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CN118546852B - 一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌及其应用 - Google Patents

一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌及其应用 Download PDF

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CN118546852B CN202411026118.1A CN202411026118A CN118546852B CN 118546852 B CN118546852 B CN 118546852B CN 202411026118 A CN202411026118 A CN 202411026118A CN 118546852 B CN118546852 B CN 118546852B
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Abstract

本发明公开了一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌及其应用，属于基因重组与代谢工程技术领域。本发明公开的一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌，是通过消除副产物、增强固碳能力、工程还原TCA循环、工程底物转运及产物外排途径获得的重组大肠杆菌。本发明公开的一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌，能够实现同时高效代谢葡萄糖、木糖生产丁二酸，丁二酸产量达到92 g/L，厌氧发酵生产阶段转化率达到0.98 g/g（总糖），代谢玉米秸秆纤维素水解液生产丁二酸的转化率达到0.97 g/g（总糖）。本发明构建的基因工程菌为高效利用纤维素水解液生产丁二酸提供了可能。

Description

一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌及其 应用
技术领域
本发明涉及基因重组与代谢工程技术领域，更具体的说是涉及一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌及其应用。
背景技术
丁二酸又名琥珀酸，是一种二羧酸，无色晶体，其CAS号为110-15-6，分子式为C4H6O4，分子量为118.088。丁二酸是一种具有广泛用途的有机化工原料，可以派生出许多日用品和专用化学品，有着广泛应用和广阔市场，被美国能源部列为12种最具潜力的大宗生物基化学品之首。在医药工业中用于合成镇静剂及治癌药物等。在化学工业中用于生产染料、醇酸树脂、玻璃纤维增强塑料、离子交换树脂及农药等。此外，还可用于分析试剂、食品铁质强化剂、清洗添加剂等。近年来，由于新应用领域的不断拓展，丁二酸的国际市场需求急剧增长，从而呈现出非常乐观的发展前景。
丁二酸的生产技术包括化学合成法、生物转化法和微生物发酵法。利用化学合成法可通过多种途径生产丁二酸。这主要取决于原材料的来源、生产费用和能耗情况。传统上，丁二酸主要利用石蜡、马来酸酎、乙炔或丙烯酸为原料通过化学方法制造获得。石蜡氧化法是传统的生产方法。石蜡在钙、锰催化下深度氧化得到混合二元酸氧化石蜡，后者通过热水蒸汽蒸馏，去除不稳定羟基油溶性酸和酯后，水相中含有丁二酸，干燥后得到丁二酸的结晶。石蜡氧化法工艺比较成熟，但收率和纯度都不高，且有污染。另外，马来酸酐加氢还原也是一种常用的方法。目前，国内外石油化工厂一般釆用丁烷为原料生成顺丁稀二酸酐马来酸酐，然后在催化剂作用下进行加氢反应，生成丁二酸。这一过程需要金或钌等贵金属参与，而且通常需要在高温高压下进行，不利于大规模生产。
生物基丁二酸并不陌生，有很多企业和研究单位涉足。但是，目前这些企业和研究单位主要采用葡萄糖为原料生物发酵法制备的路径，虽然丁二酸产量高和产率较高，但是存在“与人争粮”的问题。随着能源危机和粮食安全问题的日益严重，利用非粮生物质原料提高生物基丁二酸的竞争力成为研究的热点。另外，应积极引导基于大宗农作物秸秆等非粮生物质的生物基材料产业创新发展。值此背景下，发展非粮生物质生产丁二酸的生物发酵工艺具有更好的技术优势和产业前景。非粮生物质的主要碳源是葡萄糖和木糖，因此构建高效共利用葡萄糖和木糖的生产菌是发展非粮生物质生产丁二酸的关键。大肠杆菌具有清晰的遗传背景，成熟的操作工具，更重要的是其具有天然的内源性木糖代谢途径，经过改造能够实现同时利用纤维素水解液主要成分葡萄糖和木糖生产丁二酸。如，Liu et al报道以甘蔗渣水解液为碳源产生39.3 g/L丁二酸；Wu et al以玉米秸秆水解液为碳源产生38.6g/L丁二酸。Gokarn et al以植物水解液（主要碳源为葡萄糖和木糖）为碳源产生51 g/L丁二酸，转化率为0.54 g/g。虽然，共利用纤维素水解液主要组分葡萄糖、木糖生产丁二酸的研究目前已有报道，但是仍然存在共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸产量偏低、木糖利用效率偏低等问题。
因此，提供一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌及其应用，解决目前大肠杆菌共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸转化率偏低，产量偏低和木糖利用效率偏低等问题。
本发明通过整合厌氧启动子工程和多策略代谢工程构建了一株高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌株并应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌，所述基因工程菌为经过底盘微生物改造的重组大肠杆菌；
所述底盘微生物改造为以大肠杆菌BW25113为出发菌株，敲除葡萄糖特异性酶IIBC组分（glucose-specific PTS enzyme IIBC component, ptsG）基因、DNA结合转录抑制因子（DNA-binding transcriptional repressor, iclR）基因、乳酸脱氢酶（D-lactatedehydrogenase, ldhA）基因、甲基乙二醛合酶（methylglyoxal synthase, mgsA）基因、丙酮酸-甲酸裂解酶1（pyruvate formate-lyase 1, pflB）基因、甲酸乙酰转移酶（2-ketobutyrate formate-lyase/pyruvate formate-lyase 4, tdcE）基因、乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase, adhE）基因、丙酮酸氧化酶（pyruvate oxidase, poxB）基因和磷酸转乙酰酶（phosphate acetyltransferase, pta）基因。
进一步，所述的一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌，还包括CO2固定模块和还原三羧酸循环途径模块；
所述CO2固定模块表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvatecarboxykinase, pck）基因、丙酮酸羧化酶突变体（pyruvatecarboxylaseP458S, pycP458S）基因和碳酸酐酶（carbonic anhydrase, CA）基因；
所述还原三羧酸循环途径模块通过厌氧表达调控元件过表达苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase, mdh）基因、富马酸酶B（fumarase B，fumB）基因和富马酸还原酶（frdABCD包括四个亚基：fumarate reductase flavoprotein subunit, fumaratereductase iron-sulfur protein, fumarate reductase membrane protein FrdC,fumarate reductase membrane protein FrdD）基因簇。
进一步，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因包括内源性大肠杆菌（Escherichiacoli）磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因，或外源性磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因；
所述丙酮酸羧化酶突变体基因包括谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum）来源的丙酮酸羧化酶突变体基因，或其他外源性丙酮酸羧化酶突变体基因；
所述碳酸酐酶基因包括蓝细菌（Synechococcus sp. PCC 7002）来源的碳酸酐酶基因，或其他外源性碳酸酐酶基因。
所述苹果酸脱氢酶基因包括内源性大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因，或外源性苹果酸脱氢酶基因；
所述富马酸酶B基因包括内源性大肠杆菌富马酸酶B基因，或外源性富马酸酶B基因；
所述富马酸还原酶基因簇包括内源性大肠杆菌富马酸还原酶基因簇，或外源性富马酸还原酶基因簇；
所述内源性大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pck）基因序列如SEQ ID NO.47所示；
所述谷氨酸棒状杆菌来源的丙酮酸羧化酶突变体（pycP458S）序列如SEQ ID NO.55中79-3536 bp所示；
所述蓝细菌来源的碳酸酐酶（CA）基因序列如SEQ ID NO.63中118-901 bp所示；
所述内源性大肠杆菌苹果酸脱氢酶（mdh）基因序列如SEQ ID NO.71中231-1169bp所示；
所述内源性大肠杆菌富马酸酶B（fumB）基因序列如SEQ ID NO.79中231-1877bp所示；
所述内源性大肠杆菌富马酸还原酶（frdABCD）基因簇序列如SEQ ID NO.87中301-3612bp所示；
所述厌氧表达调控元件为厌氧条件下高表达内源性大肠杆菌富马酸还原酶黄蛋白亚基（fumarate reductase flavoprotein subunit, frdA）（后续简写为厌氧表达调控元件PfrdA）或内源性大肠杆菌厌氧甘油-3-磷酸脱氢酶亚基A（anaerobic glycerol-3-phosphate dehydrogenase subunit A, glpA）（后续简写为厌氧表达调控元件PglpA）；
所述内源性大肠杆菌富马酸还原酶黄蛋白亚基序列如SEQ ID NO.87中1-300 bp所示；
所述内源性大肠杆菌厌氧甘油-3-磷酸脱氢酶亚基A序列如SEQ ID NO.79中1-230bp所示。
进一步，所述的一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌，还包括乙醛酸途径模块；
所述乙醛酸途径模块表达苹果酸合成酶（malate synthase A，aceB）和异柠檬酸酶（isocitrate lyase，aceA）基因簇aceBA。
进一步，所述苹果酸合成酶和异柠檬酸酶基因簇aceBA包括内源性大肠杆菌苹果酸合成酶和异柠檬酸酶基因簇aceBA，或外源性苹果酸合成酶和异柠檬酸酶基因簇aceBA；
所述内源性大肠杆菌苹果酸合成酶和异柠檬酸酶基因簇aceBA序列如SEQ IDNO.95中63-3041 bp所示。
进一步，所述的一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌，还包括葡萄糖和木糖底物转运途径模块和丁二酸转运途径模块；
所述葡萄糖和木糖底物转运途径模块表达葡萄糖转运蛋白（glucose transportprotein，glf）基因、葡萄糖激酶（glucokinase，glk）基因（来提高葡萄糖的转运）、木糖异构酶（xylose isomerase，xylA）基因和转醛醇酶（transaldolase B，talB）基因（来提高木糖的转运和代谢）；
所述丁二酸转运途径模块表达丁二酸外排蛋白yjjPB（yjjPB，包括两个亚基：putative succinate exporter YjjP和putative succinate exporter YjjB）基因簇基因。
进一步，所述葡萄糖转运蛋白基因包括运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）来源的葡萄糖转运蛋白基因，或其他外源性葡萄糖转运蛋白基因；
所述葡萄糖激酶基因包括内源性大肠杆菌葡萄糖激酶基因，或外源性葡萄糖激酶基因；
所述木糖异构酶基因包括内源性大肠杆菌木糖异构酶基因，或外源性木糖异构酶基因；
所述转醛醇酶基因包括内源性大肠杆菌转醛醇酶基因，或外源性转醛醇酶基因；
所述丁二酸外排蛋白yjjPB基因簇包括内源性大肠杆菌丁二酸外排蛋白yjjPB基因簇，或外源性丁二酸外排蛋白yjjPB基因簇；
所述运动发酵单胞菌来源的葡萄糖转运蛋白（glf）基因序列如SEQ ID NO.103中79-1540 bp所示；
所述内源性大肠杆菌葡萄糖激酶（glk）基因序列如SEQ ID NO.111中169-1134 bp所示；
所述内源性大肠杆菌葡萄木糖异构酶（xylA）基因序列如SEQ ID NO.119中367-1684bp所示；
所述内源性大肠杆菌转醛醇酶（talB）基因序列如SEQ ID NO.127中279-1238 bp所示；
所述内源性大肠杆菌丁二酸外排蛋白yjjPB基因簇序列如SEQ ID NO.135中505-1773 bp所示。
进一步，一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）以大肠杆菌BW25113为出发菌株，依次敲除ptsG、iclR、ldhA、mgsA、pflB、tdcE、adhE、poxB和pta基因，获得改造的大肠杆菌；和/或
（2）在改造的大肠杆菌中表达所述的CO2固定模块、还原三羧酸循环途径模块；和/或
表达所述的乙醛酸途径模块；和/或
表达所述的葡萄糖和木糖底物转运途径模块和丁二酸转运途径模块。
进一步，所述的基因工程菌或所述的方法在生产丁二酸和提高丁二酸产量中的应用。
进一步，一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的方法，利用所述的基因工程菌或所述的方法构建的基因工程菌进行发酵。
值得说明的是，纤维素水解液中主要碳源为葡萄糖、木糖，本发明构建的基因工程菌能够利用纤维素水解液作为碳源，为实现高效利用纤维素水解液生产丁二酸提供了可能。
本发明提供了一种共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的途径（图1）：
大肠杆菌中通过底盘改造激活共利用葡萄糖和木糖生产途径中的木糖吸收途径和乙醛酸途径；消除副产物竞争途径；表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因、丙酮酸羧化酶基因和异源表达碳酸酐酶基因强化前体草酰乙酸供应和CO2固定能力；过表达还原三羧酸循环途径基因强化还原TCA通路；过表达乙醛酸途径基因强化乙醛酸途径通路；过表达葡萄糖转运和代谢途径基因、木糖代谢途径基因强化底物吸收通路；过表达丁二酸转运途径基因强化丁二酸外排通路。
所述激活共利用葡萄糖和木糖生产途径中的木糖吸收途径和乙醛酸途径为敲除葡萄糖特异性酶IIBC组分基因（ptsG）使大肠杆菌能够同时代谢葡萄糖和木糖，敲除DNA结合转录抑制因子基因（iclR）激活乙醛酸途径使大肠杆菌能够同时利用还原TCA路径和乙醛酸途径生产丁二酸。
所述消除副产物竞争途径为敲除乳酸脱氢酶基因（ldhA）、甲基乙二醛合酶基因（mgsA）、丙酮酸-甲酸裂解酶1基因（pflB）、甲酸乙酰转移酶基因（tdcE）、乙醇脱氢酶基因（adhE）、丙酮酸氧化酶基因（poxB）和磷酸转乙酰酶基因（pta）减少葡萄糖和木糖代谢的碳流量用于合成副产物乳酸、甲酸、乙醇和乙酸等，使更多的碳流量用于生产丁二酸。
所述表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因、丙酮酸羧化酶基因强化前体供应和CO2固定能力是通过过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pck）基因和异源表达丙酮酸羧化酶突变体(pycP458S)、异源表达碳酸酐酶（CA）基因强化草酰乙酸（OAA）供应同时固定更多的CO2。
所述过表达还原三羧酸循环途径基因强化还原TCA通路是通过厌氧启动子过表达苹果酸脱氢酶基因（mdh）、富马酸酶B基因（fumB）和富马酸还原酶（frdABCD）基因簇，提高丁二酸产量和产率。
所述过表达乙醛酸途径基因强化乙醛酸途径通路是通过过表达乙醛酸途径模块表达苹果酸合成酶（malate synthase A，aceB）和异柠檬酸酶（isocitrate lyase，aceA）基因簇aceBA，提高丁二酸产量和产率。
所述过表达葡萄糖转运和代谢途径基因、木糖代谢途径基因强化底物吸收通路是通过过表达葡萄糖转运蛋白（glf）基因、葡萄糖激酶（glk）基因、木糖异构酶（xylA）基因和转醛醇酶（talB）基因来增强葡萄糖和木糖的转运和代谢能力。
所述过表达丁二酸转运途径基因强化丁二酸外排通路是通过过表达丁二酸外排蛋白(yjjPB)基因簇提高丁二酸外排能力。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌及其应用，具体提供一种更高效的共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的重组大肠杆菌，通过激活共利用葡萄糖和木糖生产途径中的木糖吸收途径和乙醛酸途径；消除副产物竞争途径；表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因、丙酮酸羧化酶基因和异源表达碳酸酐酶基因强化前体供应和CO2固定能力；过表达还原三羧酸循环途径基因强化还原TCA通路；过表达乙醛酸途径基因强化乙醛酸通路；过表达葡萄糖转运和代谢途径基因、木糖代谢途径基因强化底物吸收通路；过表达丁二酸转运途径基因强化丁二酸外排通路；大大提升了菌株的生产能力，最终在发酵液中获得了92 g/L的丁二酸，是目前共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌的最高纪录，具有广泛的应用前景；为进一步利用纤维素水解液生产丁二酸提供了可能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的途径。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
LB液体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。对应的LB固体培养基添加2%琼脂。
实施例1
一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
以大肠杆菌BW25113为出发菌株，依次敲除葡萄糖特异性酶IIBC组分（ptsG）基因、DNA结合转录抑制因子（iclR）基因、乳酸脱氢酶（ldhA）基因、甲基乙二醛合酶（mgsA）基因、丙酮酸-甲酸裂解酶1（pflB）基因、甲酸乙酰转移酶（tdcE）基因、乙醇脱氢酶（adhE）基因、丙酮酸氧化酶（poxB）基因和磷酸转乙酰酶（pta）基因。
（1）葡萄糖特异性酶IIBC组分（ptsG）基因的敲除
（1-1）第一步：制备敲除片段ΔptsG-1000。
以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，使用引物ΔptsG-1和ΔptsG-2扩增获得含上游同源臂基因片段F的PCR产物；使用引物ΔptsG-3和ΔptsG-4扩增获得含下游同源臂基因片段r的PCR产物。
引物ΔptsG-1和ΔptsG-2的具体序列如下：
ΔptsG-1：5’-cattgtgaccttccgtaatgcgg-3’；SEQ ID NO.1。
ΔptsG-2：5’-ctgccttagtctttacgttctcacgcgtggcaag-3’；SEQ ID NO.2。
引物ΔptsG-3和ΔptsG-4的具体序列如下：
ΔptsG-3：5’-cgtgagaacgtaaagactaaggcagccagatggc-3’；SEQ ID NO.3。
ΔptsG-4：5’-tgagcaggataatgtcgctcagtcc-3’；SEQ ID NO.4。
PCR扩增体系：Primestar酶（Takara）25 µL，上下游引物各2 µL，模板 1 µL，ddH2O20 µL。
PCR扩增程序：98 ℃预变性3分钟；98℃变性10秒，57℃退火30秒，72℃延伸10秒/kb，35个循环；72℃延伸10分钟。
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和产物回收后得到上游同源臂基因片段F和下游同源臂基因片段r。
以上游同源臂基因片段F和下游同源臂基因片段r为底物，ΔptsG-1和ΔptsG-4为引物，PCR扩增获得含敲除片段ΔptsG-1000的PCR产物。扩增体系和扩增条件同上。
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和产物回收后得到敲除片段ΔptsG-1000。
（1-2）第二步：制备敲除质粒ΔptsG-gRNA。
以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，ΔptsG-gRNA-F和gRNA-R为引物扩增获得含ΔptsG-gRNA基因片段的PCR产物。扩增体系和扩增条件同上。
ΔptsG-gRNA-F和gRNA-R的具体序列如下：
ΔptsG-gRNA-F：5’-GGACTAGTGATGCCATAGGCAACAACTGgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.5。
gRNA-R：5’-CCGctcgagtagggataacagggt-3’；SEQ ID NO.6。
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和产物回收后得到ΔptsG-gRNA基因片段。
将ΔptsG-gRNA基因片段和pEcgRNA质粒分别用内切酶XhoI和SpeI在37℃条件下分别酶切2小时，酶切产物经过回收后分别得到ΔptsG-gRNA酶切片段和酶切的pEcgRNA片段。
ΔptsG-gRNA基因片段酶切体系：ΔptsG-gRNA基因片段40µL，XhoI酶1 µL，SpeI 1µL，rCutSmart 5 µL，ddH2O 3 µL。
pEcgRNA质粒酶切体系：pEcgRNA质粒40µL，XhoI酶1 µL，SpeI 1 µL，rCutSmart 5µL，ddH2O 3 µL。
将ΔptsG-gRNA酶切片段和酶切的pEcgRNA片段在T4 DNA连接酶作用下22 ℃连接2小时，获得连接产物。
T4 DNA连接酶连接体系：ΔptsG-gRNA酶切片段2 µL，T4 DNA连接酶1 µL，T4 DNA连接酶缓冲液1 µL，酶切的pEcgRNA片段1 µL，ddH2O 5 µL。
将10 µL上述连接产物按照使用说明转入购买的商业trans 10感受态（全式金公司），37 ℃复苏1小时，涂在含50 µg/mL壮观霉素的LB固体培养基平板中，37 ℃培养12小时获得单菌落。
将上述单菌落接种于50 µg/mL壮观霉素的LB液体培养基中，培养12小时，提取质粒并测序，测序结果显示敲除ptsG基因的即为敲除质粒ΔptsG-gRNA。
（1-3）第三步：敲除ptsG基因：将质粒pEcCas电转入BW25113宿主感受态细胞中37℃复苏，涂于含50 µg/mL硫酸卡那霉素的LB平板，37℃培养至长出单菌落。将上述携带pEcCas质粒的单菌落接于LB（加50 µg/mL硫酸卡那霉素抗性）试管中37℃培养12 h。
从上述试管中转接1mL菌液于含20 mL LB液体培养基的小瓶中，加50 µg/mL硫酸卡那霉素和终浓度10 mM的阿拉伯糖，37℃培养至菌液浓度为OD=0.6~0.8。
利用上述菌液中的大肠杆菌制备感受态细胞，100 µL的感受态细胞中加入100 ngΔptsG-gRNA敲除质粒及400 ng敲除片段ΔptsG-1000，进行电转化，电转化结束立即加入1mL预冷的LB液体培养基，37℃复苏1h，涂于含有50 µg/mL硫酸卡那霉素和50 µg/mL壮观霉素的双抗LB平板上，37℃培养至长出单菌落。
挑取单菌落测序验证，测序结果显示敲除ptsG基因的菌株为获得的敲除ptsG基因的菌株。
（1-4）第四步：敲除质粒ΔptsG-gRNA和pEcCas的消除：
挑取3到6株敲除ptsG基因的菌株于含3 mL LB液体培养基的试管中，需加入50 µg/mL硫酸卡那霉素和终浓度20mM鼠李糖，培养约12 h。将上述试管中的菌液吸取10 µL转接于含3 mL无抗LB液体培养基的试管中培养约12 h，然后划线于含20g/L蔗糖的LB平板上，37℃培养至长出单菌落。
挑取同一菌落分别点在无抗LB，含50 µg/mL硫酸卡那霉素的单抗LB和含50 µg/mL壮观霉素的单抗LB平板上，37℃过夜培养，若对应位置上只有无抗平板生长，说明该菌所含有的敲除质粒ΔptsG-gRNA和pEcCas已经消除，将其命名为工程菌株BW01，用于下一轮基因敲除。
（2）敲除iclR、ldhA、mgsA、pflB、tdcE、adhE、poxB和pta基因，除制备敲除片段所用引物不同及制备敲除质粒所用的上游引物不同外，其它步骤参照葡萄糖特异性酶IIBC组分（ptsG）基因的敲除方法。
①以工程菌株BW01为基础，敲除iclR基因，制备敲除片段所用引物为ΔiclR-1和ΔiclR-2以及ΔiclR-3和ΔiclR-4；制备敲除质粒所用的上游引物为ΔiclR-gRNA-F。敲除iclR基因后的菌株命名为工程菌株BW02。
具体引物序列如下：
ΔiclR-1：5’-TCCACTCGTCAGCACAAGCTCG-3’；SEQ ID NO.7。
ΔiclR-2：5’-ATATTGCCTCTGCTGTTAGCTAATGCAATAGTTACTGAACTGATCCG-3’；SEQ IDNO.8。
ΔiclR-3：5’-GCATTAGCTAACAGCAGAGGCAATATTCTGCCCATCATAC-3’；SEQ ID NO.9。
ΔiclR-4：5’-TTCTTATCAGCTTGTAAGACGGACGTGG-3’；SEQ ID NO.10。
ΔiclR-gRNA-F：5’-GGACTAGTACGATGAGGAACATGCACTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT-3’；SEQ ID NO.11。
②以工程菌株BW02为基础，敲除ldhA基因，制备敲除片段所用引物为ΔldhA-1和ΔldhA-2以及ΔldhA-3和ΔldhA-4；制备敲除质粒所用的上游引物为ΔldhA-gRNA-F。敲除ldhA基因后的菌株命名为工程菌株BW03。
具体引物序列如下：
ΔldhA-1：5’-caagcagaatcaagttctaccg-3’；SEQ ID NO.12。
ΔldhA-2：5’-agcggcaagaaagactttctccagtgatgttg-3’；SEQ ID NO.13。
ΔldhA-3：5’-agaaagtctttcttgccgctcccctgcattc-3’；SEQ ID NO.14。
ΔldhA-4：5’-tgtctgttttgcggtcgcc-3’；SEQ ID NO.15。
ΔldhA-gRNA-F：5’-GGACTAGTGATACGCGCGGTGAATACGGgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.16。
③以工程菌株BW03为基础，敲除mgsA基因，制备敲除片段所用引物为ΔmgsA-1和ΔmgsA-2以及ΔmgsA-3和ΔmgsA-4；制备敲除质粒所用的上游引物为ΔmgsA-gRNA-F。敲除mgsA基因后的菌株命名为工程菌株BW04。
具体引物序列如下：
ΔmgsA-1：5’-AATACCCAGCTCATCAACCAG-3’；SEQ ID NO.17。
ΔmgsA-2：5’-CTGTGCAATAAATGTACATCCGTAGTTAACTTTCCTACAG-3’；SEQ ID NO.18。
ΔmgsA-3：5’-GATGTACATTTATTGCACAGGTGGCAAACG-3’；SEQ ID NO.19。
ΔmgsA-4：5’-AACAGCTTAACCAATGGAGAC-3’；SEQ ID NO.20。
ΔmgsA-gRNA-F：5’-GGACTAGTACAAATGCTGATGAGCTGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT-3’；SEQ ID NO.21。
④以工程菌株BW04为基础，敲除pflB基因，制备敲除片段所用引物为ΔpflB-1和ΔpflB-2以及ΔpflB-3和ΔpflB-4；制备敲除质粒所用的上游引物为ΔpflB-gRNA-F。敲除pflB基因后的菌株命名为工程菌株BW05。
具体引物序列如下：
ΔpflB-1：5’-cagacaggtatgaatgccttc-3’；SEQ ID NO.22。
ΔpflB-2：5’-ggtaggtgttacttagatttgactgaaatcgtacagtaaaaagc-3’；SEQ IDNO.23。
ΔpflB-3：5’-agtcaaatctaagtaacacctaccttcttaagtggat-3’；SEQ ID NO.24。
ΔpflB-4：5’-atatgaccgcaaatggtcaatg-3’；SEQ ID NO.25。
ΔpflB-gRNA-F：5’-GGACTAGTACAGCCAGGTCATCTACACGgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.26。
⑤以工程菌株BW05为基础，敲除tdcE基因，制备敲除片段所用引物为ΔtdcE-1和ΔtdcE-2以及ΔtdcE-3和ΔtdcE-4；制备敲除质粒所用的上游引物为ΔtdcE-gRNA-F。敲除tdcE基因后的菌株命名为工程菌株BW06。
具体引物序列如下：
ΔtdcE-1：5’-gtcgactttggtgcgatgtc-3’；SEQ ID NO.27。
ΔtdcE-2：5’-tcctccggcgaataatctctctacaatacttcaactaaattatgc-3’；SEQ IDNO.28。
ΔtdcE-3：5’-agagattattcgccggaggatgtatgaaaaagattatc-3’；SEQ ID NO.29。
ΔtdcE-4：5’-cacggtatgcgaactggag-3’；SEQ ID NO.30。
ΔtdcE-gRNA-F：5’-GGACTAGTTGATGCCATACAGCGCTACGgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.31。
⑥以工程菌株BW06为基础，敲除adhE基因，制备敲除片段所用引物为ΔadhE-1和ΔadhE-2以及ΔadhE-3和ΔadhE-4；制备敲除质粒所用的上游引物为ΔadhE-gRNA-F。敲除adhE基因后的菌株命名为工程菌株BW07。
具体引物序列如下：
ΔadhE-1：5’-ggttgaccagcgcaaataac-3’；SEQ ID NO.32。
ΔadhE-2：5’-gcgctactgaaatgctctcctgataatgttaaactt-3’；SEQ ID NO.33。
ΔadhE-3：5’-ggagagcatttcagtagcgctgtctggcaa-3’；SEQ ID NO.34。
ΔadhE-4：5’-tgaactgtgcgccatcaatg-3’；SEQ ID NO.35。
ΔadhE-gRNA-F：5’-GGACTAGTGGATCAGGTTGATGTCTGGGgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.36。
⑦以工程菌株BW07为基础，敲除poxB基因，制备敲除片段所用引物为ΔpoxB-1和ΔpoxB-2以及ΔpoxB-3和ΔpoxB-4；制备敲除质粒所用的上游引物为ΔpoxB-gRNA-F。敲除poxB基因后的菌株命名为工程菌株BW08。
具体引物序列如下：
ΔpoxB-1：5’-TTCACGTACCGTGATGACCTG-3’；SEQ ID NO.37。
ΔpoxB-2：5’-GCCACCCTTTGGTTCTCCATCTCCTGAATGTG-3’；SEQ ID NO.38。
ΔpoxB-3：5’-ATGGAGAACCAAAGGGTGGCATTTCCCGTC-3’；SEQ ID NO.39。
ΔpoxB-4：5’-AACATGCAGCGCCAGATTG-3’；SEQ ID NO.40。
ΔpoxB-gRNA-F：5’-GGACTAGTGGTGAAAATAGCGTCATCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT-3’；SEQ ID NO.41。
⑧以工程菌株BW08为基础，敲除pta基因，制备敲除片段所用引物为Δpta-1和Δpta-2以及Δpta-3和Δpta-4；制备敲除质粒所用的上游引物为Δpta-gRNA-F。敲除pta基因后的菌株命名为工程菌株BW09（重组大肠杆菌BW09）。
具体引物序列如下：
Δpta-1：5’-CATGAGCGTTGACGCAATCAAC-3’；SEQ ID NO.42。
Δpta-2：5’-GATGACGAGAGGTTTATCCTCTTTCGTTACCGCC-3’；SEQ ID NO.43。
Δpta-3：5’-GAGGATAAACCTCTCGTCATCATCCGCAGC-3’；SEQ ID NO.44。
Δpta-4：5’-GATCCTGAGGTTAATCCTTCAAACGG-3’；SEQ ID NO.45。
Δpta-gRNA-F：5’-GGACTAGTAGAAAGTGACGGATTTAACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT-3’；SEQ ID NO.46。
（3）以工程菌株BW09为基础，过表达CO2固定模块相关基因（内源性大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶pck基因，外源性谷氨酸棒状杆菌丙酮酸羧化酶突变体pycP458S基因以及外源性蓝细菌来源的碳酸酐酶CA基因）和过表达还原三羧酸循环途径中相关基因（苹果酸脱氢酶mdh基因、富马酸酶B fumB基因和富马酸还原酶frdABCD基因），获得菌株BW15。
（3-1）过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶pck基因
（A1）第一步：制备过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因整合片段pck-1000。
以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，使用引物pck-1和pck-2扩增获得含上游同源臂基因片段F的PCR产物；使用引物pck-3和pck-4扩增获得含待整合基因pck（序列如SEQID NO.47所示）的PCR产物；使用引物pck-5和pck-6扩增获得含下游同源臂基因片段r的PCR产物。
具体引物序列如下：
pck-1：5’-tatcggcctggtgcaactctgg-3’；SEQ ID NO.48。
pck-2：5’-ctttaatgaattcactagtattatacctaggactgagct agctgtcaagtatagttactcaggcggcaacaac-3’；SEQ ID NO.49。
pck-3：5’-gtcctaggtataatactagtgaattcattaaagaggaga aaggtaccatgcgcgttaa caatggtttgacc-3’；SEQ ID NO.50。
pck-4：5’-gctgtaatgctgtttacagtttcggaccagccgctac-3’；SEQ ID NO.51。
pck-5：5’-tccgaaactgtaaacagcattacagccagcaggaag-3’；SEQ ID NO.52。
pck-6：5’-cagcggaatgctgtcattgttaataacg-3’；SEQ ID NO.53。
PCR扩增体系：Primestar酶（Takara）25 µL，上下游引物各2 µL，模板 1 µL，ddH2O20 µL。
PCR扩增程序：98 ℃预变性3分钟；98℃变性10秒，57℃退火30秒，72℃延伸10秒/kb，35个循环；72℃延伸10分钟。
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和产物回收后得到上游同源臂基因片段F、待整合基pck基因片段M和下游同源臂基因片段r。
以上游同源臂基因片段F、待整合基因pck片段M和下游同源臂基因片段r为底物，pck-1和pck-6为引物PCR扩增获得含过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因整合片段pck-1000的PCR产物。扩增体系和扩增条件同上。
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和产物回收后得到基因整合片段pck-1000。
（A2）第二步：制备整合质粒pck-gRNA。
除上游引物pck-gRNA-F不同外，其它整合质粒制备步骤参见上文（1-2）第二步：制备敲除质粒ΔptsG-gRNA。制备整合质粒pck-gRNA所用pck-gRNA-F引物序列如下：5’-GGACTAGTATTGCCGTTCATAATCCCTGgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.54。
（A3）第三步：整合pck基因到大肠杆菌基因组
基因整合步骤参见上文（1-3）第三步：敲除ptsG基因，除将上述（1-3）第三步：敲除ptsG基因中敲除质粒ΔptsG-gRNA和敲除片段ΔptsG-1000替换为整合基因所用的整合质粒pck-gRNA和整合片段pck-1000外，其它操作步骤与（1-3）第三步：敲除ptsG基因保持一致。
（A4）第四步：整合质粒pck-gRNA和pEcCas的消除：
参照上文（1-4）第四步：敲除质粒ΔptsG-gRNA和pEcCas的消除，消除整合质粒pck-gRNA和pEcCas。消除整合质粒pck-gRNA和pEcCas的大肠杆菌命名为工程菌株BW10，用于下一轮基因整合。
（3-2）过表达外源性谷氨酸棒状杆菌丙酮酸羧化酶突变体pycP458S基因、外源性蓝细菌来源的碳酸酐酶CA基因、苹果酸脱氢酶mdh基因、富马酸酶B fumB基因和富马酸还原酶frdABCD基因簇，除制备基因整合片段所用引物不同及制备整合质粒所用的上游引物不同外，其它步骤参照上述“（3-1）过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶pck基因”进行。
①以工程菌株BW10为基础，过表达外源性谷氨酸棒状杆菌丙酮酸羧化酶突变体pycP458S基因，制备基因整合片段所用引物为pyc-1和pyc-2（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）、pyc-3和pyc-4（以合成的SEQ ID NO.55为模板）以及pyc-5和pyc-6（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）；制备整合质粒所用上游引物为pyc-gRNA-F。过表达外源性谷氨酸棒状杆菌丙酮酸羧化酶突变体pycP458S基因后的菌株命名为工程菌株BW11。
SEQ ID NO.55为含J23100启动子（SEQ ID NO.55中1-35bp所示）和RBS（SEQ IDNO.55中36-78bp所示）的谷氨酸棒状杆菌丙酮酸羧化酶突变体pycP458S的核苷酸序列。
具体引物序列如下：
pyc-1：5’-gacaggattgccattagtagcatgaac-3’；SEQ ID NO.56。
pyc-2：5’-gctagcactgtacctaggactgagctagccgtcaacctggtcaaataacctatgagctcag-3’；SEQ ID NO.57。
pyc-3：5’-ttgacggctagctcagtcctaggtac-3’；SEQ ID NO.58。
pyc-4：5’-cggtgtcattgtagTGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3’；SEQ ID NO.59。
pyc-5：5’-GCAATAACTAGCActacaatgacaccgcagtgatgg-3’；SEQ ID NO.60。
pyc-6：5’-gcaatggtgttaatggcgtactg-3’；SEQ ID NO.61。
pyc-gRNA-F：5’-GGACTAGTCGTACTCAGGAGAAAAACAGgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.62。
②以工程菌株BW11为基础，过表达外源性蓝细菌来源的碳酸酐酶CA基因，制备基因整合片段所用引物为CA-1和CA-2（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）、CA-3和CA-4（以合成的SEQ ID NO.63为模板，其中40-74 bp为J23119启动子和75-117 bp为RBS）以及CA-5和CA-6（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）；制备整合质粒所用上游引物为CA-gRNA-F。过表达外源性蓝细菌来源的碳酸酐酶CA基因后的菌株命名为工程菌株BW12。
具体引物序列如下：
CA-1：5’-tccacctgcacttcaacatcttgtg-3’；SEQ ID NO.64。
CA-2：5’-GACACTGCGGATtcagtcagctaatattgcttatccgttgg-3’；SEQ ID NO.65。
CA-3：5’-attagctgactgaATCCGCAGTGTCTTGCGTCTC-3’；SEQ ID NO.66。
CA-4：5’-gcatcaatcgccGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTG-3’；SEQ ID NO.67。
CA-5：5’-CTAGCATAACCggcgattgatgctacagtggtgg-3’；SEQ ID NO.68。
CA-6：5’-aataactggctggctgctacacc-3’；SEQ ID NO.69。
CA-gRNA-F：5’-GGACTAGTAGTGCGCTGCTGAAGACGAGgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.70。
③以工程菌株BW12为基础，通过PglpA调控元件过表达内源性大肠杆菌苹果酸脱氢酶mdh基因，以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，制备基因整合片段所用引物为mdh-1和mdh-2（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）、mdh-3和mdh-4（以合成的SEQ ID NO.71为模板，其中1-230bp为厌氧表达调控元件PglpA）以及mdh-5和mdh-6（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）；制备整合质粒所用上游引物为mdh-gRNA-F。过表达内源性大肠杆菌苹果酸脱氢酶mdh基因后的菌株命名为工程菌株BW13。
具体引物序列如下：
mdh-1：5’-aagatgtcgtctggttgcagg-3’；SEQ ID NO.72。
mdh-2：5’-ctcactgaatcaggttcatcaggtgatgattaagctggaaatc-3’；SEQ ID NO.73。
mdh-3：5’-tcacctgatgaacctgattcagtgagagaacctgccgtttc-3’；SEQ ID NO.74。
mdh-4：5’-gggcttcttaacacttacttattaacgaactcttcgcccagg-3’；SEQ ID NO.75。
mdh-5：5’-gttcgttaataagtaagtgttaagaagcccatcagtctgataagg-3’；SEQ IDNO.76。
mdh-6：5’-cacgatgaccatgaactgaaggc-3’；SEQ ID NO.77。
mdh-gRNA-F：5’-GGACTAGTAGGTCATCGAGACAATCAGGgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.78。
④以工程菌株BW13为基础，通过PglpA调控元件过表达内源性大肠杆菌富马酸酶BfumB基因，制备基因整合片段所用引物为fumB-1和fumB-2（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）、fumB-3和fumB-4（以合成的SEQ ID NO.79为模板，其中1-230bp为厌氧表达调控元件PglpA）以及fumB-5和fumB-6（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）；制备整合质粒所用上游引物为fumB-gRNA-F。过表达内源性大肠杆菌富马酸酶B fumB基因后的菌株命名为工程菌株BW14。
具体引物序列如下：
fumB-1：5’-atcagccgcgatgagtctctg-3’；SEQ ID NO.80。
fumB-2：5’-ctcactgaatcagtgctatacgttttgccagaaggccg-3’；SEQ ID NO.81。
fumB-3：5’-aacgtatagcactgattcagtgagagaacctgccg-3’；SEQ ID NO.82。
fumB-4：5’-acgcaccagcacttacttagtgcagttcgcgcactg-3’；SEQ ID NO.83。
fumB-5：5’-tgcactaagtaagtgctggtgcgttaaatgattatcatgc-3’；SEQ ID NO.84。
fumB-6：5’-ttccagcgctgcatattcgcc-3’；SEQ ID NO.85。
fumB-gRNA-F：5’-GGACTAGTGGAATTTATGCTCTACACCAgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.86。
⑤以工程菌株BW14为基础，通过PfrdA调控元件过表达内源性大肠杆菌富马酸还原酶frdABCD基因簇，制备基因整合片段所用引物为 frdABCD-1和frdABCD-2（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）、frdABCD-3和frdABCD-4（以合成的SEQ ID NO.87为模板，其中1-300bp为厌氧表达调控元件PfrdA）以及frdABCD-5和frdABCD-6（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）；制备整合质粒所用上游引物为frdABCD-gRNA-F。过表达内源性大肠杆菌富马酸还原酶frdABCD基因簇后的菌株命名为工程菌株BW15（重组大肠杆菌BW15）。
具体引物序列如下：
frdABCD-1：5’-gaatcaacgttgatgattgcggtcagc-3’；SEQ ID NO.88。
frdABCD-2：5’-gagtagacttcgtgcccggatagcaggaaggtttctgtcaacaatc-3’；SEQ IDNO.89。
frdABCD-3：5’-tgctatccgggcacgaagtctactcgcaac-3’；SEQ ID NO.90。
frdABCD-4：5’-ccatcaggcatattcgttagattgtaacgacaccaatcagcgtg-3’；SEQ IDNO.91。
frdABCD-5：5’-cgttacaatctaacgaatatgcctgatggtgcaacac-3’；SEQ ID NO.92。
frdABCD-6：5’-cggttacagtcgccaattccatcc-3’；SEQ ID NO.93。
frdABCD-gRNA-F：5’-GGACTAGTAAATAGGGGAAATGTCACCAgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.94。
实施例2
以工程菌株BW15为基础，过表达乙醛酸途径中相关基因簇aceBA（苹果酸合成酶aceB和异柠檬酸酶aceA的基因簇aceBA），除制备基因整合片段所用引物不同及制备整合质粒所用的上游引物不同外，其它步骤参照上述“（3-1）过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶pck基因”进行。
以工程菌株BW15为基础，过表达内源性大肠杆菌基因簇aceBA，以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，制备基因整合片段所用引物为aceBA-1和aceBA-2、aceBA-3和aceBA-4（扩增获得的序列如SEQ ID NO.95所示）以及aceBA-5和aceBA-6；制备整合质粒所用上游引物为aceBA-gRNA-F。过表达内源性大肠杆菌基因簇aceBA后的菌株命名为工程菌株BW16（重组大肠杆菌BW16）。
SEQ ID NO.95为含J23119启动子（SEQ ID NO.95中1-35bp所示）和RBS（SEQ IDNO.95中36-62bp所示）的内源性大肠杆菌苹果酸合成酶和异柠檬酸酶基因簇aceBA。
具体引物序列如下：
aceBA-1：5’-aactgataggctcgatcagcgg-3’；SEQ ID NO.96。
aceBA-2：5’-ctttaatgaattcactagtattatacctaggactgagctagctgtcaaaacagatggcgattgacgcc-3’；SEQ ID NO.97。
aceBA-3：5’-ttgacagctagctcagtcctaggtataatactag-3’；SEQ ID NO.98。
aceBA-4：5’-cttatccagctttgaacgccttatccggcctac-3’；SEQ ID NO.99。
aceBA-5：5’-ggataaggcgttcaaagctggataagcagcaggtg-3’；SEQ ID NO.100。
aceBA-6：5’-ttgcagctcgttgaagattgtctggc-3’；SEQ ID NO.101。
aceBA-gRNA-F：5’-GGACTAGTAAAGTATTGATACAGCGTATgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.102。
实施例3
以工程菌株BW16为基础，依次过表达底物（葡萄糖和木糖）转运途径中相关基因（外源性运动发酵单胞菌的葡萄糖转运蛋白glf基因、葡萄糖激酶glk基因、木糖异构酶xylA基因和转醛醇酶talB基因）和丁二酸转运途径中相关基因（丁二酸外排蛋白yjjPB基因簇；yjjPB，包括两个亚基：putative succinate exporter YjjP 和putative succinateexporter YjjB），获得菌株BW21。
除制备基因整合片段所用引物不同及制备整合质粒所用的上游引物不同外，其它步骤参照上述“（3-1）过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶pck基因”进行。
①以工程菌株BW16为基础，过表达外源性运动发酵单胞菌的葡萄糖转运蛋白glf基因，以运动发酵单胞菌为模板，制备基因整合片段所用引物为glf-1和glf-2（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）、glf-3和glf-4（以合成的SEQ ID NO.103为模板）以及glf-5和glf-6（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）；制备整合质粒所用上游引物为glf-gRNA-F。过表达外源性运动发酵单胞菌的葡萄糖转运蛋白glf基因后的菌株命名为工程菌株BW17。
SEQ ID NO.103为含J23119启动子（SEQ ID NO.103中1-35bp所示）和RBS（SEQ IDNO.103中36-78bp所示）的外源通过外源葡萄糖转运蛋白基因（glf）序列。
具体引物序列如下：
glf-1：5’-aagctctgctgaacaattgcgatc-3’；SEQ ID NO.104。
glf-2：
5’-actagtattatacctaggactgagctagctgtcaaagccacagtaccaggtcaagttcag-3’；SEQ ID NO.105。
glf-3：5’-ttgacagctagctcagtcctaggtataatactag-3’；SEQ ID NO.106。
glf-4：5’-gacaggttcagGTTATTGCTCAGCGGTGGCAG-3’；SEQ ID NO.107。
glf-5：5’-CGCTGAGCAATAACctgaacctgtcgtgactgatgcc-3’；SEQ ID NO.108。
glf-6：5’-tcgtaccgaagacaatctggttgtcatg-3’；SEQ ID NO.109。
glf-gRNA-F：5’-GGACTAGTGGACCGGATATTTGACACGGgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.110。
②以工程菌株BW17为基础，过表达内源性大肠杆菌葡萄糖激酶glk基因，制备基因整合片段所用引物为glk-1和glk-2（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）、glk-3和glk-4（以合成的SEQ ID NO.111为模板）以及glk-5和glk-6（以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板）；制备整合质粒所用上游引物为glk-gRNA-F。过表达内源性大肠杆菌葡萄糖激酶glk基因后的菌株命名为工程菌株BW18。
SEQ ID NO.111为含J23119启动子（SEQ ID NO.111中91-125bp所示）和RBS（SEQID NO.111中126-168bp所示）的内源性葡萄糖激酶基因（glk）序列。
具体引物序列如下：
glk-1：5’-ggagttcagatgcttcaaattattagaggc-3’；SEQ ID NO.112。
glk-2：5’-CAGTCAGCTCCTTttgaatactcacctggcgtcct-3’；SEQ ID NO.113。
glk-3：5’-ggtgagtattcaaAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGG-3’；SEQ ID NO.114。
glk-4：5’-gatgatctttccctgtgttacagaatgtgacctaaggtctggc-3’；SEQ IDNO.115。
glk-5：5’-cacattctgtaacacagggaaagatcatcagaagttcac-3’；SEQ ID NO.116。
glk-6：5’-cgactcttatcataagaatgccggag-3’；SEQ ID NO.117。
glk-gRNA-F：5’-GGACTAGTACCCCTGATATACGACAACAgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.118。
③以工程菌株BW18为基础，过表达内源性大肠杆菌木糖异构酶xylA基因，以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，制备基因整合片段所用引物为xylA-1和xylA-2、xylA-3和xylA-4（扩增获得的序列如SEQ ID NO.119所示，其中1-366bp为原始表达调控元件）以及xylA-5和xylA-6；制备整合质粒所用上游引物为xylA-gRNA-F。过表达内源性大肠杆菌木糖异构酶xylA基因后的菌株命名为工程菌株BW19。
具体引物序列如下：
xylA-1：5’-aacctgctgtaccgccatc-3’；SEQ ID NO.120。
xylA-2：5’-ggccctacaccattaacccattacaagcccgctgc-3’；SEQ ID NO.121。
xylA-3：5’-cttgtaatgggttaatggtgtagggccttctgtagttagag-3’；SEQ ID NO.122。
xylA-4：5’-gtcatgcgtgttaactgtcgaacagataatggtttaccag-3’；SEQ ID NO.123。
xylA-5：5’-tctgttcgacagttaacacgcatgactcttgaaatcc-3’；SEQ ID NO.124。
xylA-6：5’-cgatgcggcttgtcatccttctatc-3’；SEQ ID NO.125。
xylA-gRNA-F：5’-GGACTAGTCAAGTGCACACAGCTCACCAgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.126。
④以工程菌株BW19为基础，过表达内源性大肠杆菌转醛醇酶talB基因，以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，制备基因整合片段所用引物为talB-1和talB-2、talB-3和talB-4（扩增后的序列如SEQ ID NO.127所示，其中1-278bp为原始表达调控元件）以及talB-5和talB-6；制备整合质粒所用上游引物为talB-gRNA-F。过表达内源性大肠杆菌转醛醇酶talB基因后的菌株命名为工程菌株BW20。
具体引物序列如下：
talB-1：5’-aacctcttgctatatatatgtcaaccg-3’；SEQ ID NO.128。
talB-:2：5’-gagggatatgcggtaagtggtgtgtaaattctagcc-3’；SEQ ID NO.129。
talB-3：5’-caccacttaccgcatatccctcttattgccggtcg-3’；SEQ ID NO.130。
talB-4：5’-ctgcggttggatggaatgattacagcagatcgccgatc-3’；SEQ ID NO.131。
talB-5：5’-ctgtaatcattccatccaaccgcagcatgttcttg-3’；SEQ ID NO.132。
talB-6：5’-actacatccgtgaggtgaatgtgg-3’；SEQ ID NO.133。
talB-gRNA-F：5’-GGACTAGTAAGCTGTGTAATACGCAATGgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.134。
⑤以工程菌株BW20为基础，通过原始表达调控元件过表达内源性大肠杆菌丁二酸外排蛋白yjjPB基因簇，以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，制备基因整合片段所用引物为yjjPB-1和yjjPB-2、yjjPB-3和yjjPB-4（扩增获得的序列如SEQ ID NO.135所示，其中1-504 bp为原始表达调控元件）以及yjjPB-5和yjjPB-6；制备整合质粒所用上游引物为yjjPB-gRNA-F。过表达内源性大肠杆菌丁二酸外排蛋白yjjPB基因簇后的菌株命名为工程菌株BW21（重组大肠杆菌BW21）。
具体引物序列如下：
yjjPB-1：5’-cagtgaaccagcgaacaaccag-3’；SEQ ID NO.136。
yjjPB-:2：5’-ggagtatgctgatatgaatctgtaggttctgaaccggttctagc-3’；SEQ IDNO.137。
yjjPB-3：5’-cagaacctacagattcatatcagcatactcctgctgcac-3’；SEQ ID NO.138。
yjjPB-4：5’-gtattacagtctgccctgtctctcatccgtgtgcttaagc-3’；SEQ ID NO.139。
yjjPB-5：5’-gatgagagacagggcagactgtaatacagtcgcttg-3’；SEQ ID NO.140。
yjjPB-6：5’-agcaatcagcgatggtgctc-3’；SEQ ID NO.141。
yjjPB-gRNA-F：5’-GGACTAGTGATAAACAGGAAACACGGGGgttttagagctagaaatagcaagtt-3’；SEQ ID NO.142。
实施例4 重组大肠杆菌BW09在厌氧瓶中的发酵
种子培养基为LBG液体培养基：蛋白胨10 g/L， 酵母粉5 g/L， NaCl 10 g/L，葡萄糖10 g/L。
发酵培养基I：葡萄糖15 g/L，木糖5 g/L，K2HPO4 3.5 g/L，KH2PO4 5 g/L，（NH4）2HPO4 3.5g/L，NaCl 1g/L，CaCl2•2H2O 30 mg/L，MgSO4•7H2O 1.2 g/L，酵母粉5.0 g/L，微量元素溶液0.2%，生物素4×10-4 g/L，维生素B1 4× 10-4 g/L。
微量元素溶液配制方法：称取1 g FeSO4·7H2O，1g MnSO4·H2O，0.1g ZnSO4•7H2O，0.2g CuSO4，0.002g NiCl2·6H2O，加水定容成100 mL，再加入100 µl浓盐酸调节pH，然后过膜滤菌，在发酵培养基体系中加0.2%。
重组大肠杆菌BW09厌氧发酵生产丁二酸，包括以下步骤：
（1）种子培养：挑取大肠杆菌BW09单菌落接种到LBG液体培养基， 37 ℃，200 rpm培养12 h，再次转接至新鲜LBG液体培养基二次活化12 h，将活化好的菌株BW09用于生长测试或发酵。
（2）种子扩大培养：恒温摇床条件为37℃、200 rpm，于250mL挡板瓶中装入50 mL发酵培养基I，接种终浓度OD600=0.5，每菌株作3个平行实验，好氧培养12 h。
（3）厌氧发酵培养：将好氧培养好的菌体，5000 rpm离心4 min收集菌体，然后加入50 ml的发酵培养基I并加入15 g/L的碳酸氢钠维持pH，转入总体积100 mL厌氧瓶中，放置于恒温摇床，37℃、200 rpm，培养72 h。
分析方法：采用UltiMate3000高效液相色谱仪（HPLC，赛默飞）检测发酵液中的组分测定。发酵液中糖和有机酸的浓度测定采用Bio-Rad AminexHPX-87H有机酸色谱柱。结果见表1。
表1
表1结果显示，在厌氧瓶中菌株BW09产生了9.3 g/L的丁二酸，厌氧发酵阶段转化率为0.81 g/g（总糖）。厌氧发酵阶段转化率（%）=丁二酸产量/葡萄糖与木糖的消耗总量x100%。
实施例5 重组大肠杆菌BW15在厌氧瓶中的发酵
重组大肠杆菌BW15在厌氧瓶中的发酵生产方法和检测方法参照实施例4。结果见表2。
表2
表2结果显示，在厌氧瓶发酵过程中，菌株BW15产生了13.1 g/L的丁二酸，厌氧发酵阶段转化率为0.90 g/g（总糖）。
实施例6 重组大肠杆菌BW16在厌氧瓶中的发酵
重组大肠杆菌BW16在厌氧瓶中的发酵生产方法和检测方法参照实施例4。结果见表3。
表3
表3结果显示，在厌氧瓶发酵过程中，菌株BW16产生了15.2 g/L的丁二酸，厌氧发酵阶段转化率为0.93 g/g（总糖）。
实施例7 重组大肠杆菌BW21在厌氧瓶中的发酵
重组大肠杆菌BW21在厌氧瓶中的发酵生产方法和检测方法参照实施例4。结果见表4。
表4
表4结果显示，在厌氧瓶发酵过程中，菌株BW21产生了17.9 g/L的丁二酸，厌氧发酵阶段转化率为0.98 g/g（总糖）。
实施例8 重组大肠杆菌BW21在5 L发酵罐中的发酵
发酵培养基II：葡萄糖30 g/L，木糖10 g/L，K2HPO4 3.5 g/L，KH2PO4 5 g/L，（NH4）2HPO4 3.5g/L，NaCl 1g/L，CaCl2•2H2O 30 mg/L，MgSO4•7H2O 1.2 g/L，酵母粉5.0 g/L，微量元素溶液0.2%，生物素4×10-4 g/L，维生素B1 4×10-4 g/L。重组大肠杆菌BW21在5 L发酵罐中“好氧-厌氧两阶段发酵生产丁二酸”，包括以下步骤：
（1）种子培养：挑取大肠杆菌BW21单菌落接种到LBG液体培养基，37 ℃，200 rpm培养12 h，再次转接至新鲜LBG液体培养基二次活化12 h，将活化好的菌株BW21用于生长测试或发酵。
（2）发酵菌体培养：于5 L挡板瓶中装入2 L发酵培养基II，起始接种OD600终浓度为1，初始pH为7.0，溶氧（DO）偶联转速并维持在40%，培养温度37℃、好氧培养12 h，此时菌体达到发酵生产所用菌体的生物量。
（3）5L发酵罐厌氧发酵：好氧培养12 h，当菌体达到发酵生产所用菌体的生物量时，停止通气，搅拌固定在100 rpm，温度提高至38℃开始培养，此时记为发酵0h，发酵过程中当检测到葡萄糖浓度低于5 g/L时，同时补加30 g葡萄糖和10 g木糖，培养至发酵结束。
分析方法：采用UltiMate3000高效液相色谱仪（HPLC，赛默飞）检测发酵液中的组分测定。发酵液中糖和有机酸的浓度测定采用Bio-Rad AminexHPX-87H有机酸色谱柱。结果见表5。
表5
表5结果显示，在5 L发酵罐中菌株BW21产生了92 g/L的丁二酸。发酵结束时，最终的发酵液体积为2.6 L，所得丁二酸质量为92 g/L*2.6 L=239.2 g；发酵过程进行5次补料，每次补加30 g葡萄糖和10 g木糖，消耗的总糖为：80 g+40 g*5-[（10.5 g/L +2.9 g/L）*2.6 L]=245.2 g；丁二酸对总糖的转化率为：239.2 g/245.2 g=0.98 g/g(总糖)。
实施例9 重组大肠杆菌BW21代谢纤维素水解液生产丁二酸
玉米秸秆纤维素水解液的制备方法：将玉米秸秆粉碎后用25目孔径的筛网筛选得到玉米秸秆粉末，将玉米秸秆粉末加入到1%的NaOH溶液中，使溶液中玉米秸秆粉的固体量达到10%，然后在100℃处理1 h，然后过滤后获得玉米秸秆渣。将获得的玉米秸秆渣用自来水冲洗，当其pH与自来水pH相同时停止冲洗，然后将玉米秸秆渣在50 ℃烘干备用。称取干燥的玉米秸秆渣溶于0.05 M的磷酸溶液中，使溶液中玉米秸秆渣的固体量达到20%，加入终浓度为40FPU/g（玉米秸秆渣）的诺维信公司生产的诺纤力赛力三代HS纤维素酶（154 FPU/mL），然后置于摇床中，50℃，200 rpm，酶解72 h，酶解结束后4500 rpm离心15min，取上清得到玉米秸秆纤维素水解液。
发酵培养基III：玉米秸秆纤维素水解液（含58.1 g/L葡萄糖和21.8 g/L木糖），K2HPO4 3.5 g/L，KH2PO4 5 g/L，（NH4）2HPO4 3.5g/L，NaCl 1g/L，CaCl2•2H2O 30 mg/L，MgSO4•7H2O 1.2 g/L，酵母粉5.0 g/L，微量元素溶液0.2%，生物素4×10-4 g/L，维生素B1 4×10-4 g/L。
重组大肠杆菌BW21在1 L发酵罐中厌氧发酵生产丁二酸，包括以下步骤：
（1）种子培养：挑取大肠杆菌BW21单菌落接种到LBG液体培养基，37 ℃，200 rpm培养12 h，再次转接至新鲜LBG液体培养基二次活化12 h，将活化好的菌株BW21离心收集菌体用于厌氧发酵生产的种子。
（2）发酵菌体培养：于1L发酵罐中装入0.4 L发酵培养基III，接种OD600终浓度为30，初始pH为7.0，转速200 rpm, 培养温度38℃、培养至发酵结束。
（3）分析方法：采用UltiMate3000高效液相色谱仪（HPLC，赛默飞）检测发酵液中的组分测定。发酵液中糖和有机酸的浓度测定采用Bio-Rad AminexHPX-87H有机酸色谱柱。结果见表6。
表6
表6结果显示，在1 L发酵罐中菌株BW21代谢玉米秸秆纤维素水解液产生了70.2g/L的丁二酸。发酵结束时，最终的发酵液体积为0.44 L，所得丁二酸质量为70.2 g/L*0.44L=30.9 g；消耗的总糖为：（58.1 g/L +21.8 g/L）*0.4 L=31.96 g；丁二酸对总糖的转化率为：30.9 g/31.96 g=0.97 g/g(总糖)。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为经过底盘微生物改造的重组大肠杆菌（Escherichia coli）；
所述底盘微生物改造为以大肠杆菌BW25113为出发菌株，敲除ptsG、iclR、ldhA、mgsA、pflB、tdcE、adhE、poxB和pta基因。
2.根据权利要求1所述的一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌，其特征在于，还包括CO2固定模块和还原三羧酸循环途径模块；
所述CO2固定模块过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）来源的pycP458S基因和碳酸酐酶基因；
所述还原三羧酸循环途径模块通过厌氧表达调控元件过表达苹果酸脱氢酶基因、富马酸酶B基因和富马酸还原酶frdABCD基因簇。
3.根据权利要求2所述的一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌，其特征在于，
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因为内源性大肠杆菌（Escherichia coli）磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因；
所述碳酸酐酶基因为蓝细菌PCC 7002（Synechococcus sp. PCC 7002）来源的碳酸酐酶基因；
所述苹果酸脱氢酶基因为内源性大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因；
所述富马酸酶B基因为内源性大肠杆菌富马酸酶B基因；
所述富马酸还原酶基因簇为内源性大肠杆菌富马酸还原酶基因簇；
所述内源性大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因序列如SEQ ID NO.47所示；
所述谷氨酸棒状杆菌来源的pycP458S基因序列如SEQ ID NO.55中79-3536bp所示；
所述蓝细菌PCC 7002来源的碳酸酐酶基因序列如SEQ ID NO.63中118-901 bp所示；
所述内源性大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因序列如SEQ ID NO.71中231-1169 bp所示；
所述内源性大肠杆菌富马酸酶B基因序列如SEQ ID NO.79中231-1877 bp所示；
所述内源性大肠杆菌富马酸还原酶基因簇序列如SEQ ID NO.87中301-3612 bp所示；
所述厌氧表达调控元件为厌氧条件下高表达内源性大肠杆菌富马酸还原酶黄蛋白亚基PfrdA或内源性大肠杆菌厌氧甘油-3-磷酸脱氢酶亚基A PglpA；
所述内源性大肠杆菌富马酸还原酶黄蛋白亚基PfrdA序列如SEQ ID NO.87中1-300bp所示；
所述内源性大肠杆菌厌氧甘油-3-磷酸脱氢酶亚基A PglpA序列如SEQ ID NO.79中1-230bp所示。
4.根据权利要求3所述的一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌，其特征在于，还包括乙醛酸途径模块；
所述乙醛酸途径模块过表达苹果酸合成酶和异柠檬酸酶基因簇aceBA。
5.根据权利要求4所述的一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌，其特征在于，
所述苹果酸合成酶和异柠檬酸酶基因簇aceBA为内源性大肠杆菌苹果酸合成酶和异柠檬酸酶基因簇aceBA；
所述内源性大肠杆菌苹果酸合成酶和异柠檬酸酶基因簇aceBA序列如SEQ ID NO.95中63-3041bp所示。
6.根据权利要求5所述的一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌，其特征在于，还包括葡萄糖和木糖底物转运途径模块和丁二酸转运途径模块；
所述葡萄糖和木糖底物转运途径模块过表达葡萄糖转运蛋白基因、葡萄糖激酶基因、木糖异构酶基因和转醛醇酶基因；
所述丁二酸转运途径模块过表达丁二酸外排蛋白yjjPB基因簇基因。
7.根据权利要求6所述的一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌，其特征在于，
所述葡萄糖转运蛋白基因为运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）来源的葡萄糖转运蛋白基因；
所述葡萄糖激酶基因为内源性大肠杆菌葡萄糖激酶基因；
所述木糖异构酶基因为内源性大肠杆菌木糖异构酶基因；
所述转醛醇酶基因为内源性大肠杆菌转醛醇酶基因；
所述丁二酸外排蛋白yjjPB基因簇为内源性大肠杆菌丁二酸外排蛋白yjjPB基因簇；
所述运动发酵单胞菌来源的葡萄糖转运蛋白基因序列如SEQ ID NO.103中79-1540 bp所示；
所述内源性大肠杆菌葡萄糖激酶基因序列如SEQ ID NO.111中169-1134 bp所示；
所述内源性大肠杆菌葡萄木糖异构酶基因序列如SEQ ID NO.119中367-1684 bp所示；
所述内源性大肠杆菌转醛醇酶基因序列如SEQ ID NO.127中279-1238 bp所示；
所述内源性大肠杆菌丁二酸外排蛋白yjjPB基因簇序列如SEQ ID NO.135中505-1773bp所示。
8.一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以大肠杆菌BW25113为出发菌株，依次敲除ptsG、iclR、ldhA、mgsA、pflB、tdcE、adhE、poxB和pta基因，获得改造的大肠杆菌；和/或
（2）在改造的大肠杆菌中过表达权利要求2所述的CO2固定模块、还原三羧酸循环途径模块；和/或
过表达权利要求4所述的乙醛酸途径模块；和/或
过表达权利要求6所述的葡萄糖和木糖底物转运途径模块和丁二酸转运途径模块。
9.权利要求1-7任一项所述的基因工程菌或权利要求8所述的方法在生产丁二酸和提高丁二酸产量中的应用。
10.一种高效共利用葡萄糖、木糖生产丁二酸的方法，其特征在于，利用权利要求1-7任一项所述的基因工程菌或权利要求8所述的方法构建的基因工程菌进行发酵；发酵所用碳源为：（1）葡萄糖、木糖；或（2）秸秆纤维素水解液。
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