CN1173737C - Hepcidin(海魄喜定)在制药中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种名为Hepcidin(海魄喜定)的富含胱氨酸的抗菌多肽在制药领域的新用途。从人尿中提纯的Hepcidin(海魄喜定)，经血流运输到十二指肠隐窝细胞，直接作用于正常吸铁能力β2M/HFE/TfR1复合物，促成隐窝细胞摄铁量增加，隐窝细胞内铁池增大，进而抑制肠吸收上皮细胞四种铁吸收蛋白表达下降，铁吸收量因此下降；当铁循环较低时，经载铁蛋白受体TFE2介导的肝细胞铁摄取将会减少，肝脏合成分泌的Hepcidin亦会减少，这将引起隐窝细胞铁池变小，肠吸收上皮相关蛋白表达增加，肠铁吸收量增加，使铁水平回复到正常。因而可将Hepcidin用作制备治疗铁代谢紊乱疾病的药物的静脉注射剂。
Description
技术领域
本发明涉及Hepcidin(海魄喜定)的用途，特别涉及其在制药领域中的用途。
背景技术
Hepcidin(海魄喜定)是一个富含半胱氨酸的抗菌多肽，其分子结构2000年，首先从人血液中分离纯化了这一多肽，称之为肝脏表达的抗菌多肽。2001年，从人尿中也分离到这一多肽，并将其命名为Hepcidin(海魄喜定)。人尿中分离出来的Hepcidin包含有20、22和25个氨基酸多肽等三种组成形式，分子量介于2-3kDa之间。正常pH值情况下，这些多肽带有+3电荷。20和25个氨基酸多肽是Hepcidin(海魄喜定)的主要存在形式。它们的C-末端都保留了半胱氨酸形成的富集区，区别仅在于氨基酸末端被切掉的氨基酸数目不同。Hepcidin(海魄喜定)含有8个半胱氨酸形成4个二硫键，CD光谱学特性研究证实，在磷酸缓冲液中，Hepcidin具有两个稳定的β折迭结构，这一结构与抗菌多肽的胱氨酸结(cystine knot)结构非常相似。人类Hepcidin(海魄喜定)在合成过程中，首先产生一个由84个氨基酸组成的早期多肽，然后被降解形成含有60个氨基酸组成的前体肽，最后从单一的前体肽生成具有生物活性的多肽分子。与以往在植物、昆虫类和软件动物发现的抗菌多肽一样，人类Hepcidin(海魄喜定)也具有广泛的抗菌、抗真菌、抗原生动物的作用。可用于制备抗菌、抗真菌、抗原生动物的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供Hepcidin(海魄喜定)的新用途，即在制药中的新应用。
实际上本发明涉及Hepcidin(海魄喜定)作为制备治疗铁代谢紊乱疾病药物的应用。
即涉及Hepcidin(海魄喜定)作为制备缓解或治疗铁过载类疾病药物的静脉注射剂。
还涉及Hepcidin(海魄喜定)的单克隆抗体作为制备治疗任何类型的缺铁性贫血药物的静脉注射剂。
铁是人体最丰富的必需微量元素之一，它广泛参与重要的生命代谢过程。铁代谢紊乱引起的疾患是人类最常见的疾病，影响着数以千万计的人口。铁缺乏可造成贫血、智障等多种疾病。而铁过量则可促发产生大量自由基，引起神经退行性变及许多与老年相关的疾病。因此，人体存在着严格的铁代谢调节机制，可以确保体内铁始终处于正常生理水平。这种机体铁稳态(iron homeostasis)的关键是依赖于小肠铁吸收和机体铁需要之间的平衡。当机体缺(或需要)铁时，小肠铁吸收会相应增加，而机体铁含量太高时，小肠则会减少铁吸收。很久以来，人们一直推测人类机体内存在调节铁稳态的类似激素样物质，这种物质可溶于血液，因此能在肝脏、小肠，网织红细胞和网状内皮RE系统之间传递有关铁调节的信号。研究显示，Hepcidin(海魄喜定)就是铁代谢研究者们长期一直寻找的调节铁稳态的重要激素。动物试验证明，Hepcidin(海魄喜定)缺乏会导致小鼠进行性组织铁积聚，而Hepcidin(海魄喜定)高表达的转基因鼠出现严重的铁缺乏，呈现严重的小细胞性贫血且生存时间大为缩短。此外，饮食铁含量增高或者肝铁增加均可导致肝脏Hepcidin(海魄喜定)表达增加。证实Hepcidin在机体铁代谢调节中具有重要作用。Hepcidin(海魄喜定)调节铁代谢的机制模式是，当任何原因引起循环铁增加时，肝细胞经TfR2(是一种区别于经典TfR的载铁蛋白受体)增加摄铁，导致肝细胞增加合成和分泌Hepcidin(海魄喜定)进入血液，Hepcidin(海魄喜定)经血流运输到十二指肠隐窝细胞直接作用于正常铁吸能力β2M/HFE/TfR1复合物，促成隐窝细胞摄铁量增加，隐窝细胞内铁池增大进而抑制肠吸收上皮细胞四种铁吸收蛋白表达下降，铁吸收量因此下降。当循环铁较低时，经TfR2介导的肝细胞铁摄取将会减少，肝脏合成分泌的Hepcidin(海魄喜定)将会减少。这将引起隐窝细胞铁池变小，肠吸收上皮相关蛋白表达增加，肠铁吸收量增加，使铁水平回复到正常。同时肝脏分泌的Hepcidin也可经血流到达网状内皮系统RE系统，调节RE系统铁代谢作相应变化。这一模式显示Hepcidin(海魄喜定)是肝脏、小肠和RE系统之间铁代谢调节信号的传递者。而且，高浓度的Hepcidin(海魄喜定)可经血液运输到达十二指肠隐窝细胞作用于β2M/HFE/TfR1复合物，导致小肠铁吸收下降。这就是炎症性贫血或慢性疾病并发性贫血的根本起因，这也是为什么这些贫血病人循环铁和小肠铁吸收都减少的原因。如果抑制这类病人的肝脏的Hepcidin(海魄喜定)合成或分泌，或者阻断Hepcidin(海魄喜定)与β2M/HFE/TfR1复合物相互作用，均应该可以增加小肠铁吸收，达到有效治疗这类贫血的目的。异常升高的Hepcidin也可能是其它类型临床贫血的原因。很显然，抗Hepcidin作用类物质也可通过增加小肠铁吸收的途径改善铁缺乏状况及有效地治疗任何类型缺铁性贫血。另一方面，任何原因引起的肝脏Hepcidin(海魄喜定)合成或分泌障碍可能是临床铁过负荷类疾病的起因。因此给予外源性Hepcidin(海魄喜定)会缓解或有效地治疗这一类疾病。这就是利用Hepcidin开发制备有效治疗各类贫血或铁积聚性疾病的药物极好的依据。
动物实验：
实验方法：
实验用小白鼠共40只，分为四组，每组10只。第一组、第二组饲喂基础饲料，含铁60mg/kg饲料。第三组、第四组饲喂高铁饲料，每千克基础饲料添加2.5％的羰基铁。第一组、第三组小白鼠每天尾静脉注射生理盐水0.1毫升作为对照，第二组和第四组每天注射小鼠的Hepcidin(海魄喜定)为0.1毫升(每毫升生理盐水含10微克海魄喜定)，连续注射7天。实验结束后，断头取血、取肝脏，分别测定血清铁和肝脏铁含量。
实验结果：
注射海魄喜定7天后，饲喂基础饲料小鼠血清铁比对照组显著降低，差异极显著P＜0.01，n＝10。表明Hepcidin(海魄喜定)有降低小鼠对铁的吸收的作用。饲喂高铁饲料的小鼠，血清铁较对照组明显升高，P＜0.05，n＝10。表明高铁饮食能够增加小鼠的血清铁的吸收。饲喂高铁饲料的小鼠注射Hepcidin(海魄喜定)，血清铁含量与单纯饲喂高铁饲料小鼠相比显著降低，差异极显著，P＜0.01，n＝10。Hepcidin(海魄喜定)有效地防止了高铁的形成。而注射Hepcidin(海魄喜定)7天后，饲喂基础饲料小鼠肝脏铁比对照组降低，但没有统计学意义，P＝0.067，n＝10。表明正常饮食情况下，尾静脉注射Hepcidin(海魄喜定)7天，对于降低小鼠肝脏铁的吸收没有明显的作用。饲喂高铁饲料的小鼠，肝脏铁较对照组明显升高，P＜0.05，n＝10。表明高铁饮食能够增加小鼠的肝脏铁的储存。饲喂高铁饲料的小鼠注射Hepcidin(海魄喜定)，肝脏铁含量与单纯饲喂高铁饲料小鼠相比显著降低，差异极显著，P＜0.01，n＝10。对于高铁情况下，Hepcidin(海魄喜定)降低肝脏铁吸收的作用比正常饮食情况下为高。以上实验结果证明Hepcidin(海魄喜定)能够抑制动物的铁摄入，阻止动物形成高铁状态。其作用尤其在动物高铁情况下更为明显。研究表明Hepcidin(海魄喜定)基因敲除小鼠肝脏有明显的铁沉积，类似遗传性血色素沉着病，而转基因小鼠则因为Hepcidin(海魄喜定)过量表达造成小鼠出生时严重贫血，不久便死亡。由此证明人体内铁的过量增高可以用Hepcidin(海魄喜定)进行治疗。而人体内铁的缺乏则可用Hepcidin(海魄喜定)抗体来调节。
将从人尿中提纯的Hepcidin(海魄喜定)制作为静脉注射剂注入人体，可加强Hepcidin(海魄喜定)与β2M/HFE/TfR1复合物相互作用，减少肠铁吸收相关蛋白的表达，降低铁的吸收，从而缓解或有效地治疗铁过载类疾病。
而将制备的Hepcidin(海魄喜定)单克隆抗体作为静脉注射剂注入人体，使其结合血液中的Hepcidin(海魄喜定)从而阻断Hepcidin(海魄喜定)与β2M/HFE/TfP1复合物相互作用，就能增加肠铁吸收相关蛋白的表达，使铁摄取增加，达到治疗铁缺乏的目的。
具体实施方式
实施例1，从人尿中提纯Hepcidin(海魄喜定)制作缓解或治疗铁过载疾病的药物Hepcidin(海魄喜定)静脉注射剂。
注射剂
1、收集过滤健康人尿液除去其中的细胞及杂质，
2、用弱阳离子交换树脂萃取得到阳离子多肽，
3、用百分之五的醋酸洗脱，然后用反向液相色谱纯化，所用C18柱子(Vydac)用百分之一的三氟醋酸平衡，
4、所得到的多肽用乙腈进行梯度(4％)洗脱，然后用20％的乙腈洗5分钟，最后用0.5％的乙腈梯度洗脱30分钟，
5、用酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析高压液相色谱得到的峰值多肽，用MALDI-TOF-MS方法进行鉴定，
6、将Hepcidin(海魄喜定)作为静脉注射剂。
实施例2：制作Hepcidin(海魄喜定)单克隆抗体作为治疗铁缺乏的药物Hepcidin(海魄喜定)单克隆抗体静脉注射剂。
1、构建噬菌体抗体库，
2、筛选噬菌体抗体库：纯化后的Hepcidin(海魄喜定)直接包被ELISA板(酶联免疫吸附实验)，经过3-4轮ELISA法筛选，最后将特异性结合的具有特异性抗体的噬菌体洗脱下来，感染受体菌，培养后铺皿，
3、Fab的抗体的可溶性表达：经上述筛选后的阳性克隆，37度培养后，提取质粒。酶切除去基因III，重新构建质粒载体，转染XLI-Blu，培养、筛选阳性克隆，培养后离心收集细菌，反复冻融三次，4度离心，吸取上清，得到可溶性的Fab抗体，
4、Fab抗体的纯化与鉴定：采用抗Fab抗体亲和层析纯化法纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯度，最后进行抗体功能测定，
5、将Hepcidin(海魄喜定)单克隆抗体作为静脉注射剂。
Claims (1)
- Hepcidin(海魄喜定)在制药中的应用，其特征在于将“海魄喜定”作为制备缓解或治疗铁过载类疾病药物的静脉注射剂。
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