KR101462307B1

KR101462307B1 - 항-헵시딘-25 선택적 항체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101462307B1
Application number: KR1020117002748A
Authority: KR
Inventors: 돈미엔느 든 문 렁; 펭 루안; 잉 탕; 데릭 리안 윗쳐; 피아 파울리나 야치
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2008-08-06
Filing date: 2009-07-29
Publication date: 2014-11-17
Anticipated expiration: 2029-07-29
Also published as: DK2328931T3; EA201170312A1; JP5730200B2; KR20110031963A; CA2733497C; HK1156326A1; US20110189190A1; AU2009279865B2; NZ590863A; US8609817B2; ES2432018T3; EP2328931A1; ZA201100261B; WO2010017070A1; CN102112489A; UA103032C2; EP2328931B1; IL210643A0; JP2011530514A; CN102112489B

Abstract

본 발명은 인간 헵시딘-25의 N-말단에 결합하고, 폴리펩티드에 대해 높은 친화도 및 선택성을 갖는 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 인간에서 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구용적률을 증가시키고, 인간 대상체에서 빈혈과 같은 다양한 질병을 치료하는데 유용하다. 본 발명의 항체는 또한, 예컨대 샌드위치 ELISA에 있어서 분석 도구로서 유용하다.

Description

항-헵시딘-25 선택적 항체 및 그의 용도 {ANTI-HEPCIDIN-25 SELECTIVE ANTIBODIES AND USES THEREOF}

본 발명은 의약 분야, 특히 인간 헵시딘-25에 대한 항체 분야의 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 특정 질환, 예컨대 빈혈의 치료를 필요로 하는 환자에게 항-헵시딘-25 선택적 항체를 투여하는 것에 의한, 질환의 치료에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 헵시딘-25를 검출하고/하거나 상승된 헵시딘-25 수준을 특징으로 하는 질환 병태를 진단하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.

주로 간세포에 의해 발현되는 폴리펩티드인 인간 헵시딘은, 장내 철분 흡수, 대식세포에 의한 철분 재생, 및 간에 저장된 철분으로부터의 철분 동원을 음성적으로 조절하는 중요한 철분-조절 단백질인 것으로 여겨진다. 헵시딘의 과생산은 빈혈 및/또는 만성 질환으로 인한 빈혈의 병태생리에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다.

현재는, 빈혈 및/또는 만성 질환으로 인한 빈혈에 대한 적합하고 효과적인 치료법이 제한되어 있다. 특히, 에리트로포이에틴을 투여하는 것은 전체 환자 중 단지 약 50％에서만 효과가 있고, 바람직하지 않은 부작용과도 관련이 있다. 또한, 수혈은 오염, 감염, 및 철분 과부하로 인해 바람직하지 않다.

인간 헵시딘은, 전형적인 N-말단의 24개의 아미노산의 소포체 표적 신호 서열과, 콘센서스 퓨린 절단 부위를 갖는 35개의 아미노산 프로영역, 및 바로 다음에 C-말단의 25개의 아미노산의 생물활성 철분-조절 호르몬 (헵시딘-25, 서열 1)을 함유하는, 84개의 아미노산 프리프로펩티드로서 코딩된다. 헵시딘의 다양한 N-말단이 절단된 형태, 예컨대 헵시딘-20 (예를 들어, 인간의 경우 서열 1의 아미노산 6-25) 및 헵시딘-22 (예를 들어, 인간의 경우 서열 1의 아미노산 4-25)도 또한 생체내에서 형성되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 헵시딘-25가, 유일하지는 않지만, 인간에서 헵시딘의 가장 생리학적으로-관련된 형태인 것으로 여겨진다. 전구체 또는 절단된 형태가 아닌, 헵시딘-25의 농도를 선택적으로 조절하는 요법이 특히 바람직하다. 특히, 전구체 및 절단된 형태가 아닌, 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 항체는 헵시딘-25의 상승된 수준과 관련된 질병의 치료 또는 진단에 상당한 이점을 제공할 것이다. 예를 들어, 비-선택적 헵시딘 항체와 비교하여, 고 친화도의 헵시딘-25 선택적 항체는 부작용의 위험을 감소시킬 것이며, 요법상 항체가 헵시딘의 생리학적으로-관련이 없는 형태와는 결합하지 않을 것이기 때문에 효과적인 치료에 요구되는 임상 투여량은 더 감소될 것이다.

헵시딘에 대한 비-인간 폴리클로날 및 모노클로날 항체가 이전에 보고된 바 있지만 (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 2006/0019339, 2007/0224186, 및 2008/0213277 참조), 당업계에는 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 모노클로날 항체에 대한 많은 요구가 여전히 존재한다. 따라서, 본 발명의 일 측면은 헵시딘-25에 포함된, 아미노산 1 내지 7 내의 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 항체를 제공하는 것이다. 그러한 항체는 인간에서 빈혈과 같은 질환, 병태, 또는 질병을 치료하기 위해 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구용적률을 증가시키는데 있어서 유용하다.

추가로, 헵시딘에 대한 현존하는 면역검정은 활성이고 생리학적으로 관련이 있는 헵시딘-25를 비활성이고 생리학적으로 관련이 없는 헵시딘 종과 구별하지 못한다 (예를 들어, 문헌 [Kemna, E.H., et al., Haematologica, 93(1):90-7 (2008)]; [Roe M.A., et al., Br J Nutr., 97:544-9 (2007)]; 및, [Luukkonen S. and Punnonen K., Clin Chem Lab Med., 44:1361-2 (2006)] 참조). 현재, 헵시딘-25에 대한 선택적인 검정에 이용되고 있는 유일한 방법으로는 LC/MS (액체 크로마토그래피/질량 분광분석법) 또는 다양한 형태의 헵시딘을 분리하는데 요구되는 유사한 복잡한 방법이 있다 (예를 들어, 문헌 ([Gutierrez, J.A., et al., BioTechniques, 38:S13-S17 (2005)], [Murphy, et al., Blood, 110:1048-54 (2007)], 및 [Kemna, E.H., et al., Clin. Chem., 53:620-8 (2007)]) 참조). 그러한 검정은 정확하고 정밀할 수는 있지만, 그에 요구되는 복잡성, 비용, 및 조작자의 높은 수준은 일상적인 실행을 저해한다. 따라서, 헵시딘-25의 검출 또는 측정을 위한 면역검정에 적용하기 위해, 인간 헵시딘-25에 고 친화도로 선택적으로 결합하는 항체에 대한 큰 요구도 역시 존재한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 포유동물의 조직 및 생물학적 체액 내에서 헵시딘-25를 검출 및 측정하기 위한, 비교적 간단하지만 매우 높은 민감도의, 강력하고 선택적인 면역검정에서 헵시딘-25 선택적 항체를 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 헵시딘-25의 아미노산 1 내지 7 내의 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 관련 전구체 및 절단된 폴리펩티드와 달리, 서열 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 선택적으로 결합하며, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 6개의 CDR을 포함한다: (i) 각각 서열 9, 10, 11, 32, 33 및 34에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; (ii) 각각 서열 12, 13, 14, 35, 36, 및 37에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; (iii) 각각 서열 45, 13, 14, 35, 36, 및 37에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; (iv) 각각 서열 12, 13, 14, 38, 36 및 37에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; (v) 각각 서열 15, 10, 16, 39, 40 및 41에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; (vi) 각각 서열 20, 21, 22, 42, 43, 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; (vii) 각각 서열 20, 21, 23, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; (viii) 각각 서열 24, 25, 23, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; (ix) 각각 서열 26, 25, 27, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; 및 (x) 각각 서열 26, 25, 28, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 헵시딘-25의 아미노산 1 내지 7 내에 함유된 에피토프, 즉 서열 1의 DTHFPIC 또는 설치류 헵시딘-25의 DTNFPIC (서열 2 또는 3)에 결합한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 경쇄 가변 영역 ("LCVR") 폴리펩티드 및 중쇄 가변 영역 ("HCVR") 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 (i) LCVR 및 HCVR 폴리펩티드는 각각 서열 48 및 49에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; (ii) LCVR 및 HCVR 폴리펩티드는 각각 서열 50 및 51에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; (iii) LCVR 및 HCVR 폴리펩티드는 각각 서열 52 및 51에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; (iv) LCVR 및 HCVR은 각각 서열 53 및 54에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; (v) LCVR 및 HCVR은 각각 서열 55 및 56에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; (vi) LCVR 및 HCVR은 각각 서열 59 및 58에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; (vii) LCVR 및 HCVR은 각각 서열 60 및 58에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; (viii) LCVR 및 HCVR은 각각 서열 61 및 58에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; (ix) LCVR 및 HCVR은 각각 서열 62 및 58에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (x) LCVR 및 HCVR은 각각 서열 63 및 58에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자; 임의로는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터; 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포; 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하여 핵산을 발현시키고, 임의로는 숙주 세포 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체를 생산하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 제약 조성물은 균질하거나 실질적으로 균질한 본 발명의 모노클로날 항체 군집 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한, 성숙한 인간 헵시딘에 선택적으로 결합하는 인간의 조작된 모노클로날 항체를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 인간 대상체에서 빈혈을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 성숙한 인간 헵시딘에 선택적으로 결합하는 인간의 조작된 모노클로날 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 의약을 제조하기 위한, 성숙한 인간 헵시딘에 선택적으로 결합하는 인간의 조작된 모노클로날 항체의 용도를 구현한다. 추가로 본 발명은 동물, 바람직하게는 포유동물 종, 보다 바람직하게는 인간 대상체에서 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구용적률을 증가시키기 위한 방법에 있어서의, 성숙한 인간 헵시딘에 선택적으로 결합하는 인간의 조작된 모노클로날 항체의 용도를 구현한다.

추가로 본 발명은 성숙한 인간 헵시딘에 결합하는 인간의 조작된 모노클로날 항체의 유효량을 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구용적률을 증가시키는 것이 필요한 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구용적률을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는, 인간 대상체에서 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 빈혈, 예를 들어 감염, 염증, 만성 질환, 및/또는 암으로 인한 빈혈을 비롯하여, 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구용적률을 증가시키는 것이 유익한 질환, 병태 또는 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (i) 포유동물로부터 조직 또는 생물학적 체액 샘플을 수득하는 단계; (ii) 상기 샘플을 헵시딘-25 선택적 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계; 및 (iii) 상기 샘플에서 헵시딘-25의 양을 정량적, 반-정량적 또는 정성적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물로부터 수득한 조직 또는 생물학적 체액 샘플에서 헵시딘-25의 양을 측정하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 (i) 고체 지지체를 서열 1, 서열 3 (마우스 5-25), 또는 서열 2 (래트 5-25)의 아미노산 5 내지 25 내에 함유된 에피토프에 결합하는 1차 항체로 코팅하는 단계; (ii) 포유동물로부터 조직 또는 생물학적 체액의 시험 샘플을 수득하는 단계; (iii) 상기 시험 샘플을 항체 코팅된 고체 지지체에 적용하는 단계; (iii) 헵시딘-1차 항체 결합을 위한 적합한 조건하에서 존재하는 임의의 헵시딘이 헵시딘-1차 항체 복합체를 형성하도록 두는 단계; (iv) 결합되지 않은 샘플을 제거하는 단계; (v) 인간 또는 설치류 헵시딘-25의 아미노산 1 내지 7 내에 함유된 에피토프, 즉 각각 DTHFPIC 또는 DTNFPIC에 결합하는 2차 항체를 고체 지지체에 적용하는 단계; (vi) 2차 항체가 임의의 헵시딘-25-1차 항체 복합체에 결합하는데 적합한 조건하에서 존재하는 임의의 헵시딘-25가 2차 항체-헵시딘-25-1차 항체 복합체를 형성하도록 두는 단계; (v) 결합되지 않은 2차 항체를 제거하는 단계; 및 (vi) 2차 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 포유동물로부터 수득한 조직 또는 생물학적 체액 샘플에서 헵시딘-25의 양을 정량하는 방법에 유용하다. 2차 항체의 존재 또는 부재는 직접적으로 또는 간접적으로 검출할 수 있으며, 정량적, 반-정량적 또는 정성적으로 측정할 수 있다.

도 1은 항-헵시딘-25 선택적 Mab 3.23에 의해 인간 혈청으로부터 면역침강된 인간 헵시딘의 형태의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 나타낸다. 신호 1은 온전한 인간 헵시딘-25 (대략 분자량 (MW) 2790 달톤 (Da))의 예상 질량과 일치하는 질량을 갖는다. 신호 2는 온전한 인간 헵시딘-20 (MW 2192 Da)의 예상 질량과 일치하는 질량을 갖는다. 크로마토그램이 증명하는 바와 같이, 항-헵시딘-25 Mab 3.23은 검출가능한 양의 헵시딘-25와 결합하였고, 훨씬 적은 양의 헵시딘-20와 결합하였다. Mab 3.23은 헵시딘-22 (MW 2436 Da), 헵시딘-24 (MW 2674 Da) 또는 프로-헵시딘 (MW 6929 Da)과는 검출가능한 수준으로 결합하는 것으로 보이지 않았다. 질량 스펙트럼은 본질적으로 이하의 실시예 6에서 기재하는 바와 같이 샘플 매트릭스로서 a-시아노-4-히드록시신남산 (펩티드 매트릭스)을 이용하여 양이온, 선형 모드 방법으로 MALDI-TOF 질량 분광분석기 상에 표출시켰다.
도 2는 도 1에 나타낸 질량 스펙트럼의 적절한 영역 (MW 2000 내지 3000 Da)의 확대도를 나타낸다. 크로마토그램이 증명하는 바와 같이, Mab 3.23은 헵시딘-25에 결합하였고 (신호 1), 훨씬 적은 수준으로 헵시딘-20에 결합하였다 (신호 2). 항-헵시딘 선택적 Mab 3.23은 헵시딘-22 (MW 2436 Da) 또는 헵시딘-24 (MW 2674 Da)와는 검출가능한 수준으로 결합하는 것으로 보이지 않았다.
도 3은 항-헵시딘-25 선택적 Mab 5E8에 의해 인간 혈청으로부터 면역침강된 인간 헵시딘의 형태의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 나타낸다. 신호 1은 온전한 인간 헵시딘-25 (2790 Da)의 예상 질량과 일치하는 질량을 갖는다. 크로마토그램이 증명하는 바와 같이, 항-헵시딘-25 Mab 5E8은 검출가능한 양의 헵시딘-25와만 결합하였다. 질량 스펙트럼은 본질적으로 이하의 실시예 6에서 기재하는 바와 같이 샘플 매트릭스로서 a-시아노-4-히드록시신남산 (펩티드 매트릭스)을 이용하여 양이온, 선형 모드 방법으로 MALDI-TOF 질량 분광분석기 상에 표출시켰다.
도 4는 도 1에 나타낸 질량 스펙트럼의 적절한 영역 (MW 2000 내지 3000 Da)의 확대도를 나타낸다. 크로마토그램이 증명하는 바와 같이, Mab 5E8은 검출가능한 양으로 헵시딘-25에 결합하였다 (신호 1). Mab 5E8은 헵시딘-20 (MW 2192 Da), 헵시딘-22 (MW 2436 Da), 헵시딘-24 (MW 2674 Da), 또는 프로-헵시딘 (MW 6929 Da)과는 검출가능한 수준으로 결합하지 않았다.
도 5는 합성 헵시딘-25 (검정색 동그라미)를 10 ㎍/L (10 ng/mL)의 농도에서 시작하여 연속 희석하고, 실시예 8에서 기재하는 MSD 면역검정을 수행하여 생성된, 헵시딘-25에 대한 검량선 그래프를 보여준다. MSD 면역검정은 헵시딘-25에 대해 특이적이었고, 헵시딘-20 (검정색 삼각형) 또는 헵시딘-22 (흰색 동그라미)는 인식하지 못했다.

하기의 약어가 본원에서 사용된다: ACN: 아세토니트릴, BSA: 소 혈청 알부민, DTT: 디티오트레이톨, EDTA: 에틸렌디아민 테트라아세트산, ELISA: 효소결합 면역흡착 검정법, IMAC: 고정된 금속-친화도 크로마토그래피, IPTG: 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드, Mab: 모노클로날 항체, Mabs: 모노클로날 항체들, MALDI-TOF: 매트릭스-관련 레이저 탈착 이온화법-비행 시간형, PBS: 포스페이트-완충 염수, SPR: 표면 플라즈몬 공명, TFA: 트리플루오로아세트산. 본 개시 내용에서 사용된 모든 아미노산 약어는 37 C.F.R. § 1.822 (B)(2)에 기재된 바와 같이, 미국 특허 상표청(United States Patent and Trademark Office)으로부터 승인받은 것이다.

본 발명은 헵시딘-25의 아미노산 1 내지 7 내에 함유된 에피토프를 표적으로 하여, 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다. 그러한 항체는 빈혈과 같은 질환, 병태 또는 질병을 치료하기 위해 인간에서 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구용적률을 증가시키는데 유용하다. 추가로, 본 발명은 포유동물의 조직 및 생물학적 체액 내에서 헵시딘-25를 검출 및/또는 측정하기 위한, 비교적 간단하지만 민감도가 매우 높고 선택적인 면역검정에서 그러한 항체를 이용하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용되는 경우, 용어 "헵시딘"은 포유동물에 존재하는 것으로 알려져 있는 임의의 형태의 헵시딘 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용되는 경우, 용어 "성숙한 헵시딘"은 포유동물에서 발현된, 임의의 성숙한 생물활성 형태의 헵시딘 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용되는 경우, 어구 "인간 헵시딘"은 인간에 존재하는 임의의 형태의 헵시딘 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용되는 경우, 어구 "인간 헵시딘-25"는 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는, 성숙한 형태의 인간 헵시딘을 지칭한다.

항체의 일반적인 구조는 당업계에 매우 잘 알려져 있다. IgG형의 항체의 경우, 쇄내 및 쇄간 디술피드 결합을 통해 가교된 4개의 아미노산 쇄 (2개의 "중쇄"와 2개의 "경쇄")가 존재한다. 특정 생물계에서 발현되는 경우, 변형되지 않은 인간 Fc 서열을 갖고 있는 항체는 Fc 영역에서 당화가 일어난다. 항체의 그 밖의 다른 위치에서도 역시 당화가 일어날 수 있다. 항체의 서브유니트 구조 및 3차원적 형상이 당업계에 잘 알려져 있다. 각 중쇄는 N-말단 중쇄 가변 영역 ("HCVR") 및 중쇄 불변 영역 ("HCCR")으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 IgG, IgD, 및 IgA의 경우에는 3개의 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)으로; 및 IgM 및 IgE의 경우에는 4개의 도메인 (CH1, CH2, CH3, 및 CH4)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 "LCVR") 및 경쇄 불변 영역 ("LCCR")으로 구성된다.

각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. HCVR 및 LCVR 영역은 추가로 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명되는 초가변 영역과, 그 사이에 배치된 프레임워크 영역 (FR)으로 명명되는 더욱 보존적인 영역으로 세분될 수 있다. 각 HCVR과 LCVR은 아미노-말단에서부터 카르복시-말단까지 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본원에서, 중쇄의 3개의 CDR은 "CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3"으로 지칭되고, 경쇄의 3개의 CDR은 "CDRL1, CDRL2 및 CDRL3"으로 지칭된다. 이들 CDR은 항원과의 특이적인 상호작용을 형성하는 잔기 대부분을 함유하고 있다. 아미노산을 각 도메인으로 지정하는 것은 잘 알려져 있는 협정 (예를 들어, 문헌 [Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)])에 따른다.

본 발명의 항체는 임의의 면역글로불린 부류 (IgA, IgD, IgG, IgM, 및 IgE)로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 또는 마우스 IgG Fc 영역으로부터 유래된 불변 영역을 함유한다.

용어 "모노클로날 항체"는, 예를 들어 임의의 진핵생물, 원핵생물, 또는 파지 클론을 비롯한 단일 카피 또는 클론으로부터 유래된 항체를 지칭하며, 그것이 생산된 방법을 지칭하는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 모노클로날 항체는 균질하거나 실질적으로 균질한 군집으로 존재한다.

본 발명의 항체는 Fc 영역을 포함하는 완전한 또는 전장의 불변 영역을 포함하는 온전한 것이거나, 또는 그러한 항체의 부분 또는 단편 (단, 임의의 단축된 형태는 항원-결합 부분을 포함하고 항원-결합 능력을 보유함)일 수 있다. 그러한 단축된 형태는, 예를 들어 개시하는 항-헵시딘-25 선택적 항체의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 Fab 단편, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편을 포함한다. 또한, 그러한 단축된 항체 형태는 LCVR 및 HCVR을 코딩하는 DNA를 링커 서열과 연결하여 생산할 수 있는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다. (문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp 269-315, 1994] 참조). 단편 또는 부분이 명시되었는지 여부와는 관계없이, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 달리 언급되지 않는 한, 그러한 단편 또는 부분 뿐만 아니라, 단일쇄 형태를 포함한다. 단백질 부분 또는 단백질 단편이 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 능력을 보유하고, 생체내 또는 시험관내에서 하나 이상의 포유동물의 헵시딘-25의 생물활성 특징을 중화시키는 한, 그것은 용어 "항체"에 포함된다.

본 발명의 항체는 당업계에 널리 알려져 있는 기술, 예를 들어 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 그러한 기술들의 조합 또는 그 밖에 당업계에 널리 알려져 있는 기술을 이용하여 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45:1628-50 (1999)] 및 [Fellouse, F.A., et al., J. Mol. Biol., 373(4):924-40 (2007)] 참조).

하기의 표 1 및 2는 본 발명의 항체에 대한 바람직한 CDR을 나타낸다.

본 발명은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 하기를 포함하는 항체를 포함한다:

a) 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역;

i) 서열 6, 9, 12, 45, 15, 17, 20, 24 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1;

ii) 서열 7, 10, 13, 18, 21 및 25로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및

iii) 서열 8, 11, 14, 16, 19, 22, 23, 17 및 28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR3; 및

b) 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역;

i) 서열 29, 32, 35, 38, 39 및 42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1;

ii) 서열 30, 33, 36, 40 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR2; 및

iii) 서열 31, 24, 27, 41 및 44로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR3.

이와 달리, 본 발명의 바람직한 항체는 하기를 포함한다:

a) 하기를 포함하는 LCVR;

i) 서열 9, 12, 20 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1;

ii) 서열 10, 13, 21 및 25로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및

iii) 서열 11, 14, 23 및 27로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR3; 및

b) 하기를 포함하는 HCVR;

i) 서열 32, 35 및 42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1;

ii) 서열 33, 36 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR2; 및

iii) 서열 34, 37 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 HCDR3.

또 다른 본 발명의 바람직한 항체는 각각 서열 20, 21, 22, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함한다.

또 다른 본 발명의 바람직한 항체는 각각 서열 26, 25, 28, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함한다.

또 다른 본 발명의 바람직한 항체는 각각 서열 24, 25, 23, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함한다.

보다 바람직한 본 발명의 항체는 각각 서열 26, 25, 27, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함한다.

보다 더 바람직한 본 발명의 항체는 각각 서열 9, 10, 11, 32, 33, 및 34에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함한다.

보다 더 바람직한 본 발명의 항체는 각각 서열 12, 13, 14, 35, 36 및 37에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함한다.

보다 더 바람직한 본 발명의 항체는 각각 서열 45, 13, 14, 35, 36 및 37에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함한다.

가장 바람직한 본 발명의 항체는 각각 서열 20, 21, 23, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함한다.

가장 바람직한 본 발명의 항체는 각각 서열 12, 13, 14, 38, 36 및 37에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함한다.

가장 바람직한 본 발명의 항체는 각각 서열 15, 10, 16, 39, 40 및 41에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함한다.

본 발명의 바람직한 항체는 서열 46, 48, 50, 52, 53, 55, 57, 59, 60, 61, 62, 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 항체는 서열 47, 49, 51, 54, 56 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 항체는 서열 59의 LCVR 및 서열 58의 HCVR을 포함한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 항체는 서열 60의 LCVR 및 서열 58의 HCVR을 포함한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 항체는 서열 61의 LCVR 및 서열 58의 HCVR을 포함한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 항체는 서열 62의 LCVR 및 서열 58의 HCVR을 포함한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 항체는 서열 63의 LCVR 및 서열 58의 HCVR을 포함한다. 가장 바람직한 본 발명의 항체는 서열 48의 LCVR 및 서열 49의 HCVR을 포함한다. 본 발명의 또 다른 가장 바람직한 항체는 서열 55의 LCVR 및 서열 56의 HCVR을 포함한다. 그러한 LCVR은 경쇄 또는 중쇄 불변 영역에 바람직하게 연결된다.

본 발명의 바람직한 모노클로날 항체는 본원에서 4C11, 1G8, 1B4, 1E3, 3A9, 2, 5E8, OB3, OB1, OH4 및 OE1로 지칭된다. Mabs 4C11, 1G8, 1B4, 1E3, 3A9, 5E8, OB3, OB1, OH4, OE1, 3.12, 3.23 및/또는 그의 다양한 단편을 코딩하는 아미노산의 서열을 하기의 표 3에 제공한다:

용어 "에피토프"는 하나 이상의 항체의 항원-결합 영역에서 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 분자의 부분을 지칭한다. 에피토프 결정자는 보통 분자의 화학적 활성 표면기, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄로 이루어지고, 보통 특이적인 3차원 구조적 특징, 및 특이적인 전하 특징을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 성숙한 헵시딘의 N-말단 상의 에피토프에 결합한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 헵시딘-25의 아미노산 1 내지 7 내에 함유된 에피토프에 결합한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 헵시딘-25의 N-말단에 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 헵시딘-25의 아미노산 1 내지 7 내에 함유된 에피토프에 결합한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 항체는 서열 1의 아미노산 DTHFPIC 내에 함유된 에피토프에 결합한다.

본원에서 사용되는 용어 "결합 친화도 (K_D)"는 특정 항원-항체 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 의도된다. K_D는 해리 속도의 비로서, "오프-속도(k_off)"라고도 불리며, 결합 속도의 비에 대해서는, 또는 "온-속도(k_on)"라고도 불린다. 따라서, K_D는 k_off/k_on과 동일하며, 몰 농도 (M)로서 표현된다. K_D가 작을수록 결합 친화도가 강하게 된다. 따라서, K_D가 1 μM이라는 것은 K_D가 1 nM인 것에 비해 결합 친화도가 약하다는 것을 나타낸다. K_D 값은 당업계에 알려져 있는 방법으로 얻을 수 있다.

본 발명의 항-헵시딘-25 항체와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "선택적"이란 항체가 25℃에서 SPR로 측정했을 때 동일한 포유동물 종에 존재하는 헵시딘-25의 적어도 하나의 전구체 형태 및/또는 헵시딘-25의 적어도 하나의 N-말단이 절단된 형태에 결합하는 항체보다 약 1000-, 500-, 200-, 100-, 50-, 10-, 또는 약 5-배 낮은 K_D로 헵시딘-25에 결합하는 항체를 지칭한다. 추가로, 또는 이와 달리, 본 발명의 헵시딘-25 선택적 항체는 본원의 하기 실시예 4 내지 8에서 기재하는 면역검정 및/또는 MALDI-TOF 질량 분광분석법으로 검정했을 때, 헵시딘-25에 결합하지만 포유동물 종에 존재하는 헵시딘-25의 적어도 하나의 전구체 형태 및/또는 헵시딘-25의 적어도 하나의 N-말단이 절단된 형태에는 결합하지 않거나 또는 오직 최소한도로 결합한다. 바람직하게는, 헵시딘-25의 전구체 형태는 프로-헵시딘이고, 보다 바람직하게는 인간 프로-헵시딘이고, 가장 바람직하게는 서열 90에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열로 이루어진 인간 프로-헵시딘이다. 바람직하게는, 헵시딘-25의 N-말단이 절단된 형태는 인간 헵시딘-20 (즉, 서열 1의 아미노산 6-25) 또는 인간 헵시딘-22 (서열 1의 아미노산 4-25)이다.

용어 "검출하다" 또는 "검출하는"은 최대로 광범위하게 사용되며, 이는 표적 분자의 정량적, 반-정량적 또는 정성적 측정을 포함한다. 일 측면에서, 본원에 기재된 방법은 생물학적 샘플 내의 특정 헵시딘 폴리펩티드 존재 여부만을 측정할 수 있고, 따라서, 헵시딘 폴리펩티드는 본 방법으로 검정하는 경우, 샘플 내에서 검출될 수도, 또는 이와 달리 검출되지 않을 수도 있다.

본 발명의 항체와 관련하여 용어 "생물활성"은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 에피토프 또는 항원 결합 친화도, 항체의 생체내 및/또는 시험관내 안정성, 항체의 면역원성 특성 (예를 들어, 인간 대상체에 투여한 경우), 및/또는 동물 염증 모델, 예를 들어 IL-6 유도된 염증 유발 검정에서 혈청 철분 수치 이상조절을 억제하는 것을 포함하여 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아님) 생체내 또는 시험관내에서 헵시딘-25의 생물활성을 중화시키거나 또는 길항작용을 하는 능력을 포함한다. 상기 특성 또는 특징은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 섬광 근접 검정, ELISA, 오리겐(ORIGEN) 면역검정 (IGEN), 형광 켄칭법, 형광 ELISA, 경쟁적 ELISA, SPR 분석 (비아코어(BIAcore) 바이오센서를 이용한 SPR 분석을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아님), 제한없는 시험관내 및 생체내 중화 검정 (예를 들어, PCT 국제 특허 공개 공보 제WO 2006/062685호 참조)을 비롯한 당업계-인지의 기술을 이용하여 관찰하거나 측정할 수 있다.

헵시딘과 관련하여 용어 "생물활성"은, 다른 단백질, 예컨대 이것으로 한정되는 것은 아니지만 그의 수용체 페로포틴(ferroportin)에의 헵시딘의 특이적 결합, 헵시딘의 하나 이상의 페로포틴-매개 기능, 예컨대 헵시딘-유도된 내재화 및/또는 페로포틴의 분해 (예를 들어, 문헌 [Nemeth, E., et al., Hepcidin Regulates Iron Efflux by Binding to Ferroportin and Inducing Its Internalization, Science 306, 2090-2093, (2004)] 참조), 페로포틴-매개 철 유출의 헵시딘 조절, 인간에서의 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구용적률에서의 헵시딘 유도된 감소, 단백질 안정성, 즉 생체내 또는 시험관내에서 다른 단백질의 수준 또는 활성에 헵시딘이 영향을 미치는 것, 및 헵시딘 발현 수준 및/또는 조직 분포를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본원에서 본 발명의 항체의 생물활성과 관련하여 사용되는 용어 "억제하다" 또는 "중화하다"는 인간, 래트, 또는 마우스 헵시딘-25의 생물활성을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아닌 헵시딘의 생물활성과 실질적으로 길항작용하거나, 또는 이를 금지하거나, 방해하거나, 저지하거나, 늦추거나, 교란하거나, 제거하거나, 중지시키거나, 감소시키거나, 또는 역전시키는 항체의 능력을 의미한다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 포유동물, 바람직하게는 인간을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 환자는 감소된 헵시딘 수준, 헵시딘 생물활성의 감소, 및/또는 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구용적률의 증가로 인해 이익을 얻을 질환, 질병, 또는 병태를 갖는다.

항체 및 헵시딘 폴리펩티드 사이의 결합과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합한다"는 25℃에서 SPR로 측정했을 때 항체가 헵시딘 폴리펩티드에 약 500 nM 미만의 K_D로 결합하는 것을 의미한다.

일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 25℃에서 SPR로 측정했을 때 인간 헵시딘-25 (서열 1)에 대해 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 1 nM, 또는 약 800 pM 미만의 K_D를 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 비-인간 포유동물 종의 적어도 하나의 성숙한 헵시딘 폴리펩디드에 특이적으로 결합한다. 보다 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스, 래트 및 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (각각 서열 3, 2, 및 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 헵시딘-25 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (서열 4)에 특이적으로 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스 및/또는 래트 헵시딘-25 (각각 서열 3 및/또는 2)에 특이적으로 결합한다.

일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 25℃에서 SPR로 측정했을 때 인간 헵시딘-25 (서열 1)에 대해 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 1 nM, 또는 약 800 pM 미만의 K_D를 갖고, i) 항체는 25℃에서 SPR로 측정했을 때 인간 프로-헵시딘, 인간 헵시딘-20 (서열 88) 또는 인간 헵시딘-22 (서열 89)에 대해 적어도 약 200-, 약 100-, 약 50-, 약 10-, 또는 약 5-배 더 큰 K_D를 갖거나, 또는 ii) 실시예 4 내지 7에서 기재하는 면역검정 및/또는 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의하면 인간 프로-헵시딘, 인간 헵시딘-20 (서열 88) 또는 인간 헵시딘-22 (서열 89)에 대한 항체의 결합은 검출되지 않거나, 최소한도로 검출된다. 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 비-인간 포유동물 종의 적어도 하나의 성숙한 헵시딘 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 보다 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스, 래트 및 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (각각 서열 3, 2 및 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 헵시딘-25 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (서열 4)에 특이적으로 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스 및/또는 래트 헵시딘-25 (각각 서열 2 및 3)에 특이적으로 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 25℃에서 SPR로 측정했을 때 인간 헵시딘-25 (서열 1)에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖고, i) 항체는 25℃에서 SPR로 측정했을 때 인간 프로-헵시딘, 인간 헵시딘-20 (서열 88) 또는 인간 헵시딘-22 (서열 89)에 대해 적어도 약 200-, 약 100-, 약 50-, 약 10-, 또는 약 5-배 더 큰 K_D를 갖거나, 또는 ii) 실시예 4 내지 7에서 기재하는 면역검정 및/또는 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의하면 인간 프로-헵시딘, 인간 헵시딘-20 (서열 88) 또는 인간 헵시딘-22 (서열 89)에 대한 항체의 결합은 검출되지 않거나, 최소한도로 검출된다. 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 비-인간 포유동물 종의 적어도 하나의 성숙한 헵시딘 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 보다 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스, 래트 및 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (각각 서열 3, 2 및 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 헵시딘-25 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (서열 4)에 특이적으로 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스 및/또는 래트 헵시딘-25 (각각 서열 3 및 2)에 특이적으로 결합한다.

일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 25℃에서 SPR로 측정했을 때 인간 헵시딘-25 (서열 1)에 대해 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 1 nM, 또는 약 800 pM 미만의 K_D를 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 비-인간 포유동물 종의 적어도 하나의 성숙한 헵시딘 폴리펩티드에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다. 보다 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스, 래트 및 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (각각 서열 3, 2, 및 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 헵시딘-25 폴리펩티드에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (서열 4)에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스 및/또는 래트 헵시딘-25 (각각 서열 3 및 2)에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 25℃에서 SPR로 측정했을 때 인간 헵시딘-25 (서열 1)에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 비-인간 포유동물 종의 적어도 하나의 성숙한 헵시딘 폴리펩티드에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다. 보다 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스, 래트 및 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (각각 서열 3, 2, 및 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 헵시딘-25 폴리펩티드에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (서열 4)에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스 및/또는 래트 헵시딘-25 (각각 서열 3 및 2)에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다.

일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 25℃에서 SPR로 측정했을 때 인간 헵시딘-25 (서열 1)에 대해 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 1 nM, 또는 약 800 pM 미만의 K_D를 갖고, i) 항체는 25℃에서 SPR로 측정했을 때 인간 프로-헵시딘, 인간 헵시딘-20 (서열 88) 또는 인간 헵시딘-22 (서열 89)에 대해 적어도 약 200-, 약 100-, 약 50-, 약 10-, 또는 약 5-배 더 큰 K_D를 갖거나, 또는 ii) 실시예 4 내지 7에서 기재하는 면역검정 및/또는 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의하면 인간 프로-헵시딘, 인간 헵시딘-20 (서열 88) 또는 인간 헵시딘-22 (서열 89)에 대한 항체의 결합은 검출되지 않거나, 최소한도로 검출된다. 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 비-인간 포유동물 종의 적어도 하나의 성숙한 헵시딘 폴리펩티드에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다. 보다 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스, 래트 및 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (각각 서열 3, 2 및 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 헵시딘-25 폴리펩티드에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (서열 4)에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스 및/또는 래트 헵시딘-25 (각각 서열 3 및 2)에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 25℃에서 SPR로 측정했을 때 인간 헵시딘-25 (서열 1)에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖고, i) 항체는 25℃에서 SPR로 측정했을 때 인간 프로-헵시딘, 인간 헵시딘-20 (서열 88) 또는 인간 헵시딘-22 (서열 89)에 대해 적어도 약 200-, 약 100-, 약 50-, 약 10-, 또는 약 5-배 더 큰 K_D를 갖거나, 또는 ii) 실시예 4 내지 7에서 기재하는 면역검정 및/또는 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의하면 인간 프로-헵시딘, 인간 헵시딘-20 (서열 88) 또는 인간 헵시딘-22 (서열 89)에 대한 항체의 결합은 검출되지 않거나, 최소한도로 검출된다. 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 비-인간 포유동물 종의 적어도 하나의 성숙한 헵시딘 폴리펩티드에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다. 보다 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스, 래트 및 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (각각 서열 3, 2 및 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 헵시딘-25 폴리펩티드에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25 (서열 4)에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 또한 25℃에서 SPR로 측정했을 때 마우스 및/또는 래트 헵시딘-25 (각각 서열 3 및 2)에 대해 약 100 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 800 pM, 약 50 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 35 nM 내지 1 nM의 K_D를 갖는다.

항체 발현

표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선별하고, 본 발명의 항체를 생산하는 숙주 세포주를 단리하고, 이들 숙주 세포를 배양하고, 항체를 배양 배지로부터 회수한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항-헵시딘 항체를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 원핵성 (박테리아) 및 진핵성 발현 시스템 (예컨대 효모, 바큘로바이러스, 식물, 포유동물 및 그 밖의 동물 세포, 트랜스제닉 동물, 및 하이브리도마 세포) 뿐만 아니라, 파지 디스플레이 발현 시스템을 비롯한, 당업계에 공지된 매우 광범위한 숙주 발현 시스템을 사용하여 본 발명의 항체를 발현시킬 수 있다.

본 발명의 항체는 숙주 세포 내에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자를 재조합 발현시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해서는, 항체의 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 DNA 단편을 운반하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키거나, 형질도입시키거나, 감염 등을 시켜, 상기 경쇄 및/또는 중쇄를 숙주 세포 내에서 발현시킨다. 중쇄 및 경쇄는 1개의 벡터 내에서 작동가능하게 연결된 상이한 프로모터로부터 독립적으로 발현될 수 있거나, 또는 이와 달리, 중쇄 및 경쇄는 2개의 벡터 - 1개는 중쇄를 발현하고 다른 1개는 경쇄를 발현함 - 내에서 작동가능하게 연결된 상이한 프로모터로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 임의로, 중쇄 및 경쇄는 다른 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다.

숙주 세포는 또한 종래의 기술을 이용하여, 온전한 항체의 부분, 또는 단편, 예를 들어 Fab 단편 또는 scFv 분자를 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 사용하여 인간 헵시딘-25에 대한 결합에 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 모두를 코딩하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거할 수 있다. 그러한 절단된 DNA 분자로부터 발현된 분자 또한 본 발명의 항체에 포함된다.

본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터 또는 구축물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 숙주 세포는, 본 발명의 항체의 LCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 HCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 벡터가 도입된 세포이다. 본 발명은 또한 본 발명의 2개의 벡터 (1개는 본 발명의 항체의 LCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 다른 1개는 본 발명의 항체 내에 존재하는 HCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 각각 유전자의 전사 수준을 높이는 인핸서/프로모터 조절 요소 (예를 들어, SV40, CMV, 아데노바이러스 등으로부터 유래된 것, 예컨대 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소)와 작동가능하게 연결됨)가 도입된 숙주 세포를 제공한다.

일단 발현되면, 본 발명의 온전한 항체, 개별적인 경쇄 및 중쇄, 또는 그 밖의 면역글로불린 형태는 황산암모늄 침전법, 이온 교환법, 친화도 (예를 들어, 단백질 A), 역상, 소수성 상호작용 칼럼 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 비롯한 당업계의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다. 제약 용도를 위해서는 균질도가 적어도 약 90％, 약 92％, 약 94％ 또는 약 96％인 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고, 약 98 내지 약 99％ 이상의 균질도가 가장 바람직하다. 일단 부분적으로 또는 원하는 균질도로 정제되고 나면, 이어서 본원에서 지시하는 바에 따라 멸균 항체를 요법적으로 사용할 수 있다.

인간의 조작된 항체

바람직하게는, 치료 목적으로 사용될 본 발명의 항체는 항체가 면역 반응을 야기할 가능성을 감소시키기 위해, 인간으로부터 유래된 프레임워크 및 불변 영역 서열을 (항체 내에 존재하는 정도로) 갖는다. 인간의 조작된 항체는 이것이 치료상 적용 가치가 있고, 인간 대상체에게 투여되었을 때 뮤린 기원의 항체 또는 뮤린 기원인 부분을 포함하는 항체에 의해 종종 관찰되는 인간 항-마우스 항체 반응의 가능성을 줄이기 때문에 특히 관심의 대상이다. 바람직하게 주입된 인간의 조작된 항체는, 예를 들어 뮤린 항체 보다 자연 발생 인간 항체에 더 가까운 반감기를 가질 수 있어, 대상체에 투여되는 용량 및 투여 빈도를 줄일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "인간의 조작된 항체"는 적어도 한 부분이 인간 기원인 항체를 지칭한다. 예를 들어, 인간의 조작된 항체는 종래의 기술 (예를 들어 합성 기술)에 의해 화학적으로 함께 연결되거나, 유전 공학 기술에 의해 인접한 폴리펩티드로서 제조된, 비인간 기원, 예컨대 마우스의 항체로부터 유래된 부분, 및 인간 기원의 항체로부터 유래된 부분을 포함할 수 있다.

바람직하게는, "인간의 조작된 항체"는 모 항체, 즉 비-인간 항체, 바람직하게는 마우스 Mab 또는 그의 단편, 예컨대 마우스 Fab 4C11로부터 기원하거나 그로부터 유래된 CDR을 갖는 한편, 프레임워크 및 불변 영역은 그것이 존재하는 정도까지 (또는 그것의 상당한 부분 또는 실질적인 부분, 즉 적어도 약 90％, 92％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％), 상기 항체가 인간 세포에서 생산되든 그렇지 않든 관계없이, 인간 생식계열 면역글로불린 영역 (예를 들어 인터내셔널 이뮤노제네틱스 데이타베이스(International ImMunoGeneTics Database) 참조) 또는 그의 재조합된 형태 또는 돌연변이된 형태에서 일어나는 핵산 서열 정보에 의해 코딩된다. 바람직하게는, 인간의 조작된 항체의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR은 원하는 특성, 예를 들어 개선된 특이성, 친화도 또는 중화도를 얻기 위해 인간의 조작된 항체가 유래되는 비-인간 모 항체의 CDR로부터 최적화되며, 이는 예를 들어 ELISA 검정과 같은 스크리닝 검정에 의해 확인할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 항체에서 최적화된 CDR은 모 마우스 Fab 4C11, 3A9, 또는 5E8에 존재하는 것과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 모 마우스 Fab 4C11, 3A9 또는 5E8과 비교하여 본 발명의 인간의 조작된 항체의 CDR 내의 특정 아미노산 치환은 항체가 불안정해질 수 있는 가능성을 감소시키거나 (예를 들어 하나 이상의 CDR Asn 잔기 제거), 인간 대상체에 투여되었을 때 항체의 면역원성의 가능성을 감소시킨다 (예를 들어 이뮤노필터™ 테크놀로지(IMMUNOFILTER™ Technology) (캘리포니아주 몬로비아 소재의 크센코르, 인크.(Xencor, Inc.))에 의해 예측).

인간의 조작된 항체는 바람직하게는 비-인간 항체로부터 유래된 서열을 최소한으로 함유한다. 인간의 조작된 항체는 수여자 항체나 모 항체로부터 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 인간의 조작된 항체는 당업계에서 흔히 사용되는 방법에 의해 시험관내에서 돌연변이유발될 수 있고, 따라서 인간의 조작된 재조합 항체의 HCVR 및 LCVR 영역의 프레임워크 영역 아미노산 서열은, 인간 생식계열 HCVR 및 LCVR 서열과 관련된 것으로부터 유래되었지만 생체내에서 인간 항체 생식계열 레파토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 인간의 조작된 재조합 항체의 HCVR 및 LCVR 프레임워크 영역의 상기 아미노산 서열은 인간 생식계열 서열과 적어도 약 85％, 약 90％, 약 92％, 약 94％, 약 95％, 약 96％, 약 98％ 또는 보다 바람직하게, 적어도 약 99％ 또는 가장 바람직하게는 100％ 동일한 것으로 생각된다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인간의 조작된 항체는 인간 생식계열 경쇄 프레임워크 서열 및 인간 생식계열 중쇄 프레임워크 서열을 포함한다 (예를 들어 PCT WO 2005/005604 참조).

인간의 조작된 항체를 생성하는데 이용가능한 많은 방법들이 당업계에 존재한다 (예를 들어, PCT 국제 특허 출원 공보 제WO2006/06046935호; 문헌 [Queen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869 (1991)]; [Jones et al., Nature, 321:522 (1986)]; [Riechmann, et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; 및 [Verhoeyen, et al., Science, 239:1534 (1988)] 참조). 예를 들어, 인간의 조작된 항체는, 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 모 항체 (예를 들어, 뮤린 항체 또는 하이브리도마에 의해 제조된 항체)의 HCVR 및 LCVR을 코딩하는 핵산 서열을 수득하고, 상기 HCVR 및 LCVR (비인간) 내의 CDR을 확인하고, 상기 CDR-코딩 핵산 서열을 선택된 인간 프레임워크-코딩 핵산 서열에 이식시킴으로써 생산할 수 있다. 임의로, CDR 영역을 프레임워크 영역에 이식시키기 전에 CDR 내의 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키기 위해, 무작위적으로 또는 특정 위치에서 돌연변이유발을 일으켜 CDR 영역을 최적화시킬 수 있다. 이와 달리, 당업자가 이용할 수 있는 방법을 사용하여 인간 프레임워크 영역 내로 삽입한 후에 CDR 영역을 최적화시킬 수 있다.

CDR-코딩 서열을 선택된 인간 프레임워크 코딩 서열에 이식시킨 후, 이어서 인간의 조작된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 코딩하는 생성된 DNA 서열을 발현시켜 헵시딘-25에 결합하는 인간의 조작된 항체를 생산한다. 인간의 조작된 HCVR 및 LCVR은 전체 항-헵시딘-25 항체 분자의 일부로서, 즉 인간 불변 도메인 서열과의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 그러나, HCVR 및 LCVR 서열은 또한 불변 서열이 없이도 발현되어, 예를 들어 인간의 조작된 항-헵시딘-25 Fv 또는 Fab를 생산할 수도 있다 (예를 들어 문헌 [Watkins, J., et al., Anal. Biochem. 253:37-45 (1997)] 및 [Watkins, J., et al., Anal. Biochem. 256:169-177, (1998)]) 참조).

진단상 용도

본 발명의 항체는 헵시딘-25에 의해 조장되는 질환 및 병태에 대한 소인을 평가하고, 상기 질환 및 병태를 앓는 환자에서 그러한 질환 및 병태를 검출 및 진단하기 위한, 조직 또는 생물학적 체액 내에서 헵시딘-25의 양을 정확하게 검출하거나 측정하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 헵시딘-25 선택적 항체는 예컨대 ELISA, RIA, 면역확산 검정, 또는 면역-검출 검정, 예컨대 SPR 검정과 같은, 고감도의 신뢰성이 있는 면역검정에 도입될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 헵시딘-25 선택적 항체는 또한 조직 또는 생물학적 체액 샘플의 면역조직화학적 (IHC) 및 면역형광적 (IF) 검정에 유용하다. 상기 검정들을 사용하여 비정상적인 헵시딘-25 수준을 검출할 수 있고, 이로써 헵시딘-25에 의해 조장된 질환 및 병태를 진단할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 환자로부터의 조직 또는 생물학적 체액 샘플에서 헵시딘-25의 수준을 측정하고, 샘플 내의 헵시딘-25의 수준을 하나 이상의 대조군 개체로부터의 상응하는 샘플 내의 헵시딘-25의 수준과 또는 참고 표준과 비교하여 헵시딘-25의 이상 수준과 관련된 질환 상태를 검출하는 것에 의한, 환자에서 헵시딘-25 관련 질환 또는 병태를 진단하는 방법을 제공한다. 질환 상태는 감소된 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구 용적률과 관련된 하나 이상의 유전적 또는 비유전적 질환을 포함할 수 있다. 바람직하게는 질환 상태는 빈혈과 관련된 하나 이상의 유전적 또는 비유전적 질환을 포함할 수 있다.

또한, 환자에서 헵시딘-25 관련 질환 또는 병태를 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 헵시딘-25 관련 질환 또는 병태를 앓고 있거나 앓을 위험이 있는 환자로부터의 조직 또는 생물학적 체액 샘플 내의 헵시딘-25의 수준을 제1 시점에 측정하고; 상기 환자로부터의 하나 이상의 조직 또는 생물학적 체액 샘플 내의 헵시딘-25의 수준을 하나 이상의 다른 시점에서 측정하고; 상이한 시점에서 측정된 헵시딘-25의 수준을 비교하여 헵시딘-25에 의해 조장된 질환 또는 병태를 모니터링하는 것을 포함한다.

본 발명의 헵시딘-25 선택적 항체는 고효율적인 방법에 적용할 경우에 특히유용하다. 그러한 방법으로는 많은 샘플이 마이크로플레이트 또는 슬라이드, 또는 당업계에 공지된 그 밖의 검정 기판 상에서 시험될 수 있도록 된 마이크로-칩 및 마이크로-어레이 방법이 있다.

생물학적 샘플 내의 헵시딘-25의 존재 또는 그의 수준은 생물학적 샘플을 예를 들어 본 발명의 항체와, 항원-항체 복합체를 형성하는데 적합한 조건하에서 조합시키는 것에 의해 확립할 수 있다. 항체를 직접적으로, 또는 보다 바람직하게는 간접적으로 검출가능한 모이어티로 표지하여, 결합되거나 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 한다. 면역복합체 형성을 검출하는 매우 다양한 방법이 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 ELISA, RIA, 면역블롯 (예를 들어, 도트 블롯, 슬롯 블롯, 웨스턴 블롯 등), 간접 면역형광 기술, 및 예컨대 SPR과 같은 물리적인 파라미터의 변화를 검출하는데 의존하는 방법 등이 있다. 그러한 적용은 검출가능한 모이어티와 접합되어 있는 본 발명의 헵시딘-25 선택적 항체를 사용하여 생물학적 샘플, 예를 들어 인간의 생물학적 체액 또는 세포 또는 조직 추출물 내의 헵시딘을 검출하는 방법을 포함한다. 상기 검정에서 본 발명의 항체는 검출가능한 모이어티에 의해 변형된 상태로 또는 변형되지 않은 상태로 사용될 수 있다. 검출가능한 모이어티에 의해 변형되는 경우, 본 발명의 항체는 검출가능한 모이어티의 공유적 또는 비공유적 부착에 의해 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "검출가능한"이란 공지된 분석 기술을 사용하여, 검출기에 의해 물질을 확인하거나 추적할 수 있도록 하는 물질 (접합체, 화합물, 또는 모이어티)의 특징을 기재한다. 검출가능한 모이어티의 대표적인 예에는, 제한없이, 발색단, 형광 모이어티, 인광 모이어티, 발광 모이어티, 방사성 모이어티, 각종 효소 (예컨대 알칼리성 포스파타제, 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제), 자성 모이어티 (예를 들어 반자성, 상자성 및 강자성 물질), 및 중금속 클러스터 뿐만 아니라, 임의의 그 밖의 공지의 검출가능한 모이어티가 포함된다. 형성된 항체-항원 표준 복합체의 양은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예컨대 광도 측정 또는 비색 측정 수단에 의해서 정량할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 변형되지 않은 상태로, 즉 당업계에 널리 알려져 있는 방법에 따라 간접적으로 표지된 상태로 사용된다.

본 발명은 본 발명의 항체를, 상기 항체가 헵시딘-25 단백질에 결합하는데 충분한 조건하에서 그러한 시간 동안 생물학적 샘플과 인큐베이션하고, 그러한 결합을 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 헵시딘-25 단백질을 검출하는 방법을 구현한다. 바람직하게는, 항체는 5E8, OH4 및/또는 OB3이다. 생물학적 샘플에서 헵시딘-25 단백질을 검출하기 위한 바람직한 방법은, 본 발명의 1차 항체를 상기 항체가 헵시딘-25 단백질과 결합하는데 충분한 조건하에서 그러한 시간 동안 생물학적 샘플과 인큐베이션하고, 결합되지 않은 샘플을 제거하고, 서열 1의 아미노산 1 내지 7 내에 함유된 에피토프에 선택적으로 결합하는 2차 항체를 적용하고, 결합되지 않은 2차 항체를 제거하고, 상기 2차 항체의 결합을 측정하는 것을 포함하는 샌드위치 ELISA이다. 바람직하게는, 1차 항체는 3.23 또는 3.12이고, 2차 항체는 OH4 또는 OB3이다. 항-헵시딘 Mab 3.23은 2개의 경쇄 폴리펩티드 및 2개의 중쇄 폴리펩티드를 포함하며, 각각의 경쇄 폴리펩티드는 서열 82에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 각각의 중쇄 폴리펩티드는 서열 83에 나타낸 아미노산 서열을 가지며, 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합한다. 항-헵시딘 Mab 3.12는 2개의 경쇄 폴리펩티드 및 2개의 중쇄 폴리펩티드를 포함하며, 각각의 경쇄 폴리펩티드는 서열 84에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 각각의 중쇄 폴리펩티드는 서열 85에 나타낸 아미노산 서열을 가지며, 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합한다. 생물학적 샘플에서 헵시딘-25 단백질을 검출하기 위한 보다 바람직한 방법은, 헵시딘의 아미노산 5-25 내에 함유된 에피토프에 선택적으로 결합하는 1차 항체를 상기 항체가 헵시딘 단백질(들)과 결합하는데 충분한 조건하에서 그러한 시간 동안 생물학적 샘플과 인큐베이션하고, 결합되지 않은 샘플을 제거하고, 헵시딘-25의 아미노산 1 내지 7 내에 함유된 에피토프에 결합하는 2차 항체를 적용하고, 결합되지 않은 2차 항체를 제거하고, 상기 2차 항체의 결합의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는 샌드위치 ELISA이다. 바람직하게는, 1차 항체는 3.23 또는 3.12이고, 2차 항체는 OH4 또는 OB3이다. 보다 바람직하게는, 2차 항체는 표지되지 않으며, 결합은 당업계에 공지된 방법에 따라 간접적으로 검출한다.

본 발명은 또한 헵시딘-25를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 스크리닝하기 위한 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 그러한 스크리닝은 상기 폴리펩티드를 함유하거나 생산하는 것으로 의심되는 환자 샘플, 또는 실험실용 샘플에 대해 실시될 수 있다. 키트는 본 발명의 헵시딘-25 선택적 항체를 함유할 수 있다. 키트는 샘플과 본 발명의 헵시딘-25 선택적 항체 사이의 상호작용을 검출하는데 적합한 완충액 및 시약을 함유할 수 있다. 제공되는 시약은 본 발명의 항체, 예컨대 항-마우스 IgG 항체와 결합할 수 있거나 상호작용할 수 있는, 방사성표지되거나, 형광-표지되거나 또는 효소-표지된 작용제일 수 있다.

키트용 시약은 고체 지지체에 부착된 액체 용액으로서, 또는 건식 분말로서 제공될 수 있다. 시약이 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 수용액인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 제공되는 시약이 고체 지지체에 부착된 경우, 고체 지지체는 크로마토그래피 매질, 다수의 웰이 있는 시험 플레이트, 또는 현미경 슬라이드일 수 있다. 제공되는 시약이 건식 분말인 경우, 분말은 키트에서 함께 제공될 수 있는 적합한 용매를 첨가하는 것에 의해 재구성될 수 있다.

본 발명의 키트는 일반적으로 항체, 항원 또는 검출 시약이 넣어질 수 있고, 바람직하게는 적절히 분취될 수 있는 바이알을 포함하는 용기로 제공된다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 상업적 시판을 위해 항체, 항원, 및 시약 용기를 함유하는 수단을 포함할 것이다. 그러한 용기는 그 안에 원하는 바이알을 보유하고 있는 플라스틱 용기와, 하나 이상의 필요한 화학물질, 예컨대 크로마토그래피 물질, 용매 및 용리제, 시험관, 계면활성제, 항체 및 검출 반응용 화학물질을 포함할 수 있다.

요법상 용도

헵시딘-25에 의해 조장된 질환 또는 병태는 상기 질환 또는 병태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 (1) 인간 헵시딘-25, 즉 DTHFPIC (서열 5), 및/또는 (2) 마우스 헵시딘-25, 즉 DTNFPIC (서열 86)를 포함하는 아미노산 1 내지 7 내에 함유된 에피토프에 결합하는 헵시딘-25 선택적 항체 2차 항체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것에 의해 예방 또는 치료될 수 있다.

본 발명의 항체를 포함하는 제약 조성물은 그를 필요로 하는 인간 대상체에게 유효량으로 투여되었을 때에 인간에서 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구용적률을 증가시키는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 헵시딘-25의 존재가 바람직하지 못한 병리학적 효과를 유발하거나 그에 원인이 되거나, 또는 헵시딘-25 수준 또는 헵시딘 생물활성을 감소시키는 것이 인간 대상체에서 요법상 유익한 병태, 질환, 또는 질병을 치료하는데 유용할 수 있다. 그러한 병태, 질환 또는 질병으로는 감염, 염증, 만성 질환, 및 암으로부터 유발된 빈혈을 비롯한 빈혈이 포함되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 바람직하게는, 바람직하지 않게 낮은 혈청 철분 수치, 낮은 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구용적률을 갖거나, 가질 위험이 있는 인간 대상체이다. 보다 바람직하게는, 감염, 염증, 만성 질환, 및/또는 암으로부터 유발된 빈혈을 비롯한 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아닌) 빈혈에 걸릴 위험이 있거나, 그러한 빈혈을 앓고 있는 인간 대상체이다.

추가로, 본 발명의 항체의 용도는 감염, 염증, 만성 질환, 및 암으로부터 유발된 빈혈을 비롯한 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아닌) 빈혈을 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하는데 사용된다.

본 발명의 헵시딘-25 선택적 항체는 또한 헵시딘-25에 의해 조장된 질환 및 병태의 예방 및 치료에 유용하다. 본 발명의 항-헵시딘-25 선택적 Mab는 헵시딘-25에 대한 수동 면역화를 위한 제약 조성물로 제형화될 수 있다. 본 발명의 Mab의 기능적 단편, 예컨대 Fab 단편, F(ab')2 단편 및 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 능력을 보유한 임의의 단편 또한 제약 조성물에 혼입될 수 있고, 치료에 적용될 수 있다.

또한, 본 발명의 헵시딘-25 선택적 Mab는 헵시딘-25에 의해 조장된 질환 및 병태의 진행을 모니터링하기 위한 면역검정에 적용될 수 있고, 이때 헵시딘-25의 수준 또는 양은 치료 또는 요법의 성공, 또는 질환 또는 병태의 진행에 있어서의 지표를 제공한다.

더욱이, 본 발명의 Mab는 헵시딘-25에 의해 조장된 질환 또는 병태를 앓고 있는 환자에서 헵시딘-25 차단 치료를 평가하는 방법에 유용하다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 초기 단계의 치료를 받기 전 또는 초기 단계 치료 중인 환자로부터 제1 생물학적 체액 샘플을 수득하는 단계;

b) 면역검정 방법에 의해 제1 샘플 내의 헵시딘-25 수준을 측정하는 단계;

c) 치료의 효과가 있을 적합한 시간 이후에 환자로부터 제2 생물학적 체액 샘플을 수득하는 단계;

d) 면역검정 방법에 의해 제2 샘플 내의 헵시딘-25의 양을 측정하는 단계;

e) 제1 샘플 내에서 측정된 헵시딘-25의 양을 제2 샘플 내의 헵시딘-25의 양과 비교하여 헵시딘-25 결합 또는 차단 치료의 효능을 판단하는 단계.

환자에서 헵시딘-25 결합 치료 또는 차단 치료를 평가하기 위해 적용되는 상기 기재의 방법은 임상 실무에서 특히 가치가 있으며, 이때 한 가지 치료적 처방 또는 다른 처방을 진행시키기 위한 결정 시점은 환자에 대한 결과상 중요할 수 있다. 본 발명의 방법은 이러한 중요한 결정에 기초가 되는 정보를 제공한다. 상기 방법은 초기 치료 단계 이전 또는 초기 치료 단계 중의 헵시딘-25 양의 측정치를 제공하고, 치료 개시 이후의, 특히 치료가 효과를 거두기 시작하는 것으로 기대되는 하나 이상의 시기에서 하나 이상의 헵시딘-25의 측정치를 제공한다.

헵시딘-25 차단 치료는 환자에 대한 항-헵시딘-25 선택적 항체의 수동 투여일 수 있다. 항-헵시딘-25 선택적 항체는 키메라 인간/비-인간 항체, 인간화되거나 또는 완전한 인간 모노클로날 항-헵시딘-25 선택적 항체, 또는 헵시딘-25 결합 기능이 있는 임의의 헵시딘-25 선택적 항체 단편일 수 있다.

면역복합체 형성을 검출하는 매우 다양한 방법들이 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 ELISA, RIA, 면역블롯 (예를 들어, 도트 블롯, 슬롯 블롯, 웨스턴 블롯 등), 간접 면역형광 기술 및 예컨대 SPR과 같은 물리적인 파라미터의 변화를 검출하는데 의존하는 방법이 있다. 널리 사용되는 한 가지 방법에서 면역복합체 형성은 표지, 예컨대 방사성표지 또는 효소 태그 (예컨대 알칼리성 포스파타제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제)를 사용하는 것을 통해 검출된다. 당업계에 널리 알려져 있는 방법에 따라 비오티닐화된 리간드와 결합하는 제2 결합 리간드, 예컨대 2차 항체 또는 아비딘-커플링된 분자를 사용하는 것을 통해 추가의 장점이 더해질 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "치료" 및 "치료하는"은 본원에서 기재하는 질환, 병태, 또는 질병을 갖고 있거나, 그러한 질환, 병태, 또는 질병의 징후가 있거나, 또는 그러한 질환, 병태, 또는 질병에 대한 소인이 있는 환자에게 치료 효과를 부여할 목적으로, 예를 들어 질환, 병태, 또는 질병, 그의 징후, 또는 그에 대한 소인을 치유하거나, 완화시키거나, 고치거나, 영향을 미치거나, 조절하거나, 중지시키거나, 개선시키거나, 또는 예방하기 위한 목적으로 물질을 투여하는 것을 지칭한다. 바람직하게는, 치료할 환자는 포유동물이고, 보다 바람직하게는 인간이다. 투여 처방은 목적하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료상 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일의 볼루스를 투여할 수 있거나, 여러 개로 세분된 용량을 시간에 걸쳐 투여할 수 있거나, 또는 치료 상황의 긴급함에 따라 용량을 비례적으로 감소시키거나 증가시킬 수 있다.

제약 조성물

본 발명의 항체는 인간 대상체에 투여하는데 적합한 제약 조성물에 혼입될 수 있다. 본 발명의 항체는 단독으로 또는 제약상 허용되는 담체 및/또는 희석제와 함께 조합되어 단일 또는 다중 용량으로 인간 대상체에 투여될 수 있다. 그러한 제약 조성물은 선택된 투여 방식에 적절하도록 디자인되고, 제약상 허용되는 희석제, 담체 및/또는 부형제, 예컨대 분산제, 완충제, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등이 적절하게 사용된다. 상기 조성물은 당업계에 공지된 통상의 기술에 따라서 디자인될 수 있다.

제약 조성물에 적합한 담체로는, 본 발명의 Mab와 함께 조합되었을 때 분자의 활성은 유지하면서, 대상체의 면역계와는 비반응성인 임의의 물질이 포함된다.

본 발명의 항-헵시딘-25 Mab를 포함하는 제약 조성물은 표준 투여 기술을 사용하여 본원에 기재된 병상, 예를 들어 빈혈 질병에 걸릴 위험이 있거나, 상기 질병을 보이는 대상체에게 투여될 수 있다.

본원에서 사용되는 어구 "유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하는데 (투여량 및 투여 기간 및 수단에 있어서) 필요한 양을 지칭한다. 항체의 유효량은, 예컨대 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유발하는 항체 또는 항체 부분의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 또한 치료상 유익한 효과가 항체의 임의의 독성 또는 불리한 효과를 능가하는 것이다.

유효량은 대상체에게 치료상 이점을 부여하는데 필요한 활성제의 적어도 최소한의 양으로, 그러나 독성량보다는 적은 양이다. 다시 말해, 본 발명의 항체의 유효량 또는 치료 유효량은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 (i) 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구용적률을 증가시키거나, (ii) 헵시딘-25의 존재가 바람직하지 못한 병리학적 효과를 유발하거나 그에 원인이 되는 병태, 질병 또는 질환을 치료하거나, 또는 (iii) 헵시딘-25 수준 또는 헵시딘 생물활성을 감소시키는 것이 감염, 염증, 만성 질환, 및/또는 암으로부터 유발된 빈혈을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아닌 만성 질환 빈혈 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아님)을 비롯한 빈혈 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아님)이 있는 포유동물, 바람직하게는 인간에서 요법상 유익한 효과를 야기하는 양이다. 유효량의 본 발명의 항체는 단일 용량으로 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 추가로, 유효량의 본 발명의 항체는, 수회에 걸쳐 투여되는 것이 아니라면, 유효량보다 적은 양의 다중 용량으로 투여될 수 있다.

의학 업계에서 널리 알려진 바와 같이, 임의의 한 대상체에 대한 투여량은 투여 빈도 및 경로, 일반적 건강 상태, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 비롯한 많은 요인에 따라 달라진다. 추가로, 용량은 질환의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다. 전형적인 용량은, 예를 들어 약 0.1 내지 약 100 mg; 바람직하게는 약 1 내지 약 100 mg; 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 50 mg의 범위일 수 있지만, 이러한 예시적 범위보다 적거나 많은 용량도 특히 상기 언급한 요인을 고려하여 구현된다. 일일 비경구적인 투여 처방은 총 체중의 약 10 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg, 바람직하게는 약 100 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg일 수 있다. 주기적인 평가에 의해 진행을 모니터링할 수 있고, 그에 따라 용량을 조정할 수 있다.

이와 같이 제시되는 항체의 양은 많은 치료적 판단에 영향을 받기 쉽다. 적절한 용량 및 스케줄 선택에 있어서 주요 요인은 수득되는 결과이다. 이러한 상황에서 고려할 요인으로는 치료될 특정 질병, 개별적인 환자의 임상 병태, 질병의 원인, 항체의 전달 부위, 항체의 특정 유형, 투여 방법, 투여 스케줄 및 빈도, 및 진료의에게 공지된 기타 요인이 있다.

본 발명의 항체의 투여 경로는 경구적, 비경구적, 흡입에 의해, 또는 국소적일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 비경구 투여에 적합한 제약 조성물에 혼입될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 비경구는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질, 또는 복강내 투여를 포함한다. 정맥내 또는 복강내 또는 피하 주사에 의한 비경구 전달이 바람직하다. 피하 주사가 가장 바람직하다. 그러한 주사에 적합한 비히클은 당업계에 널리 알려져 있다.

제약 조성물은 전형적으로 무균성이어야 하고, 제조 및 보관 조건하에서, 예를 들어 밀봉된 바이알, 시린지 또는 그 밖의 전달 장치, 예를 들어 펜을 비롯한 제공되는 용기 내에서 안정적이어야 한다. 따라서, 제약 조성물은 제형의 제조 후에 무균 여과될 수 있거나, 또는 다르게는 미생물학적으로 허용가능하게 제조될 수 있다.

하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 인간 헵시딘-25의 생산

인간 헵시딘-25는 상업적 공급원 (예를 들어 펩티드 인터내셔날(Peptide International) (켄터키주 루이스빌 소재))으로부터 입수할 수 있거나, 또는 당업계에 공지되어 있는 다양한 합성 또는 재조합 기술로 생산할 수 있다. 예를 들어, 25개의 헵시딘-25 아미노산을 포함하고 서열 95에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 이. 콜라이 (E. coli)에서 발현시켰다. 37℃에서 1 mM IPTG를 사용하여 유도한지 3 내지 6시간이 경과한 후에 인간 헵시딘-25 융합 단백질을 발현하는 3 ℓ의 이. 콜라이로부터 봉입체를 단리하였다. 봉입체를 완충액 A (50 mM 트리스 및 8 M 우레아 (pH 8.0))에 용해시켰다. 상청액을 고정된 금속-이온 친화도 크로마토그래피(Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography; IMAC) 칼럼 (20 mL 수지)으로 통과시켰다. 흡광도가 기준선으로 되돌아 갈 때까지 완충액 A를 사용하여 칼럼을 세척하고, 결합된 폴리펩티드는 완충액 A 중의 0.5 M 이미다졸을 이용하여 칼럼으로부터 배치 방식으로 용리시켰다. 인간 헵시딘-25 융합 단백질을 풀링하고, 50 mM DTT로 환원시켰다. 이어서, 풀링된 물질을 최종 단백질 농도가 50 ㎍/mL 미만이 되도록 2 M 우레아, 3 mM 시스테인, 50 mM 트리스 (pH 8.0)로 희석시켜 상기 융합 단백질을 리폴딩시켰다. 상기 물질을 실온에서 교반하고, 48시간 동안 공기 산화시켰다. 산화된 폴리펩티드를 5 mL/분의 유속으로 IMAC 칼럼 (20 mL)을 통과시키고, 인간 헵시딘-25 융합 단백질을 완충액 A 중의 0.5 M 이미다졸을 이용하여 칼럼으로부터 배치 방식으로 용리시켰다. 인간 헵시딘-25 융합 단백질을 함유하는 풀링된 분획을 농축시키고, 50 mM 트리스, 4 M 우레아 (pH 8.0)에 의해 평형상태에 있는 사이징 칼럼 (예를 들어, 슈퍼덱스(SUPERDEX)®75, GE 헬스케어(GE Healthcare), XK26/60)을 통해 3 mL/분의 유속으로 통과시켰다. 용리된 단량체 융합 단백질을 풀링한 다음, 50 mM 트리스, 2 M 우레아, 5 mM CaCl₂ (pH 8.0)로 희석하고, 이어서 엔테로키나제로 절단하여 서열 1의 인간 헵시딘-25를 생산하였다. 절단되지 않은 인간 헵시딘-25 융합 단백질은 (상기에서 개략한 바와 같이) 수동 IMAC 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 이어서, IMAC 칼럼으로부터의 관류를 4.0 mL/분의 유속으로 C-18 역상 칼럼 상에 로딩하였다. 흡광도가 기준선으로 되돌아 갈 때까지 물 중의 0.1％ TFA를 사용하여 칼럼을 세척하고, 결합된 폴리펩티드는 0.1％ TFA에 의한 20％ → 40％의 ACN의 선형 구배로 0.5％/분의 속도로 칼럼으로부터 용리시켰다. 인간 헵시딘-25 폴리펩티드를 함유하는 분획을 풀링하고, N-말단 아미노산 서열분석법 및 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광분석법 (MALDI-MS)에 의해 분석하였다.

래트, 마우스, 및 시노몰구스 원숭이 헵시딘-25, 및 헵시딘-22 및 헵시딘-20을 비롯한 인간 헵시딘-25의 다양한 N-말단이 절단된 형태를 코딩하는 폴리펩티드도 또한, 본질적으로 인간 헵시딘-25에 대해 기재한 것과 같이 제조하였다.

실시예 2: N-말단 헵시딘-25 항체의 생산

마우스를 OVA 펩티드 (아미노산 323 내지 336) 서열에 대한 5개의 아미노산 펩티드 링커 (즉, GPGPG)와 접합된 N-말단 헵시딘 펩티드 (서열 1의 아미노산 1 내지 7), 즉 전장 면역원 DTHFPICGPGPGISQAVHAAHAEINE (서열 87)로 면역화하고, 27일 째에 상기 마우스로부터의 비장을 채취하였다. B-세포를 Ag⁺ 및 IgG⁺ 기억 및 배아 중심 세포에 대해 웰 당 1 세포로 분류하고, EL4B 세포와 2 주 동안 공동-배양하였다. 이어서, IgG를 함유하는 생성된 상청액을 1.4 배 희석하고, 다음과 같이 3 가지의 ELISA 포맷으로 스크리닝하였다: 1) 뉴트라비딘(NEUTRAVIDIN)™ 결합 단백질, 디글리코실화되고 등전적으로 중성인 아비딘 형태 (피어스 바이오테크놀로지 (Pierce Biotechnology), 일리노이주 록빌 소재)에 의해 카르보네이트 완충액 중의 2 ㎍/mL로 밤새 코팅된 96 웰 플레이트. 비특이적 결합 부위는 카세인으로 1 시간 동안 차단시켰다. 이어서, 플레이트를 0.05％ 트윈-20을 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 100 nM의 비오티닐화된 헵시딘을 플레이트 상에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기한 바와 같이 세척하였다. 이어서, 배양물로부터의 IgG 상청액을 1 시간 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 세척하였다. 헵시딘-25 항체의 특이적 결합을 0.5 ㎍/mL 염소 항-마우스 IgG Fcγ-알칼리성 포스파타제로 검출하였다. 알칼리성 포스파타제 활성은 적절한 양의 PMP/AMP 기질 (0.5 M 트리스, pH 10.2, 2％ 2-아미노-2-메틸-1-프로판올 (AMP), 0.1％ NaN₃ 중의 6 mg/ml 페놀프탈레인 모노포스페이트 (PMP))을 첨가하여 측정하였고, 560 nm에서 흡광도를 측정하였다; 2) 96-웰 플레이트를 염소 항-마우스 카파 IgG로 카르보네이트 완충액 중의 2 ㎍/mL로 밤새 코팅하였다. 이어서, 비특이적 결합 부위를 카세인으로 1 시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 0.05％ 트윈-20을 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 배양물로부터의 IgG 상청액을 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 비오티닐화된 헵시딘-25 (100 nM)를 플레이트 상에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 상기한 바와 같이 세척하였다. 이어서, 포획된 항체에 대한 헵시딘-25의 특이적 결합을 1 ㎍/ml 뉴트라비딘-AP™, 뉴트라비딘™-알칼리성 포스파타제 접합체 (피어스 바이오테크놀로지, 일리노이주 록포드 소재)를 첨가하고, PMP/AMP 기질을 첨가하여 알칼리성 포스파타제 활성을 검출하고, 560 nm에서 흡광도를 측정하는 것에 의해 검출하였고; 3) 96-웰 플레이트를 물 중의 100 nM 헵시딘-25로 밤새 37℃에서 코팅하였다. 이어서, 비특이적 결합 부위를 카세인으로 1 시간 동안 차단시키고, 플레이트를 0.05％ 트윈-20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 배양물로부터의 IgG 상청액을 1 시간 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 다시 상기한 바와 같이 세척하였다. N-말단 헵시딘-25 항체의 특이적 결합을 0.5 ㎍/mL 염소 항-마우스 IgG Fcγ-알칼리성 포스파타제로 검출하였다. 알칼리성 포스파타제 활성은 PMP/AMP 기질을 이용하여 측정하였고, 흡광도의 양은 560 nm에서 측정하였다.

이어서, 헵시딘-25의 N-말단에 대해 특이적인 마우스 항체, 예컨대 3A9, 4C11 및 5E8를 발현하는 B 세포를 사용하여 RNA를 단리하고, 가변 영역을 RT-PCR에 의해 증폭시킨 다음, 시판하는 마우스 IgG1 벡터로 또는 각각 중쇄 및 경쇄로 클로닝하였다. 일시적으로 발현된 마우스 항체를 SPR을 사용하여 N-말단 헵시딘-25 특이적 항체로서 확인하였다.

실시예 3: SPR을 이용한 항-헵시딘 Fab 및 Mab의 친화도 결합 측정

SPR 바이오센서, 예컨대 비아코어® T100을 사용하여 항체, 예컨대 본원에서 개시하는 항체의 결합 역학 및 친화도를 측정할 수 있다. 비아코어® 시스템은 덱스트란 바이오센서 매트릭스 내에 존재하는 상호작용 분자의 단백질 농도에 있어서의 변경을 검출하는 SPR의 광학적 성질을 이용한다. 언급하는 것을 제외하면, 모든 시약과 물질은 비아코어® AB (스웨덴 웁살라 소재)로부터 구입하였다. 모든 측정은 25℃에서 수행하였다. 샘플을 HBS-EP 완충액 (150 mM 염화나트륨, 3 mM EDTA, 0.05％ (w/v) 계면활성제 P-20, 및 10 mM HEPES (pH 7.4))에 용해시켰다. 인간 카파를 이용하여 Fab를 포획하기 위해, 아민 커플링 키트를 사용하여 5000 내지 10000 반응 유니트 (Rus) 수준으로 CM5 센서 칩의 유동 셀 1 내지 4 상에 염소-항-인간 카파를 고정시켰다. 마우스 IgG1을 이용하여 Mab를 포획하기 위해, 아민 커플링 키트를 사용하여 5000 내지 10000 Rus 수준으로 CM5 센서 칩의 유동 셀 1 내지 4 상에 염소-항-마우스 Fc 감마를 고정시켰다. 인간 IgG4를 이용하여 항체를 포획하기 위해, 아민 커플링 키트를 사용하여 400-700 Rus 수준으로 CM4 센서 칩의 유동 셀 1 내지 4 상에 단백질 A를 고정시켰다. 다중 분석 사이클을 사용하여 이. 콜라이 주변 세포질로부터 제조된 Fab 및 포유동물 세포 배양물로부터 제조된 Mab를 평가하였다. 각 사이클은 다음과 같은 단계로 이루어졌다: 포획량이 200 내지 1000 Rus가 되도록 Fab 또는 Mab를 약 10 ㎕/분으로 0.3 내지 2 분간 주입하고, 상기 실시예 1에서 기재한 바와 같이 수득한 인간 헵시딘-25를 다양한 농도 (600 nM 내지 0.1 nM)로 50 ㎕/분으로 2분간 주입한 후 2 내지 10분 동안 해리시키고, 30 ㎕의 10 mM 글리신 히드로클로라이드 (pH 1.5)를 사용하여 재생시켰다. 25℃에서 측정치를 수득하고, 비아이벨루에이션(BIAevaluation) 소프트웨어의 "질량 이동에 따른 1:1(1:1 with mass transfer)" 결합 모델을 사용하여 각 사이클 당 결합 및 해리 속도를 평가하였다.

마우스 모노클로날 항체 3A9, 4C11, 5E8, OB3, OH4, OB1, 및 OE1은 약 36 nM 내지 약 1 nM의 친화도 (K_D)로 인간 헵시딘-25에 결합하는 것으로 나타났다. 마우스 모노클로날 항체 OH4는 인간 헵시딘-25에 약 1.2 nM의 K_D로 결합하지만, 인간 헵시딘-20 또는 인간 헵시딘-22에는 검출가능한 정도로 결합하지 않았다. 마우스 모노클로날 항체 5E8은 인간 헵시딘-25에는 결합하지만 마우스 또는 래트 헵시딘-25에는 검출가능한 정도로 결합하지 않았다. 마우스 모노클로날 항체 4C11은 인간, 마우스, 및 래트 헵시딘-25에 결합하였고, 훨씬 낮은 정도로 인간 헵시딘-22 (약 209 nM)에도 결합하였지만, 인간 헵시딘-20에는 결합하지 않았다.

실시예 4: 인간 헵시딘-25에 동시에 결합하는 Mab 쌍의 확인

SPR 분석에 의해 인간 헵시딘-25에 높은 친화도로 결합하는 것이 증명된, 인간 헵시딘-25의 아미노산 1 내지 7에 대한 모노클로날 항체에 대해, 인간 헵시딘-25에 Mab 3.23과 동시에 결합하는 그의 능력을 시험하였다.

간략하게, 비아코어® T100 상에서, 염소 항-마우스 IgG1 Fc 폴리클로날 항체를 5000 내지 15000 반응 유니트 (Ru)로 CM5 칩의 유동 셀 1 내지 4에 고정시켰다. Mab 5E8이 유동 셀 2에 포획되었고, Mab 4C11이 유동 셀 3에 포획되었으며, Mab 3A9가 유동 셀 4에 포획되었다. 유동 셀 1은 참고 유동 셀로서 사용되었다. 이어서, 모든 유동 셀에 인간 헵시딘-25를 주입하였다. Mab 5E8, 4C11, 및 3A9가 고정된 유동 셀은 모두 Rus의 증가를 나타내었고, 이는 이들 Mab가 인간 헵시딘-25에 결합되었음을 나타낸다. 다음으로, 모든 유동 셀에 Mab 3.23을 주입하였다. 오직 Mab 5E8이 고정된 유동 셀 2 만이 Mab 5E8 및 3.23에 의한 인간 헵시딘-25의 동시 결합을 나타내었다.

추가로, Mab Hu22, 3.23, 3.12 및 음성 대조군 인간 IgG4 항체를 1000 내지 4000 Rus로 센서 칩_CM4 칩 (비아코어)의 분리된 유동 셀에 고정시켰다. 이어서, 유동 셀에 인간 헵시딘-25를 주입하였다. 다음으로, 유동 셀에 Mab 5E8을 주입하였다. Mab Hu22, 3.23, 및 3.12가 고정된 유동 셀은 인간 헵시딘-25의 결합을 나타내었고, 이어서 Mab 5E8의 동시 결합을 나타내었다. 음성 대조군 인간 IgG4가 고정된 유동 셀은 인간 헵시딘-25에 대해서도, Mab 5E8에 대해서도 결합을 나타내지 않았다. 또한, Mab 5E8은 인간 및 마우스 헵시딘-25의 아미노산 1 내지 7로 이루어진 펩티드에 접합된 KLH에 대한 토끼 폴리클로날 항혈청 (알파 디아그노스틱 인터내셔널(Alpha Diagnostic International), 텍사스주 샌 안토니오 소재; cat. #Hepc13-S) 또는 그의 IgG 정제된 제제 (알파 디아그노스틱 인터내셔널; cat.# Hepc13-A)와 동시에 인간 헵시딘-25에 결합하지 않았다.

실시예 5: 인간 헵시딘-25를 측정하기 위한 샌드위치 ELISA 검정

다중-웰 플레이트의 웰을 1 시간 동안 실온에서 Mab 3.23으로, 카르보네이트-비카르보네이트 코팅 완충액 (pH 9.40) (피어스 바이오테크놀로지, 일리노이주 록빌 소재) 중의 2 mg/L의 농도로 코팅하였다. 다음으로, 웰을 흡입해내고, TBST (10 mmol/L 트리스 (pH 7.4), 150 mmol/L NaCl (1 mL 트윈-20/L을 포함함)을 함유하는 트리스 완충된 염수)로 3회 세척하였다. 이어서, 웰을 TBS-카세인 차단 완충액 (캐톤 항미생물제(Kathon antimicrobial) (피어스 바이오테크놀로지; cat. # 37532)를 함유하는 150 mM NaCl, 25 mM 트리스, 1％ 카세인 (pH 7.4))으로 1 시간 동안 차단하였다. 다음으로, 100 ㎕의 헵시딘-25 표준 (50 mmol/L HEPES, pH 7.40, 150 mmol/L NaCl, 10 mL/L 트리톤® X-100 비-이온성 계면활성제 (유니온 칼비드 코퍼레이션(Union Carbide Corp.; 코네티컷주 댄버리 소재), 5 mmol/L EDTA, 및 5 mmol/L 에틸렌글리코-테트라아세트산 (EGTA)으로 이루어진 검정 완충액 중의 다양한 농도의 합성 인간 헵시딘-25)을 일련의 세트의 웰에 첨가하여 검량선을 생성하였다. 그 후, 혈청 샘플을 검정 완충액 중에서 1:20으로 희석하고, 그 각각의 웰에 첨가하고, ELISA 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 흡입해낸 후, 웰을 TBST로 3회 세척하고, 100 ㎕의 비오티닐화된 항-헵시딘-25 Mab 5E8의 1:1000 희석액을 1 mg/ml로 웰에 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 흡입해낸 후, 웰을 TBST로 3회 세척하고, 100 ㎕의 폴리-스트렙타비딘-HRP 용액 (피어스 바이오테크놀로지, 일리노이주 록빌 소재)을 웰에 첨가하고, 30 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 웰을 TBST로 3회 세척하였다. TBST를 마지막으로 흡입해낸 후, 100 ㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 발색 기질 (피어스 바이오테크놀로지, 일리노이주 록빌 소재)을 웰에 첨가하고, 30 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 동 부피의 2 N 인산으로 반응을 중지시키고, 450 nm에서 플레이트를 판독하였다.

40 명의 정상인 및 암 환자로부터의 헵시딘-25의 혈청 농도를 상기의 샌드위치 ELISA에 의해 5 내지 656 ㎍/L의 범위에서 측정하고, 표준 LC/MS 검정을 이용하여 측정한 헵시딘-25의 혈청 농도와 직접 연관시켰다 (r = 0.98, p < 0.0001) (문헌 [Murphy, et al., (2007)] 참조). 또한, 바이오레클라메이션, 인크.(Bioreclamation, Inc.; 뉴저지주 이스트 메도우 소재)로부터 구입한 건강한 기증자 (50 명의 남성 및 50 명의 여성; 연령 범위는 18세 내지 66세, 평균 37세)로부터의 100 개의 인간 혈청 샘플에 대해 헵시딘-25 농도가 1 미만 내지 79 ㎍/ml 범위인지를 측정하였다. 추가로, 샌드위치 ELISA로 적어도 1 ng/ml에 이르는 용량-의존적 방식으로 인간 헵시딘-25 통제 펩티드를 검출하였다. 한편, 인간 혈청 샘플 양성 대조군, 즉 이전에 LC/MS 검정에 의해 헵시딘-25를 함유하는 것으로 측정된 대조군 내의 인간 헵시딘-25 통제 펩티드 (최대 2 ng/ml) 또는 내인성 헵시딘-25는 Mab 5E8을 i) 인간 및 마우스 헵시딘-25의 아미노산 1 내지 7로 이루어진 펩티드에 접합된 KLH에 대한 토끼 폴리클로날 항혈청 (알파 디아그노스틱 인터내셔널, 텍사스주 샌 안토니오 소재; cat. #Hepc13-S) 또는 ii) 그의 IgG 정제된 제제 (알파 디아그노스틱 인터내셔널; cat.# Hepc13-A)로 치환시킨 경우의 동일한 검정에서는 검출되지 않았다. 또한, 헵시딘-25 표준 또는 인간 혈청 샘플 양성 대조군은 HEPC-13-S 항-혈청 또는 그의 IgG 정제된 제제를 i) 검정 플레이트의 분리된 벽에 코팅하거나 (즉, 포획 항체로서), ii) 비오틴-접합된 검출 항체로서 검정에 첨가하거나, 또는 iii) 비접합된 검출 항체 (즉, 항-토끼 IgG 2차 항체를 사용하여 그들의 결합이 후속 검정된 것)로서 검정에 첨가한 경우에는 검출되지 않았다.

인간 혈청 양성 대조군 샘플 내의 인간 헵시딘-25 통제 펩티드 및 내인성 헵시딘-25는 포획 항체로서 Mab 5E8을 이용하여 샌드위치 ELISA를 수행한 경우에는 검출되지 않았고, 13-아미노산 성숙한 인간 헵시딘 C-말단 펩티드인, 접합된 KLH에 대한 시판하는 토끼 폴리클로날 IgG (알파 디아그노스틱 인터내셔널, 텍사스주 샌 안토니오 소재; cat.# HEPC12-A)와는 쌍을 이루었다.

실시예 6: MALDI-TOF를 이용한 항-헵시딘 항체의 선택성 측정

바이오마커에 대한 통상의 임상적 진단은 주로 예를 들어 ELISA와 같은 면역학적인 정량 기술을 기초로 한다. 이러한 방법은 종종 소형 항원이나 항원 이소형에는 적용될 수 없다 (문헌 [Sparbier, K., International Meeting of the Association of Biomolecular Resource Facilities, Salt Lake City, UT, Poster V28-S, (2008)]; 및 [Gutierrez, J.A., et al., (2005)]). Mab 또는 Fab는 샘플 환원 이후에 수행되는 항체-결합된 헵시딘 폴리펩티드에 대한 MALDI-TOF 질량 분광분석법을 통해 인간 혈청으로부터 내인성 헵시딘-25를 그의 전구체 또는 절단된 형태보다 선택적으로 면역침강시키는 능력에 대해 평가될 수 있다.

항-인간 헵시딘 Mab 또는 Fab를 카르보네이트-비카르보네이트 (pH 9.4) 완충액 중의 96-웰 표준 ELISA 플레이트의 분리된 벽에 1 시간 동안 실온에서 2 mg/L의 농도로 코팅하였다. 이어서, 웰을 흡입해내고, TBST로 3회 세척하였다. 공지된 양의 헵시딘-25 (검정 완충액 중에서 희석된 것)를 함유하는 인간 혈청 샘플을 100 ㎕/웰로 1 시간 동안 실온에서 첨가하였다. 웰을 흡입해내고, TBST로 3회 세척하였다. 포획된 헵시딘 폴리펩티드는 0.1％ 포름산을 40 ㎕/웰로 첨가하여 실온에서 5분 동안 용리시켰다. 용리된 샘플을 수집하고, 단백질 또는 펩티드의 정제 및 펨토몰 내지 피코몰, 이상적으로는 25,000 MW 내지 100,000 MW 범위로의 농축을 위한 크로마토그래피 매질층을 갖는 10 ㎕ 피펫 팁인 C4 집팁(ZipTip)™ (밀리포어(Millipore), 메사추세츠주 빌레리카 소재)으로 농축시켰다. ㎕ 샘플의 1/2을 MALDI 표적 상에 스포팅하고, 동일한 부피의 매트릭스 용액 (50％ 아세토니트릴, 알파-시안-4-히드록시신남산으로 포화된 0.1％ TFA)을 샘플에 첨가하였다. 샘플을 건조시키고, 선형 모드로 작동하는 4700 TOF-TOF 질량 분광분석기 (어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))로 분석하였다.

본질적으로 바로 위에서 기재한 바와 같이 MALDI-TOF 분광분석법을 이용하여 수행한 실험은 Mab 3.23이 헵시딘-25에 결합하고, 훨씬 낮은 정도로 헵시딘-20에 결합함을 보여주었다 (도 1 및 2). Mab 3.23은 시험 대상인 혈청 샘플이 인간 헵시딘의 헵시딘-22 (MW 2436 Da), 헵시딘-24 (MW 2674 Da), 또는 프로-헵시딘 (MW 6929 Da) 형태를 예상되는 양으로 역시 함유하고 있는 것으로 추정되는 경우에도,이러한 형태와는 검출가능한 수준으로 결합하는 것으로 보이지 않았다.

인간 혈청 내의 어떤 헵시딘 종이 Mab 5E8에 의해 결합되는지를 판단하기 위해 MALDI-TOF 분광분석법을 이용하여 유사한 실험을 수행하였다. 이러한 실험에서 Mab 5E8은 인간 혈청 내에서 헵시딘-25와만 결합하는 것이 확인되었다 (도 3 및 4). 중요한 것은, 인간 헵시딘의 헵시딘-20, 헵시딘-22, 프로-헵시딘, 또는 그 밖의 헵시딘 종이 혈청 샘플 내에 예상대로 존재하는 것으로 추정되는 경우에도, 어떤 종도 Mab 5E8과 결합하지 않는다는 것이다.

따라서, Mab 5E8, 또는 그로부터 유래되거나 그와 관련된 항체, 예컨대 이것으로 한정되는 것은 아니지만 Mab OH4를 이용한 면역검정은, 인간 혈청 내의 활성이 있고 생리학적으로 관련이 있는 헵시딘 형태인 인간 헵시딘-25에 대해 매우 특이적이며 선택적이다. Mab 5E8, 또는 그로부터 유래되거나 그와 관련된 항체, 예컨대 이것으로 한정되는 것은 아니지만 Mab OH4, 및 Mab 3.23, Mab 3.12, 또는 그로부터 유래되거나 그와 관련된 항체를 이용하는 것과 조합하여, 인간 헵시딘-25에 대한 면역검정에서 특이성 및/또는 선택성을 더욱 개선하는 것이 기대된다.

실시예 7: (항체를 직접 표지하지 않고) 인간 헵시딘-25를 측정하기 위한 샌드위치 ELISA 검정

i) 표지된 접합 항체를 비표지된 OH4로 치환하고 ii) OH4의 결합을 염소 항-마우스 항체에 접합된 호스래디쉬 퍼옥시다제를 사용하여 간접적으로 검출하는 것을 제외하고, 실시예 5에서와 같이 샌드위치 ELISA를 수행하였다.

상기한 바와 같이 샌드위치 ELISA에서 Mab 3.23 및 비표지된 Mab OH4를 사용하여, 인간 혈청 내에서 인간 헵시딘-25를 약 0.2 ng/mL의 민감도로 선택적으로 검출하였다.

실시예 8: 인간 헵시딘-25를 측정하기 위한 메조 스케일 디스커버리 샌드위치 면역검정

상기한 시약을 사용하여 인간 헵시딘-25 메조 스케일 디스커버리 (메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), 매릴랜드주 게이더스버그 소재) (MSD) 면역검정을 구축하였다. 간략하게, 1 mg의 Mab OH4를 50％ 글리콜 중에 희석된 시판하는 키트 (피어스 바이오테크놀로지, 일리노이주 록빌 소재)를 이용하여 비오티닐화하고, 필요할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 스트렙타비딘-코팅되고 차단된 ELISA 플레이트의 웰을 2 mg/L의 농도의 비오티닐화된 Mab OH4와 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후에, 웰을 흡입해내고, TBST (10 mmol/L 트리스 (pH 7.40), 150 mmol/L NaCl (1 mL 트윈 20/L을 포함함)을 함유하는 트리스 완충된 염수)로 3회 세척하였다. 이어서, 100 ㎕의 헵시딘 표준 (50 mmol/L HEPES, pH 7.40, 150 mmol/L NaCl, 10 mL/L 트리톤 X-100, 5 mmol/L EDTA, 및 5 mmol/L EGTA로 이루어진 검정 완충액 중의 다양한 농도의 합성된 헵시딘-25 단백질)을 웰에 첨가하여 검량선을 생성하였다. 동시에, 혈청 샘플을 검정 완충액 중에서 1:20으로 희석하고, 그 각각의 웰에 첨가하고, ELISA 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 흡입해낸 후, 웰을 TBST로 3회 세척하고, 100 ㎕의 루테늄-표지된 Mab 3.23의 1:1000 희석액을 1 mg/ml로 웰에 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 흡입해낸 후, 웰을 TBST로 3회 세척하고, 웰을 가로질러 전압이 통과하는 MSD 판독기를 이용하여 ELISA 플레이트를 발광시키고, 각 웰로부터의 루테늄 전자화학발광을 기록하였다. ELISA에 대해 검량선을 맞추는데 MSD 소프트웨어 및 시그마플롯 버젼 8.0을 사용하였다.

MSD 샌드위치 면역검정에서 항체의 최적의 쌍형성은 포획 항체로서 Mab OH4와 접합 항체로서 Mab 3.23의 쌍형성인 것으로 판단되었다. 합성된 헵시딘-25 단백질을 10 ㎍/L의 농도로 제조하고, 연속 희석하여 표준 곡선을 만들었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, ELISA는 허용가능한 역학 범위, 배경, 및 민감도를 갖는 것으로 나타났다. 0 눈금측정기로부터의 3개의 표준 편차 평가를 기초로, 면역검정의 민감도는 0.01 ㎍/L 보다 더 나은 것으로 판단되었고, 이는 면역검정이 이전에 LC/MS 유형의 검정 (문헌 [Murphy, et al., (2007)])으로 측정한 인간 혈청 헵시딘-25의 추정치에 기초하여 인간 혈청 헵시딘-25 수준을 측정한 것에 비해 보다 충분한 민감도를 가질 것임을 나타낸다. 또한, 도 2의 그래프의 데이터는 MSD 샌드위치 면역검정이 헵시딘-20 또는 헵시딘-22는 검출하지 않으므로, 헵시딘-25에 대해 선택적임을 보여준다. 또한, 재조합 표준 및 실제 인간 혈청 샘플에 대한 면역검정 희석 곡선은 평행인 것으로 측정되었고, 면역검정은 인간 혈청 샘플에 대한 우수한 희석상 선형성을 가짐이 증명되었다 (데이터는 나타내지 않음).

MSD 샌드위치 면역검정 방법의 선택성 및 민감도를 상기한 금본위제 LC/MS 검정 (문헌 [Murphy, et al., (2007)])과 비교하였다. 보다 구체적으로, 정상인 대상체와 암 환자가 섞인 집합으로부터의 52개의 인간 혈청 샘플을 MSD 샌드위치 면역검정 뿐만 아니라 상기한 헵시딘-25에 대해 특이성을 나타내는 LC/MS 검정 (문헌 [Murphy, et al., (2007)]) 둘 다를 이용하여 분석하였다. 이러한 비교의 결과는 MSD 면역검정을 이용하여 측정한 헵시딘-25 값이 LC/MS 헵시딘-25 검정 값과 매우 높은 관련성이 있음을 나타내었고 (r = 0.98, p < 0.00001), 이는 MSD 샌드위치 면역검정이 인간 혈청 샘플 내의 헵시딘-25를 특이적이고 선택적으로 측정함을 확인시켜준다 (데이터는 나타내지 않음).

MSD 샌드위치 면역검정의 몇몇 파라미터를 인간 혈청 샘플을 이용하여 평가하였다. 보다 구체적으로, 4개의 다른 혈청 샘플을 시험하여 동결-해동 안정성을 평가하였다. 그 결과, MSD 샌드위치 면역검정이 5번의 동결-해동 사이클 이후에도 일관적으로 80 내지 120％의 헵시딘-25 회복률을 가져, 동결-해동 안정성을 보유하는 것으로 나타났다. 동결-해동 사이클에서의 개별적인 결과치는 다음과 같다: 샘플 A - 각각 0.16, 0.16, 0.17, 0.17, 0.17, 및 0.17 ㎍/L; 샘플 B - 각각 4.5, 4.4, 4.6, 4.6, 4.6, 및 4.4 ㎍/L; 샘플 C - 각각 8.9, 9.6, 9.7, 9.7, 9.9, 및 9.6 ㎍/L; 및 샘플 D - 각각 15.1, 15.1, 15.4, 15.7, 15.4 및 15.4 ㎍/L. MSD 샌드위치 면역검정의 정확성은 내인성 헵시딘-25를 0.16, 4.5, 및 15.1 ㎍/L 함유하는 인간 혈청 샘플을 이용하여 평가하였다. 검정-내 (n=20) 정확성 결과 (CV)는 상기 수준에서 각각 3.4％, 4.5％ 및 3.5％였고, 이는 시험된 헵시딘-25의 모든 농도에서 허용가능한 정확성이다.

인간 혈청에 첨가된 합성 헵시딘-25 단백질의 회복률을 평가하기 위해, 합성 헵시딘-25 단백질을 4 개의 다른 인간 혈청 샘플 (각각 내인성 헵시딘-25를 매우 낮은 농도로 함유함)에 각각 250, 25, 2.5, 및 0.25 ㎍/L의 농도로 첨가하였다. 이들 샘플을 MSD 샌드위치 면역검정을 이용하여 분석하였다. 평균 (SD) 결과는 각각 287 (6) ㎍/L, 24.2 (0.2) ㎍/L, 2.0 (0.1) ㎍/L, 및 0.23 (0.01) ㎍/L이었고, 이는 시험된 헵시딘-25의 모든 수준에서 80 내지 120％의 회복률을 나타낸다.

MSD 샌드위치 면역검정의 정상 범위는 정상적인 건강한 자원봉사자 (50명의 남성 및 50명의 여성)로부터의 100개의 혈청 샘플을 구동하여 확립하였다. 이들 샘플에서의 헵시딘-25의 값은 < 0.02 ㎍/L 내지 25 ㎍/L이었고, 평균값은 3.0 ± 0.5 ㎍/L이었으며, 이는 이전에 LC/MS 검정을 사용하여 정상적인 인간에서 보고된 헵시딘-25의 수준과 일치하였다 (문헌 [Murphy, et al., Blood, 110:1048-54 (2007)] 참조).

흥미롭게도, 정상적인 인간 대상체에서의 헵시딘-25 수준은 남성 (4.2 ± 0.8 ㎍/L)에 비해 여성 (1.8 ± 0.4 ㎍/L)에서 상당히 (p < 0.01) 낮은 것으로 나타났다. 이러한 정상적인 대상체에서의 헵시딘-25 수준을 또한 혈청 페리틴 농도와 비교하였고, 혈청 페리틴 수준과 직접적인 관련성을 확인하였다 (r = 0.71, p < 0.001) (데이터는 나타내지 않음).

마지막으로, 암 환자 (n=34)의 혈청에서의 헵시딘-25 수준을 정상적이고 건강한 자원봉사자 (n=100)의 혈청에서의 헵시딘-25 수준과 비교하였다 (각각 MSD 샌드위치 면역검정에 의해 측정함). 이러한 비교의 결과, 헵시딘-25 수준이 정상적인 대조군 (3.0 ± 0.5 ㎍/L)에 비해 암 환자 (70.9 ± 10.4 ㎍/L)에서 상당히 (p < 0.001) 상승되었음이 증명되었다 (데이터는 나타내지 않음). 흥미롭게도, 혈액상 악성종양 (83.3 ± 11.9 ㎍/L) 및 비-혈액상 악성종양 (58.4 ± 17 ㎍/L) 둘 다의 환자 집단이 각각 정상적인 대조군에 비해 상당히 증가된 헵시딘-25 수준 (둘 다에서 p < 0.001)을 나타내었고, 이는 상승된 헵시딘-25 수준이 암-관련 빈혈에서 중요한 역할을 할 수 있음을 제시한다 (데이터는 나타내지 않음).

헵시딘-25에 대해 특이적이지 않고, 프로-헵시딘 및 그 밖의 관련없는 헵시딘 종과 교차-반응할 수 있는 현존하는 ELISA 방법에 비해, 본원에서 기재하는 MSD 샌드위치 면역검정은 인간 혈청 내의 헵시딘-25 수준을 특이적이고 선택적으로 측정하며, 헵시딘-25에 대한 상기 기재의 금본위제 LC/MS 검정법과 매우 관련성이 있다. 인간 혈청 헵시딘 수준을 측정하는데 있어서 LC/MS 유형의 방법에 비해 MSD 샌드위치 면역검정의 한 가지 장점은, MSD 샌드위치 면역검정이 통상적으로 LC/MS 유형의 검정을 수행하는데 요구되는 복잡한 장치나 고도로 전문화된 작동자의 능력없이도 대부분의 임상 실험실에서 시행될 수 있다는 것이다. 또한, MSD 샌드위치 면역검정은 LC/MS 검정에 비해 훨씬 많은 처리량에 대한 잠재력을 가진다. 따라서, MSD 샌드위치 면역검정은 인간 대상체에서 헵시딘-25 수준을 선택적으로 측정하기 위해 임상적으로 흔하게 사용될 수 있는 방법을 제공한다.

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> ANTI-HEPCIDIN-25 SELECTIVE ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> X18122 <150> 61/086557 <151> 2008-08-06 <150> PCT/US2009/052044 <151> 2009-07-29 <160> 90 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Thr His Phe Pro Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg 1 5 10 15 Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr 20 25 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 2 Asp Thr Asn Phe Pro Ile Cys Leu Phe Cys Cys Lys Cys Cys Lys Asn 1 5 10 15 Ser Ser Cys Gly Leu Cys Cys Ile Thr 20 25 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Asp Thr Asn Phe Pro Ile Cys Ile Phe Cys Cys Lys Cys Cys Asn Asn 1 5 10 15 Ser Gln Cys Gly Ile Cys Cys Lys Thr 20 25 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> macaca sp. <400> 4 Asp Thr His Phe Pro Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg 1 5 10 15 Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Arg Thr 20 25 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Asp Thr His Phe Pro Ile Cys 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is Tyr or Ser <400> 6 Ser Ala Ser Ser Ser Xaa Ser Xaa Met Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is Asn or His <400> 7 Leu Thr Ser Xaa Leu Ala Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is Asn, Gly, or Tyr <400> 8 Gln Gln Trp Ser Ser Xaa Pro Pro Thr 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Leu Thr Ser His Leu Ala Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Gln Gln Trp Ser Ser Gly Pro Pro Thr 1 5 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Met Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is Ser, Arg, or Pro <400> 17 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Xaa Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr 1 5 10 15 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is Ser or Pro <400> 18 Leu Val Ser Lys Leu Asp Xaa 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is Val, His, Ile or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is Thr or Val <400> 19 Xaa Gln Gly Ser His Phe Pro Trp Xaa 1 5 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr 1 5 10 15 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Val Gln Gly Ser His Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 His Gln Gly Ser His Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr 1 5 10 15 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Leu Val Ser Lys Leu Asp Pro 1 5 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Pro Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr 1 5 10 15 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Ile Gln Gly Ser His Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Phe Gln Gly Ser His Phe Pro Trp Val 1 5 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is Phe, Tyr or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is Tyr or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is Ile or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa at position 11 is Val or Ile <400> 29 Gly Xaa Ser Leu Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is Asp or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is Ala or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is Ser or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is Ala or Thr <400> 30 His Ile Trp Trp Asn Xaa Xaa Lys Xaa Tyr Asn Thr Xaa Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is Gly or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is Ser, Ala or Tyr <400> 31 Ile Xaa Tyr Tyr Gly Xaa Xaa Xaa Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Ile Gly Val Gly 1 5 10 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Ser Tyr Asn Thr Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Ile Gly Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Gly Tyr Ser Leu Ser Thr Pro Gly Ile Gly Val Gly 1 5 10 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 His Ile Trp Trp Asn Asp Ala Lys Ser Tyr Asn Thr Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 Ile Gly Tyr Tyr Gly Ser Thr Ala Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Gly Leu Ser Leu Ser Thr Pro Gly Ile Gly Val Gly 1 5 10 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 Gly Phe Ser Leu Asn Ser Tyr Gly Phe Gly Ile Gly 1 5 10 <210> 40 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 His Ile Trp Trp Asn Gly Asn Lys Tyr Tyr Asn Thr Thr Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 41 Ile His Tyr Tyr Gly Asn Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 10 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 43 Thr Ile Ile Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 44 Asp Gly Tyr Ile His 1 5 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 45 Ser Ala Ser Pro Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 46 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is Asp or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is Leu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is Leu or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is Thr or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is Ser or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is Tyr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa at position 52 is Asn or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa at position 59 is Ala or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa at position 76 is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa at position 93 is Asn, Tyr or Gly <400> 46 Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Xaa Ser Xaa Ser Xaa Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Xaa Leu Ala Ser Gly Val Pro Xaa Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Xaa Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Xaa Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is Glu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is Lys or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is Lys or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is Gln or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is Phe, Tyr or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa at position 32 is Tyr or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa at position 34 is Ile or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa at position 36 is Val or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa at position 43 is Ala or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa at position 51 is Ala or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa at position 57 is Asp or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> Xaa at position 58 is Asn or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> Xaa at position 60 is Ser or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa at position 64 is Ala or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa at position 87 is Val or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(89) <223> Xaa at position 89 is Thr or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(90) <223> Xaa at position 90 is His or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223> Xaa at position 97 is Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98)..(98) <223> Xaa at position 98 is Leu or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> Xaa at position 100 is Gly or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (104)..(104) <223> Xaa at position 104 is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> Xaa at position 105 is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> Xaa at position 106 is Ser, Ala or Tyr <400> 47 Xaa Val Xaa Leu Xaa Xaa Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Xaa Ser Leu Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Gly Xaa Gly Xaa Gly Trp Ile Arg Gln Pro Xaa Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Xaa His Ile Trp Trp Asn Xaa Xaa Lys Xaa Tyr Asn Thr Xaa 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Xaa Asp Xaa Xaa Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Xaa Xaa Ile Xaa Tyr Tyr Gly Xaa Xaa Xaa Gly Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 48 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 48 Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 49 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 49 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Ser Tyr Asn Thr Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Thr His Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Val Ile Gly Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 50 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 50 Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser His Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Gly Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 51 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 51 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Tyr Ser Leu Ser Thr Pro 20 25 30 Gly Ile Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Ala Lys Ser Tyr Asn Thr Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Thr His Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Val Ile Gly Tyr Tyr Gly Ser Thr Ala Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 52 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 52 Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Pro Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser His Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Gly Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 53 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 53 Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser His Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Gly Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 54 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 54 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Leu Ser Leu Ser Thr Pro 20 25 30 Gly Ile Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Ala Lys Ser Tyr Asn Thr Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Thr His Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Val Ile Gly Tyr Tyr Gly Ser Thr Ala Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 55 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 55 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 56 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 56 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Tyr 20 25 30 Gly Phe Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asn Gly Asn Lys Tyr Tyr Asn Thr Thr 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Leu Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Ile His Tyr Tyr Gly Asn Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 57 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa at position 32 is Ser, Arg or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa at position 61 is Ser or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa at position 94 is Val, His, Ile or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102)..(102) <223> Xaa at position 102 is Thr or Val <400> 57 Asp Ile Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Xaa 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Xaa Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Xaa Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Trp Xaa Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 58 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 58 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ile Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asp Asp Gly Tyr Ile His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ala <210> 59 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 59 Asp Ile Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 60 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 60 Asp Ile Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys His Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 61 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 61 Asp Ile Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Pro Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys His Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 62 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 Asp Ile Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Pro 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Pro Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Ile Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 63 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 63 Asp Ile Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Pro 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Pro Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 64 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is Asp or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is Leu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is Leu or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is Thr or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is Ser or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is Tyr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa at position 52 is Asn or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa at position 59 is Ala or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa at position 76 is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa at position 93 is Asn, Tyr or Gly <400> 64 Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Xaa Ser Xaa Ser Xaa Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Xaa Leu Ala Ser Gly Val Pro Xaa Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Xaa Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Xaa Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 65 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is Glu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is Lys or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is Lys or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is Gln or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is Phe, Tyr or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa at position 32 is Tyr or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa at position 34 is Ile or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa at position 36 is Val or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa at position 43 is Ala or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa at position 51 is Ala or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa at position 57 is Asp or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> Xaa at position 58 is Asn or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> Xaa at position 60 is Ser or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa at position 64 is Ala or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa at position 87 is Val or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(89) <223> Xaa at position 89 is Thr or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(90) <223> Xaa at position 90 is His or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223> Xaa at position 97 is Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98)..(98) <223> Xaa at position 98 is Leu or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> Xaa at position 100 is Gly or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (104)..(104) <223> Xaa at position 104 is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> Xaa at position 105 is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> Xaa at position 106 is Ser, Ala or Tyr <400> 65 Xaa Val Xaa Leu Xaa Xaa Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Xaa Ser Leu Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Gly Xaa Gly Xaa Gly Trp Ile Arg Gln Pro Xaa Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Xaa His Ile Trp Trp Asn Xaa Xaa Lys Xaa Tyr Asn Thr Xaa 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Xaa Asp Xaa Xaa Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Xaa Xaa Ile Xaa Tyr Tyr Gly Xaa Xaa Xaa Gly Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly 210 215 220 Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu 290 295 300 Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg 305 310 315 320 Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro 340 345 350 Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr 355 360 365 Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly 385 390 395 400 Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu 405 410 415 Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn 420 425 430 His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 66 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 66 Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 67 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 67 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Ser Tyr Asn Thr Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Thr His Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Val Ile Gly Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro 115 120 125 Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met 130 135 140 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His 195 200 205 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys 210 215 220 Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe 225 230 235 240 Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro 245 250 255 Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 275 280 285 Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu 290 295 300 Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 320 Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro 340 345 350 Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile 355 360 365 Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp 385 390 395 400 Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp 405 410 415 Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His 420 425 430 Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 68 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 68 Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser His Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Gly Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 69 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 69 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Tyr Ser Leu Ser Thr Pro 20 25 30 Gly Ile Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Ala Lys Ser Tyr Asn Thr Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Thr His Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Val Ile Gly Tyr Tyr Gly Ser Thr Ala Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro 115 120 125 Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met 130 135 140 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His 195 200 205 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys 210 215 220 Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe 225 230 235 240 Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro 245 250 255 Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 275 280 285 Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu 290 295 300 Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 320 Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro 340 345 350 Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile 355 360 365 Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp 385 390 395 400 Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp 405 410 415 Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His 420 425 430 Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 70 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 70 Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Pro Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser His Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Gly Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 71 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 71 Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser His Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Gly Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 72 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 72 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Leu Ser Leu Ser Thr Pro 20 25 30 Gly Ile Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Ala Lys Ser Tyr Asn Thr Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Thr His Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Val Ile Gly Tyr Tyr Gly Ser Thr Ala Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro 115 120 125 Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met 130 135 140 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His 195 200 205 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys 210 215 220 Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe 225 230 235 240 Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro 245 250 255 Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 275 280 285 Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu 290 295 300 Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 320 Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro 340 345 350 Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile 355 360 365 Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp 385 390 395 400 Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp 405 410 415 Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His 420 425 430 Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 73 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 73 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 74 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 74 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Tyr 20 25 30 Gly Phe Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Thr His Ile Trp Trp Asn Gly Asn Lys Tyr Tyr Asn Thr Thr 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Leu Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Ile His Tyr Tyr Gly Asn Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro 115 120 125 Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met 130 135 140 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His 195 200 205 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys 210 215 220 Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe 225 230 235 240 Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro 245 250 255 Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 275 280 285 Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu 290 295 300 Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 320 Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro 340 345 350 Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile 355 360 365 Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp 385 390 395 400 Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp 405 410 415 Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His 420 425 430 Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 75 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa at position 32 is Ser, Arg or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa at position 61 is Ser or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa at position 94 is Val, His, Ile or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102)..(102) <223> Xaa at position 102 is Thr or Val <400> 75 Asp Ile Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Xaa 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Xaa Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Xaa Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Trp Xaa Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 76 <211> 438 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 76 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ile Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asp Asp Gly Tyr Ile His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly 115 120 125 Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu 145 150 155 160 Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr 165 170 175 Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu 180 185 190 Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr 210 215 220 Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 225 230 235 240 Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp 245 250 255 Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp 260 265 270 Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 275 280 285 Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp 290 295 300 Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro 305 310 315 320 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala 325 330 335 Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp 340 345 350 Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile 355 360 365 Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn 370 375 380 Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys 385 390 395 400 Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys 405 410 415 Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu 420 425 430 Ser His Ser Pro Gly Lys 435 <210> 77 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 77 Asp Ile Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 78 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 78 Asp Ile Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys His Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 79 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 79 Asp Ile Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Pro Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys His Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 80 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 80 Asp Ile Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Pro 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Pro Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Ile Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 81 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 81 Asp Ile Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Pro 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Pro Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 82 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 82 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Thr 20 25 30 Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Pro Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro 85 90 95 Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 83 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 83 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Val Thr Asn Tyr Val Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 84 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 84 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Thr 20 25 30 Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Thr Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro 85 90 95 Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 85 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 85 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Val Thr Asn Tyr Leu Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 86 Asp Thr Asn Phe Pro Ile Cys 1 5 <210> 87 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 87 Asp Thr His Phe Pro Ile Cys Gly Pro Gly Pro Gly Ile Ser Gln Ala 1 5 10 15 Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu 20 25 <210> 88 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met 1 5 10 15 Cys Cys Lys Thr 20 <210> 89 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Phe Pro Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys 1 5 10 15 Gly Met Cys Cys Lys Thr 20 <210> 90 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Gly Ser Val Phe Pro Gln Gln Thr Gly Gln Leu Ala Glu Leu Gln Pro 1 5 10 15 Gln Asp Arg Ala Gly Ala Arg Ala Ser Trp Met Pro Met Phe Gln Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Asp Thr His Phe Pro Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly 35 40 45 Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr 50 55 60

Claims

인간 헵시딘-25에 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 6개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 모노클로날 항체:
(i) 각각 서열 20, 21, 22, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3;
(ii) 각각 서열 20, 21, 23, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3;
(iii) 각각 서열 24, 25, 23, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3;
(iv) 각각 서열 26, 25, 27, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; 및
(v) 각각 서열 26, 25, 28, 42, 43 및 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3.
제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역 (LCVR) 폴리펩티드 및 중쇄 가변 영역 (HCVR) 폴리펩티드를 포함하며:
(vi) LCVR 및 HCVR 폴리펩티드가 각각 서열 59 및 58에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나;
(vii) LCVR 및 HCVR 폴리펩티드가 각각 서열 60 및 58에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나;
(viii) LCVR 및 HCVR 폴리펩티드가 각각 서열 61 및 58에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나;
(ix) LCVR 및 HCVR 폴리펩티드가 각각 서열 62 및 58에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; 또는
(x) LCVR 및 HCVR 폴리펩티드가 각각 서열 63 및 58에 나타낸 아미노산 서열을 갖는
항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, (vi) 각각 서열 76 및 77에 나타낸 아미노산 서열; (vii) 각각 서열 76 및 78에 나타낸 아미노산 서열; (viii) 각각 서열 76 및 79에 나타낸 아미노산 서열; (ix) 각각 서열 76 및 80에 나타낸 아미노산 서열; 또는 (x) 각각 서열 76 및 81에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체.
제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, 빈혈의 치료 또는 예방을 위한 제약 조성물.
제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구용적률을 증가시키기 위한 제약 조성물.
(i) 조직 또는 생물학적 체액 샘플을 제1항 또는 제2항의 항체와 접촉시키는 단계; 및
(ii) 상기 샘플에서 항체에 결합된 헵시딘-25의 양을 정량적으로, 반-정량적으로 또는 정성적으로 검출하는 단계
를 포함하는, 조직 또는 생물학적 체액 샘플에서 헵시딘-25의 양을 측정하는 방법.
(i) 고체 지지체를 (a) 제1항 또는 제2항에 따른 1차 항체, 또는 (b) 서열 1의 아미노산 5 내지 25 내에 함유된 에피토프에 결합하는 1차 항체로 코팅하는 단계;
(ii) 샘플을 상기 항체 코팅된 고체 지지체에 적용하는 단계;
(iii) 결합되지 않은 샘플을 제거하는 단계;
(iv) 단계 (i)에서의 1차 항체가 (a)인 경우, 서열 1의 아미노산 5 내지 25 내에 함유된 에피토프에 결합하는 2차 항체를 고체 지지체에 적용하거나, 또는 단계 (i)에서의 1차 항체가 (b)인 경우, 제1항 또는 제2항에 따른 2차 항체를 고체 지지체에 적용하는 단계;
(v) 결합되지 않은 2차 항체를 제거하는 단계; 및
(vi) 상기 샘플에서 2차 항체에 결합된 헵시딘-25의 양을 정량적으로, 반-정량적으로 또는 정성적으로 검출하는 단계
를 포함하는, 조직 또는 생물학적 체액 샘플에서 헵시딘-25 단백질의 양을 정량하는 방법.
제7항에 있어서, 서열 1의 아미노산 5 내지 25 내에 함유된 에피토프에 결합하는 1차 항체 또는 2차 항체가 각각 서열 82 및 83에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액 (CSF), 양수, 타액, 땀, 복수액, 림프액, 낭종액, 모유, 상처액, 또는 그로부터 유래된 것이고, 상기 샘플을 효소 면역검정 (EIA), ELISA, 샌드위치 ELISA 검정, 방사성면역검정, 침전 반응 또는 형광 면역검정에서 상기 항체와 접촉시키는 방법.
제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, 헵시딘-25를 검출 또는 정량하기 위한 키트.
(i) 조직 또는 생물학적 체액 샘플을, 각각 서열 76 및 80에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체와 접촉시키는 단계; 및
(ii) 상기 샘플에서 항체에 결합된 헵시딘-25의 양을 정량적으로, 반-정량적으로 또는 정성적으로 검출하는 단계
를 포함하는, 조직 또는 생물학적 체액 샘플에서 헵시딘-25의 양을 측정하는 방법.
(i) 고체 지지체를 (a) 각각 서열 76 및 80에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 1차 항체, 또는 (b) 서열 1의 아미노산 5 내지 25 내에 함유된 에피토프에 결합하는 1차 항체로 코팅하는 단계;
(ii) 샘플을 상기 항체 코팅된 고체 지지체에 적용하는 단계;
(iii) 결합되지 않은 샘플을 제거하는 단계;
(iv) 단계 (i)에서의 1차 항체가 (a)인 경우, 서열 1의 아미노산 5 내지 25 내에 함유된 에피토프에 결합하는 2차 항체를 고체 지지체에 적용하거나, 또는 단계 (i)에서의 1차 항체가 (b)인 경우, 각각 서열 76 및 80에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 2차 항체를 고체 지지체에 적용하는 단계;
(v) 결합되지 않은 2차 항체를 제거하는 단계; 및
(vi) 상기 샘플에서 2차 항체에 결합된 헵시딘-25의 양을 정량적으로, 반-정량적으로 또는 정성적으로 검출하는 단계
를 포함하는, 조직 또는 생물학적 체액 샘플에서 헵시딘-25 단백질의 양을 정량하는 방법.
제12항에 있어서, 1차 항체 또는 2차 항체가 각각 서열 84 및 85에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 1차 항체 또는 2차 항체가 각각 서열 82 및 83에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 것인 방법.
각각 서열 76 및 80에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 포함하는, 헵시딘-25를 검출 또는 정량하기 위한 키트.
제7항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액 (CSF), 양수, 타액, 땀, 복수액, 림프액, 낭종액, 모유, 상처액, 또는 그로부터 유래된 것이고, 상기 샘플을 효소 면역검정 (EIA), ELISA, 샌드위치 ELISA 검정, 방사성면역검정, 침전 반응 또는 형광 면역검정에서 상기 항체와 접촉시키는 방법.
제8항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액 (CSF), 양수, 타액, 땀, 복수액, 림프액, 낭종액, 모유, 상처액, 또는 그로부터 유래된 것이고, 상기 샘플을 효소 면역검정 (EIA), ELISA, 샌드위치 ELISA 검정, 방사성면역검정, 침전 반응 또는 형광 면역검정에서 상기 항체와 접촉시키는 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제