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KR101434712B1 - 생물학적 활성 펩티드 - Google Patents

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KR101434712B1
KR101434712B1 KR1020107025687A KR20107025687A KR101434712B1 KR 101434712 B1 KR101434712 B1 KR 101434712B1 KR 1020107025687 A KR1020107025687 A KR 1020107025687A KR 20107025687 A KR20107025687 A KR 20107025687A KR 101434712 B1 KR101434712 B1 KR 101434712B1
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Abstract

(i) WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 1); 또는 (ii) WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 1) 내의 1, 2, 3 또는 4 L-아미노산 치환을 포함하는 변이체 아미노산 서열; 또는 (iii) (i) 및 (ii) 부분 중 하나의 펩티드 또는 펩티드 유도체의 레트로-인버소 변이체를 포함하고, 상기 펩티드 또는 펩티드 유도체가 응고촉진 활성을 갖는 펩티드 또는 펩티드 유도체. (i) imfwydcye을 포함하는 아미노산 서열; 또는 (ii) imfwydcye 내에 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 아미노산 치환을 포함하는 변이체 아미노산 서열을 포함하고, 여기에서 상기 펩티드 또는 펩티드 유도체가 응고촉진 활성을 가지는 펩티드 또는 펩티드 유도체.

Description

생물학적 활성 펩티드{BIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDES}
본 출원은 각각이 본원에 그 전체로서 참고문헌으로 도입된 2008.4.17에 출원된 미국 가특허출원 제61/009,326호 및 2008.11.10에 출원된 미국 가특허출원 제61/113,055호의 우선권을 주장한다.
본 발명은 FV, FVII, FVIII, FX 및/또는 FXI 결핍증을 갖는 환자의 치료를 위한 응고촉진 활성(procoagulant activity)을 갖는 저분자량 펩티드에 관한다.
혈액 응고 캐스케이드(coagulation cascade)는 일련의 세린 프로테아제 효소(효소원) 및 단백질 보조인자를 포함한다. 필요한 경우, 불활성 효소원 전구체는 활성 형태로 전환되고, 결과적으로 다음 효소를 캐스케이드로 전환한다. 이는 3 개의 분별가능한 단편으로 나누어진다; 내생적(접촉 활성화), 외인성(조직 인자), 및 공통의 경로.
캐스케이드의 내생적 경로에서, 혈우병은 가장 현저한 출혈 질환이고, 이는 불충분한 혈전의 형성을 야기하는 인자 FIX (FIXa)/인자 VIIIa (FVIIIa) 복합체(내생적 점성 복합체)에 의한 인자 Xa의 불충분한 발생을 야기한다. 출혈은 그 후 자동적으로 또는 부상 후에 일어날 수 있다.
혈우병은 유전된 출혈 질환이고 두 가지 형태의 혈우병, 혈우병 A 및 B가 공지되어 있다. 혈우병 A는 FVIII의 결핍증의 결과이고 관절 및 근육 내부로의 대출혈에 의해 특징지어진다. FVIII는 매우 저농도로 혈장 내에서 순환하고, 비-공유적으로 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 결합된다. 지혈 동안, FVIII는 트롬빈에 의해 활성화되고, vWF로부터 분리되고, 활성화 속도를 증가시킴에 의해 활성화된 FIXa-매개된 FX 활성화를 위한 보조인자로서 작용한다.
정상 FVIII 1 % 미만을 갖는 환자들은 중증 혈우병을, 1-5 %를 갖는 경우 약한 중증 혈우병, 5 % 초과이나 40 % 미만을 갖는 경우 경미한 혈우병을 갖는다고 여겨진다.
요즘은 혈우병 A의 관리를 위한 치료의 선택이 각종 혈장 유래 또는 재조합 FVIII 농축액을 사용한 대체 요법이다. 비록 용매-세제 처리 또는 액상 가열 처리를 포함하는 특이적 바이러스성-불활성화 단계가 바이러스를 불활성화시키는데 사용가능하지만, 혈장 유래된 농축액 내의 잘 특성화되지 않은 제제(예컨대, 프리온)의 가능한 전파가 여전히 당 업계에서 논의되는 논점이다.
FVIII는 출혈 질환에서 치료적 용도를 위한 재조합 단백질로서 또한 합성된다. 이러한 상품은 바이러스성 오염의 위험을 저하시킨다. 혈우병 A의 치료를 위한 많은 재조합 제품들이 시장에 나와있다. 이들 농축액 중의 하나는 애드베이트(Advate)® FVIII 조성물이며, 이는 CHO-세포 내에서 생산되고 백스터 헬스케어 코포레이션(Baxter Healthcare Corporation)에 의해 제조된다. 인간 또는 동물 혈장 단백질은 세포 배양 과정, 정제 또는 이러한 생성물의 최종 제형에 첨가되지 않는다.
비록 FVIII의 생산 과정에서, 순도, 효능 및 바이러스성 안전을 보장하기 위한 진전이 지난 수십년간 이루어져 왔지만, 일부 제한이 남아있다. 먼저, 중증 혈우병 A 환자들은 종종 항-FVIII 억제제 항체 형성에 의해 영향을 받아, 치료를 무효화시킨다.
중증 HA를 갖는 약 30 %의 환자들이 FVIII을 중성화시킬 수 있는 동종항체 억제제를 발달시킨다. (문헌[Hay, Haemophilia 2006;12 Suppl 6:23-9; Peerlinck and Hermans, Haemophilia 2006; 12:579-90]). 이들 억제제들은 통상적으로 보체를 고정하지 않고, 순환 면역 복합체와 함께 관찰되는 말단-기관 손상을 야기하지 않는, 우세하게는 IgG4 하위집단의 면역글로불린 G(IgG)이다. 이들 억제제들은 어린 나이(10 살에 약 50 %)에, 주로 1 % 미만의 FVIII을 갖는 환자에서 발생한다. 또한, 후천성 혈우병이 발생할 수 있고, 이는 FVIII 결핍증의 병력이 없는 사람에서의 FVIII 항체 억제제의 발달이다. 이러한 질병은 특발성(50 세 초과의 사람에서 발병)이고, 콜라겐 혈관 질병 또는 출산 주기와 관련될 수 있거나, 또는 이는 약물 반응(예컨대, 페니실린에 대한)을 나타낼 수 있다. 임상적인 목적을 위해서, 항체 반응의 크기는 베데스다 유닛(Bethesda unit)(BU) 억제제 역가가 획득될 수 있는 관능적인 억제제 분석법의 수행을 통해 정량화될 수 있다. 혈전증 및 지혈의 국제 사회(ISTH:The International Society of Thrombosis and Haemostasis)의 높은 역가 반응의 정의는 5 BU 초과이고, 이의 낮은 역가 반응의 정의는 0.5 내지 5 BU 사이이다.
많은 용량의 인간 FVIII을 사용하여 억제제를 압도하기 위한 시도가 시도되어왔다. 인간 FVIII 항체와 낮은 교차-반응성을 갖는 돼지의 FVIII 또한 투여되어왔다. 더욱 빈번하게는, 활성화된 프로트롬빈 복합체 농축액(예컨대, FEIBA(인자 8 억제제 바이패싱제))을 포함하는 FVIII-바이패싱제(bypassing agent) 및 재조합 활성 인자 FVII (FVIIa) 또한 사용되었다.
억제제 발달의 결점에 더하여 치료학적 폴리펩티드 약물, 예컨대, FVIII는 또한 단백질 분해 효소에 의해 신속하게 분해되기 때문에, FVIII는 빈번하게 정맥으로 투여되어야 했다. 순환에서의 각종 FVIII 생성물의 평균 반감기를 고려하면, 이는 일주일에 2 내지 3 번의 FVIII를 줌으로써 일반적으로 달성될 수 있었다. 따라서 이러한 치료는 오히려 외래 환자 집단, 특히 어린 아이들에게 복잡했다.
따라서 현재 FVIII의 많은 제조업자들의 목적은 증가된 약역학적 및 약물동력학적 성질을 가지면서 모든 다른 생성물 특징들을 유지하는 다음 세대 생성물을 개발하는 것이다. 더 긴 순환 반감기를 갖는 개선된 폴리펩티드 약물이 필요한 투여의 수를 감소시킬 것이고, 폴리펩티드 약물의 화학적 또는 효소적 변형은 이러한 목표를 달성하기 위한 바람직한 접근법 중의 하나이다.
이러한 하나의 예는 그들의 약역학적 및 약물동력학적 프로파일을 보호하고 개선시키는 폴리펩티드 약물의 페길화이다.(문헌[Harris and Chess, Nat Rev Drug Discov. 2003;2:214-21]) 미국 제6,037,452호는 폴리(알킬렌 옥시드)-FVIII 또는 FIX 접합체를 설명하고, 여기에서 단백질은 폴리(알킬렌 옥시드)에 상기 FVIII의 카르보닐기를 통해 공유적으로 결합한다.
이들 방법들이 억제제 발달을 감소시키지만, 이들은 여전히 정맥으로의 투여에 대한 필요를 없애지 못한다. 상술한 혈우병 치료의 결점의 대부분을 구식으로 만드는 가장 품격있는 선택사항은, 저분자량 화합물, 예컨대, 응고를 개선할 수 있는 역량을 가지고, 비-정맥내 경로에 의해 투여될 수 있는 펩티드(펩티드-모방체)의 개발일 것이다. 비록 다년간 논의되었지만(예컨대, 문헌[Kaufman and Pipe, Haemophilia 1998;4.370-9; Llung, Thromb Haemost. 1999;82:525-30]), 현재 입수가능하거나, 임상적으로 개발된 이러한 제제는 없다.
혈액 응고에서의 작은 펩티드의 사용을 위한 당 업계의 현재 상태는 하기의 문헌에 의해 예시로서 기록된다:
문헌[DK Liles, DM Monroe and HR Roberts (1997) Blood Vol 90 No 10 Supplement 1, 463a]은 인지질 표면 위의 FIXa 중재된 FX의 활성화를 촉진시킬 수 있는 FVIII로부터의 펩티드 698-712을 개시하는 포스터 초록이다. 그러나, FVIIIa의 존재 하에, 펩티드는 인지질 표면 위의 FIXa 중재된 FX의 활성화를 억제한다. 지금까지, 이 포스터 초록에 개시된 결과를 확인시켜주는 이들 작가들에 의한 동업자가 평가한 발행물은 없었다.
문헌[Blostein et al (2000) Biochemistry 39:12000-12006]은 양친매성 알파 헬릭스들이 FIXa GIa 영역과 상호작용할 수 있고, 인지질의 부재 하에서 FX의 활성화를 증가시킬 수 있다는 것을 개시한다. 펩티드는 인지질을 모방함에 의해 아미노산 서열과 독립적으로 작용하는 것으로 나타났다. 치료에 이러한 펩티드를 사용하는 것에 대한 시사는 없다. 정상 조건 하에서, 활성화된 혈소판은 응고를 지지하는 지질 [O]표면을 제공한다. 혈소판들이 혈관성 부상의 지점에서 형성된 트롬빈에 의해서 활성화되기 때문에, 응고 과정은 부상 지점에 한정된다. 신체에 응고촉진 지질의 일반적인 대체물인 펩티드를 제공하는 것은 이것이 전신적인 응고 를 야기하고 궁극적으로 파종성 혈관내 응고(DIC)를 야기할 수 있기 때문에 매우 적절하지 않다. 따라서, 블로스테인(Blostein)에 의해 설명된 펩티드는 치료에서 유용하지 않을 수 있다.
미국 특허 제7,109,170호 및 제6,624,289호는 FVIIIa과 상호작용하는 FIXa 프로테아제 영역의 부위를 개시한다. 펩티드는 FIXa의 FVIIIa 결합 지점을 포함하고 FVIIIa에 대한 FIXa의 결합을 억제한다. 그러나, 이들은 혈전증을 예방 또는 치료하기 위한 항응고제로서만 유용하다.
US20010014456A1는 인간 FVIII 및 FVIII-유사 단백질을 위한 결합 분자를 개시한다. 이들 폴리펩티드는 FVIII 및/또는 FVIII-유사 폴리펩티드를 결합하고, 혈액 또는 컨니셔닝된 매질과 같은 용액으로부터의 인간 FVIII 및/또는 FVIII-유사 폴리펩티드의 검출 및 정제에 유용하다.
미국 특허 제7,033,590호에서 FIX/FIXa 활성 항체 및 항체 유도체들은 FIXa의 아미돌리틱(amidolytic) 활성은 증가시키는데 및 혈우병 A 및 출혈 소질과 같은 혈액 응고 장애를 치료하는데 사용된다.
미국 특허 제7,084,109호에서 FVIIa 길항제가 개시된다. 이들 길항제는 FVIIa 활성을 억제하는 펩티드이고 혈전용해제 치료와 함께 동맥 혈전증의 예방에 유용하다고 말해진다.
본 명세서 내의 선행-공개 문헌의 나열 또는 논의가 반드시 문헌이 당 업계의 상태 또는 일반적인 지식의 일부라는 것에 대한 확인으로서 받아들여지는 것은 아니다.
당업계에는 혈우병 A(FVIII 결핍증)을 가진 환자의 치료를 위한 응고촉진 활성을 가진 저분자량 펩티드에 대한 거대한 수요가 남아있다. 본 발명은 혈우병 A의 비-정맥내 치료에 사용될 수 있는 응고촉진 활성을 갖는 신규한 저분자량 펩티드를 제공한다. 본 예방법은 또한 FV, FVII, FX 및/또는 FXI의 결핍증의 치료를 위한 신규한 펩티드를 제공한다.
본 발명의 제1 측면은 (i) WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 1); 또는
(ii) WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 1) 내의 1, 2, 3 또는 4 L-아미노산 치환을 포함하는 변이체 아미노산 서열; 또는
(iii) (i) 및 (ii) 부분 중 하나의 펩티드 또는 펩티드 유도체의 레트로-인버소(retro-inverso) 변이체를 포함하고, 상기 펩티드 또는 펩티드 유도체가 응고촉진 활성을 갖는 펩티드 또는 펩티드 유도체를 제공한다.
확실히 하기 위해, 서열 WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 1)은 아미노산에 대한 세 글자 코드를 사용하여 L-아미노산 Trp-Asp-Leu-Tyr-Phe-Glu-Ile-Val-Trp으로 나타내어질 수 있다. WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 1)의 레트로-인버소 변이체는 wviefyldw이고 D-아미노산을 포함한다.
본 발명의 제2 측면은 (i) imfwydcye을 포함하는 아미노산 서열; 또는
(ii) imfwydcye 내에 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 아미노산 치환을 포함하는 변이체 아미노산 서열을 포함하고, 여기에서 상기 펩티드 또는 펩티드 유도체가 응고촉진 활성을 가지는 펩티드 또는 펩티드 유도체를 제공한다.
확실히 하기 위해, 서열 cimfwydcye은 아미노산에 대한 세 글자 코드를 사용하여 D-아미노산 ile-met-phe-trp-tyr-asp-cys-tyr-glu로 나타내어질 수 있다.
본 발명의 제3 측면은 본 발명의 제1 또는 제2 측면에 규정된 추가적인 펩티드 또는 펩티드 유도체에 접합된 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체를 포함하고, 여기에서 두 개의 펩티드/유도체는 서로에 대해 동일하거나 상이할 수 있는, 응고촉진 활성을 가진 이중 펩티드를 제공한다.
본 발명의 제4 측면은 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체 또는 본 발명의 제3 측면의 이중 펩티드를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 제5 측면은 FV, FVII, FVIII, FX 및/또는 FXI의 결핍증을 가진 환자를 치료하기 위한 본 발명의 제3 측면의 이중 펩티드 또는 제1 또는 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체를 제공한다.
본 발명의 제6 측면은 환자에서 FV, FVII, FVIII, FX 및/또는 FXI의 결핍증의 치료를 위한 약의 제조에 있어서 본 발명의 제3 측면의 이중 펩티드 또는 제1 또는 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체의 용도를 제공한다.
본 발명의 제7 측면은 제4 측면의 제약학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 FV, FVII, FVIII, FX 및/또는 FXI의 결핍증을 가진 환자의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 제8 측면은 응고촉진 활성을 가지고, 펩티드 또는 펩티드 유도체가 FVIII 또는 그의 단편이 아니고, 상기 응고촉진 활성이 규정된 내생 트롬빈 발생 분석법(Defined Intrinsic Thrombin Generation Assay)에서 100 mU/mL 인자 8 억제 바이패싱 활성(FEIBA:Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity) 이상, 바람직하게는 300 mU/mL FEIBA 이상, 더욱 바람직하게는 900 mU/mL FEIBA 이상, 가장 바람직하게는 1200 mU/ml FEIBA 이상의 그것과 등가인 25, 50 또는 100 μM의 펩티드, 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드의 트롬빈 발생 시간인 펩티드 또는 펩티드 유도체를 제공한다.
본 발명의 제9 측면은 응고촉진 활성을 가지고, 펩티드 또는 펩티드 유도체가 FVIII 또는 그의 단편이 아니고, 상기 응고촉진 활성이 규정된 내생 트롬빈 발생 분석법에서 30 분 이내, 바람직하게는 15 분 이내 및 가장 바람직하게는 10 분 이내에서 정점인 25, 50 또는 100 μM의 펩티드, 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드의 트롬빈 발생 시간인 펩티드 또는 펩티드 유도체를 제공한다.
본 발명의 제10 측면은 응고촉진 활성을 가지고, 펩티드 또는 펩티드 유도체가 FVIII 또는 그의 단편이 아니고, 중증 인간 혈우병 A의 동물 모델에 투여된 경우 생물학적 활성 FVIII의 부재를 적어도 부분적으로 보상할 수 있는 펩티드 또는 펩티드 유도체를 제공한다.
도 1: 규정된 이중-경로 트롬빈 발생 분석법에서의 트롬빈 피크 시간 및 피크 트롬빈 발생에 미치는 혈우병의 치료를 위해 허가된 치료제의 효과.
도 2: FVIII -/- 생쥐 출혈 모델에 미치는 A01 효과-혈액 손실.
본 발명의 범위 내의 용어 "아미노산"은 모든 자연발생적인 L α-아미노산을 포함하도록 의도된다. 자연발생적인 아미노산에 대한 하나 및 세 글자 약어가 본원에서 사용된다.(문헌[Lehninger, Biochemistry, 2d ed., Worth Publishers, New York, 1995: 71-92] 참고) 용어 "아미노산"은 또한 입체이성질체(예컨대, D-아미노산) 및 자연발생적인 아미노산의 변형물, 비-단백질성 아미노산 및 아미노산을 모방하게 설계된 구조물을 포함한다.
변형되고 비-단백질성인 아미노산은 일반적으로 문헌[Grant, Synthetic Peptides: A User's Guide, Oxford University Press, 1992]에 설명된다.
예컨대, 자연발생하지 않는 각종 아미노산의 도입 또는 본원에서 설명된 아미노산의 변형에 의한 향상된 안정성 및 가용성, 프로테아제 분해에 대한 저항성 및 펩티드의 활성을 제공하는 것이 가능하다.
비-단백질성 아미노산은 β-알라닌 (β-Ala), 노르발린 (Nva), 노르류신 (Nle), 4-아미노부티르산 (γ-Abu), 2-아미노이소부티르산 (Aib), 6-아미노헥산산 (ε-Ahx), 오르니틴 (orn), 히드록시프롤린 (Hyp), 사르코신, 시트룰린, 시스테인산 (Coh) 및 시클로헥실알라닌, 메티오닌술폭시드 (Meo), 메티오닌술폰 (Moo), 호모세린메틸에스테르 (Hsm), 프로파르길글리신 (Eag), 5-플루오로트립토판 (5Fw), 6-플루오로트립토판 (6Fw), 3',4'-디메톡시페닐-알라닌 (Ear), 3',4'-디플루오로페닐알라닌 (Dff), 4'-플루오로페닐-알라닌 (Pff), 1-나프틸-알라닌 (1Ni), 1-메틸트립토판 (1 Mw), 페니실아민 (Pen), 호모세린 (HSe)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 이러한 아미노산은 α-아미노 이소부티르산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신 (Phg), 벤조티에닐알라닌 (Bta), L-호모-시스테인 (L-Hcys), N-메틸-페닐알라닌 (NMF), 2-티에닐알라닌 (Thi), 3,3-디페닐알라닌 (Ebw), 호모페닐알라닌 (Hfe), s-벤질-L-시스테인 (Ece) 또는 시클로헥실알라닌 (Cha)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이들 및 기타 비-단백질성 아미노산은 D- 또는 L-이성질체로서 존재할 수 있다. 이성질체의 표시가 주어지지 않은 경우, L-이성질체를 의도한다.
아미노산을 모방하도록 설계된 구조물은 아미노산의 아미노 및/또는 카르복실기가 다른 기에 의해 대체된 화합물이다. 비제한적인 예시는 티오아미드, 요소, 티오우레아, 아실히드라지드, 에스테르, 올레핀, 슬폰아미드, 인산 아미드, 케톤, 알콜, 보론산 아미드, 벤조디아제핀 및 기타 방향족 또는 비-방향족 헤테로사이클(검토를 위해, 문헌[M. A. Estiarte, D. H. Rich in Burgers Medicinal Chemistry, 6th edition, volume 1 , part 4, John Wiley & Sons, New York, 2002] 참고)이다. 이들 구조물이 펩티드 유도체에 포함된다면, 이들은 일반적으로 아미드 결합 대신에 하나 이상의 상술한 관능기로 나머지 펩티드 유도체에 연결된다.
"펩티드"란, 아미노산 잔기가 펩티드(-CO-NH-) 연결에 의해 연결된 분자 뿐만 아니라, 펩티드 결합이 역전된 분자도 포함한다. "레트로 변형된 " 펩티드는 아미노산 잔기가 레트로 변형된 원생 펩티드에 대하여 대향하는 방향으로 결집된 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 원생 펩티드가 L-아미노산을 포함하는 경우, "레트로 변형된" 펩티드는 또한 L-아미노산을 포함할 것이다. 그러나, 원생 펩티드가 D-아미노산을 포함하는 경우, "레트로 변형된" 펩티드는 D-아미노산을 포함할 것이다. 레트로 펩티드는 CO-NH 펩티드 결합 대신에 NH-CO 결합을 함유한다. "인버소 변형된" 펩티드는 아미노산 잔기가 인버소 변형된 것에 대하여 원생 펩티드와 같은 방향으로 결집되었으나, 아미노산의 키랄성은 도치된 펩티드이다. 따라서, 원생 펩티드가 L-아미노산을 포함하는 경우, "인버소 변형된" 펩티드는 D-아미노산을 포함할 것이다. 원생 펩티드가 D-아미노산을 포함하는 경우, "인버소 변형된" 펩티드는 L-아미노산을 포함할 것이다. 인버소 펩티드는 여전히 CO-NH 펩티드 결합을 가진다. "레트로-인버소 변형된" 펩티드는 레트로-인버소 변형된 원생 펩티드에 대하여 도치된 키랄성을 가지고 대향된 방향으로 결집된 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드를 지칭한다. 레트로-인버소 유사체는 역전된 종단부 및 펩티드 결합의 역전된 방향(즉, NH-CO)을 가지며, 대략적으로 원생 펩티드 서열과 같은 측쇄의 위상을 유지한다. 문헌[Guichard et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:9765-9769]은 천연 L-펩티드 IRGERA의 구조 및 항원 활성을 모방하나 D- 및 레트로 펩티드의 그것을 모방하지 않는 레트로-인버소 펩티드를 설명한다. 이러한 레트로-인버소 펩티드유사체(peptidomimetic)는 당업계에 알려진 방법, 예컨대, 이를테면 본원에 참고문헌으로 도입된 문헌[Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237]에 설명된 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 부분적인 레트로-인버소 펩티드 유사체는 서열의 일부만이 역전되고 거울상이성질체성 아미노산 잔기로 대체된 폴리펩티드이다. 이러한 유사체를 만드는 과정은 문헌[Pessi, A., Pinori, M., Verdini, A. S. & Viscomi, G. C. (1987) "Totally solid phase synthesis of peptide(s)- containing retro-inverted peptide bond, using crosslinked sarcosinyl copolymer as support", European Patent 97994-B]에 설명된다.
종래에는, L-아미노산은 대문자를 사용하여 표시되었고, D-아미노산은 소문자로 표시되었다. 본 발명의 펩티드 및 펩티드 유도체는 그들의 바람직한 형태로 표시되지만, 그들을 바람직한 형태로 제한하지는 않는다. 본 발명의 제1 측면의 펩티드는 WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 1) 또는 그의 변이체를 포함하는 것으로 표시된다. 본 발명의 제1 측면의 펩티드는 또한 WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 1)의 레트로-인버소 변이체 또는 그의 변이체, 즉, wviefyldw 또는 그의 변이체일 수 있다. 본 발명의 제2 측면의 펩티드는 cimfwydcye 또는 그의 변이체를 포함하는 것으로 표시된다.
종래에는, 아미노산이 펩티드 결합에 의해 연결되는 경우, 펩티드는 N-말단부에서의 아미노산이 왼쪽에 그리고 C-말단부에서의 카르복실기가 오른쪽에 나타나도록 나타내졌다. 본 발명에 따른 펩티드 및 펩티드 유도체는 이러한 방식으로 나타내어진다.
"펩티드 유도체"는 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 링커 기(linker group) 또는 다른 공유적으로 연결된 기의 변형물을 함유한다.
유도체의 예시가 아미노 말단 또는 다른 자유 아미노기의 N-아실 유도체, 카르복실 말단 또는 다른 자유 카르복실 또는 히드록실기의 에스테르, 암모니아와 또는 적절한 아민과 반응하여 생성된 카르복실 말단 또는 다른 자유 카르복실기의 아미드, 글리코실화 유도체, 히드록실화 유도체, 뉴클레오티딜화 유도체, ADP-리보실화 유도체, 페길화 유도체, 포스포릴화 유도체, 친유기성 부분에 접합된 유도체, 및 항체 또는 기타 생물학적 리간드에 접합된 유도체를 포함한다. 또한 화학적 유도체들 중에서 포함되는 것은 펩티드 결합 -CO-NH-의 변형에 의해, 예컨대, -CH2-NH-로의 환원 또는 -CO-N(알킬)-로의 알킬화에 의해 획득된 것들이다.
바람직한 유도체화(derivatisation)는 C-말단 아미드화이다. 펩티드의 C-말단 아미드화는 C-말단의 음성 전하를 제거한다. C-말단 아미드를 갖는 펩티드 유도체는 C-말단에서 "NH2"로, 예컨대, Ac-WDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 1)로 나타내어진다. 다른 바람직한 유도체화는 N-말단 아세틸화이다. 이는 N-말단에서 양성 전하를 제거한다. 예컨대, C-말단 아미드화 또는 N-말단 아세틸화에 의한 C- 또는 N- 말단의 차단은 외부단백분해성(exoproteolytic) 소화에 대한 감소된 감수성에 기인하여 단백질분해 안정성을 향상시킬 수 있다.
적절한 링커는 가요성 링커 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민(Ttds), 글리신, 6-아미노헥산산, 베타-알라닌, 또는 Ttd, 글리신, 6-아미노헥산산 및 베타-알라닌의 조합을 포함한다.
본 발명의 펩티드는 화학적 합성법, 재조합 DNA 기술, 거대 분자의 생화학적 또는 효소적 단편화, 상술한 것의 조합에 의해 또는 임의의 기타 방법에 의해 생산될 수 있다.
펩티드(적어도 아미노산 잔기 간의 펩티드 연결을 함유하는 것들)는 문헌["Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach", edited by W.C.Chan, P. D. White, Oxford University Press, New York 2000] 및 그의 참고문헌에 설명된 고체상 펩티드 합성의 Fmoc 전략에 의해 합성될 수 있다. 일시적인 N-아미노기 보호는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 기에 의해 제공된다. 이 고도의 염기-불안정성 보호기의 반복적인 절단은 N,N-디메틸포름아미드 내의 20 % 피페리딘을 사용하여 결과된다. 측쇄 관능기들은 그들의 부틸 에테르(세린, 트레오닌 및 티로신의 경우), 부틸 에스테르(글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부틸옥시카르보닐 유도체(리신 및 히스티딘의 경우), 트리틸 유도체(시스테인, 아스파라진 및 글루타민의 경우) 및 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐 유도체(알지닌의 경우)로서 보호될 수 있다. 고체상 지지체는 3 개의 단량체 디메틸아크릴아미드(골격-단량체), 비스아크릴로일에틸렌 디아민(교차 링커) 및 아크릴로일사르코신 메틸 에스테르(관능화제)로 구성된 폴리디메틸-아크릴아미드 중합체에 기반한다. 사용된 펩티드-에서-수지 절단가능하게 연결된 제제(cleavable linked agent)는 산-불안정성 4-히드록시메틸-페녹시아세트산 유도체이거나, C-말단 아미드의 경우 링크-아미드 링커(Rink-amide linker)이다. 역전된 N,N-디시클로헥실-카르보디이미드/1-히드록시벤조트리아졸 매개된 커플링 과정을 사용하여 첨가되는 아스파라긴 및 글루타민을 예외로 한 모든 아미노산 유도체는 그들의 사전형성된 대칭성 무수물 유도체로서 첨가된다. 모든 커플링 및 탈보호 반응은 닌히드린, 트리니트로벤젠 술폰산 또는 이소틴 시험 과정을 사용하여 모니터링된다. 합성이 완결되면, 펩티드는 50 % 스캐빈저 혼합물을 함유한 95 % 트리플루오로아세트산으로 처리하여 측쇄-보호기의 수반되는 제거와 함께 수지 지지체로부터 절단된다. 통상적으로 사용되는 스캐빈저는 에탄디티올, 페놀, 아니졸 및 물이고, 정확한 선택은 합성되는 펩티드의 구성성분 아미노산에 의존한다. 트리플루오로아세트산은 진공 하에서의 증발에 의해 제거되고 후속적인 디에틸 에테르에 의한 분쇄로 조 펩티드를 제공한다. 현존하는 임의의 스캐빈저는 수성 상의 동결건조시에 스캐빈저가 없는 조 펩티드를 제공하는 간단한 추출과정에 의해 제거된다. 펩티드 합성을 위한 시약은 일반적으로 칼바이오켐-노바바이오켐 (UK) 엘티디(Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK)로부터 입수가능하다. 정제는 크기 배제 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 용해도 차이 및 (주로) 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 기술의 임의의 하나 또는 조합에 의해 가능할 수 있다. 펩티드의 분석은 박막 크로마토그래피, 역상 고성능 액상 크로마토그래피, 산 가수분해 후의 아미노산 분석 및 고속 원자 충격(FAB:fast atom bombardment) 질량 분광 분석을 사용하여 수행될 수 있다.
잠재적으로 고심해볼 수 있는, SPOT-합성, 연속적 셀룰로스 막 상의 펩티드의 화학적 합성 또한 사용될 수 있다.(문헌[R Frank Tetrahedron (1992) 48, 9217])
고체상 펩티드 합성 기술에 대한 대안으로서, 펩티드는 또한 재조합 단백질 발현 또는 시험관 내 번역 시스템(문헌[Sambrook et al, "Molecular cloning: A laboratory manual", 2001, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY])에 의해 생산될 수 있다. 물론, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩가능한 자연-발생하는 펩티드 결합에 의해 연결된 자연 발생하는 아미노산 잔기를 함유한 펩티드만이다. 이러한 방법은 펩티드가 특히 거대한 경우, 예컨대, 50 아미노산보다 큰 경우, 또는 100 아미노산보다 큰 경우, 고체상 펩티드 합성 기술보다 바람직하다.
본 발명의 제1 측면에 대하여 규정된 "변이체" 아미노산 서열은 WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 1) 안에 하나, 둘, 셋 또는 네 개의 L-아미노산 치환을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 변이체 아미노산 서열은 X1X2X3YX4EX5X6X7(식 중, X1은 W, L 또는 P, X2는 D 또는 S, X3는 L 또는 F, X4는 F, Phg, L, Ebw, Pff, Thi, 1Ni, Hfe, Ece 또는 Cha, X5는 I 또는 F, X6는 S, V 또는 G 및 X7은 W 또는 L)(SEQ ID NO: 1)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
더욱 바람직하게는, 변이체 아미노산 서열은 X1X2X3YX4EX5X6X7(식 중, X1은 W 또는 L, X2는 D 또는 S, X3는 L 또는 F, X4는 F, Phg 또는 L, X5는 I 또는 F, X6는 S, V 또는 G 및 X7은 W 또는 L)(SEQ ID NO: 1)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 제2 측면에 대하여 규정된 "변이체" 아미노산 서열은 imfwydcye 안에 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
바람직하게는, imfwydcye 안의 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 이상의 상기 치환은 D-아미노산이다.
변이체 내부의 임의의 치환은 비보존성 또는 보존성일 수 있다.
"보존성 치환"이란, 다음의 기 내부의 치환을 의미한다: Val, Ile, Leu, Ala, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr, Gly, Ala; Lys, Arg, His; 및 Phe, Tyr, Trp.
바람직하게는, 본 발명의 제1 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체는 RMEFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 325) 또는 RMKFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 326); 또는 RMEFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 325) 또는 RMKFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 326)에서 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 개의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 아미노산 서열을 포함한다.
확실히 하기 위해서, 서열 RMEFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 325)은 아미노산을 위한 세 글자 코드를 사용하여 Arg-Met-Glu-Phe-Asp-Val-Trp-Asp-Leu-Tyr-Phe-Glu- Ile-Val-Trp (SEQ ID NO: 325)으로 나타내어질 수 있다. RMKFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 326)는 아미노산을 위한 세 글자 코드를 사용하여 Arg-Met-Lys-Phe-Asp-Val-Trp-Asp-Leu-Tyr-Phe-Glu-Ile-Val-Trp(SEQ ID NO: 326)으로 나타내어질 수 있다.
더욱 바람직하게는, 변이체 아미노산 서열은 X8X9X10FDVX1X2X3YX4EX5X6X7 (식 중, X8은 R 또는 P, X9는 M, Nva, Moo, N, Nle, Meo, Q, Eag, X10는 E, K 또는 D, X1은 W, L 또는 P, X2는 D 또는 S, X3는 L 또는 F, X4는 F, Phg, L, Ebw, Pff, Thi, 1Ni, Hfe, Ece, Cha, X5는 I 또는 F, X6는 S, V 또는 G 및 X7은 W 또는 L (SEQ ID NO: 2)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
더욱 바람직하게는, 변이체 아미노산 서열은 X8X9X10FDVX1X2X3YX4EX5X6X7 (식 중, X8은 R 또는 P, X9는 M 또는 Nva, X10은 E, K 또는 D, X1은 W 또는 L, X2는 D 또는 S, X3는 L 또는 F, X4는 F, Phg 또는 L, X5는 I 또는 F, X6은 S, V 또는 G 및 X7은 W 또는 L (SEQ ID NO: 2)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
적절하게는, 본 발명의 제1 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체는 하기의 표에 나타내어지는 바와 같은 펩티드 또는 펩티드 유도체이거나, 하기의 표 1 내지 3에 나타내어지는 바와 같은 펩티드 또는 펩티드 유도체의 아미노산 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진다.
가장 바람직한 펩티드
펩티드 서열
SEQ ID NO: 329 A01 Ac-RMKFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 330 A02 Ac-PMKFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 331 A03 Ac-RMDFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 332 A04 Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 333 A05 Ac-WDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 334 A06 Ac-WDLYFEIVWE
SEQ ID NO: 335 A07 Ac-WDLYFEIVW-ttds-E
SEQ ID NO: 336 A08 ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 337 A09 ERMEFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 338 A12 ERXEFDVWDLYFEIVW-NH2 X는 Nva
SEQ ID NO: 339 A13 ttds-RMEFDVWDLYXEIVW-ttds-NH2 X는 Phg
SEQ ID NO: 340 A14 Ac-WSLYFEIVWE
SEQ ID NO: 341 A15 Ac-WDLYFEISW-ttds-E
SEQ ID NO: 342 A16 PEG5000-RMKFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 343 A17 PEG5000-WSLYFEIVWE
SEQ ID NO: 344 A18 PEG5000-ERMEFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 345 A19 Ac-VWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 346 A21 Ac-FDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 347 A24 EWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 348 A25 E-ttds-WDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 349 A26 Ac-WDLYFEIVW-ttds-E-NH2
SEQ ID NO: 350 A27 Ac-RMEFDVWDLYFEIVW
SEQ ID NO: 325 A28 RMEFDVWDLYFEIVW
SEQ ID NO: 351 A29 Ac-K-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 352 A30 Ac-RMEFDVWDLYFEIVWK
SEQ ID NO: 353 A31 Ac-RMEFDVWDLYFEIVWK-NH2
SEQ ID NO: 354 A32 Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-K-NH2
SEQ ID NO: 355 A33 Ac-WDLYFEISWE
SEQ ID NO: 356 A34 Ac-WDLYLEIVWE
SEQ ID NO: 357 A35 Ac-WDLYFEIVLE
SEQ ID NO: 322 A38 WDLYFEIVW
SEQ ID NO: 358 A49 RMEFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 359 A50 Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 360 A52 Ac-KRMEFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 361 A53 K-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 362 A54 Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-K
SEQ ID NO: 363 A55 Ac-LDLYFEIVW-ttds-E
SEQ ID NO: 364 A56 Ac-WDLYFEIVL-ttds-E
SEQ ID NO: 365 A57 E-RMEFDVLDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 366 A58 E-RMEFDVWDLYFEIVL-NH2
SEQ ID NO: 367 A84 Ac-WDFYFEIVWE
SEQ ID NO: 368 A85 Ac-WDLYFEFVWE
SEQ ID NO: 369 A86 Ac-LDLYFEIVWE
SEQ ID NO: 370 A87 Ac-WDLYFEIGWE
SEQ ID NO: 371 A89 Ac-WDLYLEISLE
SEQ ID NO: 372 A90 Ac-WDLYXEIVLE X는 Phg
SEQ ID NO: 373 A91 Ac-WSLYXEIVWE X는 Phg
SEQ ID NO: 374 A92 Ac-LDLYFEIVLE
SEQ ID NO: 375 A93 Ac-LDLYFEISLE
SEQ ID NO: 376 A94 Ac-LDLYXEISWE X는 Phg
SEQ ID NO: 377 A95 Ac-LSLYFEIVWE
SEQ ID NO: 378 A96 Ac-LSLYFEIVLE
SEQ ID NO: 379 A97 Ac-LSLYFEISLE
삭제
삭제
바람직한 펩티드
펩티드 서열
SEQ ID NO: 380 A20 Ac-WDLYFEIVW-ttds-K
SEQ ID NO: 381 A22 Ac-DVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 382 A23 Ac-wviefyldwvdfkmr-NH2
SEQ ID NO: 383 A37 Ac-WDLYFEIVW
SEQ ID NO: 384 A39 Ac-ttds-WDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 385 A40 ttds-WDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 386 A41 Ac-WDLYFEIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 387 A42 Ac-ttds-WDLYFEIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 388 A43 ttds-WDLYFEIVW-ttds
SEQ ID NO: 389 A44 ttds-WDLYFEIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 390 A45 Ac-KWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 391 A46 Ac-K-ttds-WDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 392 A47 Ac-WDLYFEIVWK
SEQ ID NO: 393 A48 Ac-WDLYFEIVWK-NH2
SEQ ID NO: 394 A71 E-R(Moo)EFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 395 A73 E-RNEFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 396 A78 ttds-RMEFDVWDLY(Ebw)EIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 397 A83 ttds-RMEFDVWDLY(Pff)EIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 398 A88 Ac-PDLYFEIVWE
SEQ ID NO: 399 A98 Ac-LSLYLEIVLE
SEQ ID NO: 400 A99 Ac-LSLYLEISLE
SEQ ID NO: 401 A100 Ac-LSLYXEIVLE X는 Phg
SEQ ID NO: 402 A101 Ac-WDLYFEIVW-ttds-K-NH2
삭제
활성 펩티드
펩티드 서열
SEQ ID NO: 403 A10 E-PMKFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 404 A11 ttds-RMDFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 405 A16 PEG5000-RMKFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 406 A36 WDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 407 A51 KRMEFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 408 A59 ttds-PMKFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 409 A60 E-RMDFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 410 A61 (Coh)-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 411 A62 글루코실-아미노옥시아세틸-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 412 A63 Ac-P(Moo)KFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 413 A64 Ac-P(Nle)KFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 414 A65 Ac-PNKFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 415 A66 Ac-R(Moo)DFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 416 A67 Ac-R(Nle)DFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 417 A68 Ac-RNDFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 418 A69 ttds-R(Nle)EFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 419 A70 ttds-RNEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 420 A72 E-R(Nle)EFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 421 A74 E-R(Meo)EFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 422 A75 E-R(Gln)EFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 423 A76 E-R(Eag)EFDVWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 424 A77 ttds-RMEFDVWDLY(Thi)EIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 425 A79 ttds-RMEFDVWDLY(1Ni)EIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 426 A80 ttds-RMEFDVWDLY(Hfe)EIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 427 A81 ttds-RMEFDVWDLY(Ece)EIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 428 A82 ttds-RMEFDVWDLY(Cha)EIVW-ttds-NH2
SEQ ID NO: 429 A102 KWDLYFEIVW-NH2
SEQ ID NO: 430 A103 K-ttds-WDLYFEIVW-NH2
삭제
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상술한 표에서, -ttds-는 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민이다. "N"은 아스파라진이다. "NH2"는 C-말단 아미드기이다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체는 하기 목록에 나타내어진 펩티드를 포함하지 않거나 그로 구성되지 않는다.
Figure 112010074648699-pct00006
Figure 112010074648699-pct00007
Figure 112010074648699-pct00008
Figure 112010074648699-pct00009
바람직하게는, 본 발명의 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체는 다음을 포함한다:
(i) cimfwydcye을 포함하는 아미노산 서열; 또는
(ii) cimfwydcye 내의 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 일곱 아미노산 치환을 포함하는 변이체 아미노산 서열.
바람직하게는, cimfwydcye 내의 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 일곱 이상의 상기 치환이 D-아미노산이다.
바람직하게는, 본 발명의 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체는 cimfwydcye에 비교하여 7 이하의 아미노산 치환을 갖는 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(식 중, 존재하는 경우, X1은 c, s, y, i, D-Pen, C, t, D-Nva, D-Nle 또는 k, X2는 i, y, w 또는 d, X3는 c 또는 m, X4는 f, t, v 또는 c, X5는 w 또는 c, X6은 y 또는 c, X7은 d, e 또는 f, X8은 c, e, f, y 또는 d, X9는 y 또는 w 및 X10은 e 또는 i)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 펩티드 또는 펩티드 유도체는 X1X2X3X4wydX8ye(식 중, X1은 c, C, D-Pen 또는 s, X2는 l, y 또는 w, X3는 c 또는 m, X4는 f, t 또는 v 및 X8은 c 또는 e)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 펩티드 또는 펩티드 유도체는 X1X2mX4wydX8ye (식 중, X1은 c, C 또는 D-Pen, X2는 i 또는 y, X4는 f, t 또는 v 및 X8은 c 또는 e)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
적절하게는, 본 발명의 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체는 하기의 표에 나타내어지는 바와 같은 펩티드 또는 펩티드 유도체이거나, 하기의 표 4 내지 6에 나타내어지는 바와 같은 펩티드 또는 펩티드 유도체의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
[표 4]
가장 바람직한 펩티드
Figure 112010074648699-pct00010
바람직한 실시태양에서, 펩티드 B05, B06, B14, B15, B17, B18, B34, B35 및 B37은 환형이다.
[표 5]
바람직한 펩티드
Figure 112010074648699-pct00011
바람직한 실시태양에서, 펩티드 B26, B27, B28, B30, B31, B32, B33, B36, B38 및 B39은 환형이다.
[표 6]
활성 펩티드
Figure 112010074648699-pct00012
바람직한 실시태양에서, 펩티드 B01, B02, B11, B25 및 B29은 환형이다.
상술한 표에서, -TTDS-는 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민이다. "NH2"는 C-말단 아미드기이다.
B01과 동일하여 상기 표에서 B08은 상기 표에서 삭제된다. B02와 동일하여 상기 표에서 B12는 상기 표에서 삭제된다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체는 하기 목록에 나타내어진 펩티드를 포함하거나 그로 구성되지 않는다:
Figure 112010074648699-pct00013
바람직하게는, 본 발명의 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체는 환형 펩티드이다. 제1 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체도 또한 환형일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "환형 펩티드"는 예컨대, 종종 카르복실 말단 및 아미노 말단에서 고리화에 적절한 둘 이상의 추가적인 기가 첨가된 펩티드의 환형 유도체를 지칭한다. 적절한 기는 아미노산 잔기를 포함한다. 환형 펩티드는 분자내 디술피드 결합, 즉, --S--S--, 두 개의 첨가된 잔기 간의 분자내 아미드 결합, 즉, --CONH-- 또는 --NHCO--, 또는 분자내 S-알킬 결합, 즉, -S-(CH2)n--CONH- 또는 -NH-C0(CH2)n--S-- (식 중, n은 1, 2 또는 그 초과이고, 바람직하게는, 6 이하)를 함유할 수 있다. 고리화는 또한 문헌[Scharn, D. et al. (2001 ) J. Org. Chem 66;507]에 예시된 바와 같이 트리아진 화학에 의해 수행될 수도 있다. 환형 펩티드 서열은 펩티드 서열 앞의 접두사 "시클로"로 나타내어지고, 서열의 환형 부분은 괄호안에 도입되고, 추가적으로 하이픈에 의해 나머지 서열로부터 분리된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 대한 접합에 의해 변형될 수 있다. 페길화의 적절한 방법은 모두 페길화 방법이 본원에 참고문헌으로 도입된 미국 특허 제5,122,614호 (Zalipsky; Enzon, Inc.) 및 제5,539,063호 (Hakimi et al; Hoffmann-La Roche Inc.)에 개시된다. PEG의 각종 분자량, 적절하게는 5000 내지 40000 kD가 사용될 수 있다. 바람직한 분자량은 5000 kD이다. 바람직하게는, PEG는 단분산이고, 이는 PEG 분자들 간의 분자량의 변화가 거의 없다는 것을 의미한다. 페길화는 펩티드의 가용성 및 혈장 반감기를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 제3 측면은 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 추가적인 펩티드 또는 펩티드 유도체에 접합된 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체를 포함하고, 여기에서 펩티드 또는 펩티드 유도체는 추가적인 펩티드 또는 펩티드 유도체와 동일하거나 상이할 수 있고, 여기에서 이중 펩티드는 응고촉진 활성을 갖는 이중 펩티드를 제공한다.
이중 펩티드는 본 발명의 펩티드성, 펩티드유사성 또는 비펩티드성일 수 있는 가요성 링커에 의해 또는 입체형태적으로 속박된 펩티드성, 펩티드유사성 또는 비-펩티드성 빌딩 블록(building block), 예컨대, 트리아진 잔기를 포함할 수 있는 입체형태적으로 속박된 링커에 의해, 또는 당 업계에 알려진 임의의 기타 가능한 방법에 의해 서로에 대해 공유적으로 연결된 제1 또는 제2 측면의 동일한 둘의, 또는 상이한 둘의 펩티드 또는 펩티드 유도체를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체 및 본 발명의 제3 측면의 이중 펩티드는 0.5 내지 3.5 kD의 분자량을 가진다. "분자량"이란, 임의의 상대 이온 또는 첨가물을 배제한 펩티드 또는 펩티드 유도체의 단량체의 이론적 질량을 의미한다. 페길화된 펩티드에 대해, 분자량은 임의의 상대 이온 또는 첨가물을 배제하고 PEG 부분 또는 부분들을 배제한 단량체성 분자의 질량으로 규정된다. 0.5 kD 내지 3.5 kD의 펩티드, 펩티드 유도체 및 이중 펩티드는 거대한 펩티드에 비해서 용이하게 합성되고, 면역원성이 될 위험이 감소되고, 환자에 일반적으로 쉽게 투여된다. 0.5 kD 미만의 펩티드는 용이하게 합성되고 투여될 수 있고, 면역원성일 가능성이 더 적지만, 요구되는 응고촉진 활성을 가지지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 0.5 kD 미만이고 3.5 kD 초과의 펩티드, 펩티드 유도체 및 이중 펩티드는 그들이 적절한 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다.
본 발명의 제1 및 제2 측면의 펩티드 및 펩티드 유도체 및 본 발명의 제3 측면의 이중 펩티드는 응고촉진 활성을 갖는다.
"응고촉진 활성"이란, 적절한 시험 시스템 내에서 트롬빈 발생 및/또는 피브린 침착을 촉진할 수 있는 능력을 의미한다.
상이한 분석법들이 응고촉진 활성을 측정하기 위해 사용가능하다는 것이 이해될 것이다. 사실, 응고촉진 활성에는 상이한 타입이 있다. 펩티드 및 펩티드 유도체들은 FV, FVII, FVIII, FX 또는 FXI가 파괴된 혈장 내의 응고를 촉진할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 유도체는 FVIII가 파괴되거나 부재하는 혈장 내에서 트롬빈 발생 및/또는 피브린 침착을 촉진한다. 이러한 타입의 활성은 응집 FVlII 활성으로 지칭된다. FVIII가 결핍된 개인으로부터의 혈장인 경우, 활성은 통상적으로 FVIII 등가 활성으로 지칭된다. 혈장이 FVIII에 대항하는 억제제를 함유하는 경우, 활성은 통상적으로 FVIII 억제제 바이패싱 등가 활성으로 지칭된다. 기타 응고촉진 활성은 FV 활성, FVII 활성, FX 활성 및 FXI 활성을 포함한다.
상이한 종류의 분석법 사이에 개별적인 펩티드 및 펩티드 유도체는 그들의 상대적인 효능이 변화할 수 있다. 따라서, 펩티드 또는 펩티드 유도체가 특정 분석법에서 낮은 효능을 가지는 것으로 보이더라도, 그럼에도 불구하고, 이는 다른 분석법에서 적당하게 높은 수준의 응고촉진 활성을 가질 수 있다.
응고촉진 활성을 결정하기 위한 적절한 분석법은 하기에 설명된 규정된 내생 트롬빈 발생 분석법(Defined Intrinsic Thrombin Generation Assay)이다. 본 분석법에서, 화합물은 25, 50 또는 100 μM의 농도에서 60 분 안에, 바람직하게는 50, 40, 30, 20 또는 10 분 안에 5 nM 트롬빈의 생성을 자극할 수 있다면, 응고촉진 활성을 가지는 것으로 여겨진다. 바람직하게는, 이는 60 분, 더욱 바람직하게는 50, 40, 30, 20 또는 10 분 안에 10 nM 트롬빈의 발생을 자극할 수 있다. 대안적인 분석법은 하기에 설명되는 규정된 이중-경로 트롬빈 발생 분석법(Defined Dual-Pathway Thrombin Generation Assay)이다. 본 분석법에서, 25, 50 또는 100 μM의 농도에서 70 분 안에, 바람직하게는 60, 50, 40, 30 또는 20 분 안에 5 nM 트롬빈의 생성을 자극할 수 있다면, 응고촉진 활성을 가지는 것으로 여겨진다. 바람직하게는, 이는 70 분, 더욱 바람직하게는 60, 50, 40, 30 또는 20 분 안에 10 nM 트롬빈의 발생을 자극할 수 있다. 상기 분석법은 그들이 FVIII-파괴된 또는 억제된 혈장의 존재 하에 수행되기 때문에 응고 FVIII 활성을 측정하는데 특히 유용하다. 그러나, 이들은 적절한 파괴된 또는 억제된 혈장으로 FVIII-파괴된 또는 억제된 혈장을 치환하여 다른 종류의 응고촉진 활성을 시험하는데 용이하게 채용될 수 있다.
적절하게는, 응고촉진 활성은 100 mU/mL 이상의 인자 8 억제제 바이패싱 활성(FEIBA), 바람직하게는 300 mU/mL 이상 FEIBA, 더욱 바람직하게는 600 mU/mL 이상 FEIBA 및 가장 바람직하게는 1200 mU/mL 이상 FEIBA의 그것에 등가인 규정된 내생 트롬빈 발생 분석법 내에서 25, 50 또는 100 μM의 화합물의 트롬빈 발생 시간이다. 트롬빈 발생 시간 또는 피크 시간은 하기에 설명되는 분석법 내에서의 다른 성분에의 사전-가온된 혈장의 첨가로부터 트롬빈 최대 피크의 시간까지의 시간 간격이다.
다르게는, 응고촉진 활성은 1 mU/mL 이상의 인자 8 억제제 바이패싱 활성(FEIBA), 바람직하게는 5 mU/mL 이상 FEIBA, 가장 바람직하게는 10 mU/mL 이상 FEIBA에 등가인 규정된 이중-경로 트롬빈 발생 분석법(DDPTGA) 내에서 25, 50 또는 100 μM의 화합물의 트롬빈 최대 피크이다. 피크 IIa로도 칭해지는 트롬빈 최대 피크는 분석 동안 발생된 최대 트롬빈 농도이다. 규정된 이중-경로 트롬빈 발생 분석법은 적절한 인자 파괴된 혈장이 FVIII 결핍 또는 억제된 혈장에 대체되기만 한다면, FVIII 활성 이외의 응고 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드, 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드는 25, 50 또는 100 μM의 농도에서, 펩티드가 부재하는 경우에 자극되는 것보다 FV, FVII, FX 또는 FXI 결핍 혈장을 각각 120 분을 초과하여 사용한 DDPTGA 내의 더 많은 트롬빈의 발생을 자극할 수 있다면, FV, FVII, FX 또는 FXI 활성을 가지는 것으로 여겨진다.
적절하게는, 응고촉진 활성은 30 분 내에, 바람직하게는 15 분 내에, 그리고 가장 바람직하게는 10 분 내에 최대인 규정된 내생 트롬빈 발생 분석법 내의 25, 50 또는 100 μM의 화합물의 트롬빈 발생 시간이다. [0]다르게는, 응고촉진 활성은 50 분 안에, 바람직하게는 45 분 안에, 그리고 가장 바람직하게는 30 분 안에 최대인 규정된 이중-경로 트롬빈 발생 분석법 내의 25, 50 또는 100 μM의 화합물의 트롬빈 발생 시간이다.
트롬빈 발생 상의 펩티드 또는 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드의 효과는 FVIII 면역 억제된, FVIII 면역 파괴된, FVIII 억제제 환자 또는 혈우병 A 환자 혈장 또는 응고 인자 결핍 혈장의 기타 종류 내에서, 예컨대, 흑색 96-웰 마이크로플레이트(클리니플레이트(Cliniplate), 써모 렙시스템즈(Thermo Labsystems)) 내에서 트롬빈-특이적 형광 기판 I-1140(바켐)의 느린 절단을 연속적으로 모니터링해서 결정될 수 있다. 펩티드 또는 펩티드 유도체의 효과를 측정하는데 사용되는 트롬빈 발생 분석법에서 유용하게 측정될 수 있는 변수들은 피크 시간에서의 트롬빈 농도; 피크 트롬빈에서의 트롬빈 발생 시간; 트롬빈 발생 곡선의 전파 상의 기울기 및 트롬빈 발생(개시 상태)의 지연 시간이다.
트롬빈 발생의 내생적 경로는 FXIa 및 인지질을 포함함으로써 트롬빈 발생 분석법에서 분석될 수 있다. 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 시험에 유사한 이러한 분석법에서, 트롬빈 발생은 단지 내생적 경로만을 통해 지시되었고, FVIII 의존성이다. 적절한 분석법은 하기에 설명되는 규정된 내생 트롬빈 발생 분석법이다. 다르게는, FXIa 및 인지질 대신에 낮은 농도의 TF 및 인지질을 사용함으로써, 트롬빈은 외인성(조직 인자) 및 내생적 경로 모두에 의해서 발생된다. 이러한 트롬빈 발생 분석법의 형태는 두 가지 트롬빈 발생 경로가 연관되기 때문에 더 생리적인 것이다; 이는 부분적으로 FVIII 의존적이다. 적절한 분석법은 규정된 이중-경로 트롬빈 발생 분석법이다.
규정된 내생 트롬빈 발생 분석법은 다음과 같이 수행된다. 인간 혈장의 FVIII 활성은 40 ㎕의 인간 정상 혈장을 염소에서 길러진(600 BU/ml, 56 ℃에서 6시간 배양됨) 10 ㎕의 열 불활성화 항-인간 FVIII 혈장과 배양(2 시간, 37 ℃)하여 억제한다. FXIa (16.67 nM) (효소 연구 실험실(Enzyme Research Laboratories)) 및 인지질(포스파티딜콜린/포스파티딜-세린 60 %/40 %, 120 μM) (아반티 폴라 리피드(Avanti Polar Lipids))의 15 ㎕의 혼합물, 3.33 mM I-1140 및 50 mM CaCl2의 15 ㎕의 혼합물, 10 ㎕ 펩티드 용액(상이한 농도)를 10 ㎕ 2x HNa/HSA5 (50 mM Hepes, 350 mM NaCl, pH 7.35, 10 mg/ml HSA)를 첨가한다. 37 ℃에서의 배양 6 분 후에, 트롬빈 발생은 50 ㎕ 사전-가온된(37 ℃) FVIII-억제된 혈장의 첨가에 의해 시작되었다. FVIII-억제된 혈장 대신에, FVIII 억제제 환자 혈장 또는 수 개의 파손된 혈장이 사용될 수 있다. 마이크로-플레이트를 즉시 제니오스 플러스(GENios Plus)(테칸(Tecan)) 또는 사파이어 2 (테칸) 형광 판독기에 넣었고, 이어서 플레이트를 매 21 초마다 판독하여 역학적으로 형광 신호(ex 340 nm/em 440 nM)가 있었다. 원래의 형광 자료를 편차냄에 따라, 발생된 트롬빈의 양을 트롬빈의 농도 범위를 사용하여 구성한 표준 곡선으로부터 계산하였다.
활성의 계산을 위해, 등가 단위 실험을 인자 8 억제제 바이패싱제(FEIBA, 벡스터(Baxter) AG), 이뮤네이트(인간 FVIII, 정제된 혈장 유래) 기준 표준(벡스터 AG) 또는 리콤비네이트 표준(인간 FVIII, 정제된 재조합, 벡스터 AG)의 희석액으로 수행하였다. 피크 트롬빈에서의 트롬빈 발생 시간에 대해서 도시된 FEIBA (FVIII) 농도의 로그함수의 선형 피트(linear fit)는 표준 곡선을 생성하였다. 이 곡선으로, FEIBA (FVIII) 등가 활성이 규정된 펩티드 농도에 대해 계산된다.
펩티드 농도가 본원에 제시된 경우, 이는 최종 분석 부피(assay volume) 내의 펩티드의 농도가 아니고, 혈장 부피에 대해 보정된 농도라는 것이 이해될 것이다. 최종 분석 부피 내의 농도는 2.5로 나누어진 보정된 농도이다. 따라서, 100 μM의 농도가 주어지면, 최종 분석 부피 내의 실제 농도는 40 μM이다. 유사하게, FEIBA 등가 활성도 또한 혈장 부피에 대해 보정된다. 따라서, 만약 100 μM에서 펩티드가 DITGA 내에서 100 mU/ml FEIBA에 등가인 활성을 가진다고 제시되면, 최종 분석 부피 내의 펩티드의 농도는 40 μM이고, 대조군 분석 내의 FEIBA의 등가 농도는 40 mU/ml FEIBA이다.
규정된 이중-경로 트롬빈 발생 분석법은 상업적인 시험 키트(테크노트롬빈(Technothrombin) TGA, 테크노클론(Technoclone) 게엠베하, 비엔나, 오스트리아)를 사용하여 하기에 설명되는 바와 같이 수행된다. 간략히, 1.25 mM 형광발생 기질(Z-GGR-AMC) 18.75 mM CaCl2의 40 ㎕ 혼합물, 10 ㎕ TGA 시약 B(17.9 pM 재조합 인간 조직 인자를 함유하는 인지질 소포체 포스파티딜콜린/포스파티딜세린 80 %/20 % (3.2 μM); 테크노클론 게엠베하) 또는 10 ㎕ TGA 제제 C 하이(High)(71.6 pM 재조합 인간 조직 인자를 함유하는 인지질 소포체 포스파티딜콜린/포스파티딜세린 80 %/20 % (32μM); 테크노클론 게엠베하) 및 10 ㎕ 펩티드 희석액, FEIBA 기준 표준 또는 FVIIa 표준 희석액(효소 연구 실험실, 사우스 벤드, 인디아나 미국)을 37 ℃에서 4 분간 배양하였다. 바람직하게는, 시약 C 하이가 사용된다. 트롬빈 발생이 수 종류의 인간 혈장(37 ℃) 중의 하나의 40 ㎕의 첨가에 의해 시작된다. 트롬빈에 의한 형광발생 기질의 전환에 이어 즉시 플레이트를 사전가열된(37 ℃) 마이크로플레이트 형광물질 판독기(테칸 사파이어 2, ex 360 nm/em 460 nm) 내로 넣고, 플레이트를 매 30 초마다 역학적으로 판독하였다. 원래의 형광 자료를 편차냄에 따라, 발생된 트롬빈의 양을 트롬빈의 농도 범위를 사용하여 구성한 표준 곡선으로부터 계산하였다. 트롬빈 발생 곡선의 피크 트롬빈 또는 피크 트롬빈까지의 시간에 대해 도시된 인자 VIIa 또는 FEIBA 농도의 비선형 회귀 분석이 표준 곡선을 생성하였다. 이들 곡선들로, 인자 VIIa 또는 FEIBA 등가 활성이 규정된 펩티드 농도에 대해 계산될 수 있었다. DITGA에 대해 설명된 바와 같이, 본원에서 DDPTGA에 대하여 본원에서 펩티드 농도가 제시된 경우, 이는 최종 분석 부피의 펩티드의 농도가 아니고, 혈장 부피에 대해 보정된 농도라는 것이 이해될 것이다. 최종 분석 부피 내에서의 농도는 2.5에 의해 나누어진 보정된 농도이다. FEIBA 등가 활성은 또한 동일한 보정 인자를 적용함에 따라 혈장 부피에 대해 보정된다.
응고촉진 활성, 및 특히 FVIII 등가 활성 또는 FVIII 억제제 바이패싱 활성을 측정하기 위한 또 다른 적합한 분석법은 하기에 설명되는 규정된 피브린 침착 분석법이다. 적절하게는, 규정된 피브린 침착 분석법 내의 25 μM 시험 화합물의 샘플의 응고촉진 활성은 30 mU/mL 이상 인자 8 억제제 바이패싱 활성(FEIBA), 바람직하게는, 80 mU/mL 이상 FEIBA, 가장 바람직하게는 200 mU/mL 이상 FEIBA에 등가이다. 본 분석법은 이것이 FVIII-파괴된 또는 억제된 혈장의 존재 하에 수행되기 때문에 응고 FVIII 활성을 측정하는데 특히 유용하다.
규정된 피브린 침착 분석법은 다음과 같이 수행된다. 구연산화된(citrated) 인간 혈장(벡스터 AG)의 FVIII 활성이 염소에서 길러진 25 ㎕의 열 불활성화된 항-인간 FVIII 혈장(300 BU/ml, 56 ℃에서 6 시간 배양)과 함께 100 ㎕의 인간 정상 혈장을 배양하여(37 ℃, 2 시간) 먼저 억제된다. 시험되는 각각의 샘플에 대해서, 125 ㎕의 이 FVIII-억제된 인간 정상 혈장을 사전-가온된 큐벳트로 이전하고, 75 ㎕의 시험 화합물의 희석액 또는 FEIBA 기준 표준(벡스터 AG)를 첨가했다. 시험 화합물의 희석액 또는 FEIBA 기준 표준은 50 mM 이미다졸, 100 mM NaCl 및 10 mg/ml 인간 혈청 알부민(시그마) pH 7.4를 함유한다. 촉발제로서, 그리고 응고촉진 표면을 제공하기 위해서, 인간 인자 XIa (3.13 nM, 효소 연구 실험실) 및 인지질(PL) 소포체 (포스파티딜콜린/포스파티딜세린 60 %/40 %, 30 μM; 아반티 폴라 리피드(Avanti Polar Lipids))의 50 mM 이미다졸 내의 혼합물의 100 ㎕, 100 mM NaCl, 10 mg/ml 인간 혈청 알부민(시그마) pH 7.4가 포함되었다. 37 ℃에서 3 분간 배양한 후에, 응고 반응을 100 ㎕의 25 mM CaCl2를 첨가함으로써 시작하였다. 혈전 형성을 응고미터기(coagulometer)(KC10A, 아멜룽, 독일)에 의해 모니터링하였다. 간략히, 각각의 큐벳트가 자성 검출 장치 위에서 천천히 회전하고, 작은 자성 금속 볼을 포함한다. 혈장 성분이 용액에 남아있는 동안, 볼은 큐벳트의 바닥에 있다. 시간이 지나, 혈전이 형성되기 시작하고, 볼은 회전하는 큐벳트 안에서 발달되는 혈전과 함께 회전하기 시작한다. "응고 시간"이 기록되고, CaCl2의 첨가로부터 발달하는 혈전이 금속성 볼을 회전시키는 시간까지의 시간으로서 규정된다. FEIBA 기준 참고 희석액에 대한 표준 곡선은 응고 시간(y-축)에 대한 로그함수인 FEIBA 농도(x-축)의 선형 회귀로서 계산된다. 각각의 화합물 농도의 응고 시간을 기준으로, FEIBA 등가 활성은 이 표준 곡선에 따라 계산된다.
규정된 피브린 침착 분석법에 대하여 본원에서 펩티드 농도가 제시된 경우, 이는 최종 분석 부피의 펩티드의 농도가 아니고, 혈장 부피에 대해 보정된 농도라는 것이 이해될 것이다. 최종 분석 부피 내에서의 농도는 4에 의해 나누어진 보정된 농도이다. 따라서, 100 μM의 농도가 제시된 경우, 최종 분석 부피 내의 실제 농도는 25 μM이다. 유사하게, FEIBA 등가 활성 또한 혈장 부피에 대해 보정된다. 따라서, 만약 100 μM에서 펩티드가 규정된 피브린 침착 분석법 내에서 100 mU/ml FEIBA에 등가인 활성을 가진다고 제시되면, 최종 분석 부피 내의 펩티드의 농도는 25 μM이고, 대조군 분석 내의 FEIBA의 등가 농도는 25 mU/ml FEIBA이다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 및 제2 측면의 펩티드 및 펩티드 유도체 및 본 발명의 제3 측면의 이중 펩티드는 중증 인간 혈우병 A의 동물 모델 내에 투여된 경우, 생물학적 활성 FVIII의 부재를 적어도 부분적으로 보상할 수 있다. 예컨대, FVIII 결핍 생쥐, 예컨대, FVIII의 엑손 17 또는 엑손 16이 파괴된, 비 등(Bi et al)(문헌[Nat Genet. 1995;10: 119-21])에 의해 상세하게 설명된 균주 내에서의 출혈을 조절하는데 이들이 활성일 수 있다. 엑손 16 FVIII-/- 생쥐들은 미국 04609 메인주 바 하버 메인 스트리트 600 잭슨 실험실(Jackson Laboratory, 600 Main Street, Bar Harbor, Maine 04609 USA)에서 입수가능하다(균주 명: B6;129S4-F8tm1Kaz/J).
출혈을 조절하는 화합물의 능력을 시험하기에 적합한 분석법은 꼬리 클립 분석법(tail clip assay)이다. 펩티드, 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드가 적합한 비히클 내에서 생쥐에 투여되며, 통상적으로는 i.v., i.p. 또는 s.c이다. 각각의 펩티드 또는 펩티드 유도체의 상이한 용량이 용량-의존성을 결정하기 위해 상이한 군의 생쥐들에 투여될 수 있다. 생쥐의 군, 통상적으로는 중증의 출혈성 질환을 갖는 8-16 수컷 및 암컷 엑손 17 FVIII 결여된 생쥐에 단일 i.v. (꼬리 정맥), i.p. 또는 s.c. 일시 주사 (10 ml/kg 체중)를 준다. 꼬리 클립의 2 분 전에, 동물들을 100 mg/kg 케타민 및 5 mg/kg 크실라진의 i.p. 적용에 의해 마취시킨다. i.v. 펩티드 또는 펩티드 유도체 투여의 5 분 후, 및 i.p. 또는 s.c. 펩티드 또는 펩티드 유도체 투여의 60 분 후에, 0.5 cm의 꼬리 끝을 제거하였다. 상처에서 떨어지는 혈액을 5.0 ml 0.04 % NH3을 포함하는 튜브에 규정된 시간 기간, 예컨대, 0-2 분, 2-4 분, 4-6 분, 6-8, 8-10, 10-12, 12-14, 14-16, 16-20, 20-24, 24-28, 28-32, 32-42, 42-52 및 52-62 분 동안 수집하였다. 각각의 튜브 내의 혈액 세포들이 파괴되었고, 헤모글로빈을 실온에서 3 시간 배양 기간에 이어서 초음파 처리에 의해 추출하였다. 추출물의 414 nm 및 620 nm에서의 흡수율은 마이크로 타이터 플레이트에서 결정되었다. 620 nm는 기준 파장이고, A620 판독치는 A414 판독치로부터 뺐다. 뺀 판독치에 해당하는 추출물 내의 혈액의 양은 야생형 대조용 생쥐, 예컨대, C57/BI6 생쥐로부터의 혈액의 공지된 양에 의해 생성된 표준 곡선으로부터 계산되었다. 기록될 생쥐의 출혈 특징의 변수들은 총 혈액 손실량, 출혈 속도, 출혈 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 24 시간 및 48 시간 생존율이었다. 축적 혈액 손실량은 각각의 시간 기간 동안의 혈액의 양을 합해서 계산되었다. 한 군의 동물들에 대한 자료를 평균하고 출혈 시간에 대하여 플롯팅하였다. 각각의 시점에서, 처리 및 비히클 대조군를 위해 설정된 자료들은 스튜던트의 t-시험에 의해 통계학적 유의성에 대해 분석되었다.
바람직하게는, 펩티드, 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드가 투여된 생쥐는 꼬리 클립 분석에서 꼬리 클립으로부터 62 분에, 비히클만이 투여된 생쥐의 혈액 손실량의 70 % 이하, 더욱 바람직하게는 60 % 이하, 및 가장 바람직하게는 비히클만이 투여된 생쥐의 혈액 손실량의 50 % 이하의 혈액 손실량을 가졌다.
바람직하게는, 상술한 분석법 내의 꼬리 클립 후 2 시간에 펩티드, 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드가 투여된 생쥐의 생존율은 40 % 이상, 더욱 바람직하게는 60 % 이상, 및 가장 바람직하게는 80 % 이상이다. 바람직하게는, 꼬리 클립 분석법에서 꼬리 클립 후 24 시간에서 펩티드 또는 펩티드 유도체가 투여된 생쥐의 생존율은 20 % 이상, 더욱 바람직하게는 30 % 이상, 및 가장 바람직하게는 40 % 이상이었다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체 또는 본 발명의 제3 측면의 이중 펩티드는 인간 혈장에서 30 분에 50 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 및 가장 바람직하게는 90 % 이상의 안정성을 가진다. 인간 혈장 내에서의 안정성을 측정하기 위한 적절한 분석법은 실시예에 기술된다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체 또는 본 발명의 제3 측면의 이중 펩티드는 25 ℃에서 포스페이트 완충된 염수 pH 7.4에서 25 μM 이상, 바람직하게는 60 μM 이상, 및 가장 바람직하게는 100 μM 이상의 수용해도를 가진다. 25 ℃에서 포스페이트 완충된 염수 pH 7.4에서 수용해도를 측정하기 위한 적절한 분석법은 실시예에 기술된다.
본원에서, 용어 "인자 VIII" 또는 "FVIII"는 원생 FVIII에 관계된 생물학적 활성을 나타내는 임의의 FVIII 부분을 지칭한다. FVIII의 서열은 NCBI 기탁 번호 NP_000123 또는 UniProtKB/Swiss-Prot entry P00451로서 찾아질 수 있다.
본원에서 사용되는 경우, "혈장-유래 FVIII"는 응고 경로를 활성화시키는 성질을 갖는 포유동물로부터 얻어진 혈액 내에서 발견되는 모든 형태의 단백질을 포함한다.
본원에서 사용되는 경우 "rFVIII"는 재조합 DNA 기술을 통해 얻어진 FVIII을 지시한다.
본 발명의 제4 측면은 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체 또는 본 발명의 제3 측면의 이중 펩티드를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 펩티드, 펩티드 유도체 및 이중 펩티드는 제약학적으로 수용가능한 염, 용매화물 또는 수화물의 형태일 수 있다. 적절하게는, 제약학적 조성물은 제약학적으로 수용가능한 운반제를 포함한다. 운반제는 바람직하게는, 액체 제형일 수 있고, 바람직하게는, 완충, 등장성, 수성 용액이다. 적절하게는 제약학적 조성물은 생리학적 또는 거의 생리학적인 pH를 가진다. 적절하게는, 이는 생리학적 또는 거의 생리학적인 삼투질 농도 및 염분도를 갖는다. 이는 염화나트륨 및/또는 아세트산나트륨을 함유할 수 있다. 본 발명의 펩티드, 펩티드 유도체 및 이중 펩티드는 생물학적 치료제의 생산에서 일어날 수 있는 현저한 발열원성 없이 만들어질 수 있다. 이는 낮은 수준의 내독소만이 관용될 수 있는 정맥 내 제형에서 특히 중요할 수 있다. 피하, 복막 내, 볼의, 정맥 내 또는 기타 비경구 제형들이 무균성이고, 내독소가 없는 것이 바람직하다.
제약학적으로 수용가능한 운반제는 또한 부형제, 예컨대, 희석제 등 및 첨가제, 예컨대, 안정화제, 보존제, 가용화제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 또한 임의의 제약학적으로 수용가능한 염의 형태로 있을 수 있다.
본원에서 사용되는 경우, 용어 "제약학적으로 수용가능한"은 인간에서 사용하기 위해 미국 또는 유럽 또는 기타 정부로부터 허가되거나 미국 약전(Pharmacopeia) 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 나열되었음을 의미한다.
조성물은 예컨대, 현탁액, 에멀젼, 서방형 제형, 크림, 겔 또는 분체일 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 운반제, 예컨대, 트리글리세라이드를 갖는 좌약으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 펩티드, 펩티드 유도체 및 이중 펩티드의 정맥 내 전달이 가능하지만 비-정맥내 경로, 특히, 피하, 비강, 볼, 구강 또는 폐 전달이 바람직하다. 복강(i.p.) 전달 또한 사용될 수 있다.
제약학적 조성물은 예컨대, 하나 이상의 물, 완충액(예컨대, 중성 완충된 염수 또는 포스페이트 완충된 염수), 에탄올, 광유, 식물유, 디메틸술폭사이드, 탄수화물(예컨대, 글루코즈, 만노오즈, 수크로즈 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 보조제, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대, 글리신, 항산화제, 킬레이트약, 예컨대, EDTA 또는 글루타티온 및/또는 보존제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 기타 활성 성분이 본원에서 제공되는 제약학적 조성물에 포함될 수 있다(반드시 그런 것은 아니다.).
제약학적 조성물은 임의의 적절한 투여의 방법, 예컨대, 국소(예컨대, 경피 또는 안구 내), 구강, 볼, 비강, 질, 직장 또는 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 경우 용어 비경구는 피하, 피내, 혈관 내(예컨대, 정맥 내), 근육 내, 척수, 두개 내, 척추강 내, 안구 내, 안구 주위의, 안와 내, 활액낭 내 및 복강 내 주입과 임의의 유사한 주입 또는 투입 기술을 포함한다. 구강용을 위해 적절한 형태는 예컨대, 정제, 트로키정, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분체 또는 과립제, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐 또는 시럽 또는 엘릭시르를 포함한다. 본원에서 제공되는 조성물은 동결건조물(lyophilizate)로 제형화될 수 있다.
수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적절한 부형제와의 혼합물로 활성 성분(들)을 함유한다. 이러한 부형제는 현탁화제(예컨대, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 소듐 알지네이트, 폴리비닐-피롤리돈, 트라가칸트 고무 및 아카시아 고무); 및 분산화제 또는 습윤제(예컨대, 자연발생적인 포스파티드, 예컨대, 레시틴, 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물, 예컨대, 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르와의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예컨대, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)를 포함한다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예컨대, 에틸, 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제, 및 하나 이상의 감미제, 예컨대, 수크로즈 또는 사카린을 포함할 수 있다.
펩티드 또는 펩티드 유도체는 국부 또는 국소 투여, 예컨대, 피부, 상처 또는 점막, 예컨대, 눈 안을 위한 국소 투여를 위해 제형화될 수 있다. 국소 투여를 위한 제형은 통상적으로 추가적인 임의의 성분과 함께 또는 그것 없이 활성화제(들)과 혼합된 국소 비히클을 포함한다. 적절한 국소 비히클 및 추가적인 성분들은 당업계에 공지되어 있으며, 비히클의 선택이 특정한 물리적 형태 및 전달의 방법에 의존될 것이라는 것이 명백할 것이다. 국소 비히클은 물; 유기 용매, 예컨대, 알콜(예컨대, 에탄올 또는 이소프로필 알콜) 또는 글리세린; 글리콜(예컨대, 부틸렌, 이소프렌 또는 프로필렌 글리콜); 지방족 알콜(예컨대, 라놀린); 물 및 유기 용매의 혼합물 및 유기 용매, 예컨대, 알콜 및 글리세린의 혼합물; 지질계 물질, 예컨대, 지방산, 아실글리세롤(오일, 예컨대, 광유 및 천연 또는 합성 기원의 지방을 포함), 포스포글리세리드, 스핑고리피드 및 왁스; 단백질계 물질, 예컨대, 콜라겐 및 겔라틴, 실리콘계 물질(비휘발성 및 휘발성 모두); 및 탄화수소계 물질, 예컨대, 마이크로스폰지 및 중합체 매트릭스를 포함한다. 조성물은 또한 적용되는 제형의 안정성 또는 효과를 개선하기 위해 채용된 하나 이상의 성분, 예컨대, 안정화제, 현탁화제, 에멀젼화제, 점도 조절제, 겔화제, 보존제, 항산화제, 피부 침투 증진제, 보습제 및 서방형 물질을 포함할 수 있다. 이러한 성분들의 예는 문헌[Martindale - The Extra Pharmacopoeia (Pharmaceutical Press, London 1993) and Martin (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences]에 설명된다. 제형은 마이크로캡슐, 예컨대, 히드록시메틸셀룰로스 또는 겔라틴-마이크로캡슐, 리포좀, 알부민 미립구, 마이크로에멀젼, 나노입자 또는 나노캡슐을 포함할 수 있다.
제약학적 조성물은 스프레이, 미스트 또는 에어로졸을 포함하는 흡입 제형으로 제형화될 수 있다. 흡입 제형의 경우, 본원에서 제공되는 화합물은 당업계에 공지된 임의의 흡입 방법을 통해 전달될 수 있다. 이러한 흡입 방법 및 장치는 포사제, 예컨대, CFC 또는 HFA 또는 생리학적으로 및 환경적으로 허용가능한 포사제를 갖는 정량 흡입기(metered dose inhaler)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 기타 적절한 장치는 호흡 작동 흡입기(breath operated inhaler), 다중투여 건조 분체 흡입기(multidose dry powder inhaler) 및 에어로졸 분무기이다. 대상 방법에서 사용하기 위한 에어로졸 제형은 통상적으로 포사제, 계면활성제 및 공동-용매(co-solvent)를 포함하고, 적절한 계량 밸브에 의해 폐쇄되는 종래의 에어로졸 용기에 채워질 수 있다.
흡입제 조성물은 분사 및 기관지내용으로 적절한 활성 성분을 함유하는 액체 또는 분체형 조성물 또는 정량이 분배된 에어로졸 단위를 통해 투여되는 에어로졸 조성물을 포함할 수 있다. 적절한 액체 조성물은 수성, 제약학적 수용가능한 흡입 용매, 예컨대, 등장성 염수 또는 정균수 내의 활성 성분을 포함한다. 용액은 펌프 또는 스퀴즈-구동된 분사형 스프레이 분배기를 사용하여 또는 필요한 용량의 액체 조성물이 환자의 폐로 흡입될 수 있도록 유발하거나 가능케 하는 임의의 기타 종래의 수단에 의해 투여된다. 투여를 위해 운반제가 액체인, 적절한 제형, 예컨대, 비강 내 스프레이 또는 비강 내 점적제는 활성 성분의 수성 또는 유성 용액을 포함한다.
운반제가 고체인 경우, 비강 내 투여에 적절한 제형 또는 조성물은 냄새가 투여되는 방법(즉, 코에 근접하게 들린 분체의 용기로부터 비강 경로를 통한 빠른 흡입)으로 투여되는 예컨대, 20 내지 500 미크론 범위에 있는 입자 크기를 갖는 조분(coarse powder)을 포함한다. 적절한 분체 조성물은 예시적으로, 락토오즈 또는 기관지내 투여에 허용가능한 기타 불활성 분체와 고르게 상호혼합된 활성 성분의 분체형 제제를 포함한다. 분체 조성물은 에어로졸 분배기를 통해 투여되거나 또는 환자에 의해 캡슐을 천공하고 분체를 흡입에 적절한 정상 상태 스크림으로 불어 나가게 하는 장치에 삽입될 수 있는 파손 가능한 캡슐에 수용될 수 있다.
제약학적 조성물은 서방출형 제형(즉, 투여 후에 조절제의 서방출을 이행하는 캡슐과 같은 제형)으로 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 일반적으로 공지된 기술에 의해 제조될 수 있고, 예컨대, 구강, 직장 또는 피하 이식에 의해 또는 원하는 표적 부위에의 이식에 의해 투여될 수 있다. 이러한 제형 내에 사용하기 위한 운반제는 생체적합성이고, 생분해성일 수도 있다; 바람직하게는 제형은 상대적으로 일정한 수준의 조절제 방출을 제공한다. 서방출형 제형에 함유된 조절제의 양은 예컨대, 이식의 부위, 속도 및 방출의 예상 지속시간 및 치료되거나 예방되어야 하는 상태의 성질에 의존한다.
제약학적 조성물은 생물학적 이용가능성을 개선하기 위한 약제, 예컨대, 유기 용매와 함께 제형화될 수 있다. 예컨대, 크레모포어(Cremophor) EL® (제품 번호. 00647/1/63; BASF Aktiengesellschaft, 독일)는 35 몰의 에틸렌 옥시드와 각 몰의 피마자유를 반응시켜 제조된 폴리에톡실화된 피마자유이다. 이는 수성 시스템 내에서 비극성 물질의 에멀젼을 안정화시키는데 사용될 수 있다. 다르게는, 펩티드, 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드는 향상된 생물학적 이용가능성을 위해 단백질성(proteinaceous) 마이크로 또는 나노 입자에 결합되거나 그에 혼입될 수 있다. 적절한 마이크로- 및 나노-입자는 미국 제5,439,686호 (Desai 등; Vivorx Pharmaceuticals, Inc., CA) 및 US 제5,498,421호 (Grinstaff 등; Vivorx Pharmaceuticals, Inc., CA)에 설명된다. 적절하게는, 단백질성 나노-입자는 인간 혈청 알부민, 특히, 인간 혈청 알부민 또는 그의 재조합 형태를 포함한다. WO 2007/077561 (Gabbai; Do-Coop Technologies Ltd., Israel)는 나노구조 및 액체를 포함하는 다른 적절한 운반제를 설명하며, 본원에서 네오워터TM(NeowaterTM)으로 지칭된다.
인간 환자를 포함한 환자에의 구강 및 비경구 투여를 위해, 본 발명의 펩티드, 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드의 일일 용량 수준은 일반적으로 성인 당 2 내지 2000 mg (즉, 약 0.03 내지 30 mg/kg)이고, 단일 또는 분할된 용량으로 투여된다.
따라서, 예컨대, 본 발명의 펩티드, 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드의 정제 또는 캡슐은 적절하게는 한번에 단일 또는 2 이상의 투여를 위해 2 mg 내지 2000 mg의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 임상의는 임의의 경우에 임의의 개개의 환자에게 가장 적절한 실제 용량을 결정할 것이고, 이는 특정 환자의 나이, 체중 및 반응에 따라 변화할 것이다. 상술한 용량은 평균적인 경우의 예시이다. 물론, 더 높은 또는 더 낮은 용량 범위가 가치있는 개개의 경우가 있을 수 있으며, 본 발명의 범위 내에 있다.
수의학적인 용도로, 본 발명의 펩티드, 펩티드 유도체 및 이중 펩티드는 정상 수의학적 실습에 따라 적절하게 허용가능한 제형으로 투여되고 수의학적 외과의는 특정 동물에게 가장 적절한 투여 요법 및 투여의 경로를 결정할 것이다.
본원에 개시된 펩티드, 펩티드 유도체 및 이중 펩티드는 의학적 적용 및 축산업 또는 수의학적 적용분야에 사용될 수 있다. 통상적으로, 생성물은 인간에서 사용된다. 용어 "환자"는 개개의 포유동물을 지시하도록 의도되고, 본 명세서 및 청구항에 걸쳐서 그렇게 사용된다.
본 발명의 제5 측면은 FV, FVII, FVIII, FX 및/또는 FXI의 결핍증을 갖는 환자의 치료를 위한 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체 또는 제3 측면의 이중 펩티드를 제공한다.
본 발명의 제6 측면은 환자 내의 FV, FVII, FVIII, FX 및/또는 FXI의 결핍증의 치료를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 펩티드 또는 펩티드 유도체 또는 제3 측면의 이중 펩티드의 용도를 제공한다
본 발명의 제7 측면은 제4 측면의 제약학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 FV, FVII, FVIII, FX 및/또는 FXI의 결핍증을 갖는 환자의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 펩티드, 펩티드 유도체 및 이중 펩티드는 FV, FVII, FVIII, FX 및/또는 FXI의 결핍증의 치료에서 예방 및 급성 출혈의 치료에서 모두 사용될 수 있다. FVIII 결핍증(혈우병 A)을 갖는 환자는 종종 FVIII에 대한 억제제 항체를 발생시킨다. (FIX에 대한) 억제제 발생은 FIX 결핍증(혈우병 B)로도 공지되어 있다. FV, FVII, FXI 및 FX 결핍증이 매우 희귀한 선천성 질병이기 때문에, 이러한 질병을 가진 환자가 억제제를 발생시킬 수 있음에도 불구하고 억제제 발생에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 억제제 환자의 치료는 제5, 제6 및 제7 측면의 바람직한 실시태양이다. 이러한 억제제 환자는 5 BU 초과의 높은 역가 반응 또는 0.5 내지 5 BU 사이의 낮은 역가 반응을 가질 수 있다. 통상적으로, 억제제들은 FVIII에 대항하게 되고 환자는 혈우병 A를 갖는다.
FVIII에 대한 항체 반응의 크기는 기능적인 억제제 분석법, 예컨대, 문헌[[0]Kasper CK et al (1975) Proceedings: A more uniform measurement of factor VIII inhibitors. Thromb Diath Haemorrh. 34(2):612]에 설명된 것을 사용하여 정량화될 수 있다. FXI 억제제는 캐스퍼(Kasper)에 의해 설명된 바와 같은 aPTT 분석법에 의해 정량화될 수 있다. FV, FVII 및 FX의 억제제는 캐스퍼의 과정을 따른 PT 기준 분석법에 의해 정량화될 수 있다.
본 발명의 제8, 제9 또는 제10 측면에 따른 펩티드 또는 펩티드 유도체는 FVIII 또는 그의 단편이 아니다. 통상적으로, 이는 인간, 포유동물 또는 척추동물 기원이든지 간에 임의의 FVIII 단백질의 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하지 않는다. 이는 FVIII 단백질의 단편으로도 구성되지 않는다. 통상적으로, 이는 FVIII 단백질, 예컨대, 인간 FVIII 단백질의 50 미만, 20 미만, 10 미만, 5 미만의 인접 아미노산을 포함한다. 바람직한 펩티드 및 펩티드 유도체는 본 발명의 제1 및 제2 측면의 펩티드 및 펩티드 유도체 또는 본 발명의 제3 측면의 펩티드 유도체이다. 대체 펩티드 및 펩티드 유도체는 예시된 펩티드 및 펩티드 유도체에 관해서 설명된 바와 같이 합성되고 응고촉진 활성에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 제8, 제9 및 제 10 측면의 펩티드 및 펩티드 유도체는 상술한 바와 같은 제약학적 조성물로서 제형화될 수 있고, 상술한 바와 같이 약제에서 사용될 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에서 그에 제한됨이 없이 추가적으로 설명될 것이다.
트롬빈 발생 활성을 갖는 화합물의 합성 및 식별
트롬빈 발생이 시험관 내에서 인자 XIa 및 인지질 소포체의 존재 하에서 FVIII-억제된 인간 혈장 내에서 정량화된 "규정된 내생 트롬빈 발생 분석법"을 사용하여 화합물을 스크리닝하였다. 또한 구체적인 설명에 설명된 바와 같이 상술한 분석법 및 "규정된 이중-경로 트롬빈 발생 분석법"에서 인자 XIa 및 인지질 대신에 조직 인자 및 인지질을 사용하여 화합물을 스크리닝했다.
펩티드 및 펩티드 유도체인 화합물을 종래 고체상 펩티드 합성 또는 위치적으로 고심할만한, 연속상 셀룰로스 막 상의 펩티드의 화학적 합성을 가능하게 하는, 스폿 당 50-100 nmol 펩티드에서의 SPOT-합성에 의해 합성하였다. 펩티드는 물 안의 10 % 또는 50 % DMSO에서 용해된다.
펩티드 및 펩티드 유도체의 페길화는 다음과 같이 수행하였다. PEG5000 NHS-에스테르를 용액 내에서 HPLC-정제된 펩티드의 N-말단에 커플링시켰다. 리신이 펩티드 서열에 존재하면, 이 아미노산은 ε-아미노기에서의 페길화를 회피하기 위해 ivDde 보호기로 보호된다. N-말단으로의 PEG5000의 커플링 후에, ivDde 보호기를 디메틸 포름아미드 내의 3 % 히드라진 수화물에 의해 절단하고, 이어서 HPLC에 의해 최종 생성물의 재정제를 하였다.
하기 표 7 및 8에 표시한 바와 같이, 트롬빈 발생을 촉진할 것이라 여겨지는 화합물을 식별하였다.
[표 7]
A01에 기초한 화합물
Figure 112013085373419-pct00050
상술한 표에서, O-는 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민(ttds)이다.
[표 8]
B01에 기초한 화합물
Figure 112013085373419-pct00016
상술한 표에서, -O-는 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민(ttds)이다. B01, B02, B05 및 B06으로 지정된, 본 연구에서 사용된 실제 펩티드는 환형이다.
내생적 및 이중-경로 트롬빈 발생 분석법에서의 화합물의 시험
각각의 펩티드의 각종 농도를 인간 FVIII 억제된 혈장을 사용하여 규정된 내생 트롬빈 발생 분석법에서 시험하였다. 결과를 하기 표에 나타내었다.
[표 9]
규정된 내생 트롬빈 발생 분석법(FXIa에 의해 촉발)에서의 펩티드 화합물의 활성. 트롬빈 피크 시간은 FEIBA 표준 보정 곡선을 기준으로 계산한 FEIBA 등가 활성(mU/ml)으로 주어진다.
Figure 112010074648699-pct00017
형광단 AMC를 방출하기 위한 Z-GGR-AMC의 절단에 기초한 시험관 내 트롬빈 발생 분석법을 정상 인간 혈장을 사용하여, 즉, 규정된 이중-경로 트롬빈 발생 분석법으로 전개하였다. 피크 트롬빈 발생 및 트롬빈 피크 시간의 조직 인자 의존성은 인지질의 고정 농도(즉, 3.2 μM)를 함유한 조성물 내에서 특성화되었다. 인지질 의존성은 조직 인자의 고정 농도(즉, 7.2 pM)을 함유한 조성물 내에서 특성화되었다. 피크 시간(피크 트롬빈 발생의 시간)은 인지질 또는 조직 인자의 농도에 의존했다. 본 분석법의 최종 형태는, (32 μM 인지질 및 71.6 pM 조직 인자) 함유 10 ㎕ 시약 C 하이가 100 ㎕ 총 부피로 사용된, 구체적인 설명에 설명된 바와 같다.
추가적인 연구를 FVIII 결핍 또는 억제된 혈장 내에서 3.2 μM 인지질 및 7.2 pM 조직 인자를 사용하여 수행하여 각종 응고 인자 제제의 트롬빈 피크 시간 및 피크 트롬빈 발생에 미치는 효과를 특성화하였다. 이들 연구는 분석법 내에서 화합물의 효능을 비교하기 위한 토대를 제공하였다. 간략히, rFVIII (벡스터로부터의 리콤비네이트®(Recombinate®) FVIII)를 FVIII 결핍 혈장 내에서 0, 5, 10, 20, 40 및 80 mU/ml에서 시험하였다. FEIBA를 FVIII 억제된 혈장 내에서 0, 8, 16, 31, 63 및 125 mU/ml에서 시험하였다. FVIIa를 FVIII 억제된 혈장 내에서 0, 0.1, 0.4, 1.6, 6.3 및 25 nM에서 시험하였다. 결과를 도 1에 나타내었다. FVIII 결핍 혈장 내의 재조합 FVIII (리콤비네이트®) 및 FVIII-면역 억제된 혈장 내의 FEIBA 및 FVIIa 모두에 대해서, 트롬빈 발생 변수의 농도 의존 향상이 관찰되었다. 피크 트롬빈은 증가하였고 지체 시간 및 트롬빈 피크 시간은 모두 감소하였다.
트롬빈 발생을 촉발하기 위한 시약 C 하이(테크노클론)을 사용한 본 규정된 이중-경로 트롬빈 발생 분석법(DDPTGA)으로 화합물을 시험하였다. 결과는 하기 표에 제시된다. 본 분석법이 FVIII-유사 활성에 대해 규정된 내생 트롬빈 발생 분석법(DITGA)보다 덜 민감함에도 불구하고, 수개의 화합물이 검출가능한 활성을 가졌다.
[표 10]
요약 결과
Figure 112010074648699-pct00018
Figure 112010074648699-pct00019
"피크 IIa"는 트롬빈 발생 곡선의 피크에서 발생된 트롬빈의 양이다. "피크 시간"은 트롬빈 발생 반응의 시작으로부터 최대양이 발생된 때까지의 시간이다. BLS=최저 표준 미만.
트롬빈은 첨가된 펩티드의 부재 하에서도 본 분석법에서 여전히 발생되었다. 따라서, 피크 IIa가 특정 펩티드 농도에서 "BLS"인 경우, 여전히 트롬빈 피크가 있었으나, 5 mU/ml FVIII, 8 mU/ml FEIBA 또는 0.1 nM FVII인 표준 최저 농도에 의해 달성된 것보다 낮았다. 유사하게, 피크 시간이 "BLS"인 때, 피크 트롬빈 발생까지의 시간은 표준 최저 농도에 의해 달성된 피크 시간보다 컸다. 펩티드는 피크 시간 상에 현저한 효과를 가질 수 있으나, 피크 IIa에는 그렇지 않으며, 또는 그 역도 그러하다. 그러나, 펩티드가 피크 시간 및 피크 IIa 모두에 효과를 가지는 것이 바람직하다. B03, B04 및 A15는 트롬빈 발생의 양 측면에 모두 긍정적으로 영향을 미쳤다. 일부 펩티드의 경우에, 트롬빈 발생에 미치는 효과의 농도 의존성은 높은 펩티드 농도에서 보이지 않았으며, 이는 비특이적 상호작용에 의해 설명될 수 있다.
몇몇 결핍된 혈장을 사용한 트롬빈 발생 분석법 내에서의 화합물의 시험
구체적인 설명에서 설명된 형광단 AMC를 방출하기 위한 Z-GGR-AMC의 절단에 기반한 시험관 내 트롬빈 발생 분석법, 즉, 규정된 이중-경로 트롬빈 발생 분석법은 몇몇 결핍된 인간 혈장 내에서의 화합물의 효과를 특성화하는데 사용되었다. 이들 실험에서, 각각의 100 ㎕ 반응은 인지질 소포체 포스파티딜콜린/포스파티딜세린 80 %/20 % (3.2μM) 및 17.9 pM 재조합 인간 조직 인자를 포함하는 10 ㎕ 시약 B를 함유했다. 10 ㎕ 펩티드 희석액, 40 ㎕ TGA 기질 및 40 ㎕ 혈장을 구체적인 설명에 설명한 바와 같이 사용했다.
실험에서 사용된 혈장은 신선하게 냉동되었고 인자 V, 인자 VII/VIIa, 인자 VIII, 인자 X 또는 인자 Xl (조지 킹 바이오-메디칼, 인크.(George King Bio-Medical, Inc.))가 결핍되었다. 결핍 혈장의 잔여 응고 인자 수준은 1 % 미만으로 구체화되었다.
본 실험에서 사용된 각각의 결핍된 혈장에 대해서, 화합물들은 두 농도, 즉, 50 μM 및 80, 90 또는 100 μM에서 시험되었다. 시험 화합물이 포함되지 않은, 음성 대조군을 사용하였다. 결과를 하기 표에 요약한다.
[표 11]
각종 격감된 혈장 내의 트롬빈 발생에 미치는 화합물의 효과의 요약 결과
Figure 112010074648699-pct00020
트롬빈 발생의 자극: "+"는 자극됨을 의미; "-"는 자극되지 않음을 의미. 대조군 실험에서, 펩티드는 포함되지 않았다.
시험된 모든 격감된 혈장은 펩티드의 부재 하에 트롬빈 발생이 보이지 않거나 매우 낮았으며, 사용된 조직 인자 농도에서 모든 응고 인자의 상호작용이 트롬빈 발생에 중요하다는 것을 나타내었다. 수개의 펩티드는 모든 자이모겐(zymogen) 격감된 혈장(FVII, FX 또는 FXI)에서 트롬빈 발생을 자극했으며, FV 격감된 혈장 내의 트롬빈 발생은 낮았고, 공통적인 경로가 펩티드 자극된 트롬빈 발생에 중요하다는 것을 나타내었다.
규정된 피브린 침착 분석법 내의 화합물의 활성
구체적인 설명에 설명된 바와 같이 규정된 피브린 침착 분석법 내에서 피브린 침착을 자극하기 위한 능력에 대해 각종 펩티드를 시험하였다. 결과를 하기 표에 나타낸다.
[표 12]
규정된 피브린 침착 분석법 내의 화합물 특성화
Figure 112010074648699-pct00021
Figure 112010074648699-pct00022
모든 시험 화합물이 FVIII 억제된 혈장의 응고 시간 및 피브린 형성을 단축하였다. 트롬빈 발생 실험과 함께, 이것은 시험 화합물의 응고촉진 활성을 확인시켜준다. 비록 소수는 비특이적 상호작용에 기인할 수 있는 높은 농도에서의 감소된 활성을 가졌으나, 대부분의 화합물들이 농도 의존적인 방식으로 작용하였다.
화합물의 특성화를 위한 시험관 내 분석법
화합물들은 트롬빈 발생 분석법 내에서의 활성뿐만 아니라 약물동태학, 가용성, HERG 억제 및 분자량에 대해서도 특성화되었다.
약물동태학 ( PK ) 연구
PK 연구는 생체 내 효능 연구의 해석 및 설계를 위해 요구된다. 혈장 단백질 결합, 혈장 안정성 및 마이크로솜성(microsomal) 안정성은 모두 본 카테고리에 포함된다.
1. 혈장 단백질 결합
메트릭스로 지칭되는, 인간 혈장(바이오클라메이션(Bioreclamation), Hicksville, NY), 생쥐 혈장(램파이어 실험실(Lampire Laboratory), Pipersville, PA) 또는 생쥐 혈청 알부민(시그마, St. Louis, MO)에의 화합물 결합의 범위는 96-웰 마이크로-평형 투석 블록 시스템(HDT-96; HT다이알리시스, 엘엘씨(HTDialysis, LLC), Gales Ferry, CT)에서 결정되었다. 간략히, 시스템의 각각의 단위는 반-투과성 막에 의해 분리되는 공여체 챔버 및 수용체 챔버를 포함한다. 실험의 원칙은 단백질(및 단백질에 결합한 화합물)들이 공여체 챔버에 보유되고 막을 지나갈 수 없다는 것이다. 자유 화합물들은 두 챔버 사이에서 막을 통해 확산될 수 있고 실험 동안에 평형에 도달한다. 이들 실험에서, 반투과성 막은 재생 셀룰로오즈로 만들어지고 12-14 kD의 분자량 한계를 가진다(cat. no 1101, HT다이알리시스, 엘엘씨).
시그마로부터 구입한 프로테아제 억제제 칵테일(P2714-1BTL)은 시험 화합물의 단백질 분해를 억제하기 위해 분석법 내에 포함되었다. 이는 증류수 내의 50x 저장 용액에서 신선하게 제조되었다. 생쥐 혈청 알부민은 40 g/L에서 포스페이트 완충된 염수(PBS)에서 신선하게 제조되었다. PBS는 인비트로겐(Invitrogen) (Carlsbad, CA)로부터 구매했으며, 사용에 앞서 pH 7.4로 조정되었다. 혈장들은 희석하지 않고 사용하였다. 프로테아제 억제제 저장 용액을 최종 1x 농도에서 각각의 메트릭스(즉, PBS 내의 생쥐 혈청 알부민)에 첨가하였다. 각각의 시험 화합물의 저장 용액을 DMSO 내에서 대조군 화합물, 와파린과 함께 제조하였다. 고단백질-결합 화합물인 와파린은 각각의 저장 용액에 포함되어서 실험 동안 막의 보전성을 확실히 하였다. 저장 용액의 분취량을 각각의 매트릭스에 첨가하여 5 μM의 시험 화합물 및 10 μM의 와파린의 최종 농도를 수득했다. DMSO의 최종 농도는 0.72 %(v/v)였다. 다른 성분들의 첨가에 의한 매트릭스의 희석은 무시할만큼 작았다(4 % 미만). 막 스트립을 증류수에서 1 시간 동안 수화시켰다; 막을 30 % 에탄올 수용액에 20 분 동안 적신 후에, 막을 증류수로 두 번 헹궜다. 헹굼 후에, 막을 PBS 내에 위치하고 사용하기 위해 준비했다. 투석 블록의 조립은 제조업자의 프로토콜을 따랐다. 조립 후에, 각각의 매트릭스/시험 화합물의 150 ㎕의 분취량을 분리된 공여체 챔버에 첨가하고, 150 ㎕의 PBS를 막의 다른 쪽에 있는 대응하는 수용체 챔버에 첨가하였다. 각각의 매트릭스/시험 화합물의 나머지를 -80 ℃에 추가적인 분석을 위해서 저장했다. 이들 매트릭스 내의 시험 화합물 및 와파린의 농도를 측정하고 값들을 회수율 계산에서 사용하였다. 96-웰 투석 블록을 그 후 37 ℃로 사전-가온된 밀폐된, 가열된 로커(rocker)에 위치시키고, 6 시간 동안 배양시켰다. 배양 후에, 양 쪽을 샘플링했다. 시험 화합물과 와파린의 농도는 LC/MS/MS 분석법에 의해 측정되었다.
회수율 및 단백질 결합 값은 다음과 같이 계산되었다.
% 회수율 = [(공여체 쪽, 농도 + 수용체 쪽, 농도) / (매트릭스 내, 측정 농도)] x 100 % (1)
% 결합 = [(공여체 쪽, 농도 - 수용체 쪽, 농도) / (공여체 쪽, 농도)] x 100 % (2)
"% 회수율"은 매트릭스에 첨가된 화합물의 얼마의 양이 공여체 및 수용체 챔버로부터 회수될 수 있는지의 척도이다. 회수율이 100 % 미만인 경우, 화합물의 일정 부분은 막 또는 챔버의 플라스틱 표면에 결합되었을 수 있거나, 또는 분해되었을 수 있다. "% 결합"은 화합물의 얼마의 양이 매트릭스에 결합되었는지 및 따라서 공여체 및 수용체 챔버 사이에서 평형을 이룰 수 없는지의 척도이다.
결과는 하기 표에서 A01 및 와파린(대조군)에 대해서 나타난다.
[표 13]
시험된 매트릭스 내에서의 A01의 단백질 결합
Figure 112010074648699-pct00023
[표 14]
시험된 매트릭스 내에서의 와파린의 단백질 결합
Figure 112010074648699-pct00024
2. 혈장 안정성
인간 또는 생쥐 혈장 내의 화합물의 반감기 또는 인간 또는 생쥐 혈장 내에서의 배양 후에 남아있는 화합물의 퍼센트는 다음과 같이 결정된다. 실험 절차에서, 시험 화합물 농도는 5 μM이며 DMSO 내의 10 mM의 시험 화합물 저장 용액으로부터 제조된다. 프로판텔린은 표준으로서 사용된다. 시험 샘플을 제조하기 위해서, DMSO 내의 시험 화합물 저장 용액의 1/20 희석액을 50 % 아세토니트릴/50 % H20에서 제조하고, 그 후 1.5 ml 에펜도르프-관에서 사전-가온된(37 ℃) 혈장(5 ㎕ 화합물[1/20 희석액] + 495 ㎕ 혈장)에서 1/100으로 희석된다. 표준 화합물 2 mM 프로판텔린은 DMSO 내에서 1/4 희석되고 후속적으로 1.5 ml 에펜도르프-관에서 사전-가온된 혈장(5 ㎕ 화합물[1/4 희석액] + 495 ㎕ 혈장)에서 1/100으로 희석된다. 모든 샘플들을 37 ℃에서 수욕 내에서 배양하였다. 화합물, 또는 프로판텔린 표준과 혈장을 혼합(t= 0 분으로 지정)한 후에, 500 ㎕ 아세토니트릴을 즉시 첨가하였다. 선택된 배양의 지속기간(일반적으로 t= 60 분) 후 각각의 샘플을 추가적으로 500 ㎕ 아세토니트릴과 혼합하였다. 샘플들을 소용돌이 혼합기 위에서 30 초 동안 혼합하고 얼음 위에 10 분간 거치시키고 원심분리를 위해 수집하였다. 샘플들을 4 ℃에서 10 분간 20 000 g에서 원심분리하였다. 500 ㎕ 상청액을 새로운 1.5 ml 에펜도르프 관으로 이전하고 동일한 부피의 아세토니트릴을 첨가하였다. 샘플을 소용돌이 혼합기를 사용하여 다시 30 초간 혼합하였다. 2 번째 원심분리 단계 (20 000 g, 10 분, 4 ℃) 후에, 250 ㎕의 상청액을 HPLC 유리 바이알 내로 이전하여 HPLC-MS 분석을 하였다. HPLC를 수행하는 조건은 다음과 같았다: 주입-부피는 20 ㎕로 설정하였다. 온도는 25 ℃로 설정하였다. 모두 0.05 % 트리플루오로아세트산(TFA)(v/v)를 함유하는 물:아세토니트릴 95:5 내지 5:95의 선형 구배가 10 분간 0.3 ml/분의 유속으로 가해졌다. PDA-검출기는 210-400 nm에서 스캐닝한다. 이온 트랩은 280 ℃의 온도에서 ESI-공급원이 구비되었고, 질량 스캐닝은 풀 스캔 모드로 50-2000 amu로부터 행해졌고 이어서 1.5 V 충돌 에너지(105 as 분. 어미 이온 수)를 사용하여 동적 배제(dynamic exclusion) MS2-실험을 했다. 퍼센트-안정성은 60 분 배양 시간(또는 선택된 시간) 대 0 분 배양 시간에서 풀 스캔 모드로 전체-이온-전류(tic) 내의 표적 화합물의 양성자화된 분자-질량 이온을 모니터링하는 곡선-아래-면적(AUC) 비로부터 계산하였다.
결과는 하기 표에 나타낸다. 시간에 따른 화합물 농도의 감소는 단백질분해성 분해 및/또는 화학적 변형에 기인한 것일 수 있다.
[표 15]
화합물의 혈장 안정성
Figure 112010074648699-pct00025
3. 마이크로솜성 안정성
인간 또는 동물 기원의 마이크로솜성 제제 내의 화합물의 안정성을 결정하기 위해 시험을 사용하였다. 마이크로솜성 안정성은 세렙(Cerep)(프랑스, 카탈로그 참조. 900-8h)에 의해 제공되는 분석법으로 또는 하기에 설명되는 프로토콜에 의해 측정된다. 10 mM/5 mM의 화합물 용액(시험 화합물, 표준 베라파밀, 이미프라민 및 테르페나딘)을 100 % DMSO 내에서 제조하였다. 이들을 증류된 H2O/MeOH에 의해 희석하고 최종 혼합물 내의 0.4 % DMSO (v/v) 미만으로 분석법 내에서 1 μM의 최종 농도를 얻었다. 안정성 분석법을 위한 마스터믹스(mastermix)를 10 ml 팔콘튜브(총 부피 4.4 ml): 3414 ㎕ 증류수, 440 ㎕ 500 mM NaPO4-완충액 pH 7.4, 440 ㎕ NADP (10 mM), 22 ㎕ Glc-6-P (1 M), 17.6 ㎕ Glc-6-P-DH의 1 U/ml 용액, 66 ㎕ 간 마이크로솜(쥐 또는 생쥐, 분석법 내에서 최종 농도 300 ㎍/ml) 내에서 제조하였다. 마스터믹스를 수욕 내에서 10 분 간 37 ℃에서 사전배양하였다. 5 ㎕의 60 μM 화합물 용액을 300 ㎕의 반응 혼합물(사전-배양된 마스터믹스)와 함께 96-웰-U-플레이트 (PP-Nunc) 내에 웰 당 첨가하였다. 다음 단계 이전에 균일한 현탁을 확실히 하기 위해 모든 웰들은 조심스럽게 혼합되어야 한다. t = 0 분에서의 75 ㎕ 샘플(이중)을 각각의 화합물에 대해 취하였다. 플레이트를 밀봉하고 수욕/써모믹서(thermomixer)로 30 분 동안 반송하였다. 시험 화합물/표준은 200 ㎕ 메탄올의 첨가에 의해 추출되었고, 또한 내부 표준을 포함하였다. 내부 표준은 "Pep770"(제리니 AG(Jerini AG), 베를린, 독일)이고, 6.25 ng/ml의 최종 농도에서 사용되었다. 샘플들을 4 ℃에서 10 분 간 1300 g에서 원심분리하였다. 200 ㎕의 상청액을 웰 당 10 ㎕ DMSO와 함께 96-웰 플레이트로 이전하였다. 화합물 안정성을 HPLC-MS 분석법(삼중)에 의해 측정하였다. 동일한 절차를 30 분 후에 반복하였다. 평균 "AUC t=0 분" 및 "AUC t=30 분"의 비를 계산하고 30 분 후의 남은 화합물의 양의 퍼센트를 결정했다. 모든 피크에 대한 신호 대 노이즈 비는 5:1 이상이어야 한다. 상이한 시점에서의 비 AUC분석물: AUC표준이 사용되어야 한다. 분석법이 유효하기 위해서는 대조군 화합물에 대한 계산된 안정성은 특정 범위 내에 들어야 한다.
결과는 하기 표에 나타난다.
[표 16]
생쥐 마이크로솜 내의 화합물의 안정성
용해도
수용해도를 세렙(프랑스, 카탈로그 참조. 900-11a)에 의해 제공되는 분석법으로 또는 하기의 프로토콜에 의해 pH 7.4에서 PBS 내에서 측정하였다. 이 절차의 목적은 HPLC를 사용하여 완충액 내의 후보물의 포화 농도를 측정함으로써 완충액 내의 약물 후보물(분석물)의 가용성을 결정하는 것이다. 유기 용매 내의 후보물의 공지된 농도가 표준으로 사용된다. DMSO 내의 시험 화합물의 저장 용액이 최초 단계로서 준비되어야 한다. 화합물의 최대 가용성에 따라, DMSO 내의 50 mM의 농도가 달성되어야 한다. DMSO 저장-용액이 DMSO (100 % 기준 용액) 및 완충액(시험 용액)으로 50 μM의 최종 농도로 희석되어 각각 500 ㎕의 최소 부피를 제공한다. 두 용액은 모두 에펜도르프 "써모믹서 컴포트(thermomixer comfort)"에서 950 rpm에서 25 ℃에서 60 분 이상 섞인다. 현탁액은 2 분 이상 동안 22 330 g에서 원심분리되고 100 ㎕의 상청액은 유리 바이알 내의 폴리프로필렌-삽입물 내로 이전되고, 스냅-링 캡에 의해 폐쇄된다. 다르게는, 용액은 마이크로타이터 플레이트 내에서 상술한 시작 용매 부피의 반으로 제조될 수 있다. 용해도의 결정을 위해 모든 샘플들을 삼중으로 HPLC에 의해 분석하였다. 주입 부피는 10 μL 이상이다. 획득한 자료를 "케미스테이션(Chemstation)-소프트웨어"(아질렌트(Agilent), 왈드브론, 독일)에 의해 분석한다. 유기 용매의 분석으로부터의 피크를 적분하고 산술 평균을 "AUC 1"(HPLC에 주입된 공지된 양의 기준 면적)으로 보고한다. 동일한 절차를 완충 용액의 분석으로부터 얻은 스펙트럼에 적용하여 "AUC 2"(완충액 내에 용해된 화합물의 미공지된 양의 면적)를 얻는다. 일반적으로 AUC는 20 면적 단위 초과이어야 하고, 신호 대 노이즈(피크의 높이)는 3 보다 커야 한다. 평균 "AUC 2" 및 "AUC 1"의 비를 계산하였고 따라서 완충액 내에 용해된 화합물의 양의 퍼센트를 획득하고 가용성을 μM 단위로 보고할 수 있었다.
하기 표에 결과를 나타내었다.
[표 17]
PBS 내의 화합물의 용해도
Figure 112010074648699-pct00027
Figure 112010074648699-pct00028
HERG 억제
QT 연장을 패치-클램프 기술에 의해 측정한 HERG 억제 또는 Rb+ 유출에 의해 평가하였다.
Rb+ 유출 방법(세렙, 프랑스, 카탈로그 참조. 900-36rb)는 초기 스크리닝에 사용된다. Rb+ 유출 분석법에서, 분석 적합성을 평가하기 위해 기준 화합물(아스테미졸)을 시험 화합물과 동시에 시험하였다. 이는 10 μM에서 시험되었고 자료를 세렙에서 결정된 역사적 값과 비교하였다.
HERG 억제의 엄격한 특성화를 위해 패치 클램프 분석법(세렙, 프랑스, 카탈로그 참조 900-36)을 적용하였다. 일반적 효력 순위 시스템은 문헌[Roche et al., 2002, Chem Bio Chem 3:455-459]으로부터 채용했다. 분석법의 감도에서 변화가 일어나지 않았음을 확실히 하기 위해, 10 nM E-4031 (Wako, cat. no.052-06523)을 사용한 세포의 동일한(클론) 배치에서 수행된 별개의 실험은 세렙에서 역사적으로 획득된 자료(58.4 ± 2.0 % 억제, 평균 ± SEM, n=3)에 견줄만한 결과(56.7 ± 1.8 % 억제, 평균 ± SEM, n=3)를 수득했다. 시험 화합물(10 mM 저장 용액)을 디메틸술폭시드(DMSO) 내에 용해하였다. 1 μM의 용액은 0.01 % DMSO를 함유했다. 1 % 이하의 DMSO를 함유하는 배쓰 용액(Bath solution)은 HERG-코딩된 테일 전류에 미치는 현저한 효과가 없었다.
10μM에서의 Rb+ 유출 방법에 의한 몇몇 화합물의 스크리닝은 HERG 채널 활성의 억제를 나타내지 않았다. 더욱 감응성인 패치 클램프 분석에서 화합물 A01, A05 및 A16은 저-효능 HERG-채널 차단제로 분류될 수 있으며, B03은 고-효능 HERG 채널 차단제로 식별된다. 결과는 하기 표에 제공된다.
[표 18]
HERG 억제 결과
Figure 112010074648699-pct00029
분자량
분자량은 임의의 상대 이온 또는 첨가물을 배제한 단량체성 분자의 이론적인 질량으로 규정된다. 화합물의 분자량은 하기 표에 나타난다.
[표 19]
화합물의 분자량
Figure 112010074648699-pct00030
Figure 112010074648699-pct00031
ADME - Tox
각종 화합물의 ADME-Tox 분석법은 실시예 5에 나타난 바와 같이 수행되었다. 요약 결과를 하기 표에 나타낸다.
[표 20]
요약 ADME-Tox 자료
Figure 112010074648699-pct00032
간략히, 수용해도를 PBS pH 7.4에서 시험하였다. 결과를 μM 단위로 제시한다. 단백질분해성 안정성을 인간 혈장 내에서 30 분 간 시험하였다. 각각에 대한 결과는 % 안정성으로 제시한다. 마이크로솜성 안정성을 생쥐 마이크로솜성 제제 내에서 30 분 간 시험하였다. 결과를 % 안정성으로 제시한다. HERG 채널 억제를 펩티드 또는 펩티드 유도체가 1 μM인 패치 클램프 방법을 사용하여 시험하였고 % 억제로 제시하였다.
동물 모델
하기 분석법은 동물 내에서 수행된다.
1. 급성 독성학
독성학 연구는 하루에 2 번이며, 적용 후의 즉각적인 독성 효과에 기인한 태도 변화의 모니터링에 관련된다; 체중의 모니터링; 뇌, 심장, 신장, 간, 폐의 조직병리학. 실험을 C57BI/6 생쥐 내에서 수행하였다.
2. 약물동태학
화합물의 약물동태학을 1 - 30 mg/kg인 위스타(Wistar) 쥐 또는 C57BI/6 생쥐에서 시험하였다. 혈류 내의 화합물 농도를 LC-MS를 사용하여 적절한 간격으로 모니터링하였다.
3. 순환 분석
혈압 및 심박을 모니터링하고 심전도를 C57BI/6 생쥐 내에서 취하였다.
4. 동물 질병 모델
꼬리 클립 모델을 FVIII -/- (E17) 생쥐, FIX -/- 생쥐 및 C57BI/6 대조군 생쥐에서 사용하였다. 정량화된 변수는 총 혈액 손실, 출혈 시간, 출혈 속도 및 생존율이다.
급성 독성학
18-20 g 무게의 C57BI/6 생쥐에 10 ml/kg으로 적절한 비히클 내의 화합물을 꼬리 정맥내로 i.v. 또는 i.p. 또는 s.c 투여하였다. 투여된 화합물의 양은 0.075 내지 125 mg/kg (i.v.), 15-125 mg/kg (i.p.) 및 125 mg/kg (s.c)의 범위에 있었다. 일 군 당 4 마리 생쥐가 있었다. 독성 효과에 기인한 태도 변화는 화합물의 투여 후 즉시 및 그 후 60 분 후에 모니터링하였다. 체중을 투여 후 5 일간 모니터링하였다. 투여 후 5 일에, 생쥐들을 추려내서 해부를 했다. 뇌, 심장, 신장, 간, 폐 및 비장을 생체조직검사를 하였다. 결과는 하기에 설명된다.
[표 21]
상이한 화합물 용량에서 독성 효과에 기인한 태도 변화
Figure 112010074648699-pct00033
Figure 112010074648699-pct00034
상술한 표에서, 투여 후의 60 분의 기간에 걸쳐 검출된 독성이 없거나, 일부 독성 또는 중증 독성을 나타낸 시험된 최대 용량이 보고되었다. "검출된 독성 없음"은 급성 독성 관찰이 없었음을 나타낸다. "일부 독성"은 실조 또는 강경증이 보고되었음을 나타내나, 동물이 사망하지 않았다. "중증 독성"은 화합물 적용의 1 시간 이내에 동물 중의 하나가 죽었음을 나타낸다.
요약하면, 대부분의 화합물이 잘 관용되었다. 특정 경로에 의해 투여된 경우 중증 독성을 야기한 화합물의 용량은 그 경로에 의해 약물동태학, 순환 분석 또는 동물 질병 모델에서 시험되지 않았다.
대부분의 화합물에 대해, 최고 용량에서조차, 육안에 의한 병리학적 소견이 생존한 생쥐로부터의 5 일째에 수집된 생체조직검사 샘플에서 관찰되지 않았으며, 화합물들이 잘 관용되었다는 것을 나타내었다. 임의의 동물에서 식별된 병리학적 변화는 오직 간, 신장, 폐 또는 심장 내의 가벼운 기형이었다. 이들은 아마도 추려냄 또는 비 화합물-관련된 가벼운 감염에 기인한 단일 동물 내의 자발적인 관찰이었다.
시험된 각각의 화합물에 대해, 생존 생쥐의 평균 체중 상의 효과, 음성 반응의 표시는 인식되지 않았다.
화합물의 약물동태학
약물동태학 연구는 i.v., i.p. 또는 s.c. 투여에 이은 혈장 내의 화합물 농도를 모니터링하기 위해 수행되었다. 연구는 약 20 g의 무게가 나가는 C57BI/6 생쥐 내에서 수행되었다.
각각의 펩티드에 대해, 모든 투여 경로에 대해 동일한 제형을 사용하였고 다음과 같았다: A01을 5 % DMSO, 5 % 크레모포어 EL(시그마-알드리치), 0.5 % 트윈 80에서 제형화하고; A02 및 A09를 각각 5% DMSO, 30% PEG 400 (폴리에틸렌 글리콜) 50 mM 소듐 포스페이트 pH 7.4에서 제형화하고; A05를 5% DMSO, 20 mM 글리신 pH 9.0에서 제형화하고; A06 및 A07을 각각 5% DMSO, 0.9 % NaCl, 50 mM 소듐 포스페이트 pH 7.4에서 제형화하였다.
혈장 내의 펩티드 농도를 질량 분석계 LCQ 클래식이 결합된 서베이어(Surveyor) HPLC 또는 ESI-공급원이 구비된 어드벤티지(Advantage)(모두 써모일렉트론(Thermo Electron), 미국) 위에서 HPLC-MS에 의해 분석하였다. 모든 HPLC 실험을 페노미넥스(Phenomenex) C-18 루나(Luna) 칼럼(50 mm x 2.0 mm, 5 ㎕ 주입 부피) 위에서 선형 구배를 사용하여 수행하였다: 용리액 A 물 중의 0.05 % 트리플루오로아세트산(TPA); 용리액 B 아세토니트릴 중의 0.05 % TFA; 10 분 안에 유속 0.3 mL/분. UV 스펙트럼을 220 내지 400 nm PDA에 의해 기록하였다. 내부 표준이 100 % 메탄올 내의 0.1 ㎍/ml 용액으로 제조되었다. 100 ㎕ 메탄올을 첨가하고 균일하게 혼합하였다. 얼음 위에서 30 분 배양 후 바이알을 4 ℃에서 15 분 동안 원심분리한다(20820 g). 150 ㎕의 상청액을 HPLC 바이알 안으로 이전하였다.
i.v. 또는 i.p 투여 후의 결과는 하기의 표에 나타난다. 간략히, i.v. 투여 후의 혈장으로부터의 펩티드 간극(clearance)은 대략 로그함수적인 코스를 따랐다. i.p. 투여 후에, C최대가 40 내지 60 분 사이에 도달되었다. 그 후 화합물 농도에서의 감소가 뒤따랐다. 이 프로파일은 i.p. 또는 s.c. 투여에서 전형적이다.
[표 22]
약물동태학 분석법에서 획득한 자료
Figure 712014001338000-pct00035
A01의 투여에 이은 순환 분석법
각각이 약 20 g 무게인 세 마리 수컷 및 세 마리 암컷 C57BI/6 생쥐의 3 군 내에서 평균 동맥상 혈압 및 심박을 모니터링하고 심전도를 취했다. 군들을 10 ml/kg NaCl을 i.v. 수용하는 "대조군"; 10 ml/kg을 i.v. 수용하는 "비히클"; 또는 20 mg/kg i.v.으로 비히클 내의 A01을 수용하는 "화합물"로 지명하였다. "비히클"은 주입을 위해 물 내의 트윈(Tween) 80 0.05 %, 크레모포어 EL (시그마-알드리치) 5 %, DMSO 5 %였다.
각각의 생쥐에 대해서, 염수/헤파린으로 충전된 카테터를 대동맥(aorta carotis)에 고정시켰다. 카테터를 혈압 플러그시스-모듈(Plugsys-module)(휴고 삭스 일렉트로니크-하버드 아파라터스 게엠베하(Hugo Sachs Electronik-Harvard Apparatus GmbH), 독일(HSE))에 탐촉자를 거쳐 연결하였다. ECG 전극을 s.c. 이식하였고, ECG 플러그시스-모듈(HSE)를 거쳐 PC에 연결하였다. 심박을 ECG로부터 계산하였다. 순환 변수를 안정화시키기 위한 10 분 이상의 기간 후에, 염수, 비히클 또는 화합물을 경정맥에 연결된 카테터를 거쳐 적절하게 투여하였다. 투여 후 60 분 동안 순환 변수들을 모니터링하고, 기록하였다. 각각의 동물에 대해, 연구 약물 투여 후의 관찰 기간 동안의 평균 동맥성 혈압 및 심박에서의 타임 코스(time course)를 선형 사다리꼴 법칙을 사용하여 곡선 아래의 면적(AUC)을 사용하여 추정하였다. 각각의 AUC(A01 20 mg/kg i.v.)를 비히클(10 mL/kg i.v.) 및 염수(10 mL/kg i.v.)의 그것과 비교하였다. 가치없는 추정(화합물과 비히클 또는 염수와의 차이가 없음)은 정확한 윌콕손 랭크 합계 시스템(Wilcoxon rank sum test)를 사용하여 평가하였다. 다중 비교를 위한 미조정된 및 조정된 2-측 p-값을 계산하였다. 다중성을 위한 조정을 본페로니-홀름(Bonferroni-Holm) 방법을 사용하여 수행하였다. 유의성의 수준은 5 %로 설정하였다. 모든 통계학적인 분석들을 R 버전 2.4.0.으로 수행하였다. 차이가 없다는 가치없는 추정을 2-측 대체물에 대하여 시험하였다. 결과를 하기 표에 나타낸다.
[표 23]
순환 분석의 통계학적 결과
Figure 112010074648699-pct00036
A01 01 20 mg/kg i.v. 및 염수 10 ml/kg i.v. 사이와 A01 20 mg/kg i.v. 및 비히클 10 ml/kg i.v. 사이의 연구 약물의 투여 후 60 분 이내에 평균 동맥의 혈압에서 AUC의 통계학적으로 유의한(5 % 수준에서의) 차이는 없었다. A01 20 mg/kg i.v. 및 염수 10 ml/kg i.v. 사이와 A01 20 mg/kg i.v. 및 비히클 10 ml/kg i.v. 사이의 연구 약물의 투여 후 60 분 이내에 심박에서 AUC의 통계학적으로 유의한(5 % 수준에서의) 차이는 없었다.
동물 질병 모델-대조군 실험
생쥐 꼬리 클립 분석법을 하기 위해 실험을 수행하여 FVIII (E17)-/-, FIX-/- (문헌[Lin HF Blood 1997; 90: 3962-6]) 및 야생형 C57BI/6 생쥐 내의 출혈 변수 및 그들의 응고 인자 제제에 대한 반응을 특성화하였다.
시험된 응고 인자 제제는 애드베이트®(Advate®) 및 이뮤닌®(Immunine®)이었다. 애드베이트®는 rFVIII 제제(벡스터 AG, 오스트리아)이다. 이뮤닌®은 정제된 혈장 FIX 제제(벡스터 AG, 오스트리아)이다.
혈액 손실을 꼬리 클립 분석법에서 꼬리 클립 후 62 분 동안 구체적인 설명에 설명된 바와 같이 모니터링하였다. FVIII -/- 생쥐에 25, 50 또는 100 U/kg i.v.의 rFVIII(애드베이트®) 또는 비히클만을 투여하였다. 비히클은 38 mg/ml 만니톨, 10 mg/ml 트레할로오스, 108 mEq/l 소듐, 12 mM 히스티딘, 12 mM 트리스, 1.9 mM 칼슘, 0.17 mg/ml 폴리소르베이트-80, 0.1 mg/ml 글루타티온인 애드베이트 제제 완충액이었다. 대조군으로서, C57BI/6 생쥐에 비히클만을 투여하였다. rFVIII의 투여는 62 분에 걸쳐 혈액 손실의 용량 의존적 감소를 야기했다. 실험에 대한 생존율 자료가 하기 표에 나타난다.
[표 24]
꼬리 클립 실험에서의 애드베이트® FVIII으로 처리된 FVIII -/- 생쥐의 생존율
Figure 712014001338000-pct00037
50, 100 또는 200 U/kg i.v.의 이뮤닌® FIX 또는 비히클만을 투여한 FIX -/- 생쥐의 꼬리 클립 후 62 분 동안 혈액 손실을 모니터링하였다. 대조군으로서, C57BI/6 생쥐에 비히클만을 투여하였다. FIX의 투여는 62 분에 걸친 혈액 손실의 용량-의존성 감소를 야기했다. 실험에 대한 생존율 자료가 하기 표에 나타난다.
[표 25]
꼬리 클립 실험에서의 이뮤닌® FIX로 처리된 FIX -/- 생쥐의 생존율
Figure 712014001338000-pct00038
본 자료는 FVIII -/- 모델에서, 25-100 U/kg 용량에서의 애드베이트® FVIII가 의존적으로 출혈 변수 및 생존율을 개선시키는 것을 보인다. FIX -/- 모델에서, 50-200 U/kg 용량의 이뮤닌® FIX는 의존적으로 출혈 변수 및 생존율을 개선시킨다. 따라서, FVIII -/- 모델은 리드 화합물(lead compound)의 응고 FVIII 활성을 시험하기에 적절한 모델이다. FIX -/- 모델은 화합물의 응고 FIX 활성을 시험하기에 적절한 모델이다.
동물 질병 모델-A01의 효능
FVIII -/- 생쥐의 생존율 및 출혈 변수에 미치는 투여된 A01의 효과를 구체적인 설명에 설명된 꼬리 클립 모델에서 시험하였다. FIX -/- 생쥐에서 유사한 실험을 수행하였다.
비히클만이 투여된 생쥐의 대조군에 의한 혈액 손실의 평균 부피에 비교하여, 꼬리 클립 5 분 전에 20 mg/kg of A01 i.v. 투여된 8 수컷 및 8 암컷 FVIII -/- 생쥐의 군에서 꼬리 클립 후의 혈액 손실의 평균 부피가 대부분의 시점에서 현저히 상이했다(p <0.05). 비히클은 주입을 위해 물 중 0.05 % 트윈 80, 5 % 크레모포어 EL, 5 % DMSO였다. 꼬리 클립 52 및 62 분 후에, p <0.01에서 차이는 현저했다. 자료는 도 2 및 하기 표에 나타내었다. 본 실험에서 생쥐의 생존율 곡선을 비교하기 위해 사용된 로그-랭크(log-rank) 시험은 비히클 대조군에서보다 A01 20 mg/kg i.v에서 통계학적으로 유의한 더 긴 생존을 보였다(p-값 = 0.0028).
[표 26]
꼬리 클립 실험에서의 A01 처리된 FVIII -/- 생쥐의 생존율
Figure 112010074648699-pct00039
상술한 실험을 반복하여 이의 재현성의 지표를 제공하였다. 결과는 하기 표에 나타내었다. 이들 두 개의 독립적으로 수행된 실험에서 변동성이 관찰되기는 했지만, A01으로 처리된 동물이 덜 출혈하고 더 길게 생존했다.
[표 27]
꼬리 클립 실험에서의 A01으로 처리된 FVIII -/- 생쥐의 생존율
Figure 112010074648699-pct00040
꼬리 클립을 0.5 cm가 아닌 1 cm로 한 것과 생쥐들을 성별에 따라 분류한 것 이외는 동일한 모델을 사용하여 추가적인 자료가 얻어졌다. 제제를 i.v. 투여하였다. 본 실험에서, A01은 암컷에서 수컷 생쥐보다 더 효과적인 것으로 나타났다. 결과는 하기 표에 나타낸다.
[표 28]
꼬리 자름 실험에서의 FVIII -/- 생쥐에서의 A01의 성별 효과
Figure 112010074648699-pct00041
Figure 112010074648699-pct00042
다르게 지시되지 않는 한, 군은 동일한 수의 수컷 및 암컷 생쥐를 포함했다.
비히클만이 투여된 생쥐의 대조군에 의한 혈액 손실의 평균 부피에 비교하여, 꼬리 클립 5 분 전에 20 mg/kg의 A01이 i.v. 투여된 16 FIX -/- 생쥐의 군에서 꼬리 클립 후의 혈액 손실의 평균 부피가 임의의 시점에서 현저히 상이하지 않았다(p <0.05). A01 투여된 생쥐 및 비히클만이 투여된 생쥐의 생존율 사이에는 현저한 차이가 없었다.
이들 결과는 꼬리 클립 후의 증가하는 생존율 및 혈액 손실의 감소에 의해 A01이 FVIII-/- 생쥐 내의 FVIII의 부족을 적어도 부분적으로 보상할 수 있지만 FIX-/- 생쥐에서는 효과가 없음을 입증한다. A01은 가장 바람직한 펩티드로 여겨지며 이는 혈우병 모델에서 효능을 입증했기 때문이다.
FVIII-/- 생쥐 꼬리 클립 모델에서의 화합물 시험의 결과
A01을 i.p. 투여에 의해 0.5 cm 꼬리 클립을 사용한 FVIII -/- 꼬리 클립 모델 내에서 추가적으로 시험하였다. 자료는 하기의 표에 요약된다.
[표 29]
꼬리 클립 실험에서의 A01으로 처리된 FVIII -/- 생쥐의 생존율
Figure 712014001338000-pct00043
Figure 712014001338000-pct00044
A01 20 mg/kg이 투여된 암컷 생쥐는 비히클 10 ml/kg i.p.이 투여된 암컷 생쥐보다 통계학적으로 유의한 (5 % 수준에서) 더 긴 생존율을 가졌다(이-측면 p-값 p=0.0073; 로그-랭크 시험). A01 20 mg/kg i.p.이 투여된 수컷 생쥐와 비히클 10 ml/kg i.p이 투여된 수컷 생쥐 간의 생존율 곡선에서 통계학적으로 유의한 차이(5 % 수준에서)는 없었다. 본 실험에서, 대조군의 수컷은 대조군의 암컷보다 더 잘 생존하는 것으로 보였다.
리드 화합물의 특성화를 위한 실험의 요약
하기의 화합물들은 규정된 내생 트롬빈 발생 분석법에서 활성을 가졌다: A01, A03, A05, A19, B01, A02, B03, B05, B06, A06, A20, A07, A08, A09 및 B07. 이들 중에서, A03, A02, B03, A08 및 A09는 100 μM의 1200 mU/mL 이상 FEIBA에서 트롬빈 발생 활성을 가졌다.
하기의 화합물들은 규정된 이중-경로 트롬빈 발생 분석법에서 활성을 가졌다: A02, A03, A08, A09, A18, B03, B04, A07, A15, A06 및 A17. 이들 중에서, A09는 50 μM의 10 mU/mL 이상 FEIBA에서 피크 IIa 활성을 가졌다. B03, B04 및 A15는 50 또는 100 μM의 10 mU/mL 이상 FEIBA에서 피크 IIa 활성을 가졌다.
하기의 화합물들은 규정된 피브린 침착 분석법에서 활성을 가진다: A01, B01, A05, B03, A06 및 A07.
하기의 화합물들은 인간 혈장 내에서 30 분 동안의 배양 후 50 % 이상의 안정성을 가진다: A01, A19, A07, A20, A06, A02, A03, A08, A09, B07, B06, B05 및 A05.
하기의 화합물은 PBS pH 7.4에서 25 μM 이상의 가용성을 가진다: A09, B03, B07, B06, B05, A07, A20, A06, A02, A03 및 A16. 이들 중에서, B03, B07, B05, A07, A20, A06, A03 및 A16은 PBS pH 7.4 내에서 100 μM 이상의 가용성을 가진다.
A01, A05 및 A16은 저-효능 HERG-채널 차단제로서 식별된다.
A01은 FVIII-/- 생쥐 내에서 꼬리 클립 분석법에서 활성을 갖는 것으로 식별된다.
성인 인간 대상물 내의 혈우병 A의 치료
높은 용량 FVIII 요법 후에 FVIII에 대한 동종항체 억제제가 발달되는 것이 혈우병 A 환자에 있어 통상적이다. 통상적인 시나리오에서, 환자의 혈액 혈장으로부터 준비된 혈청 중의 이러한 항체의 존재는 임상의에 의해 모니터링된다. 항체 반응의 역가가 허용불가하게 높아질 때, 예를 들어 약 5 BU일 때, 임상의는 환자에 FVIII을 주입하는 것을 중지하고 본 발명의 펩티드, 예컨대, 펩티드 A01의 투여를 시작하기로 결정할 수 있다.
펩티드는 알부민 쉘(albumin shell)에서 US 5,439,686에 설명된 바와 같이 약 10 μm 직경을 갖는 마이크로입자로 제형화될 수 있고, 수성 매체에 현탁될 수 있다. 환자는 스스로 분무기를 사용하여 흡입에 의해 제형을 투여할 수 있다. 5 또는 10 mg의 일일 또는 일일 2회 용량이 흡입될 수 있다. 임상의는 효능을 확인하기 위해, 펩티드 요법의 시작 후에 곧 부분적인 트롬보플라스틴 시간을 시험할 수 있다. 결과에 따라서, 용량은 따라서 변화될 수 있다. 실질적으로 용량을 증가시키는 것이 필요하다면, 더 작은 마이크로입자, 통상적으로 약 5 μm 직경이 사용될 수 있고, 이들은 정맥 내로 투여될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Baxter International Inc. Baxter Healthcare S.A. <120> Biologically active peptides <130> 31315/44907 <140> US 12/425,277 <141> 2009-04-16 <150> US 61/009,326 <151> 2008-04-17 <150> US 61/113,055 <151> 2008-11-10 <160> 434 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Trp, Leu or Pro <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Asp or Ser <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa is Leu or Phe <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa is Phe or Leu <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> Xaa is Ile or Phe <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa is Val, Ser or Gly <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> Xaa is Trp or Leu <400> 1 Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Arg or Pro <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Met, Nva, Asn, Nle, or Gln <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa is Glu, Lys or Asp <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> Xaa is Trp, Leu or Pro <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa is Asp or Ser <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> Xaa is Leu or Phe <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Phe or Leu <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> Xaa is Ile or Phe <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> Xaa is Val, Ser or Gly <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> Xaa is Trp or Leu <400> 2 Xaa Xaa Xaa Phe Asp Val Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A06 <400> 3 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp Glu 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A09 <400> 4 Glu Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Nva <400> 5 Glu Arg Xaa Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A14 <400> 6 Trp Ser Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp Glu 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A19 <400> 7 Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 8 Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A24 <400> 9 Glu Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A30 <400> 10 Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp Lys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A33 <400> 11 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Ser Trp Glu 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A34 <400> 12 Trp Asp Leu Tyr Leu Glu Ile Val Trp Glu 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A35 <400> 13 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Leu Glu 1 5 10 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide A52 <400> 14 Lys Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A57 <400> 15 Glu Arg Met Glu Phe Asp Val Leu Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A58 <400> 16 Glu Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Leu 1 5 10 15 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A84 <400> 17 Trp Asp Phe Tyr Phe Glu Ile Val Trp Glu 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A85 <400> 18 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Phe Val Trp Glu 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A86 <400> 19 Leu Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp Glu 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A87 <400> 20 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Gly Trp Glu 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A89 <400> 21 Trp Asp Leu Tyr Leu Glu Ile Ser Leu Glu 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A92 <400> 22 Leu Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Leu Glu 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence A93 <220> <223> Synthetic Peptide A93 <400> 23 Leu Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Ser Leu Glu 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A95 <400> 24 Leu Ser Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp Glu 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A96 <400> 25 Leu Ser Leu Tyr Phe Glu Ile Val Leu Glu 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A97 <400> 26 Leu Ser Leu Tyr Phe Glu Ile Ser Leu Glu 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A22 <400> 27 Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A45 <400> 28 Lys Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A47 <400> 29 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp Lys 1 5 10 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A73 <400> 30 Glu Arg Asn Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A88 <400> 31 Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp Glu 1 5 10 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A98 <400> 32 Leu Ser Leu Tyr Leu Glu Ile Val Leu Glu 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A99 <400> 33 Leu Ser Leu Tyr Leu Glu Ile Ser Leu Glu 1 5 10 <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A10 <400> 34 Glu Pro Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A60 <400> 35 Glu Arg Met Asp Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide A75 <400> 36 Glu Arg Gly Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 37 Ala Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 38 Cys Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 39 Asp Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 40 Glu Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 41 Phe Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 42 Gly Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 43 His Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 44 Ile Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 45 Lys Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 46 Leu Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 47 Met Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 48 Asn Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 49 Gln Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 50 Ser Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 51 Thr Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 52 Val Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 53 Trp Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 54 Tyr Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 55 Arg Ala Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 56 Arg 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Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 63 Arg Lys Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 64 Arg Leu Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 65 Arg Asn Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 66 Arg Pro Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 67 Arg Gln Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 68 Arg Arg Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe 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Hfe, Ece, Cha <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> Xaa is Ile or Phe <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> Xaa is Ser, Val or Gly <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> Xaa is Trp or Leu <400> 327 Xaa Xaa Xaa Phe Asp Val Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 328 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Arg or Pro <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Met or Nva <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa is Glu, Lys or Asp <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> Xaa is Trp or Leu <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa is Asp or Ser <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> Xaa is Leu or Phe <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Phe, Phg or Leu <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> Xaa is Ile or Phe <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> Xaa is Ser, Val or Gly <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> Xaa is Trp or Leu <400> 328 Xaa Xaa Xaa Phe Asp Val Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 329 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> C-terminal amidation <400> 329 Arg Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 330 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> C-terminal amidation <400> 330 Pro Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 331 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> C-terminal amidation <400> 331 Arg Met Asp Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 332 <211> 15 <212> PRT 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D-Asp <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> D-Lys <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> D-Met <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> D-Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> C-terminal amidation <400> 382 Trp Val Ile Glu Phe Tyr Leu Asp Trp Val Asp Phe Lys Met Arg 1 5 10 15 <210> 383 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <400> 383 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 <210> 384 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetyl group linked to Trp via ttds linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> C-terminal amidation <400> 384 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 <210> 385 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> C-terminal amidation <400> 385 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 <210> 386 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 386 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 <210> 387 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetyl group linked to Trp via ttds linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 387 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 <210> 388 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> C-terminal ttds <400> 388 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 <210> 389 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 389 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 <210> 390 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> C-terminal amidation <400> 390 Lys Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 <210> 391 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Lys linked to Trp via ttds linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> C-terminal amidation <400> 391 Lys Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 <210> 392 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <400> 392 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp Lys 1 5 10 <210> 393 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> C-terminal amidation <400> 393 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp Lys 1 5 10 <210> 394 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is methioninesulfone <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> C-terminal amidation <400> 394 Glu Arg Xaa Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 395 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> C-terminal amidation <400> 395 Glu Arg Asn Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 396 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is 3,3-diphenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 396 Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Xaa Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 397 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is 4-fluorophenyl-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 397 Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Xaa Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 398 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <400> 398 Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp Glu 1 5 10 <210> 399 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <400> 399 Leu Ser Leu Tyr Leu Glu Ile Val Leu Glu 1 5 10 <210> 400 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <400> 400 Leu Ser Leu Tyr Leu Glu Ile Ser Leu Glu 1 5 10 <210> 401 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 401 Leu Ser Leu Tyr Xaa Glu Ile Val Leu Glu 1 5 10 <210> 402 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(10) <223> Trp linked to Lys via ttds linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> C-terminal amidation <400> 402 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp Lys 1 5 10 <210> 403 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> C-terminal amidation <400> 403 Glu Pro Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 404 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 404 Arg Met Asp Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 405 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Covalently bound to PEG5000 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> C-terminal amidation <400> 405 Arg Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 406 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> N-terminal amidation <400> 406 Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 <210> 407 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> C-terminal amidation <400> 407 Lys Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 408 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 408 Pro Met Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 409 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> C-terminal amidation <400> 409 Glu Arg Met Asp Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 410 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Cysteic Acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Cystic Acid linked to Arg via ttds linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 410 Xaa Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 411 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Glucosyl-aminooxyacetyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Glucosyl-aminooxyacetyl linked to Arg via ttds linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 411 Xaa Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 412 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is methioninesulfone <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> C-terminal amidation <400> 412 Pro Xaa Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 413 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is norleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> C-terminal amidation <400> 413 Pro Xaa Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 414 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> C-terminal amidation <400> 414 Pro Asn Lys Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 415 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is methioninesulfone <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> C-terminal amidation <400> 415 Arg Xaa Asp Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 416 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is norleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> C-terminal amidation <400> 416 Arg Xaa Asp Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 417 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal acetylation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> C-terminal amidation <400> 417 Arg Asn Asp Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 418 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is norleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 418 Arg Xaa Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 419 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 419 Arg Asn Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 420 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Norleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> C-terminal amidation <400> 420 Glu Arg Xaa Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 421 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is methioninesulfoxide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> C-terminal amidation <400> 421 Glu Arg Xaa Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 422 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> C-terminal amidation <400> 422 Glu Arg Gln Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 423 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is propargylglycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> C-terminal amidation <400> 423 Glu Arg Xaa Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 424 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is 2-thienylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 424 Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Xaa Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 425 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is 1-naphthyl-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 425 Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Xaa Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 426 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is homophenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 426 Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Xaa Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 427 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is s-benzyl-L-cysteine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 427 Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Xaa Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 428 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-terminal ttds <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is cyclohexylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Linked to ttds, which terminates in an amide <400> 428 Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Xaa Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 429 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> C-terminal amidation <400> 429 Lys Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 <210> 430 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Lys linked to Trp via ttds linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> C-terminal amidation <400> 430 Lys Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 <210> 431 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 431 Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 432 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 432 Xaa Xaa Leu Tyr Ile Glu Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 433 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synethic peptide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 433 Glu Arg Xaa Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Phe Glu Ile Val Trp 1 5 10 15 <210> 434 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 434 Arg Met Glu Phe Asp Val Trp Asp Leu Tyr Xaa Glu Ile Val Trp 1 5 10 15

Claims (58)

  1. (i) WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 322); 또는
    (ii) WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 322)에서 1, 2, 3 또는 4개의 L-아미노산이 치환된 것인 X1X2X3YX4EX5X6X7 (여기에서 X1은 W, L 또는 P, X2는 D 또는 S, X3는 L 또는 F, X4는 F, Phg, L, Ebw, Pff, Thi, 1Ni, Hfe, Ece 또는 Cha, X5는 I 또는 F, X6는 S, V 또는 G 및 X7은 W 또는 L (SEQ ID NO: 323); 또는
    (iii) (i) 또는 (ii) 부분에서 정의된 펩티드 또는 펩티드 유도체의 레트로-인버소 변형된 펩티드 또는 펩티드 유도체
    를 갖고, 상기 유도체는 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 링커기(linker group) 또는 다른 공유적으로 연결된 기의 변형물을 함유하는 것이고, 응고촉진 활성을 갖는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, X1X2X3YX4EX5X6X7을 갖고, 여기에서 X1은 W 또는 L, X2는 D 또는 S, X3는 L 또는 F, X4는 F, Phg 또는 L, X5는 I 또는 F, X6는 S, V 또는 G 및 X7은 W 또는 L (SEQ ID NO: 324)인 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  4. 제1항에 있어서,
    (1) RMEFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 325); 또는
    (2) RMKFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 326); 또는
    (3) RMEFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 325) 또는 RMKFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 326)의 펩티드 유도체로, X1X2X3YX4EX5X6X7을 갖고, 여기에서 X1은 W, L 또는 P, X2는 D 또는 S, X3는 L 또는 F, X4는 F, Phg, L, Ebw, Pff, Thi, 1Ni, Hfe, Ece 또는 Cha, X5는 I 또는 F, X6는 S, V 또는 G 및 X7은 W 또는 L인 펩티드 유도체
    를 갖는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  5. 제4항에 있어서, X8X9X10FDVX1X2X3YX4EX5X6X7(여기에서 X8은 R 또는 P, X9는 M, Nva, Moo, N, Nle, Meo, Q, 또는 Eag, X10은 E, K 또는 D, X1은 W, L 또는 P, X2는 D 또는 S, X3는 L 또는 F, X4는 F, Phg, L, Ebw, Pff, Thi, 1Ni, Hfe, Ece, 또는 Cha, X5는 I 또는 F, X6는 S, V 또는 G 및 X7은 W 또는 L) (SEQ ID NO: 327)을 갖는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  6. 제5항에 있어서, X8X9X10FDVX1X2X3YX4EX5X6X7(여기에서 X8은 R 또는 P, X9는 M 또는 Nva, X10은 E, K 또는 D, X1은 W 또는 L, X2는 D 또는 S, X3는 L 또는 F, X4는 F, Phg 또는 L, X5는 I 또는 F, X6는 S, V 또는 G 및 X7은 W 또는 L) (SEQ ID NO: 328)을 갖는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  7. 제1항에 있어서, N-말단에서 아세틸화되고, C-말단에서 아미드화되거나 두 말단 중 하나에서 페길화된 펩티드 유도체.
  8. 제1항에 있어서, 환형인 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  9. 제1항에 있어서,
    Ac-RMKFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 329), Ac-PMKFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 330), Ac-RMDFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 331), Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 332), Ac-WDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 333), Ac-WDLYFEIVWE (SEQ ID NO: 334), Ac-WDLYFEIVW-ttds-E (SEQ ID NO: 335), ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 336), ERMEFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 337), ER(Nva)EFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 338), ttds-RMEFDVWDLY(Phg)EIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 339), Ac-WSLYFEIVWE (SEQ ID NO: 340), Ac-WDLYFEISW-ttds-E (SEQ ID NO: 341), PEG5000-RMKFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 342), PEG5000-WSLYFEIVWE (SEQ ID NO: 343), PEG5000-ERMEFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 344), Ac-VWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 345), Ac-FDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 346), EWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 347), E-ttds-WDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 348), Ac-WDLYFEIVW-ttds-E-NH 2 (SEQ ID NO: 349), Ac-RMEFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 350), RMEFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 325), Ac-K-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-NH 2 (SEQ ID NO: 351), Ac-RMEFDVWDLYFEIVWK (SEQ ID NO: 352), Ac-RMEFDVWDLYFEIVWK-NH2 (SEQ ID NO: 353), Ac-RMEFDVWDLYFEIVW- ttds-K-NH2 (SEQ ID NO: 354), Ac-WDLYFEISWE (SEQ ID NO: 355), Ac-WDLYLEIVWE (SEQ ID NO: 356), Ac-WDLYFEIVLE (SEQ ID NO: 357), WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 322), RMEFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 358), Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 359), Ac-KRMEFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 360), K-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 361), Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-K (SEQ ID NO: 362), Ac-LDLYFEIVW-ttds-E (SEQ ID NO: 363), Ac-WDLYFEIVL-ttds-E (SEQ ID NO: 364), E-RMEFDVLDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 365), E-RM EFDVWDLYFEIVL-NH2 (SEQ ID NO: 366), Ac-WDFYFEIVW E (SEQ ID NO: 367), Ac-WDLYFEFVWE (SEQ ID NO: 368), Ac-LDLYFEIVWE (S EQ ID NO: 369), Ac-WDLYFEIGWE (SEQ ID NO: 370), Ac-WDLYLEISLE (SEQ ID NO: 371), Ac-WDLYXEIVLE (SEQ ID NO: 372), Ac-WSLYXEIVWE (SEQ ID NO: 373), Ac-LDLYFEIVLE (SEQ ID NO: 374), Ac-LDLYFEISLE (SEQ ID NO: 375), Ac-LDLYXEISWE (SEQ ID NO: 376), Ac-LSLYFEIVWE (SEQ ID NO: 377), Ac-LSLYFEIVLE (SEQ ID NO: 378), Ac- LSLYFEISLE (SEQ ID NO: 379), Ac-WDLYFEIVW-ttds-K (SEQ ID NO: 380), Ac-DVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 381), Ac-wviefyldwvdfkmr-NH2 (SEQ ID NO: 382), Ac-WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 383), Ac-ttds-WDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 384), ttds-WDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 385), Ac-WDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 386), Ac-ttds-WDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 387), ttds-WDLYFEIVW-ttds (SEQ ID NO: 388), ttds-WDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 389), Ac-KWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 390), Ac-K-ttds-WDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 391), Ac-WDLYFEIVWK (SEQ ID NO: 392), Ac-WDLYFEIVWK-NH2 (SEQ ID NO: 393), E-R(Moo)EFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 394), E-RNE FDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 395), ttds-RMEFDVWDLY(Ebw)EIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 396), ttds-RMEFDVWDLY(Pff)EIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 397), Ac-PDLYFEIVWE (SEQ ID NO: 398), Ac-LSLYLEIVLE (SEQ ID NO: 399), Ac-LSLYXEIVLE (SEQ ID NO: 401), Ac-WDLYFEIVW-ttds-K-NH2 (SEQ ID NO: 402), E-PMKFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 403), ttds-RMDFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 404), PEG5000-RMKFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 405), WDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 406), KRMEFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 407), ttds-PMKFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 408), E-RMDFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 409), (Coh)-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 410), 글루코실-아미노옥시아세틸-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 411), Ac-P(Moo)KFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 412), Ac-P(Nle)KFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 413), Ac-PNKFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 414), Ac-R(Moo)DFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 415), Ac-R(Nle)DFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 416), Ac-RNDFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 417), ttds-R(Nle)EFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 418), ttds-RNEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 419), E-R(Nle)EFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 420), E-R(Meo)EFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 421), E-RQEFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 422), E-R(Eag)EFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 423), ttds-RMEFDVWDLY(Thi)EIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 424), ttds-RMEFDVWDLY(1Ni)EIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 425), ttds-RMEFDVWDLY(Hfe)EIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 426), ttds-RMEFDVWDLY(Ece)EIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 427), ttds-RMEFDVWDLY(Cha)EIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO: 428), KWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 429), 또는 K-ttds- WDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO: 430) (여기에서 -ttds-는 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민, (Nva)는 노르발린, (Phg)는 페닐글리신, (Coh)는 시스테인산, (Moo)는 메티오닌술폰, (Ebw)는 3,3-디페닐알라닌, (Pff)는 4'-플루오로페닐-알라닌, (Nle)는 노르류신, (Meo)는 메티오닌술폭시드, (Eag)는 프로파르길글리신(propargylglycine), (Thi)는 2-티에닐알라닌, (1Ni)는 1-나프틸-알라닌, (Hfe)는 호모페닐알라닌, (Ece)는 s-벤질-L-시스테인, (Cha)는 시클로헥실알라닌임)을 갖거나, 이것으로 구성된 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  10. 삭제
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  19. 제1항, 제3항, 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 규정된 제2 펩티드 또는 제2 펩티드 유도체에 접합된 제1항에 규정된 제1 펩티드 또는 제1 펩티드 유도체를 포함하고, 여기에서 제1 펩티드 또는 제1 펩티드 유도체는 제2 펩티드 또는 제2 펩티드 유도체와 동일하거나 상이할 수 있고, 응고촉진 활성을 가지는 이중 펩티드.
  20. 삭제
  21. 제1항에 있어서, 0.5 내지 3.5 kD의 분자량을 가지는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  22. 삭제
  23. 제1항에 있어서, 상기 응고촉진 활성이 규정된 내생 트롬빈 발생 분석법(Defined Intrinsic Thrombin Generation Assay)에서 100 mU/mL 이상의 인자 8 억제 바이패싱 활성(FEIBA:Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity)의 그것에 등가인 25, 50 또는 100 μM의 펩티드, 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드의 트롬빈 발생 시간인 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  24. 삭제
  25. 제1항에 있어서, 상기 응고촉진 활성이 규정된 내생 트롬빈 발생 분석법에서 30 분 이내에 정점인 25, 50 또는 100 μM의 펩티드, 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드의 트롬빈 발생 시간인 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  26. 삭제
  27. 제1항에 있어서, 중증 인간 혈우병 A의 동물 모델에 투여된 경우 생물학적 활성 FVIII의 부재를 적어도 부분적으로 보상할 수 있는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  28. 삭제
  29. 제1항에 있어서, 인간 혈장 내에서 30 분에서의 안정성이 50 % 이상인 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  30. 삭제
  31. 제1항에 있어서, 포스페이트 완충 염수 pH 7.4 내에서의 수용해도가 25 μM 이상인 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  32. 삭제
  33. 하나 이상의 제약학적으로 수용가능한 부형제, 운반제 또는 희석제 및 제1항 의 펩티드 또는 펩티드 유도체를 포함하고, FV, FVII, FVIII, FX 또는 FXI 결핍증 또는 이들의 조합을 치료하기 위한 제약학적 조성물.
  34. 삭제
  35. 제33항에 있어서, 피하, 비강, 협측, 경구 또는 폐에의 투여에 적합한 제약학적 조성물.
  36. 삭제
  37. 제35항에 있어서, 정맥 내 투여에 적합한 제약학적 조성물.
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. FV, FVII, FVIII, FX 또는 FXI 결핍증 또는 이들의 조합을 갖는 환자의 치료용 약을 제조하기 위한 제1항의 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 제43항에 있어서, 상기 환자가 FV, FVII, FVIII, FX, FXI 또는 이들의 조합에 대항하는 억제제 항체를 가지는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 고체상 합성에 의해 제1항의 펩티드 또는 펩티드 유도체를 만드는 방법.
  55. 삭제
  56. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 또는 펩티드 유도체가 FVIII 또는 그의 단편이 아니고, 응고촉진 활성이 규정된 내생 트롬빈 발생 분석법에서 100 mU/mL 이상 인자 8 억제 바이패싱 활성(FEIBA)의 그것과 등가인 25, 50 또는 100 μM의 펩티드, 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드의 트롬빈 발생 시간인, 응고촉진 활성을 갖는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  57. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 또는 펩티드 유도체가 FVIII 또는 그의 단편이 아니고, 응고촉진 활성이 규정된 내생 트롬빈 발생 분석법에서 30 분 이내에서 정점인 25, 50 또는 100 μM의 펩티드, 펩티드 유도체 또는 이중 펩티드의 트롬빈 발생 시간인, 응고촉진 활성을 갖는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
  58. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 또는 펩티드 유도체가 FVIII 또는 그의 단편이 아니고, 펩티드 또는 펩티드 유도체가 중증 인간 혈우병 A의 동물 모델에 투여된 경우 생물학적 활성 FVIII의 부재를 적어도 부분적으로 보상할 수 있는, 응고촉진 활성을 갖는 펩티드 또는 펩티드 유도체.
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