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KR101452770B1 - 유산균 발효액을 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선 효과를 갖는 화장료 조성물 - Google Patents

유산균 발효액을 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선 효과를 갖는 화장료 조성물 Download PDF

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KR101452770B1
KR101452770B1 KR1020130019841A KR20130019841A KR101452770B1 KR 101452770 B1 KR101452770 B1 KR 101452770B1 KR 1020130019841 A KR1020130019841 A KR 1020130019841A KR 20130019841 A KR20130019841 A KR 20130019841A KR 101452770 B1 KR101452770 B1 KR 101452770B1
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Abstract

본 발명은 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃 및 연근의 혼합추출물을 유산균으로 발효시킨 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 혼합추출물을 유산균으로 발효시킨 유산균 발효액을 화장료 조성물로 포함하는 화장품을 사용하는 경우 한 종류의 화장품으로 항산화 효과, 피부 미백효과 및 피부주름 개선효과를 모두 나타낼 수 있음을 확인할 수 있다.

Description

유산균 발효액을 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선 효과를 갖는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising lactobacillus fermented solution having anti-oxidation, whitening and anti-wrinkle effect}
본 발명은 유산균 발효액을 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃 및 연근의 혼합추출물을 유산균으로 발효시킨 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.
최근 웰빙(well-being) 트랜드의 확산으로 건강과 아름다움을 오랫동안 유지하려는 요구가 증가하면서 식품, 화장품, 주거 환경 등의 모든 분야에서 천연 식물성 소재와 전통적인 민간요법으로 전래 되는 생리활성이 우수한 식물소재에 대한 관심이 증가하고 있다.
천연 식물소재는 합성소재에 비해 안전하고 자연 친화적이기 때문에 화장품 산업 분야에서 오래전부터 사용하여 왔으며, 최근에는 생리활성이 높은 식물소재 및 한약재를 이용한 화장품이 주류를 이루어 가고 있다. 전통적으로 수백년간 사용되어 오면서 안전성이나 효과 측면에서 입증된 소재이기 때문에 소비자들에게 쉽게 인식되어 사용될 수 있으며, 그 효과도 합성소재에 비해 뒤떨어지지 않는 장점을 가지고있다. 더 나아가 이러한 식물소재 및 한약재에서 얻은 추출액에 자체발효 또는 유산균이나 효모 등을 접종, 발효시켜 식물체의 영양성분이 흡수되기 쉬운 형태로 변환될 수 있을 뿐만 아니라 효소작용에 의해 생성된 성분이 새로운 생리조절 기능을 발현할 수 있다.
발효(fermentation)란 미생물이 분비하는 효소에 의해 유기물을 분해하는 과정을 말한다. 또한 미생물이 에너지를 얻는 과정에서 유용한 물질을 내는 것도 발효이다. 한국인은 이러한 발효와 친숙한데 예로부터 김치를 비롯하여 된장, 청국장 등의 전통 발효식품이 대표적이다. 이러한 발효과정은 무산소호흡을 하는 미생물들로 유기물을 완전히 분해 시키고 다른 종류의 유기물을 만들어 내기도 하여 적은 양의 에너지를 생성시킨다. 이러한 발효의 종류는 미생물에 따라 젖산발효, 알콜 발효, 프로피온산 발효, 메탄 발효 등이 있다.
이러한 발효에 관계되는 미생물의 대표적인 유산균은 포도당 또는 유당과 같은 당을 분해하여 젖산이나 초산과 같은 유기산을 생성하며 부산물로 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제, 프로테아제와 같은 효소를 생성하여 천연물 내의 거대분자의 저분자화를 통하여 피부침투를 용이하게 해준다.
한편 본 발명자들은 항산화기능을 가지며 미백효과와 피부주름 개선효과가 우수한 수십 종의 천연물을 검색하던 중 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃, 연근의 4가지 꽃과 그 뿌리의 혼합물이 항산화, 미백효과 및 주름개선에 뛰어난 상승효과가 있음을 확인하였다. 더 나아가 유산균의 발효를 이용하여 수득한 발효액이 더 우수한 항산화, 미백효과 및 피부주름 개선효과가 있음을 확인하고 화장료에 적용함으로써 본 발명을 완성하였다.
석류꽃은 석류과(Punicaceae)의 낙엽활엽소 교목의 꽃으로 붉은색, 가지색, 노란색, 흰색 등 여러 가지가 있으며 정장작용, 화상치유, 창상치유, 중이염치유효과 등이 있는 것으로 보고되고 있다. 대한민국 특허 공개번호 10-2010-0031839에서는 석류꽃 및 관동화 추출물이 유효성분으로 함유되어 히아루론산 생성촉진, 히아루론산 합성효소 유전자 발현 증가, 버시칸 유전자 발현 증가, MMP12 유전자 발현 감소 등을 통해 피부노화방지에 효과적인 조성물임을 강조했다.
석류근은 석류나무뿌리로 알칼로이드 성분이 약 1% 함유하고 있으며 주성분은 휘발성인 펠레티에린류의 액상 알칼로이드를 함유하고 있다. 그밖에 탄닌, 만니트, 에퀴몰 등을 함유하고 있어 위 내에 들어가 위 내의 효소가 과중하게 발휘되는 것을 제지하고 장에서는 장점막을 수축하여 장액의 분비를 감소시키고 조충이나 회충을 사멸시키는 역할을 한다.
촉규화는 아욱과의 접시꽃으로 백대하, 하복부 냉증, 토혈, 화상 및 코끝이 빨개지는 증상들에게 쓰인다. 대한민국 특허 10-1135264에는 자초, 구맥 및 촉규화 혼합추출물이 항산화, 항노화, 미백효과가 있는 화장료 조성물로 등록하였다.
촉규근은 접시꽃의 뿌리로서 점액이 있어 한방에서 점활제(粘滑濟)로 사용한다. 이 점액질은 펜토오즈, 펜토산, 메칠펜토산, 유론산 등이 함유되어 있어 염증을 제거하고 부스럼을 치료하는데 사용하였다고 한다. 대한민국 특허 10-0887294에서는 이 점액질을 이용한 것으로, 촉규근 추출물을 함유시켜 보습, 세포증식효과, 항염증, 가려움증 억제 및 항 아토피 효과가 있는 화장료 조성물로 등록하였다.
매실꽃은 매실나무의 꽃이며 주요성분이 아밀갈린, 베타-시토스테롤, 이유게놀, 구아이콜, 올레노익애씨드, 올레익애씨드, 씨트릭애씨드, 라우릭애씨드가 있다. 갈증, 숙취해소가 뛰어나며 카네킨산은 강한 해독, 살균작용이 있어 장내 살균효과를 높여 장염을 치료하고 설사를 멎게 한다, 대한민국 특허 10-0937339에서 동백꽃, 금은화, 이화, 회화, 백련화, 홍화 및 매화(매실꽃)의 복합조성물이 피부염증완화 및 피부노화방지용 화장료 조성물로 등록되었다.
매근은 매실나무 뿌리이며, 대한민국 공개특허 10-2012-0087716에서 매실, 매엽 및 매근의 혼합물에 1차 자연발효시켜 추출액을 제조한 후 제조된 추출액에 유산균을 접종하여 2차 숙성 발효시켜 수득 된 발효추출물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 공개하였다. 매실나무에서 얻을 수 있는 재료를 모두 활용하여 1차와 2차에 걸쳐 발효를 진행하였으나 자연발효를 통해서는 항상 일정한 효능을 유지하는 부산물의 농도를 조절하기가 까다로우며, 효능에서도 미백효과만을 제시하였다.
연꽃과 연근은 연(蓮)의 꽃과 뿌리로서 식품 및 한약재로 다양하게 사용되어 그 안전성이 상당히 입증된 식물이다. 중의학 문헌과 본초강목 등에서 항노화효과와 기력회복 등에 대해 기술하였고, 연근은 아스파라긴산이 들어있어 식용하며 자양강장제로 쓰인다. 대한민국 특허 10-1020535는 연꽃 및 연잎을 열수 추출한 후 유산균과 효모균의 미생물로 복합발효시킨 연 발효수를 정제수 대신으로 대체하여 따로 방부제를 첨가할 필요 없고 피부질환을 감소시킬 수 있는 화장료 조성물로 등록하였다. 이 특허에는 천연 방부효과를 줄 수 있는 방법만으로 개시하여 주름개선 또는 미백효과 등의 기능성 효과에 대해서는 언급되어 있지 않다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃 및 연근의 혼합추출물을 유산균으로 발효시킨 유산균 발효액을 화장료 조성물로 포함하는 화장품을 사용하는 경우 한 종류의 화장품으로 항산화 효과, 피부 미백효과 및 피부주름 개선효과를 모두 나타낼 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 한 종류의 화장품으로 항산화 효과, 피부 미백효과 및 피부주름 개선효과을 갖는 유산균 발효액을 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유산균 발효액을 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선 효과를 갖는 화장료 조성물을 이용한 스킨케어 화장료, 바디 화장료 및 색조 화장료를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃, 및 연근의 혼합추출물을 유산균으로 발효시킨 유산균 발효액을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 주름개선 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 이전에는 각각의 식물에 따른 효과를 실시하였으나, 본 발명에서는 네 가지 식물의 꽃과 뿌리를 함께 사용하였다. 특히, 기존에는 석류나 매실과 같이 열매를 사용 한 반면에 본 발명에서는 열매가 아닌 석류꽃 및 석류나무뿌리와 매실꽃 및 매실나무뿌리로 그 효능을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균 발효액은 항산화 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 실험예 2 및 실험예 3에서 DPPH 라디칼 소거능 및 Xanthine Oxidase 저해활성 시험을 통해 사화근효액이 삼화근효액 및 이화근효액과 유산균 발효시키지 않은 사화근액 보다 현저한 항산화 효과를 갖는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 사화근효액을 화장료 조성물로 함유할 경우 우수한 항산화 효과를 갖는 화장료를 제공할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에서 “사화근효액(四化根酵液)”이란 본 발명에서 사용되는 네 가지 식물의 꽃과 뿌리 즉, 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃 및 연근의 혼합추출물을 유산균으로 발효시켜 얻은 발효액을 일컫는다. 또한, “사화근액(四化根液)”은 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃 및 연근의 혼합추출물로서 유산균으로 발효시키지 않은 것을 일컬으며, 본 발명에서 “삼화근효액(三化根酵液)”은 본 발명에서 사용되는 세 가지 식물 즉, 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃 및 매실나무뿌리(매근)의 혼합추출물을 유산균으로 발효시켜 얻은 발효액을 일컬으며 “이화근효액(二化]根酵液)”은 본 발명에서 사용되는 두 가지 식물 즉, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃, 및 연근의 혼합추출물을 유산균으로 발효시켜 얻은 발효액을 일컫는다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균 발효액은 미백 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 실험예 3에서 티로시나아제(tyrosinase)활성 저해 시험을 통해 사화근효액이 유산균 발효시키지 않은 사화근액과 삼화근효액 및 이화근효액 보다 현저한 미백효과를 갖는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 사화근효액을 화장료 조성물로 함유할 경우 우수한 미백 효과를 갖는 화장료를 제공할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균 발효액은 주름개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 실험예 4에서 콜라겐 생성 효과 및 콜라게나아제 활성 억제 측정 시험을 통해 사화근효액이 유산균 발효시키지 않은 사화근액과 삼화근효액 및 이화근효액 보다 현저한 주름개선 효과를 갖는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 사화근효액을 화장료 조성물로 함유할 경우 우수한 피부주름개선 효과를 갖는 화장료를 제공할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, 상기 혼합추출물은 종래에 알려진 어떠한 추출방법으로도 추출될 수 있으며, 예컨대 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌 글리콜 또는 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 50 ~ 90% 에탄올로 추출하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.)인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
볼 발명에 따르면, 유산균의 일예로서 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)를 사용하여 사화근효액을 제조하였다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균 발효액을 호기성 발효하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
호기성 발효(aerobic fermentation)란 호기 조건하에서 당이나 알코올을 산화시켜 산을 생성하는 발효를 말하며 산화발효라고도 한다. 본 발명에서는 호기성 발효 시 따로 영양분을 넣어주지 않는데, 이는 본 발명에 함유되는 식물 뿌리에 다당류(polysaccharide)와 같은 영양소가 있기 때문에 넣지 않고 진행하였다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균 발효액은 기초화장료 제형, 색조화장료 제형, 헤어화장료 제형 및 바디화장료 제형으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물의 제형으로는 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 에멀젼, 에센스, 세럼, 앰플, 크림, 팩, 클렌저, 자외선차단크림, 비비크림, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형과 수중유형 또는 유중수형의 메이컵베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 립밤, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 그리고 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어팩, 헤어 트리트먼트, 두피영양 앰플, 헤어 에센스, 헤어 토닉, 세팅 젤, 세팅 스프레이, 세팅 무스, 세팅 왁스류로 이루어진 헤어화장료 제형; 바디클렌저, 바디로션, 바디크림, 바디에센스, 바디젤류로 이루어진 바디화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균 발효액은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.01 ~ 10중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 유산균 발효액을 세포에 10 중량% 처리에도 세포 생존율이 95% 이상으로 유산균 발효액의 10 중량% 처리 시에도 세포독성을 일으키지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는 유산균 발효액을 화장료 조성물에 총 중량 대비 10중량%를 함유하여도 세포독성을 일으키지 않고 피부에 안전하다는 것을 의미한다. 또한, 실험예 5에서 유산균 발효액을 함유하는 화장료의 안전성 검사 결과 아무 자극 없이 안전한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 유산균 발효액을 화장료 조성물로 함유 시 피부 안전성이 매우 우수하여 화장료 조성물로 적합하다는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 통해 유산균 발효액을 제조하는 제조방법:
a) 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃 및 연근을 실온에서 침적하여 얻는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 얻은 식물을 각각 1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2의 중량비로 혼합하여 분쇄하는 단계;
c) 상기 b)단계의 혼합물을 50 ~ 90% 에탄올로 혼합하여 추출하는 단계;
d) 상기 c)단계에서 추출한 추출물을 농축하여 혼합추출물을 얻는 단계; 및
e) 상기 d)단계의 혼합추출물에 유산균을 처리하여 유산균 발효액을 얻는 단계를 포함하는 유산균 발효액 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 e)단계의 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.)인 것을 특징으로 하는 유산균 발효액 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 유산균의 일예로서 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)를 사용하여 사화근효액을 제조하였다.
본 발명에 있어서, 상기 e)단계의 유산균은 엠알에스 배지(MRS medium)에 접종 후 진탕 배양기에서 배양 후 계대배양하는 것을 특징으로 하는 유산균 발효액 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 e)단계의 유산균은 초기 균수를 107 ~ 109CFU/ml로 조절하는 것을 특징으로 하는 유산균 발효액 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 e)단계의 유산균 발효액은 1차 내지 3차 여과하는 것을 특징으로 하는 유산균 발효액 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 1차 여과는 종이 여과지를 사용하여 여과하고 2차 여과는 0.8 ~ 1.2㎛ 기공크기의 멤브레인 필터를 이용하여 여과하며 3차 여과는 0.4 ~ 0.5㎛ 기공크키의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한다.
석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃 및 연근의 혼합추출물을 유산균으로 발효시킨 유산균 발효액이 항산화, 미백 및 피부주름 개선 효과가 있음을 확인하였고 이러한 효과를 갖는 화장료 조성물을 함유하는 화장품을 사용하는 경우 하나의 화장품으로 세 가지 효과을 얻을 수 있는 것과 함께 사용 시 번거로움을 덜어 주는 장점이 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1 : 사화근액 ( 四花根液 ) 제조
먼저 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃, 연근의 4가지 꽃과 그 뿌리를 각각 1:1:1:1:1:1:1:1로 혼합하여 곱게 분쇄한 500 중량부에 70% 에탄올 용액 5,000 중량부를 혼합하여 혼합액을 제조하였다. 다음은 이 혼합액을 7일 동안 실온에서 침적하여 추출시킨 후, 추출하고 남은 천연물들은 종이 여과지로 여과하여 제거한 다음, 여액을 1.0㎛ 기공 크기의 멤브레인 필터로 2차 여과한 후 0.45㎛ 기공크기의 멤브레인 필터로 3차 여과하여 이를 500 중량부가 될 때까지 농축하여 Brix25의 추출액(사화근액)을 제조하였다.
실시예 2 : 사화근효액 ( 四花根酵液 ) 제조
먼저 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei, KCTC 13416)를 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 엠알에스 배지(MRS Medium)에 접종하고 37℃ 진탕 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 계대배양 하였다. 상기 배양된 균주를 멸균수로 2회 세척하고 초기 균수를 108CFU/㎖로 조절하여 유산균 스타터를 준비하였다. 다음은 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃, 연근을 각각 1:1:1:1:1:1:1:1로 한 500 중량부를 곱게 분쇄한 다음 여기에 70% 에탄올 용액 5,000 중량부를 혼합하여 7일 동안 실온에서 침적시킨 추출액을 500 중량부가 될 때까지 농축시키고, 여기에 상기 유산균 스타터를 농축액 부피의 3%가 되도록 접종한 후 37℃에서 48시간 호기성 발효시켰다. 발효가 완료되면 80℃에서 10분간 가열하여 실화를 유도한 후 발효액은 종이 여과지로 1차 여과하고, 여액을 1.0㎛ 기공크기의 멤브레인 필터로 2차 여과한 후 0.45㎛ 기공크기의 멤브레인 필터로 마지막 여과하여 유산균 발효액(사화근효액, Brix 25)을 제조하였다.
비교예 1 : 삼화근효액 ( 三花根酵液 ) 제조
먼저 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei, KCTC 13416)를 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 엠알에스 배지(MRS Medium)에 접종하고 37℃ 진탕 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 계대배양 하였다. 상기 배양된 균주를 멸균수로 2회 세척하고 초기 균수를 108CFU/㎖로 조절하여 유산균 스타터를 준비하였다.
다음은 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근)을 각각 1:1:1:1:1:1:로 한 500 중량부를 곱게 분쇄한 다음 여기에 70% 에탄올 용액 5,000 중량부를 혼합하여 7일 동안 실온에서 침적시킨 추출액을 500 중량부가 될 때까지 농축시키고, 여기에 상기 유산균 스타터를 농축액 부피의 3%가 되도록 접종한 후 37℃에서 48시간 호기성 발효시켰다. 발효가 완료되면 80℃에서 10분간 가열하여 실화를 유도한 후 발효액은 종이 여과지로 1차 여과하고, 여액을 1.0㎛ 기공크기의 멤브레인 필터로 2차 여과한 후 0.45㎛ 기공크기의 멤브레인 필터로 마지막 여과하여 유산균 발효액(삼화근효액, Brix 25)을 제조하였다.
비교예 2 : 이화근효액 ( 二花根酵液 ) 제조
먼저 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei, KCTC 13416)를 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 엠알에스 배지(MRS Medium)에 접종하고 37℃ 진탕 배양기에서 24시간동안 배양한 후 계대배양 하였다. 상기 배양된 균주를 멸균수로 2회 세척하고 초기 균수를 108CFU/㎖로 조절하여 유산균 스타터를 준비하였다.
다음은 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃, 연근을 각각 1:1:1:1로 한 500 중량부를 곱게 분쇄한 다음 여기에 70% 에탄올 용액 5,000 중량부를 혼합하여 7일 동안 실온에서 침적시킨 추출액을 500 중량부가 될 때까지 농축시키고, 여기에 상기 유산균 스타터를 농축액의 부피의 3%가 되도록 접종한 후 37℃에서 48시간 호기성 발효시켰다. 발효가 완료되면 80℃에서 10분간 가열하여 실화를 유도한 후 발효액은 종이 여과지로 1차 여과하고, 여액을 1.0㎛ 기공크기의 멤브레인 필터로 2차 여과한 후 0.45㎛ 기공크기의 멤브레인 필터로 마지막 여과하여 유산균 발효액(이화근효액, Brix 25)을 제조하였다.
실시예 3 : 사화근효액(四花根酵液)을 함유하는 화장료 조성물 제조
상기 실시예 2에서 제조된 사화근효액(Brix 25)을 함유하는 화장료 조성물을 하기 표 1의 조성으로 제조하였다.
비교예 3 : 사화근효액(四花根酵液)을 함유하지 않는 화장료 조성물 제조
상기 실시예 3에서 사화근효액을 제외한 나머지 성분만으로 화장료 조성물을 제조하여 하기 표 1에 나타내었다.
단 위 사화근액
(실시예 1)		 사화근효액
(실시예 2)		 삼화근효액
(비교예 1)		 이화근효액
(비교예 2)
pH - 5.33 5.08 5.10 5.14
굴절률 - 1.322 1.323 1.322 1.321
폴리페놀화합물 함량 ㎎/g 184 302 201 195
플라보노이드 함량 ㎎/g 168 275 175 170
환원당 함량 ㎎/g 292 367 300 295
유기산 산도 % 0.00072 0.00076 0.00075 0.00074
시험예 1 : 이화학적 성분분석
상기 실시예 1의 사화근액과 실시예 2의 사화근효액, 비교예 1의 삼화근효액 및 비교예 2의 이화근효액에 대한 이화학적 성분분석은 발효 전과 발효 후의 물리화학적 변화를 측정하기 위해 추출액의 고형분 기준으로 농도 0.1%로 제조한 액을 사용하였으며, 분석방법은 아래와 같다.
1) 굴절률 측정
물질의 굴절률은 진공 중의 광의 속도와 물질 중의 광의 속도와의 비(ratio)이며, 물질에 대한 광의 입사각의 정현(正弦)과 굴절각의 정현비와 동일하다. 측정은 압베굴절계를 이용하여 실온에서 측정하였다.
2) 폴리페놀화합물 함량 측정
폴리페놀화합물의 함량은 페놀성 물질이 몰리브덴산나트륨(Sodium Molybdate)과 반응하여 청색을 나타내는 현상을 이용한 Folin-Denis법에 따라 약간의 방법을 변형하여 측정하였다. Folin-Ciocalteu's reagent(FCR)는 Fluka Folin-Ciocalteu's phenol reagent를 사용하였다. 폴리페놀화합물의 측정을 위해 증류수 1.5㎖에 FCR 0.1㎖와 탄산나트륨(Sodium Carbonate) 포화용액 0.2㎖을 가한 후 증류수로 10배 희석한 사화근액과 사화근효액, 삼화근효액 및 이화근효액을 0.2㎖ 첨가해 총 부피를 2㎖로 하여 실온에서 20분간 방치한 후 3,000rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액을 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 725㎚에서 흡광도를 측정하였고 갈산(Gallic Acid)을 이용하여 얻은 표준곡선으로부터 폴리페놀화합물의 함량을 구하였다.
3) 플라보노이드 함량 측정
사화근액과 사화근효액, 삼화근효액 및 이화근효액 각각 0.11㎖에 1㎖의 디에틸렌 글라이콜(Diethylene Glycol)을 가하여 혼합한 후 1N NaOH 0.01㎖를 첨가하였다. 37℃ 항온 수조에서 1시간 반응시킨 후 분광광도계를 이용해 420㎚에서 흡광도를 측정하였고 루틴(Rutin)을 이용하여 얻은 표준 곡선으로부터 플라보노이드의 함량을 구하였다.
4) 환원당 함량 측정
환원당에 의하여 3,5-디니트로살리실산(3,5-dinitrosalicylic acid : DNS)이 환원되어 생성된 3-아미노-5-디니트로살리실산(3-amino-5-dinitrosalicylic acid)의 흡광도를 측정하여 당을 정량분석 하였다. 이 반응은 알칼리성에서 일어나므로 반응용액을 알칼리성으로 만들어 발색을 증가시키고, 생성된 3-아미노-5-디니트로살리실산의 안정화를 위해 DNS 시약에 NaOH, 로셀염(Rochelle salt), 페놀(Phenol) 및 메타중아황산나트륨(Sodium Metabisulfite : Na2S2O5)을 첨가하였다. 사화근액과 사화근효액, 삼화근효액 및 이화근효액 0.5㎖에 DNS 시약 1.5㎖를 가하여 혼합한 후 끓는 물에 5분간 반응시킨 다음 상온으로 냉각시켰다. 분광광도계를 이용하여 550㎚에서 흡광도를 측정하였고 글루코오스(Glucose)를 이용하여 얻은 표준곡선으로부터 환원당의 함량을 구하였다.
5) 유기산 산도 측정
검체 10㎖에 증류수 100㎖를 가하고 이에 페놀프탈레인 시약 0.5㎖를 가하여 0.1N NaOH로 30초간 홍색이 지속 될 때까지 적정하고 다음 식에 따라 산도를 구하였다. 단, 시험용액이 착색되어 있는 경우에는 pH측정기를 사용하여 pH 8.3까지 적정한다.
* 유기산 산도(%) = (a×f×0.009/검체채취량(㎖))×100
a : 0.1N NaOH의 소비량(㎖)
f : 0.1N NaOH의 역가
상기의 분석방법으로 분석한 사화근액(실시예 1)과 사화근효액(실시예 2), 삼화근효액(비교예 1) 및 이화근효액(비교예 2)의 분석결과를 하기 표 2에 나타내었다.
단 위 사화근액
(실시예 1)		 사화근효액
(실시예 2)		 삼화근효액
(비교예 1)		 이화근효액
(비교예 2)
pH - 5.33 5.08 5.10 5.14
굴절률 - 1.322 1.323 1.322 1.321
폴리페놀화합물 함량 ㎎/g 184 302 201 195
플라보노이드 함량 ㎎/g 168 275 175 170
환원당 함량 ㎎/g 292 367 300 295
유기산 산도 % 0.00072 0.00076 0.00075 0.00074
그 결과 상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 발효 전(사화근액)과 발효 후(사화근효액)의 물리적인 변화는 거의 없는 상태이지만 폴리페놀화합물, 플라보노이드, 환원당 함량 등에서 변화가 일어났음을 알 수 있다. 또한, 세 가지의 꽃과 뿌리 혼합추출물을 유산균으로 발효시킨 삼화근효액(비교예 1) 및 두 가지의 꽃과 뿌리의 혼합추출물을 유산균으로 발효시킨 이화근효액(비교예 2)에서도 물리적 변화는 거의 없었으며, 폴리페놀화합물, 폴라보노이드, 환원당 함량에서 변화가 일어났기는 했으나 현저한 효과는 사화근효액에서 나타나는 것을 알 수 있다. 특히 폴리페놀화합물과 플라보노이드의 함량은 사화근액과 비교하여 사화근효액이 약 160% 이상 많은 양이 생성됨을 알 수 있다. 이러한 변화로 인해 항산화력을 높일 수 있는 여건이 될 수 있음을 알 수 있고, 실험예 2에서 발효 전과 후의 항산화 효과의 변화를 측정하였다.
시험예 2 : 항산화 효과 측정
상기 시험예 1에서 발효 전(사화근액)보다 발효 후(사화근효액)에 폴리페놀화합물과 플라보노이드의 함량이 크게 늘어난 결과를 토대로 실제 항산화 효과가 어떻게 나타나는지 측정하였다.
1) DPPH 라디칼 소거능 측정
실시예 1(Brix 25), 실시예 2(Brix 25), 비교예 1(Brix 25) 및 비교예 2(Brix 25)를 증류수를 넣어 1/5(각 실시예 또는 비교예와 증류수를 1:4의 비율)로 희석하여 Brix 5인 사화근액, 사화근효액, 삼화근효액 및 이화근효액을 제조하고, 다시 증류수로 10배 희석하여 Brix 0.5인 사화근액, 사화근효액, 삼화근효액 및 이화근효액을 제조하였다.
라디칼 소거능은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)의 환원력을 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 400μM 농도가 되도록 에탄올에 용해한 DPPH 0.2㎖와 희석한 실시예 1, 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2 시료(상기 Brix 이 0.5인 사화근액, 사화근효액, 삼화근효액 및 이화근효액) 0.2㎖를 분주한 다음 실온에서 30분간 반응시키고 분광광도계를 이용하여 525㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 에탄올을 첨가하였고, 비교를 위하여 대표적인 항산화제인 아스코빈산(Ascorbic Acid)를 사용하였다. 분석 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
[식 1]
Figure 112013016679557-pat00001

DPPH 라디칼 소거능(%)
Ascorbic Acid(100ppm) 96.92

Brix 0.5		 사화근액 94.62
사화근효액 95.08
삼화근효액 94.79
이화근효액 94.70

Brix 5		 사화근액 95.17
사화근효액 99.80
삼화근효액 99.17
이화근효액 96.01
상기 표 3에서 보듯이 발효 전(사화근액)에 비해 발효 후(사화근효액)에 더 높은 매우 우수한 항산화력을 보임을 알 수 있었으며, 희석하여도 발효 후가 더 강한 항산화력을 가질 뿐만 아니라, 비교물질인 아스코빈산과 유사한 항산화력을 보임을 알 수 있었다. 삼화근효액 및 이화근효액 또한 사화근액에 비해 높은 항산화력을 보였으나, 사화근효액에서 더 현저한 효과를 나타내었다.
2) Xanthine Oxidase 저해 활성 측정
실시예 1(Brix 25), 실시예 2(Brix 25), 비교예 1(Brix 25) 및 비교예 2(Brix 25)를 증류수를 넣어 1/5(각 실시예 또는 비교예와 증류수를 1:4의 비율)로 희석하여 Brix 5인 사화근액, 사화근효액, 삼화근효액 및 이화근효액을 제조하고, 다시 증류수로 10배 희석하여 Brix 0.5인 사화근액, 사화근효액, 삼화근효액 및 이화근효액을 제조하였다.
Xanthine Oxidase 저해 활성은 SOD 유사활성 측정/NBT(Nitroblue tetrazolium)법에 따라 측정하였다. 사화근액(Brix 5), 사화근효액(Brix 5), 삼화근효액(Brix 5) 및 이화근효액(Brix 5) 10㎕에 50mM sodium phosphate buffer(pH 7.5) 140㎕, xanthine(3mM) 40㎕, 1.5mM NBT 10㎕를 넣어 혼합한 후, 여기에 xanthine oxidase(0.13U/㎖) 10㎕를 마지막으로 넣어 혼합한 후 25℃에서 40분 동안 반응시키고 560㎚에서 흡광도를 측정하였다. 비교를 위하여 대표적인 항산화제인 아스코빈산(Ascorbic Acid)를 사용하였다. 분석 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
[식 2]
Figure 112013016679557-pat00002
Ascorbic Acid(100ppm) 사화근액
(Brix 5)		 사화근효액
(Brix 5)		 삼화근효액
(Brix 5)		 이화근효액
(Brix 5)

Xanthine Oxidase 저해 활성(%)
46.81
53.06
87.89
61.07
59.84
그 결과 상기 표 4에서 나타나는 바와 같이, 유산균으로 발효된 사화근효액이 발효를 진행하지 않은 추출액(사화근액)보다 160% 이상의 높은 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다. 또한, 삼화근효액 및 이화근효액 또한 사화근액 보다 높은 항산화력을 나타냈지만 사화근효액에서 현저한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 3 ; 티로시나제 ( tyrosinase ) 활성 저해 시험으로 미백 효과 측정
티로시나제 활성 저해 시험을 통해 사화근효액의 미백효과를 확인하였다. 반응구 96-well plate 내의 0.1M phosphate buffer(pH 6.5) 220㎕에 1.5mM L-Tyrosine 용액(in 0.1M phosphate buffer(pH 6.5)) 40㎕ 및 실시예 2(사화근효액)를 20㎕를 넣은 후, mushroom tyrosinase(1,500~2,000unit/㎖) 20㎕를 첨가하여 반응액을 형성하였다. 상기 반응액을 37℃에서 10분간 반응시켜 생성된 도파크롬에 대하여 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하되, 상기와 같은 반응액의 형성 및 흡광도의 측정을 각 시료 당 3회씩 실시하였고 사화근액, 삼화근효액 및 이화근효액도 상기와 같은 방법으로 실시하였다.
실험 결과의 비교를 위해 500ppm 농도의 알부틴(Arbutin)을 사용하였으며, 상기 측정된 각 시료용액의 흡광도를 산출하여 티로시나제 활성 저해 수치를 다음의 식을 이용하여 계산하였다. 측정 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
[식 3]
Figure 112013016679557-pat00003
a : 공시료액의 반응 후의 흡광도
b : 시료액의 반응 후의 흡광도
a', b' : 티로시나제 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도
알부틴
(500/)		 사화근액
(Brix 5)		 사화근효액
(Brix 5)		 삼화근효액
(Brix 5		 이화근효액
(Brix 5)

티로시나제
활성 저해율(%)
50.09
63.13
79.73
64.29
63.98
그 결과, 표 5에서 나타난 바와 같이 유산균 발효를 통해 얻어낸 사화근효액이 발효전인 사화근액에 비해 티로시나아제 활성 저해율이 훨씬 높게 나타났다. 또한, 삼화근효액 및 이화근효액 또한 사화근액 보다 높은 티로시나아제 저해 활성을 나타냈지만 사화근효액에서 더 현저한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 4: 세포독성 및 주름개선 효과 측정
시험 재료 및 제조
유산균 발효 전의 실시예 1과 발효 후인 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2를 1/5로 희석하여 Brix 5의 사화근액, 사화근효액, 삼화근효액 및 이화근효액을 혈청이 함유되지 않은 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, gibco, USA) 배지 또는 PBS (Phosphate Buffer Saline) 용액에 % 단위로 용해시켜 사용하였다.
세포 배양
사람 섬유아세포 종인 CCD-986sk 세포는 37℃, 5% CO2의 조건하에서 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Gibco, USA), 100㎍/㎖ streptomycin, 100U/㎖ penicillin이 첨가된 DMEM 배지가 사용되었다. CCD-986sk 세포는 75㎠ 플라스크(Falcon, USA)에서 충분히 증식시킨 후 배양 2~3일 간격으로 배양세포 표면을 PBS 용액으로 씻어준 후 0.25% trypsin-EDTA 용액을 넣고 incubator에서 1~2분 처리하여 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 15㎖를 새로운 배양용기에 옮겨 1 : 20 split ratio로 37℃, 5% CO2의 조건하에서 배양하였다.
1) MTT 분석을 통한 세포독성 측정
섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 5×105의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 시험물질(사화근액 (Brix 5), 사화근효액(Brix 5), 삼화근효액(Brix 5) 및 이화근효액(Brix 5)을 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24시간 배양한 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium boromide, Sigma, U.S.A.)용액을 각 well에 100㎕씩 첨가한 후(3㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150㎕의 디메틸설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 6에 나타내었다.
[식 4]
Figure 112013016679557-pat00004

1차 생존율(%) 2차 생존율(%) 평균(%)




사화근액
(Brix 5)		 0% 100 100 100
0.01% 97.44 107.02 102.23
0.03% 101.74 101.65 101.70
0.05% 100.00 99.09 99.55
0.10% 99.28 102.99 101.14
0.30% 98.56 111.66 105.11
0.50% 92.00 117.96 104.98
1.00% 113.94 93.49 103.72
3.00% 99.74 102.99 101.37
5.00% 98.44 99.42 98.93
10.00% 97.38 96.79 97.09




사화근효액
(Brix 5)		 0% 100 100 100
0.01% 98.19 97.93 98.06
0.03% 114.27 98.34 106.31
0.05% 105.51 92.13 98.82
0.10% 94.67 116.40 105.54
0.30% 99.01 103.07 101.04
0.50% 108.84 103.15 105.78
1.00% 97.74 108.03 102.89
3.00% 105.84 95.11 100.48
5.00% 100.99 98.48 99.74
10.00% 97.23 98.18 97.71




삼화근효액
(Brix 5)
 0% 100 100 100
0.01% 97.59 96.73 97.16
0.03% 102.98 97.24 100.11
0.05% 101.98 91.09 96.54
0.10% 92.26 104.87 98.56
0.30% 98.79 102.09 100.44
0.50% 95.13 101.57 98.35
1.00% 96.54 95.87 96.19
3.00% 100.65 93.65 97.15
5.00% 98.54 97.13 97.84
10.00% 96.54 97.16 96.85




이화근효액
(Brix 5)		 0% 100 100 100
0.01% 96.01 96.24 96.13
0.03% 101.54 96.15 98.85
0.05% 101.11 90.78 95.95
0.10% 91.69 103.56 97.63
0.30% 97.36 101.86 99.61
0.50% 94.65 100.92 97.79
1.00% 95.35 95.06 95.20
3.00% 99.88 92.43 96.16
5.00% 97.38 96.09 96.74
10.00% 95.54 96.52 96.03
그 결과 상기 표 6에서 보는 바와 같이, 발효 전과 후 모두에서 시료 농도 10% 처리 시에도 세포 생존율이 95% 이상인 것을 확인할 수 있다.
2) 콜라겐 생성 효과 측정
콜라겐 생성 효과를 알아보기 위하여 CCD-986sk 세포를 24 well plate에 5×104cell/well의 밀도로 분주한 뒤, 10% FBS/DMEM 배지로 24시간 배양시킨 다음 serum free 배지로 단계적으로 희석한 사화근액(Brix 5), 사화근효액(Brix 5), 삼화근효액(Brix 5) 및 이화근효액(Brix 5)을 가하고 다시 24시간동안 CO2 incubator에서 배양하였다. 세포 배양액을 가지고 Procollagen Type C-peptide EIA kit(Takara, Japan)를 이용하여 콜라겐 양을 측정하였다. 먼저 antibody-POD cojugate solution 100㎕를 각 well에 첨가하고, 사화근액(Brix 5), 사화근효액(Brix 5), 삼화근효액(Brix 5), 이화근효액(Brix 5) 및 standard를 20㎕씩 넣은 뒤 잘 섞은 후 37℃에서 3시간 동안 반응시키고 반응이 끝나면 내용물을 제거한 뒤 PBS 400㎕로 4번 세척하였다. 제거 후 기질용액 100㎕를 넣고 20~30℃에서 15분간 반응시킨 후 1N H2SO4 100㎕를 첨가하여 발색을 중지시킨 후 shaking하였다. 450㎚에서 흡광도를 측정한 후 표준농도곡선을 작성하여 콜라겐 양을 산정하였다. 비교를 위하여 대표적인 주름개선 물질인 Retinol(비타민 A)을 사용하였다. 분석 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
시료 1차 생성율(%) 2차 생성율(%) 평균(%)
control 100 100 100
Retinol(1㎎/㎖) 168.75 166.96 167.86

사화근액 (Brix 5)		 0.1% 102.67 117.85 110.26
0.2% 117.86 111.60 114.73
0.5% 124.11 126.79 125.45
1.0% 131.25 124.11 127.68

사화근효액
(Brix 5)		 0.1% 113.39 108.92 111.16
0.2% 119.64 123.89 121.77
0.5% 149.11 138.39 143.75
1.0%. 152.68 156.25 154.47

삼화근효액
(Brix 5)		 0.1% 103.66 107.13 105.40
0.2% 118.03 112.97 115.50
0.5% 126.36 127.79 127.08
1.0% 135.91 126.99 131.45

이화근효액
(Brix 5)		 0.1% 102.11 106.93 104.52
0.2% 116.29 110.47 113.38
0.5% 124.73 122.87 123.80
1.0% 132.96 125.11 129.04
그 결과, 상기 표 7에서 나타나는 바와 같이 양성 대조군으로는 Retinol(1㎎/㎖)을 이용하여 콜라겐의 생성량을 확인하였고, 발효전인 사화근액과 발효 후인 사화근효액, 삼화근효액 및 이화근효액의 콜라겐 생성량의 비교는 사화근효액, 삼화근효액 및 이화근효액이 사화근액보다 농도 의존적으로 상승하는 결과를 나타내었으며, 또한 이중 사화근효액은 더 현저한 효과를 나타내고 있다.
3) 콜라게나제 활성 억제 측정
CCD-986sk 세포를 24 well plate에 5×104cell/well의 밀도로 분주한 뒤, 10% FBS/DMEM 배지로 24시간 배양시킨 다음 배지를 버리고 10% PBS 용액으로 세척한 후 사화근액(Brix 5), 사화근효액(Brix 5), 삼화근효액(Brix 5), 이화근효액(Brix 5) 및 새로운 배지를 넣고 48시간 배양하였다. 세포 배양액을 가지고 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) human biotrak ELISA system(Amersham life science)을 사용하여 콜라게나아제 양을 측정하였다. 먼저 배양액 및 표준액 각 100㎕를 넣고 상온에서 2시간 30분 동안 shaker에서 배양하였다. well plate에서 배양액을 제거한 다음 세척용 완충액 200㎕로 4회 씻어준 후, Biotinylated antibody를 100㎕넣고 상온에서 1시간 반응시킨 다음 세척용 완충액 200㎕로 4회 씻어주었다. HRP-Streptavidin 용액 100㎕를 넣고 상온에서 45분간 반응시킨 다음 세척용 완충액 200㎕로 5회 씻는다. TMB substrate 100㎕를 넣고 상온에서 30분간 반응시켰다. Stop solution 50㎕를 넣고 450㎚에서 ELISA reader로 측정하였다. 비교를 위하여 대표적인 주름개선 물질인 Retinol(비타민 A)을 사용하였다. 분석 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
시료 1차 생성율(%) 2차 생성율(%) 평균(%) 억제율(%)
control 100 100 100
Retinol(1㎎/㎖) 21.57 22.76 22.17 77.83

사화근액 (Brix 5)		 0.1% 90.4 91.13 90.77 9.23
0.2% 83.15 84.92 84.04 15.96
0.5% 65.56 71.93 68.75 31.25
1.0% 59.67 62.39 61.03 38.97

사화근효액
(Brix 5)		 0.1% 70.09 73.54 71.82 28.18
0.2% 59.83 55.80 57.82 42.18
0.5% 41.29 37.25 39.27 60.73
1.0% 38.79 34.83 36.81 63.19

삼화근효액
(Brix 5)		 0.1% 85.65 86.76 86.21 13.80
0.2% 80.79 81.29 81.04 19.00
0.5% 63.47 68.47 65.97 34.03
1.0% 57.39 60.17 58.78 41.22

이화근효액
(Brix 5)		 0.1% 86.97 87.26 87.12 12.89
0.2% 82.31 82.73 82.52 17.48
0.5% 64.73 69.73 67.23 32.77
1.0% 59.01 61.68 60.35 39.66
그 결과, 표 8에서 나타나는 바와 같이 양성 대조군인 Retinol(1㎎/㎖)을 이용하여 콜라게나제의 생성율을 확인하였고, 발효전인 사화근액과 발효 후인 사화근효액, 삼화근효액 및 이화근효액의 콜라게나제 생성율의 비교는 전체적으로 사화근액보다 농도 의존적으로 감소하는 결과를 보이며 특히, 사화근효액이 사화근액보다 현저하게 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 5 : 화장료 조성물의 피부 안전성 검사
실험예 1 내지 4를 통해 사화근효액이 삼화근효액 및 이화근효액보다 현저한 효과가 있음을 확인하였고, 이를 통해 사화근효액을 화장료 조성물로 포함하는 것이 적절하다고 판단하여 피부 안전성 검사를 실시하였다.
상기 표 1에 있는 실시예 3 및 비교예 3의 구성성분 및 함유량에 따라 화장료 조성물의 안전성을 확인하기 위하여 인체 피부 누적자극 시험을 실시하였다.
구체적으로, 건강한 20명의 성인을 대상으로 상기 실시예 3과 비교예 3 각각에 대해 위쪽 팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적 첩포 검사를 수행하였다. 상기 첩포 방법으로는 핀 챔버(Finn chamber) 방법이 이용되었으며, 챔버당 15㎕의 화장료 조성물을 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응도를 그 정도에 따라 ±, +, ++로 나누어 나타냈으며, 각각에 대하여 1점, 2점 및 4점(최고점수)을 부여하였다. 또한 하기 수학식에 따라 평균 반응도를 계산하였으며, 상기 반응도의 결과와 함께 하기 표 9에 나타내었다. 하기 표 9에서 평균 반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정된다. 하기 표 9에서 “-”는 해당하는 인원이 없음을 나타낸다.
[식 5]
Figure 112013016679557-pat00005


시험
물질		 반응이 나타난 피검자 수 평균 반응도
1주 2주 3주
1차 2차 3차 4차 5차 6차 7차 8차 9차
± + ++ ± + ++ ± + ++ ± + ++ ± + ++ ± + ++ ± + ++ ± + ++ ± + ++
실시예 3 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.00
비교예 3 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.00
피검인원 20 20 20 20 20 20 20 20 20
그 결과, 상기 표 9에서 알 수 있는 바와 같이 실시예 3 및 비교예 3 모두 누적자극 양상이 전혀 나타나지 않았다. 따라서 상기 사화근효액이 10% 함유된 화장료 조성물이 피부 안전성이 매우 우수함을 알 수 있다.
시험예 6 : 화장료 조성물의 인간 피부에 대한 미백 효과 측정
건강한 성인 남,녀 10명을 대상으로 피검자의 위쪽 팔뚝 부위에 직경 1.5㎝의 구멍 2개가 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5 ~ 2배 정도의 자외선을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다. 이어서, 색차계를 이용하여 흑화 된 피부의 명암(L1 : 피부가 어두울수록 그 값이 작아짐)을 측정하였다.
그 다음, 상기 실시예 3 과 비교예 3의 화장료 조성물을 상기 흑화 된 피부에 아침과 저녁 2회씩 2달 동안 매일 바르도록 하였다. 그 후, 색차계를 이용하여 상기 흑화 되었던 피부의 명암(L2)를 측정하였다. 상기 측정 결과를 토대로 하기 수학식을 이용하여 명암의 차이를 계산한 후, 각 피검자별 명암의 차이의 평균을 하기 표 10에 나타내었다.
[식 6]
Figure 112013016679557-pat00006

각 피검자별 L의 평균값
실시예 3 3.73
비교예 3 1.25
그 결과, 상기 표 10에서 알 수 있는 바와 같이 실시예 3을 2달간 사용한 부위의 평균 명암의 차이가 비교예 3을 2달간 사용한 부위의 평균 명암의 차이보다 약 2배 이상의 차이로 나타났다. 따라서 사화근효액을 10% 함유하고 있는 화장료 조성물의 미백효과가 매우 우수함을 알 수 있다.
시험예 7 : 화장료 조성물의 인간 피부에 대한 주름 개선 효과
30~40대 여성 20명을 2개의 조로 분류하고 실리콘을 이용하여 레플리카를 뜨고, 비지오메터(visiometer : SV500, Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용한 화상 분석을 통하여 각 조의 피검자의 피부 주름 깊이를 측정하였다. 또, 코네오메터(coneometer : CM820, Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 각 조의 피검자의 보습력을 측정하였다. 이어서, 상기 각 조별로 피검자에게 상기 실시예 3과 비교예 3에 따른 화장료 조성물을 제공하였다. 그리고 각 피검자에게 제공된 화장료 조성물을 매일 아침, 저녁으로 2회씩 1개월간 피부에 도포하도록 하였다. 1개월이 지난 후, 상기 각 조별 피검자의 피부 주름 깊이, 보습력을 측정하였다. 측정 결과를 이용하여 실시예 3과 비교예 3의 도포 전과 후의 평균 주름 감소율, 평균 보습력 증가율을 각각 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
평균 주름 감소율(%) 평균 보습 증가율(%)
실시예 3 35 86
비교예 3 13 45
그 결과, 상기 표 11에서 알 수 있는 바와 같이 사화근효액 10%가 함유된 실시예 3의 화장료 조성물에서 주름 감소율과 보습 증가율이 크게 높아짐을 알 수 있었다. 이로서 사화근효액을 함유한 화장료 조성물이 주름개선에 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (14)

  1. 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃 및 연근의 혼합추출물을 유산균으로 발효시킨 유산균 발효액을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 주름개선 효과를 갖는 화장료 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유산균 발효액은 항산화 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 항산화용 화장료 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 유산균 발효액은 주름개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 혼합추출물은 50 ~ 90% 에탄올로 추출하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.)인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 유산균 발효액을 호기성 발효하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 유산균 발효액은 기초화장료 제형, 색조화장료 제형, 헤어화장료 제형 및 바디화장료 제형으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  9. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유산균 발효액은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.01 ~ 10중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  10. 하기 단계를 통해 유산균 발효액을 제조하는 제조방법:
    a) 석류꽃, 석류나무뿌리(석류근), 접시꽃(촉규화), 촉규근, 매실꽃, 매실나무뿌리(매근), 연꽃 및 연근을 실온에서 침적하여 얻는 단계;
    b) 상기 a) 단계에서 얻은 식물을 각각 1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2의 중량비로 혼합하여 분쇄하는 단계;
    c) 상기 b)단계의 혼합물을 50 ~ 90% 에탄올로 혼합하여 추출하는 단계;
    d) 상기 c)단계에서 추출한 추출물을 농축하여 혼합추출물을 얻는 단계; 및
    e) 상기 d)단계의 혼합추출물에 유산균을 처리하여 유산균 발효액을 얻는 단계를 포함하는 유산균 발효액 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 e)단계의 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.)인 것을 특징으로 하는 유산균 발효액 제조방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 e)단계의 유산균은 엠알에스 배지(MRS medium)에 접종 후 진탕 배양기에서 배양 후 계대배양하는 것을 특징으로 하는 유산균 발효액 제조방법.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 e)단계의 유산균은 초기 균수를 107 ~ 109CFU/ml로 조절하는 것을 특징으로 하는 유산균 발효액 제조방법.
  14. 제 10항에 있어서, 상기 e)단계의 유산균 발효액은 1차 내지 3차 여과 하는 것을 특징으로 하는 유산균 발효액 제조방법.
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