KR101549637B1

KR101549637B1 - 신규한 Ｔｈ1 세포 전환용 에피토프 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101549637B1
Application number: KR1020120088645A
Authority: KR
Inventors: 권병세
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2012-08-13
Publication date: 2015-09-03
Anticipated expiration: 2032-08-13
Also published as: US20140072566A1; US20180371055A1; US20140065152A1; US11053298B2; KR20130138062A; US20160024177A1; US10851151B2; KR20130138063A; US9255151B2; KR20130138064A; US20160244503A1; US11072646B2; KR101566539B1; US20140072565A1; US20180362612A1; US20160046691A1; US20180170997A1; US9309321B2; US9255152B2; KR101566538B1

Abstract

본 발명은 신규한 T 세포를 T_H1 세포(Helper T cell 1)로 전환하기 위한 에피토프에 관한 것으로서, 구체적으로 AITR(activation-inducible tumor necrosis factor receptor)의 세포 외 도메인(Extracellular domain, ECD)의 56번 내지 65번 아미노산 부위(서열번호 2)인 에피토프, 상기 에피토프를 인지하는 항체, 상기 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환체, 상기 항체를 포함하는, T 세포의 T_H1 세포로의 전환용 조성물 및 전환방법, 상기 항체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 항체를 이용하여 암을 치료하는 방법 및 상기 항체를 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 Ｔｈ1 세포 전환용 에피토프 및 이의 용도{Novel epitope for switching to Th1 cell and use thereof}

TNFR 슈퍼 패밀리(tumor necrosis factor receptor superfamily)에 속하는 다양한 수용체들은 세포 증식, 분화, 사멸에 연관되어 있고, 면역 반응의 발달, 종양 사멸 및 자가면역 질환에 대한 보호 등에 있어 중요한 역할을 수행하고 있다. 상기 TNFR 슈퍼 패밀리에 속하는 수용체의 예로, CD28, 4-1BB, OX40, CD40 또는 CD27이 있다.

인간 활성-유도성 종양 괴사 인자 수용체(activation-inducible tumor necrosis factor receptor, AITR)는 TNFR 슈퍼 패밀리의 한 구성원으로서, GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), TNFRSF18(Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18) 또는 CD357로도 명명된다. AITR은 제1형TNFR 슈퍼 패밀리에 속하는 막관통 단백질(transmembrane protein)이다. 면역 조절 T 세포(T_reg 세포 또는 CD4⁺CD25^high T 세포)는 GITR을 지속적으로 높은 수준으로 발현하고, 말초혈액 단핵세포(PBMCs, peripheral blood mononuclear cell)가 활성화되면 GITR을 빠르게 높인다. 특히, GITR을 통한 신호전달은 T_reg 세포의 억제 기능(suppressive function)을 저해시키는 것으로 알려져 있고, CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 T_reg 세포의 억제에 대한 저항성을 높여, 상기 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포들을 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 또한, GITR에 특이적으로 결합하는 단일클론항체(예:DTA-1) 또는 이것의 생리학적 리간드인 GITRL는 in vivo의 다양한 모델에서 항암 면역(antitumor immunity)을 강화시키는 것으로 알려져 있다. 반면, GITR의 활성은 자가면역 반응에서는 자가반응성 T 세포를 억제하는 능력을 가진 T_reg 세포을 억제하여 자가면역 반응을 촉진하기도 한다고 알려져 있다.

AITR 및 AITR 리간드에 대한 생물학적 기능에 대한 정보는 아직 많이 밝혀지지 않았으나, AITR은 휴지기 T 세포(resting T cell)에서 낮은 수준으로 발현되나, T 세포가 활성화된 후에는 그 발현이 급격히 증가하는 것으로 알려져 있다. 또한, 요추 디스크 탈출증(lumber disc herniation) 환자에서 탈출된 디스크 조직의 세포에서 AITR의 발현 수준이 증가되어 있으며, 활성 전신성 홍반성 루프스(active systemic lupus erythematosus)와 같은 자가면역 질환을 가진 환자의 T_reg 세포에서 AITR의 발현 수준이 높은 것으로 알려져 있다.

AITR은 TRAF(TNFR-associated factor)1, TRAF2 및 TRAF3과 같은 TRAF 단백질들과 결합하며, AITR에 리간드가 상호작용하는 경우, 세포 내에서 TRAF2를 동원하고, 결국 NF-kB/NIK를 활성화시키는 것으로 알려져있다(Kwon, B. et al., J Biol Chem 274, 6056-6061, 1999). TRAF 단백질들은 세포 내 어댑터 단백질 종류에 속하며, 세포밖 증식(extracellular proliferation), 분화, 활성화 및 이동 신호 전달에 관여한다. TRAF 단백질의 N-말단 지역은 매우 다양하며, TRAF1을 제외한 모든 TRAF 단백질들은 RING-핑커 모티프(RING-finger motif)를 N-말단에 가진다. RING-핑거는 TRAF에 의해 매개되는 신호전달에 매우 필수적인 것으로 알려져 있다. 6 종류의 모든 TRAF 단백질들에 대한 유전자를 마우스에서 유전자 타겟팅으로 결실시킨 결과, 다양한 표현형을 나타내어, TRAF 단백질이 매우 다양한 생물학적 기능을 할 것이라고 알려진바 있다(Ha, H., Curr Protoc Immunol. Chapter 11:Unit11.9D, 2009).

NFAT(nuclear factor of activated T cells)로 알려진, Ca² ⁺ 의존성 전사인자는 T 세포 뿐만 아니라, 많은 종류의 성장 인자, 사이토카인을 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한, 세포 간 상호작용 분자(cell-to-cell interaction molecule)로서 다양한 세포 및 기관에서 형태발생(morphogenesis), 발생(development) 및 여러 기능에 관여하고 있다. 최근, NFAT는 T-bet(T_H1), GATA-3(T_H2), RORγt(T_H17) 및 Foxp3(T_reg)와 같은 T_H 계통특이적인 전사인자(T_H lineage specific transcription factor)의 전사조절을 통하여 T_H 계통으로의 분화 및 기능 조절을 유도하는 특정 유전자 프로그램의 중요한 인자로 알려져 있다. 또한, NFAT 패밀리는 다양한 사이토카인 및 이들의 사이토카인 수용체의 전사를 조절한다고 보고된바 있다(Macian, F. Nat Rev Immunol. 5, 472-484, 2005).

CD4⁺ T 세포의 운명을 결정하는 데 있어 가장 중요한 요인 중 하나는 미접촉 TCR에 의한 CD4⁺ T 세포(naive CD4⁺ T cell)가 활성화될 때 존재하는 주변의 사이토카인 환경이다. 사이토카인에 의해 유도되는 주요한 신호전달경로는 STAT(signaling transducer and activator of transcription) 패밀리 단백질의 활성화이다. 상기 STAT 단백질들은 T_H 세포의 분화 및 확장(expansion)에 있어 중요한 역할을 하며, 특히, IFN-γ/NFAT1/STAT-1 경로는 T_H1 세포로 분화하게 하는 전사인자 T-bet을 활성화시키고, NFAT1/STAT-3 경로는 T_H17 세포로 분화하게 하는 전사인자 RORγt를 활성화시킨다. 또한, IL-4/NFAT2/STAT-6 경로는 T_H2 세포로 분화하게 하는 GATA-3를 활성화시키고, NFAT1/STAT-5 경로는 T_reg 세포로 분화하게 하는 Foxp3를 활성화를 촉진시킨다. 이렇게 복잡한 세포 내 신호전달 캐스케이드(cascade)가, T_H 세포의 분화 및 기능 결정에 있어 주요하게 작용하게 된다.

비접촉 T 세포(naive CD4 T cell)은 T_H1, T_H2, T_H17 및 유도된 T_reg 세포, 4가지로 분화될 수 있는 가능성을 가지고 있다. 그 중 T_H1 세포의 경우, 세포 내 병원균(pathogen)에 대한 면역 반응을 조절하는 역할을 하며, 특히 인간에서는 마이코박테리아(mycobacteria) 감염에 대한 저항에 있어 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. T_H1 세포의 가장 주된 사이토카인은 IFN-γ(Interferon-γ), LTα(lymphotoxin α) 및 IL-2로서, 그중에서도 IFN-γ는 대식세포(Macrophage)의 활성화에 있어 매우 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. IFN-γ는 이합체 형태의 수용성 사이토카인으로서, 선천성 및 후천성 면역에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 특히, 암과 같은 질병에 있어서는 종양의 성장을 억제하는 것으로 보고된 바 있다(Ikeda H, et al., Cytokine Growth Factor Rev. 13(2), 95-109, 2002).

T_reg 세포는 종양 환경(tumor environment)에서 높은 수준으로 존재하며, T 세포의 효과기 기능(effector function)을 억제할 수 있다. 따라서, T_reg 세포와 작용 T 세포(Effector T cell)를 함께 adoptive transfer할 때 작용 T 세포의 adoptive transfer가 가지는 치료학적 효과가 떨어지게 된다. 또한, T_reg 세포에 의해 분비되는 TGF-β는 T 세포의 세포독성 기능(cytotoxic function)을 억제시킬 수 있음이 알려져 있다. 따라서 종양에서 T_reg 세포의 분화를 유도하여 종양 내의 T_reg 세포의 수를 감소시킬 수 있는 치료학적 약물에 대한 개발이 요구된다.

이에 본 발명자들은, T 세포를 특이적으로 분화시킬 수 있는 방법을 찾기 위하여 예의 노력한 결과, 조절 T 세포에 존재하는 AITR의 세포 외 도메인의 일부분인 56번 내지 65번에 특이적으로 결합하는, AITR에 특이적인 항체를 개발하였고, 상기 항체가 조절 T 세포에 작용하여 IFN-γ를 분비하는 작용 T 세포인 T_H1 세포로 전환시킬 수 있으며, 이에 따라 종양 내의 조절 T 세포의 수를 현저히 감소시켜 항암 효과를 나타낼 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 정의되는, T 세포를 T_H1 세포(Helper T cell 1)로 전환하기 위한, AITR(activation-inducible tumor necrosis factor receptor)의 에피토프(epitope)인 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 2로 기재된 AITR의 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 에피토프 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는, T 세포의 T_H1 세포(보조 T 세포 1)로의 전환용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 T 세포에 처리하는 단계를 포함하는, T 세포의 T_H1 세포(보조 T 세포 1)로의 전환 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는, 면역 증강용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 이용하여 면역을 증강시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 정의되는, T 세포를 T_H1 세포(Helper T cell 1)로 전환하기 위한, AITR(activation-inducible tumor necrosis factor receptor)의 에피토프(epitope)인 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명에서 용어, "AITR(activation-inducible tumor necrosis factor receptor)"은 TNFR 슈퍼 패밀리에 속하는 수용체의 일종을 의미하며, GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), TNFRSF18(tumor necrosis factor receptor superfamily member 18) 또는 CD357과 혼용될 수 있다. 상기 AITR 은 바람직하게는 인간 AITR을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. AITR에 대한 정보는 NCBI GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NP_004186일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 AITR은 활성화된 T 세포 또는 T_reg 세포에서 지속적으로 높은 수준으로 발현한다.

본 발명에서 용어, "에피토프(epitope)"란, 항원 분자에 존재하는 항원 특이성을 결정하는 부위를 의미하며, 항원결정기 또는 항원결정부위와 혼용되어 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 에피토프는 AITR의 세포 외 도메인의 56번 내지 65번 부위로서, T 세포를 T_H1 세포로 전환시킬 수 있는 부위를 의미하나, 동일한 활성을 나타내는 부위인한, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 활성과 동일한 활성을 나타내는 서열인한, 상기 서열과 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열도 제한없이 포함될 수 있다. 상기 AITR의 세포 외 도메인의 56번 내지 65번 부위를 도 3 및 표 2에 나타내었고, 서열번호 2로 명명하였다. 서열번호 2의 아미노산 서열로 기재된 에피토프로 T 세포를 T_H1 세포로 전환시킬 수 있는 부위임은 본 발명자들에 의해서 최초로 규명되었다. 본 발명자들은 139개의 아미노산으로 이루어진 AITR의 세포 외 도메인(서열번호 1)에서 T 세포를 T_H1 세포로 특이적으로 전환시킬 수 있는 특정 부위를 찾기 위하여 예의 노력한 결과, 서열번호 2로 기재된 56번 내지 65번 아미노산 부위를 에피토프로 하는 경우, 특이적으로 T_H1 세포로 전환시킬 수 있음을 확인하였다. 56번 내지 65번의 인접한 부위의 경우에는 T_H1 세포로의 전환 활성을 보여주지 않아, 상기 부위가 T_H1 세포로 전환에 있어 매우 특이적인 부위임을 규명하였다(실험예 2 및 4 내지 8).

본 발명에서 용어, "T 세포를 T_H1 세포(Helper T cell 1)로 전환"이란, 서열번호 2로 기재된 AITR의 특정 에피토프에 항체가 결합하거나 특이적인 비항체 단백질 등이 결합하여 T 세포를 T_H1 세포로 전환하는 것을 의미하며, 바람직하게는 T 세포에 존재하는 서열번호 2로 기재된 AITR의 에피토프에 항체가 결합하여 IFN-γ를 분비하는 T_H1 세포로 전환시키는 것을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 T_H1 세포는 IFN-γ(interferon-γ)를 생산하는 면역 세포로서, 세포 내 병원균(intracellular pathogen)에 대한 면역 반응을 매개하며, 종양에 있어서는 암을 예방하는 것으로 알려져 있다. 종양의 T_H1 세포에 의한 염증(inflammation)은 암을 촉진시키지 않고, 오히려 예방하는 것으로 알려져 있다(Haabeth OA et al., Nat Commun 2011; 2:240). 따라서 T 세포를 T_H1 세포로 전환시킬 수 있는 본 발명의 서열번호 2로 기재된 AITR의 에피토프인 폴리펩티드는 암의 예방 또는 치료용 항체 등의 개발에 있어 유용하게 사용될 수 있다.

상기 T 세포의 T_H1 세포로의 전환에서, T 세포는 T_reg 세포(조절 T 세포, Regulatory T cell)일 수 있다.

본 발명에서 용어, "T_reg 세포"는 T 세포의 소집단(subpopulation)으로서, 면역 시스템을 저하(down-regulation)시킬 수 있는 T 세포의 일종을 의미하며, T_reg 세포, CD4⁺CD25^high 세포 또는 CD4⁺CD25^highFoxp3⁺ 세포와 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 T_reg 세포는 자연 조절 T 세포(natural or constitutive regulatory T cell) 및 적응 조절 T 세포(adaptive or inducible regulatory T cell)를 모두 포함한다. 종양에 있어 T_reg 세포는 국지적 종양 성장(local tumor growth)을 촉진시킨다. 따라서, 암에 대한 면역학적 치료법에 있어 T_reg 세포는 큰 장애로 여겨지고 있으며, 종양 면역(tumor immunity)에 있어 종양 조절 T 세포를 저하시키는 것이 암의 치료에 있어 중요한 부분으로 여겨지고 있다(Liu Z et al., J Immunol 182(10), 6160-7, 2009). 따라서, T_reg 세포의 T_H1 세포로의 전환은 암에 있어 매우 유용한 예방 또는 치료법이 될 수 있다.

상기 T_reg 세포의 T_H1 세포로의 전환에는 T_H1 분화에 관련된 신호전달경로 및 전사인자가 관련한다. 특히, Foxp3 전사인자는 T_reg 세포에 특이적인 세포내 마커로서, T_reg 세포가 T_H1 세포로 분화되는 경우에는 Foxp3의 세포 내 수준이 저하되게 된다. 반면, T_H1 세포의 분화에 관여하는 전사인자인 T-bet는 IFN-γ/NFAT1/STAT-1 경로를 통하여 그 수준이 증가되게 된다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 2의 에피토프를 특이적으로 인지하는 본 발명의 대표적인 항체인 A27에 의하여, T_reg 세포가 T_H1 세포로 분화됨을 확인하였다. 특히, 서열번호 2의 에피토프 이외의 부위를 인지하는 AITR에 특이적인 항체의 경우에는 상기와 같은 전환 효과를 나타내지 못하였다. 구체적으로, 41번 내지 50번 아미노산 부위를 인지하는 A35와 20번 내지 30번 아미노산 부위를 인지하는 A41 항체는 에피토프 부위가 AITR의 세포 외 도메인 56번 내지 65번 부위와 매우 근접하였음에도 불구하고, T_H1 세포로 전환효과를 가져오지 못하였다(도 3 및 도 12). 특히, A35 또는 A41을 처리하여 특정 사이토카인을 분비하는 세포로 전환시켰더라 하더라도, 본 발명의 서열번호 2의 에피토프를 인지하는 A27 항체를 처리하는 경우, 다시 IFN-γ를 분비하는 세포로 전환되었다. 이러한 결과는 서열번호 2의 에피토프가 T_H1 세포로의 전환에 있어 매우 중요한 부위임을 시사하는 결과이다(도 10 및 11). 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 2의 에피토프를 통한 T_H1 세포로의 전환에 대한 분자적인 메커니즘을 규명하였다. T_H1 세포로의 전환에 있어, NFAT1이 관여하며, STAT-1 단백질의 인산화 수준을 증가시킴을 확인하였다(도 15 및 16). 또한, T_reg 세포에 특이적인 마커인 Foxp3는 감소시키는 반면, T_H1 세포에 특이적인 마커인 T-bet는 증가시킴을 보여 이를 통하여 T_reg 세포를 T_H1 세포로 효율적으로 전환시킬 수 있음을 나타내었다(도 16).

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 2의 AITR의 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가(bivalent) 또는 양특이성 분자(예를 들어, 양특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

본 발명에서 용어, "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다. 인간 항체는 통상적으로 인간의 질병의 치료에 사용되는데, 이는 3가지 이상의 잠재적인 장점을 가질 수 있다. 먼저, 이는 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)에 의하여 목적 세포를 보다 효율적으로 파괴시킬 수 있다. 둘째로, 인간 면역 체계가 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는 이점이 있다. 셋째로, 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 이점이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 2의 에피토프를 특이적으로 인지하는 인간 단일클론항체가 AITR에 대하여 강한 친화력을 나타내며, T 세포를 T_H1 세포로 효과적으로 전환시킬 수 있음을 확인하였다(도 1, 10 및 11). T 세포를 T_H1 세포로 효과적으로 전환시킬 수 있는 상기 항체는 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래이기 때문에 낮은 면역원성을 나타내므로 암의 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "서열번호 2의 AITR(activation-inducible tumor necrosis factor receptor) 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체"는 서열번호 2의 에피토프를 특이적으로 인지하여 T 세포의 T_H1 세포로의 전환을 가져올 수 있는 항체를 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 항체는 특히 T_reg 세포에 있어서 T_H1 세포로 전환시키므로, 암의 예방 또는 치료 및; 면역 증강에 있어서 유용하게 사용될 수 있다.

상기 서열번호 2로 기재된 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체는 바람직하게는 서열번호 6으로 기재된 중쇄 CDR1(complementarity-determining region 1); 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 10으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 12로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 5로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 9로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 서열번호 5로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 9로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 인간 단일클론항체를 A27로 명명하였다. 상기 서열번호 2로 기재된 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체를 코딩하는 핵산은 서열번호 13으로 기재된 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열; 및 서열번호 14로 기재된 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 서열번호 2로 기재된 에피토프를 인지하는 AITR에 특이적인 인간 단일클론항체는 바람직하게는 서열번호 16으로 기재된 중쇄 CDR1(complementarity-determining region 1); 서열번호 17로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 18로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 20으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 21로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 22로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 15로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 19로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 서열번호 15로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 19로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 항체를 B32로 명명하였다. 상기 서열번호 2로 기재된 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체를 코딩하는 핵산은 서열번호 23으로 기재된 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열; 및 서열번호 24로 기재된 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이와 같이, 본 발명은 서로 다른 서열로 이루어진 항체여도 서열번호 2의 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체라면 T 세포를 T_H1 세포로 특이적으로 전환시킬 수 있음을 확인하였으며, 암의 예방 또는 치료, 및 면역 증강에 유용하게 사용될 수 있음을 구체적으로 확인하였다.

또한, 본 발명의 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 불변 영역을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 그 예로, IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 불변 영역으로부터 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다.

본 발명에서 용어, "하이브리드(hybrid)"란 단쇄 면역 글로불린 중쇄 불변 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하며, 그 예로 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하다. 한편, IgG의 아형인 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중쇄 불변영역의 조합 또는 혼성화도 가능하다. 상기 조합 및 혼성화에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

또한, 본 발명의 항체가 경쇄 불변영역을 포함하는 경우, 상기 경쇄 불변영역은 람다(λ) 또는 카파(κ) 경쇄 유래일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 AITR에 특이적으로 결합하는 항체인 A27 및 B32를 인간 항체 라이브러리로부터 선별해내었으며(실험예 1), AITR에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였고(도 1), 상기 항체들이 인지하는 AITR 세포 외 도메인 부분을 규명하였다(도 3 및 표 2). 또한, 상기 항체들이 다른 AITR의 부위를 인지하는 항체들과 달리, T 세포를 T_H1 세포로 전환시킬 수 있으며, 이미 특정 T 세포로 분화된 경우에도 T_H1 세포로 다시 전환시킬 수 있음을 확인하였다(실험예 7 내지 8, 및 도 10 및 11). 이러한 결과는 본 발명의 서열번호 2의 에피토프를 인지하는 AITR에 특이적인 항체가 T 세포, 특히 T_reg 세포를 T_H1 세포로 효율적으로 전환시킬 수 있고, 이를 통하여 암의 예방 또는 치료, 및 면역 증진에 유용하게 사용될 수 있음을 뒷받침하는 결과이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 항체는 공지의 항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나(Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495), 파아지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다클론항체의 제조방법은 공지의 항체 제조기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있으며, 본 발명의 에피토프를 포함하는 항원을 이용하여 제조할 수 있다.

파아지 디스플레이 기술을 이용한 항체 라이브러리는 하이브리도마를 제작하지 않고 바로 B 림프구로부터 항체 유전자를 얻어 파아지(phage) 표면에 항체를 발현시키는 방법이다. 파아지 디스플레이 기술을 이용하면 B-세포 불멸화(immortalization)에 의해 단일클론항체를 생성하는데 관련된 기존의 많은 어려움이 극복될 수 있다. 일반적으로 파아지 디스플레이 기술은 1) 파아지의 외피 단백질(coat protein) pⅢ (또는 pⅣ) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 수용체 물질을 처리하는 단계; 4) 수용체에 결합된 펩티드-파아지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 패닝(panning)에 의하여 용출된 파아지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 펩티드의 서열을 결정하는 단계로구성된다.

바람직하게 본 발명의 단일클론항체의 제조방법은 파아지 디스플레이 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 당업자는 공지의 파아지 디스플레이 기술, 예를 들어 Barbas 등(METHODS : A Companion to Methods in Enzymology 2:119, 1991 및 J. Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9) 및 Winter 등(Ann. Rev.Immunol. 12:433, 1994) 의 논문 등에 공지된 방법을 참고하여 상기 본 발명의 제조방법의 각 단계를 용이하게 수행할 수 있다. 항체 라이브러리를 구축하기 위해 사용될 수 있는 파아지는, 예를 들어 필라멘트성 파아지(filamentous phage)로 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 파아지가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 필라멘트성 파아지의 표면상에 이종 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터에는 예를 들어, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 또는 fdtetDOG 등의 파아지 벡터 또는 pHEN1, pComb3, pComb8 또는 pSEX 등의 파아지미드 벡터가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 증폭을 위한 재조합 파아지의 성공적인 재감염을 위해 요구되는 야생형 외피 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 헬퍼 파아지에는, 예를 들어 M13K07 또는 VSCM13 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 하이브리도마 유래의 단일클론항체 또는 파아지 디스플레이 클론을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 그 예로, 하이브리도마 또는 파아지 주형 DNA로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 일단 상기 폴리뉴클레오티드가 단리되면, 이를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여, 형질전환된 숙주세포(즉, 형질전환체)로부터 원하는 단일클론항체을 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 항체의 제조 방법은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 증폭시키는 단계를 포함하는, 항체의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 에피토프 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 제공하는 상기 에피토프 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.

상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "도입"은 상기 에피토프 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 포함하는, T 세포의 T_H1 세포로의 전환용 조성물을 제공한다.

상기 항체, T 세포, T_H1 세포 및 T 세포의 T_H1 세포로의 전환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 서열번호 2의 AITR의 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체는 T 세포의 T_H1 세포로 특이적으로 전환시킬 수 있으므로, 상기 항체를 포함하는 조성물은 T 세포의 T_H1 세포로의 전환에 있어 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 이미 분화가 완료된 세포를 다시 T_H1 세포로 전환시킬 수 있으므로 목적에 따라 다양하게 이용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 T 세포에 처리하는 단계를 포함하는, T 세포의 T_H1 세포로의 전환 방법을 제공한다.

상기 항체, T 세포, T_H1 세포 및 T 세포의 T_H1 세포로의 전환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 항체를 T 세포, 특히 조절 T 세포에 처리하는 경우 T_H1 세포로 효과적으로 전환되므로, 상기 항체를 이용하여 T_H1 세포를 전환시켜 T_H1 세포가 필요한 질병 등에 있어서 유용하게 사용할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "암"은 본 발명의 항체에 의해 치료될 수 있는 암이라면 그 종류에 제한없이 포함되나, 그 예로 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 또는 다발성 골수종 혈액암일 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 암을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 2의 에피토프에 결합하는 본 발명의 항체가 T 세포를 효율적으로 IFN-γ를 생산하는 T_H1 세포로 전환시킴을 확인하였다. 상기에서 설명한 바와 같이 본 발명의 항체는 암의 예방 또는 치료에 있어 큰 장애가 되는 T_reg 세포의 수를 현저하게 감소시킬 수 있으며, 암의 예방 또는 치료에 도움이 되는 T_H1 세포의 수를 증가시킬 수 있으므로 항암 치료에 있어서 효과적으로 사용될 수 있다(도 4, 도 12 및 14). 특히, 서열번호 2의 에피토프에 결합하는 대표적인 항체인 A27이 대조군에 비하여 현저한 항암 효과가 있음을 in vivo에서 확인하여(도 17), 서열번호 2의 에피토프를 인지하는 A27이 암의 치료에 있어서 유용하게 사용될 수 있다는 것을 확인하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 항체 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 암을 치료하는 방법은 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 암이 발병되거나 발명 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다. 상기 암을 치료하는 방법은 바람직하게는 항체를 포함하는 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있다.

상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유 동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 암이 치료되는 개체는 제한없이 포함된다.

이때, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 서열번호 2의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 상기에서 설명한 바와 같이 본 발명의 항체는 조절 T 세포를 IFN-γ를 생산하는 T_H1 세포로 효율적으로 전환시키므로, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물을 인체 내에 투여하여, 암의 발생, 증식 또는 전이를 억제시키거나 진행을 막아 암을 치료할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응(immune response)을 강화시키는 방법을 제공한다.

상기 항체, 개체 및 투여에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 서열번호 2의 에피토프를 인지하는 본 발명의 항체는 면역 반응을 억제시키는 T_reg 세포를 IFN-γ 또는 IL-2를 분비하여 면역 반응을 유도하는 T_H1 세포로 전환시키므로, 상기 항체를 개체에 투여하여 면역 반응을 강화시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 암환자의 경우, 정상인에 비하여 T_reg 세포의 비율이 3배 가량 높았으므로(실험예 8 및 도 13 및 14), 상기 항체를 암에 걸렸거나 암이 의심되는 개체에 투여하는 경우에는 특히, 면역 반응을 보다 효과적으로 높일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 포함하는, 면역 증강용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 약학적 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

식품 조성물인 경우, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분은 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드(예를 들어, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예를 들어, 말토스, 슈크로스, 올리고당 등) 및 폴리사카라이드(예를 들어, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제(예를 들어, 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등과 같은 스테비아 추출물) 및 합성 향미제(예를 들어, 사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

본 발명에서는 T 세포를 T_H1 세포(Helper T cell 1)로 전환시킬 수 있는 서열번호 2의 AITR의 신규한 에피토프를 규명하여, 상기 에피토프에 특이적으로 인지하는 항체가 T 세포를 T_H1 세포로 효과적으로 전환시킬 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 항체는 T 세포를 T_H1 세포로 전환시키므로, T_reg 세포의 감소 및 T_H1 세포의 증가가 필요한 암과 같은 질병의 예방 또는 치료에 있어 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은, 인간 항체 라이브러리로부터 얻은 항-AITR 단일클론항체의 제조에 관한 도이다. A는 파지 디스플레이(phage displaying)에 의해 선별된 항-AITR Fab 클론 및; 일시적으로 형질전환시킨 HEK 293 세포에서 생성된 이가 형태(bivalent form)의 항-AITR 단일클론항체를 쿠마시 블루 염색(commassie blue staining)을 통하여 보여주는 도이다. B는 AITR을 과발현시킨 Jurkat 세포에서 항-AITR 단일클론항체들이 AITR과 결합하는 것을 PE-컨쥬게이션된 항-AITR 단일클론항체로 염색한 다음, 유세포 분류기로 확인한 결과이다. C는 PBMCs를 항-CD3 및 IL-2 또는 LPS(Lipopolysaccharide)로 2일 동안 자극시킨 후, PE-컨쥬게이션된 항-AITR 단일클론항체(클론 A41)로 염색시킨 다음, 이를 CD4⁺, CD8⁺ 및 CD19⁺로 분류한 결과이다. D는 항-CD3 및 IL-2로 3일 동안 자극시킨 정제된 CD4⁺T 세포를 보여주는 것으로, 활성화된 CD4⁺T 세포에서의 AITR의 발현을 PE-컨쥬게이션된 항-AITR 단일클론항체들로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는, 활성화에 의존적인 방식으로 CD4⁺ T 세포가 AITR을 발현함을 보여주는 도이다. 분리한 PBMCs를 항-CD3/IL-2 또는 LPS로 2일 동안 자극시켰다; A는 PE-컨쥬게이션된 항-AITR 단일클론항체(클론 A41)로 염색한 세포들을 CD4⁺, CD8⁺및 CD19⁺ 세포로 분류한 결과이다. CD8⁺T(중간 판넬) 또는 CD19⁺세포(아래쪽 판넬)에 대해 CD4⁺T 세포(위쪽 판넬)에서 AITR의 발현(화살표)을 염색하여 나타내었다; B는 PE-컨쥬게이션된 항-AITR 단일클론항체로 염색한 세포들을 CD11c⁺CD14⁺ 세포, BDCA-2⁺세포 및 CD56⁺세포로 분류한 결과이다. 비처리군(왼쪽) 또는 활성화된 군(오른쪽)에 대해 AITR의 발현을 염색한 다음, 확인하였다. 대표적인 유세포 분류기 프로파일을 도트-플롯 다이아그램을 나타내었다. 각 군에서 AITR을 발현하는 세포의 비율을 나타내었다. 3번의 독립적인 실험 중 한 번의 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 항-AITR 단일클론항체의 에피토프 맵핑(epitope mapping)에 관한 도이다. A는 전장 AITR(Full-length AITR) 및 항체의 유도 및 에피토프 맵핑에 사용된 재조합 GST 단백질 용해물에 대한 모식도를 나타낸 것이다. Top: AITR의 ICD(intracellular domain) 및 ECD(extracellular domain); Bottom: 12개의 AITR 재조합 단백질인 R1, R2 및 R3 내지 R12(R3-R12); B는 항-AITR 단일클론항체가 전체 AITR-ECD의 각 단편에 특이적으로 결합하는 능력을 보여주는 웨스턴 블랏팅 결과이다. 쿠마시 블루 염색으로 AITR-GST 단백질의 단편(Top 및 left 판넬)을 나타내었고, 분자량 마커 및 재조합 GST 단백질 크기를 왼쪽에 나타내었다.
도 4는, 본 발명의 각기 다른 AITR의 세포 외 도메인 부분을 인지하는 항 AITR 단일클론항체가 서로 다른 표현형을 가진 CD4⁺ T 세포로의 분화를 유도하는 것을 보여주는 도이다. A는 정제된 CD4⁺T 세포에 항-CD3 및 항-AITR 단일클론항체(A27, A35 또는 A41)를 3일 동안 처리한 다음, 인간 T_H1/T_H2 사이토카인 비드 어세이 및 IL-17A ELISA 어세이로 분비된 사이토카인을 분석한 결과를 나타내는 도이다. B는 정제된 CD4⁺T 세포에 항-CD3 및 IL-2를 3일 동안 처리하고, 항-AITR 단일클론항체 또는 AITR 리간드를 7일간 처리하였다. 배양한 세포에 대하여 세포 내 IL-4, IFN-γ 및 IL-17A에 대해 염색한 다음, 이를 유세포 분류기로 분석하였다. IL-4+ 세포, IFN-γ+ 세포 및 IL-17A+ 세포의 비율(%)를 계산하였다. 이때, 바 그래프(Bar graph, mean ± SD)는 3번의 독립적인 실험을 수행한 것으로 나타낸 것이다. *p<0.05
도 5는, 항-AITR 단일클론항체에 의해 CD4⁺ T 세포에서 세포 분열(cell division)이 유도됨을 나타내는 도이다. CFSE-라벨된 CD4⁺ T 세포를 항-CD3 및 IL-2가 코팅되어 있는 바닥이 납작한 96 웰 조직 배양 플레이트에 깔고, 항-AITR 단일클론항체를 3일 동안 처리하였다. 유세포 분류기로 세포 분열의 최대 5 사이클까지 해상도(resolution)을 히스토그램으로 나타내었다. 3번의 독립적인 실험 중 한 번의 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은, CD4⁺ T 세포에서 T_H 계열 마커(T_H lineage marker)의 유도를 나타낸 도이다. 정제된 CD4⁺ T 세포를 항-CD3/IL-2로 3일동안 자극하였고(A), 항-AITR 단일클론항체(B) 또는 AITR 리간드(C)를 7일 동안 처리하였다. 배양한 세포들의 세포 내 IL-4, IFN-γ 및 IL-17A을 염색하였고, 표면을 PE-컨쥬게이션된 AITR 단일클론항체(클론 41)로 염색한 다음, 유세포 분류기로 분석하였다. 3번의 독립적인 실험 중 한 번의 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 7은, 각기 다른 AITR의 세포 외 도메인 부분을 인지하는 본 발명의 항-AITR 단일클론항체들이 CD4⁺T 세포에서 서로 다른 신호전달 단백질을 동원하여 서로 다른 활성을 나타내는 것을 보여주는 도이다. 정제된 CD4⁺T 세포를 항-CD3 및 IL-2로 3일 동안 자극하였고, 항-AITR 단일클론항체들을 2, 6, 12 및 24시간 별로 처리하였다. A는 24시간 동안 세포를 배양한 후에, 세포를 용해시킨 후, 세포 용해물(Cell lysate)를 항-TRAF1, 2, 3, 5 및 6 또는 항-AITR 단일클론항체들로(A27, A35 및 A41) 단백질 G에 대해 면역 침강을 한 다음, 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과를 나타내는 도이다; B는 항-AITR 단일클론항체을 시간대 별로 처리한 세포의 용해물에 대해 항-NFAT1/2, p-p38, p-ERK1/2, p-JNK1/2, p-NF-kB을 사용하여 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 이때, 베타-액틴에 특이적인 항체를 사용하여 정상화(Normalization)하였다; C는 세포를 24시간 동안 배양한 후에, p-STAT-1, 3, 4, 5, 및 6에 대한 항체를 이용하여 유세포 분석을 수행한 결과를 나타낸 결과이다; D는 24시간 동안 세포를 배양한 후에, T-bet, GATA-3 및 RORγt 항체로 각각 염색한 다음, 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타내는 도이다; STAT 단백질의 발현 및 마스터 전사 인자의 발현을 나타내었다(검은색(filled histogram) 및 화살표 표시); 각 패널에 기재된 대표적인 양의 숫자는(mean±SD) 세 개의 독립된 실험으로부터 얻어진 것이다(흰색 선(Open histogram)은 대조군을 나타냄).
도 8은, CD4⁺ T 세포 및 T_reg 세포에서 항-AITR 단일클론항체에 의한 TRAF 단백질 동원 및 신호 전달 분자의 활성화를 나타내는 도이다.
도 9는, CD4⁺ T 세포 및 T_reg 세포에서 항-AITR 단일클론항체에 의한 STAT 단백질의 활성화 및 마스터 전사인자의 유도를 나타낸 도이다.
도 10은, CD4⁺T 세포에서의 항-AITR 단일클론항체에 의한 전환 효과(switching effect)를 나타낸 도이다; 정제된 CD4⁺T 세포를 항-CD3 및 IL-2로 3일 동안 자극하여 활성화시키고, 항-AITR 단일클론항체들을 7일 동안 처리하였다. 그 다음, 배양한 세포를 세척한 다음, 다른 또는 같은 에피토프를 가진 항체를 포함하는 배지로 7일 동안 재자극시켰다. 세포내 사이토카인(IFN-γ, IL-4, IL-17A)에 대하여 염색한 다음, 이펙터 표현형(Effector phenotype)을 확인하였다. 또한, 세포군의 수를 측정하였으며, 상기 데이터들은 3번의 독립적인 실험 결과를 나타내는 것이다(mean±SD). *p<0.05(다른 그룹과 비교)
도 11은, CD4⁺ T 세포에서 항-AITR 단일클론항체에 의한 스위칭 효과(switching effect)를 나타낸 도이다.
도 12는, AITR에 의해 매개되는 T_reg 세포의 T_H1 또는 T_H17 세포로의 전환 효과를 나타낸 도이다; 정상인과 암환자에게서 분리한 CD4⁺T 세포에 항-CD3/IL-2을 2일 동안 처리하여, 활성화시켰다; A는 정상인으로부터 분리한 CD4⁺CD25^high 세포에 항-AITR 단일클론항체를 7일 동안 처리하였다. 세포내 사이토카인(IFN-γ, IL-4, IL-17A)에 대하여 염색한 다음, 유세포 분류기로 이펙터 표현형을 확인하였다. B는 시간대 별로 세포를 모은 다음, 배양액에 있는 TGF-β, IFN-γ, IL-4 및 IL-17A 사이토카인을 측정한 결과이다; C는 분리한 CD4⁺CD25^high 세포(sorting CD4⁺CD25^high cell)를 항-AITR 단일클론항체로 자극시켰다. 각 시간대 별로 세포를 모은 다음, T-bet, RORγt, GATA-3 및 Foxp3의 항체를 이용하여 각각 염색하였다. 그 다음, 발현 및 MFI(mean fluorescence intensity)를 유세포 분석기를 이용하여 측정하였다; D는 암환자에서 분리한 CD4⁺CD25^high 세포에 항-AITR 단일클론항체를 7일 동안 처리하였다. 그 다음, 세포 내 사이토카인(IFN-γ, IL-4, IL-17A)에 대하여 염색한 다음, 유세포 분류기로 이펙터 표현형을 확인하였다. 유세포 분리기를 이용해서 분리하였고, 항-AITR 단일클론 항체들을 7일 동안 처리하였다. 배양된 세포의 내에 있는 IFN-γ, IL-4, IL-17A 사이토카인을 유세포 분석기를 이용하여 측정하였다. 세포군의 수를 계산하였다. 상기 결과들은 3번의 독립적인 실험에 대한 결과를 나타내는 것이다(mean±SD). *p<0.05(다른 그룹과 비교)
도 13은, AITR에 의해 매개되는 정상인으로부터 분리한 인간 T_reg 세포의 T_H1 또는 T_H17 세포의 전환을 나타낸 도이다. 정상인으로부터 정제된 CD4⁺ T 세포를 항-CD3/IL-2로 5일간 자극시켰다. A는 FACS 분류기(sorter)를 이용하여 분류한 CD4⁺CD25^high T 세포(R1) 및 CD4⁺CD25^-(R2) T 세포를 나타낸 도이다. 분류한 세포들의 AITR 및 Foxp3의 발현을 확인하였다; B는 분류한 CD4⁺CD25^high T 세포 및 CD4⁺CD25^- 세포에 항-AITR 단일클론항체를 처리하여 자극시켰다. 자극된 세포의 이펙터 표현형은 세포 내 사이토카인(IL-4, IFN-γ 및 IL-17A) 염색한 다음, 유세포 분류기로 확인하였다. 항-AITR 단일클론항체를 처리하고 Foxp3의 발현을 확인한 결과, A27에 의하여 그 발현이 저하됨을 확인하였다. 3번의 독립적인 실험 중 한 번의 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 14는, AITR에 의해 매개되는 암환자로부터 분리한 인간 T_reg 세포의 T_H1로의 전환을 나타낸 도이다. 암환자로부터 정제된 CD4⁺ T 세포(각 케이스 별로 n=10)은 항-CD3/IL-2로 5일간 자극하였다. A는 CD4⁺CD25^high T 세포를 FACS 분류기로 분류하였고, 분류한 CD4⁺CD25^high T 세포의 AITR 및 Foxp3 발현을 나타내었다. 상기 데이터는 3번의 독립적인 실험 결과를 나타내는 것이다(mean±SD). B는 분류한 CD4⁺CD25^high T 세포를 항-AITR 단일클론항체(클론 A27)로 7일간 자극한 결과를 나타내는 것이다. 자극된 세포의 이펙터 표현형은 세포 내 사이토카인(IL-4, IFN-γ 및 IL-17A) 염색한 다음, 유세포 분류기로 확인하였다. 항-AITR 단일클론항체를 처리하고 Foxp3 발현을 확인한 결과, A27에 의하여 Foxp3 발현이 저하되었다. 3번의 독립적인 실험 중 한 번의 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 15는, 항-AITR 단일클론항체에 의한 CD4⁺CD25^high T 세포에서의 TRAF 단백질의 동원 및 다른 신호 전달 분자의 활성을 나타낸 도이다. 분류한 CD4⁺CD25^high T 세포는 항-AITR 단일클론항체로 6, 12 또는 24시간 동안 자극하였다. A는 24시간 동안의 배양 후, 세포 용해물을 준비하고 이를 단백질 G에 대해 면역 침강한 다음 항-TRAF1, 2, 3, 5 및 6 또는 항-AITR 단일클론항체로 웨스턴 블랏한 결과를 나타내는 것이다. B는 각 시간대별 세포 용해물을 준비한 다음, 이를 NFAT1/2, p-p38, p-ERK1/2, p-JNK1/2, p-NF-kB 또는 β-ACTIN에 항체를 사용하여 웨스턴 블랏한 결과를 나타내는 것이다. β-ACTIN 발현은 대조군으로 사용되었다. 상기 결과들은 3번의 독립적인 실험 결과를 나타내는 것이다.
도 16은, 항-AITR 단일클론항체에 의한 CD4⁺CD25^high T 세포에서의 STAT 단백질 및 마스터 전사인자의 유도 및 활성화를 나타낸 도이다. 분류한 CD4⁺CD25^high T 세포를 항-AITR 단일클론항체로 자극시켰다. A는 24시간 동안의 배양 후, 세포를 준비하고, p-STAT-1, -3, -4, -5 및 -6에 대한 항체를 사용하여 유세포 분류기로 분석한 결과를 나타낸다. 대조군(채워지지 않은 히스토그램)에 대한 STAT 단백질의 발현(채워진 히스토그램, 화살표)을 표시하였다. 상기 결과들은 3번의 독립적인 실험들의 결과를 나타내는 것이다(mean±SD). b는 표시한 시간대별로 세포를 모아 T-bet, GATA-3, RORγt 및 Foxp3 항체로 염색한 다음, 유세포 분류기로 분석한 결과를 나타낸다. 3번의 독립적인 실험들 중 한 번의 실험 결과를 표시한 것이다.
도 17은, 각기 다른 AITR의 세포 외 도메인 부분을 인지하는 본 발명의 항-AITR 단일클론항체들의 항암효과를 비교한 도이다; Hu-PBL-SCID 마우스에 1X10⁶ 개의 H441 세포를 피하 내로 주입하였고, 종양 크기가 1cm에 달하였을 때, 항-AITR 단일클론항체를 복강 내로 주입하였다. A는 인간 말초단핵세포의 주입 후, 4주 내지 5주 후에 Hu-PBL-SCID 마우스로부터 분리한 PBMC에서 인간 T 세포의 발현을 유세포 분류기를 통해 분석한 결과를 나타내는 도이다. B는 Hu-PBL-SCID 마우스의 종양 크기(tumor volume, mm³)를 표시한 시간대 별로 각 그룹에서 측정한 결과를 나타내는 도이다(n=5-8); C는 항-AITR 단일클론항체 A27을 주입하고 12일 지난 후에, 쥐에서 PBMCs, 암세포, DLN(tumor-draining lymph nodes) 세포 및 비장 세포를 분리하여 이에 대해 인간 CD4, Foxp3, CD8, CD56 및 mCD45로 염색하였다. 그 다음, 마우스 CD45 음성군에서 인간군(human population)의 발현을 나타내었다. 이때, 세포군의 수를 계산하였다. 상기 결과들은 3번의 독립적인 실험에 대한 결과를 나타내는 것이다(mean±SD). *p<0.05(다른 그룹과 비교)
도 18은, Hu-PBL-SCID 마우스의 제조를 나타낸 도이다. A는 PBMCs을 주입하고 4 내지 5주 후에, Hu-PBL-SCID 마우스로부터 분리한 비장세포의 인간 세포(마우스 CD45 음성군) 또는 마우스 세포(마우스 CD45 양성군)의 발현을 유세포 분류기로 조사한 결과를 나타낸다. B는 마우스 세포(R1 게이트, 위쪽 판넬) 및 인간 세포(R2 게이트, 아래쪽 판넬)를 유세포 분류기로 림프구 군(lymphocyte population, hCD3, hCD4, hCD8 및 hCD19) 또는 비림프구 군(non-lymphocyte population, hCD11c, hCD14 및 hCD56)으로 분석하였다. 상기 데이터는 3번의 독립적인 실험 중 한 번의 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 19는, AITR의 세포 외 도메인 중 AA 56-65을 인지하는 항-AITR 항체인 A27이 종양 내의 T_reg 세포의 축적을 저해시키고, 종양 내 CD8+ T 세포 및 CD8+CD56+ T 세포의 활성을 증진시킴을 나타내는 도이다. Hu-PBL-SCID 마우스에 H441 폐암 세포 1X10⁶개를 피하 내로 주입한 다음, 항-AITR 단일클론항체 A27 또는 인간 IgG를 처리한 결과를 나타내는 것이다. a는 항체 주입 후 12일 후에 PBMC, 암세포, 종양-DLN(draining lymph nodes) 및 비장 세포를 분리하여 hCD4, hCD8, hFoxp3, hCD56 및 mCD45로 염색한 결과를 나타내는 것이다. 인간군(human population)은 마우스 CD45 음성군으로 게이트되었다. 3번의 독립적인 실험 결과 중 하나를 보여주는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포의 분리( Cell isolation )

정상인과 암환자로부터 갓 채취한 말초 정맥혈(peripheral venous blood)에 헤파린(heparin)을 처리한 다음, Ficoll-paque(GE Healthcare, Piscataway, NJ) 농도 구배 원심분리하여 말초혈 단핵 세포(peripheral-blood mononuclear cells, PBMCs)를 분리하였다. 분리한 PBMCs를 1% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 2일 동안 재현탁하였다. 그 다음, 항-CD4⁺(miltenyibiotec, gladbach, germany) 항체를 이용하여 미접촉 CD4⁺T 세포 아형(naive CD4⁺ T cell subsets)을 양성 선별(positive selection)하여 준비하였다. 상기 준비된 CD4⁺ T 세포 분획의 정제 수준은 ~97%였다.

고순도의 CD4⁺CD25^high ^/- T 세포를 얻기 위하여, 분리한 상기 CD4⁺T 세포를 7일 동안 0.1 ㎍/㎖의 항-CD3(HIT3a; BD PharMingen, San Diego, CA) 항체로 자극하였고, 100U/㎖의 IL-2(Interleukin-2, Peprotech, Rocky Hill, NJ)를 2일마다 첨가하였다. 그 다음, 배양한 CD4⁺ T 세포를 PE-cy5-컨쥬게이트 항-CD25 항체(PE-cy5-conjugated anti-CD25 antibody) 및 FITC-컨쥬게이트 항-CD4 항체(FITC-conjugated anti-CD4 antibody)로 염색한 다음, FACS Aria(BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용하여 CD4⁺CD25^high T 세포 또는 CD4⁺CD25^- T 세포를 분리하였다.

실시예 2: 항체 및 유세포 분석( Flow cytometry )

본 발명자들은 유세포 분석에 CD4, CD8, CD11c, IFN-γ, Foxp3, CTLA-4, CD62L, CD45RO, CD45RA(BD Bioscience), CD19, CD56, CD14, CD127, IL-4, IL-17A, GATA-3, T-bet, RORγt(ebioscience, San Diego, CA) 및 BDCA-2(Miltenyi Biotec)에 대한 형광색소가 컨쥬게이션된 항체(fluorochrome-conjugated antibodies)를 이용하였다. 또한, 항-AITR 항체의 경우, 비오틴화된(biotinylated) AITR-특이적 항체(클론 A27, A35, A41, B32 및 B62)을 이용하였다. 사이토카인(Cytokine)의 세포내 수준은 50ng/㎖의 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate, Sigma-Aldrich, St Louis. MO), 10㎍/㎖의 이오노마이신(ionomycin, Sigma-Aldrich, St Louis. MO) 및 10㎍/㎖ 브레펠딘 A(Brefeldin A, Sigma-Aldrich, St Louis. MO)을 5시간 전처리(pre-incubation)한 후, 측정하였다. 유세포 분석은 모두 FACSCalibur 유세포 분석기(BD Bioscience)를 이용하였고, WinMDI 소프트웨어, Ver2.9(Scripps. Institute)로 분석하였다.

실시예 3: 수용성 AITR 및 AITR 과발현 세포의 제조

AITR에 특이적인 인간 단일클론항체의 특이적인 결합은 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 또는 FACS를 이용하여 측정하였다. 수용성인 AITR-ECD(Extracellular domain, 26번-139번 아미노산) GST 융합 단백질을 제조하기 위해, 활성화된 CD4+ T 세포로부터 추출한 cDNA를 주형으로 하여, 하기 표 1의 AITR 코딩 서열에 대한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한 다음, 이를 BamH1/Xho1 제한효소로 절단(digestion)하고, pGEX-6p-1 벡터에 클로닝하여, GST-태그된 AITR-ECD 발현 벡터(pGEX-6p-1/AITR-ECD)를 제작하였다.

	서열(5'→3')	서열번호
정방향 프라이머	AAGCTTGGTCAGCGCCCCACCGGG	49
역방향 프라이머	CCGGCAGAGCCGCCTTAACTCGAG	50

상기 pGEX-6p-1/AITR-ECD를 대장균(BL21-DE3-pLyss)에 형질전환하여, IPTG(0.2mM)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 상기 대장균에서 발현한 재조합 AITR-GST 단백질은 글루타티온 아가로스 4B 비드 컬럼(glutathione agarose 4B bead column)을 이용하여 정제하였다.

AITR 과발현 세포를 제조하기 위하여, AITR-TM(transmembrane domain)-ECD를 포유동물 벡터(mammalian vector)인 pCDNA3.1(+)에 cd5l 서열에 in-frame으로 넣었다(pcDNA3.1(+)/CD5L-AITR-TM-ECD). pcDNA3.1(+)/Empty vector 또는 pcDNA3.1(+)/CD5L-AITR-TM-ECD을 전기천공법(electroporation)을 이용하여 Jurkat 세포에 일시적 형질감염(transient transfection)하였다. AITR의 세포 표면에서의 발현은 바이오틴-컨쥬게이션된 항-AITR 단일클론항체를 이용하여 염색하여 확인하였다.

실시예 4: 항- AITR 단일클론항체(A nti - AITR mAbs )의 제조

인간 Fab 항체 cDNA 라이브러리를 포함하는 pCANTAB5E 파지미드 벡터(phagemid vector)를 대장균 TG1에 형질전환하였다. 그 다음, 상기 형질전환체를 100㎍/㎖ 앰피실린 및 50㎍/㎖ 카나마이신을 포함하는 2 x YT 브로스(broth)에서 배양하였고, M13K07 헬퍼 파지(helper phage)로 초감염(superinfect)시켰다. 30℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양액을 원심분리하여 배양 상등액(culture supernant)만 취한 다음, 3.3%(w/w) 폴리에틸렌글라이콜(시그마) 및 2.3%(w/w) 염화나트륨(NaCl)을 첨가하여 재조합 파지 입자(recombinant phage particles)를 침전시킨 후, 침전된 파지를 다시 2 x YT 브로스에 재현탁하였다.

파지 디스플레이(phage display)로 인간 AITR-GST 융합 단백질에 특이적인 파지를 선별하기 위하여, 상기 현탁액을 라이브러리로 사용하여 바이오패닝(biopanning)을 수행하였다(1-4회 바이오패닝). ELISA를 이용하여 각각의 클론의 배양 상등액에서 생성된 상기 재조합 파지 입자에서 인간 AITR-GST 융합 단백질 양성 클론(positive clone)을 선별하였다.

또한, 2가(bivalent) 형태의 항체를 생성하기 위하여, 파지 디스플레이로부터 얻어진 Fab(VH 및 VL)유전자를 PCR로 제조한 다음, 이를 발현 벡터인 pDCMV-dhfr의 제한 효소 자리를 이용하여 삽입하였다. 그 결과, 5 가지 서로 다른 클론(A27, A35, A41, B62 및 B32)의 항체 유전자 및 이의 작제물(construct)를 얻을 수 있었다. 2가 형태의 항-인간 AITR 단일클론항체를 생산하기 위하여, 상기 작제물을 HEK293 및 CHO 세포에 일시적 형질감염시켰고, 단백질 G 컬럼을 이용하여 배양 상등액으로부터 정제하였다(GE healthcare).

실시예 5: 항- AITR 단일클론항체(A nti - AITR mAbs )의 에피토프 맵핑

본 발명의 항-AITR 단일클론항체가 인지하는 정확한 에피토프를 규명하기 위하여 AITR 세포 외 도메인(AITR extracellular domains)에 대한 12개의 단편(R1 내지 R12)을 제작하였고, 이를 GST-벡터인 pGEX-6p-1에 클로닝하였다(도 3 A).

pGEX-6p-1/R1-R12를 대장균(BL21-DE3-pLyss)에 형질전환한 다음, IPTG(0.20mM)을 첨가하여 단백질의 발현을 유도하였다. 상기 대장균에서 발현된 재조합 R1 내지 R12 GST 융합 단백질은 글루타티온 아가로스 4b 비드 컬럼(Peptron)을 이용하여 정제하였고, 이때, horseradish peroxidase-coupled anti-human IgG(sigma aldrich, st louis, missouri, USA)를 1:10,000으로 희석(dilution)하여 이용하였다. 또한, SuperSignal West Pico 화학 발광 기질(chemiluminescence substrate, Pierce, Rockford, IL)을 화학 발광을 검출하였다.

실시예 6: 세포 분열( Cell division ) 및 사이토카인(C ytokine ) 분석

본 발명에서는, CFSE(Molecular Probes, Invitrogen)를 CD4⁺T 세포에 부착시켰다. 항-CD3 항체(0.1㎍/㎖)/IL-2(100U/㎖) 및 5㎍/㎖의 항-AITR 단일클론 항체을 72시간 동안 처리하여 상기 CFSE가 부착된 CD4⁺T 세포(5x10⁵ 세포/웰)의 증식을 촉진시켰다. 72시간 동안 상기 세포를 배양한 다음, 세포 상등액을 분리하여 T_h1/T_h2 사이토카인 비드 어레이 키트(BD Bioscience), 인간 TGF-β1 Quantikine ELISA 키트(R&D 시스템, Minneapolis, MN) 및 인간 IL-17A ELISA 키트(Abcam, Cambridge, UK)로 사이토카인을 분석하였다.

실시예 7: 분화된 이펙터 ( Effector ) CD4 ⁺ T 세포 실험

정제한 CD4⁺T 세포(5x10⁵ 세포/웰)를 0.1㎍/㎖ 항-CD3 항체 및 100u/㎖ IL-2로 3일 동안 자극시켰다. 그 다음, 상기 배양된 세포에 다시 7일 동안 5㎍/㎖의 항-AITR 단일클론항체 또는 0.1㎍/㎖ AITR 리간드(AITRL)를 처리하였다.

그 다음, 분화된 작용 T 세포 아형(Effector T cell subsets)을 1xPBS로 세척한 다음, 처음 처리한 AITR 항체와 다른 에피토프를 인지하는 AITR 항체 5㎍/㎖를 포함하는 새 배지로 7일 동안 다시 배양하였고, 100U/㎖의 IL-2를 이틀마다 첨가하였다. 그 다음, 세포를 모으고, 세포 내 IFN-γ, IL-4 및 IL-17A를 염색하고, 3색 유세포 분석기(three-color flow cytometry)로 분석하였다.

실시예 8: AITR 과 TRAF 간의 상호작용 분석

정제된 CD4⁺ T 세포(5 x 10⁵ 세포/웰)를 0.1㎍/㎖ 항-CD3 항체 및 100U/㎖ IL-2로 2일 동안 자극하였다. 상기 배양된 세포를 5㎍/㎖ 항-AITR 단일클론항체로 24시간 동안 처리하였다. 배양된 세포를 100㎕ RIPA 버퍼(50mM Tris-HCL(pH 7.4), 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.25% Na-디옥시콜레이트, 1mM PMSF, 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제)로 용해하였다.

면역 침강(Immunoprecipitation)을 위해, 세포 용해물(cell lysate)에 20㎕의 단백질 G-세파로스(sepharose)의 1:1 슬러리(slurry)를 넣고, 한 시간동안 배양하였다. 그 다음, 침전물을 1XPBS로 세척하고, 단백질 복합체를 용출시켰다. 항-TRAFs(1, 2, 3, 5 및 6)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 또는 항-AITR 단일클론 항체로 웨스턴 블랏 분석을 수행하였고, Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG 또는 항-인간 IgG를 2차 항체로 사용하였다.

다른 실험에서는, 분류한 CD4⁺CD25^high T 세포(5x10⁵세포/웰)를 5㎍/㎖ 항-AITR 단일클론항체로 24시간 동안 자극시켰고, 상기와 같은 방법으로 AITR 및 TRAF 간의 상호작용을 확인하였다.

실시예 9: 세포내 신호전달 경로 단백질의 인산화 분석

정제한 CD4⁺T 세포(1x10⁶세포/웰)를 항-CD3 항체 및 IL-2를 처리하여 3일 동안 자극하였다. 상기 세포들에 항-AITR 단일클론항체를 2, 6, 12 및 24시간 동안 처리하였다. 그 다음, 상기 세포들의 현탁액을 준비하여 phospho-STATs(1, 3, 4, 5, 및 6), 및 마스터 전사 인자(T-bet, GATA-3, RORγt 및 Foxp3)를 유세포 분석기로 분석하였다. 상기 배양에서 세포들은 RIPA 완충액으로 용해시켰다. 그 다음, 전체 단백질 추출물로 8 내지 12% SDS-PAGE를 수행한 다음, NFAT1/2(Cell signaling, Danvers, MA, USA), p-p38(Cell signaling, Danvers, MA, USA), p-ERK1/2(Cell signaling, Danvers, MA, USA), p-JNK1/2(Cell signaling, Danvers, MA, USA) 및 NF-kB(Cell signaling, Danvers, MA, USA)에 대한 항체를 이용하여 면역 블롯(immunoblot)을 수행하였다. 또한, 동량의 단백질을 로딩했는지 확인하기 위하여 항-β 액틴 항체를 사용하였다.

다른 실험에서는, 분류한 CD4⁺CD25^high T 세포(5x10⁵세포/웰)를 5㎍/㎖의 항-AITR 단일클론항체를 처리하여 자극하였고, 상기와 같은 방법으로 세포 내 신호전달 경로에 관여하는 단백질의 인산화를 분석하였다.

실시예 10: 인간 CD4 ⁺ CD25 ^high Foxp3 ⁺ ( T _reg ) 세포의 다른 서브셋(subset)으로의 표현형( phenotype ) 전환

정상인 및 암환자로부터 분리한 인간 조절 T 세포(T_reg cells)는 실시예 1에서 설명한 방법으로 분류하였다. 상기 세포들은 5㎍/㎖ 항-AITR 단일클론항체로 7일 동안 자극시켰고, 100U/㎖ IL-2를 2일마다 첨가하였다. 그 다음, 세포들을 모으고 AITR, CTLA-4, CD62L, CD127, CD45RO 및 CD45RA의 세포 표면 발현을 확인하였고, 세포내 IFN-γ, IL-4 및 IL-17A, 및 마스터 전사 인자에 대해 염색하고 유세포 분류기로 분석하였다. 또한, 배양 상등액(Culture supernants)를 모은 다음, IFN-γ, IL-4 및 IL-17A, 및 TGF-β의 발현을 확인하였다.

다른 실험에서는, 분류한 CD4⁺CD25^-(non-T_reg) 세포들(5x10⁶세포/웰)을 5㎍/㎖ 항-AITR 단일클론항체로 자극시켰다. 배양한 세포에서 세포 내 IFN-γ, IL-4 및 IL-17A를 염색하였고, 3색 유세포 분석기(three-color flow cytometry)로 분석하였다.

실시예 11: NOD - SCID 마우스 이식( engraftment ) 및 항-종양 활성

우선, HLA-A*0201 타입의 건강한 기증자로부터 PBMCs를 실시예 1에 기술한 방법으로 얻었다. 5 내지 7 주령의 NOD-SCID 마우스(Jackson Laboratory, Barharbor, ME)는 국립암센터(대한민국)의 동물실에서 SPF(specific pathogen free) 환경에서 사육하였다. 모든 동물실험은 국립암센터의 동물실험윤리위원회의 관리 및 승인 하에 이루어졌고, 실험 동물 윤리 가이드에 따라 수행되었다. Ficoll-paque 농도구배 원심분리하여 인간 단핵구 세포를 정제한 다음, 회복(recovery)을 위한 3시간 이내에 RPMI에 포함된 인간 PBMCs 50x10⁶개를 NOD-SCID 마우스 복강 내로 주입하였다. 상기 이식한 마우스에 대하여 인간 PBMCs(HLA-A*0201 타입) 주입으로부터 4 내지 5주 후에 분석하였다.

항-AITR 단일클론항체의 항암 효과를 분석하기 위하여 Hu-PBL-SCID 마우스에 인간 폐암 세포 H441(HLA-A*02 type, 1 x 10⁷개/mice)를 등 쪽 피하 내 주입한 후에, 종양크기가 ~1cm 지름에 도달하였을 때부터 항-AITR 단일클론항체(200㎍/i.p.injection, 3 times/day)를 하루에 3번 복강 투여하였다. 대조군으로 인간 IgG를 사용하였다. 마우스의 종양의 부피를 시간대 별로 각 그룹별로 측정하였다. 또한, 항체를 주입한 지 12일 후에, 마우스에서 말초핼액단핵세포, 종양세포, 림프 노드 세포(DLN) 및 비장 세포를 분리하여 hCD4, hCD8, hFoxp3, hCD56 및 mCD45에 대해 염색하였고, 유세포 분석기로 분석하였다.

실시예 12: 통계학적 분석

모든 실험 데이터는 통계 프로그램인 Prism 5.0 GraphPad(San Diego, CA)로 분석하였다. Student's t-test는 그룹 간의 통계학적으로 유의한 차이점을 결정하기 위하여 사용하였다.

실험예 1: 항- AITR 단일클론항체의 제조

상기 실시예 4에 기재한 바와 같이, 인간 Fab 항체 라이브러리로부터 AITR에 대한 5개의 Fab 항체를 선별하였으며, 각각 A27, A35, A41, B32 및 B62로 명명하였다. 상기 항체 각각은 서열번호 5인 중쇄 가변영역과 서열번호 9인 경쇄 가변영역(A27), 서열번호 15인 중쇄 가변영역과 서열번호 19인 경쇄 가변영역(B32), 서열번호 25인 중쇄 가변영역과 서열번호 29인 경쇄 가변영역(A35), 서열번호 35인 중쇄 가변영역과 서열번호 36인 경쇄 가변영역(B62), 및 서열번호 39인 중쇄 가변영역과 서열번호 43인 경쇄 가변영역(A41)을 포함하였다.

또한, 항-AITR 유전자는 VH 및 VL DNA 서열을 인간 IgG1 백본에 이식(grafting)하여 제작하였다. 항-AITR 단일클론항체 A27, A35, A41, B32 및 B62는 상기 항체 작제물(construct)를 HEK293 세포에 일시적인 형질감염하여 생산하였다(도 1 a). 상기 항체들은 AITR을 과발현시킨 Jurkat 세포에서 각각 유사한 정도의 친화도(affinity)를 나타내었다(도 1 b).

실험예 2: 항- AITR 단일클론항체의 에피토프 맵핑( epitope mapping )

상기 실험예 1에서 선별한 AITR에 대한 인간 단일클론항체 5가지의 에피토프를 확인하였다. 에피토프를 확인하기 위하여, R1 내지 R12로 명명한 AITR-GST 융합 단백질을 이용하였다(도 3). 항-AITR 단일클론항체와 R0 내지 R12-GST 단백질 간의 면역 블롯 결과, 상기 5가지 항체가 서로 구별되는 3 종류의 에피토프를 인지하는 AITR에 특이적인 단일클론항체로 분류될 수 있었다.

A27 및 B32는 R1 및 R2 부위에 특이적으로 결합했으며, A35 및 B62는 R1-R4 및 R8-R11에 특이적으로 결합하였고, A41은 R1-R6, R8 및 R9에 특이적으로 결합하는 결과를 나타내었다(도 3 B). AITR이 결합하는 에피토프 부위를 더욱 명확하게 조사한 결과, A27 및 B32는 AITR ECD의 56번 내지 65번 아미노산 부위(AA 56-65)를 특이적으로 인지하였으며, A35 및 B62는 41번 내지 50번 아미노산 부위(AA 41-50)를 특이적으로 인지하였고, A41은 20번 내지 30번 아미노산 부위(AA 20-30)를 특이적으로 인지하였다(도 3 C 및 표 2). A27 및 B32가 인지하는 에피토프 부위를 서열번호 2로, A35 및 B62가 인지하는 에피토프 부위를 서열번호 3으로, A41이 인지하는 에피토프 부위를 서열번호 4로 각각 표시하였다.

항체	에피토프	서열번호
A27&B32	HCGDPCCTTC (AA 56-65)	2
A35&B62	ECCSEWDCMC (AA 41-50)	3
A41	GTDARCCRVHT (AA 20-30)	4

실험예 3: 면역 세포( Immune cell )에서의 AITR 의 발현

PBMCs를 자극시킨 후에는 AITR의 발현이 증가되었으나, 자극되지 않은 경우에는 AITR의 mRNA는 검출되지 않았다. 또한, T 세포에서 CD3 자극(CD3 stimulation)을 준 경우에는 AITR의 발현이 매우 증가되었다. 유세포 분석기로 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구(monocytes)에서 AITR의 발현을 조사한 결과, 본 발명의 항-AITR 인간 단일클론항체들은 대부분 약 40 배가량 높은 발현을 나타내는 활성화된 CD4⁺ T 세포에 존재하는 AITR을 인지하는 결과를 나타내었다. CD8⁺ T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구에서 상기 항체들을 사용한 경우에는 휴지기(resting) 또는 활성화된 AITR이 검출되지 않았다(도 1 C).

이와 같은 결과는, 본 발명의 항-AITR 단일클론항체가 TCR-매개 활성화된 신호에 의해, 활성화된 CD4⁺ T 세포군에서의 빠르게 증가된 AITR의 발현을 인식한다는 것을 나타내는 결과이다.

실험예 4: AITR 신호전달에 의한 CD4 ⁺ T 세포군( cell population )에서의 세포 분열 및 사이토카인 생산의 동시 자극( co - stimulation ) 확인

활성화된 CD4⁺T 세포에서 AITR이 주로 발현된다는 것을 확인하여(도 1 C), 증식 및 사이토카인 분비에 있어서 공동자극 분자(costimulatory molecule)로서 AITR의 역할을 분석하였다. 정제된 CFSE-라벨된 CD4⁺T 세포(CFSE-labeled CD4⁺ T cell)을 고정된 항-CD3로 자극하고, 항-AITR 단일클론항체의 존재하에 배양하였다. 이때, 항-CD3 단독으로 배양한 경우와 달리, 항-AITR 단일클론항체 및 항-CD3로 함께 배양한 경우 활성화된 CD4⁺ T 세포의 증식이 현저히 증가하는 결과를 나타내었다(도 5).

그 다음, 항-AITR 단일클론항체의 종류에 따른 분비하는 사이토카인의 종류를 배양 상등액으로부터 분석하였다. 그 결과, AITR의 서로 다른 부분을 인지하는 본 발명의 항체들은 각각 서로 다른 사이토카인의 수준을 변화시켰다. A27을 처리한 경우, T_H1 사이토카인인 IL-2 및 IFN-γ 수준이 현저히 증가하였으며, A35를 처리한 경우에는 A27과 달리 T_H17 사이토카인인 IL-17A의 수준을 증가시켰다. 반면, A41을 처리한 경우에는 T_H2 사이토카인인 IL-2, IL-4 및 IL-5의 수준을 현저히 증가시키는 결과를 보였다(도 4 A).

또한, 본 발명의 항-AITR 항체 또는 AITR 리간드를 처리하는 경우, 활성화된 CD4⁺T 세포에서 IFN-γ, IL-17A 및 IL-4의 발현에 대한 표현형 CD4⁺T 세포 마커를 분석하였다. 그 결과, A27을 처리한 경우에는 IIFN-γ를 생산하는 CD4⁺T 세포(IFN-γ producing CD4⁺T cell)를 증가(90.2±0.50%)시켰고, A35를 처리한 경우에는 IL-17A을 생산하는 CD4⁺T 세포를 증가(37.8±0.11%)시켰으며, A41은 IL-4를 생산하는 CD4⁺T 세포를 증가(91.5±6.21%)시켰다. 또한, 이들의 리간드인 AITRL은 T_H1 CD4⁺ T 세포에서 IFN-γ의 생산을 유도하는 결과를 나타내었다(도 4 B 및 도 6).

상기와 같은 결과들은 본 발명의 항-AITR 단일클론항체가 CD4⁺ T 세포에서 공동자극 신호(costimulatory signal)로서 작용할 수 있으며, 특정 T_H 세포로의 분화 및 사이토카인 분비를 촉진시킬 수 있음을 나타내는 결과이다. 특히, 상기의 결과들은 본 발명의 항체가 인지하는 AITR 부위에 따라 서로 다른 효과를 가져올 수 있다는 것을 나타낸다. 그 중에서도 본 발명의 A27 및 B32 항체가 CD4⁺ T 세포에 존재하는 AITR의 여러 부위 중에서도 서열번호 2의 에피토프를 인지함으로써, 여러 사이토카인 중에서도 T_H1 세포의 사이토카인인 IL-2 및 IFN-γ을 분비시킬 수 있도록 변화시킬 수 있음을 보여주었다.

실험예 5: AITR 과 TRAF family 단백질 간의 상호작용 및 하위 신호전달

TRAF(tumor necrosis factor receptor-associated factor) 단백질은 NF-kB 활성화에 관여하고 있으며, TNFR 패밀리 멤버에 의해 ERK1/2, JNK1/2, p38과 같은 하위 신호전달분자가 활성화될 수 있음이 보고된 바 있다. 또한, AITR의 세포내 도메인(cytoplasmic domain)은 마우스 또는 인간에 보존되어 있는 산성 잔기(acidic residue)를 가지고 있고, 이는 TRAF 단백질과의 결합에 관여한다. AITR은 TRAF1, TRAF2 및 TRAF3와는 상호작용하는 것이 알려져 있으나, TRAF5 및 6와는 상호작용하지 않는다(Kwon B et al., J Biol Chem 274, 6056-6061, 1999; Ha, H et al., Curr Protoc Immunol. Chapter11:Unit11.9D, 2009). 이에 본 발명자들은 활성화된 CD4⁺ T 세포에서 본 발명의 항-AITR 단일클론항체에 의해 AITR이 활성화되는 경우 어떤 TRAF 단백질과 상호작용하는지를 확인하였다.

AITR-TRAF 복합체는 항-AITR 단일클론항체를 이용하여 활성화된 CD4⁺ T 세포의 용해물로부터 Protein G로 면역 침전시켰고, 항-TRAF 항체 및 항-AITR 단일클론항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과, 각기 다른 AITR의 부위를 인지하는 본 발명의 항체들은 서로 다른 종류의 TRAF 단백질을 AITR에 동원(Recruitment)하는 결과를 나타내었다(도 7 A).

즉, 본 발명의 서열번호 2의 에피토프를 인지하는 A27의 경우, TRAF1 및 2를 AITR로 동원하였으나, 서열번호 3의 에피토프를 인지하는 A35의 경우, TRAF6를 동원하였다. 서열번호 4의 에피토프를 인지하는 A41의 경우, TRAF3 및 5를 동원하는 결과를 나타내어, AITR을 항체가 인식하는 부위에 따라 서로 다른 세포 내 신호전달을 가져올 수 있음을 나타내었다. 또한, TRAF1 및 2를 동원하는 본 발명의 A27 항체의 경우, 헤테로올리고머(heterooligomer)를 형성시킬 수 있으며, 이는 p-JNK1/2 및 p-NF-kB를 활성화하는 결과를 나타내었다. 반면 비교군인 TRAF6를 동원하는 A35의 경우, p-p38 및 p-NF-kB를 활성화시키는 결과를 나타내었고, TRAF3 및 5를 동원하는 A41의 경우, p-ERK1/2를 활성화시키는 결과를 나타내었다(도 7 A, B 및 도 8).

T 세포는 NFAT1, NFAT2 및 NFAT3를 발현하며, NFAT 단백질들은 T_H 세포의 TCR이 활성화되었을 때 작용 사이토카인(effector cytokine)을 생산하는데 필수적인 역할을 하며, T_H 세포 분화 조절에 관여하고 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 항-AITR 단일클론항체를 CD4⁺ T 세포에 처리하였을때, NFAT1 또는 2의 활성화를 가져올 수 있는 지를 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 서열번호 2의 에피토프를 인지하는 A27 항체 및 서열번호 3의 에피토프를 인지하는 A35 항체의 경우 활성화된 NFAT1을 시간에 의존적으로 증가시켰으며, 비교군인 A41의 경우에는 A27 및 A35와 달리, NFAT1이 아닌 NFAT2의 발현을 증가시키는 결과를 나타내었다(도 7 B).

상기와 같은 결과들은 AITR이 TRAFs 또는 하위 신호전달을 활성화시킬 수 있는 어댑터 세포 내 분자가 결합할 수 있는 결합 도메인을 가지고 있음을 나타내는 것이다. 또한, AITR 항체가 인지하는 AITR의 특정 부위에 따라, 다른 종류의 TRAF 단백질을 동원할 수 있으며, 서로 다른 TRAF 단백질이 동원됨에 따라 세포 내 신호전달도 달라지게 됨을 보여주었다. 본 발명의 서열번호 2의 에피토프에 특이적인 AITR 항체들은 다른 부위를 인식하는 항체들과 비교하여 TRAF 단백질 뿐만 아니라, 서로 다른 NFAT 활성도 또한 나타낼 수 있으므로, 이러한 결과는 AITR 항체가 인지하는 부위에 따라 다른 NFAT가 핵 내로 이동(translocation)하고, NFAT-의존적인 유전자 발현이 다른 양상으로 나타날 수 있음을 보여주는 것이다.

이와 같은 결과들은 특히, 본 발명의 A27 및 B32가 AITR의 여러 부위 중에서 서열번호 2의 에피토프를 인지함으로써 다양한 종류의 TRAF 단백질 중 TRAF1 및 2를 동원하고 p-JNK1/2 및 p-NF-kB에 의해 매개되는 세포 내 신호전달을 가져올 수 있으며, 이를 통하여 T_H1 사이토카인인 IFN-γ 생산세포 전환에 관여할 수 있을 것이라는 것을 뒷받침하는 것이다.

실험예 6: 항- AITR 단일클론항체에 의한 전사인자 및 STAT 단백질에 의한 CD4 ⁺ T 세포의 분화 확인

T_H 세포의 운명 결정(fate determination) 및 사이토카인 생산에 있어, STAT(signaling transducer and activatin of transcription) 단백질 및 마스터 전사인자는 필수적인 것으로 알려져 있다(Hermann-Kleiter, N. & Baier G, Blood. 15, 2989-2997, 2010). 이에, 본 발명의 항-AITR 단일클론항체에 의해 활성화된 CD4⁺ T 세포에서의 STAT 단백질 및 마스터 전사 인자의 활성을 분석하였다.

p-STATs(1, 3, 4, 5, 및 6) 및 T-bet, GATA-3 및 RORγt에 대한 항체를 사용하여 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 항-AITR 항체를 처리하지 않고, 항-CD4 및 IL-2만을 처리한 군에 비하여, A27을 처리한 군은 활성화된 p-STAT-1(52.8±0.25%), pSTAT-4(54.2±0.19%), 및 T-bet(80.2±0.08%)을 증가시켰고, A35을 처리한 군은 활성화된 p-STAT-3(63.1±1.24%), RORγt(53.4±2.18%)을 증가시켰고, A41을 처리한 군은 활성화된 p-STAT-5(85.1±0.38%), p-STAT-6(79.2±0.12%) 및 GATA-3(76.5±0.11%)을 증가시켰다(도 7 C, D 및 도 9).

이러한 결과들은 AITR의 서로 다른 부위를 인지하는 본 발명의 AITR 항체는 서로 다른 AITR에 의해 매개되는 신호 전달을 CD4⁺ T 세포에 가지고 온다는 것을 나타내는 것이다. 특히, 서열번호 2의 에피토프를 인지하는 본 발명의 A27 및 B32 항체가 T_H 세포의 운명 결정에 관여할 때, STAT-1,-4 및 T-bet에 의해 매개되는 신호 전달이 관여할 수 있음을 나타내는 결과이다.

실험예 7: 항- AITR 단일클론 항체에 의한 T _reg 세포의 T _H 1 세포로의 전환 확인

상기 실험예 5 및 6은 특정 에피토프를 인지하는 본 발명의 서열번호 2의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-AITR 항체가 CD4⁺ T 세포에서 T_H 세포 운명 결정에 관여하는 특이적인 신호 전달 인자를 조절함을 보여주었다. 즉, AITR 내의 에피토프의 위치가 변화하면 전혀 다른 T_H 세포로 전환시킬 수 있음을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 항-AITR 단일클론항체가 인지하는 에피토프 부위에 따라 CD4⁺ T 세포의 기능적인 표현형(functional phenotype)을 전환시킬 수 있을 것으로 판단하여, CD4⁺ T 세포에 AITR의 서로 다른 세 부위를 인지하는 대표적인 항체인 A27, A35 및 A41를 처리하여 그 전환능력을 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 서열번호 2의 에피토프에 특이적인 항체인 A27에 의해 유도된 IFN-γ 생산세포(99.2±0.21%)는 비교군인 A35에 의해 IL-17A 생산세포로 전환되었고(18.8±0.23%), 비교군인 A41에 의해서는 IL-4 생산세포(38.7±0.32%)로 전환되었다. 비교군인 A35에 의해 유도된 IL-17A 생산세포(35.2±0.60%)는 본 발명의 항체인 A27에 의해 IFN-γ 생산 세포(82.6±1.21 %)로 전환되었고, 비교군인 A41에 의해 IL-4 생산세포(70.5±0.62%)로 전환되었다. 비교군인 A41에 의해 유도된 IL-4-생산세포(98.2±0.29%)는 본 발명의 항체인 A27에 의해 IFN-γ 생산세포(90.1±0.42%)로 전환되었고, 비교군인 A35에 의해 IL-17A 생산세포(16.9±0.58%)로 전환되었다(도 10 및 11).

상기와 같은 결과들은, 본 발명의 서열번호 2의 AITR 에피토프에 특이적인 항체는 AITR의 특정 부위 즉, 서열번호 2의 에피토프(AA 56-65)를 인지함으로써 특정 사이토카인 생산 세포로 전환시킬 수 있음을 보여주는 결과로, 비교군인 A35가 IL-17A를 생산하는 T_H17 세포로, 비교군인 A41이 IL-4를 생산하는 T_H2 세포로 전환시키는 것과 달리, 서열번호 2의 에피토프를 인지하는 본 발명의 A27 및 B32는 IFN-γ를 생산하는 T_H1 세포로 특이적으로 전환시킬 수 있음을 뒷받침하는 결과이다.

실험예 8: 항- AITR 항체의 CD4 ⁺ CD25 ^high Foxp3 ⁺ ( T _reg ) 세포의 전환 능력 확인

GITR 또는 AITR은 T_reg 세포에서 공동자극 분자(co-stiumulatory molecule)인 것으로 알려져 있으며, T_reg 세포에는 활성화 시키지 않아도 본질적으로 GITR 이나 AITR 발현이 높게 유지된다고 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 항-AITR 단일클론항체들에 대한 T_reg 세포에서 AITR의 역할을 조사하였다. 항-CD3 및 IL-2로 자극시킨 후, 정상인 및 암환자로부터 T_reg 세포(CD4⁺CD25^high cell) 및 비-T_reg 세포(CD4⁺CD25^-cell)를 FACS 분류기를 이용하여 분리하였다. 정상인 및 암환자로부터 분리한 T_reg 세포는 모두 Foxp3 및 AITR을 지속적으로 발현하고 있었으며, 비-T_reg 세포의 경우, T_reg 세포에 비하여 낮은 수준의 AITR을 발현하고 있는 결과를 보였다. 다만, 암환자로부터 분리한 T_reg 세포의 수는 정상인에 비하여 3배 가량 높은 수치를 나타내었다(도 13 및 14).

상기 실험예의 결과에 비추어 본 발명의 항-AITR 단일클론항체가 T_reg 세포를 전환할 수 있는지 여부를 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 서열번호 2의 에피토프를 인지하는 A27은 정상인 및 암환자로부터 분리한 T_reg 세포를 모두 IFN-γ 생산 세포로 전환시켰으며(각각 93.9±0.12% 및 88.2±0.43%), 비교군인 서열번호 3의 에피토프를 인지하는 A35는 정상인으로부터 분리한 T_reg 세포를 IL-17A 생산세포로 전환시켰으나(10.4±0.32%), 암환자로부터 분리한 T_reg 세포를 전환시키지는 못하였다. 또한, 비교군인 서열번호 4의 에피토프를 인지하는 A41은 정상인 및 암환자로부터 분리한 T_reg 세포 모두에 대해 전환능력을 보이지 않았다(도 12 A 및 D, 도 13 B 및 도 14 B). 또한, 분비하는 사이토카인을 분석한 결과, A27 및 A35의 경우에는 TGF-β를 낮추고, IFN-γ 및 IL-17A를 높인 반면, 비교군인 A41은 TGF-β를 시간별로 높이는 결과를 나타내었다(도 12B).

이에 대한 신호전달 메커니즘을 확인해본 결과, A27 및 A35는 실험예 5에 나타낸 결과와 같이, A27은 TRAF1 및 2를 동원하고 NFAT1의 발현을 증가시켰으며, p-JNK1/2, p-NF-kB 신호전달경로를 활성화시키는 결과를 나타내었고, A35는 TRAF6를 동원하였고 p-p38 및 p-NF-kB 신호전달경로를 활성화시킴을 나타내었다(도 7). 이러한 결과들은 A27 및 A35는 각각 상기 신호전달경로를 통하여 Foxp3의 발현을 감소시키고 T-bet 또는 RORγt 발현을 증가시켜, A27의 경우에는 T_reg 세포를 T_H1 세포로, A35의 경우에는 T_reg 세포를 T_H17 세포로 전환시킬 수 있음을 나타내는 것이다(도 9, 도 12 C 및 도 16).

그러나, A41의 경우에는 Foxp3의 발현을 T_reg 세포에서 거의 유지시키는 결과를 보였으므로(도 9, 도 12 C 및 도 16), A41이 TRAF 단백질을 AITR에 동원할때, TRAF5에 비하여 TRAF3을 강하게 동원하며, ERK1/2 및 NF-kB를 활성화시키고, STAT5를 활성화시켜, NFAT1 전사인자 등을 통하여 T_reg 세포에서 다른 신호전달 캐스케이드를 가져오는 것을 판단되었다(도 9 및 15).

이러한 결과들은 서열번호 2의 특정 에피토프를 인지하는 본 발명의 항체는 다른 부위의 에피토프와는 다른 신호전달경로를 통하여, T_H1 세포로 특이적으로 분화할 수 있다는 것을 뒷받침하는 결과이다.

실험예 9: 인간 이종이식 종양 모델에서의 항- AITR 단일클론 항체의 항암 활성 확인

본 발명의 항-AITR 단일클론항체의 in vivo에서의 항암 효과를 알아보기 위하여, HuPBL-SCID 마우스 모델을 사용하였다. 정상인으로부터 분리한 인간 PBMCs(HLA-A*0201 타입)를 NOD-SCID 마우스 복강 내로 주입하였다. 주입 후 28일 및 35일 사이에, 상기 마우스로부터 분리한 비장 세포 및 혈액 세포를 확인한 결과, 인간 면역 세포가 Gated 마우스 CD4 음성군(negative population)에서 관찰되었다(도 17 A 및 도 18). 상기 마우스(각 군에 대해 8 또는 5 마리)들에 인간 폐암 세포 H441(HLA-A*02 type, 1 x 10⁷세포/mice)를 주입하였다. 암이 유도된 마우스에 본 발명의 항-AITR 단일클론항체인 A27, 및 비교군인 A35 및 A41을 종양크기가 ~1cm 지름에 도달하였을 때부터 1일 3번씩 복강 내로 투여하였으며, 투여량은 각 투여시마다 200㎍이었다.

그 결과, A27은 대조군, 즉 A35을 처리한 군 및 A41을 처리한 군과 비교하여 종양의 성장을 매우 효과적으로 근절하였으며, 종양의 성장을 효과적으로 억제하는 결과를 나타내었다. A35의 경우에는 종양의 성장을 억제시키지 못하였으며, A41도 종양의 성장 속도를 늦추는 결과를 보였으나 완전히 근절시키지는 못하였다(도 17).

또한, 항-AITR 단일클론항체를 주입한 후 12일 후에, A27은 CD4⁺TIL에 비하여 종양 내(intra-tumor)의 T_reg(CD4⁺Foxp3⁺) 세포의 수를 현저하게 감소시키는 결과를 나타내었다(A27:2%, CD4⁺TIL: 27%). 반면, CD4⁺IFN-γ⁺ 세포, CD8⁺CD56^-세포 및 CD8⁺CD56^- 세포의 수를 현저하게 증가시켰다. 이러한 결과는 본 발명의 A27이 T_reg 세포에 존재하는 AITR의 ECD의 AA 56-65 부위를 인지함으로써, 이를 CD4⁺IFN-γ⁺ 세포 등으로 효과적으로 전환시켜 항암 효과를 나타내는 것임을 뒷받침하는 결과이다.

상기와 같은 결과들은 AITR 내의 특정 부분인 서열번호 2의 에피토프를 인지하는 본 발명의 항체를 사용하는 경우에만 항암 효과를 나타낼 수 있다는 것을 보여주는 것으로, T_reg 세포를 IFN-γ 생산 세포로 전환시킴으로써 항암 효과를 보일 수 있다는 것을 나타낸다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범 위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> Novel epitope for switching to Th1 cell and use thereof <130> PA120660KR <150> KR 10-2012-0061791 <151> 2012-06-08 <160> 50 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Extracellular domain(ECD) of AITR <400> 1 Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu 1 5 10 15 Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg 20 25 30 Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys 35 40 45 Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr 50 55 60 Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly 65 70 75 80 Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe 85 90 95 Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln 100 105 110 Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val 115 120 125 Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala Glu Pro Pro 130 135 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope of A27 or B32 <400> 2 His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope of A35 or B62 <400> 3 Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope of A41 <400> 4 Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region of A27 <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Gln Val Lys Met Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Pro Tyr Thr His Arg Thr Asn Ser Ser Pro Lys Leu 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Thr Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Asn 100 105 110 Gly Ala Phe 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tccaggacag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 acgtattacg atttttggag tggttatttc gacaatggtg cttttgatat ctggggccaa 360 ggcaccctgg tcaccgtctc ctca 384 <210> 14 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of A27 <400> 14 cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcacctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcaactc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaattata agcgaccctc tgggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccgg 240 actggggacg aggccgatta tttctgcgga acatgggata gtagcctgaa tgcttgggtg 300 ttcggcgggg ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 15 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region of B32 <400> 15 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Ser 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Arg Gly Gly Pro Thr Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser 100 105 110 Gly Tyr Tyr Thr Asp Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of B62 <400> 36 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Asp Leu Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region of B62 <400> 37 gaagtgcagc tggaagtgca gctggtgcag tctgggggag gcttggtcca gccggggggg 60 tccctaagac tctcctgttc agcctctgga ttcagcttca gtagttatgc tatgcactgg 120 gtccgccagg ctccagggaa gggactggaa tatgtctcag gtattagtga taatggaggt 180 agcacaaagt acgcagactc agtgaagggc agattcacca tctccagaga caattcccag 240 aacacgctgt atcttcaaat gagcagcctg agatctgagg acacggccgt gtattactgt 300 gcgagaggcg ggcccacgta ttacgatttt tggagtggtt attataccga cgaagatgct 360 tttgatatct ggggccaagg caccctggtc accgtctcct cg 402 <210> 38 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of B62 <400> 38 gaaattgtaa tgacacagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagtattaac aactatttaa actggtatca gcaaaaaccc 120 gggaaagccc ctaagctcct aatctatgct acatccaggt tgcagagtgg cgtcccatcc 180 aggttcagtg gcagtggatc tggggcagat ctcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagatgttg caacttatta ctgtcaacag agctacagtt tcccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 39 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region of A41 <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of a heavy chain variable region of A41 <400> 40 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of a heavy chain variable region of A41 <400> 41 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 42 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of a heavy chain variable region of A41 <400> 42 Ala Arg Gly Ile Ala Ala Ala Gly Pro Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Tyr Met Asp Val 20 <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of A41 <400> 43 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Tyr Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Gly Gly 50 55 60 Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of a light chain variable region of A41 <400> 44 Gln Thr Ile Tyr Asn Tyr 1 5 <210> 45 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of a light chain variable region of A41 <400> 45 Ala Ala Ser 1 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of a light chain variable region of A41 <400> 46 Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 47 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain variable region of A41 <400> 47 caggtccagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactac 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggaata 300 gcagcagctg ggccccccta ctactactac tactactaca tggacgtctg gggcaaaggg 360 accacggtca ccgtctcctc a 381 <210> 48 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain variable region of A41 <400> 48 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgctt ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gaccatttac aactatctaa attggtatca gcagaagcca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcggtg gccgtggata tgggacagat ttcactctca ccatcaacag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttactt ctgtcaacag agttacacga gtcctctcac ttttggccag 300 gggaccaaag tggatatcaa a 321 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 49 aagcttggtc agcgccccac cggg 24 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 50 ccggcagagc cgccttaact cgag 24

Claims

서열번호 2로 기재된 AITR(activation-inducible tumor necrosis factor receptor)의 에피토프(epitope)를 특이적으로 인지하는 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 6으로 기재된 중쇄 CDR1(complementarity-determining region 1); 서열번호 7로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 10으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 11로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 12로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체.
제2항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 5로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 9로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 16으로 기재된 중쇄 CDR1(complementarity-determining region 1); 서열번호 17로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 18로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 20으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 21로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 22로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 항체.
제4항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 15로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 19로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 정의되는, T 세포를 T_H1 세포(Helper T cell 1)로 전환하기 위한, AITR(activation-inducible tumor necrosis factor receptor)의 에피토프(epitope)인 폴리펩타이드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제6항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제9항의 벡터가 도입된 형질전환체.
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제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 암은 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 및 다발성 골수종 혈액암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 면역 증강용 약학적 조성물.