谢演化期间未检测到甲酸和乳酸。图4A(5％w/v葡萄糖)和图4B(10％w/v葡萄糖)，KJ012到KJ017；图4C(5％w/v葡萄糖)和图4D(10％w/v葡萄糖)，KJ032到KJ060；图4E，10％葡萄糖，KJ070到KJ071；图4F，10％葡萄糖，KJ072到KJ073。所有图的符号：■，琥珀酸；□，甲酸；Δ，乙酸；▲，苹果酸；◆，乳酸；和丙酮酸。

图5.总结大肠杆菌C的遗传改造和代谢演化中步骤的简图，所述大肠杆菌C作为琥珀酸和苹果酸生产的生物催化剂。该过程代表了261次连续传代，其提供了超过2000个基于生长选择的世代。从每种方案的最终培养物中分离克隆并指定菌株名称，显示于表3中的圆括号内。

图6.葡萄糖的发酵和相关途径。中枢代谢指出在被改造用于生产琥珀酸的构建体中缺失的基因。实线箭头表述中枢发酵途径。虚线箭头表示丙酮酸氧化成为乙酸(poxB)的微需氧途径。点线箭头显示在需氧代谢期间正常发挥作用的途径、丙酮酸脱氢酶(pdh)和乙醛酸支路(aceAB)。带框的十字代表用于构建KJ012和KJ017的三个初始基因缺失(ldhA，adhE，ackA)。简单的十字标记了构建KJ017衍生物期间缺失的额外基因：KJ032(ldhA，adhE，ackA，focA，pflB)，和KJ070(ldhA，adhE，ackA，focA，pflB，mgsA)，和KJ072(ldhA，adhE，ackA，focA，pflB，mgsA，poxB)。基因和酶：ldhA，乳酸脱氢酶；focA，甲酸转运蛋白；pflB，丙酮酸-甲酸裂解酶；pta，磷酸乙酰基转移酶；ackA，乙酸激酶；adhE，醇脱氢酶；ppc，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；pdh，丙酮酸脱氢酶复合物；gltA，柠檬酸合酶；mdh，苹果酸脱氢酶；fumA，fumB和fumC，延胡索酸酶异构酶；frdABCD，延胡索酸还原酶；fdh，甲酸脱氢酶；mgsA，甲基乙二醛合酶；gloAB，乙二醛酶I和II；poxB，丙酮酸氧化酶；aceA，异柠檬酸裂合酶；aceB，苹果酸合酶；acnAB，顺乌头酸酶；和acs，乙酰～CoA合成酶。

图7A-7C.通过大肠杆菌C的衍生物在矿物盐培养基(10％葡萄糖)中生产琥珀酸和苹果酸。图7A显示AM1培养基中由KJ060生产琥珀酸。图7B显示AM1培养基中由KJ073生产琥珀酸。图7C显示在NBS培养基中由KJ071生产苹果酸。发酵以33mg DCW l^-1的水平接种。所有图的符号：○，葡萄糖；●，琥珀酸；■，苹果酸；Δ，细胞量。

图8.pLOI4162的构建。与pEL04和pLOI4152相关联的短实线箭头表示用于DNA扩增的引物。

图9.KJ073中的琥珀酸生产途径。编码该研究中涉及琥珀酸生产的主要羧化酶——磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因以反转形式显示。实线箭头指出期望在葡萄糖的厌氧发酵期间有功能的反应。实线十字指出缺失的基因。带框的十字代表用于构建琥珀酸生产初始菌株KJ017的关键缺失(ldhA，adhE，ackA)。虚线表示PoxB将丙酮酸氧化为乙酸，这是通常仅在微需氧条件下有功能的过程。点线表示主要与需氧代谢相关的反应。基因和酶：ldhA，乳酸脱氢酶；pflB，丙酮酸-甲酸裂解酶；focA，甲酸转运蛋白；pta，磷酸乙酰基转移酶；ackA，乙酸激酶；adhE，醇脱氢酶；ppc，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；pdh，丙酮酸脱氢酶复合物；gltA，柠檬酸合酶；mdh，苹果酸脱氢酶；fumA，fumB，和fumC，延胡索酸酶异构酶；frdABCD，延胡索酸还原酶；fdh，甲酸脱氢酶；icd，异柠檬酸脱氢酶；acs，乙酰～CoA合成酶；mgsA，甲基乙二醛合酶；poxB，丙酮酸氧化酶；aldA，醛脱氢酶；和aldB，醛脱氢酶。tdcE基因(丙酮酸甲酸-裂解酶，与pflB同源)和tcdD基因(丙酸激酶，与ackA同源)在圆括号中显示，并通常在苏氨酸降解期间被表达。

图10.代谢的扩展部分阐述了被缺失的其他基因(实线十字)的途径。琥珀酸和乙酸是来自KJ073发酵的主要产物(带框的)。基因和酶：citDEF，柠檬酸裂解酶；gltA，柠檬酸合酶；aspC，天冬氨酸转氨酶；pck，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；sfcA，NAD+-相关的苹果酸酶；fumA&fumB，延胡索酸酶；frdABCD，延胡索酸还原酶；pykA&pykF，丙酮酸激酶；tdcE，丙酮酸甲酸-裂解酶(pflB的同源物)；pta，磷酸乙酰转移酶；tcdD，乙酸激酶(ackA的同源物)。

发明详述

本发明提供了材料和方法，其中独特和有利的基因突变组合被用于指导碳流向期望的产物，例如琥珀酸和/或苹果酸。本发明的技术可被用于从天然途径以及重组途径获得产物。有利地，本发明提供了仅用矿物盐和糖作为营养物生产这些产物的通用平台。

可通过修饰细菌中的一个或多个靶基因获得本发明的微生物，所述细菌例如属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。在一些实施方案中，被修饰的细菌可以是大肠杆菌，或其具体菌株，例如大肠杆菌B、大肠杆菌C、大肠杆菌W或类似的。在本发明的一些其他实施方案中，可根据本发明被修饰的细菌包括但不仅限于氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)、浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacter asaii)、德尔马瓦无色杆菌(Achromobacterdelmarvae)、粘无色杆菌(Achromobacter viscosus)、乳无色杆菌(Achromobacterlacticum)、根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、柠檬节杆菌(Arthrobactercitreus)、肿胀节杆菌(Arthrobacter tumescens)、石蜡节杆菌(Arthrobacterparaffineus)、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans)、天牛短小杆菌(Aureobacterium saperdae)、印度固氮菌(Azotobacterindicus)、产安短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、divaricatum、Brevibacteriumlactofermentum、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、Brevibacterium globosum、暗褐短杆菌(Brevibacterium fuscum)、酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)、Brevibacterium helcolum、Brevibacterium pusillum、Brevibacterium testaceum、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、Brevibacterium immariophilium、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)、Brevibacterium protopharmiae、嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetophilum)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、菊欧文氏菌(Erwiniachrysanthemi)、Flavobacterium peregrinum、Flavobacterium fucatum、Flavobacteriumaurantinum、莱茵黄杆菌(Flavobacterium rhenanum)、Flavobacterium sewanense、Flavobacterium breve、Flavobacterium meningosepticum、微球菌属物种CCM825、摩氏变形菌(Morganella morganii)、Nocardia opaca、粗糙诺卡氏菌(Nocardia rugosa)、Planococcus eucinatus、雷氏变形菌(Proteus rettgeri)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、成黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、卵状假单胞菌(Pseudomonas ovalis)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、Pseudomonasacidovolans、霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)、睾丸酮假单胞菌(Pseudomonastestosteroni)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、红球菌属物种ATCC 15592、红球菌属物种ATCC 19070、脲芽孢八叠球菌(Sporosarcina ureae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、Vibrio metschnikovii、Vibrio tyrogenes、马杜拉诺卡氏菌(Actinomadura madurae)、Actinomyces violaceochromogenes、Kitasatosporiaparulosa、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、Streptomyces flavelus、浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄色链霉菌(Streptomyces olivaceus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)、抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)、可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、环状芽孢杆菌(bacillus circulans)、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus thiaminolyticus)、弗氏埃希氏菌(Escherichia freundii)、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、Salmonella schottmulleri、柑橘黄单胞菌(Xanthomonascitri)等等。

在某些实施方案中，本发明提供了缺乏质粒、抗生素抗性基因和/或来自其他生物的材料的菌株(例如大肠杆菌)，所述菌株适用于生产琥珀酸或苹果酸。与其他微生物体系不同，本发明的微生物可在使用糖作为底物的单步生产过程中使用，具有高的产物生产率，高产量，简单的营养需求(例如矿物盐培养基)，和允许生物转化己糖、戊糖和许多二糖的强大代谢。

因此，根据本公开生产的微生物可具有通过本领域已知的多种方法失活的一个或多个靶基因。例如，可通过向靶基因中引入插入物、缺失或随机突变，使靶基因失活。因此，本发明的某些方面提供了向靶基因中插入至少一个终止密码子(例如一个到十个或更多个终止密码子)。本发明的一些方面提供了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多碱基的插入或缺失，从而在靶基因中引入移码突变。本发明的其他方面提供了1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29或更多个碱基的插入或缺失，从而在靶基因中引入移码突变。本申请的其他实施方案还提供了在靶基因中引入一个或多个点突变(例如1到30个或更多)，而本发明的其他方面提供了从本发明的微生物中部分、总体或完全缺失靶基因。在本发明这些方面的每个方面中，通过使靶基因编码的多肽的酶活性失活，使得代谢途径失活。

本文使用“靶基因”是指编码以下的基因：乙酸激酶、醇脱氢酶、天冬氨酸转氨酶、柠檬酸裂解酶、甲酸转运蛋白、乳酸脱氢酶、甲基乙二醛合酶、丙酮酸-甲酸裂解酶、丙酮酸氧化酶、磷酸乙酰转移酶、苹果酸酶，和/或丙酸激酶/α-酮丁酸甲酸裂解酶(α-ketobutyrate formatelyase)。在某些优选的实施方案中，基因是ackA(乙酸激酶)、adhE(醇脱氢酶)、aspC(天冬氨酸转氨酶)、citCDEF(柠檬酸裂解酶)、focA(甲酸转运蛋白)、ldhA(乳酸脱氢酶)、mgsA(甲基乙二醛合酶)、pflB(丙酮酸-甲酸裂解酶)、poxB(丙酮酸氧化酶)、pta(磷酸乙酰转移酶)、sfcA(苹果酸酶)和/或tdcDE(丙酸激酶/α-酮丁酸甲酸裂解酶)。因此在本发明的某些方面，在微生物(含有这类基因的任何细菌菌株，例如大肠杆菌)中使一个或多个这些基因失活。具有改进的生长和琥珀酸或苹果酸生产的菌株的选择过程称作“代谢演化(metabolic evolution)”(其实例在公开的实施例中提供)。“天然的大肠杆菌基因”应当理解为天然存在于大肠杆菌微生物中的基因，其与被引入大肠杆菌中且从除大肠杆菌之外的任何微生物获得的“异源基因”相反。

本发明的多个非限制性实施方案包括：

1.经遗传修饰的细菌菌株，其包含对一个或多个以下靶基因的遗传修饰：a)乙酸激酶，b)乳酸脱氢酶，c)醇脱氢酶，d)丙酮酸甲酸裂解酶，e)甲基乙二醛合酶，f)丙酮酸氧化酶，和/或g)柠檬酸裂解酶，所述遗传修饰使所述靶基因生产的多肽的酶活性失活；

2.根据实施方案1的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株是大肠杆菌、氧化葡糖杆菌、浅井氏葡糖杆菌、德尔马瓦无色杆菌、粘无色杆菌、乳无色杆菌、根瘤农杆菌、放射形土壤杆菌、粪产碱杆菌、柠檬节杆菌、肿胀节杆菌、石蜡节杆菌、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、氧化节杆菌、天牛短小杆菌、印度固氮菌、产安短杆菌、divaricatum、Brevibacterium lactofermentum、黄色短杆菌、Brevibacteriumglobosum、暗褐短杆菌、酮戊二酸短杆菌、Brevibacterium helcolum、Brevibacteriumpusillum、Brevibacterium testaceum、玫瑰色短杆菌、Brevibacterium immariophilium、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)、Brevibacterium protopharmiae、嗜乙酰棒杆菌、谷氨酸棒状杆菌、美棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、产气肠杆菌、解淀粉欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、草生欧文氏菌、菊欧文氏菌、Flavobacterium peregrinum、Flavobacterium fucatum、Flavobacterium aurantinum、莱茵黄杆菌、Flavobacteriumsewanense、Flavobacterium breve、Flavobacterium meningosepticum、微球菌属物种CCM825、摩氏变形菌、Nocardia opaca、粗糙诺卡氏菌、Planococcus eucinatus、雷氏变形菌、谢氏丙酸杆菌、成黄假单胞菌、氮假单胞菌、荧光假单胞菌、卵状假单胞菌、施氏假单胞菌、Pseudomonas acidovolans、霉味假单胞菌、睾丸酮假单胞菌、铜绿假单胞菌、红串红球菌、玫瑰红红球菌、红球菌属物种ATCC 15592、红球菌属物种ATCC 19070、脲芽孢八叠球菌、金黄色葡萄球菌、Vibrio metschnikovii、Vibrio tyrogenes、马杜拉诺卡氏菌、Actinomyces violaceochromogenes、Kitasatosporia parulosa、天蓝色链霉菌、Streptomyces flavelus、浅灰链霉菌、变铅青链霉菌、橄榄色链霉菌、田无链霉菌、弗吉尼亚链霉菌、抗生链霉菌、可可链霉菌、淡紫灰链霉菌、绿色产色链霉菌、杀鲑气单胞菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌、弗氏埃希氏菌、嗜氨微杆菌、粘质沙雷菌、鼠伤寒沙门氏菌、Salmonella schottmulleri或柑橘黄单胞菌；

3.根据实施方案1或2的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经修饰的细菌菌株是大肠杆菌B；

4.实施方案1、2或3的经遗传修饰的细菌菌株，其中以下的靶基因被失活：a)乙酸激酶，b)乳酸脱氢酶，c)醇脱氢酶，d)丙酮酸甲酸裂解酶，和e)丙酮酸氧化酶；

5.实施方案4的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述细菌菌株还包含失活的甲基乙二醛合酶基因；

6.实施方案4或5的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述细菌菌株还包含失活的柠檬酸裂解酶基因；

7.根据实施方案1、2、3、4或5的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株是经代谢演化的；

8.根据实施方案1、2、3、4、5、6或7的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述基因或其部分被缺失；

9.根据实施方案1、2、3、4、5、6或7的经遗传修饰的细菌菌株，其中通过移码突变、点突变、插入终止密码子或其组合使所述基因失活；

10.根据实施方案2、3、4、5、6、7、8或9的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株是大肠杆菌菌株，并且不含有外源基因或其片段(或仅含有天然的大肠杆菌基因)；

11.根据实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的经遗传修饰的细菌菌株，前提是：1)所述经遗传修饰的细菌菌株的一个或多个以下基因未被失活：a)延胡索酸还原酶；b)ATP合酶；c)2-酮戊二酸脱氢酶(sucAB)；d)琥珀酸脱氢酶(例如sdhAB)、磷酸乙酰转移酶(例如pta)；e)葡萄糖转运蛋白(例如ptsG)；f)异柠檬酸裂合酶阻抑物(例如iclR)；和/或2)所述经遗传修饰的菌株不含有编码和/或过表达下述基因的质粒或多拷贝质粒，所述基因例如苹果酸脱氢酶(mdh)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸羧化酶(pyc)和/或柠檬酸合酶(例如枯草芽孢杆菌的citZ)；

12.根据实施方案1-11的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株是KJ012，KJ017，KJ032，KJ044，KJ059，KJ060，KJ070，KJ071，KJ072或KJ073；

13.培养或培育经遗传修饰的细菌菌株的方法，包括用根据实施方案1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12任一的一种或多种经遗传修饰的细菌菌株接种培养基，并培养或培育所述经遗传修饰的细菌菌株；

14.生产琥珀酸或苹果酸的方法，包括在允许生产琥珀酸或苹果酸的条件下培养根据实施方案1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12任一的一种或多种经遗传修饰的细菌菌株；

15.根据实施方案14的方法，其中所述一种或多种经遗传修饰的细菌菌株是KJ012，KJ034，KJ044，KJ059，KJ060，KJ070，KJ071，KJ072或KJ073；

16.根据实施方案13、14或15任一的方法，其中所述经遗传修饰的细菌菌株在矿物盐培养基中培养；

17.根据实施方案16的方法，其中所述矿物盐培养基包含2％和20％(w/v)之间的碳水化合物；

18.根据实施方案17的方法，其中所述矿物盐培养基含有2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％或20％(w/v)的糖；

19.根据权利要求17或18的方法，其中所述碳水化合物是葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、纤维二糖、半纤维素或其多种组合；

20.根据实施方案14、15、16、17、18或19的方法，其中以至少0.20M、0.25M、0.30M、0.35M、0.40M、0.45M、0.50M、0.55M、0.60M、0.65M或0.70M的浓度生产琥珀酸或苹果酸；

21.根据实施方案14、15、16、17、18、19或20的方法，其中培养基是NBS矿物盐培养基或AM1培养基(见表4)；

22.根据实施方案14、15、16、17、18、19、20或21的方法，其中琥珀酸或苹果酸的产率至少是或大于(或大于或等于)90％；

23.根据实施方案22的方法，其中产率至少是90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％或99％；

24.根据权利要求13-16或20-23任一的方法，其中生长培养基包含甘油作为底物用于生产琥珀酸、苹果酸或延胡索酸；

25.根据权利要求17-19的方法，其中所述培养基还包含甘油作为底物用于生产琥珀酸、苹果酸或延胡索酸；或

26.组合物，其包含根据实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12任一的一种或多种经遗传修饰的细菌菌株和培养基。

本申请还提供了以下的其他实施方案：

1.经遗传修饰的细菌菌株，其包含对以下靶基因的遗传修饰，所述靶基因编码：a)乙酸激酶，b)乳酸脱氢酶，c)醇脱氢酶，d)丙酮酸甲酸裂解酶，e)甲基乙二醛合酶，f)丙酮酸氧化酶，g)柠檬酸裂解酶，h)天冬氨酸转氨酶，i)甲酸转运蛋白，j)磷酸乙酰转移酶，k)苹果酸酶，和l)丙酸激酶/α-酮丁酸甲酸裂解酶，所述遗传修饰使所述靶基因生产的多肽的酶活性失活；

2.根据实施方案1的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株是大肠杆菌、氧化葡糖杆菌、浅井氏葡糖杆菌、德尔马瓦无色杆菌、粘无色杆菌、乳无色杆菌、根瘤农杆菌、放射形土壤杆菌、粪产碱杆菌、柠檬节杆菌、肿胀节杆菌、石蜡节杆菌、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、氧化节杆菌、天牛短小杆菌、印度固氮菌、产安短杆菌、divaricatum、Brevibacterium lactofermentum、黄色短杆菌、Brevibacteriumglobosum、暗褐短杆菌、酮戊二酸短杆菌、Brevibacterium helcolum、Brevibacteriumpusillum、Brevibacterium testaceum、玫瑰色短杆菌、Brevibacterium immariophilium、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)、Brevibacterium protopharmiae、嗜乙酰棒杆菌、谷氨酸棒状杆菌、美棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、产气肠杆菌、解淀粉欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、草生欧文氏菌、菊欧文氏菌、Flavobacterium peregrinum、Flavobacterium fucatum、Flavobacterium aurantinum、莱茵黄杆菌、Flavobacteriumsewanense、Flavobacterium breve、Flavobacterium meningosepticum、微球菌属物种CCM825、摩氏变形菌、Nocardia opaca、粗糙诺卡氏菌、Planococcus eucinatus、雷氏变形菌、谢氏丙酸杆菌、成黄假单胞菌、氮假单胞菌、荧光假单胞菌、卵状假单胞菌、施氏假单胞菌、Pseudomonas acidovolans、霉味假单胞菌、睾丸酮假单胞菌、铜绿假单胞菌、红串红球菌、玫瑰红红球菌、红球菌属物种ATCC 15592、红球菌属物种ATCC 19070、脲芽孢八叠球菌、金黄色葡萄球菌、Vibrio metschnikovii、Vibrio tyrogenes、马杜拉诺卡氏菌、Actinomyces violaceochromogenes、Kitasatosporia parulosa、天蓝色链霉菌、Streptomyces flavelus、浅灰链霉菌、变铅青链霉菌、橄榄色链霉菌、田无链霉菌、弗吉尼亚链霉菌、抗生链霉菌、可可链霉菌、淡紫灰链霉菌、绿色产色链霉菌、杀鲑气单胞菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌、弗氏埃希氏菌、嗜氨微杆菌、粘质沙雷菌、鼠伤寒沙门氏菌、Salmonella schottmulleri或柑橘黄单胞菌；

3.根据实施方案2的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株是大肠杆菌；

4.经遗传修饰的细菌菌株，其包含：

(a)对柠檬酸裂解酶基因和一个或多个以下靶基因的遗传修饰，所述靶基因编码a)乙酸激酶，b)乳酸脱氢酶，c)醇脱氢酶，d)丙酮酸甲酸裂解酶，e)甲基乙二醛合酶，f)丙酮酸氧化酶，g)天冬氨酸转氨酶，h)甲酸转运蛋白，i)磷酸乙酰转移酶，j)苹果酸酶，和/或k)丙酸激酶/α-酮丁酸甲酸裂解酶；或

(b)对柠檬酸裂解酶基因、乳酸脱氢酶基因、醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、甲酸转运蛋白基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、甲基乙二醛合酶基因、丙酮酸氧化酶基因和一个或多个以下靶基因的遗传修饰，所述靶基因编码：a)天冬氨酸转氨酶，b)磷酸乙酰转移酶，c)苹果酸酶，和/或d)丙酸激酶/α-酮丁酸甲酸裂解酶；

所述遗传修饰使所述靶基因生产的多肽的酶活性失活；

5.根据实施方案4的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株是大肠杆菌、氧化葡糖杆菌、浅井氏葡糖杆菌、德尔马瓦无色杆菌、粘无色杆菌、乳无色杆菌、根瘤农杆菌、放射形土壤杆菌、粪产碱杆菌、柠檬节杆菌、肿胀节杆菌、石蜡节杆菌、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、氧化节杆菌、天牛短小杆菌、印度固氮菌、产安短杆菌、divaricatum、Brevibacterium lactofermentum、黄色短杆菌、Brevibacteriumglobosum、暗褐短杆菌、酮戊二酸短杆菌、Brevibacterium helcolum、Brevibacteriumpusillum、Brevibacterium testaceum、玫瑰色短杆菌、Brevibacterium immariophilium、扩展短杆菌、Brevibacterium protopharmiae、嗜乙酰棒杆菌、谷氨酸棒状杆菌、美棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、产气肠杆菌、解淀粉欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、草生欧文氏菌、菊欧文氏菌、Flavobacterium peregrinum、Flavobacterium fucatum、Flavobacterium aurantinum、莱茵黄杆菌、Flavobacterium sewanense、Flavobacteriumbreve、Flavobacterium meningosepticum、微球菌属物种CCM825、摩氏变形菌、Nocardiaopaca、粗糙诺卡氏菌、Planococcus eucinatus、雷氏变形菌、谢氏丙酸杆菌、成黄假单胞菌、氮假单胞菌、荧光假单胞菌、卵状假单胞菌、施氏假单胞菌、Pseudomonas acidovolans、霉味假单胞菌、睾丸酮假单胞菌、铜绿假单胞菌、红串红球菌、玫瑰红红球菌、红球菌属物种ATCC 15592、红球菌属物种ATCC 19070、脲芽孢八叠球菌、金黄色葡萄球菌、Vibriometschnikovii、Vibrio tyrogenes、马杜拉诺卡氏菌、Actinomycesviolaceochromogenes、Kitasatosporia parulosa、天蓝色链霉菌、Streptomycesflavelus、浅灰链霉菌、变铅青链霉菌、橄榄色链霉菌、田无链霉菌、弗吉尼亚链霉菌、抗生链霉菌、可可链霉菌、淡紫灰链霉菌、绿色产色链霉菌、杀鲑气单胞菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌、弗氏埃希氏菌、嗜氨微杆菌、粘质沙雷菌、鼠伤寒沙门氏菌、Salmonella schottmulleri或柑橘黄单胞菌；

6.根据实施方案5的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株是大肠杆菌；

7.根据实施方案1、2、3、4、5或6的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株是经代谢演化的；

8.根据实施方案1、2、3、4、5或6的经遗传修饰的细菌菌株，其中通过缺失、移码突变、点突变、插入终止密码子或其组合使所述靶基因或其部分、或靶基因或其部分失活；

9.根据实施方案1、2、3、4、5或6的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株不合有任何外源基因或其片段，或仅含有天然的基因；

10.根据实施方案1、2、3、4、5或6的经遗传修饰的细菌菌株，前提是：1)所述经遗传修饰的细菌菌株中一个或多个以下的酶未被失活：a)延胡索酸还原酶；b)ATP合酶；c)2-酮戊二酸脱氢酶；d)琥珀酸脱氢酶；e)葡萄糖转运蛋白；f)异柠檬酸裂合酶阻抑物；和/或2)所述经遗传修饰的菌株不含有编码和/或过表达苹果酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶和/或柠檬酸合酶的质粒或多拷贝质粒；

11.根据实施方案7、8、9、10或11的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株是经代谢演化的。

12.根据实施方案1-10中任一的经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株生产：

a)浓度为至少200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM、600mM、650mM或700mM的琥珀酸；

b)浓度为至少200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM、600mM、650mM或700mM的延胡索酸；或

c)浓度为至少200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM的苹果酸；

13.经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株是KJ012、KJ017、KJ032、KJ044、KJ059、KJ060、KJ070、KJ071、KJ072、KJ073、KJ076、KJ079、KJ091、KJ098、KJ104、KJ110、KJ119、KJ122或KJ134；

14.培养或培育经遗传修饰的细菌菌株的方法，包括用实施方案1-13中任一项的一种或多种经遗传修饰的细菌菌株接种培养基，并培养或培育所述经遗传修饰的细菌菌株；

15.生产琥珀酸、延胡索酸或苹果酸的方法，包括在允许生产琥珀酸或苹果酸或延胡索酸的条件下培养根据实施方案1-13中任一项的一种或多种经遗传修饰的细菌菌株；

16.根据实施方案15的方法，其中所述一种或多种经遗传修饰的细菌菌株是KJ012、KJ017、KJ032、KJ044、KJ059、KJ060、KJ070、KJ071、KJ072、KJ073、KJ076、KJ079、KJ091、KJ098、KJ104、KJ110、KJ119、KJ122或KJ134；

17.根据实施方案14-16中任一项的方法，其中所述经遗传修饰的细菌菌株在矿物盐培养基中培养；

18.根据实施方案17的方法，其中所述矿物盐培养基包含2％和20％(w/v)之间的碳水化合物；

19.根据权利要求18的方法，其中矿物盐培养基含有2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％或20％(w/v)的糖；

20.根据实施方案18或19的方法，其中碳水化合物是葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、纤维二糖、半纤维素或其组合；

21.根据实施方案15-20中任一项的方法，其中琥珀酸或苹果酸的产率大于或等于90％；

22.根据实施方案21的方法，其中产率至少为90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％或99％；

23.根据实施方案15-22中任一项的方法，其中所述经遗传修饰的细菌菌株生产浓度为至少200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM、600mM、650mM或700mM的琥珀酸；

24.根据实施方案15-22中任一项的方法，其中所述经遗传修饰的细菌菌株生产浓度为至少200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM的苹果酸；

25.根据实施方案15-22中任一项的方法，其中所述经遗传修饰的细菌菌株产生浓度为至少200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM、600mM、650mM或700mM的延胡索酸；

26.根据实施方案14-17或21-25中任一项的方法，其中所述生长培养基包含甘油作为底物用于生产琥珀酸、苹果酸或延胡索酸；

27.根据实施方案18-20中任一项的方法，其中所述培养基还包含甘油作为底物用于生产琥珀酸、苹果酸或延胡索酸；或

28.组合物，其包含根据实施方案1-13中任一项的一种或多种经遗传修饰的细菌菌株和培养基。

微生物如实施例中所示保藏在美国农业研究菌种保藏中心(AgriculturalResearch Service Culture Collection)，1815N.University Street，Peoria，Illinois，61604U.S.A。根据37CFR 1.14和35USC 122，以确保专利和商标局局长(Commissioner ofPatents and Trademarks)确定要授权的任何人在该专利申请的未决期间能够获得该培养物的条件进行保藏。在提交本申请的复本或其后代的国家中，保藏物根据外国专利法的需要是可以获得的。然而，应当理解保藏物的可获得性不构成实践本发明从而损害政府行为所授予的专利权的许可。

另外，根据微生物保藏的布达佩斯条约的规定，应当保藏主题培养物保藏物并且其是公众可以获得的，即应当保藏它们并使用所有必需的护理，使其在提供保藏样品的最近要求后至少五年的周期内存活并且不被污染，并且在任何情况下，在保藏日后至少30(三十)年的周期内或提出公开所述培养物的任何专利的可实施寿命内存活并且不被污染。当保藏机构由于保藏物的情况而不能根据要求提供样品时，保藏者具有更换保藏物的责任。公开培养物保藏的专利被授权后，对主题培养物保藏的公众可获得性的所有限制将被不可撤销地去除。

下文的实施例阐述了实践本发明的步骤。这些实施例不应被解释为限制。除非另有说明，所有百分比以重量计，并且所有的溶剂混合物比例以体积计。

实施例1

微生物如下保藏在ARS培养物保藏中心：

培养物	菌株命名	保藏日期
			KJ012	B-50022	2007年3月15日
KJ017	B-50023	2007年3月15日
			KJ032	B-50024	2007年3月15日
KJ060	B-50025	2007年3月15日
			KJ070	B-50026	2007年3月15日
KJ071	B-50027	2007年3月15日
			KJ072	B-50028	2007年3月15日
KJ073	B-50029	2007年3月15日

材料和方法

菌株、培养基和培养条件

该研究中使用的菌株总结在表2中。通过特有的基因缺失和针对提高生产力的选择的组合，开发了大肠杆菌C(ATCC 8739)的衍生物用于琥珀酸生产。仅在菌株构建期间，将培养物在改良的Luria-Bertani(LB)液体培养基(每升：10g Difco胰蛋白胨、5g Difco酵母提取物、5g氯化钠)(Miller，1992)中于37℃下培养。适当时包含抗生素。

在大部分研究中使用补充了100mM KHCO₃、1mM甜菜碱HCl和糖(2％到10％)的NBS矿物盐培养基(Causey等，2004)作为发酵液体培养基，并用于维持菌株。在该研究的晚期阶段开发了一种新的低盐培养基AM1(4.2g l^-1总盐；Martinez等，2007)，并将其用于KJ060和KJ073的发酵中。用100mM KHCO₃和所示的糖补充该培养基，并且当初始糖浓度为5％或更高时包含1mM甜菜碱。除了构建期间的中间体以外，开发用于琥珀酸生产的菌株中不存在编码抗生素抗性的基因、质粒或其他外来基因。

遗传学方法

该研究中使用的质粒和引物总结在表2中。用于染色体缺失、整合和抗生素抗性基因去除的方法先前已经描述(Datsenko和Wanner，2000；Grabar等，2006；Posfai等，1997；Zhou等，2006)。正义引物含有对应于每个靶基因N-端的序列(粗体)，之后是对应于FRT-kan-FRT盒的20bp(加下划线)。反义引物含有对应于每个靶基因C-端的序列(粗体)，之后是对应于所述盒的20bp(加下划线)。扩增的DNA片段被电穿孔转化进带有Red重组酶(pKD46)的大肠杆菌菌株中。在得到的重组体中，FRT-kan-FRT盒通过同源重组(双交换事件)代替了缺失的靶基因区。随后使用质粒pFT-A，用FLP重组酶将抗性基因(FRT-kan-FRT)从染色体上切下，留下含有一个FRT位点的瘢痕区。通过针对抗生素标记物的测试、PCR分析和发酵产物分析，验证染色体缺失和整合。使用普适的P1噬菌体转导(Miller，1992)，将ΔfocA-pflB：：FRT-kan-FRT突变从菌株SZ204转移进菌株KJ017，产生KJ032。

mgsA和poxB基因的缺失

开发了一种改进的方法，用于使用两步同源重组过程缺失大肠杆菌染色体基因(Thomason等，2005)。使用该方法时，在基因缺失后染色体上没有剩余抗生素基因或瘢痕序列。在第一次重组中，部分靶基因被替换为含有氯霉素抗性基因(cat)和果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的DNA盒。在第二次重组中，cat-sacB盒被替换为省略缺失区的天然序列。含有sacB基因的细胞在用蔗糖孵育期间累积果聚糖并被杀死。针对cat-sacB盒的丧失高度富集存活的重组体。

构建一种盒从而简化基因缺失。使用JMcatsacB引物组(表2)，通过PCR从pEL04(Lee等，2001；Thomason等，2005)扩增cat-sacB区，用NheI消化，并连接进pLOI3421的相应位点中，产生pLOI4151。使用pLOI4151(模板)和cat-up2/sacB-down2引物组(每个引物中包含EcoRV位点)，通过PCR扩增cat-sacB盒，用EcoRV消化，并用于随后的连接中。

使用引物组mgsA-up/down扩增mgsA基因和相邻的500bp区域(yccT'-mgsA-helD’，1435bp)并将其克隆进pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)中，产生质粒pLOI4228。该质粒DNA的1000-倍稀释制剂发挥模板的作用，使用mgsA-1/2引物组(两个引物均在mgsA基因内并且朝向外侧)进行由内向外(inside-out)的扩增。将得到的含有复制子的4958bp片段与从pLOI4151扩增、经EcoRV消化的cat-sacB盒连接，产生pLOI4229。还使用该4958bp片段构建第二质粒pLOI4230(磷酸化和自我连接)。在pLOI4230中，mgsA的中央区缺失(yccT'-mgsA'-mgsA”-helD’)。

用XmnI(载体内)消化pLOI4229和pLOI4230后，将其作为模板使用mgsA-up/down引物组进行扩增，分别产生用于整合步骤I(yccT'-mgsA'-cat-sacB-mgsA”-helD’)和步骤II(ycc T'-mgsA'-mgsA”-helD’)的线性DNA片段。将步骤I片段电穿孔进入含pKD46(Red重组酶)的KJ060中并在30℃下孵育2小时以允许表达和分离之后，在平板上(30℃，18小时)针对氯霉素(40mg l^-1)和氨苄西林(20mg l^-1)抗性选择重组体。选择了三个克隆，在含有氨苄西林和5％w/v阿拉伯糖的Luria发酵液中培养，并准备用于电穿孔。用步骤II片段进行电穿孔后，将细胞在37℃下孵育4小时并转移至250-ml烧瓶中，所述烧瓶含有100ml含10％蔗糖的改良的LB(添加100mM MOPS缓冲液并省略NaCl)。过夜孵育(37℃)后，在含6％蔗糖的改良的LB平板(无NaCl；添加100mM MOPS)上选择克隆(39℃，16小时)。测试得到的克隆是否丧失氨苄西林和氯霉素抗性。通过PCR分析进一步验证构建体。选择缺乏mgsA基因的克隆并命名为KJ070。

通过和用于缺失mgsA基因的方式相似的方式，从KJ071中缺失poxB基因。用于构建poxB缺失的另外的引物组(poxB-up/down和poxB-1/2)与相应的质粒(pLOI4274、pLOI4275和pLOI4276)一起包含在表2中。得到的菌株被命名为KJ072。

酶测定

在含5％或10％葡萄糖的NBS培养基中培养细胞，在对数生长中期期间通过离心(4℃下8,000g 5分钟)收获，用冷的100mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液洗涤，并重悬于相同的缓冲液(5ml)中。通过Bead-处理(MP Biomedicals；Solon，Ohio)用玻璃珠破裂细胞，然后在13,000g离心15分钟，得到粗提取物。通过BCA方法测量蛋白质，使用牛血清白蛋白作为标准(Pierce BCA蛋白质测定试剂盒)。

如之前所述测量PEP羧化酶活性(Canovas和Kornberg，1969)。反应混合物含有100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、10mM MgCl₂、1mM DTT、25mM NaHCO₃、0.2mM NADH、20U苹果酸脱氢酶和10mM PEP，通过添加粗提取物起始反应。如先前所述测量PEP羧激酶活性(Vander Werf等，1997)。反应混合物含有100mM MES缓冲液(pH6.6)、10mM MgCl₂、75mM NaHCO₃、5mM MnCl₂、50mM ADP、1mM DTT、0.2mM NADH、20U苹果酸脱氢酶和10mM PEP。通过添加粗提取物起始反应。

如先前所述在两个方向上测量NAD⁺依赖型苹果酸酶活性(Stols和Donnelly，1997)。对羧基化方向而言，反应混合物含有100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、25mM NaHCO₃、1mM MnCl₂、1mM DTT、0.2mM NADH和25mM丙酮酸。通过添加粗提取物起始反应。然而因为乳酸脱氢酶的存在，该测定方法不能在野生型大肠杆菌C中测量苹果酸酶活性。对脱羧化而言，反应混合物含有100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、2.5mM NAD⁺、1mM DTT、10mM MgCl₂、20mM KCl和20mM L-苹果酸。通过添加粗提取物起始反应。

通过与NADP⁺依赖型苹果酸酶相同的方式测量NADP⁺依赖型苹果酸酶活性，例外是用NADP(H)⁺代替NAD(H)⁺。一个活性单位定义为每分钟氧化或还原1nmol底物的酶量。

实时RT-PCR分析

如先前所述使用实时RT-PCR测量信使RNA水平(Jarboe等，2008)。将细胞在含5％或10％葡萄糖的NBS培养基中培养，在对数生长中期期间通过在干冰/乙醇浴中振荡然后离心收获，并在-80℃下储存于RNALater(Qiagen，Valencia CA)中直至纯化。用RNeasy Mini柱(Qiagen)进行RNA纯化，之后用DNaseI(Invitrogen)消化。使用50ng总RNA作为模板，用Superscript II(Invitrogen，Carlsbad CA)进行反转录。在Bio-Rad iCycler中用SYBRGreen RT-PCR混合物(Bio-Rad，Hercules CA)进行实时PCR。通过在不存在反转录时进行RT-PCR，检验RNA是否有基因组DNA污染。使用基因组DNA作为标准评价转录本丰度，并通过转录阻抑物——birA基因标准化表达水平(Jarboe等，2008)。用于pck和birA的RT-PCR引物列于表2中。

pck区的测序

为了获知KJ073的pck基因中是否发生任何突变，通过PfuUltra高保真DNA聚合酶(Stratagene；Wilmington，DE)在KJ012和KJ073二者中扩增了pck基因的编码区和启动子区(在编码区之前约800bp)。使用引物组pck-F/R，通过转录终止子扩增编码区。使用引物组pck-2扩增启动子区。DNA测序由佛罗里达大学生物技术研究学际中心(University ofFlorida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research)(使用AppliedBiosystems自动测序仪)提供。

发酵

在含葡萄糖、100mM KHCO₃和1mM甜菜碱HCl的NBS或AM1矿物盐培养基中于37℃、100rpm下孵育接种培养物和发酵物。在初始的实验期间通过自动添加KOH将这些维持在pH7.0。随后通过添加3MK₂CO₃和6N KOH的1∶1混合物维持pH。在具有350ml工作体积的小发酵罐中进行发酵。如所指示的，以0.01(3.3mg CDW l^-1)或0.1(33.3mg CDW l^-1)的初始OD₅₅₀接种发酵。测试的菌株中不存在抗生素抗性基因。除了用作取样口的16计量注射针(gaugeneedle)以外，发酵罐是密封的。在生长期间用添加的碳酸氢盐快速达成厌氧生活，所述碳酸氢盐发挥确保大气CO₂的作用。

分析

用Bausch&Lomb Spectronic 70分光光度计根据550nm处的吸光度评价细胞量(OD1.0＝333mg细胞干重l^-1)。通过使用高效液相层析测定有机酸和糖(Grabar等，2006)。

结果和讨论

构建用于琥珀酸生产的KJ012：缺失ldhA、adhE和ackA

迄今为止对大肠杆菌的大部分科学知识来自于在复合培养基(如Luria发酵液)而不是矿物盐培养基中的研究，所述矿物盐培养基使用低浓度糖底物(通常为0.2％w/v；11mM)而不是本文报道的研究中使用的5％(w/v)葡萄糖(278mM)和10％w/v(555mM)。产生商业显著水平的产物需要大量糖。先前的研究人员描述了用于在复合培养基中生产琥珀酸的许多大肠杆菌衍生物的构建(表1)。使用复合培养基时，基于基本途径的合理设计在代谢工程的学术论证方面已经取得了合理的成功。然而，使用复合营养物用于生产细菌发酵产物提高了材料成本、纯化成本和与废物处置相关的成本。无复合培养基组分的矿物盐培养基的使用应当是更加成本有效的。

大肠杆菌C在含葡萄糖的NBS矿物盐培养基中生长良好，并产生乳酸、乙酸、乙醇和琥珀酸的混合物作为发酵产物(图1A；表3)。与使用大肠杆菌的其他研究相反(表1)，本文报道的研究着重于下述菌株的开发，所述菌株能够将高水平糖转化为琥珀酸，使用矿物盐培养基最小化材料、琥珀酸纯化和废物处置的成本。通过检查图1(其阐述了被普遍接受的大肠杆菌标准发酵途径)，发明了产琥珀酸菌株代谢工程的合理设计，其中在所有备选产物：乳酸(ldhA)、乙醇(adhE)和乙酸(ackA)的终端步骤的编码基因中进行缺失。通过合理设计从该代谢改造得到的结果是完全出乎意料的。得到的菌株(KJ012)在厌氧条件下含5％葡萄糖(278mM)的矿物盐培养基中生长非常差，并产生乙酸而不是琥珀酸作为主要的发酵产物。与来自合理设计的期望相反，琥珀酸作为次要产物保留。这些突变导致以被代谢的葡萄糖为基础的琥珀酸摩尔产率没有改变，在含5％葡萄糖的NBS矿物盐培养基中发酵期间，对亲本和KJ012而言为每摩尔葡萄糖0.2摩尔琥珀酸。我们证实NBS矿物盐培养基含有在需氧条件下孵育时KJ012生长所需的全部矿物营养物(需氧摇瓶；5％葡萄糖)。在需氧摇瓶中，KJ012的细胞产率比厌氧生长期间高5倍，并且是厌氧生长期间大肠杆菌C(亲本)的75％。这些结果也证实了在KJ012中所有的中央生物合成途径保持功能。

存在复合营养物(Luria发酵液)时，与矿物盐培养基中KJ012相比，KJ012的发酵性琥珀酸生产提高了20倍，并且琥珀酸摩尔产率提高了3.5倍。显然，基于主要途径的合理设计更好地适用于学术论证或适用于设计旨在使用复合营养物的工艺。

矿物盐培养基中厌氧代谢期间KJ012(ΔldhA：：FRTΔadhE：：FRTΔackA：：FRT)的较差生长、较差琥珀酸生产和乙酸生产提高的原理是未知的。这些是由使用合理设计的代谢工程造成的出乎意料的后果，所述合理设计基于标准的途径表。在最小培养基中，针对代谢工程的合理设计显然是不可预测的。得到的菌株KJ012在生长方面劣于亲本，在琥珀酸生产方面几乎等于亲本。

通过基于生长的KJ012选择，开发用于琥珀酸生产的KJ017

与亲本大肠杆菌C相比，KJ012(ΔldhA：：FRTΔadhE：：FRTΔackA：：FRT)生长较差，显示更低的琥珀酸生产率，并提供几乎相等的摩尔产率(表3)。尽管有这些结果，但是基于以下理论，尝试使用该菌株的连续传代作为共同选择改进的生产和琥珀酸生长的方法。葡萄糖发酵成为琥珀酸的主要途径(图1A和图2A)通常被认为是使用磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)进行羧化步骤(Unden和Kleefeld，2004；Fraenkel 1996；Keseler等，2005；Millard等，1996；Gottschalk，1985；Karp等，2007)。该羧化酶不保存磷酸烯醇丙酮酸中的高能磷酸，并还原可获得的纯ATP用于生长。使用能够提高ATP产率并因此能够促进生长的已知大肠杆菌基因所有组成成分，可以推测琥珀酸生产的备选途径(图1A；图2B、2C和2D)。然而，在用大肠杆菌天然菌株发酵期间，这些备选途径均未显示发挥琥珀酸生产的作用。这些备选途径中的关键酶被葡萄糖抑制，并且通常在糖异生期间是有活性的。通常，这些葡萄糖异生酶的水平随着葡萄糖和其他代谢产物的可用度相反地变化(Goldie和Sanwal，1980a；Wright和Sanwal，1969；Sanwal和Smando，1969a)，并在相反方向——脱羧中发挥作用(Keseler等，2005；Oh等，2002；Kao等，2005；Stols和Donnelly，1997；Samuelov等，1991；Sanwal，1970a；Delbaere等，2004；Goldie和Sanwal，1980b；Sanwal和Smando，1969b；Sanwal1970b)。

已经证明这些途径之一的一个关键酶——NADH-连锁的苹果酸酶(sfcA)(图2B)，能够在大肠杆菌中提高琥珀酸生产，但是需要从质粒中过表达来实现(Stols和Donnelly，1997)。然而，这些备选途径均未被期望在使用高水平葡萄糖的厌氧生长期间在大肠杆菌天然菌株或KJ012中发挥作用。KJ012的连续传代与针对改进的生产的选择提供了一个机会，所述机会用于选择琥珀酸生产的备选途径的突变活化(图1B)，所述活化维持氧化还原平衡并提高ATP产率。

在发酵条件下NBS葡萄糖培养基中，根据生长所允许尽可能快地连续传代KJ012(图3A；图4A；图5)。在最初9次传代之间，生长持续缓慢，需要孵育4-5天，然后可观地提高，允许以24小时的间隔进行传代。该事件伴随着乙酸的增加(图4A)，琥珀酸生产几乎没有改进。27次传代(60天)后，用3M K₂CO₃和6N KOH的1∶1混合物代替KOH，以提供额外的二氧化碳(向所有NBS矿物盐培养基中最初添加100mM)。连续传代导致琥珀酸生产的改进。在5％葡萄糖(227mM)中进行总计40次传代，之后在10％葡萄糖(555mM)中进行另外40次传代。在10％葡萄糖中传代期间，琥珀酸产率保持为每摩尔代谢的葡萄糖约0.7mol，副产物为乳酸、乙酸和甲酸(表3)。该产率比大肠杆菌C和KJ012高3倍。分离克隆并命名为KJ017。选择KJ012生长中的改进，产生针对琥珀酸生产(速率、滴度和摩尔产率)中的改进而共同选择的KJ017。

KJ017的提高的琥珀酸生产的生理学原理

使用通常被认为是天然发酵途径(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；ppc)的大肠杆菌生产的琥珀酸通过生产无机磷酸而浪费磷酸烯醇丙酮酸的能量。通过该途径，生产每个琥珀酸丢失一个ATP(图1；图6)。通过使用备选的酶系统将该能量作为ATP保存代表了促进细胞生长和共同选择提高的琥珀酸生长的机会。以大肠杆菌中已知的基因为基础，预想了琥珀酸生产的三种其他酶途径，所述途径会保存ATP并因此能够促进生长(图1；图6)。然而，这些备选途径中的所有羧化步骤被认为在相反方向(脱羧化)中作用，主要用于在底物例如有机酸上生长期间的糖异生(Keseler等，2005；Oh等，2002；Kao等，2005；Stols和Donnelly，1997；Samuelov等，1991；Sanwal，1970a；Delbaere等，2004；Goldie和Sanwal，1980b；Sanwal和Smando，1969b；Sanwal 1970b)。为了测试基于生长选择开发KJ017实际活化了一个或多个这些备选途径的假设，比较了关键羧化步骤的比活性(表4)。其中三个在大肠杆菌C、KJ012和KJ017中相似或更低。与KJ012相比，KJ017中保存能量的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pck)提高4倍，与下述假设一致：选择改进的生长会共同选择通过提高ATP产率而提高琥珀酸的生长，这是由提高琥珀酸生产的能量保存途径的表达造成的。

还使用基于生长的选择和额外的基因缺失构建许多额外的菌株，所述菌株在生长和琥珀酸生产中具有进一步的改进(图3和图4)。还检查了这些菌株之一——KJ073中的酶水平。在该菌株中，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的体外活性被进一步提高为KJ017的8倍，同时其他羧化酶保持基本没有改变(表4)。

从KJ012和KJ073中克隆pck和周围区域并测序。编码区中未发现改变。没有翻译后修饰时，酶的催化特性应当是未被改变。在pck启动子区中检测到单个突变，相对于翻译起点-64bp位点处G变为A。该突变在转录起点之后，其相对于翻译起点为-139bp位点。在KJ073中将该序列恢复(A到G)为大肠杆菌C的序列不影响细胞生长、发酵或琥珀酸生产，表明该突变不是关键性的(数据未显示)。RT-PCR证实KJ073中信息水平被提高。这些结果与作为提高的pck表达基础的调节突变一致。

先前的研究者注意到磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pck)的动力学参数可对羧化和琥珀酸生产具有重要的影响(Millard等，1996；Kim等，2004)。对大肠杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)而言，朝向碳酸氢盐的Km为0.15mM(Morikawa等，1980)，比大肠杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pck)(13mM)低9倍(Krebs和Bridger 1980)。尽管在多拷贝质粒中过表达来自大肠杆菌的pck将磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性提高50倍，但是据报道这对琥珀酸生产没有影响(Millard等，1996)。在大肠杆菌K12中过表达来自产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶时，琥珀酸生产也未被提高(Kim等，2004)。该酶还对碳酸氢盐具有高Km(30mM；Laivenieks等，1997)。然而，在大肠杆菌K12的ppc突变体中过表达产琥珀酸厌氧螺菌的pck时，琥珀酸生产被提高6.5倍(Kim等，2004)。在KJ017和随后的衍生物中，即使存在有功能的天然磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶也无疑是占优势的羧化活性。

来自大肠杆菌C的酶测量的结果是非常惊人的。通常被认为是生长期间天然大肠杆菌琥珀酸生产的优势羧化活性的酶(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；ppc)(Unden和Kleefeld，2004；Fraenkel 1996；Keseler等，2005；Millard等，1996；Gottschalk 1985；Karp等，2007)对大肠杆菌C而言不是体外最有活性的酶。因此，对大肠杆菌而言普遍接受的代谢途径(Unden和Kleefeld，2004；Fraenkel 1996；Sanchez等，2006；Cox等，2006；Vemuri等，2002a；Wang等，2006；Sanchez等，2005ab；Gokarn等，2000；Karp等，2007)可能不精确地反映所有菌株中的代谢，代谢工程的合理设计和代谢通量的估计通常基于所述途径。在底物饱和的体外条件下，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性是最有活性的。在大肠杆菌K12中，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶二者的活性被报道为在体外是相等的(140nmmin^-1mg^-1细胞蛋白质；Van der Werf等，1997)，前者作为朝向琥珀酸的主要途径。

先前的研究显示，由于更多的PEP羧化补充了TCA循环的中间产物，所以大肠杆菌中天然ppc基因的过表达导致更高的比琥珀酸生产(Millard等，2000)、更高的比生长速率和更低的比乙酸生产(Farmer和Liao，1997)。然而，由于PEP是葡萄糖转运系统所需要的，所以与等基因对照相比，过表达ppc还将葡萄糖摄取率降低15-40％，而不显著提高琥珀酸产率(每份葡萄糖)(Chao和Liao，1993；Gokarn等，2000)。天然磷酸烯醇丙酮酸羧化酶提高琥珀酸产率的失败使大部分研究注意力转向新的代谢设计，过表达来自Lactobacilluslactis或菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的PYC(丙酮酸羧化酶)作为羧化步骤(Vemuri等，2002ab；Gokarn等，2000；Lin等，2005abc)而不是追求用大肠杆菌基因的天然所有组成成分进行进一步工作。

瘤胃细菌例如琥珀酸放线菌(Actinobacillus succinogenes)在葡萄糖发酵期间使用保存能量的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶用于羧化，生产琥珀酸作为主要产物(Kim等，2004；McKinlay等，2005；McKinlay和Vieille，2008)。针对该生物报道的活性是KJ017的5倍，并且是通过连续性基于生长的选择(代谢演化)的KJ073所获得的一半。因此，通过使用代谢工程(ldhA adhE ackA)和代谢演化(基于生长选择提高的ATP生产效率)的组合，本文报道的研究证明了仅使用大肠杆菌基因的天然所有组成成分开发产琥珀酸的大肠杆菌菌株，所述菌株类似瘤胃生物例如A.succinogenes。尽管先前报道在磷酸烯醇丙酮酸合酶中没有突变时过表达大肠杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)对琥珀酸生产没有帮助(Chao和Liao，1993；Kim等，2004；Gokarn等，2000；Millard等，1996)，但是将KJ017和衍生物改造为使用磷酸烯醇丙酮酸羧激酶作为琥珀酸和苹果酸生产的主要途径。

构建KJ032和KJ060

在使用10％(w/v)葡萄糖的生长期间，尽管缺失了编码主要的乳酸脱氢酶(ldhA)和乙酸激酶(ackA)活性的基因，但是使用KJ017(ΔldhA：：FRTΔadhE：：FRTΔackA：：FRT)的发酵中有大量不想要的副产物(乙酸、甲酸和乳酸)(表3)。乳酸和乙酸的生产也可导致更高的ATP产率，这是基于生长选择的基础(图1A)。

从KJ017中缺失编码丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)的基因，以消除作为甲酸的还原剂的损失和过量的可能的乙酸来源——乙酰～CoA。还缺失了该操纵子中的上游甲酸转运蛋白(focA)。如所期望的，该缺失的菌株(KJ032)没有乙酸时不生长，证实了这是KJ017中乙酰～CoA生产的主要途径(图3C)。众所周知在厌氧条件下pflB的缺失引起乙酸营养缺陷型(Sawers和Bock，1988)。通过添加20mM乙酸恢复KJ032的生长和琥珀酸生产(图3C、图4C和图5)。pflB(和focA)缺失导致甲酸和乙酸生产大量降低。尽管该菌株生长需要乙酸，但是在发酵期间也产生额外的乙酸。先前在构建丙酮酸生产的大肠杆菌K-12生物催化剂期间，针对pflB缺失的菌株报道了相同的现象(Causey等，2004)。KJ032中的乳酸水平也降低了(表3；图4C)。随后的传代伴随着生长和琥珀酸生产的改进。在随后的传代期间，添加的乙酸减少，接种量减少，葡萄糖浓度翻番(10％w/v)(图4D)。将乙酸量减少至5mM后，形成了一种不稳定的种群，其消耗琥珀酸生产提高水平的苹果酸。进一步传代后，省略乙酸并开发出一种菌株，所述菌株不再是乙酸营养缺陷型，推测是归因于另一基因的提高的表达。然而，耗尽添加的乙酸后琥珀酸产率下降，同时苹果酸和乙酸水平提高。乙酸来源和苹果酸提高的基础是未知的。还产生了小量的丙酮酸。从最后一次传代分离的一个克隆并命名为KJ060(ΔldhA：：FRTΔadhE：：FRTΔackA：：FRTΔfocA-pflB：：FRT)。在含10％葡萄糖的NBS矿物盐培养基中，该菌株相对于每摩尔代谢的葡萄糖生产1摩尔琥珀酸。

通过缺失甲基乙二醛合酶(mgsA)构建KJ070和KJ071

假设多种菌株发酵液中存在的小量乳酸来源于甲基乙二醛合酶途径(图6；Grabar等，2006)。尽管这代表了产率的小量损失，但是通过该途径的乳酸生产指示着生长和糖酵解抑制剂甲基乙二醛的累积(Egyud和Szent-Gyorgyi，1966；Grabar等，2006；Hopper和Cooper，1971)。通过在KJ060中缺失mgsA基因(甲基乙二醛合酶)消除甲基乙二醛和乳酸的生产，产生KJ070(ΔldhA：：FRTΔadhE：：FRTΔackA：：FRTΔfocA-pflB：：FRTΔmgsA)。最初在5％(w/v)葡萄糖中继代培养菌株KJ070(图4E和图5)。推测mgsA的缺失具有提高的糖酵解通量，如培养基中丙酮酸的累积所证实(表3)。糖酵解通量的该提高也可以负责琥珀酸/苹果酸比例的进一步降低，这归因于提高的延胡索酸还原酶别构抑制剂草酰乙酸的生产(Iverson等，2002；Sanwal，1970c)。

在第21次传代时，将葡萄糖翻番至10％(w/v)并继续传代。该更高的葡萄糖水平和随后的传代导致苹果酸生产的进一步提高，超过之后传代中的琥珀酸(图4E)。10％w/v葡萄糖中苹果酸相对于琥珀酸的提高的生产还与提高的糖酵解通量和草酰乙酸对延胡索酸还原酶的抑制一致。在第50次传代时，每摩尔代谢的葡萄糖产生1.3摩尔苹果酸和0.71摩尔琥珀酸(表3)。还产生了显著量的乙酸。从最终的继代培养物中分离出一个新的菌株，并命名为KJ071(ΔldhA：：FRTΔadhE：：FRTΔackA：：FRTΔfocA-pflB：：FRTΔmgsA)。该菌株可适用于苹果酸生产。

通过缺失poxB构建KJ072和KJ073

尽管葡萄糖到乙酸的转化是氧化还原中性的，但是将碳分配给乙酸降低了琥珀酸和苹果酸的产率。丙酮酸氧化酶(poxB)代表在微需氧条件下孵育期间乙酸和CO₂的可能来源(Causey等，2004)。尽管在厌氧条件下其不应发挥氧化丙酮酸的功能，但是poxB是基因缺失的靶标(图6)。如所预期的，缺失poxB生产KJ072(ΔldhA：：FRTΔadhE：：FRTΔackA：：FRTΔfocA-pflB：：FRTΔmgsAΔpoxB)未降低乙酸生产表明备选的途径参与乙酸生产。然而，消除poxB导致发酵产物中出乎意料的改变，琥珀酸的增加和苹果酸的减少(表3；图4F)。琥珀酸生产的该改进机制是未知的，但是可能与丙酮酸氧化酶的其他活性例如3-羟基丁酮生产、脱羧和醛连接(carboligation)相关(Ajl和Werkman，1948；Chang和Cronan，2000)。

在含10％(w/v)葡萄糖的更低盐培养基——AM1培养基中对菌株KJ072再进行40轮代谢演化(表3；图4F和图5)。在这些传代期间观察到生长、细胞产率和琥珀酸生产的改进。苹果酸、丙酮酸和乙酸水平也有提高。从最终传代中分离了一个克隆并命名为KJ073(ΔldhA：：FRTΔadhE：：FRTΔackA：：FRTΔpflB：：FRTΔmgsAΔpoxB)。该菌株保留磷酸烯醇丙酮酸羧激酶途径用于羧化(表4)。该菌株的体外活性比KJ012高45倍并且比KJ017高10倍，提供了能量保存与琥珀酸生产和生长的紧密偶联的进一步证据，并进一步确立了用于选择的基础。

在含10％(w/v)葡萄糖的AM1培养基中发酵KJ060和KJ073

图7显示琥珀酸生产的两种最佳生物催化剂——KJ060和KJ073的分批发酵。尽管在最初48小时的孵育内完成了生长，但是琥珀酸生产持续96小时。三分之一的琥珀酸生产发生在没有细胞生长时。这些菌株产生668-733mM的琥珀酸滴度，具有以代谢的葡萄糖为基础1.2-1.6的摩尔产率。使用AM1培养基时，产率通常高于使用NBS矿物盐培养基时。乙酸、苹果酸和丙酮酸作为不受欢迎的副产物累积，并从琥珀酸的可能产率中移除(表3)。来自葡萄糖和CO₂(过量)的琥珀酸最大理论产率为每摩尔葡萄糖1.71摩尔，以以下等式为基础：

7C₆H₁₂O₆+6CO₂→12C₄H₆O₄+6H₂O

然而，在大肠杆菌中没有达到该产率的直接琥珀酸途径(图6)。

将其他底物转化为琥珀酸

尽管该研究主要着重于葡萄糖到琥珀酸的转化。众所周知，大肠杆菌具有代谢组成植物细胞壁的所有己糖和戊糖的天然能力(Asghari等，1996；Underwood等，2004)。一些大肠杆菌菌株也可代谢蔗糖(Moniruzzaman等，1997)。在血清管中测试菌株KJ073对2％己糖和戊糖的利用。在所有情况下，这些糖主要被转化为琥珀酸。菌株KJ073还将甘油代谢为琥珀酸。在用2％甘油孵育期间，143mM甘油被代谢，以0.89的摩尔产率产生127mM琥珀酸，所述产率是理论最大值的89％。

在含1mM甜菜碱和10％葡萄糖的NBS培养基中生产苹果酸

在基于生长的选择期间，观察培养物在其苹果酸生产方面不同(表3)，所述苹果酸是可能有用的备选产物。苹果酸是KJ071使用10％葡萄糖时最丰富的产物(表3；图4E)，几乎是琥珀酸的两倍。该菌株以代谢的葡萄糖为基础产生1.44摩尔产率的516mM苹果酸(表3)。

结论

大肠杆菌的发酵代谢显示适应能力非常强。改造和开发衍生物，以防止大量缺失与天然发酵途径相关的基因，并且提高经过剩余酶的通量从而维持氧化还原平衡、提高ATP生产的效率和提高生长。尽管更具挑战性，但是细胞可在矿物盐培养基上进行这类适应性改变，同时平衡碳分配以提供所有的生物合成需要。消除NADH氧化(乳酸脱氢酶、醇脱氢酶)和乙酸生产(乙酸激酶)的基本途径后，为了氧化还原平衡，生长和ATP生产保持与NADH氧化和苹果酸或琥珀酸的生产相关(图1B)。基于厌氧生长的选择确保氧化还原平衡并选择提高的效率和提高的ATP生产速率，这是提高的生长的基础。针对氧化还原平衡和ATP生产的该选择不能容易地在作为终产物的苹果酸和琥珀酸之间区分，因为二者的前体均发挥电子受体的作用。在这些研究期间开发了一种菌株(KJ071)，其生产比琥珀酸更多的苹果酸。该菌株和其他衍生物可用于苹果酸生产。其他菌株例如KJ073和KJ060以每摩尔葡萄糖1.2到1.6摩尔的产率生产琥珀酸作为主要产物。

缺失厌氧生长期间乙酰～CoA的主要来源pflB导致需要乙酸的营养缺陷型(Sawers和Bock，1988)。该需要通过代谢演化消除，推测是归因于其他途径例如丙酮酸脱氢酶对乙酰～CoA的提高的生产(de Graef等，1999)。代替该营养缺陷型需要的乙酸或乙酰～CoA的代谢来源是未知的。代谢产物中的许多变换是出乎意料的。缺失mgsA后选择期间苹果酸的增加是无法解释的。甲基乙二醛是响应代谢失衡产生的代谢抑制剂(Grabar等，2006)。甲基乙二醛生产的消除可提供与生长相关的优点，例如提高的生长率、接种后更短的滞后等。poxB缺失后苹果酸的减少和向更高琥珀酸生产的转换也是另人惊讶的。几乎没有观察到乙酸水平的改变，表明该酶是乙酸的次要来源，或者其功能被乙酸生产的其他途径代替。缺失poxB后，琥珀酸再次作为主要的二羟酸被生产。使用琥珀酸生产的最佳菌株KJ060和KJ073时，苹果酸和乙酸作为丰富的副产物保留(表3；图4D和4F)。这些的消除代表提高产率的又一机会。

所有开发用于琥珀酸生产的先前被改造的大肠杆菌使用复合培养基和带有抗生素的质粒用于维持。大部分在单批发酵中仅达到低的琥珀酸滴度，需要更复杂的工艺达到高滴度(表1)。已报道了在复合培养基中通过重组的大肠杆菌提高从葡萄糖生产琥珀酸的多种遗传学途径。在我们最初的构建体中，在矿物盐培养基中生长和糖代谢是非常差的，但是在复合培养基(Luria培养基)中则非常有活力。含维生素、氨基酸和其他大分子前体的复合培养基可掩蔽代谢工程所导致的代谢和生物合成中潜在的调节问题。

许多其他研究人员也使用异源基因和复杂的工艺，所述工艺包括用气体(CO₂、H₂、O₂或空气)喷射和二元的需氧和厌氧工艺步骤。预期该工艺和营养物的复杂性会提高构建、材料、纯化和废物处置的成本。相反，菌株KJ060和KJ073在使用不含任何复杂营养物或外来基因的矿物盐培养基的单批次发酵(10％糖)中，产生高滴度的琥珀酸(600-700mM)。

实施例2

如下将微生物保藏在ARS培养物保藏中心：

培养物	菌株名称	保藏日期
			KJ073	B-50029	2007年3月15日
KJ091	B-50110	2008年2月20日
			KJ098	B-50111	2008年2月20日
KJ104	B-50112	2008年2月20日
			KJ110	B-50113	2008年2月20日
KJ119	B-50114	2008年2月20日
			KJ122	B-50115	2008年2月20日
KJ134	B-50116	2008年2月20日

材料和方法

菌株、培养基和生长条件

使用特有的基因缺失组合与基于生长的选择联合，开发了大肠杆菌C(ATCC 8739)的新衍生物用于琥珀酸生产。该研究中使用的菌株、质粒和引物概括于表1中。在菌株构建期间，将培养物在改良的Luria-Bertani(LB)液体培养基(每升：10g Difco胰蛋白胨、5gDifco酵母提取物、5g氯化钠)(Miller，1992)中于37℃下培养，所述培养基适当时补充有抗生素(Jantama等，2008；Zhang等，2007)。被开发用于琥珀酸生产的最终菌株中不存在编码抗生素抗性的基因、质粒或外来基因。构建后在AM1培养基(Martinez等，2007)中培养和维持菌株。用100mM KHCO₃和葡萄糖(如所指出的)补充该培养基。当初始葡萄糖浓度为5％(w/v)或更高时添加甜菜碱(1mM)。

在adhE、ldhA和focA-pflB区域中缺失FRT标记物

用于制造连续基因缺失并从adhE、ldhA和focA-pflB基因座中去除FRT标记物的策略是先前已描述的(Datsenko和Wanner，2000；Grabar等，2006；Jantama等，2008；Zhang等，2007)。使用质粒pLOI4151作为cat-sacB盒的来源，使用Red重组酶(pKD46)促进双交换(同源重组事件)。使用氯霉素抗性选择整合。使用在蔗糖上的生长选择sacB的丧失。通过该途径构建了连续缺失，产生KJ079的衍生物，所述衍生物消除了所有FRT位点。引物和质粒列于表1中。

为了去除ΔadhE区中的FRT位点，针对ΔadhE：：FRT靶区域的杂种引物(WMadhEA/C)被设计为含有与ΔadhE：：FRT位点5′和3′区同源的约50bp，和对应于来自pLOI4151的cat-sacB基因的20bp。这些引物被用于cat-sacB盒的PCR扩增，使用pLOI4151作为模板。得到的PCR产物被用于通过双交换(同源重组事件)和对氯霉素抗性的选择，用cat-sacB盒代替ΔadhE区中的FRT位点，产生TG200。

使用up/downadhE引物从大肠杆菌C扩增adhE基因和周围的序列。将含ychE'-adhE-ychG’(3.44kb)的PCR产物克隆进pCR2.1-TOPO中，得到pLOI4413。使用第二组引物(IO-adhEup/down)扩增从内向外的产物，使用pLOI4413作为模板和Pfu聚合酶得到平末端产物，其中adhE序列的2.6kb内部区段被缺失。对该从内向外的PCR产物进行激酶处理并自我连接，得到pLOI4419。通过另一双重同源重组事件和针对sacB丧失的蔗糖选择，使用从pLOI4419扩增(up/downadhE引物)的PCR产物用期望的染色体序列代替TG200中的cat-sacB盒。得到的菌株命名为TG201(从ΔadhE区中去除FRT的KJ079)

通过和用于缺失adhE：：FRT位点相似的方式，去除ΔldhA和Δ(focA-pflB)区中的FRT位点。用于去除ΔldhA中FRT位点的其他引物组(ldhAA/C和IO-ldhAup/down)与相应的质粒(pLOI4430和pLOI4432)一起包含在表1中。通过用来自pLOI4151的PCR产物(WMldhAA/C引物)替换TG201中的该区域，产生菌株TG202。用来自pLOI4432(ldhAA/C引物)的PCR产物替换TG202中的cat-sacB盒并针对sacB的丧失进行蔗糖选择，产生TG203。

用于去除Δ(focA-pflB)中FRT位点的引物组(upfocA/MidpflA和IO-ycaOup/IO-midpflAdown)和相应的质粒(pLOI4415和pLOI4421)包括在表1中。通过用来自pLOI4151(WMpflBA/C引物)的PCR产物代替TG203中的该区域，产生菌株TG204。用来自pLOI4421(upfocA/MidpflA引物)的PCR产物替换TG204中的cat-sacB盒并针对sacB的丧失进行蔗糖选择，产生KJ091。KJ091是其中从染色体ΔadhE、ΔldhA和ΔfocA-pflB区域中去除所有FRT位点的KJ073的衍生物。

构建含cat-sacB盒的pLOI4162用于无标记物基因缺失

为了便于染色体DNA的连续缺失，构建具有可去除的cat-sacB盒的质粒pLOI4162(图1)，所述质粒可选地包含18-bp的合成DNA区段，其中所有读码框中具有终止密码子。该质粒由合成序列和质粒pLOI2228(Martinez-Morales等，1999)、pLOI2511(Underwood等，2002)和pEL04(Lee等，2001；Thomason等，2005)的部分组成。使用pEL04作为模板，用JMpEL04F1/R1引物进行从内向外的PCR，从而消除cat和sacB基因之间不想要的SmaI和BamHI位点。用BglII(两个引物内)消化扩增的产物并自我连接，产生pLOI4152。通过将来自pLOI2228的FRT-cat-FRT片段(用Klenow处理的BanI，ClaI)连接进pLOI2511(用Klenow处理的NheI，ClaI)的相容位点中，构建质粒pLOI4131。随后用EcoRI消化质粒pLOI4131并自我连接以去除FRT-cat-FRT片段，产生保留单一KasI和XmaI位点的pLOI4145。通过退火互补的寡核苷酸(SfPBXPSsense和SfPBXPScomp)制备多聚连接子区段(SfPBXPS)。用KasI和XmaI消化后，将该区段连接进pLOI4145的相应位点中，产生pLOI4153。使用JMcatsacBup3/down3引物组，通过PCR扩增pLOI4152中经修饰的cat-sacB盒。用BamHI和XhoI消化后，将该盒连接进pLOI4153的相应位点中，产生pLOI4146。为了在所有六个读码框中创建含终止密码子的18-bp区域(5’GCCTAATTAATTAATCCC3’)(SEQ ID NO：1)，用PacI消化pLOI4146并自我连接，产生pLOI4154(未显示)，去除了cat-sacB盒。使用诱变引物(JM4161sense/comp)和线性质粒扩增向pLOI4154的SfoI和PacI位点之间插入两个额外的碱基(T和A)，产生pLOI4161。最后将含有cat-sacB盒的来自pLOI4146的经PacI消化的片段连接进pLOI4161的经PacI-消化的位点中，产生pLOI4162(GenBank登录号EU531506)。

tdcDE和aspC基因缺失的构建

使用tdcDEup/down引物扩增tdcDE基因和相邻的1000bp区域(tdcG'-tdcFED-tdcC'，5325bp)，并克隆进pCR2.1-TOPO载体中，产生质粒pLOI4515。该质粒DNA的1000-倍稀释制剂在使用tdcDEF7/R7引物(两种引物均在tdcDE基因内并朝向外侧)的从内向外的扩增中发挥模板的作用。将得到的含复制子的6861bp片段与从pLOI4162扩增的(JMcatsacBup3/down3引物)、经SmaI/SfoI-消化的cat-sacB盒连接，产生pLOI4516。该6861bp片段还用于构建第二质粒，含有tcdD和tdcE缺失的pLOI4517(激酶处理，自我连接)。使用从pLOI4516和pLOI4517扩增(tdcDEup/down引物)的PCR片段代替KJ091中的tdcDE区。针对氨苄西林和氯霉素抗性的丧失测试得到的克隆，并命名为KJ098。

通过和用于缺失tdcDE基因相似的方式从KJ104中缺失aspC基因。用于构建aspC缺失的其他引物组(aspCup/down和aspC1/2)与相应的质粒(pLOI4280、pLOI4281和pLOI4282)一起包括在表1中。得到的菌株命名为KJ110。KJ098或KJ110在各自被缺失的区域(tdcDE和aspC)中均不含有任何间插序列。

ackA区域中FRT位点的去除和citF、sfcA和pta-ackA基因缺失的构建

为了消除KJ073的ackA区中的FRT位点，如下构建含有想要的突变序列的质粒。使用大肠杆菌C基因组DNA作为用JMackAF1/R1引物PCR扩增ackA的模板，所述引物在ackA基因上游和下游约200bp处结合。将线性产物克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，产生pLOI4158。然后使用质粒pLOI4158作为模板，进行使用JMackAup1/down1引物和Pfu聚合酶的从内向外的PCR，得到缺乏ackA的808-bp内部区段的平末端产物。然后将侧翼是PacI的cat-sacB盒(来自pLOI4162的SmaI/SfoI片段)连接进平末端PCR产物中，产生pLOI4159。质粒pLOI4159发挥模板作用用于PCR扩增(JMackAF1/R1引物)。通过双交换同源重组与针对氯霉素抗性的选择，使用该PCR产物代替KJ073的ackA区中的FRT位点。得到的克隆命名为KJ076。

还用PacI消化质粒pLOI4159以去除cat-sacB盒，并自我连接产生保留18-bp翻译终止序列的pLOI4160。质粒pLOI4160发挥PCR模板的作用(JMackAF1/R1引物)。通过双交换同源重组并针对sacB的丧失进行选择，将该扩增的片段用于代替KJ076中的cat-sacB盒。通过在提高的温度下生长去除pKD46后，将得到的菌株命名为KJ079。在该菌株中，缺失的区域被18-bp翻译终止序列代替。

上文用于从ackA区去除FRT位点的策略被用于制造citF、sfcA或pta-ackA的连续缺失和用18-bp翻译终止序列代替缺失区域。用于构建citF缺失的其他引物组(citFup/down和citF2/3)与相应的质粒(pLOI4629、pLOI4630和pLOI4631)一起包括在表1中。得到的菌株命名为KJ104。

从菌株KJ104和KJ110中缺失sfcA基因，得到分别命名为KJ119和KJ122的菌株。用于构建sfcA缺失的其他引物组(sfcAup/down和sfcA1/2)和相应的质粒(pLOI4283、pLOI4284和pLOI4285)一起包括在表1中。

从KJ122中缺失ackA-pta操纵子(包括合成的翻译终止序列)，产生菌株KJ134。用于构建该缺失的其他引物组(ackAup/ptadown和ackA2/pta2)与相应的质粒(pLOI4710、pLOI4711和pLOI4712)一起包括在表1中。菌株KJ134不合有任何FRT位点或外来基因。

发酵

在含10％(w/v)葡萄糖(555mM)、100mM KHCO₃和1mM甜菜碱HCl的AM1矿物盐培养基(Martinez等，2007)中于37℃(100rpm)下孵育接种培养物和发酵物。添加3M K₂CO₃和6N KOH的混合物维持pH和提供CO₂。碱组成(1∶1、4∶1、6∶1的混合物)的差异对发酵几乎没有影响。在具有350ml工作体积的小发酵罐中进行发酵。除非另有说明，以0.01(3.3mg CDW l^-1)的初始OD₅₅₀接种发酵。除了用作通气口和取样口的16计量注射针以外，发酵罐是密封的。在生长期间快速达成厌氧生活。添加的碳酸氢盐发挥确保大气CO₂的作用。

分析

通过使用Bausch&Lomb Spectronic 70分光光度计，根据550nm处的光密度评价细胞量(OD 1.0＝333mg细胞干重l^-1)。通过使用高效液相层析测定有机酸和糖(Grabar等，2006)。

结果和讨论

构建用于琥珀酸生产的无标记物菌株

通过Datsenko&Wanner(2000)的策略，用PCR产物和可去除的抗生素标记物(通过使用FRT识别位点和FLP重组酶)连续缺失大肠杆菌C野生型中的中心厌氧发酵基因。使用这些构建与代谢演化(基于生长选择提高的ATP生产效率)组合选择下述突变体菌株，所述突变体菌株恢复了保存能量的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pck)，以提高生长和琥珀酸生产(图9)。得到的菌株KJ073代谢每摩尔葡萄糖产生1.2摩尔琥珀酸(Jantama等，2008)，并且现在使用与瘤胃细菌琥珀酸放线菌(van der Werf等，1997)和Mannheimiasucciniciproducens(Song等，2007)非常相似的琥珀酸途径。然而，用于构建这些基因缺失的方法在每个缺失的基因(ackA，ldhA，adhE，ackA，focA-pflB)区域中留下单个82到85-nt的遗传瘢痕或者FRT位点。这些FRT位点在去除抗生素基因期间发挥FLP重组酶识别位点的作用(Storici等，1999)。使用先前描述的方法，从KJ073中连续去除所有这些外来序列，并用仅含有期望的基因缺失的天然DNA代替(Grabar等，2006；Zhang等，2007；Jantama等，2008)。得到的菌株KJ091在ackA、ldhA、adhE、focA-pflB、ackA、mgsA和poxB中含有特异的缺失，并且缺乏所有的FRT位点。除了ackA中的18-bp翻译终止序列以外，该菌株缺乏所有外来的和合成的DNA。菌株KJ091的琥珀酸生产与KJ073相等(表7)。该菌株用作进一步改进琥珀酸生产的亲本。

通过缺失tdcD和tdcE减少琥珀酸生产期间的乙酸

在大肠杆菌对葡萄糖的厌氧发酵期间，丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)发挥乙酰～CoA(乙酰～P前体)主要来源的作用，乙酸激酶(ackA)发挥从乙酰～P生产乙酸的主要途径的作用(Karp等，2007；Kessler&Knappe，1996)。菌株KJ073和KJ091中作为发酵产物的乙酸丰度是惊人的，因为这些菌株在ackA和pflB中都含有缺失(图9)。发酵结束时该残余的乙酸代表了进一步针对改进的琥珀酸产量更改代谢的机会。

与乙酸激酶(和丙酸激酶)活性相关的一种酶由tdcD编码，并通常仅生产用于降解苏氨酸(Hesslinger等，1998；Reed等，2003)。可能选择期间发生的突变提高了tdcD的表达，如图10中所示。在使用10％(w/v)葡萄糖的厌氧生长期间，tdcD的表达能够功能性地替代ackA，提高乙酰～P到乙酸的生产。相同操纵子中相邻的tdcE基因与pflB相似并编码丙酮酸(和α-酮丁酸)甲酸裂解酶活性，所述活性在苏氨酸降解期间被共同表达(Hesslinger等，1998)。可能使用10％(w/v)葡萄糖的厌氧生长期间，该基因提高的表达能够提高乙酰～CoA(乙酰～P的直接前体)和废物还原剂如甲酸的生产(图10)。同时从KJ091中缺失tdcD和tdcE(相邻的)二者，产生KJ098。与KJ091相比，KJ098中这两个基因的缺失将乙酸生产减少一半，并将琥珀酸产率提高10％，确立了该出乎意料的在将碳流转换偏离琥珀酸途径中的重要性。惊人的是，KJ098中新的缺失导致KJ091的苹果酸生产也被消除。KJ098生产的丙酮酸水平也降低了40％，所述丙酮酸是预测在消除丙酮酸代谢的两种备选途径——丙酮酸甲酸裂解酶活性(tdcD)和乙酸激酶活性(tdcE)之后会增加的中间产物。由于tdcD和tdcE同时缺失导致的苹果酸消除(琥珀酸纯化期间的问题污染物)、丙酮酸减少和琥珀酸增加的机制是未知的。

柠檬酸裂解酶(citDEF)缺失对琥珀酸生产期间乙酸产率的影响

尽管KJ098代表了超过KJ091的显著改进，但是乙酸水平的进一步降低和琥珀酸产率的进一步提高是可能的。在厌氧条件下，草酰乙酸被分配进还原的产物(苹果酸)和氧化的中间产物(柠檬酸)中(图9)。柠檬酸可以被柠檬酸裂解酶(citDEF)转化回草酰乙酸和乙酸，从而再循环细胞内OAA池用于另一代谢功能(Nilekani等，1983)。柠檬酸裂解酶的大量表达与在柠檬酸上的生长相关(Lutgens和Gottschalk，1980；Kulla和Gottschalk，1977)。柠檬酸裂解酶是由三条不同多肽链组成的多酶复合物。α亚基或大亚基是催化第一步的柠檬酸-ACP转移酶。β亚基或中亚基是催化第二步的柠檬酰-ACP裂解酶。γ亚基或小亚基发挥酰基运载体的作用，并且也载有辅基组分。所有三个亚基都是发生反应所需的(Quentmeier等，1987)。编码一个或多个这些亚基的基因的缺失会消除柠檬酸裂解酶的活性，并可在琥珀酸生产期间进一步降低乙酸水平。从KJ098中缺失citF基因产生KJ104。然而，该缺失对乙酸生产或其他琥珀酸产率没有影响(表7)。因为citF的缺失不引起任何乙酸减少，所以推测该中间产物来自于其他途径。因为未知的原因，与KJ098相比citF的缺失对KJ104的生长有不利的影响(将细胞产率降低22％)，并且将发酵结束时的丙酮酸水平几乎提高50％。然而，使用KJ104的琥珀酸产率、滴度、平均生产力和乙酸水平是可与KJ098相比较的(表7)。

aspC和sfcA缺失对琥珀酸产率的影响

天冬氨酸转氨酶(aspC)是通过转氨基反应催化天冬氨酸、苯丙氨酸和其他化合物合成的多功能酶。在该反应中通过与L-谷氨酸的转氨基反应，从PEP羧化的中间产物草酰乙酸合成L-天冬氨酸。天冬氨酸是蛋白质的组分，并参与若干其他生物合成途径。估计约27％的细胞氮流经天冬氨酸(Reitzer，2004)。天冬氨酸生物合成和琥珀酸生产共享通用的草酰乙酸细胞内池。aspC的缺失会导致提高的琥珀酸生产，但是也可创建营养缺陷型需要，所述需要防止在最小盐培养基例如AM1上厌氧生长。

从KJ104中缺失该天冬氨酸转氨酶基因(aspC)，产生KJ110。出乎意料的是，与KJ104相比，KJ110中aspC的缺失对琥珀酸产率或细胞产率没有影响(表7)。因此，在我们的菌株中，天冬酶似乎并不将显著水平的草酰乙酸转换偏离琥珀酸生产。似乎可以获得备选的酶，所述酶代替先前由天冬氨酸转氨酶催化的生物合成需要。

在使用KJ104和改造用于琥珀酸生产的其他大肠杆菌菌株的发酵结束时，存在大量的丙酮酸(表7)。该丙酮酸代表不想要的产物和提高琥珀酸产率的又一个机会。发酵液中该高水平的丙酮酸可能由苹果酸酶(sfcA)将苹果酸脱羧为丙酮酸而导致，如图10中所阐述。认为该酶主要在糖异生期间而不是葡萄糖的厌氧代谢期间发挥作用(Unden和Kleefeld，2004；Stols和Donnelly，1997；Oh等，2002)。尽管丙酮酸形成苹果酸的还原性羧化是热力学有利的，但是该酶的动力学参数喜好在生理学条件下脱氢和脱羧(Stols和Donnelly，1997)。过表达该酶以羧化丙酮酸先前被用作构建用于生产琥珀酸的大肠杆菌菌株的基础(Stols和Donnelly 1997)。

如果苹果酸酶(sfcA)在KJ104(和相关菌株)中羧化并有助于琥珀酸生产，则预期该基因的缺失会降低琥珀酸产率并提高其他产物例如丙酮酸的水平。或者，如果苹果酸酶(scfA)在KJ104中脱羧并将苹果酸转向丙酮酸，则预期缺失编码该酶的基因会提高琥珀酸产率并降低丙酮酸水平。出乎预料的是，与KJ104相比从KJ104中缺失sfcA基因产生KJ119对琥珀酸生产、生长、丙酮酸水平等没有可测量的影响(表7)。这些结果清楚地证明苹果酸酶(sfcA)对KJ104和相关菌株中的琥珀酸生产并不重要。该结果与Stols等，(1997)开发的琥珀酸生产菌株截然相反，所述菌株中使用提高的苹果酸酶生产作为琥珀酸生产的主要途径。

尽管从KJ104中的sfcA缺失或aspC缺失均未观察到显著的益处，但是进行了研究测试组合删除两个基因的影响。这通过缺失KJ110中的sfcA基因产生KJ122来实现，并且预期看不到益处。然而，与亲本菌株KJ110和相关菌株(KJ104和KJ119)相比，sfcA和aspC二者的组合缺失(菌株KJ122)导致琥珀酸产率和滴度的出乎意料的提高，和乙酸的小量减少(表7)。与KJ104相比，KJ122中的组合缺失(aspC和sfcA)导致琥珀酸产率、琥珀酸滴度和平均生产力分别18％、24％和24％的显著提高。尽管该机制是未知的，但是可能单突变无效是因为它们通过提高的经过保留活性、苹果酸酶或天冬氨酸转氨酶的流通而被部分代偿(图10)，缓冲了任何可能的益处。推测琥珀酸产率和滴度的提高由草酰乙酸可用度的提高造成，允许更大的部分前进至琥珀酸。苹果酸水平也保持非常之低。

菌株KJ122(表7)每摩尔葡萄糖产生1.5摩尔琥珀酸，这是最大理论产率(每摩尔葡萄糖产生1.71摩尔)的88％。为了生产该高水平的琥珀酸并完全减少苹果酸，需要额外的还原剂。尽管该额外还原剂的来源是未知的，但是这些结果与流经丙酮酸脱氢酶的丙酮酸增加是一致的。认为该酶主要在需氧代谢期间发挥作用(Guest等，1989)，但是也有报道在发酵期间于低水平下发挥作用(de Graef等，1999)。

通过缺失pta减少丙酮酸和乙酸

KJ122产生了极佳的琥珀酸产率(1.5mol mol^-1葡萄糖)加上更少量的乙酸和丙酮酸。琥珀酸的最大理论产率是1.71mol mol^-1葡萄糖，并且这些3-碳中间产物代表了进一步提高产率的机会。推测丙酮酸作为代谢溢流从糖酵解中累积，并可与乙酸累积相关。乙酰～CoA是许多酶的异构调节剂。乙酸和乙酸激酶活性的来源是未知的，因为编码乙酸激酶两种主要活性的基因(tdcD和ackA)已缺失(图9和图10)。假设乙酸由磷酸转乙酰酶的产物——乙酰～P生产，则在KJ122中构建又一缺失使pta基因失活。得到的菌株KJ134产生接近理论水平的琥珀酸(表7)。在该菌株中，丙酮酸和乙酸水平被显著降低。体积生产力也被降低17％。菌株KJ134的琥珀酸产率等于或优于所有其他菌株，与发酵工艺的复杂性、培养基或生长条件无关。

^a缩写：CSL，玉米浆；YE，酵母提取物；NR，未报道。

^b平均体积生产力在琥珀酸滴度下显示于括号中[g l^-1h^-1]。

^c摩尔产率以需氧和厌氧条件下由代谢的糖生产的琥珀酸为基础计算。生物量主要在需氧生长期间产生。琥珀酸主要在使用CO₂、H₂或二者混合物的厌氧孵育期间产生。

^a数据来自van der Werf等，1997

^b由于乳酸脱氢酶的存在，在野生型大肠杆菌C中不能测量。

^aNBS+1mM甜菜碱：用甜菜碱(1mM)改良的NBS培养基。

^b计算包括用于中和甜菜碱-HCl储存液的KOH。

^c在120mM HCl中制备痕量金属储存液(1000×)。

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Claims (20)

1.经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述菌株包含对下述靶基因的遗传修饰，所述靶基因编码：a)乙酸激酶ackA，b)乳酸脱氢酶的ldhA，c)醇脱氢酶adhE，d)丙酮酸-甲酸裂解酶pflB，e)甲酸转运蛋白focA，f)甲基乙二醛合酶mgsA，所述遗传修饰使所述靶基因编码的多肽的酶活性失活，并且所述大肠杆菌菌株过表达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶pck，其中所述大肠杆菌菌株产生至少200mM琥珀酸。

2.权利要求1的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述大肠杆菌菌株还包含对编码丙酮酸氧化酶的靶基因的遗传修饰，并且所述遗传修饰使所述基因编码的多肽的酶活性失活。

3.权利要求1的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述大肠杆菌菌株还包含对下述靶基因的遗传修饰，所述靶基因编码a)丙酮酸氧化酶，b)丙酸激酶和c)α-酮丁酸甲酸裂解酶，并且所述遗传修饰使所述靶基因的多肽的酶活性失活。

4.权利要求1的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述大肠杆菌菌株还包含对下述靶基因的遗传修饰：所述靶基因编码a)丙酮酸氧化酶，b)丙酸激酶，c)α-酮丁酸甲酸裂解酶和d)柠檬酸裂解酶，并且所述遗传修饰使所述靶基因的多肽的酶活性失活。

5.权利要求1的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述大肠杆菌菌株还包含对下述靶基因的遗传修饰：所述靶基因编码a)丙酮酸氧化酶，b)丙酸激酶，c)α-酮丁酸甲酸裂解酶，d)柠檬酸裂解酶和e)天冬氨酸转氨酶和f)苹果酸酶，并且所述遗传修饰使所述靶基因的多肽的酶活性失活。

6.权利要求1的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述大肠杆菌菌株还包含对下述靶基因的遗传修饰：所述靶基因编码a)丙酮酸氧化酶，b)天冬氨酸转氨酶，c)苹果酸酶，d)丙酸激酶，e)α-酮丁酸甲酸裂解酶，f)柠檬酸裂解酶和g)磷酸乙酰转移酶，并且所述遗传修饰使所述靶基因的多肽的酶活性失活。

7.权利要求1-6中任一项的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中通过缺失、移码突变、点突变、插入终止密码子或其组合使所述基因或其部分、或靶基因或其部分失活。

8.权利要求1-6中任一项的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述经遗传修饰的大肠杆菌菌株不具有外源基因或其片段或仅具有天然基因。

9.权利要求1-6中任一项的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，条件是：1)所述经遗传修饰的大肠杆菌菌株中一个或多个以下的酶未被失活：a)延胡索酸还原酶；b)ATP合酶；c)2-酮戊二酸脱氢酶；d)琥珀酸脱氢酶；e)异柠檬酸裂合酶阻抑物；和/或2)所述经遗传修饰的菌株不含有编码和/或过表达苹果酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶和/或柠檬酸合酶的质粒。

10.权利要求9的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述质粒是多拷贝质粒。

11.权利要求1-6中任一项的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述遗传修饰的大肠杆菌菌株是经代谢演化的。

12.生产琥珀酸的方法，该方法包括在培养基中培养一种或者多种权利要求1-6中任一项的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，所述培养基包含2％至20％w/v的碳水化合物，所述碳水化合物是葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、纤维二糖、半纤维素或其组合。

13.权利要求12的方法，其中琥珀酸的产率大于或等于90％。

14.权利要求12或13的方法，其中所述培养基包含甘油作为底物用于生产琥珀酸。

15.权利要求2的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，所述菌株还包含对下述基因的遗传修饰，所述基因编码丙酸激酶和α-酮丁酸甲酸裂解酶，所述遗传修饰失活由所述基因产生的多肽的酶活性，其中所述菌株的相关特征是ΔmgsA,ΔpoxB,ΔackA::翻译终止序列,ΔadhE,ΔldhA,Δ(focA-pflB),ΔtdcDE。

16.权利要求15的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述菌株还包含对编码柠檬酸裂解酶的基因的遗传修饰，所述遗传修饰使所述基因编码的多肽的酶活性失活。

17.权利要求16的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述菌株还包含编码苹果酸酶的基因的遗传修饰，所述遗传修饰使所述基因产生的多肽的酶活性失活。

18.权利要求16的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述菌株还包含编码天冬氨酸转氨酶的基因的遗传修饰，所述遗传修饰使所述基因产生的多肽的酶活性失活。

19.权利要求18的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述菌株还包含编码苹果酸酶的基因的遗传修饰，所述遗传修饰使所述基因产生的多肽的酶活性失活。

20.权利要求19的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中所述菌株还包含编码磷酸乙酰转移酶的基因的遗传修饰，所述遗传修饰使所述基因产生的多肽的酶活性失活。