KR101411828B1 - 에탄올 생산용 재조합 방선균 및 이를 이용한 에탄올 생산방법 - Google Patents
에탄올 생산용 재조합 방선균 및 이를 이용한 에탄올 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 에탄올 생산용 재조합 방선균주 및 이를 이용한 에탄올 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 에탄올 생산방법은 방선균을 이용하여 다양한 바이오매스 원료를 이용하여 파이루베이트(pyruvate)를 아세트알데하이드(acetaldehyde)로 전환하고, 이를 에탄올로 전환시킬 수 있음으로써 효율적으로 바이오 에탄올을 생산할 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 에탄올 생산용 재조합 방선균 및 이를 이용한 에탄올 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대사 재설계를 이용하여 바이오 에탄올 생산능이 향상된 재조합 벡터, 이를 도입한 방선균 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용한 에탄올 생산방법에 관한 것이다.
최근 원유가격의 급등과 에너지 고갈에 대한 우려가 심각해지면서 대체 에너지 생산에 관한 관심이 증폭되고 있다. 대체 에너지 중 수송용 연료의 경우 가장 활발하게 대두되고 있는 소재가 바로 바이오 에탄올이다. 이는 자동차의 최종 기술 목표인 전기자동차 또는 수소자동차의 개발단계까지 현재의 아직도 개발초기 단계여서 이의 완료까지 이를 대체할 수 있는 절충형의 대체에너지가 필요하다. 현재 바이오 에탄올은 휘발유와 혼합하여 사용할 수 있어 바이오 디젤과 더불어 대표적인 재생자원 에너지이며 바이오 에탄올 연소 시 발생하는 이산화탄소는 교토의정서에서 규정한 온실가스 계산에서 예외 적용을 받아 온실가스 감축효과가 있다. 또한 보급에 별도의 인프라(주유소 등) 구축이 필요한 다른 청정연료와는 달리 기존 인프라에서 보급이 가능해 조기 상용화가 용이하다.
한편, 바이오매스의 생화학적 변환을 통한 바이오 에탄올 생산은 매우 환경 친화적이며, 그 효율을 극대화할 수 있는 연구기반이 필수적으로 요구된다. 지금까지 미생물의 대사공학적 재설계를 통한 에탄올 생산은 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis)의 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase)와 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase II)를 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli)의 염색체에 도입하여 에탄올을 생산하는 E. coli KO11 균주제작이 성공적으로 이루어진바 있다.
이와 유사하게, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase)와 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase II)를 도입한 연구도 있었으나 산화과정에 비해 상대적으로 적은 산소가 공급되는 발효조건에서는 락테이트(lactate), 아세테이트(acetate), 2,3- 부탄다이올(2,3-butanediol)이 생성되고, 미량의 에탄올만이 생산되어 낮은 에탄올생산효율을 보이는 문제점이 있었다.
우리나라의 경우 정부가 2004년을 신 재생에너지 원년으로 선포하고 국내 대기업들을 참여시켜 본격적인 투자에 착수하기 시작하였으나, 바이오 에탄올 분야에 관한 프로젝트는 지원과제에 포함되지 않고 있는 실정이며, 관련 법령에 따라 바이오에너지 개발의 필요성은 인정하고 있으나, 다른 프로젝트와 달리 실제 지원은 없어 조속한 개발지원이 필요한 실정이다.
바이오매스로부터의 에탄올 생산을 효율적으로 이루기 위해서는 균주가 생장에 사용할 수 있는 기질이 다양해야 한다. 방선균은 토양에서 유래하여, 대사에 이용할 수 있는 기질이 매우 다양하여 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), 자일로오스(xylose), 아라비노오스(arabinose), 셀로바이오스(cellobiose) 등과 같은 많은 탄소원을 이용 가능하다(Journal of Bacteriology. 54(2):213-218. 1947). 또한 숲과 같은 환경에서 목질부에 노출될 기회가 많아, 아밀로오즈(amylose)는 물론, 셀룰로오스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicelluloses), 자일란 (xylan)등과 같은 다양한 물질을 분해시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
그러나 방선균의 대사공학적 재설계를 통한 에탄올 생산은 국내·외에서 아직까지 시도된바 없으며, 에탄올에 대한 내성 연구 역시 아직 보고된 바 없는 미개척 분야이다.
이에, 본 발명자들은 대사공학적 재설계를 통한 에탄올 생산에 대한 지속적인 연구를 진행하던 중 국내외에서 아직까지 시도된바 없으며, 에탄올에 대한 내성연구도 보고된 바 없는 방선균의 대사경로를 이용하여 다양한 바이오매스로부터 다량의 에탄올을 효율적으로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 바이오 에탄올 제조에 있어서, 생산균주인 방선균주가 기질로 제공되는 당을 에탄올로 생합성할 수 있도록 하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 유래의 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase)유전자; 및 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase II)유전자;가 도입된 형질전환체을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 에탄올을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바이오 에탄올 제조에 있어서, 생산균주인 방선균이 기질로 제공되는 당을 효과적으로 에탄올로 전환할 수 있도록 하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체, 및 상기 형질전환체를 이용하여 에탄올을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 에탄올 생산방법은 방선균을 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방선균은 방선균에 적합한 코돈체계로 최적화(codon optimization)한 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase, pdc)유전자; 및 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase II, adhII)유전자;를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 된 재조합 방선균인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 가지는 파이루베이트 디카르복실레이즈 및 서열번호 2에 기재된 염기서열을 가지는 알코올 디하이드로지네이즈를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
미생물을 이용한 에탄올 생산은 글루코스(glucose)가 파이루베이트(pyruvate)로 산화된 후, 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase, 이하 ‘pdc’라고 칭한다.)에 의해 아세트알데하이드(acetaldehyde)가 생성되고, 생성된 아세트알데하이드(acetaldehyde)가 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase II, 이하 ‘adhII’라고 칭한다.)에 의해 에탄올로 전환되는 주요 대사경로(pathway)를 가진다. 도 1을 참조한다.
본 발명의 방선균은 상기 에탄올을 생산에 관여하는 상기 pdc 유전자 및 adhII 유전자가 모두 존재하지 않기 때문에, 본 발명자들은 방선균이 기질로 제공되는 당류로부터 에탄올을 효율적으로 생산할 수 있도록 하는 재조합 벡터를 제조하였고, 상기 재조합 벡터가 형질전환 된 재조합 방선균을 이용하여 효율적으로 다량의 바이오 에탄올을 생성할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 방선균에 적합한 코돈체계로 최적화(codon optimization)한 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase, pdc)유전자; 및 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase II, adhII)유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
보다 상세하게는 박테리아 중 대표적으로 에탄올을 생산하는 균주인 자이모모나스 모빌리스(Zymomonasmobilis)로부터 pdc 유전자와 adhII 유전자 염기서열을 확보였다.
그러나 방선균의 경우, 다른 종류들의 박테리아와는 달리, 유전자의 염기서열에서 구아닌(guanine)과 시토신(cytocine)이 차지하고 있는 비율(GC content)이 70% 이상이고, 코돈(codon)의 3번째 뉴클레오티드(nucleotide)의 90% 이상이 구아닌(guanine)과 시토신(cytocine)으로 되어 있는 특징으로 인해, 상기 pdc 유전자와 adhII 유전자의 발현이 어렵고, 발현되더라도 그 양이 매우 적은 문제점을 가지고 있다.
이에 본 발명에 따른 재조합 벡터는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)유래의 pdc 유전자와 adhII 유전자를 방선균에 적합한 코돈으로 유전자를 치환하여 합성하고, 합성된 pdc 유전자와 adhII 유전자를 이어 붙여서 pet operon(production of ethanol operon) 모듈을 제작하였다.
본 발명에 있어서, 상기 “pet operon 모듈”은 상기 pdc 유전자와 adhII 유전자가 재조합되어 제조된 재조합 유전자를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 방선균에 적합한 코돈체계로 최적화한 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase)유전자는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase) 유전자는 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시(degeneracy)를 고려하여 상기 서열번호 1에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 파이루베이트 디카르복실레이즈 유전자에 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 방선균에 적합한 코돈체계로 최적화한 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase II)유전자는 서열번호 2에 기재된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase II) 유전자는 서열번호 2에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시(degeneracy)를 고려하여 상기 서열번호 2에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 알코올 디하이드로지네이즈 유전자에 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 5의 개열지도를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 상세하게는 본 발명의 방선균은 발현벡터로서, 예를 들면 pUWL201PW 벡터를 사용할 수 있다. 방선균에의 재조합 DNA의 도입방법으로는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 폴리에틸렌글라이콜 법 (Practical Streptomyces Genetics, Chapter 10, p.232-236, John Innes Center, Norwhich(2000))등이 이용가능하다.
또한, 재조합 벡터에는 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.
본 발명은 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 유래의 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase)유전자; 및 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase II)유전자;가 도입된 재조합 방선균을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 재조합 방선균을 제공한다.
상기 방선균은 토양에서 유래하여, 대사에 이용할 수 있는 기질이 매우 다양하며 숲과 같은 환경에서 목질부에 노출될 기회가 많아서, 아밀로오즈(amylose)는 물론 셀룰로오스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicelluloses), 자일란(xylan)등과 같은 다양한 물질을 분해시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 에탄올의 생산방법은 상기 방선균을 숙주로 이용하는 것으로, 보다 상세하게는 상기 방선균은 스트렙토마이세스 실리칼라(Streptomyces coelicolor) 또는 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)인 것을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 제조된 재조합 유전자 pet operon 모듈의 도입방법으로는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 폴리에틸렌글라이콜 법(Practical Streptomyces Genetics, Chapter 10, p.232-236, John Innes Center, Norwhich(2000))등이 이용가능하다.
본 발명은 상기 본 발명의 재조합 방선균을 배양하여 에탄올을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 에탄올 생산방법은 재조합 방선균을 글루코스(glucose), 자일로오스(xylose), 갈락토오스(galactose), 셀로바이오스(cellobiose), 스타치(starch), 말토오스(maltose), 아가로스(agarose), 셀룰로스(cellulose) 및 자일란(xylan)으로부터 선택되는 1종 이상의 미생물의 증식에 필요한 탄소원을 사용하여 배양할 수 있으며, 보다 바람직하게는 글루코스(glucose)를 사용하여 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스, 맥아엑기스, 카제인 분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물 유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산제 1칼륨, 인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에, 티오스트렙톤(thiostrepton) 등의 항생물질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.
또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동 배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 보다 상세하게는 방선균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 ISP4 배지, YEME 배지, R2YE 배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 10 내지 40℃의 온도 범위에서 배양함으로써 형질 전환된 방선균은 파이루베이트(pyruvate)를 아세트알데하이드(acetaldehyde)로 전환하고, 이를 에탄올로 전환시킬 수 있는 에탄올 생산능력을 가진다.
본 발명은 본 발명의 형질전환체를 포함하는 에탄올 생성용 조성물을 제공한다. 본 발명의 에탄올 생성물 조성물은 예를 들어 상기 형질전환체를 배양하여 당류를 기질로 하여 에탄올을 생성하는데 적합한 폴리펩타이드, 브로쓰, 세포 용해물, 정제 또는 정제되지 않은 효소 추출물 또는 폴리펩타이드 등을 포함한다.
본 발명에 따른 에탄올 생산방법은 방선균을 이용하여 다양한 바이오매스 원료를 이용하여 파이루베이트(pyruvate)를 아세트알데하이드(acetaldehyde)로 전환하고, 이를 에탄올로 전환시킬 수 있음으로써 효율적으로 바이오 에탄올을 생산할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 미생물을 이용한 에탄올 생산의 주요 대사경로(pathway)를 보여주는 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 재조합 방선균의 에탄올 생산에 대한 주요 대사경로(pathway)를 보여주는 것이며,
도 3은 본 발명에 따른 방선균에 적합한 코돈체계로 최적화한 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase)유전자의 염기서열(서열번호 1)을 보여주는 것이고,
도 4는 본 발명에 따른 방선균에 적합한 코돈체계로 최적화한 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase II)유전자의 염기서열(서열번호 2)을 보여주는 것이며,
도 5는 본 발명에 따른 재조합 벡터의 개열지도를 보여주는 것이고,
도 6은 본 발명에 따른 재조합 스트렙토마이세스 실리칼라(Streptomyces coelicolor) 형질전환체를 이용하여 생산된 에탄올 농도를 측정한 결과이며,
도 7은 본 발명에 따른 재조합 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 형질전환체를 이용하여 생산된 에탄올 농도를 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 재조합 방선균의 에탄올 생산에 대한 주요 대사경로(pathway)를 보여주는 것이며,
도 3은 본 발명에 따른 방선균에 적합한 코돈체계로 최적화한 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase)유전자의 염기서열(서열번호 1)을 보여주는 것이고,
도 4는 본 발명에 따른 방선균에 적합한 코돈체계로 최적화한 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase II)유전자의 염기서열(서열번호 2)을 보여주는 것이며,
도 5는 본 발명에 따른 재조합 벡터의 개열지도를 보여주는 것이고,
도 6은 본 발명에 따른 재조합 스트렙토마이세스 실리칼라(Streptomyces coelicolor) 형질전환체를 이용하여 생산된 에탄올 농도를 측정한 결과이며,
도 7은 본 발명에 따른 재조합 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 형질전환체를 이용하여 생산된 에탄올 농도를 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.
이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.
또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
[실시예 1]
pdc
와
adh
II 유전자 염기서열 확보 및 코돈 최적화(codon optimization)
자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)에서 유래한 에탄올 생산 유전자 pdc 유전자와 adhII 유전자의 염기서열을 미국 국립생물정보센터의 유전자 서치(search) 프로그램을 통하여 확보한 후, 이 염기서열을 방선균에 적합한 코돈 체계로 최적화하여, 미국 Genescript社를 통해 합성하였다.
코돈 최적화를 통해, pdc유전자(1.7 kb)의 염기서열에서 구아닌(guanine)과 시토신(cytocine)이 차지하고 있는 비율(GC content)이 52.43%에서 67.87%로 증가하였으며, adhII 유전자(1.2 kb)의 GC content는 50.71%에서 67.61%로 증가하였다. 상기 염기서열은 각각 도 3 및 도 4에 도시하였다.
[실시예 2]
pet
operon이 삽입된 pUWL201PW 플라즈미드 제작
상기 실시예 1에서 코돈 최적화되어 합성된 pdc와 adhII 유전자를 방선균용 고발현 벡터인 pUWL201PW에 서브클로닝(subcloning)하기 위하여, pdc 유전자의 5' 말단에 Nde1 제한효소 자리를 부착하고, 3’말단에는 PstI 제한효소 자리를 부착하였다.
adhII 유전자는 5’말단에 NdeI 제한효소 자리를 부착하고, 3’말단에 BamH1 제한효소 자리를 부착하였다. 상기 부착한 각각의 제한효소 자리의 인식서열을 확인할 수 있는 프라이머(primer)를 제작하여 하기 표 1에 나타내었다.
상기 표 1의 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭한 후, 증폭된 유전자들을 각각 TA 벡터에 라이게이션(ligation)하였고, 염기서열 분석을 통해 해당 유전자의 염기서열이 일치함을 확인하였다.
상기 증폭된 유전자들을 pUWL201PW 벡터에 서브클로닝(subcloning)하기 위해, adhII 유전자는 Nde1과 BamH1 제한효소 처리하여 아가로스 겔 상에서 전기영동 하고, pdc 유전자와 pUWL201PW 벡터는 Nde1과 Pst1 제한효소를 처리하여 아가로스 겔 상에서 전기영동 하여, 각각의 밴드를 겔 추출(gel elution)하여 DNA 단편을 회수하였다.
상기 회수된 DNA 단편은 동일한 제한효소로 처리된 pUWL201PW 벡터에 라이게이션(ligation)하였다.
상기 목적으로 하는 두 가지 유전자의 모듈을 production of ethanol operon (이하, pet operon)이라 지칭한다.
상기 pet operon을 ‘ermE - RBS(Ribosome Binding Site) - pdc - RBS - adhII’의 순서로 구축하여 pUWL201PW 벡터에 삽입하기 위해, 5’ RBS(Ribosome Binding Site)에 Pst1 제한효소 자리를 부착하여 하기 표 2의 프라이머를 제작하고, adhII 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 adhII 유전자는 PstI과 BamHI 제한효소를 처리하여 RBS를 포함하는 유전자 절편을 얻고, pdc가 서브클로닝(subcloning)된 pUWL201PW도 PstI과 BamHI 제한효소를 처리하였다. 제한효소로 처리한 pdc 유전자가 삽입된 pUWL201PW 벡터와 상기 RBS를 포함하는 유전자 절편을 라이게이션(ligation)하여 최종적으로 pet operon이 삽입된 재조합 pUWL201PW 벡터를 제조하였다. 도 5에 도시하였다.
상기 재조합 pUWL201PW 벡터는 하기 표 2의 프라이머로 확인하였다.
[실시예 3] 재조합 pUWL201PW 벡터가 도입된 재조합 방선균의 제조
방선균 숙주세포는 스트렙토마이세스 실리칼라(Streptomycesc oelicolor)와 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)을 사용하였고, 상기 방선균 숙주세포는 프로토플라스트(protoplast)를 분리하여 이용하였다.
상기 프로토플라스트 분리는 각각의 방선균의 포자를 ISP4(International Streptomyces Project 4) 배지, 또는 R2YE 배지에서 7일간 28℃에서 배양하였다. 배양된 플레이트를 가로, 세로 각각 1 cm 크기로 잘라서, YEME 배지에서 28℃, 200 rpm으로 36시간 동안 진탕배양(shaking incubation)한 후, 진탕 배양된 방선균을 회수하여 p-buffer로 세척하고, 라이소자임(lysozyme)을 4 mg/㎖의 농도로 첨가하여 30℃에서 30분간 더 배양하였다.
상기 배양된 방선균을 탈지면으로 여과하여 마이셀리움(mycelium)을 제거하고 순수 포자만을 회수하였다.
회수된 포자 50 ㎕에 상기 실시예 2에서 제조된 재조합 pUWL201PW 벡터(pet operon in pUWL201PW vector)를 10 ㎕첨가하고, PEG(polyethylene glycol) 용액을 800 ㎕ 첨가하여 5분간 정치한 후, R2YE 고체 배지에 300 ㎕씩 분주하여 도말하였다.
상기 도말된 고체배지는 30℃에서 18시간 동안 배양한 후, 배양된 고체 배지 위에 항생물질인 티오스트렙톤(Thiostrepton) 4 ㎕/㎖ 을 1 ㎖씩 분취하고 플러딩(flooding) 킨 후, 티오스트렙톤이 플러딩(flooding) 된 고체배지를 28℃에서 3일간 배양하고, 다시 티오스트렙톤 함유 R2YE 고체배지에 28℃에서 7일간 계대배양 하였다.
[실시예 4] 형질전환된 재조합 방선균을 이용한 에탄올 생산
상기 실시예 3에서 형질 전환된 재조합 방선균 아가 플레이트를 1×1㎠로 잘라, 그 단편을 티오스트렙톤(Thiostrepton) 함유 R2YE 액체배지에 접종한 후, 28℃에서 48시간 동안 배양하여 활성화(activation)시켰다. 에탄올 생산할 수 있는 탄소원(glucose, galactose, xylose, cellobiose, maltose, starch, agarose, CM-cellulose, xylan 등)이 첨가되어 있는 에탄올 생산 배지(yeast extract 15 g/L, KH2PO4 1 g/L, (NH4)2SO4 1 g/L, MgSO4 1 g/L, pH 7.20 with 1N NaOH)에 배양된 액체 배양액을 10(v/v)%의 농도로 접종하고, 28℃에서 120 rpm으로 90시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 배양액으로부터 생산된 에탄올의 농도는 YSI 2786 membrane이 장착된 YSI biochemistry analyzer(Model 2700, Yellow Springs Instrument Co., Inc)를 이용하여 분석하였다.
방선균용 고발현 벡터인 pUWL201PW만 형질전환 된 방선균에 비하여, 방선균에 적합한 코돈체계로 최적화(codon optimization)한 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase)유전자 및 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase II)유전자를 포함하는 재조합 벡터에서 에탄올을 생산수율이 우수한 것을 확인할 수 있었고, 재조합 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 형질전환체와 재조합 스트렙토마이세스 실리칼라(Streptomyces coelicolor) 형질전환체의 에탄올 생산수율이 매우 유사한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 도 6 및 도 7에 각각 도시하였다.
상기의 결과로부터 방선균에 적합한 코돈체계로 최적화(codon optimization)한 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase)유전자 및 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase)유전자가 도입된 형질전환 방선균은 다양한 기질로부터 에탄올을 생산할 수 있을 뿐 아니라 기질의 당화와 에탄올 생산을 동시에 할 수 있는 특징을 가지고 있어, 효율적으로 바이오에탄올을 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology
<120> Bio-ethanol production capacity of recombinant Streptomyces sp.
and method for preparing bio-ethanol using the same
<160> 8
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1707
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> pyruvate decarboxylase
<400> 1
atgtcctaca ccgtcggcac ctacctcgcc gagcgcctgg tgcagatcgg cctcaagcac 60
cacttcgcgg tcgccggcga ctacaacctg gtgctgctcg acaacctgct cctgaacaag 120
aacatggagc aggtctactg ctgcaacgag ctgaactgcg gcttctccgc cgagggctac 180
gcccgtgcca agggcgccgc ggccgcggtc gtgacctaca gcgtcggcgc gctgtccgcc 240
ttcgacgcga tcggcggcgc gtacgccgag aacctccccg tcatcctgat ctcgggcgcc 300
ccgaacaaca acgaccacgc cgccggtcac gtgctccacc acgccctggg caagaccgac 360
taccactacc agctggagat ggccaagaac atcaccgccg cggccgaggc catctacacc 420
cccgaggagg cgccggccaa gatcgaccac gtcatcaaga ccgccctccg cgagaagaag 480
cccgtgtacc tggagatcgc ctgcaacatc gcgtccatgc cgtgcgcggc accgggcccc 540
gcgtcggccc tgttcaacga cgaggcctcc gacgaggcgt cgctcaacgc ggccgtcgag 600
gagaccctga agttcatcgc caaccgcgac aaggtggcgg tcctcgtggg ctcgaagctg 660
cgggccgccg gtgccgagga ggcggccgtc aagttcgcgg acgccctggg cggcgcggtg 720
gccaccatgg ccgccgcaaa gagcttcttc cccgaggaga acccgcacta catcggcacc 780
tcgtggggcg aggtctccta ccccggcgtg gagaagacca tgaaggaggc ggacgccgtc 840
atcgcgctgg ccccggtgtt caacgactac tccaccaccg gctggaccga catcccggac 900
cccaagaagc tcgtcctggc cgagccccgc agcgtcgtgg tcaacggcat ccggttcccg 960
tccgtccacc tcaaggacta cctcacccgc ctggcccaga aggtgtcgaa gaagaccggc 1020
gccctggact tcttcaagag cctcaacgcc ggcgagctga agaaggccgc gccggccgac 1080
cccagcgcgc cgctggtcaa cgccgagatc gcgcggcagg tggaggccct cctgaccccc 1140
aacaccaccg tcatcgccga gaccggcgac tcctggttca acgcccagcg catgaagctg 1200
ccgaacggcg cccgcgtcga gtacgagatg cagtggggcc acatcggctg gtccgtcccg 1260
gccgcattcg gctacgccgt gggcgcgccg gagcgccgga acatcctcat ggtcggcgac 1320
ggctcgttcc agctgaccgc ccaggaggtc gcgcagatgg tgcgcctcaa gctgcccgtc 1380
atcatcttcc tgatcaacaa ctacggctac accatcgagg tgatgatcca cgacggcccg 1440
tacaacaaca tcaagaactg ggactacgcc ggcctgatgg aggtcttcaa cggcaacggc 1500
ggctacgaca gcggcgccgg caagggcctc aaggccaaga ccggcggcga gctggcggag 1560
gccatcaagg tggcgctcgc caacaccgac ggcccgaccc tgatcgagtg cttcatcggc 1620
cgggaggact gcaccgagga gctggtcaag tggggcaagc gcgtggccgc ggccaactcg 1680
cggaagccgg tcaacaagct cctgtga 1707
<210> 2
<211> 1152
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> alcohol dehydrogenase II
<400> 2
atggcctcct cgaccttcta catccccttc gtcaacgaga tgggcgaggg ctccctcgag 60
aaggccatca aggacctgaa cggctcgggc ttcaagaacg ccctgatcgt ctcggacgcg 120
ttcatgaaca agagcggcgt cgtgaagcag gtggccgacc tgctcaaggc gcagggcatc 180
aactccgccg tctacgacgg cgtgatgccg aaccccaccg tcacggcggt gctggagggc 240
ctcaagatcc tgaaggacaa caactcggac ttcgtcatca gcctgggcgg cggctccccg 300
cacgactgcg ccaaggcgat cgccctggtc gccaccaacg gcggcgaggt gaaggactac 360
gagggcatcg acaagtccaa gaagccggcc ctgcccctca tgtcgatcaa caccacggcc 420
ggcacggcga gcgagatgac ccgcttctgc atcatcacgg acgaggtccg gcacgtgaag 480
atggccatcg tcgaccgcca cgtgaccccg atggtctcgg tgaacgaccc cctgctcatg 540
gtcggcatgc cgaagggcct caccgccgcg acgggcatgg acgccctgac ccacgccttc 600
gaggcgtaca gctccaccgc cgcgacgccc atcaccgacg cgtgcgccct caaggccgcg 660
agcatgatcg ccaagaacct gaagaccgcg tgcgacaacg gcaaggacat gccggcccgg 720
gaggcgatgg cctacgcgca gttcctcgcc ggcatggcgt tcaacaacgc cagcctgggc 780
tacgtccacg ccatggcgca ccagctcggc ggctactaca acctgcccca cggcgtctgc 840
aacgccgtgc tgctcccgca cgtgctggcc tacaacgcgt ccgtcgtggc cggccggctg 900
aaggacgtcg gcgtggccat gggcctcgac atcgcgaacc tgggcgacaa ggaaggcgcc 960
gaggcgacga tccaggccgt ccgcgacctg gccgcgtcca tcggcatccc cgccaacctc 1020
accgagctgg gcgccaagaa ggaagacgtg ccgctgctcg ccgaccacgc gctcaaggac 1080
gcctgcgcgc tgaccaaccc ccgccagggc gaccagaagg aagtcgagga gctgttcctc 1140
tcggccttct ga 1152
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pdc forward primer
<400> 3
catatgatgt cctacaccgt cggcacctac 30
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pdc reverse primer
<400> 4
ctgcagtcac aggagcttgt tgac 24
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adhII forward primer
<400> 5
catatgatgg cctcctcgac cttctac 27
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adhII reverse primer
<400> 6
ggatcctcag aaggccgaga ggaa 24
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 7
ctgcaggagg agcatatgat ggcctcctcg acc 33
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 8
ggatcctcag aaggccgaga ggaacag 27
Claims (11)
- 방선균에 적합한 코돈체계로 최적화(codon optimization)한 서열번호 1에 기재된 염기서열을 가지는 파이루베이트 디카르복실레이즈(pyruvate decarboxylase)유전자; 및 서열번호 2에 기재된 염기서열을 가지는 알코올 디하이드로지네이즈 (alcohol dehydrogenase II)유전자;를 포함하는 재조합 벡터.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 벡터는 도 5의 개열지도를 가지는 재조합 벡터. - 삭제
- 삭제
- 제 1항에 따른 재조합 벡터로 형질전환 된 재조합 방선균.
- 제 7항에 있어서,
상기 방선균은 스트렙토마이세스 실리칼라(Streptomyces coelicolor) 또는 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)인 것을 특징으로 하는 재조합 방선균. - 제 7항에 따른 재조합 방선균을 배양하여 에탄올을 생산하는 방법.
- 제 9항에 있어서,
상기 방법은 재조합 방선균을 글루코스(glucose), 갈락토오스(galactose), 자일로오스(xylose), 셀로바이오스(cellobiose), 스타치(starch), 아가로스(agarose), 카르복시메틸셀룰로스(CM-cellulose) 및 자일란(xylan)으로부터 선택되는 1종 이상의 탄소원을 사용하여 배양하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 7항에 따른 재조합 방선균을 포함하는 에탄올 생성용 조성물.
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